CN104181297B - 一种检测羊伪狂犬病毒抗体的elisa试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及动物疫病诊断技术领域，更具体的讲是一种用于检测羊的伪狂犬病毒抗体ELISA试剂盒，本发明提供的ELISA试剂盒包括包被板、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、酶标结合物、20×浓缩洗涤液、底物液、终止液、封口胶、自封袋、使用说明书，所述的试剂盒能快速、灵敏、准确的检测羊体内的PRV抗体水平，填补了国内外该领域的空白。所述的试剂盒用以代替病毒中和试验等传统的血清学方法，用以实现敏感性高、特异性强、稳定性好的高通量大规模的羊体内PRV抗体的检测。
Description
技术领域
本发明涉及动物疫病诊断技术领域，尤其涉及一种检测羊的伪狂犬病毒抗体的间接ELISA试剂盒，以此对羊群的伪狂犬病毒抗体水平及疫病分布与流行情况进行监测。
背景技术
伪狂犬病，亦称奥耶兹基氏病，简称PRV，是由疱疹病毒科的甲型疱疹病毒引起的。该病毒可感染人类和无尾猿以外的所有哺乳动物的中枢神经系统和其它器官，如呼吸道。该病可危害各阶段的羊群，死亡率高达100%，临床上以发热、奇痒以及脑脊髓炎症状为特征。该病在世界范围内发生且广泛流行，近年来随着我国肉羊产业的发展和羊频繁流动，本病给养羊业带来了巨大的经济损失。
gD是PRV的主要结构蛋白，它不仅诱导体液免疫，而且诱导细胞免疫，同时是病毒粒子表面的病毒感染细胞的主要分子，在病毒吸附和侵入宿主细胞过程中发挥重要作用，为病毒复制的必需基因，是一种重要的中和抗原，也是保护性抗体的主要目标，能诱导较好的保护反应，抵抗PRV强毒株攻击，因此gD被作为PRV特异性抗原研究的首选蛋白。
目前，一般采用病毒中和试验、乳胶凝集或ELISA方法检测伪狂犬病毒的抗体。国内外已有许多商品化的检测试剂盒可供使用，但检测对象多针对最为普遍和易感的猪。本发明应用涉及针对羊建立的伪狂犬病毒抗体的ELISA检测试剂盒。
发明内容
本发明要解决问题是建立一种检测羊PRV抗体的ELISA试剂盒，用以代替病毒中和试验等传统的血清学方法，用以实现敏感性高、特异性强、稳定性好的高通量大规模的羊体内PRV抗体水平的监测。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种检测羊伪狂犬病毒抗体的ELISA试剂盒，包括以下组分：包被板、阳性对照、阴性对照、酶标结合物、样品稀释液、20×浓缩洗涤液、底物液、终止液、封口胶。
上述酶标结合物是由酶标抗体稀释液稀释2000倍的HRP标记的兔抗山羊IgG（购自北京中杉金桥生物技术有限公司）每一试剂盒装有1瓶体积为20ml的酶标结合物，4℃保存；。
上述酶标抗体稀释液为NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，KH2PO40.2g，甘油20ml，小牛血清200ml，Casein5g，蔗糖2g，TritonX-10010ml，硫柳汞0.1g，加纯水定容至1L。
上述样品稀释液包括NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，KH2PO40.2g，吐温-205ml，甘油10ml，小牛血清100ml，硫柳汞0.1g，加纯水定容至1L。
上述包被板由伪狂犬病毒的重组gD蛋白作为包被抗原，并由封闭液封闭，所述封闭液为NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，KH2PO40.2g，小牛血清100ml，蔗糖50g，明胶1g，Casein2.5g，硫柳汞0.1g，加纯水定容至1L。
上述阴性对照：以样品稀释液将不含PRV抗体的阴性羊血清做40倍稀释，每一试剂盒装有1只体积为1ml的阴性对照，4℃保存；
上述阳性对照：以样品稀释液将含PRV抗体的阳性羊血清做100倍稀释，每一试剂盒装有1只体积为1ml的阳性对照，4℃保存。
上述重组gD蛋白的表达和纯化包括如下步骤：
1）根据GenBank公布的登录号为AY196984的PRVFa株的gD基因序列，设计引物序列如下：
P1：5’-GGGGAATTCTACCCGTACAC-3’
P2：5’-GGGCTCGAGCCTCAGGCGGA-3’
2）通过PCR扩增PRVFa株gD基因，与pMD18-T克隆载体连接；
3）双酶切重组质粒pMD18-T-gD，构建重组表达载体PET-32a-gD；
4）重组质粒PET-32a-gD转化感受态细胞BL21(DE3)，诱导表达，然后纯化设备，亲和柱进行亲和纯化。
上述20×浓缩洗涤液为NaCl80g，KCl2g，Na2HPO4·12H2O29g，KH2PO42g，吐温-205ml，加纯水定容至500ml。
上述终止液为1MH2SO4，4℃保存，所述底物液为可溶型单组分TMB底物液。
上述试剂盒还包括自封袋和使用说明书。
上述一种检测羊伪狂犬病毒抗体的ELISA试剂盒的使用方法，其特征在于，主要使用方法如下：
（1）在A1和A2孔中分别加入100μl阴性对照；在A3和A4孔中分别加入100μl阳性对照；
（2）取100μl经1：40稀释好的待检样品液加入相应孔中，并做好记录；37℃孵育1h；
（3）将各孔的液体弃入废液桶，每孔加250μl的洗涤液进行洗板，重复5次，每次30s；
（4）每孔加100μl酶标结合物；37℃孵育1h；
（5）重复步骤（3）；
（6）每孔加100μl底物液；
（7）37℃避光显色孵育10min；
（8）每孔加100μl的终止液；立刻于450nm波长处测定各孔的吸光度值，即OD450nm值；
（9）临界值（C.O.）的计算正常情况下，阳性对照孔OD450值≥0.4；阴性对照孔OD450值≤0.2；临界值=0.17+阴性对照孔均值；阴性对照孔OD450值大于0.2时应舍弃，如所有阴性对照孔OD450值都大于0.2时须重复实验；阴性对照孔低于0.05时以0.05计算；
（10）结果判定检测样品OD450值≥临界值，判定该检测样品为阳性；检测样品OD450值＜临界值，判定该检测样品为阴性。
封口胶：购自商品化的精制不干胶纸，用以在试验中盖住反应的微孔板；
本发明的有益效果是：本发明中所述的包被抗原为基因工程方法表达的重组gD蛋白，具有很强的特异性、敏感性，能真实准确地反应羊群中PRV的抗体水平。
本发明中所述的封闭液（NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，KH2PO40.2g，小牛血清100ml，蔗糖50g，明胶1g，Casein2.5g，硫柳汞0.1g，加纯水至1L），试验显示PRV阴性对照及阴性血清OD值显著降低，消除样品中非特异性IgG结合微孔板底的干扰，较好的起到了封闭微孔板底空白位点的作用，4℃放置6个月稳定不沉底不变质。
本发明中所述的样品稀释液与PBS的比较试验显示PRV阴性对照及阴性血清OD值显著降低，与口蹄疫、布病、羊痘等的交叉反应明显减弱，较好的起到减少非特异性结合、消除假阳性的作用，稳定性试验显示4℃放置6个月稳定不沉底不变质；用样品稀释液稀释成工作浓度的阳性对照，加速破坏性试验显示37℃烤9dOD值降低30%以内。
本发明中所用的酶标抗体稀释液（NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，KH2PO40.2g，甘油20ml，小牛血清200ml，Casein5g，蔗糖2g，TritonX-10010ml，硫柳汞0.1g，加纯水至1L），用该稀释液稀释成工作浓度的酶标结合物，稳定性试验显示4℃放置6个月稳定不沉底不变质，加速破坏性试验显示37℃烤9d灵敏度降低25%以内。
综上所述：本发明所述试剂盒专用于检测羊体内的PRV抗体水平，填补了国内外该领域的空白，而且本发明用以代替病毒中和试验等传统的血清学方法，从而实现敏感性高、特异性强、稳定性好的高通量大规模的羊体内PRV抗体的检测。
附图说明
图1为gD基因PCR扩增产物，泳道1为DL15000marker，泳道2、3为gD基因PCR扩增产物，泳道4为DL2000marker；
图2为重组质粒pMD18-T-gDPCR及双酶切酶切鉴定结果，泳道1为pMD18-T-gDPCR扩增产物，泳道2为DL2000marker，泳道3为pMD18-T-gD双酶切结果，泳道4为DL15000marker；
图3为重组质粒PET-32a-gD酶切鉴定结果，泳道1为DL15000marker，泳道2为PET-32a-gD双酶切结果，泳道3为PET-32a-gD单酶切结果，泳道4为DL2000marker。
具体实施方式
实施例1：重组gD蛋白的表达及纯化
1）引物设计与合成
根据GenBank公布的登录号为AY196984的PRVFa株的gD基因序列，利用Oligo6.0和Primer软件设计一对gD基因的引物，分别引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点，扩增片段1059bp，引物序列如下：
P1：5’-GGGGAATTCTACCCGTACAC-3’
P2：5’-GGGCTCGAGCCTCAGGCGGA-3’
2）PRV基因组DNA的提取
取PRVFa株（购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心）病毒液200μl，使用小量病毒DNA/RNA提取试剂盒（购自美国AXYGEN公司）提取病毒DNA。
3）PCR扩增PRVgD基因与克隆
以提取的PRVFa株DNA为模板，加入设计的特异引物PCR扩增gD目的基因；PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃lmin，61℃lmin，72℃l.5min，共进行30个循环，72℃延伸10min，4℃终止反应。取PCR产物0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定（见图1），用PCR产物快速胶回收试剂盒回收纯化。PCR纯化产物与pMD18-T载体16℃连接过夜，转化大肠杆菌（DH5α）感受态细胞，双酶切鉴定为阳性重组质粒pMD18-T-gD（见图2）。
4）gD表达载体的构建与鉴定
取重组质粒pMD18-T-gDEcoRⅠ/XhoⅠ双酶切，回收目的片段，插入表达载体PET-32a中，转化大肠杆菌（DH5α）感受态细胞，双酶切鉴定为阳性重组质粒PET-32a-gD。（见图3）
5）重组gD蛋白的表达与分析
取重组质粒PET-32a-gD转化BL21(DE3)感受态细胞，挑单菌落接种于含K+的LB液体培养基中，37℃震荡培养6h。1%接种于含K+的LB液体培养基中培养至OD600≈0.6，加诱导剂IPTG至终浓度为1.0mM。30℃震荡培养6h，离心收集菌体超声破碎，10000r/min离心10min，分别收集上清及沉淀，SDS-PAGE分析gD蛋白以包涵体形式表达。
6）重组gD蛋白的纯化
将包涵体形式的重组gD蛋白以0.22μm滤膜过滤，选用AKTApurifier100（购自美国通用电气医疗集团）纯化设备，亲和柱HisTrapHP（购自美国通用电气医疗集团）进行亲和纯化，SDS-PAGE分析蛋白纯度，纯化后gD蛋白透析复性-20℃贮存备用。
实施例2：抗原包被板的制备
（1）包被缓冲液稀释的gD负载于微孔板上
具体的，所述的包被方法包括0.05MpH9.6碳酸缓冲液做包被液，向微孔板的每孔加入含gD的包被液0.1ml，4℃过夜包被16h。
（2）洗板
将各孔的液体弃入废液桶，每孔加250μl的洗涤液（试剂盒内20×浓缩洗涤液需用蒸馏水或去离子水稀释后方可使用。如有结晶，需先溶解后，方可进行稀释）进行洗板，重复2次，每次30s；最后拍干微孔板。
（3）封闭
向微孔板的每孔加入0.13ml封闭液，室温放置2.5h，把孔内封闭液甩掉，最后拍干微孔板。
（4）干燥
具体的，将微孔板放入恒温恒湿箱，37℃放置40min。
（5）包装
具体的，将微孔板放入铝箔袋，加防潮剂，真空包装机封口4℃保存。
实施例3：阳性血清和阴性血清的制备
1）阳性血清制备
挑选体格健壮体重在15~20kg的山羊，颈部皮下注射伪狂犬病灭活疫苗5.0mL（购自山东绿都生物科技有限公司），一免后28d进行第二次免疫，剂量同前；二免后14d，在无菌情况下进行采血分离血清，血清中和试验（参考OIE陆生动物诊断试验和疫苗手册）测定其中和抗体；如中和抗体效价≥1：128，则在无菌情况下进行大量采血并制备血清，于-20℃保存备用。
2）阴性血清制备
挑选未接种过疫苗且未感染伪狂犬的体格健壮体重在15~20kg的山羊，在无菌情况下进行采血分离血清，血清中和试验（参考OIE陆生动物诊断试验和疫苗手册）测定其中和抗体；如中和抗体效价≤1：4，则在无菌情况下进行大量采血并制备血清，于-20℃保存备用。
实施例4：试剂盒使用方法示例
①在A1和A2孔中分别加入100μl阴性对照；在A3和A4孔中分别加入100μl阳性对照；
②取100μl经1：40稀释好的待检样品液加入相应孔中，并做好记录；37℃孵育1h；
③将各孔的液体弃入废液桶，每孔加250μl的洗涤液（试剂盒内20×浓缩洗涤液需用蒸馏水或去离子水稀释后方可使用。如有结晶，需先溶解后，方可进行稀释）进行洗板，重复5次，每次30s；
④每孔加100μl酶标结合物；37℃孵育1h；
⑤重复步骤③；
⑥每孔加100μl底物液；
⑦37℃孵育10min（避光显色）；
⑧每孔加100μl的终止液；立刻于450nm波长处测定各孔的吸光度值，即OD450nm值。
⑨临界值（C.O.）的计算正常情况下，阳性对照孔OD450值≥0.4；阴性对照孔OD450值≤0.2；临界值=0.17+阴性对照孔均值；阴性对照孔OD450值大于0.2时应舍弃，如所有阴性对照孔OD450值都大于0.2时须重复实验；阴性对照孔低于0.05时以0.05计算。
⑩结果判定检测样品OD450值≥临界值，判定该检测样品为阳性；检测样品OD450值＜临界值，判定该检测样品为阴性。
实施例5：敏感性实验
具体的，参照实施例4的试剂盒使用方法，所述的试剂盒检测PRV阳性羊血清，当血清稀释至6400倍时，检测结果仍为阳性；而血清中和试验检测其最大稀释度为256。
实施例6：特异性实验
具体的，参照实施例4的试剂盒使用方法，检测PRV阴性羊血清（血清中和试验检测阴性）30份，所述的羊伪狂犬病毒抗体间接ELISA试剂盒检测结果均为阴性，表明所述的ELISA试剂盒具有好的特异性。
注：本次试验的阴性对照平均值为0.066，临界值为0.233。
实施例7：重复性实验
具体的，参照实施例4的试剂盒使用方法，所述的试剂盒检测6份PRV抗体水平不同的临床羊血清，每份血清平行做5个重复，得出批内重复性实验的变异系数为4.89%，小于5%（见表2）；选择5个不同批次的所述试剂盒分别检测6份临床羊血清，数据显示批间重复性实验的变异系数为8.68%，小于10%，综上所述，ELISA试剂盒具有好的重复性。
实施例8：稳定性实验
具体的，参照实施例4的试剂盒使用方法，选择4个相同批次的所述试剂盒分别37℃放置0d（4℃放置9d）、37℃放置3d、37℃放置6d、37℃放置9d，同时检测20份临床羊血清；37℃放置3d敏感性下降7.60%，37℃放置6d敏感性下降9.07%，均小于10%，37℃放置9d敏感性下降17.55%，均小于20%。加速破坏性试验显示，所述的ELISA试剂盒具有好的稳定性。
实施例9：符合率实验
具体的，参照实施例2的试剂盒使用方法，用所述的试剂盒与血清中和试验同时检测来自山东、河南等地的600份田间羊血清，敏感性为89.3%，特异性为93.0%，与血清中和试验的符合率达92.2%，试验表明所述的ELISA试剂盒具有好的符合率。
Claims (1)
1.一种检测羊伪狂犬病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包括以下组分：包被板、阳性对照、阴性对照、酶标结合物、样品稀释液、20×浓缩洗涤液、底物液、终止液、封口胶；
所述酶标结合物是由酶标抗体稀释液稀释2000倍的HRP标记的兔抗山羊IgG；
所述酶标抗体稀释液为NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，KH2PO40.2g，甘油20ml，小牛血清200ml，酪蛋白5g，蔗糖2g，TritonX-10010ml，硫柳汞0.1g，加纯水定容至1L；
所述样品稀释液包括NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，KH2PO40.2g，吐温-205ml，甘油10ml，小牛血清100ml，硫柳汞0.1g，加纯水定容至1L；
所述包被板由伪狂犬病毒的重组gD蛋白作为包被抗原，并由封闭液封闭，所述封闭液为NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，KH2PO40.2g，小牛血清100ml，蔗糖50g，明胶1g，酪蛋白2.5g，硫柳汞0.1g，加纯水定容至1L；
所述重组gD蛋白的表达和纯化包括如下步骤：1）根据GenBank公布的登录号为AY196984的PRVFa株的gD基因序列，设计引物序列如下：P1：5’-GGGGAATTCTACCCGTACAC-3’P2：5’-GGGCTCGAGCCTCAGGCGGA-3’2）通过PCR扩增PRVFa株gD基因，与pMD18-T克隆载体连接；3）双酶切重组质粒pMD18-T-gD，构建重组表达载体PET-32a-gD；4）重组表达载体PET-32a-gD转化感受态细胞BL21(DE3)，诱导表达，然后选用纯化设备，亲和柱进行亲和纯化；
所述20×浓缩洗涤液为NaCl80g，KCl2g，Na2HPO4·12H2O29g，KH2PO42g，吐温-205ml，加纯水定容至500ml；
所述终止液为1MH2SO4，所述底物液为可溶型单组分TMB底物液；
所述试剂盒还包括自封袋和使用说明书；
上述的一种检测羊伪狂犬病毒抗体的ELISA试剂盒的主要使用方法如下：（1）在A1和A2孔中分别加入100μl阴性对照；在A3和A4孔中分别加入100μl阳性对照；（2）取100μl经1：40稀释好的待检样品液加入相应孔中，并做好记录；37℃孵育1h；（3）将各孔的液体弃入废液桶，每孔加250μl的洗涤液进行洗板，重复5次，每次30s；（4）每孔加100μl酶标结合物；37℃孵育1h；（5）重复步骤（3）；（6）每孔加100μl底物液；（7）37℃避光显色孵育10min；（8）每孔加100μl的终止液；立刻于450nm波长处测定各孔的吸光度值，即OD450nm值；（9）临界值（C.O.）的计算正常情况下，阳性对照孔OD450值≥0.4；阴性对照孔OD450值≤0.2；临界值=0.17+阴性对照孔均值；阴性对照孔OD450值大于0.2时应舍弃，如所有阴性对照孔OD450值都大于0.2时须重复实验；阴性对照孔低于0.05时以0.05计算；（10）结果判定检测样品OD450值≥临界值，判定该检测样品为阳性；检测样品OD450值＜临界值，判定该检测样品为阴性。
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