CN112326975A - 心肌肌钙蛋白i、脑利钠肽和d-二聚体胸痛三联免疫荧光定量检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供心肌肌钙蛋白I、脑利钠肽和D‑二聚体胸痛三联免疫荧光定量检测试剂盒。用于心肌肌钙蛋白I、脑利钠肽和D‑二聚体联合定量检测的试剂盒，包括试剂条，所述试纸条包括衬底和衬底上依次粘贴的样品垫、CP垫、NC膜和吸收垫；所述CP垫包被有心肌肌钙蛋白I抗体、脑利钠肽抗体、D‑二聚体抗体和鸡IgY的荧光素标记偶合物；NC膜上分别设有包被有D‑dimer单克隆抗体、cTnI单克隆抗体、BNP单克隆抗体和兔抗鸡IgY单克隆抗体的检测线。本发明检测试剂盒，能够实现一次取样而同时快速、准确地对cTnI、BNP和D‑dimer进行定量检测，从而有效辅助临床对胸痛病人进行诊断和治疗。

Description

心肌肌钙蛋白I、脑利钠肽和D-二聚体胸痛三联免疫荧光定量 检测试剂盒
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，具体涉及心肌肌钙蛋白I、脑利钠肽和D-二聚体胸痛三联免疫荧光定量检测试剂盒。
背景技术
致命性胸痛是临床中常见的疾病，该疾病一旦发作，会快速进展，持续加重，如果不能得到及时诊治，会导致患者死亡。而急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)、急性主动脉夹层(acute aortic dissection,AAD)和急性肺栓塞(Acute PulmonaryEmbolism,APE)是临床上最常见的3种致命性胸痛疾病。对于致命性胸痛，越早抢救越能挽救患者的生命；然而临床诊疗中，受患者的临床表现不典型、病因复杂等影响，常会导致疾病误诊、漏诊，耽误患者及时治疗；因此在实际诊断中，快速准确鉴别AMI、AAD和APE，为临床治疗提供依据显得越发重要。研究发现，心肌肌钙蛋白I(cTnI)能够敏感的提示心肌损伤状态；脑利钠肽(BNP)是反应心功能的有效指标；D-二聚体(D-dimer)主要用于血栓情况检测。
心肌肌钙蛋白(cardiac troponin，cTn)是心肌肌肉收缩的调节蛋白，由心肌肌钙蛋白T(cTnT)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)和心肌肌钙蛋白C(cTnC)三种亚单位组成。cTnI和cTnT是心肌细胞特有的抗原。心肌细胞损伤后，血中出现cTnI、cTnT时间最早、持续时间长，cTnI、cTnT对心肌损伤具有很高的敏感度和特异性，并且cTnI较cTnT更敏感，而cTnI现已成为首选的心肌损伤标志物。
脑利钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)是利钠肽家族成员之一。利钠肽家族是由心房利钠肽(atrial natriureticpeptide,ANP)、BNP、C型利钠肽(C-typenatriuretic peptide,CNP)、D型利钠肽(D-type natriuretic peptide,DNP)和尿利钠肽(uro natriuretic peptide,UNP)等组成,其中ANP和BNP来源于心脏，为心脏激素，它们都有类似的环状结构,但氨基端和羧基端结构不相同,因此具有不同的生理功能。BNP于1988年首先在猪脑中发现,后来又在人的心脏中分离纯化出且发现其分泌量高于脑。研究发现,不同临床类型间BNP水平存在差异,心肌梗死组高于不稳定型心绞痛组和正常对照组,不稳定性心绞痛组亦高于正常对照组,表明ACS(急性冠状动脉综合征)患者入院早期血浆BNP水平即明显升高。Jernberg等发现在无ST段抬高的胸痛患者中,BNP水平与远期病死率强烈相关,更重要的是BNP水平可以预测肌钙蛋白I(TnI)阴性患者的病死率及心肌梗死事件。在2015年国家标准《冠状动脉疾病和心力衰竭时心脏标志物检测与临床应用》中，BNP作为重要心脏标志物用于ACS的危险分层以及心力衰竭的早期发现、诊断和预后评估等中，并发挥了重要作用。
D-dimer：D-dimer是纤维蛋白降解产物(FDPs)的一种，专指纤维蛋白被分解后的片段，其结构保留有纤维蛋白单体中的γ链交错分子结构。此交错分子结构在纤维蛋白中才有，而在纤维蛋白原中没有。因此，D-dimer可以说是唯一由纤维蛋白分解后的产物。血液中D-dimer升高暗示了两种含义：一是血中发生了纤维蛋白凝集；二是体内抗凝血机制已启动，已有纤维蛋白被切割分解。因此，D-dimer升高或者阳性是体内存在凝血及纤溶活性增强的重要分子标志物。对D-dimer进行检测，不仅对血栓栓塞性疾病、弥散性血管内凝血的早期诊断很有帮助；而且在心脑血管疾病(如心肌梗塞、心绞痛、高血压、冠心病、脑梗塞、脑出血等)等许多疾病的发生和发展过程中也具有重要意义：心脑血管疾病都有可能引起D-dimer升高，结合临床表现和其他检查，选择恰当时机动态监测D-dimer的变化，可为临床预防血栓形成，病情转归评估等提供有价值的信息，特别在胸痛早期对D-dimer进行检测，对心脑血管疾病的预防、诊治、病情转归评估等方面的意义更大。
但是，现有技术中对cTnI、BNP和D-dimer的检测试剂盒是以单检或二联检形式存在，缺乏能够高灵敏度地同时检测cTnI、BNP和D-dimer的检测试剂盒。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种心肌肌钙蛋白I、脑利钠肽和D-二聚体胸痛三联免疫荧光定量检测试剂盒，能够实现一次取样而同时快速、准确地对cTnI、BNP和D-dimer进行定量检测，从而有效辅助临床对胸痛病人进行诊断和治疗。
用于心肌肌钙蛋白I、脑利钠肽和D-二聚体联合定量检测的试剂盒，包括试剂条，所述试纸条包括衬底和衬底上依次粘贴的样品垫、CP垫、NC膜和吸收垫；所述CP垫包被有心肌肌钙蛋白I抗体、脑利钠肽抗体、D-二聚体抗体和鸡IgY的荧光素标记偶合物；NC膜上分别设有包被有D-dimer单克隆抗体、cTnI单克隆抗体、BNP单克隆抗体和兔抗鸡IgY单克隆抗体的检测线。
在本发明中，所述CP垫包被有心肌肌钙蛋白I抗体、脑利钠肽抗体、D-二聚体抗体的荧光素标记偶合物分别为Biospacific公司编号为A34703的心肌肌钙蛋白I抗体,Meridian公司编号为HM037A-1037B的脑利钠肽抗体、Biospacific公司编号为A38130的D-二聚体抗体的荧光素标记偶合物。
在本发明中，NC膜上分别设有包被有D-dimer单克隆抗体、cTnI单克隆抗体、BNP单克隆抗体分别为biospacific公司编号为A38150的D-dimer单克隆抗体、biospacific公司编号为A34704的cTnI单克隆抗体、meridian公司编号为HM037A-1037G的BNP单克隆抗体。
在本发明中，所述鸡IgY来源于武汉原谷生物科技有限责任公司，编号为BCB005的；兔抗鸡IgY单克隆抗体是武汉原谷生物科技有限责任公司编号AB-038B的抗体。
在本发明中，所述试纸条外侧设有卡壳，所述卡壳包括相互卡接的上卡壳和下卡壳，所述下卡壳设有放置试纸条的卡槽，所述上卡壳对应于试纸条的样品垫处设有加样口、对应于试纸条的NC膜处设有观测口，NC膜上的T1检测线、T2检测线、T3检测线和质控线C均暴露于观测口处。
在本发明中，所述试剂盒还包括带有心肌肌钙蛋白I、脑利钠肽和D-二聚体标准曲线的U盘。
在本发明中，所述试剂盒还包括样本稀释液，所述样本稀释液为PBS缓冲液。
本发明试剂盒的检测原理如下：将待检样本滴入测试卡的加样口内，在18℃下反应8min，待检样本中的cTnI、BNP和D-dimer与预先包被在CP垫上的cTnI mAb标记偶合物、BNP mAb标记偶合物和D-dimer mAb标记偶合物相结合，结合物在毛细作用力的效应下向另一端层析，随后其中的cTnI、BNP和D-dimer结合物会被固定在NC膜上相应测试区T1检测线的D-dimer单克隆抗体、T2检测线的cTnI单克隆抗体以及T3检测线的BNP单克隆抗体结合捕获，样本中的D-dimer、cTnI和BNP越多，T1、T2和T3检测线上积聚的结合物越多，荧光信号强度值就越强，反应捕获的D-dimer、cTnI和BNP数量就越多，荧光信号强度值反应了被捕获物的数量。反应结束后，通过瑞莱生物生产的免疫荧光检测仪(TZ310或TZ320)，在激发光波长777nm、接收光波长794nm条件下，检测T1、T2和T3检测线的荧光信号强度值，根据标准曲线得出待检样品中cTnI、BNP和D-dimer的浓度。
有益效果：
(1)本发明试剂盒，能够实现一次取样而同时快速、准确地对cTnI、BNP和D-dimer进行定量检测，从而有效辅助临床对胸痛病人进行诊断和治疗。本发明试剂盒具有较宽的检测范围和较低的检出限。从取样到检测到获取结果，时间短，对于患有致命性胸痛的病人，时间就是生命，尽快判断出病情从而对症治疗对挽救病人的生命至关重要；实现了一次取样，可检测三个指标，可极大的方便医生依据cTnI、BNP和D-dimer的检测结果，综合判断患者的病情。
(2)测试卡由卡壳和试纸条组合测试，保护了试条不受污染，还起到固定的作用，使得试条不易滑动，影响测定，也使得加样量流速均一，从而降低了CV值，提高了精密度，进一步提高了检测的准确性；另外该卡壳与检测设备能够配套使用，卡壳插入该检测设备相应的通道，使得自动稳定送样检测，进一步提高检测结果的准确性，蛋白含量测定值更加精确；荧光定量采用三种捕获抗体包被在硝酸纤维素膜上的方法实现三种蛋白的同时检测，真正意义上实现CP垫上的三种抗体偶合物都能被捕获在硝酸纤维素膜上，且能达到三种检测项目间不会相互干扰的目的，并能够最大限度地承载抗体量，提高其灵敏度，使得最终的检测线也更加均匀，不会出现深浅不一或不连续的现象，进一步降低了CV值，提高了其精密度；本发明可以同时快速灵敏检测特定蛋白含量，避免了复杂的操作，可以适应多种检测环境，并且所述检测设备具有打印功能，检测结果可以长期保存，便于对照分析，使检测更具有普遍性。
附图说明
图1卡壳的结构示意图，其中1-上卡壳，2-下卡壳，3-加样口，4-观测口，5-卡槽。
图2试纸条的结构示意图6-衬底，7-样品垫，8-CP垫，9-NC膜，10-吸收垫。
图3是cTnI标准曲线，横坐标为cTnI浓度(ng/ml)，纵坐标为T2/C。
图4.D-dimer标准曲线，横坐标为D-dimer浓度(mg/l)，纵坐标为T1/C。
图5.BNP标准曲线，横坐标为BNP浓度(pg/ml)，纵坐标为T3/C。
图6本发明试剂盒与贝克曼库尔特ACCESS 2全自动免疫分析系统检测血清样品中cTnI浓度结果的相关性。
图7本发明试剂盒与贝克曼库尔特ACCESS 2全自动免疫分析系统检测血清样品中BNP浓度结果的相关性。
图8本发明试剂盒与西门子全自动化学发光免疫分析仪检测血清样品中D-dimer浓度结果的相关性。
具体实施方式
实施例1用于心肌肌钙蛋白I、脑利钠肽和D-二聚体联合定量检测的试剂盒
1.试剂盒的组成及制备方法
用于心肌肌钙蛋白I、脑利钠肽和D-二聚体联合定量检测的试剂盒，包含：测试卡、带有标准曲线的U盘和样本稀释液。
(1)测试卡的结构
结合下图1和图2，说明测试卡的结构。
测试卡包括卡壳和设于卡壳内的试纸条。
试纸条包括衬底6和衬底上依次粘贴的样品垫7、CP垫8、NC膜9和吸收垫10。样品垫、CP垫、NC膜和吸收垫相邻的端部互相搭接。
卡壳包括相互卡接的上卡壳1和下卡壳2，下卡壳2的内表面设置有用于放置试纸条的卡槽5，上卡壳对应于试纸条的样品垫处设有加样口3、对应于试纸条的NC膜处设有观测口4，NC膜上的T1检测线、T2检测线、T3检测线和质控线C均暴露于观测口处。
卡壳不仅保护了试条，避免其受损污染，还起到固定的作用，使得试条不易出现滑动，影响测定。上下卡壳能够将试条固定且压紧，CP垫上的标记抗体和样品稀释液能够同步运行，保证液体流速均匀，从而进一步降低CV系数，提高精密度和准确性，同时操作方便，放平直接加样即可快速测试，对操作人员无硬性技术要求。另外该卡壳与检测设备能够配套使用，卡壳插入该检测设备(瑞莱生物生产的免疫荧光检测仪，TZ310或TZ320)相应的通道，然后自动稳定送样检测，进一步提高检测结果的准确性，蛋白含量测定值更加精确。
(2)试纸条的制备
①NC膜的制备
自样品垫至吸收垫方向，NC膜(硝酸纤维素膜)上依次等间隔设置有T1检测线、T2检测线、T3检测线和质控线C。T1检测线上包被有D-dimer单克隆抗体(购自Biospacific,产品编号A38150)，包被浓度为1mg/mL；T2检测线上包被cTnI单克隆抗体(购自Biospacific,产品编号A34704)，包被浓度为1mg/mL；T3检测线上包被BNP单克隆抗体(购自Meridian,产品编号HM037A-1037G)，包被浓度为1mg/mL；质控线C上包被兔抗鸡IgY单克隆抗体(购自武汉原谷生物科技有限责任公司，产品编号AB-038B)，包被浓度为0.2mg/mL。T1检测线与T2检测线之间、T2检测线与T3检测线之间、T3检测线与质控线C之间的距离均相同，便于划线，检测效果也好。
②CP垫的制备
将心肌肌钙蛋白I抗体、脑利钠肽抗体、D-二聚体抗体和鸡IgY分别标记生物素后与荧光素链霉亲和素相偶联并混合，然后喷在玻璃纤维滤膜上，制备得到CP垫。
按照如下方法将心肌肌钙蛋白I抗体与生物素进行偶联，得到生物素-cTnI mAb偶合物溶液，具体方法如下：在DPBS(杜氏磷酸盐缓冲液，购自HyClone，产品编号SH30028.02)中加入0.5mg心肌肌钙蛋白I抗体(购自Biospacific,产品编号A34703)，然后加入0.5mg生物素，然后用DPBS补足体积至250ul，旋涡混匀，迅速放入恒温培养振荡器中在25℃、600rpm条件下孵育一小时，将反应产物采用截留分子量为30KDa的超滤管进行超滤，取截留液，得到生物素-cTnI mAb偶合物溶液。
按照如下方法将脑利钠肽抗体与生物素进行耦合，得到生物素-BNP mAb偶合物溶液，具体方法如下：在DPBS(杜氏磷酸盐缓冲液，购自HyClone，产品编号SH30028.02)中加入0.6mg脑利钠肽抗体(购自Meridian,产品编号HM037A-1037B)，加入0.5mg生物素，然后用DPBS补足体积至250ul，旋涡混匀，迅速放入恒温培养振荡器中在25℃、600rpm条件下孵育一小时，将反应产物采用截留分子量为30KDa的超滤管进行超滤，取截留液，得到生物素-BNP mAb偶合物溶液。
按照如下方法将D-二聚体抗体与生物素进行耦合，得到生物素-D-dimer mAb偶合物溶液，具体方法如下：在DPBS(杜氏磷酸盐缓冲液，购自HyClone，产品编号SH30028.02)中加入0.55mg D-二聚体抗体(购自Biospacific,产品编号A38130)，然后加入0.5mg生物素，用DPBS补足体积至250ul，旋涡混匀，迅速放入恒温培养振荡器中在25℃、600rpm条件下孵育一小时，将反应产物采用截留分子量为30KDa的超滤管进行超滤，取截留液，得到生物素-D-dimer mAb偶合物溶液。
按照如下方法将鸡IgY与生物素进行耦合，得到生物素-鸡IgY偶合物溶液，具体方法如下：在DPBS(杜氏磷酸盐缓冲液，购自HyClone，产品编号SH30028.02)中加入0.4mg鸡IgY(购自武汉原谷生物科技有限责任公司，产品编号BCB005)，加入0.5mg生物素，然后用DPBS补足体积至250ul，旋涡混匀，迅速放入恒温培养振荡器中在25℃、600rpm条件下孵育一小时，将反应产物采用截留分子量为30KDa的超滤管进行超滤，取截留液，得到生物素-鸡IgY偶合物溶液。
采用Thermo scientific PierceTM Biotin Quantitation Kit检测生物素-cTnImAb偶合物溶液、生物素-BNP mAb偶合物溶液、生物素-D-dimer mAb偶合物溶液和生物素-鸡IgY偶合物溶液中平均每个抗体分子上标记的生物素的个数。结果如下：平均每个心肌肌钙蛋白I抗体上标记的生物素的个数是7.6，平均每个脑利钠肽抗体上标记的生物素的个数是6.8，平均每个D-二聚体抗体上标记的生物素的个数是7.2。平均每个鸡IgY上标记的生物素的个数是8.0。
将生物素-cTnI mAb偶合物与荧光素链霉亲和素偶合，具体方法如下：在DPBS中，加入生物素-cTnI mAb偶合物，在25℃、500rpm条件下震荡，然后迅速加入荧光素链霉亲和素(购自Thermo scientific,产品编号46421)进行反应，得到cTnI mAb标记偶合物。反应体系总体积为250ul，反应体系中生物素-cTnI mAb偶合物浓度为0.56mg/ml，荧光素链霉亲和素浓度为0.3mg/ml。
将生物素-BNP mAb偶合物与荧光素链霉亲和素偶合，具体方法如下：在DPBS中，加入生物素-BNP mAb偶合物，在25℃、500rpm条件下震荡，然后迅速加入荧光素链霉亲和素(购自Thermo scientific,产品编号46421)，得到BNP mAb标记偶合物。反应体系总体积为250ul，反应体系中生物素-BNP mAb浓度0.62mg/ml，荧光素链霉亲和素浓度0.3mg/ml。
将生物素-D-dimer mAb偶合物与荧光素链霉亲和素偶合，具体方法如下：在DPBS中，加入生物素-D-dimer mAb偶合物，在25℃、500rpm条件下震荡，然后迅速加入荧光素链霉亲和素(Thermo scientific,46421)，得到D-dimer mAb标记偶合物。反应体系总体积为250ul，反应体系中生物素-D-dimer mAb偶合物浓度为0.73mg/ml，荧光素链霉亲和素浓度为0.3mg/ml。
将生物素-IgY偶合物与荧光素链霉亲和素偶合，具体方法如下：在DPBS中，加入生物素-IgY偶合物，在25℃、500rpm条件下震荡，然后迅速加入荧光素链霉亲和素(Thermoscientific,46421)，得到鸡IgY标记偶合物。反应体系总体积为250ul，反应体系中生物素-IgY偶合物浓度为0.46mg/m，荧光素链霉亲和素浓度0.3mg/ml。
配制1000ul的CP包被液，是以QC-buffer为溶剂，配制的含有0.1mg/ml的cTnI mAb标记偶合物、0.15mg/ml的BNP mAb标记偶合物、0.13mg/ml的D-dimer mAb标记偶合物、0.07mg/ml鸡IgY标记偶合物的溶液。QC-buffer：是含有5％(质量百分浓度)人血清白蛋白、0.1％(质量百分浓度)PVP90、2％(质量百分浓度)海藻糖、0.5％(质量百分浓度)叠氮钠的水溶液。使用BIODOT包被机将CP包被液包被在玻璃纤维(尺寸是10mm×280mm)上，喷量是2.2ul/cm，喷好后放入真空干燥箱内处理至少24h，得到CP垫。
③样品垫的制备
处理液:是含有6.055mg/ml Tris base(三羟甲基氨基甲烷),1.2mg/ml的EDTA-Na2，2mg/ml Casein(酪蛋白)，8％(体积百分浓度)Tween-20和5％(质量百分浓度)海藻糖的水溶液，pH 7.2。
将聚酯纤维膜在处理液中浸泡处理后烘干而制得样品垫。该种方法制得的样品垫使用效果最好，阳性和阴性对照效果较好，使用检测设备进行测定，cTnI、BNP和D-dimer的cutoff值处均有明显的信号值，而阴性信号值为零，且不同浓度梯度的阳性标准品的信号值测试结果有着明显的梯度差异，浓度越大信号值越高。
④组装
将样品垫、CP垫、NC膜和吸收垫依次粘贴在衬底上，切条制成试条，并与相配套的卡壳组装。然后装入铝箔袋，再取一袋干燥剂装入铝箔袋中，用热封机封好铝箔袋。最终完成测试卡的制备。
吸收垫的材质为玻璃纤维和棉绒混合(购自Ahlstrom公司，货号：320)
衬底的材质为聚氯乙烯。
(3)带有标准曲线的U盘
U盘上带有cTnI标准曲线标准、D-dimer标准曲线和BNP标准曲线。
各物质标准曲线制作方法如下：
cTnI标准曲线的制作：以PBS(10mM，pH 7.2)为溶剂，将cTnI标准品(国际标准品，购买自NIST，产品编号SRM2921)配置成浓度分别为50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、2.5ng/ml、0.5ng/ml、0.1ng/ml的溶液。将各浓度的cTnI标准品溶液滴入测试卡的加样口内，然后放进瑞莱生物生产的免疫荧光检测仪(TZ310或TZ320)内，在18℃下反应8min。反应结束后，通过上述免疫荧光检测仪(TZ310或TZ320)，在激发光波长777nm、接收光波长794nm条件下，检测T2检测线的荧光信号强度(记为T2)和质控线C的荧光信号强度(记为C)。以标准品中cTnI浓度为横坐标，以T2/C为纵坐标，制作标准曲线，结果如图3，方程为y＝0.0275x+0.0232，R2＝0.9982，其中x为cTnI浓度，y为T2/C。cTnI的线性检测范围是0.1-50ng/ml。
D-dimer标准曲线的制作：以PBS(10mM，pH是7.2)为溶剂，将D-dimer标准品(国家标准品，产品编号GBW(E)090735)配置浓度分别为10mg/l、5mg/l、2.5mg/l、1.0mg/l、0.2mg/l、0.1mg/l的溶液。将各浓度的D-dimer标准品滴入测试卡的加样口内，然后放进瑞莱生物生产的免疫荧光检测仪(TZ310或TZ320)内，在18℃下反应8min。反应结束后，通过免疫荧光检测仪(TZ310或TZ320)，在激发光波长777nm、接收光波长794nm条件下，检测T1检测线的荧光信号强度(记为T1)和质控线C的荧光信号强度(记为C)，以标准品中D-dimer浓度为横坐标，以T1/C为纵坐标，制作标准曲线，结果如图4，方程为y＝0.1502x-0.0307，R2＝0.9951，其中x为D-dimer浓度，y为T1/C；D-dimer的线性检测范围是0.1-10mg/l。
BNP标准曲线的制作：将采集自胸痛患者含有高浓度BNP的血清样本，采用贝克曼库尔特ACCESS 2全自动免疫分析系统检测定值，然后用阴性血清稀释至BNP浓度分别为5000pg/ml、2500pg/ml、1000pg/ml、200pg/ml、40pg/ml、8pg/ml、1pg/ml溶液。将各浓度的BNP溶液滴入测试卡的加样口内，然后放进瑞莱生物生产的免疫荧光检测仪(TZ310或TZ320)内，在18℃下反应8min。反应结束后，通过免疫荧光检测仪(TZ310或TZ320)，在激发光波长777nm、接收光波长794nm条件下，检测T3检测线的荧光信号强度(记为T3)和质控线C的荧光信号强度(记为C)，以BNP浓度为横坐标，以T3/C为纵坐标，制作标准曲线，结果如图5，方程为y＝0.0007x+0.1171，R2＝0.9942，x为BNP浓度，y为T3/C。BNP的线性检测范围是1-5000pg/ml。
(4)样本稀释液
样本稀释液成分为PBS缓冲液(10mM，pH是7.2)，由购买自Amresco的PBS粉末(0780)直接溶于水制成：称取10g PBS粉末，加入适量水中待其完全溶解后定容至1L即可。
将本实施例制备的试剂盒记为本发明试剂盒。
2.本发明试剂盒的使用方法及检出限
测试时，将待检样本滴入测试卡的加样口内，将测试卡放入瑞莱生物生产的免疫荧光检测仪(TZ310或TZ320)内，在18℃反应8min，然后通过免疫荧光检测仪(TZ310或TZ320)，在激发光波长777nm、接收光波长794nm条件下，检测T1、T2和T3检测线的荧光信号强度值，再根据保存在U盘上的标准曲线计算，得到待检样本中D-dimer、cTnI和BNP的浓度。只有当质控线C处的荧光信号强度大于0.5的情况下，检测结果才算可信。
当样本浓度超过检测范围上限的时候，用稀释液对样本进行稀释后滴加至测试卡进行检测。目标物质浓度：将根据标准曲线计算所得结果乘以稀释倍数后得到。
按照常规方法，得到本发明试剂盒对cTnI的检出限(能检测出的最低浓度)为0.05ng/ml，对BNP的检出限为0.5pg/ml，对D-dimer的检出限为0.05mg/l。
实施例2本发明试纸条与其他试纸条的效果对比
分别制备对照试纸条1-4。
对照试纸条1的NC膜上等间隔设置有T2检测线和质控线。T2检测线上包被有cTnI单克隆抗体(购自华葵金配,产品编号A8H12)，包被浓度为1mg/mL。质控线上包被兔抗鸡IgY单克隆抗体(购自武汉原谷生物科技有限责任公司，产品编号AB-038B)，包被浓度为0.2mg/mL。按照实施例1中方法将心肌肌钙蛋白I抗体(购自华葵金配,产品编号F6B11)和鸡IgY(购自武汉原谷生物科技有限责任公司，产品编号BCB005)分别标记生物素后与荧光素链霉亲和素相偶联，混合后喷在玻璃纤维滤膜上，得到CP垫。然后按照本发明试纸条的组装方法制备得到仅仅能检测cTnI的对照试纸条1。
对照试纸条2仅仅用于检测BNP，NC膜上等间隔设置有T3检测线和质控线。T3检测线上包被BNP单克隆抗体(购自Hytest,产品编号4BNP2)，包被浓度为1mg/mL；质控线上包被兔抗鸡IgY单克隆抗体(购自武汉原谷生物科技有限责任公司，产品编号AB-038B)，包被浓度为0.2mg/mL。按照实施例1中方法将BNP抗体(购自格瑞林生物，产品编号901032)和鸡IgY(购自武汉原谷生物科技有限责任公司，产品编号BCB005)分别标记生物素后与荧光素链霉亲和素相偶联，混合后喷在玻璃纤维滤膜上，得到CP垫。然后按照本发明试纸条的组装方法制备得到仅仅能检测BNP的对照试纸条2。
对照试纸条3仅仅用于检测D-dimer。NC膜上等间隔设置有T1检测线和质控线。T1检测线上包被有D-dimer单克隆抗体(购自科赛格，产品编号CSB-DA220HmN①)，包被浓度为1mg/mL；质控线上包被兔抗鸡IgY单克隆抗体(购自武汉原谷生物科技有限责任公司，产品编号AB-038B)，包被浓度为0.2mg/mL。按照实施例1中方法分别将D-dimer单克隆抗体(购自科赛格，产品编号CSB-DA220HmN②)和鸡IgY(购自武汉原谷生物科技有限责任公司，产品编号BCB005)标记生物素后与荧光素链霉亲和素相偶联，混合后，喷在玻璃纤维滤膜上，得到CP垫。然后按照本发明试纸条的组装方法制备得到仅仅能检测D-dimer的对照试纸条3。
对照试纸条4同时检测cTnI、BNP和D-dimer。NC膜上依次等间隔设置有T1检测线、T2检测线、T3检测线和质控线，T1检测线上包被有D-dimer单克隆抗体(购自科赛格，产品编号CSB-DA220HmN①)，包被浓度为1mg/mL；T2检测线上包被cTnI单克隆抗体(购自华葵金配,产品编号A8H12)，包被浓度为1mg/mL；T3检测线上包被BNP单克隆抗体(购自Hytest,产品编号4BNP2)，包被浓度为1mg/mL；质控线上包被兔抗鸡IgY单克隆抗体(购自武汉原谷生物科技有限责任公司，产品编号AB-038B)，包被浓度为0.2mg/mL。按照实施例1中方法分别将D-dimer单克隆抗体(购自科赛格，产品编号CSB-DA220HmN②)、BNP抗体(购自格瑞林生物，产品编号901032)、心肌肌钙蛋白I抗体(购自华葵金配,产品编号F6B11)和鸡IgY(购自武汉原谷生物科技有限责任公司，产品编号BCB005)分别标记生物素后与荧光素链霉亲和素相偶联，混合后，喷在玻璃纤维滤膜上，得到CP垫。然后按照本发明试纸条的组装方法制备得到能同时检测cTnI、BNP和D-dimer的对照试纸条4。
分别检测上述对照试纸条1-4的线性检测范围和检出限。结果如表1。从表1可见，对照试纸条1-3线性检测范围和检出限与本发明试纸条相当，但是，将单检时的抗体结合起来，共同检测cTnI、BNP和D-dimer的对照试纸条4，检出限显著降低，说明三种物质共同检测时，存在干扰现象。
表1各试纸条的线性检出范围和检出限
Figure BDA0002760260070000101
实施例3采用本发明试剂盒检测血清样品
搜集110例胸痛患者的血清样本，用本发明试剂盒检测样本中的cTnI浓度，同时采用贝克曼库尔特ACCESS 2全自动免疫分析系统检测这些样本中的cTnI浓度,比较两者的数据相关性，结果如图6。
搜集110例胸痛患者的血清样本，用本发明试剂盒检测样本中BNP浓度，同时采用贝克曼库尔特ACCESS 2全自动免疫分析系统检测这些样本的BNP浓度,比较两者的数据相关性，结果如图7。
搜集110例胸痛患者的血清样本，用本发明试剂盒检测样本中D-dimer浓度，同时采用西门子全自动化学发光免疫分析仪(ADIVA Centaur XP Immunoassay System)检测这些样本中D-dimer浓度,比较两者的数据相关性，结果如图8。

Claims (7)

1.心肌肌钙蛋白I、脑利钠肽和D-二聚体联合定量检测试剂盒，其特征在于包括试纸条，所述试纸条包括衬底和衬底上依次粘贴的样品垫、CP垫、NC膜和吸收垫；所述CP垫包被有心肌肌钙蛋白I抗体、脑利钠肽抗体、D-二聚体抗体和鸡IgY的荧光素标记偶合物；NC膜上分别设有包被有D-dimer单克隆抗体、cTnI单克隆抗体、BNP单克隆抗体的检测线和包被有兔抗鸡IgY单克隆抗体的的质控线。
2.根据1所述试剂盒，其特征在于所述CP垫包被有心肌肌钙蛋白I抗体、脑利钠肽抗体、D-二聚体抗体的荧光素标记偶合物分别为Biospacific公司编号为A34703的心肌肌钙蛋白I抗体, Meridian公司编号为HM037A-1037B的脑利钠肽抗体、Biospacific公司编号为A38130的D-二聚体抗体的荧光素标记偶合物。
3.根据权利要求1或2所述试剂盒，其特征在于NC膜上包被的D-dimer单克隆抗体、cTnI单克隆抗体、BNP单克隆抗体分别为Biospacific公司编号为A38150的D-dimer单克隆抗体、Biospacific公司编号为A34704的cTnI单克隆抗体和Meridian公司编号为HM037A-1037G的BNP单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于所述鸡IgY来源于武汉原谷生物科技有限责任公司，编号为BCB005；兔抗鸡IgY单克隆抗体是武汉原谷生物科技有限责任公司编号AB-038B的抗体。
5.根据权利要求4所述试剂盒，所述试纸条外侧设有卡壳，所述卡壳包括相互卡接的上卡壳和下卡壳，所述下卡壳设有放置试纸条的卡槽，所述上卡壳对应于试纸条的样品垫处设有加样口、对应于试纸条的NC膜处设有观测口，NC膜上的检测线和质控线均暴露于观测口处。
6.其特征在于所述试剂盒还包括带有心肌肌钙蛋白I、脑利钠肽和D-二聚体标准曲线的U盘。
7.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括样本稀释液，所述样本稀释液为PBS缓冲液。
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