CN115575645A - 一种三联免疫荧光定量检测卡及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种三联免疫荧光定量检测卡及试剂盒，所述检测卡包括试剂条，所述试剂条包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘附至底板上，所述结合垫上吸附有cTnI抗体‑荧光微球偶联物、sST2抗体‑荧光微球偶联物、D‑二聚体抗体‑荧光微球偶联物；所述硝酸纤维素膜上按样品流动方向从前到后依次具有包被有识别sST2另一个表位的单克隆抗体的T1检测线、包被有识别cTnI另一个表位的单克隆抗体的T2检测线、包被有识别D‑二聚体的另一个表位的单克隆抗体的T3检测线和质控线C。本发明可同时得到cTnI、sST2和D‑dimer三个项目的检测结果，简单高效。

Description

一种三联免疫荧光定量检测卡及试剂盒
本申请要求申请号为202211145766X专利申请的优选权(在先申请的申请日为2022年9月20日，发明名称为一种三联免疫荧光定量检测卡及试剂盒)。——应用于优先权
技术领域
本发明属于荧光免疫检测技术领域，涉及一种三联免疫荧光定量检测卡及试剂盒，尤其是涉及一种心肌肌钙蛋白I、可溶性生长刺激表达因子2、D-二聚体三联免疫荧光定量检测卡及试剂盒。
背景技术
荧光免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术，该技术以固定有检测线(包被抗体或包被抗原)和质控线(抗抗体)的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，荧光标记抗体或抗原固定于连接垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。对于带有多个抗原决定簇的大分子抗原(蛋白、病毒、致病菌等)，通常采用“三明治”型双抗夹心免疫层析方法，即待测物在流动相作用下先与荧光标记抗体结合，当到达检测线时再与包被抗体结合形成双抗夹心的“三明治”型。对于只具有单一抗原表位的小分子抗原(农兽药、违禁药物等)，待测小分子抗原与荧光标记抗体结合后，由于空间位阻作用难以再与检测线上的包被抗体结合。所以，具有单一抗原表位的小分子待测物多采用竞争免疫层析法检测。
致命性胸痛是临床中常见的疾病，该疾病一旦发作，会快速发展，持续加重，如果不能得到及时诊治，会导致患者死亡。急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)、急性主动脉夹层(acute aortic dissection，AAD)和急性肺栓塞(acute pulmonaryembolism，APE)是临床上最常见的3种致命性胸痛疾病。对于致命性胸痛，越早抢救越能挽救患者的生命。在临床诊断中，受患者的临床表现不典型、病因复杂等影响，常会导致疾病误诊、漏诊，耽误患者及时治疗；因此在实际诊断中，快速准确鉴别3种致命性胸痛疾病，为临床治疗提供依据显得越发重要。研究发现，心肌肌钙蛋白(cTnI)能够敏感的提示心肌损伤状态；sST2是预测急性失代偿性心力衰竭、慢性心力衰竭、心肌梗死患者中短期死亡率的独立指标；D-二聚体(D-dimer)主要用于血栓情况监测。
心肌肌钙蛋白(cardiac troponin，cTn)是心肌肌肉收缩的调节蛋白，由心肌肌钙蛋白T(cTnT)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)和心肌肌钙蛋白C(cTnC)三种亚单位组成。心肌细胞损伤后，cTnI和cTnT在循环血中较早出现并能持续较长时间。相对于cTnT而言，cTnI显示出较低的初始灵敏性和较高的特异性。CTnI是目前存在于心肌上而非骨骼肌上的肌钙蛋白，具有高度的心肌特异性和灵敏度，已经成为目前最理想的心肌梗死标志物。
ST2(可溶性生长刺激表达因子2)是白介素I(IL-4)受体家族的成员，具有跨膜(ST2L)和可溶性(sST2)两种存在方式。作为Th2淋巴细胞的表面标志物之一，ST2L具有免疫调节功能，在T细胞介导的免疫性疾病如哮喘和类风湿性关节炎中发挥重要作用，而使用ST2L封闭性抗体或sST2则会阻断ST2L与配体结合从而下调Th2淋巴细胞功能，提示sST2具有抑制炎症反应的作用。在心力衰竭发生发展过程中，心肌压力负荷过重导致心肌细胞肥大、心肌纤维化和心室重塑是主要的病理生理变化。动物模型实验验证了IL-33/ST2L信号通路是一个力学激活系统，能够控制心肌细胞肥大和心脏纤维化从而发挥保护心脏的作用，而sST2能作为诱骗受体与IL-33结合，阻止IL-33/ST2L信号通路。因此sST2在心力衰竭发展中的机制和sST2测定值的临床意义广泛引起关注并得到一系列的实证。2013版ACC/AHA HF指南和2014中国心力衰竭诊断和治疗指南将sST2引入生物标志物的推荐中。sST2浓度对HF和ACS患者具有预后判断作用，最新版美国HF指南已将其推荐为可提供附加危险分层价值的生物标志物。除HF和ACS外，最新临床研究显示，sST2浓度还与高血压、肺动脉高压等疾病相关。
D-二聚体是纤维蛋白降解产物(FDPs)的一种，专指纤维蛋白被分解后的片段，其结构保留有纤维蛋白单体中的γ链交错分子结构。此交错分子结构在纤维蛋白中才有，而在纤维蛋白原中没有。因此，D-二聚体可以说是唯一由纤维蛋白分解后的产物。血液中D-二聚体升高暗示了两种含义：一是血中发生了纤维蛋白凝集；二是体内抗凝血机制已启动，已有纤维蛋白被切割分解。因此，D-二聚体升高或者阳性是体内存在凝血及纤溶活性增强的重要分子标志物。对D-二聚体进行检测，不仅对血栓栓塞性疾病、弥散性血管内凝血的早期诊断很有帮助；而且在心脑血管疾病(如心肌梗塞、心绞痛、高血压、冠心病、脑梗塞、脑出血等)等许多疾病的发生和发展过程中也具有重要意义：心脑血管疾病都有可能引起D-二聚体升高，结合临床表现和其他检查，选择恰当时机动态监测D-二聚体的变化，可为临床预防血栓形成，病情转归评估等提供有价值的信息，特别在胸痛早期对D-二聚体进行检测，对心脑血管疾病的预防、诊治、病情转归评估等方面的意义更大。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种三联免疫荧光定量检测卡及试剂盒，特别是提供一种心肌肌钙蛋白I、可溶性生长刺激表达因子2、D-二聚体三联免疫荧光定量检测卡及试剂盒。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种心肌肌钙蛋白I、可溶性生长刺激表达因子2、D-二聚体三联免疫荧光定量检测卡，所述检测卡包括试剂条，所述试剂条包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘附至底板上，所述结合垫上吸附有心肌肌钙蛋白I抗体-荧光微球偶联物、可溶性生长刺激表达因子2抗体-荧光微球偶联物、D-二聚体抗体-荧光微球偶联物；所述硝酸纤维素膜上按样品流动方向从前到后依次具有包被有识别可溶性生长刺激表达因子2(ST2)另一个表位的单克隆抗体的T1检测线、包被有识别心肌肌钙蛋白I(cTnI)另一个表位的单克隆抗体的T2检测线、包被有识别D-二聚体的另一个表位的单克隆抗体的T3检测线和质控线C。
本发明的三联免疫荧光定量检测卡能够实现一次取样而同时能快速、准确的对cTnI、sST2、D-二聚体进行定量检测，从而有效辅助临床上对胸痛病人进行诊断和治疗。本发明试剂盒有较宽的检测范围和较低的检测限，从取样到检测到获得结果，所需时间短，尽快判断出病情从而对症治疗对挽救病人的生命至关重要，实现了一次取样，可检测3个指标，极大的方便医生依据cTnI、sST2和D-dimer的检测结果，综合判断患者的病情。
在本发明中，所述T1、T2和T3三条检测线有特定的物质对应位置关系，本发明中包被有可溶性生长刺激表达因子2(ST2)单克隆抗体的为T1检测线，在硝酸纤维素膜上按样品流动方向位于最前面，包被有心肌肌钙蛋白I(cTnI)单克隆抗体的T2检测线位于中间，而包被有D-二聚体单克隆抗体的T3检测线位于最后面。这样的检测线顺序的设置能够保证检测快速准备的效果。
优选地，所述T1检测线与T2检测线之间、T2检测线与T3检测线之间、T3检测线与质控线C之间的距离均相等。在这样的情况下，一方面便于划线，另一方面也能保证检测效果的准确性，如果各条线之间的间距不相同，则会导致检测准确度问题。
优选地，所述T1检测线与T2检测线之间、T2检测线与T3检测线之间、T3检测线与质控线C之间的距离均相等，且所述距离为0.5-0.6cm。如果各条线之间的距离小于0.5cm，则影响仪器判读的准确度，如果各条线之间的距离大于0.6cm，则可能导致组装试剂条的时候检测线和质控线不在窗口范围内，影响判读。
优选地，所述T1检测线上包被的识别可溶性生长刺激表达因子2另一个表位的单克隆抗体的量为0.25-4μg/cm(例如0.25μg/cm、0.5μg/cm、0.8μg/cm、1μg/cm、1.5μg/cm、1.8μg/cm、2.0μg/cm、2.5μg/cm、3μg/cm、3.5μg/cm或4μg/cm)；所述T2检测线上包被的心肌肌钙蛋白I另一个表位的单克隆抗体的的量为0.25-4μg/cm(例如0.25μg/cm、0.5μg/cm、0.8μg/cm、1μg/cm、1.5μg/cm、1.8μg/cm、2.0μg/cm、2.5μg/cm、3μg/cm、3.5μg/cm或4μg/cm)；所述T3检测线上包被的识别D-二聚体的另一个表位的单克隆抗体的量为0.25-4μg/cm(例如0.25μg/cm、0.5μg/cm、0.8μg/cm、1μg/cm、1.5μg/cm、1.8μg/cm、2.0μg/cm、2.5μg/cm、3μg/cm、3.5μg/cm或4μg/cm)。
优选地，所述结合垫上吸附的心肌肌钙蛋白I抗体-荧光微球偶联物的量为0.05-0.15μg/cm(例如0.05μg/cm、0.08μg/cm、0.1μg/cm、0.12μg/cm、0.14μg/cm或0.15μg/cm)，吸附的可溶性生长刺激表达因子2抗体-荧光微球偶联物的量为0.05-0.15μg/cm(例如0.05μg/cm、0.08μg/cm、0.1μg/cm、0.12μg/cm、0.14μg/cm或0.15μg/cm)，吸附的D-二聚体抗体-荧光微球偶联物的量为0.05-0.15μg/cm(例如0.05μg/cm、0.08μg/cm、0.1μg/cm、0.12μg/cm、0.14μg/cm或0.15μg/cm)。
在本发明中，所述荧光微球为基于PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)的磷光微球，例如可以为CN101787276A或CN101805483A中公开的磷光微球。
在本发明中，如果结合垫上所述三种抗体-荧光微球偶联的吸附量太少，则会灵敏度降低，如果吸附量太高，则会信号太强，检测梯度分不开。
优选地，所述质控线C为包被驴抗鸡IgY单克隆抗体的质控线。
优选地，所述质控线C上驴抗鸡IgY单克隆抗体的包被量为0.125-2μg/cm，例如0.125μg/cm、0.2μg/cm、0.5μg/cm、0.8μg/cm、1μg/cm、1.2μg/cm、1.4μg/cm、1.5μg/cm、1.7μg/cm、1.9μg/cm或2μg/cm。
优选地，所述底板为PVC底板。
优选地，所述样品垫为利用处理液浸泡玻璃纤维素膜后烘干得到的样品垫，所述处理液为含有6.055mg/mL三羟甲基氨基甲烷以及含有质量百分比浓度为5％的海藻糖的水溶液，其pH为7.4。
优选地，所述吸水垫为脱脂棉吸水垫、硅胶吸水垫或海绵吸水垫中的任意一种。
优选地，所述检测卡还包括卡壳，所述卡壳包括相互卡接的上卡壳和下卡壳，下卡壳的内表面设置有用于放置所述试纸条的卡槽，上卡壳对应于试纸条的样品垫处设有加样口、对应于试纸条的硝酸纤维素膜处设有观测口，硝酸纤维素膜上的T1检测线、T2检测线、T3检测线和质控线C均暴露于观测口处。
在本发明中，卡壳不仅保护了试条，避免其受损污染，还起到固定的作用，使得试条不易出现滑动，影响测定。上下卡壳能够将试条固定且压紧，CP垫上的标记抗体和样品稀释液能够同步运行，保证液体流速均匀，从而进一步降低CV系数，提高精密度和准确性，同时操作方便，放平直接加样即可快速测试，对操作人员无硬性技术要求。另外该卡壳与检测设备能够配套使用，卡壳插入该检测设备(光景生物科技(苏州)有限公司生产的免疫荧光检测仪，LTRIC-600)相应的通道，然后自动稳定送样检测，进一步提高检测结果的准确性，蛋白含量测定值更加精确。且检测设备具有打印功能，检测结果可以长期保存，便于对照分析，使检测更具有普遍性。
本发明真正意义上实现结合垫上的三种抗体偶联物都能被捕获在硝酸纤维素膜上，达到三种检测项目间不会相互干扰的目的，最大限度的承载抗体量，提高灵敏度，使得最终的检测线更加均匀，不会出现深浅不一或不连续的现象，降低CV值，提高精密度；同时快速检测特定蛋白含量，避免复杂的操作，适应多种检测环境。
在本发明中，所述心肌肌钙蛋白I、可溶性生长刺激表达因子2、D-二聚体三联免疫荧光定量检测卡可以通过现有技术制备得到。示例性地，可以通过如下制备方法制备得到：
①NC膜的制备
自样品垫至吸水垫方向，NC膜(硝酸纤维素膜)上依次等间隔设置有T1检测线、T2检测线、T3检测线和质控线C。
T1检测线上包被有识别sST2另一个表位的单克隆抗体(购自博岳生物科技有限公司，产品编号IP181129；T2检测线上包被识别cTnI另一个表位的单克隆抗体(购自Hytest,产品编号4T27cc)；T3检测线上包被识别D-dimer另一个表位的单克隆抗体(购自罗氏，产品编号Roche 1.2)。质控线C上包被驴抗鸡IgY单克隆抗体(购自Fitzgerald，产品编号41R-ID002)。
首先得到浓度为1mg/mL的T1检测线、T2检测线、T3检测线上使用的各个单克隆抗体的溶液；以及浓度为0.5mg/mL的质控线C包被抗体的溶液。在点膜仪上以0.25～4.0μL/cm的喷量在硝酸纤维素膜上划线。
②结合垫的制备
结合垫包被有cTnI抗体标记物、sST2抗体标记物和D-dimer抗体标记物。
cTnI、sST2和D-dimer联合检测试剂条结合垫的制备方法：具体制备步骤包括：
1)抗体标记：抗体标记荧光微球：微球活化：向1mg/mL荧光微球中加入用50mM，pH7.0MES(2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物)溶解的5mg EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)和5mg NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，活化60min，15000rpm离心30min，弃上清，沉淀用pH7.0的50mM PBS(磷酸盐缓冲液)重悬，得到1mg/mL活化的荧光微球溶液；抗体偶联：将1.0mgcTnI、sST2和D-dimer标记抗体分别加入1mg/mL活化的荧光微球溶液2mL中，室温混匀1h，15000rpm离心30min，弃上清，沉淀用含5mg BSA(牛血清白蛋白)的50mM PBS(磷酸盐缓冲液)溶液封闭1h，搅拌混匀，15000rpm离心30min，收集的沉淀保存于pH7.0含0.5％BSA(牛血清白蛋白)的20mM Tris缓冲液中，得到浓度为0.1mg/mL cTnI抗体标记荧光微球溶液、0.1mg/mL sST2抗体标记荧光微球溶液、0.1mg/mL D-dimer抗体标记荧光微球溶液；
2)结合垫制作：将步骤1)中得到的cTnI抗体标记物、sST2抗体标记物、D-dimer抗体标记物喷涂在结合膜材上，使得结合垫上吸附的cTnI抗体标记荧光微球、sST2抗体标记荧光微球、D-dimer抗体标记荧光微球的量为0.05-0.15μg/cm，得到的结合垫干燥备用。
③样品垫的制备
处理液：含有6.055mg/mL Tris base(三羟甲基氨基甲烷)，5％(质量百分浓度)海藻糖的水溶液，pH 7.4。
将玻璃纤维素膜在处理液中浸泡处理后烘干而制得样品垫。该种方法制得的样品垫使用效果最好，阳性和阴性对照效果较好，使用检测设备进行测定，cTnI、sST2和D-dimer的cutoff值处均有明显的信号值，而阴性信号值为零，且不同浓度梯度的阳性标准品的信号值测试结果有着明显的梯度差异，浓度越大信号值越高。
④组装
将样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫依次搭接地粘贴在底板上且分别部分重合，即得cTnI、sST2和D-dimer联合检测试剂条；将黏贴有样品垫、结合垫、分析膜和吸收垫的PVC底板裁切成长度为7.5cm，宽度为4mm的纸条，并装入卡壳以及包装中，即得cTnI、sST2和D-dimer联合检测试剂条；试剂条可装入任意形式外卡壳，也可不装外卡壳直接使用。
另一方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的心肌肌钙蛋白I、可溶性生长刺激表达因子2、D-二聚体三联免疫荧光定量检测卡。
优选地，所述试剂盒还包括定标卡。
优选地，所述定标卡带有心肌肌钙蛋白I(cTnI)标准曲线、可溶性生长刺激表达因子2(sST2)标准曲线和D-二聚体(D-dimer)标准曲线。
在本发明中，所述标准曲线可以采用如下方法制备得到。
cTnI标准曲线的制作：以PBS(10mM，pH 7.2)为溶剂，将cTnI标准品(国际标准品，购买自NIST，产品编号SRM2921)配置成浓度分别为25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.12ng/mL、1.56ng/mL、0.78ng/mL、0.39ng/mL、0.19ng/mL、0.1ng/mL、0.05ng/mL的溶液。将各浓度的cTnI标准品溶液滴入测试卡的加样口内，，在室温反应15min。反应结束后，放进光景生物生产的免疫荧光检测仪(LTRIC-600)内,，通过免疫荧光检测仪(LTRIC-600)，在激发光波长405nm、接收光波长675nm条件下，检测T2检测线的荧光信号强度(记为T2)和质控线C的荧光信号强度(记为C)。以标准品中cTnI浓度为横坐标，以T2/C为纵坐标，制作标准曲线，结果如图2，方程为y＝0.5325x+0.3036，R2＝0.9942，其中x为cTnI浓度，y为T2/C。cTnI的线性检测范围是0.1-25ng/mL。
sST2标准曲线的制作：将采集自胸痛患者含有高浓度sST2的血清样本，采用贝克曼库尔特ACCESS 2全自动免疫分析系统检测定值，然后用阴性血清稀释至sST2浓度分别为300ng/mL、150ng/mL、80ng/mL、40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL溶液。将各浓度的sST2溶液滴入测试卡的加样口内，在室温反应15min。反应结束后，放进光景生物生产的免疫荧光检测仪(LTRIC-600)内,，通过免疫荧光检测仪(LTRIC-600)，在激发光波长405nm、接收光波长675nm条件下，检测T1检测线的荧光信号强度(记为T1)和质控线C的荧光信号强度(记为C)，以sST2浓度为横坐标，以T1/C为纵坐标，制作标准曲线，结果如图3，方程为y＝0.0479x+0.0082，R2＝0.999，x为sST2浓度，y为T1/C。sST2的线性检测范围是2.5-300ng/mL。
D-dimer标准曲线的制作：以PBS(10mM，pH是7.2)为溶剂，将D-dimer标准品(国家标准品，产品编号GBW(E)090735)配置浓度分别为15.00mg/L、7.50mg/L、3.75mg/L、1.88mg/L、0.94mg/L、0.47mg/L、0.23mg/L的溶液。将各浓度的D-dimer标准品滴入测试卡的加样口内，在室温反应15min。反应结束后，放进光景生物生产的免疫荧光检测仪(LTRIC-600)内,，通过免疫荧光检测仪(LTRIC-600)，在激发光波长405nm、接收光波长675nm条件下，检测T3检测线的荧光信号强度(记为T3)和质控线C的荧光信号强度(记为C)，以标准品中D-dimer浓度为横坐标，以T3/C为纵坐标，制作标准曲线，结果如图4，方程为y＝0.3526x+0.1224，R2＝0.9982，其中x为D-dimer浓度，y为T1/C；D-dimer的线性检测范围是0.23-15mg/L。
优选地，所述试剂盒还包括样本稀释液，样本稀释液成分为生理盐水。
所述生理盐水通过如下方法制备：称取9g NaCl粉末，加入到适量水中完全溶解后定容至1L。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明试剂盒，能够实现一次取样而同时能快速、准确的对cTnI、sST2、D-二聚体进行定量检测，从而有效辅助临床上对胸痛病人进行诊断和治疗。本发明试剂盒有较宽的检测范围和较低的检测限。cTnI线性范围：0.1-25ng/mL，检测限0.05ng/mL；sST2线性范围：2.5-300ng/mL，检测限1.5ng/mL；D-二聚体线性范围：0.23-15mg/L，检测限0.2mg/L。从取样到检测到获得结果，所需时间短，尽快判断出病情从而对症治疗对挽救病人的生命至关重要，实现了一次取样，可检测3个指标，极大的方便医生依据cTnI、sST2和D-二聚体的检测结果，综合判断患者的病情。
(2)本发明可以实现一份样本，一次加样，一次检测，同时得到cTnI、sST2和D-dimer三个项目的检测结果，简化操作步骤，减少样本用量，节约时间，节省成本。并且可检样本种类多，包含血清、血浆、全血和末梢血的样本，且无需对样本进行前处理，操作简便，方便快捷。
附图说明
图1为本发明中检测卡中试纸条的结构示意图，其中1为样品垫，2为结合垫，3为NC膜，4为吸水垫，5为PVC底板，31为检测线T1、T2和T3，32为质控线C；
图2为cTnI标准曲线图；
图3为sST2标准曲线图；
图4为D-dimer标准曲线图；
图5为利用实施例1的试剂盒以及利用奥森多系统检测样本中的cTnI浓度的数据相关性结果图；
图6为利用实施例1的试剂盒以及利用Critical Diagnostics系统检测样本中的sST2浓度的数据相关性结果图；
图7为利用实施例1的试剂盒以及利用西森美康免疫比浊系统检测样本中的D-dimer浓度的数据相关性结果图；
图8为利用实施例1的试剂盒检测样本中的cTnI浓度得到的结果图；
图9为利用实施例1的试剂盒检测样本中的sST2浓度得到的结果图；
图10为利用实施例1的试剂盒检测样本中的D-dimer浓度得到的结果图；
图11为利用实施例2的试剂盒检测样本中的cTnI浓度得到的结果图；
图12为利用实施例2的试剂盒检测样本中的sST2浓度得到的结果图；
图13为利用实施例2的试剂盒检测样本中的D-dimer浓度得到的结果图；
图14为利用对比例2的试剂盒检测样本中的sST2浓度得到的结果图；
图15为利用对比例2的试剂盒检测样本中的cTnI浓度得到的结果图；
图16为利用对比例2的试剂盒检测样本中的D-dimer浓度得到的结果图；
图17为利用对比例4的试剂盒检测样本中的sST2浓度得到的结果图；
图18为利用对比例4的试剂盒检测样本中的cTnI浓度得到的结果图；
图19为利用对比例4的试剂盒检测样本中的D-dimer浓度得到的结果图；
图20为利用对比例5的试剂盒检测样本中的sST2浓度得到的结果图；
图21为利用对比例5的试剂盒检测样本中的cTnI浓度得到的结果图；
图22为利用对比例5的试剂盒检测样本中的D-dimer浓度得到的结果图；
图23为利用对比例6的试剂盒检测样本中的cTnI浓度得到的结果图；
图24为利用对比例7的试剂盒检测样本中的D-Dimer浓度得到的结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
在以下实施例中使用的荧光微球为CN101787276A中实施例制备的聚甲基丙烯酸甲酯钯磷光微球。
实施例1
本实施例中提供一种检测卡，所述检测卡包括卡壳和试剂条，试剂条包括PVC底板5和PVC底板上依次粘贴的样品垫1、结合垫2、NC膜3和吸水垫4。样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫相邻的端部互相搭接。检测线T1、T2、T3为31；质控线C为32。
卡壳包括相互卡接的上卡壳和下卡壳，下卡壳的内表面设置有用于放置试纸条的卡槽，上卡壳对应于试纸条的样品垫处设有加样口、对应于试纸条的NC膜处设有观测口，NC膜上的T1检测线、T2检测线、T3检测线和质控线C均暴露于观测口处。
试剂条的制备
①NC膜的制备
自样品垫至吸水垫方向，NC膜(硝酸纤维素膜)上依次等间隔设置有T1检测线、T2检测线、T3检测线和质控线C，每条检测线之间的间距为0.5cm。
T1检测线上包被有识别sST2另一个表位的单克隆抗体(购自博岳生物科技有限公司，产品编号IP181129；T2检测线上包被识别cTnI另一个表位的单克隆抗体(购自Hytest,产品编号4T27cc)；T3检测线上包被识别D-dimer另一个表位的单克隆抗体(购自罗氏，产品编号Roche 1.2)。质控线C上包被驴抗鸡IgY单克隆抗体(购自Fitzgerald，产品编号41R-ID002)。首先得到浓度为1mg/mL的T1检测线、T2检测线、T3检测线上使用的各个单克隆抗体的溶液；以及浓度为0.5mg/mL的质控线C包被抗体的溶液。在点膜仪上以1.0μL/cm的喷量在硝酸纤维素膜上划线。
②结合垫的制备
结合垫包被有cTnI抗体标记物、sST2抗体标记物和D-dimer抗体标记物。
cTnI、sST2和D-dimer联合检测试剂条结合垫的制备方法：具体制备步骤包括：
1)抗体标记：抗体标记荧光微球：微球活化：向1mg/mL荧光微球中加入用50mM，pH7.0MES(2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物)溶解的5mg EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)和5mg NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，活化60min，15000rpm离心30min，弃上清，沉淀用pH7.0的50mM PBS(磷酸盐缓冲液)重悬，得到1mg/mL活化的荧光微球溶液；抗体偶联：将1.0mgcTnI、sST2和D-dimer标记抗体分别加入1mg/mL活化的荧光微球溶液2mL中，室温混匀1h，15000rpm离心30min，弃上清，沉淀用含5mg BSA(牛血清白蛋白)的50mM PBS(磷酸盐缓冲液)溶液封闭1h，搅拌混匀，15000rpm离心30min，收集的沉淀保存于pH7.0含0.5％BSA(牛血清白蛋白)的20mM Tris缓冲液中，得到浓度为0.1mg/mL cTnI抗体标记荧光微球溶液、0.1mg/mL sST2抗体标记荧光微球溶液、0.1mg/mL D-dimer抗体标记荧光微球溶液；
2)结合垫制作：将步骤1)中得到的cTnI抗体标记物、sST2抗体标记物、D-dimer抗体标记物喷涂在结合膜材上，使得结合垫上结合的cTnI抗体标记荧光微球、sST2抗体标记荧光微球、D-dimer抗体标记荧光微球的结合量均为0.1μg/cm，而后将结合垫干燥备用。
③样品垫的制备
处理液：含有6.055mg/mL Tris-base(三羟甲基氨基甲烷)，5％(质量百分浓度)海藻糖的水溶液，pH 7.4。
将玻璃纤维素膜在处理液中浸泡处理后烘干而制得样品垫。该种方法制得的样品垫使用效果最好，阳性和阴性对照效果较好，使用检测设备进行测定，cTnI、sST2和D-dimer的cutoff值处均有明显的信号值，而阴性信号值为零，且不同浓度梯度的阳性标准品的信号值测试结果有着明显的梯度差异，浓度越大信号值越高。
④组装
将样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫依次搭接地粘贴在底板上且分别部分重合，即得cTnI、sST2和D-dimer联合检测试剂条；将黏贴有样品垫、结合垫、分析膜和吸收垫的PVC底板裁切成长度为7.5cm，宽度为4mm的纸条，并装入卡壳以及包装中，即得cTnI、sST2和D-dimer联合检测试剂条。将试剂条装入卡壳。
另外，本实施例还提供一种试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的检测卡，还包括定标卡和样本稀释液。
定标卡带有cTnI标准曲线、sST2标准曲线和D-dimer标准曲线。
cTnI标准曲线的制作：以PBS(10mM，pH 7.2)为溶剂，将cTnI标准品(国际标准品，购买自NIST，产品编号SRM2921)配置成浓度分别为25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.12ng/mL、1.56ng/mL、0.78ng/mL、0.39ng/mL、0.19ng/mL、0.1ng/mL、0.05ng/mL的溶液。将各浓度的cTnI标准品溶液滴入测试卡的加样口内，在室温反应15min。反应结束后，放进光景生物生产的免疫荧光检测仪(LTRIC-600)内,，通过免疫荧光检测仪(LTRIC-600)，在激发光波长405nm、接收光波长675nm条件下，检测T2检测线的荧光信号强度(记为T2)和质控线C的荧光信号强度(记为C)。以标准品中cTnI浓度为横坐标，以T2/C(荧光信号强度比值)为纵坐标，制作标准曲线，结果如图2，方程为y＝0.5325x+0.3036，R2＝0.9942，其中x为cTnI浓度，y为T2/C。cTnI的线性检测范围是0.1-25ng/mL。
sST2标准曲线的制作：将采集自胸痛患者含有高浓度sST2的血清样本，采用贝克曼库尔特ACCESS 2全自动免疫分析系统检测定值，然后用阴性血清稀释至sST2浓度分别为300ng/mL、150ng/mL、80ng/mL、40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL溶液。将各浓度的sST2溶液滴入测试卡的加样口内，在室温反应15min。反应结束后，放进光景生物生产的免疫荧光检测仪(LTRIC-600)内，通过免疫荧光检测仪(LTRIC-600)，在激发光波长405nm、接收光波长675nm条件下，检测T1检测线的荧光信号强度(记为T1)和质控线C的荧光信号强度(记为C)，以sST2浓度为横坐标，以T1/C为纵坐标，制作标准曲线，结果如图3，方程为y＝0.0479x+0.0082，R2＝0.999，x为sST2浓度，y为T1/C。sST2的线性检测范围是2.5-300ng/mL。
D-dimer标准曲线的制作：以PBS(10mM，pH是7.2)为溶剂，将D-dimer标准品(国家标准品，产品编号GBW(E)090735)配置浓度分别为15.00mg/L、7.50mg/L、3.75mg/L、1.88mg/L、0.94mg/L、0.47mg/L、0.23mg/L的溶液。将各浓度的D-dimer标准品滴入测试卡的加样口内，在室温反应15min。反应结束后，放进光景生物生产的免疫荧光检测仪(LTRIC-600)内,，通过免疫荧光检测仪(LTRIC-600)，在激发光波长405nm、接收光波长675nm条件下，检测T3检测线的荧光信号强度(记为T3)和质控线C的荧光信号强度(记为C)，以标准品中D-dimer浓度为横坐标，以T3/C为纵坐标，制作标准曲线，结果如图4，方程为y＝0.3526x+0.1224，R2＝0.9982，其中x为D-dimer浓度，y为T1/C；D-dimer的线性检测范围是0.23-15mg/L。
样本稀释液成分为生理盐水。称取9g NaCl粉末，加入到适量水中完全溶解后定容至1L得到所述样本稀释液。
实施例2
与实施例1不同的是T1检测线、T2检测线、T3检测线和质控线C中，各条线之间的间距是0.6cm，所述T1检测线上包被的识别可溶性生长刺激表达因子2另一个表位的单克隆抗体的量为2μg/cm；所述T2检测线上包被的心肌肌钙蛋白I另一个表位的单克隆抗体的的量为2μg/cm；所述T3检测线上包被的识别D-二聚体的另一个表位的单克隆抗体的量为2μg/cm。
所述结合垫上吸附的心肌肌钙蛋白I抗体-荧光微球偶联物的量为0.05μg/cm，吸附的可溶性生长刺激表达因子2抗体-荧光微球偶联物的量为0.05μg/cm，吸附的D-二聚体抗体-荧光微球偶联物的量为0.05μg/cm。
实施例3
与实施例1不同的是T1检测线、T2检测线、T3检测线和质控线C中，各条线之间的间距是0.6cm，所述T1检测线上包被的识别可溶性生长刺激表达因子2另一个表位的单克隆抗体的量为4μg/cm；所述T2检测线上包被的心肌肌钙蛋白I另一个表位的单克隆抗体的的量为4μg/cm；所述T3检测线上包被的识别D-二聚体的另一个表位的单克隆抗体的量为4μg/cm。
所述结合垫上吸附的心肌肌钙蛋白I抗体-荧光微球偶联物的量为0.1μg/cm，吸附的可溶性生长刺激表达因子2抗体-荧光微球偶联物的量为0.1μg/cm，吸附的D-二聚体抗体-荧光微球偶联物的量为0.1μg/cm。
实施例4
与实施例1不同的是T1检测线、T2检测线、T3检测线和质控线C中，各条线之间的间距是0.5cm，所述T1检测线上包被的识别可溶性生长刺激表达因子2另一个表位的单克隆抗体的量为0.25μg/cm；所述T2检测线上包被的心肌肌钙蛋白I另一个表位的单克隆抗体的的量为0.25μg/cm；所述T3检测线上包被的识别D-二聚体的另一个表位的单克隆抗体的量为0.25μg/cm。
所述结合垫上吸附的心肌肌钙蛋白I抗体-荧光微球偶联物的量为0.15μg/cm，吸附的可溶性生长刺激表达因子2抗体-荧光微球偶联物的量为0.15μg/cm，吸附的D-二聚体抗体-荧光微球偶联物的量为0.15μg/cm。
对比例1
与实施例1的区别仅在于，T1检测线、T2检测线、T3检测线和质控线C中，各条线之间的间距不相等，分别为0.4cm、0.5cm、0.6cm。
对比例2
与实施例1的区别仅在于，T1检测线、T2检测线、T3检测线和质控线C中各条线之间的间距相等，但是均为0.4cm。
对比例3
与实施例1的区别仅在于，T1检测线、T2检测线、T3检测线和质控线C中各条线之间的间距相等，但是均为0.7cm。
对比例4
与实施例1的区别仅在于，结合垫上吸附的心肌肌钙蛋白I抗体-荧光微球偶联物的量为0.260μg/cm，吸附的可溶性生长刺激表达因子2抗体-荧光微球偶联物的量为0.260μg/cm，吸附的D-二聚体抗体-荧光微球偶联物的量为0.260μg/cm。
对比例5
与实施例1的区别仅在于，结合垫上吸附的心肌肌钙蛋白I抗体-荧光微球偶联物的量为0.02μg/cm，吸附的可溶性生长刺激表达因子2抗体-荧光微球偶联物的量为0.02μg/cm，吸附的D-二聚体抗体-荧光微球偶联物的量为0.02μg/cm。
对比例6
与实施例1的区别仅在于，将T1检测线、T2检测线、T3检测线的顺序变换为沿着样品流动方向为T2检测线、T1检测线、T3检测线。
对比例7
与实施例1的区别仅在于，将T1检测线、T2检测线、T3检测线的顺序变换为沿着样品流动方向为T3检测线、T1检测线、T2检测线。
应用例
利用实施例1的试剂盒进行样本的测试。
测试时，将待检样本滴入测试卡的加样口内，室温反应15min后，用免疫荧光检测仪((LTRIC-600)，在激发波长405nm、接收光波长675nm条件下，检测T1、T2和T3检测线的荧光信号强度值，再根据定标卡的标准曲线计算，得到待检样本中sST2、cTnI和D-dimer的浓度。
当样本浓度超过检测范围上限的时候，用稀释液对样本进行稀释后滴加至检测卡进行检测。目标物质浓度：将根据标准曲线计算所得结果。
按照国家法规的要求，得到本发明试剂盒对sST2的检出限为1.5ng/mL，cTnI的检出限为0.05ng/mL，D-dimer的检出限为0.2ug/mL。
搜集120例胸痛患者的血清样本(如冠心病或心肌梗死等心肌损伤引起的样本)，用本发明试剂盒检测样本中的cTnI浓度，同时用奥森多临床诊断(英国)有限责任公司的全自动生化免疫分析仪VITROS 5600Intergrated System检测这些样本中的cTnI浓度，比较两者的数据相关性，结果如图5。根据图5可以看出，本发明的cTnI检测结果与奥森多化学发光系统检测结果有一致性。
搜集120例胸痛患者的血清样本(主要包括心肌梗死或心力衰竭患者等样本)，用本发明试剂盒检测样本中的sST2浓度，同时用重症监护诊断有限公司的CriticalDiagnostics系统检测这些样本中的sST2浓度，比较两者的数据相关性，结果如图6。根据图6可以看出，本发明的sST2检测结果与Critical Diagnostics系统检测结果有一致性。
搜集120例胸痛患者的血清样本(主要包括血栓样本)。用本发明试剂盒检测样本中的D-dimer浓度，同时用西森美康CS2000免疫比浊法检测这些样本中的D-dimer浓度，比较两者的数据相关性，结果如图7。根据图7可以看出，本发明的D-dimer检测结果与西森美康免疫比浊系统检测结果有一致性。
通过实施例1的划线间距和喷球浓度，用3个指标的标准品检测浓度，结果如图8-10。划线间距在一定范围内，不会对准确度产生影响。
通过实施例2的划线间距和喷球浓度，用3个指标的标准品检测浓度，结果如图11-13。划线间距在一定范围内，不会对准确度会产生影响。
实施例3和4的试剂盒进行3个指标的检测时也能够得到与实施例1和2相似的效果，检测结果准确度高。
对比例1中，划线的间距不同，会导致仪器对结果的判读C线出现变化，结果会出现无信号的问题。
对比例2中，划线的间距相同，但是间距较短，检测结果会有出现跳点，线性结果出现问题。R值达不到0.99。如图14-16。
对比例3中，划线的间距相同，间距较大，会导致检测信号会超过窗口的检测范围。会导致仪器对结果的判读C线出现变化，结果会出现无信号等问题。
对比例4中，划线的间距在范围内，喷球的浓度太高，会导致检测信号偏高，标曲的范围变窄，如图17-19。
对比例5中，划线的间距在范围内，喷球的浓度太低，会导致检测信号偏低，灵敏度变低，如图20-22。
对比例6中三条线的位置发生变化，导致肌钙蛋白的检测灵敏度降低。如图23。
对比例7中三条线的位置发生变化，肌钙蛋白的检测灵敏度升高，但是D-Dimer检测灵敏度降低。如图24。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的三联免疫荧光定量检测卡及试剂盒，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种心肌肌钙蛋白I、可溶性生长刺激表达因子2、D-二聚体三联免疫荧光定量检测卡，其特征在于，所述检测卡包括试剂条，所述试剂条包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘附至底板上，所述结合垫上吸附有心肌肌钙蛋白I抗体-荧光微球偶联物、可溶性生长刺激表达因子2抗体-荧光微球偶联物、D-二聚体抗体-荧光微球偶联物；所述硝酸纤维素膜上按样品流动方向从前到后依次具有包被有识别可溶性生长刺激表达因子2另一个表位的单克隆抗体的T1检测线、包被有识别心肌肌钙蛋白I另一个表位的单克隆抗体的T2检测线、包被有识别D-二聚体的另一个表位的单克隆抗体的T3检测线和质控线C。
2.根据权利要求1所述的三联免疫荧光定量检测卡，其特征在于，所述T1检测线与T2检测线之间、T2检测线与T3检测线之间、T3检测线与质控线C之间的距离均相等。
3.根据权利要求1所述的三联免疫荧光定量检测卡，其特征在于，所述T1检测线与T2检测线之间、T2检测线与T3检测线之间、T3检测线与质控线C之间的距离均相等，且所述距离为0.5-0.6cm。
4.根据权利要求1所述的三联免疫荧光定量检测卡，其特征在于，所述T1检测线上包被的识别可溶性生长刺激表达因子2另一个表位的单克隆抗体的量为0.25-4μg/cm；所述T2检测线上包被的心肌肌钙蛋白I另一个表位的单克隆抗体的的量为0.25-4μg/cm；所述T3检测线上包被的识别D-二聚体的另一个表位的单克隆抗体的量为0.25-4μg/cm。
5.根据权利要求1所述的三联免疫荧光定量检测卡，其特征在于，所述结合垫上吸附的心肌肌钙蛋白I抗体-荧光微球偶联物的量为0.05-0.15μg/cm，吸附的可溶性生长刺激表达因子2抗体-荧光微球偶联物的量为0.05-0.15μg/cm，吸附的D-二聚体抗体-荧光微球偶联物的量为0.05-0.15μg/cm。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的三联免疫荧光定量检测卡，其特征在于，所述质控线C为包被驴抗鸡IgY单克隆抗体的质控线；所述质控线C上驴抗鸡IgY单克隆抗体的包被量为0.125-2μg/cm。
7.根据权利要求1所述的三联免疫荧光定量检测卡，其特征在于，所述底板为PVC底板；
所述吸水垫为脱脂棉吸水垫、硅胶吸水垫或海绵吸水垫中的任意一种。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的三联免疫荧光定量检测卡，其特征在于，所述检测卡还包括卡壳，所述卡壳包括相互卡接的上卡壳和下卡壳，下卡壳的内表面设置有用于放置所述试纸条的卡槽，上卡壳对应于试纸条的样品垫处设有加样口、对应于试纸条的硝酸纤维素膜处设有观测口，硝酸纤维素膜上的T1检测线、T2检测线、T3检测线和质控线C均暴露于观测口处。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-8中任一项所述的心肌肌钙蛋白I、可溶性生长刺激表达因子2、D-二聚体三联免疫荧光定量检测卡。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括定标卡和样本稀释液；
所述定标卡带有心肌肌钙蛋白I标准曲线、可溶性生长刺激表达因子2标准曲线和D-二聚体标准曲线；
所述样本稀释液的成分为生理盐水。
CN202211248920.6A 2022-09-20 2022-10-12 一种三联免疫荧光定量检测卡及试剂盒 Pending CN115575645A (zh)

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