CN115166262B - 一种肝素结合蛋白的量子点荧光检测方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种肝素结合蛋白的量子点荧光检测方法及应用，属于分析化学和检测技术领域。本发明基于量子点免疫荧光法，取受检人群的血清、血浆或全血作为待检样本，经样本稀释液前处理和检测过程优化，基于量子点的免疫层析试纸条，从而实现对肝素结合蛋白（HBP）的快速、准确和宽范围检测，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种肝素结合蛋白的量子点荧光检测方法及应用
技术领域
本发明属于分析化学和检测技术领域，具体涉及一种肝素结合蛋白的量子点荧光检测方法及应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
感染性疾病是一类严重威胁人类健康的疾病，其初期症状缺乏特异性，往往会导致诊断延误，是导致危重症患者死亡的主要原因。因此，对感染性疾病的早期识别至关重要。肝素结合蛋白（heparin-binding protein，HBP）是一种新型感染标志物。《中国严重脓毒症/脓毒性休克治疗指南（2014）》指出，HBP可作为脓毒症，特别是严重细菌感染的早期诊断标志物。
肝素结合蛋白（HBP）是胰蛋白酶样丝氨酸蛋白家族的一员，具有杀菌活性且带正电荷，主要在中性粒细胞的细胞质中产生。HBP主要沉淀于内皮细胞中，可诱导内皮渗透增加，激活单核细胞沿着内皮滚动，发挥对炎症反应和血管渗漏的调节作用。HBP对内毒素脂质A成分具有较强的亲和力，可与内毒素结合。HBP与肝素也有很强的亲和力，两者结合后，其活性会被抑制。HBP受各种细胞因子、炎性因子、趋化因子和细菌刺激后释放，也可由单核细胞少量释放。HBP参与炎性反应、趋化作用，有抗菌作用，可促进血管通透性，又称天青素或37000阳离子抗菌蛋白（CAP37）。
HBP在中性粒细胞成熟过程中已经被合成，一部分储存于嗜天青颗粒和分泌囊泡中，极少部分存在于白细胞膜的β2整合素中，健康人血液中HBP水平一般不超过10ng/mL。当机体受到细菌感染后，部分细菌侵入到血管内，菌体本身或者细菌释放的毒素等物质刺激中细粒细包释放HBP从而导致血中HBP含量升高，HBP在一般感染时能达到20-30ng/ml，ICU中严重感染会更高达100-1000ng/ml，病危患者甚至可能超过1000ng/ml。因此，HBP可以在血液和组织中释放，对各种细胞产生相应的作用。
HBP的主要作用机制有以下几点：（1）调节血管内皮细胞功能，影响血管通透性及炎性反应；（2）调节单核-巨噬细胞功能，促进其激活及相关炎性反应的扩大；（3）通过线粒体途径调节细胞凋亡。鉴于HBP参与激活白细胞、增加毛细血管通透性及使有效循环血容量减少等多种脓毒症的病理、生理过程，因此HBP在脓毒症的研究中越来越受到关注。
传统炎症标志物较多，临床上最常用的有白细胞计数（WBC）、CRP、白细胞介素-6（IL-6）、PCT和血清淀粉样蛋白A（SAA）等，上述指标在感染性疾病的诊断、治疗及预后方面均具有一定的应用价值，但其诊断灵敏度和特异性相差较大。WBC、CRP和IL-6等诊断感染性疾病的特异性较低。PCT和SAA特异性较高，可用于诊断脓毒症及评判脓毒症的严重程度，但其早期诊断价值较低，且PCT不能有效区分是细菌感染还是非细菌感染所引起的全身炎症反应综合征。与PCT相比，HBP可以更早地预测脓毒症，且与疾病的严重程度呈正相关，因此，HBP在细菌感染及脓毒症的诊断上是优于传统标志物的。
目前HBP的检测方法主要包括免疫比浊法、酶联免疫吸附法(ELISA)、磁微粒化学发光法、胶体金法等。其中免疫比浊和ELISA法的操作时间长，检测范围受方法学限制；磁微粒化学发光法需要配备全自动仪器，检测地点收到限制，且检测时间较长；而胶体金法的检出限高、无法准确定量，且靠肉眼观察容易出现误判，因此在临床上的使用均比较受限。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种肝素结合蛋白的量子点荧光检测方法及应用。本发明基于量子点免疫荧光法，取受检人群的血清、血浆或全血作为待检样本，经样本稀释液前处理和检测过程优化，从而实现对肝素结合蛋白（HBP）的快速、准确和宽范围检测。基于上述研究成果，从而完成本发明。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种肝素结合蛋白的检测方法，所述检测方法具体包括：
S1、将待测样品加入样本稀释液中进行稀释并预处理；
S2、将上述待测物加入基于量子点的免疫层析试纸条上，对显色完成的试纸条进行荧光检测。
所述待测样品优选为血清、血浆或全血。
其中，所述样本稀释液由含有0.05%-0.2%EDTA、0.6%-1.8% PEG8000、0.75%-2%PVA、0.3%-0.9%Tween20的0.05-0.2M Tris-HCl缓冲液构成，其中，Tris-HCl缓冲液有助于稳定待测样本pH值，EDTA用于螯合二价金属离子，PEG8000、PVA、Tween20作为封闭剂和表面活性剂，提升检测的特异性并且能消除非特异性吸附。
基于量子点的免疫层析试纸条，所述基于量子点的免疫层析试纸条包括底板，所述底板上依次设置有滤血膜、结合垫、检测垫和吸水垫，相邻各垫在连接处交叠连接。
其中，所述滤血膜可采用市售商品，如以玻纤和棉纤混合材质制备的滤血膜，但是本发明试纸条上的滤血膜需经预处理液浸泡处理冻干后获得。
所述预处理液为含有2.0%-6.0%海藻糖、0.75%-2.25%S9（TETRONIC1307）、0.02%-0.06%抗红细胞抗体（RBC抗体）和0.1%-0.4%阻断剂（所述阻断剂为非特异性的鼠、兔、羊、牛等来源的IgG或者抗血清，优选为鼠源IgG）的0.05-0.2M Tris-HCl缓冲液（pH8.0）；通过采用预处理液浸泡并经冻干获得的滤血膜，能够给最大程度上过滤全血中的红细胞（因其含有RBC抗体），并除掉人血样本中的异嗜性抗体干扰（含有阻断剂，如鼠源IgG）。同时，为了最大限度保持RBC和阻断剂的活性，滤血膜浸泡处理后采用冻干方式进行干燥。
所述结合垫上包被有量子点标记肝素结合蛋白抗体（Q-Ab）和量子点标记鸡IgY抗体的混合物。
所述量子点标记肝素结合蛋白抗体和量子点标记鸡IgY抗体的质量比为0.5-2:1，优选为1:1。
量子点（QDs）为一种新型荧光标记物，上述量子点为镉系量子点CdSe/ZnS ，QDs经由特殊专利工艺精制而成，相对普通荧光物质，具有发射光谱半峰宽小、发光效率高、灵敏度高、性能稳定等优点。
所述肝素结合蛋白抗体为单克隆抗体；所述量子点和肝素结合蛋白抗体均可通过市售方式获得。
所述检测垫以硝酸纤维素膜（NC膜）为基垫，硝酸纤维素膜上依次设置检测线和质控线。
所述检测线上包被有划线缓冲液稀释的HBP检测线抗体，所述质控线上包被有划线缓冲液稀释的羊抗鸡IgY，检测垫采用冷冻干燥方式进行干燥后获得。
其中，所述划线缓冲液其为0.01M-0.03M Tris-HCl缓冲液体系，含有3%-5%甲醇以及0.2%-0.5%Tween-20。
所述吸水垫可以为吸水纸，所述底板可采用PVC板。
本发明的第二方面，提供了一种肝素结合蛋白的量子点荧光检测试剂盒，所述检测试剂盒至少包含免疫层析试纸条（或检测卡）；
所述免疫层析试纸条即上述第一方面检测方法中所使用的基于量子点的免疫层析试纸条。
具体的，所述免疫层析试纸条，其采用如下方法制备得到：
S1、制备检测线与质控线区域的包被膜：取NC膜和PVC板，将NC膜非点样面贴于PVC板的既定位置，取肝素结合蛋白抗体以及羊抗鸡IgY，划膜包被于NC膜的检测线和质控线位置，干燥后即得；
S2、制备结合垫：
a：取硒化镉量子点，加入到MES、MOPS或HEPES缓冲液中，活化处理；
b：取步骤a制备的量子点标记液，向其中依次加入EDC和NHS，再加入肝素结合蛋白抗体进行避光反应；
c：取步骤b中的标记后混合液转移到超滤管中，进行超滤离心，并用硼酸盐缓冲液作为洗脱液进行洗脱；
d：收集步骤c中得到内管中液体，混匀并超声，即得到量子点标记的肝素结合蛋白抗体；
e：按照上述步骤a~d同样的方法制备量子点标记鸡IgY抗体；
f：将两种标记抗体与冻干液混匀后（量子点标记HBP抗体：量子点标记鸡IgY抗体：冻干液=0.5-2：0.5-2：6，优选为1：1：6，w/w），制成结合垫包被液，喷涂于结合垫上，冷冻干燥后即得；
需要说明的是，为保持抗体活性，采用量子点标记抗体喷涂结合垫的冷冻干燥过程为工艺难点。
所述冻干液采用0.05-0.2 M Tris-HCl体系，并向其中添加0.05-0.2%甘露醇，0.5-2%谷氨酸钠，1-3%甘氨酸，0.1-1%S9，1.2%-1.8%羟丙基-β-环糊精和1-6%海藻糖；经过优化后的冻干处理过程，给标记抗体性能提供保障，并能显著提高量子点标记抗体的稳定性，从而延长产品的保质期。
S3、制备滤血膜；
a：配制滤血膜的预处理液；
b：将滤血膜裁切后，应用预处理液进行浸泡或涂布预处理；
c：冷冻干燥后即得。
其中，所述预处理液为含有2.0%-6.0%海藻糖、0.75%-2.25%S9（TETRONIC1307）、0.02%-0.06%抗红细胞抗体（RBC抗体）和0.1%-0.4%阻断剂（鼠源IgG）的0.05-0.2M Tris-HCl缓冲液（pH8.0）。
S4、组装：
将底板上对应位置的粘纸撕去，将吸水纸粘贴在包被膜的NC膜上方，将结合垫粘贴在包被膜的NC膜下方；将滤血膜粘贴在结合垫下方并部分覆盖结合垫，即可得到组装好的大板。
S6、切条装壳：设置试纸条宽度后，进行裁切，即为制备好的试纸条；
进一步的，将试纸条正向放入检测卡壳中，压壳封装好，即得到单人份肝素结合蛋白检测卡。
所述检测试剂盒还包括样本稀释液；
其中，所述样本稀释液由含有0.05%-0.2%EDTA、0.6%-1.8% PEG8000、0.75%-2%PVA、0.3%-0.9%Tween20的0.05-0.2M Tris-HCl缓冲液；其中，Tris-HCl缓冲液有助于稳定待测样本pH值，EDTA用于螯合二价金属离子，PEG8000、PVA、Tween20作为封闭剂和表面活性剂，提升检测的特异性并且能消除非特异性吸附。
本发明的第三方面，提供上述检测方法和/或试剂盒在如下任意一种或多种中的应用：
1）肝素结合蛋白检测；
2）细菌感染和/或脓毒症诊断或辅助诊断。
以上一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案通过对的前处理和检测过程进行优化，特别采用冻干工艺，并配合冻干液的使用，从而保证相应抗体的检测活性，并最终实现对肝素结合蛋白的快速（可在10min内完成检测）、准确和宽范围检测，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明试纸条结构示意图；
其中，1-滤血膜，2-结合垫，3-NC膜，4-吸水垫，5-PVC底板，6-检测线，7-质控线。
图2为检测卡外部结构示意图；
其中，8-加样孔，9-观察窗（视窗）。
图3为本发明肝素结合蛋白标准曲线图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。
如前所述，目前HBP的检测方法往往存在操作或检测时间长、检出限高、检测设备高昂且固定，无法进行现场检测等问题。
量子点作为一种新型的发光纳米材料，其在检测领域具有独特的光致发光，化学稳定性和出色的生物相容性。将量子点应用于侧向层析方法，具有灵敏度高、线性范围宽、稳定性好的优点，且操作简便、快捷、准确。
有鉴于此，本发明提供一种肝素结合蛋白的检测方法，具体的，本发明基于基于量子点荧光技术肝素结合蛋白（HBP）检测方法原理如下：
本试剂盒采用双抗夹心法，结合垫上包被量子点标记HBP抗体（Q-Ab）与量子点标记鸡IgY抗体的混合物；检测垫的硝酸纤维素膜（NC膜）上依次设置检测线和质控线：其中NC膜上划HBP捕捉抗体作为检测线，划羊抗鸡IgY作为质控线。加样后样本中待测抗原（HBP）分别与量子点标记抗体结合形成量子点标记抗体-抗原复合物。随后，样本通过固化有HBP捕捉抗体的检测线区域，并与检测线抗体结合形成量子点标记抗体-抗原-抗体复合物，未结合的量子点标记鸡IgY抗体继续前移，与质控线区域的羊抗鸡IgY抗体结合，完成质控校准反应。通过配套仪器激发量子点产生荧光信号，并获得定量检测结果，样品中待测抗原（HBP）的含量与荧光信号强度在一定范围内呈正相关，通过标准曲线计算即可得出待测样品浓度。
本申请将人血清、血浆或全血样本经样本稀释液处理后，直接用移液器取样滴加入加样孔中，进行加样，展板10min后。
1）所得实验结果准确度好，与标准品的相对偏差在±10%以内；
2）所得实验结果重复性好，CV不超过10%；
3）样本无需特殊处理；
4）试剂盒和样本稀释液无需冷藏，常温运输储藏即可；
5）稳定性良好，常温下的保质期可达18个月以上。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
本实施例提供肝素结合蛋白联合检测用试剂盒，包括PVC板、设置在PVC板上的硝酸纤维素膜（NC膜），NC膜上端设置有玻璃纤维素膜材质的结合垫，结合垫上端设置有滤血膜，与此二者相对应的NC膜的另一端设有吸水垫，所述吸水垫由吸水纸制成。所述结合垫上标记物线区域包被有质量比为1：1的量子点标记肝素结合蛋白单克隆抗体和量子点标记鸡IgY抗体的混合物；所述NC膜上依次设置有检测线和质控线，所述检测线上包被有肝素结合蛋白抗体，所述质控线上包被有羊抗鸡IgY；所述量子点为硒化镉量子点，如图1所示。
本实施例肝素结合蛋白检测用试剂盒的制备方法，具体操作步骤为：
1）制备包被膜：取NC膜和PVC板，将NC膜非点样面贴于PVC板的既定位置，取浓度为1.5mg/ml的肝素结合蛋白抗体、羊抗鸡IgY，应用划膜喷金仪按1μl/cm划膜分别包被于NC膜的检测线和质控线位置，37℃烘干4h，即得所述的包被膜。
2）制备结合垫：
a：取20μl硒化镉量子点，加入到5ml浓度为50mM的MES缓冲液（pH6.5）中，活化15min，4℃避光保存备用；
b：取步骤a制备的量子点标记液，向其中依次加入20mg/ml EDC、20mg/ml NHS各7.5μl，再加入5mg/ml肝素结合蛋白抗体250μl，避光反应3h；
c：取步骤b中的标记后混合液转移至300KD超滤管中进行离心，以4000g/min离心15min，确保离心后液体体积小于原体积的1/10；用0.1M硼酸盐缓冲液（pH7.5）作为洗脱液，洗脱5次，确保每次离心后液体体积小于原体积的1/10；
d：收集各个内管中的液体并混匀，即得到量子点标记的肝素结合蛋白抗体；
e：按照上述步骤a~d同样的方法制备量子点标记鸡IgY抗体；
f：将两种标记抗体与冻干液混匀后（量子点标记HBP抗体：量子点标记鸡IgY抗体：冻干液=1：1：6，w/w），制成结合垫包被液，应用划膜喷金仪按照5μL/cm喷于结合垫，冷冻干燥24小时，即可得到所述的结合垫；
为保持抗体活性，采用量子点标记抗体喷涂结合垫的冷冻干燥过程为工艺难点。
所述冻干液采用0.1 M Tris-HCl体系，并向其中添加0.1%甘露醇，1%谷氨酸钠，1.5%甘氨酸，0.5%S9，1.5%羟丙基-β-环糊精和5%海藻糖；经过优化后的冻干处理过程，给标记抗体性能提供保障，并能显著提高量子点标记抗体的稳定性。
3）制备滤血膜：
a：配制滤血膜的预处理液；所述预处理液为含有5.0%海藻糖、1%S9、0.05%抗红细胞抗体和0.2%阻断剂（鼠源IgG）的0.1M Tris-HCl缓冲液（pH8.0）；
b：将滤血膜裁切至适当尺寸后，应用预处理液进行涂布预处理（处理时长1h）；
c：放入冷冻干燥机进行冷冻干燥24h，即可得处理好的滤血膜。
4）组装：
将底板上对应位置的粘纸撕去，将吸水纸粘贴在包被膜的NC膜上方，覆盖NC膜1.5mm；将结合垫粘贴在包被膜的NC膜下方，覆盖NC膜1.5mm；将滤血膜粘贴在结合垫下方，覆盖结合垫2mm，即可得到组装好的大板。
5）切条装壳：应用微电脑斩切机，设置好试纸条宽度后，进行裁切，即为制备好的试纸条；将试纸条正向放入检测卡壳中，压壳封装好，即得到单人份肝素结合蛋白检测卡，如图2所示。
所述试剂盒还含有样本稀释液，所述样本稀释液由含有0.1%EDTA、1% PEG8000、1%PVA、0.5%Tween20的0.1M Tris-HCl缓冲液构成。
试验例
将肝素结合蛋白稀释浓度5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml作为标准品溶液，并同时配制空白溶液。
分别取各浓度的标准品溶液70μl分别加入到实施例1制备的检测卡的样品垫上，10min后将展板完成的检测卡放入荧光免疫分析仪（山东子峰生物技术有限公司）进行判读，获取不同浓度检测线、质控线的荧光值，并记录各浓度标准品的荧光比值（T/C）与标准品浓度之间的对应关系。根据测量结果的荧光信号——标定浓度值，制定标准曲线方程。如图3所示，肝素结合蛋白的标准曲线回归方程为：LOG（Y-0.0054）=0.6007×LOG（X）-1.041。将标准曲线烧录到ID卡中，制成肝素结合蛋白校准卡。
另外，取空白溶液加入到实施例1制备的检测卡中，肝素结合蛋白的反代浓度显示为0ng/ml。
取100例随机临床样本，采用本发明实施例1制备的试剂盒对肝素结合蛋白的浓度进行检测，检测方法为：取校准卡插入到荧光免疫分析仪（山东子峰生物技术有限公司）中，对仪器进行校准；取20μl样本中加入到80μl样品稀释液中，混匀后取70μl样本液滴加至加样孔中，展板10min放入荧光免疫分析仪（山东子峰生物技术有限公司）中，测得肝素结合蛋白的检测结果并记录。所测得结果如下表1所示：
表1 肝素结合蛋白检测结果
Figure DEST_PATH_IMAGE001
Figure 665997DEST_PATH_IMAGE002
Figure DEST_PATH_IMAGE003
由此可见，本试剂盒可以直接定量检测肝素结合蛋白的浓度，方便快速10min即可获得结果，适合在急诊等科室推广和使用。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (3)

1.一种肝素结合蛋白的检测方法，其特征在于，所述检测方法具体包括：
S1、将待测样品加入样本稀释液中进行稀释并预处理；
S2、将上述待测物加入基于量子点的免疫层析试纸条上，对显色完成的试纸条进行荧光检测；
其中，所述样本稀释液由含有0.1%EDTA、1% PEG8000、1%PVA、0.5%Tween20的0.1MTris-HCl缓冲液构成；
所述待测样品为血清、血浆或全血；
所述基于量子点的免疫层析试纸条包括底板，所述底板上依次设置有滤血膜、结合垫、检测垫和吸水垫，相邻各垫在连接处交叠连接；
所述结合垫含有冻干液为：0.1%甘露醇，1%谷氨酸钠，1.5%甘氨酸，0.5%S9，1.5%羟丙基-β-环糊精和5%海藻糖的0.1 M Tris-HCl体系；
所述滤血膜经预处理液浸泡处理冻干后获得；
所述预处理液为含有5.0%海藻糖、1%S9、0.05%抗红细胞抗体和0.2%阻断剂的0.1MTris-HCl缓冲液；
所述阻断剂为非特异性的鼠、兔、羊、牛来源的IgG或者抗血清；
所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上依次设置标记物线、检测线和质控线；
所述检测线上包被有划线缓冲液稀释的HBP检测线抗体，所述质控线上包被有划线缓冲液稀释的羊抗鸡IgY，检测垫采用冷冻干燥方式进行干燥后获得；
其中，所述划线缓冲液其为0.01M-0.03M Tris-HCl缓冲液体系，含有3%-5%甲醇以及0.2%-0.5%Tween-20；
所述结合垫上包被有量子点标记肝素结合蛋白抗体和量子点标记鸡IgY抗体的混合物；
所述量子点标记肝素结合蛋白抗体和量子点标记鸡IgY抗体的质量比为0.5-2:1；
肝素结合蛋白抗体为单克隆抗体；
所述吸水垫为吸水纸，所述底板采用PVC板。
2.一种肝素结合蛋白的量子点荧光检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒至少包含免疫层析试纸条或检测卡；
所述免疫层析试纸条，其采用如下方法制备得到：
S1、制备检测线与质控线区域的包被膜：取NC膜和PVC板，将NC膜非点样面贴于PVC板的既定位置，取肝素结合蛋白抗体以及羊抗鸡IgY，划膜包被于NC膜的检测线和质控线位置，干燥后即得；
S2、制备结合垫：
a：取硒化镉量子点，加入到MES、MOPS或HEPES缓冲液中，活化处理；
b：取步骤a制备的量子点标记液，向其中依次加入EDC和NHS，再加入肝素结合蛋白抗体进行避光反应；
c：取步骤b中的标记后混合液离心，并用硼酸盐缓冲液作为洗脱液进行洗脱；
d：收集步骤c中得到内管中液体，混匀并超声，即得到量子点标记的肝素结合蛋白抗体；
e：按照上述步骤a~d同样的方法制备量子点标记鸡IgY抗体；然后将两种标记抗体与冻干液混匀后制成结合垫包被液，喷涂于结合垫上，冷冻干燥后即得；
所述冻干液采用0.1 M Tris-HCl体系，并向其中添加0.1%甘露醇，1%谷氨酸钠，1.5%甘氨酸，0.5%S9，1.5%羟丙基-β-环糊精和5%%海藻糖；
所述量子点标记HBP抗体、量子点标记鸡IgY抗体与冻干液的质量比为0.5-2：0.5-2：6；
S3、制备滤血膜；
a：配制滤血膜的预处理液；
b：将滤血膜裁切后，应用预处理液进行浸泡或涂布预处理；
c：冷冻干燥后即得；
所述预处理液为含有5.0%海藻糖、1%S9、0.05%抗红细胞抗体和0.2%阻断剂的0.1MTris-HCl缓冲液；
所述阻断剂为非特异性的鼠、兔、羊、牛来源的IgG或者抗血清；
S4、组装：
将底板上对应位置的粘纸撕去，将吸水纸粘贴在包被膜的NC膜上方，将结合垫粘贴在包被膜的NC膜下方；将滤血膜粘贴在结合垫下方并部分覆盖结合垫，即可得到组装好的大板；
S5、切条装壳：设置试纸条宽度后，进行裁切，即为制备好的试纸条；
将试纸条正向放入检测卡壳中，压壳封装好，即得到单人份肝素结合蛋白检测卡；
所述检测试剂盒还包括样本稀释液；
其中，所述样本稀释液由含有0.1%EDTA、1% PEG8000、1PVA、0.5%Tween20的0.1M Tris-HCl缓冲液。
3.权利要求1所述检测方法或权利要求2所述试剂盒在肝素结合蛋白检测中的应用。
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