CN113588939A - 一种肝素结合蛋白测定试剂盒、制备方法及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肝素结合蛋白测定试剂盒,其特征在于,包括固相标记物、示踪标记物、中和标记物、清洗液及底物;所述固相标记物包括包被抗体及固相支撑物,所述包被抗体标记于所述固相支撑物上;所述示踪标记物包括标记抗体及示踪物,所述标记抗体标记于所述示踪物上;所述中和标记物包括微球或磁珠中的一种,以及标记于所述微球或磁珠上的标记抗体;所述中和标记物中的标记抗体与示踪标记物中的标记抗体为针对同一表位的抗体;所述清洗液包括缓冲液及表面活性剂,所述底物为所述示踪物所对应的底物。该试剂盒通过与化学发光免疫分析仪结合,进行对样本中肝素结合蛋白含量的检测,该试剂盒检验灵敏度高、重现性好、准确度高,并且具有较宽的检测线性范围。
Description
技术领域
本发明属于体外诊断试剂领域,特别是涉及一种肝素结合蛋白测定试剂盒、制备方法及使用方法。
背景技术
肝素结合蛋白(heparin-binding protein,HBP)也被称为azurocidin或者CAP37,是中性粒细胞来源的颗粒蛋白。HBP是一种多功能、有活性的同源丝氨酸蛋白酶,相对分子质量为37kDa。HBP的结构为包含222个氨基酸的单链蛋白,含有8个半胱氨酸残基,在第100、114或145位天冬氨酸残基上具有糖基化位点,结构类似于中性粒细胞弹性蛋白酶,与其同源性为45%,与其他颗粒衍生丝氨酸蛋白酶的同源性为30%~37%。大约74%的HBP储存在嗜苯胺蓝颗粒中,18%在分泌小泡中,而8%在胞质膜上。
研究表明,HBP可以作为感染性疾病,尤其是严重的细菌感染的一种早期诊断标志。与其他传统炎症指标相比,它除了具有灵敏性高、特异性强、阳性/阴性检出率高等优点,还具有出现早,只在急性细菌感染时浓度极度升高,在病毒感染和非特异性炎症时却保持较低的水平等特点。更有意义的是,通过对HBP浓度的动态监测,可以对严重感染患者将要出现的休克以及循环衰竭进行预测,从而实现早期干预。
炎症就是平时人们所说的“发炎”,是机体对于刺激的一种防御反应,表现为红、肿、热、痛和功能障碍。炎症,可以是感染引起的感染性炎症,也可以不是由于感染引起的非感染性炎症。炎症是损伤和抗损伤的统一过程。凡能够引起组织和细胞损伤的因素都可成为炎症的原因。例如妇科炎症,据世界卫生组织对中国妇女的调查:41%的育龄女性患有不同程度的妇科炎症,而已婚女性妇科炎症的发病率更高达70%。
感染从发病率上讲,85--90%为病毒;细菌大概不足10%。病毒性感染可由多种病毒引起,如呼吸道病毒、胃肠道病毒、皮肤和黏膜病毒等等,均为常见病。
脓毒症是指宿主对感染反应失调引起的致命性的器官功能障碍,脓毒症进一步发展,出现循环和细胞/代谢失调的脓毒症则被称为脓毒症休克。脓毒症起病急病程快的特点,因此抗生素治疗在脓毒血症早期诊断和治疗具有十分关键的重要,相关研究发现,脓毒症早期患者每延迟一小时治疗,患者存活率下降7.6%,在发生疾病1小时内得到正确诊治,患者存活率将达到70-80%以上;6小时之后诊治,患者的生存率下降到30%以下。HBP具有杀菌、致炎、抗凋亡和提高细胞穿透力等生物学作用,其主要储存于中性粒细胞的噬天青颗粒中,是构成人类中性粒细胞的先天防御系统的一部分。健康人血中HBP水平很低,一般不超过10μg/L,当有感染发生时,部分细菌侵入到血管内,菌体本身或者细菌释放的毒素等物质刺激中性粒细胞释放HBP从而导致血中HBP含量升高。HBP在一般感染时能达到20~30ng/mL,ICU中严重感染可能超过100ng/mL甚至高达1000ng/mL以上;当HBP含量超过1000ng/mL时病人已经处于极度危险中,面临着随时可能死亡的危险。
广州医科大学呼吸疾病国家重点实验室钟南山院士和孙宝清教授团队发表《肝素结合蛋白水平与重症新冠肺炎病情加重及多器官损伤的关系》,研究表明,HBP在重症新冠肺炎患者全身炎症反应中起关键作用。纵向分析显示,在器官功能障碍的任何影像学特征出现前5天左右,HBP即升高。因此,监测HBP水平可以作为感染SARS-COV-2后新冠肺炎病情加重和多器官损伤的一个有用的生物标志物。
临床上,通过体外定量检测人血浆样本中肝素结合蛋白(HBP)的含量,可用于重度脓毒症和脓毒性休克的辅助诊断。当然,HBP的测定结果仅供临床参考,不能单独作为诊断或排除病例的依据。
目前,检测肝素结合蛋白的代表性试剂盒有英国Axis-shield公司的酶联免疫试剂盒,该试剂盒是在96孔微孔板上包被抗体,加入待测样本后,样本中的HBP抗原与包被抗体,以及酶标记的标记抗体形成免疫复合物,经过洗涤后加入显色底物,酶催化底物产生颜色变化,通过测量特定波长下的吸光度变化,定量检测样本中的HBP浓度。但该试剂盒的ELISA微孔板包被蛋白量有限,进而影响反应后形成免疫夹心复合物的含量,造成该试剂盒的线性范围较窄,且存在操作繁琐,检测时间较长的缺点。
CN204882574U公开一种胶体金法检测肝素结合蛋白的试剂盒,CN204882575U公开一种免疫荧光层析法检测肝素结合蛋白的试剂盒,这两种方法虽然都可以快速检测,但只能进行定性或者半定量的检测,准确度低,无法提供准确度高的结果。
CN11929443A与CN112255416A均报道了一种化学发光检测试剂,但两种均属于常规的检测原理,且容易受到抗原过剩的影响,造成试剂盒的检测线性范围不够宽,难以满足临床的需要。
肝素结合蛋白在正常人群中的浓度为10ng/mL以下,但在炎症及严重感染的情况下可达1000ng/mL以上,因此该项目对检测线性范围要求较宽。
因此,在肝素结合蛋白检测技术领域,现有技术仍对肝素结合蛋白的检测线性范围存在更高的要求,仍需开发一种检测线性范围较宽的肝素结合蛋白免疫测定试剂盒,以满足临床应用的需要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷,提供一种检测线性范围较宽的肝素结合蛋白免疫测定试剂盒、制备方法及使用方法。
为实现上述目的,本发明提供了一种肝素结合蛋白测定试剂盒,采取以下技术方案:
一种肝素结合蛋白测定试剂盒,其特征在于,包括固相标记物、示踪标记物、中和标记物、清洗液及底物;所述固相标记物包括包被抗体及固相支撑物,所述包被抗体标记于所述固相支撑物上;所述示踪标记物包括标记抗体及示踪物,所述标记抗体标记于所述示踪物上;所述中和标记物包括微球或磁珠中的一种,以及标记于所述微球或磁珠上的标记抗体;所述中和标记物中的标记抗体与示踪标记物中的标记抗体为针对HBP抗原同一表位的抗体;所述清洗液包括缓冲液及表面活性剂,所述底物为所述示踪物所对应的底物。
进一步地,所述包被抗体为第一HBP抗体,所述标记抗体为第二HBP抗体,所述第一HBP抗体与第二HBP抗体不具有相同的表位。
进一步地,所述中和标记物中的微球为乳胶微球,为一种白色微球或有色微球,所述微球的粒径为200-5000nm,所述乳胶微球表面修饰有羟基、羧基或Toysal中至少一种功能基团;所述磁珠为超顺磁珠,所述磁珠的粒径为200-5000nm,所述磁珠的表面修饰有功能基团,所述功能基团选自羧基、羟基或Toysal中的至少一种。
进一步地,所述固相支撑物选自微孔板或磁珠,所述微孔板由聚苯乙烯或聚氯乙烯制成,所述磁珠为超顺磁珠,所述磁珠的粒径为200-5000nm,所述磁珠的表面修饰有功能基团,所述功能基团选自羧基、羟基或Toysal中的至少一种。
进一步地,所述所述示踪物包括酶或发光物质,所述酶选自碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶,所述发光物质选自鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯及其衍生物或三联吡啶钌中的一种。
进一步地,所述试剂盒满足以下工作浓度:
固相标记物的工作浓度为0.1mg/mL~1.0mg/mL;微孔板固相包被浓度为0.5-5μg/mL;
示踪标记物的工作浓度为0.1μg/mL~5.0μg/mL;
中和标记物的工作浓度为0.2μg/mL~8μg/mL。
进一步地,所述固相标记物中标记抗体的浓度为5~100μg抗体/mg磁珠;
所述示踪标记物中标记抗体与示踪物的比例为1:1~1:50;
所述中和标记物中标记抗体的浓度为5~100μg抗体/mg微球或磁珠。
进一步地,所述肝素结合蛋白测定试剂盒的检测线性范围为10-1500ng/mL,所述肝素结合蛋白测定试剂盒的最低检测限度为不大于0.2ng/mL。
进一步地,所述的肝素结合蛋白测定试剂盒的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将HBP包被抗体包被到磁珠或微孔板上,得到固相标记物;
(2)将HBP标记抗体标记到微球或磁珠上,得到中和标记物;
(3)将HBP标记抗体标记到示踪物上,得到示踪标记物;
(4)将固相标记物、中和标记物、示踪标记物、清洗液及底物组装得到试剂盒。
进一步地,所述固相标记物的制备方法,包括以下步骤:(1)将10-40mg磁珠采用偶联缓冲液清洗,磁性分离,弃上清,再用偶联缓冲液复溶,混匀静置,所述偶联缓冲液为10-40mM MES溶液;(2)再加入50-200mg/mL的EDC溶液,混匀,室温避光孵育30min-60min;(3)加入偶联缓冲液,混匀器混合均匀,再加入100-300μg HBP包被抗体至活化的磁珠中,混匀,室温避光振荡孵育30min-60min,孵育后,磁分离,弃上清液;(4)加封闭液,混匀,室温避光振荡孵育30min;(5)加洗涤液,重复洗涤3次;(6)保存:用保存液复溶,分装后保存于4℃冰箱。
进一步地,所述中和标记物的制备方法,包括以下步骤:(1)用10-30mM MES的活化缓冲液洗涤微球,用活化缓冲液吹打微球,再离心,弃上清液,重复洗涤2次;(2)用活化缓冲液重悬微球,加入50-200mg/mL的EDC溶液,室温活化30min-60min,离心,弃上清液,重复步骤(1)洗涤2次;(3)用活化缓冲液重悬微球,加入100-500μg HBP标记抗体,室温反应30min-60min,离心,弃上清液,重复步骤(1)洗涤2次;(4)保存:加入保存液重悬微球,使用时,用稀释液将中和标记物稀释至0.2μg/mL~8μg/mL。
进一步地,所述示踪标记物的制备,包括以下步骤:(1)将0.5-2mg的HBP标记抗体加入100-200mg/mL的活化剂2-亚胺四氢噻吩溶液,于35-38℃反应30min-90min;(2)反应完成后,用脱盐柱进行纯化,收集活化后的抗体,保存于2-8℃备用;(3)取1-5mg碱性磷酸酶溶液,加入5-15mg/mL的4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液,室温反应30-60min;(4)反应完成后用脱盐柱进行纯化,收集含碱性磷酸酶的溶液,并保存于2-8℃备用;(5)将活化好的HBP标记抗体与碱性磷酸酶混合,在2-8℃反应10-20小时;(6)保存,使用时用稀释液将标记好的示踪标记物稀释至0.1-5μg/mL。
进一步地,所述肝素结合蛋白测定试剂盒按照以下步骤使用:
(1)加样:将待测样本50μL,加入到固相标记物、示踪标记物、中和标记物混匀,于37℃条件下反应5-10分钟;
(2)示踪标记物和中和标记物竞争结合样本中的肝素结合蛋白,样本中部分肝素结合蛋白被中和掉,剩下的肝素结合蛋白与固相标记物、示踪标记物形成免疫夹心复合物;
(3)重复洗涤,将免疫夹心复合物去除;
(4)加入底物,产生可检测的光电信号,计算待测物的浓度。
进一步地,待测样本为血浆样本。
本发明采用双抗体夹心法、化学发光检测原理。将样本、固相标记物、示踪标记物和中和标记物混合进行免疫反应,示踪标记物和中和标记物同时竞争样本中的肝素结合蛋白,样本中的部分肝素结合蛋白被中和掉,剩余的肝素结合蛋白与固相标记物、示踪标记物形成免疫夹心复合物。通过添加磁场吸附免疫夹心复合物,进行固液分离,充分洗涤将乳胶微球偶联的标记抗体结合部分肝素结合蛋白去除,最后加入底物,产生可检测的光电信号,光电信号与待测物肝素结合蛋白抗原的浓度成比例关系,从而计算出待测物的浓度。
本发明与现有技术相比,本发明具有以下有益效果包括:
(1)本发明发现在反应体系中加入中和标记物,该中和标记物的标记抗体与示踪标记物的标记抗体为针对HBP抗原同一表位的抗体,中和标记物与示踪标记物同时竞争样本中的肝素结合蛋白,样本中部分肝素结合蛋白被中和掉,从而可以延缓一步法反应中抗原过剩的现象,从而明显的拓宽试剂盒的检测线性范围,使本发明试剂盒的检测线性范围达到10-1500ng/mL,最低检测限度达到不大于0.2ng/mL,当检测样本浓度达到1500ng/mL时,本发明试剂盒没有发现明显的HOOK效应,很好的满足了临床检测的需求。
(2)本发明中和标记物中的微球优选为乳胶微球,为一种白色微球或有色微球,粒径为200-5000nm,乳胶微球表面修饰有羧基、羟基或Toysal中至少一种功能基团,使中和标记物能够与肝素结合蛋白更高效的结合,从而进一步提高本发明试剂盒的检测线性范围,并且使该试剂盒的精密度优异,CV不大于10%。
(3)本发明试剂盒的适用性好,可以在全自动化学发光免疫分析仪中使用,如深圳市爱康生物科技有限公司的全自动化学发光测定仪CLIA-mate、C900、CLIA-mate Plus等。
(4)本发明试剂盒的检测速度快,待测样本无需稀释,加入到固相标记物、示踪标记物、中和标记物中混合,孵育反应5分钟,经过洗涤3次,再加入底物,仪器自动读取光电信号,并转换为检测浓度值,总检测时间控制在15-17min以内。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明肝素结合蛋白测定试剂盒与酶联免疫试剂盒的相关性图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案,下面将结合附图对本发明作进一步的详细介绍。显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。
第一HBP抗体和第二HBP抗体可以分别为HBP单克隆抗体1和HBP单克隆抗体2,也可以为市场中常见的其他HBP抗体。
以下实施例采用深圳市爱康生物科技有限公司生产的全自动化学发光测定仪CLIA-mate进行测定。
实施例1
HBP固相标记物(磁珠标记)的制备
(1)取1个玻璃小瓶,加入20mM MES-buffer(PH6.0)洗涤玻璃瓶,移除该缓冲溶液后,加入10mg羧基磁珠(粒径3μm),磁性分离,弃上清,再用偶联缓冲液洗涤2遍。最后用缓冲溶液复溶,混匀静置10min。
(2)加入100mg/mL的EDC 50μL到玻璃小瓶,混匀,室温避光孵育30min。
(3)先加入0.5mL的偶联缓冲溶液,漩涡混匀器混合均匀。然后加入200μg HBP包被抗体到活化的磁珠中。混匀,室温避光震荡孵育1h。孵育后,把玻璃瓶置于磁分离器上,分离后弃上清液。
(4)先加入封闭液,混匀,室温避光震荡孵育30min。
(5)每管中加入的洗涤液,漩涡混匀。4分钟分离,移除上清液。再加入2mL洗涤液,重复洗涤3次。
(6)保存:最后各用保存液复溶。分装后保存于4℃冰箱。使用时,用50mM Tris(PH7.4)+1%BSA缓冲液将HBP磁珠标记物稀释到0.4mg/mL。
HBP中和标记物(乳胶微球标记)的制备
(1)用活化缓冲液(20mM MES(PH6.0))洗涤1mL(10mg/mL)的羧基乳胶微球(粒径500nm)2次。洗涤过程为:用1mL活化缓冲液混匀吹打乳胶微球,然后用9000G离心力离心15分钟,离心完成后吸去上层清液,然后再次加入活化缓冲液,按照上述步骤再次洗涤1遍。
(2)用0.5mL活化缓冲液重悬乳胶微球(可超声),加入100mg/mL的EDC溶液50μL,室温活化30分钟;然后用9000G离心力离心15分钟,离心完成后吸去上层清液,然后按照步骤1洗涤2次。
(3)用0.5mL活化缓冲液重悬乳胶微球(可超声),加入100-500μg的HBP标记抗体,室温反应1h。然后用9000G离心力离心15分钟,离心完成后吸去上层清液,然后按照步骤1洗涤2次。
(4)用0.5mL活化缓冲液重悬乳胶微球(可超声),加入1%BSA溶液100μL,室温反应1h。然后用9000G离心力离心15分钟,离心完成后吸去上层清液,然后按照步骤1洗涤2次。
(5)加入保存液重悬乳胶微球,使用时,用稀释液将HBP乳胶标记物稀释到0.2μg/mL。
HBP酶标记物(碱性磷酸酶标记)的制备
将1mg的HBP标记抗体加入适量150mg/mL的活化剂(2-亚胺四氢噻吩溶液),于37℃反应90分钟,反应完成后,用脱盐柱进行纯化,收集活化后的抗体,并保存到2-8℃备用。取3mg的碱性磷酸酶溶液,加入适量10mg/mL的4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液,室温反应30分钟,反应完成后用脱盐柱进行纯化,收集含碱性磷酸酶的溶液并保存到2-8℃备用。将上述活化好的HBP标记抗体及碱性磷酸酶混合,在2-8℃反应10-20小时。用稀释液将标记好的酶标记物稀释到0.2μg/mL。
清洗液的配制:
配置50mM MOPS缓冲液,调节PH到7.2,加入0.05%TW-20,混合均匀,并加入0.01%P300。
标准品的配制:
用稀释液(50mM Tirs(PH7.4),1%BSA)将HBP抗原分别梯度配置成10、50、200、500、1000、1500ng/mL共6个浓度点。
一种肝素结合蛋白测定试剂盒的使用方法,包括以下步骤:
(1)加样:将待测样本50μL,加入到固相标记物、示踪标记物、中和标记物混匀,于37℃条件下反应5-10分钟;
(2)示踪标记物和中和标记物竞争结合样本中的肝素结合蛋白,样本中部分肝素结合蛋白被中和掉,剩下的肝素结合蛋白与固相标记物、示踪标记物形成免疫夹心复合物;
(3)重复洗涤,将免疫夹心复合物去除;
(4)加入底物,产生可检测的光电信号,计算待测物的浓度。
实施例2
HBP固相标记物(微孔板)的制备
用50mM碳酸盐缓冲液(PH9.6)将包被抗体稀释至1.5μg/mL,混合均匀,然后微孔板每孔加入100μL稀释好的包被抗体,于2~8度中包被12-24小时;然后甩去包被液体,用清洗液洗涤板孔一次;然后每孔加入120μL封闭液于2~8度中包被12-24小时;然后甩去包被液,微孔板于37度中干燥2h,然后装入密封袋中,真空密封待用。
HBP中和标记物(磁珠标记)的制备
(1)取1个玻璃小瓶,加入20mM MES-buffer(PH6.0)洗涤玻璃瓶,移除该缓冲溶液后,加入10mg羧基磁珠(粒径3μm),磁性分离,弃上清,再用偶联缓冲液洗涤2遍。最后用缓冲溶液复溶,混匀静置10min。
(2)加入100mg/mL的EDC 50μL到玻璃小瓶,混匀,室温避光孵育30min。
(3)先加入0.5mL的偶联缓冲溶液,漩涡混匀器混合均匀。然后加入200μg HBP包被抗体到活化的磁珠中。混匀,室温避光震荡孵育1h。孵育后,把玻璃瓶置于磁分离器上,分离后弃上清液。
(4)先加入封闭液,混匀,室温避光震荡孵育30min。
(5)每管中加入的洗涤液,漩涡混匀。4分钟分离,移除上清液。再加入2mL洗涤液,重复洗涤3次。
(6)保存:最后各用保存液复溶。分装后保存于4℃冰箱。使用时,用50mM Tris(PH7.4)+1%BSA缓冲液将HBP中和标记物稀释到2μg/mL。
HBP示踪标记物(异鲁米诺标记)的制备
1)将HBP抗体溶于PBS缓冲液中,用0.005mol/L PH=8.0的PBS缓冲液透析至无NH4+存在(用奈氏试剂检测)。
2)取6mg的N-(β-羟基丙酰基)异鲁米诺(CPIL)溶于1mL 0.5%的NaOH溶液,加0.25mL提纯后的HBP抗体(3mg),摇匀后,加入2mg EDC,再摇匀,置于37度水浴中反应2h,取出后再加入5.0mg甘氨酸溶解摇匀,再置于37度水浴反应1h取出。
3)然后再把标记物转入透析袋中,于4杜仲,用0.01mol/LPH=7.5的硼酸溶液中充分透析(更换透析液4次,透析24h)。
4)吸出标记物,加入保护蛋白,用稀释液将标记好的异鲁米诺标记物稀释到0.1μg/mL。
实施例2的清洗液、标准品的配制及试剂盒的使用方法均与实施例1中相同,不再重复描述。
实施例3
HBP固相标记物(磁珠标记)的制备
(1)取1个玻璃小瓶,加入40mM MES-buffer(PH6.0)洗涤玻璃瓶,移除该缓冲溶液后,加入40mg Toysal磁珠(粒径10μm),磁性分离,弃上清,再用偶联缓冲液洗涤2遍。最后用缓冲溶液复溶,混匀静置20min。
(2)加入200mg/mL的EDC 50μL到玻璃小瓶,混匀,室温避光孵育60min。
(3)先加入0.5mL的偶联缓冲溶液,漩涡混匀器混合均匀。然后加入300μg HBP包被抗体到活化的磁珠中。混匀,室温避光震荡孵育1h。孵育后,把玻璃瓶置于磁分离器上,分离后弃上清液。
(4)先加入封闭液,混匀,室温避光震荡孵育30min。
(5)每管中加入的洗涤液,漩涡混匀。4分钟分离,移除上清液。再加入2mL洗涤液,重复洗涤3次。
(6)保存:最后各用保存液复溶。分装后保存于4℃冰箱。使用时,用50mM Tris(PH7.4)+1%BSA缓冲液将HBP磁珠标记物稀释到1mg/mL。
HBP中和标记物(乳胶微球标记)的制备
(1)用活化缓冲液(30mM MES(PH6.0))洗涤1mL(10mg/mL)的羟基乳胶微球(粒径200μm)2次。洗涤过程为:用1mL活化缓冲液混匀吹打乳胶微球,然后用9000G离心力离心15分钟,离心完成后吸去上层清液,然后再次加入活化缓冲液,按照上述步骤再次洗涤1遍。
(2)用1mL活化缓冲液重悬乳胶微球(可超声),加入200mg/mL的EDC溶液200μL,室温活化60分钟;然后用6000G离心力离心20分钟,离心完成后吸去上层清液,然后按照步骤1洗涤2次。
(3)用1mL活化缓冲液重悬乳胶微球(可超声),加入500μg的HBP标记抗体,室温反应1h。然后用6000G离心力离心20分钟,离心完成后吸去上层清液,然后按照步骤1洗涤2次。
(4)用1mL活化缓冲液重悬乳胶微球(可超声),加入1%BSA溶液100μL,室温反应1h。然后用6000G离心力离心20分钟,离心完成后吸去上层清液,然后按照步骤1洗涤2次。
(5)加入保存液重悬乳胶微球,使用时,用稀释液将HBP乳胶标记物稀释到8μg/mL。
HBP示踪标记物(吖啶酯标记)的制备
1)将吖啶酯固体粉末用二甲基甲酰胺溶解到2mg/mL,并置于-20℃保存。
2)HBP抗体用0.1M的磷酸盐缓冲液(PH7.4)稀释至1mg/mL。标记时,将吖啶酯与抗体以摩尔比5:1的比例进行混合,充分搅拌并在室温反应30分钟。
3)用10μL含有10%赖氨酸的0.1M的磷酸盐缓冲液(PH7.4)终止反应,使用反应20分钟。
4)然后将上述标记物用0.1M的磷酸盐缓冲液(PH7.4)透析4小时,以除去游离的吖啶酯及赖氨酸。
5)加入保护蛋白,用稀释液将标记好的吖啶酯标记物稀释到5μg/mL。
实施例3的清洗液、标准品的配制及试剂盒的使用方法均与实施例1中相同,不再重复描述。
对比例1
以中翰盛泰生物的肝素结合蛋白测定试剂盒(免疫荧光法)作为对比例。该对比例可从市场中购买获得,也可按照CN201810318917.4中实施例1公开的方法进行制备。该对比例是基于免疫荧光技术,采用双抗体夹心法,将待测样本与检测缓冲液混匀,检测缓冲液中的荧光标记抗体会与待测样本中HBP抗原结合。加至板条加样孔后,经毛细管作用扩散,在检测区(T)被固定在膜上的配对抗体捕获,形成HBP抗体-HBP-标记抗体复合物。复合物的荧光抗体信号与HBP浓度呈正比,经免疫分析仪或干式荧光免疫分析仪后可计算出样本中HBP抗原的浓度。该对比例的线性区间范围为5.9-300ng/mL。
测试例1检出限测试
采用实施例1、实施例2及实施例3的制备的试剂盒,对样本稀释液进行检测,每个实施例方法制备的试剂盒重复测定20次,得出20次结果的RLU值(相对发光值),计算其平均值(X)和标准差(SD),得出X+2SD,根据样本稀释液和相邻校准品之间的浓度—RLU值结果进行两点线性回归拟合得出一次方程,将X+2SD的RLU值代入上述方程,求出对应的浓度值,即为检出限。
表1
从上述数据可知,本发明实施例的测定试剂盒的检测限均不大于0.2ng/mL,而对比例1的最低检出限为不高于5.9ng/mL。
测试例2线性范围测试
将高浓度的HBP样本用阴性血浆样本梯度稀释至1500ng/mL、1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、50ng/mL、10ng/mL。对每一浓度的样本采用实施例1、实施例2、实施例3及对比例1试剂盒进行检测,每一浓度样本重复检测3次,计算其平均值,将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合,并计算线性相关系数(R)。
表2
根据测试结果,实施例1、实施例2及实施例3的计算相关系数R=0.999,即本试剂盒的线性范围为10-1500ng/mL。而对比例1在该区间,相关系数R=0.75。
测试例3重复性测试
分别采用实施例1、实施例2及实施例3试剂盒对浓度范围在150-250ng/mL(高值样本)和6-20ng/mL(低值样本)的两个样本各重复检测10次,计算10次测量结果的平均值(M)和标准差(SD),根据公式求得变异系数CV(CV=SD/M×100%)。结果见表3。
表3
由表3所示,实施例1、实施例2及实施例3中测试不同浓度的样本得到的CV值均在10%以下,表明本发明测定试剂盒重复性良好。
测试例4临床样本测试
选取40份临床样本(涵盖整个线性范围),其中50%样本浓度值在参考区间外,用本发明实施例1所述试剂盒与进口肝素结合蛋白测定试剂盒(酶联免疫法)(厂家Axis-Shield)对临床样本分别进行检测,计算两者检测结果的相关系数R,检测结果见表4及图1。
表4
由表4和图1所示,本发明试剂盒与进口肝素结合蛋白测定试剂盒(酶联免疫法)(厂家Axis-Shield)相关性良好,R2=0.9945。
所属领域的普通技术人员应当理解:以上任何实施例的讨论仅为示例性的,并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子;在本发明的思路下,以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合,并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化,为了简明它们没有在细节中提供。因此,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何省略、修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (13)
1.一种肝素结合蛋白测定试剂盒,其特征在于,包括固相标记物、示踪标记物、中和标记物、清洗液及底物;所述固相标记物包括包被抗体及固相支撑物,所述包被抗体标记于所述固相支撑物上;所述示踪标记物包括标记抗体及示踪物,所述标记抗体标记于所述示踪物上;所述中和标记物包括微球或磁珠中的一种,以及标记于所述微球或磁珠上的标记抗体;所述中和标记物中的标记抗体与示踪标记物中的标记抗体为针对HBP抗原同一表位的抗体;所述清洗液包括缓冲液及表面活性剂,所述底物为所述示踪物所对应的底物。
2.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白测定试剂盒,其特征在于,所述包被抗体为第一HBP抗体,所述标记抗体为第二HBP抗体,所述第一HBP抗体与第二HBP抗体不具有相同的表位。
3.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白测定试剂盒,其特征在于,所述中和标记物中的微球为乳胶微球,为一种白色微球或有色微球,所述微球的粒径为200-5000nm,所述乳胶微球表面修饰有羟基、羧基或Toysal中至少一种功能基团;所述磁珠为超顺磁珠,所述磁珠的粒径为200-5000nm,所述磁珠的表面修饰有功能基团,所述功能基团选自羧基、羟基或Toysal中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白测定试剂盒,其特征在于,所述固相支撑物选自微孔板或磁珠,所述微孔板由聚苯乙烯或聚氯乙烯制成,所述磁珠为超顺磁珠,所述磁珠的粒径为200-5000nm,所述磁珠的表面修饰有功能基团,所述功能基团选自羧基、羟基或Toysal中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白测定试剂盒,其特征在于,所述所述示踪物包括酶或发光物质,所述酶选自碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶,所述发光物质选自鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯及其衍生物或三联吡啶钌中的一种。
6.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白测定试剂盒,其特征在于,所述试剂盒满足以下工作浓度:
固相标记物的工作浓度为0.1mg/mL~1.0mg/mL;微孔板固相包被浓度为0.5-5μg/mL;
示踪标记物的工作浓度为0.1μg/mL~5.0μg/mL;
中和标记物的工作浓度为0.2μg/mL~8μg/mL。
7.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白测定试剂盒,其特征在于,所述固相标记物中标记抗体的浓度为5~100μg抗体/mg磁珠;
所述示踪标记物中标记抗体与示踪物的比例为1:1~1:50;
所述中和标记物中标记抗体的浓度为5~100μg抗体/mg微球或磁珠。
8.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白测定试剂盒,其特征在于,所述肝素结合蛋白测定试剂盒的检测线性范围为10-1500ng/mL,所述肝素结合蛋白测定试剂盒的最低检测限度为不大于0.2ng/mL。
9.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白测定试剂盒的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将HBP包被抗体包被到磁珠或微孔板上,得到固相标记物;
(2)将HBP标记抗体标记到微球或磁珠上,得到中和标记物;
(3)将HBP标记抗体标记到示踪物上,得到示踪标记物;
(4)将固相标记物、中和标记物、示踪标记物、清洗液及底物组装得到试剂盒。
10.根据权利要求9所述的肝素结合蛋白测定试剂盒的制备方法,其特征在于,所述固相标记物的制备方法,包括以下步骤:(1)将10-40mg磁珠采用偶联缓冲液清洗,磁性分离,弃上清,再用偶联缓冲液复溶,混匀静置,所述偶联缓冲液为10-40mM MES溶液;(2)再加入50-200mg/mL的EDC溶液,混匀,室温避光孵育30min-60min;(3)加入偶联缓冲液,混匀器混合均匀,再加入100-300μg HBP包被抗体至活化的磁珠中,混匀,室温避光振荡孵育30min-60min,孵育后,磁分离,弃上清液;(4)加封闭液,混匀,室温避光振荡孵育30min;(5)加洗涤液,重复洗涤3次;(6)保存:用保存液复溶,分装后保存于4℃冰箱。
11.根据权利要求9所述的肝素结合蛋白测定试剂盒,其特征在于,所述中和标记物的制备方法,包括以下步骤:(1)用10-30mM MES的活化缓冲液洗涤微球,用活化缓冲液吹打微球,再离心,弃上清液,重复洗涤2次;(2)用活化缓冲液重悬微球,加入50-200mg/mL的EDC溶液,室温活化30min-60min,离心,弃上清液,重复步骤(1)洗涤2次;(3)用活化缓冲液重悬微球,加入100-500μg HBP标记抗体,室温反应30min-60min,离心,弃上清液,重复步骤(1)洗涤2次;(4)保存:加入保存液重悬微球,使用时,用稀释液将中和标记物稀释至0.2μg/mL~8μg/mL。
12.根据权利要求9所述的肝素结合蛋白测定试剂盒,其特征在于,所述示踪标记物的制备,包括以下步骤:(1)将0.5-2mg的HBP标记抗体加入100-200mg/mL的活化剂2-亚胺四氢噻吩溶液,于35-38℃反应30min-90min;(2)反应完成后,用脱盐柱进行纯化,收集活化后的抗体,保存于2-8℃备用;(3)取1-5mg碱性磷酸酶溶液,加入5-15mg/mL的4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液,室温反应30-60min;(4)反应完成后用脱盐柱进行纯化,收集含碱性磷酸酶的溶液,并保存于2-8℃备用;(5)将活化好的HBP标记抗体与碱性磷酸酶混合,在2-8℃反应10-20小时;(6)保存,使用时用稀释液将标记好的示踪标记物稀释至0.1-5μg/mL。
13.根据权利要求1-12所述的肝素结合蛋白测定试剂盒,其特征在于,所述肝素结合蛋白测定试剂盒按照以下步骤使用:
(1)加样:将待测样本50μL,加入到固相标记物、示踪标记物、中和标记物混匀,于37℃条件下反应5-10分钟;
(2)示踪标记物和中和标记物竞争结合样本中的肝素结合蛋白,样本中部分肝素结合蛋白被中和掉,剩下的肝素结合蛋白与固相标记物、示踪标记物形成免疫夹心复合物;
(3)重复洗涤,将免疫夹心复合物去除;
(4)加入底物,产生可检测的光电信号,计算待测物的浓度。
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