CN112255416A - 使用磁微粒化学发光定量检测hbp的试剂盒及其制备、检测方法 - Google Patents

使用磁微粒化学发光定量检测hbp的试剂盒及其制备、检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明为使用磁微粒化学发光定量检测HBP的试剂盒及其制备、检测方法，所述试剂盒包括：HBP校准品、HBP试剂1、HBP试剂2、HBP磁分离试剂和HBP质控品，所述HBP校准品包括六个水平，包括不同浓度的HBP抗原和含牛血清白蛋白的Tris缓冲液；所述HBP试剂1包括生物素酯标记的HBP‑Ab和含牛血清白蛋白的Tris缓冲液；所述HBP试剂2包括碱性磷酸酶标记的HBP‑Ab和含牛血清白蛋白的Tris缓冲液；所述HBP磁分离试剂包括链霉亲和素标记的磁微粒和含牛血清白蛋白的Tris缓冲液；所述HBP质控品包括2个质控水平，包括不同浓度的HBP抗原和含牛血清白蛋白的Tris缓冲液。其能够以较低的成本制备得到，且能够实现人肝素结合蛋白(HBP)准确和高精确地定量测定。

Description

使用磁微粒化学发光定量检测HBP的试剂盒及其制备、检测 方法
技术领域
本发明涉及免疫学检测技术领域，具体涉及一种使用磁微粒化学发光定量检测人肝素结合蛋白(HBP)的试剂盒及其制备方法和检测方法。
背景技术
人肝素结合蛋白(heparin-binding protein,HBP)：也被称为azurocidin或者CAP37，是中性粒细胞来源的颗粒蛋白，于1984年由Shafer等首次分离和鉴定。HBP的结构包含222个氨基酸的单链蛋白，含有8个半胱氨酸残基，在第100、114或145位天冬氨酸残基上具有糖基化位点，结构类似于中性粒细胞弹性蛋白，与其同源性为45％，与其他颗粒衍生丝氨酸蛋白酶的同源性为30％～37％。大约74％的HBP储存在嗜苯胺蓝颗粒中，18％在分泌小泡中，而8％在胞质膜上。
释放机制：HBP在细胞成熟的过程中已经被合成并且储存于相应的位置中，一些刺激原能刺激其大量释放。目前已报道的HBP释放机制有：化脓链球菌M蛋白(strepto-coccuspyogenesMprotein)与多形核中性粒细胞(polymorpho-nuclearneutrophils，PMN)表面的β2整合素(β2integrin)以及血液中的纤维蛋白原(fibrinogen，FB)结合形成复合物刺激PMN释放HBP；链球菌溶血素O(streptolysinO，SLO)通过对PMN细胞膜穿孔，胞外钙离子进入细胞内激活p38-丝裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activatedproteinkinases，p38MAPK)信号通路，诱导PMN释放HBP；白细胞释放的小分子物质白三烯B4(leukotrieneB4，LTB4)结合PMN表面BLT1受体，激活胞内磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)信号通路导致HBP释放；A族链球菌引起的丹毒症状激活人体接触系统(humancontactsystem)导致HBP释放。
功能：HBP最早引起注意是它的杀菌功能以及肝素结合能力，人肝素结合蛋白这个名字也因此而得来。
目前临床上人肝素结合蛋白(HBP)的检测有的免疫荧光法、乳胶增强免疫比浊法和ELISA。免疫荧光法应用的是用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法，其特点：特异性强、敏感性高、速度快；主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。
胶乳增强技术是将抗体连接在微小的胶乳颗粒上，当偶联了抗体的微球与抗原相遇时，短时间聚集在一起，形成抗原-抗体-胶乳颗粒复合物，改变了溶液的透光性，溶液的吸光度与抗原的量成比例的变化。特点：增加了免疫复合物的直径，提高了检测敏感性；减少了受到其他非特异性反应的影响(内源性如血脂)。缺点：灵敏度低，分析内精密度差。
ELISA的灵敏度在免疫法基础上有所提升，但仍然较低，并且线性范围窄，分析内精密度差，反应时间也较长，自动化程度较低，仍然不能很好满足临床的应用。
磁微粒化学发光免疫分析法，较以前的免疫荧光法和ELISA，在检测灵敏度、检测范围、检测时间及自动化操作上有了大大提高，且没有污染，临床应用广。
目前，使用磁微粒化学发光分析法在人肝素结合蛋白(HBP)免疫分析产品的应用仍未见。
中国专利CN 110806487 A、CN 204882575 U分别公开了检测人肝素结合蛋白(HBP)的试剂盒及其制备方法，涉及两种检测人肝素结合蛋白(HBP)的胶乳增强免疫比浊试剂盒及制备方法和荧光免疫层析试剂及制备方法。因此，目前尚需一种污染小、灵敏度高、操作简单、自动化程度高、特异性好、成本低的人肝素结合蛋白(HBP)检测试剂盒和使用方法。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供一种使用磁微粒化学发光定量检测人肝素结合蛋白(HBP)的试剂盒，其能够以较低的成本制备得到，且能够实现人肝素结合蛋白(HBP)准确和高精确地定量测定。
本发明是通过如下技术方案来实现的：一种使用磁微粒化学发光定量检测人肝素结合蛋白(HBP)的试剂盒，所述试剂盒包括：HBP校准品、HBP试剂1、HBP试剂2、HBP磁分离试剂和HBP质控品。
所述HBP校准品包括6个水平，由不同浓度的HBP抗原和含牛血清白蛋白的Tris缓冲液配制而成，目标浓度分别为0、20、100、250、500、1000ng/mL；校准品的六水平指HBP抗原浓度分别在下述范围内各取一个值：0、15-30、60-140、200-300、400-600、800-1200。浓度设置最低点0，高点1000(线性范围上限)，其他各点在此范围内尽量均匀分布。
所述HBP试剂1由生物素酯标记的HBP-Ab和含牛血清白蛋白的Tris缓冲液配制而成；
所述HBP试剂2由碱性磷酸酶标记的HBP-Ab和含牛血清白蛋白的Tris缓冲液配制而成；
所述HBP磁分离试剂由链霉亲和素标记的磁微粒和含牛血清白蛋白的Tris缓冲液瓶配制而成；
所述HBP质控品包括2个质控水平(两个质控水平存在于两个不同质控品中，如质控品1和质控品2，其中质控品1为低浓度，质控品2为高浓度，检测两个质控品后分别得到低、高两个浓度的测值)，由两个不同浓度的HBP抗原和含牛血清白蛋白的Tris缓冲液配制而成，两个质控水平的质控品的浓度分别在下述范围内取值：(16-24)ng/mL和(200-300)ng/mL。质控品的浓度具体以HBP抗原的含量计算，比如质控品1的中含有20ng/mLHBP抗原，质控品2中含有250ng/mLHBP抗原。
所述试剂盒检测原理为将待测样本、所述HBP试剂1和试剂2混合温育，样本中的人肝素结合蛋白(HBP)与试剂1中的HBP-Ab-生物素及试剂2中的HBP-Ab-碱性磷酸酶中的HBP-Ab特异性结合，形成免疫复合物，再加入所述HBP磁分离试剂，人肝素结合蛋白(HBP)与HBP-Ab的免疫复合物被吸附到磁微粒表面，洗涤去除未结合物质。碱性磷酸酶(ALP)催化底物发光，测定相对发光强度(RLU)。在一定范围内RLU与样本中人肝素结合蛋白(HBP)浓度呈正相关，通过RLU就可以从标准曲线上计算出待测样本的人肝素结合蛋白(HBP)含量。
本发明采取的又一技术方案是：一种人肝素结合蛋白(HBP)的磁微粒化学发光定量检测试剂盒的制备方法，所述试剂盒的制备方法包括以下步骤：
步骤1.制备所述HBP校准品包括：HBP校准品稀释液配制步骤和HBP校准品配制步骤：
所述HBP校准品稀释液的配制步骤包括：
加800mL纯化水和12.1g的Tris到容器中，搅拌混合均匀，再加8.5g的氯化钠、0.58g的氯化钙和1.51g的MIT(甲基异噻唑啉酮)，搅拌至完全溶解，将pH值调为8.0-8.5，加50g的牛血清白蛋白到容器中，搅拌至完全溶解，再将pH值调为8.0-8.5，用纯化水定容至1L，使用0.2μm滤器过滤，获得的校准品稀释液，将获得的所述校准品稀释液保存在2-8℃待用；
所述HBP校准品的配制步骤包括：
用上述HBP校准品稀释液将人肝素结合蛋白(HBP)抗原分别配制为0、20、100、250、500、1000ng/mL共6个浓度点；
步骤2.制备所述HBP试剂1包括：HBP试剂1稀释液配制步骤和HBP试剂1配制步骤：
所述HBP试剂1稀释液的配制步骤：
加800mL纯化水、6.05g的Tris和5.8g的NaCl于1L容器中，搅拌至完全溶解，再加入1.51g的MIT(甲基异噻唑啉酮)，搅拌至完全溶解，再加入5g的牛血清白蛋白，搅拌至完全溶解，将pH值调为8.0-8.5，用纯化水定容至1L，使用0.2μm滤器过滤，获得试剂1稀释液，将获得的所述试剂1稀释液保存在2-8℃待用；
所述HBP试剂1的配制步骤：
用0.2mol/L的pH9.0碳酸盐缓冲液配制0.5mg/mL的生物素酯(EZ-link NHS-Biotin Reagents)溶液，按照HBP-Ab与生物素酯溶液质量比为10:1的比例在HBP-Ab溶液中加入到上述0.5mg/mL的生物素酯溶液，混合均匀，室温静置18h，反应生成HBP-Ab-生物素酯连接物的反应液；将得到的HBP-Ab-生物素酯连接物的反应液通过G-25凝胶柱进行分离，除去未反应的生物素，得到HBP-Ab-生物素酯连接物；再用所述试剂1稀释液将HBP-Ab-生物素酯连接物稀释到0.1-0.3μg/mL，得到所述的HBP试剂1；
步骤3.制备所述HBP试剂2包括：HBP试剂2稀释液配制步骤和HBP试剂2的配制步骤：
所述HBP试剂2稀释液的配制步骤：
加800mL纯化水、6.06g的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和8.5g的NaCl到容器中，搅拌至完全溶解，再加入5g的牛血清白蛋白、0.1g的ZnCl2、0.1g的MgCl2和1.51g的MIT(甲基异噻唑啉酮)，搅拌至完全溶解，将pH值调为7.0-7.5，用纯化水定容至1L，使用0.2μm滤器过滤，获得试剂2稀释液，将获得的所述试剂2稀释液保存在2-8℃待用；
所述HBP试剂2的配制步骤：
将1mg的HBP-Ab和2-4μL的10mg/mL的偶联剂为2-亚胺四氢噻吩溶液，室温静置20min，加入0.1mol/L的甘氨酸溶液10μL，室温静置5min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后抗体，将活化后的HBP-Ab抗体保存在2-8℃备用；取1.5mg的碱性磷酸酶溶液，加入5mg/mL的4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液10-20μL，室温静置30min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后碱性磷酸酶，将活化后的碱性磷酸酶保存在2-8℃备用；再将上述活化后的HBP-Ab抗体与活化后的碱性磷酸酶混合，在2-8℃条件下静置12-24h，用Supperdex200凝胶纯化柱纯化，获得HBP-Ab-碱性磷酸酶连接物浓溶液，置于2-8℃保存备用；将HBP-Ab-碱性磷酸酶连接物浓溶液用所述试剂2稀释液稀释到0.1-0.3μg/mL，得到所述的HBP试剂2；
步骤4.制备所述HBP磁分离试剂包括：HBP磁分离试剂稀释液配制步骤和HBP磁分离试剂配制步骤：
所述HBP磁分离试剂稀释液配制步骤：
加800mL纯化水、12.1g的Tris和8.5g的NaCl到容器中，搅拌至完全溶解，再加5g的牛血清白蛋白、50mL的新生牛血清和1.51g的MIT(甲基异噻唑啉酮)，搅拌至完全溶解，将pH值调为7.9-8.1，用纯化水定容至1L，使用0.2μm滤器过滤，获得磁分离试剂稀释液，将获得的所述磁分离试剂稀释液保存在2-8℃待用；
所述HBP磁分离试剂配制步骤：
取100mg磁微粒，磁分离去上清，取用0.025mol/L的pH值为4.5-6的2-吗啉乙磺酸缓冲液10mL重悬，室温下混匀2～3h，加入0.5-1.0mL新配制的浓度为10mg/mL的碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的吗啉乙磺酸缓冲液，室温振荡混悬30-60min，使磁珠充分活化，磁分离，去上清，用0.025mol/L的pH值为4.5-6.0的2-吗啉乙磺酸缓冲液10mL重悬，加入4-8mg的链霉亲和素，室温混悬16-20h，再进行磁分离，去上清；用百分比浓度0.5％的牛血清白蛋白，百分比浓度0.5％脱脂奶粉和百分比浓度0.05％吐温-20的2-吗啉乙磺酸缓冲液10mL重悬，室温条件下混匀2～3h，再磁分离，去上清；用所述磁分离试剂稀释液稀释重悬到0.5mg/mL，在2～8℃下平衡16～24h，室温条件下混匀2～3h后，使用超声振荡仪将混悬液中聚集成团的磁珠分散成单颗粒状态，得到所述HBP磁分离试剂。
本发明还提供了一种使用磁微粒化学发光定量检测人肝素结合蛋白(HBP)的试剂盒的检测方法，所述试剂盒的检测方法包括以下步骤：
步骤1.将HBP校准品放到全自动化学发光免疫分析仪测试位置，得到由全自动化学发光免疫分析仪输出的拟合曲线；
步骤2.将HBP质控品放到上述分析仪测试位置，得到由全自动化学发光免疫分析仪输出的质控品的测试发光值和通过步骤1得到的拟合曲线拟合得到HBP质控品的浓度值；
步骤3.将待测样本放到上述分析仪测试位置，得到由全自动化学发光免疫分析仪输出的待测样本的浓度值。
上述使用磁微粒化学发光定量检测人肝素结合蛋白(HBP)的试剂盒的检测方法，所述步骤1、步骤2和步骤3均包括全自动化学发光免疫分析仪的全自动检测步骤：
步骤1)加10μL样本、校准品或质控品至检测管中；
步骤2)加50μL的HBP试剂1和50μL的HBP试剂2至步骤1)所述检测管中，混匀后，37±0.5℃温育10min；
步骤3)加50μL的HBP磁分离试剂至步骤2)所述检测管中，混匀后，37±0.5℃温育5min，进行磁分离，去上清；
步骤4)加300μL的清洗液至检测管中，混匀，进行磁分离，去上清；
步骤5)重复步骤4)两遍；
步骤6)加200μL的化学发光底物至检测管中，混匀，检测发光强度。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
灵敏度－空白限不高于0.1ng/mL；
线性范围－[0.1,1000]ng/mL；
精密度－分析内精密度为＜5％(n＝10)，批间精密度＜10％(n＝30)，精密度远优于国家要求，说明本发明试剂盒在实验过程中具有很好的可重复性；
准确度－将已知人肝素结合蛋白的高值样本加入到低值样本中，计算回收率为95％～105％；
特异性－与降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)的交叉反应率均小于0.1％。
本发明采用的夹心法的反应模式(样本、校准品、质控品中含有HBP抗原，试剂1和试剂2中均含有HBP抗体，将样本、校准品、质控品及试剂加入反应管后的反应过程为双抗体夹心法)，利用磁微粒化学发光检测技术与磁微粒免疫分离技术相结合的原理，定量检测人血浆样品中的人肝素结合蛋白含量，大大的提高了检测的灵敏度、精密度、准确度和线性范围。并且对样品的前处理要求低、可快速高通量检测大批量样本，便于临床试剂应用。本发明为临床检测人血浆中的人肝素结合蛋白提供了一种更准确、精确、方便、快捷和简单的方法。
所述检测方法配合全自动化学发光免疫分析仪实现全自动使用，操作简便，结果判断客观等优点，对于临床诊断具有重要价值，应用前景广阔。
本发明试剂盒用磁微粒化学发光定量检测人肝素结合蛋白(HBP)，选择以生物素酯标记的HBP-Ab和含牛血清白蛋白的Tris缓冲液作为HBP试剂1和碱性磷酸酶标记的HBP-Ab和含牛血清白蛋白的Tris缓冲液作为HBP试剂2、链霉亲和素标记的磁微粒和含牛血清白蛋白的Tris缓冲液作为磁分离试剂，能够保证精准检测的同时拓宽了线性检测的范围，使其检测上限能达到1000ng/mL，且保证了其检测范围内的线性要求。本发明针对人肝素结合蛋白(HBP)进行设计，提高了HBP的检测上限，质控品根据HBP含量设置高低两种浓度，使其能在整个线性范围内均表现出很好的检测效果。当检测到HBP含量不超过10ng/mL时，表明为正常；当现HBP浓度在20～30ng/mL范围内时，说明检测者处于一般性感染；当HBP浓度在超过100ng/mL甚至高达1000ng/mL以上时，说明检测者处于严重感染；需要紧急救治。本发明能精确定量的检测出具体的HBP浓度，检测灵敏度高，有助于后期判断检测者的当前所处状态，并定量给出偏向哪种程度，给出相应的救治方案。采用磁微粒化学发光法，其污染更小、灵敏度更高、操作简单、自动化程度更高、特异性更好好、成本亦较低。
本发明制备方法选择特定组成及含量的特定试剂，实现了HBP的高精度快速检测；检测方法能够排除外界干扰，保证检测精度，提高测试结果的准确性，在尽量短的时间内完成人肝素结合蛋白(HBP)的定量检测，检测精度及灵敏度高，在保证高精度的前提下满足试剂盒快速检测的实际需要。
附图说明
图1是本申请实施例中人肝素结合蛋白检测试剂盒的校准曲线图；
图2是本申请实施例中人肝素结合蛋白检测试剂盒的检测线性范围结果图；
图3是本申请实施例中分别采用人肝素结合蛋白检测试剂盒和进口试剂盒进行检测的检测结果的相关性分析图。
图3中的横坐标x为对比方法的试剂盒样本测值，浓度单位为ng/mL，纵坐标y为所述申请试剂盒样本测值，浓度单位为ng/mL。
具体实施方式
下面结合实施例及附图进一步解释本发明，但并不以此作为对本申请保护范围的限定。
实施例1
一种使用磁微粒化学发光定量检测人肝素结合蛋白(HBP)的试剂盒，该试剂盒包括：HBP校准品、HBP试剂1、HBP试剂2、HBP磁分离试剂、HBP质控品。
试剂盒的制备方法包括以下内容：
步骤1.制备所述HBP校准品包括：HBP校准品稀释液配制步骤和HBP校准品配制步骤：
所述HBP校准品稀释液的配制步骤包括：
加800mL纯化水和12.1g的Tris到容器中，搅拌混合均匀，再加8.5g的氯化钠、0.58g的氯化钙和1.51g的MIT(甲基异噻唑啉酮)，搅拌至完全溶解，将pH值调为8.0-8.5，加50g的牛血清白蛋白到容器中，搅拌至完全溶解，再将pH值调为8.0-8.5，用纯化水定容至1L，使用0.2μm滤器过滤，将获得的所述校准品稀释液保存在2-8℃待用；
所述HBP校准品的配制步骤包括：
用上述HBP校准品稀释液将肝素结合蛋白(HBP)抗原分别配制为0、20、100、250、500、1000ng/mL共6个浓度点；
步骤2.制备所述HBP试剂1包括：HBP试剂1稀释液配制步骤和HBP试剂1配制步骤：
所述HBP试剂1稀释液的配制步骤：
加800mL纯化水、6.05g的Tris和5.8g的NaCl于1L容器中，搅拌至完全溶解，再加入1.51g的MIT(甲基异噻唑啉酮)，搅拌至完全溶解，再加入5g的牛血清白蛋白，搅拌至完全溶解，将pH值调为8.0-8.5，用纯化水定容至1L，使用0.2μm滤器过滤，将获得的所述试剂1稀释液保存在2-8℃待用；
所述HBP试剂1的配制步骤：
用0.2mol/L的pH9.0碳酸盐缓冲液配制0.5mg/mL的生物素酯(EZ-link NHS-Biotin Reagents)溶液，按照HBP-Ab与生物素酯溶液质量比为10:1的比例在HBP-Ab溶液中加入到上述0.5mg/mL的生物素酯溶液，混合均匀，室温静置18h，反应生成HBP-Ab-生物素酯连接物的反应液，将得到的HBP-Ab-生物素酯连接物反应液通过G-25凝胶柱进行分离，除去未反应的生物素，得到HBP-Ab-生物素酯连接物，再用所述试剂1稀释液将HBP-Ab-生物素酯连接物稀释到0.1-0.3μg/mL，得到所述的试剂1；
步骤3.制备所述HBP试剂2包括：HBP试剂2稀释液配制步骤和HBP试剂2的配制步骤：
所述HBP试剂2稀释液的配制步骤：
加800mL纯化水、6.06g的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和8.5g的NaCl到容器中，搅拌至完全溶解，再加入5g的牛血清白蛋白、0.1g的ZnCl2、0.1g的MgCl2和1.51g的MIT(甲基异噻唑啉酮)，搅拌至完全溶解，将pH值调为7.0-7.5，用纯化水定容至1L，使用0.2μm滤器过滤，将获得的所述试剂2稀释液保存在2-8℃待用；
所述HBP试剂2的配制步骤：
将1mg的HBP-Ab和2-4μL的10mg/mL的偶联剂为2-亚胺四氢噻吩溶液，室温静置20min，加入0.1mol/L的甘氨酸溶液10μL，室温静置5min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后抗体，将活化后的抗体保存在2-8℃备用，取1.5mg的碱性磷酸酶溶液，加入5mg/mL的4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液10-20μL，室温静置30min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后碱性磷酸酶，将活化后的碱性磷酸酶保存在2-8℃备用，再将上述活化的HBP-Ab与活化的碱性磷酸酶混合，在2-8℃条件下静置12-24h，用Supperdex200凝胶纯化柱纯化，获得HBP-Ab-碱性磷酸酶连接物浓溶液，置于2-8℃保存备用，将HBP-Ab-碱性磷酸酶连接物浓溶液用所述试剂2稀释液稀释到0.1-0.3μg/mL，得到所述的试剂2；
步骤4.制备所述HBP磁分离试剂包括：HBP磁分离试剂稀释液配制步骤和HBP磁分离试剂配制步骤：
所述HBP磁分离试剂稀释液配制步骤：
加800mL纯化水、12.1g的Tris和8.5g的NaCl到容器中，搅拌至完全溶解，再加5g的牛血清白蛋白、50mL的新生牛血清和1.51g的MIT(甲基异噻唑啉酮)，搅拌至完全溶解，将pH值调为7.9-8.1，用纯化水定容至1L，使用0.2μm滤器过滤，将获得的所述磁分离试剂稀释液保存在2-8℃待用；
所述HBP磁分离试剂配制步骤：
取100mg磁微粒，磁分离去上清，取用0.025mol/L的pH值为4.5-6的2-吗啉乙磺酸缓冲液10mL重悬，室温下混匀2～3h，加入0.5-1.0mL新配制的浓度为10mg/mL的碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的吗啉乙磺酸缓冲液，室温振荡混悬30-60min，使磁珠充分活化，磁分离，去上清，用0.025mol/L的pH值为4.5-6的2-吗啉乙磺酸缓冲液10mL重悬，加入4-8mg的链霉亲和素，室温混悬16-20h，再进行磁分离，去上清，用百分比浓度0.5％的牛血清白蛋白，百分比浓度0.5％脱脂奶粉和百分比浓度0.05％吐温-20的2-吗啉乙磺酸缓冲液10mL重悬，室温条件下混匀2～3h，再磁分离，去上清，用磁微粒缓冲液稀释重悬到0.5mg/mL，在2～8℃下平衡16～24h，室温条件下混匀2～3h后，使用超声振荡仪将混悬液中聚集成团的磁珠分散成单颗粒状态，得到所述HBP磁分离试剂。
本发明所述试剂盒的分析性能评价：
1)准确度评价
将浓度约为1000ng/mL(允许其浓度偏差为±20％)的人肝素结合蛋白(HBP)样品A加入到低值样品B(低于高值样本的值)中，所加入A的体积不超过总体积A+B的10％，根据公式(1)计算回收率R，本方法的回收率在95-105％范围内，数据参见表1。
Figure BDA0002708245890000091
R：回收率；
V：加入样本A液的体积；
V0：样本B液的体积；
C：样本B液加入A液后的检测浓度；
C0：样本B液的检测浓度；
Cs：样本A液的浓度。
表1-准确度评价—添加回收实验数据
Figure BDA0002708245890000092
2)空白限评价
用零浓度校准品作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的RLU，RLU为相对发光值，计算其平均值M和标准差SD，得出M+2SD所对应的RLU值，根据零浓度校准品与相邻校准品之间的浓度-RLU值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD所对应的RLU值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为空白限。本方法的空白限不大于0.1ng/mL。本实施例中校准品有6个浓度点，分别将其命名为校准品A、B、C、D、E、F，校准品A为零浓度校准品，校准品B为其相邻校准品，校准曲线如图1所示。具体数据参见表2。
表2空白限评价
Figure BDA0002708245890000101
3)线性范围评价
将接近线性范围上限为1000ng/mL的高值样本按一定比例稀释为至少5种浓度，其中低值浓度的样本须接近线性范围的下限。按试剂盒说明书进行操作，对每一浓度的样本均重复检测2次，计算其平均值，将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数r，本方法的线性范围为0.1～1000ng/mL，相关系数r应≥0.9900。数据参见表3。曲线见图2。
表3线性范围评价
Figure BDA0002708245890000102
4)分析内精密度评价
取本实施例中的试剂盒重复检测浓度为20±4ng/mL和250±50ng/mL的样本各10次，计算10次测量结果的平均值M和标准差SD，根据公式CV＝SD/M×100％得出变异系数CV，本方法变异系数(CV)不大于5％。数据参见表4。
CV＝SD/M×100％......(2)
式中：CV—变异系数；
SD—测量结果的标准差；
M—测量结果的平均值。
表4分析内精密度评价
HBP浓度(ng/mL) 测定次数 分析内CV(％)
20 10 2.83％
250 10 1.87％
5)批间精密度评价
将实施例的试剂盒取三批，每批试剂盒均测定浓度在20±4ng/mL和250±50ng/mL范围内的样本，每批重复测定10次，计算30次测定结果的平均值(M)和标准差(SD)，根据公式(2)计算变异系数(CV)，本方法变异系数(CV)不大于10％。数据参见表5。
表5批间精密度评价
HBP浓度(ng/mL) 测定次数 批间CV(％)
20 30 5.84％
250 30 4.05％
6)特异性评价
取1份HBP浓度含量接近于0ng/mL的样本，加入降钙素原和C反应蛋白，使样本中降钙素原和C反应蛋白分别为100ng/mL和100μg/mL，使用该试剂盒对该样本进行检测，测定样本中的HBP含量。结果见表6，本方法与人血清白蛋白无交叉反应。数据参见表6。
表6特异性实验
测试交叉反应物 浓度 RLU 干扰度
PCT 100ng/mL 507 ＜0.1％
CRP 100μg/mL 1040 ＜0.1％
7)相关性评价
用实施例的试剂盒和进口的商品化的人肝素结合蛋白(HBP)检测试剂盒(酶联免疫法)对126份人血浆样品同时进行检测。其检测结果如图3所示，以人肝素结合蛋白(HBP)检测试剂盒酶联免疫法测定的结果为横坐标，以本发明方法的测定的结果为纵坐标作回归分析，相关方程为：y＝0.941x-5.0339，相关系数为R2：0.9962。经统计学处理结果表明，本方法同其他方法的试剂盒临床样本测值相关性良好。
实施例2
一种使用磁微粒化学发光定量检测肝素结合蛋白(HBP)的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
步骤1.将HBP校准品放到全自动化学发光免疫分析仪测试位置，分析仪测得不同校准品浓度下的发光值，得到由全自动化学发光免疫分析仪输出发光值-浓度值的拟合曲线，即校准曲线；
步骤2.将HBP质控品放到上述分析仪测试位置，分析仪测得不同质控品浓度下的发光值，得到由全自动化学发光免疫分析仪输出的所述质控品的测试发光值和通过步骤1得到的拟合曲线拟合得到HBP质控品的浓度值；在所有质控品的浓度均在规定的范围内时证明本次实验有效，可进行后续实验，初步排除系统误差；
步骤3.将待测样本放到上述分析仪测试位置，分析仪测得该样本下的发光值，结合拟合曲线得到待测样本的浓度值。
所述步骤1、步骤2和步骤3均包括全自动化学发光免疫分析仪的全自动检测步骤：
1)加10μL样本、校准品或质控品至检测管中，校准品、质控品、样本可以统一称之为待测物；
2)加50μL的HBP试剂1和50μL的HBP试剂2至步骤1)所述检测管中，混匀后，37±0.5℃温育10min；
3)加50μL的HBP磁分离试剂至步骤2)所述检测管中，混匀后，37±0.5℃温育5min，进行磁分离，去上清；
4)加300μL的清洗液至检测管中，混匀，进行磁分离，去上清；
5)重复步骤4)两遍；
6)加200μL的化学发光底物至检测管中，混匀，检测发光强度。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明未述及之处适用于现有技术。

Claims (6)

1.一种使用磁微粒化学发光定量检测人肝素结合蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括：HBP校准品、HBP试剂1、HBP试剂2、HBP磁分离试剂和HBP质控品，其特征在于：
所述HBP校准品包括六个水平，包括不同浓度的HBP抗原和含牛血清白蛋白的Tris缓冲液；校准品的六水平指HBP抗原浓度分别在下述范围内各取一个值：0、15-30、60-140、200-300、400-600、800-1200；
所述HBP试剂1包括生物素酯标记的HBP-Ab和含牛血清白蛋白的Tris缓冲液；
所述HBP试剂2包括碱性磷酸酶标记的HBP-Ab和含牛血清白蛋白的Tris缓冲液；
所述HBP磁分离试剂包括链霉亲和素标记的磁微粒和含牛血清白蛋白的Tris缓冲液；
所述HBP质控品包括2个质控水平，包括不同浓度的HBP抗原和含牛血清白蛋白的Tris缓冲液，两个质控品的浓度的取值范围分别为：(16-24)ng/mL和(200-300)ng/mL。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述标准品的六水平目标浓度分别为0、20、100、250、500、1000ng/mL。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，人肝素结合蛋白线性检测范围为[0.1,1000]ng/mL；分析内精密度＜5％，批间精密度＜10％；空白限不高于0.1ng/mL；将已知人肝素结合蛋白的高值样本加入到低值样本中，计算回收率为95％～105％；与降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)的交叉反应率均小于0.1％。
4.一种权利要求1-3任一所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，该方法包括下述步骤：
步骤1.制备所述HBP校准品包括：HBP校准品稀释液配制步骤和HBP校准品配制步骤：
所述HBP校准品稀释液的配制步骤包括：
加800mL纯化水和12.1g的Tris到容器中，搅拌混合均匀，再加8.5g的氯化钠、0.58g的氯化钙和1.51g的MIT(甲基异噻唑啉酮)，搅拌至完全溶解，将pH值调为8.0-8.5，加50g的牛血清白蛋白到容器中，搅拌至完全溶解，再将pH值调为8.0-8.5，用纯化水定容至1L，使用0.2μm滤器过滤，获得的校准品稀释液，将获得的校准品稀释液保存在2-8℃待用；
所述HBP校准品的配制步骤包括：
用HBP校准品稀释液将人肝素结合蛋白(HBP)抗原分别配制为0、20、100、250、500、1000ng/mL共6个浓度点；
步骤2.制备所述HBP试剂1包括：HBP试剂1稀释液配制步骤和HBP试剂1配制步骤：
所述HBP试剂1稀释液的配制步骤：
加800mL纯化水、6.05g的Tris和5.8g的NaCl于1L容器中，搅拌至完全溶解，再加入1.51g的MIT(甲基异噻唑啉酮)，搅拌至完全溶解，再加入5g的牛血清白蛋白，搅拌至完全溶解，将pH值调为8.0-8.5，用纯化水定容至1L，使用0.2μm滤器过滤，获得试剂1稀释液，将获得的试剂1稀释液保存在2-8℃待用；
所述HBP试剂1的配制步骤：
用0.2mol/L的pH9.0碳酸盐缓冲液配制0.5mg/mL的生物素酯(EZ-link NHS-BiotinReagents)溶液，按照HBP-Ab与生物素酯溶液质量比为10:1的比例在HBP-Ab溶液中加入到上述0.5mg/mL的生物素酯溶液，混合均匀，室温静置18h，反应生成HBP-Ab-生物素酯连接物的反应液；将得到的HBP-Ab-生物素酯连接物的反应液通过G-25凝胶柱进行分离，除去未反应的生物素，得到HBP-Ab-生物素酯连接物；再用所述试剂1稀释液将HBP-Ab-生物素酯连接物稀释到0.1-0.3μg/mL，得到HBP试剂1；
步骤3.制备所述HBP试剂2包括：HBP试剂2稀释液配制步骤和HBP试剂2的配制步骤：
加800mL纯化水、6.06g的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和8.5g的NaCl到容器中，搅拌至完全溶解，再加入5g的牛血清白蛋白、0.1g的ZnCl2、0.1g的MgCl2和1.51g的MIT(甲基异噻唑啉酮)，搅拌至完全溶解，将pH值调为7.0-7.5，用纯化水定容至1L，使用0.2μm滤器过滤，获得试剂2稀释液，将获得的试剂2稀释液保存在2-8℃待用；
所述HBP试剂2的配制步骤：
将1mg的HBP-Ab和2-4μL的10mg/mL的偶联剂为2-亚胺四氢噻吩溶液，室温静置20min，加入0.1mol/L的甘氨酸溶液10μL，室温静置5min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后抗体，将活化后的HBP-Ab抗体保存在2-8℃备用；取1.5mg的碱性磷酸酶溶液，加入5mg/mL的4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液10-20μL，室温静置30min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后碱性磷酸酶，将活化后的碱性磷酸酶保存在2-8℃备用；再将上述活化后的HBP-Ab抗体与活化后的碱性磷酸酶混合，在2-8℃条件下静置12-24h，用Supperdex200凝胶纯化柱纯化，获得HBP-Ab-碱性磷酸酶连接物浓溶液，置于2-8℃保存备用；将HBP-Ab-碱性磷酸酶连接物浓溶液用所述试剂2稀释液稀释到0.1-0.3μg/mL，得到HBP试剂2；
步骤4.制备所述HBP磁分离试剂包括：HBP磁分离试剂稀释液配制步骤和HBP磁分离试剂配制步骤：
所述HBP磁分离试剂稀释液配制步骤：
加800mL纯化水、12.1g的Tris和8.5g的NaCl到容器中，搅拌至完全溶解，再加5g的牛血清白蛋白、50mL的新生牛血清和1.51g的MIT(甲基异噻唑啉酮)，搅拌至完全溶解，将pH值调为7.9-8.1，用纯化水定容至1L，使用0.2μm滤器过滤，获得磁分离试剂稀释液，将获得的磁分离试剂稀释液保存在2-8℃待用；
所述HBP磁分离试剂配制步骤：
取100mg磁微粒，磁分离去上清，取用0.025mol/L的pH值为4.5-6的2-吗啉乙磺酸缓冲液10mL重悬，室温下混匀2～3h，加入0.5-1.0mL新配制的浓度为10mg/mL的碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的吗啉乙磺酸缓冲液，室温振荡混悬30-60min，使磁珠充分活化，磁分离，去上清，用0.025mol/L的pH值为4.5-6.0的2-吗啉乙磺酸缓冲液10mL重悬，加入4-8mg的链霉亲和素，室温混悬16-20h，再进行磁分离，去上清；用百分比浓度0.5％的牛血清白蛋白，百分比浓度0.5％脱脂奶粉和百分比浓度0.05％吐温-20的2-吗啉乙磺酸缓冲液10mL重悬，室温条件下混匀2～3h，再磁分离，去上清；用所述磁分离试剂稀释液稀释重悬到0.5mg/mL，在2～8℃下平衡16～24h，室温条件下混匀2～3h后，使用超声振荡仪将混悬液中聚集成团的磁珠分散成单颗粒状态，得到所述HBP磁分离试剂。
5.一种使用磁微粒化学发光定量检测HBP的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
步骤1.将HBP校准品放到全自动化学发光免疫分析仪测试位置，分析仪测得不同校准品浓度下的发光值，得到由全自动化学发光免疫分析仪输出的发光值-浓度值的拟合曲线，即校准曲线；
步骤2.将HBP质控品放到上述分析仪测试位置，分析仪测得不同质控品浓度下的发光值，得到由全自动化学发光免疫分析仪输出的所述质控品的测试发光值和通过步骤1得到的拟合曲线拟合得到HBP质控品的浓度值；在所有质控品的浓度均在规定的范围内时进行步骤3；
步骤3.将待测样本放到上述分析仪测试位置，分析仪测得该样本下的发光值，结合拟合曲线得到待测样本的浓度值。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：步骤1、步骤2和步骤3均包括全自动化学发光免疫分析仪的全自动检测步骤：
1)加10μL样本、校准品或质控品至检测管中，校准品、质控品、样本可以统一称之为待测物；
2)加50μL的HBP试剂1和50μL的HBP试剂2至步骤1)所述检测管中，混匀后，37±0.5℃温育10min；
3)加25μL的HBP磁分离试剂至步骤2)所述检测管中，混匀后，37±0.5℃温育5min，进行磁分离，去上清；
4)加300μL的清洗液至检测管中，混匀，进行磁分离，去上清；
5)重复步骤4)两遍；
6)加200μL的化学发光底物至检测管中，混匀，检测发光强度。
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