JP2001288198A - ヘパリン高親和性ペプチド結合担体およびヘパリン抗血栓活性画分の分離精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 ヘパリンに高親和性を有するペプチド、
該ペプチドを結合させた担体、該担体を用いてヘパリン
分子中の抗血栓活性画分を分離精製する方法、および該
方法により得られるヘパリン抗血栓活性画分。 【効果】 本発明によれば、抗血栓剤として臨床上有用
な、ヘパリン分子中の抗血栓活性画分を効率よく分離精
製することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はヘパリンに高親和性
を有するペプチド、該ペプチドを結合させた担体、該担
体を用いてヘパリン分子中の抗血栓活性画分を分離精製
する方法、および該方法により得られるヘパリン抗血栓
活性画分に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヘパリンは、小腸や肺に主に存在するム
コ多糖の一種で、抗血液凝固作用（抗血栓作用）を有す
る。一方、アンチトロンビンIII はトロンビンをはじ
め、多くのセリンプロテアーゼと複合体を形成し、その
血液凝固活性を阻害する。ヘパリンはアンチトロンビン
III と結合して複合体を形成することによってアンチト
ロンビンIII による上記阻害反応を著しく促進する。従
って、ヘパリンは、血液凝固系に異常のある疾患の治療
や人工透析・人工心肺などを用いた体外循環血液の凝固
抑制など臨床上広く用いられ、さらには生体内に導入さ
れる医療器具に抗血栓性を付与するためにも用いられ
る。

【０００３】Anderssonら [L.O.Andersson et al., Thr
omb. Res., 9, 575 (1976)]、および Hook、Lam らはそ
れぞれ独立して天然ヘパリンの 30-50％の分子種のみが
アンチトロンビンIII（以下、AT IIIと表記する) と結
合し得るが、残りの分子種は結合しないことを発見し
た。その後、このようなAT IIIと高い親和性でもって結
合するヘパリン分子（以下、AT III高親和性ヘパリン分
子という）の構造と活性の相関性について種々の研究が
なされた結果、抗血栓作用の活性部位は、その分子中の
AT III 結合性オリゴ糖鎖部分、詳しくはヘパリンの構
成糖の内の５つの糖からなる部位を含む 18-20ユニット
の糖鎖部分に存在し、その作用は抗第Ｘａ因子活性に基
づくものであることが判明した。

【０００４】従って、抗血栓作用に必須と考えられる、
ヘパリンの上記 AT III 結合性オリゴ糖鎖部分のみを分
離精製することができれば、高活性でかつ安価な抗血栓
剤として提供できることが期待される。従来より、上記
の目的のために、ヘパリンを亜硝酸分解、過酸化水素分
解などの化学的分解法、ヘパリン分解酵素による脱重合
反応などの酵素的分解法によって低分子化した後、さら
にこれをAT IIIを結合した担体を保持させたカラム（AT
III結合性アフィニティーカラム）で分離精製すること
が行われている。しかしながら、AT IIIは非常に分子量
の大きな蛋白であり、それを固定化した担体は高価でコ
スト的に問題がある。しかも、AT III自体が塩基性アミ
ノ酸を多く有しており、低分子量ヘパリンが高濃度で存
在する条件下では単純な静電相互作用によって生体内で
の実際の結合部位以外でヘパリンが結合する可能性もあ
る。また、担体に結合させたAT IIIの安定性にも問題が
あり、分離精製工程中にAT III由来の分解物がそれに結
合したヘパリン分子の方に流入してしまうことも懸念さ
れる。

【０００５】これまで、ATIII 中にはヘパリンとの結合
性を示す特定のフラグメントの存在が知られている。例
えば、ATIII の278-293 位のフラグメント（Pro-Lys-Pr
o-Glu-Lys-Ser-Leu-Ala-Lys-Val-Glu-Lys-Glu-Leu-Thr-
Pro)は、ヘパリンとの結合性を有する可能性が示されて
いる[The Journal of Biological Chemistry, 4, 2531-
2536 (1984)]。本フラグメントは、分子内にαヘリック
ス構造を形成し、またリジンを豊富に含んでいるために
正の電荷を帯びており、負の電荷を有するヘパリンと相
互作用すると考えられる。

【０００６】ATIII の123-141 位のフラグメント(Phe-A
la-Lys-Leu-Asn-Cys-Arg-Leu-Tyr-Arg-Lys-Ala-Asn-Lys
-Ser-Ser-Lys-Leu-Val) もまた、ヘパリンとの結合性を
有することが示されている[The Journal of Biological
Chemistry, 262, 11964-11972 (1987) 、Biochem. J.,
301, 121-129 (1994)] 。本フラグメントも同じく分子
内にαヘリックス構造を有し、かつリジン及びアルギニ
ン等の塩基性アミノ酸を豊富に含んでいるので、上記と
同様の機序によりヘパリンに結合すると考えられる。

【０００７】一方、The Journal of Biological Chemis
try, 30, 21946-21953 (1992) には、 ATIIIの41位のプ
ロリン、47位のアルギニン、49位のトリプトファンの、
また、Biochemistry, 26, 4403-4408 (1987)においても
49 位のトリプトファンのヘパリン結合への関与が示さ
れている。しかしながら、これらの塩基性アミノ酸を含
む領域に関し、ヘパリンとの結合性を発揮しうるフラグ
メントの特定には至っていない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、ヘパ
リン高親和性ペプチドを利用し、ヘパリン分子中の抗血
栓活性画分を効率的に分離精製することを目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、ATIII 中にヘパリ
ンとの親和性の非常に高い部分ペプチドを見い出すとと
もに、該ペプチドを固定化した担体を開発することに成
功し、本発明を完成させるに至った。

【００１０】すなわち、本発明は以下の(1) 〜(7): (1) 少なくとも配列番号１に記載のアミノ酸配列を含
み、かつヘパリンに高親和性を有するペプチド、(2)
上記(1) のペプチドを結合させた担体、(3) 配列番号
５に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを結合させた
担体、(4) 少なくとも配列番号６に記載のアミノ酸配
列を含み、かつヘパリンに高親和性を有するペプチドを
結合させた担体、(5) 配列番号８に記載のアミノ酸配
列からなるペプチドを結合させた担体、(6) 上記(2)
〜(5) のいずれかの担体に、ヘパリン自体またはヘパリ
ン処理物を含有する溶液を接触させることを特徴とす
る、ヘパリン分子中の抗血栓活性画分の分離精製方法、
および(7) 上記方法により得られるヘパリン抗血栓活
性画分の発明である。本明細書において、「ヘパリン」
とは、ヘパリンのナトリウム、カリウム、カルシウム等
の塩をも含む。以下、本発明を詳細に説明する。

【００１１】

【発明を実施するための形態】[1] ヘパリン高親和性ペ
プチドの合成 本発明のヘパリン高親和性ペプチドは公知のペプチド合
成の常法に従って合成できる。例えば「ザ．ペプチド(T
he Peptides)」第1巻(1966年) [Schreder andLuhke
著、Academic Press, New York, U.S.A.] 、あるいは
「ペプチド合成」［泉屋ら著、丸善株式会社(1975年)］
の記載に従い、具体的には、アジド法、酸クロライド
法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エス
テル法（P-ニトロフエニルエステル法、Ｎ−ヒドロキシ
コハク酸イミドエステル法、シアノメチルエステル法な
ど）、ウッドワード試薬Ｋを用いる方法、カルボイミダ
ゾール法、酸化還元法、ＤＣＣ−アディティブ（ＨＯＮ
Ｂ、ＨＯＢｔ、ＨＯＳｕ）法など、各種の方法により合
成することができる。これらの方法は、固相合成及び液
相合成のいずれにも適用できる。

【００１２】本発明においてペプチド合成は、上記のよ
うな一般的なポリペプチドの合成法に従って、例えば末
端アミノ酸に順次１個ずつアミノ酸を縮合させるいわゆ
るステップワイズ法によって、または数個のフラグメン
トに分けてカップリングさせていく方法により行われ
る。

【００１３】例えばステップワイズ法による固相合成
は、具体的には、メリフィールド（Merrifield.R.B.)の
方法 [Solid phase peptide synthesis, J.Amer.Chem.S
oc., 85, 2149-2159 (1963)]に従い、以下のようにして
行うことができる。まず、Ｃ末端アミノ酸（アミノ基を
保護したもの）をそのカルボキシル基によって不溶性樹
脂に結合させ、その後、該Ｃ末端アミノ酸のアミノ基の
保護基を除去する。次いで、得られたこの遊離の反応性
アミノ基に、目的とするペプチドのアミノ酸配列に従っ
て、アミノ基を保護したアミノ酸の反応性カルボキシル
基を縮合反応により順次結合させる。このようにして一
段階ずつ全配列を合成した後、ペプチドを不溶性樹脂か
らはずす。

【００１４】上記の固相合成において用いられる不溶性
樹脂は、反応性カルボキシル基との結合性を有するもの
であればいずれをも使用でき、例えばベンズヒドリルア
ミン樹脂（BHA樹脂）、クロルメチル樹脂、オキシメチ
ル樹脂、アミノメチル樹脂、メチルベンズヒドリル樹脂
（MBHA樹脂）、４−アミノメチルフェノキシメチル樹
脂、４−ヒドロキシメチルフェノキシメチル樹脂、４−
オキシメチルフェニルアセタミドメチル樹脂などが挙げ
られる。

【００１５】また、α−アミノ基の保護基として９−フ
ルオレニルメチルオキシカルボニル基（Fmoc)を使用す
る場合は４−ヒドロキシメチルフェノキシメチル樹脂な
ど、トリフルオロ酢酸(TFA)によって樹脂から脱離でき
るものがよく、ｔ−ブトキシカルボニル基(Boc)を使用
する場合は４−オキシメチルフェニルアセタミドメチル
樹脂（PAM樹脂）など、フッ化水素などによって樹脂か
ら脱離できるものがよい。

【００１６】樹脂1g当りペプチド濃度は0.5mmole以下と
することが好ましい。上記の方法においては、アミノ酸
のペプチド結合に関与するアミノ基への保護基の結合及
び該保護基の脱離、ならびにアミノ酸のペプチド結合に
関与するカルボキシル基の活性化が必要である。

【００１７】アミノ基の保護基として、例えば、ベンジ
ルオキシカルボニル（Ｚ）、ｔ−ブトキシカルボニル
（Boc）、ｔ−アミノオキシカルボニル（Aoc）、イソボ
ニルオキシカルボニル、p-メトキシベンジルオキシカル
ボニル、２−クロル−ベンジルオキシカルボニル、アダ
マンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フ
タロイル、ホルミル、o-ニトロフェニルスルフェニル、
ジフェニルホスフイノチオイルなどの基が挙げられる。

【００１８】また、アミノ酸の中で、側鎖に官能基を有
するもの、例えばHis、Tyr、Thr、Lys、Asp、Arg及びSe
rは、その側鎖の官能基を保護しておくのが好ましい。
官能基の保護は、通常用いられている方法で、下記のよ
うな通常の保護基を結合させることにより行われ、反応
終了後、該保護基は脱離される。Hisのイミノ基の保護
基としては、例えばベンジルオキシメチル（Bom）、p-
トルエンスルホニル（Tos)、ベンジル（Bzl）、ベンジ
ルオキシカルボニル（Ｚ）、トリチル基などが挙げられ
る。

【００１９】Ser及びThrの水酸基は、例えばエステル化
またはエーテル化によって保護することができるが、こ
の保護は必須ではない。エステル化に適する基として
は、アセチルなどの低級アルカノイル基、ベンゾイルな
どのアロイル基、ベンゾイルオキシカルボニル、エチル
オキシカルボニルなどの炭酸から誘導される基などが挙
げられる。またエーテル化に適する基としては、ベンジ
ル（Bzl）、テトラヒドロピラニル、tert−ブチル基な
どが挙げられる。

【００２０】Tyrの水酸基の保護基としては、例えばベ
ンジル（Bzl）、ブロモベンジルオキシカルボニル（Br-
Z) 、ジクロロベンジル（Cl₂-Bzl) 、ベンジルオキシカ
ルボニル（Ｚ）、アセチル、p-トルエンスルホニル（To
s)基などが挙げられる。Lysのアミノ基の保護基として
は、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、クロロベ
ンジルオキシカルボニル（Cl-Z) 、ジクロロベンジル
（Cl₂-Bzl)、ｔ−ブトキシカルボニル基（Boc）、p-ト
ルエンスルホニル（Tos）基などが挙げられる。

【００２１】Argのグアニジノ基の保護基としては、例
えばp-トルエンスルホニル（Tos）、ニトロ、ベンジル
オキシカルボニル（Ｚ）、ｔ−アミルオキシカルボニル
（Aoc）基などが挙げられる。Aspのカルボキシル基の保
護は、例えばベンジルアルコール、メタノール、エタノ
ール、tert−ブタノール、シクロヘキシル(cHex)などに
よるエステル化により行われる。

【００２２】その他のアミノ酸の保護基として、Trpの
インドリル基の保護基としては、例えばホルミル、カル
ボベンゾキシル、4-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼ
ンスルホニル、2,2,2-トリクロロエチルオキシカルボニ
ルなどが挙げられるが、この保護は必須ではない。Met
のチオメチル基の保護基としては予めメチルスルホキシ
ドにしておき、後に還元する方法があるが、この保護は
必須ではない。

【００２３】一方、カルボキシル基の活性化は、従来公
知の方法にて行うことができ、用いられる試薬なども公
知のものから適宜選択しえる。例えば、カルボキル基の
活性化は、該カルボキシル基と種々の試薬とを反応さ
せ、対応する酸クロライド、酸無水物または混合酸無水
物、アジド、活性エステル（ペンタクロロフェノール、
p-ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、
Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシ−
５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等との
エステル）などを形成させることにより行う。

【００２４】上記の固相における反応性アミノ基と反応
性カルボキシル基との縮合反応（ペプチド結合形成反
応）に用いる溶媒としては、ペプチド結合形成に使用で
きるものであればいずれでもよい。例えば無水または含
水のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホ
キシド（DMSO）、ピリジン、クロロホルム、ジオキサ
ン、ジクロロメタン（DCM)、テトラヒドロフラン（TH
F)、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリドン、ヘキサメチル
リン酸トリアミド（HMPA)などを単独で、あるいは２種
以上の混合溶媒として使用することができる。

【００２５】また、上記縮合反応は、縮合剤、例えばジ
シクロヘキシルカルボキシイミド（DCC)、カルボジイミ
ダゾールなどのカルボジイミド試薬やテトラエチルピロ
ホスフェイト、ベンゾトリアゾール−Ｎ−ヒドロキシト
リスジメチルアミノホスホニウムヘキサフルオロリン化
物塩（Bop試薬）などの存在下に行うこともできる。

【００２６】得られたペプチドは、通常の方法に従い脱
塩、精製することができる。例えば、DEAE−セルロース
などのイオン交換クロマトグラフィー、セファデックス
LH-20 、セファデックスG-25 などの分配クロマトグラ
フィー、シリカゲルなどの順相クロマトグラフィー、OD
S−シリカゲルなどの逆相クロマトグラフィー、高速液
体クロマトグラフィーなどが挙げられる。

【００２７】[2] ヘパリン高親和性ペプチド結合担体の
作製 合成したヘパリン高親和性ペプチドを結合させる担体と
しては、ペプチドのＮ末もしくはＣ末を直接化学的に連
結するか、任意の架橋物質を用いて結合することが出来
るものであれば特に限定はないが、有機合成高分子系、
アガロース系、デキストラン系、セルロース系、ポリア
クリルアミド系、シリカゲル系、シリカビーズ系、ガラ
ス系、ケイソウ土、セライト、アルミナ、チャーコール
等その他当分野で公知のものを用いることができる。よ
り具体的には、ベンザヒドリルアミン樹脂（BHA 樹脂)
、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、アミノメチ
ル樹脂、メチルベンズヒドリル樹脂(MBHA 樹脂) 、４−
アミノメチルフェノキシメチル樹脂、４−ヒドロキシメ
チルフェノキシメチル樹脂、４−オキシメチルフェニル
アセタミドメチル樹脂、テンタゲル、架橋ポリアクリル
アミド、ナイロン、親水性のビニルポリマー、寒天、セ
ルロース、アガロース、架橋アガロース、架橋デキスト
ラン、キトサン、シリカ等を挙げることができる。担体
の形状は、球状、板状、粉砕状、中空糸状、膜状等が挙
げられ、特に限定されるものではない。また、前記各形
状の担体は、多孔性であってもよい。

【００２８】ペプチドの担体への結合は、なるべく強固
な化学結合にて架橋させることが好ましい。結合方式と
しては、共有結合法、イオン結合法、あるいは物理吸着
法等により固定化する方法が挙げられるが、ペプチド遊
離の可能性の少ない共有結合法が好ましい。共有結合法
によるペプチド固定化方法としては、シッフ塩基結合
法、ジアゾニウムカップリング法、臭化シアン活性化結
合法、イソシアネート誘導体、トリアジニル誘導体、ハ
ロゲノアセチル誘導体、酸アジド誘導体、またはカルボ
キルシクロリド誘導体を用いた結合、縮合試薬を用いる
結合法、活性エステル法が該当する。ペプチドの担体へ
の結合量は精製に可能な濃度であればよく、例えば担体
量1mL に対してペプチド量が 100mg〜1000mg程度結合し
ていればよく、経済的に結合量は変動させことができ
る。上記のペプチドの担体への結合様式、ペプチドの担
体への結合量は限定されるものではない。

【００２９】[3] ヘパリン分子の抗血栓活性画分の分離
精製 本発明のヘパリン高親和性ペプチド結合担体を用いたア
フィニティークロマトグラフィーは、上記のペプチド結
合担体を充填したカラムを使用する以外、その操作は常
法に従い行えばよい。まず、ヘパリン分子はそのままア
フィニティークロマトグラフィーに供してもよいが、以
下の化学的処理または酵素処理をヘパリン分子に施して
からアフィニティークロマトグラフィーに供してもよ
い。

【００３０】まず、ヘパリン分子を脱塩処理した後、亜
硝酸処理、低 pH 条件下および温度で過ヨウ素酸塩酸化
処理、ヘパリナーゼをはじめとする各種多糖類分解酵素
を用いた脱重合、カルボキシル基のエステル化による解
重合とβ脱離、Ｎ−脱硫酸化による部分的脱重合、ある
いは一般的な酸加水分解反応、ホウ素化水素ナトリウム
による還元、過酸化物によるラジカル反応等によって分
解することにより低分子化する。

【００３１】次に、ヘパリン分子又は上記の処理を行っ
たヘパリン処理物を含む溶液をカラムに流し、その後、
担体に特異的に吸着した画分を、例えばNaCl、KCl 、Na
₂SO₄などのアルカリ金属液水溶液などの溶離剤を用いて
溶出させる。以上の操作により、ヘパリン分子中の特異
的でかつ非常に活性の高い抗血栓画分を取得することが
できる。

【００３２】

【実施例】以下に本発明を実施例を挙げてより具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。なお、実施例において合成した各ペプチドの高速液
体クロマトグラフィー（HPLC) 及びアミノ酸分析条件は
以下の通りである。 ・高速液体クロマトグラフィー（HPLC) 高速液体クロマトグラフィーはLC-Module-1 （日本ウォ
ーターズ・リミテッド社製）を用いて分析を行った。 （HPLC分析条件） カラム： TSK-gel ODS-120T（4.6×250mm） 溶 媒： Ａ 0.1% TFA Ｂ アセトニトリル/0.1% TFA 溶媒Ｂを20％から60％に毎分２％変化させる直線勾配グラジェント 流 速：1ml/min 検出波長：220nm ・アミノ酸分析 アミノ酸分析条件は、6N-HCl 0.1%フェノール含有）中
で 110℃、20時間の加水分解反応を行った後に、日立ア
ミノ酸分析Ｌ−8500型（日立製作所社製）によって分析
した。

【００３３】〔実施例１〕 ペプチドの合成 固相合成用反応槽（ガラス製、φ6.0×29.5 cm；三商社
製）を用い、ペプチドHBP-1-1（Lys-Ile-Pro-Glu Ala-T
hr-Asn-Arg-Arg-Val-Trp-Glu-Leu-Ser-Lys-Al：配列番
号４）の固相合成を行った。まず、MBHA樹脂（ペプチド
研究所社製、アミノ基 0.66 mmol/g） 10 g を出発原料
として DCM 150ml (2 回)、50% TEA含有DCM 150ml (2
回)で洗浄後、16番目のアミノ酸 Boc-Ala-OH 13.2 mmo
l、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt) 13.2 mmole
、DCM 100ml を加えて攪拌し、さらに DCC (1 M-DCM
溶液）13.2 mlを加えて 2時間反応させた。反応液を濾
過した後、MeOH 150 ml (2回)、DCM 150ml（2 回）の順
に攪拌下処理し、各々の処理後濾過した。同じく 16 番
目のアミノ酸 Boc-Ala-OH 6.6 mmol、HOBt 6.6 mmol、D
CM 100 mlを加えて攪拌し、さらに DCC (1 M-DCM 溶
液）6.6 mlを加えて 2時間反応させた。反応液を濾過し
た後、MeOH 150 ml (2回)，DCM 150 ml（2 回）の順に
攪拌下処理し、各々の処理後濾過した。

【００３４】さらに、Boc-Lys (Cl-Z)-OH 13.2 mmol、H
OBt 13.2 mmol、DCM 100 mlを加えて攪拌し、DCC (1M-D
CM溶液）13.2 mlを加えて 2時間反応させた。反応液を
濾過した後、MeOH 150 ml (2回)、DCM 150 ml（2 回）
の順に攪拌下処理し、各々の処理後濾過して、Boc-Lys
(Cl-Z)-Ala-MBHA 樹脂を得た。

【００３５】なお、未反応の Ala-MBHA 樹脂は、20％無
水酢酸含有 DCM溶液 150 mlを加えて 5分間攪拌し、濾
過後 MeOH 150 ml (2 回)、DCM 150 ml（2 回）の順に
攪拌下処理し、各々の処理後濾過して副反応が進まない
ようにした。以下、次に示す保護アミノ酸を用いて順次
16 番目から 1番目までのアミノ酸をカップリングし
た。

【００３６】

【表１】

【００３７】この様にして、下記式:Boc-Lys (Cl-Z)-Il
e-Pro-Glu (OcHex)-Ala-Thr (Bzl)-Asn (Xan)-Arg (To
s)-Arg (Tos)-Val-Trp-Glu (OcHex)-Leu-Ser (Bz)-Lys
(Cl-Z)-Ala-MBHA 樹脂 9.05 g を得た。

【００３８】ここで得られた保護ペプチド-MBHA 樹脂
9.05 g にアニソール 11.5 ml、1,2-エタンジチオール
11.5 mlを加え、さらに無水フッ化水素 80 mlを加えて
０℃で1時間撹拌した。反応後、無水フッ化水素を減圧
下留去後、残査をエーテルで洗浄し、これに 20 ％酢酸
100 mlを加えて 10 分撹拌してペプチドを抽出した。

【００３９】抽出液を以下に示す条件で逆相カラムクロ
マトグラフィーにより精製した。 逆相カラムクロマトグラフィー カラム：ＯＤＳ−１０２０ＴＴ（φ 40×400 mm） 溶 媒：平衡化および溶出 15％アセトニトリル/0.1％
ＴＦＡ 流 速：５ml/min

【００４０】得られた溶出液を凍結乾燥し、ペプチドHB
P-1-1 （Ｃ−末端はＮＨ₂)を得た。この精製ペプチドの
収量およびアミノ酸配列分析結果を下記に示す。 ・収量 170 mg（純度 99 %） ・アミノ酸分析 Asp (1) 0.91, Thr (1) 0.85, Ser (1) 0.83, Glu (2)
1.83, Ala (2) 1.88,Val (1) 0.783, Ile (1) 0.75, Le
u (1) 1.00, Lys (2) 1.59, Arg (2) 1.50,Pro (1) 0.8
64

【００４１】上記と同様にして、下記のペプチド：ペプ
チドHBP-1-2（Ile-Pro-Glu-Ala-Thr-Asn-Arg-Arg-Val-T
rp-Glu-Leu-Ser-Lys-Ala ；配列番号３）、ペプチドHBP
-1-3（Glu-Ala-Thr-Asn-Arg-Arg-Val-Trp-Glu-Leu-Ser-
Lys-Ala；配列番号２）、ペプチドHBP-1-4（Arg-Arg-Va
l-Trp-Glu-Leu-Ser-Lys-Ala ；配列番号１）、ペプチド
HBP-2 （Pro-Lys-Pro-Glu-Lys-Ser-Leu-Ala-Lys-Val-Gl
u-Lys-Glu-Leu-Thr-Pro ；配列番号５）、ペプチドHBP-
3（Phe-Ala-Lys-Leu-Asn-Cys-Arg-Leu-Tyr-Arg-Lys-Ala
-Asn-Lys-Ser-Ser-Lys-Leu-Val ；配列番号７）、ペプ
チドHBP-4（Phe-Ala-Lys-Leu-Asn-Cys-Arg-Leu-Tyr-Arg
-Lys-Ala-Asn-Lys-Ser-Ser ；配列番号６）、ペプチドH
BP-5（Phe-Ala-Lys-Leu-Asn-Cys-Arg-Leu-Tyr-Arg-Lys-
Ala-Asn-Ala-Ser-Ser ；配列番号６）、ペプチドHBP-6
（Phe-Lys-Ala-Lys-Asn-Cys-Arg-Leu-Tyr-Arg-Ala-Lys-
Ser-Ser-Asn-Leu ；配列番号８）をそれぞれ合成した。

【００４２】〔実施例２〕（精製ペプチドのヘパリンへ
の結合性評価） 実施例１にて合成した精製ペプチドについて、ヘパリン
−アガロースカラムを用いて結合能を評価した。すべて
のペプチド濃度を 1 mg/mlに調製し、以下の条件で示す
ように HPLC で分析した。表２に各ペプチドの保持時間
および対応塩濃度を示す。 カラム：HiTrap Heparin (ファルマシア，1 ml） 溶 媒：A; H₂O (pH 5.0), B; 1 M Na₂SO₄ aq (pH 5.0) 両溶媒を用い，以下のタイムプログラムで分析を行っ
た。 0 min A Conc.=100 % B Conc.=0 % 5 min A Conc.=100 % B Conc.=0 % 25 min A Conc.=0 % B Conc.=100 % 流 速：0.5 ml/min

【００４３】

【表２】

【００４４】表２に示されるように、一連のペプチド
は、非常に高い塩濃度でヘパリンから溶出する。このこ
とは、これら一連のペプチドがヘパリンと強い親和性を
有していることを示している。よって、かかるペプチド
を結合させた担体は、ヘパリン分子のアフィニティーク
ロマトグラフィーに好適であるといえる。

【００４５】〔実施例３〕（各精製ペプチドによるヘパ
リンの抗第Ｘａ因子活性阻害試験） 実施例１にて合成した精製ペプチドについて、ATIII へ
のヘパリンとの競合的結合能を調べることによって、こ
れらのペプチドによるヘパリンの抗第Ｘａ因子活性阻害
試験を以下のようにして行った。

【００４６】0.5 低分子ヘパリン国際単位 (以下 IU)/m
l ダルテパリンナトリウムトリス緩衝液（pH 8.4）150
μl 、トリス緩衝液 150μl 、AT III溶液 50μl 及び
ヒト正常血漿 50μl をプラスチック製試験管内に入れ
た。これに、各精製ペプチドをトリス緩衝液で任意の濃
度に希釈したサンプルを 100μl 加えて混和した。別の
プラスチック製試験管に、試料溶液を 200μl ずつ加
え、37±1 ℃に正確に 30分間保った。その後、第Ｘａ
因子溶液 (7.1 nKat S-2222/ml) 100μl を加えて混和
し、37±1 ℃に正確に 30 秒間保った後、直ちに S-222
2 基質溶液 (N-ベンゾイル-L-イソロイシル-L-グルタミ
ル-グリシル-L-アルギニル-p-ニトロアニリド・塩酸塩
15 mg/20 ml) 200μl を加え、混和後さらに 37±1 ℃
に正確に 3分間保った。反応を停止させるべく、50 %酢
酸 300μl を加え、これを検体１とした。さらに別のプ
ラスチック製試験管に生理食塩液 100μl をとり、pH
8.4のトリス緩衝液 700μl 、AT III溶液 100μl 及び
ヒト正常血漿 100μl を加えて混和した。この溶液を 2
00μl 測り取り、水 300μl 及び 50 % 酢酸 300μl を
加えて混和したものを検体２とした。検体２を対照と
し、波長 405 nm における吸光度を測定した。結果を図
１に示す。

【００４７】図１に示されるように、全てのペプチドが
ヘパリンの抗第Ｘａ因子活性を阻害した。特に、 HBP-
3, 4 が強い阻害を示した。従って、一連のペプチドは
強いヘパリン結合性を有するだけでなく、その結合部位
はヘパリンとAT IIIのそれと同じくすることが明らかと
なった。

【００４８】〔実施例４〕 （ヘパリン高親和性ペプチ
ド結合担体の調製） アセトン溶媒中にて NHS-セルロファイン（チッソ株式
会社） 1 ml を撹拌しつつ、実施例１にて合成したペプ
チド（HBP-3)5 mgを pH 9.0 の水 2 ml に溶解させたも
のを混和した。その後、この混和物を濾過し、残った樹
脂担体をメタノール、水 20 mlで洗浄することにより、
ヘパリン高親和性ペプチド結合担体を得た。

【００４９】〔実施例５〕（アフィニティークロマトグ
ラフィーによるヘパリン抗血栓活性画分の分離精製） (1) ヘパリンの分解（低分子化）処理 ヘパリン 2 gを脱イオン水 50 mlに溶解し、強陽イオン
交換樹脂にて脱塩を行いヘパリン酸とした。その後 pH
を希硫酸を加えて 1.5に調整し、150 mlに脱イオン水で
メスアップし、氷冷下ジメトキシエタン 150 ml を加え
た。氷冷下スターラーで撹拌し、0.1 mlの亜硝酸イソペ
ンチルを加えて適切な時間の脱重合反応を行った。反応
後、 10 % 酢酸ナトリウムを適量加えて反応を終了さ
せ、飽和重曹水にて中和後、3 L のエタノールにて目的
物を沈殿させた。遠心分離器にて沈殿物のみを回収し、
真空ポンプにて乾燥して低分子化ヘパリン混合物を得
た。

【００５０】(2) ヘパリン抗血栓活性画分の分離精製 実施例４にて作成したヘパリン高親和性ペプチド結合担
体1 mlをパッキングしたカラムを作成し、HPLCのライン
に設置した。上記(1) にて製造した低分子化ヘパリン混
合物10 mg を脱イオン水 1 ml に溶解し、そのサンプル
25μl を以下に示す条件にて分析した。 溶 媒：A; H₂O (pH 5.0), B; 1 M Na₂SO₄ aq (pH 5.0) 両溶媒を用い、以下のタイムプログラムで分析を行っ
た。 0 min A Conc.=100 % B Conc.=0 % 5 min A Conc.=100 % B Conc.=0 % 25 min A Conc.=0 % B Conc.=100 % 流 速：0.5 ml/min

【００５１】この際、１分毎に試験管に溶出液を採取
し，カルバゾール法にて含有糖（主にウロン酸）の定量
を行い溶出曲線を得た（図２）。その結果、主に２つの
溶出ピーク（フラクションＮｏ．４〜６とフラクション
Ｎｏ．２０）が認められ、これらの抗 Xa 活性を調べた
ところ、前者のピークは活性が極めて低く、後者のピー
クには明らかな活性が認められた（図３）。これによ
り、本カラムには極めて強い特異性があることが示唆さ
れた。

【００５２】

【発明の効果】本発明によれば、抗血栓剤として臨床上
有用な、ヘパリン分子中の抗血栓活性画分を効率よく分
離精製することができる。

【００５３】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> ITOHAM FOODS INC. <120> Carrier bound by Peptide having high affinity to Heparin, and Math od for purifying and isolating Heparin fraction having antithrombin acit ivity <130> P99-0668 <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 1 Arg Arg Val Trp Glu Leu Ser Lys Ala 1 5 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 2 Glu Ala Thr Asn Arg Arg Val Trp Glu Leu Ser Lys Ala 1 5 10 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 3 Ile Pro Glu Ala Thr Asn Arg Arg Val Trp Glu Leu Ser Lys Ala 1 5 10 15 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 4 Lys Ile Pro Glu Ala Thr Asn Arg Arg Val Trp Glu Leu Ser Lys Ala 1 5 10 15 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 5 Pro Lys Pro Glu Lys Ser Leu Ala Lys Val Glu Lys Glu Leu Thr Pro 1 5 10 15 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <200> <221> PEPTIDE <222> 14 <223> Xaa represents Lys or Ala <400> 6 Phe Ala Lys Leu Asn Cys Arg Leu Tyr Arg Lys Ala Asn Xaa Ser Ser 1 5 10 15 Lys <210> 7 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 7 Phe Ala Lys Leu Asn Cys Arg Leu Tyr Arg Lys Ala Asn Lys Ser Ser 1 5 10 15 Lys Leu Val <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequnece <220> <223> Synthetic Peptide <400> 8 Phe Lys Ala Lys Asn Cys Arg Leu Tyr Arg Ala Lys Ser Ser Asn Leu 1 5 10 15 Lys

【図面の簡単な説明】

【図１】各精製ペプチドによる抗第Ｘａ因子活性阻害能
評価を示す。

【図２】本発明のヘパリン高親和性ペプチド結合担体を
用いたアフィニティークロマトグラフィーによる各溶出
画分のウロン酸濃度を示す。

【図３】本発明のヘパリン高親和性ペプチド結合担体を
用いたアフィニティークロマトグラフィーによる各溶出
画分の抗第Ｘａ因子活性を示す。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも配列番号１に記載のアミノ酸
   配列を含み、かつヘパリンに高親和性を有するペプチ
   ド。
2. 【請求項２】 配列番号２に記載のアミノ酸配列からな
   る請求項１に記載のペプチド。
3. 【請求項３】 配列番号３に記載のアミノ酸配列からな
   る請求項１に記載のペプチド。
4. 【請求項４】 配列番号４に記載のアミノ酸配列からな
   る請求項１に記載のペプチド。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかに記載のペプチ
   ドを結合させた担体。
6. 【請求項６】 配列番号５に記載のアミノ酸配列からな
   るペプチドを結合させた担体。
7. 【請求項７】 少なくとも配列番号６に記載のアミノ酸
   配列を含み、かつヘパリンに高親和性を有するペプチド
   を結合させた担体。
8. 【請求項８】 ペプチドが配列番号７に記載のアミノ酸
   配列からなるペプチドである、請求項７に記載の担体。
9. 【請求項９】 配列番号８に記載のアミノ酸配列からな
   るペプチドを結合させた担体。
10. 【請求項１０】 請求項５〜９のいずれかに記載の担体
    に、ヘパリン自体またはヘパリン処理物を含有する溶液
    を接触させることを特徴とする、ヘパリン分子中の抗血
    栓活性画分の分離精製方法。
11. 【請求項１１】 ヘパリン処理物が、ヘパリンに化学的
    処理または酵素処理を行うことにより得られたものであ
    る、請求項１０に記載の方法。
12. 【請求項１２】 請求項１０に記載の方法により得られ
    る、ヘパリン抗血栓活性画分。