KR20110067097A

KR20110067097A - 당단백질의 제조방법 및 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR20110067097A
Application number: KR1020117005717A
Authority: KR
Inventors: 야스히로 가지하라; 가즈히로 후카에
Original assignee: 오츠카 가가쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2008-08-19
Filing date: 2009-08-18
Publication date: 2011-06-21
Also published as: HUE037238T2; DK2330114T3; CA2734124C; RU2011110430A; CA2734124A1; WO2010021126A1; AU2009283678B2; BRPI0917298B1; JP5530358B2; PT2330114T; US20110262945A1; BRPI0917298B8; EP2330114B1; EP2330114A1; JPWO2010021126A1; CN102124024A; ES2646119T3; AU2009283678A1; BRPI0917298A2; RU2520240C2

Abstract

본 발명은 혈중 반감기 등의 당쇄에 기인하는 기능에 더하여, 생리활성도 균일한 당단백질, 즉, 아미노산 서열, 당쇄구조 및 고차구조가 균일한 당단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 아미노산 서열, 당쇄구조 및 고차구조가 균일한 당단백질을 제조하는 방법으로서, 이하의 공정 (a)~(c): (a) 아미노산 서열 및 당쇄가 균일한 당단백질을 폴딩시키는 공정; (b) 상기 폴딩시킨 당단백질을 칼럼 크로마토그래피에 의해 분획하는 공정; 및 (c) 소정의 활성을 갖는 분획을 회수하는 공정을 포함하는 방법을 제공한다.

Description

당단백질의 제조방법 및 스크리닝 방법{Glycoprotein production method and screening method}

본 발명은 아미노산 서열, 당쇄구조 및 고차구조가 균일한 당단백질을 제조하는 방법 등에 관한 것이다.

최근 들어, 당단백질을 다양한 의약으로서 사용하는 연구가 진행되고 있다. 당단백질의 당쇄부분은, 프로테아제로의 내성을 부가하여 혈중으로부터의 대사를 지연시키는 기능이나, 세포 내에서의 소기관으로의 수송을 담당하는 시그널으로서의 기능 등을 갖는다. 따라서, 적절한 당쇄를 부가함으로써, 당단백질의 혈중 반감기나 세포 내에서의 수송을 제어하는 것이 가능하다.

당쇄가 당단백질의 생리활성에 영향을 미치는 대표적인 예로, 에리스로포이에틴(EPO)을 들 수 있다. 이 당단백질은, 적혈구계 전구세포에 작용하여 그 증식·분화를 촉진함으로써, 말초혈 중의 적혈구 수를 유지하는 기능을 가진 혈구분화 호르몬이다. EPO의 당쇄구조와 생리활성의 상관에 대해 연구된 결과, 인 비트로(in vitro)에서는 당쇄가 결합하고 있지 않더라도 생리활성을 갖지만, 인 비보(in vivo)에서는 당쇄가 없으면 바로 신장으로부터 배출되어 버려서, 충분한 생리활성을 얻을 수 없는 것이 판명되었다.

또한, 당단백질은 당쇄가 불완전한 경우나, 상이한 당쇄가 결합되어 있는 경우도, 혈액 중의 마크로파지 등에 인식되어, 혈중으로부터 배출되는 경우가 있다.

따라서, 당단백질을 의약품으로서 사용하는 경우에는, 각 단백질의 같은 위치에 균일한 구조의 당쇄가 부가되어 있는 것이 바람직하다.

종래의 당단백질의 제조방법으로서는, 단백질에 당을 효소 부가하는 방법이 널리 사용되고 있지만, 이 방법으로는 균일한 당쇄를 부가할 수 없고, 또한, 당쇄를 부가한 후에 수식이나 트리밍을 균일하게 실시하는 것도 곤란하다.

또한, 일반적으로 단백질제제는 역가(titer)로 평가되지만, 동일한 역가를 갖는 제제라도, 당쇄구조에 편차가 있는 것이 포함되어 있는 경우가 있어, 혈중 반감기에 편차가 생기거나 품질관리면에서 문제가 될 수 있다.

본 발명자들은 지금까지, 지용성 보호기로 아미노기를 보호한 아미노산과 당쇄 아스파라긴을 재료로 하여, 균일한 아미노산 서열과 당쇄를 갖는 당단백질을 비교적 대량으로 제조할 수 있는 방법을 개발하였다(예를 들면 특허문헌 1 참조). 또한, 충분한 혈중농도를 유지할 수 있는 아미노화 복합형 당쇄 유도체 및 당단백질을 개발하였다(특허문헌 2 참조). 어느 당단백질도 의약품으로서의 유용성이 기대된다.

그런데, 의약품으로서 사용하기 위해서는 생리활성에 편차가 없는 당단백질을 제조하는 것이 필요하지만, 당단백질의 기능에는 아미노산 서열과 당쇄구조 뿐 아니라, 단백질부분의 고차구조도 밀접하게 관련되어 있다고 생각된다.

단백질의 고차구조는 아미노산 잔기 간의 수소 결합, 이온 결합, 소수성 상호작용, 시스테인 잔기 간의 S-S 결합 등에 의해 안정화되어, 대부분의 단백질은 각각 고유한 고차구조를 갖는다. 그러나, S-S 결합 이외의 결합은 비교적 약한 결합이어서, 비교적 온화한 가열이나 가압 등에 의해 고차구조가 무너져, 그 생리활성이 저하·소실된다. 이것을 단백질의 변성이라 부른다. 또한, 특히 아미노산 사슬이 긴 경우, 에너지의 극소점을 부여하는 구조가 복수 생기기 때문에, 이상한 고차구조(미스폴딩)를 발생시키는 경우가 있다. 이 경우에도 단백질의 활성이 변화 또는 소실되는 것이 보고되어 있다.

이러한 사실로부터, 일반적으로 단백질이 기능을 발휘하기 위해서는 바른 고차구조가 필수이며, 단백질을 폴딩시키면, 생리활성을 갖는 바른 폴딩과, 생리활성을 갖지 않는 미스폴딩으로 나뉜다고 생각되고 있다.

단백질의 고차구조와 생리활성의 관계에 대해서는 각종 연구가 이루어지고 있지만, 인공적으로 합성한 당단백질에 있어서, 당쇄가 폴딩이나 생리활성에 어떠한 영향을 미칠 수 있는가에 대해서는 지금까지 보고가 없다.

본 발명자들은 특허문헌 1의 방법으로 당단백질 단편을 합성하고, 천연형 화학적 라이게이션법(Native Chemical Ligation, NCL법)으로 다른 펩티드 단편과 연결함으로써, 단구주화성 단백질-3을 합성하였다. 합성된 단구주화성 단백질-3을 폴딩시킨 후 키모트립신 처리로 디설파이드 결합의 위치를 확인해 본 결과, 약 90%의 당단백질은 디설파이드 결합이 바른 위치에 형성되어 있으나, 약 10%는 통상과 다른 위치에 디설파이드 결합이 형성되어 있는 것이 판명되었다(비특허문헌 1).

그러나, 동문헌에서는 다른 2종류 이상의 당단백질을 폴딩한 상태에서는 분리되어 있지 않다. 키모트립신 처리시에, 디설파이드 결합이 재형성될 가능성이 있는 것도 고려하면, 2종류 이상의 폴딩이 생겼던 것이 아니라, 키모트립신 처리의 결과가 2종류 이상으로 나뉘었을 뿐일 가능성도 부정할 수 없다. 따라서, 당연한 일이지만 디설파이드 결합이 바른 위치에 형성된 당단백질과, 통상과 다른 위치에 형성된 당단백질의 생리활성의 차이에 대해도 검토되어 있지 않다.

또한, 비교적 기능이나 구조가 잘 연구되어 있는 당단백질로, 난백에 포함되는 단백질의 일종인 오보뮤코이드 단백질(ovomucoid protein)이 있다. 오보뮤코이드는 분자량 약 28,000의 단백질로, 분자 내에 3개의 도메인을 가지며, 각 도메인이 각각 다른 프로테아제에 대해 저해활성을 갖는다. 특히 제3 도메인은, 단독으로도 저해활성을 나타내는 것으로부터 상세하게 연구되어 있다. 지금까지, 100종 이상의 새 유래의 제3 도메인에 대해 구조가 보고되고, X선 결정해석에 의해서도 입체구조가 명확해져 있다.

화학적으로 합성된 오보뮤코이드 제3 도메인의 입체구조에 대해서는, 예를 들면, NCL법에 의해, 펩티드골격을 개변한 오보뮤코이드 제3 도메인을 합성하여, X선결정해석을 행한 것이 보고되어 있다(비특허문헌 2를 참조).

또한, 오보뮤코이드 제3 도메인을 축차신장(stepwise synthesis)법과 NCL법에 의해 합성하여, 폴딩시킨 결과, 열안정성의 해석에 의해, 바르게 접어 겹쳐진 것이 강하게 시사되는 결과가 얻어졌다는 보고도 있다(비특허문헌 3을 참조).

국제공개 제2004/005330호 팸플릿 국제공개 제2004/011036호 팸플릿

Yamamoto et al., Journal of American Chemical Society, 2008, 130, 501-510 Bateman et al., Journal of Molecular Biology(2001)305, 839-849 Lu et al., Journal of American Chemical Society, 1996, 118, 8518-8523

그러나, 전술한 선행기술에서는, 합성된 단백질에 당쇄가 부가되어 있지 않아, 당단백질에 있어서, 당쇄가 폴딩이나 생리활성에 어떻게 영향을 미치는가에 대해서는 불명확하였다.

이에 본 발명은, 혈중 반감기 등의 당쇄에 기인하는 기능에 더하여, 생리활성도 균일한 당단백질, 즉, 아미노산 서열, 당쇄구조 및 고차구조가 균일한 당단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은, 생리활성의 강도가 상이한 복수 종류의 당단백질로부터 소정의 활성을 갖는 당단백질을 선택하는 스크리닝 방법을 제공하는 것, 목적하는 활성을 갖는 당단백질 혼합물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 아미노산 서열과 당쇄구조가 균일한 오보뮤코이드 단백질의 제3 도메인을 합성하여 폴딩시키면, 복수 종류의 고차구조를 일정의 비율로 포함하는 혼합물을 재현성 좋게 얻을 수 있는 것을 발견하였다. 그리고 이들을 분리하여 생리활성을 측정한 결과, 종래의 이해와는 달리, 동일 종류의 생리활성을 비교적 고활성이라고 인정할 수 있는 레벨로 갖는 고차구조가 복수 종류 존재하는 것; 비교적 고활성이라고는 해도 고차구조에 따라 활성에 차가 있는 것; 고차구조가 상이한 당단백질은, 칼럼 크로마토그래피에 의해 각각 분리·정제할 수 있는 것을 확인하였다.

또한, 소정의 활성을 갖는 당단백질 이외의 것은 언폴딩시킨 후, 재차 폴딩시키면, 상기 일정의 비율로 얻어지는 고차구조로 변환할 수 있는 것, 따라서, 언폴딩/리폴딩 공정을 반복함으로써, 소정의 활성을 갖는 고차구조를 갖는 당단백질을 최대한으로 회수할 수 있음을 발견하였다.

즉, 본 발명은,

아미노산 서열, 당쇄구조 및 고차구조가 균일한 당단백질을 제조하는 방법으로서, 이하의 공정 (a)~(c):

(a) 아미노산 서열 및 당쇄가 균일한 당단백질을 폴딩시키는 공정;

(b) 상기 폴딩시킨 당단백질을 칼럼 크로마토그래피에 의해 분획하는 공정; 및

(c) 소정의 활성을 가진 분획을 회수하는 공정

을 포함하는 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서는,

상기 공정 (c) 다음에,

(d) 상기 공정 (c)에서 회수되지 않은 분획에 포함되는 당단백질을 언폴딩시키는 공정;

(e) 상기 언폴딩시킨 당단백질을 재차 폴딩시키는 공정;

(f) 상기 재차 폴딩시킨 당단백질을 칼럼 크로마토그래피에 의해 분획하여, 상기 소정의 활성을 갖는 분획을 회수하는 공정; 및

(g) 필요에 따라 (d)에서 (f)를 반복하는 공정

을 추가적으로 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명은 또한,

소정의 생리활성을 갖는 당단백질을 스크리닝하는 방법으로서, 이하의 공정 (i)~(iii):

(i) 아미노산 서열 및 당쇄가 균일한 당단백질을 폴딩시키는 공정;

(ii) 상기 폴딩시킨 당단백질을 칼럼 크로마토그래피에 의해 분획하는 공정; 및

(iii) 각 분획의 활성을 측정하여, 소정의 활성을 갖는지 여부를 판정하는 공정

을 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한,

목적하는 생리활성을 갖는 당단백질 혼합물을 얻는 방법으로서, 이하의 공정 (A)~(D):

(B) 상기 폴딩시킨 당단백질을 칼럼 크로마토그래피에 의해 분획하는 공정;

(C) 각 분획의 활성을 측정하는 공정; 및

(D) 목적하는 활성을 얻기 위한 각 분획의 혼합비율을 구하고, 당해 비율에 따라 각 분획을 혼합하는 공정

을 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명의 당단백질의 제조방법, 당단백질의 스크리닝 방법, 또는 목적하는 생리활성을 갖는 당단백질 혼합물을 얻는 방법에 있어서는,

아미노산 서열 및 당쇄가 균일한 당단백질은, 적어도 그 일부가 이하의 공정 (1)~(6):

(1) 수산기를 갖는 수지(레진)의 수산기와, 지용성 보호기로 아미노기가 보호된 아미노산의 카르복실기, 또는 지용성 보호기로 아미노기가 보호된 당쇄 부가된 아미노산의 카르복실기를 에스테르화 반응시키는 공정;

(2) 상기 지용성 보호기를 이탈하여 유리(遊離) 아미노기를 형성시키는 공정;

(3) 상기 유리 아미노기와 지용성 보호기로 아미노기가 보호된 아미노산의 카르복실기, 또는 지용성 보호기로 아미노기가 보호된 당쇄 부가된 아미노산의 카르복실기를 아미드화 반응시키는 공정;

(4) 상기 공정 (3) 다음에, 지용성 보호기를 이탈하여 유리 아미노기를 형성시키는 공정; 및

(5) 상기 공정 (3) 및 (4)의 공정을 1회 이상 반복하는 공정; 및

(6) 상기 공정 (1)에서 형성된 에스테르 결합을 산으로 절단하는 공정

을 포함하는 방법에 의해 제조되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 아미노산 서열 및 당쇄가 균일한 당단백질의 제조방법에 있어서는,

상기 공정 (1)~(6)에 의해 상기 아미노산 서열 및 당쇄가 균일한 당단백질의 일부가 제조되는 경우로서, 당해 당단백질이, 추가적으로 이하의 공정 (7):

(7) 상기 공정(6)에서 얻은 당단백질의 일부와, 다른 펩티드 또는 당펩티드를, 라이게이션법에 의해 연결하는 공정

을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 당단백질의 제조방법에 의하면, 아미노산 서열, 당쇄구조에 더하여, 고차구조도 균일한 당단백질을 얻을 수 있기 때문에, 혈중 반감기나 세포 내에서의 수송에 편차가 없을 뿐 아니라, 소정의 생리활성을 균일하게 갖는 당단백질을 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 당단백질의 스크리닝 방법에 의하면, 고차구조가 다르기 때문에 생리활성에 편차가 생긴 당단백질군으로부터, 소정의 생리활성을 균일하게 갖는 당단백질을 선택할 수 있다. 당해 당단백질은, 당쇄구조가 균일한 것으로부터, 혈중 반감기나 세포 내에서의 수송 등의 당쇄에 기인하는 기능도 균일하다.

또한, 본 발명에 의하면, 당단백질의 혼합물이 목적하는 활성을 갖도록 제어하는 것이 가능해진다.

본 발명에 의한 이들 효과는, 특히 당단백질을 의약품으로 사용할 경우에 유리하다.

도 1은 silver pheasant의 오보뮤코이드 제3 도메인(OMSVP3)과, 그 화학합성에 사용하는 프래그먼트 1~3의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2는 OMSVP3의 화학합성에 사용하는 프래그먼트 1(티오에스테르체)을 나타낸다.
도 3은 당쇄를 갖는 OMSVP3의 화학합성에 사용하는 프래그먼트 2(티오에스테를체)를 나타낸다.
도 4는 OMSVP3의 화학합성에 사용하는 프래그먼트 3를 나타낸다.
도 5는 프래그먼트 1 합성시의 각 단계에 있어서의 파장 220 ㎚에서의 크로마토그램을 나타낸다.
도 6은 프래그먼트 2 합성시의 각 단계에 있어서의 파장 220 ㎚에서의 크로마토그램을 나타낸다.
도 7은 프래그먼트 3 합성시의 각 단계에 있어서의 파장 220 ㎚에서의 크로마토그램을 나타낸다.
도 8은 프래그먼트 2 및 프래그먼트 3의 NCL법에 의한 연결의 각 단계에 있어서의 파장 220 ㎚에서의 크로마토그램을 나타낸다.
도 9는 프래그먼트 2 및 3와, 프래그먼트 1의 NCL법에 의한 연결의 각 단계에 있어서의 파장 220 ㎚에서의 크로마토그램을 나타낸다.
도 10은 당쇄를 갖는 OMSVP3를 폴딩시킨 후, HPLC로 분리했을 때의 파장 220 ㎚에서의 크로마토그램을 나타낸다.
도 11은 도 10의 분획 B의 NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 12는 도 10의 분획 B의 CD 스펙트럼을 나타낸다.
도 13은 도 10의 각 분획의 키모트립신에 대한 저해활성의 측정결과를 나타낸다.
도 14는 당쇄를 갖지 않는 OMSVP3의 화학합성에 사용하는 프래그먼트 2'(티오에스테르체)를 나타낸다.
도 15는 프래그먼트 2' 합성시의 각 단계에 있어서의 파장 220 ㎚에서의 크로마토그램을 나타낸다.
도 16은 프래그먼트 2' 및 프래그먼트 3의 NCL법에 의한 연결의 각 단계에 있어서의 파장 220 ㎚에서의 크로마토그램을 나타낸다.
도 17은 프래그먼트 2' 및 3와, 프래그먼트 1의 NCL법에 의한 연결의 각 단계에 있어서의 파장 220 ㎚에서의 크로마토그램을 나타낸다.
도 18은 당쇄를 갖지 않는 OMSVP3를 폴딩시킨 후, HPLC로 분리했을 때의 파장 220 ㎚에서의 크로마토그램을 나타낸다.
도 19는 도 18의 분획 F의 NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 20은 도 18의 분획 F의 CD 스펙트럼을 나타낸다.
도 21은 도 18의 각 분획의 키모트립신에 대한 저해활성의 측정결과를 나타낸다.
도 22는 분획 F의 검량선을 나타낸다.
도 23은 분획 A-D의 키모트립신에 대한 저해율을 나타낸다.
도 24는 분획 A-D의 IC₅₀값을 나타낸다.
도 25는 분획 E-H의 키모트립신에 대한 저해율을 나타낸다.
도 26은 분획 E-H의 IC₅₀값을 나타낸다.
도 27은 분획 B의 온도변화에 따른 CD 스펙트럼을 나타낸다.
도 28은 분획 F의 온도변화에 따른 CD 스펙트럼을 나타낸다.
도 29는 분획 B에 대한 서몰리신(Thermolysin) 소화에 있어서의 파장 220 ㎚에서의 크로마토그램을 나타낸다.
도 30은 분획 B에 대한 서몰리신(Thermolysin) 소화 후의 펩티드 단편의 질량분석결과를 나타낸다.
도 31은 분획 F에 대한 서몰리신(Thermolysin) 소화에 있어서의 파장 220 ㎚에서의 크로마토그램을 나타낸다.
도 32는 분획 F에 대한 서몰리신(Thermolysin) 소화 후의 펩티드 단편의 질량분석결과를 나타낸다.
도 33은 분획 B에 대한 서몰리신(Thermolysin) 소화에 의한 디설파이드 결합의 위치결정의 결과를 나타낸다.
도 34는 분획 F에 대한 서몰리신(Thermolysin) 소화에 의한 디설파이드 결합의 위치결정의 결과를 나타낸다.
도 35는 기질 펩티드의 검량선을 나타낸다.
도 36은 기질 펩티드의 미하엘리스-멘텐 플롯(Michaelis-Menten plot)을 나타낸다.
도 37은 기질 펩티드의 단위시간당 반응속도를 나타낸다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시형태에 대해 설명한다.

본 명세서에 있어서, 「단백질」이란, 복수의 아미노산이 아미드 결합에 의해 결합되어 있는 것이라면 특별히 한정되지 않고, 공지 단백질, 신규 단백질 및 단백질 개변체를 포함한다. 바람직한 태양에 있어서, 본 발명의 제조방법으로 얻어지는 당단백질에 있어서의 단백질 부분은, 천연형과 같은 아미드 결합(펩티드 결합)으로 복수의 아미노산과 결합되어 있다. 본 명세서에 있어서 단백질은, 폴딩시킴으로써 소정의 고차구조를 취할 수 있는 길이를 갖는 것이다.

본 명세서에 있어서, 「단백질 개변체」란, 단백질을 천연 또는 인공적으로 개변한 화합물로서, 그러한 개변으로는, 예를 들면, 단백질의 1 또는 복수의 아미노산 잔기의, 알킬화, 아실화(예를 들면 아세틸화), 아미드화(예를 들면, 단백질의 C 말단의 아미드화), 카르복실화, 에스테르 형성, 디설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 인산화, 수산화, 표지성분의 결합 등을 들 수 있다.

또한 본 명세서에 있어서, 용어 「펩티드」는, 원칙적으로 단백질과 동일한 정의로 사용되지만, 단백질의 일부나, 고차구조를 취하지 않는 비교적 짧은 아미노산 사슬을 가리키기 위하여 사용되는 경우도 있다.

본 명세서에 있어서, 「아미노산」이란, 그 가장 넓은 의미로 사용되어, 천연의 아미노산, 예를 들면 세린(Ser), 아스파라긴(Asn), 발린(Val), 류신(Ler), 이소류신(Ile), 알라닌(Ala), 티로신(Tyr), 글리신(Gly), 리신(Lys), 아르기닌(Arg), 히스티딘(His), 아스파라긴산(Asp), 글루타민산(Glu), 글루타민(Gln), 트레오닌(Thr), 시스테인(Cys), 메티오닌(Met), 페닐알라닌(Phe), 트립토판(Trp), 프롤린(Pro) 뿐 아니라, 아미노산 변이체 및 유도체 등과 같은 비천연 아미노산을 포함한다. 당업자라면 이 넓은 정의를 고려하여, 본 명세서에 있어서의 아미노산으로서, 예를 들면 L-아미노산; D-아미노산; 아미노산 변이체 및 유도체 등의 화학수식된 아미노산; 노르류신, β-알라닌, 오르니틴 등 생체 내에서 단백질의 구성재료가 되지 않는 아미노산; 및 당업자에게 공지의 아미노산의 특성을 갖는 화학적으로 합성된 화합물 등을 들 수 있는 것을 이해할 것이다. 비천연 아미노산의 예로서는, α-메틸아미노산(α-메틸알라닌 등), D-아미노산, 히스티딘 유사 아미노산(2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘 및 α-메틸-히스티딘 등), 측쇄에 여분의 메틸렌을 갖는 아미노산(「호모」아미노산) 및 측쇄 중의 카르복실산 관능기 아미노산이 설폰산기로 치환된 아미노산(시스테인산 등)을 들 수 있다.

바람직한 태양에 있어서, 본 발명의 제조방법으로 얻어지는 당단백질의 단백질 부분은, 모두 생체 내에 단백질 또는 당단백질의 구성아미노산으로서 존재하는 아미노산으로 된다.

본 명세서에 있어서, 「당단백질」이란, 상기 단백질에 적어도 한 개의 당쇄가 부가된 화합물이라면 특별히 한정되지 않고, 공지의 당단백질 및 신규의 당단백질을 포함한다. 또한, 본 명세서에 있어서, 용어 「당펩티드」는, 원칙적으로 당단백질과 동일 정의로 사용되지만, 당단백질의 일부나, 상기 펩티드에 당쇄가 결합된 것을 가리키는 경우도 있다.

바람직한 태양에 있어서, 본 발명의 제조방법으로 얻어지는 당단백질은, N 결합형 당쇄 또는 O 결합형 당쇄를 갖는 단백질로, 예를 들면, 에리스로포이에틴, 인터류킨, 인터페론-β, 항체, 단구주화성 인자 단백질-3(monocyte chemotactic protein-3, MCP-3), 오보뮤코이드 단백질 등의 펩티드의 일부분 또는 전부를 들 수 있다.

당단백질에 있어서 당쇄와 단백질 중의 아미노산 잔기란, 직접 결합되어 있어도, 링커를 매개로 결합되어 있어도 된다. 당쇄와 아미노산의 결합부위에 특별히 제한은 없지만, 당쇄의 환원말단에 아미노산이 결합되어 있는 것이 바람직하다.

당쇄가 결합되는 아미노산의 종류는 특별히 한정되지 않고, 천연 아미노산, 비천연 아미노산의 어느 쪽에 결합되어 있어도 된다. 당단백질이 생체 내에 존재하는 당단백질과 동일 또는 유사한 구조를 갖는다는 관점에서는, 당쇄는 N 결합형 당쇄와 같이 Asn에 결합되어 있는 것, 또는 O 결합형 당쇄와 같이 Ser 또는 Thr에 결합되어 있는 것이 바람직하다. 특히, N결합형 당쇄의 경우, 본 발명의 제조방법에 의해 얻어지는 당단백질은, Asn에 당쇄가 결합되고, 그 Asn의 C 말단측에 프롤린 이외의 아미노산(X)이 아미드 결합(펩티드 결합)되며, 추가적으로 그 X의 C 말단측에 Thr 또는 Ser이 아미드 결합(펩티드 결합)된 구조(-당Asn-X-Thr/Ser-)를 갖는 당단백질인 것이 바람직하다. 당쇄와 아미노산이 링커를 매개로 결합되어 있는 경우, 링커와의 결합 용이성이라는 관점에서는, 당쇄가 결합되는 아미노산은: 아스파라긴산이나 글루타민산 등의 분자 내에 2 이상의 카르복실기를 갖는 아미노산; 리신, 아르기닌, 히스티딘, 트립토판 등의 분자 내에 2 이상의 아미노기를 갖는 아미노산; 세린, 트레오닌, 티로신 등의 분자 내에 수산기를 갖는 아미노산; 시스테인 등의 분자 내에 티올기를 갖는 아미노산; 또는 아스파라긴, 글루타민 등의 분자 내에 아미드기를 갖는 아미노산이 바람직하다. 특히, 반응성의 관점에서는, 아스파라긴산, 글루타민산, 리신, 아르기닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴 또는 글루타민이 바람직하다.

당단백질에 있어서, 당쇄와 아미노산이 링커를 매개로 결합되어 있는 경우, 링커로서는, 당해 분야에 있어서 사용되고 있는 것을 널리 사용할 수 있지만, 예를 들면:

(식 중, a는 정수이며, 목적으로 하는 링커기능을 저해하지 않는 한 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 0~4의 정수를 나타낸다.);

C₁ _- ₁₀폴리메틸렌;

(여기서, R³는, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 탄소환기, 치환된 탄소환기, 복소환기 및 치환된 복소환기로 이루어진 군으로부터 선택되는 기로부터 수소원자가 1개 이탈하여 생기는 기이다)

;

등을 들 수 있다.

본 명세서 중에 있어서, 「당쇄」란, 단위당(단당 및/또는 그의 유도체)이 두 개 이상 한 줄로 이어져 생긴 화합물 외에, 1개의 단위당(단당 및/ 또는 그의 유도체)으로 되는 화합물도 포함한다. 이와 같은 당쇄로서는, 예를 들면, 생체 중에 함유되는 단당류 및 다당류(글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 푸코오스, 크실로오스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 시알산, 및 그들의 복합체 및 유도체) 외에, 분해된 다당, 당단백질, 프로테오글리칸, 글리코사미노글리칸, 당지질 등의 복합 생체분자로부터 분해 또는 유도된 당쇄 등 광범위한 것을 들 수 있지만 그들에 한정되지 않는다. 단위당이 2개 이상 한 줄로 이어져 있는 경우, 각각의 단위당끼리의 사이는, 글리코시드 결합에 의한 탈수축합에 의해 결합한다. 당쇄는 직쇄형이어도 되고 분기쇄형이어도 된다.

또한, 본 명세서 중에 있어서, 「당쇄」에는 당쇄의 유도체도 포함되며, 당쇄의 유도체로서는, 예를 들면, 당쇄를 구성하는 당이 카르복실기를 갖는 당(예를 들면, C-1 위치가 산화되어 카르복실산이 된 알돈산(예를 들면, D-글루코오스가 산화된 D-글루콘산), 말단의 C원자가 카르복실산이 된 우론산(D-글루코오스가 산화된 D-글루쿠론산)), 아미노기 또는 아미노기의 유도체(예를 들면, 아세틸화된 아미노기)를 갖는 당(예를 들면, N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-D-갈락토사민 등), 아미노기 및 카르복실기를 양쪽 모두 갖는 당(예를 들면, N-아세틸뉴라민산(시알산), N-아세틸무람산 등), 데옥시화된 당(예를 들면, 2-데옥시-D-리보오스), 황산기를 포함하는 황산화당, 인산기를 포함하는 인산화당 등인 당쇄를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 당쇄는, 바람직하게는, 생체 내에서 복합 당질(당단백질(또는 당펩티드), 프로테오글리칸, 당지질 등)로서 존재하는 당쇄이며, 바람직하게는, 생체 내에서 당단백질(또는 당펩티드)로서 단백질(또는 펩티드)에 결합되어 있는 당쇄인 N-결합형 당쇄, O-결합형 당쇄 등이다. O-결합형 당쇄가 결합되어 있는 당단백질에 있어서는, 펩티드의 Ser 또는 Thr에 N-아세틸갈락토사민(GalNAc), N-아세틸글루코사민(GlcNAc), 크실로오스, 푸코오스 등이 O-글리코시드 결합으로 결합되고, 이것에 추가적으로 당쇄가 부가된다. N 결합형 당쇄로서는, 예를 들면, 고만노오스(하이만노오스)형, 복합(콤플렉스)형, 혼성(하이브리드)형을 들 수 있으며, 복합형이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 바람직한 당쇄로서는, 예를 들면, 하기 화학식 4로 표시되는 당쇄이다.

[화학식 중, R¹ 및 R²는 각각 독립적으로, 수소원자, 또는 화학식 5~8로 나타내어지는 기이다.]

본 발명의 당단백질의 제조방법을, 의약품 등의 제조 분야에 적용하는 것을 고려한 경우에 항원성 등의 문제를 회피할 수 있다는 관점에서는, 바람직한 당쇄로서는, 예를 들면, 인체 내에서 단백질과 결합한 당단백질로서 존재하는 당쇄(예를 들면, FEBS LETTERS Vol.50, No. 3, Feb. 1975에 기재된 당쇄)와, 동일한 구조를 갖는 당쇄(구성당의 종류 및 그들의 결합양식이 동일한 당쇄) 또는 이것의 비환원말단으로부터 1 또는 복수의 당을 상실한 당쇄를 들 수가 있다.

당단백질에 있어서, 당쇄의 부가 수는, 1 사슬 이상이면 특별히 한정되지 않지만, 생체 내에 존재하는 당단백질과 유사한 구조의 당단백질을 제공한다는 관점에서는, 체내에 존재하는 당단백질과 같은 정도의 부가 수라면, 보다 바람직할 것이다.

본 발명의 당단백질의 제조방법에서는, 아미노산 서열 및 당쇄가 균일한 당단백질이 사용된다. 본 발명에 있어서, 당단백질에 있어서의 당쇄의 구조가 균일하다는 것은, 당단백질 간에 비교한 경우에, 펩티드 중의 당쇄 부가 부위, 당쇄를 구성하는 각 당의 종류, 결합순서 및 당 간의 결합양식이 적어도 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 99% 이상의 당쇄에 있어서 동일한 것을 말한다.

또한, 본 발명에 있어서, 당단백질에 있어서의 아미노산 서열이 균일하다는 것은, 당단백질 간에 비교한 경우에, 단백질 중의 아미노산의 종류, 결합순서 및 아미노산 간의 결합양식이 동일한 것을 말한다. 단, 당단백질을 폴딩시켰을 때에 소정의 활성을 갖는 한, 적어도 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 99% 이상의 당단백질에 있어서 동일하면 된다.

본 발명에 사용되는 아미노산 서열 및 당쇄가 균일한 당단백질은, 고상합성, 액상합성, 세포에 의한 합성, 천연에 존재하는 것을 분리 추출하는 방법 등, 당업자에게 공지의 펩티드 제조방법에, 당쇄 부가공정을 끼워 넣음으로써 제조할 수 있다. 당쇄 부가 공정에서 사용하는 당쇄의 제조방법에 관해서는, 예를 들면, 국제공개번호 WO03/008431, WO2004/058984, WO2004/008431, WO2004/058824, WO2004/070046, WO2007/011055 등을 참조할 수 있다.

본 발명의 바람직한 태양에 있어서는, 아미노산 및 당쇄가 균일한 당단백질은, 적어도 그 일부가, 이하에 나타내는 방법에 의해 제조된다. 이하에 나타내는 방법에 있어서는 WO2004/005330 팸플릿도 참조할 수 있다.

먼저, (1) 수산기를 갖는 수지(레진)의 수산기와, 지용성 보호기로 아미노기가 보호된 아미노산의 카르복실기, 또는 지용성 보호기로 아미노기가 보호된 당쇄 부가된 아미노산의 카르복실기를 에스테르화 반응시킨다. 이 경우 아미노산의 아미노기를 지용성 보호기로 보호하고 있기 때문에, 아미노산끼리의 자기축합은 방지되고, 레진의 수산기와 아미노산의 카르복실기 사이에서 에스테르화 반응이 일어난다.

다음으로, (2) 공정 (1)에서 얻어진 에스테르의 지용성 보호기를 이탈하여 유리 아미노기를 형성시키고,

(3) 상기 유리 아미노기와, 지용성 보호기로 아미노기가 보호된 아미노산의 카르복실기, 또는 지용성 보호기로 아미노기가 보호된 당쇄 부가된 아미노산의 카르복실기를 아미드화 반응시키며,

(4) 공정 (3) 다음에, 지용성 보호기를 이탈하여 유리 아미노기를 형성시키고

(5) 공정 (3) 및 (4)의 공정을 필요에 따라 반복함으로써, 목적하는 수의 아미노산이 연결되어, 목적하는 위치에 1개 이상의 당쇄가 부가된 당단백질을 얻을 수 있다. 또한, 당쇄 부가된 아미노산으로서는, 예를 들면, 아스파라긴 측쇄의 아미드기의 질소에 당쇄가 N-글루코시드 결합한 당쇄 아스파라긴, 세린 또는 트레오닌 측쇄의 수산기에 당쇄가 O-글리코시드 결합한 당쇄 세린 및 당쇄 트레오닌을 들 수 있다.

공정 (5)에서 얻어지는 당단백질은, 일단이 레진에 결합하고, 또 다른 일단에 유리 아미노기를 갖는다. 거기서, (6) 공정 (1)에서 형성된 에스테르 결합을 산으로 절단함으로써, 목적하는 당단백질을 제조할 수 있다.

고상수지(레진)로서는, 통상, 고상합성에서 사용하는 수지(레진)면 되고, 예를 들면, Amino-PEGA레진(머크사제), Wang레진(머크사제), HMPA-PEGA레진(머크사제), Trt Chloride레진(머크사제) 등을 사용할 수 있다.

또한, Amino-PEGA레진(수지)과 아미노산 사이에 링커를 존재시켜도 되고, 이와 같은 링커로서는, 예를 들면, 4-히드록시메틸페녹시초산(HMPA), 4-(4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시)-부틸초산(HMPB) 등을 들 수 있다.

지용성 보호기로서는, 예를 들면, 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)기, t-부틸옥시카르보닐(Boc)기, 알릴옥시카르보닐(Alloc)기 등의 카르보닐 함유기, 아세틸(Ac)기 등의 아실기, 알릴기, 벤질기 등의 보호기를 들 수 있으나, 특별히 이들에 한정되는 것은 아니다.

지용성 보호기를 도입하기 위해서는, 예를 들면 Fmoc기를 도입하는 경우에는 9-플루오레닐메틸-N-숙신이미딜카보네이트와 탄산수소나트륨을 첨가하여 반응을 행함으로써 도입할 수 있다. 반응은 0~50℃, 바람직하게는 실온에서, 약 1~5시간 정도 행하는 것이 좋다.

지용성 보호기로 보호된 아미노산으로서는, 기출의 아미노산을 상기의 방법으로 보호한 것을 사용할 수 있다. 또한, 시판의 것도 사용할 수 있다. 예를 들면, Fmoc-Ser, Fmoc-Asn, Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Ile, Fmoc-Ala, Fmoc-Tyr, Fmoc-Gly, Fmoc-Lys, Fmoc-Arg, Fmoc-His, Fmoc-Asp, Fmoc-Glu, Fmoc-Gln, Fmoc-Thr, Fmoc-Cys, Fmoc-Met, Fmoc-Phe, Fmoc-Trp, Fmoc-Pro을 들 수 있다.

에스테르화 촉매로서, 예를 들면 1-메틸렌설포닐-3-니트로-1,2,4-트리아졸(MSNT), 디시클로헥실카르보디이미드(DCC), 1,3-디이소프로필카르보디이미드(DIPCDI) 등의 공지의 탈수축합제를 사용할 수 있다. 아미노산과 탈수축합제의 사용 비율은, 전자 1중량부에 대해, 후자가 통상 1~10중량부, 바람직하게는 2~5중량부이다.

에스테르화 반응은, 예를 들면, 고상 칼럼에 레진을 넣어, 이 레진을 용제로 세정하고, 그 후 아미노산의 용액을 첨가함으로써 행하는 것이 바람직하다. 세정용 용제로서는, 예를 들면 디메틸포름아미드(DMF), 2-프로판올, 염화메틸렌 등을 들 수 있다. 아미노산을 용해하는 용매로서는, 예를 들면 디메틸설폭시드(DMSO), DMF, 염화메틸렌 등을 들 수 있다. 에스테르화 반응은 0~50℃, 바람직하게는 실온에서, 약 10분~30시간 정도, 바람직하게는 15분~24시간 정도 행하는 것이 좋다.

이때 고상 상의 미반응의 관능기를, 무수초산 등을 사용해서 아세틸화하여 캡핑하는 것도 바람직하다.

지용성 보호기의 이탈은, 예를 들면 염기로 처리함으로써 행할 수 있다. 염기로서는, 예를 들면 피페리딘, 모르폴린 등을 들 수 있다. 그때, 용매의 존재하에 행하는 것이 바람직하다. 용매로서는, 예를 들면 DMSO, DMF, 메탄올 등을 들 수 있다.

유리 아미노기와, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 임의의 아미노산의 카르복실기와의 아미드화 반응은, 활성화제 및 용매의 존재하에 행하는 것이 바람직하다.

활성화제로서는, 예를 들면, 디시클로헥실카르보디이미드(DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드·염산염(WSC/HCl), 디페닐포스포릴아지드(DPPA), 카르보닐디이미다졸(CDI), 디에틸시아노포스포네이트(DEPC), 1,3-디이소프로필카르보디이미드(DIPCI), 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트(PyBOP), 3-디에톡시포스포릴옥시-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-온(DEPBT), 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt), 히드록시숙신이미드(HOSu), 디메틸아미노피리딘(DMAP), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt), 3-히드록시-4-옥소-3,4-디히드로-5-아자벤조-1,2,3-트리아진(HODhbt), 히드록시프탈이미드(HOPht), 펜타플루오로페놀(Pfp-OH), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스포네이트(HATU), O-벤조트리아졸-1-일-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TBTU) 등을 들 수 있다.

활성화제의 사용량은, 지용성의 보호기로 아미노기 질소가 보호된 임의의 아미노산에 대해, 1~20당량, 바람직하게는 1~10당량, 더욱 바람직하게는 1~5당량으로 하는 것이 바람직하다.

상기 활성화제만으로도 반응은 진행되지만, 보조제로서 아민을 병용하는 것이 바람직하다. 아민으로서는, 예를 들면, 디이소프로필에틸아민(DIPEA), N-에틸모르폴린(NEM), N-메틸모르폴린(NMM), N-메틸이미다졸(NMI) 등을 사용할 수 있다. 보조제의 사용량은, 지용성의 보호기로 아미노기 질소가 보호된 임의의 아미노산에 대해, 1~20당량, 바람직하게는 1~10당량, 더욱 바람직하게는 1~5당량으로 하는 것이 바람직하다.

용매로서는, 예를 들면 DMSO, DMF, 염화메틸렌 등을 들 수 있다. 반응은 0~50℃, 바람직하게는 실온에서, 약 10분~30시간 정도, 바람직하게는 15분~24시간 정도 행하는 것이 좋다. 이때에도 고상 상의 미반응의 아미노기를 무수초산 등을 사용해서 아세틸화하여 캡핑하는 것이 바람직하다. 지용성 보호기의 이탈은, 상기와 동일하게 행할 수 있다.

레진(수지)으로부터 펩티드 사슬을 절단하기 위해서는 산으로 처리하는 것이 바람직하다. 산으로서는, 예를 들면 트리플루오로초산(TFA), 불화수소(HF) 등을 들 수 있다. 그때, 아미노산에 사용하고 있던 지용성 보호기 및 레진(수지) 상의 링커로부터, 반응성이 높은 양이온종이 생성되는 경우가 있기 때문에, 이것을 포획하기 위해 구핵성 시약을 첨가하는 것이 바람직하다. 구핵성 시약으로서는 트리이소프로필실란(TIS), 페놀, 티오아니솔, 에탄디티올(EDT) 등을 들 수 있다.

아미노산 서열 및 당쇄가 균일한 당단백질은, 몇 가지의 펩티드 블록 또는 당펩티드 블록으로 나누어, 각각을 공정 (1)~(6)에 의해 합성한 후, 라이게이션법에 의해 연결하여 제조하는 것도 가능하다.

본 명세서에 있어서 「라이게이션법」이란, 국제공개 제96/34878호 팸플릿에 기재된 천연형 화학적 라이게이션법(Native Chemical Ligation, NCL법)을 비롯하여, 비천연 아미노산이나 아미노산 유도체를 포함하는 펩티드에 대해, 천연형 화학적 라이게이션법을 응용하는 경우도 포함한다. 라이게이션법에 의하면, 연결 부위에 천연 아미드 결합(펩티드 결합)을 갖는 단백질을 제조할 수 있다.

라이게이션을 사용한 연결은, 펩티드-펩티드 간, 펩티드-당펩티드 간, 당펩티드-당펩티드 간의 어느 것에 있어서도 행할 수 있으나, 연결되는 2개의 펩티드 또는 당펩티드의 한쪽이 N 말단에 시스테인 잔기를 가지고, 다른 쪽이 C 말단에 α카르복시티오에스테르 부분을 가지고 있을 필요가 있다.

각 펩티드 또는 당펩티드 블록이, N 말단에 시스테인 잔기를 갖도록 하기 위해서는, 예를 들면, 각 펩티드 또는 당펩티드 블록을 설계할 때에, 최종적으로 제조하는 당단백질에 포함되어 있는 시스테인 잔기의 N 말단측에서 분할하면 된다.

C 말단에 α카르복시티오에스테르 부분을 갖도록 한 펩티드 또는 당펩티드 블록은, 국제공개번호 WO96/34878에 기재된 방법 등, 당업자에게 공지의 수법을 사용하여 제조할 수 있다.

예를 들면, 후술하는 실시예의 기재와 같이, 고상합성법에 의해, 아미노산 측쇄와 N 말단의 아미노기가 보호된 보호펩티드(또는 당펩티드)를 얻어, 이 C 말단측의 카르복실기를, 액상 중에 있어서 축합제에 PyBOP(Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate)/DIPEA를 사용하여 벤질메르캅탄과 축합시키고, 그 후, 95% TFA용액을 사용해서 탈보호함으로써, C 말단에 α-카르복시티오에스테르 부분을 갖도록 한 펩티드(또는 당펩티드)를 얻을 수 있다.

라이게이션법은, 특허문헌 1의 기재와 같은 당업자에게 공지의 수법을 이용하여, 또한, 후술하는 실시예의 기재를 참조하여 실시할 수 있다. 예를 들면, C 말단에 -C(=O)-SR에 의해 표시되는 α-카르복시티오에스테르 부분을 갖도록 한 제1 펩티드와, N 말단에 -SH기를 갖는 아미노산 잔기를 갖는 제2 펩티드를 전술한 기재를 참조하여 준비한다. 또한, 제1 펩티드에 있어서, R은 티올 교환반응을 저해하지 않고, 카르보닐탄소로의 구핵치환반응에 있어 이탈기가 되는 기라면 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 벤질메르캅탄 등의 벤질형, 티오페놀, 4-(카르복시메틸)-티오페놀 등의 아릴형, 2-메르캅토에탄설폰산염, 3-메프캅토프로피온산아미드 등의 알킬형 등으로부터 선택할 수 있다. 또한, 제2 펩티드의 N 말단의 -SH기는, 목적하는 바에 따라 보호기에 의해 보호되어 있어도 되지만, 이 보호기는 이하의 라이게이션 반응까지의 목적하는 시점에서 탈보호하여, N 말단에 -SH기를 갖는 제2 펩티드가 제1 펩티드와 반응한다. 예를 들면 디설파이드기 등, 라이게이션이 일어나는 조건에 있어서 자연히 탈보호되는 보호기라면, 보호기에 의해 보호한 제2 펩티드를 그대로 이하의 라이게이션 반응에 사용하는 것도 가능하다.

이들의 2개의 펩티드를, 필요에 따라서, 4-메르캅토페닐초산, 벤질메르캅탄, 티오페놀 등의 촉매 티올의 존재하에, 100 mM 인산 완충용액 등의 용액 중에서 혼합한다. 바람직하게는, 제1 펩티드 1당량에 대해 제2 펩티드를 0.5~2당량 및 촉매 티올을 5당량 정도의 비율로 반응을 행한다. 반응은 pH 6.5~7.5 정도, 20~40℃ 정도의 조건하에, 약 1~30시간 정도 행하는 것이 바람직하다. 반응의 진행은, HPLC, MS 등을 조합시킨 공지의 수법을 이용하여 확인할 수 있다.

이것에, 디티오트레이톨(DTT), 트리스2-카르복시에틸포스핀 염산염(TCEP)과 같은 환원제를 첨가하여 부반응을 억제하고, 목적하는 바에 따라 정제함으로써, 제1 펩티드와 제2 펩티드를 연결할 수 있다.

또한, C 말단에 카르복시티오에스테르 부분(-C=O-SR)을 갖도록 한 펩티드에 있어서, R기가 상이한 펩티드가 존재하는 경우, 라이게이션 반응의 순서를 조작하는 것이 가능하여(Protein Science(2007), 16:2056-2064 등 참조), 복수 회의 라이게이션을 행하는 경우에는 이것을 고려할 수 있다. 예를 들면, R로서 아릴기, 벤질기 및 알킬기가 존재하는 경우에는, 일반적으로 이 순으로 연결반응이 진행된다.

본 명세서에 있어서, 단백질의 「고차구조」란, α헬릭스나 β시트 구조 등의 2차구조, 또는 랜덤 코일 등의 구조, 2차구조가 수소 결합, 디설파이드 결합, 이온 결합, 소수성 상호작용 등에 의해 공간적으로 접어 겹쳐져서, 안정한 형태를 형성한 3차구조, 복수의 폴리펩티드 사슬이 서브유닛으로서 집합하여 형성되는 4차구조를 포함하는, 단백질의 입체구조를 말한다. 단백질의 고차구조는, 단백질이 생체 내에서 기능을 발휘하기 위해 필요한 구조인 것이 바람직하다. 단백질의 고차구조는, X선 결정구조해석이나 NMR 등에 의해 해석할 수 있다.

본 명세서에 있어서, 당단백질의 고차구조가 균일하다는 것은, 당단백질의 단백질 부분의 고차구조를, 당단백질 간에 비교한 경우에, 실질적으로 동일한 것을 말한다. 고차구조가 실질적으로 동일하다는 것은, 적어도 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상의 구조가 균일한 것을 말한다. 고차구조가 균일한 당단백질은, 품질이 일정하여, 특히 의약품의 제조나, 어세이 등의 분야에 있어서 바람직하다. 어느 한 분획에 포함되는 당단백질의 고차구조가 균일한지 여부는, 예를 들면, NMR 해석, CD 측정, 디설파이드 맵핑 등에 의해 확인할 수 있다.

본 명세서에 있어서 「폴딩」이란, 당단백질의 단백질 부분이 특정한 고차구조로 접어 겹쳐지는 것을 말한다. 당단백질의 폴딩은, 공지의 방법 또는 그것에 준하는 방법에 따라 당업자는 적절히 행할 수 있지만, 예를 들면, 투석법과 희석법, 불활성화법 등을 들 수 있다. 투석법은, 사전에 단백질 변성제(언폴딩제)를 첨가해두고, 이것을 투석에 의해 서서히 희석하여 완충액 등으로 치환함으로써, 펩티드를 소정의 고차구조로 폴딩시키는 방법이다. 언폴딩제로서는, 염화 구아니딘, 요소 등을 들 수 있다. 또한 희석법은, 단백질 변성제를 첨가한 후, 완충액 등으로 단계적 또는 한번에 희석함으로써 펩티드를 고차구조로 폴딩시키는 방법이다. 불활성화법이란, 단백질 변성제를 첨가한 후, 단계적 또는 한번에 이 변성제를 불활성화시키는 제2의 제(agent)를 첨가함으로써 펩티드를 고차구조로 폴딩시키는 방법이다.

본 발명에 있어서 「소정의 생리활성」이란, 폴딩시켰을 때에, 일정한 비율로 재현성 좋게 얻어지는 고차구조를 갖는 당단백질의 생리활성 중에서 선택할 수 있다. 이러한 생리활성은, 사전에 대상으로 하는 당단백질을, 후술하는 공정 (a) 및 공정 (b)와 동일한 방법으로 폴딩시켜, 칼럼 크로마토그래피에 의해 분획하고, 주된 피크에 대응하는 유출액을 회수하여, 그 분획에 포함되는 당단백질의 생리활성을 측정함으로써 구할 수 있다. 여기서, 주된 피크란, 공정 (a) 및 공정 (b)를 반복하여 행한 경우에, 재현성 좋게 얻어지는 피크를 의미한다. 생리활성의 측정은, 대상이 되는 당단백질에 따라, 당업자에게 공지의 방법으로 행할 수 있다.

본 발명의 「아미노산 서열, 당쇄구조 및 고차구조가 균일한 당단백질의 제조방법」에서는, 먼저 공정 (a)에 있어서, 아미노산 서열 및 당쇄가 균일한 당단백질을 폴딩시킨다. 폴딩 후의 당단백질을 포함하는 용액에는, 고차구조가 상이한 당단백질이 혼재되어, 소정의 활성을 갖는 것과 갖지 않는 것이 포함된다.

다음으로, 공정 (b)에 있어서, 폴딩시킨 당단백질을 칼럼 크로마토그래피에 의해 분획한다. 칼럼 크로마토그래피는, 고차구조가 상이한 당단백질을 분리할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 고속액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용할 수 있다. 칼럼 크로마토그래피의 고정상, 이동상의 종류, 유출속도 등의 조건은, 분리하는 당단백질에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있지만, 예를 들면, ODS타입의 역상 크로마토그래피, 순상계 칼럼, 친화성 칼럼, 겔 여과 칼럼, 이온교환 칼럼 등을 이용할 수 있다.

공정 (c)에 있어서, 칼럼 크로마토그래피의 용출액의 각 분획에 포함되는 당단백질의 활성을 측정하여, 소정의 활성을 갖는 분획을 회수함으로써, 아미노산 서열, 당쇄구조 및 고차구조가 균일한 당단백질을 얻을 수 있다.

본 발명의 당단백질 제조방법에서는, 공정 (c) 다음에, (d) 상기 공정 (c)에서 회수되지 않은 분획에 포함되는 당단백질을 언폴딩시키고,

(e) 상기 언폴딩시킨 당단백질을 재차 폴딩시키며,

(f) 상기 재차 폴딩시킨 당단백질을 칼럼 크로마토그래피에 의해 분획하여, 상기 목적하는 활성을 갖는 분획을 회수하고,

(g) 필요에 따라 (d)에서 (f)를 반복하는 것도 바람직하다.

공정 (d)에서 언폴딩되는 당단백질이 포함되는 분획에는, 소정의 활성을 갖지 않는 고차구조도 포함된다. 또한, 소정의 활성을 갖는 당단백질이 2 이상 혼재되어 있는 분획도, 소정의 활성값을 나타내지 않기 때문에, 언폴딩되는 분획에 포함한다.

당단백질의 언폴딩은, 당업자에게 공지의 방법을 이용하여 행할 수 있지만, 예를 들면, 염산구아니딘, 요소 등의 언폴딩제(단백질 변성제)를 첨가하는 방법, 또한 이들에 더하여 디티오트레이톨(DTT), 메르캅토에탄올 등의 환원제를 첨가하는 수법도 들 수 있다.

공정 (e) 및 공정 (f)는, 상기 공정 (a) 내지 공정 (c)와 동일한 방법으로 행할 수 있다.

이와 같이 공정 (d)에서 공정 (f)를 행함으로써, 소정의 활성을 갖지 않는 분획에 포함되는 당단백질이, 일단 되감겨, 재차 접어 겹쳐짐으로써, 일정한 비율로 소정의 활성을 갖는 고차구조로 변환될 수 있다. 이와 같이 하여, 소정의 활성을 갖는 고차구조를 취하는 당단백질을 최대한 회수할 수 있다.

본 발명의 「당단백질의 스크리닝 방법」은, (i) 아미노산 서열 및 당쇄가 균일한 당단백질을 폴딩시키고,

(ii) 상기 폴딩시킨 당단백질을 칼럼 크로마토그래피에 의해 분획하여,

(iii) 각 분획의 활성을 측정하고, 소정의 활성을 갖는지 여부를 판정한다.

공정 (i) 및 공정 (ii)는, 상기 공정 (a) 및 공정 (b)와 동일하게 행할 수 있다. 전술한 바와 같이, 아미노산 서열 및 당쇄가 균일한 당단백질을 폴딩한 후의 당단백질용액에는, 복수의 고차구조를 취하는 당단백질이 혼재되어 있다. 따라서, 칼럼 크로마토그래피에 의해 분획한 후, 각 분획의 활성을 측정하여, 소정의 활성을 갖는지 여부를 판정함으로써, 소정의 생리활성을 갖는 균일한 고차구조를 갖는 당단백질만을 선택하여 정제할 수 있다.

또한, 본 발명은, 목적하는 생리활성을 갖는 당단백질 혼합물을 얻는 방법을 제공한다. 동방법은, (A) 아미노산 서열 및 당쇄가 균일한 당단백질을 폴딩시키고,

(B) 상기 폴딩시킨 당단백질을 칼럼 크로마토그래피에 의해 분획하여,

(C) 각 분획의 활성을 측정하고,

(D) 목적하는 활성을 얻을 수 있는 각 분획의 혼합비율을 구하여, 해당 비율에 따라 각 분획을 혼합하는 것을 포함한다.

공정 (A) 및 공정 (B)는, 상기 공정 (a) 및 공정 (b)와 동일하게 행할 수 있다. 공정 (A) 및 공정 (B)에 의해, 아미노산 서열, 당쇄구조 및 고차구조가 균일하고, 소정의 활성을 갖는 당단백질을 얻을 수 있다. 따라서, 이들을 소정의 비율로 혼합함으로써, 목적하는 생리활성을 갖는 당단백질 혼합물을 얻는 것이 가능하다.

또한, 본 명세서에 있어서 사용되는 용어는, 특정의 실시태양을 설명하기 위해 사용되는 것으로, 발명을 한정하는 의도는 아니다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 「포함한다」라는 용어는, 문맥상 명확하게 다르게 이해해야하는 경우를 제외하고, 기술된 사항(부재, 스텝, 요소, 숫자 등)이 존재하는 것을 의도하는 것으로, 그 이외의 사항(부재, 스텝, 요소, 숫자 등)이 존재하는 것을 배제하지 않는다.

상이한 정의가 없는 한, 여기에 사용되는 모든 용어(기술용어 및 과학용어를 포함한다.)는, 본 발명이 속하는 기술의 당업자에 의해 널리 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 여기에 사용되는 용어는, 상이한 정의가 명시되어 있지 않는 한, 본 명세서 및 관련 기술분야에 있어서의 의미와 정합적인 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 이상화되거나, 또는 과도하게 형식적인 의미로 해석되어서는 안 된다.

본 발명의 실시태양은 모식도를 참조하면서 설명되는 경우가 있는데, 모식도인 경우, 설명을 명확히 하기 위해, 과장되게 표현되어 있는 경우가 있다.

제1, 제2 등의 용어가 각종 요소를 표현하기 위해 사용되는데, 이들 요소는 그들 용어에 의해 한정되어서는 안 되는 것을 이해할 수 있다. 이들 용어는 하나의 요소를 다른 요소와 구별하기 위해서만 사용되고 있는 것으로, 예를 들면, 제1 요소를 제2 요소로 기재하고, 동일하게, 제2 요소는 제1 요소로 기재하는 것은, 본 발명의 범위를 일탈하는 일 없이 가능하다.

이하에 있어서, 본 발명을, 실시예를 참조해 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명은 여러 가지 태양에 의해 구현화 할 수 있으므로, 여기에 기재되는 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다.

실시예

<실시예1> silver pheasant의 오보뮤코이드 제3 도메인(이하, 「OMSVP3」으로 기재하는 경우도 있다)의 화학합성

1. 아미노산 서열 및 당쇄가 균일한 silver pheasant 의 오보뮤코이드 제3 도메인의 화학합성

도 1에 나타내어지는 3개의 프래그먼트를 각각 합성한 후, NCL법에 의해 라이게이션을 행하여, 아미노산 서열 및 당쇄가 균일한 silver pheasant의 오보뮤코이드 제3 도메인을 합성하였다. 프래그먼트 1~3를 도 2~4에 나타낸다.

[사용한 장치]

¹H-NMR은 Bruker의 AVANCE 600(600 MHz로 표기)으로 측정하였다. ESI 질량 스펙트럼 측정에는, Bruker Daltonics의 Esquire3000plus.를 사용하였다.

CD 스펙트럼 측정에는, JASCO의 J-820, J-805를 사용하였다.

RP-HPLC 분석장치는 Waters사제의 것을, UV 검출기는 Waters제의 Waters486과 photodiode array detector(Waters 2996)와 Waters2487을, 칼럼은 Cadenza column(Imtakt Corp., 3 ㎛, 4.6×75 ㎜)과 VydacC-18(5 ㎛, 4.6×250 ㎜, 10×250 ㎜), VydacC-8(5 ㎛, 10×250 ㎜), VydacC-4(5 ㎛, 4.6×250 ㎜)를 사용하였다.

[프래그먼트 1의 합성]

고상합성용 칼럼에 2-클로로트리틸 레진(2-Chlorotrityl resin)(143 ㎎, 200 μmol)을 넣고, 염화메틸렌(DCM)으로 충분히 세정하였다. 별도로, Fmoc-Leu(212.1 ㎎, 0.6 mmol)와 DIPEA(272.1 μL, 1.6 mmol)를 DCM(1.2 mL)에 용해시킨 것을, 수지가 들어 있는 고상합성용 칼럼에 넣고, 실온에서 2시간 교반하였다. 교반 후, 수지를 DCM:MeOH:DIPEA=17:2:1, DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. 이어서, Fmoc기를 20분 20% 피페리딘/DMF용액(2 mL)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, Kaiser Test에 의해 반응을 확인하고, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 이용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.

Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산과 HOBt(135.1 ㎎, 1 mmol), DIPCI(153.9 μL, 1 mmol)를 DMF(4 mL)에 용해시켜 15분간 활성화시킨 후, 고상합성용 칼럼에 넣고, 실온에서 1시간 교반하였다. 교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 20분 20% 피페리딘/DMF용액(2 mL)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하여, 아미노산을 순차 축합시켰다. 아미노기를 보호한 아미노산에는, Fmoc-Pro, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Met, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Ala, Fmoc-Pro, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Pro, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Val, Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Val, Fmoc-Ala, Fmoc-Ala를 사용하고, 마지막 아미노산은 보호기를 산으로 제거할 수 있는 Boc-Leu-OH·H₂O(249.3 ㎎, 1 mmol)를 사용하였다. 고상수지 상에, Boc-Leu-Ala-Ala-Val-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Pro-Lys(Boc)-Pro-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Met-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-Leu의 보호기를 갖는 23잔기 펩티드(서열번호 1)를 얻었다. 이것에, AcOH:DCM:MeOH=5:4:1을 2 mL 첨가하고, 실온에서 3시간 교반하였다. 교반 후, 수지를 여과하여 제거하고, 추가적으로 MeOH로 수지의 세정을 행하였다. 여액을 별도로 준비한 헥산 중에 첨가하고, 정석(晶析)을 행하였다. 여과 후의 결정을 과잉량의 벤젠으로 3회 공비한 후, 동결건조를 행하였다(도 5 상단. 단 탈보호해서 측정하였다.).

얻어진 펩티드(보호기를 갖는 서열번호 1에 기재된 23잔기 펩티드)(39 ㎎, 10 μmol)와 MS4A, 벤질메르캅탄(35.5 μL, 0.3 mmol)을 DMF용매 중(1.35 mL), 아르곤기류하 -20℃에서 1시간 교반한 후, PyBOP(26 ㎎, 50 μmol)와 DIPEA(8.5 μL, 50 μmol)를 첨가하고, 2시간 교반하였다. 교반 후, 반응용액에 과잉량의 디에틸에테르를 첨가하여 화합물을 침전시키고, 여과하였다. 그 후에 침전물을 DMF로 용해하였다. 용액을 감압하에 농축한 후, 95% TFA, 2.5% TIPS, 2.5% H₂O용액(1 mL)을 첨가하고 실온에서 2시간 교반하였다(도 5 중단). 반응용액을 감압 농축 후, HPLC(Cadenza column CD18(Imtakt Inc.), 3 ㎜, 75×4.6 ㎜, 전개용매 A:0.09% TFA 수용액 B:0.1% TFA 아세토니트릴:물=90:10 그라디언트 A:B=80:20→40:60(아세토니트릴의 그라디언트:18%→54%) 15분 유속 1.0 mL/min)로 정제하여, Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Val-Asp-Cys-Ser-Glu-Tyr-Pro-Lys-Pro-Ala-Cys-Thr-Met-Glu-Tyr-Arg-Pro-Leu-SBn의 C 말단이 벤질티오에스테르인 23잔기의 펩티드(서열번호 2)를 얻었다(도 5 하단).

[프래그먼트 2의 합성]

이어서, 다른 고상합성용 칼럼에 Amino-PEGA resin(머크사제)(1 g, 50 μmol)을 넣고, 염화메틸렌(DCM), DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(0.125 mmol), TBTU(0.125 mmol) 및 N-에틸모르폴린(0.125 mmol)을 DMF(1 ㎖)에 용해시켜 칼럼에 넣고, 실온에서 2시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세정하고, Kaiser Test로 반응을 확인하였다. Kaiser Test 음성(-)인 것을 확인하고, 수지를 DCM으로 1시간 팽윤시켰다. HMPB-PEGA resin을 얻어, 이것을 고상합성용 고상담체로서 사용하였다.

Fmoc-Phe(96.9 ㎎, 0.25 mmol), MSNT(74 ㎎, 0.25 mmol) 및 N-메틸이미다졸(14.9 ㎕, 0.188 mmol)을 DCM(1 mL)에 용해시켜, 고상합성용 칼럼에 넣고, 실온에서 2시간 교반하였다. 교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용하여 세정하고, Fmoc기를 20% 피페리딘/DMF용액(1 mL)으로 20분간 처리하여 탈보호하였다. DMF로 세정 후, Kaiser Test에 의해 반응을 확인하고, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 이용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.

Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산과 HOBt(33.8 ㎎, 0.25 mmol), DIPCI(38.5 μL, 0.25 mmol)를 DMF(1 mL)에 용해시켜 15분간 활성화시킨 후, 고상합성용 칼럼에 넣고, 실온에서 1시간 교반하였다. 교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 20분 20% 피페리딘/DMF용액(1 mL)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하여, 아미노산을 순차 축합시켰다. 아미노기를 보호한 아미노산에는, Fmoc-Asn, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Asn, Fmoc-Gly, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Lys(Boc)를 사용하여, 고상수지 상에, Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Asn-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asn-Phe의 보호기를 갖는 9잔기 펩티드(서열번호 3)를 얻었다. 이 고상수지 상의 9잔기 펩티드 3 μmol 상당을 다른 고상합성용 칼럼에 덜어 Fmoc기를 20분 20% 피페리딘/DMF용액(1 mL)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 충분히 세정을 행한 후, 수지를 에펜도르프 튜브에 옮겼다. 이어서, 하기 화학식 1로 표시되는 당쇄 아스파라긴(12 ㎎, 6μmol)과 DEPBT(3 ㎎, 10μmol)를 DMF:DMSO=4:1, 0.20 mL에 용해시켜, 에펜도르프 튜브에 넣고, DIPEA(1.02 μL, 6 μmol)를 첨가하여 실온에서 20시간 교반하였다.

교반 후, 수지를 고상합성용 칼럼으로 옮겨, DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 20% 피페리딘/DMF용액(1 mL)으로 20분간 처리하여 탈보호하였다. DMF로 세정 후, 그 후의 당펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 이용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다. Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산과 HOBt(2 ㎎, 0.015 mmol), DIPCI(2.3 μL, 0.015 mmol)를 DMF(0.375 mL)에 용해시켜 15분간 활성화시킨 후, 고상합성용 칼럼에 넣고, 실온에서 2시간 교반하였다. 교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 20분 20% 피페리딘/DMF용액(1 mL)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하여, 아미노산을 순차 축합시켰다. 아미노기를 보호한 아미노산에는, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Gly, Boc-Cys(Thz)를 사용하여, 고상수지 상에 Boc-Cys(Thz)-Gly-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Asn(Oligosaccharide)-Lys(Boc)―Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Asn-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asn-Phe의 보호기를 갖는 14잔기 당쇄 부가 펩티드(서열번호 4)를 얻었다. 이것에, 초산:트리플루오로에탄올(=1:1) 1 mL를 첨가하고, 실온에서 20시간 교반을 행하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 추가적으로 MeOH로 세정한 후, 여액을 감압하에 농축 후, 벤젠을 사용하여 공비를 3회 행하였다. 이 잔사를 용해 후, 동결건조를 행하였다(도 6 상단. 단 탈보호하여 측정하였다).

얻어진 펩티드(보호기를 갖는 서열번호 4에 기재된 14잔기 당쇄 부가 펩티드)(11.7 ㎎, 3 μmol)와 MS4A(10 ㎎), 벤질메르캅탄(10.6 μL, 0.09 mmol)을 DMF용매 중(0.41 mL), 아르곤 기류하 -20℃에서 1시간 교반한 후, PyBOP(7.8 ㎎, 15 μmol)와 DIPEA(2.6 μL, 15 μmol)를 첨가하고, 2시간 교반하였다. 교반 후, 반응용액에 과잉량의 디에틸에테르를 첨가하여 화합물을 침전시키고, 여과 후에 침전물을 DMF로 용해하였다. 용액을 감압하에 농축한 후, 95% TFA, 2.5% TIPS, 2.5% H₂O용액(1 mL)을 첨가하고 실온에서 2시간 교반하였다(도 6 중단). 반응용액을 감압하에 농축 후, HPLC(Cadenza column CD18(Imtakt Inc.), 3 ㎜, 75×4.6 ㎜, 전개용매 A:0.09% TFA 수용액 B:0.1% TFA 아세토니트릴:물=90:10 그라디언트 A:B=80:20→40:60(아세토니트릴의 그라디언트:18%→54%) 15분 유속 1.0 mL/min)로 정제하여, Cys(Thz)-Gly-Ser-Asp-Asn(Oligosaccharide)-Lys-Thr-Tyr-Gly-Asn-Lys-Cys-Asn-Phe-SBn의 C 말단이 벤질티오에스테르인 보호기를 갖는 14잔기 당쇄 부가 펩티드(서열번호 5)를 얻었다(도 6 하단).

[프래그먼트 3의 합성]

이어서, 고상합성용 칼럼에 2-Chlorotrityl resin(200 μmol)을 넣고, 염화 메틸렌(DCM)으로 충분히 세정하였다. 별도로, Fmoc-Cys(Trt)(351.4 ㎎, 0.6 mmol)와 DIPEA(272.1 μL, 1.6 mmol)를 DCM(1.2 mL)에 용해시킨 것을, 수지가 들어 있는 고상합성용 칼럼에 넣고, 실온에서 2시간 교반하였다. 교반 후, 수지를 DCM:MeOH:DIPEA=17:2:1, DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. 이어서, Fmoc기를 20분 20% 피페리딘/DMF용액(2 mL)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, Kaiser Test에 의해 반응을 확인하고, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 이용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.

Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산과 HOBt(135.1 ㎎, 1 mmol), DIPCI(153.9 μL, 1 mmol)를 DMF(4 mL)에 용해시켜 15분간 활성화시킨 후, 고상합성용 칼럼에 넣고, 실온에서 1시간 교반하였다. 교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 20분 20% 피페리딘/DMF용액(2 mL)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하여, 아미노산을 순차 축합시켰다. 아미노기를 보호한 아미노산에는, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Gly, Fmoc-Phe, Fmoc-His(Trt), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Gly, Fmoc-Asn, Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Val, Fmoc-Val, Fmoc-Ala, Fmoc-Asn, Fmoc-Cys(Trt)를 사용하여, 고상수지 상에, Cys(Trt)-Asn-Ala-Val-Val-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Asn-Gly-Thr(tBu)-Leu-Thr(tBu)-Leu-Ser(tBu)-His(Trt)-Phe-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)의 보호기를 갖는 19잔기 펩티드(서열번호 6)를 얻었다. 이것에 95% TFA, 2.5% TIPS, 2.5% H₂O용액(3 mL)을 첨가하고 실온에서 2시간 교반한 후, 수지를 여과하여 제거하고, 여액을 감압하에 농축하였다(도 7 상단). 이것을 HPLC(Cadenza column CD18(Imtakt Inc.), 3 ㎜, 75×4.6 ㎜, 전개용매 A:0.09% TFA 수용액 B:0.1% TFA 아세토니트릴:물=90:10 그라디언트 A:B=80:20→40:60(아세토니트릴의 그라디언트:18%→54%) 15분 유속 1.0 mL/min)로 정제하여, Cys-Asn-Ala-Val-Val-Glu-Ser-Asn-Gly-Thr-Leu-Thr-Leu-Ser-His-Phe-Gly-Lys-Cys의 19잔기 펩티드(서열번호 7)를 얻었다(도 7 하단).

[프래그먼트 2와 프래그먼트 3의 NCL법에 의한 라이게이션]

프래그먼트 3(서열번호 7에 기재된 19잔기 펩티드) 1.9 ㎎(1 μmol)과 프래그먼트 2(서열번호 5에 기재된 C 말단이 벤질티오에스테르인 보호기를 갖는 14잔기의 당쇄 부가 펩티드) 3.2 ㎎(1 μmol)의 두 종류를 동일한 에펜도르프 튜브에 넣고, 0.1% 인산 완충용액(pH 7.5, 6 M 구아니딘 염산염 함유) 485 μL에 용해시킨 후, 25℃에서 티오페놀(15 μL)을 첨가하고, 실온에서 반응을 행하였다(도 8의 0 h). 24시간 후, 반응 종료를 HPLC로 확인한 후(도 8의 24 h), 반응용액을 HPLC(Cadenza column CD18(Imtakt Inc.), 3 ㎜, 75×4.6 ㎜, 전개용매 A:0.09% TFA 수용액 B:0.1% TFA 아세토니트릴:물=90:10 그라디언트 A:B=80:20→40:60(아세토니트릴의 그라디언트:18%→54%) 15분 유속 1.0 mL/min)로 정제하였다(도 8의 정제 후). 그 후 동결건조를 행하여, Cys(Thz)-Gly-Ser-Asp-Asn(Oligosaccharide)-Lys-Thr-Tyr-Gly-Asn-Lys-Cys-Asn-Phe-Cys-Asn-Ala-Val-Val-Glu-Ser-Asn-Gly-Thr-Leu-Thr-Leu-Ser-His-Phe-Gly-Lys-Cys의 보호기를 갖는 33잔기 당쇄 부가 펩티드(서열번호 8)를 얻었다.

얻어진 펩티드(서열번호 8에 기재된 보호기를 갖는 33잔기 당쇄 부가 펩티드)를, 0.2 M 메톡시아민 수용액(pH=4.0)에 용해시켰다. 4시간 후, 반응의 종료를 HPLC로 확인한 후, HPLC(Cadenza column CD18(Imtakt Inc.), 3 ㎜, 75×4.6 ㎜, 전개용매 A:0.09% TFA 수용액 B:0.1% TFA 아세토니트릴:물=90:10 그라디언트 A:B=80:20→40:60(아세토니트릴의 그라디언트:18%→54%) 15분 유속 1.0 mL/min)로 정제하였다(도 8의 티아졸린 탈보호). 그 후 동결건조를 행하여, Cys-Gly-Ser-Asp-Asn(Oligosaccharide)-Lys-Thr-Tyr-Gly-Asn-Lys-Cys-Asn-Phe-Cys-Asn-Ala-Val-Val-Glu-Ser-Asn-Gly-Thr-Leu-Thr-Leu-Ser-His-Phe-Gly-Lys-Cys의 33잔기 당쇄 부가 펩티드(서열번호 9)를 얻었다.

또한, 이하의 조건에서도 동일하게 서열번호 9에 기재된 33잔기 당쇄 부가 펩티드가 얻어졌다.

프래그먼트 3(서열번호 7에 기재된 19잔기 펩티드) 1.9 ㎎(1 μmol)과 프래그먼트 2(서열번호 5에 기재된 C 말단이 벤질티오에스테르인 보호기를 갖는 14잔기의 당쇄 부가 펩티드) 3.2 ㎎(1 μmol)의 두 종류를 각각 에펜도르프 튜브에 넣고, 0.1% 인산 완충용액(pH 7.5, 6 M 구아니딘 염산염 함유) 247.5 μL에 용해시킨 후, 하나의 에펜도르프 튜브에 합쳤다. 25℃에서 1% 티오페놀(5 μL)을 첨가하고, 실온에서 반응을 행하였다. 반응을 HPLC와 질량분석으로 추적하여, 7시간 후에 HPLC로 프래그먼트 3의 소실을 확인하였다. 그 후 0.2 M의 메톡시아민 수용액을 계중이 pH 4 부근이 될 때까지 첨가하여 N 말단의 Cys를 탈보호하였다. 6시간 후 반응의 종료를 질량분석으로 확인하고, 반응용액을 HPLC(Cadenza column CD18(Imtakt Inc.), 3 ㎜, 75×4.6 ㎜, 전개용매 A:0.09% TFA 수용액 B:0.1% TFA 아세토니트릴:물=90:10 그라디언트 A:B=80:20→40:60(아세토니트릴의 그라디언트:18%→54%) 15분 유속 1.0 mL/min)로 정제하였다. 그 후 동결건조를 행하여, 서열번호 9의 33잔기 당쇄 부가 펩티드를 얻었다.

[프래그먼트 1과, 프래그먼트 2 및 3의 NCL법에 의한 라이게이션]

프래그먼트 2와 프래그먼트 3를 라이게이션함으로써 조제한 33잔기 당쇄 부가 펩티드(서열번호 9) 1.3 ㎎(0.25 μmol)과 프래그먼트 1(서열번호 2에 기재된 C 말단이 벤질티오에스테르인 23잔기 펩티드) 1.3 ㎎(0.50 μmol)의 두 종류를 동일한 에펜도르프 튜브에 넣고, 0.1% 인산 완충용액(pH 7.5, 8 M 구아니딘 염산염 함유) 485μL에 용해시킨 후, 25℃에서 티오페놀(15 μL)을 첨가하고, 실온에서 반응을 행하였다(도 9의 O h). 54시간 후, 반응종료를 HPLC로 확인한 후(도 9의 54 h), 반응용액을 HPLC(Cadenza column CD18(Imtakt Inc.), 3 ㎜, 75×4.6 ㎜, 전개용매 A:0.09% TFA 수용액 B:0.1% TFA 아세토니트릴:물=90:10 그라디언트 A:B=80:20→40:60(아세토니트릴의 그라디언트:18%→54%) 15분 유속 1.0 mL/min)로 정제하였다(도 9 하단). 그 후 동결건조를 행하여, Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Val-Asp-Cys-Ser-Glu-Tyr-Pro-Lys-Pro-Ala-Cys-Thr-Met-Glu-Tyr-Arg-Pro-Leu-Cys-Gly-Ser-Asp-Asn(Oligosaccharide)-Lys-Thr-Tyr-Gly-Asn-Lys-Cys-Asn-Phe-Cys-Asn-Ala-Val-Val-Glu-Ser-Asn-Gly-Thr-Leu-Thr-Leu-Ser-His-Phe-Gly-Lys-Cys의 56잔기 당쇄 부가 펩티드(서열번호 10)를 얻었다.

또한, 이하의 조건에서도 동일하게, 56잔기 당쇄 부가 펩티드(서열번호 10)를 얻을 수 있었다.

서열번호 9에 기재된 33잔기 당쇄 부가 펩티드 1.3 ㎎(0.25 μmol)과 프래그먼트 1(서열번호 2에 기재된 C 말단이 벤질티오에스테르인 23잔기 펩티드) 1.3 ㎎(0.50 μmol)의 두 종류를 각각 에펜도르프 튜브에 넣고, 0.1% 인산 완충용액(pH 7.5, 8 M 구아니딘 염산염 함유) 247.5 μL에 용해시킨 후, 하나의 에펜도르프 튜브에 합쳤다. 반응을 HPLC와 질량분석으로 추적하여, 30시간 후에, 반응용액을 HPLC(Cadenza column CD18(Imtakt Inc.), 3 ㎜, 75×4.6 ㎜, 전개용매 A:0.09% TFA 수용액 B:0.1% TFA 아세토니트릴:물=90:10 그라디언트 A:B=80:20→40:60(아세토니트릴의 그라디언트:18%→54%) 15분 유속 1.0 mL/min)로 정제하였다.

[당단백질의 폴딩]

이와 같이 하여 조제한 56잔기 당쇄 부가 펩티드(서열번호 10) 0.5 ㎎(65.2 nmol)을 에펜도르프 튜브에 덜어, 0.6 M 트리스 완충액(pH=8.7, 0.6 M 구아니딘 염산염, 6 mM EDTA 함유) 100 μL에 용해하였다. 증류수 500 μL를 첨가하여 희석하고, 당쇄를 갖는 오보뮤코이드 제3 도메인을 폴딩시켰다.

[HPLC에 의한 분획]

36시간 후, 반응의 진행을 HPLC와 질량분석으로 확인한 후, HPLC(Cadenza column CD18(Imtakt Inc.), 3 ㎜, 75×4.6 ㎜, 전개용매 A:0.09% TFA 수용액 B:0.1% TFA 아세토니트릴:물=90:10 그라디언트 A:B=80:20→40:60(아세토니트릴의 그라디언트:18%→54%) 15분 유속 1.0 mL/min)로 정제하였다. 고차구조를 가진 Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Val-Asp-Cys-Ser-Glu-Tyr-Pro-Lys-Pro-Ala-Cys-Thr-Met-Glu-Tyr-Arg-Pro-Leu-Cys-Gly-Ser-Asp-Asn(Oligosaccharide)-Lys-Thr-Tyr-Gly-Asn-Lys-Cys-Asn-Phe-Cys-Asn-Ala-Val-Val-Glu-Ser-Asn-Gly-Thr-Leu-Thr-Leu-Ser-His-Phe-Gly-Lys-Cys의 56잔기 당쇄 부가 펩티드(서열번호 10)가 포함되는 4개의 분획 A~D를 얻었다(도 10).

A; Found. 1532.5, 1915.2, 2553.2

B; Found. 1532.5, 1915.2, 2553.2

C; Found. 1532.6, 1915.3, 2553.2

D; Found. 1532.7, 1915.4, 2553.3

도 9 하단에서 도 10으로의 피크의 변화 및 질량의 감소는, 전술한 폴딩공정에 의해, 디설파이드 결합이 형성된 것을 나타낸다.

또한, 반응을 HPLC와 질량분석으로 추적하여, 질량분석으로 분자량 변화와 HPLC로 피크의 리텐션 타임이 변화한 것을 확인함으로써, 반응시간을 적절히 변경(예를 들면, 24시간)할 수 있다.

분획 B의 NMR 측정: 동결건조 후의 분획 B를 5% D₂O/H₂O(300 ㎕)에 녹여 25℃, 60 ms, 600MHz에서 2D TOCSY를 측정하였다. NMR 스펙트럼을 도 11에 나타낸다.

분획 B의 CD 측정: 동결건조 후의 분획 B를 증류수에 녹여 CD 측정을 행하였다. 장치는 JASCO의 J-820을 사용하였다. 측정영역은 180 ㎚~260 ㎚의 범위에서 행하였다. CD 스펙트럼을 도 12에 나타낸다.

도 11로부터, HPLC에 의한 분리만으로, 동일한 고차구조를 갖는 당펩티드가 고도로 정제되는 것이 확인되었다.

2. 당쇄를 갖지 않는 silver pheasant 의 오보뮤코이드 제3 도메인의 화학합성

실시예와 동일하게, 3개의 프래그먼트를 각각 합성한 후, NCL법에 의한 라이게이션을 행하여, 당쇄를 갖지 않는 silver pheasant의 오보뮤코이드 제3 도메인을 합성하였다. 프래그먼트 1 및 프래그먼트 3는, 실시예와 동일하게 합성하였다. 비교예로, 실시예의 프래그먼트 2에 대응하는 프래그먼트(이하 「프래그먼트 2'」라고 한다)는, 도 14에 나타내는 바와 같이 당쇄를 갖지 않는다.

[프래그먼트 2'의 합성]

고상합성용 칼럼에 2-Chlorotrityl resin(143 ㎎, 200 μmol)을 넣고, 염화메틸렌(DCM)으로 충분히 세정하였다. 별도로, Fmoc-Phe(232.4 ㎎, 0.6 mmol)와 DIPEA(272.1 μL, 1.6 mmol)를 DCM(1.2 mL)에 용해시킨 것을, 수지가 들어 있는 고상합성용 칼럼에 넣고, 실온에서 2시간 교반하였다. 교반 후, 수지를 DCM:MeOH:DIPEA=17:2:1, DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. 이어서, Fmoc기를 20분 20% 피페리딘/DMF용액(2 mL)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, Kaiser Test에 의해 반응을 확인하고, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 이용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.

Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산과 HOBt(135.1 ㎎, 1 mmol), DIPCI(153.9 μL, 1 mmol)를 DMF(0.4 mL)에 용해시켜 15분간 활성화시킨 후, 고상합성용 칼럼에 넣고, 실온에서 1시간 교반하였다. 교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 20분 20% 피페리딘/DMF용액(1 mL)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하여, 아미노산을 순차 축합시켰다. 아미노기를 보호한 아미노산에는, Fmoc-Asn, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Asn, Fmoc-Gly, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Asn, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Gly를 사용하고, 마지막 아미노산은 보호기를 산으로 제거할 수 있는 Boc-Cys(Thz)-OH(233.3 ㎎, 1 mmol)를 사용하였다. 고상수지 상에, Boc-Cys(Thz)-Gly-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Asn-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Asn-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asn-Phe의 보호기를 갖는 14잔기 펩티드(서열번호 11)를 얻었다. 이것에 AcOH:DCM:MeOH=5:4:1을 2 mL 첨가하고, 실온에서 3시간 교반하였다. 교반 후, 수지를 여과하여 제거하고, 추가적으로 MeOH으로 수지의 세정을 행하였다. 여액을 감압하에 농축하고, 과잉량의 벤젠으로 3회 공비하여 동결건조를 행하였다(도 15 상단. 단 탈보호하여 측정하였다).

얻어진 펩티드(서열번호 11에 기재된 보호기를 갖는 14잔기 펩티드) 110 ㎎(50 μmol)과 MS4A(10 ㎎), 벤질메르캅탄(177.4 μL, 1.5 mmol)을 DMF용매 중(6.8 mL), 아르곤 기류하 -20℃에서 1시간 교반한 후, PyBOP(130 ㎎, 250 μmol)와 DIPEA(42.5 μL, 250 μmol)를 첨가하고, 2시간 교반하였다. 교반 후, 반응용액에 과잉량의 디에틸에테르를 첨가하여 화합물을 침전시키고, 여과 후에 침전물을 DMF로 용해하였다. 용액을 감압하에 농축한 후, 95% TFA, 2.5% TIPS, 2.5% H₂O용액(5 mL)을 첨가하여 실온에서 2시간 교반하였다(도 15 중단). 반응용액을 감압하에 농축 후, HPLC(Cadenza column CD18(Imtakt Inc.), 3 ㎜, 75×4.6 ㎜, 전개용매 A:0.09% TFA 수용액 B:0.1% TFA 아세토니트릴:물=90:10 그라디언트 A:B=80:20→40:60(아세토니트릴의 그라디언트:9%→27%) 15분 유속 1.0 mL/min)로 정제하여, Cys(Thz)-Gly-Ser-Asp-Asn-Lys-Thr-Tyr-Gly-Asn-Lys-Cys-Asn-Phe-SBn의 C 말단이 벤질티오에스테르인 보호기를 갖는 14잔기 펩티드(서열번호 12)를 269.6 ㎎ 얻었다(도 15 하단).

[프래그먼트 2'와 프래그먼트 3의 NCL법에 의한 라이게이션]

이와 같이 하여 조제한 프래그먼트 2'(서열번호 12에 기재된 C 말단이 벤질티오에스테르인 보호기를 갖는 14잔기 펩티드) 1.6 ㎎(0.96 μmol)과, 실시예에서 합성한 프래그먼트 3 1.9 ㎎(0.96 μmol)의 두 종류를 동일한 에펜도르프 튜브에 넣고, 0.1% 인산 완충용액(pH 7.5, 6 M 구아니딘 염산염 함유) 495 μL에 용해시킨 후, 티오페놀(5 μL)을 첨가하고, 실온에서 반응을 행하였다(도 16의 0 h). 18시간 후, 반응종료를 HPLC로 확인한 후(도 16의 18 h), 반응용액을 HPLC(Cadenza column CD18(Imtakt Inc.), 3 ㎜, 75×4.6 ㎜, 전개용매 A:0.09% TFA 수용액 B:0.1% TFA 아세토니트릴:물=90:10 그라디언트 A:B=80:20→40:60(아세토니트릴의 그라디언트:18%→54%) 15분 유속 1.0 mL/min)로 정제하였다(도 16의 정제 후). 그 후 동결건조를 행하여, Cys(Thz)-Gly-Ser-Asp-Asn-Lys-Thr-Tyr-Gly-Asn-Lys-Cys-Asn-Phe-Cys-Asn-Ala-Val-Val-Glu-Ser-Asn-Gly-Thr-Leu-Thr-Leu-Ser-His-Phe-Gly-Lys-Cys의 보호기를 갖는 33잔기 펩티드(서열번호 13)를 얻었다.

얻어진 보호기를 갖는 33잔기 펩티드(서열번호 13)를, 0.2 M 메톡시아민 수용액(pH=4.0)에 용해시켰다. 4시간 후, 반응의 종료를 HPLC로 확인한 후, HPLC(Cadenza column CD18(Imtakt Inc.), 3 ㎜, 75×4.6 ㎜, 전개용매 A:0.09% TFA 수용액 B:0.1% TFA 아세토니트릴:물=90:10 그라디언트 A:B=80:20→40:60(아세토니트릴의 그라디언트:18%→54%) 15분 유속 1.0 mL/min)로 정제하였다(도 16의 티아졸린 탈보호). 그 후 동결건조를 행하여, Cys-Gly-Ser-Asp-Asn-Lys-Thr-Tyr-Gly-Asn-Lys-Cys-Asn-Phe-Cys-Asn-Ala-Val-Val-Glu-Ser-Asn-Gly-Thr-Leu-Thr-Leu-Ser-His-Phe-Gly-Lys-Cys의 33잔기 펩티드(서열번호 14)를 얻었다.

또한, 이하의 조건에서도 동일하게 서열번호 14에 기재된 33잔기 당쇄 부가 펩티드가 얻어졌다.

프래그먼트 2'(서열번호 12에 기재된 C 말단이 벤질티오에스테르인 보호기를 갖는 14잔기 펩티드) 1.6 ㎎(0.96 μmol)과, 실시예에서 합성한 프래그먼트 3 1.9 ㎎(0.96 μmol)의 두 종류를 각각 에펜도르프 튜브에 넣고, 0.1% 인산 완충용액(pH 7.5, 6 M 구아니딘 염산염 함유) 247.5 μL에 용해시킨 후, 하나의 에펜도르프 튜브에 합쳤다. 1% 티오페놀(5 μL)을 첨가하고, 실온에서 반응을 행하였다. 반응을 HPLC와 질량분석으로 추적하여, 6시간 후에 HPLC로 프래그먼트 3의 소실을 확인하였다. 그 후 0.2 M의 메톡시아민 수용액을 계중이 pH 4 부근이 될 때까지 첨가하여 N 말단의 Cys를 탈보호하였다. 6시간 후 반응의 종료를 질량분석으로 확인하고, 반응용액을 HPLC(Cadenza column CD18(Imtakt Inc.), 3 ㎜, 75×4.6 ㎜, 전개용매 A:0.09% TFA 수용액 B:0.1% TFA 아세토니트릴:물=90:10 그라디언트 A:B=80:20→40:60(아세토니트릴의 그라디언트:18%→54%) 15분 유속 1.0 mL/min)로 정제하였다.

[프래그먼트 1과, 프래그먼트 2' 및 3의 NCL법에 의한 라이게이션]

이와 같이 하여 조제한 33잔기 펩티드(서열번호 14) 0.6 ㎎(0.17 μmol)과 실시예에서 합성한 프래그먼트 1(서열번호 2에 기재된 C 말단이 벤질티오에스테르인 23잔기 펩티드) 1.1 ㎎(0.41 μmol)의 두 종류를 동일한 에펜도르프 튜브에 넣고, 0.1% 인산 완충용액(pH 7.5, 8 M 구아니딘 염산염 함유) 485 μL에 용해시킨 후, 티오페놀(15 μL)을 첨가하고, 실온에서 반응을 행하였다(도 17의 0 h). 45시간 후, 반응종료를 HPLC로 확인한 후(도 17의 45 h), 반응용액을 HPLC(Cadenza column CD18(Imtakt Inc.), 3 ㎜, 75×4.6 ㎜, 전개용매 A:0.09% TFA 수용액 B:0.1% TFA 아세토니트릴:물=90:10 그라디언트 A:B=80:20→40:60(아세토니트릴의 그라디언트:18%→54%) 15분 유속 1.0 mL/min)로 정제하였다. 그 후 동결건조를 행하여, Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Val-Asp-Cys-Ser-Glu-Tyr-Pro-Lys-Pro-Ala-Cys-Thr-Met-Glu-Tyr-Arg-Pro-Leu-Cys-Gly-Ser-Asp-Asn-Lys-Thr-Tyr-Gly-Asn-Lys-Cys-Asn-Phe-Cys-Asn-Ala-Val-Val-Glu-Ser-Asn-Gly-Thr-Leu-Thr-Leu-Ser-His-Phe-Gly-Lys-Cys의 56잔기 펩티드(서열번호 15)를 얻었다(도 17 하단).

또한, 이하의 조건에서도 동일하게 서열번호 15에 기재된 56잔기 당쇄 부가 펩티드가 얻어졌다.

서열번호 14에 기재된 33잔기 펩티드 0.6 ㎎(0.17 μmol)과 프래그먼트 1(서열번호 2에 기재된 C 말단이 벤질티오에스테르인 23잔기 펩티드) 1.1 ㎎(0.41 μmol)의 두 종류를 각각 에펜도르프 튜브에 넣고, 0.1% 인산 완충용액(pH 7.5, 8 M 구아니딘 염산염 함유) 247.5 μL에 용해시킨 후, 하나의 에펜도르프 튜브에 합쳤다. 1% 티오페놀(5 μL)을 첨가하고, 실온에서 반응을 행하였다. 반응을 HPLC와 질량분석으로 추적하여, 30시간 후에, 반응용액을 HPLC(Cadenza column CD18(Imtakt Inc.), 3 ㎜, 75×4.6 ㎜, 전개용매 A:0.09% TFA 수용액 B:0.1% TFA 아세토니트릴:물=90:10 그라디언트 A:B=80:20→40:60(아세토니트릴의 그라디언트:18%→54%) 15분 유속 1.0 mL/min)로 정제하였다. 그 후 동결건조를 행하여, 서열번호 15에 기재된 56잔기 당쇄 부가 펩티드를 얻었다.

[단백질의 폴딩]

이와 같이 하여 조제한 56잔기 펩티드(서열번호 15) 0.4 ㎎(66.2 nmol)을 에펜도르프 튜브에 덜어, 0.6 M 트리스 완충액(pH=8.7, 0.6 M 구아니딘 염산염, 6 mM EDTA 함유) 100 μL에 용해하였다. 증류수 500 μL를 첨가하여 희석하고, 당쇄가 없는 오보뮤코이드 제3 도메인을 폴딩시켰다.

[HPLC에 의한 분획]

36시간 후, 반응의 진행을 HPLC와 질량분석으로 확인한 후, HPLC(Cadenza column CD18(Imtakt Inc.), 3 ㎜, 75×4.6 ㎜, 전개용매 A:0.09% TFA 수용액 B:0.1% TFA 아세토니트릴:물=90:10 그라디언트 A:B=80:20→40:60(아세토니트릴의 그라디언트:18%→54%) 15분 유속 1.0 mL/min)로 정제하여, 고차구조를 가진 Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Val-Asp-Cys-Ser-Glu-Tyr-Pro-Lys-Pro-Ala-Cys-Thr-Met-Glu-Tyr-Arg-Pro-Leu-Cys-Gly-Ser-Asp-Asn-Lys-Thr-Tyr-Gly-Asn-Lys-Cys-Asn-Phe-Cys-Asn-Ala-Val-Val-Glu-Ser-Asn-Gly-Thr-Leu-Thr-Leu-Ser-His-Phe-Gly-Lys-Cys의 56잔기 펩티드(서열번호 15)가 포함되는 4개의 분획 E~H를 얻었다(도 18).

E; Found. 1207.7, 1509.3, 2012.0

F; Found. 1207.6, 1509.3, 2012.0

G; Found. 1207.7, 1509.3, 2012.0

H; Found. 1207.8, 1509.3, 2012.0

도 17 하단부터 도 18으로의 피크의 변화 및 질량의 감소는, 전술한 폴딩공정에 의해, 디설파이드 결합이 형성된 것을 나타낸다.

또한, 반응을 HPLC와 질량분석으로 추적하여, 질량분석으로 분자량 변화와 HPLC로 피크의 리텐션 타임이 변화된 것을 확인함으로써, 반응시간을 적절히 변경(예를 들면, 24시간)할 수 있다.

분획 F의 NMR 측정: 동결건조 후의 분획 F를 5% D₂0/H₂0(300 ㎕)에 녹여 25℃, 80 ms, 600 MHz에서 2D TOCSY를 측정하였다. NMR 스펙트럼을 도 19에 나타낸다.

분획 F의 CD 측정: 동결건조 후의 분획 F를 증류수에 녹여 CD 측정을 행하였다. 장치는 JASCO의 J-820을 사용하였다. 측정영역은 180 ㎚~260 ㎚의 범위에서 행하였다. CD 스펙트럼을 도 20에 나타낸다.

도 19로부터, HPLC에 의한 분리만으로, 동일한 고차구조를 갖는 당펩티드가 고도로 정제되는 것이 확인되었다.

[분획 F의 검량선의 작성]

분획 F(1 ㎎)를 BSA(0.1 ㎎/㎖)를 포함하는 pH 8.0의 0.1 M 인산 버퍼(1 ㎖)에 녹이고, 이 용액을 희석하여 165 μM, 82.5 μM, 41.3 μM, 20.6 μM의 농도의 분획 F를 조제하였다. 각 농도의 용액의 OD280을 각각 3회씩 측정하여, 평균값화 한 것을 표 1 및 도 22에 나타내었다.

<실시예 2> 생리활성의 측정

[당쇄 부가 OMSVP3(분획 A~D)의 생리활성의 측정]

0.1 M 인산 완충액(pH=8.0, 0.01% α-키모트립신, 0.01% 소혈청 알부민 함유)의 효소용액, 및 0.1 M 인산 완충액(pH=8.0, 517 μM의 참고예 1(후술)에서 합성한 보호기를 갖는 14잔기 펩티드(서열번호 16), 0.01% 소혈청 알부민 함유)의 기질용액을 조제하여, 각각 20 μL를 에펜도르프 튜브에 첨가하였다. 이 용액에, 실시예 1에서 얻어진 분획 A~D 각각을 동결건조한 후, 0.1 M 인산 완충액(pH=8.0, 0.01% 소혈청 알부민 함유)에 용해시켜, 각 용액의 OD280을 측정하고, 용액 중에 포함되는 단백질 농도를 일정하게 한 샘플액 20 μL를 첨가하여, 저해활성을 측정하였다. 이때의, 최종적인 반응농도는, 샘플농도 2.5 μM, 효소농도 0.33 ㎍/mL, 기질농도 175 μM이다. 이 반응액을, 37℃에서 10분간 인큐베이트한 후, 4 N 염산을 5 μL 첨가하여 반응을 정지하였다. 동일한 조작을 3회 반복하여, 각각 분해율의 평균값 및 표준편차를 산출하였다. 결과를 도 13에 나타낸다.

[당쇄가 없는 OMSVP3(분획 E~H)의 생리활성의 측정]

0.1 M 인산 완충액(pH=8.0, 0.01% α-키모트립신, 0.01% 소혈청 알부민 함유)의 효소용액, 및 0.1 M 인산 완충액(pH=8.0, 517 μM의 참고예 1(후술)에서 합성한 보호기를 갖는 14잔기 펩티드(서열번호 16), 0.01% 소혈청 알부민 함유)의 기질용액을 조제하여, 각각 20 μL를 에펜도르프 튜브에 첨가하였다. 이 용액에, 실시예 1에서 얻어진 분획 E~H 각각을 동결건조한 후, 0.1 M 인산 완충액(pH=8.0, 0.01% 소혈청 알부민 함유)에 용해시켜, 각 용액의 OD280을 측정하고, 용액 중에 포함되는 단백질 농도를 일정하게 한 샘플액 20 μL를 첨가하여, 저해활성을 측정하였다. 이때의, 최종적인 반응농도는, 샘플농도 2.5 μM, 효소농도 0.33 ㎍/mL, 기질농도 172 μM이다. 이 반응액을, 37℃에서 10분간 인큐베이트한 후, 4 N 염산을 5 μL 첨가하여 반응을 정지하였다. 동일한 조작을 3회 반복하여, 각각 분해율의 평균값 및 표준편차를 산출하였다. 결과를 도 21에 나타낸다.

<실시예 3> 생리활성의 측정(IC₅₀의 도출)

[당쇄 부가 OMSVP3(분획 A~D)의 IC₅₀의 도출]

참고예 1(후술)에서 합성한 보호기를 갖는 14잔기 펩티드(서열번호 16)(1.5 ㎎)를, 0.1 M 인산 완충액(pH 8.0, 0.1 ㎎/mL BSA 함유) 1 mL에 용해시켜, 1 mM의 용액을 조제하였다. 흡광도계를 사용하여 0.34 mM가 되도록 희석하였다(용액 1). 키모트립신(1 ㎎)을 0.1 M 인산 완충액(pH 8.0, 0.1 ㎎/mL BSA 함유) 1 mL에 용해시켜, 이 용액을 10배 희석하고, 추가적으로 그 용액을 10배 희석하는 것을 반복하여 0.2 ㎍/mL가 되도록 조제하였다(용액 2). 분획 B를, 0.1 M 인산 완충액(pH 8.0, 0.1 ㎎/mL BSA 함유) 100 μL에 용해시켜, 흡광도계를 사용하여 65 nM가 되도록 희석하였다. 이것을 희석하여 58.5 nM, 52 nM, 45.5 nM, 39 nM, 32.5 nM, 26 nM, 19.5 nM, 13 nM, 6.5 nM의 용액을 만들었다(용액 3). 빙상에서 충분히 식힌 용액 1을 80 μL, 용액 2, 3을 40 ㎕씩 동일한 에펜도르프 튜브로 옮기고, 37℃에서 1시간 인큐베이트하였다. 1시간 후, 1N의 염산을 16 μL 첨가함으로써 반응을 정지시켰다. 반응액 20 μL를, 버퍼 80 μL와 혼합시켜 합계 100 μL로 하여, HPLC에 의한 측정에 사용하였다. 반응생성물의 HPLC 상의 피크 면적으로부터 단위시간당 분해율(단위시간당 반응속도)을 계산하였다. 도 23은 각 저해제 농도에 대한 저해율을 플롯한 그래프를 나타낸다. 동일하게 분획 A, C 및 D에 대해서도 저해제의 농도가 효소의 활성을 50% 저해하는 농도를 사이에 두도록 플롯하였다. 그 결과의 그래프를 나타낸다(도 23). 이 그래프를 토대로 산출한 당쇄 부가 OMSVP3(분획 A~D)의 IC₅₀값을 그래프에 나타낸다(도 24).

[당쇄가 없는 OMSVP3(분획 E~H)의 IC₅₀의 도출]

참고예 1(후술)에서 합성한 보호기를 갖는 14잔기 펩티드(서열번호 16)(1.5 ㎎)를, 0.1 M 인산 완충액(pH 8.0, 0.1 ㎎/mL BSA 함유) 1 mL에 용해시켜, 1 mM의 용액을 조제하였다. 흡광도계를 사용하여 0.34 mM가 되도록 희석하였다(용액 1). 키모트립신(1 ㎎)을 0.1 M 인산 완충액(pH 8.0, 0.1 ㎎/mL BSA 함유) 1 mL에 용해시켜, 이 용액을 10배 희석하고, 추가적으로 그 용액을 10배 희석하는 것을 반복하여 0.2 ㎍/mL가 되도록 조제하였다(용액 2). 분획 F를, 0.1 M 인산 완충액(pH 8.0, 0.1 ㎎/mL BSA 함유) 100 μL에 용해시켜, 흡광도계를 사용하여 65 nM가 되도록 희석하였다. 이것을 희석하여 58.5 nM, 52 nM, 45.5 nM, 39 nM, 32.5 nM, 26 nM, 19.5 nM, 13 nM, 6.5 nM의 용액을 만들었다(용액 3). 빙상에서 충분히 식힌 용액 1을 80 μL, 용액 2, 3을 40 μL씩 동일한 에펜도르프 튜브로 옮기고, 37℃에서 1시간 인큐베이트하였다. 1시간 후, 1N의 염산을 16 μL 첨가함으로써 반응을 정지시켰다. 반응액 20 μL를, 버퍼 80 μL와 혼합시켜 합계 100 μL로 하여, HPLC에 의한 측정에 사용하였다. 반응생성물의 HPLC 상의 피크 면적으로부터 단위시간당 분해율(단위시간당 반응속도)을 계산하였다. 도 25는 각 저해제 농도에 대한 저해율을 플롯한 그래프를 나타낸다. 동일하게 분획 E, G 및 H에 대해서도 저해제의 농도가 효소의 활성을 50% 저해하는 농도를 사이에 두도록 플롯하였다. 그 결과의 그래프를 나타낸다(도 25). 이 그래프를 토대로 산출한 당쇄가 없는 OMSVP3(분획 E~F)의 IC₅₀값을 그래프에 나타낸다(도 26).

<실시예 4> 열안정성의 측정

CD 측정용 셀을 증류수로 채우고, 실온 그대로 측정하였다. 이 측정값을 블랭크로 하고 이후의 측정값은 전부 이 블랭크의 수치를 빼서 계산하였다.

[당쇄 부가 OMSVP3(분획 B)의 열안정성]

분획 B를 증류수 300 μL에 용해하여 실온에서 측정하였다. 측정종료 후, 시료를 셀에 채운 채로 셀째로 항온조에 침지하여 온도가변실험을 행하였다. 처음에 50℃의 항온조에 10분간 침지해둔 셀을 10분간 실온에 정치하고 측정을 행하였다. 이후 90℃까지 동일한 조작을 하여 CD 스펙트럼을 측정하였다. 결과를 도 27에 나타낸다.

[당쇄가 없는 OMSVP3(분획 F)의 열안정성]

분획 F를 증류수 300 ㎕에 용해하여 실온에서 측정하였다. 측정종료 후, 시료를 셀에 채운 채로 셀째로 항온조에 침지하여 온도가변실험을 행하였다. 처음에 50℃의 항온조에 10분간 침지해둔 셀을 10분간 실온에 정치하여 측정을 행하였다. 이후 90℃까지 동일한 조작을 하여 CD 스펙트럼을 측정하였다. 결과를 도 28에 나타낸다.

<실시예 5> 오보뮤코이드 제3 도메인의 디설파이드 맵핑

합성한 OMSVP3는 3개의 디설파이드 결합을 가지고 있다. 디설파이드 결합은 단백질의 폴딩시에 형성되고, 그 형성과정은 평형반응이다. 그 때문에 천연형 단백질과는 상이한 위치에서의 디설파이드 결합 형성도 생길 것으로 생각된다.

이번에 합성한 OMSVP3(분획 B)는 NMR 및 저해활성평가의 결과로부터 단일화합물이며, 천연형 단백질과 같은 위치에서 디설파이드 결합을 형성하고 있다고 예상되었다. 이에 분획 B가 확실하게 천연과 같은 위치에서 디설파이드 결합을 형성하고 있는지 확인하기 위해서 이하의 검토를 행하였다.

[아미노산 서열 및 당쇄가 균일한 OMSVP3(분획 B)의 디설파이드 맵핑]

실시예 1에서 얻어진 분획 B(0.4 ㎎)에 대해 브롬화시안(1 ㎎/mL)을, 40% 아세토니트릴, 2% TFA 수용액 중, 37℃, 차광 조건하에서 하룻밤 반응시켰다. 이것을 동결건조시켜 HPLC(VyDAC column C4(Imtakt Inc.), 3 ㎛, 4.5×250 ㎜ 전개용매 A:0.09% TFA 수용액 B:0.1% TFA 아세토니트릴:물=90:10 그라디언트 A:B=80:20→40:60(아세토니트릴의 그라디언트:18%→54%) 30분 유속 1.0 ㎖/min)로 정제하여 분획 I을 얻었다.

다음으로, 서몰리신(Thermolysin)(50 ㎍/mL)을 용해시킨 50 mM 트리스 완충액(pH 7.6, 10 mM CaCl₂ 함유)에, 분획 I(0.1 ㎎)을 용해시켜, 37℃에서 인큐베이트하였다. 3시간 후에 HPCL(VyDAC column C4(Imtakt Inc.), 3 ㎛, 4.5×250 ㎜ 전개용매 A:0.09% TFA 수용액 B:0.1% TFA 아세토니트릴:물=90:10 그라디언트 A:B=95:5→50:50(아세토니트릴 그라디언트:4.5%→45%) 15분 유속 1.0 ㎖/min)로 정제한 분획 II에서 VI를 얻었다(도 29, 30).

[당쇄를 갖지 않는 OMSVP3(분획 F)의 디설파이드 맵핑]

실시예 1에서 얻어진 분획 F(0.4 ㎎)에 대해 브롬화시안(1 ㎎/mL)을, 40% 아세토니트릴, 2% TFA 수용액 중, 37℃, 차광 조건하에서 하룻밤 반응시켰다. 이것을 동결건조시켜 HPLC(VyDAC column C4(Imtakt Inc.), 3 ㎛, 4.5×250 ㎜ 전개용매 A:0.09% TFA 수용액 B:0.1% TFA 아세토니트릴:물=90:10 그라디언트 A:B=80:20→40:60(아세토니트릴의 그라디언트:18%→54%) 30분 유속 1.0 ㎖/min)로 정제하여 분획 VII을 얻었다.

다음으로, 서몰리신(Thermolysin)(50 ㎍/mL)을 용해시킨 50 mM 트리스 완충액(pH 7.6, 10 mM, CaCl₂ 함유)에, 분획 VII(0.1 ㎎)을 용해시켜, 37℃에서 인큐베이트하였다. 4시간 후에 HPLC(VyDAC column C4(Imtakt Inc.), 3 ㎛, 4.5×250 ㎜ 전개용매 A:0.09% TFA 수용액 B:0.1% TFA 아세토니트릴:물=90:10 그라디언트 A:B=95:5→50:50(아세토니트릴 그라디언트:4.5%→45%) 15분 유속 1.0 ㎖/min)로 정제하여 분획 VIII에서 XI을 얻었다(도 31, 32).

CNBr 처리를 이용하여 당쇄를 갖는 OMSVP3(분획 B) 서열 중의 메티오닌 부위에서 특이적으로 펩티드 사슬을 절단하고(분획 I), 계속해서 서몰리신(Thermolysin) 소화를 행한 결과, 디설파이드 결합으로 연결된 펩티드 단편이 얻어졌다(도 29). 각각의 펩티드 프래그먼트를 정제 후, ESI-mass에 의해 그 질량을 측정하였다. 그리고, 얻어진 질량이, OMSVP3의 어느 프래그먼트에 상당하는지를 해석하였다. 그 결과 얻어진 추정구조를 도 33의 아래 도면에 나타내었다. 동일한 방법을 이용하여 당쇄를 갖지 않는 OMSVP3(분획 F)에 대해서도, 동일한 방법을 이용하여 해석하고(도 31, 34 참조), 그 결과 얻어진 추정구조를 도 34의 아래 도면에 나타내었다. 천연의 OMSVP3와 같은 위치에 디설파이드 결합이 형성되어 있는 것을 확인하였다(도 31, 34). 이들의 디설파이드 맵핑으로부터 추정된 분획 B 및 분획 F에 있어서의 디설파이드 결합 위치는, 이미 해석되어 있는 천연의 OMSVP3의 디설파이드 결합 위치와 일치하는 것이었다.

이들 사실로부터, 본 발명의 폴딩공정, 분획공정 및 회수공정에 의해, 아미노산 서열, 당쇄구조 및 고차구조가 균일한 당단백질을 제조할 수 있는 것이 나타내어졌다. 또한, OMSVP3의 경우에 있어서, 본 발명의 분획공정에 있어서 최대 피크로서 얻어진 분획은, 천연과 같은 디설파이드 결합을 가지며, 또한, 고활성의 분획으로, 목적하는 구조 및 목적하는 활성을 갖는 당단백질을 효율적으로 제조할 수 있었다. 또한, 이것은, 다른 당단백질을 제조하는 경우에 있어서, 최대 피크의 분획이 목적하는 활성 내지 목적하는 구조가 아닌 것이었다고 해도, 목적하는 활성을 갖는 기타 분획을 적절히 회수함으로써, 역시, 소정의 활성을 갖는, 아미노산 서열, 당쇄구조 및 고차구조가 균일한 당단백질을 제조할 수 있는 것이며, 본 발명이 실시 가능한 것에 아무런 방해가 되지 않는다.

본 발명의 실시예에 있어서, 당단백질을 갖는 오보뮤코이드 제3 도메인을 폴딩시켜, HPLC로 분획한 패턴(도 10)과, 당쇄를 갖지 않는 제3 도메인을 폴딩시켜, HPLC로 분획한 패턴(도 18)은, 4개의 피크를 갖는 비교적 유사한 것이었다. 또한, 활성의 강도도 각각, 실시예 2에 있어서는, 분획 A>분획 B>분획 D>분획 C, 분획 F>분획 E>분획 H>분획 G(도 13과 도 21), 실시예 3에 있어서는, 분획 A>분획 B>분획 C>분획 D, 분획 E>분획 F>분획 G>분획 H(도 23~26)와 유사했던 것으로부터, 동일한 고차구조를 갖는 것이, 같은 순서로 용출된 것처럼 보였다. 그 중에서도 최대 피크로서 얻어지는, 고활성을 갖는 분획 B와 분획 F에 대해, 디설파이드 결합 위치가 동일했던 것도, 이것과 정합하는 결과였다.

그러나, 분획 B와 분획 F의 CD 스펙트럼은 일치하지 않아, 양자의 고차구조가 상이한 것이 나타내어졌다(도 12와 도 20). 이것은, 당쇄 부가가, 당쇄를 갖지 않는 단백질의 폴딩에 대해 변형을 부여하는 것 등에 의해, 단백질의 고차구조에 변화를 야기할 수 있는 것을 나타낸다.

단백질의 이와 같은 고차구조의 변화는, 기질과의 결합의 용이성 등에도 영향을 미치는 점에서, 생리활성에 영향을 미칠 수 있는 것이 예상되고, 또한, 사구여과체의 통과의 용이함에도 영향을 미친다는 점에서, 혈중 반감기에도 영향을 미칠 수 있다는 것이 예상된다. 이 사실로부터, 당단백질을 의약품으로서 사용할 때에는, 단백질에 당쇄를 부가한 상태로 고차구조가 일정한 것만을 정제 분리함으로써, 생리활성 및 혈중 반감기를 일정하게 하는 의약을 제조하는 것이 중요한 바, 본 발명의 방법은 이것을 가능하게 하는 것이다.

<참고예 1 저해활성 시험용 기질의 합성>

[기본 펩티드의 합성]

고상합성용 칼럼에 2-Cholorotrityl resin(143 ㎎, 200 μmol)을 넣고, 염화메틸렌(DCM)으로 충분히 세정하였다. 별도로, Fmoc-Phe(232.4 ㎎, 0.6 mmol)와 DIPEA(272.1 μL, 1.6 mmol)를 DCM(1.2 mL)에 용해시킨 것을, 수지가 들어 있는 고상합성용 칼럼에 넣고, 실온에서 2시간 교반하였다. 교반 후, 수지를 DCM:MeOH:DIPEA=17:2:1, DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. 이어서, Fmoc기를 20분 20% 피페리딘/DMF용액(2 mL)을 사용해서 탈보호하였다. DMF로 세정 후, Kaiser Test에 의해 반응을 확인하고, 그 후의 펩티드 사슬의 신장은 이하에 나타내는 방법을 이용하여, 순차 아미노산을 축합시켰다.

Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산과 HOBt(135.1 ㎎, 1 mmol), DIPCI(153.9 μL, 1 mmol)를 DMF(0.4 mL)에 용해시켜 15분간 활성화시킨 후, 고상합성용 칼럼에 넣고, 실온에서 1시간 교반하였다. 교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용해서 세정하였다. Fmoc기를 20분 20% 피페리딘/DMF용액(1 mL)을 사용해서 탈보호하였다. 이 조작을 반복하여, 아미노산을 순차 축합시켰다. 아미노기를 보호한 아미노산에는, Fmoc-Asn, Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Asn, Fmoc-Gly, Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Asn, Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Gly를 사용하고, 마지막 아미노산은 Boc-Cys(Thz)-OH(233.3 ㎎, 1 mmol)를 사용하였다. 고상수지 상에, Boc-Cys(Thz)-Gly-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Asn-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Asn-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asn-Phe의 보호기를 갖는 14잔기 펩티드(서열번호 11)를 얻었다. 이것에 95% TFA, 2.5% TIPS, 2.5% H₂O용액(3 mL)을 첨가하여 실온에서 2시간 교반한 후, 수지를 여과하여 제거하고, 여액을 감압하에 농축하였다. 이것을 HPLC(VyDAC column C4(Imtakt Inc.), 3 ㎛, 4.5×250 ㎜ 전개용매 A:0.09% TFA 수용액 B:0.1% TFA 아세토니트릴:물=90:10 그라디언트 A:B=95:5→50:50(아세토니트릴 그라디언트:4.5%→45%) 15분 유속 1.0 ㎖/min)로 정제한 후, 동결건조를 행하여, Cys(Thz)-Gly-Ser-Asp-Asn-Lys-Thr-Tyr-Gly-Asn-Lys-Cys-Asn-Phe의 보호기를 갖는 14잔기 펩티드(서열번호 16)를 얻었다.

[기질 펩티드의 검량선의 작성]

합성한 14잔기 펩티드(서열번호 16) 1.5 ㎎을, 0.1 M 인산 완충액(pH 8.0, BSA(0.1 ㎎/mL) 함유) 1 mL에 용해하고, 이 용액을 희석하여 0.6 mM, 0.4 mM, 0.2 mM, 0.1 mM의 기질농도의 용액을 조제하였다. 각 농도의 용액의 OD280을 각각 3회씩 측정하여, 평균값화 한 것을 표 2 및 도 35에 나타내었다.

[기질 펩티드의 미하엘리스-멘텐 플롯(Michaelis-Menten plot)의 도출]

합성한 14잔기 펩티드(서열번호 16) 3.1 ㎎을, 0.1 M 인산 완충액(pH 8.0, BSA(0.1 ㎎/mL) 함유) 1 mL에 용해하여, 2 mM의 용액을 조제하였다. 이것을 희석하여 1.6 mM, 1.2 mM, 0.8 mM, 0.4 mM, 0.2 mM, 0.1 mM, 0.05 mM의 농도의 기질용액을 조제하였다. 또한 키모트립신(1 ㎎)을 0.1 M 인산 완충액(pH 8.0, BSA(0.1 ㎎/mL) 함유) 1 mL에 용해하여, 이 용액을 10배 희석하고, 추가적으로 그 용액을 10배 희석하는 것을 반복하여 0.1 ㎍/mL가 되도록 조제하였다. 빙상에서 충분히 식힌 각 농도의 기질용액을 50 μL, 효소용액을 50 μL씩 동일한 에펜도르프 튜브로 옮기고, 37℃에서 30분 인큐베이트하였다. 30분 후, 1N의 염산을 10 μL 첨가함으로써 반응을 정지시켰다. 반응액 20 μL를, 완충액 80 μL와 혼합시켜 합계 100 μL로 하여, HPLC에 의한 측정에 사용하였다. 반응생성물의 HPLC 상의 피크 면적으로부터 단위시간당 분해율(단위시간당 반응속도)을 계산하였다(도 36). 표 3에 각 기질농도에 대한 반응속도를 나타낸다.

[기질 펩티드의 라인웨버-버크 플롯(Lineweaver-Burk plot)의 도출]

합성한 14잔기 펩티드(서열번호 16) 1.5 ㎎을 0.1 M 인산 완충액(pH 8.0, BSA(0.1 ㎎/mL) 함유) 1 mL에 용해하여, 1 mM의 용액을 조제하였다. 이것을 희석하여 1 mM, 500 μM, 333 μM, 250 μM, 200 μM의 농도의 기질용액을 조제하였다. 또한 키모트립신(1 ㎎)을 0.1 M 인산 완충액(pH 8.0, BSA(0.1 ㎎/mL) 함유) 1 mL에 용해하여, 이 용액을 10배 희석하고, 추가적으로 그 용액을 10배 희석하는 것을 반복하여 0.1 ㎍/mL가 되도록 조제하였다. 빙상에서 충분히 식힌 각 농도의 기질용액을 50 μL, 효소용액을 50 ㎕씩 동일한 에펜도르프 튜브로 옮기고 37℃에서 30분 인큐베이트하였다. 30분 후, 1N의 염산을 10 μL 첨가함으로써 정지시켰다. 반응액 20 μL를, 버퍼 80 μL와 혼합시켜 합계 100 μL로 하여, HPLC에 의한 측정에 사용하였다. 반응생성물의 HPLC 상의 피크 면적으로부터 단위시간당 분해율(단위시간당 반응속도)을 계산하였다(도 37). 표 4에 각 기질농도의 역수에 대한 반응속도의 역수를 나타낸다.

본 발명의 제조방법에 의해, 아미노산 서열, 당쇄구조에 더하여, 고차구조도 균일한 당단백질을 얻는 것이 가능해졌다. 본 발명의 제조방법에 의해 얻어지는 당단백질은, 고차구조가 균일한 것으로부터, 혈중 반감기나 세포 내에서의 수송에 편차가 없을 뿐 아니라, 소정의 생리활성을 균일하게 갖는다. 또한, 본 발명에 의하면, 당단백질의 혼합물이 목적하는 활성을 갖도록 제어하는 것이 가능해진다. 따라서, 본 발명의 제조방법은, 특히 당단백질을 이용한 의약품의 개발에 이용 가능하다.

서열표 프리텍스트

서열번호 1은, 프래그먼트 1의, 보호기를 갖는 아미노산 서열이다.

서열번호 2는, 프래그먼트 1의, 벤질티오에스테르기를 갖는 아미노산 서열이다.

서열번호 3은, 프래그먼트 2의, 보호기를 갖는 아미노산 서열이다.

서열번호 4는, 프래그먼트 2의, 당쇄가 부가된, 보호기를 갖는 아미노산 서열이다.

서열번호 5는, 프래그먼트 2의, 당쇄가 부가된, 벤질티오에스테르기 및 보호기를 갖는 아미노산 서열이다.

서열번호 6은, 프래그먼트 3의, 보호기를 갖는 아미노산 서열이다.

서열번호 7은, 프래그먼트 3의 아미노산 서열이다.

서열번호 8은, 당쇄가 부가된, 보호기를 갖는 아미노산 서열이다.

서열번호 9는, 당쇄가 부가된, 아미노산 서열이다.

서열번호 10은, 당쇄 부가 OMSVP3의, 당쇄가 부가된, 아미노산 서열이다.

서열번호 11은, 프래그먼트 2'의, 보호기를 갖는 아미노산 서열이다.

서열번호 12는, 프래그먼트 2'의, 벤질티오에스테르기 및 보호기를 갖는 아미노산 서열이다.

서열번호 13은, 보호기를 갖는 아미노산 서열이다.

서열번호 14는, 아미노산 서열이다.

서열번호 15는, 당쇄 부가되지 않은 OMSVP3의, 아미노산 서열이다.

서열번호 16은, 키모트립신의 기질인, 보호기를 갖는 아미노산 서열이다.

SEQUENCE LISTING <110> Otsuka Chemical Co., Ltd. <120> Method of manufacturing glycoprotein and screening method of glycoprotein <130> OCKP0803P1F <150> JP 2008-211144 <151> 2008-08-19 <150> JP 2009-029206 <151> 2009-06-08 <160> 16 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 23 <212> PRT <213> silver pheasant <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (fragment 1) <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Leu having blocking group Boc <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Arg having blocking group Pbf <400> 1 Leu Ala Ala Val Ser Val Asp Cys Ser Glu Tyr Pro Lys Pro Ala Cys 1 5 10 15 Thr Met Glu Tyr Arg Pro Leu 20 <210> 2 <211> 23 <212> PRT <213> silver pheasant <220> <223> amino acid sequence having benzyl thioester group (fragment 1) <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Leu having benzyl thioester group <400> 2 Leu Ala Ala Val Ser Val Asp Cys Ser Glu Tyr Pro Lys Pro Ala Cys 1 5 10 15 Thr Met Glu Tyr Arg Pro Leu 20 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> silver pheasant <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (fragment 2) <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Lys having blocking groups Fmoc and Boc <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Cys having blocking group Trt <400> 3 Lys Thr Tyr Gly Asn Lys Cys Asn Phe 1 5 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> silver pheasant <220> <223> glycosylated amino acid sequence having blocking groups (fragment 2) <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Cys having blocking groups Boc and Thz <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Glycosylated Asn <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Cys having blocking group Trt <400> 4 Cys Gly Ser Asp Asn Lys Thr Tyr Gly Asn Lys Cys Asn Phe 1 5 10 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> silver pheasant <220> <223> glycosylated amino acid sequence having benzyl thioester group and blocking group (fragment 2) <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Cys having blocking group Thz <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Glycosylated Asn <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Phe having benzyl thioester group <400> 5 Cys Gly Ser Asp Asn Lys Thr Tyr Gly Asn Lys Cys Asn Phe 1 5 10 <210> 6 <211> 19 <212> PRT <213> silver pheasant <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (fragment 3) <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Cys having blocking group Trt <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Glu having blocking group OtBu <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> His having blocking group Trt <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Cys having blocking group Trt <400> 6 Cys Asn Ala Val Val Glu Ser Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser His Phe 1 5 10 15 Gly Lys Cys <210> 7 <211> 19 <212> PRT <213> silver pheasant <220> <223> amino acid sequence (fragment 3) <400> 7 Cys Asn Ala Val Val Glu Ser Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser His Phe 1 5 10 15 Gly Lys Cys <210> 8 <211> 33 <212> PRT <213> silver pheasant <220> <223> glycosylated amino acid sequence having blocking group <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Cys having blocking group Thz <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Glycosylated Asn <400> 8 Cys Gly Ser Asp Asn Lys Thr Tyr Gly Asn Lys Cys Asn Phe Cys Asn 1 5 10 15 Ala Val Val Glu Ser Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser His Phe Gly Lys 20 25 30 Cys <210> 9 <211> 33 <212> PRT <213> silver pheasant <220> <223> glycosylated amino acid sequence <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Glycosylated Asn <400> 9 Cys Gly Ser Asp Asn Lys Thr Tyr Gly Asn Lys Cys Asn Phe Cys Asn 1 5 10 15 Ala Val Val Glu Ser Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser His Phe Gly Lys 20 25 30 Cys <210> 10 <211> 56 <212> PRT <213> silver pheasant <220> <223> glycosylated amino acid sequence (glycosylated OMSVP3) <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> Glycosylated Asn <400> 10 Leu Ala Ala Val Ser Val Asp Cys Ser Glu Tyr Pro Lys Pro Ala Cys 1 5 10 15 Thr Met Glu Tyr Arg Pro Leu Cys Gly Ser Asp Asn Lys Thr Tyr Gly 20 25 30 Asn Lys Cys Asn Phe Cys Asn Ala Val Val Glu Ser Asn Gly Thr Leu @@@@35 40 45 Thr Leu Ser His Phe Gly Lys Cys 50 55 <210> 11 <211> 14 <212> PRT <213> silver pheasant <220> <223> amino acid sequence having blocking groups (fragment 2f) <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Cys having blocking groups Boc and Thz <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Ser having blocking group tBu <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Asp having blocking group OtBu <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Thr having blocking group tBu <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Tyr having blocking group tBu <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Lys having blocking group Boc <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Cys having blocking group Trt <400> 11 Cys Gly Ser Asp Asn Lys Thr Tyr Gly Asn Lys Cys Asn Phe 1 5 10 <210> 12 <211> 14 <212> PRT <213> silver pheasant <220> <223> amino acid sequence having benzyl thioester group and blocking group (fragment 2f) <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Cys having blocking group Thz <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Phe having benzyl thioester group <400> 12 Cys Gly Ser Asp Asn Lys Thr Tyr Gly Asn Lys Cys Asn Phe 1 5 10 <210> 13 <211> 33 <212> PRT <213> silver pheasant <220> <223> amino acid sequence having blocking group <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Cys having blocking group Thz <400> 13 Cys Gly Ser Asp Asn Lys Thr Tyr Gly Asn Lys Cys Asn Phe Cys Asn 1 5 10 15 Ala Val Val Glu Ser Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser His Phe Gly Lys 20 25 30 Cys <210> 14 <211> 33 <212> PRT <213> silver pheasant <220> <223> amino acid sequence <400> 14 Cys Gly Ser Asp Asn Lys Thr Tyr Gly Asn Lys Cys Asn Phe Cys Asn 1 5 10 15 Ala Val Val Glu Ser Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser His Phe Gly Lys 20 25 30 Cys <210> 15 <211> 56 <212> PRT <213> silver pheasant <220> <223> amino acid sequence (non-glycosylated OMSVP3) <400> 15 Leu Ala Ala Val Ser Val Asp Cys Ser Glu Tyr Pro Lys Pro Ala Cys 1 5 10 15 Thr Met Glu Tyr Arg Pro Leu Cys Gly Ser Asp Asn Lys Thr Tyr Gly 20 25 30 Asn Lys Cys Asn Phe Cys Asn Ala Val Val Glu Ser Asn Gly Thr Leu @@@@35 40 45 Thr Leu Ser His Phe Gly Lys Cys 50 55 <210> 16 <211> 14 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> amino acid sequence having blocking group (substrate for chymotrypsin) <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Cys having blocking group Thz <400> 16 Cys Gly Ser Asp Asn Lys Thr Tyr Gly Asn Lys Cys Asn Phe 1 5 10

Claims

아미노산 서열, 당쇄구조 및 고차구조가 균일한 당단백질을 제조하는 방법으로서, 이하의 공정 (a)~(c):
(a) 아미노산 서열 및 당쇄가 균일한 당단백질을 폴딩시키는 공정;
(b) 상기 폴딩시킨 당단백질을 칼럼 크로마토그래피에 의해, 분획하는 공정; 및
(c) 소정의 활성을 갖는 분획을 회수하는 공정
을 포함하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 공정 (c) 다음에,
(d) 상기 공정 (c)에서 회수되지 않은 분획에 포함되는 당단백질을 언폴딩시키는 공정;
(e) 상기 언폴딩시킨 당단백질을 재차 폴딩시키는 공정;
(f) 상기 재차 폴딩시킨 당단백질을 칼럼 크로마토그래피에 의해 분획하고, 상기 소정의 활성을 갖는 분획을 회수하는 공정; 및
(g) 필요에 따라 (d)에서 (f)를 반복하는 공정
을 추가적으로 포함하는 방법.
소정의 생리활성을 갖는 당단백질을 스크리닝하는 방법으로서, 이하의 공정 (i)~(iii):
(i) 아미노산 서열 및 당쇄가 균일한 당단백질을 폴딩시키는 공정;
(ii) 상기 폴딩시킨 당단백질을 칼럼 크로마토그래피에 의해 분획하는 공정; 및
(iii) 각 분획의 활성을 측정하여, 소정의 활성을 갖는지 여부를 판정하는 공정
을 포함하는 방법.
목적하는 생리활성을 갖는 당단백질 혼합물을 얻는 방법으로서, 이하의 공정 (A)~(D):
(A) 아미노산 서열 및 당쇄가 균일한 당단백질을 폴딩시키는 공정;
(B) 상기 폴딩시킨 당단백질을 칼럼 크로마토그래피에 의해 분획하는 공정;
(C) 각 분획의 활성을 측정하는 공정; 및
(D) 목적하는 활성을 얻기 위한 각 분획의 혼합 비율을 구하여, 당해 비율에 따라 각 분획을 혼합하는 공정
을 포함하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 아미노산 서열 및 당쇄가 균일한 당단백질은, 적어도 그 일부가 이하의 공정 (1)~(6):
(1) 수산기를 갖는 수지(레진)의 수산기와, 지용성 보호기로 아미노기가 보호된 아미노산의 카르복실기, 또는 지용성 보호기로 아미노기가 보호된 당쇄 부가된 아미노산의 카르복실기를 에스테르화 반응시키는 공정;
(2) 상기 지용성 보호기를 이탈하여 유리(遊離) 아미노기를 형성시키는 공정;
(3) 상기 유리 아미노기와, 지용성 보호기로 아미노기가 보호된 아미노산의 카르복실기, 또는 지용성 보호기로 아미노기가 보호된 당쇄 부가된 아미노산의 카르복실기를 아미드화 반응시키는 공정;
(4) 상기 공정 (3) 다음에, 지용성 보호기를 이탈하여 유리 아미노기를 형성시키는 공정; 및
(5) 상기 공정 (3) 및 (4)의 공정을 1회 이상 반복하는 공정; 및
(6) 상기 공정 (1)에서 형성된 에스테르 결합을 산으로 절단하는 공정
을 포함하는 방법에 의해 제조되는 방법.
제5항에 있어서,
상기 공정 (1)~(6)에 의해 상기 아미노산 서열 및 당쇄가 균일한 당단백질의 일부가 제조되는 경우로서, 당해 당단백질이, 추가적으로 이하의 공정 (7):
(7) 상기 공정 (6)에서 얻어진 당단백질의 일부와, 다른 펩티드 또는 당펩티드를, 라이게이션법에 의해 연결하는 공정을 포함하는 방법에 의해 제조되는 방법.