BR112015024423B1 - Polipeptídeo glicosilado tendo atividade de interferon ?, composição farmacêutica e uso de um polipeptídeo glicosilado - Google Patents

Abstract

POLIPEPTÍDEO GLICOSILADO COM CADEIA DE AÇÚCAR SIALILADA. O objeto da presente invenção consiste em proporcionar um polipeptídeo tendo atividade de interferon (Beta) glicosilado com cadeias de açúcar sialilados altamente uniformes. A presente invenção é um polipeptídeo glicosilado, em que o polipeptídeo é qualquer polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo dos seguintes (1) a (4); (1) um polipeptídeo que consiste da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1, (2) um polipeptídeo possuindo um ou poucos aminoácidos deletados, substituídos ou adicionados no polipeptídeo que consiste da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1, (3) um polipeptídeo que é um análogo de interferon (Beta), e (4) um polipeptídeo possuindo 80% ou mais de homologia com o polipeptídeo consistindo da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1, nos quais os aminoácidos nas posições 4 a 6 são substituídos por aminoácidos glicosilados, e em que todos os terminais não redutores da referida cadeia de açúcar são sialilados.

Description

CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção refere-se a um polipeptídeo glicosilado com uma cadeia de açúcar sialilada. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo possuindo atividade de interferon β glicosilado com cadeias de açúcar sialiladas altamente uniformes.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] Interferon β humano natural (IFN-β) é uma glicoproteína que consiste em 166 resíduos de aminoácidos. O interferon β pertence à família das citoquinas e é conhecido por estar envolvido na ação imunorreguladora, na atividade antiviral e na ação inibidora do crescimento celular. Os interferons β humanos também tem três Cys nas posições 17, 31 e 141 na sequência de aminoácidos naturais, e tem um oligossacarídeo N-ligado no complexo de Asn na posição 80. Sabe-se também que tem uma ligação de dissulfeto em Cys nas posições 31 e 141.

[003] O interferon β como um produto farmacêutico é fabricado através da utilização de um sistema de expressão celular e é classificado em IFN-β-1a ou IFN-β-1b em função da diferença no hospedeiro para expressão. IFN-β-1a é um sistema de expressão que utiliza células de ovário de hamster chinês (CHO) e é uma glicoproteína possuindo cadeias de açúcar de forma semelhante a um interferon β natural. Por outro lado, o IFN-β-1b é expresso em E. coli, e é uma proteína sem cadeias de açúcar.

[004] O IFN-β-1a é conhecido por ter um efeito mais potente em comparação com o IFN-β-1b em relação à imunogenicidade, a atividade antiviral e propriedades antitumoral. Além disso, a estrutura da cadeia de açúcar contida em uma glicoproteína é conhecida por ter uma forte influência sobre a farmacocinética.

[005] Sabe-se também que os efeitos, tais como a melhoria na estabilidade física, estabilidade ao calor e estabilidade no plasma da proteína são proporcionadas através da ligação de um polímero solúvel em água, tal como polietilenoglicol (PEG), com a proteína. Há relatos sobre IFN-β PEGuilado com expectativa para tais efeitos. Por exemplo, existem relatórios a respeito de um complexo de IFN-β que foi PEGuilado no N-terminal de IFN-β-1b (Literatura de patente 1 e 2). Há também um relatório sobre um complexo de IFN-β que foi PEGuilado no N-terminal de IFN-β-1a (Literatura de patente 3). Tais modificações podem, de fato, contribuir para as estabilidades acima da proteína, mas por sua vez causa preocupação de que elas reduzam a atividade de IFN-β como um produto farmacêutico. Por exemplo, relata-se que a atividade é, dramaticamente, reduzida em certos casos, nomeadamente quando o peso molecular de PEG é 20.000 ou mais (Literatura de não- Patente 1).

[006] Com a consideração para as preocupações de PEGilação acima descritas, há também um relatório de seleção de uma posição que pode manter a atividade de IFN-β mesmo quando um PEG de peso molecular elevado para PEGuilação específica do local é ligado (Literatura de Patente 4). No entanto, uma vez que PEG é um composto que não existe in vivo, investigação suficiente ainda não foi estabelecida em relação ao acúmulo, à segurança e à eficácia da administração a longo prazo de IFN-β PEGilado.

[007] Por outro lado, há também um relatório sobre complexos de IFN-β glicosilados especificamente em sítios (Literatura de Patente 5). Na Literatura de Patente 5, uma mutação de aminoácidos é introduzida na sequência de aminoácidos naturais de IFN-β de modo que ela tem uma sequência de consenso (Asn-X-Ser/Thr), o que será o local de reconhecimento para uma cadeia de açúcar N-ligada, e isto é expresso com células CHO. No entanto, com este método, mutações de aminoácidos diferentes do aminoácido a ser glicosilado serão produzidas a fim de introduzir mutações na sequência de consenso. É também conhecido, em geral, que a uniformidade de cadeias de açúcar irá ocorrer quando expressas com células CHO.

LISTA DE CITAÇÕES

[008] [Literatura de Patente 1] Pedido de Patente Publicado dos EUA No. 2009/0214472 [Literatura de Patente 2] Patente dos EUA No. 7.829.659 [Literatura de Patente 3] Patente dos EUA No. 7.446.173 [Literatura de Patente 4] Publicação Internacional No. 2005/019260 [Literatura de Patente 5] Publicação Internacional No. 02/074806

[009] [Literatura de não-Patente 1] J. Control. Rel. Vol. 88, páginas 35-42 (2003)

SUMÁRIO DA INVENÇÃO Problemas a Serem Resolvidos pela Invenção

[0010] Há um exemplo de modificação de polipeptídeo de interferon β com PEG a fim de melhorar a estabilidade física, estabilidade térmica, estabilidade no plasma e semelhantes de interferon β, como descrito acima. No entanto, conforme descrito acima, a atividade de interferon β como um produto farmacêutico pode ser reduzida quando modificado com PEG. Além disso, uma vez que o PEG não é uma substância que existe in vivo, há uma preocupação para o sofrimento induzido por fármaco, devido à acumulação in vivo.

[0011] Por outro lado, também existe um exemplo de modificação de um polipeptídeo de interferon β com uma cadeia de açúcar. No entanto, como descrito acima, por exemplo, sabe-se que a uniformidade é causada no tipo de cadeia de açúcar adicionada ou na posição adicionada quando interferon β glicosilado é para ser fabricado por expressão em células CHO. Quando as cadeias de açúcar não são uniformes, existe uma possibilidade de que a diferença no efeito do fármaco, uma vez que um medicamento vai ser cautilizado entre lotes, e surge também uma desvantagem que um interferon β glicosilado natural tem um tempo de retenção curto no sangue.

Meios para Resolver os Problemas

[0012] Como resultado de extensa investigação pelos presentes inventores para resolver os problemas acima, verificou-se que um polipeptídeo glicosilado que tem capacidade de retenção superior no sangue e a atividade antitumoral superior à de um interferon β humano natural é obtido por substituição de aminoácidos nas posições 4 a 6 por aminoácidos glicosilados, em que todos os terminais não redutores da cadeia de açúcar são sialilados no polipeptídeo de interferon β.

[0013] Em outras palavras, a presente invenção, em um aspecto, refere-se a um polipeptídeo glicosilado possuindo atividade de interferon β, caracterizado por o referido polipeptídeo glicosilado ser qualquer polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo dos seguintes (1) a (4); (1) um polipeptídeo que consiste da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1, (2) um polipeptídeo possuindo um ou poucos aminoácidos deletados, substituídos ou adicionados no polipeptídeo que consiste da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1, (3) um polipeptídeo que é um análogo de interferon β, e (4) um polipeptídeo possuindo 80% ou mais de homologia com o polipeptídeo que consiste da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1, no qual os aminoácidos nas posições 4 a 6 são substituídos por aminoácidos glicosilados, e em que todos os terminais não redutores da referida cadeia de açúcar são sialilados.

[0014] Em um aspecto da presente invenção, o referido respectivo aminoácido glicosilado pode ser cada um, independentemente, de um Cys glicosilado ou um Asn glicosilado.

[0015] Em um aspecto da presente invenção, as cadeias de açúcar no referido respectivo aminoácido glicosilado podem ser todas selecionadas independentemente a partir do grupo que consiste de uma cadeia de açúcar de disialo, uma cadeia de açúcar de trisialo e uma cadeia de açúcar de tetrasialo.

[0016] Em um aspecto da presente invenção, as cadeias de açúcar no referido respectivo aminoácido glicosilado podem ser todas selecionados independentemente a partir do grupo que consiste na seguinte Fórmula (1), Fórmula (2), Fórmula (3) e Fórmula (4).

[0017] Em um aspecto da presente invenção, as cadeias de açúcar no referido respectivo aminoácido glicosilado podem ser todas idênticas.

[0018] Em um aspecto da presente invenção, pelo menos um dos referidos respectivos aminoácidos glicosilados podem estar presentes na posição correspondente a uma posição selecionada a partir do grupo que consiste nas posições 1, 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 79, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139 e 164 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1.

[0019] Aqui, em ainda um aspecto da presente invenção, todos os referidos respectivos aminoácidos glicosilados podem ser aqueles que não existem na posição correspondente às posições 2, 5, 6, 9, 12, 13, 16, 19, 20, 23, 27, 33, 37, 39, 40, 43, 53, 54, 55, 57, 58, 61, 62, 64, 65, 68, 69, 73, 78, 83, 86, 87, 90, 93, 94, 100, 124, 125, 128, 131, 132, 138, 141, 142, 145, 148, 149, 152, 153, 156, 159, 160 ou 163 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1.

[0020] Em um aspecto da presente invenção, pelo menos um de, os referidos respectivos aminoácidos glicosilados podem estar presentes na posição correspondente a uma posição selecionada a partir do grupo que consiste nas posições 1, 3, 41, 48, 75, 79, 107, 112, 123 e 136 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1.

[0021] Em um aspecto da presente invenção, pelo menos três de, os referidos respectivos aminoácidos glicosilados podem estar presentes na posição correspondente a uma posição selecionada a partir do grupo que consiste nas posições 1, 3, 41, 48, 75, 79, 107, 112, 123 e 136 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1.

[0022] Em um aspecto da presente invenção, os referidos respectivos aminoácidos glicosilados podem estar presentes na posição correspondente a uma posição selecionada a partir do grupo que consiste nas posições 1, 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 79, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139 e 164 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1.

[0023] Em um aspecto da presente invenção, o referido polipeptídeo glicosilado pode ser sintetizado quimicamente.

[0024] Além disso, em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo: (5) o referido polipeptídeo glicosilado e/ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e (6) um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0025] Em um aspecto da presente invenção, a referida composição farmacêutica pode ser utilizada para a terapia ou prevenção de uma doença relacionada com o interferon β. Aqui, a referida doença pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em tumor cerebral, melanoma maligno cutâneo, hepatite B crônica ativa, hepatite C crônica, panencefalite esclerosante subaguda, cirrose C compensada e esclerose múltipla.

[0026] Além disso, em um aspecto da presente invenção, a sequência do polipeptídeo glicosilado, o aminoácido no aminoácido glicosilado, o tipo e a estrutura da cadeia de açúcar no aminoácido glicosilado, a posição de substituição de um aminoácido pelo aminoácido glicosilado, o método para sintetizar o polipeptídeo glicosilado e a doença alvo como uma composição farmacêutica, tal como anteriormente descrito, pode ser qualquer combinação selecionada a partir do grupo acima, respectivamente.

EFEITOS DA INVENÇÃO

[0027] O polipeptídeo glicosilado da presente invenção tem a estrutura da cadeia de açúcar uniforme porque pode ser sintetizado quimicamente. De acordo com a presente invenção, portanto, pode ser proporcionado um polipeptídeo glicosilado que possui atividade de interferon β com qualidade estável e menos variabilidade entre lotes, assim como uma composição farmacêutica compreendendo o polipeptídeo glicosilado acima referido.

[0028] Além disso, o polipeptídeo glicosilado da presente invenção pode ser um polipeptídeo que tem uma cadeia de açúcar que existe in vivo adicionada neste. De acordo com a presente invenção, portanto, pode ser proporcionado um polipeptídeo glicosilado que é seguro para o corpo humano, mesmo quando administrado em longo prazo, bem como uma composição farmacêutica compreendendo o polipeptídeo glicosilado acima referido.

[0029] Além disso, de acordo com o presente invento, pode ser proporcionado um polipeptídeo glicosilado que tem maior capacidade de retenção no sangue e atividade antitumoral mais elevada em comparação com um interferon β natural, bem como uma composição farmacêutica compreendendo o polipeptídeo glicosilado acima referido.

[0030] O polipeptídeo glicosilado da presente invenção mostrou ter maior capacidade de retenção no sangue e uma maior atividade antitumoral em comparação com um interferon β natural. Embora interferon β PEGilado conhecido como a tecnologia convencional ser melhorado em capacidade de retenção no sangue em comparação com um interferon β natural humano, nenhuma melhoria na atividade antitumoral foi observada. É surpreendente que, por virtude da presente invenção, a melhoria na capacidade de retenção no sangue, que foi semelhante ou superior à forma PEGuilada, poderia ser realizada através do emprego de uma cadeia de açúcar tendo um peso molecular menor do que o PEG, e ainda que a atividade antitumoral foi significativamente melhorada sob a forma glicosilada da presente invenção, mesmo quando não foi melhorada na forma peguilada. Assim, o polipeptídeo glicosilado de acordo com o presente invento é pensado ter alta atividade de interferon β e ser extremamente útil para o tratamento de uma doença relacionada com o interferon β.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0031] A Figura 1 é o espectro de massa que mostra os resultados da realização de espectrometria de massa (método de ionização ESI) em 2-6 diSialo (S1C-Q48C-N79C-K107C- R112C-R123C) obtido no (Exemplo 3-1) e 2-6 monoSialo (S1C- Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) obtido no (Exemplo 4-1).

[0032] A Figura 2 é uma fotografia que mostra os resultados da realização de SDS-PAGE em 2-6 diSialo (S1C- Q48C-N79C- K107C-R112C-R123C) obtido no (Exemplo 3-1) e 2-6 monoSialo (S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) obtido no (Exemplo 4-1).

[0033] A Figura 3 é o espectro de massa que mostra os resultados da realização de análise por CLAE de fase normal nos componentes de cadeia de açúcar de 2-6 diSialo (S1C- Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) obtido no (Exemplo 3-1) e 2-6 monoSialo (S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) obtido no (Exemplo 4-1).

[0034] A Figura 4 é um gráfico que mostra a transição da concentração plasmática para cada polipeptídeo glicosilado quando 2-6 diSialo (S1C-Q48C-N79C-K107C), 2-6 diSialo (S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C) e 2-6 diSialo (S1C- Q48C-N79C- K107C-R112C-R123C) foram administrados por via subcutânea.

[0035] A Figura 5 é uma tabela que mostra os parâmetros farmacocinéticos para cada polipeptídeo glicosilado quando 2-6 diSialo (S1C-Q48C-N79C-K107C), 2-6 diSialo (S1C-Q48C- N79C-K107C-R112C) e 2-6 diSialo (S1C-Q48C N79C-K107C-R112C- R123C) foram administrados por via subcutânea.

[0036] A Figura 6 são representações gráficas que mostram a transição da concentração plasmática para cada polipeptídeo glicosilado quando 2-6 diSialo (S1C-Q48C-N79C- K107C) e 2-6 monoSialo (S1C-Q48C-N79C-K107C) foram administrados por via intravenosa e subcutânea. O gráfico da esquerda é uma representação gráfica da concentração plasmática de transição, para cada polipeptídeo glicosilado, quando administrado por via intravenosa, e o gráfico da direita é um gráfico que mostra a transição da concentração plasmática, para cada polipeptídeo glicosilado, quando administrado por via subcutânea.

[0037] A Figura 7 é uma tabela que mostra os parâmetros farmacocinéticos para cada polipeptídeo glicosilado quando 2-6 diSialo (S1C-Q48C-N79C-K107C) e 2-6 monoSialo (S1C- Q48C-N79C-K107C) foram administrados por via intravenosa e por via subcutânea.

[0038] A Figura 8 é um gráfico que mostra a transição da concentração plasmática para cada polipeptídeo glicosilado quando 2-6 diSialo (S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C- R123C) e 2-6 monoSialo (S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) foram administrados por via intravenosa.

[0039] A Figura 9 é uma tabela que mostra os parâmetros farmacocinéticos para cada polipeptídeo glicosilado quando 2-6 diSialo (S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) e 2-6 monoSialo (S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) foram administrados por via intravenosa.

[0040] A Figura 10 é um gráfico que mostra a transição da concentração plasmática para cada polipeptídeo glicosilado quando 2-6 diSialo (S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C- R123C) e IFN-β modificado com PEG20K foram administrados subcutaneamente.

[0041] A Figura 11 é uma tabela que mostra os parâmetros farmacocinéticos para cada polipeptídeo glicosilado quando 2-6 diSialo (S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C- R123C) e IFN-β modificado com PEG20K foram administrados subcutaneamente.

[0042] A Figura 12 é um gráfico que mostra os resultados da avaliação da atividade antitumoral em ratos de câncer das vias biliares, que foram administrados por via subcutânea 2-6 diSialo (S1C-Q48C-N79C-K107C), 2-6 diSialo (S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C), 2-6 diSialo (S1C-Q48C- N79C-K107C-R112C-R123C) e 2-6 diSialo (S1C-N3C-Q48C-N79C- K107C-R112C).

[0043] A Figura 13 é um gráfico que mostra os resultados da avaliação da atividade antitumoral em ratos de câncer das vias biliares, que foram administrados por via subcutânea 2-6 diSialo (S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C- R123C) e 2-6 monoSialo (S1C-Q48C-N79C-K107C -R112C-R123C).

[0044] A Figura 14 é um gráfico que mostra os resultados da avaliação da atividade antitumoral em ratos de câncer das vias biliares, que foram administrados por via subcutânea 2-6 diSialo (S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C- R123C), 2-6 trisialo (S1C-Q48C-N79C- K107C -R112C-R123C) e 2-6 tetraSialo (S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C).

[0045] A Figura 15 é um gráfico que mostra os resultados da avaliação da atividade antitumoral em ratos de câncer das vias biliares, que foram administrados por via subcutânea 2-6 diSialo (S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C- R123C) e IFN-β modificado com PEG20K.

[0046] A Figura 16 mostra a sequência de aminoácidos do interferon-β 1b (SEQ ID NO. 1) como um exemplo da sequência de aminoácidos de interferon β aqui descrita.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES

[0047] A presente invenção refere-se a um polipeptídeo glicosilado com uma cadeia de açúcar sialilada. Especificamente, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo glicosilado tendo atividade de interferon β glicosilado com cadeias de açúcar sialiladas altamente uniformes.

[0048] Uma "cadeia de açúcar" refere-se a um composto feito de um ou mais açúcares unitários (um monossacarídeo e/ou um seu derivado), ligados entre si. Quando duas ou mais unidades de açúcar estão ligadas entre si, cada unidade de açúcar está ligada por uma condensação de desidratação por uma ligação glicosídeo no meio. Tais cadeias de açúcar incluem, mas não estão limitadas a, por exemplo, uma ampla gama tal como monossacarídeos e polissacarídeos contidos in vivo (glicose, galactose, manose, xilose, fucose, N-acetilglicosamina, N- acetilgalactosamina, ácido siálico e seus complexos e derivados), bem como as cadeias de açúcar que têm sido degradadas ou induzidas a partir de materiais biológicos complexos tais como polissacarídeos, glicoproteínas, proteoglicanos, glicosaminoglicanos e glicolipídios degradados.

[0049] A cadeia de açúcar preferida no presente documento é uma cadeia de açúcar que não dissipa a atividade do interferon β do complexo de interferon. Tal cadeia de açúcar não é particularmente limitada, e pode ser uma cadeia de açúcar que existe como um glicoconjugado in vivo (tal como um glicopeptídeo ou uma glicoproteína, um proteoglicano e um glicolipídio), ou pode ser um carboidrato que não existe como um glicoconjugado in vivo.

[0050] Uma cadeia de açúcar, que existe como um glicoconjugado in vivo é preferível no que diz respeito ao fato de que o complexo de interferon da presente invenção é administrado in vivo. Exemplos de uma cadeia de açúcar que existem como um glicoconjugado in vivo incluem cadeias de açúcar ligadas ao N ou ao O e semelhantes, que são cadeias de açúcar ligadas a um peptídeo ou uma proteína in vivo como um glicopeptídeo ou uma glicoproteína.

[0051] Em um aspecto da presente invenção, uma cadeia de açúcar ligada a N é, de preferência, utilizada. As cadeias de açúcar N-ligadas podem incluir, por exemplo, uma forma de alta-manose, uma forma de complexo ou uma forma híbrida, particularmente de preferência, uma forma complexa.

[0052] As cadeias de açúcar aqui são caracterizadas pelo fato de todos os terminais não redutores da cadeia de açúcar serem sialilados. "Todos os terminais não redutores da cadeia de açúcar são sialilados" aqui utilizado, por exemplo, significa que ambos os dois terminais não redutores são sialilados no caso de uma cadeia de açúcar de complexo biantenário, todos os três terminais não redutores são sialilados no caso de uma cadeia de açúcar de complexo triantenário, e todos os quatro terminais não redutores são sialilados no caso de uma cadeia de açúcar de complexo tetraantenário.

[0053] A sialilação aqui significa que um ácido siálico está ligado ao terminal não redutor da cadeia de açúcar. O ácido siálico é um termo genérico para um ácido neuramínico tendo o grupo amino ou o grupo hidroxi substituído. Na presente invenção, o ácido siálico presente no terminal não redutor da cadeia de açúcar pode incluir quaisquer e todas as formas substituídas de ácido neuramínico, contanto que não dissipe ou reduza significativamente a atividade de interferon do polipeptídeo glicosilado da presente invenção. Entre estes, a sialilação da cadeia de açúcar no polipeptídeo glicosilado de acordo com a presente invenção é, de preferência, um ácido siálico que ocorre naturalmente no que diz respeito ao fato de o polipeptídeo glicosilado da presente invenção ser administrado in vivo. Por exemplo, ácido N-acetilneurâmico (Neu5Ac) acetilado na posição 5 ou ácido N-glicolil neuramínico (Neu5Gc) modificado com ácido glicólico na posição 5 e análogos são conhecidos como ácidos siálicos de ocorrência natural.

[0054] Tal como um aspecto da presente invenção, os exemplos específicos de cadeias de açúcar, com todos os terminais não redutores sialilados incluem, por exemplo, como uma cadeia de açúcar conhecida por existir in vivo, uma cadeia de açúcar de complexo de uma cadeia de açúcar N- ligada. Como a cadeia de açúcar de complexo de uma cadeia de açúcar ligada a N, aqueles diferindo no seu modo de ligação, a presença ou ausência de fucose, a presença ou ausência de modificação no substituinte de cadeia lateral e semelhantes, estão também incluídos, desde que tenha o esqueleto de base de uma cadeia de açúcar geralmente conhecido como um complexo de cadeia de açúcar de uma cadeia de açúcar N-ligada. Exemplos de um complexo de cadeia de açúcar ligada em N podem incluir, dependendo da diferença na estrutura de ramificação da cadeia de açúcar, por exemplo, uma cadeia de açúcar de disialo, uma cadeia de açúcar de trisialo e uma cadeia de açúcar de tetrasialo. Em outras palavras, uma "cadeia de açúcar de disialo" aqui refere-se a uma cadeia de açúcar de complexo N-ligado que tem uma estrutura biantenária e tem todos os terminais não redutores sialilados. Do mesmo modo, uma "cadeia de açúcar de trisialo" refere-se a uma cadeia de açúcar de complexo N-ligado que tem uma estrutura triantenária e tem todos os terminais não redutores sialilados. Do mesmo modo, uma "cadeia de açúcar de tetrasialo" refere-se a uma cadeia de açúcar de complexo N-ligado que tem uma estrutura tetra- antenária e tem todos os terminais não redutores sialilados.

[0055] Mais especificamente, estas cadeias de açúcar podem incluir a cadeia de açúcar de α2-6 disialo representada pela seguinte Fórmula (1), a cadeia de açúcar de α2-3 disialo representada pela Fórmula (2), a cadeia de açúcar de α2-6 trisialo representada pela Fórmula (3), a cadeia de açúcar de α2-6 tetrasialo representada pela Fórmula (4) e semelhantes.

[0056] As cadeias de açúcar sialiladas aqui não estão limitadas aos exemplos específicos acima, e incluem ligação entre a cadeia de açúcar e o ácido siálico é diferente, tal como cadeias de açúcar de α2-3 trisialo e α2-3 tetrasialo. Quanto ao modo de ligação, todas as cadeias ramificadas na cadeia de açúcar sialilada podem ser um modo de ligação idêntico, ou pode incluir diferentes modos de ligação. Além disso, a cadeia de açúcar sialilada aqui inclui também aquelas que possuem uma fucose adicionada na mesma. Os exemplos específicos de uma cadeia de açúcar de complexo tendo uma fucose adicionada podem incluir a seguinte Fórmula (13) no caso de uma cadeia de açúcar de disialo, a seguinte fórmula (15) e Fórmula (16) no caso de uma cadeia de açúcar de de açúcar tetrasialo.

[0057] Em um aspecto da presente invenção, as cadeias de açúcar do respectivo aminoácido glicosilado no polipeptídeo glicosilado da presente invenção podem ser idênticas, ou podem também compreender diferentes cadeias de açúcar. As cadeias de açúcar do respectivo aminoácido glicosilado no polipeptídeo glicosilado são idênticas, tal como aqui utilizada, refere-se ao fato de que, quando os aminoácidos nas posições 4 a 6 são substituídos por aminoácidos glicosilados na presente invenção, o tipo de açúcar que configura a cadeia de açúcar, a ordem de ligação e o modo de ligação são idênticos dentro do polipeptídeo glicosilado, quando as cadeias de açúcar nos aminoácidos glicosilados nas posições 4 a 6 são comparados uns com os outros.

[0058] Além disso, em um aspecto da presente invenção, em uma composição contendo o polipeptídeo glicosilado da presente invenção, cada uma das cadeias de açúcar no polipeptídeo glicosilado é, de preferência, cada uma, substancialmente uniforme. Cada cadeia de açúcar no polipeptídeo glicosilado é, cada uma, substancialmente uniforme, tal como aqui utilizado refere-se ao fato de que quando cada cadeia de açúcar é comparada entre os polipeptídeos glicosilados para cada posição de glicosilação, as posições sobre o polipeptídeo são idênticas e o tipo de açúcar que configura a cadeia de açúcar em cada posição, a ordem de ligação e o modo de ligação entre os açúcares são, cada um, substancialmente idênticos em cada cadeia de açúcar. Na presente invenção, cada uma das cadeias de açúcar no polipeptídeo glicosilado é, pelo menos, 90% ou mais, de preferência 95% ou mais, e mais preferivelmente 99% ou mais uniforme.

[0059] Uma composição que compreende um polipeptídeo glicosilado, em que cada cadeia de açúcar no polipeptídeo glicosilado é, cada uma, substancialmente uniforme, tem uma qualidade constante e é, particularmente, preferida em campos tal como a fabricação de medicamentos e ensaios. A proporção das cadeias de açúcar uniforme pode ser medida, por exemplo, por um método que emprega CLAE, eletroforese capilar, espectrometria de massa e outros semelhantes.

[0060] A "sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO. 1" aqui é a sequência de aminoácidos do interferon- β 1b (ver Figura 16). Interferon β-1b é conhecido por ter Met na posição 1 deletado e Cys na posição 17 substituído por Ser, em um interferon β humano natural.

[0061] Um "polipeptídeo glicosilado" aqui refere-se a, por exemplo, um polipeptídeo que consiste da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1, com os aminoácidos das posições 4 a 6 substituídos por "aminoácidos glicosilados".

[0062] Um "aminoácido glicosilado", aqui utilizado, é um aminoácido que tem uma cadeia de açúcar ligada a este, em que a cadeia de açúcar e o amino ácido podem estar ligados através de um ligante. O tipo de aminoácido a ser glicosilado não é, particularmente, limitado e qualquer um dos aminoácidos naturais e aminoácidos não-naturais podem ser empregados.

[0063] Quando a cadeia de açúcar e o aminoácido são ligados através de um ligante, o aminoácido preferido do aminoácido glicosilado, no que diz respeito à facilidade de ligação com o ligante, é um aminoácido tendo dois ou mais grupos carboxila na molécula, tal como ácido aspártico e ácido glutâmico, um aminoácido tendo dois ou mais grupos amino na molécula, tal como lisina, arginina, histidina e triptofano, um aminoácido tendo um grupo hidroxila na molécula, tal como serina, treonina e tirosina, um aminoácido tendo um grupo tiol na molécula, tal como cisteína, e um aminoácido tendo um grupo amida na molécula, tal como glutamina e asparagina. Em particular, cisteína, asparagina, ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina, arginina, serina, treonina, e glutamina são preferidos em relação à reatividade.

[0064] Para qualquer polipeptídeo glicosilado da presente invenção, se a estrutura da cadeia de açúcar, a estrutura diferente à da cadeia de açúcar, o local de glicosilação e o número de cadeias de açúcar adicionadas são idênticos, não se pensa haver grande diferença na meia-vida no sangue do polipeptídeo glicosilado da presente invenção entre o momento em que o aminoácido glicosilado é um Asn glicosilado e quando é um Cys glicosilado.

[0065] Quando a cadeia de açúcar e o aminoácido são ligados através de um ligante, àqueles utilizados nos campos em questão podem ser amplamente utilizados como o ligante, exemplos dos quais podem incluir -NH-(CO)-(CH2)a- CH2- (em que a indica um inteiro que não é limitado desde que não iniba a função de ligante alvo, mas é, de preferência, um número inteiro de 0 a 4), polimetileno C110, -CH2-R- (em que R é um grupo produzido pela separação de um átomo de hidrogênio de um grupo selecionado a partir do grupo consistindo de um grupo alquil, um grupo alquil substituído, um alcenil, um alcenil substituo, um alcinil, um alcinil substituído, um aril, um aril substituído, um grupo carbocíclico, um grupo carbocíclico substituído, um grupo heterocíclico e um grupo heterocíclico substituído), - (CO)-(CH2)a-(CO)- (em que a indica um inteiro que não é limitado desde que não iniba a função de ligante alvo, mas é, de preferência, um número inteiro de 0 a 4), e semelhantes.

[0066] O método de fabricação do polipeptídeo glicosilado da presente invenção não é para ser limitado, de qualquer maneira, pela descrição do mesmo (tal como a descrição do "polipeptídeo glicosilado possuindo um aminoácido é substituído por um aminoácido glicosilado"), e um polipeptídeo glicosilado fabricado por qualquer um dos métodos A ou B descritos abaixo é incluído no "polipeptídeo glicosilado possuindo um aminoácido é substituído por um aminoácido glicosilado". Além disso, por exemplo, um polipeptídeo glicosilado, em que uma cadeia de açúcar sem qualquer aminoácido ligado à mesma, é ligado diretamente ou através de um ligante a um aminoácido em um peptídeo; um polipeptídeo glicosilado em que um açúcar ou uma cadeia de açúcar é posteriormente adicionada à cadeia de açúcar adicionada no polipeptídeo glicosilado, a fim de alongar a cadeia de açúcar já adicionada; um polipeptídeo glicosilado em que um ou alguns aminoácidos estão ligados ao grupo amino e/ou grupo carboxila de um aminoácido glicosilado, e ainda ligados a um ou mais fragmentos de interferon β; e um polipeptídeo glicosilado em que uma cadeia de açúcar tendo um aminoácido ligado ao mesmo está ligado através de um ligante a um aminoácido em um peptídeo, e outros semelhantes também estão incluídos no polipeptídeo glicosilado da presente invenção, desde que a estrutura final seja correspondente.

[0067] Em um aspecto da presente invenção, as posições de substituição dos "aminoácidos nas posições 4 a 6", descritas acima com aminoácidos glicosilados, devem ser selecionadas tendo em conta vários aspectos, de modo que a atividade do interferon β não seja reduzida por substituição do aminoácido glicosilado. Por exemplo, Asn na posição 80 (correspondente à posição 79 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1) onde a cadeia de açúcar está ligada em um interferon β natural é preferida aqui como uma posição para ser substituída por um aminoácido glicosilado.

[0068] Em um aspecto da presente invenção, a posição de substituição do aminoácido glicosilado é selecionada, preferencialmente, de modo que não vá perturbar a formação da conformação de interferon β na dobragem do polipeptídeo. A fim de evitar a perturbação da formação da conformação de interferon β, a posição de substituição do aminoácido glicosilado pode ser a posição de aminoácidos presentes na superfície da estrutura conformacional quando interferon β tenha formado uma conformação semelhante àquela na natureza. Em outras palavras, a posição pode ser posições de aminoácidos que não configurem a vizinhança da superfície de estrutura conformacional quando interferon β tenha formado uma conformação semelhante àquela na natureza (também aqui referidos como "as posições de aminoácidos de não-superfície"). Além disso, em um aspecto da presente invenção, a posição de substituição do aminoácido glicosilado não é, de preferência, o local de ligação do receptor do interferon β. Os presentes inventores realizaram investigações extensas com dados, tal como análise conformacional de interferon β para estimar as posições dos aminoácidos de não-superfície de interferon β, e posições estimadas que possam perturbar outra formação conformacional ou posições que possam perturbar ligação com o receptor. A partir dessa perspectiva, em um aspecto da presente invenção, o aminoácido glicosilado não está, de preferência, presente na posição correspondente às posições 2, 5, 6, 9, 12, 13, 16, 19, 20, 23, 27, 33, 37, 39, 40, 43, 53, 54, 55, 57, 58, 61, 62, 64, 65, 68, 69, 73, 78, 83, 86, 87, 90, 93, 94, 100, 124, 125, 128, 131, 132, 138, 141, 142, 145, 148, 149, 152, 153, 156, 159, 160 ou 163 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1. Além disso, os versados na técnica, tendo em vista esta especificação, serão capazes de investigar, apropriadamente, posições de substituição semelhantes não preferíveis para o aminoácido glicosilado de acordo com estas posições.

[0069] Em um aspecto da presente invenção, a posição de substituição do aminoácido glicosilado é, de preferência, não Cys nas posições 31 e 141, que forma uma ligação de dissulfeto em um interferon β natural (correspondendo às posições 30 e 140 na sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO. 1).

[0070] Os inventores da presente invenção realizaram uma extensa pesquisa do ponto de vista acima descrito para sintetizar vários polipeptídeos glicosilados possuindo vários aminoácidos na sequência de aminoácidos substituídos com aminoácidos glicosilados e mediu as suas atividades de interferon β. Como resultado, verificou-se que, pelo menos, as posições 1, 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 79, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139 e 164 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1 são posições que contribuem para a manutenção ou a melhoria da atividade de interferon β por glicosilação.

[0071] A partir das razões acima expostas, em um aspecto da presente invenção, pelo menos um de, os seus respectivos aminoácidos glicosilados está, de preferência, presente na posição correspondente a uma posição selecionada a partir do grupo que consiste nas posições 1, 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 79, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139 e 164 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1.

[0072] Além disso, em um aspecto da presente invenção, pelo menos dois dos seus respectivos aminoácidos glicosilados estão, de preferência, presentes na posição correspondente a uma posição selecionada a partir do grupo que consiste nas posições 1, 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 79, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139 e 164 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1.

[0073] Além disso, em um aspecto da presente invenção, pelo menos, três dos seus respectivos aminoácidos glicosilados estão, de preferência, presentes na posição correspondente a uma posição selecionada a partir do grupo que consiste nas posições 1, 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 79, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139 e 164 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1.

[0074] Além disso, em um aspecto da presente invenção, pelo menos, quatro dos seus respectivos aminoácidos glicosilados estão de preferência presentes na posição correspondente a uma posição selecionada a partir do grupo que consiste nas posições 1, 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 79, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139 e 164 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1.

[0075] Além disso, em um aspecto da presente invenção, quando 5 ou mais posições são substituídas por aminoácidos glicosilados, pelo menos, cinco dos seus respectivos aminoácidos glicosilados estão, de preferência, presentes na posição correspondente a uma posição selecionada a partir do grupo que consiste nas posições 1, 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 79, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139 e 164 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1.

[0076] Em um aspecto da presente invenção, é mais preferido que cada um dos aminoácidos glicosilados descritos acima, estejam presentes na posição correspondente a uma posição selecionada a partir do grupo que consiste nas posições 1, 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 79, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139 e 164 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1.

[0077] Em um aspecto da presente invenção, é mais preferido que um dos aminoácidos glicosilados esteja presente na posição correspondente à posição 79 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1.

[0078] Além disso, em um aspecto da presente invenção, é mais preferido que um ou mais de cada um dos outros aminoácidos glicosilados (exceto posição 79) estejam presentes na posição correspondente a uma posição selecionada a partir do grupo que consiste nas posições 1, 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139 e 164 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1.

[0079] Além disso, estas posições são exemplos preferidos específicos, e não estão a limitar as posições aqui listadas. Os versados na técnica, tendo em vista a presente invenção, serão capazes de selecionar as posições a serem substituídas por aminoácidos glicosilados de modo semelhante à presente invenção.

[0080] Em um aspecto da presente invenção, um dos respectivos aminoácidos glicosilados está, de preferência, presente na posição correspondente à posição 1 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1. Em um aspecto da presente invenção, um dos respectivos aminoácidos glicosilados está, de preferência, presente na posição correspondente à posição 3 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1. Em um aspecto da presente invenção, um dos respectivos aminoácidos glicosilados está, de preferência, presente na posição correspondente à posição 41 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1. Em um aspecto da presente invenção, um dos respectivos aminoácidos glicosilados está, de preferência, presente na posição correspondente à posição 48 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1. Em um aspecto da presente invenção, um dos respectivos aminoácidos glicosilados está, de preferência, presente na posição correspondente à posição 75 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1. Em um aspecto da presente invenção, um dos respectivos aminoácidos glicosilados está, de preferência, presente na posição correspondente à posição 79 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1. Em um aspecto da presente invenção, um dos respectivos aminoácidos glicosilados está, de preferência, presente na posição correspondente à posição 107 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1. Em um aspecto da presente invenção, um dos respectivos aminoácidos glicosilados está, de preferência, presente na posição correspondente à posição 112 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1. Em um aspecto da presente invenção, um dos respectivos aminoácidos glicosilados está, de preferência, presente na posição correspondente à posição 123 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1. Em um aspecto da presente invenção, um dos respectivos aminoácidos glicosilados está, de preferência, presente na posição correspondente à posição 136 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1.

[0081] Além disso, em um aspecto da presente invenção, quando substituindo um aminoácido por um aminoácido glicosilado, a posição pode ser qualquer combinação de posições selecionadas a partir das posições de substituição acima.

[0082] Exemplos específicos de combinação preferível de posições nas quais os respectivos aminoácidos glicosilados estão presentes, aqui acima descrito, podem ser exemplificados pelas posições correspondentes às posições seguintes da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1, mas não estão limitados a estas. posições 1, 48, 79, 107, 112 e 123; posições 1, 3, 48, 79, 107 e 112; posições 1, 48, 79, 99, 107 e 112; posições 1, 48, 79, 107, 112 e 130; posições 1, 48, 79, 107, 112 e 136; posições 1, 48, 79, 107, 112 e 139; posições 1, 48, 79, 107, 112 e 164; posições 1, 29, 48, 79, 107 e 136; posições 1, 35, 48, 79, 107 e 136; posições 1, 41, 48, 79, 107 e 136; posições 1, 48, 75, 79, 107 e 136; posições 48, 75, 79, 107, 112 e 136; posições 41, 75, 79, 103, 107 e 136; posições 41, 75, 79, 106, 107 e 136; posições 41, 75, 79, 107, 109 e 136; posições 41, 75, 79, 107, 112 e 136; posições 41, 75, 79, 107, 115 e 136; posições 41, 75, 79, 107, 119 e 136; posições 1, 28, 48, 70, e 79; posições 1, 48, 79, 107 e 112; posições 24, 79, 107 , 112 e 136; posições 25, 79, 107 , 112 e 136; posições 32, 79, 107 , 112 e 136; posições 35, 79, 107 , 112 e 136; posições 38, 79, 107 , 112 e 136; posições 41, 79, 107 , 112 e 136; posições 7, 79, 107, 112 e 136; posições 48, 79, 107 , 112 e 136; posições 75, 79, 107 , 112 e 136; posições 41, 75, 79, 107 e 136; posições 42, 75, 79, 107 e 136; posições 45, 75, 79, 107 e 136; posições 46, 75, 79, 107 e 136; posições 47, 75, 79, 107 e 136; posições 48, 75, 79, 107 e 136; posições 49, 75, 79, 107 e 136; posições 50, 75, 79, 107 e 136; posições 1, 48, 79 e 107; posições 1, 3, 48, e 79; posições 79, 107, 112 e 136; posições 1, 79, 107 e 136; posições 28, 79, 107 e 136; posições 35, 79, 107 e 136; posições 70, 79, 107 e 136; e posições 75, 79, 107 e 136.

[0083] A posição que corresponde à posição da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1 refere-se aqui ao aminoácido na posição correspondente à posição do aminoácido na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1, contanto que não haja adição, deleção, etc. de aminoácidos. Além disso, quando a adição ou deleção de aminoácidos está presente na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1, o termo refere-se ao aminoácido na posição que toma em consideração a mudança na sequência de aminoácidos, devido à adição ou deleção de aminoácidos. Por exemplo, em um interferon β-1b glicosilado que possui a sequência Ser1-Tyr2-Asn3-Leu4- nas posições 1 e 4, quando um aminoácido (Trp) é adicionado entre os aminoácidos nas posições 1 e 2 (Ser-Trp-Tyr-Asn- Leu), "a posição correspondente à posição 2 (Tyr)" refere- se à posição do aminoácido (Tyr), que é deslocado em direção ao terminal C, devido à adição de Trp.

[0084] Um "aminoácido" é utilizado aqui no seu sentido mais lato, e pode incluir não apenas aminoácidos naturais, mas também os aminoácidos não naturais, tal como variantes de aminoácidos e derivados. Os versados na técnica reconhecerão que, tendo em conta essa ampla definição, os aminoácidos na presente invenção incluem, por exemplo, os ácidos L-aminoácidos proteinogênicos naturais; D- aminoácidos; aminoácidos quimicamente modificados, tal como variantes de aminoácidos e seus derivados; aminoácidos não-naturais, tais como norleucina proteinogênica, β-alanina e ornitina; compostos quimicamente sintetizados possuindo propriedades conhecidas na arte que são características de aminoácidos e semelhantes. Exemplos de aminoácidos não naturais incluem α-metilamino ácidos (tais como α-metilalanina), D- aminoácidos, aminoácidos semelhantes à histidina (tal como 2-amino-histidina, β-hidroxi-histidina, homohistidina, α- fluorometil-histidina e α-metil-histidina), amino ácidos tendo metilenos em excesso na cadeia lateral ("homo" aminoácidos), e aminoácidos nos quais o grupo funcional carboxilato na cadeia lateral é substituído por um grupo sulfonato (tal como o ácido cisteico). Em um aspecto preferido, os aminoácidos contidos no composto da presente invenção consistem apenas de aminoácidos naturais.

[0085] "A sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO. 1", aqui utilizado, indica a sequência de aminoácidos do interferon-β 1b (ver Figura 16). Interferon β-1b é conhecido por ter Met na posição 1 deletado e Cys na posição 17 substituído por Ser em um interferon β humano natural.

[0086] Quando referido como "tendo um ou alguns aminoácidos deletados, substituídos ou adicionados na sequência de aminoácidos" aqui o número de aminoácidos a ser substituído, etc., não é particularmente limitado desde que a atividade como interferon β seja retida e, por exemplo, significa que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 aminoácidos são diferentes. Alternativamente, pode também incluir os casos em que 20% ou menos, preferencialmente 10% ou menos dos aminoácidos de todo o comprimento da sequência de aminoácidos são diferentes. O aminoácido a ser substituído ou adicionado pode ser um aminoácido natural, um aminoácido não-natural ou um análogo de aminoácido, preferencialmente um aminoácido natural. Como um aspecto da presente invenção, um polipeptídeo "possuindo um ou poucos aminoácidos ácidos deletados, substituídos ou adicionados na sequência de aminoácidos" inclui um interferon β humano natural. Conforme descrito acima, o polipeptídeo consistindo da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1, isto é, interferon-β 1b, tem Met na posição 1 deletado e Cys na posição 17 substituído por Ser, em um interferon β humano natural. Em outras palavras, o interferon β humano natural tem um aminoácido adicionado e um aminoácido substituído em um polipeptídeo que consiste da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1. Os versados na técnica, tendo em vista a especificação aqui, pode empregar a sequência de aminoácidos do interferon humano natural (interferon β-1a) em vez da sequência de aminoácidos do interferon β-1b humano empregado nos presentes exemplos, e ainda fabricar e utilizar o presente peptídeo glicosilado de forma semelhante com a presente invenção fazendo referência às divulgações aqui descritas. A sequência de aminoácidos do interferon β-1a humano natural é mostrada como SEQ ID NO. 2. Em um aspecto da presente invenção, quando a sequência de aminoácidos do interferon β-1a humano natural é utilizada em vez da sequência de aminoácidos do interferon β-1b humano empregado nos presentes exemplos, é preferida a utilização de uma sequência de aminoácido que não tenha cadeias de açúcar uniformes presas junto à posição natural 80.

[0087] Um "análogo de interferon β", aqui, inclui um polipeptídeo estruturalmente semelhante ao interferon β e/ou um polipeptídeo tendo uma estrutura de sobreposição de interferon β, por exemplo, um polipeptídeo possuindo um ou poucos aminoácidos entre os aminoácidos de interferon β conservativamente substituídos, um interferon β modificado, um fragmento de interferon β tendo atividade de interferon β, e um interferon β alongado possuindo atividade de interferon β.

[0088] "Tendo um ou alguns aminoácidos entre os aminoácidos substituídos de forma conservativa", aqui utilizado, refere-se a uma substituição de aminoácido em que o índice hidrofílico e/ou o índice hidrofóbico entre o aminoácido original e o aminoácido a ser substituído são semelhantes, em que a substituição não causa redução aparente ou dissipação de atividade de interferon β entre antes e depois de tal substituição.

[0089] Um "interferon β modificado", aqui, é uma forma modificada de interferon β que inclui variantes de ocorrência natural de interferon β ou compostos modificados artificialmente de interferon β, e tais modificações incluem, por exemplo, alquilação, acilação (tal como a acetilação), amidação, carboxilação, esterificação, formação de ligação de dissulfeto, glicosilação, lipidação, fosforilação, hidroxilação, ligação de um componente de rotulagem e semelhantes, de um ou mais resíduos de aminoácidos de interferon β.

[0090] Um "fragmento de interferon β tendo atividade de interferon β", aqui utilizado, é um peptídeo que tem um ou mais aminoácidos deletados a partir do N- e/ou C-terminal do interferon β e mantém atividade de interferon β.

[0091] Um "um interferon β alongado possuindo atividade de interferon β", aqui utilizado, é um peptídeo que tem um ou mais aminoácidos adicionados ao N- e/ou C-terminal do interferon e mantém atividade de interferon β.

[0092] O polipeptídeo glicosilado da presente invenção pode incluir um polipeptídeo consistindo de uma sequência de aminoácidos que tem 80% ou mais de homologia com a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1, na qual os aminoácidos nas posições 4 a 6 são substituídos por aminoácidos glicosilados.

[0093] O polipeptídeo glicosilado da presente invenção pode ser fabricado através da integração de um passo de glicosilação em um método de síntese de peptídeos, bem conhecido aos versados na técnica. Embora um método utilizando enzimas representadas por transglutaminase também possa ser empregado para a glicosilação, existem problemas, neste caso, como a necessidade de uma grande quantidade de cadeia de açúcar a ser adicionada, complicação de purificação após a etapa final e restrição de posições de glicosilação e cadeias de açúcar que podem ser adicionadas. Como resultado, embora seja possível empregar-se em uma síntese em pequena escala, tal como para os ensaios, não pode ser considerado um método prático para uma fabricação em grande escala, tal como para a fabricação de medicamentos.

[0094] Os exemplos específicos de métodos que são métodos fáceis de fabricação para o polipeptídeo glicosilado da presente invenção, bem como métodos de produção estáveis de um polipeptídeo glicosilado possuindo a estrutura da cadeia de açúcar uniforme, são exemplificados como segue: um método de utilização de Asn glicosilado como o aminoácido glicosilado, e aplicação de um método de síntese de peptídeos bem conhecido, tal como síntese em fase sólida e em fase líquida para, assim, fabricar um polipeptídeo glicosilado (método A); e um método de fabricação de um polipeptídeo possuindo qualquer aminoácido do polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1, e semelhantes, substituído por Cys de acordo com um método de síntese de peptídeos bem conhecido, e, em seguida, a glicosilação de Cis através de síntese química para a fabricação de um polipeptídeo glicosilado (método B). Os versados na técnica serão capazes de produzir vários polipeptídeos glicosilados referindo-se a estes métodos de fabricação, e os polipeptídeos glicosilados obtidos, bem como o método de fabricação dos mesmos, são extremamente úteis, especialmente no campo da fabricação de medicamentos.

[0095] Além disso, estes métodos A e B podem ser realizados em uma combinação de dois ou mais. No caso de uma síntese em pequena escala empregado para ensaios etc., o método acima referido pode ainda ser combinado com uma reação de alongamento da cadeia de açúcar por uma transferase. O método A é descrito na Publicação Internacional No 2004/005330 (US2005222382 (A1)) e o método B é descrito na Publicação Internacional No 2005/010053 (US2007060543 (A1)), as divulgações as quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade. Além disso, a fabricação de uma cadeia de açúcar tendo a estrutura da cadeia de açúcar uniforme empregado nos métodos A e B encontram-se descritas em, por exemplo, Publicação Internacional No 03/008431 (US2004181054 (A1)), Publicação Internacional No 2004/058984 (US2006228784 (A1)), Publicação Internacional No 2004/058824 (US2006009421 (A1)), Publicação Internacional No 2004/070046 (US2006205039 (A1)) e Publicação Internacional No 2007/011055, as divulgações as quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

Método para Fabricar Polipeptídeo Glicosilado (Método A)

[0096] O polipeptídeo glicosilado pode ser fabricado, por exemplo, pela síntese em fase sólida empregando Asn glicosilado descrito abaixo. (1) O grupo carboxila de um aminoácido com o grupo amino com nitrogênio protegido com um grupo protetor lipofílico está ligado a uma resina. Neste caso, uma vez que o nitrogênio do grupo amino do amino ácido é protegido com um grupo protetor lipofílico, autocondenação de aminoácidos uns com os outros é impedida, e a resina e o aminoácido reagem para produzir uma ligação. (2) O grupo de proteção lipofílica do reagente obtido é separado para formar um grupo amino livre. (3) O grupo amino livre e o grupo carboxila de um aminoácido tendo a nitrogênio do grupo amino protegido com um grupo protetor lipofílico são submetidos a uma reação de amidação. (4) O grupo protetor lipofílico é separado para formar um grupo amino livre. (5) Os passos (3) e (4) acima são repetidos uma ou mais vezes para se obter um peptídeo de qualquer número de quaisquer aminoácidos ligados entre si, tendo uma resina ligada em uma extremidade e um grupo amino livre na outra extremidade. (6) Por fim, a resina é clivada com um ácido e um peptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos desejada pode ser obtido.

[0097] Aqui, se um Asn glicosilado que possui o nitrogênio do grupo amino protegido com um grupo protetor lipofílico é empregado em vez do aminoácido tendo o nitrogênio do grupo amino protegido com um grupo protetor lipofílico, e o grupo carboxila da porção de asparagina acima mencionada e o grupo hidroxila da resina são feitos reagir em (1), um peptídeo possuindo Asn glicosilado na posição C-terminal pode ser obtido.

[0098] Além disso, após (2), ou depois de repetir (3) e (4) em qualquer número de vezes, que é uma ou mais vezes, se o Asn glicosilado que possui o átomo de nitrogênio do grupo amino protegido com um grupo protetor lipofílico é empregado em vez do aminoácido tendo o nitrogênio do grupo amino protegido com um grupo protetor lipofílico em (3), uma cadeia de açúcar pode ser adicionada em qualquer local.

[0099] Deste modo, através do emprego de um Asn glicosilado que possui o átomo de nitrogênio do grupo amino protegido com um grupo protetor lipofílico, em vez do aminoácido tendo o nitrogênio do grupo amino protegido com um grupo protetor lipofílico duas ou mais vezes em qualquer dos passos (1) e (3), um peptídeo possuindo cadeias de açúcar adicionadas em qualquer dois ou mais locais, pode ser obtido.

[00100] Se, após a ligação do aminoácido glicosilado, o grupo protetor lipofílico é separado e o grupo amino livre é formado, e o passo (6) é realizado imediatamente a seguir, um peptídeo possuindo um Asn glicosilado no N- terminal pode ser obtido.

[00101] A resina pode ser resinas normalmente utilizadas para a síntese em fase sólida, e por exemplo, resina de cloreto de 2-clorotritila funcionalizada com cloro (da Merck & Co., Inc.), resina amino-PEGA funcionalizada com um grupo amino (da Merck & Co., Inc.), resina de álcool NovaSyn TGT possuindo um grupo hidroxila (da Merck & Co., Inc.), resina Wang (da Merck & Co., Inc.) e resina HMPA-PEGA (da Merck & Co., Inc.) pode ser empregado. Além disso, um ligante pode estar presente entre a resina amino-PEGA e o aminoácido, e exemplos de tais ligantes podem incluir ácido 4- hidroximetilfenoxiacético (HMPA), ácido 4-(4-hidroximetil- 3-metoxifenoxi)-butilacético (HMPB) e semelhantes.

[00102] Além disso, quando amidando o terminal C, é preferível utilizar-se, por exemplo, resina de Rink-amida- PEGA funcionalizada com um grupo amino (da Merck & Co., Inc.). Pela clivagem desta resina e o peptídeo com um ácido, o aminoácido do terminal C do peptídeo pode ser amidado.

[00103] Para a ligação entre a resina e um aminoácido com o nitrogênio do grupo amino protegido com um grupo protetor lipofílico, por exemplo, a fim de usar uma resina tendo um grupo hidroxila ou uma resina funcionalizada com cloro, o grupo carboxila do aminoácido é submetido a uma ligação de éster com a resina. Além disso, ao utilizar uma resina funcionalizada com um grupo amino, o grupo carboxila do aminoácido é ligado à resina por uma ligação de amida.

[00104] Qualquer aminoácido pode ser utilizado como o aminoácido, exemplos dos quais podem incluir os aminoácidos naturais serina (Ser), asparagina (Asn), valina (Val), leucina (Leu), isoleucina (Ile), alanina (Ala), tirosina (Tyr), glicina (Gly), lisina (Lys), arginina (Arg), histidina (His), ácido aspártico (Asp), ácido glutâmico (Glu), glutamina (Gln), treonina (Thr), cisteína (Cys), metionina (Met), fenilalanina (Phe), triptofano (Trp) e prolina (Pro). A forma D dos aminoácidos naturais acima também pode ser utilizada.

[00105] Exemplos de um grupo protetor lipofílico podem incluir, por exemplo, um grupo protetor à base de carbonato ou uma amida, tal como um grupo 9- fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc), um grupo t- butiloxicarbonila (Boc), um grupo benzil, um grupo alil, um grupo aliloxicarbonil e um grupo acetil. De modo a introduzir um grupo de proteção lipofílico em um aminoácido, por exemplo, aquando da introdução de um grupo Fmoc, a introdução pode ser efetuada pela adição de carbonato de 9-fluorenilmetil-N-succinimidila e hidrogenocarbonato de sódio e submetendo a reação. A reação pode ser realizada entre 0 e 50 °C, de preferência à temperatura ambiente durante cerca de 1 a 5 horas.

[00106] Aqueles comercialmente disponíveis também podem ser utilizados como um aminoácido protegido com um grupo protetor lipofílico. Exemplos podem incluir Fmoc-Ser-OH, Fmoc-Asn-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc- Ala-OH, Fmoc-Tyr-OH, Fmoc-Gli-OH, Fmoc-Lys-OH, Fmoc-Arg- OH, Fmoc-His-OH, Fmoc-Asp-OH, Fmoc-Glu-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Thr-OH, Fmoc-Cys-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc- Trp-OH e Fmoc-Pro-OH.

[00107] Além disso, exemplos de um aminoácido protegido com um grupo protetor lipofílico tendo um grupo protetor introduzido na cadeia lateral pode incluir Fmoc-Arg(Pbf)- OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys (Acm)- OH, Fmoc-Cys(StBu)-OH, Fmoc-Cys(tBu)-OH, Fmoc-Cys (Trt)- OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-His (Trt)- OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr (tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH e Fmoc-Tir(tBu)- OH.

[00108] Além disso, quando um agente de ligação é para ser adicionado na sequência de aminoácidos do polipeptídeo glicosilado, um ligante pode ser inserido na posição desejada utilizando um ligante protegido com um grupo protetor lipofílico, em vez do aminoácido protegido com um grupo protetor lipofílico acima, durante o processo de síntese em fase sólida.

[00109] Quando se utiliza resina de cloreto 2- clorotritila, a esterificação pode ser realizada através do emprego de uma base, tal como diisopropiletilamina (DIPEA), trietilamina, piridina e 2,4,6-colidina. Além disso, quando se emprega uma resina com um grupo hidroxila, por exemplo, um agente de condensação de desidratação bem conhecido, tal como 1- mesitilenossulfonil-3-nitro-1,2,4-triazol (MSNT), diciclohexilcarbodiimida (DCC) e diisopropilcarbodiimida (DIC) pode ser empregado como catalisador de esterificação. A proporção de utilização entre o aminoácido e o agente de condensação de desidratação é de 1 parte em peso do primeiro para, normalmente, 1 a 10 partes em peso, preferencialmente 2 a 5 partes em peso deste último.

[00110] A reação de esterificação é, preferivelmente, realizada por, por exemplo, a colocação de uma resina em uma coluna de fase sólida, lavando esta resina com um solvente e, em seguida, adicionando uma solução de aminoácido. Exemplos do solvente de lavagem podem incluir dimetilformamida (DMF), 2-propanol, diclorometano e outros semelhantes. Os exemplos do solvente para dissolução do aminoácido podem incluir sulfóxido de dimetila (DMSO), DMF, diclorometano e outros semelhantes. A reação de esterificação pode ser realizada a 0 até 50°C, de preferência à temperatura ambiente durante cerca de cerca de 10 minutos a 30 horas, de preferência durante cerca de 15 minutos a 24 horas.

[00111] Nesta altura, é também preferido proteger o grupo hidroxila não reagido na fase sólida por acetilação com anidrido acético e semelhantes.

[00112] A separação do grupo protetor lipofílico pode ser realizada por, por exemplo, tratamento com uma base. Exemplos da base podem incluir piperidina, morfolina e similares. É preferível realizar isto na presença de um solvente. Exemplos de solvente podem incluir DMSO, DMF, metanol e semelhantes.

[00113] A reação de amidação entre o grupo amino livre e o grupo carboxila de um aminoácido tendo o nitrogênio do grupo amino protegido com um grupo protetor lipofílico é, de preferência, realizada na presença de um ativador e de um solvente.

[00114] Exemplos do ativador podem incluir diciclo- hexilcarbodiimida (DCC), sal de cloridrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (WSC/HCl), difenilfosforilazida (DPPA), carbonildiimidazol (CDI), dietilcianofosfonato (DEPC), benzotriazol-1-iloxi- trispirrolidinofosfônio (DIPCI), hexafluorfosfato de benzotriazol-1-iloxi-trispirrolidinofosfônio (PyBOP), 1- hidroxibenzotriazol (HOBt), hidroxissuccinimida (HOSu), dimetilaminopiridina (DMAP), 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt), hidroxiftalimida (HOPht), pentafluorfenol (Pfp- OH), hexafluorfosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3- tetrametilurônio (HBTU), óxido de hexafluorfosfato de 1- [bis (dimetilamino)metileno]-5-cloro-1H-3-benzotriazólio (HCTU), hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)- 1,1,3,3-tetrametilurônio (HATU), tetrafluorborato de O- benzotriazol-1-il-1,1,3,3-tetrametilurônio (TBTU), 3,4-di- hidro-3-hidrodi-4-oxa-1,2,3-benzotriazina (Dhbt) e semelhantes.

[00115] É preferido que a quantidade de ativador utilizada seja de 1 a 20 equivalentes, preferivelmente 1 a 10 equivalentes e, de um modo mais preferido, 1 a 5 equivalentes do ácido para qualquer grupo amino possuindo o nitrogênio do grupo amino protegido com um grupo protetor lipofílico.

[00116] Exemplos do solvente podem incluir DMSO, DMF, diclorometano e outros semelhantes. A reação pode ser realizada a 0 até 50°C, de preferência à temperatura ambiente durante cerca de cerca de 10 a 30 horas, de preferência durante cerca de 15 minutos a 24 horas. A separação do grupo protetor lipofílico pode ser realizada de modo semelhante ao descrito acima.

[00117] O tratamento com um ácido é preferido para a clivagem da cadeia peptídica a partir da resina. Exemplos do ácido podem incluir ácido trifluoroacético (TFA), fluoreto de hidrogênio (HF) e semelhantes.

[00118] Deste modo, um polipeptídeo glicosilado possuindo a posição desejada substituída por um Asn glicosilado pode ser obtido.

[00119] Em uma modalidade da presente invenção, quando o terminal não redutor na cadeia de açúcar no Asn glicosilado utilizada para a síntese de fase sólida compreende um ácido siálico, é preferível proteger o grupo carboxila do ácido siálico acima mencionado com um grupo de proteção, a fim de impedir que o ácido siálico seja clivado por tratamento com ácido. Exemplos de grupo de proteção podem incluir um grupo benzil, um grupo alil, um grupo difenilmetil e outros semelhantes. Os métodos para introduzir o grupo protetor e liberar o grupo protetor podem ser realizados por métodos bem conhecidos.

Método para Fabricar Polipeptídeo Glicosilado (Método B)

[00120] O polipeptídeo glicosilado também pode ser fabricado por um método de primeiro sintetizar uma cadeia de peptídeo, e em seguida, glicosilação da cadeia de peptídeo sintetizado. Especificamente, um peptídeo compreendendo Cys na posição para ser glicosilado é fabricado pelo método de síntese em fase sólida, método de síntese em fase líquida, um método de síntese por uma célula, um processo de separação e extração daqueles presentes na natureza e semelhantes. Cys que não é para ser glicosilado tal como Cys na posição predeterminada para formar uma ligação de dissulfeto protegida aqui com, por exemplo, um grupo (Acm) acetoamidometil. Além disso, aquando da introdução de Cys que não é para ser glicosilado e não utilizado para a formação de uma ligação de dissulfeto no polipeptídeo glicosilado, ele pode ser introduzido através da proteção de Cys por um grupo protetor durante o passo de glicosilação e o passo de formação de ligações de dissulfeto, e, em seguida, desprotegendo-o. Exemplos de um tal grupo protetor podem incluir terc-butil (tBu) e 4-metoxibenzil.

[00121] Além disso, quando adicionando uma cadeia de açúcar diferente à Cys no polipeptídeo glicosilado, uma cadeia de açúcar diferente pode ser introduzida por primeiro tornar o Cys para a introdução em uma cadeia de açúcar para estar em um estado não protegido, e em seguida, protegendo o Cys para a introdução em uma cadeia de açúcar diferente por StBu e semelhantes. Especificamente, quando sintetizando o peptídeo por síntese em fase sólida, etc., o Cys para introduzir em uma primeira cadeia de açúcar é processado não protegido, e o Cys para a introdução em uma segunda cadeia de açúcar é processado para ser Cys tendo um grupo de proteção com Fmoc-Cys(StBu)-OH etc. Em seguida, uma cadeia de açúcar é introduzida no Cys desprotegido enquanto o grupo protetor, tal como StBu, ainda é mantido. Uma cadeia de açúcar diferente pode, então, ser introduzida no Cys tornando desprotegido por desproteção do grupo StBu etc. O Cys para introduzir na primeira cadeia de açúcar e o Cys para a introdução na segunda cadeia de açúcar podem ser um ou mais.

[00122] A desproteção do grupo StBu pode ser realizada submetendo a uma reação com um agente redutor tal como sal de cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), ditiotreitol (DTT) e tributilfosfina. A reação acima pode ser realizada normalmente a 0 a 80 °C, de preferência a entre 5 e 60 °C, e ainda mais preferivelmente a entre 10 e 35 °C. De um modo preferido, o tempo de reação é, normalmente, aproximadamente 30 minutos a 5 horas. Após a conclusão da reação, este pode ser purificado por um método bem conhecido (por exemplo, cromatografia de coluna líquida de alta eficiência (CLAE)) conforme apropriado.

[00123] Quando um ligante é para ser adicionado na sequência de aminoácidos do polipeptídeo glicosilado, um ligante pode ser inserido na posição preferida do polipeptídeo sintetizado por, por exemplo, utilizando um ligante protegido com um grupo protetor lipofílico, em vez do aminoácido protegido com um grupo protetor lipofílico, durante o processo de síntese em fase sólida. Em seguida, por reação de um complexo haloacetilado de cadeia de açúcar derivado com o peptídeo que compreende um Cys desprotegido obtido acima, a cadeia de açúcar é feita reagir com o grupo tiol do Cys desprotegido e ligado ao peptídeo. A reação acima pode ser realizada em um tampão de fosfato, um tampão de tris-cloridrato, um tampão de citrato, uma solução ou mistura destes, normalmente, de 0 a 80°C, de preferência a entre 10 e 60°C, e ainda mais preferivelmente a entre 15 e 35°C. De preferência, o tempo de reação é, geralmente, 10 minutos a 24 horas e, preferencialmente, normalmente, aproximadamente 30 minutos a 5 horas. Após a conclusão da reação, este pode ser purificado por um método bem conhecido (por exemplo, CLAE), conforme apropriado.

[00124] O derivado de cadeia de açúcar de complexo haloacetilado é, por exemplo, um composto que tem o grupo hidroxila ligado ao carbono na posição 1 de uma cadeia de açúcar de complexo ligado a asparagina substituído por - NH-(CH2)a-(CO)-CH2X (em que X indica um átomo de halogênio, e a indica um inteiro que não é limitado desde que não iniba a função de ligante alvo, mas é, de preferência, um número inteiro de 0 a 4).

[00125] Especificamente, o derivado de cadeia de açúcar de complexo haloacetilado e o peptídeo contendo Cis são feitos reagir em um tampão de fosfato à temperatura ambiente. Após a conclusão da reação, o polipeptídeo glicosilado substituído por um Cis glicosilado pode ser obtido por purificação com CLAE.

[00126] A reação também pode ser realizada em uma solução mista de um solvente orgânico tal como DMSO, DMF, metanol, acetonitrila e com o tampão anterior. Neste caso, o solvente orgânico pode ser adicionado ao tampão anterior a uma razão no intervalo de 0 a 99% (v/v). Uma vez que a adição de tal solvente orgânico pode melhorar a solubilidade contra a solução de reação, esta é preferida para um peptídeo compreendendo Cys desprotegido com baixa solubilidade contra o tampão.

[00127] A reação também pode ser realizada em um solvente orgânico tal como DMSO, DMF, metanol e acetonitrila ou uma solução mista destes. Neste caso, prefere-se ser efetuada na presença de uma base. Exemplos de base podem incluir DIPEA, trietilamina, piridina, 2,4,6-colidina e semelhantes.

[00128] A reação também pode ser realizada em uma solução mista de guanidina ou ureia adicionados à solução tampão. Cloridrato de guanidina ou ureia podem ser adicionados ao tampão acima, de modo que a concentração final será de 1 M a 8 M. Isto é preferido, uma vez a adição de cloridrato de guanidina ou ureia também pode melhorar a solubilidade do peptídeo com baixa solubilidade contra o tampão.

[00129] Além disso, a reação também pode ser realizada com adição de sal de cloridrato tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) ou ditiotreitol (DTT) ao tampão, a fim de evitar a formação de um dímero de peptídeos compreendendo Cis desprotegido através de uma ligação de dissulfeto. TCEP ou DTT podem ser adicionados ao tampão, de modo que a concentração final seja de 10 μM a 10 mM.

[00130] Além disso, após a cadeia de açúcar ser ligada ao Cys alvo, o grupo protetor de Cys protegido com Acm e semelhantes é desprotegido. Quando o grupo protetor é um grupo Acm, a desproteção pode ser realizada permitindo a reação com iodo, acetato de mercúrio (II), nitrato de prata (I) ou acetato de prata (I) e semelhantes, em água, metanol, ácido acético ou uma solução mista destes.

[00131] A reação acima pode ser realizada normalmente a 0 a 80°C, de preferência, entre 5 e 60°C, e ainda mais preferivelmente a entre 10 e 35°C. De um modo preferido, o tempo de reação é, normalmente, cerca de 5 minutos a 24 horas. Após a conclusão da reação, esta pode ser purificada por um método bem conhecido (por exemplo, CLAE), conforme o caso, após o tratamento com DTT ou ácido clorídrico e semelhantes.

[00132] Deste modo, um polipeptídeo glicosilado possuindo a posição desejada substituída por um Cis glicosilado pode ser obtido. Além disso, conforme descrito abaixo, o polipeptídeo glicosilado purificado, como tal, forma uma ligação de dissulfeto entre Cys desprotegido.

[00133] Por outro lado, quando a fabricação de um polipeptídeo glicosilado tendo múltiplas cadeias de açúcar contendo ácido siálico, tal como cadeias de açúcar de disialo ou monosialo, na sequência do peptídeo, uma cadeia de açúcar contendo ácido siálico tendo o grupo carboxila do ácido siálico na cadeia de açúcar a ser introduzida protegido com um grupo benzil (Bn), um grupo alil, um grupo difenilmetil, um grupo fenacil e semelhantes pode ser empregado.

[00134] Quando uma cadeia de açúcar tendo o grupo carboxila do ácido siálico protegido é introduzida, um passo de desproteção do grupo protetor do ácido siálico pode ser realizado após o passo de formação de uma ligação de dissulfeto no polipeptídeo glicosilado. Deste modo, por proteção do grupo carboxila do ácido siálico com um grupo benzil e semelhantes, o passo de separação/purificação por CLAE, etc., no passo de fabricação será facilitado. A proteção do grupo carboxila do ácido siálico irá também permitir a prevenção do desprendimento de um ácido siálico ácido-lábil.

[00135] A reação de proteção do grupo carboxila do ácido siálico na cadeia de açúcar pode ser realizada por um método bem conhecido aos versados na técnica. Além disso, no polipeptídeo glicosilado que se formou uma ligação de dissulfeto, o grupo protetor do grupo carboxila do ácido siálico pode ser desprotegido por hidrólise sob condições básicas. A reação acima pode ser realizada normalmente a 0 a 50°C, de preferência a entre 0 e 40°C, e ainda mais preferivelmente a entre 0 e 30°C. De preferência, o tempo de reação é, normalmente, de cerca de 5 minutos a 5 horas. Após a conclusão da reação, esta pode ser purificada por um método bem conhecido (por exemplo, CLAE), conforme o caso, após neutralização por um ácido fraco, tal como ácido fosfórico ou ácido acético.

[00136] Além disso, o polipeptídeo glicosilado criado pelos métodos A e B acima pode formar uma ponte de dissulfeto entre Cis com um método bem conhecido aos versados na técnica utilizando ar e/ou oxigênio, iodo, DMSO, uma mistura de glutationa oxidada e reduzida, ferricianeto de potássio, reagente de Ellman (ácido 5,5'- ditiobis(2-nitrobenzóico)), trifluoroacetato de tálio (III), sulfóxido alquiltriclorosilano e semelhantes.

[00137] Quando se forma uma ligação de dissulfeto entre Cys-Cys, Cys em um polipeptídeo glicosilado que não é desejado formar uma ligação de dissulfeto é protegido por um grupo protetor. Um grupo protetor estável sob condições de oxidação, tal como Acm, tBu, 4-metoxibenzil, 4- metilbenzil e semelhantes, pode ser utilizado como um tal grupo protetor.

[00138] No método B, a formação de uma ligação de dissulfeto pode também ser realizada antes da introdução da cadeia de açúcar. No entanto, quando um grupo protetor é introduzido no Cys para formar uma ligação de dissulfeto, o passo de desproteção irá preceder o passo de formação da ligação de dissulfeto. (Atividade)

[00139] O polipeptídeo glicosilado da presente invenção tem atividade de interferon β. "Atividade de Interferon β", aqui, significa ter, pelo menos, uma atividade entre atividades bem conhecidas, tal como a ação imunorreguladora, atividade antiviral e atividade antitumoral.

[00140] Por exemplo, a atividade de interferon β do polipeptídeo glicosilado pode ser medida com o ensaio de medição da atividade antitumoral descrito nos Exemplos 11 a 14 e semelhantes. O ensaio de medição da atividade antitumoral pode ser examinado por, por exemplo, administração subcutânea o objeto polipeptídeo glicosilado a ratos que possuem um tumor e medindo o volume do tumor ao longo do tempo. (Composição Farmacêutica)

[00141] Uma composição farmacêutica contendo o polipeptídeo glicosilado da presente invenção como o ingrediente ativo é eficaz para a terapia ou prevenção de uma doença relacionada com o interferon β. Exemplos de uma doença relacionada com interferon incluem β tumor cerebral, melanoma maligno cutâneo, hepatite B crônica ativa, hepatite C crônica, panencefalite esclerosante subaguda, cirrose compensada C, esclerose múltipla e semelhantes. O tumor cerebral acima inclui glioblastoma, meduloblastoma, astrocitoma e semelhantes. A composição farmacêutica contendo o polipeptídeo glicosilado da presente invenção como o ingrediente ativo é eficaz para a terapia ou prevenção da doença acima.

[00142] Além disso, o objeto da administração da composição farmacêutica contendo o polipeptídeo glicosilado da presente invenção como o ingrediente ativo significa qualquer indivíduo biológico, de preferência, um animal, mais preferivelmente um mamífero, e ainda mais preferivelmente um indivíduo humano.

[00143] A composição farmacêutica acima é aquela formulada em uma forma de composição farmacêutica comum com um diluente ou um excipiente tal como enchimentos, expansores, ligantes, agentes molhantes, desintegrantes, tensoativos, lubrificantes e semelhantes utilizados vulgarmente. Exemplos de tais composições farmacêuticas incluem comprimidos, pílulas, pós, líquidos, suspensões, emulsões, grânulos, cápsulas, supositórios, soluções oftálmicas, inalantes, injeções e similares.

[00144] A quantidade do polipeptídeo glicosilado da presente invenção contida na composição farmacêutica não está particularmente limitada e pode ser selecionada de forma adequada entre um amplo intervalo. É, normalmente, preferido conter 1 a 90% em peso, mais preferivelmente conter 1 a 70%, em peso, do polipeptídeo glicosilado da presente invenção na composição farmacêutica.

[00145] A composição farmacêutica contendo o polipeptídeo glicosilado da presente invenção como o ingrediente ativo pode ainda conter outros ingredientes ativos, ou pode também ser empregado em combinação com uma composição farmacêutica contendo outros ingredientes ativos. Além disso, a composição farmacêutica contendo o polipeptídeo glicosilado da presente invenção como o ingrediente ativo pode compreender o polipeptídeo glicosilado como um seu sal farmaceuticamente aceitável, ou pode também compreender um ou mais outros polipeptídeos glicosilados diferentes dos da presente invenção como o ingrediente ativo. Ele também pode ser empregado em combinação com um ou mais composições farmacêuticas contendo o polipeptídeo glicosilado diferente do da presente invenção como o ingrediente ativo. Além disso, outros ingredientes que podem estar contidos na composição farmacêutica podem incluir um veículo farmaceuticamente aceitável e análogos conhecidos aos versados na técnica.

[00146] O método de administração da composição farmacêutica de acordo com a presente invenção não é particularmente restringido, e é administrado por um método que está de acordo com várias formulações de fármacos, a idade do paciente, sexo, estado de doença e outras condições. Um exemplo do método de administração, no caso de comprimidos, pílulas, líquidos, suspensões, emulsões, grânulos, e cápsulas inclui a administração oral. Além disso, no caso de injeções, pode ser por via intravenosa, por via intramuscular, intradérmica, subcutânea ou via intraperitoneal, administrado sozinho ou em uma mistura com substituições de fluidos normais, tal como glicose e aminoácidos. No caso dos supositórios, é administrado por via retal. No caso das soluções oftálmicas, é aplicado ao tecido do olho, tal como o saco conjuntivo. No caso dos inalantes, é aplicado ao tubo bronquial ou os pulmões.

[00147] A dosagem da composição farmacêutica anterior pode ser selecionada como apropriada para o uso de acordo com, a idade do paciente, sexo, extensão da doença e outras condições. Por exemplo, a dosagem pode ser de 0,001 a 100 nmol, de um modo preferido 0,01 a 10 nmol, e mais preferencialmente 0,01 a 1 nmol do polipeptídeo glicosilado da presente invenção por cada 1 kg de peso corporal.

[00148] A frequência de administração da composição farmacêutica acima pode ser selecionada como apropriado para o uso de acordo com, a idade do paciente, sexo, a extensão da doença e outras condições. Por exemplo, uma frequência de administração que é três vezes/dia, duas vezes/dia, uma vez/dia ou, ainda mais, uma frequência até menor dependendo da sua estabilidade em sangue (tal como uma vez/semana ou uma vez/mês) também pode ser selecionado. A frequência de administração da composição farmacêutica acima é, preferivelmente, uma vez ou menos/dia.

[00149] A cadeia de açúcar adicionada ao polipeptídeo glicosilado da presente invenção é facilmente degradada pelo sistema metabólico no corpo. Além disso, em um aspecto da presente invenção, a referida cadeia de açúcar tem uma estrutura que existe como ligado a um glicopeptídeo (ou uma glicoproteina) in vivo. Por conseguinte, uma composição farmacêutica que compreende o polipeptídeo glicosilado da presente invenção, e o polipeptídeo glicosilado acima mencionado como ingredientes ativos, tem vantagens, tal como não apresentando efeitos colaterais ou antigenicidade, mesmo quando administrado in vivo, e causando menos preocupações em perder o efeito do fármaco devido a reações alérgicas ou à produção de anticorpos. Além disso, o polipeptídeo glicosilado da presente invenção é também extremamente útil no que diz respeito a permitir o fornecimento em larga escala fácil e estável, e fornecimento de medicamentos de alta qualidade com uma qualidade estável.

[00150] Os termos aqui utilizados devem ser empregados para descrever modalidades particulares, e não pretende limitar a invenção.

[00151] O termo "compreendendo", conforme aqui utilizado, a menos que o conteúdo indique claramente para ser entendido de outro modo, pretende a presença dos artigos descritos (tal como componentes, passos, elementos e números), e não exclui a presença de outros itens (tal como componentes, etapas, elementos e números).

[00152] A menos que de outro modo definido, todos os termos aqui utilizados (incluindo termos técnicos e científicos) têm os mesmos significados que os amplamente reconhecidos pelos versados na técnica da tecnologia para a qual a presente invenção pertence. Os termos utilizados aqui, a menos que explicitamente definido em contrário, devem ser interpretados como tendo significados consistentes com os significados aqui e nas áreas técnicas afins, e não devem ser interpretados como tendo significados idealizados ou excessivamente formais.

[00153] Os termos, tal como primeiro e segundo, por vezes, são empregados para expressar vários elementos e deve-se reconhecer que esses elementos não são para serem limitados por estes termos. Estes termos são utilizados unicamente para o propósito de discriminar um elemento de um outro e é, por exemplo, possível descrever um primeiro elemento como um segundo elemento, e da mesma forma, descrever um segundo elemento como um primeiro elemento, sem nos afastarmos do escopo da presente invenção.

[00154] A presente invenção será agora descrita mais especificamente pelos Exemplos. No entanto, o presente invento pode ser concretizado através de várias formas, e não deve ser interpretado como sendo limitado aos Exemplos aqui descritos.

EXEMPLOS O sistema de notação dos fragmentos de polipeptídeo aqui será descrito mais abaixo.

[00155] Por exemplo, IFN 1-78 (S1Thi-C30Acm)MESNA indica um fragmento de peptídeo que possui uma sequência peptídica equivalente a 1a - 78a sequência de aminoácidos na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1, em que a primeira serina é substituída por cisteína tendo uma estrutura de tiazolidina, a cadeia lateral da 30a cisteína é protegida por Acm e o C-terminal está alquiltioesterificado por 2-mercaptoetanossulfonato (MESNA) na sua sequência peptídica.

[00156] Além disso, IFN 1-78 (S1Thi-C30Acm-M35C-Q48C) MESNA indica um fragmento de peptídeo que possui uma sequência peptídica equivalente a 1a - 78a sequência de aminoácidos na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1, em que a primeira serina é substituída por cisteína tendo uma estrutura de tiazolidina, a cadeia lateral da 30a cisteína é protegida por Acm, a 35a metionina é substituída por cisteína, a 48a glutamina é substituída por cisteína, e o terminal-C é alquiltioesterificado por 2-mercaptoetanossulfonato (MESNA) na sua sequência peptídica.

[00157] Do mesmo modo, IFN 1-78 (S1Thi-C30Acm- Q48C)Ethan indica um fragmento de peptídeo que possui uma sequência peptídica equivalente a 1a - 78a sequência de aminoácidos na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1, em que a primeira serina é substituída por cisteína tendo uma estrutura de tiazolidina, a cadeia lateral da 30a cisteína é protegida por Acm, a 48a glutamina é substituída por cisteína, e o C-terminal é alquiltioesterificado por etantiol na sua sequência peptídica.

[00158] Além disso, IFN 79-165 (N79C-K107C-R112C-R123C- C140Acm) indica um fragmento de peptídeo que possui uma sequência peptídica equivalente à 79a - 165a sequência de aminoácidos na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1, em que a 79a asparagina é substituída por cisteína, a 107a lisina é substituída por cisteína, a 112a lisina é substituída por cisteína, a 123a arginina é substituída por cisteína e a 140a cisteína está protegida por um grupo Acm na sua sequência peptídica. O sistema de notação de polipeptídeos glicosilados será descrito abaixo.

[00159] Por exemplo, 2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C- R112C-R123C) indica que cada um dos aminoácidos de serina na posição 1, glutamina na posição 48, asparagina na posição 79, lisina na posição 107, arginina na posição 112 e arginina na posição 123 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1 é substituído por Cys, e a estrutura da cadeia de açúcar de α2-6 disialo mostrada na substituição.

[00160] Além disso, 2-3diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C- R112C-R123C) indica que cada um dos aminoácidos de serina na posição 1, glutamina na posição 48, asparagina na posição 79, lisina na posição 107, arginina na posição 112 e arginina na posição 123 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1 está substituído por Cys, e a estrutura da cadeia de açúcar de α2-3 disialo mostrada na seguinte Fórmula (2) está ligada a Cys em cada substituição.

[00161] Além disso, 2-6 monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C- R112C-R123C) indica que cada um dos aminoácidos de serina na posição 1, glutamina na posição 48, asparagina na posição 79, lisina na posição 107, arginina posição 112 e arginina na posição 123 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1 está substituído por Cys, e a estrutura da cadeia de açúcar de α2-6 monoSialo mostrada na seguinte fórmula (5) ou (6) está ligada a Cys em cada substituição.

[00162] Além disso, 2-6 trisialo(S1C-Q48C-N79C-K107C- R112C-R123C) indica que cada um dos aminoácidos de serina na posição 1, glutamina na posição 48, asparagina na posição 79, lisina na posição 107, arginina posição 112 e arginina na posição 123 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1 está substituído por Cys, e a estrutura da cadeia de açúcar de α-2-6 trisialo sialo mostrado na seguinte Fórmula (3) está ligada a Cys em cada substituição.

[00163] Além disso, 2-6 tetraSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C- R112C-R123C) indica que cada um dos aminoácidos de serina na posição 1, glutamina na posição 48, asparagina na posição 79, lisina na posição 107, arginina posição 112 e arginina na posição 123 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1 está substituído por Cys, e a estrutura da cadeia de açúcar de α2-6 tetrasialo substituição

Fórmula (4)

[00164] A estrutura de uma estrutura de cadeia de açúcar ligada a Cys é mostrada na seguinte fórmula (14) com cadeia de açúcar de α2-6 disialo como um exemplo. Na fórmula a seguir, linhas de onda indicam que desenhos de aminoácidos adjacentes ligados por ligações peptídicas à cisteína desenhada na borda direita da fórmula seguinte são omitidos.

[00165] "DiSialo" significa uma cadeia de açúcar de disialo, "monoSialo" significa uma cadeia de açúcar de monoSialo, "trisialo" significa uma cadeia de açúcar de trisialo e "tetraSialo" significa uma cadeia de açúcar de tetrasialo.

[00166] Além disso, 2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79-K107C- R112C-R123C) indica que cada um dos aminoácidos de serina na posição 1, glutamina na posição 48, lisina na posição 107, arginina na posição 112, arginina posição 123 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1 está substituído por Cys, e a estrutura da cadeia de açúcar de α2-6 disialo mostrada na seguinte Fórmula (1) está ligada a Cys em cada substituição acima e asparagina na posição 79.

[00167] [Fórmula Química 20]

[00168] Além disso, nos Exemplos seguintes, IFN-β tendo aminoácidos nas posições 4, 5 e 6 substituídos com aminoácidos glicosilados podem estar representando como "IFN-β quádruplo, quíntuplo e sêxtuplo-glicosilada", respectivamente. No presente invento, "um polipeptídeo glicosilado possuindo aminoácidos em 4 posições substituídos com aminoácidos glicosilados" e "IFN-β quádruplo-glicosilado" são sinônimos, e de forma semelhante, "um polipeptídeo glicosilado possuindo aminoácidos em 5 posições substituído por aminoácidos glicosilado" e "um IFN-β quíntuplo glicosilado" são sinônimos, e de forma semelhante, "um polipeptídeo glicosilado tendo aminoácidos em 6 posições substituídas com aminoácidos glicosilados" e "um IFN-β sextuplo- licosilado"são sinônimos. (Exemplo 1) Síntese de Fragmentos de Tioéster (Exemplo 1-1) Síntese de IFN 1-78(S1Thi-C30Acm- Q48C)Ethan (SEQ ID NO. 3)

[00169] A resina amino-PEGA (da Merck & Co., Inc.) (50 μmol) foi adicionada em uma coluna de síntese de fase sólida, ácido 4-hidroximetil-3-metoxifenoxi butírico (HMPB) (125 μmol), tetrafluorborato de O-benzotriazol-1- il-1,1,3,3-tetrametilurônio (TBTU) (125 μmol) e N- etilmorfolina (125μmol) foram dissolvidos em dimetilformamida (DMF) (1,25 mL), e agitou-se à temperatura ambiente durante 4 horas. A resina foi suficientemente lavada com DMF e diclorometano (DCM). Subsequentemente, Fmoc-Trp(Boc)-OH (0,25 mmol), 1- mesitilenossulfonilo-3-nitro-1,2,4-triazol (MSNT) (0,25 mmol) e N-metilimidazol (0,187 mmol) foram dissolvidos em DCM (1,25 mL) e adicionou-se a coluna para a síntese em fase sólida, e, em seguida, agitou-se durante 4 horas.

[00170] A resina foi lavada com DCM e DMF, e o grupo Fmoc foi tratado durante 15 minutos com solução de piperidina/DMF a 20% (2 mL) para permitir a desproteção. Este foi lavado com DMF, e o subsequente alongamento da cadeia peptídica empregou o método mostrado abaixo para condensar, sequencialmente, aminoácidos.

[00171] O aminoácido protegido com um grupo Fmoc ou Boc foi dissolvido em DMF, e a solução foi adicionada à coluna de síntese em fase sólida (0,25 mmol). 0,2 M de óxido de hexafluorofosfato de 1-[bis(dimetilamino)metileno]-5- cloro-1H-3-benzotriazólio (HCTU)/DMF (0,25 mmol) foi adicionado à coluna de síntese em fase sólida e 0,8 M de N-metil-morfolina /DMF (0,50 mmol) ou 0,8 M de 2,6,4- trimetilpiridina/DMF (0,50 mmol) foram adicionados à coluna de síntese em fase sólida. Depois de se agitar à temperatura ambiente durante 15 ou 30 minutos, a resina foi lavada com DMF e o grupo Fmoc foi tratado durante 10 minutos com solução de piperidina/DMF a 20% (2 mL) para permitir a desproteção. Esta operação foi repetida e os aminoácidos foram, sequencialmente, condensados por método de síntese em fase sólida de Fmoc.

[00172] Depois de se lavar a resina obtida com DCM e DMF, uma solução mista de trifluoroetanol e ácido acético (1:1) foram adicionados e o peptídeo protegido foi separado da resina por agitação durante 18 horas à temperatura ambiente. A solução de reação compreendendo o peptídeo protegido foi concentrada sob pressão reduzida, e em seguida secou-se sob pressão reduzida. O peptídeo protegido seco foi dissolvido em DMF (3,0 mL), e depois arrefeceu-se sob atmosfera de nitrogênio a -15 C e -20°C. A esta, etantiol foi adicionado (5,0 mmol), e em seguida, hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxi- trispirrolidinofosfônio (PyBOP) (0,50 mmol), em seguida, di-isopropiletilamina (DIPEA) (0,5 mmol) foram adicionados. Depois de se agitar à temperatura de -15°C a -20°C durante 2 horas, ácido acético (0,8 mL) foi adicionado, e este foi deixado voltar gradualmente à temperatura ambiente. Quando a temperatura voltou para a temperatura ambiente, a solução reacional foi concentrada sob pressão reduzida. Ao resíduo obtido foi adicionado ácido trifluoroacético : água : fenol : tioanisol : triisopropilsilano (= 95:2,5:2,5:2,5:5), e esta foi agitada à temperatura ambiente. Após 2 horas, esta solução foi de novo adicionada a um éter de dietila preparado separadamente e deixou-se precipitar, em seguida, sujeita a separação por centrífuga, e a porção de solução foi removida para se obter um resíduo que compreende a forma de tioéster de peptídeo alvo. Este resíduo obtido foi purificado por CLAE [coluna:SHISEIDO Proteonavi] e, como um resultado da análise de massa por ESI-MS, a massa do composto obtido correspondeu à massa do IFN 1-78(S1Thi- C30Acm-Q48C)Ethan alvo (valor calculado = 9445,8 Da (1,5685 x 10-20g)), valor real = 9445,5 Da (1,5684 x 10- 20g)). (Exemplo 1-2) Síntese de IFN 1-78 (S1Thi-C30Acm-Q48C- S75C)MESNA (SEQ ID NO. 4)

[00173] A resina amino-PEGA (da Merck & Co., Inc.) (50 μmol) foi adicionado em uma coluna de síntese de fase sólida, ácido 3-Fmoc-4-diaminobenzóico (150 μmol), 3-óxido de hexafluorofosfato de 1-[bis (dimetilamino)metileno]-5- cloro-1H-benzotriazólio de (HCTU) (150 μmol), e diisopropiletilamina (300μmol) foram dissolvidos em DMF (1,25 mL), e agitou-se à temperatura ambiente durante 2 horas.

[00174] Depois de se agitar, a resina foi lavada com DMF, o grupo Fmoc foi tratado durante 15 minutos com solução de piperidina/DMF a 20% (2 mL) para permitir a desproteção, e, em seguida, a resina foi lavada com DMF suficientemente. Os aminoácidos foram sequencialmente condensados no alongamento de cadeia peptídica subsequente utilizando o método apresentado abaixo.

[00175] O aminoácido protegido com um grupo Fmoc ou Boc foi dissolvida em DMF, e a solução foi adicionada à coluna de síntese em fase sólida (0,25 mmol). 0,2 M de 3-óxido de hexafluorofosfato de 1-[bis(dimetilamino)metileno]-5- cloro-1H-benzotriazólio (HCTU)/DMF (0,25 mmol) foram adicionados à coluna de síntese em fase sólida e 0,8 M de N-metil morfolina/DMF (0,50 mmol) ou 0,8 M de 2,6,4- trimetilpiridina/DMF (0,50 mmol) foram adicionados à coluna de síntese em fase sólida. Depois de se agitar à temperatura ambiente durante 15 ou 30 minutos, a resina foi lavada com DMF e o grupo Fmoc foi tratado durante 10 minutos com solução de piperidina/DMF a 20% (2 mL) para permitir a desproteção. Esta operação foi repetida, e os aminoácidos foram sequencialmente condensados por método de síntese em fase sólida de Fmoc.

[00176] Depois de se lavar a resina obtida com DMF e DCM, 4-nitrofenila (0,25 mmol) foi dissolvido em DCM, adicionado à coluna de síntese em fase sólida, e, em seguida, agitada à temperatura ambiente durante 30 minutos. Depois de se agitar, a resina foi lavada com DCM e DMF, diisopropiletilamina (2,5 mmol) foi adicionado, e agitado à temperatura ambiente durante 15 minutos. Depois de se lavar a resina obtida com DMF e DCM, ácido trifluoroacético : água: fenol : tioanisol : triisopropilsilano (= 95:2,5:2,5:2,5:5) foi adicionado, e esta foi agitada à temperatura ambiente. Após 5 horas, a resina foi lavada suficientemente com uma solução tampão a pH 7,2 compreendendo 2-mercaptoetanossulfonato de sódio (solução de cloridrato de guanidina 8 M, solução de ácido fosfórico 0,1 M e 2-mercaptoetanossulfonato de sódio300 M). O tampão acima foi adicionado à resina, e agitou-se à temperatura ambiente durante 12 horas.

[00177] Após agitação, a solução obtida foi purificada por CLAE [coluna: SHISEIDO Proteonavi] e como um resultado da análise de massa por ESI-MS, a massa do composto obtido correspondeu à massa do IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C- N75C)MESNA alvo (valor calculado = 9540,9 Da (1,5843x10- 20g), valor real = 9541,6 Da (1,5844 x10-20g)). (Exemplo 1-3) Síntese de Outros Fragmentos de Tioéster

[00178] Os fragmentos de tioéster mostrados abaixo foram sintetizados de modo semelhante ao (Exemplo 1-1). IFN 1-78(S1Thi-N3C-C30Acm-Q48C)Ethan (SEQ ID NO. 5) IFN 1-78(S1Thi-E28C-C30Acm-Q48C-R70C)Ethan (SEQ ID NO. 6)

[00179] Os seguintes fragmentos de tioéster foram sintetizado de modo semelhante ao (Exemplo 1-2). IFN 1-78(C30Acm)MESNA (SEQ ID NO. 7) IFN 1-78(S1Thi-C30Acm)MESNA (SEQ ID NO. 8) IFN 1-78(F7C-C30Acm)MESNA (SEQ ID NO. 9) IFN 1-78(N24C-C30Acm)MESNA (SEQ ID NO. 10) IFN 1-78(G25C-C30Acm)MESNA (SEQ ID NO. 11) IFN 1-78(E28C-C30Acm)MESNA (SEQ ID 12 NO.) IFN 1-78(C30Acm-K32C)MESNA (SEQ ID NO. 13) IFN 1-78(C30Acm-M35C)MESNA (SEQ ID NO. 14) IFN 1-78(C30Acm-D38C)MESNA (SEQ ID NO. 15) IFN 1-78(C30Acm-E41C)MESNA (SEQ ID NO. 16) IFN 1-78(C30Acm-Q48C)MESNA (SEQ ID NO. 17) IFN 1-78(C30Acm-R70C)MESNA (SEQ ID NO. 18) IFN 1-78(C30Acm-S75C)MESNA (SEQ ID NO. 19) IFN 1-78(C30Acm-E41C-S75C)MESNA (SEQ ID NO. 20) IFN 1-78(C30Acm-E42C-S75C)MESNA (SEQ ID NO. 21) IFN 1-78(C30Acm-Q45C-S75C)MESNA (SEQ ID NO. 22) IFN 1-78(C30Acm-L46C-S75C)MESNA (SEQ ID NO. 23) IFN 1-78(C30Acm-Q47C-S75C)MESNA (SEQ ID NO. 24) IFN 1-78(C30Acm-Q48C-S75C)MESNA (SEQ ID NO. 25) IFN 1-78(C30Acm-F49C-S75C)MESNA (SEQ ID NO. 26) IFN 1-78(C30Acm-Q50C-S75C)MESNA (SEQ ID NO. 27) IFN 1-78(S1Thi-Y29C-C30Acm-Q48C)MESNA (SEQ ID NO. 28) IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-M35C-Q48C)MESNA (SEQ ID NO. 29) IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-E41C-Q48C)MESNA (SEQ ID 30 NO.)

[00180] Os resultados de espectrometria de massa dos compostos obtidos no (Exemplo 1-1), (Exemplo 1-2), e (Exemplo 1-3) são apresentados na (Tabela 1) abaixo. [Tabela 1] Exemplo Composto Valor Teórico (PM) Valor Real (PM) Método de Ionização

(Exemplo 2) Síntese de Fragmentos de Peptídeo (Exemplo 2-1) Síntese de IFN 79-165(N79C-K107C-R112C- R123C-C140Acm) (SEQ ID NO. 31)

[00181] A resina amino-PEGA (da Merck & Co., Inc.) (50 μmol) foi adicionada em uma coluna de síntese de fase sólida, ácido 4-hidroximetil-3-metoxifenoxibutírico (HMPB) (125 μmol), tetrafluoroborato de O-benzotriazol-1-il- 1,1,3,3-tetrametilurônio (TBTU) (125 pmol) e N- etilmorfolina (125μmol) foram dissolvidos em DMF (1,25 mL) e agitou-se à temperatura ambiente durante 4 horas. A resina foi suficientemente lavada com DMF e DCM. Subsequentemente, Fmoc-Asn(Trt)-OH (0,25 mmol), 1- mesitilenossulfonil-3-nitro-1,2,4-triazol (MSNT) (0,25 mmol) e N-metilimidazol (0,187 mmol) foram dissolvidos em DCM (1,25 mL) e colocados na coluna de síntese em fase sólida, e, em seguida, agitou-se durante 4 horas.

[00182] Depois de se agitar, a resina foi lavada com DCM e DMF e o grupo Fmoc foi tratado durante 15 minutos com solução de piperidina/DMF a 20% (2 mL) para permitir a desproteção. Após lavagem com DMF, o subsequente alongamento da cadeia peptídica empregou o método mostrado abaixo para, sequencialmente, condensar aminoácidos.

[00183] O aminoácido protegido com um grupo Fmoc ou Boc foi dissolvido em DMF e a solução foi adicionada à coluna de síntese em fase sólida (0,25 mmol). 0,2 M de 3-óxido de hexafluorofosfato de 1-[bis(dimetilamino)metileno]-5- cloro-1H-benzotriazólio (HCTU)/DMF (0,25 mmol) foram adicionados à coluna de síntese em fase sólida e 0,8 M de N-metilmorfolina/DMF (0,50 mmol) ou 0,8 M de 2,6,4- trimetilpiridina/DMF (0,50 mmol) foram adicionados à coluna de síntese em fase sólida. Depois de se agitar à temperatura ambiente durante 15 ou 30 minutos, a resina foi lavada com DMF e o grupo Fmoc foi tratado durante 10 minutos com solução de piperidina/DMF a 20% (2 mL) para permitir a desproteção. Esta operação foi repetida, e os aminoácidos foram sequencialmente condensados pelo método de síntese em fase sólida de Fmoc.

[00184] Para a resina obtida, foi adicionado ácido trifluoroacético:água:fenol:tioanisol:triisopropilsilano (= 95:2,5:2,5:2,5:5), e esta foi agitada à temperatura ambiente. Após 3 horas, esta solução foi de novo adicionada a um éter de dietila preparado separadamente e deixou-se precipitar, em seguida, sujeita a separação centrífuga, e a porção de solução foi removida para se obter um resíduo que compreende o peptídeo alvo. Este resíduo obtido foi purificado com CLAE de fase inversa [coluna: SHISEIDO Proteonavi] e, como um resultado da análise de massa por ESI-MS, a massa do composto obtido correspondeu à massa de IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-R123C- C140Acm) (valor calculado = 10499,1 Da (1,7434x10-20g), valor real = 10498,1 Da (1,7432x10-20g)). (Exemplo 2-2) Síntese de Outros Fragmentos de Peptídeos

[00185] Os seguintes fragmentos de peptídeos foram sintetizados de modo semelhante ao (Exemplo 2-1). IFN 79-165(N79C-C140Acm) (SEQ ID NO. 32) IFN 79-165(N79C-K107C-C140Acm) (SEQ ID NO. 33) IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-C140Acm) (SEQ ID NO. 34) IFN 79-165(N79C-K107C-E136C-C140Acm) (SEQ ID NO. 35) IFN 79-165(N79C-T99C-K107C-R112C-C140Acm) (SEQ ID NO. 36) IFN 79-165(N79C-E103C-K107C-E136C-C140Acm) (SEQ ID NO. 37) IFN 79-165(N79C-E106C-K107C-E136C-C140Acm) (SEQ ID NO. 38) IFN 79-165(N79C-K107C-D109C-E136C-C140Acm) (SEQ ID NO. 39) IFN 79-165(N79C-K107C-L115C-E136C-C140Acm) (SEQ ID NO. 40) IFN 79-165(N79C-K107C-L119C-E136C-C140Acm) (SEQ ID NO. 41) IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-H130C-C140Acm) (SEQ ID NO. 42) IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-E136C-C140Acm) (SEQ ID NO. 43) IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-H139C-C140Acm) (SEQ ID NO. 44) IFN 79-165 (N79C-K107C-R112C-C140Acm-R164C) (SEQ ID NO. 45)

[00186] Os resultados de espectrometria de massa dos compostos obtidos enom (Exemplo 2-1) e (2-2 Exemplo) são apresentados na (Tabela 2) abaixo. [Tabela 2] Valor Teórico (PM) Valor Real (PM) Método de Ionização Exemplo Composto

(Exemplo 3) Síntese de IFN-β de disialo glicosilado (Exemplo 3-1) Síntese de 2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C- K107C-R112C-R123C) (SEQ ID NO. 46)

[00187] IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C)Ethan (SEQ ID NO. 3) e IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-R123C- C140Acm) (SEQ ID NO. 31) foram dissolvidos em uma solução tampão a pH 7,2 compreendendo ácido 4-mercaptofenilacético (8 M de solução de cloridrato de guanidina, solução de ácido fosfórico a 0,1 M, e ácido 4-mercaptofenilacético 125 mM), e deixada à temperatura ambiente. Após 24 horas, a solução de ditiotreitol (2 M de ditiotreitol) foi adicionada à solução de reação e deixada à temperatura ambiente durante 3 horas. Após a conclusão da reação, a solução de metoxiamina (1 M de cloridrato de metoxiamina) e solução de ácido clorídrico (ácido clorídrico 1 M e cloridrato de guanidina 8 M) foram adicionados à solução, o pH foi ajustado a 4,0, e, em seguida, deixada à temperatura ambiente durante 24 horas. A solução após a reação ter terminado foi desmineralizada por CLAE de fase inversa [coluna: SHISEIDO Proteonavi] e liofilizada.

[00188] O produto purificado em bruto obtido foi dissolvido em uma solução tampão a pH 8,5 (solução de cloridrato de guanidina 8 M e 0,1 M de tris- hidroximetilaminometano), a cadeia de açúcar de disialo bromoacetilada representada pela seguinte fórmula (7) (5 equivalentes) foi adicionada e deixada por 1 hora.

Fórmula (7)

[00189] Após a conclusão da reação, a solução de mercaptoetanossulfonato de sódio (mercaptoetanossulfonato de sódio 200 mM) foi adicionada e deixada à temperatura ambiente durante 30 minutos. A solução após a reação ter terminado foi desmineralizada por CLAE de fase inversa [coluna: SHISEIDO Proteonavi] e liofilizada.

[00190] O produto bruto purificado obtido foi dissolvido em solução de acetato de prata (60 mM de acetato de prata, 7,5 M de ureia e 875 mM de ácido acético), e deixado à temperatura ambiente durante 4 horas. Após a reação, foi adicionada uma solução de ditiotreitol (2 M de ditiotreitol). Para o reagente, foi adicionada uma solução tampão a pH 8,5 (8 M de cloridrato de guanidina e 0,1 M de tris-hidroximetilaminometano) e desmineralizada por CLAE [coluna: SHISEIDO Proteonavi] e liofilizada.

[00191] O liofilizado obtido foi dissolvido em uma solução tampão a pH 8,5 (solução de cloridrato de guanidina 8 M e 0,1 M de tris-hidroximetilaminometano), e deixada à temperatura ambiente durante 30 minutos. A solução foi substituída sob condições de refrigeração (4°C) a solução de cloridrato de guanidina diluída (4,5 M cloridrato de guanidina e 0,1 M de tris- hidroximetilaminometano). À solução substituída foi adicionada solução de sulfato de cobre (300 mM de sulfato de cobre (II) penta-hidrato), e deixada durante 4 horas sob condições de refrigeração (4°C). Depois da reação, o ácido etilenodiaminotetraacético (400 mM de ácido etilenodiaminotetraacético) foi adicionado e deixado durante 1 hora sob condições de arrefecimento (4°C). A solução depois da reação foi submetida a substituição durante a noite para solução de ácido acético (solução de ácido acético 10 mM), sob condições de refrigeração (4°C) para remover o agente de desnaturação. A solução depois de dobragem foi purificada por CLAE [coluna: SHISEIDO Proteonavi] e, como um resultado da espectrometria de massa (método de ionização ESI), a massa do composto obtido correspondeu à massa do 2-6 diSialo(S1C-Q48C- N79C- K107C-R112C-R123C) alvo (valor calculado = 33304,8 Da (5,5303x10-20g), valor real = 33303,6 Da (5,5301x10-20g)). (Exemplo 3-2) Síntese de 2-6 diSialo(Q48C-S75C-N79C- K107C-R112C-E136C) (SEQ ID NO. 47)

[00192] IFN 1-78(C30Acm-Q48C-S75C)MESNA (SEQ ID NO. 25) e IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-E136C- C140Acm) (SEQ ID NO. 43 foram dissolvidos em uma solução tampão a pH 7,2 compreendendo ácido 4-mercaptofenilacético (solução de cloridrato de guanidina 8 M, solução 0,1 M de ácido fosfórico e ácido 4-mercaptofenilacético 125 mM), e deixada à temperatura ambiente. Após 24 horas, solução de ditiotreitol (2 M de ditiotreitol) foi adicionada à solução de reação e deixada à temperatura ambiente durante 3 horas. A solução após a reação ter terminado foi desmineralizada por CLAE de fase inversa [coluna: SHISEIDO Proteonavi] e liofilizada.

[00193] A espectrometria de massa (método de ionização ESI) foi realizada com o produto em bruto obtido purificado de forma semelhante ao (Exemplo 3-1). Como resultado, a massa do composto obtido correspondeu à massa do 2-6 diSialo(Q48C-S75C-N79C-K107C-R112C-E136C) alvo (valor calculado = 33331,8 Da (5,5348x10-20g), valor real = 33331,2 Da (5,5347x10-20g)). (Exemplo 3-3) Síntese de 2-3diSialo(S1C-N3C-Q48C-N79C- K107C-R112C) (SEQ ID NO. 48)

[00194] Com IFN 1-78(S1Thi-N3C-C30Acm-Q48C)Ethan (SEQ ID NO. 5) e IFN 79-165(N79C-K107C-R112C- C140Acm) (SEQ ID NO 34.), IFN-β de disialo glicosilado foi sintetizado de modo semelhante ao (Exemplo 3-1), exceto que a cadeia de açúcar de disialo bromoacetilada representada pela seguinte fórmula (8) foi utilizada em alternativa. Como resultado da realização de espectrometria de massa (método de ionização ESI), a massa do composto obtido correspondeu à massa do 2-3 diSialo(S1C-N3C-Q48C-N79C-K107C-R112C) alvo (valor calculado = 33346,9 Da (5,5373x10-20g), valor real = 33346,6 Da (5,5373x10-20g)).

(Exemplo 3-4) Síntese de Outros IFN-β de Disialo Glicosilado

[00195] A síntese dos compostos apresentados abaixo foi realizada com um método semelhante ao (Exemplo 3-1). 2-6 diSialo(S1C-N3C-Q48C-N79C-K107C-R112C) (SEQ ID NO. 49) 2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-T99C-K107C-R112C) (SEQ ID NO. 50) 2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-H130C) (SEQ ID NO. 51) 2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-E136C) (SEQ ID NO. 52) 2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-H139C) (SEQ ID NO. 53) 2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R164C) (SEQ ID NO. 54) 2-6 diSialo(S1C-Y29C-Q48C-N79C-K107C-E136C) (SEQ ID NO. 55) 2-6 diSialo(S1C-M35C-Q48C-N79C-K107C-E136C) (SEQ ID NO. 56) 2-6 diSialo(S1C-E41C-Q48C-N79C-K107C-E136C) (SEQ ID NO. 57) 2-6 diSialo(S1C-Q48C-S75C-N79C-K107C-E136C) (SEQ ID NO. 58) 2-6 diSialo(S1C-E28C-Q48C-R70C-N79C) (SEQ ID NO. 59) 2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C) (SEQ ID NO. 60) 2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C) (SEQ ID NO. 61) 2-6 diSialo(S1C-N3C-Q48C-N79C) (SEQ ID NO. 62) 2-6 diSialo(S1C-N79C-K107C-E136C) (SEQ ID NO 63).

[00196] A síntese dos compostos apresentados abaixo foi realizada com um método semelhante ao (Exemplo 3-2). 2-6 diSialo(E41C-S75C-N79C-E103C-K107C-E136C) (SEQ ID NO. 64) 2-6 diSialo(E41C-S75C-N79C-E106C-K107C-E136C) (SEQ 65) 2-6 diSialo(E41C-S75C-N79C-K107C-D109C-E136C) (SEQ 66) 2-6 diSialo(E41C-S75C-N79C-K107C-R112C-E136C) (SEQ 67) 2-6 diSialo(E41C-S75C-N79C-K107C-L115C-E136C) (SEQ 68) 2-6 diSialo(E41C-S75C-N79C-K107C-L119C-E136C) (SEQ 69) 2-6 diSialo(N24C-N79C-K107C-R112C-E136C) (SEQ ID 2-6 diSialo(G25C-N79C-K107C-E136C-R112C) (SEQ ID 2-6 diSialo(K32C-N79C-K107C-E136C-R112C) (SEQ ID 2-6 diSialo(M35C-N79C-K107C-E136C-R112C) (SEQ ID 2-6 diSialo(D38C-N79C-K107C-E136C-R112C) (SEQ ID 2-6 diSialo(E41C-N79C-K107C-R112C-E136C) (SEQ ID 2-6 diSialo(F7C-N79C-K107C-E136C-R112C) (SEQ ID NO. 2-6 diSialo(Q48C-N79C-K107C-R112C-E136C) (SEQ ID 2-6 diSialo(S75C-N79C-K107C-E136C-R112C) (SEQ ID 2-6 diSialo(E41C-S75C-N79C-K107C-E136C) (SEQ ID NO. 2-6 diSialo(E42C-S75C-N79C-K107C-E136C) (SEQ ID NO. 2-6 diSialo(Q45C-S75C-N79C-K107C-E136C) (SEQ ID NO. 2-6 diSialo(L46C-S75C-N79C-K107C-E136C) (SEQ ID NO. 82) 2-6 diSialo(Q47C-S75C-N79C-K107C-E136C) (SEQ ID NO. 83) 2-6 diSialo(Q48C-S75C-N79C-K107C-E136C) (SEQ ID NO. 84) 2-6 diSialo(F49C-S75C-N79C-K107C-E136C) (SEQ ID NO. 85) 2-6 diSialo(Q50C-S75C-N79C-K107C-E136C) (SEQ ID NO. 86) 2-6 diSialo(N79C-K107C-R112C-E136C) (SEQ ID NO. 87) 2-6 diSialo(E28C-N79C-K107C-E136C) (SEQ ID NO. 88) 2-6 diSialo(M35C-N79C-K107C-E136C) (SEQ ID NO. 89) 2-6 diSialo(R70C-N79C-K107C-E136C) (SEQ ID NO. 90) 2-6 diSialo(S75C-N79C-K107C-E136C) (SEQ ID NO. 91)

[00197] A síntese do composto apresentado abaixo foi realizada com um método semelhante ao (Exemplo 3-3). 2-3 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C) (SEQ ID NO. 92) 2-3 (Exemplo 3-5) Síntese de 2-6 diSialo(S1C-R26C-Q48C- A67C-N79-A88C) (SEQ ID NO. 100) (Exemplo 3-5-A) Síntese de IFN 1-25(S1Thi)tiofenil (SEQ ID NO. 101)

[00198] Resina amino-PEGA (da Merck & Co., Inc.) (50 μmol) foi adicionada em uma coluna de síntese de fase sólida, ácido 4-hidroximetil-3-metoxifenoxi butírico (HMPB) (125μmol), tetrafluoroborato de O-benzotriazol-1-il- 1,1,3,3-tetrametilurônio (TBTU) (125 pmol) e N- etilmorfolina (125μmol) foram dissolvidos em dimetilformamida (DMF) (1,25 mL), e agitou-se à temperatura ambiente durante 4 horas. A resina foi suficientemente lavada com DMF e diclorometano (DCM). Subsequentemente, Fmoc-Trp(Boc)-OH (0,25 mmol), 1-mesitilenossulfonil-3- nitro-1,2,4-triazol (MSNT) (0,25 mmol) e N-metilimidazol (0,187 mmol) foram dissolvidos em DCM (1,25 mL) e adicionou-se a coluna para a síntese em fase sólida, e, em seguida, agitou-se durante 4 horas.

[00199] A resina foi lavada com DCM e DMF, e o grupo Fmoc foi tratado durante 15 minutos com solução de piperidina/DMF a 20% (2 mL) para permitir a desproteção. Este foi lavado com DMF, e o subsequente alongamento da cadeia peptídica empregou o método mostrado abaixo para, sequencialmente, condensar aminoácidos.

[00200] O aminoácido protegido com um grupo Fmoc ou Boc foi dissolvido em DMF, e a solução foi adicionada à coluna de síntese em fase sólida (0,25 mmol). 0,2 M de 3-óxido de hexafluorofosfato de 1-[bis(dimetilamino)metileno]-5-cloro- 1H-benzotriazólio (HCTU)/DMF (0,25 mmol) foram adicionados à coluna de síntese em fase sólida, e 0,8 M de N- metilmorfolina/DMF (0,50 mmol) ou 0,8 M de 2,6,4- trimetilpiridina/DMF (0,50 mmol) foram adicionados à coluna de síntese em fase sólida. Depois de se agitar à temperatura ambiente durante 15 ou 30 minutos, a resina foi lavada com DMF e o grupo Fmoc foi tratado durante 10 minutos com solução de piperidina/DMF a 20% (2 mL) para permitir a desproteção. Esta operação foi repetida, e os aminoácidos foram, sequencialmente, condensados pelo método de síntese em fase sólida de Fmoc.

[00201] Depois de se lavar a resina obtida com DCM e DMF, uma solução mista de trifluoroetanol e ácido acético (1:1) foram adicionados e o peptídeo protegido foi separado da resina por agitação durante 18 horas à temperatura ambiente. A solução de reação compreendendo o peptídeo protegido foi concentrada sob pressão reduzida, e em seguida secou-se sob pressão reduzida. O peptídeo protegido seco foi dissolvido em DMF (2,1 mL), e depois arrefeceu-se sob atmosfera de nitrogênio a -15°C e -20°C. A esta mistura adicionou-se tiofenol como fonte de tiol (0,2 mmol), e em seguida, hexafluorfosfato de benzotriazol-1-il-oxi- trispirrolidino fosfônio (PyBOP) (1,4 mmol), em seguida, di-isopropiletilamina (DIPEA) (0,2 mmol) foram adicionados. Depois de se agitar à temperatura de -15°C a -20°C durante 2 horas, ácido trifluoroacético (0,2 mL) foi adicionado, e este foi deixado voltar gradualmente à temperatura ambiente. Quando a temperatura voltou para a temperatura ambiente, a solução reacional foi concentrada sob pressão reduzida. Ao resíduo obtido foi adicionado ácido trifluoroacético : água: triisopropilsilano (= 92,5:2,5:5), e esta foi agitada à temperatura ambiente. Após 2 horas, esta solução foi de novo adicionada a um éter de dietila preparado separadamente e deixou-se precipitar, em seguida, sujeita a separação centrífuga, e a porção de solução foi removida para se obter um resíduo que compreende a forma de peptídeo de tioéster alvo. Este resíduo obtido foi purificado por CLAE [coluna: SHISEIDO Proteonavi] e, como um resultado da análise de massa por ESI-MS, a massa do composto obtido correspondeu à massa do IFN 1- 25(S1Thi)tiofenil (SEQ ID NO. 101) alvo (valor calculado = 3062,6 Da (5,0855x10-21g), valor real = 3062,5 Da (5,0854x10-21g)). (Exemplo 3-5-B) Síntese de IFN 26-47(R26C-C30Acm) Etantiol (SEQ ID NO. 102)

[00202] Um fragmento de peptídeo foi sintetizado de modo semelhante às operações de (Exemplo 3-5-A). Etantiol foi utilizado como a fonte para IFN 26-47(R26C- C30Acm)Etantiol.

[00203] Como resultado da análise de massa por ESI-MS, o composto sintetizado correspondeu à massa do IFN 26- 47(R26C-C30Acm)Etantiol (SEQ ID NO. 102) alvo (valor calculado = 2844,4 Da (4,7232x10-21g), valor real = 2844,5 Da (4,7234x10-21g)). (Exemplo 3-5-C) Síntese de IFN 48-66(Q48Thi)MESNA (SEQ ID NO. 103)

[00204] Resina amino-PEGA (da Merck & Co., Inc.) (50 μmol) foi adicionada em uma coluna de síntese de fase sólida, ácido 3-Fmoc-4-diaminobenzóico (150 μmol), óxido de hexafluorofosfato de 1-[bis(dimetilamino)metileno]-5-cloro- 1H-benzotriazólio (HCTU) (150 μmol) e diisopropiletilamina (300μmol) foram dissolvidos em DMF (1,25 mL), e agitou-se à temperatura ambiente durante 1 hora.

[00205] Depois de se agitar, a resina foi lavada com DMF, o grupo Fmoc foi tratado durante 15 minutos com solução de piperidina/DMF a 20% (2 mL) para permitir a desproteção, e, em seguida, a resina foi lavada com DMF, suficientemente. Os aminoácidos foram sequencialmente condensados no subsequente alongamento de cadeia peptídica utilizando o método apresentado abaixo.

[00206] O aminoácido protegido com um grupo Fmoc ou Boc foi dissolvido em DMF e a solução foi adicionada à coluna de síntese em fase sólida (0,25 mmol). 0,2 M de 3-óxido de hexafluorofosfato de 1-[bis(dimetilamino)metileno]-5-cloro- 1H-benzotriazólio (HCTU)/DMF (0,25 mmol) foram adicionados à coluna de síntese em fase sólida, e 0,8 M de N- metilmorfolina/DMF (0,50 mmol) ou 0,8 M de 2,6,4- trimetilpiridina/DMF (0,50 mmol) foram adicionados à coluna de síntese em fase sólida. Depois de se agitar à temperatura ambiente durante 15 ou 30 minutos, a resina foi lavada com DMF e o grupo Fmoc foi tratado durante 10 minutos com solução de piperidina/DMF a 20% (2 mL) para permitir a desproteção. Esta operação foi repetida e os aminoácidos foram, sequencialmente, condensados pelo método de síntese em fase sólida de Fmoc.

[00207] Depois de se lavar a resina obtida com DMF e DCM, 4-nitrofenil (1,4 mmol) foi dissolvido em DCM, adicionado à coluna de síntese em fase sólida, e, em seguida, agitado à temperatura ambiente durante 40 minutos. Depois de se agitar, a resina foi lavada com DCM e DMF, diisopropiletilamina (5,0 mmol) dissolvida em solução de DMF foi adicionada, e agitada à temperatura ambiente durante 15 minutos. Depois de se lavar a resina obtida com DMF e DCM, ácido trifluoroacético:água: triisopropilsilano (= 92,5:2,5:5) foi adicionado, e esta foi agitada à temperatura ambiente. Após 2 horas, a resina foi suficientemente lavada com DMF e DCM, e em seguida, a resina foi suficientemente lavada com uma solução tampão a pH 8,5 compreendendo 2-mercaptoetanossulfonato de sódio (solução de cloridrato de guanidina 6 M, solução de ácido 0,2 M fosfórico e 2-mercaptoetanossulfonato de sódio 1 M). O tampão acima foi adicionado à resina e agitou-se, à temperatura ambiente, durante 2 horas. Após agitação, a solução obtida foi purificada por CLAE [coluna: SHISEIDO Proteonavi] e, como um resultado da análise de massa por ESI-MS, a massa do composto obtido correspondeu à massa do IFN 48-66(Q48Thi)MESNA (SEQ ID NO. 103) alvo (valor calculado = 2413,8 Da (4,0082x10-21g), valor real = 2413,9 Da (4,0083x10-21g)). (Exemplo 3-5-D) Síntese de IFN 67-87(A67Thi,N79) tiofenil de disialo glicosilada (SEQ ID NO. 104)

[00208] Resina amino-PEGA (da Merck & Co., Inc.) (50 μmol) foi adicionado em uma coluna de síntese de fase sólida, ácido 3-Fmoc-4-diaminobenzóico (150 μmol), óxido de hexaflurofosfato de 1-[bis(dimetilamino)metileno]-5-cloro- 1H-benzotriazólio (HCTU) (150 μmol) e diisopropiletilamina (300μmol) foram dissolvidos em DMF (1,25 mL), e agitou-se à temperatura ambiente durante 1 hora.

[00209] Depois de se agitar, a resina foi lavada com DMF, o grupo Fmoc foi tratado durante 15 minutos com solução de piperidina/DMF a 20% (2 mL) para permitir a desproteção, e, em seguida, a resina foi lavada com DMF, suficientemente. Os aminoácidos foram sequencialmente condensados no subsequente alongamento da cadeia peptídica utilizando o método apresentado abaixo.

[00210] O aminoácido protegido com um grupo Fmoc ou Boc foi dissolvido em DMF e a solução foi adicionada à coluna de síntese em fase sólida (0,25 mmol). 0,2 M de 3-óxido de hexafluorofosfato de 1-[bis(dimetilamino)metileno]-5-cloro- 1H-benzotriazólio (HCTU)/DMF (0,25 mmol) foram adicionados à coluna de síntese em fase sólida, e 0,8 M de N- metilmorfolina/DMF (0,50 mmol) ou 0,8 M de 2,6,4- trimetilpiridina/DMF (0,50 mmol) foram adicionados à coluna de síntese em fase sólida. Depois de se agitar à temperatura ambiente durante 15 ou 30 minutos, a resina foi lavada com DMF e o grupo Fmoc foi tratado durante 10 minutos com solução de piperidina/DMF a 20% (2 mL) para permitir a desproteção. Esta operação foi repetida, e os aminoácidos foram sequencialmente condensados pelo método de síntese em fase sólida de Fmoc.

[00211] No peptídeo de 8 resíduos obtido, o grupo Fmoc foi desprotegido por tratamento com solução de piperidina/DMF a 20% (2 mL) durante 15 minutos. Após lavagem com DMF, asparagina de cadeia de açúcar de dibenzil disialo (0,2 mmol) e DEPBT (0,2 mmol) foram dissolvidos em DMF/DMSO (1:1 solução mista, 2,2 mL) em um tubo de centrífuga preparado separadamente, colocado na coluna de fase sólida síntese, DIPEA (0,15 mmol) foi adicionado, e agitado à temperatura ambiente durante 18 horas. Após a lavagem com DMF e DCM, um peptídeo de cadeia de açúcar de 9 resíduos ligado a uma asparagina de cadeia de açúcar de dibenzil disialo representado pela seguinte fórmula (18) foi obtido na fase sólida. [Fórmula Química 23]

Fórmula (18)

[00212] No subsequente alongamento da cadeia de glicopeptídeo, aminoácidos foram sequencialmente condensados com o método mostrado abaixo.

[00213] Um aminoácido possuindo o aminoácido protegido com um grupo Fmoc, HOBt (0,50 mmol) e DIPCI (0,475 mmol) foi dissolvido em DMF (6,3 mL), ativado durante 15 minutos, e, em seguida, colocado na coluna para síntese em fase sólida. Depois de se agitar à temperatura ambiente durante 1 hora, o grupo Fmoc foi tratado durante 20 minutos com solução de piperidina/DMF a 20% (2 mL) para permitir a desproteção. Esta operação foi repetida e os aminoácidos foram, sequencialmente, condensados.

[00214] Depois de se lavar a resina obtida com DCM e DMF, uma solução mista de trifluoroetanol e ácido acético (1:1) foram adicionados de modo que a resina foi suficientemente embebida, e a resina e o fragmento de peptídeo glicosilado foram clivados por agitação durante 18 horas, à temperatura ambiente. A resina clivada foi removida por filtração, e a solução reacional foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo obtido foi concentrado para se obter um peptídeo de cadeia de açúcar possuindo a cadeia lateral de aminoácido protegida.

[00215] O fragmento peptídico glicosilado obtido (50 mmol) foi transferido para um balão de recuperação, dissolvido em DMF, e, em seguida, arrefeceu-se sob atmosfera de nitrogênio a -15°C e -20°C. A esta foi adicionado tiofenol (0,15 mmol), e em seguida PyBOP (2,5 mmol), em seguida DIPEA (0,15 mmol) foram adicionados. Depois de se agitar à temperatura de -15°C a -20°C durante 2 horas, foi adicionado ácido trifluoroacético, e esta foi deixada voltar gradualmente à temperatura ambiente. Quando a temperatura voltou para a temperatura ambiente, a solução reacional foi concentrada sob pressão reduzida. Ao resíduo obtido foi adicionado ácido trifluoroacético:água:TIPS (= 95:2,5:2,5), e esta foi agitada à temperatura ambiente. Após 2 horas, esta solução foi de novo adicionada a um éter de dietila preparado separadamente e deixou-se precipitar, em seguida, sujeita a separação centrífuga, e a porção de solução foi removida para se obter um resíduo que compreende a forma de tioéster de peptídeo alvo. Este resíduo obtido foi purificado por CLAE [coluna: SHISEIDO proteonavi] e, como um resultado da análise de massa por ESI-MS, a massa do composto obtido correspondeu à massa do IFN 67-87(A67Thi, N79)tiofenil de disialo glicosilado (SEQ ID NO. 104) alvo (valor calculado = 4903,1 Da (8,1417x10- 21g), valor real = 4903,1 Da (8,1417x10-21g)). (Exemplo 3-5-E) Síntese de IFN 88-165(C140Acm) (SEQ ID NO. 105)

[00216] Resina amino-PEGA (da Merck & Co., Inc.) (50 μmol) foi adicionada em uma coluna de síntese de fase sólida, ácido 4-hidroximetil-3-metoxifenoxi butírico (HMPB) (125μmol), tetrafluoroborato de O-benzotriazol-1-il- 1,1,3,3-tetrametilurônio (TBTU) (125 pmol) e N- etilmorfolina (125μmol) foram dissolvidos em DMF (1,25 mL) e agitou-se à temperatura ambiente durante 4 horas. A resina foi suficientemente lavada com DMF e DCM. Subsequentemente, Fmoc-Asn(Trt)-OH (0,25 mmol), 1- mesitilenossulfonil-3-nitro-1,2,4-triazol (MSNT) (0,25 mmol) e N-metilimidazol (0,187 mmol) foram dissolvidos em DCM (1,25 mL) e colocados na coluna de síntese em fase sólida, e, em seguida, agitou-se durante 4 horas.

[00217] Depois de se agitar, a resina foi lavada com DCM e DMF e o grupo Fmoc foi tratado durante 15 minutos com solução de piperidina/DMF a 20% (2 mL) para permitir a desproteção. Após lavagem com DMF, o subsequente alongamento da cadeia peptídica empregou o método mostrado abaixo para, sequencialmente, condensar aminoácidos. O aminoácido protegido com um grupo Fmoc ou Boc foi dissolvido em DMF, e a solução foi adicionada à coluna de síntese em fase sólida (0,25 mmol). 0,2 M de 3-óxido de hexafluorfosfato de 1-[bis (dimetilamino)metileno]-5-cloro- 1H-benzotriazólio (HCTU) /DMF (0,25 mmol) foram adicionados à coluna de síntese em fase sólida, e 0,8 M de N- metilmorfolina/DMF (0,50 mmol) ou 0,8 M de 2,6,4- trimetilpiridina/DMF (0,50 mmol) foram adicionados à coluna de síntese em fase sólida. Depois de se agitar à temperatura ambiente durante 15 ou 30 minutos, a resina foi lavada com DMF e o grupo Fmoc foi tratado durante 10 minutos com solução de piperidina/DMF a 20% (2 mL) para permitir a desproteção. Esta operação foi repetida, e os aminoácidos foram sequencialmente condensados pelo método de síntese em fase sólida de Fmoc.

[00218] Para a resina obtida, foi adicionado ácido trifluoroacético:água:fenol:tioanisol:triisopropilsilano (= 95:2,5:2,5:2,5:5), e esta foi agitada à temperatura ambiente. Após 3 horas, esta solução foi de novo adicionada a um éter de dietila preparado separadamente e deixou-se precipitar, em seguida, sujeita a separação centrífuga, e a porção de solução foi removida para se obter um resíduo que compreende o peptídeo alvo. Este resíduo obtido foi purificado com CLAE de fase inversa [coluna: SHISEIDO Proteonavi] e, como um resultado da análise de massa por ESI-MS, a massa do composto obtido correspondeu à massa de IFN 88-165 (C140Acm) (SEQ ID NO. 105) (valor calculado = 9647,3 Da (1,6019x10-20g), valor real = 9647,2 Da (1,6019x10-20g)). (Exemplo 3-5-F) de ligação de cada fragmento (Passo 1. Passo de Ligação Cinética)

[00219] IFN 1-25(S1Thi)tiofenil (SEQ ID NO. 101) e IFN 26-47(R26C-C30Acm)Etantiol (SEQ ID NO. 102) foram dissolvidos em uma solução tampão a pH 6,8 (solução de cloridrato de guanidina 8 M, solução de ácido fosfórico 0,2 M, e 20 mM de TCEP), e deixou-se reagir à temperatura ambiente durante 3 horas. A solução, após a reação ter terminado, foi purificada por CLAE de fase inversa [coluna: SHISEIDO Proteonavi] e liofilizada. Como resultado da análise de massa deste produto liofilizado obtido por ESI MS, a massa do composto obtido correspondeu à massa de IFN 1-47(S1Thi-R26C-C30Acm)Etantiol (SEQ ID NO. 106) (= valor calculado 5796,8 Da (9,6258x10-21g), valor real = 5796,7 Da (9,6256x10-21g)). (Passo 2. Ligação Química Nativa Passo A)

[00220] IFN 67-87(A67Thi, N79)tiofenil de disialo glicosilada (SEQ ID NO. 104) e IFN 88-165(C140Acm) (SEQ ID No. 105) foram dissolvidos em uma solução tampão a pH 7,2 (solução de cloridrato de guanidina 8 M, solução de ácido fosfórico 0,2 M, e 20 mM de TCEP), tiofenol (3% v/v) foi adicionado, e deixou-se reagir à temperatura ambiente. Depois de 23 horas, solução de metoxiamina (cloridrato de guanidina 6 M, cloridrato de metoxiamina 0,2 M e TCEP 20 mM) foi adicionada à solução de reação, o pH foi ajustado a 4,0, e, em seguida, deixou-se reagir à temperatura ambiente durante 4 horas. À solução reacional adicionou-se NaOH a 50 mM de solução aquosa para tornar a solução de reação básica, e, em seguida, deixou-se reagir em gelo durante 0,5 horas. Após a conclusão da reação, a solução, após a reação ter terminado, foi purificada por CLAE de fase inversa [coluna: SHISEIDO Proteonavi] para se obter um produto liofilizado. Como resultado da análise de massa deste produto liofilizado obtido por ESI-MS, a massa do composto obtido correspondeu à massa de IFN 67-165 (A67C-N79-A88C- C140Acm) de disialo glicosilado (SEQ ID NO. 107) (valor calculado = 14247,9 Da (2,3659x10-20g), valor real = 14247,2 Da (2,3658x10-20g)). (Passo 3. Ligação Química Nativa Passo B)

[00221] IFN 67-165(A67C-N79-A88C-C140Acm) de disialo glicosilada (SEQ ID NO. 107) obtido no passo 2 e IFN 48-66 (Q48Thi)MESNA (SEQ ID NO. 103) foram dissolvidos em uma solução tampão a pH 7,2 (solução de cloridrato de guanidina 8 M, solução de ácido fosfórico 0,2 M, TCEP 20 mM e MPAA 30 mM), e deixou-se reagir à temperatura ambiente. Depois de 18 horas, solução de metoxiamina (cloridrato de guanidina 6 M, cloridrato de metoxiamina 0,2 M e TCEP 20 mM) foi adicionada à solução de reação, o pH foi ajustado a 4,0, e, em seguida, deixou-se reagir à temperatura ambiente. Após 5 horas, a solução reacional foi adicionada 2- mercaptoetanossulfonato de sódio, e deixou-se reagir à temperatura ambiente durante 1 hora. Após a conclusão da reação, a solução, após a reação ter terminado, foi purificada por CLAE de fase inversa [coluna: SHISEIDO Proteonavi] para se obter um produto liofilizado. Como resultado da análise de massa deste produto liofilizado obtido por ESI-MS, a massa do composto obtido correspondeu à massa de IFN 48-165 (Q48C-A67C-N79-A88C-C140Acm) de disialo glicosilada (SEQ ID No. 108) (valor calculado = 16507,6 Da (2,7411x10-20g), valor real = 16507,9 Da (2,7412x10-20g)). (Passo 4. Ligação Química Nativa Passo C)

[00222] Semelhante ao passo 3, o IFN 1-47(S1Thi-R26C- C30Acm) Etantiol (SEQ ID NO. 106) obtido no passo 1 e IFN 48-165 (Q48C, A67C, N79, A88C, C140Acm) de disialo glicosilada (SEQ ID NO. 108) foram deixados reagir. Como resultado da análise de massa por ESI-MS, o composto obtido a partir da reação correspondeu à massa do IFN 1-165 (S1C- R26C-C30Acm-Q48C-A67C-N79-A88C-C140Acm) de disialo glicosilado alvo (SEQ ID NO. 109) (valor calculado = 22230,2 Da (3,6914x10-20g), valor real = 22230,3 Da (3,6914x10-20g)). (Passo 5. Passo de Glicosilação)

[00223] IFN 1-165(S1C-R26C-C30Acm-Q48C-A67C-N79-A88C- C140Acm) de disialo glicosilada (SEQ ID NO. 109) obtido no Passo 4 foi dissolvido em uma solução tampão a pH 8,5 (solução de cloridrato de guanidina 8 M, solução de Tris 0,1 M), a cadeia de açúcar de disialo bromoacetilada representada pela seguinte fórmula (19) (25 equivalentes) foi adicionada, e deixou-se reagir à temperatura ambiente 2 horas.

Fórmula (19)

[00224] Após a conclusão da reação, a solução reacional foi purificada por CLAE de fase inversa [coluna: SHISEIDO Proteonavi] para se obter um produto liofilizado. Como resultado da análise de massa deste produto liofilizado obtido por ESI-MS, a massa do composto obtido correspondeu à massa de 2-6 diSialo(S1C-R26C-C30Acm-Q48C-A67C-N79-A88C- C140Acm) tendo cadeias de açúcar de disialo adicionadas nas posições 1, 26, 48, 67 e 88 através de átomos de enxofre na cadeia lateral da cisteína e tendo uma cadeia de açúcar adicionada na posição 79 através da cadeia lateral de asparagina (SEQ ID NO. 110) (valor calculado = 33545,4 Da (5,5703x10-20g), valor real = 33545,5 Da (5,5703x10-20g)). (Passo 6. Desproteção do grupo Acm)

[00225] O liofilizado obtido através do passo 5 acima foi dissolvido em solução de acetato de prata (acetato de prata 100 mM e uma solução aquosa de ácido acético a 90%), e deixou-se reagir à temperatura ambiente. Após 4 horas, a produção do produto alvo foi confirmada por CLAE e ESI-MS. À solução reacional adicionou-se ditiotreitol, agitou-se à temperatura ambiente durante 15 minutos, e, em seguida, submeteu-se a separação por centrifugação, e o sobrenadante excluindo o precipitado foi recolhido. Este sobrenadante foi recolhido por filtração com um filtro de membrana, a porção de filtrado que compreende o produto alvo foi purificada por CLAE de fase inversa [coluna: SHISEIDO Proteonavi] para se obter um produto liofilizado. Como resultado da análise de massa deste produto liofilizado obtido por ESI-MS, a massa do composto obtido correspondeu à massa de 2-6 diSialo (S1C-R26C-Q48C-A67C-N79-A88C) tendo cadeias de açúcar de disialo adicionadas às posições 1, 26, 48, 67 e 88 através de átomos de enxofre de cadeia lateral da cisteína e tendo uma cadeia de açúcar adicionada na posição 79 através da cadeia lateral de asparagina (SEQ ID NO. 111) (valor calculado = 33403,3 Da (5,5467x10-20g), valor real = 33403,2 Da (5,5467x10-20g)). (Passo 7. Passo de Dobragem)

[00226] O liofilizado obtido através do passo 6 acima foi dissolvido em de uma solução tampão a pH 8,5 (solução de cloridrato de guanidina 8 M e tris- hidroximetilaminometano 0,1 M), e deixada à temperatura ambiente durante 30 minutos. A solução foi substituída sob condições de refrigeração (4°C) para a solução diluída de cloridrato de guanidina (cloridrato de guanidina 4,5 M e tris-hidroximetilaminometano 0,1 M). À solução substituída foi adicionada solução de sulfato de cobre (300 mM de sulfato de cobre (II) penta-hidrato), e deixada durante 3 horas sob condições de refrigeração (4°C). Depois da reação, o ácido etilenodiaminotetraacético (400 mM de ácido etilenodiaminotetraacético) foi adicionado e deixado sob condições de refrigeração (4°C) durante 0,5 horas. A solução depois da reação foi submetida a substituição durante a noite para solução de ácido acético (solução de ácido acético 10 mM), sob condições de refrigeração (4°C) para remover o agente de desnaturação. A solução depois de dobragem foi purificada por CLAE [coluna: SHISEIDO Proteonavi], e como um resultado da espectrometria de massa (método de ionização ESI), a massa do composto obtido correspondeu à massa do 2-6 diSialo(S1C-R26C- Q48C-A67C- N79-A88C) (SEQ ID NO. 100) alvo (valor calculado = 33401,2 Da (5,5463x10-20g), valor real = 33401,2 Da (5,5463x10-20g)). (Exemplo 4) Síntese de IFN-β de monoSialo glicosilada (Exemplo 4-1) Síntese de 2-6 monoSialo (S1C-Q48C-N79C- K107C-R112C-R123C) (SEQ ID NO. 93)

[00227] Com IFN 1-78 (S1Thi-C30Acm-Q48C)Ethan (SEQ ID NO. 3) e IFN 79-165(N79C-K107C-R112C- R123C-C140Acm) (SEQ ID NO. 31), IFN-β de monoSialo glicosilado foi sintetizado por um método semelhante ao (Exemplo 3-1), exceto que a mistura da cadeia de açúcar de monoSialo bromoacetilada representada pela seguinte fórmulas gerais (9) e (10) (proporção de composto 1:1) (5 equivalentes) foram utilizados alternativamente. Como resultado da realização de espectrometria de massa (método de ionização ESI), a massa do composto obtido correspondeu à massa do 2-6 monoSialo (S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) alvo (valor calculado = 31557,2 Da (5,2401x10-20g), valor real = 31556,6 Da (5,2400x10-20g)). Os resultados de espectrometria de massa para (Exemplo 3-1) e (4-1 Exemplo) são mostrados na Figura 1. [Fórmula Química 25]

Fórmula (9)

Fórmula (10)

[00228] Os compostos obtidos no (Exemplo 3-1) e (4-1 Exemplo) foram analisados por SDS-PAGE e CLAE de fase inversa [coluna: Waters BEH300]. O resultado de SDS-PAGE é mostrado na Figura 2. Olhando para o resultado de SDS-PAGE, foi sugerido que ambos os compostos foram uniformemente glicosilados, uma vez que foram detectadas bandas claras. Da mesma forma, a análise por CLAE de fase inversa originou também dados que sugerem glicosilação uniforme (dados não mostrados).

[00229] Além disso, a porção de cadeia de açúcar foi clivada a partir dos compostos obtidos no (Exemplo 3-1) e (4-1 Exemplo) por adição de Endo-β-N-acetilglicosaminidase (Endo-H) (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) sob tampão de fosfato (0,1 M de ácido fosfórico) solução a pH 6,0. O resultado da análise por CLAE de fase normal [coluna: Shodex NH2P-50], após a marcação do terminal de redução da cadeia de açúcar livre obtido com 2-aminobenzóico (Sigma Aldrich,) é mostrado na Figura 3. Como resultado da análise da estrutura de cadeia de açúcar, um pico foi confirmado em um tempo de retenção similar à cadeia de açúcar de disialo alvo, e a adição de cadeia de açúcar alvo foi confirmada. (Exemplo 4-2) Síntese de Outros IFN-β monoSialo glicosilados

[00230] A síntese dos compostos apresentados abaixo foi realizada com um método semelhante ao (Exemplo 4-1). 2-6 monoSialo(S1C-N3C-Q48C-N79C-K107C-R112C) (SEQ ID NO. 94) 2-6 monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C) (SEQ ID NO. 95) (Exemplo 5) Síntese de IFN-β de trisialo glicosilado (Exemplo 5-1) Síntese de 2-6 trisialo(S1C-Q48C-N79C- K107C-R112C-R123C) (SEQ ID NO. 96)

[00231] Com IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C)Ethan (SEQ ID NO. 3) e IFN 79-165(N79C-K107C-R112C- R123C-C140Acm) (SEQ ID NO. 31), IFN-β de trisialo glicosilado foi sintetizado por um método semelhante ao (Exemplo 3-1), exceto que a cadeia de açúcar de trisialo bromoacetilada representada pela seguinte fórmula (11) (5 equivalentes) foi adicionada. Como resultado da realização da espectrometria de massa (método de ionização ESI), a massa do composto obtido correspondeu à massa do 2-6 trisialo(S1C-Q48C-N79C-K107C- R112C-R123C) alvo (valor calculado = 37244,3 Da (6,1845x10- 20g), valor real = 37243,2 Da (6,1843x10-20g)). [Fórmula Química 27]

Fórmula (11) (Exemplo 5-2) Síntese de Outros IFN-β de trisialo glicosilado

[00232] A síntese do composto apresentado abaixo foi realizada com um método semelhante ao (Exemplo 5-1). 2-6 trisialo(S1C-Q48C-N79C-K107C) (SEQ ID NO. 97) (Exemplo 6) Síntese de IFN-β de Tetrasialo Glicosilado (Exemplo 6-1) Síntese de 2-6 tetraSialo(S1C-Q48C-N79C- K107C-R112C-R123C) (SEQ ID NO. 98)

[00233] Com IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C)Ethan (SEQ ID NO. 3) e IFN 79-165(N79C-K107C-R112C- R123C-C140Acm) (SEQ ID NO: 31.), IFN-β de tetrasialo glicosilada foi sintetizado por um método semelhante ao (Exemplo 3-1), exceto que a cadeia de açúcar de tetrasialo bromoacetilada representada pela seguinte fórmula (12) (5 equivalentes) foi utilizada em alternativa. Como um resultado da espectrometria de massa (método de ionização ESI), a massa do composto obtido correspondeu à massa do 2-6 tetraSialo (S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) alvo (valor calculado = 41183,8 Da (6,8387x10-20g), valor real = 41182,6 Da (6,8385x10-20g)). [Fórmula Química 28]

Fórmula (12) (Exemplo 6-2) Síntese de Outros IFN-β de Tetrasialo Glicosilado

[00234]

[00235] A síntese do composto apresentado abaixo foi realizada com um método semelhante ao (Exemplo 6-1). 2-6 tetraSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C) (SEQ ID NO. 99)

[00236] Os resultados de espectrometria de massa dos compostos obtidos no Exemplo 3-1, Exemplo 3-2, Exemplo 3-3, 3-4 Exemplo, Exemplo 4-1, Exemplo 4-2, Exemplo 5-1, Exemplo 5-2, Exemplo 6-1 e Exemplo 6-2 são apresentados na (Tabela 3) a seguir. [Tabela 3] Exemplo Composto Valor Teorico Valor Real Metodo de (PM) (PM) lonizagao

(Exemplo 7) Farmacocinética de IFN-β Modificado com Cadeia de DiSialoaçúcar Quádruplo, Quíntuplo e Sêxtuplo em Ratos (Exemplo 7-1) Preparação de Agentes e Reagentes de Administração

[00237] 2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C) (SEQ ID NO. 61), 2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C) (SEQ ID NO. 60), 2-6 diSialo(S1C -Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (SEQ ID NO. 46), e Avonex (Biogen Idec) foram preparadas a 588 nM com um tampão de acetato, compreendendo L-arginina e polissorbato. Avonex é um IFN-β natural (IFN-β-1a) que foi utilizado como um agente de controle. Avonex é fabricado com uma linha celular CHO, tem uma cadeia de açúcar na posição que é a posição 80 do interferon β humano natural (a posição correspondente à posição 79 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1 aqui), e a sua estrutura de cadeia de açúcar pode ser várias cadeias de açúcar de complexos ligados a N para cada polipeptídeo. (Exemplo 7-2) Administração e coleta de sangue

[00238] Os ratos (rato Balb/c, macho, 8 semanas de idade, peso corporal 21-23 g) foram administrados a uma dose de 2352 pmol/kg sob alimentação completa do subcutâneo dorsal com uma seringa de insulina Myjector 29G x 1/2 (Terumo Corporação) com um volume de 4 mL/kg. 75 μL de sangue foram recolhidos a partir da veia da cauda com um tubo capilar de hematócrito tratado com heparina (Hirshmann Laborgerate) antes da administração subcutânea, bem como em 10 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas e 30 horas após administração. Este foi rapidamente misturado com 6 mM de EDTA-PBS, com o mesmo volume que o sangue recolhido e submetido a separação por centrifugação (15000 rpm, 4 graus, 10 minutos). 90 μL do sobrenadante foram recolhidos como amostra de plasma sanguíneo. A amostra de plasma sanguíneo foi guardada congelada até ser utilizada para a medição. (Exemplo 7-3) Medição de Concentração Sanguínea

[00239] O kit ELISA de Interferon β humano (Kamakura Techno-Science) foi utilizado para a medição da concentração sanguínea de IFN-β. IFN-β de cadeia de diSialoaçúcar quádrupla - sêxtupla modificada e Avonex a partir do mesmo lote, como aquelas administradas, foram utilizados como padrões para a criação de uma curva padrão, e preparados para 200 pM, 100 pM, 50 pM, 25 pM, 12,5 pM, 6,25 pM e 3,125 pM com o diluente associado ao kit. O plasma sanguíneo foi adicionado em branco com a curva padrão de acordo com a razão de diluição da amostra de plasma do sangue de modo a que a quantidade trazida será a mesma. Uma representação gráfica da transição de concentração plasmática de IFN-β obtida é mostrada na Figura 4.

[00240] Como é mostrado na Figura 4, quando a concentração de IFN-β no plasma sanguíneo é comparada, IFN- β modificado por cadeia de disialoaçúcar quádrupla, quíntupla e sêxtupla manteve uma concentração plasmática muito mais elevada do que o agente de controle de Avonex em qualquer ponto de medição, confirmando melhora ou capacidade de retenção no sangue. Além disso, uma vez que o Tmax se torna mais lento conforme o número de diSialoglicosilação aumenta, pensava-se que a transferência do composto a partir do subcutâneo para o sangue estava atrasada. Cmax ou a concentração no sangue na fase de dissipação tornou-se maior conforme o número de diSialoglicosilação aumentou. A partir disto, foi demonstrado que adicionando cadeias de diSialoaçúcar, a estabilidade de IFN-β in vivo é melhorada de acordo com o número de cadeias de diSialoaçúcar. (Exemplo 7-4) Cálculo dos Parâmetros Farmacocinético

[00241] A partir da transição de concentração plasmática de IFN-β obtida, utilizando a análise de momento, a área sob a curva de concentração de sangue (AUC“) foi calculada pela regra trapezoidal. Além disso, a concentração máxima no sangue (Cmax) e o tempo para a concentração sanguínea máxima (Tmax) foram determinados a partir da semivida no sangue (t1/2), tempo de retenção (MRT), e o valor real da administração subcutânea. Os parâmetros farmacocinéticos obtidos estão apresentados na Figura 5.

[00242] Como é mostrado na Figura 5, foi também demonstrado, a partir dos resultados da análise de momento, que o efeito de IFN-β diSialoglicosilado para melhorar o t1/2, AUC e MRT irá aumentar de acordo com o número de modificações. (Exemplo 8)Farmacocinética de IFN-β Cadeia de DiSialoAçúcar e MonoSialoAçúcar Cadeia Quádruplo glicosilada em Ratos (Exemplo 8-1) Preparação de Agentes e Reagentes de Administração

[00243] 2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C) (SEQ ID NO. 61), 2-6 monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C) (SEQ ID NO. 95) e Avonex foram preparados a 112 nM com um tampão de acetato compreendendo L-arginina e polissorbato. (Exemplo 8-2) Administração e Coleta de Sangue

[00244] Os ratos (Rato Balb/c, macho, 8 semanas de idade, peso corporal 21-23 g) foram administrados na dose de 448 pmol/kg sob alimentação completa a partir da veia da cauda ou a subcutânea dorsal com uma seringa de insulina Myjector 29G x 1/2 (Terumo Corporation) a um volume de 4 mL/kg. 75 μL de sangue foram recolhidos a partir da veia da cauda com um tubo capilar de hematócrito tratado com heparina (Hirshmann Laborgerate) antes da administração, bem como a 2 minutos, 10 minutos, 30 minutos, 1 hora, 3 horas, 6 horas, 8 horas, e 24 horas após a administração para a administração intravenosa, e antes da administração, bem como em 10 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas e 30 horas após a administração por via subcutânea. Este foi rapidamente misturado com EDTA-PBS, com o mesmo volume como o sangue recolhido, e submetido a separação por centrifugação (15000 rpm, 4 graus, 10 minutos) . 90 μL do sobrenadante foram recolhidos como amostra de plasma sanguíneo. A amostra de plasma sanguíneo foi guardada congelada até ser utilizada para a medição. (Exemplo 8-3) Medição de Concentração Sanguínea

[00245] O kit ELISA de interferon β humano (Kamakura Techno-Science) foi utilizado para a medição da concentração sanguínea de IFN-β. IFN-β de cadeia de diSialoaçúcar quádrupla glicosilado, cadeia de monoSialoaçúcar quádruplo glicosilada e Avonex a partir do mesmo lote, como aquelas administradas, foram utilizados como padrões para a criação de uma curva padrão, e preparados para 200 pM, 100 pM, 50 pM, 25 pM, 12,5 pM, 6,25 pM, e 3,125 pM com o diluente associado ao kit. O plasma sanguíneo foi adicionado em branco com a curva padrão de acordo com a razão de diluição da amostra de plasma do sangue de modo que a quantidade trazida será a mesma. Uma representação gráfica da transição de concentração plasmática de IFN-β obtida é mostrada na Figura 6.

[00246] Como é mostrado na Figura 6, quando a concentração de IFN-β no plasma sanguíneo é comparada, 2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C) foi confirmado ser drasticamente melhorado em todo de t1/2, AUC“ e MRT do que o agente de controle de Avonex em qualquer ponto de medição. Em contraste, tanto em administração subcutânea e administração intravenosa da cauda, 2-6 monoSialo(S1C-Q48C- N79C-K107C), em que a sialilação estava incompleta, mostrou transição drasticamente baixa da concentração no sangue do que o agente de controle de Avonex. A partir deste resultado, verificou-se que todo o açúcar terminal de cadeia sendo sialilado contribui largamente para a melhoria da capacidade de retenção de IFN-β no sangue. (Exemplo 8-4) Cálculo dos Parâmetros Farmacocinéticos

[00247] A partir da transição de concentração plasmática de IFN-β obtida, utilizando a análise de momento, a área sob a curva de concentração de plasma (AUC) foi calculada pela regra trapezoidal. Além disso, a concentração inicial prevista (C0) para administração intravenosa foi determinada pelo método de extrapolação, e ainda mais, a concentração máxima no sangue (Cmax) e o tempo para a concentração sanguínea máxima (Tmax) foram determinados a partir de semivida no sangue (t1/2), tempo de retenção médio (MRT), e o valor real da administração subcutânea. O resultado é mostrado na Figura 7.

[00248] Como é mostrado na Figura 7, foi também confirmado a partir dos resultados da análise de momento que IFN-β modificado com cadeia de diSialoaçúcar quádrupla teve um efeito de melhora em t1/2, AUC“ e MRT mais do que o agente de controle de Avonex. Por outro lado, IFN-β modificado com cadeia de monoSialoaçúcar quádrupla apresentou valores mais baixos para qualquer de T1/2, AUC“ e MRT do que o agente de controle de Avonex, confirmando que se dissipa mais rapidamente a partir do sangue. (Exemplo 9) Farmacocinética de IFN-β glicosilado com Cadeia de DiSialoAçúcar e MonoSialoAçúcar Sêxtupla em Ratos (Exemplo 9-1) Preparação de Agentes e Reagentes de Administração

[00249] 2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (SEQ ID NO. 46), 2-6 monoSialo(K107C-R112C-R123C-S1C-Q48C N79C-) (SEQ ID NO. 93) e Avonex foram preparados a 588 nM com um tampão acetato compreendendo L-arginina e polissorbato. (Exemplo 9-2) Administração e Coleta de Sangue

[00250] Os ratos (Rato Balb/c, do sexo masculino, peso corporal 21-23 g) foram administrados a uma dose de 2352 pmol/kg sob alimentação completa a partir da veia da cauda com uma seringa de insulina Myjector 29G x 1/2 (Terumo Corporation) a um volume de 4 mL/kg. 75 μL de sangue foram recolhidos a partir da veia da cauda com um tubo capilar de hematócrito tratado com heparina (Hirshmann Laborgerate) antes da administração intravenosa, bem como em 2 minutos, 10 minutos, 30 minutos, 1 hora, 3 horas, 6 horas, 8 horas e 24 horas após a administração. Este foi rapidamente misturado com EDTA-PBS, com o mesmo volume como o sangue recolhido, e submetido a separação por centrifugação (15000 rpm, 4 graus, 10 minutos). 90 μL do sobrenadante foram recolhidos como amostra de plasma sanguíneo. A amostra de plasma sanguíneo foi guardada congelada até ser utilizada para a medição. (Exemplo 9-3) Medição da Concentração Sanguínea

[00251] Kit elisa interferon β humano (Kamakura TechnoScience) foi utilizado para a medição da concentração sanguínea de IFN-β. IFN-β glicosilado com cadeia de diSialoaçúcar sêxtupla, IFN-β glicosilado com cadeia de monoSialoaçúcar sêxtupla, e Avonex a partir do mesmo lote, como aqueles administrados foram utilizados como padrões para a criação de uma curva padrão, e preparado para 200 pM, 100 pM, 50 pM, 25 pM, 12,5 pM, 6,25 pM, e 3,125 pM com o diluente associado ao kit. O plasma sanguíneo foi adicionado em branco com a curva padrão de acordo com a razão de diluição da amostra de plasma do sangue de modo a que a quantidade trazida será a mesma. Uma representação gráfica da transição de concentração plasmática de IFN-β obtido é mostrada na Figura 8.

[00252] Resultados semelhantes ao IFN-β quádruplo modificado acima descrito também foram obtidos para IFN-β sextuplo modificado. Em outras palavras, foi confirmado 2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) ser drasticamente melhorado em todos de t1/2, AUC“ e MRT do que o agente de controle de Avonex. Por outro lado, 2-6 monoSialo(S1C-Q48C- N79C-K107C-R112C-R123C) mostrou transição drasticamente baixa da concentração no sangue do que o agente de controle de Avonex para administração intravenosa de cauda. A partir deste, que também foi confirmado que, para IFN-β sêxtuplo- glicosilado, de forma semelhante ao IFN-β quádruplo- glicosilado, todo o açúcar terminal de cadeia sendo sialilado é extremamente importante para a melhoria da capacidade de retenção de IFN-β no sangue. (Exemplo 9-4) Cálculo dos Parâmetros Farmacocinéticos

[00253] A partir da transição de concentração plasmática de IFN-β obtido, utilizando a análise de momento, a área sob a curva de concentração de plasma (AUC) foi calculada pela regra trapezoidal. Além disso, a concentração inicial prevista (C0) para administração intravenosa foi determinada pelo método de extrapolação, e ainda mais, meia-vida no sangue (t1/2) e o tempo médio de retenção (MRT) foram determinados. O resultado é mostrado na Figura 9.

[00254] Como é mostrado na Figura 9, foi também confirmado a partir dos resultados da análise momento, que 2-6 diSialo (S1C-Q48C- N79C-K107C-R112C-R123C) melhora drasticamente todos de t1/2, AUC“, e MRT mais do que o agente de controle de Avonex. Por outro lado, 2-6 monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) apresentou valores mais baixos para qualquer de T1/2, AUC“ e MRT do que o agente de controle de Avonex, indicando que ele se dissipa mais rapidamente do sangue. (Exemplo 10) Farmacocinética de IFN-β Modificado com Cadeia de DiSialoaçúcar Sêxtupla e IFN-β Modificado com PEG20K em Ratos (Exemplo 10-1) Preparação de agentes e Reagentes de Administração

[00255] 2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (SEQ ID NO. 46), IFN-β modificado com PEG20K e Avonex foram preparados a 558 nM com um tampão de acetato compreendendo L-arginina e polissorbato. (Exemplo 10-2) Administração e Coleta de Sangue

[00256] Os ratos (Rato Balb/c, macho, 8 semanas de idade, peso corporal 21-23 g) foram administrados a uma dose de 2352 pmol/kg sob alimentação completa do subcutâneo dorsal com uma seringa de insulina Myjector 29G x 1/2 (Terumo Corporação) com um volume de 4 mL/kg. 75 μL de sangue foram recolhidos a partir da veia da cauda com um tubo capilar de hematócrito tratado com heparina (Hirshmann Laborgerate) antes da administração subcutânea, bem como em 10 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas e 30 horas após administração. Este foi rapidamente misturada com EDTA-PBS, com o mesmo volume como o sangue recolhido, e submetida a separação por centrifugação (15000 rpm, 4 graus, 10 minutos). 90 μL do sobrenadante foram recolhidos como amostra de plasma sanguíneo. A amostra de plasma sanguíneo foi guardada congelada até ser utilizada para a medição. (Exemplo 10-3) Medição da Concentração Sanguínea

[00257] Kit ELISA de interferon β humano (Kamakura Techno-Science) foi utilizado para a medição da concentração sanguínea de IFN-β. IFN-β modificado com cadeia de diSialoaçúcar sêxtupla, IFN-β modificado com PEG20K e Avonex a partir do mesmo lote, como aqueles administrados, foram utilizados como padrões para a criação de uma curva padrão, e preparado para 200 pM, 100 pM, 50 pM, 25 pM, 12,5 pM, 6,25 pM, e 3,125 pM com o diluente associado ao kit. O plasma sanguíneo foi adicionado em branco com a curva padrão de acordo com a razão de diluição da amostra de plasma do sangue de modo que a quantidade trazida será a mesma. Uma representação gráfica da transição de concentração plasmática de IFN-β obtido é mostrada na Figura 10. (Exemplo 10-4) cálculo dos parâmetros Farmacocinético

[00258] A partir da transição de concentração plasmática de IFN-β obtido, utilizando a análise de momento, a área sob a curva de concentração de sangue (AUC) foi calculada pela regra trapezoidal. Além disso, a concentração inicial prevista (C0) para administração intravenosa foi determinada pelo método de extrapolação, e ainda mais, meia-vida no sangue (t1/2) e o tempo médio de retenção (MRT) foram determinados. O resultado é mostrado na Figura 11.

[00259] Como é mostrado nas Figuras 10 e 11, a partir dos resultados de transição de concentração de plasma e a análise momento, IFN-β modificado com cadeia de diSialoaçúcar sêxtupla e IFN-β modificado com PEG20K ambos melhoraram drasticamente todos de t1/2, AUC“ e MRT do que Avonex. Além disso, verificou-se que o IFN-β modificado com cadeia de diSialoaçúcar sêxtupla ultrapassa IFN-β modificado com PEG20K em relação à AUC“ e Cmax. Para t1/2 e MRT, comparação entre IFN-β modificado com cadeia de diSialoaçúcar sêxtupla e IFN-β modificado com PEG20K deram resultados comparáveis. A partir destes resultados, foi demonstrado que IFN-β modificado com cadeia de diSialoaçúcar sêxtupla melhora a estabilidade de Avonex in vivo a um nível comparável com PEG20K ou superior. (Exemplo 11) Atividade Antitumoral In vivo de IFN-β Modificado com Cadeia de DiSialoaçúcar Quádrupla, Quíntupla e Sêxtupla

[00260] A atividade antitumoral do IFN-β modificado com cadeia de diSialoaçúcar quádrupla, quíntupla e sêxtupla in vivo foi avaliada com ratos com câncer. (Exemplo 11-1) Cultura de Células Ratos portadores de câncer preparados por inoculação de células de Daudi, que são o linfoma de Burkitt humano, foram utilizados para o teste de atividade antitumoral. O meio utilizado foi RPMI1640 (Invitrogen) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (GIBCO) sujeito a um tratamento de inativação a 56°C durante 30 minutos e penicilina/estreptomicina (Sigma). A placa de cultura utilizada foi um prato Non-treat (IWAKI). A cultura foi realizada a 37°C sob condição concentração de 5% de CO2 e passadas uma vez a cada 2 - 3 dias. (Exemplo 11-2) Preparação de Ratos Portadores de Câncer

[00261] Células Daudi cultivadas foram recolhidas em um tubo e submetidas a separação por centrifugação (1300 rpm, 4 graus, 3 minutos). O sobrenadante foi removido com um aspirador, HBSS (Nacalai) foi adicionado, e as células foram suspensas. Este foi, em seguida, novamente submetido a separação por centrifugação, e o sobrenadante foi removido. Este tratamento de lavagem de células foi realizado durante um total de três vezes. Além disso, o número de células foi calculado com um hemocitômetro, e uma suspensão de células foi reparada com HBSS a 2 x 108 células/mL. Imediatamente antes da inoculação das células de Daudi, Matrigel (BD) com o mesmo volume da suspensão celular foi adicionado para permitir a diluição dupla, e uma suspensão de células para inoculação foi preparada. A suspensão de células para inoculação foi armazenada em gelo até imediatamente antes da inoculação. Somnopentyl (Kyoritsu Seiyaku) foi empregado como o anestésico diluído a 5 mg/mL com PBS. 300 μL do anestésico foram administrados por via intraperitoneal a ratos SCID (rato CB-17/Icr- scid/scidJcl, do sexo masculino, 6 semanas de idade) (CLEA Japan) com uma seringa de insulina Myjector 29G x 1/2 (Terumo Corporation). Após a confirmação de que a anestesia foi introduzida, uma máquina de barbear foi utilizada para raspar o flanco direito dos ratos. Uma agulha de injeção 26G 1/2 (Terumo) e uma seringa de vidro de 1 mL (Terumo) foram utilizadas para inocular subcutaneamente 100 μL da suspensão de células para inoculação.

[00262] Aproximadamente 30 dias após o tratamento de inoculação de células, o eixo maior (mm) e o eixo menor (mm) do tecido do tumor formado foram medidos com um compasso de calibre (Mitsutoyo). O volume do tumor (mm3) foi determinado com os valores numéricos obtidos. O volume do tumor foi calculado utilizando a fórmula: volume do tumor (mm3) = eixo maior (mm) x eixo menor (mm) x eixo menor (mm) x 0,5, e os ratos com câncer foram agrupados em quatro grupos (n = 4/grupo). O volume do tumor no momento do agrupamento foi de aproximadamente 800 mm3. (Exemplo 11-3) Preparação do Fluido de Administração

[00263] 2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C) (SEQ ID NO. 61), 2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C) (SEQ ID NO. 60), 2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (SEQ ID NO. 46) e 2-6 diSialo(S1C-N3C- Q48C-N79C-K107C-R112C) (SEQ ID NO. 49), bem como o agente de controle Avonex foram preparados a 588 nM com um tampão de acetato, compreendendo L-arginina e polissorbato. A preparação do fluido de administração foi realizada imediatamente antes da administração. (Exemplo 11-4) Método de Administração

[00264] O fluido de administração preparado foi utilizado para administrar ao subcutâneo dorsal, de modo que a dose vai ser 2352 pmol/kg em um volume de 4 mL/kg, com uma seringa de insulina Myjector 29G x 1/2. O grupo de administração de veículo foi administrado compreendendo um tampão de acetato de L-arginina e polissorbato empregado para a preparação da administração do fluido a um volume de 4 mL/kg. O dia da administração e agrupamento inicial foi definido no dia 0, e a administração subcutânea dorsal foi realizada em dias alternados durante cinco vezes até o dia 9. (Exemplo 11-5) Avaliação do Poder da Atividade

[00265] Tecido de câncer ressecado de ratos no dia 24 após o início da administração, e o peso de tecido úmido foi medido. Como um indicador de atividade antitumoral, o valor relativo do peso de tecido úmido do IFN-β modificado por cadeia de diSialoaçúcar quádrupla - sêxtupla e grupo de administração Avonex quando o peso de tecido úmido do grupo de administração de veículo foi definido como 100% (% T/C: teste/controle), foi calculado. O resultado é mostrado na Figura 12.

[00266] Como é mostrado na Figura 12, o valor relativo do peso de tecido úmido do tecido de câncer (% T/C) foi de 44,5% para o grupo de administração Avonex, ao passo que os valores foram de 0,3% para o grupo de administração de 2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C- grupo R123C), 0,4% para o grupo de administração de 2-6 diSialo(S1C-N3C-Q48C-N79C- K107C-R112C), 18,9% para o grupo de administração de 2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C), e de 28,1% para o grupo de administração de 2-6 diSialo (S1C- Q48C-N79C-K107C), e o IFN-β modificada de cadeia de diSialoaçúcar quádrupla, quíntupla e sêxtupla da presente invenção quase erradicaram o tecido de câncer, ou mostrou atividade antitumoral superior à de um ponto de tecido de câncer muito reduzido. A partir dos resultados acima, quando a administração subcutânea foi realizada uma vez por dia, em dias alternados x 5 vezes, e em 2352 pmol/kg, uma tendência de forte atividade antitumoral foi observada como sendo o número de diSialoglicosilação aumentado. (Exemplo 12) Atividade Antitumoral In vivo de IFN-β modificado com cadeia de DiSialosugar/MonoSialoaçúcar Sêxtupla

[00267] As células foram cultivadas com um método semelhante ao (Exemplo 11-1), e ratos com câncer foram preparados por um método semelhante ao (Exemplo 11-2). O fluido de administração foi preparado com um método semelhante ao (Exemplo 11-3), exceto que o fluido de administração (Exemplo 11-3) foi 2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C- K107C-R112C-R123C) (SEQ ID NO. 46), 2-6 monoSialo(S1C-Q48C- N79C-K107C-R112C-R123C) (SEQ ID NO. 93) e o agente de controle de Avonex, e administrado a ratos com câncer com um método semelhante ao (Exemplo 11 -4).

[00268] O tecido de câncer foi ressecado a partir de ratos no dia 22 após o início da administração, e o peso de tecido úmido foi medido. Como um indicador de atividade antitumoral, o valor relativo do peso de tecido úmido do grupo de administração de Avonex quando o peso de tecido úmido do grupo de administração de veículo foi fixado em 100% (% T/C: teste/controle) foi calculada. O resultado é mostrado na Figura 13.

[00269] Como é mostrado na Figura 13, o valor relativo do peso de tecido úmido do tecido de câncer (% T/C) foi 63,0% para o grupo de administração de Avonex, ao passo que o valor foi de 1,3% para o grupo de administração de IFN-β diSialoaçúcar modificado com cadeia sêxtupla e forte atividade antitumoral foi confirmada. Por outro lado, o valor foi de 79,3% para o grupo de administração de IFN-β modificado com cadeia de monoSialoaçúcar sêxtuplo. A partir dos resultados acima, quando a administração subcutânea foi realizada uma vez por dia, em dias alternados x 5 vezes, e em 2352 pmol/kg, com IFN-β modificado por cadeia de diSialoaçúcar sêxtupla, forte atividade antitumoral de tal forma que quase erradicou o tecido de câncer que foi muito superior do que o grupo de administração de Avonex, foi mostrado. Por outro lado, com o IFN-β modificado com cadeia de monoSialoaçúcar sêxtupla em que apenas um dos dois terminais não redutores é sialilada, atividade antitumoral superior ao do grupo de administração de Avonex não foi observada. A partir disto, verificou-se que todos os terminais não redutores sendo sialilados são importantes para a atividade antitumoral. (Exemplo 13) Atividade Antitumoral In vivo de IFN-β modificado com cadeia de DiSialoaçúcar/TriSialoaçúcar/ TetraSialoaçúcar Sêxtupla

[00270] As células foram cultivadas com um método semelhante ao (Exemplo 11-1), e ratos com câncer foram preparados por um método semelhante ao (Exemplo 11-2). O fluido de administração foi preparado com um método semelhante ao (Exemplo 11-3), exceto que o fluido de administração (Exemplo 11-3) foi 2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C- K107C-R112C-R123C) (SEQ ID NO. 46), 2-6 trisialo(S1C- Q48C- N79C-K107C-R112C-R123C) (SEQ ID NO. 96), 2-6 tetraSialo (S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (SEQ ID NO. 98), e o agente de controle de Avonex, e administrado a ratos com câncer com um método semelhante ao (Exemplo 11-4). Câncer do tecido ressecado de ratos no dia 21 após o início da administração, e o peso de tecido úmido foi medido. Como um indicador de atividade antitumoral, o valor relativo do peso de tecido úmido do grupo de administração de Avonex quando o peso de tecido úmido do grupo de administração de veículo foi fixada em 100% (% T/C: teste/controle) foi calculado. O resultado é mostrado na Figura 14.

[00271] Como é mostrado na Figura 14, o valor relativo do peso de tecido úmido do tecido de câncer (% T/C) foi de 55,5% para o grupo de administração de Avonex, ao passo que os valores foram de 3,6% para o grupo de administração de IFN-β modificado com cadeia de diSialoaçúcar sêxtupla, 9,1% para o grupo de administração de IFN-β modificado com cadeia de tetraSialoaçúcar sêxtupla e 28,7% para o grupo de administração de IFN-β modificado com cadeia de triSialoaçúcar sêxtupla e demonstrou-se que qualquer um dos IFN-β modificados com cadeia de açúcar sêxtuplas têm forte atividade antitumoral. No que diz respeito à estrutura da cadeia de açúcar, quando o foco sobre a diferença no número de ramificações da cadeia de açúcar, embora a forma modificada de cadeia de diSialoaçúcar sêxtupla biantenal mostre forte atividade antitumoral, a forma modificada de cadeia de triSialoaçúcar sêxtupla triantenário e a forma modificada de cadeia de tetraSialoaçúcar sêxtupla tetraantenal mostrou atividade antitumoral que era mais fraca do que a forma modificada com cadeia de diSialoaçúcar sêxtupla. Pensa-se que a diferença na atividade inibidora de crescimento celular in vitro, tal como aquela mostrada no resultado do Exemplo 16 descrito abaixo (Tabela 4) ou a diferença na cinética do sangue in vivo e semelhantes estão possivelmente relacionados com este. (Exemplo 14) Atividade Antitumoral In vivo de IFN-β modificado com cadeia de DiSialoaçúcar Sêxtupla e IFN-β Modificado com PEG20K

[00272] As células foram cultivadas com um método semelhante ao (Exemplo 11-1), e ratos com câncer foram preparados por um método semelhante ao (Exemplo 11-2). O fluido de administração foi preparado com um método semelhante ao (Exemplo 11-3), exceto que o fluido de administração (Exemplo 11-3) foi 2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C- K107C-R112C-R123C) (SEQ ID NO. 46), IFN-β modificado com PEG20K, e o agente de controle de Avonex, e administrado a ratos com câncer com um método semelhante ao (Exemplo 114).

[00273] O tecido de câncer foi ressecado de ratos no dia 21 após o início da administração, e o peso de tecido úmido foi medido. Como um indicador de atividade antitumoral, o valor relativo do peso de tecido úmido do grupo de administração de Avonex, quando o peso de tecido úmido do grupo de administração de veículo foi fixado em 100% (% T/C: teste/controle,) foi calculado. O resultado é mostrado na Figura 15.

[00274] Como é mostrado na Figura 15, o valor relativo do peso de tecido úmido do tecido de câncer (% T/C) foi de 62,6% para o grupo de administração de Avonex, ao passo que o valor foi de 0,3% para o grupo de administração de IFN-β modificado com cadeia de diSialoaçúcar sêxtupla, e atividade antitumoral extremamente elevada, de tal forma que quase erradicou o tecido de câncer, foi mostrada. Por outro lado, o % de T/C do grupo de administração de IFN-β modificado com PEG20K foi 58,5%, o que era apenas um nível comparável ao agente de controle de grupo de administração de Avonex. A partir disto, tornou-se claro que o IFN-β modificado com cadeia de diSialoaçúcar sêxtupla tem atividade de IFN-β extremamente superior em comparação com o agente de controle Avonex e o IFN-β modificado com PEG20K se sabe como a tecnologia convencional.

[00275] De um modo geral, como a tecnologia convencional, a adição de PEG a polipeptídeos foi realizada a fim de melhorar a estabilidade física ou estabilidade das proteínas do plasma. Também no (Exemplo 10) da presente invenção, IFN-β PEGuilado mostrou significativamente melhor transição da concentração no sangue em comparação com o Avonex. No entanto, no (Exemplo 14), IFN-β PEGuilado só mostrou atividade antitumoral que era apenas um nível comparável ao Avonex. Em outras palavras, nenhuma melhoria foi observada em relação à atividade antitumoral de IFN-β com PEGilação, que é geralmente conhecido por ter um efeito de melhoria da capacidade de retenção no sangue, ao passo que o IFN-β glicosiladao da presente invenção, surpreendentemente, tinha significativamente elevada capacidade de retenção no sangue do que Avonex, como mostrado no (Exemplo 10), e também foi significativamente melhorada em relação à atividade antitumoral. A partir disto, foi mostrado que o IFN-β glicosilado da presente invenção é extremamente útil como produto farmacêutico em comparação com o IFN-β PEGilado ou natural. (Exemplo 15) O Atividade Inibidora de crescimento celular In Vitro de IFN-β glicosilado com quádruplo, quíntuplo e Sêxtuplo

[00276] A atividade inibidora do crescimento de células de IFN-β glicosilado quádruplo, quíntuplo, e sêxtuplo in vitro foi avaliada pelo seguinte método. Estirpe de células de linfoma de Burkitt humano de Daudi foi suspensa em 10% de soro fetal bovino, 100 U/mL de penicilina, e 100 μg/mL de meio RPMI 1640 (FCS a 10%, RPMI 1640) de 1,25 x 105 células/mL contendo estreptomicina. A suspensão de células foi semeada em uma placa de 96 poços de fundo plano a 1 x 104 células/80 μL/poço cada. Além disso, 20 μL/poço de cada um dos múltiplos IFN-β glicosilados diluídos em série com 10% de FCS-RPMI 1640 foram adicionados, e isto foi cultivado em um incubador de CO2 a 5% ajustado para a concentração de CO2 a 37 graus durante 3 dias. A atividade inibidora do crescimento celular foi medida com a atividade de desidrogenase mitocondrial no dia 3 de cultura, como o indicador de contagem celular com kit-8 (DOJINDO) de acordo com o manual anexo ao kit. Além disso, Avonex foi utilizado como controle. O valor de IC50 foi calculado com o GraphPad Prism. Os resultados são apresentados na (Tabela 4) abaixo. [Tabela 4] Composto !C(50)

[00277] Como mostrado na (Tabela 4), melhoria da atividade inibidora do crescimento celular in vitro foi também observada com vários polipeptídeos glicosilados que foram glicosilados em uma posição diferente do IFN-β glicosilado em que um efeito de melhoria da atividade antitumoral foi aqui observado. Em relação aos polipeptídeos glicosilados apresentados na (Tabela 4), de forma semelhante aos polipeptídeos de glicosilação acima referidos, pensa-se que o polipeptídeo glicosilado da presente invenção, em que todos os terminais não redutores são sialilados, também pode ser utilizado como um produto farmacêutico tendo atividade de interferon β e como um produto farmacêutico superior em atividade do interferon, tal como atividade antitumoral.

[00278] A partir do acima, o IFN-β glicosilado quádruplo - sêxtuplo da presente invenção mostrou ter uma capacidade de retenção mais elevada no sangue e uma atividade antitumoral mais elevada do que o IFN-β natural (Avonex). Conforme mostrado nas Figuras 4, 5 e 12, foi mostrado que IFN-β glicosilada com disialo terá uma capacidade de retenção mais elevada no sangue, bem como atividade antitumoral superior, tal como o número de cadeias de açúcar aumentado de quádruplo para quíntuplo, quíntuplo para sêxtuplo, etc. Além disso, no presente invento, mostrou-se que todos os terminais não redutores da cadeia de açúcar sendo sialilados é importante para a melhoria da capacidade de retenção de IFN-β no sangue e na melhoria da atividade antitumoral in vivo. Além disso, em todos os casos de emprego de várias cadeias de açúcares, tal como cadeias de açúcar de disialo, bem como cadeias de açúcar de trisialo e cadeias de açúcar de tetrasialo como uma cadeia de açúcar tendo todos os terminais não redutores do açúcar da cadeia sialilados, foi demonstrado ter uma maior capacidade de retenção de sangue e uma atividade antitumoral maior do que IFN-β natural (Avonex). Assim, o polipeptídeo glicosilado da presente invenção pensa-se ser útil como um fármaco com atividade de interferon β superior. Listagem de Sequências Sequência table.TXT

Claims (13)

1. Polipeptídeo glicosilado tendo atividade de interferon β, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido polipeptídeo glicosilado é qualquer polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo nos seguintes (1) e (2); (1) um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1, e (2) um polipeptídeo tendo um a dez aminoácidos deletados, substituídos ou adicionados no polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1, nos quais os aminoácidos nas posições 4 a 6 são substituídos por aminoácidos glicosilados, e em que todos os terminais não redutores da referida cadeia de açúcar são sialilados, e em que pelo menos três dos referidos respectivos aminoácidos glicosilados estão presentes na posição correspondente a uma posição selecionada a partir do grupo que consiste nas posições 1, 3, 41, 48, 75, 79, 107, 112, 123, e 136 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1.

2. Polipeptídeo glicosilado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido respectivo aminoácido glicosilado é cada um independentemente um Cys glicosilado ou um Asn glicosilado.

3. Polipeptídeo glicosilado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que as cadeias de açúcar nos referidos respectivos aminoácidos glicosilados são todas independentemente selecionadas a partir do grupo que consiste em uma cadeia de açúcar de disialo, uma cadeia de açúcar de trisialo e uma cadeia de açúcar de tetrasialo.

4. Polipeptídeo glicosilado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que as cadeias de açúcar nos referidos respectivos aminoácidos glicosilados são todas independentemente selecionadas a partir do grupo que consiste nas seguintes Fórmula (1), Fórmula (2), Fórmula (3) e Fórmula (4):

5. Polipeptídeo glicosilado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que as cadeias de açúcar nos referidos respectivos aminoácidos glicosilados são todas idênticas.

6. Polipeptídeo glicosilado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que nenhum dos referidos respectivos aminoácidos glicosilados existe na posição correspondente às posições 2, 5, 6, 9, 12, 13, 16, 19, 20, 23, 27, 33, 37, 39, 40, 43, 53, 54, 55, 57, 58, 61, 62, 64, 65, 68, 69, 73, 78, 83, 86, 87, 90, 93, 94, 100, 124, 125, 128, 131, 132, 138, 141, 142, 145, 148, 149, 152, 153, 156, 159, 160 ou 163 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1.

7. Polipeptídeo glicosilado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que todos os referidos respectivos aminoácidos glicosilados estão presentes na posição correspondente a uma posição selecionada a partir do grupo que consiste nas posições 1, 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 79, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139, e 164 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 1.

8. Polipeptídeo glicosilado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido polipeptídeo glicosilado é quimicamente sintetizado.

9. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que a referida composição farmacêutica compreende: (1) um polipeptídeo glicosilado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, e/ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e (2) um veículo farmaceuticamente aceitável.

10. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA pelo fato de ser utilizada para a terapia ou prevenção de uma doença relacionada com o interferon β.

11. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que a referida doença relacionada com interferon β é selecionada a partir do grupo que consiste em tumor cerebral, melanoma maligno cutâneo, hepatite B crônica ativa, hepatite C crônica, panencefalite esclerosante subaguda, cirrose compensada C e esclerose múltipla.

12. Uso de um polipeptídeo glicosilado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, e/ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e um veículo farmaceuticamente aceitável, CARACTERIZADO pelo fato de ser na preparação de uma composição farmacêutica para a terapia ou prevenção de uma doença relacionada com o interferon β.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida doença relacionada com interferon β é selecionada a partir do grupo que consiste em tumor cerebral, melanoma maligno cutâneo, hepatite B crônica ativa, hepatite C crônica, panencefalite esclerosante subaguda, cirrose compensada C e esclerose múltipla.

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