KR102186063B1 - 시알릴화 당쇄가 부가된 폴리펩티드 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 목적은, 균일성이 높은 시알릴화 당쇄가 부가된 인터페론β활성을 갖는 폴리펩티드를 제공하는 것이다. 본 발명은, 당쇄 부가 폴리펩티드가 하기의 (1) 내지 (4)로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 폴리펩티드이며;
(1) 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드,
(2) 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드에서, 1개 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 폴리펩티드,
(3) 인터페론β의 유사체인 폴리펩티드, 및
(4) 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드에 대해서, 80%이상의 상동성을 갖는 폴리펩티드,
여기서, 4 내지 6개 위치의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환되어 있고,
상기 당쇄의 비환원 말단의 모두가 시알릴화 되어 있는 것을 특징으로 하는 당쇄 부가 폴리펩티드이다.

Description

시알릴화 당쇄가 부가된 폴리펩티드{POLYPEPTIDE HAVING SIALYLATED SUGAR CHAINS ATTACHED THERETO}
본 발명은 시알릴화 당쇄가 부가된 폴리펩티드에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 균일성이 높은 시알릴화 당쇄가 부가된 인터페론β활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다.
천연의 인간 인터페론β(IFN-β)는 166개의 아미노산 잔기로 구성된 당단백질이다. 인터페론β는 사이토카인 족에 속하고, 면역조정작용, 항바이러스 활성, 세포 증식억제 작용에 관여한다는 것이 알려져 있다. 또한, 인간 인터페론β는 천연의 아미노산 서열에서 17, 31, 141번 위치에 3개의 Cys을 가지고 있고, 80번 위치의 Asn에 1개의 결합형의 N결합형 올리고당을 가지고 있다. 또한, 31번 위치와 141번 위치의 Cys에서 디술피드 결합을 가지고 있다는 것이 알려져 있다.
약제로서의 인터페론β는, 세포 발현계를 이용하여 제조되고 있고, 발현시키는 숙주의 차이에 따라 IFN-β-1a 또는 IFN-β-1b로 분류된다. IFN-β-1a는, 중국햄스터의 난소(CHO)세포를 이용한 별현계이며, 천연의 인터페론β와 동일하게 당쇄를 갖는 당단백질이다. 반면, IFN-β-1b는 대장균에서 발현시킨 것으로, 당쇄를 갖지 않는 단백질이다.
IFN-β-1a는, IFN-β-1b와 비교해서, 면역원성, 항바이러스 활성 및 항종양특성에 있어서 보다 강력한 효능을 지니고 있다고 알려져 있다. 게다가, 당단백질 중에 포함되는 당쇄 구조는 약물동태에 대해 강한 영향력을 지니고 있다고 알려져 있다.
또한, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 수용성 중합체를 단백질에 결합시키면, 단백질의 물리적 안정성, 열 안정성, 혈장중의 안정성 향상 등의 효과를 가져온다고 알려져 있다. 이와 같은 효과를 기대하여, PEG로 수식한 IFN-β에 관한 보고가 존재한다. 예를 들어, IFN-β-1b의 N말단에 PEG 수식을 한 IFN-β복합체에 관한 보고가 있다(미국특허출원공개 제2009/0214472호 명세서, 미국특허 제7829659호 명세서). 또한, IFN-β-1a의 N말단에 PEG 수식을 한 IFN-β복합체에 관한 보고도 존재한다(미국특허 제7446173호 명세서). 이와 같은 수식은, 확실하게 단백질의 상기 안정성 등에는 기여할지는 모르나, 한편으로는 IFN-β의 약제로서의 활성을 저하시킬 우려가 있다. 예를 들어, PEG의 분자량이 2만 이상인 경우 등에는, 활성이 극적으로 저하한다고 보고되고 있다(J. Control. Rel. 88, 35-42, 2003).
PEG 수식의 상술과 같은 우려를 고려하여, 고분자량의 PEG를 결합시켜도 IFN-β의 활성이 유지될 수 있는 위치를 선택하여, 부위 특이적으로 PEG 수식을 한 보고도 존재한다(국제공개 제2005/019260호). 그러나, PEG는 생체 내에 존재하지 않는 화합물이고, PEG 수식 IFN-β를 장기투여한 경우의 축적성, 안전성, 유효성에 관해서는, 아직도 충분한 검토는 확립되어 있지 않다.
또한, 부위 특이적으로 당쇄 수식을 한 IFN-β복합체에 관한 보고도 존재한다(국제공개 제 02/074806호). 특허문헌 5에서는, 천연형 IFN-β의 아미노산 서열에 대해서, N결합형 당쇄의 인식부위인 공통서열(Asn-X-Ser/Thr)을 갖도록 아미노산 변이를 도입하고, CHO세포를 이용하여 발현하고 있다. 그러나, 이 방법으로는 공통서열을 도입하기 위해서, 당쇄를 부가하는 아미노산 이외에도 아미노산 변이가 생기게 된다. 또한, 일반적으로, CHO세포로 발현한 경우에는, 당쇄의 불균일성이 생긴다고 알려져 있다.
인터페론β의 물리적 안정성, 열 안정성, 혈장 중의 안정성 등을 향상시키기 위해서 상술한 바와 같이, 인터페론β의 폴리펩티드를 PEG로 수식한 예가 존재한다. 그러나 PEG로 수식을 한 경우에는 상술한 바와 같이, 인터페론β의 약제로서의 활성이 저하하는 경우가 있다. 또한, PEG는 생체 내에 존재하는 물질이 아니기 때문에 생체 내에서의 축적으로 의한 약해의 우려가 있다.
반면에, 인터페론β의 폴리펩티드를 당쇄로 수식한 예도 존재한다. 그러나, 예를 들어, CHO세포에서의 발현에 의해 당쇄 부가 인터페론β를 제조할 경우, 상술한 바와 같이, 부가된 당쇄의 종류 또는 부가된 위치에 불균일성이 생기는 것으로 알려져 있다. 당쇄가 불균일할 경우에는, 의약품으로서 로트 간에서 약효에 차이가 생길 가능성도 있고, 또한 천연형의 당쇄 부가 인터페론β에서는, 혈중 체류시간이 짧다는 결점도 생겼다.
본 발명자들은, 상술의 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 인터페론β의 폴리펩티드에 대해, 당쇄의 비환원 말단이 모두 시알릴화 된 당쇄 부가 아미노산으로, 4 내지 6개 위치의 아미노산을 치환함으로서, 천연의 인간 인터페론β보다도 혈중 체류성에 뛰어나고, 또한, 항종양 활성이 뛰어난 당쇄 부가 폴리펩티드가 얻어진다는 것을 밝혔다.
즉, 본 발명은 일 양태에 있어서, 인터페론β활성을 갖는 당쇄 부가 폴리펩티드로서, 상기 당쇄 부가 폴리펩티드가 하기의 (1) 내지 (4)로 이루어진 군에서 선택되는 임으의 폴리펩티드이며;
(1) 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드,
(2) 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드에서, 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 폴리펩티드,
(3) 인터페론β의 유사체인 폴리펩티드 및
(4) 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드에 대해서, 80%이상의 상동성을 갖는 폴리펩티드,
여기서, 4 내지 6개 위치의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환되어 있고, 상기 당쇄의 비환원 말단의 모두가 사알릴화 되어 있는 것을 특징으로 하는 당쇄 부가 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에 있어서는, 상기 각 당쇄 부가 아미노산은, 각각 독립적으로 당쇄 부가 Cys 또는 당쇄 부가 Asn일 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서는, 상기 각 당쇄 부가 아미노산의 당쇄는, 모두 독립적으로, 디시알로 당쇄, 트리시알로 당쇄 및 테트라시알로 당쇄로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서는, 상기 각 당쇄 부가 아미노산의 당쇄는, 모두 독립적으로, 하기식(1), 식(2), 식(3) 및 식(4)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
〔화학식 1〕
Figure 112014113375492-pct00001
식(1)
〔화학식 2〕
Figure 112014113375492-pct00002
식(2)
〔화학식 3〕
Figure 112014113375492-pct00003
식(3)
〔화학식 4〕
Figure 112014113375492-pct00004
식(4)
본 발명의 일 양태에 있어서는, 상기 각 당쇄 부가 아미노산의 당쇄는, 모두 동일할 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서는, 상기 각 당쇄 부가 아미노산의 적어도 1개는, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열에서 1, 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 79, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139 및 164번 위치로 이루어진 군에서 선택되는 위치에 해당하는 위치에 존재할 수 있다.
여기서, 본 발명의 일 양태에 있어서는, 또한 상기 각 당쇄 부가 아미노산은, 모두 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열에서 2, 5, 6, 9, 12, 13, 16, 19, 20, 23, 27, 33, 37, 39, 40, 43, 53, 54, 55, 57, 58, 61, 62, 64, 65, 68, 69, 73, 78, 83, 86, 87, 90, 93, 94, 100, 124, 125, 128, 131, 132, 138, 141, 142, 145, 148, 149, 152, 153, 156, 159, 160 또는 163번 위치에 해당하는 위치에 존재하지 않는 것으로 할 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서는, 상기 각 당쇄 부가 아미노산의 적어도 1개는, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열에서 1, 3, 41, 48, 75, 79, 107, 112, 123 및 136번 위치로 이루어진 군에서 선택되는 위치에 해당하는 위치에 존재할 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서는, 상기 각 당쇄 부가 아미노산의 적어도 3개는, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열에서 1, 3, 41, 48, 75, 79, 107, 112, 123 및 136번 위치로 이루어진 군에서 선택되는 위치에 해당하는 위치에 존재할 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서는, 상기 각 당쇄 부가 아미노산은, 모두 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열에서 1, 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 79, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139 및 164번 위치로 이루어진 군에서 선택되는 위치에 해당하는 위치에 존재할 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서는, 상기 당쇄 부가 폴리펩티드가 화학적으로 합성될 수 있다.
또한, 본 발명은 일 양태에 있어서,
(1) 상기 당쇄 부가 폴리펩티드 및/또는 약학적으로 허용되는 그의 염 및,
(2) 약리학적으로 허용되는 담체를 포함하는
의약조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 상기 의약조성물은 인터페론β에 관련하는 질환의 치료 또는 예방을 위해서 이용될 수 있다. 여기서, 상기 질환은, 뇌종양, 피부악성 흑색종, B형 만성 활동성 감염, C형 만성 감염, 아급성 경화성 범뇌염, C형 대상성 간경변 및 다발성 경화증으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 양태에 있어서는, 이미 기술한 당쇄 부가 폴리펩티드의 서열, 당쇄 부가 아미노산의 아미노산, 당쇄 부가 아미노산의 당쇄의 종류 및 구조, 당쇄 부가 아미노산에 의한 아미노산 치환의 위치, 당쇄 부가 폴리펩티드의 합성방법, 의약조성물로서의 대상질환에 대해서, 각각 상기의 군에서 선택되는 임의의 조합으로 할 수 있다.
본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드는, 화학적으로 합성할 수 있기 때문에, 균일한 당쇄 구조를 갖는다. 이 때문에, 본 발명에 따르면, 로트간의 격차가 적고, 품질이 안정적인 인터페론β활성을 갖는 당쇄 부가 폴리펩티드 및 해당 부가 폴리펩티드를 포함하는 의약조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드는, 생체 내에 존재하는 당쇄가 부가한 폴리펩티드일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 장기투여를 해도 인체에 안전한 당쇄 부가 폴리펩티드 및 해당 당쇄 부가 폴리펩티드를 포함하는 의약조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 천연형 인터페론β보다도 혈중 체류성이 높고, 항종양 활성도 높은 당쇄 부가 폴리펩티드 및 해당 당쇄 부가 폴리펩티드를 포함하는 의약조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드는, 천연형 인터페론β보다도 혈중 체류성이 높고, 또한, 항종양 활성도 높은 것으로 나타났다.
종래 기술로서 알려져 있는 PEG 수식을 한 인터페론β에서는, 천연형 인간 인터페론β와 비교해서, 혈중 체류성은 향상하지만, 항종양 활성의 향상은 볼 수 없었다. 본 발명에 따라, PEG보다도 분자량이 작은 당쇄를 이용하여, PEG 수식체와 같거나, 또는 그것을 웃도는 혈중 체류성의 향상을 실현할 수 있었던 것, 또한, PEG 수식체에서는 항종양 활성은 향상하지 않았음에도 불구하고, 본 발명의 당쇄 부가체에서는 항종양 활성이 현저하게 향상한 것은 놀라운 일이다. 따라서, 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드는, 높은 인터페론β활성을 갖고, 인터페론β에 관련하는 질환의 치료에 있어서 매우 유용하다고 생각된다.
〔도 1〕(실시예 3-1)로 얻어진 2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) 및 (실시예 4-1)로 얻어진 2-6 모노시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)에 대해서, 질량분석(ESI 이온화법)을 수행한 결과를 나타내는 질량 스팩트럼이다.
〔도 2〕(실시예 3-1)로 얻어진 2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) 및 (실시예 4-1)로 얻어진 2-6 모노시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)에 대해서, SDS-PAGE를 수행한 결과를 나타내는 사진이다.
〔도 3〕(실시예 3-1)로 얻어진 2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) 및 (실시예 4-1)로 얻어진 2-6 모노시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)의 당쇄 성분에 대해서, 순상 HPLC에 의한 분석을 수행한 결과를 나타내는 스펙트럼이다.
〔도 4〕2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C), 2-6 디시알로 (S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C), 2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)를 피하투여하였을 때의, 각 당쇄 부가 폴리펩티드의 혈장중 농도 추이를 나타내는 그래프이다.
〔도 5〕2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C), 2-6 디시알로 (S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C), 2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)를 피하투여하였을 때의, 각 당쇄 부가 폴리펩티드의 약물 속도론적 파라미터를 나타내는 표이다.
〔도 6〕2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C), 2-6 모노시알로 (S1C-Q48C-N79C-K107C)를 정맥 내 투여 및 피하투여하였을 때의, 각 당쇄 부가 폴리펩티드의 혈장중 농도 추이를 그래프화한 것이다. 왼쪽의 그래프가 정맥 내에 투여하였을 때의, 각 당쇄 부가 폴리펩티드의 혈장중 농도 추이를 그래프화한 것이고, 오른쪽의 그래프가 피하투여하였을 때의, 각 당쇄 부가 폴리펩티드의 혈장중 농도 추이를 나타내는 그래프이다.
〔도 7〕2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C), 2-6 모노시알로 (S1C-Q48C-N79C-K107C)를, 정맥 내 투여 및 피하투여하였을 때의, 각 당쇄 부가 폴리펩티드의 약물 속도론적 파라미터를 나타내는 표이다.
〔도 8〕2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C), 2-6 모노시알로 (S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)를 정맥 내 투여하였을 때의, 각 당쇄 부가 폴리펩티드의 혈장중 농도 추이를 나타내는 그래프이다.
〔도 9〕2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C), 2-6 모노시알로 (S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)를 정맥 내 투여하였을 때의, 각 당쇄 부가 폴리펩티드의 약물 속도론적 파라미터를 나타내는 표이다.
〔도 10〕2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C), PEG20K 수식 IFN-β를 피하투여하였을 때의, 각 당쇄 부가 폴리펩티드의 혈장중 농도 추이를 나타내는 그래프이다.
〔도 11〕2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C), PEG20K 수식 IFN-β를 피하투여하였을 때의, 각 당쇄 부가 폴리펩티드의 약물 속도론적 파라미터를 나타내는 표이다.
〔도 12〕2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C), 2-6 디시알로 (S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C), 2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C), 2-6 디시알로(S1C-N3C-Q48C-N79C-K107C-R112C)를 피하투여한 담암 마우스의 항종양 활성의 평가 결과를 나타내는 그래프이다.
〔도 13〕2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C), 2-6 모노시알로 (S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)를 피하투여한 담암 마우스의 항종양 활성의 평가 결과를 나타내는 그래프이다.
〔도 14〕2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C), 2-6 트리시알로 (S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C), 2-6 테트라시알로 (S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)를 피하투여한 담암 마우스의 항종양 활성의 평가 결과를 나타내는 그래프이다.
〔도 15〕2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C), PEG20K 수식 IFN-β를 피하투여한 담암 마우스의 항종양 활성의 평가 결과를 나타내는 그래프이다.
〔도 16〕본 발명의 인터페론β의 아미노산 서열의 예로서, 인터페론β-1b의 아미노산 서열(서열번호 1)을 나타낸다.
본 발명은, 시알릴화 당쇄가 부가된 폴리펩티드에 관한 것이다. 구체적으로는, 균일성이 높은 시알릴화 당쇄가 부가된 인터페론β활성을 갖는 당쇄 부가 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 명세서 중에서, “당쇄”란, 단위당(단당 및/또는 그의 유도체)이 1개 이상 연결되어 생긴 화합물을 말한다. 단위당이 2개 이상 연결된 경우, 각각의 단위당 사이는, 글리코시드 결합에 의한 탈수축합에 의해 결합한다. 이와 같은 당쇄로서는, 예를 들어, 생체 중에 함유된 단당류 및 다당류(글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 푸코오스, 자일로스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 시알산 및 이들의 복합체 및 유도체)외에, 분해된 다당, 당단백질, 프로테오글리칸, 글리코사미노글리칸, 당지질 등의 복합 생체물질로부터 분해 또는 유도된 당쇄 등 광범위한 것을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서, 바람직한 당쇄는, 인터페론 복합체의 인터페론β활성을 소실시키지 않는 당쇄이다. 이와 같은 당쇄는 특별히 한정되지 않고, 생체 내에서 복합 당질(당펩티드 또는 당단백질, 프로테오글리칸, 당지질 등)로서 존재하는 당쇄일 수 있고, 생체 내에서는 복합 당질로서 존재하지 않는 당질일 수 있다.
생체 내에서 복합 당질로서 존재하는 당쇄는, 본 발명의 인터페론 복합체가 체내에 투여된다는 관점에서 바람직하다. 생체 내에서 복합 당질로서 존재하는 당쇄로서는, 생체 내에서 당펩티드 또는 당단백질로서 펩티드 또는 단백질에 결합해 있는 당쇄인 N-결합형 당쇄, O-결합형 당쇄 등을 들 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서는, 바람직하게는 N-결합형 당쇄가 이용된다. N-결합형 당쇄로서는, 예를 들어, 고 만노오스(하이 만노오스)형, 복합(콤플렉스)형, 혼합(하이브리드)형을 들 수 있고, 특별히 바람직하게는 복합형이 좋다.
본 발명의 당쇄는, 당쇄의 비환원 말단이 모두 시알릴화되어 있는 것을 특징으로 한다. 본 명세서에서, “당쇄의 비환원 말단이 모두 시알릴화 되어 있다”란, 예를 들어, 2분기형 복합 당질의 경우는, 2개의 비환원 말단이 모두 시알릴화 되어 있는 것을 의미하고, 3분기형 복합 당쇄의 경우는, 3개의 비환원 말단이 모두 시알릴화 되어 있는 것을 의미하고, 4분기형 복합 당쇄의 경우는, 4개의 비환원 말단이 모두 시알릴화 되어 있는 것을 의미한다.
본 발명에서, 시알릴화란, 당쇄의 비환원 말단에 시알산이 결합해 있는 것을 의미한다. 시알산이란, 뉴라민산의 아미노기 또는 히드록시기가 치환된 것의 총칭이다. 본 발명에서는, 당쇄의 비환원 말단에 존재하는 시알산은, 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 인터페론 활성을 소실 또는 현저하게 저감시키는 것이 아닌 한, 뉴라민산의 모든 치환체를 포함할 수 있다. 그 중에서도, 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드가 생체에 투여된다는 관점에서, 본 발명에서 당쇄 부가 폴리펩티드의 당쇄의 시알릴화는, 천연에 존재하는 시알산인 것이 바람직하다. 천연에 존재하는 시알산으로서는, 예를 들어, 5번 위치가 아세틸화된 N-아세틸뉴라민산(Neu5Ac) 또는 5번 위치가 글리콜산으로 수식된 N-글라이콜릴뉴라민산(Neu5Gc) 등이 알려져 있다.
본 발명의 일 양태로서, 비환원 말단이 모두 시알릴화 되어 있는 당쇄의 구체예로서는, 예를 들어, 생체 내에 존재한다고 알려져 있는 당쇄로서, N-결합형 당쇄의 복합형 당쇄를 들 수 있다. N-결합형 당쇄의 복합형 당쇄로서는, N-결합형 당쇄의 복합형 당쇄로서 일반적으로 알려져 있는 당쇄의 기본 골격을 갖는 것이면, 그의 결합양식, 푸코오스의 유무, 측쇄의 치환기에 대한 수식의 유무 등이 다른 것이어도 포함된다. N-결합형의 복합형 당쇄로서는, 당쇄의 분기구조의 차이에 따라, 예를 들어, 디시알로 당쇄, 트리시알로 당쇄 및 테트라시알로 당쇄 등을 들 수 있다. 즉, 본 발명에서 “디시알로 당쇄”란, N-결합형의 복합형 당쇄로, 2분기형의 구조를 갖고 또한, 비환원 말단이 모두 시알릴화 되어 있는 것을 말한다. 마찬가지로, “트리시알로 당쇄”는, N-결합형의 복합형 당쇄로, 3분기형의 구조를 갖고 또한, 비환원 말단이 모두 시알릴화 된 것을 말한다. 마찬가지로, “테트라시알로 당쇄”는 N-결합형의 복합형 당쇄로, 4분기형의 구조를 갖고 또한, 비환원 말단이 모두 시알릴화 된 것을 말한다.
이들 당쇄로서는, 보다 구체적으로는, 하기식(1)로 나타내는 α2-6 디시알로 당쇄, 식(2)로 나타내는 α2-3 디시알로 당쇄, 식(3)으로 나타내는 α2-6 트리시알로당쇄 및 식(4)로 나타내는 α2-6 테트라시알로 당쇄 등을 들 수 있다.
〔화학식 5〕
Figure 112014113375492-pct00005
식(1)
〔화학식 6〕
Figure 112014113375492-pct00006
식(2)
〔화학식 7〕
Figure 112014113375492-pct00007
식(3)
〔화학식 8〕
Figure 112014113375492-pct00008
식(4)
본 발명의 시알릴화 당쇄는, 상기 구체예에 한정되지 않고, α2-3 트리시알로 당쇄, α2-3 테트라시알로 당쇄 등, 당쇄와 시알산과의 결합양식이 다른 것도 포함된다. 이들의 결합양식은, 시알릴화 당쇄에서 모든 분기쇄가 동일한 결합양식일 수 있고, 다른 결합양식이 포함될 수도 있다.
또한, 본 발명의 시알릴화 당쇄에는, 푸코오스가 붙은 것도 포함된다. 푸코오스가 붙은 복합형 당쇄로서는, 예를 들어, 디시알로 당쇄이면 하기식(13), 트리시알로 당쇄이면 하기식(15) 및 식(16), 테트라시알로 당쇄이면 하기식(17)을 구체예로서 들 수 있다.
〔화학식 9〕
Figure 112014113375492-pct00009
식(13)
〔화학식 10〕
Figure 112014113375492-pct00010
식(15)
〔화학식 11〕
Figure 112014113375492-pct00011
식(16)
〔화학식 12〕
Figure 112014113375492-pct00012
식(17)
본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드 중의 각 당쇄 부가 아미노산의 당쇄는, 모두 동일하다고 할 수도 있고, 다른 것을 포함할 수도 있다. 또한, 본 명세서 중에서, 당쇄 부가 폴리펩티드 중의 각 당쇄 부가 아미노산의 당쇄가 동일하다는 것은, 본 발명에서, 4 내지 6개 위치의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환될 경우에, 그의 4 내지 6개 위치의 당쇄 부가 아미노산의 당쇄 간을 비교했을 때, 당쇄를 구성하는 당의 종류, 결합순서 및 결합양식이 당쇄 부가 폴리펩티드 내에서 동일한 것을 말한다.
또한, 본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드를 포함하는 조성물에서, 당쇄 부가 폴리펩티드의 각 당쇄는, 각각 실질적으로 균일한 것이 바람직하다. 본 명세서에서, 당쇄 부가 폴리펩티드의 각 당쇄가 각각 실질적으로 균일하다, 란, 당쇄 부가 폴리펩티드 간에서 당쇄가 부가하는 위치마다 각 당쇄를 비교했을 경우에, 폴리펩티드의 위치가 동일하고 또한, 각각의 위치의 당쇄를 구성하는 당의 종류, 결합순서 및 당 간의 결합양식이 각 당쇄에서, 각각 실질적으로 동일하다는 것을 말한다. 본 발명에서, 당쇄 부가 폴리펩티드의 각 당쇄는, 적어도 90%이상, 바람직하게는 95%이상, 더 바람직하게는 99%이상 균일하다.
당쇄 부가 폴리펩티드의 각 당쇄가 각각 실질적으로 균일한 당쇄 부가 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 품질이 일정하고, 특히 의약품의 제조와 분석 등의 분야에 있어서 바람직하다. 균일한 당쇄의 비율은, 예를 들어, HPLC, 모세관 전기영동, 질량분석 등을 이용한 방법에 의해서 측정하는 것이 가능하다.
본 발명의 “서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열”은, 인터페론β-1b의 아미노산 서열이다(도 16 참조). 인터페론β-1b는, 천연의 인간형 인터페론β의 1번 위치의 Met이 결손하고, 17번 위치의 Cys이 Ser으로 치환되어 있다고 알려져 있다.
본 발명의 “당쇄 부가 폴리펩티드”는 예를 들어, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 등에서, 4 내지 6개 위치의 아미노산이 “당쇄 부가 아미노산”으로 치환된 것을 말한다.
본 명세서 중에서, “당쇄 부가 아미노산”이란, 당쇄가 결합한 아미노산이고, 여기서, 당쇄와 아미노산이란, 링커를 통해 결합해 있을 수 있다. 당쇄가 결합하는 아미노산의 종류에 특별히 한정은 없고, 천연 아미노산, 비천연 아미노산의 어느 쪽을 이용할 수도 있다.
당쇄와 아미노산이 링커를 통해 결합해 있는 경우, 링커와의 용이한 결합이라는 관점에서는, 당쇄 부가 아미노산의 아미노산은, 아스파라긴산과 글루타민산 등의 분자 내에 2개 이상의 카르복실기를 갖는 아미노산, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 트립토판 등의 분자 내에 2개 이상의 아미노기를 갖는 아미노산, 세린, 트레오닌, 타이로신 등의 분자 내에 수산기를 갖는 아미노산, 시스테인 등의 분자 내에 티올기를 갖는 아미노산, 아스파라긴, 글루타민 등의 분자 내에 아미드기를 갖는 아미노산이 바람직하다. 특히, 반응성의 관점에서는, 시스테인, 아스파라긴, 아스파라긴산, 글루타민산, 라이신, 아르기닌, 세린, 트레오닌, 글루타민이 바람직하다.
또한, 본 발명의 임의의 당쇄 부가 폴리펩티드에 대해서, 당쇄 구조, 당쇄 이외의 구조, 당쇄의 부가 부위 및 당쇄의 부가 수가 동일한 경우에, 당쇄 부가 아미노산이 당쇄 부가 Asn의 경우와 당쇄 부가 Cys의 경우로, 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 혈중 반감기에 큰 차이는 없다고 생각된다.
당쇄와 아미노산이 링커를 통해 결합해 있는 경우, 링커로서는, 해당 분야에서 이용되는 것을 폭넓게 사용할 수 있지만, 예를 들어, -NH-(CO)-(CH2)a-CH2- (식 중, a는 정수이고, 목적으로 하는 링커 기능을 방해하지 않는 한, 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 0 내지 4의 정수를 나타낸다.), C1 -10 폴리메틸렌, -CH2-R- (여기서, R은 알킬, 치환된 알킬, 알켄닐, 치환된 알켄닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 탄소환기(carbocyclic group), 치환된 탄소환기, 복소환기(heterocyclic group) 및 치환된 복소환기로 이루어진 군에서 선택되는 기로부터 수소 원자가 1개 이탈하여 생기는 기이다.), -(CO)-(CH2)a-(CO)- (식 중, a는 정수이고, 목적으로 하는 링커 기능을 방해하지 않는 한, 한정된 것은 아니지만, 바람직하게는 0 내지 4의 정수를 나타낸다.) 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드는, 그 기재(예를 들어, “아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 당쇄 부가 폴리펩티드”라고 하는 기재)에 의해 어떠한 제조방법이 한정되는 것은 아니고, 후술의 A법 또는 B법의 어느 방법으로 제조한 당쇄 부가 폴리펩티드라도 “아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 당쇄 부가 폴리펩티드”에 포함된다. 또한, 예를 들어, 아미노산이 결합해 있지 않은 당쇄를, 펩티드 상의 아미노산에 직접 또는 링커를 통해서 결합한 당쇄 부가 폴리펩티드; 당쇄 부가 폴리펩티드에서, 부가한 당쇄에 더 당 또는 당쇄를 부가함으로서, 이미 부가된 당쇄를 신장시킨 당쇄 부가 폴리펩티드; 당쇄 부가 아미노산의 아미노기 및/또는 카르복실기에 1 또는 수개의 아미노산을 결합시키고, 게다가 이것을 1 또는 복수의 인터페론β단편과 연결시킨 당쇄 부가 폴리펩티드; 아미노산이 결합한 당쇄를, 펩티드 상의 아미노산에 링커를 통해서 결합한 당쇄 부가 폴리펩티드 등도 최종적인 구조가 일치해 있는 한, 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드에 포함된다.
본 발명의 일 양태에서, 상술의 “4 내지 6개 위치의 아미노산”을 당쇄 부가 아미노산으로 치환하는 위치는, 당쇄 부가 아미노산의 치환에 의해 인터페론β의 활성이 저하하는 일이 없도록, 다양한 관점으로부터 선택해야 한다. 예를 들어, 천연의 인터페론β에서 당쇄가 결합해 있는 80번 위치의 Asn(서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열에서는 79번 위치에 해당)은, 본 발명에서 당쇄 부가 아미노산으로 치환하는 위치로서 바람직하다.
본 발명의 일 양태에서, 당쇄 부가 아미노산의 치환 위치로서는, 폴리펩티드의 폴딩에서, 인터페론β의 입체구조 형성에 장해가 되지 않도록 선택하는 것이 바람직하다. 인터페론β의 입체구조 형성에 장해가 되지 않도록 하기 위해서는, 당쇄 부가 아미노산의 치환 위치를, 인터페론β가 천연과 동일한 입체구조를 형성한 경우에, 입체구조의 표면에 존재하는 아미노산의 위치로 할 수 있다. 바꿔말하면, 인터페론β가 천연과 동일한 입체구조를 형성한 경우에, 입체구조의 표면 부근을 구성하지 않는 아미노산의 위치(본 발명에서“비 표면 아미노산의 위치”라고도 한다.)가 아닌 위치로 할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 양태에서, 당쇄 부가 아미노산의 치환 위치로서는, 인터페론β의 수용체 결합부위가 아닌 것이 바람직하다. 본 발명자들은, 인터페론β의 입체구조 해석 등의 데이터를 이용해 예의 검토를 수행하여, 인터페론β의 비 표면 아미노산의 위치와 그 외의 입체형성에 장해가 될 수 있는 위치, 수용체와의 결합에 장해가 될 수 있는 위치를 추정하였다. 이러한 관점에서, 본 발명의 일 양태에서, 당쇄 부가 아미노산은, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열에서 2, 5, 6, 9, 12, 13, 16, 19, 20, 23, 27, 33, 37, 39, 40, 43, 53, 54, 55, 57, 58, 61, 62, 64, 65, 68, 69, 73, 78, 83, 86, 87, 90, 93, 94, 100, 124, 125, 128, 131, 132, 138, 141, 142, 145, 148, 149, 152, 153, 156, 159, 160 또는 163번 위치에 해당하는 위치에 존재하지 않는 것이 바람직하다. 또한, 본 명세서를 본 당업자라면, 이들의 위치에 기준하여, 동일하게 당쇄 부가 아미노산의 치환 위치로서 바람직하지 않은 위치를 적절히 검토할 수 있을 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 당쇄 부가 아미노산의 치환 위치로서는, 천연의 인터페론β에서 디술피드 결합을 형성하고 있는 31번 위치와 141번 위치의 Cys(서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열에서는 30번 위치와 140번 위치에 해당)이 아닌 것이 바람직하다.
본 발명의 발명자들은, 상술과 같은 관점에서 예의 연구를 거듭하여, 아미노산 서열 상의 다양한 아미노산을 당쇄 부가 아미노산으로 치환한 많은 당쇄 부가 폴리펩티드를 합성하여 인터페론β활성을 측정하였다. 그 결과, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열에서, 적어도 1, 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 79, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139 및 164번 위치는, 당쇄 부가에 의한 인터페론β의 활성의 유지 또는 향상에 기여하는 위치인 것을 밝혔다.
상기의 이유로부터, 본 발명의 일 양태에서, 각 당쇄 부가 아미노산의 적어도 1개는, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열에서 1, 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 79, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139 및 164번 위치로 이루어진 군에서 선택되는 위치에 해당하는 위치에 존재하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 일 양태에서, 각 당쇄 부가 아미노산의 적어도 2개는, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열에서 1, 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 79, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139 및 164번 위치로 이루어진 군에서 선택되는 위치에 해당하는 위치에 존재하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 일 양태에서, 각 당쇄 부가 아미노산의 적어도 3개는, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열에서 1, 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 79, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139 및 164번 위치로 이루어진 군에서 선택되는 위치에 해당하는 위치에 존재하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 일 양태에서, 각 당쇄 부가 아미노산의 적어도 4개는, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열에서 1, 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 79, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139 및 164번 위치로 이루어진 군에서 선택되는 위치에 해당하는 위치에 존재하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 일 양태에서, 5개 위치 이상이 당쇄 부가 아미노산에 의해 치환되는 경우에는, 각 당쇄 부가 아미노산의 적어도 5개는, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열에서 1, 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 79, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139 및 164번 위치로 이루어진 군에서 선택되는 위치에 해당하는 위치에 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 양태에서는, 상술의 각 당쇄 부가 아미노산은, 모두 서열번호 l로 나타내는 아미노산 서열에 있어서 1, 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 79, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139 및 164번 위치로 이루어진 군에서 선택되는 위치에 해당하는 위치에 존재하는 것이 더 바람직하다.
본 발명의 일 양태에서는, 당쇄 부가 아미노산의 1개가 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열에서, 79번 위치의 아미노산에 해당하는 위치에 존재하는 것이 보다 바람직하다.
또한, 본 별명의 일 양태에서는, 그외의 (79번 위치 이외의)각 당쇄 부가 아미노산의 1개 내지 복수가, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열에서 1, 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139 및 164번 위치로 이루어진 군에서 선택되는 위치에 해당하는 위치에 존재하는 것이 바람직하다.
또한, 이들의 위치는 적절한 구체예이고, 여기에 열거한 위치에 한정을 하는 것은 아니다. 본 발명을 본 당업자라면, 본 발명과 동일하게 당쇄 부가 아미노산으로 치환하는 위치를 선택할 수 있을 것이다.
본 발명의 일 양태에서는, 각 당쇄 부가 아미노산의 1개는, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열에서 1번 위치에 해당하는 위치에 존재하는 것이 바람직하다.
본발명의 일 양태에서는, 각 당쇄 부가 아미노산의 1개는, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열에서 3번 위치에 해당하는 위치에 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 양태에서는, 각 당쇄 부가 아미노산의 1개는, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열에서 41번 위치에 해당하는 위치에 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 양태에서는, 각 당쇄 부가 아미노산의 1개는, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열에서 48번 위치에 해당하는 위치에 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 양태에서는, 각 당쇄 부가 아미노산의 1개는, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열에서 75번 위치에 해당하는 위치에 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 양태에서는, 각 당쇄 부가 아미노산의 1개는, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열에서 79번 위치에 해당하는 위치에 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 양태에서는, 각 당쇄 부가 아미노산의 1개는, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열에서 107번 위치에 해당하는 위치에 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 양태에서는, 각 당쇄 부가 아미노산의 1개는, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열에서 112번 위치에 해당하는 위치에 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 양태에서는, 각 당쇄 부가 아미노산의 1개는, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열에서 123번 위치에 해당하는 위치에 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 양태에서는, 각 당쇄 부가 아미노산의 1개는, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열에서 136번 위치에 해당하는 위치에 존재하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 일 양태에서는, 아미노산을 당쇄 부가 아미노산으로 치환하는 경우는, 상기의 치환 위치에서 선택된 위치의 임의의 조합으로 할 수 있다.
본 발명에서, 상술의 각 당쇄 부가 아미노산이 존재하는 위치로서 적절한 조합의 구체예로서는, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열에서, 하기의 위치에 해당하는 위치를 예시할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
1, 48, 79, 107, 112 및 123번 위치;
1, 3, 48, 79, 107 및 112번 위치;
1, 48, 79, 99, 107 및 112번 위치;
1, 48, 79, 107, 112 및 130번 위치;
1, 48, 79, 107, 112 및 136번 위치;
1, 48, 79, 107, 112 및 139번 위치;
1, 48, 79, 107, 112 및 164번 위치;
1, 29, 48, 79, 107 및 136번 위치;
1, 35, 48, 79, 107 및 136번 위치;
1, 41, 48, 79, 107 및 136번 위치;
1, 48, 75, 79, 107 및 136번 위치;
48, 75, 79, 107, 112 및 136번 위치;
41, 75, 79, 103, 107 및 136번 위치;
41, 75, 79, 106, 107 및 136번 위치;
41, 75, 79, 107, 109 및 136번 위치;
41, 75, 79, 107, 112 및 136번 위치;
41, 75, 79, 107, 115 및 136번 위치;
41, 75, 79, 107, 119 및 136번 위치;
1, 28, 48, 70 및 79번 위치;
1, 48, 79, 107 및 112번 위치;
24, 79, 107, 112 및 136번 위치;
25, 79, 107, 112 및 136번 위치;
32, 79, 107, 112 및 136번 위치;
35, 79, 107, 112 및 136번 위치;
38, 79, 107, 112 및 136번 위치;
41, 79, 107, 112 및 136번 위치;
7, 79, 107, 112 및 136번 위치;
48, 79, 107, 112 및 136번 위치;
75, 79, 107, 112 및 136번 위치;
41, 75, 79, 107 및 136번 위치;
42, 75, 79, 107 및 136번 위치;
45, 75, 79, 107 및 136번 위치;
46, 75, 79, 107 및 136번 위치;
47, 75, 79, 107 및 136번 위치;
48, 75, 79, 107 및 136번 위치;
49, 75, 79, 107 및 136번 위치;
50, 75, 79, 107 및 136번 위치;
1, 48, 79 및 107번 위치;
1, 3, 48 및 79번 위치;
79, 107, 112 및 136번 위치;
1, 79, 107 및 136번 위치;
28, 79, 107 및 136번 위치;
35, 79, 107 및 136번 위치;
70, 79, 107 및 136번 위치; 및
75, 79, 107, 및 136번 위치.
본 명세서에서, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열의 위치에 해당하는 위치란, 아미노산의 부가, 결실 등이 없는 한, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열의 아미노산의 위치에 대응하는 위치의 아미노산을 말한다. 또한 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열 내에서, 아미노산의 부가, 결실이 존재하는 경우에는, 아미노산의 부가, 결실에 따른 아미노산 서열상의 이동을 고려한 위치에 있는 아미노산을 말한다. 예를 들어, 1번 위치 내지 4번 위치까지 Ser1-Tyr2-Asn3-Leu4- 의 서열을 갖는 당쇄 부가 인터페론β-1b에서, 1번 위치와 2번 위치의 아미노산 간에 1개의 아미노산(Trp)이 부가된 경우(Ser-Trp-Tyr-Asn-Leu-)에, “2번 위치(Tyr)에 해당하는 위치”란, Trp의 부가에 따라 C말단 측으로 1개 이동한 아미노산(Tyr)의 위치를 말한다.
본 명세서 중에서, “아미노산”이란, 그의 가장 넓은 의미로 이용되고, 천연의 아미노산뿐만 아니라, 아미노산 변이체 및 유도체와 같은 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 당업자라면, 이 넓은 정의를 고려하여 본 명세서 중의 아미노산으로서, 예를 들어, 천연의 단백질원성(proteinogenic) L-아미노산; D-아미노산; 아미노산 변이체 및 유도체 등의 화학수식된 아미노산; 노르로이신, β-알라닌, 오르니틴 등의 천연의 비단백질원성 아미노산; 및 아미노산의 특징인 당업계에 공지된 특성을 갖는 화학적으로 합성된 화합물 등을 들 수 있는 것을 이해할 것이다. 비천연 아미노산의 예로서, α-메틸아미노산(α-메틸알라닌 등), D-아미노산, 히스티딘 유사 아미노산(2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, α플루오로메틸-히스티딘 및 α-메틸-히스티딘 등), 측쇄에 여분의 메틸렌을 갖는 아미노산(“호모”아미노산) 및 측쇄 중의 카르복실산 관능기 아미노산이 술폰산기로 치환된 아미노산(시스테인산 등)을 들 수 있다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 화합물에 포함되는 아미노산은, 천연 아미노산만으로 이루어진다.
본 발명에서, “서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열”은, 인터페론β-1b의 아미노산 서열을 나타낸다(도 16 참조). 인터페론β-1b는, 천연의 인간형 인터페론β의 1번 위치의 Met이 결실하고, 17번 위치의 Cys이 Ser으로 치환되어 있다고 알려져 있다.
본 명세서 중에서, “아미노산 서열의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된”인 경우, 치환 등이 되는 아미노산의 개수는, 인터페론β활성을 유지하는 한, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 정도의 아미노산이 다르다는 것을 의미한다. 또는, 전체의 아미노산 서열의 길이는 20%이내, 바람직하게는 10%이내의 아미노산이 다른 경우도 포함할 수 있다. 치환 또는 부가된 아미노산은, 천연의 아미노산, 비천연의 아미노산 또는 아미노산 아날로그일 수 있고, 바람직하게는 천연의 아미노산이다. 본 발명의 일 양태로서, “아미노산 서열의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된”폴리펩티드로서는, 천연형의 인간 인터페론β를 들 수 있다. 전술과 같이, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 즉, 인터페론β-1b는, 천연의 인간형 인터페론β의 1번 위치의 Met이 결손하고, 17번 위치의 Cys이 Ser으로 치환된 것이다. 즉, 천연형의 인간 인터페론β는, 서열번호 1로 나타내는 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드에 대해서 1개의 아미노산이 부가하고 1개의 아미노산이 치환된 것이다. 본 발명의 명세서를 본 당업자라면, 본 명세서의 개시를 참조하여, 본건의 실시예에 이용된 인간 인터페론β-1b의 아미노산 서열 대신에, 천연형의 인간 인터페론의 아미노산 서열(인터페론β-1a)를 이용해도, 본 발명과 동일한 당쇄 부가 펩티드를 제조하여 사용할 수 있다. 천연형의 인간 인터페론β-1a의 아미노산 서열을 서열번호 2로서 나타낸다. 본 발명의 일 양태에서, 본건의 실시예에 이용된 인터페론β-1b의 아미노산 서열 대신에, 천연형의 인간 인터페론β-1a의 아미노산 서열을 이용하는 경우에는, 천연의 80번 위치에 불균일한 당쇄가 결합해 있지 않은 아미노산 서열을 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서, “인터페론β의 유사체”란, 인터페론β와 구조상 유사한 폴리펩티드 및/또는 인터페론β와 중복된 구조를 갖는 폴리펩티드, 예를 들어, 인터페론β의 아미노산의 1 또는 수개의 아미노산이 보존적으로 치환된 폴리펩티드, 인터페론β개변체, 인터페론β활성을 갖는 인터페론β의 단편, 인터페론β활성을 갖는 신장 인터페론β를 들 수 있다.
본 명세서 중에서, “아미노산의 1 또는 수개의 아미노산이 보존적으로 치환된”이란, 아미노산 치환에서 원래의 아미노산과 치환된 아미노산과의 친수성 지수 및/또는 소수성 지수가 유사한 치환으로, 이와 같은 치환의 전후에서, 인터페론β활성의 분명한 저하 또는 소실이 생기지 않는 치환을 말한다.
본 명세서 중에서, “인터페론β개변체”란, 인터페론β의 개변체로서, 인터페론β의 천연에 존재하는 변이체 또는 인터페론β를 인공적으로 개변한 화합물을 포함하고, 이와 같은 개변으로서는, 예를 들어, 인터페론β의 1 또는 복수의 아미노산 잔기의 알킬화, 아실화(예를 들어, 아세틸화), 아미드화, 카르복실화, 에스테르화, 디술피드 결합형성, 글리코실화, 지질화, 인산화, 수산화, 표지성분의 결합 등을 들 수 있다.
본 명세서, “인터페론β활성을 갖는 인터페론β의 단편”이란, 인터페론β의 N말단 및/또는 C말단으로부터 1개 또는 그 이상의 아미노산이 결실하고 또한, 인터페론β활성을 유지한 펩티드이다.
본 명세서 중에서, “인터페론β활성을 갖는 신장 인터페론β”란, 인터페론 N말단 및/또는 C말단에 1개 또는 그 이상의 아미노산이 부가되고, 또한, 인터페론β활성을 유지한 펩티드이다.
본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드는, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열과 80%이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드에서, 4 내지 6개 위치의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환되어 있는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드는, 당업자에 공지된 펩티드 합성 방법으로, 당쇄 부가 공정을 넣음으로서 제조할 수 있다. 당쇄 부가에 대해 고려하여, 트랜스 글루타미나아제로 대표되는 효소를 이용하는 방법도 이용할 수 있지만, 이 경우, 부가하는 당쇄가 다량으로 필요해 진다, 최종 공정 후의 정제가 번잡해 진다, 당쇄 부가 위치 및 부가 가능한 당쇄가 제한된다,는 등의 문제가 있기 때문에, 분석용 등의 소량의 합성에는 이용하는 것이 가능하여도, 의약품 제조 등의 대규모 제조에는 실용적인 방법이라고는 말할 수 없는 것이다.
본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 간단한 제조 방법으로, 또한, 당쇄의 구조가 균일한 당쇄 부가 폴리펩티드의 안정적인 제조방법의 구체예로서, 이하, 당쇄 부가 아미노산으로서 당쇄 부가 Asn을 사용하고, 고상합성, 액상합성 등의 공지된 펩티드 합성방법을 적용함으로서 당쇄 부가 폴리펩티드를 제조하는 방법(A법) 및 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 등의 임의의 아미노산을 Cys으로 치환한 폴리펩티드를 공지된 펩티드 합성방법에 따라 제조하고, 그 후에, Cys으로 화학합성에 의해 당쇄를 부가하고, 당쇄 부가 폴리펩티드를 제조하는 방법(B법)을 예시한다. 이들의 제조방법을 참고로, 당업자라면 다양한 당쇄 부가 폴리펩티드를 제조하는 것이 가능하고, 얻어진 당쇄 부가 폴리펩티드 및 그 제조 방법은, 특히 의약품 제조의 분야에서 매우 유용하다.
또한, 이들의 A법 및 B법은, 2개 이상을 조합하여 수행하는 것도 가능하다. 분석 등에 이용하는 소량의 합성이라면, 더욱이, 상기의 방법에 전이효소에 의한 당쇄 신장 반응을 조합시키는 것도 가능하다. 또한, A법은, 국제공개 제2004/005330호 팜플렛(US2005222382(A1))에, B법은, 국제공개 제(2005/010053호 팜플렛(US2007060543(A1))에, 각각 기재되어 있고, 그 개시는 전체적으로 본 명세서에 참조로 삽입된다. 또한, A법 및 B법에서 이용되는 당쇄 구조가 균일한 당쇄의 구조에 관해서는, 국제공개 제03/008431호 팜플렛(US2004181054(A1)), 국제공개 제2004(058984호 팜플렛(US2006228784(A1)), 국제공개 제2004/058824호 팜플렛 (US2006009421(A1)), 국제공개 제2004/070046호 팜플렛(US2006205039(A1)), 국제공개 제 2007/011055호 팜플렛 등에 기재되어 있고, 그 개시는 전체적으로 본 명세서에 참조로 삽입된다.
당쇄 부가 폴리펩티드를 제조하는 방법(A법)
당쇄 부가 폴리펩티드는 예를 들어, 이하에 개략을 나타내는 당쇄 부가 Asn을 이용한 고상합성에 의해 제조할 수 있다.
(1) 지용성 보호기로 아미노산기 질소가 보호된 아미노산의 카르복실기를 수지(레진)로 결합시킨다. 이 경우, 아미노산의 아미노기 질소를 지용성 보호기로 보호하고 있기 때문에, 아미노산 간의 자기축합은 방지되고, 레진과 아미노산이 반응하여 결합이 일어난다.
(2) 얻어진 반응물의 지용성 보호기를 이탈하여 유리 아미노기를 형성시킨다.
(3) 이 유리 아미노기와 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 임의의 아미노산의 카르복실기를 아미드화 반응시킨다.
(4) 상기 지용성 보호기를 이탈하여 유리 아미노기를 형성시킨다.
(5) 상기 (3) 및 (4)의 공정을 1회 이상 반복함으로서, 임의의 수의, 임의의 아미노산이 연결되고, 말단에 레진을 결합하고, 다른 말단에 유리 아미노기를 갖는 펩티드가 얻어진다.
(6) 마지막으로, 산으로 레진을 절단함으로서, 원하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 얻을 수 있다.
여기서, (1)에서, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 아미노산 대신에, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 당쇄 부가 Asn을 이용하여, 해당 아스파라긴 부분의 카르복실기와 레진의 수산기를 반응시키면, C말단에 당쇄 부가 Asn을 갖는 펩티드를 얻을 수 있다.
또한, (2)의 이후, 또는 (3)과 (4)를 1회 이상 임의의 횟수 반복한 후, (3)에서, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 아미노산 대신에, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 당쇄 부가 Asn을 이용하면, 임의의 위치에 당쇄를 부가할 수 있다.
이와 같이, (1) 및 (3)의 어느 공정에서, 2회 이상, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 아미노산 대신에, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 당쇄 부가 Asn을 이용함으로서, 임의의 2개 이상의 위치에 당쇄가 부가된 펩티드를 얻을 수 있다.
당쇄 부가 아미노산을 결합시킨 후, 지용성 보호기를 이탈하여 유리 아미노기를 형성시키고, 그 직후에 공정(6)을 수행하면, N말단에 당쇄 부가 Asn을 갖는 펩티드를 얻을 수 있다.
수지(레진)로서는, 보통, 고상합성으로 사용하는 수지(레진)일 수 있고, 예를 들어, 염소로 관능화된 2-클로로트리틸클로라이드 수지(Merck 사제)와 아미노기로 관능화된 Amino-PEGA 레진(Merck 사제), 수산기를 갖는 NovaSyn TGT 알콜 수지(Merck사제), Wang 레진(Merck 사제), HMPA-PEGA 레진(Merck 사제) 등을 이용할 수 있다. 또한, Amino-PEGA 레진과 아미노산과의 사이에 링커를 존재시킬 수도 있으며, 이와 같은 링커로서 예를 들어, 4-히드록시메틸페녹시아세트산(HMPA), 4-(4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시)-부틸아세트산(HMPB) 등을 들 수 있다.
또한, C말단을 아미드화하는 경우에는, 예를 들어, 아미노기로 관능화된 Rink-Amide-PEGA 레진(Merck 사제)를 이용하는 것이 바람직하다. 이 레진과 펩티드를 산으로 절단함으로서, 펩티드의 C말단 아미노산을 아미드화할 수 있다.
수지와 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 아미노산과의 결합은, 예를 들어, 수산기를 갖는 수지와 염소로 관능화된 수지를 사용하려면, 아미노산의 카르복실기를 수지로 에스테르 결합시킨다. 또한, 아미노기로 관능화된 수지를 사용하는 경우에는, 아미노산의 카르복실기를 수지에 아미드 결합에 의해 결합시킨다.
아미노산으로서는 모든 아미노산을 이용할 수 있고, 예를 들어, 천연 아미노산인 세린(Ser), 아스파라긴(Asn), 발린(Val), 루신(Leu), 이소루신(Ile), 알라닌 (Ala), 타이로신(Tyr), 글리신(Gly), 라이신(Lys), 아르기닌(Arg), 히스티딘 (His), 아스파라긴산(Asp), 글루탐산(Glu), 글루타민(Gln), 트레오닌(Thr), 시스테인(Cys), 메티오닌(Met), 페닐알라닌(Phe), 트립토판(Trp), 프로린(Pro)을 들 수 있다.
또한, 상기 천연 아미노산의 D체를 사용할 수도 있다.
지용성 보호기로서는, 예를 들어, 9-플루오렌메톡시카르보닐(Fmoc)기, t-부틸옥시카르보닐(Boc)기, 벤질기, 알릴기, 알릴옥시카르보닐기, 아세틸기 등의 카보네이트계 또는 아미드계의 보호기 등을 들 수 있다. 아미노산에 지용성 보호기를 도입하려면, 예를 들어, Fmoc기를 도입하는 경우에는, 9-플루오렌메틸-N-석시니미딜카보네이트와 탄산수소나트륨을 부가하여 반응을 수행함으로서 도입할 수 있다. 반응은 0 내지 50℃, 바람직하게는 실온에서, 약 1 내지 5시간 정도 수행하는 것이 좋다.
지용성 보호기로 보호한 아미노산으로서는, 시판의 것도 사용할 수 있다. 예를 들어, Fmoc-Ser-OH, Fmoc-Asn-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Tyr-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys-OH, Fmoc-Arg-OH, Fmoc-His-OH, Fmoc-Asp-OH, Fmoc-Glu-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Thr-OH, Fmoc-Cys-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Pro-OH를 들 수 있다.
또한, 지용성 보호기로 보호한 아미노산으로, 측쇄에 보호기를 도입한 것으로서, 예를 들어, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Cys(StBu)-OH, Fmoc-Cys(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH를 들 수 있다.
또한, 당쇄 부가 폴리펩티드의 아미노산 서열 중에, 링커를 부가시키고 싶은 경우에는, 고상합성의 공정에서, 상기의 지용성 보호기로 보호한 아미노산 대신에, 지용성 보호기로 보호한 링커를 사용함으로서, 바람직한 위치에 링커를 삽입할 수 있다.
2-클로로트리틸클로라이드 수지를 이용하는 경우, 디이소프로필에틸아민(DIPEA), 트리에틸아민, 피리딘, 2,4,6-콜로딘 등의 염기를 이용함으로서 에스테르화를 수행할 수 있다. 또한, 수산기를 갖는 수지를 이용하는 경우, 에스테르화 촉매로서, 예를 들어, 1-메시틸렌술포닐-3-니트로-1,2,4-트리아졸(MSNT), 디시클로헥실카르보디이미드(DCC), 디이소프로필카르보디이미드(DIC) 등의 공지된 탈수축합제를 이용할 수 있다. 아미노산과 탈수축합제와의 사용비율은, 전자 1중량부에 대해서, 후자가 보통, 1 내지 10중량부, 바람직하게는 2 내지 5중량부이다.
에스테르화 반응은, 예를 들어, 고상 컬럼에 레진을 넣고 이 레진을 용제로 세척하고, 그 후, 아미노산 용액을 부가함으로서 수행하는 것이 바람직하다. 세척용 용제로서는, 예를 들어, 디메틸포름아미드(DMF), 2-프로판올, 디클로로메탄 등을 들 수 있다. 아미노산을 용해하는 용매로서는, 예를 들어, 디메틸설폭시드(DMSO), DMF, 디클로로메탄 등을 들 수 있다. 에스테르화 반응은 0 내지 50℃, 바람직하게는 실온에서, 약 10분 내지 30시간 정도, 바람직하게는 15분 내지 24시간 정도 수행하는 것이 좋다.
이때, 고상 상의 미반응 수산기를 무수아세트산 등을 이용해 아세틸화하여 캐핑하는 것도 바람직하다.
지용성 보호기의 이탈은, 예를 들어, 염기로 처리함으로서 수행할 수 있다. 염기로서는, 예를 들어, 피페리딘, 모폴린 등을 들 수 있다. 이때, 용매의 존재하에서 수행하는 것이 바람직하다. 용매로서는, 예를 들어, DMSO, DMF, 메탄올 등을 들 수 있다.
유리 아미노기와, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 임의의 아미노산의 카르복실기와의 아미드화 반응은, 활성화제 및 용매의 존재하에서 수행하는 것이 바람직하다.
활성화제로서는, 예를 들어, 디시클로헥실카르보디이미드(DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드·염산염(WSC/HCl), 디페닐포스포릴아자이드(DPPA), 카르보닐디이미다졸(CDI), 디에틸시아노포스포네이트(DEPC), 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스피로리디노포스포늄(DIPCI), 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스피롤리디노포스포늄엑사풀루오로포스페이트(PyBOP), 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt), 히드록시석신이미드(HOSu), 디메틸아미노피리딘 (DMAP), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt), 히드록시프탈이미드(HOPht), 펜타풀루오로페놀(Pfp-OH), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸유로니움헥사플루오로포스페이트(HBTU), 1-〔비스(디메틸아미노)메틸렌〕-5-클로로-1H-벤조트라아졸륨 3-옥시드 헥사풀루오로포스페이(HCTU), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸유로니움헥사풀루오로포스페이트(HATU), O-벤조트리아졸-1-일-1,1,3,3-테트라메틸유로니움테트라풀루오르붕산염(TBTU), 3,4-디히드로-3-히드로디-4-옥사-1,2,3-벤조트리아진(Dhbt) 등을 들 수 있다.
활성화제의 사용량은, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 임의의 아미노산에 대해서, 1 내지 20당량, 바람직하게는 1 내지 10당량, 더 바람직하게는 1 내지 5당량으로 하는 것이 바람직하다.
용매로서는, 예를 들어, DMSO, DMF, 디클로로메탄 등을 들 수 있다. 반응은 0 내지 50℃, 바람직하게는 실온으로, 약 10 내지 30 시간 정도, 바람직하게는 15분 내지 24시간 정도 수행하는 것이 좋다. 지용성 보호기의 이탈은, 상기와 동일하게 수행할 수 있다.
수지(레진)로부터 펩티드쇄를 절단하려면 산으로 처리하는 것이 바람직하다. 산으로서는, 예를 들어, 트리플루오로아세트산(TFA), 플루오린화수소(HF) 등을 들 수 있다.
이와 같이하여, 원하는 위치를 당쇄 부가 Asn으로 치환한 당쇄 부가 폴리펩티드를 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시양태에 있어서, 고상합성에 이용하는 당쇄 부가 Asn의 당쇄 상의 비환원 말단에 시알산을 포함하는 경우에는, 산 처리에 의해 시알산이 절단되는 것을 막기 위해서, 해당 시알산의 카르복실기를, 보호기에 의해 보호하는 것이 바람직하다. 보호기로서는, 예를 들어, 벤질기, 알릴기, 디페닐메틸기 등을 들 수 있다. 보호기의 도입 및 보호기의 이탈 방법은, 공지된 방법에 의해 수행할 수 있다.
당쇄 부가 폴리펩티드를 제조하는 방법(B법)
당쇄 부가 폴리펩티드는, 우선 펩티드쇄를 합성하고, 후에 합성한 펩티드쇄로 당쇄를 부가하는 방법에 의해서도 제조할 수 있다. 구체적으로는, 당쇄를 부가하고 싶은 위치에 Cys를 포함하는 펩티드를, 고상합성법, 액상합성법, 세포에 의해 합성하는 방법, 천연에 존재하는 것을 분리추출하는 방법 등에 의해 제조한다. 여기서, 디술피드 결합을 형성할 예정인 위치에 있는 Cys 등, 당쇄를 부가하지 않는 Cys에 대해서는, 예를 들어, 아세토아미드메틸(Acm)기로 보호해 둔다. 또한, 당쇄를 부가하지 않고, 또한, 디술피드 결합의 형성에도 사용하지 않는 Cys를 당쇄 부가 폴리펩티드에 도입하는 경우에는, 당쇄 부가 공정 및 디술피드 결합 형성 공정 동안, Cys를 보호기에 의해 보호해 두고, 그 후에 탈 보호 하도록 하여 Cys를 도입할 수 있다. 이와 같은 보호기로서는, 예를 들어, tert-부틸(tBu)과 4-메톡시벤질을 들 수 있다.
또한, 당쇄 부가 폴리펩티드 중의 Cys에, 다른 당쇄를 부가하는 경우에는, 처음에 당쇄를 도입하는 Cys를 무보호로 하고, 다음으로 다른 당쇄를 도입하는 Cys를, StBu 등에 의해 보호해 둠으로서, 다른 당쇄를 도입할 수 있다. 구체적으로는, 고상합성 등에 의해 펩티드를 합성할 때, 첫 번째 당쇄를 도입하고 싶은 Cys를 무보호로 하고, 또한, 두 번째 당쇄를 도입하고 싶은 Cys를 Fmoc-Cys(StBu)-OH 등을 이용하여, 보호기를 갖는 Cys로 한다. 그 다음, StBu 등의 보호기를 보유한 채, 무 보호의 Cys로 당쇄를 도입한다. 다음으로, StBu기 등을 탈보호함으로서, 무보호된 Cys로 다른 당쇄를 도입할 수 있다. 또한, 첫 번째 당쇄를 도입하고 싶은 Cys 및 두 번째 당쇄를 도입하고 싶은 Cys는, 1 또는 복수 개로 할 수 있다.
또한, StBu기의 탈보호는, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀염산염(TCEP), 디티오트레이톨(DTT), 트리부틸포스핀 등의 환원제를 이용하여 반응시킴으로서 탈보호할 수 있다. 상기 반응은, 보통, 0 내지 80℃, 바람직하게는 5 내지 60℃, 더 바람직하게는 10 내지 35℃로 수행하는 것이 좋다. 반응 시간은, 바람직하게는 보통, 30분 내지 5시간 정도이다. 반응종료 후는, 적당한 공지된 방법(예를 들어, 고속액체 컬럼크로마토그래피(HPLC))로 정제하는 것이 좋다.
당쇄 부가 폴리펩티드의 아미노산 서열 중에, 링커를 부가시키고 싶은 경우에는, 예를 들어, 고상합성의 과정에서, 지용성 보호기로 보호한 아미노산 대신에, 지용성 보호기로 보호한 링커를 사용함으로서, 합성한 폴리펩티드의 바람직한 위치에, 링커를 삽입할 수 있다.
다음으로, 할로아세틸화 복합형 당쇄 유도체를 상기에서 얻은 무보호의 Cys를 포함하는 펩티드와 반응시킴으로서, 당쇄를 무보호 Cys의 티올기와 반응시켜, 펩티드에 결합시킨다. 상기 반응은, 인산 완충액, 트리스-염산 완충액, 구연산 완충액 또는 이들의 혼합용액 중에서, 보통, 0 내지 80℃, 바람직하게는, 10 내지 60℃, 더 바람직하게는 15 내지 35℃로 수행하는 것이 좋다. 반응 시간은, 보통, 10분 내지 24시간, 바람직하게는 보통, 30분 내지 5시간 정도이다. 반응종료 후는, 적당한 공지된 방법(예를 들어, HPLC)로 정제하는 것이 좋다.
할로아세틸화 복합형 당쇄 유도체는, 예를 들어, 복합형 아스파라긴 결합형 당쇄의 1번 위치의 탄소에 결합해 있는 수산기를, -NH-(CH2)a-(CO)-CH2X (X는 할로겐 원자, a는 정수이고, 목적으로 하는 링커 기능을 방해하지 않는 한 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 0 내지 4의 정수를 나타낸다.)로 치환한 화합물이다.
구체적으로는, 할로아세틸화 복합형 당쇄 유도체와 Cys함유 펩티드를 인산 완충액 중에서 실온으로 반응시킨다. 반응종료 후, HPLC로 정제함으로서, 당쇄 부가 Cys로 치환한 당쇄 부가 폴리펩티드를 얻을 수 있다.
또한, DMSO, DMF, 메탄올, 아세트나이트릴과 같은 유기용매와 상기의 완충액과의 혼합용액 중에서 반응을 수행할 수 있다. 이 때, 유기용매의 비율은, 0 내지 99%(v/v)의 범위에서, 상기 완충액에 첨가할 수 있다. 완충액으로의 용해도가 낮은 무보호의 Cys를 포함하는 펩티드는, 이와 같은 유기용매를 첨가함으로서 반응용액으로의 용해성을 향상시킬 수 있어 바람직하다.
또한, DMSO, DMF, 메탄올, 아세트나이트릴과 같은 유기용매 또는 그들의 혼합용액 중에서 반응을 수행할 수도 있다. 이때, 염기의 존재하에서 수행하는 것이 바람직하다. 염기로서는, 예를 들어, DIPEA, 트리에틸아민, 피리딘, 2,4,6-콜리딘 등을 들 수 있다.
또한, 구아니딘 염산염과 요소(urea)를 완충용액에 부가한 혼합용액 중에서도 반응을 수행할 수 있다. 또한, 구아니딘 염산염과 요소는, 최종 농도가 1 M 내지 8 M이 되도록 상기 완충액에 부가할 수 있다. 구아니딘 염산염과 요소의 첨가에 의해서도 완충액으로서의 용해성이 낮은 펩티드의 용해성을 상승시킬 수 있어 바람직하다.
게다가, 무보호의 Cys를 포함하는 펩티드가 디술피드 결합을 통해 2량체를 형성하는 것을 방지하기 위해서, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 염산염(TCEP) 또는 디티오트레이톨(DTT)을 완충액에 첨가하여 반응시킬 수도 있다. TCEP 또는 DTT는, 최종농도가 10μM 내지 10mM이 되도록 완충액에 부가할 수 있다.
또한, 당쇄를 목적의 Cys로 결합시킨 후, Acm 등으로 보호된 Cys의 보호기를 탈보호한다. 보호기가 Acm기인 경우는, 물, 메탄올, 아세트산 또는 이들의 혼합용액 중에서, 요오드, 아세트산 수은(Ⅱ), 질산은(Ⅰ) 또는 아세트산은(Ⅰ) 등을 이용하여 반응시킴으로서, 탈 보호할 수 있다.
상기 반응은, 보통, 0 내지 80℃, 바람직하게는 5 내지 60℃, 더 바람직하게는 10 내지 35℃로 수행하는 것이 좋다. 반응시간은, 바람직하게는 보통, 5분 내지 24시간 정도이다. 반응종료 후는, DTT 또는 염산 등에 의해 처리한 후, 적절한 공지된 방법(예를 들어, HPLC)로 정제하는 것이 좋다.
이와 같이하여, 원하는 위치를 당쇄 부가 Cys로 치환한 당쇄 부가 폴리펩티드를 얻을 수 있다. 또한, 이와 같이 정제된 당쇄 부가 폴리펩티드는, 후술과 같이, 탈보호된 Cys간의 디술피드 결합을 형성시킨다.
또한, 디시알로 당쇄와 모노시알로 당쇄 등의 시알산 함유 당쇄를 펩티드 서열 중에 복수 개 갖는 당쇄 부가 폴리펩티드를 제조할 때에는, 도입하는 당쇄 상의 시알산의 카르복실기가 벤질(Bn)기, 알릴기, 디페닐메틸기, 페나실기 등에 의해 보호된 시알산 함유 당쇄를 이용할 수 있다.
시알산의 카르복실기가 보호된 당쇄를 도입할 때에는, 당쇄 부가 폴리펩티드의 디술피드 결합의 형성 공정 후, 시알산 보호기의 탈보호의 공정을 할 수 있다.
이와 같이, 시알산의 카르복실기를 벤질기 등으로 보호함으로서, 제조 공정의 HPLC 등에 의한 분리·정제 공정이 쉬워진다. 또한, 시알산의 카르복실기의 보호는, 산에 불안정한 시알산의 이탈을 막는 것도 가능하다.
당쇄 상의 시알산의 카르복실기의 보호반응은, 당업자에 주지된 방법에 의해 수행할 수 있다. 또한, 디술피드 결합을 형성시킨 당쇄 부가 폴리펩티드에서 시알산의 카르복실기의 보호기는, 염기성 조건하에서 가수분해함으로서 탈 보호할 수 있다. 상기 반응은, 보통, 0 내지 50℃, 바람직하게는 0 내지 40℃, 더 바람직하게는 0 내지 30℃로 수행하는 것이 좋다. 반응시간은, 바람직하게는 보통, 5분 내지 5시간 정도이다. 반응종료 후는, 인산과 아세트산 등의 약산에 의해서 중화한 후, 적당한 공지된 방법(예를 들어, HPLC)로 정제하는 것이 좋다.
또한, 상기 A법 및 B법에 의해 제작된 당쇄 부가 폴리펩티드는, 공기 및/또는 산소, 요오드, DMSO, 산화 및 환원된 글루다티온의 혼합물, 페리시안산칼륨, 엘만시약(5,5＇-디티오비스(2-니트로벤조산)), 탈륨트리플루오로아세테트산(Ⅲ) 및 알킬트리클로로실란술폭시드 등을 이용한 당업자에 주지된 방법으로, Cys간의 디술피드 결합을 형성할 수 있다.
또한, Cys-Cys간에서의 디술피드 결합을 형성시킬 때에, 디술피드 결합하는 것이 바람직하지 않은 당쇄 부가 폴리펩티드 중의 Cys에 대해서는, 보호기에 의해 보호해둔다. 이러한 보호기로서는, Acm, tBu, 4-메톡시벤질, 4-메틸벤질 등, 산화 조건에서 안정적인 보호기를 이용할 수 있다.
또한, B법에서, 디술피드 결합의 형성은, 당쇄의 도입 전에 수행하는 것도 가능하다. 단, 디술피드 결합시키고 싶은 Cys에 보호기가 도입되어 있는 경우에는, 탈 보호 공정이 디술피드 결합 형성의 공정보다 우선이 된다.
(활성)
본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드는, 인터페론β활성을 가지고 있다. 본 명세서에서 “인터페론β활성”이란, 면역조정 작용, 항바이러스 활성, 항종양 활성 등 공지된 활성 중 적어도 1개의 활성을 갖는 것을 의미한다.
예를 들어, 당쇄 부가 폴리펩티드의 인터페론β활성은, 실시예 11 내지 14에 기재된 항종양 활성 측정시험 등을 이용하여 측정할 수 있다.
항종양 활성의 측정시험은, 예를 들어, 종양을 갖는 마우스에게 대상이 되는 당쇄 부가 폴리펩티드를 피하투여하여, 경시적인 종양 체적의 측정에 의해 조사할 수 있다.
(의약조성물)
본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드를 유효 성분으로서 함유하는 의약조성물은, 인터페론β에 관련하는 질환의 치료 또는 예방에 유효하다. 인터페론β에 관련하는 질환에는, 예를 들어, 뇌종양, 피부악성흑색종, B형 만성활동성 간염, C형 만성간염, 아급성 강화성 범뇌염, C형 대상성 간경변 및 다발성 경화증 등이 포함된다. 또한, 상기의 뇌종양에는 교아종, 수모세포종 및 성상 세포종 등이 포함된다. 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드를 유효성분으로서 함유하는 의약조성물은, 상기 질환의 치료 또는 예방에 유효하다.
또한, 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드를 유효성분으로서 함유하는 의약조성물의 투여 대상은, 임의의 생물 개체를 의미하고, 바람직하게는 동물, 더 바람직하게는 포유동물, 더 바람직하게는 인간의 개체이다.
상기 의약조성물은, 보통, 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕괴제, 표면활성제, 활택제 등의 희석제 또는 부형제를 이용하여, 보통, 의약조성물의 형태로 제제한 것이다.
이와 같은 의약조성물로서는, 예를 들어, 정제, 환제, 산제, 액제, 현탁제, 유제, 과립제, 캅셀제, 좌약, 흡입제, 점안제, 주사제 등을 들 수 있다.
의약조성물 중에 함유되는 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 양은, 특별히 한정되지 않고 넒은 범위 내에서 적절하게 선택할 수 있지만, 보통, 의약조성물 중에 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드를 1 내지 90중량% 함유시키는 것이 바람직하고, 1 내지 70중량% 함유시키는 것이 더 바람직하다.
본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드를 유효성분으로서 함유하는 의약조성물은, 또 다른 유효성분을 함유할 수도 있고, 다른 유효성분을 함유하는 의약조성물과 조합하여 이용할 수도 있다. 또한, 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드를 유효성분으로서 함유하는 의약조성물은, 당쇄 부가 폴리펩티드를 약학적으로 허용가능한 염으로서 포함할 수도 있고, 또 다른 1개 이상의 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드를 유효 성분으로서 함유할 수도 있다. 또한, 다른 1개 이상의 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드를 유효성분으로서 함유하는 의학 조성물과 조합하여 이용할 수도 있다. 또한, 의약조성물에 함유시킬 수 있는 그 외의 성분으로서는, 당업자에 주지된 약학적으로 허용된 담체 등을 들 수 있다.
본 발명에 관련된 의약조성물의 투여 방법으로서는 특별히 제한은 없고, 각종 제제 형태, 환자의 연령, 성별, 질환의 상태, 그 외의 조건에 따른 방법으로 투여된다. 정제, 환제, 액제, 현탁제, 유제, 과립제 및 캅셀제의 경우의 투여방법으로서는, 예를 들어, 경구투여를 들 수 있다. 또한 주사제의 경우에는, 단독으로, 또는 포도당, 아미노산 등의 보통의 보액과 혼합하여, 정맥 내, 근육내, 피내, 피하 또는 복강내에 투여할 수 있다. 좌제의 경우에는, 직장 내에 투여된다. 점액제의 경우는, 결막낭 등의 눈 조직에 적용한다. 흡입제의 경우에는, 기관지 또는 폐에 적용한다.
상기 의약조성물의 투여량은, 용법, 환자의 연령, 성별, 질환의 정도, 그 외의 조건에 따라 적절하게 선택할 수 있고, 예를 들어, 체중 1kg에 대해서 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드가 0.001 내지 100 nmol, 바람직하게는 0.01 내지 10 nmol, 더 바람직하게는 0.01 내지 1 nmol이 되는 투여량으로 할 수 있다.
상기 의약조성물의 투여횟수는, 용법, 환자의 연령, 성별, 질환의 정도, 그외의 조건에 따라 적절하게 선택할 수 있고, 예를 들어, 3회/1일, 2회/1일, 1회/1일, 게다가, 그 혈중 안정성에 따라, 더 빈도가 적은 투여횟수(예를 들어, 1회/주, 1회/월 등)도 선택할 수 있다. 바람직하게는, 상기 의약조성물의 투여횟수는 1회 이하/1일이다.
본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드에 부가되는 당쇄는, 체내의 대사계에서 쉽게 분해된다. 또한, 본 발명의 일 양태에서, 해당 당쇄는 생체 내에서 당펩티드(또는 당단백질)로서 결합하여 존재하는 구조를 갖는다. 따라서, 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드 및 해당 당쇄 부가 폴리펩티드를 유효성분으로서 포함하는 의약조성물은, 생체 내에 투여해도 부작용 또는 항원성을 나타내지 않고, 알레르기 반응 또는 항체생산에 의해 약효를 얻지 못할 우려가 적다는 등의 이점을 갖는다.
게다가, 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드는 안정적으로 간편하게 대량으로 공급하는 것이 가능하고, 품질이 안정된 고품질의 의약품의 제공이라는 관점에서도 매우 유용하다.
또한, 본 명세서에서 이용되는 용어는, 특정의 실시형태를 설명하기 위해 이용되는 것으로, 발명을 한정하는 의도는 아니다.
또한, 본 명세서에서 이용되는 “포함하다”라는 용어는 문맥상 분명하게 다른 이해를 해야할 경우를 제외하고, 기술된 사항(부재, 단계, 요소, 숫자 등)이 존재하는 것을 의도하는 것으로, 그 이외의 사항(부재, 단계, 요소, 숫자 등)이 존재하는 것을 배제하지 않는다.
다른 정의가 없는 한, 여기서 이용되는 모든 용어(기술용어 및 과학용어를 포함한다.)는 본 발명이 속하는 기술의 당업자에 의해서 넓게 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다. 여기서 이용되는 용어는, 다른 정의가 명시되어 있지 않는 한, 본 명세서 및 관련 기술 분야의 의미와 정합적인 의미를 갖는 것으로서 해석되어야 하고, 이상화되거나 또는 과도하게 형식적인 의미로 해석되어서는 안된다.
첫 번째의, 두 번째의 등의 용어가 다양한 요소를 표현하기 위해서 이용되는 경우가 있지만, 이들 요소는 이들의 용어에 의해 한정되어서는 안된다는 것이 이해된다. 이들 용어는 1개의 요소를 다른 요소와 구별하기 위해서만 사용되고 있는 것으로, 예를 들어, 첫 번째의 요소를 두 번째의 요소라고 기재하고, 마찬가지로, 두 번째의 요소를 첫 번째의 요소라고 기재하는 것은, 본 발명의 범위를 일탈하지 않고 가능하다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더 구체적으로 설명하지만, 그러나, 본 발명은 여러 형태에 의해 구현화할 수 있고, 여기에 기재된 실시예에 한정되는 것으로서 해석되어서는 안된다.
(실시예)
본 명세서 중에서 폴리펩티드 단편의 표기 방법에 대해서 하기에 설명한다.
예를 들어, IFN 1-78(S1Thi-C30Acm)MESNA라고 나타낸 경우에는, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열의 1-78번째의 아미노산 서열과 동등한 펩티드 서열을 갖고, 그 펩티드 서열에 대해, 1번째의 세린이 티아졸리딘 구조를 갖는 시스테인으로 치환되고, 30번째의 시스테인의 측쇄가 Acm에 의해 보호되고, C말단이 2-메르캅토에탈술폰산(MESNA)에 의해 알킬티오에스테르화된 펩티드 단편을 가리킨다.
또한, IFN 1-78(S1Thi-C30Acm)MESNA라고 나타낸 경우에서는, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열의 1-78번째의 아미노산 서열과 동등한 펩티드 서열을 갖고, 그 펩티드 서열에 대해서, 1번째의 세린이 티아졸리딘 구조를 갖는 시스테인으로 치환되고, 30번째의 시스테인 측쇄가 Acm에 의해 보호되고, 35번째의 메티오닌이 시스테인으로 치환되고, 48번째의 글루타민이 시스테인으로 치환되고, C말단이 2-메르캅토에탄술폰산(MESNA)에 의해 알킬티오에스테르화 된 펩티드 단편을 가리킨다.
마찬가지로, IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C)에탄이라고 나타낸 경우에는, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열의 1-78번째의 아미노산 서열과 동등한 펩티드 서열을 갖고, 그 펩티드 서열에 대해서, 1번째의 세린이 티아졸리딘 구조를 갖는 시스테인으로 치환되고, 30번째의 시스테인의 측쇄가 Acm에 의해 보호되고, 48번째의 글루타민이 시스테인으로 치환되고, C말단이 에탄티올(Ethanthiol)에 의해 알킬티오에스테르화된 펩티드 단편을 가리킨다.
또한, IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-R123C-C140Acm)이라고 나타낸 경우에는, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열의 79-165번째의 아미노산 서열과 동등한 펩티드 서열을 갖고, 그 펩티드 서열에 대해서, 79번째의 아스파라긴이 시스테인으로 치환되고, 107번째의 라이신이 시스테인으로 치환되고, 112번째의 라이신이 시스테인으로 치환되고, 123번째의 아르기닌이 시스테인으로 치환되고, 140번째의 시스테인이 Acm기에 의해 보호된 펩티드 단편을 가리킨다.
당쇄 수식된 폴리펩티드의 표기방법에 대해서 하기에 설명한다.
예를 들어, 2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)로 나타낸 경우에는, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열의 1번 위치의 세린, 48번 위치의 글루타민, 79번 위치의 아스파라긴, 107번 위치의 라이신, 112번 위치의 아르기닌, 123번 위치의 아르기닌의 각 아미노산이 Cys로 치환되어, 하기식(1)로 나타내는 α2-6 디시알로 당쇄 구조가 각 치환의 Cys에 결합해 있는 것을 나타낸다.
〔화학식 13〕
Figure 112014113375492-pct00013
식(1)
또한, 2-3 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)로 나타낸 경우에는, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열의 1번 위치의 세린, 48번 위치의 글루타민, 79번 위치의 아스파라긴, 107번 위치의 라이신, 112번 위치의 아르기닌, 123번 위치의 아르기닌의 각 아미노산이 Cys로 치환되어, 하기식(2)로 나타내는 α2-3 디시알로 당쇄 구조가 각 치환의 Cys에 결합해 있는 것을 나타낸다.
〔화학식 14〕
Figure 112014113375492-pct00014
식(2)
또한, 2-6 모노시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)라고 나타낸 경우에는, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열의 1번 위치의 세린, 48번 위치의 글루타민, 79번 위치의 아스파라긴, 107번 위치의 라이신, 112번 위치의 아르기닌, 123번위치의 아르기닌의 각 아미노산이 Cys로 치환되어 하기식(5) 또는 하기식(6)으로 나타내는 α2-6 모노시알로 당쇄 구조가 각 위치의 Cys에 결합해 있는 것을 나타낸다.
〔화학식 15〕
Figure 112014113375492-pct00015
식(5)
〔화학식 16〕
Figure 112014113375492-pct00016
식(6)
또한, 2-6 트리시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)라고 나타낸 경우에는, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열의 1번 위치의 세린, 48번 위치의 글루타민, 79번 위치의 아스파라긴, 107번 위치의 라이신, 112번 위치의 아르기닌, 123번 위치의 아르기닌의 각 아미노산이 Cys로 치환되어, 하기식(3)으로 나타내는 α2-6 트리시알로 당쇄 구조가 각 위치의 Cys에 결합해 있는 것을 나타낸다.
〔화학식 17〕
Figure 112014113375492-pct00017
식(3)
또한, 2-6 테트라시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)라고 나타낸 경우에는, 서열번호 1로 나타내는 아미노산의 1번 위치의 세린, 48번 위치의 글루타민, 79번 위치의 아스파라긴, 107번 위치의 라이신, 112번 위치의 아르기닌, 123번 위치의 아르기닌의 각 아미노산이 Cys로 치환되어, 하기식(4)로 나타내는 α2-6 테트라시알로 당쇄 구조가 각 위치의 Cys에 결합해 있는 것을 나타낸다.
〔화학식 18〕
Figure 112014113375492-pct00018
식(4)
당쇄 구조가 Cys에 결합한 구조에 대해서, α2-6 디시알로 당쇄의 경우를 예로서 하기식(14)에 나타낸다. 하기식 중에서, 파선은 하기식의 오른쪽 끝에 기재된 시스테인에 대해서, 펩티드 결합에 의해 결합해 있는 인접한 아미노산의 기재를 생략한 것을 나타낸다.
〔화학식 19〕
Figure 112014113375492-pct00019
식(14)
또한, “diSialo”는 디시알로 당쇄를 의미하고,“monoSialo”는 모노시알로 당쇄를 의미하고, “triSialo”는 트리시알로 당쇄를 의미하고, “tetraSialo”는 테트라시알로 당쇄를 의미한다.
또한, 2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79-K107C-R112C-R123C)라고 나타낸 경우에는, 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열의 1번 위치의 세린, 48번 위치의 글루타민, 107번 위치의 라이신, 112번 위치의 아르기닌, 123번 위치의 아르기닌의 각 아미노산이 Cys로 치환되어 있고, 하기식(1)로 나타내는 α2-6 디시알로 당쇄 구조가 상기의 각 치환의 Cys 및 79번 위치의 아스파라긴에 결합해 있는 것을 나타낸다.
〔화학식 20〕
Figure 112014113375492-pct00020
식(1)
또한, 이하의 실시예에서, 4,5,6번 위치의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환되어 있는 IFN-β를 각각 “4,5,6개의 당쇄 수식 IFN-β”로 나타내는 경우가 있다. 본 발명에서, “4개 위치의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환되어 있는 당쇄 부가 폴리펩티드”와“4개의 당쇄 수식 IFN-β”는 같은 의미이고, 마찬가지로, “5번 위치의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환되어 있는 당쇄 부가 폴리펩티드”와“5개의 당쇄 수식 IFN-β”는 같은 의미이고, 마찬가지로,“6번 위치의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환되어 있는 당쇄 부가 폴리펩티드”와“6개의 당쇄 수식 IFN-β”는 같은 의미이다.
( 실시예 1) 티오에스테르 단편의 합성
( 실시예 1-1) IFN 1-78 ( S1Thi - C30Acm - Q48C )에탄 (서열번호 3)의 합성
고상합성용 컬럼 상에 Amino-PEGA 레진(Merck 사제) (50μmol)를 부가하고, 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB) (125μmol), O-벤조트리아졸-1-일-1,1,3,3-테트라메틸유로니움테트라플루오르붕산염(TBTU) (125μmol) 및 N-에틸모폴린(125μmol)을 디메틸포름아미드(DMF) (1.25 mL)에 용해시켜, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 디클로로메탄(DCM)으로 충분히 세척하였다. 계속해서, Fmoc-Trp(Boc)-OH(0.25 mmol), 1-메시틸렌술포닐-3-니트로-1,2,4-트리아졸(MSNT) (0.25 mmol) 및 N-메틸이미다졸(0.187 mmol)을 DCM(1.25 ml)에 용해시켜 고상합성용 컬럼에 부가한 후, 4시간 교반하였다.
수지를 DCM, DMF를 이용하여 세척하고, Fmoc기를 20%피페리딘/DMF 용액(2 ml)를 이용하여 15분간 처리하여 탈 보호하였다. DMF로 세척하고, 그 후의 펩티드 쇄의 신장은 이하에 나타내는 방법을 이용하여, 순차적으로 아미노산을 축합하였다.
Fmoc 또는 Boc기로 보호된 아미노산을 DMF에 용해하고, 그 용액을 고상합성 컬럼에 부가하였다(0.25 mmol). 0.2 M 1-〔비스(디메틸아미노)메틸렌〕-5-클로로-1H-벤조트리아졸륨 3-옥시드헥사플루오로포스페이트(HCTU)/DMF(0.25 mmol)를 고상합성 컬럼에 부가하고 0.8 M N-메틸모폴린/DMF(0.50 mmol) 또는 0.8 M 2,6,4-트리메틸피리딘/DMF(0.50 mmol)을 고상합성용 컬럼에 첨가하였다. 실온에서 15분간 또는 30분간 교반한 후, 수지를 DMF에 의해 세척하고 Fmoc기를 20%피리딘/DMF용액(2 ml)을 이용해 10분간 처리하여 탈 보호하였다. 이 조작을 반복하여 Fmoc 고상합성법에 의해 아미노산을 순차적으로 축합하였다.
얻어진 수지를 DCM 및 DMF를 이용하여 세척한 후, 트리플루오로에탄올과 아세트산의 혼합용액(1:1)을 부가하여, 18시간 실온에서 교반함으로서, 수지로부터 보호펩티드를 분리하였다. 보호펩티드를 포함하는 반응용액을 감압하에서 농축한 후, 감압하에서 건조하였다. 건조한 보호펩티드를 DMF(3.0 mL)에 용해한 후, 질소 분위기하에서 -15℃ 내지 -20℃로 냉각하였다. 이에 대해, 에탄티올(5.0 mmol)을 부가한 후, 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스피롤리디노포스포늄엑사플루오로포스페이트(PyBOP) (0.50 mmol), 계속해서, 디이소프로필에틸아민(DIPEA) (0.50 mmol)을 부가하였다. -15℃ 내지 -20℃에서 2시간 교반한 후, 아세트산(0.8 mL)을 부가하고, 서서히 실온으로 옮겼다. 실온으로 옮긴 후, 반응 용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 트리플루오로아세트산: 물: 페놀: 티오아니졸: 트리이소프로필실란(= 95: 2.5: 2.5: 2.5: 5)을 부가하여 실온에서 교반하였다. 2시간 후, 재차 이 용액을 별도로 준비한 디에틸에테르에 부가하여 침전시킨 후, 원심분리를 수행하여, 용액 부분을 제거함으로서 목적으로 하는 펩티드티오에스테르체를 포함하는 잔사를 얻었다. 이 얻어진 잔사를 HPLC〔컬럼: SHISEIDO Proteonavi〕로 정제하고, ESI-MS에 의해 질량을 분석한 결과, 얻어진 화합물의 질량은, 목적으로 하는 IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C)에탄의 질량과 일치하였다(계산치 = 9445.8 Da, 실측치 = 9445.5 Da).
( 실시예 1-2) IFN 1-78 ( S1Thi - C30Acm - Q48C - S75C )MESNA (서열번호 4)의 합성
고상합성용 컬럼 상에 Amino-PEGA 레진 (Merck 사제) (50 μmol)을 부가하고, 3-Fmoc-4-디아미노벤조산(150μmol), 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌〕 -5-클로로-1H-벤조트리아졸륨 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트(HCTU) (150μmol) 및 디이소프로필에틸아민(300μmol)을 DMF(1.25 ml)에 용해시켜, 실온에서 2시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DMF에 의해 세척하고, Fmoc기를 20%피페리딘/DMF용액 (2 ml)을 이용하여 15분간 처리하여 탈 보호한 후, DMF로 수지를 충분히 세척하였다. 그 후의 펩티드쇄의 신장은 이하에 나타내는 방법을 이용하여 순차적으로 아미노산을 축합하였다.
Fmoc 또는 Boc기로 보호된 아미노산을 DMF에 용해하고, 그 용액을 고상합성 컬럼에 부가하였다(0.25 mmol). 0.2 M 1-〔비스(디메틸아미노)메틸렌〕-5-클로로-1H-벤조트리아졸륨 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트(HCTU)/DMF (0.25 mmol)를 고상합성 컬럼에 부가하고 0.8 M N-메틸모폴린/DMF(0.50 mmol) 또는 0.8 M 2,6,4-트리메틸피리딘/DMF(0.50 mmol)를 고상합성용 컬럼에 첨가하였다. 실온에서 15분간 또는 30분간 교반한 후, 수지를 DMF에 의해 세척하고 Fmoc기를 20%피페리딘/DMF용액(2 ml)를 이용해 10분간 처리하여 탈 보호하였다. 이 조작을 반복하여 Fmoc 고상합성법에 의해 아미노산을 순차적으로 축합하였다.
얻어진 수지를 DMF, DCM에 의해 세척한 후, 4-니트로페닐 클로로포르메이트 (0.25 mmol)를 DCM에 용해시키고, 고상합성 컬럼에 첨가한 후, 실온에서 30분 교반하였다. 교반 후, 수지를 DCM, DMF를 이용하여 세척하고, 디이소프로필에틸아민(2.5 mmol)을 부가하여 실온에서 15분 교반하였다. 얻어진 수지를 DMF, DCM에 의해 세척한 후, 트리플루오로아세트산: 물: 페놀: 티오아니졸: 트리이소프로필실레인(= 95: 2.5: 2.5: 2.5: 5)을 부가하여 실온에서 교반하였다. 5시간 후, 2-메르캅토에탄술폰산나트륨을 포함하는 pH 7.2의 완충용액(8 M 구아니딘 염산액, 0.1 M 인산용액, 300 mM 2-메르캅토에탄술폰산나트륨)으로 수지를 충분히 세척하였다. 상기 완충액을 수지에 부가하여 실온에서 12시간 교반하였다.
교반 후, 얻어진 용액을 HPLC〔컬럼: SHISEIDO Proteonavi〕로 정제하고, ESI-MS에 의해 질량을 분석한 결과, 얻어진 화합물의 질량은 목적으로 하는 IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C-N75C)MESNA의 질량과 일치하였다(계산치 = 9540.9 Da, 실측치 = 9541.6 Da).
( 실시예 1-3) 그 외의 티오에스테르 단편의 합성
(실시예 1-1)과 마찬가기로, 이하에 나타내는 티오에스테르 단편의 합성을 수행하였다.
IFN 1-78(S1Thi-N3C-C30Acm-Q48C)에탄 (서열번호 5)
IFN 1-78(S1Thi-E28C-C30Acm-Q48C-R70C)에탄 (서열번호 6)
(실시예 1-2)과 마찬가지로, 이하의 티오에스테르 단편을 합성하였다.
IFN 1-78(C30Acm)MESNA (서열번호 7)
IFN 1-78(S1Thi-C30Acm)MESNA (서열번호 8)
IFN 1-78(F7C-C30Acm)MESNA (서열번호 9)
IFN 1-78(N24C-C30Acm)MESNA (서열번호 10)
IFN 1-78(G25C-C30Acm)MESNA (서열번호 11)
IFN 1-78(E28C-C30Acm)MESNA (서열번호 12)
IFN 1-78(C30Acm-K32C)MESNA (서열번호 13)
IFN 1-78(C30Acm-M35C)MESNA (서열번호 14)
IFN 1-78(C30Acm-D38C)MESNA (서열번호 15)
IFN 1-78(C30Acm-E41C)MESNA (서열번호 16)
IFN 1-78(C30Acm-Q48C)MESNA (서열번호 17)
IFN 1-78(C30Acm-R70C)MESNA (서열번호 18)
IFN 1-78(C30Acm-S75C)MESNA (서열번호 19)
IFN 1-78(C30Acm-E41C-S75C)MESNA (서열번호 20)
IFN 1-78(C30Acm-E42C-S75C)MESNA (서열번호 21)
IFN 1-78(C30Acm-Q45C-S75C)MESNA (서열번호 22)
IFN 1-78(C30Acm-L46C-S75C)MESNA (서열번호 23)
IFN 1-78(C30Acm-Q47C-S75C)MESNA (서열번호 24)
IFN 1-78(C30Acm-Q48C-S75C)MESNA (서열번호 25)
IFN 1-78(C30Acm-F49C-S75C)MESNA (서열번호 26)
IFN 1-78(C30Acm-Q50C-S75C)MESNA (서열번호 27)
IFN 1-78(S1Thi-Y29C-C30Acm-Q48C)MESNA (서열번호 28)
IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-M35C-Q48C)MESNA (서열번호 29)
IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-E41C-Q48C)MESNA (서열번호 30)
(실시예 1-1), (실시예 1-2), (실시예 1-3)에서 얻어진 화합물의 질량분석 결과를 하기(표 1)에 나타낸다.
〔표 1〕
Figure 112014113375492-pct00021
( 실시예 2) 펩티드 단편의 합성
( 실시예 2-1) IFN 79-165( N79C - K107C - R112C - R123C - C140Acm ) (서열번호 31) 의 합성
고상합성용 컬럼 상에 Amino-PEGA 레진(Merck 사제) (50μmol)을 부가하고, 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB) (125μmol), O-벤조트리아졸-1-일-1,1,3,3-테트라메틸유로니움테트라플루오보레이트(TBTU) (125μmol) 및 N-에틸모폴린(125μmol)을 DMF(1.25 ml)에 용해시켜, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세척하였다. 계속해서, Fmoc-Asn(Trt)-OH(0.25μmol), 1-메시틸렌술포닐-3-니트로-1,2,4-트리아졸(MSNT) (0.25 mmol) 및 N-메틸이미다졸(0.187 mmol)을 DCM(1.25 ml)에 용해시켜 고상합성용 컬럼에 넣은 후, 4시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 이용하여 세척하고, Fmoc기를 20%피페리딘/DMF용액(2 ml)을 이용해 15분간 처리하여 탈 보호하였다. DMF로 세척한 후, 그 후의 펩티드쇄의 신장은 이하에 나타내는 방법을 이용하여 순차적으로 아미노산을 축합하였다.
Fmoc 또는 Boc기로 보호된 아미노산을 DMF에 용해하고, 그 용액을 고상합성 컬럼에 부가하였다(0.25 mmol). 0.2 M 1-〔비스(디메틸아미노)메틸렌〕-5-클로로-1H-벤조트리아졸륨 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트(HCTU)/DMF(0.25 mmol)을 고상합성 컬럼에 부가하고 0.8 M N-메틸모폴린/DMF(0.50 mmol) 또는 0.8 M 2,6,4-트리메틸피리딘/DMF(0.50 mmol)를 고상합성용 컬럼에 첨가하였다. 실온에서 15분간 또는 30분간 교반한 후, 수지를 DMF에 의해 세척하고, Fmoc기를 20%피페리딘/DMF용액(2 ml)을 이용해 10분간 처리하여 탈 보호하였다. 이 조작을 반복하여 Fmoc 고상합성법에 의해 아미노산을 순차적으로 축합하였다.
얻어진 수지를 트리플루오로아세트산: 물: 페놀: 티오아니졸: 트리이소프로필실레인 (= 95: 2.5: 2.5: 2.5: 5)을 부가하고 실온에서 교반하였다. 3시간 후, 재차 이 용액을 별도로 준비한 에틸에테르에 부가하여 침전시킨 후, 원심분리를 하고, 용액 부분을 제거함으로서, 목적으로 하는 펩티드를 포함하는 잔사가 얻어졌다. 이 얻어진 잔사를 역상 HPLC〔컬럼: SHISEIDO Proteonavi〕로 정제하고, ESI-MS에 의해서 질량을 분석한 결과, 얻어진 화합물의 질량은, IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-R123C-C140Acm)의 질량과 일치하였다(계산치 = 10499.1 Da, 실측치 = 10498.1 Da).
( 실시예 2-2) 그 외의 펩티드 단편의 합성
(실시예 2-1)과 마찬가지로, 이하에 나타내는 펩티드 단편을 합성하였다.
IFN 79-165(N79C-C140Acm) (서열번호 32)
IFN 79-165(N79C-K107C-C140Acm) (서열번호 33)
IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-C140Acm) (서열번호 34)
IFN 79-165(N79C-K107C-E136C-C140Acm) (서열번호 35)
IFN 79-165(N79C-T99C-K107C-R112C-C140Acm) (서열번호 36)
IFN 79-165(N79C-E103C-K107C-E136C-C140Acm) (서열번호 37)
IFN 79-165(N79C-E106C-K107C-E136C-C140Acm) (서열번호 38)
IFN 79-165(N79C-K107C-D109C-E136C-C140Acm) (서열번호 39)
IFN 79-165(N79C-K107C-L115C-E136C-C140Acm) (서열번호 40)
IFN 79-165(N79C-K107C-L119C-E136C-C140Acm) (서열번호 41)
IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-H130C-C140Acm) (서열번호 42)
IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-E136C-C140Acm) (서열번호 43)
IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-H139C-C140Acm) (서열번호 44)
IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-C140Acm-R164C) (서열번호 45)
(실시예 2-1), (실시예 2-2)에서 얻어진 화합물의 질량분석 결과를 하기(표 2)에 나타낸다.
〔표 2〕
Figure 112014113375492-pct00022
( 실시예 3) 디시알로 당쇄 수식 IFN -β의 합성
( 실시예 3-1) 2-6 디시알로 ( S1C - Q48C - N79C - K107C - R112C - R123C ) (서열번호 46)의 합성
IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C)에탄 (서열번호 3)과 IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-R123C-C140Acm) (서열번호 31)을 4-메르캅토페닐아세트산을 포함하는 pH7.2의 완충용액 (8 M 구아니딘 염산액, 0.1 M 인산용액, 125 mM 4-메르캅토페닐아세트산)에 용해시켜, 실온에서 방치시켰다. 24시간 후, 반응용액에 대해서 디티오트레이톨용액(2 M 디티오트레이톨)을 부가하고 실온에서 3시간 방치하였다. 반응종료 후, 메톡시아민용액(1 M 메톡시아민 염산염)과 염산용액(1 M 염산, 8 M 구아니딘 염산염)을 용액에 부가하고, pH를 4.0으로 조정한 후, 실온에서 24시간 방치시켰다. 반응종료 후의 용액을 역상 HPLC〔컬럼: SHISEIDO Proteonavi〕에 의해 탈염하고 동결건조하였다.
얻어진 조정제물을 pH8.5의 완충용액(8 M 구아니딘 염산액, 0.1 M 트리스히드록시메틸아미노메탄)에 용해시켜, 하기식(7)로 나타내는 브로모아세틸화된 디시알로 당쇄(5등량)를 부가하여 1시간 방치하였다.
〔화학식 21〕
Figure 112014113375492-pct00023
식(7)
반응종료 후, 메르캅토에탄술폰산나트륨용액(200 mM 메르캅토에탄술폰산나트륨)을 부가하고 실온에서 30분 방치하였다. 반응종료 후의 용액을 역상 HPLC〔컬럼: SHISEIDO Proteonavi〕에 의해 탈염하고 동결건조하였다.
상기 공정에 의해 얻어진 조정제물을 아세트산은 용액(60 mM 아세트산은, 7.5M 요소, 875 mM 아세트산)에 용해하고 실온에서 4시간 방치하였다. 반응 후 티오트레이톨용액(2 M 디티오트레이톨)을 부가하였다. 반응물에 대해서, pH8.5의 완충용액(8 M 구아니딘 염산염, 0.1 M 트리스히드록시메틸아미노메탄)을 부가하고 HPLC〔SHISEIDO Proteonavi〕에 의해 탈염하여 동결건조하였다.
얻어진 동결건조물을 pH8.5의 완충용액(8 M 구아니딘 염산액, 0.1 M 트리스히드록시메틸아미노메탄)에 용해시켜 실온에서 30분 방치하였다. 용액을 냉각조건 (4℃)에서 희석된 구아니딘 염산염용액(4.5 M 구아니딘 염산염, 0.1 M 트리스히드록시메틸아미노메탄)으로 치환하였다. 치환된 용액에 대해서, 황산동용액(300 mM 황산동Ⅱ오수화물)을 부가하고, 냉각조건(4℃)에서 4시간 방치하였다. 반응 후, 에틸렌디아민사아세트산(400 mM 에틸렌디아민사아세트산)을 부가하고 냉각조건(4℃)으로 1시간 방치하였다. 반응 후의 용액을 아세트산용액(10 mM 아세트산용액)으로 냉각조건(4℃)에서 밤새 방치함으로서, 변성제를 제거하였다. 폴딩 후의 용액을 HPLC〔컬럼: SHISEIDO Proteonavi〕에 의해서 정제하고, 질량분석(ESI 이온화법)을 수행한 결과, 얻어진 화합물의 질량은, 목적으로 하는 2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)의 질량과 일치하였다(계산치 = 33304.8 Da, 실측치 = 33303.6 Da).
( 실시예 3-2) 2-6 디시알로 ( Q48C - S75C - N79C - K107C - R112C - E136C ) (서열번호 47)의 합성
IFN 1-78(C30Acm-Q48C-S75C)MESNA (서열번호 25)과 IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-E136C-C140Acm) (서열번호 43)을 4-메르캅토페닐아세트산을 포함하는 pH7.2의 완충용액 (8 M 구아니딘 염산액, 0.1 M 인산용액, 125 mM 4-메르캅토페닐아세트산)에 용해시키고 실온에서 방치하였다. 24시간 후, 반응용액에 대해서 디티오트레이톨용액(2 M 디티오트레이톨)을 부가하고 실온에서 3시간 방치하였다. 반응종료 후의 용액을 역상 HPLC〔컬럼: SHISEIDO Proteonavi〕에 의해 탈염하여 동결건조하였다.
얻어진 조정제물을 이용하여 (실시예 3-1)과 마찬가지로, 질량분석(ESI 이온화법)을 수행하였다. 그 결과, 얻어진 화합물의 질량은, 목적으로 하는 2-6 디시알로(Q48C-S75C-N79C-K107C-R112C-E136C)의 질량과 일치하였다(계산치 = 33331.8 Da, 실측치 = 33331.2 Da).
( 실시예 3-3) 2-3 디시알로 ( S1C - N3C - Q48C - N79C - K107C - R112C ) (서열번호 48) 의 합성
IFN 1-78(S1Thi-N3C-C30Acm-Q48C)에탄 (서열번호 5)과 IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-C140Acm) (서열번호 34)에 대해서, 하기식(8)로 나타내는 브로모아세틸화된 디시알로 당쇄로 변경한 것 이외는 (실시예 3-3)과 마찬가지로, 디시알로 당쇄 수식 IFN-β를 합성하였다. 질량분석(ESI 이온화법)을 수행한 결과, 얻어진 화합물의 질량은, 목적으로 하는 2-3 디시알로 (S1C-N3C-Q48C-N79C-K107C-R112C)의 질량과 일치하였다(계산치 = 33346.9 Da, 실측치 = 33346.6 Da).
〔화학식 22〕
Figure 112014113375492-pct00024
식(8)
( 실시예 3-4) 그 외의 디시알로 당쇄 수식 IFN -β의 합성
(실시예 3-1)과 동일한 방법을 이용하여, 이하에 나타내는 화합물의 합성을 수행하였다.
2-6 디시알로(S1C-N3C-Q48C-N79C-K107C-R112C) (서열번호 49)
2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-T99C-K107C-R112C) (서열번호 50)
2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-H130C) (서열번호 51)
2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-E136C) (서열번호 52)
2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-H139C) (서열번호 53)
2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R164C) (서열번호 54)
2-6 디시알로(S1C-Y29C-Q48C-N79C-K107C-E136C) (서열번호 55)
2-6 디시알로(S1C-M35C-Q48C-N79C-K107C-E136C) (서열번호 56)
2-6 디시알로(S1C-E41C-Q48C-N79C-K107C-E136C) (서열번호 57)
2-6 디시알로(S1C-Q48C-S75C-N79C-K107C-E136C) (서열번호 58)
2-6 디시알로(S1C-E28C-Q48C-R70C-N79C) (서열번호 59)
2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C) (서열번호 60)
2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C) (서열번호 61)
2-6 디시알로(S1C-N3C-Q48C-N79C) (서열번호 62)
2-6 디시알로(S1C-N79C-K107C-E136C) (서열번호 63)
(실시예 3-2)와 동일한 방법을 이용하여, 이하에 나타내는 화합물의 합성을 수행하였다.
2-6 디시알로(E41C-S75C-N79C-E103C-K107C-E136C) (서열번호 64)
2-6 디시알로(E41C-S75C-N79C-E106C-K107C-E136C) (서열번호 65)
2-6 디시알로(E41C-S75C-N79C-K107C-D109C-E136C) (서열번호 66)
2-6 디시알로(E41C-S75C-N79C-K107C-R112C-E136C) (서열번호 67)
2-6 디시알로(E41C-S75C-N79C-K107C-L115C-E136C) (서열번호 68)
2-6 디시알로(E41C-S75C-N79C-K107C-L119C-E136C) (서열번호 69)
2-6 디시알로(N24C-N79C-K107C-R112C-E136C) (서열번호 70)
2-6 디시알로(G25C-N79C-K107C-R112C-E136C) (서열번호 71)
2-6 디시알로(K32C-N79C-K107C-R112C-E136C) (서열번호 72)
2-6 디시알로(M35C-N79C-K107C-R112C-E136C) (서열번호 73)
2-6 디시알로(D38C-N79C-K107C-R112C-E136C) (서열번호 74)
2-6 디시알로(E41C-N79C-K107C-R112C-E136C) (서열번호 75)
2-6 디시알로(F7C-N79C-K107C-R112C-E136C) (서열번호 76)
2-6 디시알로(Q48C-N79C-K107C-R112C-E136C) (서열번호 77)
2-6 디시알로(S75C-N79C-K107C-R112C-E136C) (서열번호 78)
2-6 디시알로(E41C-S75C-N79C-K107C-E136C) (서열번호. 79)
2-6 디시알로(E42C-S75C-N79C-K107C-E136C) (서열번호 80)
2-6 디시알로(Q45C-S75C-N79C-K107C-E136C) (서열번호 81)
2-6 디시알로(L46C-S75C-N79C-K107C-E136C) (서열번호 82)
2-6 디시알로(Q47C-S75C-N79C-K107C-E136C) (서열번호 83)
2-6 디시알로(Q48C-S75C-N79C-K107C-E136C) (서열번호 84)
2-6 디시알로(F49C-S75C-N79C-K107C-E136C) (서열번호 85)
2-6 디시알로(Q50C-S75C-N79C-K107C-E136C) (서열번호 86)
2-6 디시알로(N79C-K107C-R112C-E136C) (서열번호 87)
2-6 디시알로(E28C-N79C-K107C-E136C) (서열번호 88)
2-6 디시알로(M35C-N79C-K107C-E136C) (서열번호 89)
2-6 디시알로(R70C-N79C-K107C-E136C) (서열번호 90)
2-6 디시알로(S75C-N79C-K107C-E136C) (서열번호 91)
(실시예 3-3)과 동일한 방법을 이용하여, 이하에 나타내는 화합물의 합성을 수행하였다.
2-3 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C) (서열번호 92)
( 실시예 3-5) 2-6 디시알로 ( S1C - R26C - Q48C -A67C- N79 -A88C) (서열번호 100)의 합성
( 실시예 3-5-A) IFN 1- 25(S1Thi)티오페닐 (서열번호 101)의 합성
고상합성용 컬럼 상에 Amino-PEGA 레진(Merck 사제) (50μmol)을 부가하고 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB) (125μmol), O-벤조트리아졸-1-일-1,1,3,3-테트라메틸유로니움테트라풀루오르붕산염(TBTU) (125μmol) 및 N-에틸모폴린(125μmol)을 디에틸포름아미드(DMF) (1.25 ml)에 용해시키고 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 디클로로메탄(DCM)으로 충분히 세척하였다. 계속해서, Fmoc-Trp(Boc)-OH(0.25 mmol), 1-메시틸렌술포닐-3-니트로-1,2,4-트리아졸(MSNT) (0.25 mmol) 및 N-메틸이미다졸(0.187 mmol)을 DCM(1.25 ml)에 용해시키고 고상합성용 컬럼에 부가한 후, 4시간 교반하였다.
수지를 DCM, DMF를 이용하여 세척하고 Fmoc기를 20%피페리딘/DMF용액(2 ml)를 이용해 15분간 처리하여 탈 보호하였다. DMF로 세척하고, 그 후의 펩티드쇄의 신장은 이하에 나타내는 방법을 이용하여 순차적으로 아미노산을 축합하였다.
Fmoc기 또는 Boc기로 보호된 아미노산을 DMF에 용해하고 그 용액을 고상합성 컬럼에 부가하였다(0.25 mmol). 0.2 M 1-〔비스(디메틸아미노)메틸렌〕-5-클로로-1H-벤조트리아졸륨 3-옥시드헥사풀루오로포스페이트(HCTU)/DMF(0.25 mmol)을 고상합성 컬럼에 부가하고 0.8 M N-메틸모폴린/DMF(0.50 mmol) 또는 0.8 M 2,6,4-트리메틸피리딘/DMF(0.50 mmol)을 고상합성용 컬럼에 첨가하였다. 실온에서 15분간 또는 30분간 교반한 후, 수지를 DMF에 의해 세척하고 Fmoc기를 20%피페리딘/DMF용액(2 ml)을 이용해 10분간 처리하여 탈 보호하였다. 이 조작을 반복하여 Fmoc고상합성법에 의해 아미노산을 순차적으로 축합하였다.
얻어진 수지를 DCM 및 DMF를 이용하여 세척한 후, 트리풀루오로에탄올과 아세트산의 혼합용액(1:1)을 부가하고, 18시간 실온에서 교반함으로서, 수지로부터 보호펩티드를 분리하였다. 보호펩티드를 포함하는 반응용액을 감압하에서 농축한 후, 감압하에서 건조하였다. 건조한 보호펩티드를 DMF(2.1 mL)에 용해한 후, 질소 분위기하에서, -15℃ 내지 -20℃로 냉각하였다. 이에 대해 티올원으로서 티오페놀(0.2 mmol)을 부가한 후, 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트(PyBOP) (1.4 mmol), 계속해서, 디이소프로필에틸아민(DIPEA) (0.2 mmol)을 부가하였다. -15℃ 내지 -20℃에서 2시간 교반한 후, 트리플루오로아세트산(0.2 mL)을 부가하여, 서서히 실온으로 옮겼다. 실온에 옮긴 후, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 트리플루오로아세트산: 물: 트리이소프로필실레인(= 92.5: 2.5: 5)를 부가하고 실온에서 교반하였다. 2시간 후, 재차 이 용액을 별도로 준비한 디에틸에테르에 부가하여 침전시킨 후, 원심분리를 하여, 용액부분을 제거함으로서 목적으로 하는 펩티드티오에스테르체를 포함하는 잔사를 얻었다. 이 얻어진 잔사를 HPLC〔컬럼: SHISEIDO Proteonavi〕로 정제하고, ESI-MS에 의해 질량을 분석한 결과, 얻어진 화합물의 질량은, 목적으로 하는 IFN1-25 (S1Thi)티오페닐 (서열번호 101)의 질량과 일치하였다(계산치 = 3062.6 Da, 실측치 = 3062.5 Da).
( 실시예 3-5-B) IFN 26- 47(R 26C-C30Acm)에탄티올 (서열번호 102)의 합성
(실시예 3-5-A)의 조작과 마찬가지로, 펩티드 단편을 합성하였다. 또한 IFN 26-47(R26C-C30Acm)에탄티올에서 티올원으로서 에탄티올을 사용하였다.
합성한 화합물은 ESI-MS에 의해 질량을 분석한 결과, 목적으로 하는 IFN 26-47(R26C-C30Acm)에탄티올(서열번호 102)의 질량과 일치하였다(계산치 = 2844.4 Da, 실측치 = 2844.5 Da).
( 실시예 3-5-C) IFN 48-66( Q48Thi )MESNA (서열번호 103)의 합성
고상합성용 컬럼 상에 Amino-PEGA 레진(Merck 사제) (50μmol)을 부가하여, 3-Fmoc-4-디아미노벤조산(150μmol), 1-〔비스(디메틸아미노)메틸렌〕-5-클로로-1H-벤조트리아졸륨 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트(HCTU) (150μmol) 및 디이소프로필에틸아민(300μmol)을 DMF(1.25 ml)에 용해시켜 실온에서 1시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DMF에 의해 세척하고, Fmoc기를 20%피페리딘/DMF용액(2 ml)을 이용하여 15분간 처리하여 탈 보호한 후, DMF로 수지를 충분히 세척하였다. 그 후의 펩티드쇄의 신장은 이하에 나타내는 방법을 이용하여 순차적으로 아미노산을 축합하였다.
Fmoc기 또는 Boc기로 보호된 아미노산을 DMF로 용해하고, 그 용액을 고상합성 컬럼에 부가하였다(0.25 mmol). 0.2 M 1-〔비스(디메틸아미노)메틸렌〕-5-클로로-1H-벤조트라이졸륨 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트(HCTU)/DMF(0.25 mmol)를 고상합성 컬럼에 부가하고 0.8 M N-메틸모폴린/DMF(0.50 mmol) 또는 0.8 M 2,6,4-트리메틸피리딘/DMF(0.50 mmol)을 고상합성용 컬럼에 첨가하였다. 실온에서 15분간 또는 30분간 교반한 후, 수지를 DMF에 의해 세척하고, Fmoc기를 20%피페리딘/DMF용액(2 ml)을 이용해 10분간 처리하여 탈 보호하였다. 이 조작을 반복하여 Fmoc고상합성법에 의해 아미노산을 순차적으로 축합하였다.
얻어진 수지를 DMF, DCM에 의해 세척한 후, 4-니트로페닐 클로로포르메이트 (1.4 mmol)을 DCM에 용해시키고, 고상합성 컬럼에 첨가한 후, 실온에서 40분 교반하였다. 교반 후, 수지를 DCM, DMF를 이용하여 세척하고, DMF용액에 용해시킨 디이소프로필에틸아민(5.0 mmol)을 부가하여 실온에서 15분 교반하였다. 얻어진 수지를 DMF, DCM에 의해 세척한 후, 트리풀루오로아세트산: 물: 트리이소프로필실레인(= 92.5: 2.5: 5)을 부가하여 실온에서 교반하였다. 2시간 후, DMF, DCM에 의해 수지를 충분히 세척한 후, 2-메르캅토에탄술폰산나트륨을 포함하는 pH8.5의 완충용액(6 M 구아니딘 염산액, 0.2 M 인산용액, 1 M 2-메르캅토에탄술폰산나트륨)으로 수지를 충분히 세척하였다. 상기 완충액을 수지에 부가하여 실온에서 2시간 교반하였다. 교반 후, 얻어진 용액을 HPLC〔컬럼: SHISEIDO Proteonavi〕로 정제하고, ESI-MS에 의해 질량을 분석한 결과, 얻어진 화합물의 질량은, 목적으로 하는 IFN 48-66(Q48Thi)MESNA (서열번호 103)의 질량과 일치하였다(계산치 = 2413.8 Da, 실측치 = 2413.9 Da).
( 실시예 3-5-D) 디시알로 당쇄 부가 IFN 67- 87(A67Thi,N79)티오페닐 (서열 번호 104)의 합성
고상합성용 컬럼 상에 Amino-PEGA 레진 (Merck 사제) (50μmol)을 부가하여 Fmoc-4-디아미노벤조산(150μmol), 1-〔비스(디메틸아미노)메틸렌〕-5-클로로-1H-벤조트리아졸륨 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트(HCTU) (150μmol) 및 디이소프로필에틸아민 (300μmol)을 DMF(1.25 ml)에 용해시켜, 실온에서 1시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DMF에 의해 세척하고, Fmoc기를 20% 피페리딘/DMF용액(2 ml)를 이용해 15분간 처리하여 탈 보호한 후, DMF로 수지를 충분히 세척하였다. 그 후의 펩티쇄의 신장은 이하에 나타내는 방법을 이용하여 순차적으로 아미노산을 축합하였다.
Fmoc기 또는 Boc기로 보호된 아미노산을 DMF에 용해하고, 그 용액을 고상합성 컬럼에 부가하였다(0.25 mmol). 0.2 M 1-〔비스(디메닐아미노)메틸렌〕-5-클로로-1H-벤조트리아졸륨 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트(HCTU)/DMF(0.25 mmol)을 고상합성 컬럼에 부가하고 0.8 M N-메틸모폴린/DMF(0.5 mmol) 또는 0.8 M 2,6,4-트리메틸피리딘/DMF(0.50 mmol)을 고상합성용 컬럼에 첨가하였다. 실온에서 15분간 또는 30분간 교반한 후, 수지를 DMF에 의해 세척하고, Fmoc기를 20%피페리딘/DMF용액(2 ml)을 이용해 10분간 처리하여 탈 보호하였다. 이 조작을 반복하여 Fmoc고상합성법에 의해 아미노산을 순차적으로 축합하였다.
얻어진 8개의 잔기 펩티드에 대해서, Fmoc기를 20%피페리딘/DMF용액(2 ml)을 이용해 15분간 처리하여 탈 보호하고 DMF로 세척 후, 별도로 준비한 원심관에 디벤질디시알로 당쇄 아스파라긴(0.2 mmol)과 DEPBT(0.2 mmol)를 DMF/DMSO (1:1혼합용액, 2.2 ml)에 용해시켜, 고상합성용 컬럼에 넣어 DIPEA(0.15 mmol)를 부가하고 실온에서 18시간 교반하였다. DMF와 DCM으로 세척하자, 고상 상에 하기식(18)로 나타내는 디벤질디시알로 당쇄 아스파라긴이 결합한 9개의 잔기 당쇄 펩티드가 얻어졌다.
〔화학식 23〕
Figure 112014113375492-pct00025
식(18)
그 후의 당펩티드쇄의 신장은 이하에 나타내는 방법을 이용하여, 순차적으로 아미노산을 축합시켰다.
Fmoc기로 아미노산을 보호한 아미노산과 HOBt(0.50 mmol), DIPCI (0.475 mmol)를 DMF(6.3 ml)에 용해시켜, 15분간 활성화시킨 후, 고상합성용 컬럼에 넣었다. 실온에서 1시간 교반한 후, Fmoc기를 20%피페리딘/DMF용액 (2 ml)을 이용해 20분간 처리하여 탈 보호하였다. 이 조작을 반복하여 아미노산을 순차적으로 축합시켰다.
얻어진 수지를 DCM 및 DMF를 이용하여 세척한 후, 트리플루오로에탄올과 아세트산의 혼합용액(1:1)을 충분히 수지에 잠길 정도로 부가하고, 18시간 실온에서 교반함으로서, 수지와 당쇄 부가 펩티드 단편을 분리하였다. 분리한 수지를 여과하여 제거하고, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 농축하고 아미노산 측쇄가 보호된 당쇄 펩티드를 얻었다.
얻어진 당쇄 부가 펩티드 단편(50 mmol)을 나스형 플라스크(recovery flask)에 옮기고, DMF에 용해시킨 후, 질소 분위기하에서, -15℃ 내지 -20℃로 냉각하였다. 여기에, 티오페놀(0.15 mmol)을 부가한 후, PyBOP(2.5 mmol), 계속해서, DIPEA(0.15 mmol)를 부가하였다. -15℃ 내지 -20℃에서 2시간 교반한 후, 트리플루오로아세트산을 부가하여 서서히 실온으로 옮겼다. 실온으로 옮긴 후, 반응용액을 감압하에서 농축하였다. 얻어진 잔사를 트리플루오로아세트산: 물: TIPS(= 95: 2.5: 2.5)를 부가하여 실온에서 교반하였다. 2시간 후, 재차 이 용액을 별도로 준비한 디에틸에테르에 부가하여 침전시킨 후, 원심분리를 하여, 용액 부분을 제거함으로서, 목적으로 하는 펩티드티오에스테르체를 포함하는 잔사를 얻었다. 이 얻어진 잔사를 HPLC[컬럼: SHISEIDO proteonavi]로 정제하고, ESI-MS에 의해 질량을 분석한 결과, 얻어진 화합물의 질량은, 목적으로 하는 디시알로 당쇄 부가 IFN 67-87(A67Thi,N79)티오페닐 (서열번호 104)의 질량과 일치하였다(계산치 = 4903.1 Da, 실측치 = 4903.1 Da).
( 실시예 3-5-E) IFN 88-165( C140Acm ) (서열번호 105)의 합성
고상합성용 컬럼 상에 Amino-PEGA 레진(Merck 사제) (50μmol)을 부가하고 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB) (125μmol), O-벤조트리아졸-1-일-1,1,3,3-테트라메틸유로니움테트라풀루오르붕산염(TBTU) (125μmol)를 DMF(1.25 ml)에 용해시켜, 실온에서 4시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 충분히 세척하였다. 계속해서, Fmoc-Asn(Trt)-OH(0.25 mmol), 1-메시틸렌술포닐-3-니트로-1,2,4-트리아졸(MSNT) (0.25 mmol) 및 N-메틸이미다졸(0.187 mmol)을 DCM(1.25 ml)에 용해시켜 고상합성용 컬럼에 넣은 후, 4시간 교반하였다.
교반 후, 수지를 DCM, DMF를 이용하여 세척하고, Fmoc기를 20%피페리딘/DMF용액(2 ml)를 이용해 15분간 처리하여 탈 보호하였다. DMF로 세척 후, 그 후의 펩티드쇄의 신장은 이하에 나타내는 방법을 이용하여 순차적으로 아미노산을 축합하였다.
Fmoc기 또는 Boc기로 보호된 아미노산을 DMF에 용해하고, 그 용액을 고상합성 컬럼에 부가하였다(0.25 mmol).0.2 M 1-〔비스(디메틸아미노)메틸렌〕-5-클로로-1H-벤조트리아졸륨 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트(HCTU)/DMF(0.25 mmol)을 고상합성 컬럼에 부가하고 0.8 M N-메틸모폴린/DMF(0.50 mmol) 또는 0.8 M 2,6,4-트리메틸피리딘/DMF(0.50 mmol)을 고상합성용 컬럼에 첨가하였다. 실온에서 15분간 또는 30분간 교반한 후, 수지를 DMF에 의해 세척하고 Fmoc기를 20%피페리딘/DMF용액(2 ml)을 이용해 10분간 처리하여 탈 보호하였다. 이 조작을 반복하여 Fmoc고상합성법에 의해 아미노산을 순차적으로 축합하였다.
얻어진 수지를 트리플루오로아세트산: 물: 페놀: 티오아니졸: 트리이소프로필실레인(= 95: 2.5: 2.5: 5)을 부가하여 실온에서 교반하였다. 3시간 후, 재차 이 용액을 별도로 준비한 디에틸에테르에 부가하여 침전시킨 후, 원심분리를 하여 용액부분을 제거함으로서, 목적으로 하는 펩티드를 포함하는 잔사가 얻어졌다. 이 얻어진 잔사를 역상 HPLC[컬럼: SHISEIDO Proteonavi]로 정제하고 ESI-MS에 의해 질량을 분석한 결과, 얻어진 화합물의 질량은, IFN 88-165(C140Acm) (서열번호 105)의 질량과 일치하였다(계산치 = 9647.3 Da, 실측치 = 9647.2 Da).
( 실시예 3-5-F) 각 단편의 결합
(공정 1. Kinetic Ligation 공정)
IFN 1-25(S1Thi)티오페닐 (서열번호 101)과 IFN 26-47(R26C-C30Acm)에탄티올 (서열번호 102)을 pH6.8의 완충용액(8 M 구아니딘 염산액, 0.2 M 인산용액, 20 mM TCEP)에 용해시키고, 실온에서 3시간 반응시켰다. 반응종료 후의 용액을 역상 HPLC[컬럼: SHISEIDO Proteonavi]에 의해 정제하여 동결건조하였다. 이 얻어진 동결건조품을 ESI-MS에 의해 질량을 분석한 결과, 얻어진 화합물의 질량은, IFN 1-47(S1Thi-R26C-C30Acm)에탄티올 (서열번호 106)의 질량과 일치하였다(계산치 = 5796.8 Da, 측정치 = 5796.7 Da).
(공정 2. Native Chemical Ligation 공정A)
디시알로 당쇄 부가 IFN 67-87(A67Thi,N79)티오페닐(서열번호 104)와 IFN 88-165(C140Acm) (서열번호 105)을 pH7.2의 완충용액(8 M 구아니딘 염산액, 0.2 M 인산용액, 20 mM TCEP)에 용해시키고 티오페놀(3% V/V)에 부가하여 실온에서 반응시켰다. 23시간 후, 메톡시아민용액(6 M 구아니딘 염산염, 0.2 M 메톡시아민 염산염, 20 mM TCEP)을 반응용액에 부가하여 pH를 4.0으로 조정한 후, 실온에서 4시간 반응시켰다. 반응용액에 대해서 50 mM NaOH 수용액을 부가하여 반응용액을 염기성으로 한 후, 얼음 위에서 0.5시간 반응시켰다. 반응종료 후, 반응종료 후의 용액을 역상 HPLC[컬럼: SHISEIDO Proteonavi]에 의해 정제하여 동결건조품을 얻었다. 이 얻어진 동결건조품을 ESI-MS에 의해 질량을 분석한 결과, 얻어진 화합물의 질량은, 디시알로 당쇄 부가 IFN 67-165(A67C-N79-A88C-C140Acm) (서열번호 107)의 질량과 일치하였다(계산치 = 14247.9 Da, 측정치 = 14247.2 Da).
(공정 3. Native Chemical Ligation 공정B)
공정 2에서 얻어진 디시알로 당쇄 부가 IFN 67-165(A67C-N79-A88C-C140Acm) (서열번호 107)와 IFN 48-66(Q48Thi)MESNA (서열번호 103)을 pH7.2의 완충용액(8 M 구아니딘 염산액, 0.2 M 인산용액, 20 mM TCEP, 30 mM MPAA)에 용해시켜, 실온에서 반응시켰다. 18시간 후, 메톡시아민용액 (6 M 구아니딘 염산염, 0.2 M 메톡시아민 염산염, 20 mM TCEP)를 반응용액에 부가하여 pH를 4.0으로 조절한 후, 실온에서 반응시켰다. 5시간 후, 반응용액에 대해서 2-메르캅토에탄술폰산나트륨을 부가하고 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응종료 후, 반응종료 후의 용액을 역상 HPLC [컬럼: SHISEIDO Proteonavi]에 의해 정제하여 동결건조품을 얻었다. 이 얻어진 동결건조품을 ESI-MS에 의해 질량을 분석한 결과, 얻어진 화합물의 질량은, 디시알로 당쇄 부가 IFN 48-165(Q48C-A67C-N79-A88C-C140Acm) (서열번호 108)의 질량과 일치하였다(계산치 = 16507.6 Da, 실측치 = 16507.9 Da).
(공정 4. Native Chemical Ligation 공정C)
공정 1에서 얻어진 IFN 1-47(S1Thi-R26C-C30Acm)에탄티올 (서열번호 106)과 공정 3에서 얻어진 디시알로 당쇄 부가 IFN 48-165(Q48C,A67C,N79,A88C,C140Acm) (서열번호 108)를, 공정 3과 마찬가지로 반응시켰다. 반응에서 얻어진 화합물은 ESI-MS에 의해 질량을 분석한 결과, 목적으로 하는 디시알로 당쇄 부가 IFN 1-165(S1C-R26C-C30Acm-Q48C-A67C-N79-A88C-C140Acm) (서열번호 109)의 질량과 일치하였다(계산치 = 22230.2 Da, 실측치 = 22230.3 Da).
(공정 5. 당쇄 부가 공정)
공정 4에서 얻어진 디시알로 당쇄 부가 IFN 1-165(S1C-R26C-C30Acm-Q48C-A67C-N79-A88C-C140Acm) (서열번호 109)를 pH8.5의 완충용액(8 M 구아니딘 염산염, 0.1 M 트리스용액)에 용해시켜, 하기식(19)로 나타내는 브로모아세틸화된 디시알로 당쇄 (25등량)을 부가하여 실온에서 2시간 반응시켰다.
〔화학식 24〕
Figure 112014113375492-pct00026
식(19)
반응종료 후, 반응용액을 역상 HPLC [컬럼: SHISEIDO Proteonavi]에 의해 정제하여 동결건조품을 얻었다. 이 얻어진 동결건조품을 ESI-MS에 의해 질량을 분석한 결과, 얻어진 화합물의 질량은, 1, 26, 48, 67, 88번 위치에 시스테인의 측쇄 유황 원자를 통해 부가된 디시알로 당쇄를 갖고, 79번 위치에 아스파라긴 측쇄를 통해 부가된 당쇄를 갖는 2-6 디시알로(S1C-R26C-C30Acm-Q48C-A67C-N79-A88C-C140Acm) (서열번호 110)의 질량과 일치하였다(계산치 = 33545.4 Da, 실측치 = 33545.5 Da).
(공정 6. Acm기의 탈 보호)
상기 공정 5에 의해서 얻어진 동결건조물을 아세트산은 용액(100 mM 아세트산은, 90%아세트산 수용액)에 용해하여 실온에서 반응시켰다. 4시간 후, HPLC와 ESI-MS를 이용하여 목적물이 생성하고 있는 것을 확인하였다. 반응용액에 디티오트레이톨을 부가하여 실온에서 15분간 교반한 후, 원심분리를 하여 침전물을 제외한 상청액을 회수하였다. 그 회수한 상청액을 멤브레인 필터로 여과하고 목적물을 포함하는 여과액 부분을 역상 HPLC [컬럼 SHISEIDO Proteonavi]에 의해 정제하여 동결건조품을 얻었다. 이 얻어진 동결건조품을 ESI-MS에 의해 질량을 분석한 결과, 얻어진 화합물의 질량은, 1, 26, 48, 67, 88번 위치에 시스테인의 측쇄 유황 원자를 통해서 부가된 디시알로 당쇄를 갖고, 79번 위치에 아스파라긴의 측쇄를 통해 부가된 당쇄를 갖는 2-6 디시알로(S1C-R26C-Q48C-A67C-N79-A88C) (서열번호 111)의 질량과 일치하였다(계산치 = 33403.3 Da, 측정치 = 33403.2 Da).
(공정 7. 폴딩 공정)
상기 공정 6에 의해 얻어진 동결건조품을 pH8.5의 완충용액(8 M 구아니딘 염산액, 0.1 M 트리스히드록시메틸아미노메탄)에 용해시켜 실온에서 30분 방치하였다. 용액을 냉각조건(4℃)에서 희석된 구아니딘 염산염용액(4.5M 구아니딘 염산염, 0.1M 트리스히드록시메틸아미노메탄)으로 치환하였다. 치환된 용액에 대해서, 황산동 용액(300 mM 황산동II오수화물)을 부가하여, 냉각조건(4℃)에서 3시간 방치하였다. 반응 후, 에틸렌디아민사아세트산(400 mM 에틸렌디아민사아세트산)을 부가하고, 냉각조건(4℃)에서 0.5시간 방치하였다. 반응 후의 용액을 아세트산 용액(10 mM 아세트산 용액)으로 냉각조건(4℃)에서 밤새 방치함으로서 변성제를 제거하였다. 폴딩 후의 용액을 HPLC [컬럼: SHISEIDO Proteonavi]에 의해 정제하여 질량분석(ESI 이온화법)을 수행한 결과, 얻어진 화합물의 질량은, 목적으로 하는 2-6 디시알로(S1C-R26C-Q48C-A67C-N79-A88C) (서열번호 100)의 질량과 일치하였다(계산치 = 33401.2 Da, 실측치 = 33401.2 Da).
( 실시예 4) 모노시알로 당쇄 수식 IFN -β의 합성
( 실시예4 -1) 2-6 모노시알로 ( S1C - Q48C - N79C - K107C - R112C - R123C ) (서열번호 93)의 합성
IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C)에탄 (서열번호 3)과 IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-R123C-C140Acm) (서열번호 31)에 대해서, 하기식(9) 및 하기식(10)으로 나타내는 브로모아세틸화된 모노시알로 당쇄 혼합물(화합물 비율 1:1) (5등량)으로 변경한 것 이외는 (실시예 3-1)과 동일한 방법에 의해, 모노시알로 당쇄 수식 IFN-β를 합성하였다. 질량분석(ESI 이온화법)을 수행한 결과, 얻어진 화합물의 질량은, 목적으로 하는 2-6 모노시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)의 질량과 일치한(계산치 = 31557.2 Da, 실측치 = 31556.6 Da)를 얻었다. (실시예 3-1) 및 (실시예 4-1)의 질량분석의 결과를 도 1에 나타낸다.
〔화학식 25〕
Figure 112014113375492-pct00027
식(9)
〔화학식 26〕
Figure 112014113375492-pct00028
식(10)
(실시예 3-1) 및 (실시예 4-1)에서 얻어진 화합물을, SDS-PAGE, 역상 HPLC [column: Waters BEH300]에 의해 분석하였다. SDS-PAGE의 결과를 도 2에 나타낸다.
SDS-PAGE의 결과를 보면, 확실한 밴드가 검출되고 있어 모든 화합물에서도, 균일하게 당쇄가 부가되어 있는 것이 시사되었다. 마찬가지로, 역상 HPLC 분석에 의한 분석에서도, 균일하게 당쇄가 부가되어 있는 것을 시사하는 데이터가 얻어졌다(Do not shown).
또한, (실시예 3-1) 및 (실시예 4-1)에서 얻어진 화합물을 pH6.0의 인산완충(1M 인산)용액에서 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제(Endo-β-N-acetylglucosaminidase(Endo-M))(동경화성공업 주식회사)를 첨가함으로서 당쇄부분의 절단을 수행하였다. 얻어진 유리 당쇄의 환원말단을 2-아미노벤조산 (2-Aminobenzoic acid)(Sigma Aldrich)에 의해 라벨링한 후에, 순상 HPLC [컬럼: Shodex NH2P-50]에 의해 분석을 수행한 결과를 도 3에 나타낸다. 당쇄 구조 분석의 결과, 목적으로 하는 디시알로 당쇄와 같은 리텐션 타임에서 피크가 확인되고, 목적의 당쇄가 부가되어 있음을 확인하였다.
( 실시예 4-2) 그 외의 모노시알로 당쇄 수식 IFN -β의 합성
(실시예 4-1)과 동일한 방법을 이용하여, 이하에 나타내는 화합물의 합성을 수행하였다.
2-6 모노시알로(S1C-N3C-Q48C-N79C-K107C-R112C) (서열번호 94)
2-6 모노시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C) (서열번호 95)
( 실시예 5) 트리시알로 당쇄 수식 IFN -β의 합성
( 실시예 5-1) 2-6 트리시알로 ( S1C - Q48C - N79C - K107C - R112C - R123C ) (서열번호 96)의 합성
IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C)에탄 (서열번호 3)과 IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-R123C-C140Acm) (서열번호 31)에 대해서, 하기식(11)로 나타내는 브로모아세틸화된 트리시알로 당쇄(5등량)를 부가한 것 이외는(실시예 3-1)과 동일한 방법에 의해, 트리시알로 당쇄 수식 IFN-β를 합성하였다. 질량분석(ESI 이온화법)을 수행한 결과, 얻어진 화합물의 질량은, 목적으로 하는 2-6 트리시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)의 질량과 일치하였다(계산치 = 37244.3 Da, 실측치 = 37243.2 Da).
〔화학식 27〕
Figure 112014113375492-pct00029
식(11)
( 실시예 5-2) 그 외의 트리시알로 당쇄 수식 IFN -β의 합성
(실시예 5-1)과 동일한 방법을 이용하여, 이하에 나타내는 화합물의 합성을 수행하였다.
2-6 트리시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C) (서열번호 97)
( 실시예 6) 테트라시알로 당쇄 수식 IFN -β의 합성
( 실시예 6-1) 2-6 테트라시알로 ( S1C - Q48C - N79C - K107C - R112C - R123C ) (서열번호 98)의 합성
IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C)에탄 (서열번호 3)과 IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-R123C-C140Acm) (서열번호 31)에 대해서, 하기식(12)로 나타내는 브로모아세틸화된 테트라시알로 당쇄(5등량)으로 변경한 것 외에는 (실시예 3-1)과 동일한 방법에 의해, 테트라시알로 당쇄 수식 IFN-β를 합성하였다. 질량분석(ESI 이온화법)을 수행한 결과, 얻어진 화합물의 질량은, 목적으로 하는 2-6 tetraSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)의 질량과 일치하였다(계산치 = 41183.8 Da, 실측치 = 41182.6 Da).
〔화학식 28〕
Figure 112014113375492-pct00030
식(12)
( 실시예 6-2) 그 외의 테트라시알로 당쇄 수식 IFN -β의 합성
(실시예 6-1)과 동일한 방법을 이용하여, 이하에 나타내는 화합물의 합성을 수행하였다.
2-6 테트라시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C) (서열번호 99)
실시예 3-1, 실시예 3-2, 실시예 3-3, 실시예 3-3, 실시예 3-4, 실시예 4-1, 실시예 4-2, 실시예 5-1, 실시예 5-2, 실시예 6-1, 실시예 6-2에서 얻어진 화합물의 질량 분석 결과를 하기(표3)에 나타낸다.
〔표 3〕
Figure 112014113375492-pct00031

Figure 112014113375492-pct00032
( 실시예 7) 디시알로 당쇄에 의한 4,5,6개의 수식 IFN - β의 마우스에서의 약물동태
( 실시예 7-1) 투여약 , 시약의 조제
2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C) (서열번호 61), 2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C) (서열번호 60), 2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (서열번호 46) 및 Avonex(바이오젠아이덱)는 L-아르기닌(L-Arginine), 폴리소르베이트를 포함하는 아세트산 완충액으로 588 nM로 조제하였다. Avonex는, 천연형의 IFN-β(IFN-β-1a)이고, 대조약으로서 이용하였다. 또한, Avonex는 CHO세포계를 이용하여 제조된 것으로, 천연의 인간 인터페론β의 80번 위치(본 발명의 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열에서 79번 위치에 해당)에 1개의 당쇄를 갖고, 그 당쇄 구조는 각 폴리펩티드마다 N-결합형 당쇄의 복합형의 다양한 당쇄일 수 있다.
( 실시예 7-2) 투여 및 채혈
마우스 (Balb/c마우스, 수컷, 8주령 체중 21-23g)에 대해서, 2352 pmol/kg의 용량으로 무제한 급이하에서, 등쪽 피하로부터 인슐린용 실린지 Myjector 29G × 1/2(Terumo 사)을 이용하여 용량 4 mL/kg으로 투여하였다. 피하투여 전, 및 투여 후, 10분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 16시간, 24시간 및 30시간에 미정맥으로부터 헤파린 처리 헤마토크리트 모세관(HIRSHMANN LABORGERATE)을 이용하여 75μL 채혈하였다. 채취한 혈액과 같은 체적의 6 mM EDTA-PBS를 빠르게 혼합하고, 원심분리(15000 rmp, 4℃, 10분)하였다. 상청액을 90μL 채취하여 혈장 샘플로 하였다. 혈장 샘플은 측정에 이용할 때까지 냉동보존하였다.
( 실시예 7-3) 혈중 농도 측정
IFN-β의 혈중 농도의 측정은, 인간 인터페론β ELISA 키트(카마쿠라 테크노 사이언스)를 이용하였다. 검량선을 작성하기 위한 스탠더드로서, 투여에 이용한 것과 동일한 로트의 디시알로 당쇄 4 내지 6개의 수식 IFN-β, Avonex를 이용하여 200 pM, 100 pM, 50 pM, 25 pM, 12.5 pM, 6.24 pM 및 3.125 pM이 되도록 키트 부속의 희석액으로 조제하였다. 검량선에는, 혈장 샘플의 희석률에 따라, 같은 반입량이 되도록 블랭크 혈장을 첨가하였다. 얻어진 IFN-β의 혈장중 농도 추이를 그래프화한 것을 도 4에 나타낸다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 혈장 중에서의 IFN-β농도를 비교하면, 모든 측정 포인트에서도, 디시알로 당쇄 4,5,6개의 수식 IFN-β는, 대조약인 Avonex 보다도 훨씰 높은 혈장중 농도를 유지하고 있고, 혈중 체류성의 개선이 확인되었다. 그리고, 디시알로 당쇄 수식 개수가 늘어날수록 Tmax가 늦어지는 결과로 부터, 화합물의 피하로부터 혈중으로의 이행이 지연되었다고 생각되었다. Cmax 또는 소실상의 혈중농도는 디시알로 당쇄 수식 개수가 많을수록 높아지고 있었다. 이 점에서, 디시알로 당쇄를 부가함으로서, 디시알로 당쇄의 개수 의존적으로 생체 중에서의 IFN-β의 안정성이 향상되는 것으로 나타났다.
( 실시예 7-4) 약물 속도론적 파라미터의 산출
얻어진 IFN-β의 혈장중 농도 추이로부터 모멘트분석을 이용하여 혈중농도 곡선하 면적(AUC∞)을 사다리꼴 공식에 의해 산출하였다. 또한, 혈중 반감기(t 1/2), 평균체류시간(MRT) 및 피하투여시의 실측치로부터 최대 혈중농도(Cmax), 최대 혈중농도 도착시간(Tmax)을 구하였다. 얻어진 약물 속도론적 파라미터를 도 5에 나타냈다.
도 5에 나타내는 바와 같이, 모멘트분석의 결과로부터도 디시알로 당쇄 수식 IFN-β는 수식 개수 의존적으로 t1/2, AUC, MRT를 개선하는 효과가 크다는 것이 나타났다.
( 실시예 8) 디시알로 당쇄 및 모노시알로 당쇄의 4개의 당쇄 수식 IFN -β의 마우스에서의 약물 동태
( 실시예 8-1) 투여약 , 시약의 조제
2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C) (서열번호 61), 2-6 모노시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C) (서열번호 95) 및 Avonex는 L-아르기닌, 폴리소르베이트를 포함하는 아세트산 완충액으로 112 nM로 조제하였다.
( 실시예 8-2) 투여 및 채혈
마우스(Balb/c마우스, 수컷, 8주령, 체중 21-23g)에 대해서, 448 pmol/kg의 용량으로 무제한 급이하에서, 미정맥 또는 등쪽 피하로부터, 인슐린용 실린지 Myjector 29G × 1/2(Terumo 사)를 이용하여 용량 4 mL/kg 투여하였다. 정맥 내 투여시는 투여 전, 및 투여 후, 2분, 10분, 30분, 1시간, 3시간, 6시간, 8시간, 24시간, 30시간에 미정맥으로부터 헤파린 처리 헤마토크리트 모세관(HIRSHMANN LABORGERATE)을 이용하여 75μL 채혈하였다. 채취 혈액과 같은 체적의 EDTA-PBS를 빠르게 혼합하고, 원심분리(15000 rpm, 4℃, 10분)하였다. 상청액을 90μL 채취하여 혈장 샘플로 하였다. 혈장 샘플은 측정에 이용할 때까지 냉동보존하였다.
( 실시예 8-3) 혈중 농도 측정
IFN-β의 혈중 농도의 측정은, 인간 인터페론β ELISA 키트(카마쿠라 테크노사이언스)를 이용하였다. 검량선을 작성하기 위한 스탠더드로서, 투여에 이용한 것과 동일한 로트의 디시알로 당쇄의 4개의 당쇄 수식 IFN-β, 모노시알로 당쇄의 4개의 당쇄 수식 IFN-β, Avonex을 이용하여, 200 pM, 100 pM, 50 pM, 25 pM, 12.5 pM, 6.25 pM 및 3.125 pM이 되도록 키트의 부속 희석액으로 조제하였다. 검량선에는, 혈장 샘플의 희석률에 따라 같은 반입량이 되도록 블랭크 혈장을 첨가하였다. 얻어진 IFN-β의 혈장중 농도 추이를 그래프화한 것을 도 6에 나타낸다.
도 6에 나타내는 바와 같이, 혈장 중에서의 IFN-β농도를 비교하면, 모든 측정 포인트에서도, 2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C)는, 대조약인 Avonex보다도 t1/2, AUC∞, MRT의 모두에서 큰 폭으로 향상되어 있는 것이 확인되었다. 이에 대해서, 피하투여, 미정맥 투여 모두에 있어서도, 시알릴화가 불완전한 2-6 모노시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C)는, 대조약인 Avonex보다도 큰 폭으로 낮은 혈중 농도 추이를 나타내었다. 이 결과로부터, 당쇄의 말단이 모두 시알릴화 되어 있는 것이 IFN-β의 혈중 체류성 등의 향상에 크게 기여하는 것으로 나타났다.
( 실시예 8-4) 약물 속도론적 파라미터의 산출
얻어진 IFN-β의 혈장중 농도 추이로부터 모멘트분석을 이용하여, 혈장중 농도 곡선하 면적(AUC)을 사다리꼴 공식에 의해 산출하였다. 또한, 외삽법에 의한 정맥 내 투여시의 예측 초기농도(C0), 게다가, 혈중 반감기(t1/2), 평균체류시간(MRT) 및 피하투여시의 실측치로부터 최대 혈중농도(Cmax), 최대 혈중농도 도착시간 (Tmax)을 구하였다. 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타내는 바와 같이, 모멘트분석의 결과로부터도, 디시알로 당쇄의 4개의 수식 IFN-β는, 대조약인 Avonex보다도 t1/2, AUC∞, MRT에 대해 개선효과가 확인되었다. 반면에, 모노시알로 당쇄의 4개의 수식 IFN-β는, 대조약인 Avonex보다도 t1/2, AUC∞, MRT의 모두에서 저가를 나타내고, 혈중에서 보다 빠르게 소실하는 것이 확인되었다.
( 실시예 9) 디시알로 당쇄 및 모노시알로 당쇄의 6개의 당쇄 수식 IFN -β의 마우스에서의 약물동태
( 실시예 9-1) 투여약 , 시약의 조제
2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (서열번호 46), 2-6 모노시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (서열번호 93) 및 Avonex는 L-아르기닌, 폴리소르베이트를 포함하는 아세트산 완충액으로 588 nM로 조제하였다.
( 실시예 9-2) 투여 및 채혈
마우스(Balb/c마우스, 수컷, 체중 21-23g)에 대해서, 2352 pmol/kg의 용량으로, 무제한 급이하에서, 미정맥으로부터 인슐린용 실린지 Myjector 29G × 1/2 (Terumo 사)를 이용하여 용량 4 mL/kg 투여하였다. 정맥 내 투여 전, 및 투여 후, 2분, 10분, 30분, 1시간, 3시간, 6시간, 8시간, 24시간에, 미정맥으로부터 헤파린처리 헤마토크리트 모세관(HIRSHMANN LABORGERATE)을 이용하여 75μL를 채혈하였다. 채취혈액과 같은 체적의 EDTA-PBS를 빠르게 혼합하고, 원심분리(15000 rpm, 4℃, 10분)하였다. 상청액을 90μL 채취하여 혈장 샘플로 하였다. 혈장 샘플은 측정에 이용할 때까지 냉동보존하였다.
( 실시예 9-3) 혈중 농도 측정
IFN-β의 혈중 농도의 측정은, 인간 인터페론β ELISA 키트(카마쿠라테크노 사이엔스)를 이용하였다. 검량선을 작성하기 위한 스탠더드로서, 투여에 이용한 것과 동일한 로트의 디시알로 당쇄의 6개의 당쇄 수식 IFN-β, 모노시알로 당쇄의 6개의 당쇄 수식 IFN-β, Avonex를 이용하여, 200 pM, 100 pM, 50 pM, 25 pM, 12.5 pM, 6.25 pM 및 3.125 pM이 되도록 키트의 부속 희석액으로 조제하였다. 검량선에는, 혈장 샘플의 희석률에 따라 같은 반입량이 되도록 블랭크 혈장을 첨가하였다. 얻어진 IFN-β의 혈장중 농도 추이를 그래프화한 것을 도 8에 나타낸다.
6개의 수식 IFN-β에서도, 상술한 4개의 수식 IFN-β와 동일한 결과가 얻어졌다. 즉, 2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)는 대조약인 Avonex보다도 t1/2, AUC∞, MRT의 모두에서 큰 폭으로 향상해 있는 것이 확인되었다. 반면에, 미정맥 투여에서, 2-6 모노시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)는, 대조약인 Anovex보다도 큰 폭으로 낮은 혈중 농도 추이를 나타냈다. 이 점에서, 6개의 당쇄 수식 IFN-β에서도, 4개의 당쇄 수식 IFN-β와 마찬가지로, 당쇄의 말단이 모두 시알릴화되어 있다는 것이, IFN-β의 혈중 체류성 등의 향상에 매우 중요하다는 것이 확인되었다.
( 실시예 9-4) 약물 속도론적 파라미터의 산출
얻어진 IFN-β의 혈장중 농도 추이로부터의 모멘트분석을 이용하여, 혈장중 농도 곡선하 면적(AUC)을 사다리꼴 공식에 의해 산출하였다. 또한 외상법에 의해 정맥 내 투여시의 예측 초기농도(C0), 게다가, 혈중 반감기(t1/2), 평균체류시간(MRT)을 구하였다. 결과를 도 9에 나타낸다.
도 9에 나타내는 바와 같이, 모멘트분석의 결과로부터도 2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)는, 대조약인 Avonex보다도 t1/2, AUC∞, MRT의 모두에서 큰 폭으로 향상해 있는 것이 나타났다. 반면, 2-6 모노디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)는 대조약인 Avonex보다도 t1/2, AUC∞, MRT의 모두에서 낮은 값을 나타내고, 혈중에서 보다 빠르게 소실하는 것이 확인되었다.
( 실시예 10) 디시알로 당쇄의 6개의 수식 IFN -β와 PEG20K 수식 IFN -β의 마우스에서의 약물동태
( 실시예 10-1) 투여약 , 시약의 조제
2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (서열번호 46), PEG20K 수식 IFN-β 및 Avonex는 L-아르기닌, 폴리소르베이트를 포함하는 아세트산 완충액으로 558 nM 로 조제하였다.
( 실시예 10-2) 투여 및 채혈
마우스(Balb/c마우스, 수컷, 8주령, 체중 21-23g)에 대해서, 2352 pmol/kg의 용량으로, 무제한 급이하에서, 등쪽 피하로부터 인슐린용 실린지 Myjector 29G × 1/2(Terumo 사)를 이용하여 용량 4 mL/kg 투여하였다. 피하투여 전, 및 투여 후, 10분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 16시간, 24시간 및 30시간에 미정맥으로부터 헤파린 처리한 헤마토크리트 모세관(HIRSHMANN LABORGERATE)을 이용하여 75μL 채혈하였다. 채취 혈액과 같은 체적의 EDTA-PBS를 빠르게 혼합하고, 원심분리(15000 rpm, 4℃, 10분)하였다. 상청액을 90μL 채취하여 혈장 샘플로 하였다. 혈장 샘플은 측정에 이용할 때까지 냉동보존하였다.
( 실시예 10-3) 혈중 농도 측정
IFN-β의 혈중 농도의 측정은, 인간 인터페론β ELISA 키트(카마쿠라테크노 사이언스)를 이용하였다. 검량선을 작성하기 위한 스탠더드로서, 투여에 이용한 것과 동일한 로트의 디시알로 당쇄의 6개의 당쇄 수식 IFN-β, PEG20K 수식 IFN-β, Avonex를 이용하여, 200 pM, 100 pM, 50 pM, 25 pM, 12.5 pM, 6.25 pM 및 3.125 pM이 되도록 키트 부속 희석액으로 조제하였다. 검량선에는 혈장 샘플의 희석률에 따라, 같은 반입량이 되도록 블랭크 혈장을 첨가하였다. 얻어진 IFN-β의 혈장중 농도 추이를 그래프화한 것을 도 10에 나타낸다.
( 실시예 10-4) 약물 속도론적 파라미터의 산출
얻어진 IFN-β의 혈장중 농도 추이로부터의 모멘트분석을 이용하여, 혈장 중 농도 곡선하 면적(AUC)을 사다리꼴 공식에 의해 산출하였다. 또한, 외상법에 의해 정맥 내 투여시의 예측 초기농도(C0), 게다가, 혈중 반감기(t1/2), 평균체류시간(MRT)을 구하였다. 결과를 도 11에 나타낸다.
도 10 및 도 11에 나타내는 바와 같이, 혈장중 농도 추이 및 모멘트분석의 결과로부터, 디시알로 당쇄의 6개의 수식 IFN-β 및 PEG20K 수식 IFN-β는, 모두 Avonex보다도 t1/2, AUC∞, MRT의 모두에서 큰 폭으로 향상시켰다. 또한, 디시알로 당쇄의 6개의 수식 IFN-β는, AUC∞ 및 Cmax에 대해서, PEG20K 수식 IFN-β를 웃도는 것을 알 수 있었다.
t1/2 및 MRT에 대해서는, 디시알로 당쇄의 6개의 수식 IFN-β와 PEG20K 수식 IFN-β와의 사이의 비교에 있어서, 같은 정도의 결과였다.
이들의 결과로부터, 디시알로 당쇄의 6개의 수식 IFN-β는, PEG20K와 같은 정도 또는 그 이상으로, Avonex의 생체 중의 안정성을 향상시키는 것이 나타났다.
( 실시예 11) 디시알로 당쇄의 4,5,6개의 수식 IFN -β의 in vivo 에서의 항종양 활성
디시알로 당쇄의 4,5,6개의 수식 IFN-β의 in vivo에서의 항종양 활성을 담암 마우스를 이용하여 평가하였다.
( 실시예 11-1) 세포 배양
항종양 활성시험에서는, 인간 버키트림프종인 Daudi세포를 접종함으로서 제작된 담암 마우스를 이용하였다. 배지는 RPMI 1640(Invitrogen)로, 56℃에서 30분간 비동화 처리한 Fetal Bovine Serum(GIBCO)을 10%, 페니실린·스트렙토마이신 (SIGMA)을 부가한 것을 이용하였다. 배양 플레이트는 Non-treat dish(IWAKI)를 이용하여, 37℃, CO2농도 5% 조건하에서 배양하여 2-3일에 1번 계대하였다.
( 실시예 11-2) 담암 마우스의 작성법
배양한 Daudi세포를 튜브에 회수하고 원심분리(1300 rpm, 4℃, 3분)하였다. 상청액을 아스피레이터로 제거하고, HBSS(Nacalai)를 부가하여 세포를 현탁하였다. 그 다음에, 원심분리를 하여 상청액을 제거하였다. 이 세포의 세척 처리를 3회 수행하였다. 그리고 혈구 계산 판을 이용하여 세포 수를 계산하고 2 × 108 cells/mL가 되도록 HBSS를 이용하여 세포 현탁액을 작성하였다. Daudi세포접종 직전에, 세포 현탁액과 같은 체적의 메트리겔(BD)을 부가하여 2배 희석하고, 접종용 세포 현탁액을 제작하였다. 접종용 세포 현탁액은, 접종 직전까지 얼음 위에서 보존하였다. 마취액으로서, Somnopentyl(Kyoritsu Seiyaku)을 PBS로 5mg/mL로 희석하여 이용하였다. SCI 마우스(C.B-17/Icr-scid/scidJcl마우스, 수컷, 6주령) (일본크레아)에 인슐린용 실린지 Myjector 29G × 1/2(Terumo 사)을 이용하여 마취약을 300μL 복강 내에 투여하였다. 마취가 도입된 것을 확인 후, 면도칼을 사용하여 마우스의 오른쪽 복측부를 전모하였다. 26G 1/2 주사 침(Terumo 사)과 1 mL의 주사 통(Terumo 사)을 이용하여 접종용 세포 현탁액을 100μL 피하접종하였다.
세포 접종 처리로부터 약 30일 후, 측정기(Mitsutoyo)를 이용하여 형성된 종양 조직의 장경(mm)과 단경(mm)을 측정하였다. 얻어진 수치를 이용하여 종양체적(㎣)을 구하였다. 종양 체적은, 종양 체적(㎣) = 장경(mm) × 단경(mm) × 단경(mm) × 0.5의 식을 이용하여 산출하고 담암 마우스를 4군으로 군을 분류하였다(n = 4/군). 군 분류 시의 종양 체적은 약 800 ㎣ 이었다.
( 실시예 11-3) 투여액의 조제법
2-6 디시알로 (S1C-Q48C-N79C-K107C) (서열번호 61), 2-6 디시알로 (S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C) (서열번호 60), 2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (서열번호 46) 및 2-6 diSialo(S1C-N3C-Q48C-N79C-K107C-R112C) (서열번호 49) 및 대조약인 Avonex를 L-아르기닌, 폴리소르베이트를 포함하는 아세트산 완충액을 이용하여 588 nM로 조제하였다. 투여액의 조제는 투여 직전에 수행하였다.
( 실시예 11-4) 투여 방법
조제한 투여액을 이용하여, 등쪽 피하에 2352 pmol/kg의 용량이 되도록 4 mL/kg의 용량으로 인슐린용 실린지 Myjector 29G × 1/2를 이용하여 투여하였다. Vehicle 투여 군에는, 투여액 조제시에 이용한 L-아르기닌, 폴리소르베이트를 포함하는 아세트산 완충액을 4 mL/kg의 용량으로 투여하였다. 군 분류 및 첫회 투여를 수행한 일을 day 0으로하고, day 9까지 격일로 5회 등쪽 피하투여를 수행하였다.
( 실시예 11-5) 항종양 활성능의 평가
투여 개시 24일째에 마우스로부터 암 조직을 적출하고, 조직 습윤 중량을 측정하였다. 항종양 활성을 지표로서, Vehicle 투여 군의 조직 습윤 중량을 100%로 했을 때의 디시알로 당쇄 4 내지 6개의 수식 IFN-β 및 Avonex투여 군의 조직 습윤 중량의 상대치(% T/C: test/control)를 산출하였다. 결과를 도 12에 나타낸다.
도 12에 나타내는 바와 같이, 암 조직의 조직 습윤 중량의 상대치(% T/C)는, Avonex투여 군에서는 44.5%이었던 것에 대해, 2-6 디시알로 (S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) 투여 군에서 0.3%, 2-6 디시알로 (S1C-N3C-Q48C-N79C-K107C-R112C) 투여 군에서 0.4%, 2-6 디시알로(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C) 투여 군에서 18.9%, 2-6 디시알로 (S1C-Q48C-N79C-K107C) 투여 군에서 28.1%이고, 본 발명의 디시알로 당쇄 4,5,6개의 수식 IFN-β는, 암 조직을 거의 소멸시키거나 또는 매우 축소시킬 만큼 뛰어난 항종양 활성을 나타내었다.
이상의 결과로부터, 1일 1회, 격일 × 5회, 2352 pmol/kg 피하투여를 실시한 경우, 디시알로 당쇄 수식의 개수가 증가할수록 항종양 활성이 강한 경향이 관찰되었다.
( 실시예 12) 디시알로 당쇄 · 모노시알로 당쇄의 6개의 수식 IFN -β의 in vivo에서의 항종양 활성
(실시예 11-1)과 동일한 방법으로 세포 배양을 하고 (실시예 11-2)와 동일한 방법으로 담암 마우스를 작성하였다.
(실시예 11-3)의 투여액을, 2-6 디시알로 (S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (서열번호 46), 2-6 모노시알로 (S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (서열번호 93) 및 대조약인 Avonex로 한 것 이외는, (실시예 11-3)과 동일한 방법으로 투여액을 조제하고 (실시예 11-4)와 동일한 방법으로 담암 마우스에 투여하였다.
투여 개시 22일째에 마우스로부터 암 조직을 적출하고, 조직 습윤 중량을 측정하였다. 항종양 활성을 지표로서, Vehicle 투여 군의 조직 습윤 중량을 100%로 했을 때의 Avonex투여 군의 조직 습윤 중량의 상대치 (% T/C: test/control)를 산출하였다. 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타내는 바와 같이, 암 조직의 조직 습윤 중량의 상대치(% T/C)는, Avonex 투여 군에서는 63.0%이었던 것에 대해, 디시알로 당쇄의 6개의 수식 IFN-β 투여 군에서 1.3%로, 강한 항종양 활성이 확인되었다. 반면, 모노시알로 당쇄의 6개의 수식 IFN-β투여 군에서는 79.3%이었다.
이상의 결과로부터, 1일 1회, 격일 × 5회, 2352 pmol/kg 피하투여를 실시한 경우, 디시알로 당쇄의 6개의 수식 IFN-β에서는, Avonex 투여 군 보다 훨씬 뛰어난, 암 조직이 거의 소멸할 정도의 강한 항종양 활성이 나타나는 반면, 2개의 비환원 말단 중에, 한쪽 밖에 시알릴화 되지 않은 모노시알로 당쇄의 6개의 수식 IFN-β에서는, Avonex 투여 군 보다 뛰어난 항종양 활성은 확인되지 않았다. 이 점에서, 모든 비환원 말단이 시알릴화되어 있는 것이 항종양 활성화에 있어서 중요하다는 것을 알았다.
( 실시예 13) 디시알로 당쇄 · 트리시알로 당쇄 · 테트라시알로 당쇄의 6개의 수식 IFN -β의 in vivo 에서의 항종양 활성
(실시예 11-1)과 동일한 방법으로 세포 배양을 하고 (실시예 11-2)와 동일한 방법으로 담암 마우스를 작성하였다.
(실시예 11-3)의 투여액을 2-6 디시알로 (S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (서열번호 46), 2-6 트리시알로 (S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (서열번호 96), 2-6 테트라시알로 (S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (서열번호 98) 및 대조약인 Avonex로 한것 이외는 (실시예 11-3)과 동일한 방법으로 투여액을 조제하고 (실시예 11-4)와 동일한 방법으로 담암 마우스에 투여하였다.
투여 개시 21일째에 마우스로부터 암 조직을 적출하고, 조직 습윤 중량을 측정하였다. 항종양 활성을 지표로서, Vehicle투여 군의 조직 습윤 중량을 100%로 했을 때의 Avonex 투여 군의 조직 습윤 중량의 상대치(% T/C: test/control)를 산출하였다. 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14에 나타내는 바와 같이, 암 조직의 조직 습윤 중량의 상대치(% T/C)는 Avonex 투여 군에서는 55.5%이었던 것에 대해, 디시알로 당쇄의 6개의 수식 IFN-β투여 군에서 3.6%, 테트라시알로 당쇄 6개 수식의 IFN-β군에서는 9.1%, 트리시알로 당쇄의 6개의 수식 IFN-β에서 28.7%로, 모든 당쇄의 6개의 수식 IFN-β도 강한 항종양 활성을 갖는 것이 나타났다.
또한, 당쇄 구조에 관해, 당쇄의 분기 수의 차이에 착목하면, 2분기형의 디시알로 당쇄 6개의 수식체는 강한 항종양 활성을 나타내지만, 3분기형의 트리시알로 당쇄 6개의 수식체, 4분기형의 테트라시알로 당쇄 6개의 수식체에서는 디시알로 당쇄 6개의 수식체 보다 약한 항종양 활성을 나타내었다. 이것은 후술의 실시예 16의 결과(표 4)로 나타내는 바와 같은 in vitro에서의 세포 증식억제 활성의 차이 또는 생체 내에서의 혈중 동태의 차이 등이 관여하고 있을 가능성이 생각되어진다.
( 실시예 14) 디시알로 당쇄의 6개의 수식 IFN -β와 PEG20K 수식 IFN -β의 in vivo에서의 항종양 활성
(실시예 11-1)과 동일한 방법으로 세포 배양을 하고 (실시예 11-2)와 동일한 방법으로 담암 마우스를 작성하였다.
(실시에 11-3)의 투여액을, 2-6 디시알로 (S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C) (서열번호 46), PEG20K 수식 IFN-β 및 대조약인 Avonex로 한 것 외에는, (실시예 11-3)과 동일한 방법으로 투여액을 조제하고, (실시예 11-4)와 동일한 방법으로 담암 마우스에 투여하였다.
투여 개시 21일째에 마우스로부터 암 조직을 적출하고 조직 습윤 중량을 측정하였다. 항종양 활성을 지표로서, Vehicle 투여 군의 조직 습윤 중량을 100%로 했을 때의 Avonex 투여 군의 조직 습윤 중량의 상대치(%T/C: test/control)를 산출하였다. 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15로 나타내는 바와 같이, 암 조직의 조직 습윤 중량의 상대치(% T/C)는 Avonex 투여 군에서는 62.6%이었던 것에 대해, 디시알로 당쇄의 6개의 수식 IFN-β투여 군에서 0.3%로, 암 조직이 거의 소멸할 정도의 매우 높은 항종양 활성을 나타내었다. 반면, PEG20K 수식 IFN-β 투여 군의 % T/C는 58.5%로, 대조약인 Avonex 투여 군과 같은 정도에 지나지않았다. 이 점에서, 디시알로 당쇄의 6개의 수식 IFN-β는, 대조약인 Avonex 및 종래 기술로서 알려진 PEG20K 수식 IFN-β에 비해, 매우 뛰어난 IFN-β활성을 갖는 것을 밝혔다.
일반적으로, 종래기술로서, 단백질의 물리적 안정성과 혈장중 안정성을 향상시키기 위해서, 폴리펩티드에 PEG를 부가하는 것이 수행되어 왔다. 본 발명의 (실시예 10)에서도, PEG 수식 IFN-β는, Avonex와 비교해서 현저하게 개선된 혈중 농도 추이를 나타내었다. 그러나 (실시예 14)에서 PEG 수식 IFN-β는, Avonex와 같은 정도의 항종양 활성밖에 나타내지 않았다. 즉, 일반적으로 혈중 체류성을 향상시키는 효과가 있다고 알려져 있는 PEG 수식에서는, IFN-β의 항종양 활성에 관해서는 향상이 보이지 않은 것에 대해, 본 발명의 당쇄 수식 IFN-β는, 놀랍게도 (실시예 10)이 나타내는 바와 같이, 혈중 체류성이 Avonex 보다도 현저하게 높고, 게다가 항종양 활성에 대해서도 현저하게 향상하였다. 이 점에서, 본 발명의 당쇄 수식 IFN-β가, 천연의 IFN-β 또는 PEG 수식 IFN-β보다도, 약제로서의 유용성이 매우 높다는 것이 나타났다.
( 실시예 15) 4,5,6개의 당쇄 수식 IFN -β의 in vitro 에서의 세포 증식억제 활성
4,5,6개의 당쇄 수식 IFN-β의 in vitro에서의 세포 증식억제 활성을 이하의 방법에 의해 평가하였다.
인간 버키트림프종 세포주 Daudi를 10% Fetal bovine serum, 100U/mL penicillin, 100μL 스트렙토마이신 함유 RPMI 1640배지(10% FCS-RPMI 1640)를 이용하여 1.25 × 105 개/mL가 되도록 현탁하였다. 세포 현탁액을 1 × 104 /80 μL/well 씩 96웰 평저플레이트에 파종하였다. 게다가, 10% FCS-RPMI 1640을 이용하여 단계 희석한 복수 개의 당쇄 수식 IFN-β를 20μL/well씩 첨가하여 CO2 농도를 5%로 조정한 CO2 인큐베이터 안에서 37℃, 3일간 배양하였다. 세포 증식억제 활성은, 배양 3일째의 미토콘드리아 탈수소효소 활성을 지표로서, Cell counting kit-8(동인 과학)을 이용하여 키트의 첨부 메뉴얼에 따라 측정하였다.
또한 대조로서, Avonex를 사용하였다. IC50 값은, GraphPad Prism을 이용하여 산출하였다. 결과를 하기(표 4)에 나타낸다.
〔표 4〕
Figure 112014113375492-pct00033
Figure 112014113375492-pct00034
본 발명에서 항종양 활성의 향상 효과를 보이는 당쇄 수식 IFN-β와는 다른 위치를 당쇄 수식한 당쇄 부가 폴리펩티드에 관해서도 (표 4)에 나타낸 대로, 다양한 당쇄 부가 폴리펩티드에서, in vitro에서의 세포 증식억제 활성의 향상을 보였다. (표 4)에서 나타낸 당쇄 부가 폴리펩티드에 대해서도, 전술의 당쇄 부가 폴리펩티드와 마찬가지로 비환원 말단이 모두 시알릴화된 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드는, 인터페론β활성을 갖는 약제로서, 항종양 활성 등의 인터페론 활성의 뛰어난 약제로 사용할 수 있다고 생각된다.
이상으로부터, 본 발명의 4 내지 6개의 당쇄 수식 IFN-β는, 천연의 IFN-β(Avonex)보다도 높은 혈중 체류성 및 높은 항종양 활성을 갖는 것이 나타났다.
도 4, 도 5 및 도 12로 나타내는 바와 같이, 디시알로 당쇄 수식 IFN-β는, 당쇄의 개수가 4개 보다도 5개, 5개 보다도 6개 라는, 개수가 많아짐에 따라 혈중 체류성이 높아지고 또한, 항종양 활성도 높아지는 것이 나타났다.
또한, 본 발명에서, 당쇄의 비환원 말단이 모두 시알릴화 되어 있는 것이, IFN-β의 혈중 체류성의 향상 및 생체 내에서의 항종양 활성의 향상에 중요하다는 것이 나타났다.
또한, 당쇄의 비환원 말단이 모두 시알릴화된 당쇄로서, 디시알로 당쇄 외에, 트리시알로 당쇄, 테트라시알로 당쇄 등의 다양한 당쇄를 이용한 경우에, 모두 천연의 IFN-β(Avonex)보다도 높은 혈중 체류성 및 높은 항종양 활성을 갖는 것이 나타났다.
따라서, 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드는 뛰어난 인터페론β활성을 갖는 약제로서 유용하다고 생각된다.
<110> GLYTECH, INC. <120> sialylated glycosylated polypeptide <130> IPA141067-JP <150> JP2013-073703 <151> 2013.03.29 <160> 111 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> expressed in Escherichia coli <220> <221> DISULFID <222> (30)..(140) <400> 1 Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Ser 1 5 10 15 Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu Lys 20 25 30 Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Gln 35 40 45 Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn 50 55 60 Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu 65 70 75 80 Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His 85 90 95 Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg 100 105 110 Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile 115 120 125 Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile 130 135 140 Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe 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disialo(alpha 2-6) oligosaccharide <220> <221> DISULFID <222> (30)..(140) <400> 100 Cys Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Ser 1 5 10 15 Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Cys Leu Glu Tyr Cys Leu Lys 20 25 30 Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Cys 35 40 45 Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn 50 55 60 Ile Phe Cys Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu 65 70 75 80 Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Cys Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His 85 90 95 Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg 100 105 110 Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile 115 120 125 Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile 130 135 140 Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr 145 150 155 160 Gly Tyr Leu Arg Asn 165 <210> 101 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> 1C has Thiazolidine gourp <220> <221> BINDING <222> (25)..(25) <223> alkylthioester-modified with Thiophenol <400> 101 Cys Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Ser 1 5 10 15 Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly 20 25 <210> 102 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (5)..(5) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (22)..(22) <223> alkylthioester-modified with MESNA <400> 102 Cys Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu 1 5 10 15 Glu Ile Lys Gln Leu Gln 20 <210> 103 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> 1C has Thiazolidine gourp <220> <221> BINDING <222> (19)..(19) <223> alkylthioester-modified with Ethanthiol <400> 103 Cys Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln 1 5 10 15 Asn Ile Phe <210> 104 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> 1C has Thiazolidine gourp <220> <221> CARBOHYD <222> (13)..(13) <223> disialo(alpha 2-6) oligosaccharide <220> <221> BINDING <222> (21)..(21) <223> alkylthioester-modified with Thiophenol <400> 104 Cys Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile 1 5 10 15 Val Glu Asn Leu Leu 20 <210> 105 <211> 78 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (53)..(53) <223> Acm <400> 105 Cys Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu 1 5 10 15 Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu 20 25 30 His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys 35 40 45 Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg 50 55 60 Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 65 70 75 <210> 106 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> 1C has Thiazolidine gourp <220> <221> BINDING <222> (30)..(30) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (47)..(47) <223> alkylthioester-modified with Ethanthiol <400> 106 Cys Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Ser 1 5 10 15 Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Cys Leu Glu Tyr Cys Leu Lys 20 25 30 Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln 35 40 45 <210> 107 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> CARBOHYD <222> (13)..(13) <223> disialo(alpha 2-6) oligosaccharide <220> <221> BINDING <222> (74)..(74) <223> Acm <400> 107 Cys Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile 1 5 10 15 Val Glu Asn Leu Leu Cys Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys 20 25 30 Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys 35 40 45 Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His 50 55 60 Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg 65 70 75 80 Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr 85 90 95 Leu Arg Asn <210> 108 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> CARBOHYD <222> (32)..(32) <223> disialo(alpha 2-6) oligosaccharide <220> <221> BINDING <222> (93)..(93) <223> Acm <400> 108 Cys Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln 1 5 10 15 Asn Ile Phe Cys Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 20 25 30 Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Cys Asn Val Tyr His Gln Ile Asn 35 40 45 His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr 50 55 60 Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 65 70 75 80 Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr 85 90 95 Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu 100 105 110 Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 115 <210> 109 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> CARBOHYD <222> (79)..(79) <223> disialo(alpha 2-6) oligosaccharide <220> <221> BINDING <222> (30)..(30) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (140)..(140) <223> Acm <400> 109 Cys Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Ser 1 5 10 15 Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Cys Leu Glu Tyr Cys Leu Lys 20 25 30 Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Cys 35 40 45 Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn 50 55 60 Ile Phe Cys Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu 65 70 75 80 Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Cys Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His 85 90 95 Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg 100 105 110 Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile 115 120 125 Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile 130 135 140 Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr 145 150 155 160 Gly Tyr Leu Arg Asn 165 <210> 110 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> disialo(alpha 2-6) oligosaccharide <220> <221> CARBOHYD <222> (26)..(26) <223> disialo(alpha 2-6) oligosaccharide <220> <221> CARBOHYD <222> (48)..(48) <223> disialo(alpha 2-6) oligosaccharide <220> <221> CARBOHYD <222> (67)..(67) <223> disialo(alpha 2-6) oligosaccharide <220> <221> CARBOHYD <222> (79)..(79) <223> disialo(alpha 2-6) oligosaccharide <220> <221> CARBOHYD <222> (88)..(88) <223> disialo(alpha 2-6) oligosaccharide <220> <221> BINDING <222> (30)..(30) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (140)..(140) <223> Acm <400> 110 Cys Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Ser 1 5 10 15 Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Cys Leu Glu Tyr Cys Leu Lys 20 25 30 Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Cys 35 40 45 Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn 50 55 60 Ile Phe Cys Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu 65 70 75 80 Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Cys Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His 85 90 95 Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg 100 105 110 Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile 115 120 125 Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile 130 135 140 Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr 145 150 155 160 Gly Tyr Leu Arg Asn 165 <210> 111 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> disialo(alpha 2-6) oligosaccharide <220> <221> CARBOHYD <222> (26)..(26) <223> disialo(alpha 2-6) oligosaccharide <220> <221> CARBOHYD <222> (48)..(48) <223> disialo(alpha 2-6) oligosaccharide <220> <221> CARBOHYD <222> (67)..(67) <223> disialo(alpha 2-6) oligosaccharide <220> <221> CARBOHYD <222> (79)..(79) <223> disialo(alpha 2-6) oligosaccharide <220> <221> CARBOHYD <222> (88)..(88) <223> disialo(alpha 2-6) oligosaccharide <400> 111 Cys Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Ser 1 5 10 15 Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Cys Leu Glu Tyr Cys Leu Lys 20 25 30 Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Cys 35 40 45 Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn 50 55 60 Ile Phe Cys Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu 65 70 75 80 Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Cys Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His 85 90 95 Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg 100 105 110 Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile 115 120 125 Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile 130 135 140 Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr 145 150 155 160 Gly Tyr Leu Arg Asn 165

Claims (14)

  1. 인터페론β 활성을 갖는 당쇄 부가 폴리펩티드로서,
    상기 당쇄 부가 폴리펩티드가 하기의 (1) 내지 (3)으로 이루어진 군에서 선택되는, 임의의 폴리펩티드이며;
    (1) 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드,
    (2) 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드에서, 1개 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 폴리펩티드, 및
    (3) 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드에 대해서, 80%이상의 상동성을 갖는 폴리펩티드,
    여기서, 4 내지 6개 위치의 아미노산이 당쇄 부가 Cys 또는 Asn으로 치환되어 있고, 상기 각각의 당쇄 부가 Cys 또는 Asn 중 적어도 3개가 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열에서 1, 3, 41, 48, 75, 79, 107, 112, 123, 및 136번 위치로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에 상응하는 위치에 존재하고,
    상기 당쇄의 비환원 말단의 모두가 시알릴화 되어 있는 것을 특징으로 하는,
    당쇄 부가 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 각 당쇄 부가 아미노산의 당쇄가 모두 독립적으로 디시알로 당쇄, 트리시알로 당쇄 및 테트라시알로 당쇄로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 당쇄 부가 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 각 당쇄 부가 아미노산의 당쇄가 모두 독립적으로 하기 식(1), 식(2), 식(3) 및 식(4)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 당쇄 부가 폴리펩티드.
    [화학식 1]
    Figure 112020058248306-pct00035
    식(1)

    [화학식 2]
    Figure 112020058248306-pct00036
    식(2)

    [화학식 3]
    Figure 112020058248306-pct00037
    식(3)

    [화학식 4]
    Figure 112020058248306-pct00038
    식(4)
  4. 제1항에 있어서, 상기 각 당쇄 부가 아미노산의 당쇄가 모두 동일한 것을 특징으로 하는 당쇄 부가 폴리펩티드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 각 당쇄 부가 아미노산이 모두 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열에 있어서 2, 5, 6, 9, 12, 13, 16, 19, 20, 23, 27, 33, 37, 39, 40, 43, 53, 54, 55, 57, 58, 61, 62, 64, 65, 68, 69, 73, 78, 83, 86, 87, 90, 93, 94, 100, 124, 125, 128, 131, 132, 138, 141, 142, 145, 148, 149, 152, 153, 156, 159, 160 또는 163번 위치에 상응하는 위치에 존재하지 않는 것을 특징으로 하는 당쇄 부가 폴리펩티드.
  6. 제1항에 있어서, 상기 각 당쇄 부가 아미노산이 모두 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열에 있어서 1, 3, 7, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 38, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 70, 75, 79, 99, 103, 106, 107, 109, 112, 115, 123, 130, 136, 139 및 164번 위치로 이루어진 군에서 선택되는 위치에 상응하는 위치에 존재하는 것을 특징으로 하는 당쇄 부가 폴리펩티드.
  7. 제1항에 있어서, 상기 당쇄 부가 폴리펩티드가 화학적으로 합성된 것을 특징으로 하는 당쇄 부가 폴리펩티드.
  8. 인터페론β에 관련하는 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 의약조성물로서, 상기 의약조성물이,
    (1) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 당쇄 부가 폴리펩티드 및/또는 약학적으로 허용되는 그 염, 및
    (2) 약리학적으로 허용되는 담체를 포함하고,
    상기 인터페론β에 관련하는 질환이 뇌종양, 피부악성흑색종, B형 만성 활동성 간염, C형 만성 감염, 아급성 경화성 범뇌염, C형 대상성 간경변 및 다발성 경화증으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 의약조성물.


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