CN104334574B

CN104334574B - 附加唾液酸化糖链的多肽

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Publication number: CN104334574B
Application number: CN201480001384.7A
Authority: CN
Inventors: 大内政辉; 西原三佳; 手塚克成; 前田政敏; 梶原康宏; 坂本泉
Original assignee: Sugar Lock Engineering Institute Co Ltd
Current assignee: Sugar Lock Engineering Institute Co Ltd
Priority date: 2013-03-29
Filing date: 2014-03-24
Publication date: 2020-01-14
Anticipated expiration: 2034-03-24
Also published as: US20160052987A1; SG11201507769SA; BR112015024423B1; KR20150139411A; RU2668163C2; PH12015502224B1; TW201518318A; AU2014245917B2; CN104334574A; EP2982686B1; CA2908211C; TWI638830B; KR102186063B1; DK2982686T3; PH12015502224A1; CA2908211A1; WO2014157107A1; JP6368706B2; ES2687801T3; JPWO2014157107A1

Abstract

本发明的目的是提供附加有高均一性的唾液酸化糖链且具有干扰素β活性的多肽。所述附加糖链的多肽是在选自下述(1)至(4)：(1)由序列编号1所示的氨基酸序列构成的多肽，(2)在由序列编号1所示的氨基酸序列构成的多肽中，删除、置换或附加1个或多个氨基酸而成的多肽，(3)为干扰素β的类似物的多肽，以及(4)相对于由序列编号1所示的氨基酸序列构成的多肽具有80％以上同源性的多肽，所构成的组中的任一多肽中，有4至6处的氨基酸以附加糖链的氨基酸置换，且该糖链的非还原末端皆被唾液酸化的附加糖链的多肽。

Description

附加唾液酸化糖链的多肽

技术领域

本发明是关于附加唾液酸化糖链的多肽。更具体而言，是关于附加有高均一性的唾液酸化糖链且具有干扰素β活性的多肽。

背景技术

天然的人类干扰素β(IFN-β)是由166个氨基酸残基所构成的糖蛋白质。已知干扰素β属于细胞激素(cytokine)家族，参与免疫调节作用、抗病毒活性、细胞增殖抑制作用。此外，人类干扰素β，于天然的氨基酸序列中的第17位、31位、141位具有3个Cys，于第80位的Asn具有1个复合型之N连接型寡糖。此外，已知于第31位及第141位的Cys处具有二硫键。

作为药物的干扰素β利用细胞表达系统来制造，依使其表达的宿主的不同而分类为IFN-β-1a或IFN-β-1b。IFN-β-1a，在使用中国仓鼠的卵巢(CHO)细胞的表达系统中表达，与天然干扰素β同样，为具有糖链的糖蛋白质。另一方面，IFN-β-1b在大肠杆菌中表达，为不具有糖链的蛋白质。

已知IFN-β-1a，与IFN-β-1b相比，在免疫原性、抗病毒活性及抗肿瘤特性方面，具有更强的效能。而且，已知在糖蛋白质中所含的糖链结构对于药物动力学具有强影响力。

此外，已知若使聚乙二醇(PEG)等水溶性聚合物结合于蛋白质，则将带来蛋白质的物理稳定性、热稳定性、血浆中稳定性的提高等效果。目前存在有关以PEG修饰的IFN-β的报道，这些效果受到期待。例如，有关于对IFN-β-1b的N末端施行PEG修饰而得到的IFN-β复合物的报道(专利文献1、2)。此外，也存在有关对IFN-β-1a的N末端施行PEG修饰而得到的IFN-β复合物的报道(专利文献3)。这些修饰，虽然也许确实可赋予蛋白质上述稳定性等，但另一方面担心会使作为药物的IFN-β的活性降低。例如，据报道在PEG的分子量为2万以上的情况，活性急剧地降低(非专利文献1)。

考虑PEG修饰的上述担心，而选择纵使结合高分子量的PEG亦可维持IFN-β的活性的位置，施行部位特异性PEG修饰的报道(专利文献4)亦存在。但是，PEG是不存在于活体内的化合物，有关长期施用PEG修饰IFN-β的情况的蓄积性、安全性、有效性尚未被充分研究而未被确立。

同时，亦存在有关部位特异性地施行糖链修饰而得到的IFN-β复合物的报道(专利文献5)。在专利文献5中，对于天然型IFN-β的氨基酸序列，以使其具有共有序列(Asn-X-Ser/Thr)的方式导入氨基酸突变，并使用CHO细胞来表达，其中该共有序列为N连接型糖链的识别部位。但是，在该方法中，为了导入共有序列，在附加糖链的氨基酸以外之处亦发生氨基酸突变。此外，已知在CHO细胞中表达时，一般会发生糖链的不均一性。

[先前技术文献]

[专利文献]

[专利文献1]美国专利申请案公开第2009/0214472号说明书

[专利文献2]美国专利第7829659号说明书

[专利文献3]美国专利第7446173号说明书

[专利文献4]国际公开第2005/019260号

[专利文献5]国际公开第02/074806号

[非专利文献]

[非专利文献1]J.Control.Rel.第88卷，第35-42页(2003)

发明内容

[发明所要解决的问题]

为了使干扰素β的物理的稳定性、热稳定性、血浆中稳定性等提高，如上述，存在以PEG修饰干扰素β的多肽的例子。但是，在以PEG修饰的情况中，如上述，干扰素β作为药物的活性有时会降低。此外，由于PEG不是存在于活体内的物质，所以有在活体内蓄积而造成药害的担心。

另一方面，亦存在以糖链修饰干扰素β的多肽的例子。但是，例如，通过在CHO细胞中的表达而制造附加糖链的干扰素β的情况，如上述，已知在所附加的糖链的种类或附加的位置方面发生不均一性。在糖链为不均一的情况中，作为医药品时，亦有可能造成各批次间药效上有所差异；此外，就天然型附加糖链的干扰素β而言，有所谓血中滞留时间短的缺点。

[用于解决问题的手段]

本发明的发明人等为了解决上述问题而反复深入研究的结果，发现对于干扰素β的多肽，通过以其中的糖链的所有的非还原末端皆被唾液酸化的附加糖链的氨基酸，置换4至6处的氨基酸，可得到与天然人类干扰素β相比血中滞留性更为优异，且抗肿瘤活性更为优异的附加糖链的多肽。

亦即，在本发明的一方面中，是关于具有干扰素β活性的附加糖链的多肽，其特征为该附加糖链的多肽是在选自下述(1)至(4)：

(1)由序列编号1所示的氨基酸序列构成的多肽，

(2)在由序列编号1所示的氨基酸序列构成的多肽中，删除、置换或附加1个或多个氨基酸而成的多肽，

(3)为干扰素β的类似物的多肽，以及

(4)相对于由序列编号1所示的氨基酸序列构成的多肽，具有80％以上同源性(homology)的多肽，

所构成的组中的任一多肽中，有4至6处的氨基酸以附加糖链的氨基酸置换，且该糖链的所有的非还原末端皆被唾液酸化的附加糖链的多肽。

在本发明的一方面中，该各附加糖链的氨基酸，可各自独立地为附加糖链的Cys或附加糖链的Asn。

在本发明的一方面中，该各附加糖链的氨基酸中的糖链，皆可各自独立地选自二唾液酸糖链、三唾液酸糖链、及四唾液酸糖链所构成的组。

在本发明的一方面中，该各附加糖链的氨基酸中的糖链，皆可各自独立地选自下述式(1)、式(2)、式(3)及式(4)所构成的组：

在本发明的一方面中，该各附加糖链的氨基酸中的糖链可全部相同。

在本发明的一方面中，该各附加糖链的氨基酸的至少1个，可存在于序列编号1所示的氨基酸序列中，与选自第1位、3位、7位、24位、25位、28位、29位、32位、35位、38位、41位、42位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、70位、75位、79位、99位、103位、106位、107位、109位、112位、115位、123位、130位、136位、139位、及164位所构成的组中的位置相当的位置。

其中，在本发明的一方面中，该各附加糖链的氨基酸，可进一步皆不存在于序列编号1所示的氨基酸序列中，与第2位、5位、6位、9位、12位、13位、16位、19位、20位、23位、27位、33位、37位、39位、40位、43位、53位、54位、55位、57位、58位、61位、62位、64位、65位、68位、69位、73位、78位、83位、86位、87位、90位、93位、94位、100位、124位、125位、128位、131位、132位、138位、141位、142位、145位、148位、149位、152位、153位、156位、159位、160位、或163位的位置相当的位置。

在本发明的一方面中，前述各附加糖链的氨基酸的至少1个，可存在于序列编号1所示的氨基酸序列中，与选自第1位、3位、41位、48位、75位、79位、107位、112位、123位、及136位所构成的组中的位置相当的位置。

在本发明的一方面中，该各附加糖链的氨基酸的至少3个，可存在于序列编号1所示的氨基酸序列中，与选自第1位、3位、41位、48位、75位、79位、107位、112位、123位、及136位所构成的组中的位置相当的位置。

在本发明的一方面中，该各附加糖链的氨基酸，可皆存在于序列编号1所示的氨基酸序列中，与选自第1位、3位、7位、24位、25位、28位、29位、32位、35位、38位、41位、42位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、70位、75位、79位、99位、103位、106位、107位、109位、112位、115位、123位、130位、136位、139位、及164位所构成的组中的位置相当的位置。

在本发明的一方面中，该附加糖链的多肽可用化学方式合成。

此外，在本发明的一方面中，是关于医药组合物，其包含：

(1)前述附加糖链的多肽及/或其药学上可接受的盐、及

(2)药理学上可接受的载体。

在本发明的一方面中，该医药组合物可用于与干扰素β相关的疾病的治疗或预防。其中，前述疾病选自脑肿瘤、皮肤恶性黑色素瘤、B型慢性活动性肝炎、C型慢性肝炎、亚急性硬化性全脑炎、C型代偿性肝硬化及多发性硬化症所构成的组。

此外，在本发明的一方面中，关于先前述及的附加糖链的多肽的序列、附加糖链的氨基酸中的氨基酸、附加糖链的氨基酸中的糖链的种类及结构、以附加糖链的氨基酸置换氨基酸的位置、附加糖链的多肽的合成方法、作为医药组合物时的目标疾病，可为分别选自上述的组的任意组合。

[发明的效果]

本发明的附加糖链的多肽，由于可用化学方式合成，具有均一的糖链结构。因此，若依照本发明，可提供批次间的差异少，质量稳定，具有干扰素β活性的附加糖链的多肽及含该附加糖链的多肽的医药组合物。

此外，本发明的附加糖链的多肽，可为附加存在于活体内的糖链的多肽。因此，若依照本发明，可提供即使进行长期施用，对人体亦安全的附加糖链的多肽及含该附加糖链的多肽的医药组合物。

此外，若依照本发明，可提供与天然型干扰素β相比血中滞留性较高，抗肿瘤活性亦较高的附加糖链的多肽及含该附加糖链的多肽的医药组合物。

本发明的附加糖链的多肽，与天然型干扰素β相比，展现较高的血中滞留性，而且，抗肿瘤活性亦较高。

就常规技术而言，已知施行PEG修饰的干扰素β，与天然型人类干扰素β比较，血中滞留性虽提高，不过未见到抗肿瘤活性的提高。令人惊奇的是，依照本发明，使用比PEG的分子量小的糖链，可实现与PEG修饰体同样、或超越PEG修饰体的血中滞留性的提高，而且，尽管PEG修饰体无法使抗肿瘤活性提高，但本发明的糖链附加体可显著地提高抗肿瘤活性。因此，认为本发明中的附加糖链的多肽，具有高干扰素β活性，在与干扰素β相关的疾病的治疗中非常有用。

附图说明

图1是对于在(实施例3-1)中所得到的2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)及在(实施例4-1)中所得到的2-6monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)，展现进行质谱分析(ESI离子化法)的结果的质谱。

图2是对于在(实施例3-1)中所得到的2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)及在(实施例4-1)中所得到的2-6monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)，展现进行SDS-PAGE的结果的照片。

图3是对于在(实施例3-1)中所得到的2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)及在(实施例4-1)中所得到的2-6monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)的糖链成分，展现通过正相HPLC进行分析的结果的质谱。

图4是展现皮下施用2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)、2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C)、2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C时，各附加糖链的多肽的血浆中浓度变化的图。

图5是展现皮下施用2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)、2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C)、2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)时，各附加糖链的多肽的药物动力学参数的表。

图6是展现静脉内施用及皮下施用2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)、2-6monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)时，各附加糖链的多肽的血浆中浓度变化的图。左图为静脉内施用时，各附加糖链的多肽的血浆中浓度变化图，右图为皮下施用时，各附加糖链的多肽的血浆中浓度变化图。

图7是展现静脉内施用及皮下施用2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)、2-6monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)时，各附加糖链的多肽的药物动力学参数的表。

图8是展现静脉内施用2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)、2-6monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)时，各附加糖链之多肽的血浆中浓度变化的图。

图9是展现静脉内施用2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)、2-6monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)时，各附加糖链的多肽的药物动力学参数的表。

图10是展现皮下施用2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)、PEG20K修饰的IFN-β时，各附加糖链的多肽的血浆中浓度变化的图。

图11是展现皮下施用2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)、PEG20K修饰的IFN-β时，各附加糖链的多肽的药物动力学参数的表。

图12是展现在皮下施用2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)、2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C)、2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)、2-6diSialo(S1C-N3C-Q48C-N79C-K107C-R112C)的胆癌小鼠中，抗肿瘤活性的评估结果的图。

图13是展现在皮下施用2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)、2-6monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)的胆癌小鼠中，抗肿瘤活性的评估结果的图。

图14是展现在皮下施用2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)、2-6triSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)、2-6tetraSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)的胆癌小鼠中，抗肿瘤活性的评估结果的图。

图15是展现在皮下施用2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)、PEG20K修饰的IFN-β的胆癌小鼠中，抗肿瘤活性的评估结果的图。

图16就本发明中的干扰素β的氨基酸序列的例子而言，展现了干扰素β-1b的氨基酸序列(序列编号1)。

具体实施方式

本发明是关于附加唾液酸化糖链的多肽。具体而言，是关于附加均一性高的唾液酸化糖链，且具有干扰素β活性的附加糖链的多肽。

在本说明书中，「糖链」意指1个以上单元糖(单糖及/或其衍生物)连接而成的化合物。在2个以上的单元糖连接的情况，各个单元糖彼此之间，通过脱水缩合而在彼此之间产生糖苷键而彼此结合。就这些糖链而言，例如，除了活体中所含有的单糖类及多糖类(葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、木糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、唾液酸以及它们的复合物及衍生物)之外，可列举从分解的多糖、糖蛋白质、蛋白多糖、糖胺多糖、糖脂(glycolipids)等复合生物体物质分解或衍生而成的糖链等广范围的糖链，不过并不限于这些。

在本发明中，优选的糖链，为不使干扰素复合物的干扰素β活性消失的糖链。此种糖链无特别限定，可为活体内以复合糖质(glycoconjugate)(糖肽或糖蛋白质、蛋白多糖、糖脂等)存在的糖链，亦可为活体内不以复合糖质存在的糖质。

从本发明的干扰素复合物施用至活体的观点而言，在活体内以复合糖质存在的糖链是优选的。就在活体内以复合糖质存在的糖链而言，可列举：是在活体内结合于肽或蛋白质而作为糖肽或糖蛋白质的糖链的N-连接型糖链、O-连接型糖链等。

在本发明的一方面中，优选为使用N-连接型糖链。就N-连接型糖链而言，可列举如：高甘露糖(high mannitol)型、复合(complex)型、混成(hybrid)型，特别优选为复合型。

本发明中的糖链以糖链的所有非还原末端皆被唾液酸化为特征。在本说明书中，「糖链的所有非还原末端皆被唾液酸化」意指例如，在2分支型复合糖链的情况，意指2个非还原末端皆被唾液酸化，在3分支型复合糖链的情况，意指3个非还原末端皆被唾液酸化，在4分支型复合糖链的情况，意指4个非还原末端皆被唾液酸化。

本发明中，唾液酸化意指糖链的非还原末端与唾液酸结合。唾液酸意指氨基或羟基经取代的的神经氨酸的总称。在本发明中，存在于糖链的非还原末端的唾液酸，只要不使本发明的附加糖链的多肽的干扰素活性消失或显著地降低，可包括神经氨酸的所有置换体。其中，从「本发明的附加糖链的多肽施用至活体」的观点而言，本发明的附加糖链的多肽中糖链的唾液酸化，优选用天然存在的唾液酸。就天然存在的唾液酸而言，已知例如，第5位经乙酰化的N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)，或第5位经乙醇酸修饰的N-乙醇酰基神经氨酸(Neu5Gc)等。

就本发明的一方面而言，所有非还原末端皆被唾液酸化的糖链的具体实例，例如，就已知存在于活体内的糖链而言，可列举：N-连接型糖链的复合型糖链。就N-连接型糖链的复合型糖链而言，只要具有通常已知作为N-连接型糖链的复合型糖链的糖链基本骨架即可，纵使那些在其结合样式、有无岩藻糖、对于侧链的取代基有无修饰等方面不同的，亦包含在内。就N-连接型的复合型糖链而言，根据糖链的分支结构的差异，可分成如：二唾液酸糖链、三唾液酸糖链、及四唾液酸糖链等。亦即，在本发明中，「二唾液酸糖链」意指具有2分支型结构、并且非还原末端皆被唾液酸化的N-连接型的复合型糖链。同样地，「三唾液酸糖链」意指具有3分支型结构、并且非还原末端皆被唾液酸化的N-连接型的复合型糖链。同样地，「四唾液酸糖链」意指具有4分支型结构、并且非还原末端皆被液酸化的N-连接型的复合型糖链。

就这些糖链而言，更具体地说，可列举下述式(1)所示的α2-6二唾液酸糖链、式(2)所示的α2-3二唾液酸糖链、式(3)所示的α2-6三唾液酸糖链、及式(4)所示的α2-6四唾液酸糖链等。

本发明中的唾液酸化糖链，不限定于上述具体实例，亦可包含α2-3三唾液酸糖链、α2-3四唾液酸糖链等糖链与唾液酸的结合样式不同的唾液酸化糖链。这些结合样式，可为唾液酸化糖链中全部分支链皆为同一结合样式，亦可包含不同的结合样式。

此外，本发明中的唾液酸化糖链，亦可包含附加有岩藻糖的那些唾液酸化糖链。就附有岩藻糖的复合型糖链而言，例如，若为二唾液酸糖链，可列举下述式(13)，若为三唾液酸糖链，可列举下述式(15)及式(16)，若为四唾液酸糖链，可列举下述式(17)，作为具体实例。

在本发明的一方面中，本发明的附加糖链的多肽中各附加糖链的氨基酸中的糖链可全部相同，亦可包含不同的糖链。而且，在本说明书中，附加糖链的多肽中各附加糖链的氨基酸中的糖链为相同，意指在本发明中，于第4至6处氨基酸以附加糖链的氨基酸置换的情况，当将定该4至6处附加糖链的氨基酸中的糖链互相比较时，构成糖链的糖的种类、结合顺序、及结合样式于附加糖链的多肽内是相同的。

此外，在本发明的一方面中，包含本发明的附加糖链的多肽的组合物中，优选地，附加糖链的多肽中的各糖链是实质上均一的。在本说明书中，附加糖链的多肽中的各糖链是实质上均一的，意指在附加糖链的多肽之间，若比较在附加糖链的每个位置的各糖链，则在多肽中的位置是相同的，并且，构成各个位置上的糖链的糖的种类、结合顺序、及糖间的结合样式，于各糖链中实质上是相同的。在本发明中，附加糖链的多肽中的各糖链，至少90％以上，优选95％以上，更优选99％以上是均一的。

包含附加糖链的多肽的组合物，若其中附加糖链的多肽中各糖链实质上是均一的，则具有恒定的质量，在医药品的制造或分析等领域中是特别优选的。均一的糖链的比例，可通过例如，使用HPLC、毛细管电泳、质谱分析等方法测定。

本发明中的「序列编号1所示的氨基酸序列」，为干扰素β-1b的氨基酸序列(参照图16)。干扰素β-1b，已知为天然人类型干扰素β中第1位的Met被删除，第17位的Cys被置换成Ser的干扰素。

本发明的「附加糖链的多肽」意指，例如，序列编号1所示的氨基酸序列所构成的多肽中，4至6处氨基酸被「附加糖链的氨基酸」置换的多肽。

在本说明书中，所谓「附加糖链的氨基酸」是结合有糖链的氨基酸，其中糖链与氨基酸可经由连接基团而结合。

对于糖链所结合的氨基酸的种类并无特殊限定，可使用任意的天然氨基酸、非天然氨基酸。

在糖链与氨基酸经由连接基团结合的情况，从所谓「容易与连接基团结合」的观点而言，附加糖链的氨基酸的氨基酸优选为：天冬氨酸或谷氨酸等分子内具有2个以上羧基的氨基酸；赖氨酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸等分子内具有2个以上氨基的氨基酸；丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸等分子内具有羟基的氨基酸；半胱氨酸等分子内具有巯基的氨基酸；天冬酰胺、谷氨酰胺等分子内具有酰氨基的氨基酸。尤其，从反应性的观点而言，优选为半胱氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺。

此外，在本发明的任意附加糖链的多肽中，若糖链结构、糖链以外的结构、糖链的附加部位及糖链的附加数目为相同时，则认为在附加糖链的氨基酸是附加糖链的Asn及附加糖链的Cys的情况，本发明的附加糖链的多肽的血中半衰期没有大的差异。

在糖链及氨基酸经由连接基团结合的情况，就连接基团而言，可广泛使用在该领域中所使用的那些。可列举如：-NH-(CO)-(CH₂)_a-CH₂-(式中，a是整数，虽然只要不阻碍目标的连接基团功能即无限定，不过优选为0至4的整数)、C_1-10聚亚甲基、-CH₂-R-(其中，R是从选自烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、芳基、经取代的芳基、碳环基、经取代的碳环基、杂环基及经取代的杂环基所构成的组中的基团脱离1个氢原子而产成的基团)、-(CO)-(CH₂)_a-(CO)-(式中，a是整数，虽然只要不阻碍目标的连接基团功能即无限定，不过优选为0至4的整数)等。

而且，本发明的附加糖链的多肽的制造方法，不受其记载(例如，「氨基酸以附加糖链的氨基酸置换而形成的附加糖链的多肽」的记载)的任何限定，以下述的A法或B法中的任一种方法所制造的附加糖链的多肽，均包含于「氨基酸以附加糖链的氨基酸置换而成的附加糖链的多肽」中。此外，例如：将未结合氨基酸的糖链直接或经由连接基团与肽上的氨基酸结合而形成的附加糖链的多肽；在附加糖链的多肽中，通过于所附加的糖链上进一步附加糖或糖链而使已经附加的糖链延长的附加糖链的多肽；使1个或多个氨基酸结合于附加糖链的氨基酸的氨基及/或羧基，然后使其与1或多个干扰素β片段连接而形成的附加糖链的多肽；将氨基酸所结合的糖链经由连接基团结合于肽上的氨基酸而形成的附加糖链的多肽等，只要最终结构一致，均包含于本发明的附加糖链的多肽中。

在本发明的一方面中，以附加糖链的氨基酸置换上述「4至6处氨基酸」的位置，应以不因附加糖链的氨基酸的置换而使干扰素β的活性降低的方式，根据各个方面进行选择。例如，在天然的干扰素β中，优选以糖链所结合的第80位的Asn(相当于序列编号1所示的氨基酸序列的第79位)作为本发明中以附加糖链的氨基酸置换的位置。

在本发明的一方面中，就附加糖链的氨基酸的置换位置而言，优选选择在多肽之折叠中，不妨碍干扰素β的立体结构(conformation)的形成的的位置。为了避免妨碍干扰素β的立体结构的形成，在干扰素β形成与天然的同样的立体结构的情况中，附加糖链的氨基酸的置换位置可以是存在于立体结构表面的氨基酸的位置。换而言之，在干扰素β形成与天然的同样的立体结构的情况中，附加糖链的氨基酸的置换位置可以是没有构成立体结构的表面附近的氨基酸的位置(在本发明中，亦称为「非表面氨基酸的位置」)。此外，在本发明的一方面中，就附加糖链的氨基酸的置换位置而言，优选为非干扰素β的受体结合部位。本发明的发明人等使用干扰素β的立体结构解析等数据，进行深入研究，而推测出干扰素β的非表面氨基酸的位置、其他可妨碍立体结构形成的位置、可妨碍与受体结合的位置。从这种观点，在本发明的一方面中，优选地，附加糖链的氨基酸不存在于序列编号1所示的氨基酸序列中，与第2位、5位、6位、9位、12位、13位、16位、19位、20位、23位、27位、33位、37位、39位、40位、43位、53位、54位、55位、57位、58位、61位、62位、64位、65位、68位、69位、73位、78位、83位、86位、87位、90位、93位、94位、100位、124位、125位、128位、131位、132位、138位、141位、142位、145位、148位、149位、152位、153位、156位、159位、160位、或163位的位置相当的位置。此外，已阅读本说明书的本领域技术人员，可以以这些位置为基准，同样地适当研究较不宜作为附加糖链的氨基酸的置换位置的位置。

在本发明的一方面中，就附加糖链的氨基酸的置换位置而言，优选为不是天然干扰素β中形成二硫键的第31位及141位的Cys(相当于序列编号1所示的氨基酸序列中的第30位及第140位)。

本发明的发明人等，根据上述的观点反复专心研究，合成许多以附加糖链的氨基酸置换氨基酸序列上的各种氨基酸而形成的附加糖链的多肽，并测定干扰素β活性。结果，发现序列编号1所示的氨基酸序列中，至少，第1位、3位、7位、24位、25位、28位、29位、32位、35位、38位、41位、42位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、70位、75位、79位、99位、103位、106位、107位、109位、112位、115位、123位、130位、136位、139位、及164位是通过糖链附加而有助于干扰素β活性的维持或提高的位置。

基于上述的理由，在本发明的一方面中，各附加糖链的氨基酸的至少1个，优选存在于序列编号1所示的氨基酸序列中，与选自第1位、3位、7位、24位、25位、28位、29位、32位、35位、38位、41位、42位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、70位、75位、79位、99位、103位、106位、107位、109位、112位、115位、123位、130位、136位、139位、及164位所构成的组中的位置相当的位置。

此外，在本发明的一方面中，各附加糖链的氨基酸的至少2个，优选存在于序列编号1所示的氨基酸序列中，与选自第1位、3位、7位、24位、25位、28位、29位、32位、35位、38位、41位、42位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、70位、75位、79位、99位、103位、106位、107位、109位、112位、115位、123位、130位、136位、139位、及164位所构成的组中的位置相当的位置。

此外，在本发明的一方面中，各附加糖链的氨基酸的至少3个，优选存在于序列编号1所示的氨基酸序列中，与选自第1位、3位、7位、24位、25位、28位、29位、32位、35位、38位、41位、42位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、70位、75位、79位、99位、103位、106位、107位、109位、112位、115位、123位、130位、136位、139位、及164位所构成的组中的位置相当的位置。

此外，在本发明的一方面中，各附加糖链的氨基酸的至少4个，优选存在于序列编号1所示的氨基酸序列中，与选自第1位、3位、7位、24位、25位、28位、29位、32位、35位、38位、41位、42位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、70位、75位、79位、99位、103位、106位、107位、109位、112位、115位、123位、130位、136位、139位、及164位所构成的组中的位置相当的位置。

此外，在本发明的一方面中，在5处以上以附加糖链的氨基酸置换的情况，各附加糖链的氨基酸的至少5个，优选存在于序列编号1所示的氨基酸序列中，与选自第1位、3位、7位、24位、25位、28位、29位、32位、35位、38位、41位、42位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、70位、75位、79位、99位、103位、106位、107位、109位、112位、115位、123位、130位、136位、139位、及164位所构成的组中的位置相当的位置。

在本发明的一方面中，更优选地，上述的各附加糖链的氨基酸的每一个均存在于序列编号1所示的氨基酸序列中，与选自第1位、3位、7位、24位、25位、28位、29位、32位、35位、38位、41位、42位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、70位、75位、79位、99位、103位、106位、107位、109位、112位、115位、123位、130位、136位、139位、及164位所构成的组中的位置相当的位置。

在本发明的一方面中，更优选地，附加糖链的氨基酸的1个存在于序列编号1所示的氨基酸序列中，与第79位的位置相当的位置。

此外，在本发明的一方面中，更优选地，以其他(第79位以外)各附加糖链的氨基酸的1个或多个存在于序列编号1所示的氨基酸序列中，与选自第1位、3位、7位、24位、25位、28位、29位、32位、35位、38位、41位、42位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、70位、75位、99位、103位、106位、107位、109位、112位、115位、123位、130位、136位、139位、及164位所构成的组中的位置相当的位置。

此外，这些位置为优选的具体实例，并不以此处所列举的位置为限。已阅读本发明的本领域技术人员，可与本发明同样地，选择以附加糖链的氨基酸置换的位置。

在本发明的一方面中，各附加糖链的氨基酸的1个优选存在于序列编号1所示的氨基酸序列中，与第1位相当的位置。

在本发明的一方面中，各附加糖链的氨基酸的1个优选存在于序列编号1所示的氨基酸序列中，与第3位相当的位置。

在本发明的一方面中，各附加糖链的氨基酸的1个优选存在于序列编号1所示的氨基酸序列中，与第41位相当的位置。

在本发明的一方面中，各附加糖链的氨基酸的1个优选存在于序列编号1所示的氨基酸序列中，与第48位相当的位置。

在本发明的一方面中，各附加糖链的氨基酸的1个优选存在于序列编号1所示的氨基酸序列中，与第75位相当的位置。

在本发明的一方面中，各附加糖链的氨基酸的1个优选存在于序列编号1所示的氨基酸序列中，与第79位相当的位置。

在本发明的一方面中，各附加糖链的氨基酸的1个优选存在于序列编号1所示的氨基酸序列中，与第107位相当的位置。

在本发明的一方面中，各附加糖链的氨基酸的1个优选存在于序列编号1所示的氨基酸序列中，与第112位相当的位置。

在本发明的一方面中，各附加糖链的氨基酸的1个优选存在于序列编号1所示的氨基酸序列中，与第123位相当的位置。

在本发明的一方面中，各附加糖链的氨基酸的1个优选存在于序列编号1所示的氨基酸序列中，与第136位相当的位置。

此外，在本发明的一方面中，将氨基酸以附加糖链的氨基酸置换时，进行置换的位置可为选自上述的置换位置的位置的任意组合。

就本发明中上述的各附加糖链的氨基酸存在的位置而言，优选组合的具体实例，可例示与序列编号1所示的氨基酸序列中的下述的位置相当的位置，不过不以这些为限。

第1位、48位、79位、107位、112位、及123位；

第1位、3位、48位、79位、107位、及112位；

第1位、48位、79位、99位、107位、及112位；

第1位、48位、79位、107位、112位、及130位；

第1位、48位、79位、107位、112位、及136位；

第1位、48位、79位、107位、112位、及139位；

第1位、48位、79位、107位、112位、及164位；

第1位、29位、48位、79位、107位、及136位；

第1位、35位、48位、79位、107位、及136位；

第1位、41位、48位、79位、107位、及136位；

第1位、48位、75位、79位、107位、及136位；

第48位、75位、79位、107位、112位、及136位；

第41位、75位、79位、103位、107位、及136位；

第41位、75位、79位、106位、107位、及136位；

第41位、75位、79位、107位、109位、及136位；

第41位、75位、79位、107位、112位、及136位；

第41位、75位、79位、107位、115位、及136位；

第41位、75位、79位、107位、119位、及136位；

第1位、28位、48位、70位、及79位；

第1位、48位、79位、107位、及112位；

第24位、79位、107位、112位、及136位；

第25位、79位、107位、112位、及136位；

第32位、79位、107位、112位、及136位；

第35位、79位、107位、112位、及136位；

第38位、79位、107位、112位、及136位；

第41位、79位、107位、112位、及136位；

第7位、79位、107位、112位、及136位；

第48位、79位、107位、112位、及136位；

第75位、79位、107位、112位、及136位；

第41位、75位、79位、107位、及136位；

第42位、75位、79位、107位、及136位；

第45位、75位、79位、107位、及136位；

第46位、75位、79位、107位、及136位；

第47位、75位、79位、107位、及136位；

第48位、75位、79位、107位、及136位；

第49位、75位、79位、107位、及136位；

第50位、75位、79位、107位、及136位；

第1位、48位、79位、及107位；

第1位、3位、48位、及79位；

第79位、107位、112位、及136位；

第1位、79位、107位、及136位；

第28位、79位、107位、及136位；

第35位、79位、107位、及136位；

第70位、79位、107位、及136位；

第75位、79位、107位、及136位。

在本说明书中，与序列编号1所示的氨基酸序列中的位置相当的位置，意指只要无氨基酸的附加、删除等，与序列编号1所示的氨基酸序列中氨基酸的位置对应的位置的氨基酸。此外，在序列编号1所示的氨基酸序列内中存在氨基酸的附加、删除的情况，意指将氨基酸的附加、删除所造成的氨基酸序列上的移动考虑在内的位置的氨基酸。例如，第1位至第4位具有Ser₁-Tyr₂-Asn₃-Leu₄-序列的糖链附加干扰素β-1b中，在第1位与第2位的氨基酸之间附加1个氨基酸(Trp)的情况(Ser-Trp-Tyr-Asn-Leu-)，「与第2位(Tyr)相当的位置」，意指因Trp的附加而向C末端侧移动1位而得到的氨基酸(Tyr)的位置。

在本说明书中，「氨基酸」意指采用其最广泛的含义，不仅包括天然氨基酸，亦可包括如氨基酸变异体及衍生物等非天然氨基酸。考虑到该广泛的定义，本领域技术人员应可理解本说明书中的氨基酸，可列举如：天然蛋白原性L-氨基酸；D-氨基酸；氨基酸变异体及衍生物等经化学修饰的氨基酸；正亮氨酸、β-丙氨酸、鸟氨酸等天然非蛋白原性氨基酸；及具有为氨基酸的特征的本技术领域所公知的特性并以化学方式合成的化合物等。就非天然氨基酸的例子而言，可列举：α-甲基氨基酸(α-甲基丙氨酸等)、D-氨基酸、组氨酸类氨基酸(2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸(homohistidine)、α-氟甲基-组氨酸、及α-甲基-组氨酸等)、侧链具有多余的亚甲基的氨基酸(「高」氨基酸)、及侧链中的羧酸官能团氨基酸以磺酸基置换而成的氨基酸(磺基丙氨酸等)。在优选的方面中，本发明的化合物所含的氨基酸仅由天然氨基酸构成。

在本发明中，「序列编号1所示之氨基酸序列」表示干扰素β-1b的氨基酸序列(参照图16)。干扰素β-1b，已知具有天然的人类型干扰素β中第1位的Met删除，第17位的Cys被置换为Ser的氨基酸序列。

在本说明书中，在「氨基酸序列中的1或多个氨基酸被删除、置换或附加」的情况，被置换等的氨基酸的个数，只要保持干扰素β活性，则无特别限定，意指例如，有约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个氨基酸是不同的。或者，亦可包含整个氨基酸序列长度的20％以内，优选10％以内的氨基酸是不同的情况。被置换或附加的氨基酸可为天然氨基酸、非天然氨基酸、或氨基酸类似物，优选为天然氨基酸。在本发明的一方面中，就「氨基酸序列中的1或多个氨基酸被删除、置换或附加」的多肽而言，可列举天然型的人类干扰素β。如前述，由序列编号1所示的氨基酸序列构成的多肽，亦即，干扰素β-1b，具有天然的人类型干扰素β中的第1位Met被删除，第17位的Cys被置换为Ser的氨基酸序列。亦即，天然型的人类干扰素β，相对于由序列编号1所示的氨基酸序列构成的多肽，具有1个附加的氨基酸和1个置换的氨基酸。已阅读本发明的说明书的本领域技术人员，参考本说明书的公开，即使使用天然型的人类干扰素的氨基酸序列(干扰素β-1a)，代替本发明实施例所用的人类干扰素β-1b的氨基酸序列，亦可与本发明同样地制造、使用附加糖链的肽。就序列编号2而言，表示天然型的人类干扰素β-1a的氨基酸序列。在本发明的一方面中，使用天然型的人类干扰素β-1a的氨基酸序列代替本发明实施例所用的人类干扰素β-1b的氨基酸序列时，优选使用在天然的第80位未结合不均一糖链的氨基酸序列。

在本发明中，「干扰素β的类似物」意指与干扰素β结构上类似的多肽及/或具有与干扰素β重复的结构的多肽，例如，可列举：干扰素β的氨基酸的1或多个氨基酸被保守性地置换的多肽、干扰素β改变体、具有干扰素β活性的干扰素β片段、具有干扰素β活性的延长的干扰素β。

在本说明书中，「氨基酸的1或多个氨基酸被保守性地置换」意指氨基酸置换中，原来的氨基酸与所置换成的氨基酸的亲水性指数及/或疏水性指数类似的置换，且于此种置换的前后，不发生干扰素β活性的明显降低或消失的置换。

在本说明书中，「干扰素β改变体」意指干扰素β的改变体，包含干扰素β的天然存在的变异体、或以人工方式改变干扰素β而得的化合物，就这些改变而言，可列举如：干扰素β的1或多个氨基酸残基的烷基化、酰化(例如乙酰化)、酰胺化、羧基化、酯化、二硫键形成、糖基化、脂质化、磷酸化、羟基化、标识成分的结合等。

在本说明书中，「具有干扰素β活性的干扰素β的片段」意指从干扰素β的N末端及/或C末端删除1个以上的氨基酸，且维持干扰素β活性的肽。

在本说明书中，「具有干扰素β活性的延长的干扰素β」，意指在干扰素N末端及/或C末端附加1个以上的氨基酸，且维持干扰素β活性的肽。

本发明的附加糖链的多肽可包括：在由与序列编号1所示的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列所构成的多肽中，4至6处的氨基酸以附加糖链的氨基酸置换而形成的多肽。

本发明的附加糖链的多肽，可通过在本领域技术人员所公知的肽合成方法中并入糖链附加步骤而制造。在附加糖链时，虽亦可使用利用以转谷氨酰胺酶为代表的酶的方法，然而在此种情况，由于存在附加的糖链必须大量，最终步骤后的纯化变得繁杂，糖链的附加位置及可附加的糖链受到限制等问题，所以即使可用于分析用等的少量的合成，但在医药品制造等大规模制造上不能算是实用的方法。

作为本发明的附加糖链的多肽的简便制造方法，且为糖链结构均一的附加糖链的多肽的稳定的制造方法的具体实例，可例示以下：使用附加糖链的Asn作为附加糖链的氨基酸，通过适当使用固相合成、液相合成等公知的肽合成方法来制造附加糖链的多肽的方法(A法)；以及依照公知的肽合成方法制造由序列编号1所示的氨基酸序列所构成的多肽等的任意氨基酸以Cys置换而成的多肽，然后，对Cys通过化学合成附加糖链而制造附加糖链的多肽的方法(B法)。参考这些制造方法，本领域技术人员，可制造各种附加糖链的多肽，所得到的附加糖链的多肽及其制造方法，尤其在医药品制造的领域中是非常有用的。

此外，这些A法及B法，亦可以以2种以上的组合而进行。若为使用于分析等的少量合成，亦可进一步在上述方法中，组合利用转移酶的糖链延长反应。而且，A法记载于国际公开第2004/005330号小册子(US2005222382(A1))，B法记载于国际公开第2005/010053号小册子(US2007060543(A1))，通过引用将其公开内容全部并入本说明书中。此外，关于A法及B法中所使用的糖链结构均一的糖链的制造，记载于国际公开第03/008431号小册子(US2004181054(A1))、国际公开第2004/058984号小册子(US2006228784(A1))、国际公开第2004/058824号小册子(US2006009421(A1))、国际公开第2004/070046号小册子(US2006205039(A1))、国际公开第2007/011055号小册子等，通过引用将其公开内容全部并入本发明中。

制造附加糖链的多肽的方法(A法)

附加糖链的多肽，可通过，例如，将概要示于以下的使用附加糖链的Asn的固相合成来制造。

(1)将以脂溶性保护基保护氨基氮的氨基酸的羧基，与树脂(resin)结合。此种情况，由于将氨基酸的氨基氮用脂溶性保护基保护，所以可防止氨基酸彼此的自缩合，而使树脂与氨基酸反应产生结合。

(2)使所得到的反应物的脂溶性保护基脱离，而形成游离氨基。

(3)使该游离氨基与以脂溶性保护基保护氨基氮的任意氨基酸的羧基进行酰胺化反应。

(4)使上述脂溶性保护基脱离，而形成游离氨基。

(5)通过重复上述(3)及(4)的步骤1次以上，使任意数目的任意氨基酸连接，得到末端与树脂结合，其他端具有游离氨基的肽。

(6)最后，通过用酸切断树脂，可得到具有期望的氨基酸序列的肽。

其中，在(1)中，若使用以脂溶性保护基保护氨基氮的附加糖链的Asn代替用脂溶性保护基保护氨基氮的氨基酸，使该天冬酰胺部分的羧基与树脂的羟基反应，可得到于C末端具有附加糖链的Asn的肽。

此外，在(2)之后、或在重复(3)及(4)1次以上的任意次数后，于(3)中，若使用以脂溶性保护基保护氨基氮的附加糖链的Asn代替以脂溶性保护基保护氨基氮的氨基酸，则可于任意处附加糖链。

以此种方式，于(1)及(3)的任何步骤，进行使用以脂溶性保护基保护氨基氮的附加糖链的Asn代替以脂溶性保护基保护氨基氮的氨基酸2次以上，可得到在任意2处以上附加糖链的肽。

如果使附加糖链的氨基酸结合后，使脂溶性保护基脱离，形成游离氨基，然后立即进行步骤(6)，则可得到N末端具有附加糖链的Asn的肽。

就树脂而言，只要为通常于固相合成中使用的树脂即可，可使用例如，以氯官能化的2-氯三苯甲基氯树脂(Merck公司制)、以氨基官能化的Amino-PEGA树脂(Merck公司制)、具有羟基的NovaSyn TGT醇树脂(Merck公司制)、Wang树脂(Merck公司制)、HMPA-PEGA树脂(Merck公司制)等。此外，可使连接基团存在于Amino-PEGA树脂与氨基酸之间，就此种连接基团而言，可列举如：4-羟基甲基苯氧基乙酸(HMPA)、4-(4-羟基甲基-3-甲氧基苯氧基)-丁基乙酸(HMPB)等。

此外，在将C末端酰胺化的情况，优选使用例如，以氨基官能化的Rink-Amide-PEGA树脂(Merck公司制)。通过将该树脂与肽以酸切断，可将肽的C末端氨基酸酰胺化。

对于树脂与以脂溶性保护基保护氨基氮的氨基酸的结合，例如，为了使用具有羟基的树脂或以氯官能化的树脂，可使氨基酸的羧基与树脂进行酯结合。此外，在使用以氨基官能化的树脂的情况，将氨基酸的羧基通过酰胺键而结合于树脂。

就氨基酸而言，可使用所有氨基酸，可列举如：为天然氨基酸的丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、甘氨酸(Gly)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、脯氨酸(Pro)。

又，亦可使用上述天然氨基酸的D型氨基酸。

就脂溶性保护基而言，可列举如：9-芴甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)、苄基、烯丙基、烯丙氧羰基、乙酰基等碳酸酯类或酰胺类的保护基等。为在氨基酸中导入脂溶性保护基，例如在导入Fmoc基团的情况，可通过添加9-芴甲基-N-琥珀酰亚氨基碳酸酯及碳酸氢钠并使其反应而导入。反应可于0至50℃，优选于室温，进行约1至5小时。

就以脂溶性保护基所保护的氨基酸而言，亦可使用市售的那些。可列举如：Fmoc-Ser-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys-OH、Fmoc-Arg-OH、Fmoc-His-OH、Fmoc-Asp-OH、Fmoc-Glu-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Cys-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Pro-OH。

此外，就于侧链导入保护基的以脂溶性保护基所保护的氨基酸而言，可列举如：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Cys(StBu)-OH、Fmoc-Cys(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH。

此外，当要在附加糖链的多肽的氨基酸序列中附加连接基团时，可以于固相合成的过程中，使用以脂溶性保护基保护的连接基团代替上述的以脂溶性保护基保护的氨基酸，而于优选的位置插入连接基团。

在使用2-氯三苯甲基氯树脂的情况，可使用二异丙基乙基胺(DIPEA)、三乙基胺、吡啶、2,4,6-三甲基吡啶等碱进行酯化。此外，在使用具有羟基的树脂的情况，就酯化催化剂而言，可使用例如：1-(均三甲苯磺酰基)-3-硝基-1,2,4-三唑(MSNT)、二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)等公知的脱水缩合剂。氨基酸与脱水缩合剂的使用比例，为相对于前者1重量份，后者通常为1至10重量份，优选为2至5重量份。

酯化反应，例如，优选通过将树脂置入固相管柱中，用溶剂洗净该树脂，然后添加氨基酸溶液而进行。就洗净用溶剂而言，可列举如：二甲基甲酰胺(DMF)、2-丙醇、二氯甲烷等。就溶解氨基酸的溶剂而言，可列举如：二甲基亚砜(DMSO)、DMF、二氯甲烷等。酯化反应可于0至50℃，优选于室温，进行约10分钟至30小时，优选为约15分钟至24小时。

此时，也优选的是，固相上未反应的羟基使用乙酸酐等进行乙酰化而进行封端。

脂溶性保护基的脱离，可通过例如用碱处理而进行。就碱而言，可列举如：哌啶、吗啉等。此时，优选在溶剂存在下进行。就溶剂而言，可列举如：DMSO、DMF、甲醇等。

游离氨基，与以脂溶性保护基保护氨基氮的任意氨基酸的羧基的酰胺化反应，优选在活化剂及溶剂的存在下进行。

就活化剂而言，可列举如：二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺·盐酸盐(WSC/HCl)、叠氮磷酸二苯酯(DPPA)、羰基二咪唑(CDI)、氰基磷酸二乙酯(DEPC)、苯并三唑-1-基-氧基-三吡咯烷基鏻(DIPCI)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、羟基琥珀酰亚胺(HOSu)、二甲基氨基吡啶(DMAP)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)、羟基酞酰亚胺(HOPht)、五氟苯酚(Pfp-OH)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)、1-[双(二甲氨基)亚甲基]-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HCTU)、O-(7-偶氮苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)、O-苯并三唑-1-基-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)、3,4-二氢-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪(Dhbt)等。

活化剂的使用量，相对于以脂溶性保护基保护氨基氮的任意氨基酸，优选为1至20当量，更优选为1至10当量，进一步优选为1至5当量。

就溶剂而言，可列举如：DMSO、DMF、二氯甲烷等。反应可于0至50℃，优选于室温，进行约10至30小时，优选为约15分钟至24小时。脂溶性保护基的脱离可用与上述同样的方式进行。

将肽链从树脂(resin)切断时，优选用酸进行处理。就酸而言，可列举如：三氟乙酸(TFA)、氟化氢(HF)等。

以此种方式，可得到于期望的位置以附加糖链的Asn进行置换的附加糖链的多肽。

而且，在本发明的一个实施方案中，当固相合成中所用的附加糖链的Asn中糖链上的非还原末端包含唾液酸时，为防止唾液酸因酸处理而被切断，优选将该唾液酸的羧基用保护基进行保护。就保护基而言，可列举如：苄基、烯丙基、二苯基甲基等。保护基的导入及保护基的脱离的方法可依照公知的方法进行。

制造附加糖链的多肽的方法(B法)

附加糖链的多肽亦可通过首先合成肽链，随后对合成的肽链附加糖链的方法制造。具体而言，可通过固相合成法、液相合成法、通过细胞来合成的方法、分离萃取天然存在的肽的方法等制造在将要附加糖链的位置包含Cys的肽。其中，对于诸如位于预定形成双硫键的位置的Cys等不附加糖链的Cys，以例如乙酰氨基甲基(Acm)基加以保护。此外，在将不附加糖链且亦不用于形成二硫键的Cys导入附加糖链的多肽的情况，可于糖链附加步骤及二硫键形成步骤之间，将该Cys以保护基保护，之后再脱保护的方式导入Cys。就此种保护基而言，可列举如：叔丁基(tBu)或4-甲氧基苄基。

此外，在附加糖链的多肽中的Cys附加不同的糖链的情况，可以通过使最初导入糖链的Cys为无保护的状态，继而通过将将要导入不同糖链的Cys以StBu等保护，即可导入不同的糖链。具体而言，通过固相合成等合成肽时，使将要导入第一糖链的Cys无保护，并且将将要导入第二糖链的Cys用Fmoc-Cys(StBu)-OH等保护，形成具有保护基的Cys。然后，在仍保持StBu等保护基下，将糖链导入至无保护的Cys。继而，通过脱去StBu基等保护基，可将不同的糖链导入至已成为无保护的Cys。而且，将要导入第一糖链的Cys及将要导入第二糖链的Cys可为1个或多个。

而且，StBu基的脱保护，可通过使用三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、三丁基膦等还原剂使其反应而脱保护。上述反应通常可于0至80℃进行，优选于5至60℃进行，进一步优选于10至35℃进行。反应时间通常优选为约30分钟至5小时。反应终了后，可通过适宜、公知的方法(例如，高效液相层析法(HPLC))进行纯化。

在附加糖链的多肽的氨基酸序列中附加有连接基团的情况，例如可以于固相合成的过程中，使用以脂溶性保护基保护的连接基团代替以脂溶性保护基保护的氨基酸，而在合成的多肽的优选位置，插入连接基团。

继而，通过使卤乙酰化复合型糖链衍生物与上述所得到的含有无保护的Cys的肽反应，使糖链与无保护的Cys的硫醇基反应而与肽结合。上述反应可于磷酸缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、或它们的混合溶液中，通常于0至80℃，优选于10至60℃，更优选于15至35℃进行。反应时间通常为10分钟至24小时，优选通常为约30分钟至5小时。反应终了后，可依照适宜、公知的方法(例如，HPLC)进行纯化。

卤乙酰化复合型糖链衍生物为，例如，将复合型天冬酰氨结合型糖链的第1位的碳所结合的羟基，以-NH-(CH₂)_a-(CO)-CH₂X(其中X为卤素原子，a为整数，且只要不阻碍目标的连接基团的功能，则无限定，但优选为表示0至4的整数)置换的化合物。

具体而言，可将卤乙酰化复合型糖链衍生物与含Cys的肽在磷酸缓冲液中，于室温反应。反应终了后，通过以HPLC纯化，可得到以附加糖链的Cys置换的附加糖链的多肽。

此外，亦可以在诸如DMSO、DMF、甲醇、乙腈等的有机溶剂与上述缓冲液的混合溶液中进行反应。此时，可以以有机溶剂的比率为0至99％(v/v)的范围，添加于上述缓冲液中。通过添加这样的有机溶剂，可使于缓冲液中溶解性低的含有无保护Cys的肽在反应溶液中的溶解性提高，因此是优选的。

此外，亦可于诸如DMSO、DMF、甲醇、乙腈等的有机溶剂，或它们的混合溶液中进行反应。此时，优选在碱的存在下进行。就碱而言，可列举如：DIPEA、三乙胺、吡啶、2,4,6-三甲基吡啶等。

此外，也可于将胍盐酸盐或尿素添加于缓冲溶液而形成的混合溶液中进行反应。而且，胍盐酸盐或尿素可以以最终浓度成为1M至8M的方式添加于上述缓冲液中。通过添加胍盐酸盐或尿素，亦可使在缓冲液中溶解性低的肽的溶解性提高，因此是优选的。

进一步，为防止含有无保护的Cys的肽，经由二硫键形成二聚体，可将三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)添加于缓冲液，使其反应。TCEP、DTT以最终浓度可成为10μM至10mM的方式添加于缓冲液中。

此外，使糖链与目标的Cys结合后，对以Acm等保护的Cys的保护基进行脱保护。在保护基为Acm基的情况，可通过在水、甲醇、乙酸、或它们的混合溶液中，使用碘、乙酸汞(II)、硝酸银(I)、或乙酸银(I)等进行反应而脱保护。

上述反应通常可于0至80℃，优选在5至60℃，进一步优选在10至35℃进行。反应时间通常优选为约5分钟至24小时。反应终了后，通过DTT或盐酸等处理后，可用适宜、公知的方法(例如，HPLC)进行纯化。

以此种方式，可得到于期望的位置以附加糖链的Cys置换的附加糖链的多肽。此外，以此方式纯化的附加糖的多肽，如下文所描述的，可使已脱保护的Cys彼此间形成二硫键。

此外，制造于肽序列中具有多条二唾液酸糖链或单唾液酸糖链等含有唾液酸的糖链的附加糖链的多肽时，可使用所导入的糖链上唾液酸的羧基以苄基(Bn)基、烯丙基、二苯基甲基、苯甲酰甲基等保护的含有唾液酸的糖链。

当导入唾液酸的羧基被保护的糖链时，可在附加糖链的多肽中形成二硫键的步骤后，进行唾液酸保护基的脱保护的步骤。

如此，通过将唾液酸的羧基以苄基等保护，将使制造步骤中通过HPLC等的分离/纯化步骤变得容易。此外，唾液酸的羧基的保护亦可防止在酸中不稳定的唾液酸的脱离。

糖链上的唾液酸的羧基的保护反应，可依照本领域技术人员所公知的方法进行。此外，在已形成二硫键的附加糖链的多肽中，唾液酸的羧基的保护基，可通过于碱性条件下水解而脱保护。上述反应通常于0至50℃，优选于0至40℃，更优选于0至30℃进行。优选地，反应时间通常为约5分钟至5小时。反应结束后，以磷酸或乙酸等弱酸中和后，可以以适宜、公知的方法(例如，HPLC)进行纯化。

此外，通过上述A法及B法所制作的附加糖链的多肽，可利用使用空气及/或氧、碘、DMSO、经氧化及还原的谷胱甘肽的混合物、铁氰化钾(potassium ferricyanide)、埃尔曼试剂(Ellman's Reagent)(5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸))、三氟乙酸铊(III)、以及烷基三氯硅烷亚砜等的本领域技术人员所公知的方法，而形成Cys之间的二硫键。

而且，形成Cys-Cys间的二硫键时，对于不希望形成二硫键的附加糖链的多肽中的Cys而言，通过保护基进行保护。就此种保护基而言，可使用Acm、tBu、4-甲氧基苄基、4-甲基苄基等于氧化条件下稳定的保护基。

此外，在B法中，二硫键的形成，亦可于糖链的导入前进行。但是，当在将要形成二硫键的Cys上导入保护基时，脱保护的步骤将于二硫键形成的步骤前先进行。

(活性)

本发明的附加糖链的多肽具有干扰素β活性。本说明书中，「干扰素β活性」，意指具有免疫调节作用、抗病毒活性、抗肿瘤活性等公知活性中的至少1种活性。

例如，附加糖链的多肽的干扰素β活性，可使用实施例11至14所记载的抗肿瘤活性测定试验等测定。

抗肿瘤活性的测定试验，可通过例如，将为对象的附加糖链的多肽皮下施用至罹患肿瘤的小鼠，并随着时间的变化而进行肿瘤体积的测定来研究。

(医药组合物)

含有本发明的附加糖链的多肽作为有效成分的医药组合物，对与干扰素β相关的疾病的治疗或预防有效。与干扰素β相关的疾病，包含例如，脑肿瘤、皮肤恶性黑色素瘤、B型慢性活动性肝炎、C型慢性肝炎、亚急性硬化性全脑炎、C型代偿性肝硬化、及多发性硬化症等。而且，上述的脑肿瘤，包含胶质母细胞瘤、成神经管细胞瘤、及星形细胞瘤等。含有本发明的附加糖链的多肽作为有效成分的医药组合物对于上述疾病的治疗或预防有效。

此外，含有本发明的附加糖链的多肽作为有效成分的医药组合物的施用对象意指任何生物个体，优选为动物，更优选为哺乳动物，进一步优选为人类的个体。

上述医药组合物是使用通常所用的填充剂、增量剂、黏合剂、湿润剂、崩散剂、表面活性剂、润滑剂等稀释剂或赋形剂，而制剂化成通常的医药组合物的形式的那些医药组合物。

就这些医药组合物而言，可列举如：片剂、丸剂、散剂、液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、胶囊剂、栓剂、吸入剂、滴眼剂、注射剂等。

医药组合物中所含有的本发明的附加糖链的多肽的量，无特别限定，可从广范围内适宜选择，然而通常在医药组合物中优选含有1重量％至90重量％本发明的附加糖链的多肽，更优选含有1重量％至70重量％。

以本发明的附加糖链的多肽作为有效成分的医药组合物，可进一步含有其他有效成分，亦可与含有其他有效成分的医药组合物组合使用。此外，以本发明的附加糖链的多肽作为有效成分的医药组合物，可含有作为药学上可接受的盐的附加糖链的多肽，亦可进一步以1种以上不同的本发明的附加糖链的多肽作为有效成分。此外，亦可与含有本发明的附加糖链的多肽作为有效成分的1种以上不同的医药组合物组合使用。此外，就医药组合物中可含有的其他成分而言，可列举本领域技术人员所公知的药学上可接受的载体等。

就本发明的医药组合物的施用方法而言，无特别限制，可以以依照各种制剂形式、患者的年龄、性别、疾病的状态、其他条件的各种方法而施用。就片剂、丸剂、液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂及胶囊剂的情况的施用方法而言，可列举如：经口施用。此外，在注射剂的情况，可单独，或与葡萄糖、氨基酸等通常的补充液混合，经由静脉内、肌肉内、皮内、皮下或腹腔内施用。在栓剂的情况，可施用至直肠内。在滴眼剂的情况，适用于结膜囊等眼组织。在吸入剂的情况，适用于支气管或肺。

上述医药组合物的施用量，可视用法、患者的年龄、性别、疾病的程度、其他条件而适宜选择，例如，对于1公斤体重，本发明的附加糖链的多肽的施用量可以为0.001nmol至100nmol，优选为0.01nmol至10nmol，更优选为0.01nmol至1nmol。

上述医药组合物的施用次数，只要依照用法、患者的年龄、性别、疾病的程度、其他条件适宜选择即可，例如，3次/1日、2次/1日、1次/1日，而且，亦可依照其血中稳定性，选择频率较少的施用次数(例如，1次/周、1次/月等)。优选地，上述医药组合物的施用次数为1次以下/1日。

本发明的附加糖链的多肽所附加的糖链可于体内的代谢系统中容易地分解。此外，在本发明的一方面中，该糖链具有在活体内以作为糖肽(或糖蛋白质)的方式结合而存在的结构。因此，本发明的附加糖链的多肽及以该附加糖链的多肽作为有效成分的医药组合物，具有即使施用至活体内，亦不会展现副作用或抗原性，可减少因过敏反应或抗体产生而无法得到药效的担心等优点。

进一步，本发明的附加糖链的多肽，可稳定、简便地大量供给，从「提供品质稳定、高品质的医药品」的观点而言，亦非常有用。

此外，在本说明书中所用的用语是用于说明特定的实施方案，而非意图限定发明。

此外，在本说明书中所用之「含有」用语，排除上下文语意上应做明显不同理解的情况，而意图表示所记载事项(构件、步骤、要素、数字等)的存在，但不排除其以外的事项(构件、步骤、要素、数字等)的存在。

除非有不同的定义，本文所用的全部用语(包含技术用语及科学用语)，与本发明所属技术领域的技术人员所广泛理解的意思具有相同含义。在本文中所用的用语，除非明示不同的定义，否则应被解释成与本说明书及关连技术领域中的含义一致的含义，而不应被解释成理想化、或过度形式化的含义。

第一、第二等用语是用于表达多种要素，不过这些要素应被理解成不受这些用语限定。这些用语仅用于将一个要素与其他要素区别，例如，可以将第一要素记载成第二要素，同样地，可以将第二要素记载成第一要素，均不会脱离本发明的范围。

以下，通过实施例将更具体地说明本发明，然而，本发明可通过各种形式实现，不应解释为仅限定于此处所记载的实施例。

[实施例]

关于本说明书中多肽片段的表示方法，如下述说明。

例如，在以IFN 1-78(S1Thi-C30Acm)MESNA表示的情况中，表示具有与序列编号1所示的氨基酸序列中第1-78号的氨基酸序列同等的肽序列，且相对于此肽序列，第1号的丝氨酸被置换成具有噻唑烷结构的半胱氨酸，第30号的半胱氨酸的侧链以Acm保护，C末端通过2-巯基乙磺酸(MESNA)而烷硫酯化(alkylthioesterified)的肽片段。

此外，在以IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-M35C-Q48C)MESNA表示的情况中，表示具有与序列编号1所示的氨基酸序列中第1-78号的氨基酸序列同等的肽序列，且相对于此肽序列，第1号的丝氨酸被置换成具有噻唑烷结构的半胱氨酸，第30号的半胱氨酸的侧链以Acm保护，第35号的甲硫氨酸被置换成半胱氨酸，第48号的谷氨酰胺被置换成半胱氨酸，C末端通过2-巯基乙磺酸(MESNA)而烷硫酯化的肽片段。

同样方式，在以IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C)Ethan表示的情况中，表示具有与序列编号1所示的氨基酸序列中第1-78号的氨基酸序列同等的肽序列，且相对于此肽序列，第1号的丝氨酸被置换成具有噻唑烷结构的半胱氨酸，第30号的半胱氨酸的侧链以Acm保护，第48号的谷氨酰胺被置换成半胱氨酸，C末端通过乙硫醇(ethanthiol)而烷硫酯化的肽片段。

此外，在以IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-R123C-C140Acm)表示的情况中，表示具有与序列编号1所示的氨基酸序列中第79-165号的氨基酸序列同等的肽序列，且相对于此肽序列，第79号的天冬酰胺被置换成半胱氨酸，第107号的赖氨酸被置换成半胱氨酸，第112号的赖氨酸被置换成半胱氨酸，第123号的精氨酸被置换成半胱氨酸，第140号的半胱氨酸以Acm基保护的肽片段。

关于经糖链修饰的多肽的表示方法，如下述说明。

例如，在以2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)表示的情况中，表示序列编号1所示的氨基酸序列中第1位的丝氨酸、第48位的谷氨酰胺、第79位的天冬酰胺、第107位的赖氨酸、112位的精氨酸、第123位的精氨酸的各氨基酸被置换成Cys，且下述式(1)所示的α2-6二唾液酸糖链结构结合于各置换中的Cys。

此外，在以2-3diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)表示的情况中，表示序列编号1所示的氨基酸序列中第1位的丝氨酸、第48位的谷氨酰胺、第79位的天冬酰胺、第107位的赖氨酸、第112位的精氨酸、123位的精氨酸的各氨基酸被置换成Cys，且下述式(2)所示的α2-3二唾液酸糖链结构结合于各置换中的Cys。

此外，在以2-6monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)表示的情况中，表示序列编号1所示的氨基酸序列中第1位的丝氨酸、第48位的谷氨酰胺、第79位的天冬酰胺、第107位之赖氨酸、第112位的精氨酸、第123位的精氨酸的各氨基酸被置换成Cys，且下述式(5)或下述式(6)所示的α2-6单唾液酸糖链结构结合于各置换中的Cys。

此外，在以2-6triSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)表示的情况中，表示序列编号1所示的氨基酸序列中第1位的丝氨酸、第48位的谷氨酰胺、第79位的天冬酰胺、第107位的赖氨酸、第112位的精氨酸、第123位的精氨酸的各氨基酸被置换成Cys，且下述式(3)所示的α2-6三唾液酸糖链结构结合于各置换中的Cys。

此外，在以2-6tetraSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)表示的情况中，表示序列编号1所示的氨基酸序列中第1位的丝氨酸、第48位的谷氨酰胺、第79位的天冬酰胺、第107位的赖氨酸、第112位的精氨酸、第123位的精氨酸的各氨基酸被置换成Cys，且下述式(4)所示的α2-6四唾液酸糖链结构结合于各置换中的Cys。

关于糖链结构结合于Cys的结构，以α2-6二唾液酸糖链的情况为例展现于下述式(14)中。下述式中，波形线表示相对于下述式右端所记载的半胱氨酸，省略了通过肽键所结合的邻接氨基酸的记载。

而且，「DiSialo」意指二唾液酸糖链，「monoSialo」意指单唾液酸糖链，「triSialo」意指三唾液酸糖链，「tetraSialo」意指四唾液酸糖链。

此外，在以2-6diSialo(S1C-Q48C-N79-K107C-R112C-R123C)表示的情况中，表示序列编号1所示的氨基酸序列中第1位的丝氨酸、第48位的谷氨酰胺、第107位的赖氨酸、第112位的精氨酸、第123位的精氨酸的各氨基酸被置换成Cys，且下述式(1)所示的α2-6二唾液酸糖链结构结合于上述各置换中的Cys、及第79位的天冬酰胺。

此外，在以下的实施例中，将4、5、6处的氨基酸以附加糖链的氨基酸置换而成的IFN-β可以分别以「4、5、6股糖链修饰的IFN-β」来表示。本发明中的「4处的氨基酸以附加糖链的氨基酸置换而成的附加糖链的多肽」与「4股糖链修饰的IFN-β」为同义，同样地，「5处的氨基酸以附加糖链的氨基酸置换而成的附加糖链的多肽」与「5股糖链修饰的IFN-β」为同义，同样地，「6处的氨基酸以附加糖链的氨基酸置换而成的附加糖链的多肽」与「6股糖链修饰的IFN-β」为同义。

(实施例1)硫酯片段的合成

(实施例1-1)IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C)Ethan(序列编号3)的合成

在固相合成用管柱上添加Amino-PEGA树脂(Merck公司制)(50μmol)，并将4-羟基甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(125μmol)、O-苯并三唑-1-基-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)(125μmol)及N-乙基吗啉(125μmol)溶解于二甲基甲酰胺(DMF)(1.25ml)中，于室温搅拌4小时。将树脂用DMF及二氯甲烷(DCM)充分洗净。继而将Fmoc-Trp(Boc)-OH(0.25mmol)、1-(均三甲苯磺酰基)-3-硝基-1,2,4-三唑(MSNT)(0.25mmol)及N-甲基咪唑(0.187mmol)溶解于DCM(1.25ml)中，添加于固相合成用管柱后，搅拌4小时。

将树脂用DCM、DMF洗净，将Fmoc基用20％哌啶/DMF溶液(2ml)处理15分钟，进行脱保护。以DMF洗净，随后肽链的延长，使用以下所示的方法依次缩合氨基酸。

将以Fmoc或Boc基保护的氨基酸溶解于DMF，将此溶液加入固相合成管柱(0.25mmol)中。将0.2M 1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HCTU)/DMF(0.25mmol)添加于固相合成管柱中，并将0.8M N-甲基吗啉/DMF(0.50mmol)或0.8M 2,6,4-三甲基吡啶/DMF(0.50mmol)添加于固相合成用管柱中。于室温搅拌15分钟或30分钟后，将树脂用DMF洗净，并使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)处理Fmoc基10分钟，进行脱保护。重复该操作，通过Fmoc固相合成法依次缩合氨基酸。

将所得到的树脂使用DCM及DMF洗净后，添加三氟乙醇及乙酸的混合溶液(1：1)，于室温下搅拌18小时，从树脂分离经保护的肽。将含经保护的肽的反应溶液于减压下浓缩后，于减压下干燥。将干燥的经保护的肽溶解于DMF(3.0mL)后，在氮氛围下，冷却至-15℃至-20℃。对此添加乙硫醇(5.0mmol)后，添加六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)(0.50mmol)，继而添加二异丙基乙基胺(DIPEA)(0.5mmol)。于-15℃至-20℃搅拌2小时后，添加乙酸(0.8mL)，慢慢地回到室温。回到室温后，将反应溶液于减压下浓缩。向所得到的残渣中添加三氟乙酸：水：苯酚：甲基苯基硫醚：三异丙基硅烷(＝95：2.5：2.5：2.5：5)，并于室温下搅拌。2小时后，再度将该溶液添加于另行准备的二乙醚使其沉淀后，进行离心分离，除去溶液部分，得到含目标肽硫酯体的残渣。将所得到之残渣用HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi]纯化，作为通过ESI-MS分析质量的结果，所得到的化合物的质量，与为目标的IFN1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C)Ethan的质量一致(计算值＝9445.8Da，实测值＝9445.5Da)。

(实施例1-2)IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C-S75C)MESNA(序列编号4)的合成

在固相合成用管柱上添加Amino-PEGA树脂(Merck公司制)(50μmol)，并将3-Fmoc-4-二氨基苯甲酸(150μmol)、1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HCTU)(150μmol)及二异丙基乙基胺(300μmol)溶解于DMF(1.25ml)中，并于室温搅拌2小时。

搅拌后，将树脂用DMF洗净，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)处理15分钟，脱去保护用的Fmoc基后，用DMF将树脂充分洗净。在随后的肽链的延长中，使用以下所示的方法依次缩合氨基酸。

将以Fmoc或Boc基保护的氨基酸溶解于DMF，将此溶液添加于固相合成管柱(0.25mmol)中。将0.2M 1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HCTU)/DMF(0.25mmol)加至固相合成管柱中，并将0.8M N-甲基吗啉/DMF(0.50mmol)或0.8M 2,6,4-三甲基吡啶/DMF(0.50mmol)添加于固相合成用管柱中。于室温搅拌15分钟或30分钟后，将树脂以DMF洗净，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)处理10分钟，脱去保护用的Fmoc基。重复该操作，通过Fmoc固相合成法依次缩合氨基酸。

将所得到的树脂用DMF、DCM洗净后，使氯甲酸4-硝基苯酯(0.25mmol)溶解于DCM，添加于固相合成管柱后，于室温搅拌30分钟。搅拌后，将树脂用DCM、DMF洗净，添加二异丙基乙基胺(2.5mmol)，并于室温搅拌15分钟。将所得到的树脂用DMF、DCM洗净后，添加三氟乙酸：水：苯酚：甲基苯基硫醚：三异丙基硅烷(＝95：2.5：2.5：2.5：5)并于室温下搅拌。5小时后，用含2-巯基乙磺酸钠的pH7.2的缓冲溶液(8M盐酸胍液、0.1M磷酸溶液、300mM 2-巯基乙磺酸钠)将树脂充分洗净。将上述缓冲液加至树脂中，并于室温搅拌12小时。

搅拌后，将所得到的溶液用HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi]纯化，作为通过ESI-MS分析质量的结果，所得到的化合物的质量，与为目标的IFN1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C-N75C)MESNA的质量一致(计算值＝9540.9Da，实测值＝9541.6Da)。

(实施例1-3)其他硫酯片段的合成

与(实施例1-1)同样地，进行以下所示硫酯片段的合成。

IFN 1-78(S1Thi-N3C-C30Acm-Q48C)Ethan(序列编号5)

IFN 1-78(S1Thi-E28C-C30Acm-Q48C-R70C)Ethan(序列编号6)

与(实施例1-2)同样地，合成以下的硫酯片段。

IFN 1-78(C30Acm)MESNA(序列编号7)

IFN 1-78(S1Thi-C30Acm)MESNA(序列编号8)

IFN 1-78(F7C-C30Acm)MESNA(序列编号9)

IFN 1-78(N24C-C30Acm)MESNA(序列编号10)

IFN 1-78(G25C-C30Acm)MESNA(序列编号11)

IFN 1-78(E28C-C30Acm)MESNA(序列编号12)

IFN 1-78(C30Acm-K32C)MESNA(序列编号13)

IFN 1-78(C30Acm-M35C)MESNA(序列编号14)

IFN 1-78(C30Acm-D38C)MESNA(序列编号15)

IFN 1-78(C30Acm-E41C)MESNA(序列编号16)

IFN 1-78(C30Acm-Q48C)MESNA(序列编号17)

IFN 1-78(C30Acm-R70C)MESNA(序列编号18)

IFN 1-78(C30Acm-S75C)MESNA(序列编号19)

IFN 1-78(C30Acm-E41C-S75C)MESNA(序列编号20)

IFN 1-78(C30Acm-E42C-S75C)MESNA(序列编号21)

IFN 1-78(C30Acm-Q45C-S75C)MESNA(序列编号22)

IFN 1-78(C30Acm-L46C-S75C)MESNA(序列编号23)

IFN 1-78(C30Acm-Q47C-S75C)MESNA(序列编号24)

IFN 1-78(C30Acm-Q48C-S75C)MESNA(序列编号25)

IFN 1-78(C30Acm-F49C-S75C)MESNA(序列编号26)

IFN 1-78(C30Acm-Q50C-S75C)MESNA(序列编号27)

IFN 1-78(S1Thi-Y29C-C30Acm-Q48C)MESNA(序列编号28)

IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-M35C-Q48C)MESNA(序列编号29)

IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-E41C-Q48C)MESNA(序列编号30)

将在(实施例1-1)、(实施例1-2)、(实施例1-3)中所得到的化合物的质谱分析结果示于下述(表1)中。

[表1]

(表1)

(实施例2)肽片段的合成

(实施例2-1)IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-R123C-C140Acm)(序列编号31)的合成

在固相合成用管柱上加入Amino-PEGA树脂(Merck公司制)(50μmol)，并使4-羟基甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(125μmol)、O-苯并三唑-1-基-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)(125μmol)及N-乙基吗啉(125μmol)溶解于DMF(1.25ml)中，于室温搅拌4小时。将树脂用DMF及DCM充分洗净。继而使Fmoc-Asn(Trt)-OH(0.25mmol)、1-(均三甲苯磺酰基)-3-硝基-1,2,4-三唑(MSNT)(0.25mmol)及N-甲基咪唑(0.187mmol)溶解于DCM(1.25ml)，加入固相合成用管柱后，搅拌4小时。

搅拌后，将树脂用DCM、DMF洗净，并使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)处理15分钟，脱去保护用的Fmoc基。以DMF洗净后，随后的肽链的延长使用以下所示的方法依次缩合氨基酸。

将以Fmoc或Boc基保护的氨基酸溶解于DMF中，将此溶液加入固相合成管柱(0.25mmol)中。将0.2M 1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HCTU)/DMF(0.25mmol)加入固相合成管柱中，并将0.8M N-甲基吗啉/DMF(0.50mmol)或0.8M 2,6,4-三甲基吡啶/DMF(0.50mmol)添加于固相合成用管柱中。于室温搅拌15分钟或30分钟后，将树脂用DMF洗净，并用20％哌啶/DMF溶液(2ml)处理10分钟脱去保护用Fmoc基。重复该操作，通过Fmoc固相合成法依次缩合氨基酸。

向所得到的树脂中添加三氟乙酸：水：苯酚：甲基苯基硫醚：三异丙基硅烷(＝95：2.5：2.5：2.5：5)，并于室温下搅拌。3小时后，再度将该溶液添加于另行准备的二乙醚中使其沉淀后，进行分离，除去溶液部分，得到包含目标的肽的残渣。将该得到的残渣以反相HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi]纯化，作为通过ESI-MS分析质量的结果，所得到的化合物的质量，与IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-R123C-C140Acm)的质量一致(计算值＝10499.1Da，实测值＝10498.1Da)。

(实施例2-2)其他肽片段的合成

以与(实施例2-1)同样的方式，合成以下所示的肽片段。

IFN 79-165(N79C-C140Acm)(序列编号32)

IFN 79-165(N79C-K107C-C140Acm)(序列编号33)

IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-C140Acm)(序列编号34)

IFN 79-165(N79C-K107C-E136C-C140Acm)(序列编号35)

IFN 79-165(N79C-T99C-K107C-R112C-C140Acm)(序列编号36)

IFN 79-165(N79C-E103C-K107C-E136C-C140Acm)(序列编号37)

IFN 79-165(N79C-E106C-K107C-E136C-C140Acm)(序列编号38)

IFN 79-165(N79C-K107C-D109C-E136C-C140Acm)(序列编号39)

IFN 79-165(N79C-K107C-L115C-E136C-C140Acm)(序列编号40)

IFN 79-165(N79C-K107C-L119C-E136C-C140Acm)(序列编号41)

IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-H130C-C140Acm)(序列编号42)

IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-E136C-C140Acm)(序列编号43)

IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-H139C-C140Acm)(序列编号44)

IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-C140Acm-R164C)(序列编号45)

将(实施例2-1)、(实施例2-2)中所得到的化合物的质量分析结果示于下述(表2)。

[表2]

(表2)

(实施例3)二唾液酸糖链修饰的IFN-β之合成

(实施例3-1)2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)(序列编号46)的合成

将IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C)Ethan(序列编号3)及IFN79-165(N79C-K107C-R112C-R123C-C140Acm)(序列编号31)溶解于含4-巯基苯基乙酸的pH7.2的缓冲溶液(8M盐酸胍液、0.1M磷酸溶液、125mM 4-巯基苯基乙酸)，并于室温静置。24小时后，于反应溶液中添加二硫苏糖醇溶液(2M二硫苏糖醇)，并于室温静置3小时。反应终了后，将甲氧基胺溶液(1M甲氧基胺盐酸盐)及盐酸溶液(1M盐酸、8M胍盐酸盐)添加于溶液中，将pH调至4.0后，于室温静置24小时。将反应终了后的溶液通过反相HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi]脱盐，并冻结干燥。

将所得到的粗纯化物溶解于pH8.5的缓冲溶液(8M盐酸胍液、0.1M三羟基甲基氨基甲烷)中，添加下述式(7)所示的经溴乙酰基化的二唾液酸糖链(5当量)，并静置1小时。

反应终了后，添加巯基乙磺酸钠溶液(200mM巯基乙磺酸钠)，于室温静置30分钟。将反应终了后的溶液通过反相HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi]脱盐，并冻结干燥。

将通过上述步骤所得到的粗纯化物溶解于乙酸银溶液(60mM乙酸银、7.5M尿素、875mM乙酸)中，并于室温静置4小时。反应后添加二硫苏糖醇溶液(2M二硫苏糖醇)。对于反应物，添加pH8.5的缓冲溶液(8M胍盐酸盐、0.1M三羟基甲基氨基甲烷)，藉由HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi]脱盐，并冻结干燥。

将所得到的冻结干燥物溶解于pH8.5的缓冲溶液(8M盐酸胍液、0.1M三羟基甲基氨基甲烷)中，并于室温静置30分钟。将溶液于冷却条件(4℃)下以稀释的胍盐酸盐溶液(4.5M胍盐酸盐、0.1M三羟基甲基氨基甲烷)置换。对于所置换的溶液，添加硫酸铜溶液(300mM硫酸铜II五水合物)，并于冷却条件(4℃)下静置4小时。反应后，添加乙二胺四乙酸(400mM乙二胺四乙酸)，并于冷却条件(4℃)下静置1小时。通过将反应后的溶液在冷却条件(4℃)下过夜置换成乙酸溶液(10mM乙酸溶液)，除去变性剂。将折叠后的溶液通过HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi]纯化，作为进行质谱分析(ESI离子化法)的结果，所得到的化合物的质量，与为目标的2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)的质量一致(计算值＝33304.8Da，实测值＝33303.6Da)。

(实施例3-2)2-6diSialo(Q48C-S75C-N79C-K107C-R112C-E136C)(序列编号47)的合成

将IFN 1-78(C30Acm-Q48C-S75C)MESNA(序列编号25)及IFN79-165(N79C-K107C-R112C-E136C-C140Acm)(序列编号43，溶解于含4-巯基苯基乙酸的pH7.2的缓冲溶液(8M盐酸胍液、0.1M磷酸溶液、125mM4-巯基苯基乙酸)中，于室温静置。24小时后，在反应溶液中添加二硫苏糖醇溶液(2M二硫苏糖醇)，并于室温静置3小时。将反应终了后的溶液通过反相HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi]脱盐，并冻结干燥。

使用所得到的粗纯化物，与(实施例3-1)同样的方式进行质谱分析(ESI离子化法)。其结果，所得到的化合物的质量，与为目标的2-6diSialo(Q48C-S75C-N79C-K107C-R112C-E136C)的质量一致(计算值＝33331.8Da，实测值＝33331.2Da)。

(实施例3-3)2-3diSialo(S1C-N3C-Q48C-N79C-K107C-R112C)(序列编号48)的合成

利用IFN 1-78(S1Thi-N3C-C30Acm-Q48C)Ethan(序列编号5)及IFN79-165(N79C-K107C-R112C-C140Acm)(序列编号34)，除了替换性地使用下述式(8)所示的溴乙酰基化二唾液酸糖链以外，以与(实施例3-1)同样的方式合成二唾液酸糖链修饰的IFN-β。进行质谱分析(ESI离子化法)的结果，所得到的化合物的质量，与为目标的2-3diSialo(S1C-N3C-Q48C-N79C-K107C-R112C)的质量一致(计算值＝33346.9Da，实测值＝33346.6Da)。

(实施例3-4)其他二唾液酸糖链修饰的IFN-β的合成

使用与(实施例3-1)同样的方法，进行以下所示的化合物的合成。

2-6diSialo(S1C-N3C-Q48C-N79C-K107C-R112C)(序列编号49)

2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-T99C-K107C-R112C)(序列编号50)

2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-H130C)(序列编号51)

2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-E136C)(序列编号52)

2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-H139C)(序列编号53)

2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R164C)(序列编号54)

2-6diSialo(S1C-Y29C-Q48C-N79C-K107C-E136C)(序列编号55)

2-6diSialo(S1C-M35C-Q48C-N79C-K107C-E136C)(序列编号56)

2-6diSialo(S1C-E41C-Q48C-N79C-K107C-E136C)(序列编号57)

2-6diSialo(S1C-Q48C-S75C-N79C-K107C-E136C)(序列编号58)

2-6diSialo(S1C-E28C-Q48C-R70C-N79C)(序列编号59)

2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C)(序列编号60)

2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)(序列编号61)

2-6diSialo(S1C-N3C-Q48C-N79C)(序列编号62)

2-6diSialo(S1C-N79C-K107C-E136C)(序列编号63)

使用与(实施例3-2)同样的方法，进行以下所示的化合物的合成。

2-6diSialo(E41C-S75C-N79C-E103C-K107C-E136C)(序列编号64)

2-6diSialo(E41C-S75C-N79C-E106C-K107C-E136C)(序列编号65)

2-6diSialo(E41C-S75C-N79C-K107C-D109C-E136C)(序列编号66)

2-6diSialo(E41C-S75C-N79C-K107C-R112C-E136C)(序列编号67)

2-6diSialo(E41C-S75C-N79C-K107C-L115C-E136C)(序列编号68)

2-6diSialo(E41C-S75C-N79C-K107C-L119C-E136C)(序列编号69)

2-6diSialo(N24C-N79C-K107C-R112C-E136C)(序列编号70)

2-6diSialo(G25C-N79C-K107C-R112C-E136C)(序列编号71)

2-6diSialo(K32C-N79C-K107C-R112C-E136C)(序列编号72)

2-6diSialo(M35C-N79C-K107C-R112C-E136C)(序列编号73)

2-6diSialo(D38C-N79C-K107C-R112C-E136C)(序列编号74)

2-6diSialo(E41C-N79C-K107C-R112C-E136C)(序列编号75)

2-6diSialo(F7C-N79C-K107C-R112C-E136C)(序列编号76)

2-6diSialo(Q48C-N79C-K107C-R112C-E136C)(序列编号77)

2-6diSialo(S75C-N79C-K107C-R112C-E136C)(序列编号78)

2-6diSialo(E41C-S75C-N79C-K107C-E136C)(序列编号79)

2-6diSialo(E42C-S75C-N79C-K107C-E136C)(序列编号80)

2-6diSialo(Q45C-S75C-N79C-K107C-E136C)(序列编号81)

2-6diSialo(L46C-S75C-N79C-K107C-E136C)(序列编号82)

2-6diSialo(Q47C-S75C-N79C-K107C-E136C)(序列编号83)

2-6diSialo(Q48C-S75C-N79C-K107C-E136C)(序列编号84)

2-6diSialo(F49C-S75C-N79C-K107C-E136C)(序列编号85)

2-6diSialo(Q50C-S75C-N79C-K107C-E136C)(序列编号86)

2-6diSialo(N79C-K107C-R112C-E136C)(序列编号87)

2-6diSialo(E28C-N79C-K107C-E136C)(序列编号88)

2-6diSialo(M35C-N79C-K107C-E136C)(序列编号89)

2-6diSialo(R70C-N79C-K107C-E136C)(序列编号90)

2-6diSialo(S75C-N79C-K107C-E136C)(序列编号91)。

使用与(实施例3-3)同样的方法，进行以下所示的化合物的合成。

2-3diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)(序列编号92)。

(实施例3-5)2-6diSialo(S1C-R26C-Q48C-A67C-N79-A88C)(序列编号100)的合成

(实施例3-5-A)IFN 1-25(S1Thi)thiophenyl(序列编号101)的合成

在固相合成用管柱上加入Amino-PEGA树脂(Merck公司制)(50μmol)，并使4-羟基甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(125μmol)、O-苯并三唑-1-基-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)(125μmol)及N-乙基吗啉(125μmol)溶解于二甲基甲酰胺(DMF)(1.25ml)中，并于室温搅拌4小时。将树脂用DMF及二氯甲烷(DCM)充分洗净。继而使Fmoc-Trp(Boc)-OH(0.25mmol)、1-(均三甲苯磺酰基)-3-硝基-1,2,4-三唑(MSNT)(0.25mmol)及N-甲基咪唑(0.187mmol)溶解于DCM(1.25ml)中，加入固相合成用管柱后，搅拌4小时。

将树脂用DCM、DMF洗净，并用20％哌啶/DMF溶液(2ml)处理15分钟以脱去保护用的Fmoc基。用DMF洗净，随后的肽链延长使用以下所示的方法依次缩合氨基酸。

将以Fmoc基或Boc基保护的氨基酸溶解于DMF，将此溶液加入固相合成管柱(0.25mmol)中。将0.2M 1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HCTU)/DMF(0.25mmol)加入固相合成管柱，并将0.8M N-甲基吗啉/DMF(0.50mmol)或0.8M 2,6,4-三甲基吡啶/DMF(0.50mmol)添加于固相合成用管柱中。于室温搅拌15分钟或30分钟后，将树脂用DMF洗净，并用20％哌啶/DMF溶液(2ml)处理10分钟以脱去保护用的Fmoc基。重复该操作，通过Fmoc固相合成法依次缩合氨基酸。

将所得到的树脂使用DCM及DMF洗净后，添加三氟乙醇及乙酸的混合溶液(1：1)，并于室温搅拌18小时，将经保护的肽从树脂分离。将含经保护的肽的反应溶液于减压下浓缩后，于减压下干燥。将干燥的经保护的肽溶解于DMF(2.1mL)后，于氮氛围下冷却至-15℃至-20℃。在其中添加作为为硫醇源的苯硫酚(thiophenol)(0.2mmol)后，添加六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)(1.4mmol)，继而添加二异丙基乙基胺(DIPEA)(0.2mmol)。于-15℃至-20℃搅拌2小时后，添加三氟乙酸(0.2mL)，慢慢地回到室温。回到室温后，将反应溶液于减压下浓缩。向所得到的残渣中添加三氟乙酸：水：三异丙基硅烷(＝92.5：2.5：5)，并于室温下搅拌。2小时后，再度将该溶液添加于另行准备的二乙醚使其沉淀后，进行离心，除去溶液部分，以得到包含目标的的肽硫酯体的残渣。将所得到的残渣用HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi]纯化，作为通过ESI-MS分析质量的结果，所得到的化合物的质量，与为目标的IFN1-25(S1Thi)thiophenyl(序列编号101)的质量一致(计算值＝3062.6Da，实测值＝3062.5Da)。

(实施例3-5-B)IFN 26-47(R26C-C30Acm)Ethanthiol(序列编号102)的合成

与(实施例3-5-A)的操作同样地合成肽片段。而且，使用乙硫醇作为IFN26-47(R26C-C30Acm)Ethanthiol的硫醇源。

合成的化合物，作为通过ESI-MS分析质量的结果，与作为目标的IFN26-47(R26C-C30Acm)Ethanthiol(序列编号102)的质量一致(计算值＝2844.4Da，实测值＝2844.5Da)。

(实施例3-5-C)IFN 48-66(Q48Thi)MESNA(序列编号103)的合成

在固相合成用管柱上添加Amino-PEGA树脂(Merck公司制)(50μmol)，使3-Fmoc-4-二氨基苯甲酸(150μmol)、1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HCTU)(150μmol)及二异丙基乙基胺(300μmol)溶解于DMF(1.25ml)，并于室温搅拌1小时。

搅拌后，将树脂用DMF洗净，用20％哌啶/DMF溶液(2ml)处理15分钟脱去保护用的Fmoc基后，用DMF将树脂充分洗净。随后的肽链延长使用以下所示的方法依次缩合氨基酸。

将以Fmoc基或Boc基保护的氨基酸溶解于DMF中，并将此溶液加入固相合成管柱(0.25mmol)中。将0.2M 1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HCTU)/DMF(0.25mmol)加入固相合成管柱，并将0.8M N-甲基吗啉/DMF(0.50mmol)或0.8M 2,6,4-三甲基吡啶/DMF(0.50mmol)添加于固相合成用管柱中。于室温搅拌15分钟或30分钟后，将树脂用DMF洗净，用20％哌啶/DMF溶液(2ml)处理10分钟以脱去保护用的Fmoc基。重复该操作，通过Fmoc固相合成法依次缩合氨基酸。

将所得到的树脂用DMF、DCM洗净后，使氯甲酸4-硝基苯酯(1.4mmol)溶解于DCM，添加于固相合成管柱后，于室温搅拌40分钟。搅拌后，将树脂用DCM、DMF洗净，并添加溶解于DMF溶液的二异丙基乙基胺(5.mmol)，于室温搅拌15分钟。将所得到的树脂用DMF、DCM洗净后，添加三氟乙酸：水：三异丙基硅烷(＝92.5：2.5：5)，并于室温下搅拌。2小时后，用DMF、DCM将树脂充分洗净后，以含2-巯基乙磺酸钠的pH8.5的缓冲溶液(6M盐酸胍液、0.2M磷酸溶液、1M 2-巯基乙磺酸钠)将树脂充分洗净。将上述缓冲液添加于树脂，并于室温搅拌2小时。搅拌后，将所得到的溶液以HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi]纯化，作为通过ESI-MS分析质量的结果，所得到的化合物的质量，与为目标的IFN48-66(Q48Thi)MESNA(序列编号103)的质量一致(计算值＝2413.8Da，实测值＝2413.9Da)。

(实施例3-5-D)二唾液酸糖链附加IFN 67-87(A67Thi，N79)thiophenyl(序列编号104)的合成

在固相合成用管柱上加入Amino-PEGA树脂(Merck公司制)(50μmol)，使3-Fmoc-4-二氨基苯甲酸(150μmol)、1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HCTU)(150μmol)及二异丙基乙基胺(300μmol)溶解于DMF(1.25ml)，并于室温搅拌1小时。

搅拌后，将树脂用DMF洗净，用20％哌啶/DMF溶液(2ml)处理15分钟以脱去保护用的Fmoc基后，用DMF将树脂充分洗净。随后的肽链延长使用以下所示的方法依次缩合氨基酸。

将以Fmoc基或Boc基保护的氨基酸溶解于DMF，将此溶液加入固相合成管柱(0.25mmol)中。将0.2M 1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HCTU)/DMF(0.25mmol)加入固相合成管柱中，并添加0.8M N-甲基吗啉/DMF(0.50mmol)或0.8M 2,6,4-三甲基吡啶/DMF(0.50mmol)于固相合成用管柱中。于室温搅拌15分钟或30分钟后，将树脂用DMF洗净，用20％哌啶/DMF溶液(2ml)处理10分钟以脱去保护用的Fmoc基。重复该操作，通过Fmoc固相合成法依次缩合氨基酸。

对于所得到的8残基肽，用20％哌啶/DMF溶液(2ml)处理15分钟以脱去保护用的Fmoc基，用DMF洗净后，在另行准备的离心管中将二苄基二唾液酸糖链天冬酰胺(0.2mmol)及DEPBT(0.2mmol)溶解于DMF/DMSO(1：1混合溶液，2.2ml)中，然后加入固相合成用管柱中，添加DIPEA(0.15mmoL)，并于室温搅拌18小时。若用DMF及DCM洗净，可得到在固相上有下述式(18)所示的二苄基二唾液酸糖链天冬酰胺结合的9残基糖链肽。

随后的糖肽链的延长使用以下所示的方法依次缩合氨基酸。

使已用Fmoc基保护氨基酸的氨基酸及HOBt(0.50mmol)、DIPCI(0.475mmol)溶解于DMF(6.3ml)，进行15分钟活化后，加入固相合成用管柱中。于室温搅拌1小时后、使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)处理20分钟以脱去保护用的Fmoc基。重复该操作，依次缩合氨基酸。

将所得到的树脂使用DCM及DMF洗净后，以可充分将树脂浸泡的程度添加三氟乙醇与乙酸的混合溶液(1：1)，于室温搅拌18小时，将树脂与糖链附加肽片段切离。将切离的树脂过滤除去，将反应溶液于减压下浓缩。将所得到的残渣浓缩，得到氨基酸侧链经保护的糖链肽。

将所得到的附加糖链的肽片段(50mmol)移至回收烧瓶中，使其溶解于DMF后，于氮氛围下冷却至-15℃至-20℃。于其中加入苯硫酚(0.15mmol)后，添加PyBOP(2.5mmol)、继而添加DIPEA(0.15mmol)。在-15℃至-20℃搅拌2小时后，添加三氟乙酸，慢慢地回到室温。回到室温后，将反应溶液于减压下浓缩。向所得到的残渣中添加三氟乙酸：水：TIPS(＝95：2.5：2.5)，并于室温下搅拌。2小时后，再度将该溶液添加于另行准备的二乙醚使其沉淀后，进行离心分离，除去溶液部分，以得到含目的肽硫酯体的残渣。将此所得到的残渣以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi]纯化，通过ESI-MS分析质量，结果所得到的化合物的质量与为目标的附加二唾液酸糖链的IFN67-87(A67Thi，N79)thiophenyl(序列编号104)的质量一致(计算值＝4903.1Da，实测值＝4903.1Da)。

(实施例3-5-E)IFN 88-165(C140Acm)(序列编号105)的合成

在固相合成用管柱上加入Amino-PEGA树脂(Merck公司制)(50μmol)，并使4-羟基甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(125μmol)、O-苯并三唑-1-基-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)(125μmol)及N-乙基吗啉(125μmol)溶解于DMF(1.25ml)中，于室温搅拌4小时。将树脂用DMF及DCM充分洗净。继而使Fmoc-Asn(Trt)-OH(0.25mmol)、1-(均三甲苯磺酰基)-3-硝基-1,2,4-三唑(MSNT)(0.25mmol)及N-甲基咪唑(0.187mmol)溶解于DCM(1.25ml)中，加入固相合成用管柱后，搅拌4小时。

搅拌后，将树脂用DCM、DMF洗净，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)处理15分钟以脱去保护用的Fmoc基。用DMF洗净后，随后的肽链延长使用以下所示的方法依次缩合氨基酸。

将以Fmoc基或Boc基保护的氨基酸溶解于DMF，将此溶液加入固相合成管柱(0.25mmol)中。将0.2M 1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HCTU)/DMF(0.25mmol)加入固相合成管柱中，并将0.8M N-甲基吗啉/DMF(0.50mmol)或0.8M 2,6,4-三甲基吡啶/DMF(0.50mmol)添加于固相合成用管柱中。于室温搅拌15分钟或30分钟后，将树脂用DMF洗净，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)处理10分钟以脱去保护用的Fmoc基。重复该操作，通过Fmoc固相合成法依次缩合氨基酸。

向所得到的树脂中加入三氟乙酸：水：苯酚：甲基苯基硫醚：三异丙基硅烷(＝95：2.5：2.5：2.5：5)，并于室温下搅拌。3小时后，再度将该溶液添加于另行准备的二乙醚中使其沉淀后，进行离心分离，除去溶液部分，得到含目标的肽的残渣。将此所得到的残渣以反相HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi]纯化，通过ESI-MS分析质量，结果所得到的化合物的质量，与IFN 88-165(C140Acm)(序列编号105)的质量一致(计算值＝9647.3Da，实测值＝9647.2Da)。

(实施例3-5-F)各片段的结合

(步骤1.动态连接(Kinetic Ligation)步骤)

将IFN 1-25(S1Thi)thiophenyl(序列编号101)及IFN 26-47(R26C-C30Acm)Ethanthiol(序列编号102)溶解于pH6.8的缓冲溶液(8M盐酸胍液、0.2M磷酸溶液、20mMTCEP)中，于室温反应3小时。将反应终了后的溶液通过反相HPLC[管柱：SHISEIDOProteonavi]纯化，并冻结干燥。将此所得到的冻结干燥品通过ESI-MS分析质量，结果所得到的化合物的质量与IFN1-47(S1Thi-R26C-C30Acm)Ethanthiol(序列编号106)的质量一致(计算值＝5796.8Da，实测值＝5796.7Da)。

(步骤2.自然化学连接(Native Chemical Ligation)步骤A)

将附加二唾液酸糖链的IFN 67-87(A67Thi，N79)thiophenyl(序列编号104)及IFN88-165(C140Acm)(序列编号105)溶解于pH7.2的缓冲溶液(8M盐酸胍液、0.2M磷酸溶液、20mM TCEP)中，添加苯硫酚(3％V/V)，使其于室温反应。23小时后，将甲氧基胺溶液(6M胍盐酸盐、0.2M甲氧基胺盐酸盐、20mM TCEP)加入反应溶液，将pH调至4.0后，使其于室温反应4小时。对于反应溶液添加50mM NaOH水溶液，将反应溶液调成碱性后，于冰上反应0.5小时。反应终了后，将反应终了后的溶液通过反相HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi]纯化，得到冻结干燥品。将此所得到的冻结干燥品通过ESI-MS分析质量，结果所得到的化合物的质量，与附加二唾液酸糖链的IFN 67-165(A67C-N79-A88C-C140Acm)(序列编号107)的质量一致(计算值＝14247.9Da，实测值＝14247.2Da)。

(步骤3.自然化学连接步骤B)

使步骤2所得到的附加二唾液酸糖链的IFN 67-165(A67C-N79-A88C-C140Acm)(序列编号107)及IFN 48-66(Q48Thi)MESNA(序列编号103)溶解于pH7.2的缓冲溶液(8M盐酸胍液、0.2M磷酸溶液、20mMTCEP、30mM MPAA)中，并于室温反应。18小时后，将甲氧基胺溶液(6M胍盐酸盐、0.2M甲氧基胺盐酸盐、20mM TCEP)加入反应溶液，调整pH至4.0后，于室温反应。5小时后，在反应溶液中添加2-巯基乙磺酸钠，并于室温反应1小时。反应终了后，将反应终了后的溶液通过反相HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi]纯化，得到冻结干燥品。将此所得到的冻结干燥品通过ESI-MS分析质量，结果所得到的化合物的质量，与附加二唾液酸糖链的IFN 48-165(Q48C-A67C-N79-A88C-C140Acm)(序列编号108)的质量一致(计算值＝16507.6Da，实测值＝16507.9Da)。

(步骤4.自然化学连接步骤C)

将步骤1所得到的IFN1-47(S1Thi-R26C-C30Acm)Ethanthiol(序列编号106)，及步骤3所得到的附加二唾液酸糖链的IFN 48-165(Q48C，A67C，N79、A88C，C140Acm)(序列编号108)，以与步骤3同样的方式使其反应。反应所得到的化合物通过ESI-MS分析质量，结果与为目标的附加二唾液酸糖链的IFN 1-165(S1C-R26C-C30Acm-Q48C-A67C-N79-A88C-C140Acm)(序列编号109)的质量一致(计算值＝22230.2Da，实测值＝22230.3Da)。

(步骤5.糖链附加步骤)

使步骤4所得到的附加二唾液酸糖链的IFN 1-165(S1C-R26C-C30Acm-Q48C-A67C-N79-A88C-C140Acm)(序列编号109)溶解于pH8.5的缓冲溶液(8M盐酸胍液、0.1M Tris溶液)，添加下述式(19)所示的溴乙酰基化二唾液酸糖链(25当量)，于室温使其反应2小时。

反应终了后，将反应溶液通过反相HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi]纯化，得到冻结干燥品。将此所得到的冻结干燥品通过ESI-MS分析质量，结果所得到的化合物的质量，与第1、26、48、67、88位具有经由半胱氨酸的侧链硫原子附加的二唾液酸糖链，第79位具有经由天冬酰胺的侧链附加的糖链的2-6diSialo(S1C-R26C-C30Acm-Q48C-A67C-N79-A88C-C140Acm)(序列编号110)的质量一致(计算值＝33545.4Da，实测值＝33545.5Da)。

(步骤6.保护用的Acm基的脱除)

将通过上述步骤5所得到的冻结干燥物溶解于乙酸银溶液(100mM乙酸银、90％乙酸水溶液)，使其于室温反应。4小时后，使用HPLC及ESI-MS确认目标物的生成。在反应溶液中添加二硫苏糖醇，于室温搅拌15分钟后，进行离心分离，除去沉淀物，回收上清液。将此回收的上清液用膜过滤器过滤，将含目标物的滤液部分通过反相HPLC[管柱：SHISEIDOProteonavi]纯化，得到冻结干燥品。将此所得到的冻结干燥品通过ESI-MS分析质量，结果所得到的化合物的质量，与第1、26、48、67、88位具有经由半胱氨酸的侧链硫原子附加的二唾液酸糖链，第79位具有经由天冬酰胺的侧链附加的糖链的2-6diSialo(S1C-R26C-Q48C-A67C-N79-A88C)(序列编号111)的质量一致(计算值＝33403.3Da，实测值＝33403.2Da)。

(步骤7.折叠步骤)

将通过上述步骤6所得到的冻结干燥物溶解于pH8.5的缓冲溶液(8M盐酸胍液、0.1M三羟基甲基氨基甲烷)，并于室温静置30分钟。将溶液在冷却条件(4℃)下以稀胍盐酸盐溶液(4.5M胍盐酸盐、0.1M三羟基甲基氨基甲烷)置换。在所置换的溶液中，添加硫酸铜溶液(300mM硫酸铜II五水合物)，并于冷却条件(4℃)下静置3小时。反应后，添加乙二胺四乙酸(400mM乙二胺四乙酸)，并于冷却条件(4℃)下静置0.5小时。通过将反应后的溶液于冷却条件(4℃)下过夜置换成乙酸溶液(10mM乙酸溶液)，除去变性剂。将折叠后的溶液通过HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi]纯化，进行质量分析(ESI离子化法)，结果所得到的化合物的质量，与为目标的2-6diSialo(S1C-R26C-Q48C-A67C-N79-A88C)(序列编号100)的质量一致(计算值＝33401.2Da，实测值＝33401.2Da)。

(实施例4)单唾液酸糖链修饰的IFN-β的合成

(实施例4-1)2-6monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)(序列编号93)的合成

利用IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C)Ethan(序列编号3)及IFN79-165(N79C-K107C-R112C-R123C-C140Acm)(序列编号31)，除了替换性地使用下述式(9)及下述式(10)所示的溴乙酰基化的单唾液酸糖链混合物(化合物比率1：1)(5当量)以外，依照与(实施例3-1)同样的方法，合成单唾液酸糖链修饰的IFN-β。进行质量分析(ESI离子化法)，结果所得到的化合物的质量，与为目标的2-6monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)的质量一致(计算值＝31557.2Da，实测值＝31556.6Da)。将(实施例3-1)及(实施例4-1)中的质谱分析的结果示于图1。

将(实施例3-1)及(实施例4-1)中所得到的化合物通过SDS-PAGE、反相HPLC[管柱：Waters BEH300]分析。将SDS-PAGE的结果示于图2。

观察SDS-PAGE的结果，由于检测出明显的区带，表明任一种化合物皆均一地附加糖链。同样地，在通过反相HPLC进行分析中，所得到的数据(数据未示出)亦表明糖链是均一地附加。

此外，将在(实施例3-1)及(实施例4-1)中所得到的化合物于pH6.0的磷酸缓冲液(0.1M磷酸)溶液中，通过添加内-β-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶(Endo-M)(东京化成工业股份有限公司)而切出糖链部分。将所得到的游离糖链的还原末端以2-氨基苯甲酸(SigmaAldrich)标识化后，通过正相HPLC[管柱：Shodex NH2P-50]进行分析，将其结果示于图3。糖链结构分析的结果，可确认在与为目标的二唾液酸糖链同样的滞留时间出现吸收峰，而确认是附加目标的糖链。

(实施例4-2)其他单唾液酸糖链修饰的IFN-β的合成

使用与(实施例4-1)同样的方法，进行以下所示的化合物的合成。

2-6monoSialo(S1C-N3C-Q48C-N79C-K107C-R112C)(序列编号94)

2-6monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)(序列编号95)。

(实施例5)三唾液酸糖链修饰的IFN-β的合成

(实施例5-1)2-6triSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)(序列编号96)的合成

除了对于IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C)Ethan(序列编号3)及IFN79-165(N79C-K107C-R112C-R123C-C140Acm)(序列编号31)，附加下述式(11)所示的经溴乙酰基化的三唾液酸糖链(5当量)以外，依照与(实施例3-1)同样的方法，合成三唾液酸糖链修饰的IFN-β。进行质量分析(ESI离子化法)，结果所得到的化合物的质量，与为目标的2-6triSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)的质量一致(计算值＝37244.3Da，实测值＝37243.2Da)。

(实施例5-2)其他三唾液酸糖链修饰的IFN-β的合成

使用与(实施例5-1)同样的方法，进行以下所示的化合物的合成。

2-6triSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)(序列编号97)

(实施例6)四唾液酸糖链修饰的IFN-β的合成

(实施例6-1)2-6tetraSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)(序列编号98)的合成

除了替换性地使用下述式(12)所示的经溴乙酰基化的四唾液酸糖链(5当量)以外，利用IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C)Ethan(序列编号3)及IFN79-165(N79C-K107C-R112C-R123C-C140Acm)(序列编号31)，依照与(实施例3-1)同样的方法，合成四唾液酸糖链修饰的IFN-β。进行质量分析(ESI离子化法)，结果所得到的化合物的质量，与为目标的2-6tetraSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)的质量一致(计算值＝41183.8Da，实测值＝41182.6Da)。

(实施例6-2)其他四唾液酸糖链修饰的IFN-β的合成

使用与(实施例6-1)同样的方法，进行以下所示的化合物的合成。

2-6tetraSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)(序列编号99)

将在实施例3-1、实施例3-2、实施例3-3、实施例3-4、实施例4-1、实施例4-2、实施例5-1、实施例5-2、实施例6-1、实施例6-2中所得到的化合物的质谱分析结果示于下述(表3)。

[表3]

(表3)

(表3续)

(实施例7)4、5、6股二唾液酸糖链修饰的IFN-β于小鼠中的药物动力学

(实施例7-1)施用药、试药的制备

2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)(序列编号61)、2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C)(序列编号60)、2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)(序列编号46)、及阿沃纳斯(Avonex)(Biogen Idec公司)，通过含L-精氨酸、聚山梨醇酯(polysorbate)的乙酸缓冲液制备成588nM。阿沃纳斯为天然型的IFN-β(IFN-β-1a)，被用做对照药。此外，阿沃纳斯为使用CHO细胞系所制造的，在天然人类干扰素β的第80位的位置(与本发明的序列编号1所示的氨基酸序列中第79位的位置相当)具有1股糖链，其糖链的结构，可为与各多肽结合的各N连接型糖链的各种复合型糖链。

(实施例7-2)施用及采血

对于小鼠(Balb/c小鼠、雄性、8周龄、体重21-23g)，于饱食下，使用胰岛素用注射器Myjector 29G×1/2(Terumo公司)，以2352pmol/kg的用量及4mL/kg的体积从背部皮下施用。于皮下施用前、及施用后10分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、16小时、24小时及30小时，使用经肝素(heparin)处理的血比容毛细管(HIRSHMANNLABORGERATE)从尾静脉采血75μL。将所采集的血液与同体积的6mM EDTA-PBS快速混和、离心分离(15000rpm，4℃，10分钟)。采取90μL上清液、作为血浆样品。将血浆样品冷冻保存至用于测定之时。

(实施例7-3)血中浓度测定

对于IFN-β的血中浓度的测定，使用人类干扰素βELISA试剂盒(鎌仓科技公司)。就制作标准曲线用的标准品而言，使用与用于施用的那些为相同批号的4至6股二唾液酸糖链修饰的IFN-β、阿沃纳斯，并以试剂盒所附的稀释液制备成200pM、100pM、50pM、25pM、12.5pM、6.25pM、及3.125pM。在标准曲线中，依照血浆样品的稀释率，以使实施量成为相同的方式添加空白组血浆。将所得到的IFN-β的血浆中浓度随时间的变化作图，并示于图4。

如图4所示，若比较在血浆中的IFN-β浓度，则于任一测定时点，4、5、6股二唾液酸糖链修饰的IFN-β皆维持比对照药阿沃纳斯高的血浆中浓度，并观察到血中滞留性的改善。而且，由于二唾液酸糖链修饰股数越增加，Tmax越延迟，所以认为化合物从皮下向血中的转移延迟。Cmax或消失相(dissipation phase)中的血中浓度，随着二唾液酸糖链修饰股数的增加而变得越高。此显示：通过附加二唾液酸糖链，IFN-β在活体内的稳定性以依存于二唾液酸糖链的股数的方式提高。

(实施例7-4)药物动力学参数的算出

使用矩(moment)分析，并通过梯形法从所得到的IFN-β的血浆中浓度变化算出血中浓度曲线下面积(AUC∞)。此外，通过血中半衰期(t1/2)、平均滞留时间(MRT)、及皮下施用时的实测值求出最大血中浓度(Cmax)、最大血中浓度到达时间(Tmax)。将所得到的药物动力学的参数示于图5中。

如图5所示，矩分析的结果亦显示二唾液酸糖链修饰的IFN-β改善t1/2、AUC、MRT的效果是以依存于修饰股数的方式而增加。

(实施例8)二唾液酸糖链型及单唾液酸糖链型的4股糖链修饰的IFN-β在小鼠中的药物动力学

(实施例8-1)施用药、试药的制备

2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)(序列编号61)、2-6monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)(序列编号95)、及阿沃纳斯，以含有L-精氨酸、聚山梨醇酯的乙酸缓冲液制备成112nM。

(实施例8-2)施用及采血

对于小鼠(Balb/c小鼠、雄性、8周龄、体重21-23g)，于饱食下，使用胰岛素用注射器Myjector 29G×1/2(Terumo公司)，以448pmol/kg的用量及以4mL/kg的体积从尾静脉或背部皮下施用。静脉内施用时，于施用前及施用后2分钟、10分钟、30分钟、1小时、3小时、6小时、8小时、24小时，皮下施用时，于施用前及及施用后10分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、16小时、24小时、30小时，使用经肝素处理的血比容毛细管(HIRSHMANN LABORGERATE)从尾静脉采血75μL。将所采集的血液与同体积的EDTA-PBS快速混和、离心分离(15000rpm，4度，10分钟)。采取90μL上清液、作为血浆样品。将血浆样品冷冻保存至用于测定之时。

(实施例8-3)血中浓度测定

对于IFN-β的血中浓度的测定，使用人类干扰素βELISA试剂盒(鎌仓科技公司)。就制作标准曲线用的标准品而言，使用与用于施用的那些为相同批号的二唾液酸糖链型的4股糖链修饰的IFN-β、单唾液酸糖链型的4股糖链修饰的IFN-β、阿沃纳斯，并以试剂盒所附的稀释液制备成200pM、100pM、50pM、25pM、12.5pM、6.25pM、及3.125pM。在标准曲线中，依照血浆样品的稀释率，以使实施量成为相同的方式添加空白组血浆。将所得到的IFN-β的血浆中浓度随时间的变化作图，并示于图6中。

如图6所示，若比较在血浆中的IFN-β浓度，则于任一测定时点，2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)，与对照药阿沃纳斯相比，可确认t1/2、AUC∞、MRT皆大幅地提高。相对于此，于皮下施用、尾静脉施用的任一情况，唾液酸化不完全的2-6monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)，与对照药阿沃纳斯相比，显示大幅降低的血中浓度变化。从该结果可显示：糖链的末端被完全唾液酸化可大幅提高IFN-β的血中滞留性。

(实施例8-4)药物动力学参数的算出

使用矩分析，并通过梯形法从所得到的IFN-β的血浆中浓度的变化算出血浆中浓度曲线下面积(AUC∞)。此外，从以外插法求得静脉内施用时的预测初期浓度(C0)，进而根据血中半衰期(t1/2)、平均滞留时间(MRT)、及皮下施用时的实测值求出最大血中浓度(Cmax)、最大血中浓度到达时间(Tmax)。将结果示于图7中。

如图7所示，从矩分析的结果确认：4股二唾液酸糖链修饰的IFN-β，与对照药阿沃纳斯相比，在t1/2、AUC∞、MRT方面有改善效果。另一方面，4股单唾液酸糖链修饰的IFN-β，与对照药阿沃纳斯相比，在t1/2、AUC∞、MRT的任一方面均展现较低值，且更早从血中消失。

(实施例9)二唾液酸糖链型及单唾液酸糖链型的6股糖链修饰的IFN-β在小鼠中的药物动力学

(实施例9-1)施用药、试药的制备

2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)(序列编号46)、2-6monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)(序列编号93)及阿沃纳斯，以含L-精氨酸、聚山梨醇酯的乙酸缓冲液制备成588nM。

(实施例9-2)施用及采血

对于小鼠(Balb/c小鼠、雄性、8周龄、体重21-23g)，于饱食下，使用胰岛素用注射器Myjector 29G×1/2(Terumo公司)，以2352pmol/kg的用量并以4mL/kg的体积从尾静脉施用。于静脉内施用前、及施用后2分钟、10分钟、30分钟、1小时、3小时、6小时、8小时、24小时，使用经肝素处理的血比容毛细管(HIRSHMANN LABORGERATE)从尾静脉采血75μL。将所采集的血液与同体积的EDTA-PBS快速混和、离心分离(15000rpm，4度，10分钟)。采取90μL上清液、作为血浆样品。将血浆样品冷冻保存至用于测定之时。

(实施例9-3)血中浓度测定

IFN-β的血中浓度的测定使用人类干扰素βELISA试剂盒(鎌仓科技公司)。就制作标准曲线用的标准品而言，使用与用于施用的那些为相同批号的二唾液酸糖链型的6股糖链修饰的IFN-β、单唾液酸糖链型的6股糖链修饰的IFN-β、阿沃纳斯，以试剂盒所附的稀释液制备成200pM、100pM、50pM、25pM、12.5pM、6.25pM、及3.125pM。在标准曲线中，根据血浆样品的稀释率，以使实施量成为相同的方式添加空白组血浆。将所得到的IFN-β的血浆中浓度随时间的变化作图，并示于图8中。

在6股修饰的IFN-β方面，亦得到与上述4股修饰的IFN-β同样的结果。亦即，确认2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)，与对照药阿沃纳斯相比，t1/2、AUC∞、MRT皆大幅地提高。另一方面，在尾静脉施用的情况，2-6monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)，与对照药阿沃纳斯相比，显示血中浓度变化大幅降低。因此，确认在6股糖链修饰IFN-β的情况，与4股糖链修饰IFN-β同样地，糖链的末端全部被唾液酸化对于IFN-β的血中滞留性等的提高非常重要。

(实施例9-4)药物动力学参数的算出

使用矩分析，并通过梯形法从所得到的IFN-β的血浆中浓度的变化算出血浆中浓度曲线下面积(AUC)。此外，通过外插法求出静脉内施用时的预测初期浓度(C0)，进而求出血中半衰期(t1/2)、平均滞留时间(MRT)。将结果示于图9中。

如图9所示，从矩分析的结果显示2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)，与对照药阿沃纳斯相比，t1/2、AUC∞、MRT皆大幅地提高。另一方面，2-6monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)，与对照药阿沃纳斯相比，显示t1/2、AUC∞、MRT的任一者的值皆较低，且较早从血中消失。

(实施例10)6股二唾液酸糖链修饰的IFN-β及PEG20K修饰的IFN-β在小鼠中的药物动力学

(实施例10-1)施用药、试药的制备

2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)(序列编号46)、PEG20K修饰的IFN-β及阿沃纳斯，以含有L-精氨酸、聚山梨醇酯的乙酸缓冲液制备成558nM。

(实施例10-2)施用及采血

对于小鼠(Balb/c小鼠、雄性、8周龄、体重21-23g)，于饱食下，使用胰岛素用注射器Myjector 29G×1/2(Terumo公司)，以2352pmol/kg的用量并以4mL/kg的体积从背部皮下施用。于皮下施用前、及施用后10分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、16小时、24小时及30小时，使用经肝素处理的血比容毛细管(HIRSHMANNLABORGERATE)从尾静脉采血75μL。将所采集的血液与同体积的EDTA-PBS快速混和、离心分离(15000rpm，4度，10分钟)。采取90μL上清液、作为血浆样品。将血浆样品冷冻保存至用于测定之时。

(实施例10-3)血中浓度测定

IFN-β的血中浓度的测定使用人类干扰素βELISA试剂盒(鎌仓科技公司)。就制作标准曲线用的标准品而言，使用与用于施用的那些为相同批号的6股二唾液酸糖链修饰的IFN-β、PEG20K修饰的IFN-β、阿沃纳斯，以试剂盒所附的稀释液制备成200pM、100pM、50pM、25pM、12.5pM、6.25pM、及3.125pM。在标准曲线中，依照血浆样品的稀释率，以使实施量成为相同的方式添加空白组血浆。将所得到的IFN-β的血浆中浓度随时间的变化作图。并示于图10中。

(实施例10-4)药物动力学参数的算出

使用矩分析，并通过梯形法从所得到的IFN-β的血浆中浓度的变化算出血浆中浓度曲线下面积(AUC)。此外，通过外插法求出静脉内施用时的预测初期浓度(C0)，进而求出血中半衰期(t1/2)、平均滞留时间(MRT)。将结果示于图11中。

如图10及图11所示，从血浆中浓度的变化及矩分析的结果可知6股二唾液酸糖链修饰的IFN-β及PEG20K修饰的IFN-β的任一者，与阿沃纳斯相比，t1/2、AUC∞、MRT皆大幅提高。此外，6股二唾液酸糖链修饰的IFN-β，在AUC∞及Cmax方面，超越了PEG20K修饰的IFN-β。

在t1/2及MRT方面，6股二唾液酸糖链修饰的IFN-β与PEG20K修饰的IFN-β之间的比较，显示相同程度的结果。

从这些结果可显示：6股二唾液酸糖链修饰的IFN-β以与PEG20K相同或其以上的程度使阿沃纳斯在活体中的稳定性提高。

(实施例11)4、5、6股二唾液酸糖链修饰的IFN-β在活体中的抗肿瘤活性

使用罹癌小鼠评估4、5、6股二唾液酸糖链修饰的IFN-β在活体中的抗肿瘤活性。

(实施例11-1)细胞培养

在抗肿瘤活性试验中，使用通过接种为人类伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)的Daudi细胞所制作的罹癌小鼠。所用的培养基是在RPMI1640(Invitrogen)中，添加于56℃经去活化处理30分钟的10％胎牛血清(GIBCO)、青霉素/链霉素(SIGMA)。使用的培养板是未经处里的培养皿(IWAKI)，于37℃、5％CO₂浓度条件下进行培养，于2-3日进行1次传代。

(实施例11-2)罹癌小鼠的制成法

将所培养的Daudi细胞回收至试管中，进行离心分离(1300rpm，4度，3分钟)。用抽吸器(aspirator)除去上清液，加入HBSS(Nacalai)，使细胞悬浮。接下来再次离心分离，除去上清液。总计进行3次该细胞洗净处理。然后，使用血细胞计数器计算细胞数目，使用HBSS以成为2×10⁸个细胞/mL的方式制成细胞悬浮液。在即将进行Daudi细胞接种之前，加入与细胞悬浮液同体积的基质胶(matrigel)(BD)以进行2倍稀释，制作成接种用细胞悬浮液。将接种用细胞悬浮液保存于冰上直至即将接种前。就麻醉药而言，将戊巴比妥钠(somnopentyl)(共立制药)用PBS稀释成5mg/mL来使用。对于SCID小鼠(C.B-17/Icr-scid/scidJcl小鼠、雄性、6周龄)(日本CLEA公司)，使用胰岛素用注射器Myjector 29G×1/2(Terumo社)，将300μL的麻醉药施用至腹腔内。确认导入麻醉后、使用刮刀将小鼠的右腹侧部除毛。使用26G1/2注射针(Terumo)及1mL的注射筒(Terumo)，将100μL的接种用细胞悬浮液接种于皮下。

细胞接种处理之后约30日后、使用卡尺(Mitsutoyo)测定所形成的肿瘤组织的长径(mm)及短径(mm)。使用所得到的数值求出肿瘤体积(mm³)。肿瘤体积使用公式：肿瘤体积(mm³)＝长径(mm)×短径(mm)×短径(mm)×0.5算出，将罹癌小鼠分成4组(n＝4/群)。分组时的肿瘤体积为约800mm³。

(实施例11-3)施用液的制备法

将2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)(序列编号61)、2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C)(序列编号60)、2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)(序列编号46)及2-6diSialo(S1C-N3C-Q48C-N79C-K107C-R112C)(序列编号49)及对照药阿沃纳斯用含L-精氨酸、聚山梨醇酯的乙酸缓冲液制备成588nM。施用液是于即将施用之前进行制备。

(实施例11-4)施用方法

使用胰岛素用注射器Myjector 29G×1/2，将所制备的施用液以使用量成为2352pmol/kg且体积成为4mL/kg的方式施用至背部皮下。此外，将制备施用液时所用的含L-精氨酸、聚山梨醇酯的乙酸缓冲液以4mL/kg的体积施用至载体(Vehicle)施用组。将分组及进行初次施用之日当作第0日，每隔一天进行背部皮下施用直至第9日为止，共计施用5次。

(实施例11-5)抗肿瘤活性能力的评估

于施用开始第24日从小鼠摘出癌组织，测定组织湿重。算出将载体施用组的组织湿重当作100％时的4-6股二唾液酸糖链修饰的IFN-β及阿沃纳斯施用组的组织湿重的相对值(％T/C：测试组/对照组)，作为抗肿瘤活性的指标。将结果示于图12中。

如图12所示，癌组织的组织湿重的相对值(％T/C)，在阿沃纳斯施用组中为44.5％，相对于此，在2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)施用组中为0.3％，在2-6diSialo(S1C-N3C-Q48C-N79C-K107C-R112C)施用组中为0.4％，在2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C)施用组中为18.9％、在2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)施用组中为28.1％，本发明的4、5、6股二唾液酸糖链修饰的IFN-β显示使癌组织几乎被消灭或极度被缩小程度的优异抗肿瘤活性。

从以上之结果观察到在1日1次、隔日×5次、实施2352pmol/kg皮下施用的情况，二唾液酸糖链修饰的股数越增加，抗肿瘤活性有越强的倾向。

(实施例12)6股二唾液酸糖链/单唾液酸糖链修饰的IFN-β在活体中的抗肿瘤活性

以与(实施例11-1)同样的方法进行细胞培养，并以与(实施例11-2)同样的方法制成罹癌小鼠。

除了将(实施例11-3)的施用液做成2-6diSialo(S1C-Q48C--N79C-K107C-R112C-R123C)(序列编号46)、2-6monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)(序列编号93)及对照药阿沃纳斯以外，以与(实施例11-3)同样的方法制备施用液，并以与(实施例11-4)同样的方法施用至罹癌小鼠。

于施用开始第22日从小鼠摘出癌组织，测定组织湿重。算出将载体施用组的组织湿重当作100％时的阿沃纳斯施用组的组织湿重的相对值(％T/C：测试组/对照组)，作为抗肿瘤活性的指标。将结果示于图13中。

如图13所示，癌组织的组织湿重的相对值(％T/C)，在阿沃纳斯施用组中为63.％，相对于此，在6股二唾液酸糖链修饰的IFN-β施用组中为1.3％，确认具有强力的抗肿瘤活性。另一方面，在6股单唾液酸糖链修饰的IFN-β施用组中为79.3％。

从以上的结果可知，在1日1次、隔日×5次、实施2352pmol/kg皮下施用的情况，6股二唾液酸糖链修饰的IFN-β，比阿沃纳斯施用组优异许多，显示癌组织几乎被消灭的强力的抗肿瘤活性，另一方面，在2个非还原末端之中仅有一端被唾液酸化的6股单唾液酸糖链修饰的IFN-β施用组中，未见到比阿沃纳斯施用组优异的抗肿瘤活性。据此可以确认：所有非还原末端皆被唾液酸化对于抗肿瘤活性而言甚为重要。

(实施例13)6股二唾液酸糖链/三唾液酸糖链/四唾液酸糖链修饰的IFN-β在活体中的抗肿瘤活性

以与(实施例11-1)同样的方法进行细胞培养，以与(实施例11-2)同样的方法制成罹癌小鼠。

除了将(实施例11-3)的施用液做成2-6diSialo(S1C-Q48C--N79C-K107C-R112C-R123C)(序列编号46)、2-6triSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)(序列编号96)、2-6tetraSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)(序列编号98)及对照药阿沃纳斯以外，以与(实施例11-3)同样的方法制备施用液，并以与(实施例11-4)同样的方法施用至罹癌小鼠。

于施用开始第21日从小鼠摘出癌组织，测定组织湿重。算出将载体施用组的组织湿重当作100％时的阿沃纳斯施用组的组织湿重的相对值(％T/C：测试组/对照组)，作为抗肿瘤活性的指标。将结果示于图14中。

如图14所示，癌组织的组织湿重的相对值(％T/C)，在阿沃纳斯施用组中为55.5％，相对于此，在6股二唾液酸糖链修饰的IFN-β施用组中为3.6％，在6股四唾液酸糖链修饰的IFN-β施用组中为9.1％、在6股三唾液酸糖链修饰的IFN-β施用组中为28.7％，显示任一种6股糖链修饰的IFN-β均具有强力抗肿瘤活性。

而且，关于糖链的结构，若着重于糖链中分支数的差异，虽然2分支型的6股二唾液酸糖链修饰体展现强力抗肿瘤活性，但3分支型的6股三唾液酸糖链修饰体、4分支型的6股四唾液酸糖链修饰体展现比6股二唾液酸糖链修饰体弱的抗肿瘤活性。认为此可能与后述实施例16的结果(表4)所示的活体外的细胞增殖抑制活性的差异及在活体内的血中动力学的差异等有关。

(实施例14)6股二唾液酸糖链修饰的IFN-β及PEG20K修饰的IFN-β在活体中的抗肿瘤活性

除了将(实施例11-3)的施用液做成2-6diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)(序列编号46)、PEG20K修饰的IFN-β、及对照药阿沃纳斯以外，以与(实施例11-3)同样的方法制备施用液，并以与(实施例11-4)同样的方法施用至罹癌小鼠。

于施用开始第21日从小鼠摘出癌组织，测定组织湿重。算出将载体施用组的组织湿重当作100％时的阿沃纳斯施用组的组织湿重的相对值(％T/C：测试组/对照组)，作为抗肿瘤活性的指标。将结果示于图15中。

如图15所示，癌组织的组织湿重的相对值(％T/C)，在阿沃纳斯施用组中为62.6％，相对于此，在6股二唾液酸糖链修饰的IFN-β施用组中为0.3％，展现癌组织几乎被消灭那样极高的抗肿瘤活性。另一方面，PEG20K修饰的IFN-β施用组的％T/C为58.5％，仅是与对照药阿沃纳斯施用组为相同的程度。据此可以表明，6股二唾液酸糖链修饰的IFNβ，与对照药阿沃纳斯及已知作为常规技术的PEG20K修饰的IFN-β相比，具有非常优异的IFN-β活性。

就常规技术而言，一般为了使蛋白质的物理稳定性或血浆中稳定性提高，可将PEG附加于多肽。纵使在本发明的(实施例10)中，PEG修饰的IFN-β，与阿沃纳斯相比，显示血中浓度的变化被显著地改善。但是，在(实施例14)中，PEG修饰的IFN-β只显示与阿沃纳斯相同程度的抗肿瘤活性。亦即，已知一般具有可使血中滞留性提高的效果的PEG修饰，在IFN-β的抗肿瘤活性方面则未见到有提高效果，相对于此，本发明的糖链修饰的IFN-β，令人惊异地，如(实施例10)所示，与阿沃纳斯相比血中滞留性显著地提高；而且，在抗肿瘤活性方面亦显著地提高。从此点可显示本发明的糖链修饰的IFN-β，与天然IFN-β及PEG修饰的IFN-β相比，在作为药物的有用性上是非常高的。

(实施例15)4,5,6股糖链修饰的IFN-β在活体外的细胞增殖抑制活性

通过以下方法评估4,5,6股糖链修饰的IFN-β在活体外的细胞增殖抑制活性。

使用含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基(10％FCS-RPMI1640)，将人类伯基特淋巴瘤细胞株Daudi，以成为1.25×10⁵个细胞/mL的方式悬浮。将细胞悬浮液以1×10⁴/80μL/孔的量接种于96孔平底培养板中。然后以20μL/孔的量添加使用10％FCS-RPMI1640阶段地稀释而得的多个糖链修饰的IFN-β，在将CO₂浓度调整成5％的CO₂培养箱中，于37℃培养3日。细胞增殖抑制活性，以培养第3日的线粒体脱氢酶活性作为指标，使用细胞计数试剂盒-8(同人科学)，依照随附于试剂盒的操作手册进行测定。

此外，使用阿沃纳斯作为对照。IC50值，使用GraphPad Prism计算出。将结果示于下述(表4)中。

[表4]

(表4)

(表4续)

关于在与本发明中见到抗肿瘤活性提高效果的糖链修饰的IFN-β不同的位置予以糖链修饰而得到的附加糖链的多肽，如(表4)所示，可见到各种附加糖链的多肽在活体外的细胞增殖抑制活性的提高。关于在(表4)中所示的附加糖链的多肽，与前述的附加糖链的多肽同样地，认为非还原末端皆被唾液酸化的本发明附加糖链的多肽可作为具有干扰素β活性的药物、作为抗肿瘤活性等干扰素活性优异的药物来使用。

以上显示本发明的4-6股糖链修饰的IFN-β具有比天然IFN-β(阿沃纳斯)更高的血中滞留性及更高的抗肿瘤活性。

如图4、图5、及图12所示，二唾液酸糖链修饰的IFN-β，随着糖链数从4股增加至5股、从5股增加至6股等，股数变得越多，血中滞留性变得越高，此外，抗肿瘤活性亦变得越高。

此外，在本发明中，糖链的非还原末端被全部唾液酸化显示对于IFN-β的血中滞留性的提高及在活体内的抗肿瘤活性的提高颇为重要。

此外，就糖链的非还原末端被全部唾液酸化的糖链而言，在使用诸如二唾液酸糖链，以及三唾液酸糖链、四唾液酸糖链等各种糖链的情况中，皆显示具有比天然IFN-β(阿沃纳斯)更高的血中滞留性及更高的抗肿瘤活性。

因此，认定本发明的附加糖链的多肽在作为具有优异的干扰素β活性的药物上是有用的。

Claims

1.附加糖链的多肽，所述附加糖链的多肽具有干扰素β活性，其特征为所述附加糖链的多肽是在下述(1)的多肽中，有4至6处的氨基酸以附加糖链的氨基酸置换，且所述糖链的所有的非还原末端皆被唾液酸化并且所述糖链为N连接型糖链的附加糖链的多肽：

(1)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列构成的多肽，

所述各附加糖链的氨基酸中的至少3个存在于SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中，与选自第1位、3位、41位、48位、75位、79位、107位、112位、123位及136位所构成的组中的位置相当的位置。

2.如权利要求1所述的附加糖链的多肽，其中，所述各附加糖链的氨基酸各自独立地为附加糖链的Cys或附加糖链的Asn。

3.如权利要求1或者2所述的附加糖链的多肽，其中，所述各附加糖链的氨基酸中的糖链，皆各自独立地选自下述式(1)、式(2)、式(3)及式(4)所构成的组：

4.如权利要求1至3中任一项所述的附加糖链的多肽，其中，所述各附加糖链的氨基酸中的糖链皆相同。

5.如权利要求1所述的附加糖链的多肽，其中，所述各附加糖链的氨基酸皆不存在于SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中，与第2位、5位、6位、9位、12位、13位、16位、19位、20位、23位、27位、33位、37位、39位、40位、43位、53位、54位、55位、57位、58位、61位、62位、64位、65位、68位、69位、73位、78位、83位、86位、87位、90位、93位、94位、100位、124位、125位、128位、131位、132位、138位、141位、142位、145位、148位、149位、152位、153位、156位、159位、160位或163位的位置相当的位置。

6.如权利要求1所述的附加糖链的多肽，其中，所述各附加糖链的氨基酸皆存在于SEQID NO.1所示的氨基酸序列中，与选自第1位、3位、7位、24位、25位、28位、29位、32位、35位、38位、41位、42位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、70位、75位、79位、99位、103位、106位、107位、109位、112位、115位、123位、130位、136位、139位及164位所构成的组中的位置相当的位置。

7.如权利要求1至6中任一项所述的附加糖链的多肽，其中，所述附加糖链的多肽是化学合成的。

8.医药组合物，其特征为所述医药组合物包含：

(1)如权利要求1至7中任一项所述的附加糖链的多肽及/或其药学上可接受的盐；以及

(2)药理学上可接受的载体。

9.如权利要求1至7中任一项所述的附加糖链的多肽在制备用于与干扰素β相关的疾病的治疗或预防的药物中的用途。

10.如权利要求9所述的用途，其中，所述与干扰素β相关的疾病选自脑肿瘤、皮肤恶性黑色素瘤、B型慢性活动性肝炎、C型慢性肝炎、亚急性硬化性全脑炎、C型代偿性肝硬化及多发性硬化症所构成的组。