TW201518318A - 附加唾液酸化糖鏈之多肽 - Google Patents

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Abstract

本發明之課題係提供附加有高均一性之唾液酸化糖鏈且具有干擾素β活性的多肽。 該多肽係在選自下述(1)至(4)：(1)由序列編號1所示之胺基酸序列構成之多肽，(2)在由序列編號1所示之胺基酸序列構成之多肽中，刪除、置換或附加1或數個胺基酸而成之多肽，(3)為干擾素β之類似物的多肽，以及(4)對比於由序列編號1所示之胺基酸序列構成之多肽，具有80%以上相同性的多肽所構成之組群之任一多肽中，4至6處之胺基酸以附加糖鏈之胺基酸置換，且該糖鏈之非還原末端皆被唾液酸化之附加糖鏈之多肽。

Description

附加唾液酸化糖鏈之多肽
本發明係關於附加唾液酸化糖鏈之多肽。更具體而言，係關於附加有高均一性之唾液酸化糖鏈且具有干擾素β活性的多肽。
天然的人類干擾素β(IFN-β)係由166個胺基酸殘基所構成之糖蛋白質。已知干擾素β屬於細胞激素家族，參與免疫調整作用、抗病毒活性、細胞増殖抑制作用。又，人類干擾素β，於天然之胺基酸序列中之17位、31位、141位具有3個Cys，於80位之Asn具有1股複合型之N鍵結型寡糖。又，已知於31位及141位之Cys處具有二硫鍵。
做為藥劑之干擾素β係利用細胞表現系來製造，依使其表現之宿主之不同而分類為IFN-β-1a或IFN-β-1b。IFN-β-1a，係在使用中國倉鼠之卵巢(CHO)細胞的表現系中表現者，與天然干擾素β同樣，為具有糖鏈的糖蛋白質。另一方面，IFN-β-1b係在大腸桿菌中表現者，為不具糖鏈的蛋白質。
已知IFN-β-1a，與IFN-β-1b相比，在免疫原性、抗病毒活性及抗腫瘤特性方面，具有更強的效能。再者，已知在糖蛋白質中所含之糖鏈構造對於藥物動態具有強影響力。
又，已知若使乙二醇(PEG)等水溶性聚合物鍵結於蛋白質，則將帶來蛋白質之物理安定性、熱安定性、血漿中安定性之提高等效果。此等效果受到期待，目前存在有關以PEG修飾之IFN-β的報告。例如，有關於對IFN-β-1b之N末端施加PEG修飾而得之IFN-β複合體的報告(專利文獻1、2)。又，亦存在有關對IFN-β-1a之N末端施行PEG修飾而得之IFN-β複合體的報告(專利文獻3)。此等修飾，雖然也許確可賦予蛋白質上述安定性等，但另一方面擔心會使做為IFN-β類藥劑的活性降低。例如，報告在PEG之分子量為2萬以上的情況，活性急劇地降低(非專利文獻1)。
考量PEG修飾之上述擔心，而選擇縱使鍵結高分子量之PEG亦可維持IFN-β之活性的位置，施行部位特異性PEG修飾的報告(專利文獻4)亦存在。但是，PEG係不存在於身體內的化合物，有關長期投與PEG修飾IFN-β之情況之蓄積性、安全性、有效性尚未被充分檢討而未被確立。
再者，亦存在有關部位特異性地施行糖鏈修飾而成之IFN-β複合體的報告(專利文獻5)。在專利文獻5中，對於天然型IFN-β之胺基酸序列，以使其具有共通序列(Asn-X-Ser/Thr)之方式導入胺基酸變異，並使用CHO細胞來表現，其中該共通序列為為N鍵結型糖鏈之識別部位。但是，在該方法中，為了導入共通序列，在附加糖鏈之胺基酸以外之處亦發生胺基酸變異。又，已知在CHO細胞中表現時，一般會發生糖鏈之不均一性。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]美國專利申請案公開第2009/0214472號說明書
[專利文獻2]美國專利第7829659號說明書
[專利文獻3]美國專利第7446173號說明書
[專利文獻4]國際公開第2005/019260號
[專利文獻5]國際公開第02/074806號
[非專利文獻]
[非專利文獻1]J. Control. Rel. 88卷35-42頁(2003)
為了使干擾素β之物理的安定性、熱安定性、血漿中安定性等提高，如上述，存在以PEG修飾干擾素β之多肽的例子。但是，在以PEG修飾之情況中，如上述，干擾素β做為藥劑之活性有時會降低。又，由於PEG非為存在於生物體內的物質，所以有在生物體內蓄積而造成藥害之虞。
另一方面，亦存在以糖鏈修飾干擾素β之多肽之例子。但是，例如，藉由在CHO細胞中之表現而製造附加糖鏈之干擾素β之情況，如上述，已知在所附加之糖鏈之種類或附加之位置方面發生不均一性。在糖鏈為不均一的情況，做為醫藥品時，亦有可能各批次間藥效上有所差異；又，就附加天然型糖鏈之干擾素β而言，有所謂血中滯留時間短的缺點。
本發明者為了解決上述問題而反覆深入研究的結 果，發現對於干擾素β之多肽，藉由以附加有糖鏈之非還原末端之任一者皆被唾液酸化的糖鏈之胺基酸，置換4至6處之胺基酸，可得到與天然人類干擾素β相比血中滯留性更為優異，且抗腫瘤活性更為優異的附加糖鏈之多肽。
亦即，在本發明之一態樣中，係關於附加糖鏈之多肽，其係具有干擾素β活性的附加糖鏈之多肽，其特徵為該附加糖鏈之多肽係在選自下述(1)至(4)：(1)由序列編號1所示之胺基酸序列構成的多肽，(2)在由序列編號1所示之胺基酸序列構成之多肽中，刪除、置換或附加1或數個胺基酸而成的多肽，(3)為干擾素β之類似物的多肽，以及(4)對比於由序列編號1所示之胺基酸序列構成之多肽，具有80%以上相同性(homology)的多肽所構成之組群之任一多肽中，4至6處之胺基酸以附加糖鏈之胺基酸置換；且該糖鏈之非還原末端皆被唾液酸化者。
在本發明之一態樣中，該各附加糖鏈之胺基酸，可各自獨立地為附加糖鏈之Cys或附加糖鏈之Asn。
在本發明之一態樣中，該各附加糖鏈之胺基酸中之糖鏈，皆各自獨立，可選自二唾液酸糖鏈、三唾液酸糖鏈、及四唾液酸糖鏈所構成之組群。
在本發明之一態樣中，該各附加糖鏈之胺基酸中之糖鏈，皆各自獨立，可選自下述式(1)、式(2)、式(3)及式(4)所構成之組群：
在本發明之一態樣中，該各附加糖鏈之胺基酸中的糖鏈可皆為相同。
在本發明之一態樣中，該各附加糖鏈之胺基酸之至少1個，可存在於序列編號1所示之胺基酸序列中，與選自1位、3位、7位、24位、25位、28位、29位、32位、35位、38位、41位、42位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、70位、75位、79位、99位、103位、106位、107位、109位、112位、115位、123位、130位、136位、139位、及164位所構成之組群 之位置相當的位置。
其中，在本發明之一態樣中，該各附加糖鏈之胺基酸，可進一步皆不存在於序列編號1所示之胺基酸序列中，與2位、5位、6位、9位、12位、13位、16位、19位、20位、23位、27位、33位、37位、39位、40位、43位、53位、54位、55位、57位、58位、61位、62位、64位、65位、68位、69位、73位、78位、83位、86位、87位、90位、93位、94位、100位、124位、125位、128位、131位、132位、138位、141位、142位、145位、148位、149位、152位、153位、156位、159位、160位、或163位之位置相當的位置。
在本發明之一態樣中，前述各附加糖鏈之胺基酸之至少1個，可存在於序列編號1所示之胺基酸序列中，與選自1位、3位、41位、48位、75位、79位、107位、112位、123位、及136位所構成之組群之位置相當的位置。
在本發明之一態樣中，該各附加糖鏈之胺基酸之至少3個，可存在於序列編號1所示之胺基酸序列中，與選自1位、3位、41位、48位、75位、79位、107位、112位、123位、及136位所構成之組群之位置相當的位置。
在本發明之一態樣中，該各附加糖鏈之胺基酸，可皆存在於序列編號1所示之胺基酸序列中，與選自1位、3位、7位、24位、25位、28位、29位、32位、35位、38位、41位、42位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、70位、75位、79位、99位、103位、106位、107位、109位、112位、115位、123位、130位、136位、139位、及164位所構成之組群之位置相當 的位置。
在本發明之一態樣中，該附加糖鏈之多肽可用化學方式合成。
又，在本發明之一態樣中，關於一種醫藥組成物，其包含：(1)前述附加糖鏈之多肽及/或其藥學上可容許的鹽、及(2)藥理學上可容許之載劑。
在本發明之一態樣中，該醫藥組成物可用於與干擾素β相關之疾病的治療或預防。其中，該等疾病係選自腦腫瘤、皮膚惡性黑色瘤、B型慢性活動性肝炎、C型慢性肝炎、亞急性硬化性全腦炎、C型代償性肝硬變及多發性硬化症所構成之組群。
又，在本發明之一態樣中，關於全部述及之附加糖鏈之多肽的序列、附加糖鏈之胺基酸中的胺基酸、附加糖鏈之胺基酸中的糖鏈之種類及構造、以附加糖鏈之胺基酸置換胺基酸的位置、附加糖鏈之多肽的合成方法、做為醫藥組成物時之對象疾病，可為分別選自上述之組群的任意組合。
本發明之附加糖鏈之多肽，由於可用化學方式合成，具有均一之糖鏈構造。因此，若依照本發明，可提供批次間之差異少，品質安定，具有干擾素β活性之附加糖鏈之多肽及含該附加糖鏈之多肽的醫藥組成物。
又，本發明之附加糖鏈之多肽，可為存在於生物體內之糖鏈附加的多肽。因此，若依照本發明，可提供即使進行長期投與，對人體亦安全之附加糖鏈之多肽及含該附加糖鏈之多肽 的醫藥組成物。
又，若依照本發明，可提供與天然型干擾素β相比血中滯留性較高，抗腫瘤活性亦較高之附加糖鏈之多肽及含該附加糖鏈之多肽的醫藥組成物。
本發明之附加糖鏈之多肽，與天然型干擾素β相比，展現較高的血中滯留性，再者，抗腫瘤活性亦較高。
就先前技術而言，已知施行PEG修飾的干擾素β，與天然型人類干擾素β比較，血中滯留性雖提高，不過未見到抗腫瘤活性之提高。依照本發明，使用比PEG之分子量小的糖鏈，可實現與PEG修飾體同樣、或超越PEG修飾體之血中滯留性之提高，再者，儘管PEG修飾體無法使抗腫瘤活性提高，但本發明之糖鏈附加體可顯著地提高抗腫瘤活性，而令人驚異。因此，研判本發明中之附加糖鏈之多肽，具有高干擾素β活性，在與干擾素β相關之疾病的治療中非常有用。
第1圖係對於在(實施例3-1)中所得到之2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)及在(實施例4-1)中所得到之2-6 monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)，展現進行質量分析(ESI離子化法)之結果的質譜。
第2圖係對於在(實施例3-1)中所得到之2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)及在(實施例4-1)中所得到之2-6 monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)，展現進行SDS-PAGE之結果的照片。
第3圖係對於在(實施例3-1)中所得到之2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)及在(實施例4-1)中所得到之2-6 monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)之糖鏈成分，展現藉由順相HPLC進行分析之結果的質譜。
第4圖係展現皮下投與2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)、2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C)、2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C時，各附加糖鏈之多肽的血漿中濃度轉變圖。
第5圖係展現皮下投與2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)、2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C)、2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)時，各附加糖鏈之多肽的藥物動力學參數表。
第6圖係展現靜脈內投與及皮下投與2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)、2-6 monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)時，各附加糖鏈之多肽之血漿中濃度轉變圖。左圖為靜脈內投與時，各附加糖鏈之多肽的血漿中濃度轉變圖，右圖為皮下投與時，各附加糖鏈之多肽的血漿中濃度轉移圖。
第7圖係展現靜脈內投與及皮下投與2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)、2-6 monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)時，各附加糖鏈之多肽的藥物動力學參數表。
第8圖係展現靜脈內投與2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)、2-6 monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)時，各附加糖鏈之多肽的血漿中濃度轉移圖。
第9圖係展現靜脈內投與2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C- R112C-R123C)、2-6 monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)時，各附加糖鏈之多肽的藥物動力學參數表。
第10圖係展現皮下投與2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)、PEG20K修飾IFN-β時，各附加糖鏈之多肽的血漿中濃度轉變圖。
第11圖係展現皮下投與2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)、PEG20K修飾IFN-β時，各附加糖鏈之多肽的藥物動力學參數表。
第12圖係展現在皮下投與2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)、2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C)、2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)、2-6 diSialo(S1C-N3C-Q48C-N79C-K107C-R112C)之膽癌小鼠中，抗腫瘤活性之評估結果圖。
第13圖係展現在皮下投與2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)、2-6 monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)之膽癌小鼠中，抗腫瘤活性的評估結果圖。
第14圖係展現在皮下投與2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)、2-6 triSialo(S1CS1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)、2-6 tetraSialo(S1CS1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)之膽癌小鼠中，抗腫瘤活性的評估結果圖。
第15圖係展現在皮下投與2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)、PEG20K修飾IFN-β之膽癌小鼠中，抗腫瘤活性的評估結果圖。
第16圖就本發明中之干擾素β之胺基酸序列之例子而言，展現干擾素β-1b之胺基酸序列(序列編號1)。
[用於實施發明之態樣]
本發明係關於附加唾液酸化糖鏈之多肽。具體而言，係關於附加均一性高之唾液酸化糖鏈，且具有干擾素β活性的附加糖鏈之多肽。
在本說明書中，「糖鏈」意指1個以上單元糖(單糖及/或其衍生物)連結而成之化合物。在2個以上單元糖連結之情況，各個單元糖彼此之間，藉著經由糖苷鍵之脫水縮合而鍵結。就此等糖鏈而言，例如，除了生物體中所含有之單糖類及多糖類(葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、木糖、N-乙醯基葡萄糖胺、N-乙醯基半乳糖胺、唾液酸以及此等之複合體及衍生物)之外，可列舉從分解的多糖、糖蛋白質、蛋白聚糖、糖胺聚糖、糖脂質等複合生物體物質分解或衍生而成之糖鏈等廣範圍之糖鏈，不過不以此等為限。
在本發明中，較佳之糖鏈，為不使干擾素複合體之干擾素β活性消失的糖鏈。此種糖鏈無特別限定，可為生物體內以複合糖質(糖肽或糖蛋白質、蛋白多糖、糖脂質等)存在之糖鏈，亦可為生物體內不以複合糖質存在之糖質。
在生物體內以複合糖質存在之糖鏈，從本發明之干擾素複合體投與至生物體之觀點而言為較佳。就在生物體內以複合糖質存在之糖鏈而言，可列舉：在生物體內呈糖肽或糖蛋白質為鍵結於肽或蛋白質之糖鏈，即N-鍵結型糖鏈、O-鍵結型糖鏈等。
在本發明之一態樣中，較佳為使用N-鍵結型糖鏈。就N-鍵結型糖鏈而言，可列舉如：高甘露糖(high mannitol)型、複 合(complex)型、混成(hybrid)型，特佳為複合型。
本發明中之糖鏈以糖鏈之非還原末端皆被唾液酸化為特徵。在本說明書中，「糖鏈之非還原末端皆被唾液酸化」意指例如，在2分枝型複合糖鏈之情況，意指2個非還原末端皆被唾液酸化，在3分枝型複合糖鏈之情況，意指3個非還原末端皆被唾液酸化，在4分枝型複合糖鏈之情況，意指4個非還原末端皆被唾液酸化。
本發明中，唾液酸化意指糖鏈之非還原末端係與唾液酸鍵結。唾液酸意指神經胺酸之胺基或羥基經取代者的總稱。在本發明中，存在於糖鏈之非還原末端的唾液酸，只要不使本發明之附加糖鏈之多肽的干擾素活性消失或顯著地降低，可包含神經胺酸之所有置換體。其中，從「本發明之附加糖鏈之多肽投與至生物體」之觀點而言，本發明之附加糖鏈之多肽中糖鏈之唾液酸化，係以天然存在之唾液酸為較佳。就天然存在之唾液酸而言，已知例如，5位經乙醯基化之N-乙醯基神經胺酸(Neu5Ac)，或5位經乙醇酸修飾之N-乙醇醯基神經胺酸(Neu5Gc)等。
就本發明之一態樣而言，非還原末端皆被唾液酸化之糖鏈之具體例，例如，就已知存在於生物體內之糖鏈而言，可列舉：N-鍵結型糖鏈之複合型糖鏈。就N-鍵結型糖鏈之複合型糖鏈而言，只要具有可做為N-鍵結型糖鏈之複合型糖鏈的一般已知之糖鏈基本骨架者即可，縱使其鍵結樣式、有無岩藻糖、對於側鏈之取代基有無修飾等方面不同者，亦包含在內。就N-鍵結型之複合型糖鏈而言，隨著糖鏈之分枝構造的差異，可分成如：二唾液酸糖鏈、三唾液酸糖鏈、及四唾液酸糖鏈等。亦即，在本發明 中，「二唾液酸糖鏈」意指為N-鍵結型之複合型糖鏈，具有2分枝型之構造，並且非還原末端皆被唾液酸化者。同樣地，「三唾液酸糖鏈」意指為N-鍵結型之複合型糖鏈，具有3分枝型之構造，並且非還原末端皆被唾液酸化者。同樣地，「四唾液酸糖鏈」意指為N-鍵結型之複合型糖鏈，具有4分枝型之構造，並且，非還原末端皆經被液酸化者。
就此等糖鏈而言，更具體言之，可列舉下述式(1)所示之α 2-6二唾液酸糖鏈、式(2)所示之α 2-3二唾液酸糖鏈、式(3)所示之α 2-6三唾液酸糖鏈、及式(4)所示之α 2-6四唾液酸糖鏈等。
本發明中之唾液酸化糖鏈，不限定於上述具體例，亦可包含α 2-3三唾液酸糖鏈、α 2-3四唾液酸糖鏈等糖鏈與唾液酸之鍵結樣式相異者。此等鍵結樣式，可為唾液酸化糖鏈中全部分枝鏈皆為同一鍵結樣式，亦可包含不同之鍵結樣式。
再者，本發明中之唾液酸化糖鏈，亦可包含附加有岩藻糖者。就附有岩藻糖之複合型糖鏈而言，例如，若為二唾液酸糖鏈，可列舉下述式(13)，若為三唾液酸糖鏈，可列舉下述式(15)及式(16)，若為四唾液酸糖鏈，可列舉下述式(17)，做為具體例。
在本發明之一態樣中，本發明之附加糖鏈之多肽中各附加糖鏈之胺基酸中的糖鏈可皆為相同，亦可包含相異者。再 者，在本說明書中，附加糖鏈之多肽中各附加糖鏈之胺基酸中的糖鏈為相同，意指在本發明中，於4至6處胺基酸以附加糖鏈之胺基酸置換的情況，當將該4至6處附加糖鏈之胺基酸中的糖鏈互相比較時，構成糖鏈之糖的種類、鍵結順序、及鍵結樣式於附加糖鏈之多肽內為同一。
又，在本發明之一態樣中，包含本發明之附加糖鏈之多肽的組成物中，附加糖鏈之多肽中之各糖鏈，以實質上係均一為較佳。在本說明書中，附加糖鏈之多肽中之各糖鏈實質上係均一，意指在附加糖鏈之多肽之間，若比較在附加糖鏈之每個位置之各糖鏈，則在多肽中之位置為相同，並且，構成各個位置上之糖鏈之糖的種類、鍵結順序、及糖間的鍵結樣式，於各糖鏈中實質上為相同。在本發明中，附加糖鏈之多肽中之各糖鏈，至少90%以上，較佳95%以上，更佳99%以上為均一。
包含附加糖鏈之多肽的組成物，若附加糖鏈之多肽中各糖鏈實質上係均一，則品質恆定，在醫藥品之製造或檢定等領域中為特佳。均一之糖鏈之比例，可藉由例如，使用HPLC、毛細管電泳、質量分析等方法測定。
本發明中之「序列編號1所示之胺基酸序列」，為干擾素β-1b之胺基酸序列(參照第16圖)。干擾素β-1b，已知為天然人類型干擾素β中1位之Met刪除，17位之Cys被置換成Ser者。
本發明之「附加糖鏈之多肽」意指，例如，序列編號1所示之胺基酸序列所構成之多肽等中，4至6處胺基酸係被「附加糖鏈之胺基酸」置換者。
在本說明書中，所謂「附加糖鏈之胺基酸」係鍵結有糖鏈之胺基酸，其中糖鏈與胺基酸可經由連接基而鍵結。
對於糖鏈所鍵結之胺基酸的種類並無特殊限定，可使用天然胺基酸、非天然胺基酸之任一種。
在糖鏈與胺基酸係經由連接基鍵結之情況，從所謂「與連接基之鍵結容易性」之觀點而言，附加糖鏈之胺基酸的胺基酸係以天冬胺酸或麩胺酸等分子內具有2個以上羧基之胺基酸；離胺酸、精胺酸、組胺酸、色胺酸等分子內具有2個以上胺基之胺基酸；絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸等分子內具有羥基之胺基酸；半胱胺酸等分子內具有巰基之胺基酸；天冬醯胺酸、麩醯胺酸等分子內具有醯胺基之胺基酸為較佳。尤其，從反應性之觀點而言，附加糖鏈之胺基酸的胺基酸，係以半胱胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、離胺酸、精胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸為較佳。
又，在本發明之任意附加糖鏈之多肽中，若糖鏈構造、糖鏈以外之構造、糖鏈之附加部位及糖鏈之附加數目為相同時，則研判在附加糖鏈之胺基酸係附加糖鏈之Asn及附加糖鏈之Cys之情況，本發明之附加糖鏈之多肽的血中半衰期沒有大的差異。
在糖鏈及胺基酸係經由連接基鍵結之情況，就連接基而言，可廣泛使用在該領域中所使用者。可列舉如：-NH-(CO)-(CH2)a-CH2-(式中，a係整數，雖然只要不會阻礙目的連接基功能即無限定，不過以表示0至4之整數為較佳)、C1-10聚亞甲基、-CH2-R-(其中，R係從選自烷基、經取代之烷基、烯基、經 取代之烯基、炔基、經取代之炔基、芳基、經取代之芳基、碳環基、經取代之碳環基、雜環基及經取代之雜環基所構成之組群中之基脫離1個氫原子而成之基)、-(CO)-(CH2)a-(CO)-(式中，a係整數，雖然只要不會阻礙目的連接基功能即無限定，不過以表示0至4之整數為較佳)等。
再者，本發明之附加糖鏈之多肽，不因其之記載(例如，記載「胺基酸以附加糖鏈之胺基酸置換而成的附加糖鏈之多肽」)而受任何製造方法限定，縱使以後述之A法或B法之任一種方法所製造之附加糖鏈之多肽，亦包含於「胺基酸以附加糖鏈之胺基酸置換而成的附加糖鏈之多肽」中。又，例如，將未鍵結胺基酸之糖鏈直接或經由連接基與肽上之胺基酸鍵結而成的附加糖鏈之多肽；附加糖鏈之多肽中，藉由於所附加之糖鏈上進一步附加糖或糖鏈而使已經附加之糖鏈伸長的附加糖鏈之多肽；使1或數個胺基酸鍵結於附加糖鏈之胺基酸的胺基及/或羧基，然後使其與1或複數個干擾素β片段連結而成的附加糖鏈之多肽；將胺基酸所鍵結之糖鏈經由連接基鍵結於肽上之胺基酸而成的附加糖鏈之多肽等，只要最終構造為一致，均包含於本發明之附加糖鏈的多肽中。
在本發明之一態樣中，以附加糖鏈之胺基酸置換上述「4至6處胺基酸」的位置，應以不因附加糖鏈之胺基酸的置換而使干擾素β之活性降低之方式，從各種觀點選擇。例如，在天然之干擾素β中，較佳以糖鏈所鍵結之80位的Asn(相當於序列編號1所示之胺基酸序列的79位)做為本發明中以附加糖鏈之胺基酸置換的位置。
在本發明之一態樣中，就附加糖鏈之胺基酸的置換位置而言，以選擇多肽之摺疊中，不成為干擾素β之立體構造形成的障礙者為較佳。為了不成為干擾素β之立體構造形成的障礙，在干擾素β形成與天然同樣之立體構造的情況中，可將附加糖鏈之胺基酸的置換位置設定成存在於立體構造表面的胺基酸之位置。換言之，在干擾素β形成與天然同樣之立體構造的情況中，非為構成立體構造之表面附近的胺基酸之位置(在本發明中，亦稱為「非表面胺基酸的位置」)。又，在本發明之一態樣中，就附加糖鏈之胺基酸的置換位置而言，以非干擾素β之受體鍵結部位為較佳。本發明人等使用干擾素β之立體構造解析等數據，進行深入檢討，而推測出干擾素β之非表面胺基酸的位置、其他可成為立體形成之障礙的位置、可成為與受體鍵結之障礙的位置。從此種觀點，在本發明之一態樣中，附加糖鏈之胺基酸，以不存在於序列編號1所示之胺基酸序列中，與2位、5位、6位、9位、12位、13位、16位、19位、20位、23位、27位、33位、37位、39位、40位、43位、53位、54位、55位、57位、58位、61位、62位、64位、65位、68位、69位、73位、78位、83位、86位、87位、90位、93位、94位、100位、124位、125位、128位、131位、132位、138位、141位、142位、145位、148位、149位、152位、153位、156位、159位、160位、或163位之位置相當的位置為較佳。又，若為已閱讀本說明書之本技術領域人士，可以此等位置為基準，同樣地適當檢討較不宜做為附加糖鏈之胺基酸之置換位置的位置。
在本發明之一態樣中，就附加糖鏈之胺基酸的置換 位置而言，以不為天然干擾素β中形成二硫鍵之31位及141位的Cys(相當於序列編號1所示之胺基酸序列中的30位及140位)為較佳。
本發明之發明人等，從上述之觀點重複專心研究，合成許多以附加糖鏈之胺基酸置換胺基酸序列上之各種胺基酸而成的附加糖鏈之多肽，並測定干擾素β活性。其結果，發現序列編號1所示之胺基酸序列中，至少，1位、3位、7位、24位、25位、28位、29位、32位、35位、38位、41位、42位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、70位、75位、79位、99位、103位、106位、107位、109位、112位、115位、123位、130位、136位、139位、及164位係藉由糖鏈附加而有助於干擾素β之活性之維持或提高的位置。
基於上述之理由，在本發明之一態樣中，各附加糖鏈之胺基酸之至少1個，以存在於序列編號1所示之胺基酸序列中，與選自1位、3位、7位、24位、25位、28位、29位、32位、35位、38位、41位、42位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、70位、75位、79位、99位、103位、106位、107位、109位、112位、115位、123位、130位、136位、139位、及164位所構成之組群之位置相當的位置為較佳。
又，在本發明之一態樣中，各附加糖鏈之胺基酸之至少2個，以存在於序列編號1所示之胺基酸序列中，與選自1位、3位、7位、24位、25位、28位、29位、32位、35位、38位、41位、42位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、70位、75位、79位、99位、103位、106位、107位、109位、112 位、115位、123位、130位、136位、139位、及164位所構成之組群之位置相當的位置為較佳。
又，本發明之一態樣中，各附加糖鏈之胺基酸之至少3個，以存在於序列編號1所示之胺基酸序列中，與選自1位、3位、7位、24位、25位、28位、29位、32位、35位、38位、41位、42位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、70位、75位、79位、99位、103位、106位、107位、109位、112位、115位、123位、130位、136位、139位、及164位所構成之組群之位置相當的位置為較佳。
又，在本發明之一態樣中，各附加糖鏈之胺基酸之至少4個，以存在於序列編號1所示之胺基酸序列中，與選自1位、3位、7位、24位、25位、28位、29位、32位、35位、38位、41位、42位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、70位、75位、79位、99位、103位、106位、107位、109位、112位、115位、123位、130位、136位、139位、及164位所構成之組群之位置相當的位置為較佳。
又，在本發明之一態樣中，在5處以上以附加糖鏈之胺基酸置換的情況，各附加糖鏈之胺基酸之至少5個，以存在於序列編號1所示之胺基酸序列中，與選自1位、3位、7位、24位、25位、28位、29位、32位、35位、38位、41位、42位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、70位、75位、79位、99位、103位、106位、107位、109位、112位、115位、123位、130位、136位、139位、及164位所構成之組群之位置相當的位置為較佳。
在本發明之一態樣中，以上述之各附加糖鏈之胺基 酸之任一者存在於序列編號1所示之胺基酸序列中，與選自1位、3位、7位、24位、25位、28位、29位、32位、35位、38位、41位、42位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、70位、75位、79位、99位、103位、106位、107位、109位、112位、115位、123位、130位、136位、139位、及164位所構成之組群之位置相當的位置為更佳。
在本發明之一態樣中，以附加糖鏈之胺基酸之1個存在於序列編號1所示之胺基酸序列中，與79位之位置相當的位置為更佳。
又，在本發明之一態樣中，以其他(79位以外)各附加糖鏈之胺基酸之1個至複數個存在於序列編號1所示之胺基酸序列中，與選自1位、3位、7位、24位、25位、28位、29位、32位、35位、38位、41位、42位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、70位、75位、99位、103位、106位、107位、109位、112位、115位、123位、130位、136位、139位、及164位所構成之組群之位置相當的位置為更佳。
又，此等位置為較佳具體例，並不以此處所列舉之位置為限。若為已閱讀本發明之本技術領域人士，可與本發明同樣地，選擇以附加糖鏈之胺基酸置換的位置。
在本發明之一態樣中，以各附加糖鏈之胺基酸之1個存在於序列編號1所示之胺基酸序列中，與1位相當的位置為較佳。
在本發明之一態樣中，以各附加糖鏈之胺基酸之1個存在於序列編號1所示之胺基酸序列中，與3位相當的位置為較佳。
在本發明之一態樣中，以各附加糖鏈之胺基酸之1個存在於序列編號1所示之胺基酸序列中，與41位相當的位置為較佳。
在本發明之一態樣中，以各附加糖鏈之胺基酸之1個存在於序列編號1所示之胺基酸序列中，與48位相當的位置為較佳。
在本發明之一態樣中，以各附加糖鏈之胺基酸之1個存在於序列編號1所示之胺基酸序列中，與75位相當的位置為較佳。
在本發明之一態樣中，以各附加糖鏈之胺基酸之1個存在於序列編號1所示之胺基酸序列中，與79位相當的位置為較佳。
本發明之一態樣中，以各附加糖鏈之胺基酸之1個存在於序列編號1所示之胺基酸序列中，與107位相當的位置為較佳。
本發明之一態樣中，以各附加糖鏈之胺基酸之1個存在於序列編號1所示之胺基酸序列中，與112位相當的位置為較佳。
本發明之一態樣中，以各附加糖鏈之胺基酸之1個存在於序列編號1所示之胺基酸序列中，與123位相當的位置為較佳。
本發明之一態樣中，以各附加糖鏈之胺基酸之1個存在於序列編號1所示之胺基酸序列中，與136位相當的位置為較佳。
又，在本發明之一態樣中，將胺基酸以附加糖鏈之胺基酸置換的情況，可為選自上述之置換位置的位置之任意組合。
就本發明中上述之各附加糖鏈之胺基酸存在的位置而言，較佳組合之具體例，可例示序列編號1所示之胺基酸序列中，與下述之位置相當的位置，不過不以此等為限。
1位、48位、79位、107位、112位、及123位；1位、3位、48位、79位、107位、及112位；1位、48位、79位、99位、107位、及112位； 1位、48位、79位、107位、112位、及130位；1位、48位、79位、107位、112位、及136位；1位、48位、79位、107位、112位、及139位；1位、48位、79位、107位、112位、及164位；1位、29位、48位、79位、107位、及136位；1位、35位、48位、79位、107位、及136位；1位、41位、48位、79位、107位、及136位；1位、48位、75位、79位、107位、及136位；48位、75位、79位、107位、112位、及136位；41位、75位、79位、103位、107位、及136位；41位、75位、79位、106位、107位、及136位；41位、75位、79位、107位、109位、及136位；41位、75位、79位、107位、112位、及136位；41位、75位、79位、107位、115位、及136位；41位、75位、79位、107位、119位、及136位；1位、28位、48位、70位、及79位；1位、48位、79位、107位、及112位；24位、79位、107位、112位、及136位；25位、79位、107位、112位、及136位；32位、79位、107位、112位、及136位；35位、79位、107位、112位、及136位；38位、79位、107位、112位、及136位；41位、79位、107位、112位、及136位；7位、79位、107位、112位、及136位； 48位、79位、107位、112位、及136位；75位、79位、107位、112位、及136位；41位、75位、79位、107位、及136位；42位、75位、79位、107位、及136位；45位、75位、79位、107位、及136位；46位、75位、79位、107位、及136位；47位、75位、79位、107位、及136位；48位、75位、79位、107位、及136位；49位、75位、79位、107位、及136位；50位、75位、79位、107位、及136位；1位、48位、79位、及107位；1位、3位、48位、及79位；79位、107位、112位、及136位；1位、79位、107位、及136位；28位、79位、107位、及136位；35位、79位、107位、及136位；70位、79位、107位、及136位；75位、79位、107位、及136位。
在本說明書中，與序列編號1所示之胺基酸序列中之位置相當的位置，意指只要無胺基酸之附加、刪除等，與序列編號1所示之胺基酸序列中胺基酸之位置對應的位置之胺基酸。又，於序列編號1所示之胺基酸序列內中存在胺基酸之附加、刪除的情況，意指將胺基酸之附加、刪除所造成之胺基酸序列上之移動納入考量的位置之胺基酸。例如，1位至4位具有 Ser1-Tyr2-Asn3-Leu4-序列的糖鏈附加干擾素β-1b中，在1位與2位之胺基酸之間附加1個胺基酸(Trp)的情況(Ser-Trp-Tyr-Asn-Leu-)，「與2位(Tyr)相當的位置」，意指因Trp之附加而向C末端側移動1位而得之胺基酸(Tyr)的位置。
在本說明書中，「胺基酸」意指採用其最廣泛之意義，不僅包含天然胺基酸，亦可包含如所謂胺基酸變異體及衍生物的非天然胺基酸。若為本技術領域人士，考慮其廣泛定義，應可理解就本說明書中之胺基酸而言，可列舉如：天然之蛋白原性L-胺基酸；D-胺基酸；胺基酸變異體及衍生物等經化學修飾之胺基酸；正白胺酸、β-丙胺酸、鳥胺酸等天然非蛋白原性胺基酸；及具有為胺基酸之特徴之本技術領域所公知之特性並以化學方式合成的化合物等。就非天然胺基酸之例子而言，可列舉：α-甲基胺基酸(α-甲基丙胺酸等)、D-胺基酸、組胺酸類胺基酸(2-胺基-組胺酸、β-羥基-組胺酸、高組胺酸、α-氟甲基-組胺酸、及α-甲基-組胺酸等)、側鏈具有多餘之亞甲基的胺基酸(「高」胺基酸)、及側鏈中之羧酸官能基胺基酸以磺酸基置換而成的胺基酸(半胱胺酸等)。在較佳態樣中，本發明之化合物所含之胺基酸僅由天然胺基酸構成。
在本發明中，「序列編號1所示之胺基酸序列」表示干擾素β-1b之胺基酸序列(參照第16圖)。干擾素β-1b，已知為天然之人類型干擾素β中1位之Met刪除，17位之Cys置換為Ser者。
在本說明書中，「胺基酸序列中之1或數個胺基酸被刪除、置換或附加」之情況，意指被置換等之胺基酸之個數， 只要保持干擾素β活性，即無特別限定，例如，有約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、或10個胺基酸係不同者。或者，亦可包含全體胺基酸序列之長度的20%以內，較佳10%以內之胺基酸為不同的情況。被置換或附加之胺基酸可為天然之胺基酸、非天然之胺基酸、或胺基酸類似物，較佳為天然之胺基酸。在本發明之一態樣中，就「胺基酸序列中之1或數個胺基酸被刪除、置換或附加」的多肽而言，可列舉天然型之人類干擾素β。如前述，由序列編號1所示之胺基酸序列構成之多肽，亦即，干擾素β-1b，為天然之人類型干擾素β中之1位Met被刪除，17位之Cys被置換為Ser者。亦即，天然型之人類干擾素β，相對於由序列編號1所示之胺基酸序列構成之多肽，為附加1個胺基酸，且置換1個胺基酸者。若為已閱讀本發明之說明書之本技術領域人士，參考本說明書揭示，即使使用天然型之人類干擾素之胺基酸序列(干擾素β-1a)，代替本案實施例所用之人類干擾素β-1b之胺基酸序列，亦可與本發明同樣地製造、使用附加糖鏈之肽。就序列編號2而言，表示天然型之人類干擾素β-1a之胺基酸序列。在本發明之一態樣中，使用天然型之人類干擾素β-1a之胺基酸序列代替本案實施例所用之人類干擾素β-1b之胺基酸序列的情況，以使用在天然之80位未鍵結不均一糖鏈的胺基酸序列為較佳。
在本發明中，「干擾素β之類似物」意指與干擾素β構造上類似之多肽及/或具有與干擾素β重複之構造的多肽，例如，可列舉：干擾素β之胺基酸之1或數個胺基酸被保存性地置換的多肽、干擾素β改變體、具有干擾素β活性之干擾素β 片段、具有干擾素β活性之伸長干擾素β。
在本說明書中，「胺基酸之1或數個胺基酸被保存性地置換」意指胺基酸置換中，原本之胺基酸與所置換成之胺基酸的親水性指數及/或疏水性指數係類似的置換，且於此種置換之前後，不發生干擾素β活性之明顯降低或消失的置換。
在本說明書中，「干擾素β改變體」意指干擾素β之改變體，係包含干擾素β之天然存在的變異體、或以人工方式改變干擾素β而得的化合物，就此等改變而言，可列舉如：干擾素β之1或複數個胺基酸殘基之烷基化、醯基化(例如乙醯基化)、醯胺化、羧基化、酯化、二硫鍵形成、糖基化、脂質化、磷酸化、羥基化、標識成分之鍵結等。
在本說明書中，「具有干擾素β活性之干擾素β之片段」意指從干擾素β之N末端及/或C末端刪除1個或以上之胺基酸，且維持干擾素β活性之肽。
在本說明書中，「具有干擾素β活性之伸長干擾素β」，意指在干擾素N末端及/或C末端附加1個或以上之胺基酸，且維持干擾素β活性之肽。
本發明之附加糖鏈之多肽可包含：在由與序列編號1所示之胺基酸序列具有80%以上相同性之胺基酸序列所構成的多肽中，4至6處之胺基酸以附加糖鏈之胺基酸置換者。
本發明之附加糖鏈之多肽，可依照本技術領域人士所公知之肽合成方法，組入糖鏈附加步驟而製造。在附加糖鏈時，雖亦可使用利用以麩醯胺轉胺酶為代表之酵素的方法，然而在此種情況，由於附加之糖鏈必須大量，而有最終步驟後之精製變得 煩雜，糖鏈之附加位置及可附加之糖鏈受到限制等問題，所以即使可用於檢定用等之少量合成，但在醫藥品製造等大規模製造上不能算是實用的方法。
做為本發明之附加糖鏈之多肽之簡便製造方法，且為糖鏈構造均一之附加糖鏈之多肽之安定製造方法的具體例而言，可例示以下：使用附加糖鏈之Asn做為附加糖鏈之胺基酸，藉由適當使用固相合成、液相合成等公知之肽合成方法來製造附加糖鏈之多肽的方法(A法)、以及依照公知之肽合成方法製造由序列編號1所示之胺基酸序列所構成之多肽等之任意胺基酸以Cys置換而成的多肽，然後，於Cys藉由化學合成附加糖鏈而製造附加糖鏈之多肽的方法(B法)。參考此等製造方法，若為本技術領域人士，可製造各種附加糖鏈之多肽，所得到之附加糖鏈之多肽及其製造方法，尤其在醫藥品製造之領域中非常有用。
又，此等A法及B法，亦可將2個以上組合而進行。若為使用於檢定等之少量合成，亦可進一步在上述方法中，組合藉由轉移酵素之糖鏈伸長反應。再者，A法係記載於國際公開第2004/005330號小冊子(US2005222382(A1))，B法係記載於國際公開第2005/010053號小冊子(US2007060543(A1))，其之揭示內容全部以做為參照之方式納入本說明書中。又，關於A法及B法中所使用之糖鏈構造係均一的糖鏈之製造，係記載於國際公開第03/008431號小冊子(US2004181054(A1))、國際公開第2004/058984號小冊子(US2006228784(A1))、國際公開第2004/058824號小冊子(US2006009421(A1))、國際公開第2004/070046號小冊子(US2006205039(A1))、國際公開第2007/011055號小冊子等，其之 揭示內容全部以做為參照之方式納入本說明書中。
製造附加糖鏈之多肽的方法(A法)
附加糖鏈之多肽，可藉由，例如，將概要示於以下之使用附加糖鏈之Asn的固相合成來製造。
(1)將以脂溶性保護基保護胺基氮之胺基酸的羧基，與樹脂(resin)鍵結。此種情況，由於將胺基酸之胺基氮用脂溶性保護基保護，可防止胺基酸彼此之自行縮合，而使樹脂與胺基酸反應產生鍵結。
(2)使所得到之反應物之脂溶性保護基脫離，形成游離胺基。
(3)使該游離胺基與以脂溶性保護基保護胺基氮之任何胺基酸之羧基進行醯胺化反應。
(4)使上述脂溶性保護基脫離，形成游離胺基。
(5)藉由重複上述(3)及(4)之步驟1次以上，使任何數目之任何胺基酸連結，得到末端與樹脂鍵結，他端具有游離胺基之肽。
(6)最後，藉由以酸切斷樹脂，可得到具有期望之胺基酸序列的肽。
其中，在(1)中，若使用以脂溶性保護基保護胺基氮的附加糖鏈之Asn代替用脂溶性保護基保護胺基氮的胺基酸，使該天冬醯胺酸部分之羧基與樹脂之羥基反應，可得到於C末端具有附加糖鏈之Asn的肽。
又，(2)之後、或重複(3)及(4)1次以上之任何次數後，於(3)中，若使用以脂溶性保護基保護胺基氮的附加糖鏈之Asn代替以脂溶性保護基保護胺基氮的胺基酸，則可於任意處附加糖鏈。
以此種方式，於(1)及(3)之任何步驟，進行使用脂溶性保護基保護胺基氮的附加糖鏈之Asn代替以脂溶性保護基保護胺基氮的胺基酸2次以上，可得到在任意2處以上附加糖鏈之肽。
使附加糖鏈之胺基酸鍵結後，使脂溶性保護基脫離，形成游離胺基，然後若立即進行步驟(6)，可得到N末端具有附加糖鏈之Asn的肽。
就樹脂而言，只要為通常於固相合成中使用之樹脂即可，可使用例如，以氯官能化之2-氯三苯基甲基氯樹脂(Merck公司製)、以胺基官能化之Amino-PEGA樹脂(Merck公司製)、具有羥基之NovaSyn TGT醇樹脂(Merck公司製)、Wang樹脂(Merck公司製)、HMPA-PEGA樹脂(Merck公司製)等。又，可使連接基存在於Amino-PEGA樹脂與胺基酸之間，就此種連接基而言，可列舉如：4-羥基甲基苯氧基乙酸(HMPA)、4-(4-羥基甲基-3-甲氧基苯氧基)-丁基乙酸(HMPB)等。
又，在將C末端醯胺化之情況，以使用例如，以胺基官能化之Rink-Amide-PEGA樹脂(Merck公司製)為較佳。藉由將該樹脂與肽以酸切斷，可將肽之C末端胺基酸醯胺化。
樹脂與以脂溶性保護基保護胺基氮之胺基酸的鍵結，例如，在使用具有羥基之樹脂或以氯官能化之樹脂時，可使胺基酸之羧基與樹脂進行酯鍵結。又，在使用以胺基官能化之樹脂的情況，係將胺基酸之羧基藉由醯胺鍵而鍵結於樹脂。
就胺基酸而言，可使用所有胺基酸，可列舉如：為天然胺基酸之絲胺酸(Ser)、天冬醯胺酸(Asn)、纈胺酸(Val)、白胺酸(Leu)、異白胺酸(Ile)、丙胺酸(Ala)、酪胺酸(Tyr)、甘胺酸(Gly)、離胺酸(Lys)、精胺酸(Arg)、組胺酸(His)、天冬胺酸(Asp)、麩胺酸(Glu)、麩醯胺酸(Gln)、蘇胺酸(Thr)、半胱胺酸(Cys)、甲硫胺酸(Met)、苯基丙胺酸(Phe)、色胺酸(Trp)、脯胺酸(Pro)。
又，亦可使用上述天然胺基酸之D體。
就脂溶性保護基而言，可列舉如：9-芴基甲氧基羰(Fmoc)基、三級丁氧羰(Boc)基、苄基、烯丙基、烯丙氧羰基、乙醯基等碳酸酯系或醯胺系之保護基等。在胺基酸中導入脂溶性保護基時，例如在導入Fmoc基的情況，可藉由添加9-芴基甲基-N-琥珀醯亞胺基碳酸酯及碳酸氫鈉並使其反應而導入。反應可於0至50℃，較佳於室溫，進行約1至5小時。
就以脂溶性保護基所保護之胺基酸而言，亦可使用市售者。可列舉如：Fmoc-Ser-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-AIa-OH、Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys-OH、Fmoc-Arg-OH、Fmoc-His-OH、Fmoc-Asp-OH、Fmoc-Glu-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Cys-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Pro-OH。
又，以脂溶性保護基所保護之胺基酸中，就於側鏈導入保護基者而言，可列舉如：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Cys(StBu)-OH、Fmoc-Cys(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH。
又，欲在附加糖鏈之多肽的胺基酸序列中附加連接基之情況，於固相合成之過程中，使用以脂溶性保護基保護之連接基代替上述之以脂溶性保護基保護之胺基酸，可於較佳之位置 插入連接基。
在使用2-氯三苯基甲基氯樹脂之情況，可使用二異丙基乙基胺(DIPEA)、三乙基胺、吡啶、2,4,6-三甲基吡啶等鹼進行酯化。又，在使用具有羥基之樹脂的情況，就酯化觸媒而言，可使用例如：1-(1,3,5-三甲苯磺醯基)-3-硝基-1,2,4-三唑(MSNT)、二環己基碳化二亞胺(DCC)、二異丙基碳化二亞胺(DIC)等公知之脫水縮合劑。胺基酸與脫水縮合劑之使用比例，相對於前者1重量份，後者通常為1至10重量份，較佳為2至5重量份。
酯化反應，例如，以藉由將樹脂置入固相管柱中，用溶劑洗淨該樹脂，然後添加胺基酸之溶液而進行為較佳。就洗淨用溶劑而言，可列舉如：二甲基甲醯胺(DMF)、2-丙醇、二氯甲烷等。就溶解胺基酸之溶劑而言，可列舉如：二甲基亞碸(DMSO)、DMF、二氯甲烷等。酯化反應可於0至50℃，較佳於室溫，進行約10分鐘至30小時，較佳約15分鐘至24小時。
此時固相上未反應之羥基以使用乙酸酐等進行乙醯基化，而封閉為較佳。
脂溶性保護基之脫離，可藉由例如用鹼處理而進行。就鹼而言，可列舉如：哌啶、嗎啉等。此時，以在溶劑存在下進行為較佳。就溶劑而言，可列舉如：DMSO、DMF、甲醇等。
游離胺基，與以脂溶性保護基保護胺基氮之任何胺基酸之羧基的醯胺化反應，以在活化劑及溶劑存在下進行為較佳。
就活化劑而言，可列舉如：二環己基碳化二亞胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺‧鹽酸鹽(WSC/HCl)、二苯基磷醯基疊氮化物(DPPA)、羰基二咪唑(CDI)、 氰基膦酸二乙酯(DEPC)、苯并三唑-1-基氧-參(吡咯啶-1-基)鏻(DIPCI)、苯并三唑-1-基氧基-參(吡咯啶-1-基)鏻六氟磷酸鹽(PyBOP)、1-羥基苯并三唑(HOBt)、羥基琥珀醯亞胺(HOSu)、二甲基胺基吡啶(DMAP)、1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)、羥基酞醯亞胺(HOPht)、五氟酚(Pfp-OH)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)、1-[雙(二甲胺基)亞甲基]-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸鹽(HCTU)、O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟膦酸鹽(HATU)、O-苯并三唑-1-基-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TBTU)、3,4二氫-3-羥基-4-氧雜-1,2,3-苯并三(Dhbt)等。
活化劑之使用量，相對於以脂溶性保護基保護胺基氮之任何胺基酸，以1至20當量為較佳，更佳為1至10當量，進一步更佳為1至5當量。
就溶劑而言，可列舉如：DMSO、DMF、二氯甲烷等。反應可於0至50℃，較佳於室溫，進行約10至30小時，較佳為15分鐘至24小時。脂溶性保護基之脫離可用與上述同樣之方式進行。
將肽鏈從樹脂(resin)切斷時，以用酸處理為較佳。就酸而言，可列舉如：三氟乙酸(TFA)、氟化氫(HF)等。
以此種方式，可得到於期望之位置以附加糖鏈之Asn進行置換的附加糖鏈之多肽。
再者，在本發明之一實施態樣中，於固相合成中所用之附加糖鏈之Asn中糖鏈上的非還原末端包含唾液酸的情況，為防止唾液酸因酸處理而切斷，以將該唾液酸之羧基用保護基保護為較佳。就保護基而言，可列舉如：苄基、烯丙基、二苯基甲 基等。保護基之導入及保護基之脫離的方法可依照公知之方法進行。
製造附加糖鏈之多肽之方法(B法)
附加糖鏈之多肽亦可藉由首先合成肽鏈，隨後對合成之肽鏈附加糖鏈的方法製造。具體而言，可藉由固相合成法、液相合成法、藉由細胞來合成之方法、分離萃取天然存在者之方法等製造在欲附加糖鏈之位置包含Cys之肽。其中，對於在形成二硫鍵之預定位置之Cys等不欲附加糖鏈之Cys，係以例如乙醯胺基甲基(Acm)基加以保護。又，在將不欲附加糖鏈且亦不用於形成二硫鍵之Cys導入附加糖鏈之多肽的情況，可於糖鏈附加步驟及二硫鍵形成步驟之間，將該等Cys以保護基保護，之後再脫保護之方式導入Cys。就此種保護基而言，可列舉如：三級丁基(tBu)或4-甲氧基苄基。
又，在附加糖鏈之多肽中之Cys附加相異之糖鏈的情況，係使最初導入糖鏈之Cys成為無保護，繼而藉由將欲導入相異糖鏈的Cys以StBu等保護，即可導入相異之糖鏈。具體而言，藉由固相合成等合成肽時，使欲導入第一糖鏈之Cys成為無保護，並且將欲導入第二糖鏈之Cys用Fmoc-Cys(StBu)-OH等保護，形成具有保護基之Cys。然後，在原樣保持StBu等保護基下，將糖鏈導入至無保護之Cys。繼而，藉由脫去StBu基等保護基，可將相異之糖鏈導入至已成為無保護之Cys。再者，欲導入第一糖鏈之Cys及欲導入第二糖鏈之Cys可為1個或複數個。
再者，StBu基之脫保護，可藉由使用參(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、二硫蘇糖醇(DTT)、三丁基膦等還原劑使其 反應而脫保護。上述反應通常可於0至80℃進行，較佳於5至60℃進行，更佳於10至35℃進行。反應時間通常係以約30分鐘至5小時為較佳。反應終了後，可藉由適宜、公知之方法(例如，高速液體管柱層析(HPLC))進行精製。
在附加糖鏈之多肽的胺基酸序列中附加有連接基的情況，例如於固相合成之過程中，使用以脂溶性保護基保護之連接基代替以脂溶性保護基保護之胺基酸，可在合成之多肽的較佳位置，插入連接基。
繼而，藉由使鹵乙醯基化複合型糖鏈衍生物與上述所得到之含有無保護之Cys的肽反應，使糖鏈與無保護之Cys的硫醇基反應而與肽鍵結。上述反應可於磷酸緩衝液、Tris-鹽酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、或此等之混合溶液中，通常於0至80℃，較佳於10至60℃，更佳於15至35℃進行。反應時間通常為10分鐘至24小時，較佳通常為約30分鐘至5小時。反應終了後，可依照適宜、公知之方法(例如，HPLC)進行精製。
鹵乙醯基化複合型糖鏈衍生物為，例如，將複合型天冬醯胺酸鍵結型糖鏈之第1位之碳所鍵結的羥基，以-NH-(CH2)a-(CO)-CH2X(X為鹵素原子，a為整數，且只要不阻礙目的連接基之功能，即無限定，惟以表示0至4之整數為較佳)置換的化合物。
具體而言，可將鹵乙醯基化複合型糖鏈衍生物與含Cys之肽在磷酸緩衝液中，於室溫反應。反應終了後，藉由以HPLC精製，可得到以附加糖鏈之Cys置換的附加糖鏈之多肽。
又，亦可於所謂DMSO、DMF、甲醇、乙腈之有機 溶劑與上述緩衝液之混合溶液中進行反應。此時，可以有機溶劑之比率係0至99%(v/v)之範圍，添加於上述緩衝液中。藉由添加此種有機溶劑，可使含有於緩衝液中溶解性低之無保護Cys的肽在反應溶液中之溶解性提高，所以較佳。
又，亦可於所謂DMSO、DMF、甲醇、乙腈之有機溶劑，或此等之混合溶液中進行反應。此時，以於鹼存在下進行為較佳。就鹼而言，可列舉如：DIPEA、三乙基胺、吡啶、2,4,6-三甲基吡啶等。
又，亦可於將胍鹽酸鹽或尿素添加於緩衝溶液而成之混合溶液中進行反應。再者，胍鹽酸鹽或尿素可以最終濃度成為1M至8M之方式添加於上述緩衝液中。藉由胍鹽酸鹽或尿素之添加，亦可使在緩衝液中溶解性低之肽的溶解性提高，所以較佳。
再者，為防止含有無保護之Cys的肽，經由二硫鍵形成二聚體，可將參(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、二硫蘇糖醇(DTT)添加於緩衝液，使其反應。TCEP、DTT係以最終濃度可成為10μM至10mM之方式添加於緩衝液中。
又，使糖鏈與目的之Cys鍵結後，將以Acm等保護之Cys的保護基脫保護。在保護基為Acm基之情況，可藉由在水、甲醇、乙酸、或此等之混合溶液中，使用碘、乙酸汞(II)、硝酸銀(I)、或乙酸銀(I)等進行反應而脫保護。
上述反應通常可於0至80℃，較佳於5至60℃，更佳於10至35℃進行。反應時間通常係以約5分鐘至24小時為較佳。反應終了後，藉由DTT或鹽酸等處理後，可用適宜、公知之方法(例如，HPLC)進行精製。
以此種方式，可得到於期望之位置以附加糖鏈之Cys置換的附加糖鏈之多肽。又，以此方式精製之附加糖鏈之多肽，如後述，可使已脫保護之Cys彼此間形成二硫鍵。
又，製造於肽序列中具有複數股二唾液酸糖鏈或單唾液酸糖鏈等含有唾液酸之糖鏈的附加糖鏈之多肽時，可使用導入之糖鏈上唾液酸的羧基以苄基(Bn)基、烯丙基、二苯基甲基、苄醯基等保護之含有唾液酸的糖鏈。
導入唾液酸之羧基被保護的糖鏈時，可在附加糖鏈之多肽中形成二硫鍵之步驟後，插入唾液酸保護基之脫保護的步驟。
如此，藉由將唾液酸之羧基以苄基等保護，將使製造步驟中藉由HPLC等之分離/精製步驟變得容易。又，唾液酸之羧基之保護亦可防止在酸中不安定之唾液酸的脫離。
糖鏈上之唾液酸之羧基的保護反應，可依照本技術領域人士所周知之方法進行。又，在已形成二硫鍵之附加糖鏈之多肽中，唾液酸之羧基的保護基，可藉由於鹼性條件下水解而脫保護。上述反應通常於0至50℃，較佳於0至40℃，更佳於0至30℃進行。反應時間通常係以約5分鐘至5小時為較佳。反應終了後，以磷酸或乙酸等弱酸中和後，可以適宜、公知之方法(例如，HPLC)進行精製。
又，藉由上述A法及B法所製作之附加糖鏈之多肽，可藉由使用空氣及/或氧、碘、DMSO、經氧化及還原之榖胱甘肽(glutathione)之混合物、鐵氰化鉀、艾爾曼試藥(5,5’-二硫雙(2-硝基苄酸))、三氟乙酸鉈(III)、以及烷基三氯矽烷亞碸等本技 術領域人士所周知之方法，形成Cys彼此間之二硫鍵。
再者，形成Cys-Cys間之二硫鍵時，對於不欲形成二硫鍵之附加糖鏈之多肽中的Cys而言，藉由保護基進行保護。就此種保護基而言，可使用Acm、tBu、4-甲氧基苄基、4-甲基苄基等於氧化條件下安定之保護基。
又，在B法中，二硫鍵之形成，亦可於糖鏈之導入前進行。但是，在欲形成二硫鍵之Cys上導入保護基之情況，脫保護之步驟係於二硫鍵形成之步驟前先進行。
(活性)
本發明之附加糖鏈之多肽具有干擾素β活性。本說明書中，「干擾素β活性」，意指具有免疫調整作用、抗病毒活性、抗腫瘤活性等公知活性中之至少1種活性。
例如，附加糖鏈之多肽之干擾素β活性，可使用實施例11至14所記載之抗腫瘤活性測定試驗等測定。
抗腫瘤活性之測定試驗，可藉由例如，將為對象之附加糖鏈之多肽皮下投與至罹患腫瘤之小鼠，並經時地進行腫瘤體積之測定而調查。
(醫藥組成物)
含有本發明之附加糖鏈之多肽做為有效成分的醫藥組成物，對與干擾素β相關之疾病的治療或預防有效。與干擾素β相關之疾病，包含例如，腦腫瘤、皮膚惡性黑色瘤、B型慢性活動性肝炎、C型慢性肝炎、亞急性硬化性全腦炎、C型代償性肝硬變、及多發性硬化症等。再者，上述之腦腫瘤，包含膠質母細胞瘤、髓質母細胞瘤、及星細胞瘤等。以本發明之附加糖鏈之多肽做為 有效成分的醫藥組成物對於上述疾病之治療或預防有效。
又，以本發明之附加糖鏈之多肽做為有效成分之醫藥組成物的投與對象意指任何生物個體，較佳為動物，更佳為哺乳動物，進一步更佳為人類之個體。
上述醫藥組成物，係使用通常所用的充填劑、増量劑、黏合劑、濕潤劑、崩散劑、表面活性劑、潤滑劑等稀釋劑或賦形劑，製劑化成通常之醫藥組成物之形式者。
就此等醫藥組成物而言，可列舉如：錠劑、丸劑、散劑、液劑、懸浮劑、乳劑、顆粒劑、膠囊劑、栓劑、吸入劑、點眼劑、注射劑等。
醫藥組成物中所含有之本發明之附加糖鏈之多肽的量，無特別限定，可從廣範圍內適宜選擇，然而通常以在醫藥組成物中含有1至90重量%本發明之附加糖鏈之多肽為較佳，而以含有1至70重量%為更佳。
以本發明之附加糖鏈之多肽做為有效成分的醫藥組成物，可進一步含有其他有效成分，亦可與含有其他有效成分的醫藥組成物組合。又，以本發明之附加糖鏈之多肽做為有效成分的醫藥組成物，可含有呈藥學上可容許之鹽的附加糖鏈之多肽，亦可進一步以1種以上相異之本發明之附加糖鏈之多肽做為有效成分。又，亦可與以1種以上相異之本發明之附加糖鏈之多肽做為有效成分的醫藥組成物組合使用。又，就醫藥組成物中可含有之其他成分而言，可列舉本技術領域人士所周知之藥學上可容許之載劑等。
就本發明之醫藥組成物的投與方法而言，無特別限 制，可依照各種製劑形式、患者之年齢、性別、疾病之狀態、其他條件而以各種方法投與。就錠劑、丸劑、液劑、懸浮劑、乳劑、顆粒劑及膠囊劑之情況的投與方法而言，可列舉如：經口投與。又，在注射劑之情況，可單獨，或與葡萄糖、胺基酸等通常之補充液混合，經由靜脈內、肌肉內、皮內、皮下或腹腔內投與。在栓劑之情況，可投與至直腸內。在點眼劑之情況，適用於結膜囊等眼組織。在吸入劑之情況，適用於支氣管或肺。
上述醫藥組成物之投與量，可視用法、患者之年齢、性別、疾病之程度、其他條件而適宜選擇，例如，對於1公斤體重，可將本發明之附加糖鏈之多肽之投與量設為0.001至100nmol，以0.01至10nmol為較佳，以0.01至1nmol為更佳。
上述醫藥組成物之投與次數，只要依照用法、患者之年齢、性別、疾病之程度、其他條件適宜選擇即可，例如，3次/1日、2次/1日、1次/1日，再者，亦可依照其血中安定性，選擇頻率較少的投與次數(例如，1次/週、1次/月等)。較佳之上述醫藥組成物的投與次數，為1次以下/1日。
本發明之附加糖鏈之多肽所附加的糖鏈可於體內之代謝系統中容易地分解。又，在本發明之一態樣中，該糖鏈具有在生物體內以呈糖肽(或糖蛋白質)之方式鍵結而存在之構造。因此，本發明之附加糖鏈之多肽及以該附加糖鏈之多肽做為有效成分之醫藥組成物，即使投與至生物體內，亦未展現副作用或抗原性，具有可減少因過敏反應或抗體產生而無法得到藥效之擔心等之優點。
再者，本發明之附加糖鏈之多肽，可安定、簡便地大量供給， 從「品質安定、高品質之醫藥品提供」之觀點而言，亦非常有用。
再者，在本說明書中所用之用語係用於說明特定之實施態樣，而非意圖限定發明。
又，在本說明書中所用之「含有」用語，係排除上下文語意上應做明顯不同理解的情況，而意圖表示所記載事項(構件、步驟、要素或數字等)之存在，但不排除其以外之事項(構件、步驟、要素或數字等)之存在。
除非有不同的定義，本文所用之全部用語(包含技術用語及科學用語)，與本發明所屬技術之領域的人士所廣泛理解者具有相同意義。在本文中所用之用語，除非明示不同的定義，否則應被解釋成與本說明書及關連技術領域中之意義符合的意義，而不應被解釋成理想化、或過度形式之意義。
第一、第二等用語係用於表現多種要素，不過此等要素應被理解成不受此等用語限定。此等用語僅係用於將一個要素與其他要素區別，例如，將第一要素記載成第二要素，同樣地，將第二要素記載成第一要素，均不會脫離本發明之範圍。
以下，藉由實施例將更具體地說明本發明，然而，本發明可藉由各種形式實現，不應解釋為僅限定於此處所記載之實施例。
[實施例]
關於本說明書中多肽片段之表示方法，如下述說明。
例如，在以IFN 1-78(S1Thi-C30Acm)MESNA表示之情況中，表示具有與序列編號1所示之胺基酸序列中1-78號之胺基酸序列同等之肽序列，且相對於此肽序列，1號之絲胺酸被置換成具有 噻唑啶構造之半胱胺酸，30號之半胱胺酸的側鏈以Acm保護，C末端為藉由2-巰基乙磺酸(MESNA)而烷硫酯化之肽片段。
又，在以IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-M35C-Q48C)MESNA表示之情況中，表示具有與序列編號1所示之胺基酸序列中1-78號之胺基酸序列同等之肽序列，且相對於此肽序列，1號之絲胺酸被置換成具有噻唑啶構造之半胱胺酸，30號之半胱胺酸的側鏈以Acm保護，35號之甲硫胺酸被置換成半胱胺酸，48號之麩醯胺酸被置換成半胱胺酸，C末端為藉由2-巰基乙磺酸(MESNA)而烷硫酯化之肽片段。
同樣方式，在以IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C)Ethan表示之情況中，表示具有與序列編號1所示之胺基酸序列中1-78號之胺基酸序列同等的肽序列，且相對於此肽序列，1號之絲胺酸被置換成具有噻唑啶構造之半胱胺酸，30號之半胱胺酸的側鏈以Acm保護，48號之麩醯胺酸被置換成半胱胺酸，C末端為藉由乙硫醇(ethanthiol)而烷硫酯化之肽片段。
又，在以IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-R123C-C140Acm)表示之情況中，表示具有與序列編號1所示之胺基酸序列中79-165號之胺基酸序列同等之肽序列，且相對於此肽序列，79號之天冬醯胺酸被置換成半胱胺酸，107號之離胺酸被置換成半胱胺酸，112號之精胺酸被置換成半胱胺酸，123號之精胺酸被置換成半胱胺酸，140號之半胱胺酸以Acm基保護的肽片段。
關於經糖鏈修飾之多肽之表示方法，如下述說明。
例如，在以2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)表示之情況中，表示具有與序列編號1所示之胺基酸序列中1位 之絲胺酸、48位之麩醯胺酸、79位之天冬醯胺酸、107位之離胺酸、112位之精胺酸、123位之精胺酸的各胺基酸被置換成Cys，且下述式(1)所示之α 2-6二唾液酸糖鏈構造鍵結於各置換中之Cys。
又，在以2-3diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)表示之情況中，表示序列編號1所示之胺基酸序列中1位之絲胺酸、48位之麩醯胺酸、79位之天冬醯胺酸、107位之離胺酸、112位之精胺酸、123位之精胺酸的各胺基酸被置換成Cys，且下述式(2)所示之α 2-3二唾液酸糖鏈構造鍵結於各置換中之Cys。
又，在以2-6 monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)表示之情況中，表示序列編號1所示之胺基酸序列中1位之絲胺酸、48位之麩醯胺酸、79位之天冬醯胺酸、107位之離胺酸、112位之精胺酸、123位之精胺酸的各胺基酸被置換成Cys，且下述式(5)或下述式(6)所示之α 2-6單唾液酸糖鏈構造鍵結於各置換中之Cys。
又，在以2-6 triSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)表示之情況中，表示序列編號1所示之胺基酸序列中1位之絲胺酸、48位之麩醯胺酸、79位之天冬醯胺酸、107位之離胺酸、112位之精胺酸、123位之精胺酸的各胺基酸被置換成Cys，且下述式(3)所示之α 2-6三唾液酸糖鏈構造鍵結於各置換中之Cys。
又，在以2-6 tetraSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)表示之情況中，表示序列編號1所示之胺基酸序列中1位之絲胺酸、48位之麩醯胺酸、79位之天冬醯胺酸、107位之離胺酸、112位之精胺酸、123位之精胺酸的各胺基酸被置換成Cys，且下述式(4)所示之α 2-6四唾液酸糖鏈構造鍵結於各置換中之Cys。
關於糖鏈構造鍵結於Cys之構造，以α 2-6二唾液酸糖鏈之情況為例展現於下述式(14)中。下述式中，波線表示相對於下述式右端所記載之半胱胺酸，省略記載肽鍵所鍵結之鄰接胺基酸。
再者，「二唾液酸」意指二唾液酸糖鏈，「單唾液酸」意指單唾液酸糖鏈，「triSialo」意指三唾液酸糖鏈，「tetraSialo」意指四唾液酸糖鏈。
又，在以2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79-K107C-R112C-R123C)表示之情況中，表示序列編號1所示之胺基酸序列中1位之絲胺酸、48位之麩醯胺酸、107位之離胺酸、112位之精胺酸、123位之精胺酸的各胺基酸被置換成Cys，且下述式(1)所示之α 2-6二唾液酸糖鏈構造鍵結於上述各置換中的Cys、及79位之天冬醯胺酸。
又，在以下之實施例中，有時將4、5、6處之胺基酸以附加糖鏈之胺基酸置換而成的IFN-β分別以「4、5、6股糖鏈修飾IFN-β」來表示。本發明中之「4處之胺基酸以附加糖鏈之胺基酸置換而成的附加糖鏈之多肽」與「4股糖鏈修飾IFN-β」為同義，同樣地，「5處之胺基酸以附加糖鏈之胺基酸置換而成的附加糖鏈之多肽」與「5股糖鏈修飾IFN-β」為同義，同樣地，「6處之胺基酸以附加糖鏈之胺基酸置換而成的附加糖鏈之多肽」與「6股糖鏈修飾IFN-β」為同義。
(實施例1)硫酯片段之合成 (實施例1-1)IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C)Ethan(序列編號3)之合成
在固相合成用管柱上添加Amino-PEGA樹脂(Merck公司製)(50μmol)，並將4-羥基甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(125μmol)、O-苯并三唑-1-基-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TBTU)(125μmol)及N-乙基嗎啉(125μmol)溶解於二甲基甲醯胺(DMF)(1.25ml)中，於室溫攪拌4小時。將樹脂用DMF及二氯甲烷(DCM)充分洗淨。繼而將Fmoc-Trp(Boc)-OH(0.25mmol)、1-(1,3,5-三甲苯磺醯基)-3-硝基-1,2,4-三唑(MSNT)(0.25mmol)及N-甲基咪唑(0.187mmol)溶解於DCM(1.25ml)中，添加於固相合成用管柱後，攪拌4小時。
將樹脂用DCM、DMF洗淨，將Fmoc基用20%哌啶/DMF溶液(2ml)處理15分鐘，進行脫保護。以DMF洗淨，隨後肽鏈之伸長，係使用以下所示之方法依次縮合胺基酸。
將以Fmoc或Boc基保護之胺基酸溶解於DMF，將 此溶液加入固相合成管柱(0.25mmol)中。將0.2M 1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸鹽(HCTU)/DMF(0.25mmol)添加於固相合成管柱中，並將0.8M N-甲基嗎啉/DMF(0.50mm ol)或0.8M 2,6,4-三甲基吡啶/DMF(0.50mmol)添加於固相合成用管柱中。於室溫攪拌15分鐘或30分鐘後，將樹脂用DMF洗淨，並使用20%哌啶/DMF溶液(2ml)處理10分鐘，將Fmoc基脫保護。重複該操作，藉由Fmoc固相合成法依次縮合胺基酸。
將所得到之樹脂使用DCM及DMF洗淨後，添加三氟乙醇及乙酸之混合溶液(1：1)，於室溫下攪拌18小時，從樹脂分離保護肽。將含保護肽之反應溶液於減壓下濃縮後，於減壓下乾燥。將乾燥之保護肽溶解於DMF(3.mL)後，在氮氛圍下，冷卻至-15℃至-20℃。對此添加乙硫醇(5.mmol)後，添加苯并三唑-1-基氧基-參吡咯啶基鏻六氟磷酸鹽(PyBOP)(0.50mmol)，繼而添加二異丙基乙基胺(DIPEA)(0.5mmol)。於-15℃至-20℃攪拌2小時後，添加乙酸(0.8mL)，慢慢地回到室溫。回到室溫後，將反應溶液於減壓下濃縮。將所得到之殘餘物添加於三氟乙酸：水：酚：甲基苯基硫醚：三異丙基矽烷(=95：2.5：2.5：2.5：5)中，並於室溫下攪拌。2小時後，再度將該溶液添加於另行準備之二乙醚使其沉澱後，進行離心，除去溶液部分，得到為目的之含肽硫酯體的殘餘物。將所得到之殘餘物用HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi]精製，藉由ESI-MS分析質量之結果，所得到之化合物的質量，與為目的之IFN1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C)Ethan的質量一致(計算值=9445.8 Da，實測值=9445.5 Da)。
(實施例1-2)IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C-S75C)MESNA (序列編號4)之合成
在固相合成用管柱上添加Amino-PEGA樹脂(Merck公司製)(50μmol)，並將3-Fmoc-4-二胺基苄酸(150μmol)、1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸鹽(HCTU)(150μmol)及二異丙基乙基胺(300μmol)溶解於DMF(1.25ml)中，並於室溫攪拌2小時。
攪拌後，將樹脂藉由DMF洗淨，使用20%哌啶/DMF溶液(2ml)處理15分鐘，脫去保護用之Fmoc基後，用DMF將樹脂充分洗淨。隨後肽鏈之伸長，係使用以下所示之方法依次縮合胺基酸。
將以Fmoc或Boc基保護之胺基酸溶解於DMF，將此溶液添加於固相合成管柱(0.25mmol)中。將0.2M 1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸鹽(HCTU)/DMF(0.25mmol)加至固相合成管柱中，並將0.8M N-甲基嗎啉/DMF(0.50mmol)或0.8M 2,6,4-三甲基吡啶/DMF(0.50mmol)添加於固相合成用管柱中。於室溫攪拌15分鐘或30分鐘後，將樹脂以DMF洗淨，使用20%哌啶/DMF溶液(2ml)處理10分鐘，脫去保護用之Fmoc基。重複該操作，藉由Fmoc固相合成法依次縮合胺基酸。
將所得到之樹脂藉由DMF、DCM洗淨後，使氯甲酸4-硝基苯酯(0.25mmol)溶解於DCM，添加於固相合成管柱後，於室溫攪拌30分鐘。攪拌後，將樹脂用DCM、DMF洗淨，添加二異丙基乙基胺(2.5mmol)，並於室溫攪拌15分鐘。將所得到之樹脂藉由DMF、DCM洗淨後，添加三氟乙酸：水：酚：甲基苯基硫 醚：三異丙基矽烷(=95：2.5：2.5：2.5：5)並於室溫下攪拌。5小時後，用含2-巰基乙磺酸鈉之pH7.2之緩衝溶液(8M胍鹽酸液、0.1M磷酸溶液、300mM 2-巰基乙磺酸鈉)將樹脂充分洗淨。將上述緩衝液加至樹脂中，並於室溫攪拌12小時。
攪拌後，將所得到之溶液用HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi]精製，藉由ESI-MS分析質量之結果，所得到之化合物的質量，與為目的之IFN1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C-N75C)MESNA的質量一致(計算值=9540.9 Da，實測值=9541.6 Da)。
(實施例1-3)其他硫酯片段之合成
與(實施例1-1)同樣地，進行以下所示硫酯片段之合成。
IFN 1-78(S1Thi-N3C-C30Acm-Q48C)Ethan(序列編號5)
IFN 1-78(S1Thi-E28C-C30Acm-Q48C-R70C)Ethan(序列編號6)
與(實施例1-2)同樣地，合成以下之硫酯片段。
IFN 1-78(C30Acm)MESNA(序列編號7)
IFN 1-78(S1Thi-C30Acm)MESNA(序列編號8)
IFN 1-78(F7C-C30Acm)MESNA(序列編號9)
IFN 1-78(N24C-C30Acm)MESNA(序列編號10)
IFN 1-78(G25C-C30Acm)MESNA(序列編號11)
IFN 1-78(E28C-C30Acm)MESNA(序列編號12)
IFN 1-78(C30Acm-K32C)MESNA(序列編號13)
IFN 1-78(C30Acm-M35C)MESNA(序列編號14)
IFN 1-78(C30Acm-D38C)MESNA(序列編號15)
IFN 1-78(C30Acm-E41C)MESNA(序列編號16)
IFN 1-78(C30Acm-Q48C)MESNA(序列編號17)
IFN 1-78(C30Acm-R70C)MESNA(序列編號18)
IFN 1-78(C30Acm-S75C)MESNA(序列編號19)
IFN 1-78(C30Acm-E41C-S75C)MESNA(序列編號20)
IFN 1-78(C30Acm-E42C-S75C)MESNA(序列編號21)
IFN 1-78(C30Acm-Q45C-S75C)MESNA(序列編號22)
IFN 1-78(C30Acm-L46C-S75C)MESNA(序列編號23)
IFN 1-78(C30Acm-Q47C-S75C)MESNA(序列編號24)
IFN 1-78(C30Acm-Q48C-S75C)MESNA(序列編號25)
IFN 1-78(C30Acm-F49C-S75C)MESNA(序列編號26)
IFN 1-78(C30Acm-Q50C-S75C)MESNA(序列編號27)
IFN 1-78(S1Thi-Y29C-C30Acm-Q48C)MESNA(序列編號28)
IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-M35C-Q48C)MESNA(序列編號29)
IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-E41C-Q48C)MESNA(序列編號30)
將在(實施例1-1)、(實施例1-2)、(實施例1-3)中所得到之化合物之質量分析結果示於下述(表1)中。
(實施例2)肽片段之合成 (實施例2-1)IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-R123C-C140Acm)(序列編號31)之合成
在固相合成用管柱上加入Amino-PEGA樹脂(Merck公司製)(50μmol)，並使4-羥基甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(125μmol)、O-苯并三唑-1-基-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TBTU)(125μmol)及N-乙基嗎啉(125μmol)溶解於DMF(1.25ml)中，於室溫攪拌4小時。將樹脂用DMF及DCM充分洗淨。繼而使Fmoc-Asn(Trt)-OH(0.25mmol)、1-(1,3,5-三甲基苯磺醯基)-3-硝基-1,2,4-三唑(MSNT)(0.25mmol)及N-甲基咪唑(0.187mmol)溶解於 DCM(1.25ml)，加入固相合成用管柱後，攪拌4小時。
攪拌後，將樹脂用DCM、DMF洗淨，並使用20%哌啶/DMF溶液(2ml)處理15分鐘，將Fmoc基脫保護。以DMF洗淨後，隨後之肽鏈伸長係使用以下所示之方法依次縮合胺基酸。
將以Fmoc或Boc基保護之胺基酸溶解於DMF中，將此溶液加入固相合成管柱(0.25mmol)中。將0.2M 1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸鹽(HCTU)/DMF(0.25mmol)加入固相合成管柱中，並將0.8M N-甲基嗎啉/DMF(0.50mmol)或0.8M 2,6,4-三甲基吡啶/DMF(0.50mmol)添加於固相合成用管柱中。於室溫攪拌15分鐘或30分鐘後，將樹脂藉由DMF洗淨，並用20%哌啶/DMF溶液(2ml)處理10分鐘脫去保護用Fmoc基。重複該操作，藉由Fmoc固相合成法依次縮合胺基酸。
將所得到之樹脂添加於三氟乙酸：水：酚：甲基苯基硫醚：三異丙基矽烷(=95：2.5：2.5：2.5：5)中，並於室溫下攪拌。3小時後，再度將該溶液添加於另行準備之二乙醚中使其沉澱後，進行離心，除去溶液部分，得到為目的之含肽之殘餘物。將該得到之殘餘物以逆相HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi]精製，藉由ESI-MS分析質量之結果，所得到之化合物的質量，與IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-R123C-C140Acm)之質量一致(計算值=10499.1 Da，實測值=10498.1 Da)。
(實施例2-2)其他肽片段之合成
以與(實施例2-1)同樣之方式，合成以下所示之肽片段。
IFN 79-165(N79C-C140Acm)(序列編號32)
IFN 79-165(N79C-K107C-C140Acm)(序列編號33)
IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-C140Acm)(序列編號34)
IFN 79-165(N79C-K107C-E136C-C140Acm)(序列編號35)
IFN 79-165(N79C-T99C-K107C-R112C-C140Acm)(序列編號36)
IFN 79-165(N79C-E103C-K107C-E136C-C140Acm)(序列編號37)
IFN 79-165(N79C-E106C-K107C-E136C-C140Acm)(序列編號38)
IFN 79-165(N79C-K107C-D109C-E136C-C140Acm)(序列編號39)
IFN 79-165(N79C-K107C-L115C-E136C-C140Acm)(序列編號40)
IFN 79-165(N79C-K107C-L119C-E136C-C140Acm)(序列編號41)
IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-H130C-C140Acm)(序列編號42)
IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-E136C-C140Acm)(序列編號43)
IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-H139C-C140Acm)(序列編號44)
IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-C140Acm-R164C)(序列編號45)
將(實施例2-1)、(實施例2-2)中所得到之化合物的質量分析結果示於下述(表2)。
(實施例3)二唾液酸糖鏈修飾IFN-β之合成 (實施例3-1)2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)(序列編號46)之合成
將IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C)Ethan(序列編號3)及IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-R123C-C140 Acm)(序列編號31)溶解於含4-巰基苯基乙酸之pH7.2的緩衝溶液(8M胍鹽酸液、0.1M磷酸溶液、125mM4-巰基苯基乙酸)，並於室溫靜置。24小時後，於反應溶液中添加二硫蘇糖醇溶液(2M二硫蘇糖醇)，並於室溫靜置3小時。反應終了後，將甲氧基胺溶液(1M甲氧基胺鹽酸鹽)及鹽酸溶液(1M鹽酸，8M胍鹽酸鹽)添加於溶液中，將pH調至4.0後，於室溫靜置24小時。將反應終了後之溶液藉由逆相HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi]脫鹽，並凍結乾燥。
將所得到之粗精製物溶解於pH8.5之緩衝溶液(8M胍鹽酸液、0.1M參羥基甲基胺基甲烷)中，添加下述式(7)所示之經溴乙醯基化的二唾液酸糖鏈(5等量)，並靜置1小時。
反應終了後，添加巰基乙磺酸鈉溶液(200mM巰基 乙磺酸鈉)，於室溫靜置30分鐘。將反應終了後之溶液藉由逆相HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi]脫鹽，並凍結乾燥。
將藉由上述步驟所得到之粗精製物溶解於乙酸銀溶液(60mM乙酸銀、7.5M尿素、875mM乙酸)中，並於室溫靜置4小時。反應後添加二硫蘇糖醇溶液(2M二硫蘇糖醇)。對於反應物，添加pH8.5之緩衝溶液(8M胍鹽酸鹽、0.1M參羥基甲基胺基甲烷)，藉由HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi]脫鹽，並凍結乾燥。
將所得到之凍結乾燥物溶解於pH8.5之緩衝溶液(8M胍鹽酸液、0.1M參羥基甲基胺基甲烷)中，並於室溫靜置30分鐘。將溶液於冷卻條件(4℃)下以稀薄化之胍鹽酸鹽溶液(4.5M胍鹽酸鹽、0.1M參羥基甲基胺基甲烷)置換。對於所置換之溶液，添加硫酸銅溶液(300mM硫酸銅II五水合物)，並於冷卻條件(4℃)下靜置4小時。反應後，添加伸乙二胺四乙酸(400mM伸乙二胺四乙酸)，並於冷卻條件(4℃)下靜置1小時。藉由將反應後之溶液在冷卻條件(4℃)下整夜置換成乙酸溶液(10mM乙酸溶液)，除去改質劑。將摺疊後之溶液藉由HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi]精製，進行質量分析(ESI離子化法)之結果，所得到之化合物的質量，與為目的之2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)之質量一致(計算值=33304.8 Da，實測值=33303.6 Da)。
(實施例3-2)2-6 diSialo(Q48C-S75C-N79C-K107C-R112C-E136C)(序列編號47)之合成
將IFN 1-78(C30Acm-Q48C-S75C)MESNA(序列編號25)及IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-E136C-C140Acm)(序列編號43，溶解於含4-巰基苯基乙酸之pH7.2的緩衝溶液(8M胍鹽酸液、0.1M磷酸 溶液、125mM4-巰基苯基乙酸)中，於室溫靜置。24小時後，在反應溶液中添加二硫蘇糖醇溶液(2M二硫蘇糖醇)，並於室溫靜置3小時。將反應終了後之溶液藉由逆相HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi]脫鹽，並凍結乾燥。
使用所得到之粗精製物，與(實施例3-1)同樣之方式進行質量分析(ESI離子化法)。其結果，所得到之化合物的質量，與為目的之2-6 diSialo(Q48C-S75C-N79C-K107C-R112C-E136C)之質量一致(計算值=33331.8 Da，實測值=33331.2 Da)。
(實施例3-3)2-3diSialo(S1C-N3C-Q48C-N79C-K107C-R112C)(序列編號48)之合成
關於IFN 1-78(S1Thi-N3C-C30Acm-Q48C)Ethan(序列編號5)及IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-C140Acm)(序列編號34)，除變更為下述式(8)所示之溴乙醯基化二唾液酸糖鏈以外，以與(實施例3-1)同樣之方式合成二唾液酸糖鏈修飾IFN-β。進行質量分析(ESI離子化法)之結果，所得到之化合物的質量，與為目的之2-3diSialo(S1C-N3C-Q48C-N79C-K107C-R112C)之質量一致(計算值=33346.9 Da，實測值=33346.6 Da)。
(實施例3-4)其他二唾液酸糖鏈修飾IFN-β之合成
使用與(實施例3-1)同樣之手法，進行以下所示之化合物的合成。
2-6 diSialo(S1C-N3C-Q48C-N79C-K107C-R112C)(序列編號49)
2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-T99C-K107C-R112C)(序列編號50)
2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-H130C)(序列編號51)
2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-E136C)(序列編號52)
2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-H139C)(序列編號53)
2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R164C)(序列編號54)
2-6 diSialo(S1C-Y29C-Q48C-N79C-K107C-E136C)(序列編號55)
2-6 diSialo(S1C-M35C-Q48C-N79C-K107C-E136C)(序列編號56)
2-6 diSialo(S1C-E41C-Q48C-N79C-K107C-E136C)(序列編號57)
2-6 diSialo(S1C-Q48C-S75C-N79C-K107C-E136C)(序列編號58)
2-6 diSialo(S1C-E28C-Q48C-R70C-N79C)(序列編號59)
2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C)(序列編號60)
2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)(序列編號61)
2-6 diSialo(S1C-N3C-Q48C-N79C)(序列編號62)
2-6 diSialo(S1C-N79C-K107C-E136C)(序列編號63)
使用與(實施例3-2)同樣之手法，進行以下所示之化合物之合成。
2-6 diSialo(E41C-S75C-N79C-E103C-K107C-E136C)(序列編號64)
2-6 diSialo(E41C-S75C-N79C-E106C-K107C-E136C)(序列編號65)
2-6 diSialo(E41C-S75C-N79C-K107C-D109C-E136C)(序列編號66)
2-6 diSialo(E41C-S75C-N79C-K107C-R112C-E136C)(序列編號67)
2-6 diSialo(E41C-S75C-N79C-K107C-L115C-E136C)(序列編號68)
2-6 diSialo(E41C-S75C-N79C-K107C-L119C-E136C)(序列編號69)
2-6 diSialo(N24C-N79C-K107C-R112C-E136C)(序列編號70)
2-6 diSialo(G25C-N79C-K107C-R112C-E136C)(序列編號71)
2-6 diSialo(K32C-N79C-K107C-R112C-E136C)(序列編號72)
2-6 diSialo(M35C-N79C-K107C-R112C-E136C)(序列編號73)
2-6 diSialo(D38C-N79C-K107C-R112C-E136C)(序列編號74)
2-6 diSialo(E41C-N79C-K107C-R112C-E136C)(序列編號75)
2-6 diSialo(F7C-N79C-K107C-R112C-E136C)(序列編號76)
2-6 diSialo(Q48C-N79C-K107C-R112C-E136C)(序列編號77)
2-6 diSialo(S75C-N79C-K107C-R112C-E136C)(序列編號78)
2-6 diSialo(E41C-S75C-N79C-K107C-E136C)(序列編號79)
2-6 diSialo(E42C-S75C-N79C-K107C-E136C)(序列編號80)
2-6 diSialo(Q45C-S75C-N79C-K107C-E136C)(序列編號81)
2-6 diSialo(L46C-S75C-N79C-K107C-E136C)(序列編號82)
2-6 diSialo(Q47C-S75C-N79C-K107C-E136C)(序列編號83)
2-6 diSialo(Q48C-S75C-N79C-K107C-E136C)(序列編號84)
2-6 diSialo(F49C-S75C-N79C-K107C-E136C)(序列編號85)
2-6 diSialo(Q50C-S75C-N79C-K107C-E136C)(序列編號86)
2-6 diSialo(N79C-K107C-R112C-E136C)(序列編號87)
2-6 diSialo(E28C-N79C-K107C-E136C)(序列編號88)
2-6 diSialo(M35C-N79C-K107C-E136C)(序列編號89)
2-6 diSialo(R70C-N79C-K107C-E136C)(序列編號90)
2-6 diSialo(S75C-N79C-K107C-E136C)(序列編號91)。
使用與(實施例3-3)同樣之手法，進行以下所示之化合物之合成。
2-3 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)(序列編號92)。
(實施例3-5)2-6 diSialo(S1C-R26C-Q48C-A67C-N79-A88C)(序列編號100)之合成 (實施例3-5-A)IFN 1-25(S1Thi)硫苯基(thiophenyl)(序列編號101)之合成
在固相合成用管柱上加入Amino-PEGA樹脂(Merck公司製)(50μmol)，並使4-羥基甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(125μmol)、O-苯并三唑-1-基-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TBTU)(125μmol)及N-乙基嗎啉(125μmol)溶解於二甲基甲醯胺(DMF)(1.25ml)中，並於室溫攪拌4小時。將樹脂用DMF及二氯甲烷(DCM)充分洗淨。繼而使Fmoc-Trp(Boc)-OH(0.25mmol)、1-(1,3,5-三甲基苯磺醯基)-3-硝基-1,2,4-三唑(MSNT)(0.25mmol)及N-甲基咪唑(0.187mmol)溶解於DCM(1.25ml)中，加入固相合成用管柱後，攪拌4小時。
將樹脂用DCM、DMF洗淨，並用20%哌啶/DMF溶液(2ml)處理15分鐘以脫去保護用之Fmoc基。用DMF洗淨，隨後之肽鏈伸長係使用以下所示之方法依次縮合胺基酸。
將以Fmoc基或Boc基保護之胺基酸溶解於DMF，將此溶液加入固相合成管柱(0.25mmol)中。將0.2M 1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸鹽(HCTU)/DMF(0.25mmol)加入固相合成管柱，並將0.8M N-甲基嗎啉/DMF(0.50mmol)或0.8M 2,6,4-三甲基吡啶/DMF(0.50mmol)添加於固相合成用管柱中。於室溫攪拌15分鐘或30分鐘後，將樹脂藉由DMF洗淨，並用20%哌啶/DMF溶液(2ml)處理10分鐘以脫去保護用之Fmoc基。重複該操作，藉由Fmoc固相合成法依次縮合胺基酸。
將所得到之樹脂使用DCM及DMF洗淨後，添加三氟乙醇及乙酸的混合溶液(1：1)，並於室溫攪拌18小時，將保護肽從樹脂分離。將含保護肽之反應溶液於減壓下濃縮後，於減壓下乾燥。將乾燥之保護肽溶解於DMF(2.1mL)後，於氮氛圍下冷卻至-15℃至-20℃。在其中添加為硫醇源之硫酚(thiophenol)(0.2mmol)後，添加苯并三唑-1-基氧基-參吡咯啶基鏻六氟磷酸鹽(PyBOP)(1.4mmol)，繼而添加二異丙基乙基胺(DIPEA)(0.2mmol)。於-15℃至-20℃攪拌2小時後，添加三氟乙酸(0.2mL)，慢慢地回到室溫。回到室溫後，將反應溶液於減壓下濃縮。將所得到之殘餘物添加於三氟乙酸：水：三異丙基矽烷(=92.5：2.5：5)中，並於室溫下攪拌。2小時後，再度將該溶液添加於另行準備之二乙醚使其沉澱後，進行離心，除去溶液部分，藉此得到為目的之含肽硫酯體的殘餘物。將所得到之殘餘物用HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi] 精製，藉由ESI-MS分析質量之結果，所得到之化合物的質量，與為目的之IFN1-25(S1Thi)硫苯基(序列編號101)之質量一致(計算值=3062.6 Da，實測值=3062.5 Da)。
(實施例3-5-B)IFN 26-47(R26C-C30Acm)乙硫醇(序列編號102)之合成
與(實施例3-5-A)之操作同樣地合成肽片段。再者，使用乙硫醇做為IFN 26-47(R26C-C30Acm)乙硫醇中之硫醇源。
合成的化合物，藉由ESI-MS分析質量的結果，與做為目的之IFN 26-47(R26C-C30Acm)乙硫醇(序列編號102)之質量一致(計算值=2844.4 Da，實測值=2844.5 Da)。
(實施例3-5-C)IFN 48-66(Q48Thi)MESNA(序列編號103)之合成
在固相合成用管柱上添加Amino-PEGA樹脂(Merck公司製)(50μmol)，使3-Fmoc-4-二胺基苄酸(150μmol)、1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸鹽(HCTU)(150μmol)及二異丙基乙基胺(300μmol)溶解於DMF(1.25ml)，並於室溫攪拌1小時。
攪拌後，將樹脂藉由DMF洗淨，用20%哌啶/DMF溶液(2ml)處理15分鐘脫去保護用之Fmoc基後，用DMF將樹脂充分洗淨。隨後之肽鏈伸長係使用以下所示之方法依次縮合胺基酸。
將以Fmoc基或Boc基保護之胺基酸溶解於DMF中，並將此溶液加入固相合成管柱(0.25mmol)中。將0.2M 1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸鹽 (HCTU)/DMF(0.25mmol)加入固相合成管柱，並將0.8M N-甲基嗎啉/DMF(0.50mmol)或0.8M 2,6,4-三甲基吡啶/DMF(0.50mmol)添加於固相合成用管柱中。於室溫攪拌15分鐘或30分鐘後，將樹脂藉由DMF洗淨，用20%哌啶/DMF溶液(2ml)處理10分鐘以脫去保護用之Fmoc基。重複該操作，藉由Fmoc固相合成法依次縮合胺基酸。
將所得到之樹脂藉由DMF、DCM洗淨後，使氯甲酸4-硝基苯酯(1.4mmol)溶解於DCM，添加於固相合成管柱後，於室溫攪拌40分鐘。攪拌後，將樹脂用DCM、DMF洗淨，並添加溶解於DMF溶液之二異丙基乙基胺(5.mmol)，於室溫攪拌15分鐘。將所得到之樹脂藉由DMF、DCM洗淨後，添加三氟乙酸：水：三異丙基矽烷(=92.5：2.5：5)，並於室溫下攪拌。2小時後，藉由DMF、DCM將樹脂充分洗淨後，以含2-巰基乙磺酸鈉之pH8.5之緩衝溶液(6M胍鹽酸液、0.2M磷酸溶液、1M 2-巰基乙磺酸鈉)將樹脂充分洗淨。將上述緩衝液添加於樹脂，並於室溫攪拌2小時。攪拌後，將所得到之溶液以HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi]精製，藉由ESI-MS分析質量之結果，所得到之化合物的質量，與為目的之IFN 48-66(Q48Thi)MESNA(序列編號103)之質量一致(計算值=2413.8 Da，實測值=2413.9 Da)。
(實施例3-5-D)二唾液酸糖鏈附加IFN 67-87(A67Thi，N79)硫苯基(序列編號104)之合成
在固相合成用管柱上加入Amino-PEGA樹脂(Merck公司製)(50μmol)，使3-Fmoc-4-二胺基苄酸(150μmol)、1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸鹽(HCTU)(150 μmol)及二異丙基乙基胺(300μmol)溶解於DMF(1.25ml)，並於室溫攪拌1小時。
攪拌後，將樹脂藉由DMF洗淨，用20%哌啶/DMF溶液(2ml)處理15分鐘以脫去保護用之Fmoc基後，用DMF將樹脂充分洗淨。隨後之肽鏈伸長係使用以下所示之方法依次縮合胺基酸。
將以Fmoc基或Boc基保護之胺基酸溶解於DMF，將此溶液加入固相合成管柱(0.25mmol)中。將0.2M 1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸鹽(HCTU)/DMF(0.25mmol)加入固相合成管柱中，並添加0.8M N-甲基嗎啉/DMF(0.50mmol)或0.8M 2,6,4-三甲基吡啶/DMF(0.50mmol)於固相合成用管柱中。於室溫攪拌15分鐘或30分鐘後，將樹脂藉由DMF洗淨，用20%哌啶/DMF溶液(2ml)處理10分鐘以脫去保護用之Fmoc基。重複該操作，藉由Fmoc固相合成法依次縮合胺基酸。
對於所得到之8殘基肽，用20%哌啶/DMF溶液(2ml)處理15分鐘以脫去保護用之Fmoc基，用DMF洗淨後，在另行準備之離心管中將二苄基二唾液酸糖鏈天冬醯胺酸(0.2mmol)及DEPBT(0.2mmol)溶解於DMF/DMSO(1：1混合溶液，2.2ml)中，然後加入固相合成用管柱中，添加DIPEA(0.15mmoL)，並於室溫攪拌18小時。若用DMF及DCM洗淨，可得到在固相上有下述式(18)所示之二苄基二唾液酸糖鏈天冬醯胺酸鍵結之9殘基糖鏈肽。
隨後之糖肽鏈之伸長係使用以下所示之方法依次縮合胺基酸。
使已用Fmoc基保護胺基酸的胺基酸及HOBt(0.50mmol)、DIPCI(0.475mmol)溶解於DMF(6.3ml)，進行15分鐘活化後，加入固相合成用管柱中。於室溫攪拌1小時後、使用20%哌啶/DMF溶液(2ml)處理20分鐘以脫去保護用之Fmoc基。重複該操作，依次縮合胺基酸。
將所得到之樹脂使用DCM及DMF洗淨後，以可充分將樹脂浸泡的程度添加三氟乙醇與乙酸之混合溶液(1：1)，於室溫攪拌18小時，將樹脂與糖鏈附加肽片段切離。將切離之樹脂過濾除去，將反應溶液於減壓下濃縮。將所得到之殘餘物濃縮，得到胺基酸側鏈經保護之糖鏈肽。
將所得到之附加糖鏈之肽片段(50mmol)移至茄型燒瓶中，使其溶解於DMF後，於氮氛圍下冷卻至-15℃至-20℃。於其中加入硫酚(0.15mmol)後，添加PyBOP(2.5mmol)、繼而DIPEA(0.15mmol)。在-15℃至-20℃攪拌2小時後，添加三氟乙酸，慢慢地回到室溫。回到室溫後，將反應溶液於減壓下濃縮。將所得到之殘餘物加至三氟乙酸：水：TIPS(=95：2.5：2.5)中，並於室溫 下攪拌。2小時後，再度將該溶液添加於另行準備之二乙醚使其沉澱後，進行離心，除去溶液部分，藉此得到含目的肽硫酯體的殘餘物。將此所得到之殘餘物以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi]精製，藉由ESI-MS分析質量，結果所得到之化合物的質量與為目的之附加二唾液酸糖鏈之IFN67-87(A67Thi，N79)硫苯基(序列編號104)之質量一致(計算值=4903.1 Da，實測值=4903.1 Da)。
(實施例3-5-E)IFN 88-165(C140Acm)(序列編號105)之合成
在固相合成用管柱上加入Amino-PEGA樹脂(Merck公司製)(50μmol)，並使4-羥基甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(125μmol)、O-苯并三唑-1-基-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TBTU)(125μmol)及N-乙基嗎啉(125μmol)溶解於DMF(1.25ml)中，於室溫攪拌4小時。將樹脂用DMF及DCM充分洗淨。繼而使Fmoc-Asn(Trt)-OH(0.25mmol)、1-(1,3,5-三甲基苯磺醯基)-3-硝基-1,2,4-三唑(MSNT)(0.25mmol)及N-甲基咪唑(0.187mmol)溶解於DCM(1.25ml)中，加入固相合成用管柱後，攪拌4小時。
攪拌後，將樹脂用DCM、DMF洗淨，使用20%哌啶/DMF溶液(2ml)處理15分鐘以脫去保護用之Fmoc基。用DMF洗淨後，隨後之肽鏈伸長係使用以下所示之方法依次縮合胺基酸。
將以Fmoc基或Boc基保護之胺基酸溶解於DMF，將此溶液加入固相合成管柱(0.25mmol)中。將0.2M 1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸鹽(HCTU)/DMF(0.25mmol)加入固相合成管柱中，並將0.8M N-甲基嗎啉/DMF(0.50mmol)或0.8M 2,6,4-三甲基吡啶/DMF(0.50mmol)添加於固相合 成用管柱中。於室溫攪拌15分鐘或30分鐘後，將樹脂藉由DMF洗淨，使用20%哌啶/DMF溶液(2ml)處理10分鐘以脫去保護用之Fmoc基。重複該操作，藉由Fmoc固相合成法依次縮合胺基酸。
將所得到之樹脂加入三氟乙酸：水：酚：甲基苯基硫醚：三異丙基矽烷(=95：2.5：2.5：2.5：5)中，並於室溫下攪拌。3小時後，再度將該溶液添加於另行準備之二乙醚中使其沉澱後，進行離心，除去溶液部分，得到為目的之含肽的殘餘物。將此所得到之殘餘物以逆相HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi]精製，藉由ESI-MS分析質量，結果所得到之化合物的質量，與IFN 88-165(C140Acm)(序列編號105)之質量一致(計算值=9647.3 Da，實測值=9647.2 Da)。
(實施例3-5-F)各片段之鍵結 (步驟1. 動態連接(Kinetic Ligation)步驟)
將IFN 1-25(S1Thi)硫苯基(序列編號101)及IFN 26-47(R26C-C30Acm)硫苯基(序列編號102)溶解於pH6.8之緩衝溶液(8M胍鹽酸液、0.2M磷酸溶液、20mMTCEP)中，於室溫反應3小時。將反應終了後之溶液藉由逆相HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi]精製，並凍結乾燥。將此所得到之凍結乾燥品藉由ESI-MS分析質量，結果所得到之化合物的質量與IFN1-47(S1Thi-R26C-C30Acm)乙硫醇(序列編號106)之質量一致(計算值=5796.8 Da，實測值=5796.7 Da)。
(步驟2. 自然化學連接(Native Chemical Ligation)步驟A)
將附加二唾液酸糖鏈之IFN 67-87(A67Thi，N79)硫苯基(序列編號104)及IFN 88-165(C140Acm)(序列編號105)溶解於pH7.2之緩 衝溶液(8M胍鹽酸液、0.2M磷酸溶液、20mMTCEP)中，添加硫酚(3%V/V)，使其於室溫反應。23小時後，將甲氧基胺溶液(6M胍鹽酸鹽、0.2M甲氧基胺鹽酸鹽、20mMTCEP)加入反應溶液，將pH調至4.0後，使其於室溫反應4小時。對於反應溶液添加50mM NaOH水溶液，將反應溶液調成鹼性後，於冰上反應0.5小時。反應終了後，將反應終了後之溶液藉由逆相HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi]精製，得到凍結乾燥品。將此所得到之凍結乾燥品藉由ESI-MS分析質量，結果所得到之化合物的質量，與附加二唾液酸糖鏈之IFN 67-165(A67C-N79-A88C-C140Acm)(序列編號107)之質量一致(計算值=14247.9 Da，實測值=14247.2 Da)。
(步驟3. 自然化學連接步驟B)
使步驟2所得到之附加二唾液酸糖鏈之IFN 67-165(A67C-N79-A88C-C140Acm)(序列編號107)及IFN 48-66(Q48Thi)MESNA(序列編號103)溶解於pH7.2之緩衝溶液(8M胍鹽酸液、0.2M磷酸溶液、20mMTCEP、30mMMPAA)中，並於室溫反應。18小時後，將甲氧基胺溶液(6M胍鹽酸鹽、0.2M甲氧基胺鹽酸鹽、20mMTCEP)加入反應溶液，調整pH至4.0後，於室溫反應。5小時後，在反應溶液中添加2-巰基乙磺酸鈉，並於室溫反應1小時。反應終了後，將反應終了後之溶液藉由逆相HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi]精製，得到凍結乾燥品。將此所得到之凍結乾燥品藉由ESI-MS分析質量，結果所得到之化合物的質量，與附加二唾液酸糖鏈之IFN 48-165(Q48C-A67C-N79-A88C-C140Acm)(序列編號108)之質量一致(計算值=16507.6 Da，實測值=16507.9 Da)。
(步驟4. 自然化學連接步驟C)
將步驟1所得到之IFN1-47(S1Thi-R26C-C30Acm)乙硫醇(序列編號106)，及步驟3所得到之附加二唾液酸糖鏈之IFN 48-165(Q48C，A67C，N79、A88C，C140Acm)(序列編號108)，以與步驟3同樣之方式使其反應。反應所得到之化合物藉由ESI-MS分析質量，結果與為目的之附加二唾液酸糖鏈之IFN 1-165(S1C-R26C-C30Acm-Q48C-A67C-N79-A88C-C140Acm)(序列編號109)之質量一致(計算值=22230.2 Da，實測值=22230.3 Da)。
(步驟5. 糖鏈附加步驟)
使步驟4所得到之附加二唾液酸糖鏈之IFN 1-165(S1C-R26C-C30Acm-Q48C-A67C-N79-A88C-C140Acm)(序列編號109)溶解於pH8.5之緩衝溶液(8M胍鹽酸液、0.1M Tris溶液)，添加下述式(19)所示之溴乙醯基化二唾液酸糖鏈(25當量)，於室溫使其反應2小時。
反應終了後，將反應溶液藉由逆相HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi]精製，得到凍結乾燥品。將此所得到之凍結乾燥品藉由ESI-MS分析質量，結果所得到之化合物的質量，與1、26、48、67、88位具有經由半胱胺酸之側鏈硫原子附加之二唾液酸糖鏈， 79位具有經由天冬醯胺酸之側鏈附加之糖鏈的2-6 diSialo(S1C-R26C-C30Acm-Q48C-A67C-N79-A88C-C140Acm)(序列編號110)的質量一致(計算值=33545.4 Da，實測值=33545.5 Da)。
(步驟6. 保護用之Acm基之脫除)
將藉由上述步驟5所得到之凍結乾燥物溶解於乙酸銀溶液(100mM乙酸銀、90%乙酸水溶液)，使其於室溫反應。4小時後，使用HPLC及ESI-MS確認目的物生成。在反應溶液中添加二硫蘇糖醇，於室溫攪拌15分鐘後，進行離心，除去沉澱物，回收上清液。將此回收之上清液用膜過濾器過濾，將含目的物之濾液部分藉由逆相HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi]精製，得到凍結乾燥品。將此所得到之凍結乾燥品藉由ESI-MS分析質量，結果所得到之化合物的質量，與1、26、48、67、88位具有經由半胱胺酸之側鏈硫原子附加之二唾液酸糖鏈，79位具有經由天冬醯胺酸之側鏈附加之糖鏈的2-6 diSialo(S1C-R26C-Q48C-A67C-N79-A88C)(序列編號111)之質量一致(計算值=33403.3 Da，實測值=33403.2 Da)。
(步驟7. 摺疊步驟)
將藉由上述步驟6所得到之凍結乾燥物溶解於pH8.5之緩衝溶液(8M胍鹽酸液、0.1M參羥基甲基胺基甲烷)，並於室溫靜置30分鐘。將溶液在冷卻條件(4℃)下以稀胍鹽酸鹽溶液(4.5M胍鹽酸鹽、0.1M參羥基甲基胺基甲烷)置換。在所置換之溶液中，添加硫酸銅溶液(300mM硫酸銅II五水合物)，並於冷卻條件(4℃)下靜置3小時。反應後，添加伸乙二胺四乙酸(400mM伸乙二胺四乙酸)，並於冷卻條件(4℃)下靜置0.5小時。藉由將反應後之溶液於 冷卻條件(4℃)下置換成乙酸溶液(10mM乙酸溶液)整夜，除去改質劑。將摺疊後之溶液藉由HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi]精製，進行質量分析(ESI離子化法)，結果所得到之化合物的質量，與為目的之2-6 diSialo(S1C-R26C-Q48C-A67C-N79-A88C)(序列編號100)之質量一致(計算值=33401.2 Da，實測值=33401.2 Da)。
(實施例4)單唾液酸糖鏈修飾IFN-β之合成 (實施例4-1)2-6 monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)(序列編號93)之合成
除了將IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C)Ethan(序列編號3)及IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-R123C-C140Acm)(序列編號31)變更為下述式(9)及下述式(10)所示之溴乙醯基化之單唾液酸糖鏈混合物(化合物比率1：1)(5當量)以外，依照與(實施例3-1)同樣之方法，合成單唾液酸糖鏈修飾IFN-β。進行質量分析(ESI離子化法)，結果所得到之化合物的質量，與為目的之2-6 monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)之質量一致(計算值=31557.2 Da，實測值=31556.6 Da)。將(實施例3-1)及(實施例4-1)中之質量分析的結果示於第1圖。
將(實施例3-1)及(實施例4-1)中所得到之化合物藉由SDS-PAGE、逆相HPLC[管柱：Waters BEH300]分析。將SDS-PAGE之結果示於第2圖。
若觀看SDS-PAGE之結果，由於檢測出明顯的區帶，暗示任一種化合物，皆均一地附加糖鏈。同樣地，在藉由逆相HPLC進行分析中，所得到之數據(數據未示出)亦暗示糖鏈係均一地附加。
又，將在(實施例3-1)及(實施例4-1)中所得到之化合物於pH6.0之磷酸緩衝液(0.1M磷酸)溶液中，藉由添加內-β-N- 乙醯基胺基葡萄糖苷酶(Endo-M)(東京化成工業股份有限公司)而切出糖鏈部分。將所得到之游離糖鏈之還原末端以2-胺基苄酸(Sigma Aldrich)標識化後，藉由順相HPLC[管柱：Shodex NH2P-50]進行分析，將其結果示於第3圖。糖鏈構造分析之結果，可確認在與為目的之二唾液酸糖鏈同樣之滯留時間出現吸收峰，而確認係附加目的之糖鏈。
(實施例4-2)其他單唾液酸糖鏈修飾IFN-β之合成
使用與(實施例4-1)同樣之手法，進行以下所示之化合物之合成。
2-6 monoSialo(S1C-N3C-Q48C-N79C-K107C-R112C)(序列編號94)
2-6 monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)(序列編號95)。
(實施例5)三唾液酸糖鏈修飾IFN-β之合成 (實施例5-1)2-6 triSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)(序列編號96)之合成
除了對於IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C)Ethan(序列編號3)及IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-R123C-C140Acm)(序列編號31)，附加下述式(11)所示之經溴乙醯基化的三唾液酸糖鏈(5等量)以外，依照與(實施例3-1)同樣之方法，合成三唾液酸糖鏈修飾IFN-β。進行質量分析(ESI離子化法)，結果所得到之化合物的質量，與為目的之2-6 triSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)之質量一致(計算值=37244.3 Da，實測值=37243.2 Da)。
(實施例5-2)其他三唾液酸糖鏈修飾IFN-β之合成
使用與(實施例5-1)同樣之手法，進行以下所示之化合物之合成。
2-6 triSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)(序列編號97)
(實施例6)四唾液酸糖鏈修飾IFN-β之合成 (實施例6-1)2-6 tetraSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)(序列編號98)之合成
除了將IFN 1-78(S1Thi-C30Acm-Q48C)Ethan(序列編號3)及IFN 79-165(N79C-K107C-R112C-R123C-C140Acm)(序列編號31)變更為下述式(12)所示之經溴乙醯基化的四唾液酸糖鏈(5當量)以外，依照與(實施例3-1)同樣之方法，合成四唾液酸糖鏈修飾IFN-β。進行質量分析(ESI離子化法)，結果所得到之化合物的質量，與為目的之2-6 tetraSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)之質量一致(計算值=41183.8 Da，實測值=41182.6 Da)。
(實施例6-2)其他四唾液酸糖鏈修飾IFN-β之合成
使用與(實施例6-1)同樣之手法，進行以下所示之化合物之合成。
2-6 tetraSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)(序列編號99)
將在實施例3-1、實施例3-2、實施例3-3、實施例3-4、實施例4-1、實施例4-2、實施例5-1、實施例5-2、實施例6-1、實施例6-2中所得到之化合物的質量分析結果示於下述(表3)。
(實施例7)藉由二唾液酸糖鏈修飾之4、5、6股修飾IFN-β於小鼠中的藥物動態 (實施例7-1)投與藥、試藥之調製
2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)(序列編號61)、2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C)(序列編號60)、2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)(序列編號46)、及阿沃納斯(Avonex)(Biogen Idec公司)，藉由含L-精胺酸、聚山梨醇酯(polysorbate)之乙酸緩衝液調製成588nM。阿沃納斯為天然型之IFN-β(IFN-β-1a)，被用做對照藥。再者，阿沃納斯為使用CHO細胞系所製造者，在天然人類干擾素β之80位之位置(與本發明之序列編號1所示之胺基酸序列中79位之位置相當)具有1股糖鏈，其糖鏈之構造，可為與各多肽鍵結之各N鍵結型糖鏈的各種複合型糖鏈。
(實施例7-2)投與及採血
對於小鼠(Balb/c小鼠、雄性、8週齡、體重21-23g)，於飽食下，使用胰島素用注射器Myjector 29G×1/2(Terumo公司)，以2352pmol/kg之用量及4mL/kg之體積從背部皮下投與。於皮下投與前、及投與後10分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、8小時、12小時、16小時、24小時及30小時，使用經肝素(heparin)處理之血比容毛細管(HIRSHMANN LABORGERATE)從尾靜脈採血75μL。將所採取之血液與同體積之6mM EDTA-PBS快速混和、離心(15000rpm，4℃，10分鐘)。採取90μL上清液、做為血漿樣品。將血漿樣品冷凍保存至用於測定之時。
(實施例7-3)血中濃度測定
IFN-β之血中濃度之測定係使用人類干擾素β ELISA套組(鎌倉科技公司)。就製作標準曲線用之標準品而言，使用與用於投與者相同批號之二唾液酸糖鏈4至6股修飾IFN-β、阿沃納斯，並以套組所附之稀釋液調製成200pM、100pM、50pM、25pM、12.5pM、6.25pM、及、3.125pM。在標準曲線中，依照血漿樣品之稀釋率，以使實施量成為相同之方式添加空白組血漿。將所得到之IFN-β之血漿中濃度隨時間之變化作圖，並示於第4圖。
如第4圖所示，若比較在血漿中之IFN-β濃度，則於任一測定時點，二唾液酸糖鏈4,5,6股修飾IFN-β皆維持比對照藥阿沃納斯高的血漿中濃度，並觀察到血中滯留性之改善。而且，由於二唾液酸糖鏈修飾股數越増加，Tmax越延遲，所以研判化合物從皮下向血中之移行延遲。Cmax及消失相中之血中濃度，隨著二唾液酸糖鏈修飾股數越増加而變得越高。此顯示：藉由附加二唾液酸糖鏈，IFN-β在生物體中之安定性以依存於二唾 液酸糖鏈之股數之方式提高。
(實施例7-4)藥物動力學參數之算出
使用矩(moment)分析，並藉由梯形法從所得到之IFN-β之血漿中濃度隨時間之變化算出血中濃度曲線下面積(AUC∞)。又，藉由血中半衰期(t1/2)、平均滯留時間(MRT)、及皮下投與時之實測值求出最大血中濃度(Cmax)、最大血中濃度到達時間(Tmax)。將所得到之藥物動力學的參數示於第5圖中。
如第5圖所示，矩分析之結果亦顯示二唾液酸糖鏈修飾IFN-β改善t1/2、AUC、MRT之效果係以依存於修飾股數之方式而增加。
(實施例8)二唾液酸糖鏈型及單唾液酸糖鏈型之4股糖鏈修飾IFN-β在小鼠中之藥物動態 (實施例8-1)投與藥、試藥之調製
2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)(序列編號61)、2-6 monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)(序列編號95)、及阿沃納斯，以含有L-精胺酸、聚山梨醇酯之乙酸緩衝液調製成112nM。
(實施例8-2)投與及採血
對於小鼠(Balb/c小鼠、雄性、8週齡、體重21-23g)，於飽食下，使用胰島素用注射器Myjector 29G×1/2(Terumo公司)，以448pmol/kg之用量及以4mL/kg之體積從尾靜脈或背部皮下投與。靜脈內投與時，於投與前及投與後2分鐘、10分鐘、30分鐘、1小時、3小時、6小時、8小時、24小時，皮下投與時，於10分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、8小時、12小時、16小時、24小時、30小時，使用經肝素處理之血比容毛細管 (HIRSHMANN LABORGERATE)從尾靜脈採血75μL。將所採取之血液與同體積之6mM EDTA-PBS快速混和、離心(15000rpm，4度，10分鐘)。採取90μL上清液、做為血漿樣品。將血漿樣品冷凍保存至用於測定之時。
(實施例8-3)血中濃度測定
IFN-β之血中濃度之測定係使用人類干擾素β ELISA套組(鎌倉科技公司)。就製作標準曲線用之標準品而言，使用與用於投與者相同批號之二唾液酸糖鏈型之4股糖鏈修飾IFN-β、單唾液酸糖鏈型之4股糖鏈修飾IFN-β、阿沃納斯，並以套組所附之稀釋液調製成200pM、100pM、50pM、25pM、12.5pM、6.25pM、及、3.125pM。在標準曲線中，依照血漿樣品之稀釋率，以使實施量成為相同之方式添加空白組血漿。將所得到之IFN-β之血漿中濃度隨時間之變化作圖，並示於第6圖中。
如第6圖所示，若比較在血漿中之IFN-β濃度，則於任一測定時點，2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)，與對照藥阿沃納斯高相比，可確認t1/2、AUC∞、MRT皆大幅地提高。相對於此，於皮下投與、尾靜脈投與之任一情況，唾液酸化不完全的2-6 monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)，與對照藥阿沃納斯相比，顯示血中濃度大幅降低。從該結果可顯示：糖鏈之末端被完全唾液酸化可大幅提高IFN-β之血中滯留性。
(實施例8-4)藥物動力學參數之算出
使用矩(moment)分析，並藉由梯形法從所得到之IFN-β之血漿中濃度隨時間之變化算出血中濃度曲線下面積(AUC∞)。又，從以外插法所求得之靜脈內投與時之預測初期濃度(C0)，進而連同血 中半衰期(t1/2)、平均滯留時間(MRT)、及皮下投與時之實測值求出最大血中濃度(Cmax)、最大血中濃度到達時間(Tmax)。將結果示於第7圖中。
如第7圖所示，從矩分析之結果確認：二唾液酸糖鏈4股修飾IFN-β，與對照藥阿沃納斯相比，在t1/2、AUC∞、MRT方面有改善效果。另一方面，單唾液酸糖鏈4股修飾IFN-β，與對照藥阿沃納斯相比，在t1/2、AUC∞、MRT之任一方面均展現較低值，且更早從血中消失。
(實施例9)二唾液酸糖鏈型及單唾液酸糖鏈型之6股糖鏈修飾IFN-β在小鼠中之藥物動態 (實施例9-1)投與藥、試藥之調製
2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)(序列編號46)、2-6 monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)(序列編號93)及阿沃納斯，以含L-精胺酸、聚山梨醇酯的乙酸緩衝液調製成588nM。
(實施例9-2)投與及採血
對於小鼠(Balb/c小鼠、雄性、8週齡、體重21-23g)，於飽食下，使用胰島素用注射器Myjector 29G×1/2(Terumo公司)，以2352pmol/kg之用量並以4mL/kg之體積從靜脈內投與。於靜脈內投與前、及投與後2分鐘、10分鐘、30分鐘、1小時、3小時、6小時、8小時、24小時，使用經肝素處理之血比容毛細管(HIRSHMANN LABORGERATE)從尾靜脈採血75μL。將所採取之血液與同體積之6mM EDTA-PBS快速混和、離心(15000rpm，4度，10分鐘)。採取90μL上清液、做為血漿樣品。將血漿樣品冷 凍保存至用於測定之時。
(實施例9-3)血中濃度測定
IFN-β之血中濃度之測定係使用人類干擾素β ELISA套組(鎌倉科技公司)。就製作標準曲線用之標準品而言，使用與用於投與者相同批號之二唾液酸糖鏈型之6股糖鏈修飾IFN-β、單唾液酸糖鏈型之6股糖鏈修飾IFN-β、阿沃納斯，以套組所附之稀釋液調製成成200pM、100pM、50pM、25pM、12.5pM、6.25pM、及、3.125pM。在標準曲線中，根據血漿樣品之稀釋率，以使實施量成為相同之方式添加空白組血漿。將所得到之IFN-β之血漿中濃度隨時間之變化作圖，並示於第8圖中。
在6股修飾IFN-β方面，亦得到與上述4股修飾IFN-β同樣之結果。亦即，確認2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)，與對照藥阿沃納斯相比，t1/2、AUC∞、MRT皆大幅地提高。另一方面，在尾靜脈投與之情況，2-6 monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)，與對照藥阿沃納斯相比，顯示血中濃度大幅降低。因此，確認在6股糖鏈修飾IFN-β之情況，與4股糖鏈修飾IFN-β同樣地，糖鏈之末端全部被唾液酸化對於IFN-β之血中滯留性等之提高非常重要。
(實施例9-4)藥物動力學參數之算出
使用矩(moment)分析，並藉由梯形法從所得到之IFN-β之血漿中濃度隨時間之變化算出血中濃度曲線下面積(AUC)。又，藉由外插法求出靜脈內投與時之預測初期濃度(C0)，進而求出血中半衰期(t1/2)、平均滯留時間(MRT)。將結果示於第9圖中。
如第9圖所示，從矩分析之結果顯示2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123℃)，與對照藥阿沃納斯相比，t1/2、AUC∞、MRT皆大幅地提高。另一方面，2-6 monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)，與對照藥阿沃納斯相比，顯示t1/2、AUC∞、MRT之任一者之值皆較低，且較早從血中消失。
(實施例10)二唾液酸糖鏈6股修飾IFN-β及PEG20K修飾IFN-β在小鼠中之藥物動態 (實施例10-1)投與藥、試藥之調製
2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)(序列編號46)、PEG20K修飾IFN-β及阿沃納斯，以含有L-精胺酸、聚山梨醇酯之乙酸緩衝液調製成558nM。
(實施例10-2)投與及採血
對於小鼠(Balb/c小鼠、雄性、8週齡、體重21-23g)，於飽食下，使用胰島素用注射器Myjector 29G×1/2(Terumo公司)，以2352pmol/kg之用量並以4mL/kg之體積從背部皮下投與。於皮下投與前、及投與後10分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、8小時、12小時、16小時、24小時及30小時，使用經肝素(heparin)處理之血比容毛細管(HIRSHMANN LABORGERATE)從尾靜脈採血75μL。將所採取之血液與同體積之6mM EDTA-PBS快速混和、離心(15000rpm，4度，10分鐘)。採取90μL上清液、做為血漿樣品。將血漿樣品冷凍保存至用於測定之時。
(實施例10-3)血中濃度測定
IFN-β之血中濃度之測定係使用人類干擾素β ELISA套組(鎌倉科技公司)。就製作標準曲線用之標準品而言，使用與用於 投與者相同批號之二唾液酸糖鏈6股修飾IFN-β、阿沃納斯，以套組所附之稀釋液調製成200pM、100pM、50pM、25pM、12.5pM、6.25pM、及、3.125pM。在標準曲線中，依照血漿樣品之稀釋率，以使實施量成為相同之方式添加空白組血漿。將所得到之IFN-β之血漿中濃度隨時間之變化作圖。並示於第10圖中。
(實施例10-4)藥物動力學參數之算出
使用矩(moment)分析，並藉由梯形法從所得到之IFN-β之血漿中濃度隨時間之變化算出血中濃度曲線下面積(AUC)。又，藉由外插法求出靜脈內投與時之預測初期濃度(C0)，進而求出血中半衰期(t1/2)、平均滯留時間(MRT)。將結果示於第11圖中。
如第10圖及第11圖所示，從血漿中濃度隨時間之變化及矩分析之結果可知二唾液酸糖鏈6股修飾IFN-β及PEG20K修飾IFN-β之任一者，與阿沃納斯相比，t1/2、AUC∞、MRT皆大幅提高。又，二唾液酸糖鏈6股修飾IFN-β，在AUC∞及Cmax方面，超越PEG20K修飾IFN-β。
在t1/2及MRT方面，二唾液酸糖鏈6股修飾IFN-β與PEG20K修飾IFN-β之間之比較，顯示相同程度之結果。
從此等結果可顯示：二唾液酸糖鏈6股修飾IFN-β以與PEG20K相同或其以上之程度使阿沃納斯在生物體中之安定性提高。
(實施例11)二唾液酸糖鏈4、5、6股修飾IFN-β在活體中之抗腫瘤活性
使用罹癌小鼠評估二唾液酸糖鏈4、5、6股修飾IFN-β在活體中之抗腫瘤活性。
(實施例11-1)細胞培養
在抗腫瘤活性試驗中，使用藉由接種人類伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)之Daudi細胞所製作之罹癌小鼠。培養基係使用在RPMI 1640(Invitrogen)中，添加於56℃經去活化處理30分鐘之10%牛胎血清(GIBCO)、青黴素/鏈黴素(SIGMA)者。培養盤係使用未經處裡之培養皿，於37℃、5%CO2濃度條件下進行培養，於2-3日進行1次繼代培養。
(實施例11-2)罹癌小鼠之製成法
將所培養之Daudi細胞回收至試管中，進行離心(1300rpm，4次，3分鐘)。用吸引器除去上清液，加入HBSS(Nacalai)，使細胞懸浮。接下來再次離心，除去上清液。總計進行3次該細胞洗淨處理。然後，使用血球計算板計算細胞數目，使用HBSS以成為2×108cells/mL之方式製成細胞懸浮液。在即將進行Daudi細胞接種之前，加入與細胞懸浮液同體積之基質膠(matrigel)(BD)進行2倍稀釋，製作成接種用細胞懸浮液。將接種用細胞懸浮液保存於冰上直至即將接種前。就麻醉藥而言，將戊巴比妥鈉(somnopentyl)(共立製藥)用PBS稀釋成5mg/mL來使用。對於SCID小鼠(C.B-17/Icr-scid/scid J cl小鼠、雄性、6週齡)(日本Claire公司)，使用胰島素用注射器Myjector 29G×1/2(Terumo社)，將300μL之麻醉藥投與至腹腔內。確認導入麻醉後、使用剪子將小鼠之右腹側部除毛。使用26G1/2注射針(Terumo)及1mL之注射筒(Terumo)，將100μL之接種用細胞懸浮液接種於皮下。
細胞接種處理之後約30日後、使用游標卡尺(Mitsutoyo)測定所形成之腫瘤組織之長徑(mm)及短徑(mm)。使用 所得到之數值求出腫瘤體積(mm3)。腫瘤體積係使用腫瘤體積(mm3)=長徑(mm)×短徑(mm)×短徑(mm)×0.5之公式算出，將罹癌小鼠分成4群(n=4/群)。分群時之腫瘤體積為約800mm3。
(實施例11-3)投與液之調製法
將2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)(序列編號61)、2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C)(序列編號60)、2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)(序列編號46)及2-6 diSialo(S1C-N3C-Q48C-N79C-K107C-R112C)(序列編號49)及對照藥阿沃納斯用含L-精胺酸、聚山梨醇酯之乙酸緩衝液調製成588nM。投與液係於即將投與之前進行調製。
(實施例11-4)投與方法
使用胰島素用注射器Myjector 29G×1/2，將所調製之投與液以使用量成為2352pmol/kg且體積成為4mL/kg之方式投與至背部皮下。又，將調製投與液時所用之含L-精胺酸、聚山梨醇酯的乙酸緩衝液以4mL/kg之體積投與至載劑投與群。將分群及進行初次投與之日當作第0日，每隔一天進行背部皮下投與直至第9日為止，共計投與5次。
(實施例11-5)抗腫瘤活性能之評估
於投與開始第24日從小鼠摘出癌組織，測定組織濕重。算出將載劑投與群之組織濕重當作100%時之二唾液酸糖鏈4-6股修飾IFN-β及阿沃納斯投與群之組織濕重的相對值(%T/C：測試組/對照組)，做為抗腫瘤活性之指標。將結果示於第12圖中。
如第12圖所示，癌組織之組織濕重之相對值(%T/C)，在阿沃納斯投與群中為44.5%，相對於此，在2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)投與群中為0.3%，在2-6 diSialo(S1C-N3C-Q48C-N79C-K107C-R112C)投與群中為0.4%，在2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C)投與群中為18.9%、在2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C)投與群中為28.1%，本發明之二唾液酸糖鏈4、5、6股修飾IFN-β顯示使癌組織幾乎消滅或極度縮小程度之優異抗腫瘤活性。
從以上之結果觀察到在1日1次、隔日×5次、實施2352pmol/kg皮下投與之情況，二唾液酸糖鏈修飾股數越増加，抗腫瘤活性有越強的傾向。
(實施例12)二唾液酸糖鏈/單唾液酸糖鏈6股修飾IFN-β在活體中之抗腫瘤活性
以與(實施例11-1)同樣之方法進行細胞培養，並以與(實施例11-2)同樣之方法製成罹癌小鼠。
除了將(實施例11-3)之投與液做成2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)(序列編號46)、2-6 monoSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)(序列編號93)及對照藥阿沃納斯以外，以與(實施例11-3)同樣之方法調製投與液，並以與(實施例11-4)同樣之方法投與至罹癌小鼠。
於投與開始第22日從小鼠摘出癌組織，測定組織濕重。算出將載劑投與群之組織濕重當作100%時之阿沃納斯投與群之組織濕重的相對值(%T/C：測試組/對照組)，做為抗腫瘤活性之指標。將結果示於第13圖中。
如第13圖所示，癌組織之組織濕重之相對值(%T/C)，在阿沃納斯投與群中為63.%，相對於此，在二唾液酸糖鏈6股修 飾IFN-β投與群中為1.3%，確認具有強力抗腫瘤活性。另一方面，在單唾液酸糖鏈6股修飾IFN-β投與群中為79.3%。
從以上之結果可知，在1日1次、隔日×5次、實施2352pmol/kg皮下投與之情況，二唾液酸糖鏈6股修飾IFN-β，比阿沃納斯投與群優異許多，顯示癌組織幾乎消滅的強力抗腫瘤活性，另一方面，在2個非還原末端之中有一端未被唾液酸化之單唾液酸糖鏈6股修飾IFN-β投與群中，未見到比阿沃納斯投與群優異的抗腫瘤活性。據此可以明白：所有非還原末端皆被唾液酸化對於抗腫瘤活性而言甚為重要。
(實施例13)二唾液酸糖鏈/三唾液酸糖鏈/四唾液酸糖鏈6股修飾IFN-β在活體中之抗腫瘤活性
以與(實施例11-1)同樣之方法進行細胞培養，以與(實施例11-2)同樣之方法製成罹癌小鼠。
除了將(實施例11-3)之投與液做成2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)(序列編號46)、2-6 triSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)(序列編號96)、2-6 tetraSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)(序列編號98)及對照藥阿沃納斯以外，以與(實施例11-3)同樣之方法調製投與液，並以與(實施例11-4)同樣之方法投與至罹癌小鼠。
於投與開始第22日從小鼠摘出癌組織，測定組織濕重。算出將載劑投與群之組織濕重當作100%時之阿沃納斯投與群之組織濕重的相對值(%T/C：測試組/對照組)，做為抗腫瘤活性之指標。將結果示於第14圖中。
如第14圖所示，癌組織之組織濕重之相對值(%T/C)， 在阿沃納斯投與群中為55.5%，相對於此，在二唾液酸糖鏈6股修飾IFN-β投與群中為3.6%，在四唾液酸糖鏈6股修飾IFN-β投與群中為9.1%、在三唾液酸糖鏈6股修飾IFN-β投與群中成為28.7%，顯示任一種6股糖鏈修飾IFN-β均具有強力抗腫瘤活性。
再者，關於糖鏈之構造，若著重於糖鏈中分枝數之差異，雖然2分枝型之6股二唾液酸糖鏈修飾體展現強力抗腫瘤活性，但3分枝型之三唾液酸糖鏈6股修飾體、4分枝型之四唾液酸糖鏈6股修飾體展現比二唾液酸糖鏈6股修飾體弱的抗腫瘤活性。研判此可能與後述實施例16之結果(表4)所示之試管內之細胞増殖抑制活性之差異及在生物體內之血中動態之差異等有關。
(實施例14)二唾液酸糖鏈6股修飾IFN-β及PEG20K修飾IFN-β在活體中之抗腫瘤活性
以與(實施例11-1)同樣之方法進行細胞培養，並以與(實施例11-2)同樣之方法製成罹癌小鼠。
除了以(實施例11-3)之投與液做成2-6 diSialo(S1C-Q48C-N79C-K107C-R112C-R123C)(序列編號46)、PEG20K修飾IFN-β、及對照藥阿沃納斯以外，以與(實施例11-3)同樣之方法調製投與液，並以與(實施例11-4)同樣之方法投與至罹癌小鼠。
於投與開始第21日從小鼠摘出癌組織，測定組織濕重。算出將載劑投與群之組織濕重當作100%時之阿沃納斯投與群之組織濕重的相對值(%T/C：測試組/對照組)，做為抗腫瘤活性之指標。將結果示於第15圖中。
如第15圖所示，癌組織之組織濕重之相對值(%T/C)，在阿沃納斯投與群中為62.6%，相對於此，在二唾液酸糖鏈6股修飾 IFN-β投與群中為0.3%，展現癌組織幾乎消滅那樣極高的抗腫瘤活性。另一方面，PEG20K修飾IFN-β投與群之%T/C為58.5%，僅係與對照藥阿沃納斯投與群為相同的程度。據此可以明白，二唾液酸糖鏈6股修飾IFNβ，與對照藥阿沃納斯及已知做為先前技術之PEG20K修飾IFN-β相比，具有非常優異的IFN-β活性。
就先前技術而言，一般為了使蛋白質之物理安定性、血漿中安定性提高，可將PEG附加於多肽。縱使在本發明之(實施例10)中，PEG修飾IFN-β，與阿沃納斯相比，顯示血中濃度隨時間之變化被顯著地改善。但是，在(實施例14)中，PEG修飾IFN-β只顯示與阿沃納斯相同程度的抗腫瘤活性。亦即，已知一般具有可使血中滯留性提高之效果的PEG修飾，在IFN-β之抗腫瘤活性方面則未見到有提高效果，相對於此，本發明之糖鏈修飾IFN-β，令人驚異地，如(實施例10)所示，與阿沃納斯相比血中滯留性顯著地提高；再者，在抗腫瘤活性方面亦顯著地提高。從此點可顯示本發明之糖鏈修飾IFN-β，與天然IFN-β及PEG修飾IFN-β相比，在做為藥劑之有用性上非常地高。
(實施例15)4,5,6股糖鏈修飾IFN-β在試管內之細胞増殖抑制活性
藉由以下方法評估4,5,6股糖鏈修飾IFN-β在試管中之細胞増殖抑制活性。
使用含10%牛胎血清、100U/mL青黴素、100μg/mL鏈黴素之RPMI 1640培養基(10%FCS-RPMI1640)，將人類伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)細胞株Daudi，以成為1.25×105個/mL之方式懸浮。將細胞懸浮液以1×104/80μL/孔之量接種於96孔平底培養 盤中。然後以20μL/孔之量添加使用10%FCS-RPMI1640階段稀釋而得之複數個糖鏈修飾IFN-β樣本，在將CO2濃度調整成5%之CO2培養箱中，於37℃培養3日。細胞増殖抑制活性，以培養第3日之粒線體脫氫酵素活性做為指標，使用細胞計數套組-8(同人科學)，依照隨附於套組之手冊進行測定。
又，使用阿沃納斯做為對照。IC50價，使用GraphPad Prism計算出。將結果示於下述(表4)中。
關於在與本發明中見到抗腫瘤活性提高效果的糖鏈修飾IFN-β不同的位置予以糖鏈修飾而得到的附加糖鏈之多肽，如(表4)所示，可見到各種附加糖鏈之多肽在試管內提高細胞増殖抑制活性。關於在(表4)中所示之附加糖鏈之多肽，與前述之附加糖鏈之前肽同樣地，非還原末端皆被唾液酸化之本發明附加糖鏈之多肽可做為具有干擾素β活性之藥劑、做為抗腫瘤活性等干擾素活性優異之藥劑來使用。
以上顯示本發明之4-6股糖鏈修飾IFN-β具有比天然IFN-β(阿沃納斯)更高的血中滯留性及更高的抗腫瘤活性。
如第4圖、第5圖、及第12圖所示，二唾液酸糖鏈修飾IFN-β，若糖鏈之股數5股與4股比，6股與5股比，股數變得越多，血中滯留性變得越高，又，抗腫瘤活性亦變得越高。
又，在本發明中，糖鏈之非還原末端被全部唾液酸化顯示對於IFN-β之血中滯留性之提高及在生物體內之抗腫瘤活性之提高頗為重要。
又，就糖鏈之非還原末端被全部唾液酸化的糖鏈而言，二唾液酸糖鏈之外，在使用三唾液酸糖鏈、四唾液酸糖鏈等各種糖鏈之情況中，皆顯示具有比天然IFN-β(阿沃納斯)更高的血中滯留性及更高的抗腫瘤活性。
因此，認定本發明之附加糖鏈之多肽在做為優異之具有干擾素β活性之藥劑上為有用。
<110> 糖鎖工學研究所股份有限公司
<120> 附加唾液酸化糖鏈之多肽
<130> OCKP1301F
<150> JP2013-073703
<151> 2013.03.29
<160> 111
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 於大腸桿菌表現
<220>
<221> 二硫化(disulfide)
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<400> 1
<210> 2
<211> 166
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
<210> 3
<211> 78
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> 結合
<222> (30)..(30)
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<220>
<221> 結合
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<211> 78
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 1C具有噻唑啶基
<220>
<221> 結合
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
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<220>
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<211> 78
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<212> PRT
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<220>
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<220>
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<221> 結合
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<221> 結合
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<211> 78
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
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<220>
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<211> 78
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
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<211> 78
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
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<221> 結合
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<211> 78
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
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<220>
<221> 結合
<222> (78)..(78)
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<211> 78
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
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<221> 結合
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
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<211> 78
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
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<220>
<221> 結合
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
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<221> 結合
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<221> 結合
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<223> 以MESNA烷硫酯化
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
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<220>
<221> 結合
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<211> 78
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
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<221> 結合
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<211> 78
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
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<212> PRT
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<220>
<223> 化學合成
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<220>
<223> 化學合成
<220>
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<220>
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<220>
<223> 化學合成
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<212> PRT
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<220>
<223> 化學合成
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<220>
<223> 化學合成
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<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> 結合
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<210> 30
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
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<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> 結合
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<222> (78)..(78)
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<211> 87
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<220>
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<220>
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<212> PRT
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<223> 化學合成
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<212> PRT
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<211> 87
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<220>
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<220>
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<220>
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<211> 87
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<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
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<211> 87
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
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<211> 87
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<220>
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<220>
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<213> 人工序列
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<221> CARBOHYD
<222> (107)..(107)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (112)..(112)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (136)..(136)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> 二硫化
<222> (30)..(140)
<400> 87
<210> 88
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (28)..(28)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (79)..(79)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (107)..(107)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (136)..(136)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> 二硫化
<222> (30)..(140)
<400> 88
<210> 89
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (35)..(35)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (79)..(79)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (107)..(107)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (136)..(136)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> 二硫化
<222> (30)..(140)
<400> 89
<210> 90
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (70)..(70)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (79)..(79)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (107)..(107)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (136)..(136)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> 二硫化
<222> (30)..(140)
<400> 90
<210> 91
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (75)..(75)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (79)..(79)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (107)..(107)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (136)..(136)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> 二硫化
<222> (30)..(140)
<400> 91
<210> 92
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (1)..(1)
<223> 二唾液酸(α 2-3)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (48)..(48)
<223> 二唾液酸(α 2-3)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (79)..(79)
<223> 二唾液酸(α 2-3)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (107)..(107)
<223> 二唾液酸(α 2-3)寡糖
<220>
<221> 二硫化
<222> (30)..(140)
<400> 92
<210> 93
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (1)..(1)
<223> 單唾液酸寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (48)..(48)
<223> 單唾液酸寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (79)..(79)
<223> 單唾液酸寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (107)..(107)
<223> 單唾液酸寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (112)..(112)
<223> 單唾液酸寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (123)..(123)
<223> 單唾液酸寡糖
<220>
<221> 二硫化
<222> (30)..(140)
<400> 93
<210> 94
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (1)..(1)
<223> 單唾液酸寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (3)..(3)
<223> 單唾液酸寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (48)..(48)
<223> 單唾液酸寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (79)..(79)
<223> 單唾液酸寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (107)..(107)
<223> 單唾液酸寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (112)..(112)
<223> 單唾液酸寡糖
<220>
<221> 二硫化
<222> (30)..(140)
<400> 94
<210> 95
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (1)..(1)
<223> 單唾液酸寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (48)..(48)
<223> 單唾液酸寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (79)..(79)
<223> 單唾液酸寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (107)..(107)
<223> 單唾液酸寡糖
<220>
<221> 二硫化
<222> (30)..(140)
<400> 95
<210> 96
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (1)..(1)
<223> 三唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (48)..(48)
<223> 三唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (79)..(79)
<223> 三唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (107)..(107)
<223> 三唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (112)..(112)
<223> 三唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (123)..(123)
<223> 三唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> 二硫化
<222> (30)..(140)
<400> 96
<210> 97
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (1)..(1)
<223> 三唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (48)..(48)
<223> 三唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (79)..(79)
<223> 三唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (107)..(107)
<223> 三唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> 二硫化
<222> (30)..(140)
<400> 97
<210> 98
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (1)..(1)
<223> 四唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (48)..(48)
<223> 四唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (79)..(79)
<223> 四唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (107)..(107)
<223> 四唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (112)..(112)
<223> 四唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (123)..(123)
<223> 四唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> 二硫化
<222> (30)..(140)
<400> 98
<210> 99
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (1)..(1)
<223> 四唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (48)..(48)
<223> 四唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (79)..(79)
<223> 四唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (107)..(107)
<223> 四唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> 二硫化
<222> (30)..(140)
<400> 99
<210> 100
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (1)..(1)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (26)..(26)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (48)..(48)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (67)..(67)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (79)..(79)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (88)..(88)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> 二硫化
<222> (30)..(140)
<400> 100
<210> 101
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 1C具有噻唑啶基
<220>
<221> 結合
<222> (25)..(25)
<223> 以硫酚烷硫酯化
<400> 101
<210> 102
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
<222> (5)..(5)
<223> Acm
<220>
<221> 結合
<222> (22)..(22)
<223> 以MESNA烷硫酯化
<400> 102
<210> 103
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 1C具有噻唑啶基
<220>
<221> 結合
<222> (19)..(19)
<223> 以乙硫醇烷硫酯化
<400> 103
<210> 104
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 1C具有噻唑啶基
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (13)..(13)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> 結合
<222> (21)..(21)
<223> 以硫酚烷硫酯化
<400> 104
<210> 105
<211> 78
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
<222> (53)..(53)
<223> Acm
<400> 105
<210> 106
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 1C具有噻唑啶基
<220>
<221> 結合
<222> (30)..(30)
<223> Acm
<220>
<221> 結合
<222> (47)..(47)
<223> 以乙硫醇烷硫酯化
<400> 106
<210> 107
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (13)..(13)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> 結合
<222> (74)..(74)
<223> Acm
<400> 107
<210> 108
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (32)..(32)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> 結合
<222> (93)..(93)
<223> Acm
<400> 108
<210> 109
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (79)..(79)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> 結合
<222> (30)..(30)
<223> Acm
<220>
<221> 結合
<222> (140)..(140)
<223> Acm
<400> 109
<210> 110
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (1)..(1)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (26)..(26)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (48)..(48)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (67)..(67)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (79)..(79)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (88)..(88)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> 結合
<222> (30)..(30)
<223> Acm
<220>
<221> 結合
<222> (140)..(140)
<223> Acm
<400> 110
<210> 111
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (1)..(1)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (26)..(26)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (48)..(48)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (67)..(67)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (79)..(79)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (88)..(88)
<223> 二唾液酸(α 2-6)寡糖
<400> 111
由於本案的圖為實驗數據，並非本案的代表圖。
故本案無指定代表圖。

Claims (14)

  1. 一種附加糖鏈之多肽，其具有干擾素β活性，其特徵為該附加糖鏈之多肽係在選自下述(1)至(4)：(1)由序列編號1所示之胺基酸序列構成的多肽，(2)在由序列編號1所示之胺基酸序列構成之多肽中，刪除、置換或附加1或數個胺基酸而成的多肽，(3)為干擾素β之類似物的多肽，以及(4)對比於由序列編號1所示之胺基酸序列構成之多肽，具有80%以上相同性的多肽所構成之組群之任一多肽中，4至6處之胺基酸以附加糖鏈之胺基酸置換；且該糖鏈之非還原末端皆被唾液酸化者。
  2. 如申請專利範圍第1項之附加糖鏈之多肽，其中，該各附加糖鏈之胺基酸各自獨立，為附加糖鏈之Cys或附加糖鏈之Asn。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之附加糖鏈之多肽，其中，該各附加糖鏈之胺基酸中的糖鏈，皆係各自獨立地選自二唾液酸糖鏈、三唾液酸糖鏈及四唾液酸糖鏈所構成之組群。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之附加糖鏈之多肽，其中，該各附加糖鏈之胺基酸中的糖鏈，皆各自獨立地選自下述式(1)、式(2)、式(3)及式(4)所構成之組群：
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之附加糖鏈之多肽，其中，該各附加糖鏈之胺基酸中的糖鏈皆為相同者。
  6. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之附加糖鏈之多肽，其中，該各附加糖鏈之胺基酸之至少一者存在於序列編號1所示之胺基酸序列中，與選自第1位、3位、7位、24位、25位、28位、29位、32位、35位、38位、41位、42位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、70位、75位、79位、99位、103位、106位、107位、109位、112位、115位、123位、130位、136位、139位及164位所構成之組群之位置相當的位置。
  7. 如申請專利範圍第6項之附加糖鏈之多肽，其中，該各附加糖鏈之胺基酸之至少一者存在於序列編號1所示之胺基酸序列中，與選自第1位、3位、41位、48位、75位、79位、107位、112位、123位、及第136位所構成之組群之位置相當的位置。
  8. 如申請專利範圍第6項之附加糖鏈之多肽，其中，該各附加糖鏈之胺基酸之至少三者存在於序列編號1所示之胺基酸序列中，與選自1位、3位、41位、48位、75位、79位、107位、112位、123位及136位所構成之組群之位置相當的位置。
  9. 如申請專利範圍第6項之附加糖鏈之多肽，其中，該各附加糖鏈之胺基酸皆不存在於序列編號1所示之胺基酸序列中，與選自第2位、5位、6位、9位、12位、13位、16位、19位、20位、23位、27位、33位、37位、39位、40位、43位、53位、54位、55位、57位、58位、61位、62位、64位、65位、68位、69位、73位、78位、83位、86位、87位、90位、93位、94位、100位、124位、125位、128位、131位、132位、138位、141位、142位、145位、148位、149位、152位、153位、156位、159位、160位或163位之位置相當的位置。
  10. 如申請專利範圍第6項之附加糖鏈之多肽，其中，該各附加糖鏈之胺基酸之任一者存在於序列編號1所示之胺基酸序列中，與選自1位、3位、7位、24位、25位、28位、29位、32位、35位、38位、41位、42位、45位、46位、47位、48位、49位、50位、70位、75位、79位、99位、103位、106位、107位、109位、112位、115位、123位、130位、136位、 139位及164位所構成之組群之位置相當的位置。
  11. 如申請專利範圍第1至10項中任一項之附加糖鏈之多肽，其中，該附加糖鏈之多肽係化學合成者。
  12. 一種醫藥組成物，其特徵為包含：(1)如申請專利範圍第1至11項中任一項之附加糖鏈之多肽及/或藥學上可容許的鹽；以及(2)藥理學上容許的載劑。
  13. 如申請專利範圍第12項之醫藥組成物，其係用於與干擾素β相關之疾病之治療或預防。
  14. 如申請專利範圍第12項之醫藥組成物，其中，該與干擾素β相關之疾病係選自腦腫瘤、皮膚惡性黑色瘤、B型慢性活動性肝炎、C型慢性肝炎、亞急性硬化性全腦炎、C型代償性肝硬變及多發性硬化症所構成之組群。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4159749A3 (en) * 2016-07-01 2023-06-14 Daiichi Sankyo Company, Limited A method for producing fc-containing molecule with remodeled sugar chain
JP6852397B2 (ja) * 2016-12-28 2021-03-31 株式会社島津製作所 分析用試料の調製方法および分析方法
WO2023145812A1 (ja) * 2022-01-31 2023-08-03 株式会社日本触媒 グルコセレブロシダーゼ活性を有する糖鎖付加タンパク質

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0237019A3 (en) 1986-03-14 1988-03-09 Toray Industries, Inc. Interferon conjugate and production thereof using recombinant gene
IL130964A0 (en) * 1997-01-16 2001-01-28 Cytel Corp Practical in vitro sialylation of recombinant glycoproteins
DE19717864C2 (de) 1997-04-23 2001-05-17 Fraunhofer Ges Forschung Humanes rekombinantes Interferon-beta, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung
CN1187094C (zh) 1998-04-28 2005-02-02 应用研究系统Ars股份公司 多元醇干扰素β偶联物
PL200586B1 (pl) 1998-10-16 2009-01-30 Biogen Idec Inc Polipeptydy zawierające mutanty interferonu-beta-1a, kodujące je cząsteczki kwasów nukleinowych, komórki gospodarza transformowane tymi cząsteczkami, sposób wytwarzania polipeptydów, zawierające je kompozycje farmaceutyczne i zastosowania polipeptydów
AU762616B2 (en) 1998-10-16 2003-07-03 Biogen Ma Inc. Polymer conjugates of interferon beta-1a and uses
US6514729B1 (en) 1999-05-12 2003-02-04 Xencor, Inc. Recombinant interferon-beta muteins
ATE385517T1 (de) 1999-12-08 2008-02-15 Amgen Inc Interferon ähnliche moleküle, und deren verwendungen
US7795002B2 (en) 2000-06-28 2010-09-14 Glycofi, Inc. Production of galactosylated glycoproteins in lower eukaryotes
AU2001273385B2 (en) 2000-09-08 2005-04-07 Gryphon Therapeutics, Inc. Polymer-modified synthetic proteins
PT1381397E (pt) 2000-10-24 2007-05-31 Cis Bio Int Estabilização de composições radiofarmacêuticas utilizando um tioeter hidrofilo ou um 6-hidroxi-cromano hidrofilo.
DE10104869A1 (de) 2001-02-03 2002-08-08 Cognis Deutschland Gmbh Additiv für ölbasierte Invert-Bohrspülungen
MXPA03007619A (es) * 2001-02-27 2003-12-04 Maxygen Aps Nuevas moleculas similares a interferon beta.
MXPA03008310A (es) 2001-03-15 2003-12-11 Merck Patent Gmbh Interferon beta modificado con inmunogenicidad reducida.
AUPR544401A0 (en) 2001-06-04 2001-06-28 Bischof, Robert Juergen Animal model for allergy
EP2481746A1 (en) 2001-06-19 2012-08-01 Otsuka Chemical Co., Ltd. Process for producing sugar chain asparagine derivative
US7226903B2 (en) 2001-10-10 2007-06-05 Neose Technologies, Inc. Interferon beta: remodeling and glycoconjugation of interferon beta
WO2003054006A2 (en) 2001-12-11 2003-07-03 Aventis Pasteur Mutated hiv tat
CA2477577A1 (en) 2002-03-12 2003-09-18 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules for treatment of stroke
US7943763B2 (en) 2002-07-05 2011-05-17 Otsuka Chemical Holdings Co., Ltd. Process for preparing glycopeptides having asparagine-linked oligosaccharides, and the glycopeptides
WO2004020468A2 (en) * 2002-08-28 2004-03-11 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules for treatment of cancer
AU2003263552A1 (en) * 2002-09-09 2004-03-29 Nautilus Biotech Rational evolution of cytokines for higher stability, the cytokines and encoding nucleic acid molecules
CA2500626A1 (en) 2002-10-01 2004-04-15 Xencor, Inc. Interferon variants with improved properties
US20040070046A1 (en) 2002-10-15 2004-04-15 Hiroaki Niimi Reliable dual gate dielectrics for MOS transistors
TWI335920B (en) 2002-12-24 2011-01-11 Yasuhiro Kajihara Sugar chain asparagine derivatives, sugar chain asparagine and sugar chain and manufacture thereof
TWI247749B (en) 2002-12-26 2006-01-21 Yasuhiro Kajihara 3 branch type saccharide chain asparagine derivative, saccharide chain asparagine there of, saccharide chain there of, and method for producing same
PT1591532T (pt) 2003-02-04 2019-01-11 Glytech Inc Processo para produção de um derivado de asparagina de cadeia de açúcar
WO2004094392A1 (en) 2003-04-21 2004-11-04 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Process for the preparation of valsartan
WO2005010053A1 (ja) 2003-07-28 2005-02-03 Otsuka Chemical Co., Ltd. アミノ化複合型糖鎖誘導体及びその製造方法
JP4850514B2 (ja) 2003-08-25 2012-01-11 東レ株式会社 インターフェロンβ複合体
WO2005084303A2 (en) 2004-03-01 2005-09-15 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Interferon-beta polymer conjugates
RU2392963C2 (ru) 2004-08-09 2010-06-27 Элиоз Байофарма, Инк. Синтетические варианты гипергликозилированного протеазо-резистентного полипептида, пероральные композиции и способы применения таких вариантов
EP1789074A4 (en) 2004-08-09 2009-08-12 Alios Biopharma Inc PROTEASE-RESISTANT HYPERGLYCOSYL SYNTHETIC POLYPEPTIDE VARIANTS, ORAL FORMULATIONS AND METHODS OF USING THE SAME
KR100781666B1 (ko) 2004-11-02 2007-12-03 신영기 인간 인터페론-베타 변이체
US20070011055A1 (en) 2005-07-05 2007-01-11 Netfire 1 Pty Ltd E-commerce with direct access to real-time inventory
US20080003202A1 (en) * 2006-03-28 2008-01-03 Thierry Guyon Modified interferon-beta (IFN-beta) polypeptides
US20080096819A1 (en) 2006-05-02 2008-04-24 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
RU2539829C2 (ru) * 2007-06-19 2015-01-27 ГЛИТЕК,ИНК.,Япония Пептид glp-1 с присоединенной олигосахаридной цепью
DK2184290T3 (en) 2007-07-31 2015-05-26 Glytech Inc PROCEDURE FOR PEPTID PREPARATION
JP2009242372A (ja) * 2008-03-11 2009-10-22 Yokohama City Univ 均一な糖鎖構造を有するエリスロポエチン誘導体
RU2543157C2 (ru) 2008-06-17 2015-02-27 Глитек,Инк. Гликозилированный пептид glp-1
US8815580B2 (en) 2008-08-08 2014-08-26 Vib Vzw Cells producing glycoproteins having altered glycosylation patterns and method and use thereof
US20110262945A1 (en) 2008-08-19 2011-10-27 Otsuka Chemical Co., Ltd. Glycoprotein production method and screening method
WO2012051615A1 (en) * 2010-10-15 2012-04-19 Transgenrx, Inc. Novel vectors for production of glycosylated interferon
EP2684899B1 (en) 2011-03-10 2018-04-25 Glytech, Inc. Method for producing glycopeptide having sialyl sugar chain, sialyl sugar chain-added amino acid derivative to be used in same, and glycopeptide
JP6151640B2 (ja) * 2011-06-29 2017-06-21 協和発酵キリン株式会社 たん白質の精製方法
US10358470B2 (en) * 2011-10-01 2019-07-23 Glytech, Inc. Glycosylated polypeptide and pharmaceutical composition containing same

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