KR100781666B1

KR100781666B1 - 인간 인터페론-베타 변이체

Info

Publication number: KR100781666B1
Application number: KR1020040088196A
Authority: KR
Inventors: 신영기; 송경; 변태호; 이종민; 진재호
Original assignee: 신영기
Priority date: 2004-11-02
Filing date: 2004-11-02
Publication date: 2007-12-03
Also published as: PT1809661E; US20100003721A1; EP1809661A4; EP1809661A1; BRPI0517932A; KR20060039132A; DK1809661T3; JP2008518631A; BRPI0517932A8; ES2369088T3; CN101111519A; WO2006049423A1; CN101111519B; EP1809661B1; US8101716B2; ATE509951T1; JP4637913B2

Abstract

본 발명은 인간 인터페론-베타 변이체를 개시한다.

구체적으로 본 발명은 천연형 인간 인터페론-베타에 비하여 1개 또는 2개의 당쇄가 추가된 형태의 인간 인터페론-베타 변이체를 개시한다.

인간 인터페론-베타 변이체, 당쇄

Description

인간 인터페론-베타 변이체{Human Interferon-beta Mutein}

도 1은 인터페론-베타의 유전자 및 단백질의 서열을 나타낸 것이다. 인공 치환되는 아미노산 서열을 박스로 표시하였다.

도 2는 인간 인터페론-베타의 유전자의 특정된 부위에 유전자를 자리지정 돌연변이를 이용하여 인공 변이시키는 과정을 나타내는 모식도이다. 제1단계는 제작한 프라이머쌍이 특정부위 유전자 서열에 결합하여 DNA 중합효소에 의해 유전자가 치환된 유전자로 새롭게 합성되는 단계를 말한다. 제2단계로는 합성된 인터페론-베타 유전자를 포함한 PCR 반응액내 메틸화된 인터페론-베타 주형 유전자를 제한효소 Dpn I을 처리하여 제거한 후 대장균에 형질 전환시키는 단계를 나타낸다.

도 3은 인터페론-베타 변이체를 발현시키기 위한 발현벡터 pcDNA3.1-IFN-β의 조립 과정을 나타내는 모식도이다.

도 4는 인터페론-베타를 발현시키기 위한 발현벡터 pcDNA3.1-IFN-β와 psp72-DHFR을 동물세포에 주입하기 위해 코-트랜스펙션 시키는 과정을 나타내는 모식도이다.

도 5는 COS 세포를 이용하여 발현시킨 인터페론-베타 변이체를 전기영동하여 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸다. 또한 변이체를 N-glycanase 로 절단하고 이를 전기 영동하여 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸다. 1차 항체는 인간 인 터페론-베타에 대한 단일 클론 항체를 사용하였으며, 2차는 항 마우스 면역글로블린 토끼 항체에 HRP 효소 접합항체를 사용하였다.

도 6은 CHO세포 배양액으로부터 정제한 인터페론-베타 변이체의 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 7은 CHO 세포를 이용하여 발현시킨 인터페론-베타 변이체와 천연형 인터페론-베타의 항바이러스 활성을 비교한 결과를 나타낸 것이다.

도 8은 CHO 세포를 이용하여 발현시킨 인터페론-베타 변이체와 천연형 인터페론-베타의 세포성장에 대한 저해 효과를 비교한 결과를 나타낸 것이다.

도 9는 CHO 세포를 이용하여 발현시킨 천연형 인터페론-베타 및 인터페론-베타 변이체의 면역조절 기능을 A549 세포에서 MHC class Ⅰ의 활성화를 통해 측정하고 이를 비교한 결과를 나타낸 것이다.

도 10은 CHO 세포를 이용하여 발현시킨 천연형 인터페론-베타 및 인터페론-베타 변이체들의 랫트의 혈중내 시간별 잔류 농도를 나타낸 것이다.

본 발명은 인간 인터페론-베타 변이체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 천연형 인간 인터페론-베타에 비하여 1 또는 2개의 당쇄가 추가된 형태의 인간 인터페론-베타 변이체에 관한 것이다.

인터페론(IFNs)은 사이토카인의 일종으로서 항 바이러스 활성을 나타내고, 세포 증식을 억제하며, 자연 면역 반응을 조절하는 기능을 갖는데, 이 중 인터페론-베타(interferon-beta; IFN-β)는 5개의 알파 헬릭스를 가지고 있는 구형 단백질로서, 크기는 22 kD이며 당쇄를 제거하면 18 kD이 된다(Arduini 등 Protein Science 8: pp 1867-1877, 1999).

인터페론-베타의 임상 적용에 관한 연구는 활발하게 진행 중에 있고, 특히 다발성 경화증(Multiple Sclerosis)에 대한 증상의 완화, 경감 또는 치료제로 각광을 받고 있다(Goodkin 등 Multiple sclerosis: Treatment options for patients with relapsing-remitting and secondary progressive multiple sclerosis, 1999).

다발성 경화증 이외에도 인터페론-베타는 항바이러스 활성, 세포 성장 억제 또는 항 성장 활성, 림프구 세포 독성 증대 활성, 면역 조절 활성, 표적 세포의 분화 유도 또는 억제 활성, 대식세포의 활성화 활성, 사이토카인 생성의 증가 활성, 세포독성 T세포의 효과 증가 활성, 자연 살해 세포(natural killing cell)의 증가 활성 등의 다양한 면역학적 활성으로 암, 자가 면역 장애 및 바이러스 감염, HIV와 관련된 질병, C형 간염, 류마티스성 관절염 등에 치료 등의 효과가 있다는 보고가 있다(Pilling 등 European Journal of Immunology 29: pp 1041-1050, 1999, Young 등 Neurology 51: pp 682-689, 1998, Cirelli 등 1995 Major therapeutic uses of interferons. Clin Immunother 3: pp 27-87).

인간 인터페론-베타도 당단백질의 일종인데, 이러한 단백질에 연결된 당쇄 부분이 그 단백질의 활성에 중요한 역할을 한다.

따라서 당단백질의 경우 당쇄를 부가시키게 되면 그 활성이 증가하는 경우가 있을 수 있다.

국제특허공개 제96/25498호나 미국 특허 제5,618,698호는 당단백질인 hTPO, hEPO에 하나 이상의 당쇄를 도입함에 의하여 활성이 증가된 경우를 개시하고 있다.

본 발명도 전술한 바의 관점에서 당단백질인 인간 천연형 인터페론-베타에 당쇄를 도입시켜 그 활성이나 기능이 증가 또는 향상된 인간 인터페론-베타 변이체를 개시한다.

따라서 본 발명의 목적은 인간 천연형 인터페론-베타에 당쇄를 도입시켜 그 활성이나 기능이 증가 또는 향상된 인간 인터페론-베타 변이체를 제공하는 데 있다.

기타 본 발명의 다른 목적이나 다른 양태 등은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명은 일 측면에 있어서, 인간 인터페론-베타 변이체에 관한 것이다.

본 발명의 인간 인터페론-베타 변이체는 천연형 인간 인터페론-베타에 당쇄가 1개 내지 2개가 추가된 형태를 취함으로써, 천연형 인간 인터페론-베타에 비하여 향상 또는 증가된 항바이러스 활성, 세포 성장 억제 활성, 면역 조절 기능, 생체 내에서의 반감기를 보여준다(하기 도 7 내지 도 10 참조).

본 발명자들은 하기 실시예에서 확인되는 바와 같이 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 천연형 인간 인터페론-베타에서 27번 아미노산인 아르기닌(R)을 트레오닌(T) 또는 세린(S)으로 치환시키거나 그 천연형 인간 인터페론-베타의 C-말단에 글리신-아스파라긴-이소루이신-트레오닌-발린(G-N-I-T-V) 서열을 추가한 폴리펩티드를 동물 세포에서 발현 제조한 경우에 한 개 또는 두 개의 N-연결형 당쇄가 추가로 부가됨으로써 천연형 인간 인터페론-베타에 비하여 활성 또는 기능이 증가 또는 향상된 인간 인터페론-베타 변이체를 얻을 수 있었다.

본 발명은 이러한 실험 결과에 기초하여 제공되어 지는 것이다.

천연형 인간 인터페론-베타에 비하여 그 활성 또는 기능이 증가 또는 향상된 본 발명의 인간 인터페론-베타 변이체는, 천연형 인간 인터페론-베타 또는 천연형 인간 인터페론-베타 변이체에서 그 아미노산 서열의 C-말단에 글리신-아스파라긴-이소루이신-트레오닌-발린 서열을 포함하고, 그 위치에 N-연결형 당쇄를 포함함을 특징으로 한다.

청구범위를 포함하는 본 명세서에서 상기 "천연형 인간 인터페론-베타 변이체"는 천연형 인간 인터페론-베타에서 유래된 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 지니면서 인간 인터페론-베타의 활성을 지니는 모든 폴리펩티드를 포함하는 의미이다.

상기에서 "인간 인터페론-베타의 활성"이란 인간 인터페론-베타가 지닌다고 알려진 활성 중에서 어떠한 폴리펩티드가 인간 인터페론-베타로 동정되기에 충분한 하나 이상의 활성으로 정의된다. 그러한 활성으로서는 이미 전술한 바의 다발성경화증에 대한 경감, 완화 또는 치료 활성, 항바이러스 활성, 세포 성장 억제 활성, 항 성장 활성, 항 증식 활성, 림프구세포독성 증대 활성, 면역 조절 활성, 표적 세포의 분화 유도 또는 억제 활성, 사이토카인 생성의 증가 활성, 세포독성 T세포의 효과 증가 활성, 대식세포의 효과 증가 활성, 자연 살해 세포(natural killing cell)의 증가 활성, 암 예방 또는 치료 활성, 자가 면역 장애 예방 또는 치료 활성, 바이러스 감염 예방 또는 치료 활성, HIV와 관련된 질병의 예방 또는 치료 활성, C형 간염 예방 또는 치료 활성, 류마티스성 관절염 예방 또는 치료 활성 등을 예시할 수 있다.

또한 상기에서 "천연형 인간 인터페론-베타에서 유래된 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 지니는 폴리펩티드"란 천연형 인간 인터페론-베타의 아미노산 서열인 서열번호 1의 아미노산 서열 전체 또는 그 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드이거나 이러한 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드를 포함하는 의미이다.

여기서, 상기 "서열번호 1의 아미노산 서열 전체의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드"란 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 천연형 인간 인터페론-베타에 비하여 활성은 낮더라도 여전히 인간 인터페론-베타의 활성을 보유하는 서열번호 1의 아미노산 서열의 일부분을 포함하는 폴리펩티드로 정의되며, 상기 "서열번호 1에 개시된 아미노산 서열 전체 또는 그 실질적인 부분과 실질적으로 유사한 폴리펩티드"란 서열번호 1의 천연형 인간 인터페론-베타에 비하여 활성은 낮더라도 인간 인터페론-베타의 활성을 여전히 보유하면서 하나 이상의 치환된 아미노산을 포함하는 서열번호 1의 아미노산 서열 전체 또는 그 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드로 정의된다.

서열번호 1에 개시된 아미노산 서열 전체의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드로서 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에서 N-말단 부분 및/또는 C-말단 부분이 결실된 경우를 들 수 있고, 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열 전체 또는 그 실질적인 부분과 실질적으로 유사한 폴리펩티드로서 하나 이상의 아미노산이 치환되더라도 치환 전의 아미노산이 치환된 아미노산과 화학적으로 등가인 경우, 예컨대 소수성 아미노산인 알라닌이 다른 소수성 아미노산으로 치환된 경우, 특히 더 소수성인 아미노산, 예를 들면 발린, 류신 또는 이소류신으로 치환된 경우를 들 수 있다.

물론 경우에 따라서는, N-말단 부분, C-말단 부분, 또는 치환된 아미노산이 인간 인터페론-베타의 활성에 필수적인 모티프에 관여함으로써, N-말단 부분 및/또는 C-말단 부분이 결실된 폴리펩티드나 치환된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드가 인간 인터페론-베타의 활성을 나타내지 않는 경우가 있을 수 있겠지만, 그럼에도, 서열번호 1에서 유래한 위 폴리펩티드가 상기 예시된 활성들 중 하나 이상을 가지는가를 확인함을 통해서, 및/또는 그 밖에 본 발명의 출원시를 기준으로 당업계에 공지된 인간 인터페론-베타 동정과 관련된 방법을 통해서, 그러한 비활성의 폴리펩티드를 활성의 폴리펩티드와 구분하고 검출해내는 것은 당업자의 통상의 능력 범위 내에 속한다.

상술한 바들을 종합·고려할 때, 본 발명의 인간 인터페론-베타 변이체는 C-말단에 글리신-아스파라긴-이소루이신-트레오닌-발린 서열을 포함하고 그 위치에 N-연결형 당쇄를 포함하면서, 인간 인터페론-베타 활성을 지니는 하기의 폴리펩티드 중 하나로 정의되어 질 수 있다.

(a) 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열 전체를 포함하는 폴리펩티드;

(b) 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드;

(c) 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드

그러므로, 본 발명의 인간 인터페론-베타 변이체는 C-말단에 글리신-아스파라긴-이소루이신-트레오닌-발린 서열을 포함하면서 그 위치에 N-연결형 당쇄를 포함하는, 인간 인터페론-베타 활성을 지니는 모든 폴리펩티드로서 이해되어야 한다.

이처럼, 본 발명의 인간 인터페론-베타 변이체는 C-말단에 글리신-아스파라긴-이소루이신-트레오닌-발린 서열을 포함하면서 그 위치에 N-연결형 당쇄를 포함하는 인간 인터페론-베타 활성을 지니는 모든 폴리펩티드로서 정의되고 이해되지만, 그럼에도 바람직한 본 발명의 인간 인터페론-베타 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 천연형 인간 인터페론-베타의 C-말단에 글리신-아스파라긴-이소루이신-트레오닌-발린 서열을 포함하면서 그 위치에 N-연결형 당쇄를 포함하는 폴리펩티드이다.

또한 바람직한 본 발명의 인간 인터페론-베타 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열 전체 또는 그 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드(상기 (c)의 폴리펩티드)로서, C-말단에 글리신-아스파라긴-이소루이신-트레오닌-발린을 포함함으로써 그 위치에 N-연결형 당쇄를 포함하는 이외에, 서열번호 1의 27번 아미노산인 아르기닌이 트레오닌이나 세린으로 치환되어 아스파라긴-글리신-트레오닌/세린-루신으로 이루어진 서열번호 1의 25번 내지 28번의 아미노산 서열을 포함함으로써 그 위치에 N-연결형 당쇄를 추가로 포함하는 폴리펩티드이다.

상기 본 발명의 인간 인터페론-베타 변이체에서 가장 바람직한 형태는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 천연형 인간 인터페론-베타에서 27번 아미노산인 아르기닌이 트레오닌이나 세린으로 치환됨으로써 그 위치에 N-연결형 당쇄를 포함하고, 또 C-말단에 글리신-아스파라긴-이소루이신-트레오닌-발린 서열을 포함함으로써 그 위치에 N-연결형 당쇄를 추가로 포함하는 폴리펩티드이다.

본 발명의 하기 실시예는 천연형 인간 인터페론-베타에 비하여 당쇄가 2개 부가된 형태의 변이체가 당쇄가 1개 부가된 형태의 변이체보다 그 활성 또는 기능이 더 향상 또는 증가됨을 보여준다(하기 실시예 5 내지 6 및 첨부 도면 7 내지 10 참조).

한편, 본 발명의 인간 인터페론-베타 변이체는 다음과 같이 다른 방식으로 정의되는 것도 가능한데,

구체적으로 본 발명의 인간 인터페론-베타 변이체는 인간 인터페론-베타 활성을 지니는 하기의 폴리펩티드 중 하나로서, 서열번호 2의 아미노산 서열 중 아스파라긴-글리신-트레오닌/세린-루신으로 이루어진 25번 내지 28번의 아미노산 서열은 보존됨으로써 그 위치에 N-연결형 당쇄가 부가된 폴리펩티드로 정의될 수 있다.

(a) 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열 전체를 포함하는 폴리펩티드;

(b) 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드;

청구범위를 포함하는 본 명세서에서, 상기 "아스파라긴-글리신-트레오닌/세린-루신으로 이루어진 25번 내지 28번의 아미노산 서열이 보존된다"의 의미는 아스파라긴-글리신-트레오닌/세린-루신으로 이루어진 25번 내지 28번의 아미노산 서열은 상기 (b) 또는 (c)의 폴리펩티드(즉, 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드 또는 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열 전체 또는 그 실질적인 부분과 실질적으로 유사한 폴리펩티드를 말함)에서 반드시 존재한다는 의미이다.

본 발명의 인간 인터페론-베타 변이체가 상기와 같이 다른 방식으로 정의될 때, 바람직한 본 발명의 인간 인터페론-베타 변이체는 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열 전체를 포함하는 폴리펩티드로서 아스파라긴-글리신-트레오닌/세린-루신으로 이루어진 25번 내지 28번의 아미노산 서열 위치에 N-연결형 당쇄가 부가된 폴리펩티드이다.

상기 서열번호 2의 아미노산 서열은 천연형 아미노산 서열을 나타내는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 그 27번 위치의 아미노산인 아르기닌이 트레오닌/세린으로 치환된 서열이다.

한편, 상기에서 "서열번호 2에 개시된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드"나 "서열번호 2에 개시된 아미노산 서열 전체 또는 그 실질적인 부분과 실질적으로 유사한 폴리펩티드"의 의미에 대해서는 이미 정의된 바 그대로 유효하다.

본 발명은 다른 측면에 있어서, 전술한 바의 인간 인터페론-베타 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

여기서 "전술한 바의 인간 인터페론-베타 변이체"는 상기 두가지 방식으로 정의된 바의 본 발명의 인간 인터페론-베타 변이체와 그 각각의 바람직한 양태의 인간 인터페론-베타 변이체를 모두 포함하는 의미이다.

당업자라면 그의 통상의 능력을 활용하는 한 어떠한 아미노산 서열이 주여졌을 때 그 아미노산 서열에 기초하여 그러한 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 용이하게 제조할 수 있다.

청구범위를 포함하는 본 명세서에서 상기 "폴리뉴클레오티드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 RNA 또는 DNA의 중합체를 모두 포함하는 의미로서 정의된다.

한편, 활성이라는 측면에서 봤을 때, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 천연형 인간 인터페론-베타에서 그 C-말단에 글리신-아스파라긴-이소루이신-트레오닌-발린 서열이 부가된 인간 인터페론-베타 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 2로 이루어진 인간 인터페론-베타 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 바람직하고, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 천연형 인간 인터페론-베타에서 그 C-말단에 글리신-아스파라긴-이소루이신-트레오닌-발린 서열이 부가되는 한편 서열번호 1의 아미노산 서열의 27번 아미노산인 아르기닌이 트레오닌이나 세린으로 치환된 인간 인터페론-베타 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 더 바람직하다.

본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 동물세포에서 본 발명의 인간 인터페론-베타 변이체를 발현시킬 수 있는 전술한 바의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 동물 세포 발현 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 인간 인터페론-베타 변이체는 천연형 인간 인터페론-베타 변이체에 비하여 1 또는 2개의 당쇄를 추가로 포함하는데, 이러한 당쇄가 일반적으로 동물세포에서 일어나는 현상임을 고려할 때, 상기 동물 세포 발현 벡터는 구체적으로

(ⅰ) 전술한 바의 인간 인터페론-베타 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;

(ⅱ) 상기 (ⅰ)의 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결되어(operably linked) RNA 분자를 형성시키는 프로모터;

(iii) 리더서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;

(iv) 복제 기점; 및

(iv) 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위를 기본적으로 포함한다.

상기에서 프로모터로는 전사를 활성화시킬 수 있는 서열을 말하는데, 그러한 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 마찬가지로 번역된 단백질을 당화가 일어나는 소포체로 이동시키기는 상기 리더 서열과 mRNA를 안정화시키는 역할을 하는 상기의 3'-비-해독화 부위도 당업계에 공지되어 있다.

한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택적으로 리포터(예: 루시퍼라아제 및 β-글 루쿠로니다아제) 유전자나 선택 표지 유전자로서 항생제(예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 내성 유전자 등을 포함할 수 있으며, 또한 선택적으로 인핸서를 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 동물 세포 발현 벡터로서 사용될 수 있는 것으로는 pSV2-neo (서던과 베르그, J. Mol. Appl. Genet., 1, 327-341, 1982 참조), pCAGGS (니와 등, Gene, 108, 193-200, 1991), pcDL-SRα296 (타케베 등, Mol. Cell Biel., 8, 466-472,1988 참조), pAc373 (럭코우 등, Bio/Technology, 6,47-55, 1988 참조) 등을 예시할 수 있는데, 위 예시된 벡터들은 필요에 따라 전술한 바의 프로모터, 리더, 복제기점, 3'-비-해독화 부위, 리포터 유전자, 선택 표지 유전자, 인핸서 등을 포함할 수 있다.

본 발명은 또 다른 측면에 있어서 상기 발현 벡터로 형질전환된 동물세포 및 이러한 동물 세포를 배양하여 인간 인터페론-베타 변이체를 생산하는 방법에 관한 것이다.

청구범위를 포함하는 본 명세서에서 형질전환이란 외래성 폴리뉴클레오티드(본 발명에서는 인간 인터페론-베타 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 의미함)가 도입됨에 의한 숙주 세포의 유전자형의 변형을 의미하며, 그 형질전환에 사용된 방법과 상관없이 외래성 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포 내로 도입된 것을 의미한다. 숙주 세포내로 도입된 외래성 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포의 게놈내로 통합되어 유지되거나 통합되지 않고 유지될 수 있는데, 본 발명은 양자 모두 포함 한다.

한편, 상기에서 동물 세포란 재조합 단백질의 생산에 사용될 수 있는 포유 동물 세포와 곤충세포를 포함하는 의미인데, 본 발명에 사용될 수 있는 동물세포로서는 COS 세포, CHO 세포, C-127 세포, BHK 세포, 래트 Hep I 세포, 래트 Hep II 세포, TCMK 세포, 사람의 폐 세포, 사람의 간종양 세포, HepG2 세포, 마우스의 간세포, DUKX 세포, 293 세포 등을 들 수 있고, 곤충세포로서는 누에 배양 세포 등을 들 수 있다.

본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 전술한 바의 본 발명의 인간 인터페론-베타 변이체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한것이다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 인간 인터페론-베타는 다발성 경화증 치료제로서 주로 사용되어 왔지만, 암, 자가 면역 장애, 바이러스 감염, HIV와 관련된 질병, C형 간염 등의 치료에도 이용될 수 있다는 보고가 있으며(Pilling 등 European Journal of Immunology 29: pp 1041-1050, 1999), 그 약리 효과는 계속하여 보고되어지고 있다.

이러한 이유에서, 본 발명의 약제학적 조성물에 있어서의 약리 효과는 다발성 경화증 치료제로서의 약리 효과 뿐만 아니라, 기타의 인간 인터페론-베타가 가지는 모든 약리 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

또 그러한 약리 효과는 베타 인간 인터페론의 약리 효과로서 현재까지 알려진 약리 효과뿐만 아니라, 추후에 밝혀지게 될 약리 효과도 포함하는 의미로서 이 해되어져야 할 것이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명에 의하여 얻어지는 활성 또는 기능이 증가된 인간 인터페론-베타변이체를 포함함에 특징이 있는 것이기 때문에, 본 발명의 약제학적 조성물이 위 약물의 현재까지 알려진 약리 효과뿐만 아니라 추후에 밝혀지게 될 약리 효과를 포함하더라도, 본 발명의 범위가 부당하게 확대되는 것은 아니다.

그럼에도 인간 인터페론-베타변이체가 여전히 다발성 경화증 치료제로서 주로 사용되어 온 점, 그리고 이미 암, 자가 면역 장애, 바이러스 감염, HIV와 관련된 질병, C형 간염 등의 치료 효과는 이미 밝혀졌다는 점에서 상기 약리 효과는 이러한 약리 효과인 것이 바람직하다.

한편, 본 발명의 약제학적 조성물은 경구투여되거나 기타 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다.

또 상기 본 발명의 약제학적 조성물들은 여러 가지 제형으로 제제화할 수 있는데, 제제화할 경우에는 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제제화할 수 있다.

또한 본 발명의 약제학적 조성물들의 1일 투여량에 있어서 이미 당업계에 공지된 투여량으로 투여하면 되는데, 일반적으로 0.01 ~ 5 mg/kg 체중 범위에서, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 실제 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어지는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발 명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니된다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 돌연변이를 통해 하나 이상의 Asn-X-Ser/Thr 서열이 부가된 인터페론-베타 변이체 유전자 확보

서열번호 1의 인간 인터페론-베타(IFN-β)의 아미노산 서열(도 1) 중 R27(27번 위치의 아미노산인 아르기닌)을 트레오닌(T) 또는 세린(S)으로 인공 변이시키기거나 IFN-β의 C-말단에 글리신-아스파라긴-이소루이신-트레오닌-발린(G-N-I-T-V) 서열를 부가시키기 위해 서열번호 3의 천연형 인터페론-베타 유전자를 주형으로 하여 자리 지정 유전자 변이법(site-directed mutagenesis)/DNA 합성법을 사용하였다.

즉, 돌연변이를 시키고자 하는 부위를 대상으로 프라이머-세트를 제작하였다. 이때 인터페론-베타 변이 유전자를 수득하기 위해 사용되는 오버래핑 PCR을 위한 프라이머-세트는 다음과 같다.

ⅰ) R27T 제조용 프라이머-세트

R27T-5': GCAAT TGAAT GGGAC GCTTG AATAC TGCCT C (서열번호 4)

R27T-3': GAGGC AGTAT TCAAG CGTCC CATTC AATTG C (서열번호 5)

ⅱ) R27S 제조용 프라이머-세트

R27S-5': GCAAT TGAAT GGGAG TCTTG AATAC TGCCT C (서열번호 6)

R27S-3': GAGGC AGTAT TCAAG ACTCC CATTC AATTG C (서열번호 7)

iii)GNITV 제조용 프라이머-세트

GNITV-5': CTTAC AGGTT ACCTC CGAAA CGGTA ATATC ACTGT CTGAA

GATCTCCTAGCCTGTCC (서열번호 8)

GNITV-3': GAATG TCCAA TGGAG GCTTT GCCAT TATAG TGACA GACTT

CTAGAGGATCGGACAGG (서열번호 9)

(상기에서 R27T과 R27S는 각각 인터페론-베타 유전자를 변이시켜 27번 위치의 아르기닌이 트레오닌 또는 세린으로 치환된 단백질을 암호화하는 유전자를 말하고, GNITV는 인터페론-베타 유전자를 변이시켜 C-말단에 글리신-아스파라긴-이소루이신-트레오닌-발린(G-N-I-T-V)이 부가된 단백질을 암호화하는 유전자를 말한다. 이하 같다)

도 2에 나타낸 것과 같이, 주형으로 인터페론-베타 유전자가 포함된 플라스미드 pGEM-T Easy vector(Promega, USA)를 사용하였으며 2개의 오버래핑 프라이머-세트와 Pfu-turbo DNA 중합효소를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 방법을 통하여 시료는 5㎕의 10 × 반응완충용액에 5―50 ng의 주형 유전자와 125 ng의 프라이머쌍을 그리고 1㎕ dNTP mix를 첨가하여 최종적으로 초순수로 50㎕되게 부피를 맞추었고, 1㎕ Pfu Turbo DNA 중합효소(2.5 U/㎕)를 첨가하였다. 95℃에서 30초간 반응시켜 주형 유전자를 변성시킨 후 95℃에서 30초, 55℃에서 60초, 68℃에서 480초의 사이클을 12회 반복시켰다. PCR로 합성한 반응물에 1㎕ DpnI(10U/㎕)을 37℃에서 4시간 처리하여 메틸화된 주형 유전자를 제거하였다. DpnI 처리된 반응액을 얼음에서 녹인 XL1-blue 대장균세포에 1㎕의 반응액을 처리한 후 42℃에서 45초간 열을 가한 후 얼음으로 냉각시켰다. 대장균 세포에 500㎕의 배양배지를 첨가하여 37℃에서 1시간 배양한 후 원심분리를 통하여 세포를 회수하였다. 회수한 세포를 LB 한천배지에 도말하여 37℃에서 16시간 이상 배양한 후 콜로니 생성을 나타냈다. 콜로니의 플라스미드 DNA를 분리한 후, 인터페론-베타 변이체 유전자는 DNA 서열분석기을 통해 서열이 확인되었다. 그 결과 자리지정 유전자 돌연변이를 통하여 27번 위치의 아미노산이 트레오닌(R27T), 또는 세린(R27S)을 암호화하는 코돈으로 바꾸었다. 또한 천연 인간 인터페론-베타 C 말단에 글리신-아스파라긴-이소루이신-트레오닌-발린으로 이루어진 아미노산 서열(GNITV)을 암호화하는 코돈을 첨가하였다. 이를 포함한 플라스미드를 pGEMT-IFN-β-R27T, pGEMT-IFN-β-R27S, pGEMT-IFN-β-GNITV 라 명명하였다.

pGEMT-IFN-β-R27T와 pGEMT-IFN-β-R27S를 주형으로 하고 상기 기술한 GNITV용 오버래핑 프라이머-세트(iii)와 Pfu-turbo DNA 중합효소를 이용하여 동일한 조건으로 PCR을 수행한 후 상기에서와 같이 클로닝 하였다. 그 결과 27번 아미노산 위치에 트레오닌 또는 세린이 암호화되어 있고, 인터페론-베타 C 말단에 글리신-아스파라긴-이소루이신-트레오닌-발린으로 이루어진 아미노산 서열을 암호화하는 코돈이 첨가된 유전자를 확보하였다. 이를 포함한 플라스미들 pGEMT-IFN-β-R27T+GNITV, pGEMT-IFN-β-R27S+GNITV라고 명명하였다.

하기 <표 1>은 본 발명에 있어서 제조된 인터페론-베타 변이체 유전자 5 종 을 클로닝한 플라스미드를 나타낸 것이다.

[표 1]

인터페론-베타 변이체 유전자

실시예 2. 발현 벡터 제조 및 COS 세포로의 형질감염 및 세포 배양

실시예 1에서 제조된 인터페론-베타 변이체의 유전자들을 포함하는 플라스미들을 주형으로 이용하고 프라이머 P1(CCGGAATTCGCCACCATGACCAACAAGTGTCTCCTCCAAA, 서열번호 10)과 P2(CCGCTCGAGGTCACTTAAACAGCATCTGCTGGTTGA, 서열번호 11)를 사용하여 PCR을 수행하여, 인공 치환된 인터페론-베타를 암호화한 유전자들을 얻는다(도 3). 이때 DNA 중합효소(Stratagene)를 이용하고 이 유전자 말단은 제한효소 EcoRI와 XhoI 위치를 갖는다. pCDNA3.1 (Invitrogen사)와 위에서 증폭된 IFN-β유전자를 제한효소 EcoR I과 Xho I으로 각각 처리하였다. 아가로스 겔(Agarose gel)에서 선형화된 pcDNA3.1과 IFN-β변이체 유전자를 Qiagen 용출 키트를 이용하여 회수 한 후 라이게이션 반응을 거쳐 대장균 DH5α를 형질전환 시켰다. LB-암피실린 고체 배지에서 하룻밤 키운 후 나타난 콜로니로부터 플라스미드를 분리하였고 제한효소 EcoR I과 Xho I을 처리하여 1% agarose gel 전기영동으로 IFN-β 유전자가 삽입된 콜로니만을 선별하였다. 선별된 콜로니의 플라스미드 DNA의 IFN-β 유전자의 염기 서열을 확인하였다. 이 플라스미드를 pCDNA3.1-IFN-β-X (여기서 X는 인터페론-베타 변이체의 번호)라 명명하였다.

제조된 재조합 발현 벡터중 천연형 인터페론-베타, 인터페론-베타 변이체 R27T, R27S, R27T+GNITV, R27S+GNITV에 해당하는 발현 벡터를 각각 COS세포 (ATCC No. CRL-1650)에 형질감염 시켰다. 즉, 전배양한 COS세포를 2 × 10⁵ cells/㎖ 농도로 60mm 조직배양 플레이트에 접종한 후 24시간 동안 배양하였다. 상기에서 언급한 각각의 재조합 발현벡터 DNA 2㎍과 7㎕ 리포펙틴(Lipofectin^TM, Gibco BRL) 시약을 혈청을 함유하지 않은 DMEM 배지 100㎕에 각각 첨가하여 상온에서 15분 동안 반응시킨 후, 두 용액을 서로 혼합하여 다시 상온에서 15분 동안 반응시켜 리포펙틴-DNA 복합체를 형성하였다. 상기 리포펙틴-DNA 복합체에 혈청을 함유하지 않은 DMEM을 첨가한 후 이것을 COS 세포위에 살짝 얹어 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 6시간 동안 배양하여 형질 감염시켰다. 각각의 발현벡터가 형질 감염된 COS 세포는 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, JRH), 50㎍/㎖ 페니실린, 50㎍/㎖ 스트렙토마이신이 함유된 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 48 시간 동안 배양하였다. 배양하면서 3일에서 5일 동안 conditioned 배양액을 수집하였다.

실시예 3. 인터페론-베타 변이체의 특성확인

실시예 3-1. 당쇄 추가 확인

상기 실시예 2에서 기술한 형질감염된 COS세포로부터 1-2 ㎍의 재조합 인간인터페론-베타 및 인터페론-베타 변이체를 포함하는 배양 상층을 실온에서 항 인터페론-베타 토끼 다 클론 항체로 하룻밤 동안 면역침강(immunoprecipitation)하였다. 상기 항체가 포함된 배양 상층에 PBS(phosphate buffered saline)에 1:1로 현탁한 프로테인 A 세파로즈 레진을 20-80 ㎕ 첨가하고 상온에서 1시간동안 반응시켰다. 시료를 원심분리하고, 침전물을 PBS로 세척하였다. 침전물의 일부에 효소 N-glycanase을 처리하여 N-연결형 당쇄를 절단하였다. N-glycanase로 처리한 침전물과 처리하지 않은 침전물을 15% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 하였고, 나이트로 셀루로즈 멤버레인에 전이하고, Runkel 등이 발표한 방법(Runkel 등, Pharaceutical Research 15: pp 641-649, 1998)에 따라 항 인터페론-베타 마우스 단클론 항체를 이용한 웨스턴 블롯 방법으로 분석하였다.

인터페론-베타 변이체가 형질전환 된 COS 세포의 배양상층을 분석한 결과, 천연형 인터페론-베타에 비해 단백질 분자량의 증가가 확인되었다(도 5). 이러한 단백질 분자량이 증가된 인터페론-베타 변이체가 N-glycanase를 처리할 경우 당쇄가 제거되어 분자량이 감소하였다(도 5).

실시예 3-2. 인터페론-베타 변이체의 활성 비교

천연형 인터페론-베타와 인터페론-베타 변이체들의 활성을 비교하기 위해 EIA를 통해 인터페론 단백질의 양을 정량하였고, 항 바이러스 활성 시험법을 통해 천연형 인터페론-베타 및 인터페론-베타 변이체의 역가를 측정하였다.

EIA는 PBL사의 kit를 이용하여 제조사의 지침에 따라 실시하였다. 즉 효소면역측정 키트중의 항체흡착 플레이트의 지정된 각 웰에 희석액을 각각 100㎕씩 가하고 희석액으로 적절히 희석한 국제표준액 및 검액들을 100㎕ 가하여 잘 섞은 후 실온에서 1시간 반응시켰다. 이때 국제표준액은 인간 IFN-β 국제 표준(영국 NIBSC사) 앰플 한개를 제형완충액 1㎖에 녹인 후 바이알 당 100㎕씩 분주하여 -70℃에 보관하였으며, 사용할 때 -70℃에서 바이알을 꺼내 녹인 후 희석액으로 희석하여 사용하였다. 각 웰의 잔여 반응액을 제거하고 세척용액으로 250㎕씩 3회 세척 한 후 각 웰에 100㎕씩의 효소항체 접합체액을 가하고 다시 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 반응액을 제거하고 세척용액으로 200㎕씩 3회 세척한 후 잔여액을 모두 제거하고 조제한 기질-발색용액 100㎕씩을 가한 후 실온에서 30분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 각 웰에 반응정지액 100㎕씩을 가한 후 정지시키고 잘 섞은 후 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준액의 농도를 횡축, 흡광도(A450nm)를 종축으로 하여 표준곡선으로부터 국제표준액과 검액 각각의 흡광도에 따른 인간 IFN-β 농도 수치를 구하고 여기에 각각의 희석비를 곱하여 얻은 3가지 희석액 농도수치의 평균값을 계산하여 국제표준 샘플과 검액의 측정치를 구한 후 최종농도를 계산하였다. 항 바이러스 활성 시험법은 실시 예 6에 기술한 것과 동일한 방법으로 실시하였다. COS 세포에서 일시적인 발현된 여러 인터페론-베타 변이체의 배양액에서 EIA와 항 바이러스 역가측정비를 <표 2>에 나타내었다. 이러한 결과에 따라 당쇄가 부가 되어 분자량 증가가 확인되었고 천연형 인터페론-베타에 비하여 활성이 동일하 거나 증가하는 인터페론-베타 변이체임 알았다. 이러한 인터페론-베타 변이체을 대량 생산하기 위해 상기에서 언급한 인터페론-베타 변이체 발현벡터를 CHO 세포주에 형질 도입하였다.

[표 2]

인터페론-베타 변이체의 분자량 증가 및 항바이러스 역가/EIA 측정 비

++ 분자량이 26 kDa으로 1개의 당쇄가 부가됨.

++++ 분자량이 30 kDa으로 2개의 당쇄가 부가됨.

실시예 4. 형질감염(Transfection) 및 세포배양(CHO세포)

60mm 세포배양 용기에서 CHO세포(DG44)를 키워 40~80% 정도로 (1-4 X 10⁵세포/60mm 디쉬) 배양하였다. Gibco사의 Lipofectin 시약 3㎕와 세포 배지(α-MEM with media, 무혈청, 무항생제) 97㎕을 잘 혼합하고 플라스미드 pcDNA3.1-IFN- β-X DNA(0.1㎍/㎕ 이상, 약 2㎍)와 pSP72-DHFR(0.2㎍)을 첨가하여 실온에서 30분간 반응시킨 후 준비된 상기 세포에 가하였다(도 4). 1일 경과 후 G418을 500㎍/㎖ 되게 첨가한 배지로 교환(alpha-MEM with media, 10% FBS)하였다. 약 7~10일간 디 옥시리보뉴클레오시드(deoxyribonucleoside) 및 리보뉴클레오시드(ribonucleoside)가 결핍된 alpha-MEM 최소배지로 교체하여 배양함으로써 형질 감염된 세포를 선별하였다. 이후 CHO DHFR+ 형질감염체 세포들을 2차 선별하였다. 2차 선별된 CHO DHFR+ 형질감염체 세포들을 한계 희석법(limiting dilution)으로 96 well plate에 클론화하여 선별배지에서 계속 배양한 후 MTX(methotrexate, 미국 sigma사)농도를 20nM에서 1000nM까지 2배수로 점차 증가시키며, 10% 혈청 함유 최소배지에서 배양하면서 MTX 선별배지에서 성장하는 MTX저항성 클론들을 3차 선별하였다.

1μM에서 1개월 이상 배양하여 건강하게 자라는 세포주에 대해 단일세포 분리를 하였다. 먼저 96 well-multi plate의 각 웰 당 1개의 단일세포를 넣고 배양한 후 이중 단일세포만 들어간 것을 선별하였다. 이후 EIA정량분석을 통하여 발현양이 우수한 후보군을 선별하였다. 이렇게 선별한 후보군에 대해서 24well, 6well로 순차적으로 옮겨서 배양하였다. 이렇게 배양한 후보군을 EIA정량분석을 이용하여 재차 선별하여 최종 인터페론-베타 고발현 세포주를 확립하였다. 상기에서 제조된 재조합 CHO 세포주의 인터페론-베타 생성량 측정결과, 천연형 인터페론-베타 세포주는 1.8 ㎍/㎖/24hr인 반면 인터페론-베타 변이체를 생산하는 CHO-R27T 세포주는 6.5 ㎍/㎖/24hr, CHO-R27T-GNITV 세포주는 7.0 ㎍/㎖/24hr으로 IFN-β를 생산함을 확인하였고, 이는 천연형의 세포주 보다 3배 이상 높음을 알 수 있었다.

실시예 5. CHO 세포주에서 생산된 하나 이상의 당쇄가 부가된 인터페론-베타의 정제

상기 실시예 4에서 돌연변이 서열이 한 개 또는 한 개 이상이 배합이 된 세포주를 셀 팩토리 (cell factory; Nunc사, Cat No. 170069)를 사용하여 배양하였다. 10% FBS가 포함된 alpha-MEM 배지로 각 발현세포주를 5X10⁴ 세포/㎖로 셀 팩토리에 계대하고, 5% CO₂, 37 ℃에서 72시간 동안 배양하여 세포성장을 확인하였다. PBS로 3회 세척하여 혈청성분을 최대한 제거하고 무혈청 배지(Sigma C8730)으로 교체하였다. 무혈청 배지로 교체한 후 24시간 마다 배양액을 수확하고, 새로운 무혈청 배지를 첨가하였다. 총 4회 동안 배양액을 수확하였고 이를 정제하였다. 블루 세파로즈 레진(Amersham-Pharmacia) 200 ㎖를 XK50/20 칼럼 (Amersham-Pharmacia)에 충진 후 완충액 A (20mM 인산나트륨, 1M NaCl, pH 7.4)를 10 C.V.(column volume) 흘려주어 평형상태에 도달하게 하였다. 평형상태의 칼럼에 제균여과한 배양액을 20 ㎖/min유속으로 흘려주었고, 파장 280nm의 UV 검출기를 연결하여 모니터링 하였다. 완충액 B (20mM 인산나트륨, 1M NaCl, 30% Ethylen Glycol, pH 7.4)로 컬럼에 흘려주어 미흡착 성분을 세척하였고, 완충액 C (20mM 인산나트륨, 1M NaCl, 60% Ethylen Glycol, pH 7.4)로 레진에 붙은 단백질을 용출하였다. 용출액을 PBS(Phosphate Buffered Saline)으로 투석하였고, 농축기(Centricon, Cut off 10,000)로 농축하고 PBS(Phosphate Buffered Saline)으로 투석하였다.

실시예 6. CHO 세포주에서 생산된 하나 이상의 당쇄가 부가된 인터페론-베타의 이화학적 성질 분석

실시예 6-1. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯

상기 실시예 5에서 정제된 시료에 5X 샘플완충용액(125mM Tris-HCl, 5% SDS, 50% glycerol, 0.1% β-mercapto-ethanol, 1㎎/㎖ bromophenol blue)을 1 : 4의 비율로 혼합하고 95℃에서 5분 동안 전 처리 한 후 분자량 표준품과 함께 15% 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel)의 웰에 20㎕씩 로딩하여 전개하였다. 전기영동이 끝난 후, 쿠마시 블리런트 염색액으로 염색한 후, 탈색액으로 탈색한 결과, 천연형 인터페론-베타는 당쇄가 없는 단백질인 약 18.0 kDa의 band와 당쇄가 있는 단백질인 약 22.0 kDa의 band를 나타내며, 1개의 당쇄가 부가된 IFN-β은 약 26.0 kDa의 band가 추가되었고 2개의 당쇄가 부가된 IFN-β은 약 30.0 kDa의 band가 추가되는 것으로 확인되었다(도 6).

실시예 6-2. 당쇄 말단의 사이알릭산 부가의 확인 시험

정제된 단백질은 모두 PBL사에서 제공되는 Human IFN-β ELISA kit를 이용하여 인터페론-베타의 함량이 측정되었다. 그리고 Masaki Ito et al. Anal. Biochem. 300, 260 (2002)의 방법을 변형시켜 각 단백질의 사이알릭산 함량을 측정하였다. 사이알릭산은 80℃, 1시간동안 0.1N 염산으로 반응시켜 당단백질로부터 분리되었고, 이 중 일부가 Takara 사에서 공급되는 사이알릭산 형광표지kit를 이용하여 사이알릭산에 형광물질을 표지하고, HPLC에서 함량 분석되었다. 그 결과는 천연형 인터페론-베타와 인터페론-베타 변이체 대비 사이알릭산 무게의 % 비율로 <표 3>에 나타내었다.

[표 3]

인터페론-베타 변이체 사이알릭산 무게

(실시예 7) CHO 세포에서 발현된 인터페론-베타 변이체의 생물학적 활성

실시예 7-1. R27T , R27S 및 GNITV 인터페론-베타 변이체의 항바이러스 활성

R27T 및 R27T+GNITV, GNITV와 당쇄가 제거된 인터페론-베타(IFNβ-1b)의 항바이러스 활성을 천연형 인터페론-베타(IFNβ-1a)에 기준을 두고 상대 비교하였다. 천연형 인터페론-베타로는 Serono의 Rebif를 이용하였다.

A549 세포를 10% FBS, MEM 비필수 아미노산 100X 용액, 100 mM Sodium pyruvate로 보강된 MEM 배지에서 배양하였다. 분석 당일, 세포들을 상기와 같은 신선한 배지에 넣고 세포밀도는 3X10⁵개 세포/㎖로 조정하였다. 시험구 및 대조구 인터페론-베타들을 상기와 같은 배지로 희석하였다. 희석은 96-웰 멀티플레이트 내에서, 100 ㎕/웰을 함유하도록 이루어졌으며 2배씩 순차적으로 희석하였다. 모든 샘플들은 2벌씩으로 하였다. 100 ㎕ 배지만을 (인터페론-베타 없음) 함유하는 대조구 웰들도 포함하였다. 100 ㎕의 세포들을 각 웰에 첨가한 후 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 20시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트에서 배지를 제거하고 상기 배지로 희석한 EMCV (1000 TCID₅₀/㎖) 100 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 22시간 동안 인큐베이션한 후 배지를 제거하고 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 염색액을 제거한 후 2-methoxyethanol 100 ㎕를 첨가하여 염색액을 추출하고 450㎚에서 흡광도를 측정하여 항바이러스 활성을 결정하였다.

당쇄가 제거된 인터페론-베타(IFNβ-1b)는 동일 조건에서 낮은 활성을 보였으며 이에 비해 R27T 및 R27T+GNITV, GNITV은 천연형 인터페론-베타(IFNβ-1a;Rebif)와 비교해 높은 활성을 나타냈다. 당쇄가 2개 추가된 R27T+GNITV는 천연형에 비해 4배 정도 높은 활성을 보였으며 당쇄가 1개 추가된 R27T는 3배 정도 높은 활성을 나타냈다(도 7).

실시예 7-2. 세포성장의 억제

세포성장에 대한 인터페론-베타 변이체의 효과가 또한 조사되었다. 항바이러스 활성과 동일하게 천연형 인터페론-베타(IFNβ-1a)에 기준을 두고 상대 비교하였으며 천연형 인터페론-베타로는 Serono의 Rebif를 이용하였다. 항-증식 활성은 Daudi 세포를 이용해 조사되었다.

Daudi 세포를 100 U/㎖ 페니실린/100 ㎎/㎖ 스트렙토마이신 및 2 mM 글루타민, 10% FBS로 보강된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 시험구 및 대조구 인터페론-베타들을 10% FBS를 함유한 RPMI 1640 배지를 이용해 96-웰 멀티플레이트 내에서, 100 ㎕/웰을 함유하도록 2배씩 순차적으로 희석하였다. 모든 샘플들은 2벌씩으로 하였다. 세포를 96-웰 멀티플레이트에 1X10⁴ 개 세포/웰의 농도로 첨가하여 37 ℃, 5% CO₂에서 40 ~ 48시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, ³[H] 티미딘 1μCi이 포함된 배지 50㎕를 웰에 첨가하고 6시간 동안 인큐베이션시킨 후 세포를 수거하여 방사선활성의 혼입량을 측정하였다.

인터페론-베타 변이체는 Daudi 세포의 성장을 억제하였으며 활성은 투여량에 의존적이었다. 당쇄가 제거된 인터페론-베타(IFNβ-1b)는 낮은 항-증식 활성을 보였으며 R27T 및 R27T+GNITV, GNITV는 천연형 인터페론-베타(IFNβ-1a)보다 높은 활성을 보였다. 변이된 인터페론-베타의 활성은 R27T+GNITV, R27T, GNITV 순서로 나타났다(도 8).

실시예 7-3. 면역 조절 기능

천연형 인터페론-베타 및 변이체의 면역조절 기능은 A549 세포에서 MHC class Ⅰ의 활성화를 통해 측정하였다.

A549 세포는 10% FBS와 2mM 글루타민을 함유한 DMEM 배지에서 배양되었다. 세포를 2배씩 순차적으로 희석한 천연형 인터페론-베타 및 변이체, 당쇄가 없는 인터페론-베타(IFNβ-1b)이 첨가된 배지에 1X10⁵개 세포/㎖의 밀도로 접종하여 48시간 동안 37℃, 5% CO₂에서 인큐베이션하였다. 5mM EDTA가 첨가된 Hank's buffered salt 용액으로 세포를 처리한 후 원심분리로 수거하였다. 세포 응집체를 FACS 버퍼에 2 x 10⁷개 세포/㎖의 밀도로 풀어준 후 FACS 분석으로 MHC class Ⅰ의 발현량을 측정하였다. 비오틴과 커플링된 항 HLA ABC 항체와 플루오레세인과 커플링된 streptavidin이 측정에 이용되었으며 모든 샘플들은 2벌씩으로 하였다.

인터페론-베타 변이체의 면역증강 효과는 천연형 인터페론-베타(IFNβ-1a)와 유사하거나 조금 증진되는 것으로 나타났다. 상기된 다른 두 가지 활성에서와 동일하게 변이된 인터페론-베타의 효과는 GNITV, R27T, R27T+GNITV의 순서로 높아지는 것으로 나타났다. 당쇄가 부가되지 않은 인터페론-베타(IFNβ-1b)는 농도에 비해 낮은 면역조절 효과를 보였다(도 9).

실시예 7-4. 약물 속도론 상수 연구

체내 활성 실험은 CHO 세포에서 발현된 인터페론-베타 변이체를 투여한 랫트의 혈액 내 인터페론-베타 변이체의 시간별 농도변화를 측정하는 방법으로 실시하였다. 생체 내 활성실험에 사용된 실험동물은 Hsd:Sprague-Dawley 랫트 암컷으로 체중분포는 246.3～258.1 g이었으며, 항온(24± 1℃), 항습(55%), 조명시간 12시간에 설정된 동물실에서 1주 정도 순화 후 사용하였다. 시험기간 중에는 동물은 동일 사육실에서 사육하였다.

1군에 4마리가 되도록 체중을 지표로 한 층별 무작위 추출에 의해 랫트를 군 분리하고, 각각 천연형 인터페론-베타 투여군, 각 변이체 투여군 및 약제를 투입하지 않은 무처리군으로 설정하였다. 실험 2일전에 경정맥에 카테터를 시술하였다. 카테터 시술된 랫트의 평균체중은 253.5 g이었다.

천연형 인터페론-베타 및 각 인터페론-베타 변이체를 랫트의 미정맥으로 검체를 주사하였다. 주사후 1, 5, 15, 30 분, 1시간15분, 3시간, 5시간, 8시간에 해당되는 시점에 경정맥 카테터를 채혈전 식염수로 관을 세척하고 0.3 mL 채혈하였 다. 채혈후 카테터에는 헤파린식염수(50 IU/mL)로 채워 관이 막히는 것을 방지하였다. 채혈된 혈액은 즉시 항응고제 sodium citrate 4% 용액으로 처리하여 응고를 막고, 원심분리한 후 혈구를 제외한 혈장(plasma)을 모아 -70 ℃에 동결하였다. 실험동물의 혈액내 인터페론-베타의 양은 항바이러스 시험법으로 측정하였다. 도 10에는 천연형 인터페론-베타 및 변이체들의 랫트의 혈중내 시간별 잔류 농도를 나타내었다. 그리고 이러한 잔류농도를 근거로 약물속도론 상수들의 구하였다.

그 결과는 <표 4>에 나타난 바와 같다. 당쇄가 2개 추가된 R27T+GNITV, R27S+GNITV 인터페론-베타 변이체의 rat 체내 반감기는 천연형 인터페론-베타에 비해 3배의 반감기 증가 효과가 있었고, 그다음으로 당쇄가 1개 추가된 인터페론-베타 변이체 R27T, R27S, GNITV의 경우 천연형 인터페론-베타에 비해 2배의 반감기 증가 효과가 있었다.

[표 4]

인터페론-베타 변이체 및 천연형의 랫트에서의 반감기

상술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 인간 천연형 인터페론-베타에 비하여 그 활성이나 기능이 증가 또는 향상된 인간 인터페론-베타 변이체를 제공할 수 있 다.

본 발명의 인간 인터페론-베타 변이체는 천연형 인간 인터페론-베타 보다 1개 내지 2개의 당쇄를 추가적으로 포함함으로써, 천연형 인간 인터페론-베타에 비하여 향상 또는 증가된 항바이러스 활성, 세포 성장 억제 활성, 면역 조절 기능, 생체 내에서의 반감기를 가진다. 이것은 인간 인터페론-베타의 투여 용량 및 투여 횟수를 낮출 수 있다는 것을 의미한다.

한편, 본 발명에 따르면, 상기 인간 인터페론-베타 변이체를 암호화하는 유전자와 이러한 유전자를 포함하는 동물 세포 발현 벡터, 이러한 발현 벡터로 형질전환된 동물 세포, 이러한 동물 세포를 배양하여 인간 인터페론-베타 변이체를 제조하는 방법, 및 인간 인터페론 변이체를 포함하는 약제학적 조성물이 아울러 제공된다.

<110> Samsung Fine Chemicals Co., Ltd. <120> Human Interferon-beta Mutein <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln 1 5 10 15 Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu 20 25 30 Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln 35 40 45 Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln 50 55 60 Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 65 70 75 80 Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn 85 90 95 His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr 100 105 110 Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 115 120 125 Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr 130 135 140 Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu 145 150 155 160 Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 165 <210> 2 <211> 166 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 2 Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln 1 5 10 15 Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Thr/Ser Leu Glu Tyr Cys Leu 20 25 30 Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln 35 40 45 Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln 50 55 60 Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 65 70 75 80 Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn 85 90 95 His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr 100 105 110 Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 115 120 125 Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr 130 135 140 Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu 145 150 155 160 Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 165 <210> 3 <211> 498 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgagctaca acttgcttgg attcctacaa agaagcagca attttcagtg tcagaagctc 60 ctgtggcaat tgaatgggag gcttgaatat tgcctcaagg acaggatgaa ctttgacatc 120 cctgaggaga ttaagcagct gcagcagttc cagaaggagg acgccgcatt gaccatctat 180 gagatgctcc agaacatctt tgctattttc agacaagatt catctagcac tggctggaat 240 gagactattg ttgagaacct cctggctaat gtctatcatc agataaacca tctgaagaca 300 gtcctggaag aaaaactgga gaaagaagat tttaccaggg gaaaactcat gagcagtctg 360 cacctgaaaa gatattatgg gaggattctg cattacctga aggccaagga gtacagtcac 420 tgtgcctgga ccatagtcag agtggaaatc ctaaggaact tttacttcat taacagactt 480 acaggttacc tccgaaac 498 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 gcaattgaat gggacgcttg aatactgcct c 31 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gaggcagtat tcaagcgtcc cattcaattg c 31 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 gcaattgaat gggagtcttg aatactgcct c 31 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 gaggcagtat tcaagactcc cattcaattg c 31 <210> 8 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 cttacaggtt acctccgaaa cggtaatatc actgtctgaa gatctcctag cctgtcc 57 <210> 9 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 gaatgtccaa tggaggcttt gccattatag tgacagactt ctagaggatc ggacagg 57 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 ccggaattcg ccaccatgac caacaagtgt ctcctccaaa 40 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 ccgctcgagg tcacttaaac agcatctgct ggttga 36

Claims

인간 인터페론-베타의 C-말단에 글리신-아스파라긴-이소루이신-트레오닌-발린(GNITV) 서열이 부가되고, 상기 부가 서열의 아스파라긴 잔기에 N 연결형 당쇄를 포함하는 인간 인터페론-베타 변이체.
제1항에 있어서, 상기 인간 인터페론-베타는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 인터페론-베타 변이체.
제1항에 있어서, 상기 인간 인터페론-베타는 추가적으로 27번째 아미노산인 아르기닌이 트레오닌이나 세린으로 치환되어 25번째 아미노산인 아스파라긴 잔기에 N-연결형 당쇄를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 인터페론-베타 변이체.
삭제
인간 인터페론-베타의 27번째 아미노산인 아르기닌이 세린 또는 트레오닌으로 치환되어 25번째 아미노산인 아스파라긴 잔기에 N 연결형 당쇄를 포함하는 인간 인터페론-베타 변이체.
제5항에 있어서,인간 인터페론-베타는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 인간 인터페론-베타 변이체.
제1항 내지 제3항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항 기재의 인간 인터페론-베타 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
제7항에 있어서,

상기 인간 인터페론-베타 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 C-말단에 글리신-아스파라긴-이소루이신-트레오닌-발린 서열을 포함하는 인간 인터페론-베타 변이체인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제7항에 있어서,

상기 인간 인터페론-베타 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 인간 인터페론-베타 변이체인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제7항에 있어서,

상기 인간 인터페론-베타 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열의 C-말단에 글리신-아스파라긴-이소루이신-트레오닌-발린 서열을 포함하는 인간 인터페론-베타 변이체인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제7항 기재의 폴리뉴클레오티드를 포함함으로써 동물 세포에서 인간 인터페론-베타를 발현시키는 발현 벡터.
제11항 기재의 발현 벡터로 형질 전환된 동물 세포.
제12항 기재의 동물 세포를 배양하는 단계를 포함하는 인간 인터페론-베타 변이체의 제조 방법.
삭제
제1항 내지 제3항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항 기재의 인간 인터페론-베타 변이체를 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물로서,

상기 약제학적 조성물은 천연형 인간 인터페론-베타가 가지는 약리 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제15항에 있어서,

상기 약제학적 조성물은 천연형 인간 인터페론-베타가 가지는 약리 효과를 가지고, 그 약리 효과는 다발성 경화증, 암, 자가 면역 장애, 바이러스 감염, HIV와 관련된 질병, C형 간염으로 구성된 군에서 선택되는 질병의 예방 또는 치료의 약리 효과인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.