KR101671501B1 - 페길화된 인터페론-베타 변이체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 페길화된 IFN-β 변이체 및 이를 유효성분으로 포함하는 과대증식성 질환, 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 페길화된 IFN-β 변이체는 천연형 IFN-β와 비페길화 IFN-β 변이체에 비하여 우수한 약동학적 성질로 인해 뛰어난 항-바이러스 효능, 면역 조절기능 및 항-세포 성장 효능을 갖는바 다양한 질환에 유용하게 이용될 수 있다. 본 발명은 투여 시 뛰어난 약리활성 효과를 나타내고, 기존 인터페론 제제보다 혈중 반감기가 유의하게 증가하는바 투여 측면에서 환자 편이성이 우수하다.

Description

페길화된 인터페론-베타 변이체{PEGylated Interferon-beta Variants}
본 발명은 페길화된 인터페론-베타 변이체에 관한 것이다.
인터페론(IFNs)은 사이토카인의 일종으로서 항-바이러스 활성을 나타내고, 세포 증식을 억제하며, 자연 면역 반응을 조절하는 기능을 갖는다. 이중 인터페론-베타(IFN-β)는 5개의 알파 헬릭스를 가지는 22 kDa의 구형 단백질로서 당쇄를 제거하면 18 kDa이 된다(Arduini et al., Protein Science 8:1867-1877(1999)).
IFN-β의 임상 적용에 관한 연구는 활발하게 진행 중에 있고, 특히 다발성 경화증(Multiple Sclerosis)에 대한 증상의 완화, 경감 또는 치료제로 각광을 받고 있다(Goodkin et al., Multiple sclerosis: Treatment options for patients with relapsing-remitting and secondary progressive multiple sclerosis, 1999). 다발성 경화증 이외에도 IFN-β는 항-바이러스 활성, 세포성장 억제 또는 항-성장 활성, 림프구 세포독성 증대 활성, 면역 조절 활성, 표적세포의 분화 유도 또는 억제 활성, 대식세포의 활성화 활성, 사이토카인 생성의 증가 활성, 세포독성 T세포의 효과 증가 활성, 자연 살해 세포(natural killing cell)의 증가 활성 등의 다양한 면역학적 활성으로 암, 자가 면역 질환 및 바이러스 감염, HIV와 관련된 질병, C형 간염, 류마티스성 관절염 등에 치료 등의 효과가 있다고 보고되어 있다(Pilling et al., European Journal of Immunology 29:1041-1050(1999), Young et al., Neurology 51:682-689(1998), Cirelli et al., Major therapeutic uses of interferons, Clin. Immunother. 3:27-87(1995)).
그러나, 혈액 및 조직에 존재하는 펩타이드의 경우 그 체내 반감기가 수 분 정도로 아주 짧은 것으로 알려져 있으며, IFN-β와 같은 단백질 치료제의 생물학적 이용도는 짧은 혈장 반감기 및 프로테아제 열화에 대한 감수성에 의해 종종 제한되어, 최대 임상 효능을 이루기가 어렵다. 따라서, IFN-β의 의약품으로 개발하기 위해서는 알려진 면역조절, 항바이러스 효과 및 항-성장/증식 효과를 더욱 향상시키는 것 외에도 체내에서의 안정성 개선이 필수적이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 IFN-β의 면역조절 활성, 세포증식 억제활성 및 항-바이러스 활성 등을 더욱 향상시킴으로써 다양한 질병에 대한 치료효과가 크게 개선된 IFN-β 변이체를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 특정 아미노산을 치환하거나 초당화를 유도한 IFN-β 변이체에 폴리에틸렌글리콜 유도체를 결합시킨 접합체(conjugate)가 천연형 IFN-β와 비페길화 IFN-β 변이체에 비해, 향상된 약동학적 프로파일(pharmacokinetic profile)과 약리적 성질을 가지고 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 페길화된(PEGylated)된 IFN-β 변이체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 과대증식성 질환(hyperproliferative disease), 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 페길화된(PEgylated) IFN-β(interferon-beta) 변이체로서, 상기 IFN-β 변이체는 이의 아민기, 카르복실기 또는 Cys 잔기에 CH3O-(CH2CH2O)n(n은 2-4000의 정수)이 카보닐, 아미드, 우레탄, 이차 아민, 티오에테르, 디설파이드 또는 하이드라존을 통하여 공유결합 되어 페길화되고, 서열목록 제1서열의 27번째 Arg 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 것인 페길화된 IFN-β 변이체를 제공한다.
본 발명자들은 IFN-β의 면역조절 활성, 세포증식 억제활성 및 항-바이러스 활성 등을 더욱 향상시킴으로써 다양한 질병에 대한 치료효과가 크게 개선된 IFN-β 변이체를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 특정 아미노산을 치환하거나 초당화를 유도한 IFN-β 변이체에 폴리에틸렌글리콜 유도체를 결합시킨 접합체가 천연형 IFN-β와 비페길화 IFN-β 변이체에 비해, 향상된 약동학적 프로파일과 약리적 성질을 가지고 있음을 확인하였다.
본 발명에 따르면, 서열목록 제1서열의 아미노산 서열은 인간의 IFN-β의 아미노산 서열이다. 본 발명은 서열목록 제1서열의 27번째 Arg 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 IFN-β 변이체에 관한 것이다.
본 발명의 IFN-β 변이체의 범위에는 서열목록 제1서열의 27번째 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 아미노산 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.
또한, 본 발명의 IFN-β 변이체의 범위에는 27번째 아미노산 잔기의 변이 외에 추가적인 변이를 갖는 아미노산 서열 변이체도 포함되는 것으로 해석된다. 이러한 변이체에는 본 발명의 IFN-β 변이체의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 및 Asp/Gly 간의 교환이다.
경우에 따라서는 IFN-β 변이체는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation) 또는 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 IFN-β 변이체는 서열목록 제1서열의 27번째 Arg 잔기가 Thr 또는 Ser 잔기로 치환된 아미노산 서열을 갖는다.
하나의 특정예에서, 본 발명의 IFN-β 변이체는 서열목록 제1서열의 27번째 Arg 잔기가 Thr 잔기로 치환된 아미노산 서열을 갖는다.
본 명세서에서 사용된 용어, "페길화(PEGylation)"는 CH3O-(CH2CH2O)n(n은 2-4000의 정수)으로 표현되는 구조식을 포함하는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 유도체를 IFN-β에 컨쥬게이션 시키는 것을 의미한다. 상기 폴리에틸렌글리콜 유도체는 페길화를 위한 다양한 말단기를 포함하며, 이에 따라 상기 폴리에틸렌글리콜 유도체는 카보닐, 아미드, 우레탄, 이차 아민, 티오에테르, 디설파이드 및 하이드라존을 통하여 IFN-β 변이체의 아민기, 카르복실기 또는 Cys 잔기에 공유결합 될 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 페길화된 IFN-β 변이체는 일 말단에 메톡시기를 가지며, 타 말단에 알데하이드, 하이드라지드, 말레이미드, 숙신이미드 또는 o-피리딜 디설파이드(orthopyridyl disulfide)를 갖는 폴리에틸렌글리콜 유도체로 페길화되어 형성된다.
본 발명의 보다 구체적인 일구현예에 따르면, 상기 페길화된 IFN-β 변이체는 하기의 화학식 1로 표시되는 폴리에틸렌글리콜 유도체로 페길화되어 형성된다:
화학식 1
CH3O-(CH2CH2O)n-R1-X-R2
상기 화학식에서, X는 -C=O- 또는 S이고;
X가 -C=O-인 경우, R1은 C1-C4 알킬렌, C1-C4 알킬렌옥시, C1-C4 알킬렌옥시 C1-C3 알킬렌 또는 C1-C4 알킬렌아미노이고; R2는 수소, 하이드라지드, NHS(N-Hydroxysuccinimide), 말레이미드 C1-C4 알킬렌 또는 o-피리딜 디설파이드 C1-C4 알킬렌이며;
X가 S인 경우, R1은 S이고, R2는 o-피리딘이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "알킬렌"은 직쇄 또는 분쇄의 포화 탄화수소기로부터 유래한 이가(bivalent) 라디칼을 의미하며, 예를 들어 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 이소프로필렌 등을 포함한다. C1-C4 알킬렌은 탄소수 1 내지 4의 알킬렌 유니트를 가지는 이가 라디칼을 의미하며, C1-C4 알킬렌이 결합된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "알킬렌옥시"는 알코올에서 산소에 결합한 수소 및 탄소에 결합한 수소가 각각 제거되어 형성된 이가(bivalent) 라디칼을 의미하며, C1-C4 알킬렌옥시가 결합한 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "알킬렌아미노"는 알킬아민에서 질소에 결합한 수소 및 탄소에 결합한 수소가 각각 제거되어 형성된 이가(bivalent) 라디칼을 의미하며, C1-C4 알킬렌옥시가 결합한 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 화학식 1의 R1은 에틸렌, 에틸렌옥시, 에틸렌옥시메틸렌 또는 에틸렌아미노이고; R2는 수소, 하이드라지드, NHS(N-Hydroxysuccinimide), 말레이미드 에틸렌 또는 o-피리딜 디설파이드 에틸렌이다.
예를 들어, 본 발명에서 이용 가능한 상기 화학식 1의 폴리에틸렌글리콜 유도체는 다음과 같다:
화학식 2
Figure 112015072135198-pat00001
화학식 3
Figure 112015072135198-pat00002
화학식 4
Figure 112015072135198-pat00003
화학식 5
Figure 112015072135198-pat00004
화학식 6
Figure 112015072135198-pat00005
화학식 7
Figure 112015072135198-pat00006
상기 화학식 2 내지 7에서, n은 2-4000의 정수이다.
본 발명에서 페길화에 이용되는 PEG 유도체는 그 분자량에 특별한 제한은 없다. 본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 IFN-β 변이체는 2-50 kDa, 5-50 kDa 또는 10-40 kDa의 분자량을 갖는 PEG 유도체로 페길화된다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 IFN-β 변이체의 페길화는 모노-페길화(mono-PEGylation)이다. 상기 용어, "모노-페길화"는 IFN-β의 특정 위치에 PEG 유도체 단일 분자를 컨쥬게이션 시키는 것을 의미한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 페길화된 IFN-β 변이체를 유효성분으로 포함하는 과대증식성 질환, 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
인간 IFN-β는 다발성 경화증 치료제로서 주로 사용되어 왔지만, 암, 자가 면역 장애, 바이러스 감염, HIV와 관련된 질병 및 C형 간염 등의 치료에도 이용될 수 있음이 알려져 있으며(Pilling 등 European Journal of Immunology 29: pp 1041-1050, 1999), 그 약리 효과는 계속하여 보고되어지고 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에는 약제학적으로 허용되는 담체가 포함될 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여, 관절강 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 정맥주사, 피하주사 또는 근육주사로 투여된다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 조성물은 정맥주사, 피하주사 및 근육주사 시에 우수한 약동학적 특성을 가지며(도 4-6 참조), 특히 피하주사의 경우 RebifR에 비해 약 13배의 AUC를 가지고 있어 기존의 인터페론 제제보다 투여 효율이 크게 개선되었는바 투여 측면에서 환자 편이성이 우수하다(도 5 참조).
본 명세서에서 사용된 용어, "과대증식성 질환"은 세포의 병적인 증식 또는 과도한 혈관의 신생에 의해 유발되는 종합적인 병적상태(pathologic condition)를 망라한다. 과대증식성 질환의 예에는 암, 당뇨성 망막증, 류마티스 관절염, 건선, 만성염증, 죽상경화증, 비만, 황반변성 및 심혈관 질환 등이 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료되는 과대증식성 질환은 암이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료되는 염증성 질환은 만성폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 패혈성 쇼크(septic shock), 사구체 신염, 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 아테롬성 동맥경화증, 당뇨 및 뇌졸중으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료되는 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 건선, 알러지성 피부염, 다발성 경화증 및 천식으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은, 예를 들어 1일 당 0.0001-100 mg/kg이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 페길화된 IFN-β 변이체 및 이를 유효성분으로 포함하는 과대증식성 질환, 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
(ⅱ) 본 발명의 페길화된 IFN-β 변이체는 천연형 IFN-β와 비페길화 IFN-β 변이체에 비하여 우수한 약동학적 성질로 인해 뛰어난 항-바이러스 효능, 면역 조절기능 및 항-세포 성장 효능을 갖는바 다양한 질환(이상증식성 질환, 염증성 질환, 자가면역 질환 및 바이러스 감염 질환 등)에 유용하게 이용될 수 있다.
(ⅲ) 본 발명은 투여 시 뛰어난 약리활성 효과를 나타내고, 기존 인터페론 제제보다 혈중 반감기가 유의하게 증가하는바 투여 측면에서 환자 편이성이 우수하다.
도 1은 IFN-β 변이체(R27T)의 N-말단에 선별적으로 PEG를 접합하여 mPEG-R27T 접합체를 합성하는 공정의 모식도를 나타낸다.
도 2는 제작된 다양한 크기의 mPEG-R27T 접합체를 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 제작된 mPEG-R27T 접합체를 크기별 배제 크로마토그램(size exclusion chromatogram)으로 분석하여 크기별로 분석하고, mono-mPEG-R27T 접합체의 생성율을 계산한 결과를 나타낸다.
도 4는 제작된 mono-mPEG-20K-R27T 및 mono-mPEG-40K-R27T 접합체와 대조약물을 쥐에 정맥주사로 투여하여 약물약동학적 분석을 수행한 결과를 나타낸다.
도 5는 제작된 mono-mPEG-20K-R27T 및 mono-mPEG-40K-R27T 접합체와 대조약물을 쥐에 피하주사로 투여하여 약물약동학적 분석을 수행한 결과를 나타낸다.
도 6은 제작된 mono-mPEG-20K-R27T 및 mono-mPEG-40K-R27T 접합체와 대조약물을 쥐에 근육주사로 투여하여 약물약동학적 분석을 수행한 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명에서 이용되는 다양한 PEG 유도체들의 구조를 나타낸다.
도 8은 Superdex-200 크기 배제 크로마토그래피로 분리 정제된 mPEG-20K- SC-R27T 접합체의 HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 9a는 Zorbax-250 크로마토그래피로 2차 분리된 mono-mPEG-20K-SC-R27T 접합체의 HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 9b는 도 8에서 분리 정제된 mPEG-20K-SC-R27T 접합체에 대한 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸다.
도 10a는 Superdex-200 크기 배제 크로마토그래피로 분리 정제된 mPEG- 20KHz-R27T 접합체의 HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 10b는 도 10a에서 분리 정제된 mPEG-20K-Hz-R27T 접합체에 대한 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸다.
도 11은 mono-mPEG-20K-ALD7-R27T(pH 7.0) 접합체의 HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 12a는 이온교환칼럼을 이용한 mPEG-20K-ALD7-R27T 접합체(pH 7.0)의 분리 정제 결과를 나타낸다.
도 12b는 도 12a에서 분리 정제된 R27T 접합체에 대한 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸다.
도 13은 mono-mPEG-20K-ALD6-R27T 접합체(pH 6.0)의 HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 14a는 이온교환칼럼을 이용한 20K-ALD6-R27T(pH 6.0)의 분리 정제 결과를 나타낸다.
도 14b는 도 14a에서 분리 정제된 mPEG-20K-ALD6-R27T 접합체(pH 6.0)에 대한 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸다.
도 15는 mono-mPEG-30K-ALD4.4-R27Tβ(pH 4.4)접합체의 HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 16a는 이온교환칼럼을 이용한 mPEG-30K-ALD4.4-R27T 접합체(pH 4.4)의 분리 정제 결과를 나타낸다.
도 16b는 mPEG-30K-ALD4.4-R27T 접합체(pH 4.4)에 대한 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸다.
도 17은 mono-mPEG-30K-ALD6-R27T 접합체(pH 6.0)의 HPLC 프로파일을 나타낸 다.
도 18a는 이온교환칼럼을 이용한 mPEG-30K-ALD6-R27T 접합체(pH 6.0)의 분리 정제 결과를 나타낸다.
도 18b는 도 18a에서 분리 정제된 mPEG-30K-ALD6-R27T 접합체(pH 6.0)에 대한 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸다.
도 19는 mono-mPEG-30K-ALD7-R27T 접합체(pH 7.0)의 HPLC 프로파일을 나타낸 다.
도 20a는 이온교환칼럼을 이용한 mPEG-30K-ALD7-R27T 접합체(pH 7.0)의 분리 정제 결과를 나타낸다.
도 20b는 도 20a에서 분리 정제된 mPEG-30K-ALD7-R27T 접합체(pH 7.0)에 대한 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸다.
도 21a는 Zorbax-250 크로마토그래피로 mPEG-20K-Mal-R27T 접합체의 분리 정제 결과를 나타낸다.
도 21b는 도 21a에서 분리 정제된 mPEG-20K-Mal-R27T 접합체에 대한 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸다.
도 22는 mono-mPEG-20K-SC-R27T 접합체의 생물학적 활성 분석결과를 나타낸다.
도 23은 mono-mPEG-20K-Hz-R27T 접합체의 생물학적 활성 분석결과를 나타낸다.
도 24는 mono-mPEG-20K-ALD7-R27T 접합체의 생물학적 활성 분석결과를 나타낸다.
도 25는 mono-mPEG-30K-ALD4.4-R27T 접합체의 생물학적 활성 분석결과를 나타낸다.
도 26은 mono-mPEG-20K-Mal-R27T 접합체의 생물학적 활성 분석결과를 나타낸다.
도 27은 R27T와 mPEG-OPSS-20K의 반응물, 분리한 mono-mPEG-OPSS-R27T 및 R27T 원물질의 크기 배제 크로마토그램들을 나타낸다.
도면 중 RBL-IFN β는 R27T를 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1. 인간 IFN-β변이체의 N-말단 특이적 페길화
인간 IFN-β 변이체(R27T)의 N-말단에 선택적으로 PEG를 결합시키기 위하여, 약산성 조건에서 모노메톡시 PEG-알데하이드(monomethoxy PEG-aldehyde, m-PEG-ALD)를 이용하여 부착실험을 실시하였으며, 도 1에 개략적인 합성과정을 나타내었다. 사용한 m-PEG-ALD는 평균분자량이 각각 10, 20, 30 및 40 kDa에 해당하는 mPEG-10K-ALD, mPEG-20K-ALD, mPEG-30K-ALD 및 mPEG-40K-ALD(NOF Corp., Japan)를 사용하였으며, R27T는 CHO 세포주에서 발현하여 분석완료한 단백질(에이비온(주), 한국)을 사용하였으며, 0.864 mg/㎖의 농도로 측정한 R27T 1 ㎖에 1:2 (R27T:PEG)의 몰비가 되도록 PEG 용액을 가하여 실험을 하였다. R27T와 PEG를 혼합 후 최종 농도가 20 mM이 되도록 소듐 시아노보로하이드라이드(와코, 일본)를 가하고, 5초 간 잘 섞어준 다음, 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다.
실시예 2. 인간 IFN-β변이체의 N-말단 특이적 페길화 확인
R27T의 N-말단 페길화를 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 수행하였다. 도 2와 같이 레인 2는 R27T이고, 레인 3은 대조약물인 천연형 IFN-β이며, 레인 4-7은 R27T와 각 크기별 mPEG-ALD 간의 반응물들이다. 도 2를 통하여 모노 페길화된(mono-PEgylated) mono-mPEG-R27T가 생성되었음을 확인할 수 있었다.
실시예 3. Mono-mPEG-R27T의 분리
페길화 반응 후, mono-mPEG-R27T를 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 이용하여 분리하였다. 컬럼은 Superose 6 10/300 GL(GE Healthcare, 미국)을 사용하였고, 이동상은 20 mM 포스페이트 완충액(pH 5.0)을 0.5 ㎖/분의 유속으로 흘렸으며, UV 215 nm에서 용출되는 단백질을 검출하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, 비변형 R27T는 41.8분에, mono-PEG-10K-R27T는 32.6분에, mono-PEG-20K-R27T는 29.4분에, mono-mPEG-30K-R27T는 27.1분에, mono-mPEG-40K-R27T는 25.5분에 각각 분자 크기별로 용출되었다. 추가 분석을 위하여 각 분자량의 mono-mPEG-R27T에 해당되는 분획만을 분리하여 Amicon Ultra-4(Milipore, 미국)를 이용하여 농축하였다. SEC 결과를 토대로 각 페길화 반응에서 생성되는 mono-mPEG-R27T는 66-75%에 해당함을 확인하였다(표 1).
RP-HPLC로 측정한 IFN-β(R27T)와 mono-PEG-IFN-β(mPEG-R27T)의 농도
시료 유지시간 (분) 농도(㎍/㎖)± CV (%)
IFN-β (R27T) 8.40 400 ± 4.4
mono-PEG-10K-IFN-β 8.37 400 ± 1.9
mono-PEG-20K-IFN-β 8.30 400 ± 1.3
mono-PEG-30K-IFN-β 8.17 400 ± 2.7
mono-PEG-40K-IFN-β 8.10 400 ± 2.9
실시예 4. mono-mPEG-R27T의 제형
상기 실시예에서 합성 및 정제하고 분석한 mono-mPEG-R27T에 대한 동물실험을 위해 주사용 제형을 제작하였다. 0.01 M의 pH 2.9의 포스페이트(또는 아세테이트) 완충액에 22.5 mg의 만니톨, 0.25 mg의 플락사머-188, 0.06 g의 메치오닌, 2.5 mg의 벤질 알콜을 포함한 용액에 원하는 농도의 다양한 분자량의 mono-mPEG-R27T를 000 IU/㎖의 농도로 제작하였다.
실시예 5 mono-mPEG-R27T의 약동학적 실험
마우스를 일주일간 안정기를 거친 뒤 실험 전 대퇴부에 카테카를 설치하였다. RebifR의 구매제형과 실시예 1 에서 제조한 다양한 분자량의 mono-mPEG-R27T를 2,000,000 IU/Kg의 투여량으로 동맥주사, 피하주사 및 근육주사 하였다. 투여 후 0분, 15분, 30분, 45분, 60분, 120분, 180분, 240분, 360분, 480분, 720분 및 1440 분에 각 흰쥐의 대퇴 동맥에서 채혈한 뒤 즉시 혈장을 분리하였다. 혈장 중 IFN-β의 농도를 상술한 방법으로 CPE 분석을 실시하여, 시간/농도 프로파일의 약동학적 분석을 시도하였다. 도 4는 정맥주사에 대한 시간과 약효 사이의 약물 약동학적인 연관관계를 나타내고, 도 5는 피하주사에 대한 시간과 약효 사이의 역물 약동학적인 연관관계를 나타내며, 도 6은 근육주사에 대한 시간과 약효 사이의 역물 약동학적인 연관관계를 나타낸다. 3가지의 투여 방법을 비교할 때, mono-mPEG-R27T는 RebifR과 비교하여 약효가 유지되고 있었으며, 특히 피하주사의 경우 RebifR에 비해 약 13배의 AUC를 가지고 있어 약효가 충분하였고, 이는 기존의 IFN 제제보다 투여방법이 크게 개선되어 환자 편이성을 증대시킬 수 있음을 보여준다.
실시예 6. mono-mPEG-20K-SC-R27T 접합체의 제조
1 mg의 R27T(0.00005 mmole)을 UF 막(AmiconR Ultra-2, Milipore, 10K MWCO)을 사용하여 pH 7.0의 50 mM 인산나트륨 완충용액으로 투석여과 하여 1 mg/㎖의 최종농도를 만든 후 2.1 mg의 PEG-SC(20K, 2 moral excess, 0.0001 mmole, IDB)를 준비된 R27T 용액에 첨가하여 25℃에서 1시간 동안 교반하였다.
반응이 종료된 후 SDS-PAGE(4-12% Gradient, Invitrogen, USA)와 크기 배제 컬럼(superdex-200, PBS 버퍼, 0.6 ㎖/분 유속, 220 nm, GE healthcare, USA)을 부착시킨 HPLC로 페길화 반응 정도를 분석하였다. 도 8에 나타난 바와 같이, tri-및 higher PEG-R27T는 13.8분, di-PEG-R27T는 16.3분, mono-PEG-R27T는 18.8분, 그리고 반응하지 않은 R27T가 26.9분에 각각 용출되었으며, 각 절편을 UF 막(AmiconR Ultra-2, Milipore, 10K MWCO)을 사용하여 농축한 후 SDS-PAGE로 각 절편을 확인하였다. 도 8에서 분리 정제된 mono-PEG-R27T 절편을 도 9와 같이 2차로 Zorbax GF-250 컬럼(PBS 버퍼, 1 ㎖/분 유속, 220 nm, Agilent, USA)으로 재분리 하였다.
실시예 7. mono-mPEG-20K-Hz-R27T 접합체의 제조
1 mg의 R27T(0.00005 mmole)를 UF 막(AmiconR Ultra-2, Milipore, 10K MWCO)을 사용하여 50 mM MES 완충액(pH 4.0)으로 투석여과 하여 농도를 5 mg/㎖로 유지시켰다. 여기에 mPEG(20K)-O-CH2CH2CO-Hz 10 mg(0.0005 mmole, 10배)을 가하였다. 2 mg의 EDAC를 50 mM MES 완충액(pH 4.0) 20 ㎕에 용해시킨 후 10 ㎕(0.005 mmol, 100배)를 가한 후 실온에서 1시간 동안 교반 하에 반응을 진행시켰다.
반응이 종료된 후 SDS-PAGE(4-12% Gradient, Invitrogen, USA)와 크기 배제 컬럼(superdex-200, PBS 버퍼, 0.6 ㎖/분 유속, 220 nm, GE healthcare, USA)을 부착시킨 HPLC로 페길화 반응 정도를 분석하였으며 각각 절편을 받았다. 도 10과 같이 tri-및 higher PEG-R27T(F1)는 13.8분, di-PEG-R27T(F2)는 16.3분, mono-PEG-R27T(F3)는 18.8분, 그리고 반응하지 않은 R27T(F4)가 26.9분에 각각 용출되었으며, 각 절편을 UF 막(AmiconR Ultra-2, Milipore, 10K MWCO)을 사용하여 농축한 후 SDS-PAGE로 각 절편을 확인하였다. 참고로 30분 이후 용출되는 절편은 과량으로 첨가한 시약이라고 추측할 수 있다.
실시예 8. mono-mPEG-ALD-R27T 접합체의 제조
1) mono-mPEG-20K-ALD-R27T 접합체의 제조
R27T를 UF 막(AmiconR Ultra-2, Milipore, 10K MWCO)을 사용하여 완충액으로 투석여과 한 후 mPEG-Aldehyde(20K, NOF, Japan)를 위의 준비된 R27T 용액에 첨가한 후 최종농도가 20 mM 소듐 시아노보로하이드라이드가 되도록 RBL-IFN β 혼합물 용액에 첨가하여 4℃ 냉장상태에서 12-14시간 동안 반응시켰다. 자세한 반응조건은 하기의 표 2와 같았다. 반응이 종료된 후 50 mM 소듐 아세테이트, pH 4.4 완충액으로 1 mg/㎖이 되게 희석한 후 페길화(PEGylation) 반응 정도를 SDS-PAGE(4-12% Gradient, Invitrogen, USA)와 크기 배제 크로마토그래피(Zorbax GF-250, PBS 버퍼, 1 ㎖/분 유속, 220 nm, Agilent, USA)로 분석하였으며 제조된 mPEG-R27T 접합체의 mono-mPEG-R27T, di-mPEG-R27T는 크기 배제 칼럼(Superdex 250, Pharmacia, USA) 또는 이온 교환 칼럼을 사용하여 선형 또는 단계적 구배로 분리 정제하였다.
mPEG(20K)-ALD-IFN β 접합체의 제조를 위한 반응조건
IFN β mPEG-Aldehyde 20K NaCNBH3 완충액, pH
1-1 150 ㎍/50 ㎕ 0.75 mg
(5 molar excess)		 20 mM 20 mM 인산용액, pH 7.0
1-2 200 ㎍/100 ㎕ 1 mg
(5 molar excess)		 20 mM 20 mM 인산용액,
pH 6.0
1-1) mPEG-20K-ALD7-R27T(pH 7.0) 접합체 분석
도 11에서 보는 것처럼, 반응 결과 di-mPEG-R27T와 mono-mPEG-R27T는 크기 배제 컬럼인 Zorbax-250을 사용하는 HPLC에서 7.5분, 8.2분에서 각각 용출되는 것으로 관찰되었다. 제조된 mPEG-20K-ALD7-R27T 접합체(pH 7.0)는 도 12에서 보는 바와 같이, 이온교환 컬럼을 이용하여 mono-mPEG-20K-ALD7-R27T(pH 7.0)를 분리하였고, 각 절편을 UF 막(AmiconR Ultra-2, Milipore, 10K MWCO)을 사용하여 농축한 후 SDS-PAGE로 각 절편을 확인하였다.
1-2) mPEG-20K-ALD6-R27T 접합체(pH 6.0) 분석
도 13에서 보는 것처럼, 반응 결과 di-mPEG-R27T와 mono-mPEG-RBL-R27T는 크기 배제 컬럼인 Zorbax-250을 사용하는 HPLC에서 7.5분, 8.2분에서 각각 용출되는 것으로 관찰되었다. 제조된 mPEG-20K-ALD6-R27T 접합체(pH 6.0)는 도 14에서처럼 이온교환 컬럼을 이용하여 mono-mPEG-20K-ALD6-R27T(pH 6.0)를 분리하였고, 각 절편을 UF 막(AmiconR Ultra-2, Milipore, 10K MWCO)을 사용하여 농축한 후 SDS-PAGE로 각 절편을 확인하였다.
2) mono-mPEG-30K-ALD-R27T 접합체의 제조
R27T를 UF 막(AmiconR Ultra-2, Milipore, 10K MWCO)을 사용하여 완충액으로 투석여과 한 후 mPEG-Aldehyde(30K, NOF, Japan)를 위의 준비된 R27T 용액에 첨가한 후 최종농도가 20 mM 소듐 시아노보로하이드라이드가 되도록 R27T 혼합물 용액에 첨가하여 4℃ 냉장상태에서 12-14시간 반응시켰다. 자세한 반응 조건은 하기의 표 3과 같았다.
반응이 종료된 후 50 mM 소듐 아세테이트, pH 4.4 완충액으로 1 mg/㎖이 되게 희석한 후 페길화 반응 정도를 SDS-PAGE(4-12% 구배, Invitrogen, USA)와 크기 배제 크로마토그래피(Zorbax GF-250, PBS buffer, 1 ㎖/분 유속, 220 nm, Agilent, USA)로 분석하였으며, 제조된 mPEG-R27T 접합체의 mono-mPEG-R27T 및 di-mPEG-R27T는 크기 배제 컬럼(Superdex 250, Pharmacia, USA) 또는 이온 교환 컬럼을 사용하여 선형 또는 단계적 구배로 분리 정제하였다.
mPEG-30K-ALD-R27T접합체의 제조를 위한 반응조건
IFN β mPEG-Aldehyde 30K NaCNBH3 완충액, pH
2-1 100 ㎍/100 ㎕ 450 ㎍
(3 molar excess)		 20 mM 10 mM 소듐 아세테이트 pH 4.4
2-2 200 ㎍/100 ㎕ 0.9 mg
(3 molar excess)		 20 mM 20 mM 인산용액
pH 6.0
2-3 200 ㎍/100 ㎕ 1.5 mg
(5 molar excess)		 20 mM 20 mM 인산용액
pH 7.0
2-1) mPEG-30K-ALD4.4-R27T(pH 4.4) 접합체 분석
도 15에서 보는 것처럼, 반응 결과 di-mPEG-R27T와 mono-mPEG-R27T는 크기배제 컬럼인 Zorbax-250을 사용하는 HPLC에서 7.5분, 8.2분에서 각각 용출되는 것으로 관찰되었다. 제조된 mPEG-30K-ALD4.4-R27T 접합체(pH 4.4)는 이온교환 컬럼을 이용하여 mono-mPEG-30K-ALD4.4-R27T(pH 4.4)를 분리하였고, 각 절편을 UF 막(AmiconR Ultra-2, Milipore, 10K MWCO)을 사용하여 농축한 후 SDS-PAGE로 각 절편을 확인하였다(도 16).
2-2) mPEG-30K-ALD6-R27T(pH 6.0) 접합체 분석
도 17에서 보는 것처럼, 반응 결과 di-mPEG-R27T와 mono-mPEG-R27T는 크기 배제 컬럼인 Zorbax-250을 사용하는 HPLC에서 7.5분, 8.2분에서 각각 용출되는 것으로 관찰되었다. 제조된 mPEG-30K-ALD6-R27T 접합체(pH 6.0)는 이온교환 컬럼을 이용하여 mono-mPEG-30K-ALD6-R27T(pH 6.0)를 분리하였고, 각 절편을 UF 막 (AmiconR Ultra-2, Milipore, 10K MWCO)을 사용하여 농축한 후 SDS-PAGE로 각 절편을 확인하였다(도 18).
2-3) mPEG-30K-ALD-R27T(pH 7.0) 접합체 분석
도 19에서 보는 것처럼, 반응 결과 di-mPEG-R27T와 mono-mPEG-R27T는 크기 배제 컬럼인 Zorbax-250을 사용하는 HPLC에서 7.5분, 8.2분에서 각각 용출되는 것으로 관찰되었다. 제조된 mPEG-30K-ALD7-R27T 접합체(pH 7.0)는 도 20에서와 같이 이온교환 컬럼을 이용하여 mono-mPEG-30K-ALD7-R27T(pH 7.0)를 분리하였고, 각 절편을 UF 막(AmiconR, Ultra-2, Milipore, 10K MWCO)을 사용하여 농축한 후 SDSPAGE로 각 절편을 확인하였다.
실시예 9. mono-mPEG-20K-MAL-R27T 접합체의 제조
R27T를 UF 막(AmiconR Ultra-2, Milipore, 10K MWCO)을 사용하여 pH 8.0의 인산완충액으로 투석여과 한 후 20배 몰비의 mPEG-MAL(20K, NOF, Japan)를 위의 준비된 R27T 용액에 첨가한 후 25℃에서 한 시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응이 종료된 후 페길화 반응 정도를 SDS-PAGE(4-12% 구배, Invitrogen, USA)와 크기 배제 컬럼(Zorbax-250, PBS 버퍼, 1 ㎖/분 유속, 220 nm)을 부착시킨 HPLC로 페길화 반응 정도를 분석하였으며, 각각 절편을 분리 정제하였다. 도 21에서 보는 것처럼, 반응 결과 di/mono-mPEG-MAL-R27T와 mPEG-MAL이 HPLC에서 6.5-7.5분, 8.2분에서 각각 용출되는 것으로 관찰되었다. 각 절편을 UF 막(AmiconR Ultra-2, Milipore, 10K MWCO)을 사용하여 농축한 후 SDS-PAGE로 각 절편을 확인하였다.
실시예 10. mono-mPEG-R27T의 생물학적 활성 시험 및 결과
A549 세포를 헤모사이토미터(hemocytometer)로 계수하여 10% FBS/MEM으로 3 X 105 세포/㎖ 농도로 희석하여 현탁시켰다. 상기 실시예에서 제조 정제된 mono-mPEG-R27T 접합체를 각각 50 IU-0.39 IU(1 mg/㎖ = 1.6 X 108 IU)의 농도로 희석하여 각각의 웰에 100 ㎕씩을 넣었다. 이어서, 각각의 웰에 세포 현탁액을 100 ㎕씩 넣고 배양기에서 22시간 동안 배양시켰다.
뇌심근염 바이러스(Encephalomyocarditis virus : EMCV, PANGEN)를 1000TCID 50/㎖의 농도로 희석시켜 100 ㎕씩 가한 후, 다시 배양기에서 22시간 동안 배양시켰다. 96웰 플레이트의 뇌심근염 바이러스(EMCV, PANGEN) 배지 용액을 제거한 후, 0.05% 크리스탈 바이올렛 염색액을 웰 당 50 ㎕씩 넣고 마이크로플레이트 판독기의 파장 570 nm에서 각 웰에 대한 O.D.를 측정하여 표준 IFN β, R27T 및 상기 실시예에서 제조된 mono-mPEG-R27T 접합체의 활성을 계산하였다(표 4, 도 22-26).
A549 세포를 이용한 mono-PEG-R27T의 생물학적 활성
샘플 A549를 이용한 생물학적 활성(%)
R27T 100
mPEG-20K-SC-R27T 21.2
mPEG-20K-Hz-R27T 27.7
mPEG-20K-ALD-R27T 18.5
mPEG-20K-MAL-R27T 19.2
실시예 11. mono-mPEG-OPSS-R27T 접합체의 제조
R27T의 시스테인(Cys17)의 -SH기에 선택적으로 PEG를 결합시키기 위하여, mPEG-orthopyridyl disulfide(mPEG-OPSS-20K, 분자량 20,000 Da)를 0.1 M 포스페이트 완충액(pH 3.0)에서 R27T와 반응시켰다. 37℃에서 3시간 동안 반응시킨 후, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 이용하여 mono-mPEG-OPSS-R27T를 분리하였다. 컬럼은 Superose 6 10/300 GL(GE Healthcare, 미국)을 사용하였고, 이동상은 20 mM 포스페이트 완충액(pH 5.5)을 0.5 ㎖/분의 유속으로 흘렸으며, UV 215 nm에서 용출되는 단백질을 검출하였다. 도 27에서 보는 바와 같이, 비변형 R27T는 36.1분에, mono-mPEG-OPSS-R27T는 27.7분에 용출되었다. Mono-mPEG-OPSS-R27T에 해당하는 분획을 분리하여 Amicon Ultra-4(Millipore, 미국)를 이용하여 농축하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Abion Inc. <120> PEGylated Interferon-beta Variants <130> PN140406P <150> KR10-2014-0093983 <151> 2014-07-24 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln 1 5 10 15 Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu 20 25 30 Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln 35 40 45 Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln 50 55 60 Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 65 70 75 80 Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn 85 90 95 His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr 100 105 110 Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 115 120 125 Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr 130 135 140 Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu 145 150 155 160 Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 165

Claims (11)

  1. 페길화된(PEgylated) IFN-β(interferon-beta) 변이체로서, 상기 IFN-β 변이체는 이의 아민기 또는 카르복실기에 CH3O-(CH2CH2O)n(n은 2-4000의 정수)이 카보닐, 아미드, 우레탄, 이차 아민, 티오에테르, 디설파이드 또는 하이드라존을 통하여 공유결합 되어 페길화되고, 서열목록 제1서열의 27번째 Arg 잔기가 Thr 잔기로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 것인 페길화된 IFN-β 변이체.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 페길화된 IFN-β 변이체는 일 말단에 메톡시기를 가지며, 타 말단에 알데하이드, 하이드라지드, 말레이미드, 숙신이미드 또는 o-피리딜 디설파이드(orthopyridyl disulfide)를 갖는 폴리에틸렌글리콜 유도체로 페길화되어 형성된 것을 특징으로 하는 페길화된 IFN-β 변이체.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 페길화된 IFN-β 변이체는 하기의 화학식 1로 표시되는 폴리에틸렌글리콜 유도체로 페길화되어 형성된 것을 특징으로 하는 페길화된 IFN-β 변이체:
    화학식 1
    CH3O-(CH2CH2O)n-R1-X-R2
    상기 화학식에서, X는 -C=O- 또는 S이고;
    X가 -C=O-인 경우, R1은 C1-C4 알킬렌, C1-C4 알킬렌옥시, C1-C4 알킬렌옥시 C1-C3 알킬렌 또는 C1-C4 알킬렌아미노이고; R2는 수소, 하이드라지드, NHS(N-Hydroxysuccinimide), 말레이미드 C1-C4 알킬렌 또는 o-피리딜 디설파이드 C1-C4 알킬렌이며;
    X가 S인 경우, R1은 S이고, R2는 o-피리딘임.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 화학식 1의 R1은 에틸렌, 에틸렌옥시, 에틸렌옥시메틸렌 또는 에틸렌아미노이고; R2는 수소, 하이드라지드, NHS(N-Hydroxysuccinimide), 말레이미드 에틸렌 또는 o-피리딜 디설파이드 에틸렌인 것을 특징으로 하는 페길화된 IFN-β 변이체.
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서, 페길화된 IFN-β 변이체의 페길화는 모노-페길화(mono-PEGylation)인 것을 특징으로 하는 페길화된 IFN-β 변이체.
  7. 제 1 항 내지 제 4 항 및 제 6 항 중 어느 한 항의 페길화된 IFN-β 변이체를 유효성분으로 포함하는 과대증식성 질환(hyperproliferative disease), 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 과대증식성 질환은 암인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 염증성 질환은 만성폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 패혈성 쇼크(septic shock), 사구체 신염, 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 아테롬성 동맥경화증, 당뇨 및 뇌졸중으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 건선, 알러지성 피부염, 다발성 경화증 및 천식으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 7 항에 있어서, 상기 조성물은 정맥주사, 피하주사 또는 근육주사로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
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