MXPA04008798A - Moleculas semejantes a interferon beta para el tratamiento de evento cerebrovascular. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere el uso de polipeptidos semejantes a interferon beta para el tratamiento de evento cerebrovascular o ataque isquemico transitorio en un primate, preferiblemente en un humano; mas particularmente, los polipeptidos semejantes a interferon beta difieren de la secuencia de aminoacidos del IFNB humano de tipo silvestre (SEQ ID NO: 2) en tanto que se ha introducido al menos un sitio de glucosilacion, preferiblemente se ha introducido al menos un sitio de N-glucosilacion in vivo; opcionalmente los polipeptidos semejantes a interferon beta estan polietilenglucosilados.

Description

MOLECULAS SEMEJANTES A INTERFERON BETA PARA EL TRATAMIENTO DE EVENTO CEREBROVASCULAR CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere el uso de polipeptidos semejantes a mterferon beta para el tratamiento del evento cerebrovascular o ataque isquémico transitorio en un primate preferiblemente en un humano ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los interferones son atocinas importantes caracterizadas por actividades antivirales antiproliferativas e mmunomoduladoras Estas actividades forman una base para los beneficios clínicos que se han observado en numerosas enfermedades incluyendo hepatitis diversos tipos de canceres y esclerosis múltiple Los interferones se dividen en las clases tipo I y tipo II El mterferon ß (también designado como mterferon beta IFNB o IFN-ß) pertenece a la clase de interferones tipo I la cual también incluye al mterferon a t y ? mientras que el mterferon ? es el único miembro conocido de la clase distintiva tipo II El IFNB humano de tipo silvestre es un polipeptido regulador con un peso molecular de 22 kDa que consiste de 166 residuos de aminoácidos Este se puede producir por la mayoría de las células en el cuerpo en particular fibroblastos en respuesta a la infección viral o a la exposición a otros agentes biológicos Este se une a un receptor de superficie celular multimenco y la unión productiva del receptor produce una cascada de eventos intracelulares que llevan a la expresión de los genes inducibles por IFNB los cuales a su vez producen efectos que pueden ser clasificados como antivirales antiprohferativos e inmunomoduladores La secuencia de aminoácidos del IFNB humano de tipo silvestre se reporto por Taniguchi Gene 10 11 15 1980 y en el documento EP 0 083 069 EPO 041 313 y US 4 686 191 Se han reportado las estructuras cristalinas para el IFNB de humano y de munno respectivamente (Proc Nati Acad Sci USA 94 1 1813 1 1818 1997 J Mol Biol 253 187 207 1995 y fueron revisadas en Cell Mol Life Sci 54 1203-1206 1998) Se han reportado relativamente pocas vanantes de proteínas diseñadas del IFNB (WO 95/25170 WO 98/48018 US 5 545 723 US 4 914 033 EP O 260 350 US 4 588 585 US 4 769 233 Stewart et al DNA Vol 6 no 2 1987 pp 119-128 y Runkel et al 1998 J Biol Chem 273 No 14 pp 8003-8008) Se ha reportado la expresión del IFNB en células CHO (US 4 966 843 US 5 376 567 y US 5 795 779) Redhch et al Proc Nati Acad Sci USA Vol 88 pp 4040-4044 1991 ha descrito inmunorreactividad de anticuerpos en contra de peptidos sintéticos que corresponden a extensiones peptidicas del IFNB recombinante de humano con la mutación C17S Se han reportado las moléculas del IFNB con un patrón de glucosilacion particular y métodos para su preparación (EP 0 287 075 y EP 0 529 300) Diversas referencias describen modificación de pohpeptidos mediante conjugación del polímero o glucosilacion Se ha reportado la modificación del polímero de IFNB nativo o una vanante C17S del mismo (EP 0 229 108 US 5 382 657 EP 0 593 868 US 4 917 888 y WO 99/55377) El documento US 4 904 584 describe pohpeptidos sin lisina polietilenglucosilados en donde al menos un residuo de lisina ha sido deletado o reemplazado con cualquier otro residuo de aminoácido El documento WO 99/67291 describe un procedimiento para conjugar una proteina con PEG en donde al menos un residuo de aminoácido en la protema se deleta y la proteina se pone en contacto con el PEG bajo condiciones adecuadas para lograr la conjugación de la protema El documento WO 99/03887 describe variantes polietilenglucosiladas de pohpeptidos que pertenecen a la superfamilia de la hormona del crecimiento en donde un residuo de cisterna ha sido sustituido por un residuo de aminoácido no esencial localizado en las regiones especificas del polipeptido El IFNB se menciona como un ejemplo de un polipeptido que pertenece a la superfamilia de la hormona del crecimiento El documento WO 00/23114 describe IFNB glucosilado y polietilenglucosilado Las proteínas de fusión del IFNB se describen en el documento WO 00/23472 Las preparaciones comerciales del IFNB se venden bajo los nombres registrados de Betaseron® (también denominado mterferon ß1 b el cual no esta glucosilado se produce utilizando células bacterianas recombinantes las cuales comprenden la mutación C17S y que tienen una delecion del residuo N-terminal de metionina) Avonex® y Rebif® (también denominado mterferon pía el cual esta glucosilado se produce utilizando células recombinantes de mamífero) Estas preparaciones son utilizadas para el tratamiento de pacientes con esclerosis múltiple y ha mostrado ser efectivas para reducir la velocidad de exacerbación y mas pacientes permanecen libres de exacerbación por periodos prolongados de tiempo en comparación con los pacientes tratados con placebo Ademas se reduce la velocidad de acumulación de incapacidad (Neurol 51 682-689 1998) Una comparación del mterferon pía y del ß 1 b con respecto a la estructura y función se ha presentado en Pharmaceut Res 15 641 649 1998 El IFNB es la primera intervención terapéutica que se muestra que retrasa la progresión de la esclerosis múltiples retrasando entonces la enfermedad degenerativa inflamatoria progresiva del sistema nervioso central No obstante su mecanismo de acción permanece mayormente desconocido Parece que el IFNB tiene un efecto inhibidor sobre la proliferación de los leucocitos y la presentación del antigeno Ademas el IFNB puede modular el perfil de producción de atocina hacia un fenotipo antiinflamatono Finalmente el IFNB puede reducir la migración de la célula T mediante la inhibición de la actividad de las metaloproteasas de la matriz de las células T Probablemente estas actividades actúan en conjunción para lograr el mecanismo del IFNB en la esclerosis múltiple (Neurol 51 682-689 1998) Ademas el IFNB puede ser utilizado para el tratamiento del osteosarcoma carcinoma de célula basal displasia cervical ghoma leucemia mieloide aguda mieloma múltiple enfermedad de Hodgkm carcinoma de mama melanoma e infecciones virales tales como virus del papiloma hepatitis viral herpes genitalis herpes zoster queratitis herpetica herpes simplex encefalitis viral neumonía por citomegalovirus y nnovirus Diversos efectos laterales están asociados con el uso de preparaciones actuales del IFNB incluyendo reacciones a los lados de la inyección fiebre escalofríos mialgias artralgias y otros síntomas semejantes al resfriado (Clin Therapeutics 19 883 893 1997) El documento WO 01/15736 describe conjugados del IFNB novedosos que comprenden una porción no polipeptidica unida a un polipeptido IFNB el cual ha sido modificado mediante la introducción y/o delecion de sitios de anclaje para una porción no polipeptidica tal con PEG y sitios de glucosilacion Las moléculas tienen propiedades mejoradas tales como vida media mejorada y/o reactividad reducida con anticuerpos neutralizantes generados en contra de los productos actuales del IFNB Recientemente se ha sugerido al IFNB como un medicamento para el tratamiento de eventos cerebrovasculares y trastornos relacionados (WO 01/41782 WO 02/089828 WO 02/080953 y Veldhuis et al Stroke enero 2002 pagina 346) BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención provee polipeptidos semejantes a IFNB los cuales son mas eficientes en el tratamiento del evento cerebrovascular y trastornos relacionados los cuales son el interferon í a (por ejemplo Avonex® y Rebif® y el interferon pib (por ejemplo Betaseron®) Por consiguiente en un primer aspecto la presente invención se refiere al uso de una variante polipeptidica del interferon ß (IFNB) que comprende una secuencia de aminoácidos la cual difiere a partir de la secuencia de aminoácidos del IFNB humano de tipo silvestre (SEQ ID NO 2) en que se ha introducido al menos un sitio de glucosilacion para la elaboración de un medicamento para el tratamiento del evento cerebrovascular o accidente cerebrovascular (CVA) en un primate En otro aspecto la presente invención se refiere a un método para tratar o prevenir el evento cerebrovascular o accidente cerebrovascular (CVA) en un primate el método comprendiendo la administración de una cantidad efectiva de una vanante polipeptidica del interferon ß (IFNB) que comprende una secuencia de aminoácidos la cual difiere de la secuencia de aminoácidos del IFNB humano de tipo silvestre (SEQ ID NO 2) en la que al menos se ha introducido un sitio de glucosilacion a un primate que necesita del mismo En un aspecto adicional la presente invención se refiere al uso de una vanante polipeptidica del interferon ß (IFNB) que comprende una secuencia de aminoácidos la cual difiere de la secuencia de aminoácidos del IFNB humano de tipo silvestre (SEQ ID NO 2) en que se ha introducido al menos un sitio de glucosilacion para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de ataque isquémico transitorio en un primate En incluso un aspecto adicional la presente invención se refiere a un método para tratar o prevenir un ataque isquémico transitono en un primate el método comprende la administración de una cantidad efectiva de una variante polipeptidica del interferon ß (IFNB) que comprende una secuencia de aminoácidos la cual difiere de la secuencia de aminoácidos del IFNB humano de tipo silvestre (SEQ ID NO 2) en que se ha introducido al menos un sitio de glucosilacion a un primate que necesita del mismo Otros aspectos serán evidentes a partir de la siguiente descripción DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Definiciones En el contexto de la presente solicitud se aplican las siguientes definiciones El termino conjugado (o de manera intercambiable pohpeptido conjugado ) se pretende que indique una molécula heterogénea (en el sentido de compuesta o quimérica) formada mediante la unión covalente de uno o mas polipeptidos a una o mas porciones no pohpeptidicas El termino unión covalente significa que el pohpeptido y la porción no polipeptidica están ya sea directamente unidas entre si o ya sea que están indirectamente unidas entre si a través de una porción o porciones que intervienen tales como un puente espaciador o porción o porciones enlazadoras utilizando un grupo de unión presente en el polipeptido Prefenblemente el conjugado es soluble a concentraciones y condiciones relevantes por ejemplo soluble en fluidos fisiológicos tales como la sangre Los ejemplos de polipeptidos conjugados para uso en la invención incluyen polipeptidos glucosilados y/o polipeptidos pohetilenglucosilados El termino pohpeptido no conjugado se puede utilizar para referirse a la parte pohpeptidica del conjugado El termino porción no polipeptidica se pretende que indique una molécula que es capaz de conjugarse a un grupo de unión de un polipeptido para uso en la invención Los ejemplos preferidos de dichas moléculas incluyen moléculas polimericas porciones de azúcar compuestos lipofilos o agentes derivados de elementos orgánicos Cuando se utilizan en el contexto de un conjugado como se describe en la presente invención se entenderá que la porción no pohpeptidica esta unida a la parte pohpeptidica del conjugado a través de un grupo de unión del polipeptido El termino molécula polimerica se define como una molécula formada mediante la unión covalente de dos o mas monomeros en donde ninguno de los monomeros es un residuo de aminoácidos excepto en donde el polímero es albúmina de humano u otra proteina plasmática abundante El termino polímero se puede utilizar de manera intercambiable con el termino molécula polimenca Los ejemplos de moléculas polimencas preferidas incluyen PEG y mPEG El termino molécula polimerica también se pretende que abarque moléculas de carbohidrato unidas mediante glucosilacion in vitro por ejemplo glucosilacion sintética llevada a cabo m vitro que normalmente implica la unión covalente de una molécula de carbohidrato a un grupo de unión del polipeptido opcionalmente utilizando un agente para entrecruzamiento Las moléculas de carbohidrato unidas mediante glucosilacion in vivo tales como N u O glucosilacion (como se describe con detalle a continuación) se refieren en la presente invención como una porción de azúcar Normalmente el sitio de glucosilacion in vivo es un sitio de N glucosilacion pero también se contempla un sitio de O glucosilacion como relevante para la presente invención Se entenderá que una vanante del IFNB glucosilado también puede ser denominado como un conjugado del IFNB (que comprende una porción no polipeptidica que es una porción de azúcar unida a la parte polipeptidica del conjugado) Excepto cuando el numero de porciones no polipeptidicas tales como una molecula(s) polimerica(s) o porciones de azúcar en el conjugado se indica expresamente en cada referencia a una porción no polipeptidica contenida en un conjugado o de otra manera utilizado en la presente invención debe ser una referencia a una o mas porciones no polipeptidicas tales como una molécula pohmenca o porciones de azúcar en el conjugado El termino grupo de unión se pretende que indique un grupo de un residuo de aminoácidos del pohpeptido capaz de acoplarse a la porción no polipeptidica relevante Por ejemplo para un polímero en particular PEG un grupo de unión frecuentemente utilizado es el grupo e amino de la hsina o el grupo N amino terminal Otros grupos de unión al polímero incluyen un grupo de acido carboxilico libre (por ejemplo aquel del residuo de aminoácido C-terminal o de un residuo de acido aspartico o de acido glutamico) los grupos carbonilo activados de manera adecuada grupos mercapto (por ejemplo aquel de un residuo de cisterna) residuos de acido aromático (por ejemplo Phe Tyr Trp) grupos hidroxi (por ejemplo aquellos de Ser Thr u OH Lys) guanidina (por ejemplo Arg) imidazol (por ejemplo His) y porciones de carbohidrato oxidados Para la N glucosilacion m vivo el termino grupo de unión se utiliza de manera no convencional para indicar los residuos de aminoácidos que constituyen un sitio de N-glucosilacion (con la secuencia N X S/T/C X en donde X es cualquier residuo de aminoácido excepto prohna X es cualquier residuo de aminoácidos que puede o no ser idéntico a X y preferiblemente es diferente de la prohna N es una asparagina y S/T/C es ya sea senna treonina o cisterna preferiblemente senna o treonina y mas preferiblemente treonina) A pesar de que el residuo de asparagina del sitio de la N-glucosilacion es aquel al cual la porción de azúcar esta unida durante la glucosilacion dicha unión no puede lograrse a menos que este presente el otro residuo de aminoácido del sitio de N-glucosilacion Por consiguiente cuando la porción no pohpeptidica es una porción de azúcar asociada a N el termino residuo de aminoácido que comprende un grupo de unión para la porción no pohpeptidica como se utiliza en conexión con las alteraciones de la secuencia de aminoácidos del pohpeptido parental debe entenderse como residuos de aminoácidos que constituyen un sitio de N glucosilacion que es/van a ser alterados de tal manera que un sitio funcional de N glucosilacion se introduce dentro de la secuencia de aminoácidos Para un sitio de O-glucosilacion el grupo de unión es el grupo OH de un residuo de serina o treonina Debe entenderse que cuando el termino al menos 25% (o 50%) de su cadena lateral expuesta al solvente se utiliza en conexión con la introducción de un sitio de N glucosilacion in vivo este termino se refiere a la superficie de accesibilidad de la cadena lateral del aminoácido en la posición en donde la porción del azúcar esta realmente unida En muchos casos sera necesario introducir un residuo de serma o un residuo de treonina en la posición +2 con relación al residuo de asparagina al cual esta unida realmente la porción del azúcar y estas posiciones en donde se introducen los residuos de senna o treonma se dejan ocultar por ejemplo para que tengan menos del 25% (o 50%) de sus cadenas laterales expuestas al solvente La porción de azúcar unida a un sitio de glucosilacion típicamente se encuentra sialilada No obstante el acido siálico se puede remover por ejemplo mediante escisión enzimatica por neurammidasa para producir un polipeptido IFNB sialo glucosilado (Brady et al J Inher Metab Dis (1994) 17 510 519 y US 5 549 892) En otra modalidad las porciones de azúcar se modifican adicionalmente para que contengan solamente mañosa Eso se puede realizar mediante tratamiento secuencial con neuraminidasa ß-galactosidasa y ß N-acetilglucosaminidasa (Brady et al J Inher Metab Dis (1994) 17 510-519 y US 5 549 892) El termino residuo de aminoácido que comprende un grupo de unión para la porción no polipeptidica se pretende que indique que el residuo de aminoácido es uno al cual se une la porción no polipeptidica (en el caso de un residuo de aminoácido introducido) o que podría unirse (en el caso de un residuo de aminoácido removido) El termino una diferencia o difiere a partir de como se utiliza en conexión con modificaciones especificas tales como la sustitución se pretende que permita diferencias adicionales que están presentes ademas de las diferencias especificas de aminoácidos Por ejemplo ademas de la remoción y/o introducción de residuos de aminoácido que comprenden un grupo de unión para la porción no pohpeptidica el polipeptido IFNB puede comprender otras sustituciones que no están relacionadas con la introducción y/o remoción de dichos residuos de aminoácidos Estas pueden incluir por ejemplo truncamiento del C terminal por uno o mas residuo de aminoácidos truncamiento del N-termmal por uno o mas residuos de aminoácidos y/o sustituciones conservativas de aminoácidos por ejemplo sustituciones que se llevan a cabo dentro de grupos de aminoácidos con características similares por ejemplo aminoácidos pequeños aminoácidos ácidos aminoácidos polares aminoácidos básicos aminoácidos hidrófobos y aminoácidos aromáticos Los ejemplos de sustituciones conservativas en la presente invención se pueden seleccionar en particular a partir de los grupos listados en el cuadro a continuación El termino al menos uno como se utiliza acerca de una porción no pohpeptidica un residuo de aminoácido una sustitución etc se pretende que signifique uno o mas En la presente solicitud los nombres de aminoácidos y nombres de átomos (por ejemplo CA CB CD CG SG NZ N O C etc) se utilizan como se define por la Protein DataBank (PDB) fwww pdb orq) la cual esta basada en la nomenclatura lUPAC (lUPAC Nomenclature and Symbohsm for Ammo Acids and Peptides (nombres de residuos nombres de átomos e t c ) Eur J Biochem 138 9 37 (1984) junto con sus correcciones en Eur J Biochem 152 1 (1985) CA algunas veces se refiere como Ca CB como Cp El termino residuo de aminoácido se pretende que indique un residuo de aminoácido contenido en el grupo que consiste de residuos de alanina (Ala o A) cisterna (Cys o C) acido aspartico (Asp o D) acido glutamico (Glu o E) fenilalanina (Phe o F) glicina (Gly o G) histidina (His o H) isoleucma (lie o I) lisma (Lys o K) leucina (Leu o L) metionma (Met o M) asparagina (Asn o N) prolina (Pro o P) glutamina (Gln o Q) arginina (Arg o R) senna (Ser o S) treonina (Thr oT) vahna (Val o V) tnptofano (Trp o W) y tirosma (Tyr o Y) La terminología utilizada para la identificación de posiciones/sustituciones de aminoácidos se ilustra como sigue La terminología utilizada para identificar posiciones/sustituciones de aminoácidos se ilustra como sigue C17 indica que la posición 17 esta ocupada por un residuo de cisterna en la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO 2 C17S indica que el residuo de Cys de la posición 17 se ha reemplazado con un residuo de Ser Las sustituciones múltiples se indican con un + por ejemplo R71 N+D73T/S significa una secuencia de aminoácidos la cual comprende una sustitución del residuo Arg en la posición 71 con un residuo Asn y una sustitución del residuo Asp en la posición 73 con un residuo Thr o Ser preferiblemente un residuo Thr T/S como se utiliza acerca de una sustitución dada en la presente invención significa ya sea un residuo T o S preferiblemente un residuo T Las deleciones se indican por un astensco Por ejemplo M1 * indica que el residuo Met en la posición 1 ha sido deletado Las inserciones se indican de la siguiente forma la inserción de un residuo adicional de Phe después del residuo de Cys localizado en la posición 17 se indica como C17CF Las sustituciones e inserciones combinadas se indican de la siguiente forma la sustitución del residuo Cys en la posición 17 con un residuo Ser y la inserción de un residuo Phe después de la posición 17 del residuo de aminoácido se indica como C17SF El termino secuencia nucleotidica se pretende que indique una extensión de secuencia de dos o mas moléculas nucleotidicas La secuencia nucleotidica puede ser de origen genomico ADNc ARN semisintetico sintético o cualesquiera combinaciones de los mismos El termino familia que posee la secuencia de la proteina IFNB se utiliza en su sentido convencional por ejemplo para indicar un grupo de pohpeptidos con secuencias de aminoácidos suficientemente homologas para permitir el alineamiento de las secuencias por ejemplo utilizando el programa CLUSTALW Una familia con la secuencia de IFNB esta disponible por ejemplo a partir de las familias PFAM versión 4 0 o se puede preparar mediante el uso de un programa de computo adecuado tal como CLUSTAL W versión 1 74 utilizando parámetros por omisión (Thompson et al 1994 CLUSTAL W improving the sensitivity of progressive múltiple sequence alignment through sequence weighting position-specific gap penalties y weight matnx choice Nucleic Acids Research 22 4673-4680) Célula célula hospedera linea celular y cultivo celular* se utilizan de manera intercambiable en la presente invención y debe entenderse que todos estos términos incluyen la progenie que resulta a partir del crecimiento o cultivo de una célula Transformación y transfeccion se utilizan de manera intercambiable para referirse a los procedimientos de introducción del ADN dentro de una célula Operativamente unido se refiere a la unión covalente de dos o mas secuencia nucleotidicas por medio de ligación enzimatica u otro tipo de unión en una configuración relativa entre si de tal manera que la función normal de las secuencias se puede llevar a cabo Por ejemplo la secuencia nucleotidica que codifica una presecuencia o líder para secreción esta operativamente asociada con una secuencia nucleotidica para un polipeptido si esta se expresa como una preprotema que participa en la secreción del pohpeptido un promotor o potenciador esta operativamente asociado a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia un sitio para unión al nbosoma esta operativamente asociado a una secuencia codificante si esta ubicado de manera que facilita la traducción Generalmente operativamente asociado significa que las secuencias nucleotidicas a ser enlazadas están contiguas y en el caso de un líder para secreción son contiguas y se encuentran en una fase de lectura El enlace se logra mediante la ligación en sitios de restricción convenientes Si dichos sitios no existen entonces se utilizan los adaptadores o enlazadores oligonucleotidos sintéticos en conjunción con métodos estándares para ADN recombmante El termino introducir se pretende principalmente que signifique la sustitución de un residuo de aminoácido existente pero también puede significar la inserción de un residuo adicional de aminoácido El termino remover se pretende que signifique principalmente la sustitución del residuo de aminoácido a ser removido por otro residuo de aminoácido pero también puede significar la delecion (sin sustitución) del residuo de aminoácido a ser removido El termino modificación como se utiliza en la presente invención abarca sustitución inserción y delecion Los términos mutación y sustitución se utilizan de manera intercambiable en la presente invención El termino inmunogenicidad como se utiliza en conexión con una sustancia dada se pretende que indique la capacidad de la sustancia para inducir una respuesta a partir del sistema inmune La respuesta inmune puede ser una respuesta mediada por célula o por anticuerpo (véase por ejemplo Roitt Essential Immunology (8a Edición Blackwell) para una definición adicional de la inmunogenicidad) La inmunogenicidad se puede determinar mediante el uso de cualquier método adecuado conocido en la técnica por ejemplo in vivo o in vitro por ejemplo utilizando la prueba de inmunogenicidad in vitro esbozada en la sección de Materiales y Métodos a continuación El termino inmunogenicidad reducida como se utiliza acerca de un polipeptido dado o conjugado se pretende que indique que el conjugado o polipeptido da lugar a una respuesta inmune mas baja que se puede medir en comparación con una moléculas de referencia tal como un IFNB de humano de tipo silvestre por ejemplo Rebif® o Avonex® o una vanante del IFNB humano de tipo silvestre tal como Betaseron® como se determina bajo condiciones comparables Cuando se hace referencia en la presente invención a los productos comercial mente disponibles de IFNB (por ejemplo Betaseron® Avonex® y Rebif®) debe entenderse que significa ya sea el producto formulado o la parte polipeptidica del IFNB del producto (como sea apropiado) Normalmente la reactividad reducida del anticuerpo (por ejemplo reactividad hacia anticuerpos presentes en el suero a partir de pacientes tratados con productos comerciales del IFNB) es una indicación de la inmunogenicidad reducida El termino vida media funcional in vivo se utiliza con su significado normal por ejemplo el tiempo al cual se retiene 50% de una funcionalidad dada del pohpeptido o conjugado (tal como el tiempo al cual 50% de la actividad biológica del pohpeptido o conjugado aun esta presente en el cuerpo/órgano blanco o el tiempo al cual la actividad del polipeptido o conjugado es 50% del valor inicial) Como una alternativa para determinar la vida media funcional in vivo se puede determinar la vida media en suero por ejemplo el tiempo al cual 50% de las moléculas del polipeptido o conjugado circulan en el plasma o en la corriente sanguínea antes de ser eliminadas La determinación de la vida media en suero frecuentemente es mas simple que la determinación de la vida media funcional in vivo y la magnitud de la vida media en suero usualmente es una buen indicación de la magnitud de la vida media funcional in vivo Los términos alternativos para la vida media en suero incluyen vida media en plasma vida media en circulación eliminación a partir del suero eliminación a partir del plasma y vida media previa a eliminación La funcionalidad restante normalmente se selecciona a partir de la actividad antiviral antiprohferativa inmunomoduladora o de unión al receptor La vida media funcional ?? vivo y la vida media en suero se pueden determinar mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica como se discute con mayor detalle en la sección de Materiales y Métodos en la presente invención El polipeptido o conjugado normalmente se elimina mediante la acción de uno o mas de los sistemas reticuloendoteliales (RES) riñon bazo o hígado o mediante proteolisis especifica o no especifica La eliminación que toma lugar por los ríñones también se puede referir como eliminación renal y se logra por ejemplo mediante filtración glomerular excreción tubular o eliminación tubular Normalmente la eliminación depende de las características físicas del polipeptido o conjugado incluyendo peso molecular tamaño (diámetro) (relativo al limite para la filtración glomerular) carga simetría forma/rigidez cadenas de carbohidratos unidos y la presencia de receptores celulares para la protema Un peso molecular de aproximadamente 67 kDa se considera un valor limite importante para la eliminación renal La eliminación renal reducida se puede establecer mediante cualquier ensayo adecuado por ejemplo un ensayo establecido in vivo Típicamente la eliminación renal se determina mediante la administración de un polipeptido o conjugado polipeptidico marcado (por ejemplo radio-marcado o marcado con fluorescencia) a un paciente y midiendo la actividad marcada en la orina recolectada a partir del paciente La eliminación renal reducida se determina con relación al polipeptido no conjugado correspondiente o al pohpeptido no conjugado correspondiente de tipo silvestre o a un producto comercial de IFNB bajo condiciones comparables El termino incrementado como se utiliza acerca de la vida media funcional in vivo o la vida media en suero se utiliza para indicar que la vida media relevante del conjugado o pohpeptido se incrementa de manera estadísticamente significativa con relación a la de la molécula de referencia tal como un IFNB humano de tipo silvestre no conjugado (por ejemplo Avonex® o Rebif®) o un IFNB vanante de humano no conjugado (por ejemplo Betaseron®) como se determina bajo condiciones comparables El termino inmunogenicidad reducida y/o vida media con funcionalidad incrementada in vivo y/o vida media incrementada en suero debe entenderse que abarca cualesquiera una dos o todas estas propiedades En una modalidad interesante un conjugado o polipeptido como se describe en la presente invención tiene al menos dos de estas propiedades por ejemplo inmunogenicidad reducida y vida media funcional incrementada in vivo inmunogemcidad reducida y vida media en suero incrementada o vida media funcional incrementada in vivo y vida media en suero incrementada El termino bajo condiciones comparables como se utiliza acerca de la medición de propiedades relativas (mas que absolutas) de una molécula para uso en la invención y una molécula de referencia se pretende que indique que la propiedad relevante de las dos moléculas se ensaya utilizando el mismo ensayo (por ejemplo el ensayo se lleva a cabo bajo las mismas condiciones incluyendo el mismo estándar interno) y cuando es relevante el mismo tipo de animales El termino que exhibe actividad IFNB se pretende que indique que el polipeptido o conjugado tiene una o mas de las funciones del IFNB nativo en particular el IFNB de humano de tipo silvestre con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO 2 (la cual es la secuencia madura) opcionalmente expresada en una célula hospedera glucosilada o cualesquiera de los productos de IFNB comercialmente disponibles Dichas funciones incluyen la capacidad de unirse a un receptor del interferon que es capaz de unirse al IFNB e iniciar la señalización intracelular a partir del receptor en particular un receptor del interferon tipo I constituido por las subunidades del receptor IFNAR 2 e IFNAR 1 (Domanski et al The Journal of Biological Chemistry Vol 273 No 6 pp 3144 3147 1998 Mogensen et al Journal of Interferon and Cytokine Research 19 1069 1098 1999) y actividad antiviral antiprohferativa o inmunomoduladora (la cual se puede determinar utilizando ensayos conocidos en la técnica (por ejemplo aquellos mencionados en la siguiente descripción)) La actividad de IFNB se puede ensayar mediante métodos conocidos en la técnica como se ejemplifica en la sección de Matenales y Métodos a continuación El polipeptido o conjugado que exhibe o que tiene actividad de IFNB es considerado que tiene dicha actividad cuando exhibe una función que se puede medir por ejemplo una unión al receptor y actividad estimulante que se pueden medir (por ejemplo se determina mediante el ensayo primario o secundario descrito en la sección de Materiales y Métodos) El pohpeptido que exhibe actividad de IFNB también se puede denominar molécula IFNB polipeptido vanante del IFNB o polipeptido IFNB en la presente invención Los términos pohpeptido IFNB vanante IFNB y polipeptido vanante se utilizan inicialmente en la presente invención acerca de pohpeptidos modificados para uso en la invención El termino IFNB parental se pretende que indique la molécula inicial a ser mejorada para uso de conformidad con la presente invención Preferiblemente el IFNB parental pertenece a la familia de secuencia IFNB Mientras que el IFNB parental puede ser de cualquier origen tal como de origen de vertebrado o de mamífero (por ejemplo cualesquiera de los orígenes definidos en WO 00/23472) el IFNB parental preferiblemente es IFNB humano de tipo silvestre con la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO 2 o una vanante de la misma En el contexto de un polipeptido IFNB parental una vanante es un pohpeptido el cual difiere en uno o mas residuos de aminoácidos a partir del polipeptido IFNB parental tal como el IFNB humano de tipo silvestre Típicamente la vanante difiere a partir del polipeptido IFNB parental tal como el IFNB humano de tipo silvestre en 1 15 residuos de aminoácidos 1 10 residuos de aminoácidos 1 8 residuos de aminoácidos 2 8 residuos de aminoácidos 1 5 residuos de aminoácidos o 2-5 residuos de aminoácidos Por lo tanto típicamente la vanante difiere a partir del polipeptido IFNB parental tal como el IFNB humano de tipo silvestre en 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 12 13 14 o 15 residuos de aminoácidos Los ejemplos de los polipeptidos IFNB humano de tipo silvestre incluyen la parte pohpeptidica de Avonex® o Rebif® Un ejemplo de una variante IFNB parental es Betaseron© Alternativamente el polipeptido IFNB parental puede comprender una secuencia de aminoácidos la cual es una molécula híbrida entre IFNB y otro polipeptido homologo tal como interferon a opcionalmente conteniendo una o mas sustituciones adicionales introducidas dentro de la molécula hibnda Dicha molécula híbrida puede contener una secuencia de aminoácidos la cual difiere en mas de 10 residuos de aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO 2 Con el objeto de ser util como un pohpeptido parental la molécula híbrida exhibe actividad de IFNB (por ejemplo como se determina en el ensayo secundario descrito en la sección de Materiales y Métodos en la presente invención) Otros ejemplos de variantes del IFNB humano de tipo silvestre que pueden servir como moléculas IFNB parenterales en la presente invención son las variantes descritas en WO 01/15736 que tienen residuos de aminoácidos introducidos y/o removidos que comprenden un grupo de unión para una porción no pohpeptidica o cualesquiera de las moléculas IFNB descritas en WO 00/23114 WO 00/23472 WO 99/3887 o que de otra manera se encuentran disponibles en la técnica El termino sitio funcional como se utiliza acerca de un polipeptido o conjugado para uso en la invención se pretende que indique uno o mas residuos de aminoácidos el cual es/son esenciales para o que de otra manera están implicados en la función o desempeño del IFNB y asi se localizan en el sitio funcional El sitio funcional es por ejemplo un sitio para unión al receptor y se puede determinar mediante métodos conocidos en la técnica preferiblemente mediante análisis de una estructura del polipeptido que se forma en complejo con un receptor relevante tal como el receptor del interferon tipo I constituido por IFNAR-1 e IFNAR-2 El presente contexto el termino glucosilacion incrementada se pretende que indique niveles incrementados de moléculas de carbohidrato unidas normalmente obtenidas como una consecuencia de la utilización incrementada (o de una mejor utilización) del sitio(s) de glucosilacion La glucosilacion incrementada se puede determinar mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica para analizar las estructuras de los carbohidratos unidos Un ensayo conveniente para determinar las estructuras de carbohidratos unidos es el método descrito en el ejemplo 7 y 8 en la presente invención Un residuo de aminoácido localizado cercano a un sitio de glucosilacion usualmente se localiza en la posición 4 3 2 1 +1 +2 +3 o +4 con relación al residuo de aminoácido del sitio de glucosilacion al cual esta unida la porción de azúcar en particular en la posición 2 1 +1 o +2 tal como en la posición -1 o +1 en particular en la posición 1 Estas posiciones se pueden modificar para incrementar la glucosilacion en el sitio La modificación normalmente es una sustitución la sustitución se realiza con cualquier otro residuo de aminoácido que da lugar a una glucosilacion incrementada de la variante IFNB en comparación con la del polipeptido IFNB parental Dicho otro residuo de aminoácido se puede determinar mediante experimentos de tipo ensayo y error (por ejemplo mediante sustitución del residuo de aminoácido de la posición relevante con cualquier otro residuo de aminoácido y la determinación de la glucosilacion resultante de la variante resultante) Cuando se utiliza en la presente invención el termino sitio de glucosilacion que se presenta naturalmente se pretende que signifique el sitio de N-glucosilacion definido por N80 y T82 Cuando se utiliza en la presente invención el termino evento cerebrovascular se pretende que signifique una condición resultante a partir de la muerte del tejido cerebral que resulta de la ausencia de flujo sanguíneo y oxigenación insuficiente al cerebro Los términos evento cerebrovascular1 y accidente cerebrovascular (o CVA ) se utilizan de manera intercambiable en la presente invención Como se explico anteriormente un evento cerebrovascular puede ser isquémico o hemorragico Los ejemplos específicos de eventos cerebrovasculares isquémicos comprenden un evento cerebrovascular embohco evento cerebrovascular cardioembohco evento cerebrovascular trombótico trombosis por vasos sanguíneos grandes infarto lacunar evento cerebrovascular arteria arteria y evento cerebrovascular criptogenico Los ejemplos específicos de eventos cerebrovasculares hemorragicos comprenden el evento cerebrovascular subdural evento cerebrovascular intraparenquimal evento cerebrovascular epidural y evento cerebrovascular subaracnoideo En el presente contexto el termino ataque isquémico transitorio se pretende que abarque una perturbación en el funcionamiento cerebral resultante a partir de una deficiencia temporal en el abastecimiento de sangre al cerebro Vanantes para uso en la invención En una modalidad preferida de la invención el pohpeptido IFNB es una vanante del IFNB de humano de tipo silvestre en donde dicha vanante comprende al menos un sitio de glucosilacion in vivo introducido (adicional) El sitio de glucosilacion in vivo introducido puede ser un sitio de O glucosilacion pero preferiblemente es un sitio de N glucosilacion Con el objeto de asegurar que las porciones de azúcar están unidas a los sitios de glucosilacion se entenderá que dichas vanantes glucosiladas se deben producir en una célula hospedera capaz de llevar a cabo glucosilacion Por lo tanto en una modalidad preferida la presente invención se refiere al uso de una vanante pohpeptidica del IFNB que comprende una secuencia de aminoácidos la cual difiere a partir de la secuencia de aminoácidos del IFNB humano de tipo silvestre (SEQ ID NO 2) en que al menos un sitio de N-glucosilacion in vivo ha sido introducido para la elaboración de un medicamento para el tratamiento del evento cerebrovascular o ataque isquémico transitorio en un primate prefenblemente en un humano Mas particularmente el sitio de N glucosilacion in vivo se introduce dentro de una posición de la molécula del IFNB parental ocupada por un residuo de aminoácido expuesto a la superficie de la molécula preferiblemente con mas del 25% de la cadena lateral expuesta al solvente en particular con mas del 50% expuesta al solvente (estas posiciones se identifican en la sección de Métodos en la presente invención) El sitio de N glucosilacion in vivo se introduce de tal manera que el residuo N de dicho sitio se localiza en dicha posición De manera análoga un sitio de O glucosilacion se introduce de tal manera que el residuo S o T que hace dicho sitio se localiza en dicha posición Ademas con el objeto de asegurar la glucosilacion eficiente se prefiere que el sitio de glucosilacion in vivo en particular el residuo N del sitio de N glucosilacion o el residuo S o T del sitio de O glucosilacion se localice dentro de los primeros 141 residuos de aminoácidos del polipeptido IFNB mas preferiblemente dentro de los primeros 116 residuos de aminoácidos Las sustituciones que llevan a la introducción de un sitio adicional de N glucosilacion in vivo en las posiciones expuestas en la superficie de la molécula de IFNB parental y ocupadas por los residuos de aminoácidos que tienen mas del 25% de la cadena lateral expuesta al solvente incluyen sustituciones seleccionadas a partir del grupo que consiste de S2N+N4S/T L6S/T L5N+G7S/T F8N+Q10S T L9N+R1 1S T R1 1 N R1 1 N+S13T S12N+N14S T F15N+C17SfT Q16N+Q18S/T Q18N+L20S T K19N+L21S/T W22N+L24S T Q23N+H25S/T G26N+L28S/T R27N+E29S/T L28S+Y30Sfl" Y30N+L32SH" L32N+D34SH" K33N+R35S/T R35N+N37ST M36N+F38S/T D39S/T D39N+P41S T E42N+144S T Q43N+K45S/T K45N+L47S/T Q46N+Q48S/T L47N+Q49T/S Q48N+F50ST Q49N+Q51S/T Q51N+E53S/T K52N+D54S/T L57N+159ST Q64N+I66SH" A68N+F70ST R71N+D73ST Q72N Q72N+S74T D73N D73N+S75T S75N+T77S S75N S76N+G78ST E81N+I83ST T28N+V84ST E85N+L87S/T L88SfT A89N+V91ST Y92ST Y92N+Q94SH" H93N+I95S/T L98S/T H97N+K99SH" K99N+V101ST T100N+L102S/T E103N+K105SAT E104N+L106S/T K105N+E107SH" E107N+E109Sn~ K108N+D110S/T E109N+F111S/T D110N+T112S D110N F111N+R113S/T R113N+K115S/T G114N+L116S/T K115N+ 117S T L116N L116N+S118T S119N+H212S/T L120N+L122SH" H121 N+K123ST K123N+Y125ST R124N+Y126S/T G127N+M29SfT R128N+L130S/T L130N+Y132S/T H131N+L133S/T K134N+K136ST A135N+E137ST K136N+Y138S T E137N Y138N+H140ST H140N+A142Sfi" V148N+I150S/T R152N+F154SH" Y155N+I157S/T L160S/T R159N+T161S R159N G162N+L164SH" e Y163N+R154ST Las sustituciones que llevan a la introducción de un sitio de adicional de N glucosilacion m vivo en las posiciones expuestas en la superficie de la molécula IFNB parental que tienen mas del 50% de la cadena lateral expuesta al solvente incluyen las sustituciones seleccionadas a partir del grupo que consiste de L6S/T L5N+G7ST F8N+Q10ST L9N+R11S/T S12N+N14S/T F15N+C17S/T Q16N+Q18ST K19N+L21S/T W22N+L24S T Q23N+H25S/T G26N+L28ST R27N+E29S/T Y30N+L32ST K33N+R35ST R35N+N37S/T 36N+F38SAT D39S/T D39N+P41S/T E42N+144S/T Q46N+Q48SH" Q48N+F50ST Q49N+Q51SH" Q51N+E53S T K52N+D54S T L57N+159S/T R71N+D73ST D73N D73N+S75T S75N+T77S S75N S76N+G78S/T E81N+I83SAT T28N+V84S T E85N+L87S T A89N+V91ST Y92ST Y92N+Q94S r H93N+I95S/T T100N+L102S/T E103N+K105S/T E104N+L106ST E107N+E109S " K108N+D110Sfl" D110N+T112S D110N F111 +R113S/T R113N+K115S/T L116N L116N+S118T K123N+Y125ST R124N+Y126SAT G127N+I129S/T H131N+L133S/T K134N+K136ST A135N+E137S/T E137N V148N+l150S/Te Y155N+I157S/T Entre las sustituciones mencionadas en las listas anteriormente mencionadas se prefieren aquellas que tienen el residuo N introducido entre los 141 residuos de aminoácidos N terminales en particular entre los 116 residuos de aminoácidos N terminales Las sustituciones actualmente mas pretendas incluyen sustituciones seleccionadas a partir del grupo que consiste de S2N+N4T/S L9N+R11T/S R11N S12N+N14T/S F15N+C17S/T Q16N+Q18T/S K19N+L21T/S Q23N+H25T/S G26N+L28T/S R27N+E29T/S L28N+Y30T/S D39T/S K45N+L47T/S Q46N+Q48T/S Q48N+F50T/S Q49N+Q51T/S Q51N+E53T/S R71N+D73T/S Q72N D73N S75N S76N+G78T/S L88T/S Y92T/S N93N+I95T/S L98S/T E103N+K105T/S E104N+L106T/S E107N+E109T/S K108N+D1 10T/S D1 10N F1 1 1 +R1 13T/S y L1 16N mas preferiblemente seleccionado a partir del grupo que consiste de S2N+N4T L9N+R1 1T Q49N+Q51T R71 N+D73T y F11 1 N+R113T incluso mas prefenblemente seleccionado a partir del grupo que consiste de Q49N+Q51T R71 N+D73T y F1 1 1 N+R1 13T en particular seleccionado a partir del grupo que consiste de Q49N+Q51 T y F111 N+R1 13T Los ejemplos específicos de vanantes preferidas del IFNB incluyen vanantes que comprenden sustituciones seleccionadas a partir del grupo que consiste de Q49N+Q51T+F111 +R113T Q49N+Q51T+R71 N+D73T+F1 1 1 N+R1 13T S2N+N4T+F111 +R113T S2N+N4T+Q49N+Q51T S2N+N4T+Q49N+Q51T+F1 1 1 +R113T S2N+N4T+L9N+R1 1T+Q49N+Q51T S2N+N4T+L9N+R1 1T+F111 N+R113T S2N+N4T+L9N+R1 11T+Q49N+Q51T+F111 N+R1 13T L9N+R1 1T+Q49N+Q51T L9N+R1 1T+Q49N+Q51T+F1 1N+R1 13T o L9N+R1 1T+F11 1 N+R1 13T Mas preferiblemente la variante IFNB comprende las sustituciones Q49N+Q51T+F11 1 N+R113T (que llevan a la introducción de dos sitios adicionales de N glucosilacion in vivo) Se entenderá que con el objeto de introducir un sitio funcional de N-glucosilacion m vivo el residuo de aminoácido entre el residuo N y el residuo S/T es diferente de un residuo de prolina Normalmente el residuo de aminoácido en medio sera capaz de ocupar la posición relevante en la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO 2 Por ejemplo en el polipeptido que comprende las sustituciones Q49N+Q51T la posición 50 es la posición en medio La variante IFNB puede contener un solo sitio de glucosilacion in vivo (por ejemplo el sitio de N glucosilacion in vivo que se presenta naturalmente en N80) No obstante con el objeto de obtener una protección eficiente de los epitopes presentes en la superficie del polipeptido parental frecuentemente se desea que el polipeptido comprenda mas de un sitio de glucosilacion m vivo en particular 2 7 o 2 5 sitios de glucosilacion in vivo tales como 2 3 4 5 6 o 7 sitios de glucosilacion in vivo Por lo tanto el polipeptido IFNB puede comprender un sitio de glucosilacion adicional (ademas del sitio de N glucosilacion in vivo que se presenta naturalmente ya presente en la posición N80) o puede comprender 1 6 o 1 4 sitios de glucosilacion in vivo adicionales (introducidos) tales como 1 2 3 4 5 o 6 sitios de glucosilacion in vivo adicionales (introducidos) Preferiblemente dichos sitios de glucosilacion in vivo son sitios de N-glucosilacion in vivo Por consiguiente la vanante IFNB puede contener una porción de azúcar (por ejemplo la porción de azúcar que se presenta naturalmente presente en N80) pero es deseable que la vanante IFNB comprenda mas de una porción de azúcar en particular 2 7 o 2 5 porciones de azúcar tales como 2 3 4 5 6 o 7 porciones de azúcar En una modalidad altamente preferida el pohpeptido IFNB comprende tres sitios de N glucosilacion in vivo (por ejemplo dos sitios adicionales (introducidos) de N-glucosilacion in vivo (ademas del sitio de N glucosilacion que se presenta naturalmente en N80)) por ejemplo la vanante IFNB comprende tres sitios de N-glucosilacion in vivo y tres porciones de azúcar En una modalidad preferida particular los tres sitios de N glucosilacion m vivo se localizan en las posiciones 49 80 y 1 11 Modificaciones adicionales Cualesquiera de las vanantes glucosiladas anteriormente descritas pueden ser modificadas adicionalmente Por ejemplo se prefiere actualmente que el pohpeptido IFNB este libre de un residuo de cisterna por ejemplo el residuo de cisterna localizado en la posición 17 de SEQ ID NO 2 Preferiblemente el residuo de cisterna ha sido removido mediante la sustitución C17S Por consiguiente en una modalidad preferida la presente invención se refiere al uso de una vanante polipeptidica del IFNB que comprende una secuencia de aminoácidos la cual difiere de la secuencia de aminoácidos del IFNB humano de tipo silvestre (SEQ ID NO 2) en que al menos un sitio de N-glucosilacion in vivo ha sido introducido y en donde el residuo de cisterna localizado en la posición 17 ha sido removido para la elaboración de un medicamento para el tratamiento del evento cerebrovascular o ataque isquémico transitorio en un primate preferiblemente en un humano Preferiblemente dicho residuo de cisterna ha sido removido mediante la sustitución C17S Los ejemplos específicos de vanantes particulares preferidas del IFNB incluyen vanantes que comprenden sustituciones seleccionadas a partir del grupo que consiste de C17S+Q49N+Q51T C17S+F1 11 N+R1 13T C17S+Q49N+Q51 T+F 1 1 1 +R113T C17S+Q49N+Q51T+R71 N+D73T+F1 1 1 N+R1 13T S2N+N4T+C17S+F1 11 N+R1 13T S2N+N4T+C17S+Q49N+Q51T S2N+N4T+C17S+Q49N+Q51T+F111 N+R1 13T S2N+N4T+L9N+R1 1T+C17S+Q49N+Q51T S2N+N4T+L9N+R11T+C17S+F1 11 N+R1 13T S2N+N4T+L9N+R1 1T+C17S+Q49N+Q51T+F1 1 1N+R1 13T L9N+R1 1T+C17S+Q49N+Q51T L9N+R11T+C17S+Q49N+Q51T+F11 1 N+R113T y L9N+R11T+C17S+F111 N+R1 13T Mas preferiblemente la vanante IFNB comprende las sustituciones C17S+Q49N+Q51T+F11 1 N+R113T (que llevan a la introducción de dos sitios adicionales de N glucosilacion in vivo en las posiciones 49 y 111 y la remoción del residuo de cisterna en la posición 17) En una modalidad adicionalmente preferida la vanante IFNB comprende adicionalmente una o mas sustituciones localizadas de manera cercana a un sitio de glucosilacion con el objeto de optimizar o incrementar la glucosilacion en el sitio Los ejemplos específicos se describen en la sección titulada vanantes con glucosilacion incrementada Vanants with mcreased glycosylation pp 14 23 en WO 02/074806 En una modalidad interesante de la invención la variante IFNB comprende una sustitución de aminoácido en la posición 48 en particular si la variante comprende un sitio de N glucosilacion in vivo introducido en la posición 49 Preferiblemente el residuo de glutamina localizado en la posición 49 se sustituye con un residuo de aminoácido hidrófobo tal como Q48F Q48V Q48W o Q48Y En una modalidad altamente preferida de la invención la variante IFNB comprende una sustitución de aminoácido en la posición 110 en particular si la variante comprende un sitio de N-glucosilacion in vivo introducido en la posición 1 11 Preferiblemente el residuo de acido aspartico localizado en la posición 1 10 se sustituye con un residuo de aminoácido hidrófobo tal como D1 10F D110V D110W o D1 10Y En una modalidad particularmente preferida la vanante comprende la sustitución D110F preferiblemente en combinación con las sustituciones F11 1 N+R113T/S en particular F111 +R1 13T Por consiguiente los ejemplos específicos de las variantes particulares preferidas del IFNB incluyen vanantes que comprenden sustituciones seleccionadas a partir del grupo que consiste de D1 10F+F1 11 N+R113T Q49N+Q51T+D110F+F1 11 N+R113T Q49N+Q51T+R71 N+D73T+D1 10F+F1 1 1 N+R1 13T S2N+N4T+D1 10F+F11 1 N+R113T S2N+N4T+Q49N+Q51T+D110F+F1 1 1 N+R113T S2N+N4T+L9N+R1 1T+D110F+F11 1 N+R113T S2N+N4T+L9N+R1 1T+Q49N+Q51T+D1 10F+F11 1 N+R1 13T L9N+R1 1T+Q49N+Q51T+D110F+F1 11 +R1 13T y L9N+R11T+ D1 10F+F1 1 1 N+R1 13T Incluso mas preferiblemente la vanante del IFNB comprende sustituciones seleccionadas a partir del grupo que consiste de C17S+ D1 10F+F111 N+R1 13T C17S+Q49N+Q51T+D1 10F+F1 1 1 N+R1 13T C17S+Q49N+Q51T+R71 N+D73T+D1 10F+F111 N+R1 13T S2N+N4T+C17S+D1 10F+F1 1 1 N+R1 13T S2N+N4T+C17S+Q49N+Q51T+D110F+F1 1 1 N+R1 13T S2N+N4T+L9N+R1 1T+C17S+D1 10F+F1 11 N+R1 13T S2N+N4T+L9N+R1 1T+C17S+Q49N+Q51T+D1 10F+F1 1 1 N+R1 1 T L9N+R1 1T+C17S+Q49N+Q51T+D1 10F+F111 N+R113T y L9N+R1 1T+C17S+D110F+F111 N+R1 13T Mas preferiblemente la vanante IFNB comprende las sustituciones C17S+Q49N+Q51T+D1 10F+F111 N+R1 13T (SEQ ID NO 3) Conjugación Las vanantes glucosiladas descritas anteriormente se pueden conjugar de manera adicional con una porción no pohpeptidica la cual es diferente a partir de una porción de azúcar Los ejemplos específicos se describen en WO 01/15736 en las secciones tituladas conjugado de la invención en donde la porción no pohpeptidica es una molécula que tiene hsina como un grupo de unión Conjúgate of the invention wherein the non polypeptide moiety is a molecule that has lisine as an attachment group (pp 17 22) conjugado de la invención en donde la porción no polipeptidica se une a un residuo de cisterna Conjúgate of the invention wherein the non polypeptide moiety bmds to a cysteine residue (pp 22-23) y conjugado de la invención en donde la porción no polipeptidica se une a un grupo acido Conjúgate of the invention wherein the non polypeptide moiety bmds to an acid group (pp 23-25) Mediante la remoción y/o introducción de residuos de aminoácidos que comprenden un grupo de unión para la porción no polipeptidica es posible adaptar específicamente el polipeptido para hacer a la molécula mas susceptible a la conjugación con la porción no polipeptidica de elección para optimizar el patrón de conjugación (por ejemplo para asegurar una distribución óptima de las porciones no polipeptidicas en la superficie de la molécula IFNB y asi por ejemplo proteger efectivamente a los epitopes y a otras partes de los polipeptidos de la superficie sin deteriorar significativamente la función de los mismos) Por ejemplo mediante la introducción de grupos de unión el polipeptido IFNB es reforzado o de otra manera alterado en el contexto de los residuos específicos de aminoácidos a los cuales la porción no polipeptidica relevante se une por medio de las cuales se alcanza una conjugación mas eficiente especifica y/o extensiva Mediante la remoción de uno o mas grupos de unión es posible evitar la conjugación con la porción no polipeptidica en las partes del pohpeptido en las cuales dicha conjugación es desventajosa por ejemplo a un residuo de aminoácido localizado en o cerca de un sitio funcional del polipeptido (puesto que la conjugación en dicho sitio puede producir la inactivación o la actividad reducida del IFNB del conjugado resultante debido al reconocimiento deteriorado del receptor) Ademas puede ser ventajoso remover un grupo de unión localizado de manera cercana a otro grupo de unión con el objeto de evitar la conjugación heterogénea a dichos grupos Se entenderá que el residuo de aminoácido que comprende un grupo de unión para una porción no polipeptidica ya sea removida o introducida se selecciona con base en la naturaleza de la porción no polipeptidica y en la mayoría de los casos con base en el método de conjugación a ser utilizado Por ejemplo cuando la porción no polipeptidica es una molécula polimerica tal como una molécula derivada de polietilenglicol u oxido de polialquileno los residuos de aminoácidos capaces de funcionar como un grupo de unión se pueden seleccionar a partir del grupo que consiste de lisina cisterna acido aspartico acido glutamico y arginina Cuando la porción no polipeptidica es una porción de azúcar el grupo de unión es un sitio de glucosilacion m vivo preferiblemente un sitio de N glucosilacion Cada vez que un grupo de unión para una porción no polipeptidica sea introducido o removido a partir del pohpeptido IFNB la posición del polipeptido IFNB a ser modificado se selecciona convenientemente como sigue La posición se localiza preferiblemente en la superficie del pohpeptido IFNB y mas preferiblemente se ocupa por un residuo de aminoácido que tiene mas del 25% de su cadena lateral expuesta al solvente preferiblemente mas del 50% de su cadena lateral expuesta al solvente Dichas posiciones han sido identificadas con base en un análisis de una estructura 3D de la molécula IFNB humano de tipo silvestre como se describe en la sección de Métodos en la presente invención La vida media funcional in vivo depende entre otras cosas del peso molecular del conjugado y del numero de grupos de unión necesarios para proveer una vida media incrementada dependiendo asi del peso molecular de la porción no polipeptidica en cuestión En una modalidad el conjugado para uso en la invención tiene un peso molecular de al menos 67 kDa en particular al menos 70 kDa como se mide mediante SDS PAGE de conformidad con Laemmli U K Nature Vol 227 (1970) p 680 85 El IFNB tiene un peso molecular de aproximadamente 20 kDa y por lo tanto se requieren de aproximadamente 50 kDa adicionales para obtener el efecto deseado Esto se puede proveer por ejemplo mediante moléculas PEG de 5 10 12 o 20 kDa o como se describió de otra manera en la presente invención En una modalidad adicional el conjugado para uso en la invención tiene una o mas de las siguientes propiedades mejoradas (determinadas bajo condiciones comparables) Inmunogenicidad reducida en comparación con el IFNB humano de tipo silvestre (por ejemplo Avonex® o Rebif®) o a Betaseron® tal como una reducción de al menos 25% mas preferiblemente de al menos 50% e incluso mas preferiblemente de al menos 75% La vida media funcional in vivo incrementada y/o vida media en suero incrementada en comparación con el IFNB humano de tipo silvestre (por ejemplo Avonex® o Rebif® o a Betaseron® La reacción reducida o la ausencia de reacción con los anticuerpos neutralizantes a partir de pacientes tratados con el IFNB humano de tipo silvestre (por ejemplo Rebif® o Avonex®) o con Betaseron® por ejemplo una reducción de la neutralización de al menos 25% tal como al menos 50% y preferiblemente de al menos 75% en comparación con el IFNB humano de tipo silvestre (por ejemplo Rebif® Avonex®) o Betaseron® La magnitud de la actividad antiviral de un conjugado para uso en la invención puede no ser critica y por lo tanto se puede reducir (por ejemplo por hasta un 75%) o se puede incrementar (por ejemplo por al menos 5%) o puede ser igual a la del IFNB humano de tipo silvestre ((por ejemplo Avonex® o Rebif®) o a Betaseron® como se determina bajo condiciones comparables Ademas el grado de actividad antiviral en comparación con la actividad antiproliferativa de un conjugado para uso en la invención puede variar y por lo tanto puede ser mayor menor o igual a la del IFNB humano de tipo silvestre La porción no polipeptidica preferiblemente es una molécula polimenca tal como PEG y el polímero esta covalentemente unido a un residuo de aminoácido de la variante en donde el residuo de aminoácido comprende un grupo de unión para la molécula polimerica Los ejemplos de dichos grupos de unión se muestran en el cuadro en la pagina 7 8 en WO 03/002152 Los grupos de unión preferidos incluyen el N-termmal del grupo amino el grupo e amino de un residuo de lisina y el grupo -S H de un residuo de cisterna en particular el grupo N-terminal amino y el grupo e amino de un residuo de hsina En una modalidad preferida al menos un residuo de hsina del polipeptido parental ha sido removido por ejemplo mediante cualesquiera de las sustituciones mencionadas en la sección titulada conjugado de la invención en donde la porción no polipeptidica es una molécula la cual tiene lisina como un grupo de unión- Conjúgate of the invention wherein the non polypeptide moiety is a molecule which has hsme as an attachment group pp 17-23 en WO 01/15736 Por lo tanto en una modalidad de este aspecto de la invención la secuencia de aminoácidos de la vanante IFNB difiere a partir de la del IFNB humano de tipo silvestre en que al menos un residuo de lisina ha sido removido Típicamente 1 5 residuos de lisina han sido removidos en particular 1-4 o 1 3 residuos de lisina han sido removidos El residuo(s) de lisina a ser removido preferiblemente mediante sustitución se selecciona a partir del grupo que consiste de K19 K33 K45 K52 K99 K105 K108 K1 15 K123 K134 y K136 preferiblemente K19 K33 K45 y K123 El residuo(s) de hsina se puede reemplazar con cualquier otro residuo de aminoácido pero preferiblemente se reemplaza por un residuo de arginina o una glutamina con el objeto de dar lugar a la diferencia estructural mínima Por consiguiente las variantes IFNB descritas en la presente invención pueden contener sustituciones adicionales seleccionadas a partir del grupo que consiste de K19R K33R K45R K123R K19R+K33R K19R+K45R K19R+K123R K33R+K45R K33R+K123R K45R+K123R K19R+K45R+K123R K19R+K33R+K123R K19R+K33R+K45R K33R+K45R+K123R y K19R+K33R+K45R+K123R prefenblemente K19R+K45R+K123R K19R+K33R+K123R K19R+K33R+K45R y K33R+K45R+K123R en particular K19R+K33R+K45R Por lo tanto los ejemplos específicos de los conjugados IFNB preferidos a los cuales al menos una porción no polipeptidica tal como una molécula polime ca en particular PEG esta covalentemente unida a un grupo de unión de un residuo de aminoácido de la vanante incluye vanantes IFNB que comprenden sustituciones seleccionadas a partir del grupo que consiste de C17S+Q49N+Q51T+K19R+K33R+K45R C17S+D110F+F11 1 +R113T+K19R+K33R+K45R C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111 N+R1 13T+K19R+K33R+K45R C17S+Q49N+Q51T+R71 N+D73T+D1 10F+F1 1 1 N+R1 13T+K19R +K33R+K45R S2N+N4T+C17S+D110F+F11 1 N+R1 13T+K19R+K33R+K45R S2N+N4T+C17S+Q49N+Q51T+D110F+F1 1 N+R113T+K19R+K 33R+K45R S2N+N4T+L9N+R1 1T+C17S+D110F+F1 11 N+R1 13T+K19R+K3 3R+K45R S2N+N4T+L9N+R1 1T+C17S+Q49N+Q51T+D1 10F+F111 N+R11 3T+K19R+K33R+K45R L9N+R1 1T+C17S+Q49N+Q51T+D1 10F+F11 1 N+R113T+K19R+ K33R+K45R y L9N+R1 1T+C17S+D110F+F11 1 N+R113T+K19R+K33R+K45R en particular C17S+Q49N+Q51 T+D110F+F1 1 1 N+R1 13T+K19R+ 33R+K45R Cuando la vanante del IFNB esta polietilenglucosilada esta usualmente comprende 1 5 moléculas de pohetilenglicol (PEG) En una modalidad adicional la molécula de IFNB comprende 1-5 moléculas de PEG tales como 1-3 moléculas de PEG por ejemplo 1 2 o 3 moléculas de PEG En una modalidad adicional cada molécula de PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 5 kDa (kiloDaltones) a 100 kDa tal como un peso molecular de aproximadamente 10 kDa a 40 kDa por ejemplo de aproximadamente 12 kDa o de aproximadamente 20 kDa En una modalidad particular preferida de la invención la vanante del IFNB comprende 1 molécula de PEG que tiene un peso molecular de aproximadamente 20 kDa Cuando se utiliza acerca de moléculas pohmericas en la presente invención la palabra aproximadamente indica un peso molecular promedio aproximado y refleja el hecho de que normalmente sera una distribución de peso molecular fija en una preparación del polímero dado Las moléculas adecuadas de PEG están disponibles a partir de Shearwater Polymers Inc y Enzon Inc y se pueden seleccionar a partir de SS PEG NPC PEG aldehid PEG mPEG-SPA mPEG SCM mPEG BTC SC PEG mPEG tresilatdo (US 5 880 255) u oxicarbonil-oxi-N dicarboxnmida PEG (US 5 122 614) Métodos para preparar un coniugado Los detalles específicos que se refieren a la conjugación de porciones no polipept/dicas en particular polímeros del PEG a las vanantes del IFNB descritas en la presente invención se dan en la sección titulada Métodos para preparar un conjugado de la invención Methods of prepanng a conjúgate of the invention pp 32-40 en WO 01/15736 Acoplamiento a una porción de azúcar Con el objeto de lograr la glucosilacion in vivo de un pohpeptido del IFNB como se describe en la presente invención la secuencia nucleotidica que codifica la vanante del IFNB se debe insertar en un hospedero para expresión en eucanonte para glucosilacion tal como una célula CHO Las células hospederas adecuadas para expresión se describen en la sección titulada acoplamiento a una porción de azúcar couplmg to a sugar moiety p 36 en WO 01/15736 Métodos para preparar una vanante polipeptidica del IFNB Las vanantes del IFNB para uso en la presente invención opcionalmente en forma glucosilada se pueden producir mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica Dichos métodos incluyen la construcción de una secuencia nucleotidica que codifica la vanante polipeptidica y que expresa la secuencia en un hospedero adecuado transformado o transfectado No obstante los polipeptidos para uso en la invención se pueden producir aunque menos eficientemente mediante síntesis química o una combinación de síntesis química o una combinación de síntesis química y tecnología de ADN recombinante La secuencia nucleotidica que codifica un pohpeptido del IFNB para uso en la presente invención se puede construir mediante el aislamiento o la síntesis de una secuencia nucleotidica que codifica el IFNB parental por ejemplo con la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO 2 y luego cambiando la secuencia nucleotidica de manera que se realiza la introducción (por ejemplo inserción o sustitución) o remoción (por ejemplo delecion o sustitución) del residuo(s) de aminoácido relevante La secuencia nucleotidica se modifica convenientemente mediante mutagenesis sitio dirigida de conformidad con los métodos bien conocidos véase por ejemplo Mark et al Site-specific Mutagenesis of the Human Fibroblast Interferon Gene Proc Nati Acad Sci USA 81 pp 5662 66 (1984) y US 4 588 585 Alternativamente la secuencia nucleotidica se prepara mediante síntesis química por ejemplo mediante el uso de un sintetizador de ohgonucleotido en donde los oligonucleotidos se diseñan basándose en la secuencia de aminoácidos del polipeptido deseado y preferiblemente seleccionando aquellos codones que son favorecidos en la célula hospedera en la cual se producirá el polipeptido recombinante Por ejemplo diversos oligonucleotidos pequeños que codifican porciones del polipeptido deseado se pueden sintetizar y ensamblar mediante PCR ligación o reacción de ligación en cadena (LCR) Los oligonucleotidos individuales típicamente contienen extensiones 5 o 3 para el ensamblaje complementario Una vez ensambladas (mediante síntesis mutagenesis sitio dirigida u otro método) la secuencia nucleotidica que codifica el polipeptido del IFNB se inserta dentro de un vector recombinante y se asocia operativamente con las secuencias control necesarias para la expresión de la vanante del IFNB en la célula hospedera transformada deseada Una descripción detallada de la producción de las vanantes del IFNB descrita en la presente invención incluyendo vectores de expresión adecuados secuencias control células hospederas medios de producción técnicas de purificación etc se puede encontrar en la sección titulada Métodos para la preparación de un polipeptido de interferon para uso en la invención Methods of prepanng an interferon polypeptide for use in the invention pp 43 51 en WO 01/15736 La actividad biológica de los polipeptidos del IFNB se puede ensayar mediante cualquier método conocido en la técnica Dichos ensayos incluyen neutralización del anticuerpo de actividad antiviral inducción de la proteina cinasa actividades de ohgoadenilato 2 5 A sintetasa o fosfodiesterasa como se describe en EP 041 313 B1 Dichos ensayos también incluyen ensayos inmunomoduladores (véase por ejemplo US 4 753 795) ensayos para la inhibición del crecimiento y medición de la unión a las células que expresan los receptores del interferon Los ensayos específicos para determinar la actividad biológica de los polipeptidos o conjugados para uso en la invención se descnben en la sección del Materiales y Métodos en la presente invención Composición farmacéutica Las moléculas de IFNB se pueden utilizar tal como se encuentran y/o en una forma de sal de las mismas Las sales adecuadas incluyen pero no se limitan a sales con metales alcalinos o metales terreos alcalinos tales como sodio potasio litio calcio y magnesio asi como por ejemplo sales de zinc Estas sales o complejos pueden estar presentes como una estructura cristalina y/o amorfa La molécula del IFNB preferiblemente se administra en una composición que incluye adicionalmente un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable Farmacéuticamente aceptable significa un vehículo o excipiente que no ocasiona ningún efecto adverso en pacientes a los cuales se administra Dichos vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables se conocen bien en la técnica La molécula de IFNB se puede formular dentro de composiciones farmacéuticas mediante métodos bien conocidos Las formulaciones adecuadas se describen en US 5 183 746 Remington s Pharmaceutical Sciences por E W Martin 18a edición A R Gennaro Ed Mack Publishing Company

[1990] Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins S Frokjaer y L Hovgaard Eds Taylor & Francis

[2000] y Handbook of Pharmaceutical Excipients 3a edición A Kibbe Ed Pharmaceutical Press

[2000]) La molécula del IFNB se puede formular dentro de una composición farmacéutica en una variedad de formas incluyendo en forma de liquido gel liofilizada dispersión pulmonar o cualquier otra forma adecuada por ejemplo como un solido comprimido La forma preferida dependerá de la indicación particular a ser tratada y sera evidente para un experto en la técnica La composición farmacéutica se puede administrar parenteralmente (por ejemplo intravenosamente intramuscularmente intrapentonealmente o subcutáneamente) oralmente intracerebralmente mtradermalmente intranasalmente intrapulmonar mediante inhalación o de cualquier otra manera aceptable por ejemplo utilizando tecnología de PowderJect o de ProLease El modo preferido de administración dependerá de la indicación particular a ser tratada y sera evidente para un experto en la técnica Una descripción detallada de las composiciones farmacéuticas adecuadas se da en la sección titulada composición farmacéutica y usos de un conjugado de la invención- Pharmaceutical composition and uses of a conjúgate of the invention pp 52-61 en WO 01/15736 En una modalidad preferida de la invención la composición farmacéutica comprende un derivado de sulfoalquil éter ciclodextnna tal como Captisol® (disponible a partir de Cydex Overland Park Kansas 66213 EUA) Los detalles que se refieren a las composiciones farmacéuticas que comprenden las variantes del IFNB descritas en la presente invención y derivados de sulfoalquil éter ciclodextrma se pueden encontrar en la sección titulada el derivado de sulfoalquil éter ciclodextnna The sulfoalkyl ether cyclodextrm denvative pp 37-49 en WO 03/002152 Uso terapéutico Las vanantes y conjugados descritos en la presente invención son útiles para el tratamiento terapéutico o profiláctico de enfermedades humanas del sistema nervioso central o del sistema nervioso periférico las cuales tienen síntomas principalmente neurologicos o psiquiátricos enfermedades oftálmicas enfermedades cardiovasculares enfermedades cardiopulmonares enfermedades respiratorias enfermedades del nñon urinarias y reproductivas enfermedades gastrointestinales y anormalidades endocrinas y metabolicas En particular dichas condiciones y enfermedades incluyen procesos inflamatorios por ejemplo procesos neuroinflamatonos los cuales afectan de manera adversa a los tejidos excitables tales como los tejidos excitables en el tejido del sistema nervio central tejido del sistema nervioso periférico tejido cardiaco o tejido retmal tales como por ejemplo cerebro corazón o retina/ojo Por lo tanto las vanantes descritas en la presente invención se pueden utilizar para tratar o para prevenir el daño al tejido excitable que resulta a partir de procesos inflamatorios en una variedad de condiciones y circunstancias Los ejemplos no limitantes de dichas condiciones y circunstancias se proveen en el cuadro 1 a continuación En el ejemplo de la protección de patologías del tejido neuronal tratables de conformidad con la presente invención dichas patologías incluyen aquellas que se producen a partir de una oxigenación reducida de los tejidos neuronales Cualquier condición que reduce la disponibilidad de oxigeno al tejido neuronal que resulta en la tensión daño y finalmente muerte de la célula neuronal se puede tratar mediante los métodos de la presente invención Generalmente referidas como hipoxia y/o isquemia estas condiciones se generan a partir de o incluyen pero no se limitan a evento cerebrovascular oclusión vascular depnvacion de oxigeno prenatal o postnatal sofocación choque casi ahogamiento envenenamiento con monoxido de carbono inhalación de humo trauma incluyendo cirugía y radioterapia asfixia epilepsia hipoglucemia enfermedad pulmonar obstructiva crónica enfisema síndrome de dificultad respiratoria en adulto choque por hipotensión choque séptico choque anafilactico choque por insulina crisis de célula falciforme arresto cardiaco disrritmia narcosis por nitrógeno y deficiencias neurologicas ocasionadas por procedimientos de desviación sanguínea en corazon-pulmon En una modalidad las vanantes del IFNB descritas en la presente invención se pueden administrar para prevenir la lesión o el daño al tejido que resulta a partir del nesgo de lesión o del tejido dañado durante procedimientos quirúrgicos tales como por ejemplo resección del tumor o reparación del aneurisma Otras patologías ocasionadas por o que resultan a partir de la hipoglucemia las cuales son tratables mediante los métodos descritos en la presente invención incluyen sobredosis de insulina también referida como hiperinsuhnemia latrogenica insulinoma deficiencia de hormona de crecimiento hipocortisohsmo sobredosis de fármacos y ciertos tumores Otras patologías que resultan a partir del daño al tejido neuronal excitable incluyen trastornos de ataques tales como epilepsia convulsiones o trastornos crónicos de ataques Otras condiciones y enfermedades tratables incluyen enfermedades tales como el evento cerebrovascular hipotensión arresto cardiaco enfermedad de Alzheimer enfermedad de Parkmson parálisis cerebral trauma al cerebro o a la medula espinal demencia por SIDA perdida de función cognitiva relacionada con la edad perdida de la memoria esclerosis amiotrofica lateral trastornos de ataques alcoholismo isquemia retinal daño al nervio óptico ocasionado por glaucoma y perdida neuronal Las variantes del IFNB descritas en la presente invención se pueden utilizar para tratar condiciones de y daño al tejido retinal Dichos trastornos incluyen pero no se limitan a isquemia retmal degeneración vascular desprendimiento retmal retinitis pigmentosa retmopatia artenosclerotica retinopatia hipertensiva bloqueo de la arteria retmal bloqueo de la vena retmal hipotensión y retinopatia diabética En otra modalidad los métodos y principios de la invención se pueden utilizar para proteger o tratar la lesión resultante a partir del daño por radiación a los tejidos excitables Una utilidad adicional de los métodos de la presente invención esta en el tratamiento del envenenamiento con neurotoxma tal como envenenamiento por acido domoico de moluscos neurolatirismo y enfermedad de Guam esclerosis amiotrofica lateral y enfermedad de Parkinson Como se menciono anteriormente la presente invención también se dirige a un método para mejorar la función del tejido excitable en un primate mediante la administración perifenca de una vanante del mterferon beta como se describió anteriormente Diversas enfermedades y condiciones se pueden tratar utilizando este método y adicionalmente este método es útil para mejorar la función cognitiva en la ausencia de cualquier condición o enfermedad Estos usos de la presente invención se describen con mayor detalle a continuación e incluyen el mejoramiento del aprendizaje y del entrenamiento tanto en primates humanos como en primates no humanos Las condiciones y enfermedades que se pueden tratar mediante los métodos de este aspecto de la presente invención se dirigen al sistema nervioso central e incluyen pero no se limitan a trastornos del humor trastornos de ansiedad depresión autismo trastornos de hiperactividad por déficit de atención disfuncion cognitiva Estas condiciones se benefician a partir del mejoramiento de la función neuronal Otros trastornos que se pueden tratar de conformidad con las enseñanzas de la presente invención incluyen la alteración del sueño por ejemplo apnea del sueño y trastornos relacionados con los viajes sangrados subaracnoideos y aneunsmales choque por hipotensión lesión por contusión choque séptico choque anafilactico y secuelas de diversas encefalitis y meningitis por ejemplo cerebntis relacionadas con enfermedad del tejido conectivo tales como el lupus Otros usos incluyen la prevención de o la protección a partir del envenenamiento mediante neurotoxinas tales como envenenamiento por acido domoico de moluscos neurolatinsmo y la enfermedad de Guam esclerosis amiotrofica lateral enfermedad de Parkinson tratamiento postoperativo para lesión embolica o lesión por isquemia irradiación total de cerebro crisis de célula falciforme y eclampsia Diversos trastornos neuropsicologicos los cuales se cree que se originan a partir de daño al tejido excitable se tratan mediante los métodos descritos en la presente invención Los trastornos crónicos en los cuales están implicados los procesos de inflamación y por lo tanto de daño neurologico y para los cuales se provee el tratamiento mediante la presente invención incluyen trastornos relacionados con el sistema nervioso central y/o sistema nervioso periférico incluyendo perdida de la función cognitiva relacionada con la edad y demencia senil trastornos crónicos de ataques enfermedad de Alzheimer enfermedad de Parkinson demencia perdida de la memoria esclerosis amiotrofica lateral esclerosis múltiple esclerosis tuberosa enfermedad cerebral de Wilson y parálisis supranuclear progresiva enfermedad de Guam demencia por cuerpo de Lewy enfermedades del pnon tales como encefalopatías espongiformes por ejemplo enfermedad de Creutzfeldt-Jakob enfermedad de Huntington distrofia miotonica ataxia de Freidrich y otras ataxias asi como el síndrome de Gilíes de la Tourette trastornos de ataques tales como epilepsia y trastorno crónico de ataque evento cerebrovascular trauma al cerebro o a la medula espinal demencia por SIDA alcoholismo autismo isquemia retinal glaucoma trastornos de la función autonómica tales como hipertensión y trastornos del sueño y trastornos neurosiquiatricos e incluyen pero no se limitan a esquizofrenia trastornos esquizoefectivo trastorno por déficit de atención trastorno distimico trastorno depresivo principal manía trastorno obsesivo-compulsivo trastornos por uso de sustancias psicoactivas ansiedad trastornos de pánico asi como trastornos afectivos unipolares y bipolares Los trastornos neurosiquiatricos y neurodegenerativos adicionales incluyen por ejemplo aquellos listados en el American Psychiatric Association s Diagnostic and Statistical manual of Mental Disorders (DSM) la versión mas actual del cual se incorpora en la presente invención como referencia en su totalidad El siguiente cuadro lista las indicaciones de ejemplos adicionales no limitantes asi como las diversas condiciones y enfermedades que se pueden tratar mediante las vanantes del interferon beta anteriormente mencionadas CUADRO 1 Célula tejido u Disfuncion o Condición o Tipo órgano patología enfermedad Corazón Isquemia Enfermedad de Aguda crónica arteria coronana estable inestable Infarto al Síndrome de miocardio Dressler Angina Enfermedad Cardiomiopatia cardiaca valvular congenita Angina Prinzmetal Ruptura cardiaca Perforación septal aneurismatica Angntis Arritmia Taqui- Nodo del seno bradiarritmia carotideo supraventncular hipersensitivo anormalidades estable inestable de conducción ventncular Insuficiencia Izquierda Cardiomiopatias cardiaca derecha bi- tales como congestiva ventricular familiar idiopatica infecciosa metabohca enfermedad de almacenamiento deficiencias trastorno del tejido conectivo infiltración y granulomas neurovascular Miocarditis Autoinmune infecciosa idiopatica Cor pulmonar Trauma directo y penetrante Célula tejido u Disfuncion o Condición o Tipo órgano patología enfermedad Toxinas Cocaína Vascular Hipertensión Primaria secundaria Enfermedad por descompresión Hiperplasia fibromuscular Aneurisma Por disección ruptura agrandamiento Pulmones obstructiva Asma bronquitis crónica enfisema y obstrucción de vías aereas Enfermedad de Embolismo pulmón pulmonar isquémico Trombosis pulmonar embolismo por grasa Enfermedades pulmonares ambientales Enfermedad Embolismo isquémica de pulmonar pulmón trombosis pulmonar Enfermedad Fibrosis pulmonar intersticial de idiopatica pulmón Congenita Fibrosis quistica Cor pulmonar Trauma Neumonía y Infecciosa neumonitis parasitaria toxica traumática por quemadura por aspiración Célula tejido u Disfuncion o Condición o Tipo órgano patología enfermedad Sarcoidosis Páncreas Endocrina Diabetes insuficiencia de mellitus tipo I y II célula beta disfuncion neuropatía diabética Otra insuficiencia de célula endocrina del páncreas Exocnna Insuficiencia Pancreatitis exocnna de páncreas Hueso Osteopenia Primaria Hipogonadismo secundaria inmovilización postmenopausic a hiperparatiroidis mo relacionado con la edad hipertiroidismo deficiencia de calcio magnesio fosforo y/o vitamina D Osteomielitis Necrosis avascular Trauma Enfermedad de Paget Piel Alopecia Areata Totalis Pnmana secundaria patrón masculino de calvicie Vitíligo Localizado Primario generalizado secundario Ulceración diabética Célula tejido u Disfuncion o Condición o Tipo órgano patología enfermedad Enfermedad vascular periférica Lesiones por quemadura Enfermedades Lupus autoinmunes entematoso Sjiogren artritis reumatoide glomerulonefntis ang tis Histiocitosis de Langerhan Ojo Neuritis óptica Lesiones romas y penetrantes infecciones enfermedad sarcoide enfermedad de célula falciforme desprendimiento retinal artentis temporal Trastornos Asfixia embrionarios y fetales Isquemia SNC Síndrome de fatiga crónica síndromes hipoosmolares e hiperosmolares agudos y crónicos demencia por SIDA electrocución Célula tejido u Disfuncion o Condición o Tipo órgano patología enfermedad Encefalitis Rabia Herpes Meningitis Hematoma subdural Adiccion a la nicotina Abuso de Cocaína fármacos y heroína crack síndrome de marihuana LSD abstinencia PCP abuso de múltiples fármacos éxtasis opioides sedantes hipnóticos anfetaminas cafeína Trastornos obsesivo compulsivos Estenosis espinal mielitis transversa Guillian Barre Trauma compresión de la raíz nerviosa compresión tu moral evento cerebrovascular por calor ENT Tinitus síndrome de Meuniere perdida de capacidad auditiva Lesión traumática barotrauma Célula tejido u Disfuncion o Condición o Tipo órgano patología enfermedad Riñon Insuficiencia Aguda crónica Vascular/isquemi renal ca enfermedad intersticial enfermedad de riñon diabético síndromes nefroticos infecciones Purpura Henoch S Músculo estriado Trastornos Miastenia gravis autoinmunes dermatomiositis polimiositis iopatias Meta bolleos endocrinos y tóxicos heredados Evento cerebrovascular por calor Lesión por compresión Rabdomilosis Enfermedad mitocondrial Infección Fascitis necrotizante Disfuncion Central y Impotencia sexual periférica secundaria a medicación Hígado Hepatitis Viral bacteriana parasitaria Enfermedad isquémica Cirrosis hígado graso Célula tejido u Disfuncion o Condición o Tipo órgano patología enfermedad Enfermedades mfiltrativas/metab olicas Gastrointestinal Enfermedad de intestino isquémico Enterocolitis necrotizante Transplante de Tratamiento del órgano donante y del recipiente Tracto Infertilidad Vascular reproductivo autoinmune anormalidades uterinas trastornos por implante Endocrino Hiper e hipofuncion glandular Como se menciono antenormente estas enfermedades trastornos o condiciones son meramente ilustrativas der la sene de los beneficios provistos por las vanantes del IFNB descritas en la presente invención Por consiguiente esta invención generalmente provee tratamiento terapéutico profiláctico de las consecuencias del trauma mecánico Se prefiere el tratamiento terapéutico o profiláctico para las enfermedades trastornos o condiciones del SNC y/o sistema nervioso periférico En una modalidad altamente preferida de la invención la enfermedad a ser tratada es el evento cerebrovascular tal como evento cerebrovascular isquémico o hemorragico En un evento cerebrovascular isquémico el abastecimiento sanguíneo a parte del cerebro se elimina debido ya sea a arterieesclerosis o a que un coagulo sanguíneo ha bloqueado un vaso sanguíneo En un evento cerebrovascular hemorragico un vaso sanguíneo se revienta previniendo el flujo normal de la sangre y permitiendo que la sangre gotee hacia un área del cerebro y lo destruya Con un evento cerebrovascular isquémico el bloqueo puede ocurrir en cualquier lugar a lo largo de las rutas arteriales hacia el cerebro Por ejemplo un deposito grande de materia grasa (ateroma) se puede desarrollar en una arteria carótida reduciendo su flujo sanguíneo a un goteo Esta condición es peligrosa puesto que cada arteria proporciona normalmente un gran porcentaje del abastecimiento sanguíneo al cerebro El material graso también puede fragmentarse a partir de la pared de la arteria carótida viajar con la sangre y atorarse en una arteria mas pequeña bloqueándola completamente Las artenas carotideas y vertebrales y sus ramas se pueden bloquear de otras formas Por ejemplo un coagulo sanguíneo formado en el corazón o en una de sus válvulas puede fragmentarse (volverse un embolo) viajar a través de las arterias hacia el cerebro y alojarse en el El resultado es un evento cerebrovascular embolico Dichos eventos cerebrovasculares son mas comunes en gente que ha pasado recientemente por cirugía cardiaca y en gente que tiene válvulas cardiacas defectuosas o ritmos anormales (especialmente fibnlacion atrial) La mayoría de los eventos cerebrovasculares empiezan de repente se desarrollan rápidamente y ocasionan daño al cerebro en cuestión de minutos Menos comunmente los eventos cerebrovasculares continúan empeorando por vanas horas hasta un día o dos conforme muere un área del cerebro constantemente en agrandamiento Los síntomas que indican un posible evento cerebrovascular requieren atención medica inmediata los doctores algunas veces pueden reducir el daño o prevenir el daño adicional mediante su rápida actuación Muchos efectos de un evento cerebrovascular requieren cuidados médicos especialmente durante las primeras horas Al principio los doctores usualmente administran oxigeno e insertan una linea intravenosa para asegurarse de que el paciente reciba fluidos y nutrición Para un evento cerebrovascular en evolución se pueden proporcionar anticoagulantes tales como la hepanna La eficiencia de las variantes del IFNB descritas en la presente invención en el tratamiento del evento cerebrovascular y enfermedades relacionadas se puede evaluar utilizando diversos modelos animales conocidos por la persona experta en la técnica Se pueden emplear numerosas pruebas para la determinación de si las vanantes descritas en la presente invención tienen un efecto benéfico en el evento cerebrovascular y enfermedades relacionadas (principalmente isquemia cerebral e isquemia de la medula espinal) Se hace referencia a las siguientes pruebas relevantes pero también pueden ser adecuadas otras pruebas i) modelo de evento cerebrovascular tromboembolico (cf Lapchak et al Stroke 2002 33 1665-1670 o Lapchak et al Stroke 2002 33 1411-1415) II) fototrombosis (cf Zhao et al Stroke 2002 32 2157 2163) ni) hemorragia sub-aracnoidea (cf Grasso et al J Neurosurgery 2002 96 565-570) iv) oclusión transitoria de la arteria cerebral media mediante clips para aneurisma (cf Yenari et al Neurological Research 2001 23 72 78) v) isquemia transitoria de la medula espinal (clip para aneunsma balón) (cf Murakawi et al Cnt Care Med 2001 29 814 818 Lips et al Anesthesiol 2000 93 1303-131 1 Lips et al J Neurosurg Anesthesiol 2002 14 35-42 Lapchak et al Stroke 2001 33 1220 1225 o Sukarai et al Stroke 2000 31 200-207) Materiales y métodos Materiales Células HeLa - (disponibles a partir de American Type Culture Collection (ATCC) ISRE Luc (Stratagene La Jolla EUA) pCDNA 3 1/hygro (Invitrogen Carlsbad EUA) vector básico pGL3 (Promega) ADN genomico de humano (CloneTech EUA) medio DMEM medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) 10% de suero de bovino fetal (disponible partir de Life Technologies A/S Copenhague Dinamarca) Ensayos Descripción del ensayo con interferon Se ha publicado previamente que el IFNB mteracciona con y activa a los receptores del interferon tipo I en células HeLa Consecuentemente la transcripción se activa en los promotores que contienen un elemento de respuesta estimulado por el interferon (ISRE) Es posible seleccionar asi para agonistas de los receptores del interferon mediante el uso de un gen reportero de luciferasa acoplado a ISRE (ISRE luc) colocado en las células HeLa Ensayo primario Las células HeLa son co transfectadas con ISRE-Luc y pCDNA 3 1/hygro y se crearon lugares (clonas celulares) mediante la selección en medio D EM que contenía higromicina B Las clonas celulares se seleccionan para actividades de luciferasa en la presencia o ausencia del IFNB Aquellas clonas que muestran las mayores relaciones de actividad luciferasa estimulada a no estimulada son utilizadas en ensayos adicionales Para seleccionar a las muteinas 15 000 celulas/pozos se siembran en placas de cultivo de 96 pozos y se incuban durante toda la noche en medio DMEM Al día siguiente las muteinas asi como los estándares conocidos se añaden a las células a diversas concentraciones Las placas se incuban por 6 horas a 37°C en una atmosfera de aire con 5% de C02 El sustrato LucLite (Packard Bioscience Groningen Los Países Bajos) se añade subsecuentemente a cada pozo Las placas se sellan y se mide la luminiscencia en un luminometro de mesa TopCount (Packard) en modo SPC (conteo de fotón particular) Cada placa individual contiene pozos incubados con IFNB asi como un control estimulado y otros pozos que contienen medio normal como un control no estimulado La relación entre la actividad de luciferasa estimulada y no estimulada sirve como un estándar interno tanto para la actividad de la muteina como para la variación de experimento a experimento Ensayo secundario Actualmente existen 18 genes del interferon a no alelicos y un gen del IFNB Estas proteínas exhiben actividades que se sobreponen y por lo tanto son criticas para asegurar que las muteinas retienen la selectividad y especificidad del IFNB El gen ß R1 se activa mediante IFNB pero no por otros interferones La transcripción de ß-RI sirve asi como un segundo marcador de la activación del IFNB y se utiliza para asegurar que las muteinas retienen la actividad del IFNB Un fragmento promotor de 300 pb de ß R1 que muestra la dirección de la transcripción sensible al interferon (Rani M R et al (1996) JBC 271 22878 22884) se aislo mediante PCR a partir de ADN genomico de humano y se inserto dentro del vector básico pGL3 (Promega) El gen resultante ß R1 luciferasa se utilizo en ensayos similares al ensayo primario descrito anteriormente En las células de astrocitoma se ha descrito que el gen resultante ß R1 luciferasa muestra una sensibilidad 250 veces mayor al IFNB en comparación con el mterferon a (Rani et al Previamente citado) Ensayo de ELISA La concentración del IFNB se cuantifico mediante el uso de un inmunoensayo comercial intercalado (PBL Biomedical Laboratories New Brunswick NJ EUA) El equipo se basa en un ELISA con anticuerpos monoclonales de ratón anti IFNB para atrapar y detectar el IFNB en las muestras prueba El anticuerpo detectado se conjuga con biotina Las muestras prueba y el IFNB recombinante humano estándar se añaden en 0 1 mL a concentraciones de 10 0 25 ng/mL a placas para microtitulacion revestidas previamente con el anticuerpo de detección Las placas se incuban a temperatura ambiente por 1 hora Las muestras y los estándares se diluye en el regulador de pH para dilución del equipo Las placas se lavan en el regulador de pH del equipo y se incuban con el anticuerpo de detección biotinilado en 0 1 mL por 1 hora a temperatura ambiente Después de otro lavado se añade el conjugado de estreptavidma-peroxidasa de rábano en 0 1 mL y se incuba por 1 hora a temperatura ambiente La reacción se visualiza mediante la adición de 0 1 mL del sustrato cromogeno tetrametilbencidina (TMB) Las placas se incuban por 15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente y la reacción se detiene mediante la adición de solución de paro La absorbancia se lee a 450nm utilizando un lector para ELISA Ensayo de unión al receptor La capacidad de unión al receptor de un pohpeptido o conjugado para uso en la invención se puede determinar utilizando el ensayo descrito en WO 95/25170 titulado Análisis de IFN ß (Pheio-i) para la unión al receptor Analysis Of IFN ß (Phe-ioi) For Receptor Bmding (el cual se basa en células Daudi o en células A549) Los dominios solubles de IFNAR1 e IFNAR2 se pueden obtener esencialmente como se describió por Arduini et al Protein Science 1999 vol 8 1867-1877 o como se describe en el ejemplo 9 en la presente invención Alternativamente la capacidad de unión al receptor se determina utilizando un agente entrecruzador tal como suberato de disuccinimidilo (DSS) disponible a partir de Pierce Rockford IL EUA como sigue El polipeptido o conjugado se incuba con el receptor IFNAR-2 soluble en la presencia o ausencia de DSS de conformidad con las instrucciones del fabricante Las muestras se separan mediante SDS PAGE y se lleva a cabo un western blot utilizando anticuerpos anti-IFNB o anti IFNAR2 La presencia de una interacción functional del pohpeptido IFNB /conjugado receptor es evidente por un incremento en el tamaño molecular del receptor y del IFNB en la presencia de DSS Ademas un ensayo de entrecruzamiento utilizando polipeptido o conjugado para uso en la invención y ambas subunidades del receptor (IFNAR 1 e IFNAR-2) puede establecer la capacidad de unión del receptor del interferon 1 En esta conexión se ha publicado que el IFNAR 1 se une solamente después de que se forma un complejo interferon ß IFNAR 2 (Mogensen et al Journal of Interferon and Cytokine Research 19 1069 1098 1999) Pruebas de inmunoqenicidad in vitro La mmunogenicidad reducida de un conjugado o pohpeptido para uso en la invención se determina mediante el uso de un método de ELISA que mide la inmunorreactividad del conjugado o polipeptido con relación a una molécula o preparación de referencia La molécula o preparación de referencia normalmente es una preparación de IFNB recombinante tal como Avonex® Rebif® o Betaseron® u otra preparación recombinante de IFNB producida mediante un método equivalente a la manera en que estos productos se elaboran El método de ELISA se basa en anticuerpos a partir de pacientes tratados con una de estas preparaciones del IFNB recombinante La inmunogenicidad se considera reducida cuando el conjugado o polipeptido de la invención tiene una respuesta menor estadísticamente significativa en el ensayo en comparación con la molécula o preparación de referencia Otro método para determinar la inmunogenicidad es mediante el uso de suero a partir de pacientes tratados con IFNB (por ejemplo cualquier producto comercial del IFNB) de manera análoga a la descrita por Ross et al J Clin Invest 95 1974-78 1995 En el bioensayo de neutralización antiviral la inmunogenicidad reducida resulta en inhibición reducida de un conjugado para uso en la invención mediante suero de pacientes en comparación con la molécula de referencia del IFNB de tipo silvestre Ademas en el ensayo bioquímico de unión del IFN se espera que un conjugado menos inmunogenico se una a una IgG de un paciente con un menor grado que a las moléculas de referencia del IFNB Para el ensayo de neutralización se añaden las moléculas de referencia y las moléculas vanantes en una concentración que produce aproximadamente 80% de protección al virus en el bioensayo de neutralización antiviral Las proteínas IFNB se mezclan con los sueros de pacientes a diversas concentraciones (iniciando a 1 20) Actividad antiviral El bioensayo antiviral se lleva a cabo utilizando células A549 (CCL 185 American tissue culture collection) y virus de la encefalomiocarditis (EMC) (VR-129B American tissue culture collection) Las células se siembran en placas para cultivo de tejidos de 96 pozos a una concentración de 10 000 celulas/pozo y se incuban a 37°C en una atmosfera de aire con 5% de C02 Se añadió un polipeptido o conjugado para uso en la invención en concentraciones a partir de 100 0 0001 lU/mL en un total de 100 ul de medio DMEM que contenía suero de ternera fetal y antibióticos Después de 24 horas el medio se removió y se añadieron 0 1 mide medio fresco que contenía el virus EMC a cada pozo El virus EMC se añadió a una concentración que ocasiona 100% de muerte celular en cultivos libres de célula con IFNB después de 24 horas Después de otras 24 horas en efecto antiviral del polipeptido o conjugado se mide utilizando el ensayo WST 1 Se añaden 0 01 ml_ de WST 1 (agente para proliferación celular WST-1 Roche Diagnostics GmbH Mannheim Alemania) a 0 1 mL de cultivo y se incuba por 4 2 horas a 37°C en una atmosfera de aire con 5% de CO2 La escisión de la sal de tetrazolio WST 1 mediante deshidrogenases mitocondnales en células viables resulta en la formación de formazan que se cuantifica mediante la medición de la observancia a 450 nm Ensayo de neutralización de actividad del elemento de respuesta estimulado por interferon (ISRE) El efecto neutralizante del IFNB de los sueros anti IFNB se analizo utilizando el ensayo de actividad de ISRE Luciferasa Se utilizaron los sueros a partir de pacientes tratados con IFNB o a partir de animales inmunizados Los sueros se añadieron ya sea en una concentración fija (dilución 1 20-1 500 (suero de pacientes) o 20 600 ng/mL (suero animal)) o en diluciones seriales de cinco veces el suero inicial a 1/20 (suero de pacientes) o 600 ng/mL (suero animal) El IFNB se añadió ya sea a diluciones cinco veces el suero inicial a 25 000 lU/mL o en una concentración fija (0 1-10 lU/mL) en un volumen total de 80 ul de medio DMEM + 10% de FCS Los sueros se incubaron por 1 hora a 37°C con IFNB Luego las muestras se transfirieron a placas de cultivo de tejidos de 96 pozos que contenían células HeLa transfectadas con ISRE-Luc crecidas por 24 horas previas (15 000 celulas/pozo) en medio DMEM Los cultivos se incubaron por 6 horas a 37°C en una atmosfera de aire con 5% de CO2 El sustrato LucLite (Packard Bioscience Groningen Los Países Bajos) se añadió subsecuentemente a cada pozo Las placas se sellaron y se midió la luminiscencia medida en un luminometro de mesa TopCount (Packard) en un modo SPC (conteo de fotón particular) Cuando las muestras IFNB se titulan en la presencia de una cantidad fija de suero el efecto neutralizante se definió como una inhibición cuantificada en numero de veces (F1 ) como EC50 (con suero )/EC50(sin suero) La reducción de la neutralización del anticuerpo de las proteínas vanantes del IFNB se define como vanante F1 (1 ) x 100% F1 de tipo silvestre Medición de la vida media biológica La medición de la vida media biológica se puede llevar a cabo de numerosas formas descritas en la literatura Un método se describe por Munafo et al European Journal of Neurology 1998 vol 5 No 2 p 187 193 el cual utilizo un método de ELISA para detectar los niveles en suero de IFNB después de la administración subcutánea e intramuscular del IFNB La disminución rápida de las concentraciones en suero del IFNB después de la administración intravenosa lo ha hecho importante para evaluar las respuestas biológicas al tratamiento con IFNB No obstante se contempla que las vanantes o conjugados para uso en la presente invención tendrán vidas medias prolongadas en suero también después de la administración intravenosa haciendo posible medirlo por ejemplo mediante un método de ELISA o mediante el ensayo de selección primaria Diferentes marcadores farmacodinamicos (por ejemplo neupterina de suero y beta 2 microglobulina) también se han estudiado (Clin Drug Invest (1999) 18(1 ) 27 34) Estas se pueden utilizar igualmente para evaluar el efecto biológico prolongado Estos experimentos también se pueden llevar a cabo en especies animales adecuadas por ejemplo ratas Los ensayos para evaluar los efectos biológicos del IFNB tales como efectos antivirales antiprohferativos e mmunomoduladores (como se describe en por ejemplo Annals of Neurology 1995 vol 37 No 1 p7 15) se pueden utilizar junto con los ensayos de selección primarios y secundarios descritos en la presente invención para evaluar la eficiencia biológica del conjugado en comparación con el IFNB de tipo silvestre Area de superficie accesible (ASA) El programa de computo Access (B Lee y F M Richards J Mol Biol 55 379-400 (1971)) versión 2 (Copyright (c) 1983 Yale University) se utiliza para computar el área de superficie accesible (ASA) de los átomos individuales en la estructura Este método utiliza típicamente una sonda con tamaño de 1 4Á y define el área de superficie accesible (ASA) como el área formada por el centro de la sonda Antes de su calculo todas las moléculas de agua y todos los átomos de hidrogeno se remueven a partir de la sene de coordenadas como lo son otros átomos que no están directamente relacionados con la protema Los programas alternativos están disponibles para el computo del ASA por ejemplo el programa Whatlf G Vnend J Mol Graph (1990) 8 52 56 electrónicamente disponible en la interfaz WWW en http //swift embl-heidelberg de/servers2/ (R Rodríguez et al CABIOS (1998) 14 523-528 ) utilizando la opción de accesibilidad para calcular la superficie molecular accesible ASA fraccional de la cadena lateral El ASA fraccional de los átomos de la cadena lateral se computa mediante la división de la suma del ASA de los átomos en la cadena lateral con un valor que representa el ASA de los átomos de la cadena lateral con respecto al tipo de residuo en un peptido ALA x-ALA extendido Véase Hubbard Campbell & Thornton (1991 ) J Mol Biol 220 507 530 Para este ejemplo el átomo CA se observa como parte de la cadena lateral de los residuos de glicina pero no para los residuos remanentes El siguiente cuadro indica el ASA 100% estándar para la cadena lateral Determinación de la superficie expuesta de los residuos de aminoácidos La estructura cnstalma tridimensional del interferon beta de humano a una resolución de 2 2 A (Karpusas et al Proc Nat Acad Sci USA (1997) 94 1 1813-11818 esta disponible a partir del banco de datos de protema (Protein Data Bank (PDB)) (Bemstem et al J Mol Biol (1977) 112 pp 535) y esta electrónicamente disponible a partir de The Research Collaboratory for Structural Bioinformatics PDB en http //www pdb org/ bajo el código de acceso 1AU1 Esta estructura cristalina contiene dos moléculas independientes del interferon beta de humano en este ejemplo se utiliza la molécula A Exposición de la superficie Utilizando el programa Whatlf como se describió anteriormente se encontraron los siguientes residuos que teman una accesibilidad de superficie cero para sus átomos de la cadena lateral (para Gly se utiliza la accesibilidad del átomo CA) G7 N14 C17 L21 I44 A55 A56 T58 I59 M62 L63 L98 L122 Y125 1129 L133 A142 W143 V146 1150 N153 1157 L160 T161 y L164 Exposición de la superficie fraccional Para el análisis adicional fue necesario remodelar las cadenas laterales de los residuos R71 R113 K1 15 L1 16 M117 debido a los choques esféricos El remodelamiento se realizo utilizando Modeler 98 MSI INC Los cálculos del ASA de desempeño fraccional utilizando el programa de computo Access sobre la molécula de inferieron beta remodelada (solamente incluyendo los residuos de aminoácidos y excluyendo la porción de azúcar N asociada) resulto en los siguientes residuos que tienen mas del 25% de su cadena lateral expuesta a la superficie S2 N4 L5 F8 L9 R11 S12 F15 Q16 Q18 K19 W22 Q23 G26 R27 L28 E29 Y30 L32 K33 R35 M36 N37 D39 E42 K45 Q46 L47 Q48 Q49 Q51 K52 Q64 A68 R71 Q72 D73 S75 S76 G78 N80 E81 T82 E85 N86 A89 Y92 H93 N96 H97 K99 T100 E103 E104 K105 E107 K108 E109 D110 F1 11 R113 G1 14 K1 15 L1 16 S119 L120 H121 K123 R124 G127 R128 L130 H131 K134 A135 K136 E137 Y138 S139 H140 V148 R152 Y155 N158 G162 Y163 R165 y N166 Y los siguientes residuos tienen mas del 50% de su cadena lateral expuesta a la superficie N4 L5 F8 S12 F15 Q16 K19 W22 G26 R27 E29 Y30 K33 R35 N37 D39 E42 Q46 Q48 Q49 Q51 K52 R71 D73 S75 G78 N80 E81 T82 E85 N86 A89 Y92 H93 K99 T100 E103 E104 E107 K108 D1 10 F1 11 L116 K123 R124 G127 H131 K134 E137 V148 Y155 R165 y N166 EJEMPLOS EJEMPL0 1 Diseño de un cassette de expresión para la expresión del IFNB en células de mamífero y de insecto La secuencia de ADN numero de acceso GenBank M28622 (mostrada en SEQ ID NO 1 ) que abarca un ADNc de longitud total que codifica el IFNB de humano con su peptido señal nativo se modifico con el objeto de facilitar su expresión elevada en células de mamífero Primero el contexto del codon de inicio ATG se modifico de conformidad con la secuencia consenso Kozak (Kozak M J Mol Biol 1987 agosto 20 196 (4) 947 50) de tal manera que hay una coincidencia perfecta con la secuencia consenso hacia el extremo 5 del codon de inicio ATG Luego los codones del IFNB nativo de humano se modificaron mediante la realización de sesgos en el uso del codon hacia los codones frecuentemente utilizados en los genes humanos que se expresan de manera elevada Subsecuentemente ciertos nucleotidos en la secuencia se sustituyeron con otros con el objeto de introducir sitios de reconocimiento para endonucleasas de restricción del ADN (esto permitió una modificación mas fácil de la secuencia postenor de ADN) Los iniciadores se diseñaron de tal manera que el gen pudo ser sintetizado CBProFprl 5 GGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTCGCCACCATGACCAACAA GTGCCTGCTCCAGATCGCCCTGCTCCTGT 3 CBProFpr2 5ACAACCTGCTCGGCTTCCTGCAGAGGAGTTCGAACTTCCA GTGCCAGAAGCTCCT GTGGCAGCTGAACGG 3 CBProFpr3 5GAACTTCGACATCCCCGAGGAAATCAAGCAGCTGCAGCAG TTCCAGAAGGAGGA CGCCGCTCTGACCATC 3 CBProFpr4 5TTCCGCCAGGACTCCAGCTCCACCGGTTGGAACGAGACCA TCGTGGAGAACCTGCTGGCCAACGTGTACC 3 CBProFpr5 5AGGAGAAGCTGGAGAAGGAGGACTTCACCCGCGGCAAGC TGATGAGCTCCCTGC ACCTGAAGCGCTACTA 3 CBProFpr6 5 GGAGTACAGCCACTGCGCCTGGACCATCGTACGCGTGGA GATCCTGCGCAACTTC TACTTCATCAACCGC-3 CBProFpr9 5 CACCACACTGGACTAGTGGATCCTTATCAGTTGCGCAGGT AGCCGGTCAGGCGGTTGATGAAGTAGAAGT 3 CBProFprlO 5 AGGCGCAGTGGCTGTACTCCTTGGCCTTCAGGTAGTGCAG GATGCGGCCATAGTAGCGCTTCAGGTGCAG 3 CBProFprl 1 5 CTCCTCTCCAGCTTCTCCTCCAGCACGGTCTTCAGGTGGT TG ATCTGGTG GTACACGTTG GCCAGC AG G 3 CBProFpr12 5 GAGCTGGAGTCCTGGCGGAAGATGGCGAAGATGTTCTGCAGCATCTCGT AGATGGTCAGAGCGGCGTCCT-3 CBProFpr13 5 CCTCGGGGATGTCGAAGTTCATCCTGTCCTTCAGGCAGTA CTCCAGGCGCCCGTTCAGCTGCCACAGGAG 3 CBProFpr14 5 CAGGAAGCCGAGCAGGTTGTAGCTCATCGATAGGGCCGT GGTGCTGAAGCACAGGAGCAGGGCGATCTGG 3 Los iniciadores se ensamblaron al gen sintético mediante PCR de un paso utilizando el equipo de la polimerasa Platinum Pfx (Life Technologies) y parámetros de ciclo de PCR estándares de tres pasos El gen ensamblado se amplifico mediante PCR utilizando las mismas condiciones Un ADNc que codifica una forma extendida N terminal del IFNB de humano se sintetizo utilizando las mismas condiciones de PCR como se describieron anteriormente pero con los iniciadores CBProFprl y 14 sustituidos con los iniciadores CBProFpr7 5 CTGCTCCAGATCGCCCTGCTCCTGTGCTTCAGCACCACGG CCCTATCGATGAAGCACCAGCACCAGCATC 3 CBProFpr8 5 CACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATA GGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAAC 3 CBProFpr15 5 CAGGAAGCCGAGCAGGTTGTAGCTCATCTGTTGGTGTTGA TGTTGGTGCTGATGCTGGTGCTGGTGCTTC 3 CBProFpr16 5 AGCAGGGCGATCTGGAGCAGGCACTTGTTGGTCATGGTG GCGAAGCTTAAGTTTAAACGCTAGCCAGCTT-3 con el objeto de incorporar una MARCA para purificación en la molécula del IFNB Los genes sintetizados se clonaron dentro de pcDNA3 1/Hygro (Invitrogen) entre el sitio Hindlll y el extremo 5 y el sitio BamHI y el extremo 3 produciendo pCBProFI y pCBProF2 El intron sintético partir de pCI Neo (Promega) se amplifico utilizando condiciones estándares de PCR como se describió anteriormente y los iniciadores CBProFpr37 5 CCGTCAGATCCTAGGCTAGCTTATTGCGGTAGTTTATCAC- 3 CBProFpr38 5 GAGCTCGGTACCAAGCTTTTAAGAGCTGTAAT 3 produciendo un fragmento de PCR de 332 pb del cual se corto con Nhel y con Hindlll y se inserto en la 5 UTR de los plasmidos pCBProFI y pCBProF2 produciendo pCBProF4 y pCBProF5 Los codones para los aminoácidos individuales se cambiaron mediante la amplificación de regiones relevantes de la región codificante por PCR de tal manera que los cambios introducidos por PCR en la secuencia se pueden introducir en los plasmidos de expresión mediante técnicas de clonación clasicas Por ejemplo los iniciadores Lys45arg iniciador 5 (Narl/Kasl) 5 GCTGAACGGGCGCCTGGAGTACTGCCTGAAGGACAGGAT GAACTTCGACATCCCCGAGGAAATCCGCCAGCTGCAGC 3 Lys45mut-iniciador 3 (BsiWI) 5 TCTCCACGCGTACGATGGTCCAGGCGCAGTGGCTG 3 se utilizaron para introducir una sustitución K45R en el fragmento de PCR que abarca la región a partir de la posición 1055 a la 1243 en pCBProFI Ambos fragmentos de PCR y pCBProFI se cortaron con Narl y con BsiWI las cuales son únicas El fragmento de PCR y estructura base del vector de pCBProFI se purificaron y se ligaron resultando en una sustitución del codon de Lys45 AAG con el codon de Arg CGC en pCBProFI Ademas el PCR de la SOE (extensión sobrante de secuencia) se utilizo para la introducción de sustituciones aminoácidos En el SOE PCR tanto la parte N terminal como la parte C-terminal de la molécula de IFNB se amplifico inicialmente en PCR primarios individuales Para estos PCR pnmanos se sintetizaron los iniciadores complementarios centrales de tal manera que el codon(es) para el aminoacido(s) a ser sustituido se cambia(n) al codon(es) deseado Los iniciadores terminales fueron iniciadores estándares que definen los N y C terminales de la molécula de IFNB respectivamente Ademas los iniciadores terminales proveyeron un sitio para enzima de restricción que permite la clonación subsecuente del producto de PCR de longitud total Por lo tanto el iniciador central (antisentido) y el iniciador N terminal (sentido) se utilizaron para amplificar la parte N terminal de la región codificante de IFNB en uno de los PCR pnmanos y que son equivalentes para la parte C terminal Una vez que se amplificaron las partes N y C terminales estas se ensamblaron dentro del producto de longitud total en un PCR secundario y se clonaron dentro de una versión modificada del pCDNA3 1/Hygro como se describió anteriormente Por ejemplo se utilizaron los siguientes iniciadores para introducir las mutaciones para las sustituciones F111 N y R1 13T CBProF iniciador 9 (sentido) CACCACACTGGACTAGTGGATCCTTATCAGTTGCGCAGGTA GCCGGTCAGGCGGTT GATGAAGTAGAAGT CBProF iniciador 231 (antisentido) CATCAGCTTGCCGGTGGTGTTGTCCTCCTTC CBProF iniciador 230 (sentido) GAAGGAGGACAACACCACCGGCAAGCTGATG CBProF iniciador 42 (antisentido) CACACTGGACTAGTAAGCTTTTATCAGTTGCGCAGGTAGC Ademas en los casos en donde las mutaciones introducidas fueron lo suficientemente cercanas a un sitio de restricción único para endonucleasa en el plasmido de expresión se construyeron genes vanantes utilizan el procedimiento de construcción que abarca un solo paso de PCR y una clonación subsecuente Por ejemplo la sustitución K19R se introdujo mediante el uso de iniciador PCR CBProFpr58 GAGGAGTTCGAACTTCCAGTGCCAGCGCCTCCTGTGGCAG CTGAACG y CBProF iniciador 9 El producto de PCR se clono subsecuentemente utilizando los sitios de restricción para endonucleasas BsiWI y BstBI EJEMPLO 2 Construcción y expresión de una vanante del IFNB con un sitio de qlucosilacion introducido en la posición III Con el objeto de insertar un sitio de glucosilacion N asociado extra en la posición 1 11 en el IFNB de humano el gen sintético (hinf ß) que codifica el IFNB de humano (descrito en el ejemplo 1 ) se altero mediante mutagenizo sitio dirigida por PCR Utilizando BIO X ACT (Biolme RU) y el plasmido PF050 [hinf )/pcDNA3 1 ( ) Hygro/lntron (un derivado de pcDNA3 1 ( ) Hygro (Invitrogen EUA) en el cual se obtuvo un intron quimérico a partir de pCI neo (Promega EUA) el cual había sido insertado entre los sitios BamHI y Nhel en el MCS del vector] como un molde se llevaron a cabo dos reacciones de PCR con dos senes de iniciadores que se sobreponen [CB41 (5 - TTTAAACTGGATCCAGCCACCATGACCAACAAG 3 )/CB55 (5 -CGGCCATAGTAGCGCTTCAGGTGCAGGGAGCTCATCAGCTTGCCGGTGG TGTTGTCCTCCTTC 3 ) y CB42/CB86 (5 GAAGGAGGACAACACCACCGGCAAGCTGATGAGCTCCCTGCACCTGAAG CGCTAC TATGGCC G-3 ) que resulta en dos fragmentos de 446 y 184 pares de bases respectivamente Estos dos fragmentos se ensamblaron en un tercer PCR con los iniciadores flanqueantes CB41 y CB42 El gen resultante se inserto dentro del vector de expresión para mamífero pcDNA3 1 ( ) Hygro/lntron y se confirmo mediante secuenciacion de ADN para que tuviera los cambios de bases correctas que llevan a las sustituciones F11 1 N y R113T en el IFNB de humano (plasmido designado PF085) Para evaluar la actividad de la vanante [F11 1 N+ R1 13T] del IFNB de humano se transfecto PF085 dentro de la linea de células CHO K1 (ATCC # CCL 61 ) mediante el uso de Lipofectamine 2000 (Life Technologies EUA) como agente para transfeccion 24 horas después el medio de cultivo se cosecho y se ensayo para actividad/concentración del IFNB Actividad 56046 Ul/ml [ensayo primario] ELISA 80 ng/ml Actividad especifica 7X108 Ul/mg Como se puede observar la variante [F111 N+R113T] del IFNB de humano tiene una actividad especifica muy alta aproximadamente el doble de la actividad especifica del IFNB humano de tipo silvestre EJEMPLO 3 Construcción y expresión de una vanante del IFNB con un sitio de qlucosilacion introducido en la posición 49 De manera análoga a lo que se describe en el ejemplo 5 de WO 01/15736 se introdujo un sitio extra de glucosilacion N asociada en la posición 49 por medio de las sustituciones Q49N y Q51T Utilizando PF043 (hif p/pcDNA3 1 (Invitrogen EUA)) como molde se llevaron a cabo dos reacciones de PCR con dos senes de iniciadores que se sobreponen [PBR7J7PBR78 (5 GGCGTCCTCCTTGGTGAAGTTCTGCAGCTG 3 ) y PBR8 (5 ATATATCCCAAGCTTTTATCAGTTGCGCAGGTAGCCGGT 3 )/PBR77 (5 CAGCTGCAGAACTTCACCAAGGAGGACGCC 3 ) resultando en dos fragmentos de 228 y 369 pares de bases respectivamente Estos dos fragmentos se ensamblaron en un tercer PCR con los iniciadores flanqueantes PBR7 y PBR8 El gen resultante se inserto dentro del vector de expresión para mamífero pcDNA3 1 ( ) Hygro/lntron y se confirmo mediante secuenciacion de ADN para que tuviera los cambios de bases correctas que llevan al [Q49N Q51T] IFNB de humano (plasmido designado PF104) Para evaluar la actividad de la variante [Q49N+Q51T] del IFNB de humano se transfecto el PF104 dentro de la linea de células CHO K1 mediante el uso de Lipofectamine 2000 (Life Technologies EUA) como agente para transfeccion 24 horas después el medio de cultivo se cosecho y se ensayo para actividad/concentración del IFNB Actividad 17639 Ul/ml [ensayo primario] ELISA 10 ng/ml Actividad especifica 1 7x 109 Ul/mg La vanante [Q49N+Q51T] del IFNB de humano tiene una actividad especifica alta Esto puede deberse al pobre reconocimiento por uno de los anticuerpos monoclonales utilizados en el ELISA EJEMPLO 4 Construcción y expresión de una vanante del IFNB con dos sitios de glucosilacion introducidos Los sitios de glucosilacion adicionales descritos en los ejemplos 5 y 6 de WO01/15736 se introdujeron dentro del IFNB de humano por medio de las sustituciones Q49N Q51T F111 N y R1 13T Utilizando PF085 (descrito en el ejemplo 5 de WO 01/15736) como molde se llevaron a cabo dos reacciones de PCR con dos senes de iniciadores que se sobreponen [PBR89 (5 CGCGGATCCAGCCACCATGACCAACAAGTGCCTG)/PBR78 y PBR8/PBR77] resultando en dos fragmentos de 228 y 369 pares de bases respectivamente Estos dos fragmentos se ensamblaron en un tercer PCR con los iniciadores flanqueantes PBR89 y PBR8 El gen resultante se inserto dentro del vector de expresión en mamífero pcDNA3 1 ( )Hygro/lntron y se confirmo mediante secuenciacion para que tuviera los cambios de bases correctas que llevan al [Q49N Q51T F1 1 1 N R1 13T] IFNB de humano (plasmido designado PF123) PF123 se transfecto dentro de las células CHO K1 mediante el uso de Fugene 6 (Roche) como agente para transfeccion 24 horas después el medio de cultivo se cosecho y se ensayo para actividad/concentración del IFNB Actividad 29401 Ul/ml [pnmary assay] ELISA 14 ng/ml Actividad especifica 2 1x109 Ul/ml Evidentemente la variante [Q49N+Q51T+ F 1 1 N+ R113TJ del IFNB de humano también tiene una elevada actividad especifica Se encontró que la vanante tiene actividad de unión al receptor en el ensayo de unión al receptor descrito en la sección de Materiales y Métodos el cual se basa en el uso del agente de entrecruzamiento DSS EJEMPLO 5 Producción de la vanante de glucosilacion del G0.49?. Q51T, G111 ?, Una subclona de CHOK1 (5/G 10) que produce la vanante de glucosilacion [Q49N+Q51T+F1 11 N+R1 13T] se sembró dentro de 2 botellas giratorias cada una con una superficie expandida de 1700 cm2 (Corning EUA) en 200 mi de medio DMEM/F-12 (LifeTechnologies Cat # 31330) suplementado con 10% de FBS y penicilina/estreptomicina (P/S) Después de 2 días el medio se cambio Después de otros 2 días las dos botellas giratorias estaban casi al 100% de confluencia y el medio se cambio a 300 mi de medio UltraCHO libre de suero (BioWhittaker Cat # 12 724) suplementado con 1/500 EX CYTE (Serologicals Proteins Cat # 81129N) y P/S El crecimiento de las células en este medio promueve una mayor masa celular mayor de la que se puede alcanzar en el medio que contiene suero Después de 2 días el medio se renovó Después de otros 2 días el medio se cambio al medio de producción el medio DMEM/F 12 (Life Technologies Cat # 21041 ) suplementado con 1/100 ITSA (Life Technologies Cat # 51300 044) [ITSA se establece para insulina (1 0 g/L) transfernna (0 55 g/L) selenio (0 67 mg/L) suplementado para cultivos adherentes] 1/500 EC CYTE y P/S Los medios cosechados a partir de las dos botellas giratorias se agruparon antes de que se tomara una muestra del medio para la determinación de la actividad del IFNB EJEMPLO 6 Producción, purificación, y polietilenglucosilacion del ÍK19R. K45R. K123R1 IFNB humano Para terminar con 100 mi de medio libre de suero que contenía la vanante del IFNB K19R+K45R+K123R se sembraron 3 botellas T 175 con células COS 7 el medio DMEM (Life technologies Cat # 21969 035) suplementado con 10% de FBS mas Glutamina y penicilina/estreptomicina Al día de la transfeccion (cerca del 100% de confluencia) el medio se renovó con 30 mi de medio fresco 4 5 horas antes de la transfeccion Para preparar la transfeccion se alicuotaron 1890 ul del medio DMEM sin suplemento en un tubo de polipropileno de 14 mi (Corning) Se añadieron 210 ul de Fugene 6 (Roche) directamente dentro del medio y se incubo por 5 minutos a temperatura ambiente Mientras tanto se ahcuotaron 168 ug del ADN plasmidico ([K19R K45R K123R] de INF-p/pcDNA3 1 (-) Hygro PF # 161 ) dentro de otro tubo de polipropileno de 14 mi Después de 5 minutos de incubación la mezcla de Fugene 6 se añadió directamente a la solución de ADN y se incubo por 15 minutos a temperatura ambiente Después de la incubación se añadieron aproximadamente 700 ul gota a gota a cada uno de los tres medios para células Al siguiente día el medio para transfeccion se sustituyo con 35 mi de medio para producción libre de suero El medio libre de suero se basa el medio DMEM (Life Technologies Cat # 31053 028) suplementado con glutamina piruvato de sodio penicilina/estreptomicina 1 % de ITSA (Life Technologies Cat # 51300-044) y 0 2% de Ex Cyte (Serologicals Proteins Cat # 81 129) Antes de añadir el medio para producción las capas celulares se lavaron dos veces en el medio DMEM sin aditivos Tres días después de la transfeccion los 100 mi de medio libre de suero se cosecharon para la purificación y polietilenglucosilacion de la vanante del IFNB El pH se ajusto a 6 8 y la conductividad se ajusto a < 10 mS/cm con agua Milli Q Posteriormente el caldo de cultivo se absorbió en lote a 1 mi de resina de intercambio canónico SP 550 (TosoHaas) pre equilibrada con regulador de pH A (20 mM de fosfato 100 mM de NaCI pH 7) Después de 2 horas de rotación de extremo sobre extremo la resina se dejo sedimentar y se transfirió a una columna La resina se lavo con 5 volúmenes de columna de regulador de pH A y se eluyo con 2 mi de regulador de pH B (20 mM de fosfato 800 mM de NaCI pH 7) El eluido se concentro a 500 ul sobre VivaSpin (limite de 10 kDa) después de la adición de 5 % de etilenglicol El concentrado se ajusto a 50 mM de fosfato 0 3 M de NaCI 20 % de etilenghcol pH 8 en un volumen final de 2 mi y posteriormente se concentro a 0 5 mi El concentrado final fue polietilenglucosilado como sigue a 100 ul del concentrado final se le añadieron 25 ul de PEG SPA activado (5000 kDa Shearwater Alabama) recientemente preparado en regulador de pH de fosfato pH 8 para hacer concentraciones finales de PEG activado de 0 5 10 25 o 50 mg/ml La reacción se dejo proceder por 30 minutos a temperatura ambiente y luego se detuvo mediante la adición de regulador de pH de glicina 50 m Las muestras se congelaron inmediatamente a -80°C y la bioactividad se midió como se describió (ensayo primario) Los Western blots de cada muestra se llevaron a cabo con el objeto de evaluar la cantidad de la variante del IFNB que no reacciono presente en la muestra polietilenglucosilada Los resultados demuestran que a 25 mg de PEG activado/ml estuvieron ausentes vanantes del IFNB no polietilenglucosiladas como se juzga mediante western blot y la vanante retenida al 50 % de su bioactividad en comparación con la muestra control (tratado de manera idéntica pero con 0 mg/ml de PEG activado) EJEMPLO 7 Vanantes que tienen unión a carbohidrato incrementada en la posición 49 El sitio de glucosilacion insertado N-asociado en la posición 49 en la vanante del IFNB [Q49N Q51T] descrito en el ejemplo 6 de WO01/15736 se utilizo solamente a aproximadamente 60% Con el objeto de incrementar la cantidad de carbohidrato unido el residuo de glutamina en la posición 48 se cambio con fenilalanina (Q48F) vahna (Q48V) y triptofano (Q48W) mediante mutagenesis sitio dirigida por PCR Utilizando BIO X ACT (Bioline RU) y PF185 (PF185 contiene la misma secuencia de ADNc que PF104 descrito en el ejemplo 6 a pesar del hecho de que una secuencia Kozak ha sido insertada en la parte frontal del inicio ATG) como molde las reacciones de PCR se llevaron a cabo con senes de iniciadores que se sobreponen Q48F. Q49N. Q51T PBR89 (5 CGCGGATCCAGCCCACCATGACCAACAAGTGCCTG)/PBR148 (5 GTCCTCCTTGGTGAAGTTGAACAGCTGCTT) y PBR8 ((5 ATATATCCCAAGCTTTTATCAGTTGCGCAGGTAGCCCGGT 3 ))/PBR147 (5 AAGCAGCTGTTCAACTTCACCAAGGAGGAC) Q48V. Q49N. Q51T PBR89 (5 CGCGGATCCAGCCACCATGACCAACAAGTGCCTG)/PBR150 (5 GTCCTCCTTGGTGAAGTTCACCAGCTGCTT) y PBR8/PBR149 (5 AAGCAGCTGGTGAACTTCACCAAGGAGGAC) Q48W. Q49N, Q51T PBR89 (5 CGCGGATCCAGCCACCATGACCAACAAGTGCCTG)/PBR152 (5 GTCCTCCTTGGTGAAGTTCCACAGCTGCTT) y PBR8/PBR151 (5 AAGCAGCTGTGGAACTTCACCAAGGAGGAC) Los fragmentos se ensamblaron en reacciones de PCR con los iniciadores flanqueantes PBR89 y PBR8 Los genes resultantes se insertaron dentro del vector de expresión para mamífero pcDNA3 1 ( ) Hygro/lntron y se confirmaron mediante la secuenciacion para que tuvieran los cambios de bases correctos que llevan al [Q48F Q49N Q51T] IFNB de humano (plasmido designado PF305) [Q48V Q49N Q51T] del IFNB de humano (plasmido designado PF306) y [Q48W Q49N Q51T] del IFNB de humano (plasmido designado PF307) respectivamente PF305 PF306 PF307 y PF185 (que codifican [Q49N 051 IFNB de humano) se transfectaron dentro de células CHO K1 mediante el uso de Fugene 6 (Roche) como agente para transfeccion 24 horas después el medio de cultivo se cosecho y se ensayo para actividad de IFNB PF185 134713 Ul/ml PF305 53122 Ul/ml PF306 65949 Ul/ml PF307 45076 Ul/ml Con el objeto de evaluar la cantidad de carbohidrato unido en estas variantes de glucosilacion se llevo a cabo Western blot con una cantidad igual que actividad en cada linea Como se observo los intercambios de aminoácidos (Q48F Q48V Q48W) enfrente del sitio de glucosilacion introducido (Q49N Q51T) llevaron a una cantidad incrementada de material completamente glucosilado En otro experimento se observo que la inserción de especialmente tirosina en la posición 48 lleva a una cantidad incrementada de carbohidrato unido al sitio de glucosilacion insertado N asociado en la posición 49 EJEMPLO 8 Vanantes que tienen unión incrementada al carbohidrato en la posición 111 El sitio de glucosilacion insertado N-asociado en la posición 1 1 en la vanante del IFNB [F111 N R113T] descrita en el ejemplo 5 de WO 01/15736 se utiliza solamente a aproximadamente 50% Con el objeto de incrementar la cantidad de carbohidrato unido el residuo de acido aspartico en la posición 110 se cambio con fenilalanina (D1 0F) y valina (D1 0V) mediante mutagenesis sitio dirigida por PCR Utilizando BIO X ACT (Bioline RU) y PF085 (descrito en el ejemplo 5 de WO 01/15736) como un molde las reacciones de PCR se llevaron a cabo con series de iniciadores que se sobreponen D1 10F. F1 11 N. R1 13T PBR89 (5 CGCGGATCCAGCCACCATGACCAACAAGTGCCTG)/PBR154 (5 CAGCTTGCCGGTGGTGTTGAACTCCTTCTC) y PBR8/PBR153 (GAGAAGGAGTTCAACACCACCGGCAAGCTG) D1 10V, F1 11 N, R1 13T PBR89 (5 CGCGGATCCAGCCACCATGACCAACAAGTGCCTG)/PBR156 (5 CAGCTTGCCGGTGGTGTTCACCTCCTTCTC) y PBR8/PBR155 (5 GAGAAGGAGGTGAACACCACCGGCAAGCTG) Los fragmentos se ensamblaron en las reacciones de PCR con los iniciadores flanqueantes PBR89 y PBR8 Los genes resultantes se insertaron dentro del vector de expresión para mamífero pcDNA3 1 ( ) Hygro/lntron y se confirmaron mediante secuenciacion para que tuvieran los cambios de bases correctos que llevan a [D110F F1 11 N R1 13T] IFNB de humano (plasmido designado PF308) y [D1 10V F111 N R113T] IFNB de humano (plasmido designado PF309) respectivamente PF308 PF309 y PF085 (que codifican [F1 11 N Rl ^ del IFNB de humano) se transfectaron dentro de las células CHO K1 mediante el uso de Fugene 6 (Roche) como un agente para transfeccion 24 horas después el medio de cultivo se cosecho y se ensayo para actividad del IFNB PF085 58615 Ul/ml PF308 50900 Ul/ml PF309 15063 Ul/ml Con el objeto de evaluar la cantidad de carbohidrato unido en estas vanantes de glucosilacion se llevo a cabo un Western blot con igual cantidad de actividad en cada linea Como se observa en los intercambios de aminoácidos (D1 10F y D110V) enfrente del sitio de glucosilacion introducido (F1 11 N R1 13T) ambos llevan a una cantidad significativamente incrementada de material completamente glucosilado En otro experimento se observo que la inserción de especialmente tirosina en la posición 110 lleva a una cantidad incrementada de carbohidrato unido al sitio de glucosilacion insertado N asociado en la posición 1 1 1 EJEMPLO 9 Separación de las glucoformas del polipeptido de IFNB La cromatografía con hidroxiapatita es un modo eficiente para la separación de las glucoformas del IFNB y por ejemplo se obtienen glucoformas las cuales utilizan completamente los sitios de glucosilacion Esto se ilustra en el presente ejemplo La vanante del IFNB [Q49N+Q51T+F1 1 1 N+R1 13T] producida como se describe en el ejemplo 8 de WO01/15736 se purifico en un procedimiento de tres pasos El medio cosechado a partir de las botellas giratorias se centrifugo y se filtro a través de un filtro de 0 22 um (PVDF) El medio filtrado se diafiltro en un sistema Vivaflow 200 equipado con una membrana de polietersulfona con un limite de 10000 y se aplico a una columna de S Sefarosa (Pharmacia) equilibrada con acetato de sodio 50 mM cloruro de sodio 50 mM pH 5 5 La vanante del IFNB unida a la columna se eluyo con acetato de sodio 50 mM cloruro de sodio 0 5 M pH 5 5 La concentración del cloruro de sodio en el eluido a partir de la columna de S Sefarosa se ajusto a 1 0 M y la muestra se aplico sobre una columna de Fenil Sefarosa de alta resolución (Pharmacia) equilibrada con acetato de sodio 50 mM cloruro de sodio 1 0 M pH 5 5 Después de la aplicación la columna se lavo con agua Milli Q La variante del IFNB se eluyo con un gradiente a partir del agua Milli Q a 60% de etilenglicol acetato de sodio 50 mM pH 5 5 en 30 volúmenes de columna Las reacciones que contenían la vanante del IFNB completamente glucosilada se recolectaron y el regulador de pH en el eluido se cambio a regulador de pH de fosfato de sodio 15 mM pH 7 2 La muestra se aplico sobre una columna de hidroxiapatita (CHTII cerámica de hidroxiapatita Tipo II Biorad) equilibrada con fosfato de sodio 15 mM La forma completamente glucosilada paso a través de la columna mientras que la forma poco glucosilada con un sitio extra utilizado se unió a la columna y se eluyo con un gradiente lineal de fosfato de sodio a partir de 15 mM a 200 mM en 20 volúmenes de columna La pureza del [Q49N+Q51T+F1 1 1 ?+?,113? IFNB completamente glucosilado se juzgo superior al 95% basándose en SDS PAGE EJEMPLO 10 Polietilenqlucosilacion de las vanantes del IFNB con sitios de qlucosilacion introducidos Una solución de almacenamiento recientemente preparada de SCM-PEG (succimmidil ester de PEG carboximetilatdo a partir de Shearwater Alabama 5 kDa o 12 kDa) se preparo en metanol antes de cada experimento Se polietilenglucosilaron 100 microlitros de una solución de 0 3 mg/ml de la glucovariante [Q49N+QS1T+F1 11 N+R1 13T] del IFNB de humano en fosfato sódico 50 mM cloruro de sodio 100 mM pH 7 0 con SCM PEG 5 kDa o 12 kDa con excesos molares de dos veces de PEG para los posibles sitios de pohetilenglucosilacion por ejemplo lisinas y N terminales Después de la incubación por 30 minutos a temperatura ambiente la reacción se detuvo mediante la adición de 5 ul de glicina 20 mM pH 8 0 En esta etapa la mezcla de reacción contenía una parte menor de proteina no modificada a juzgar por SDS PAGE La evaluación in vitro utilizando el ensayo de selección primaria demostró que el matenal polietilenglucosilado retenía 40% de actividad con 1 3 grupos de PEG de 12 kDa unidos Con 1 3 grupos de PEG de 5 kDa unidos la bioactividad retenida fue del 25% En otro experimento 50 ul del [Q49N+Q51T+F111 N+R1 13T+K19R+K45R+K123R] IFNB purificado de humano con una concentración de protema de 0 1 mg/ml se polietilenglucosilaron en fosfato sódico 50 mM cloruro de sodio 100 mM pH 8 0 con SCM PEG 5 kDa con 20 veces de exceso molar de PEG para los posibles sitios de polietilenglucosilacion por ejemplo lisinas y N terminales Después de la incubación por 30 minutos a temperatura ambiente la reacción se detuvo mediante la adición de 5 ul de glicina 20 mM pH 8 0 En esta etapa la mezcla de reacción contenía una parte menor de protema no modificada juzgada por SDS PAGE La evaluación in vitro utilizando el ensayo de selección primario demostró que el material pohetilenglucosilado retenía 45% de actividad con 1 3 grupos de PEG de 5 kDa unidos A un mayor exceso molar el PEG fue necesario para las vanantes pohetilenglucosiladas en las cuales una o vanas hsinas fueron sustituidas con otros residuos de aminoácidos El material polietilenglucosilado se separo a partir el material no polietilenglucosilado y del exceso de PEG utilizando ya sea mediante cromatografía por exclusión de tamaño o mediante cromatografía de intercambio cationico o una combinación de ambas La cromatografía por exclusión de tamaño se llevo a cabo con una columna de Superase 12 o Superdex 75 a partir de Pharmacia equilibrada con regulador de pH de PBS pH 7 2 La cromatografía de intercambio cationico se llevo a cabo sobre una columna de SP Sefarosa HP (Pharmacia) equilibrada con citrato 20 mM pH 2 7 La elución a partir de la columna de SP Sefarosa HP se llevo a cabo ya me sea mediante el incremento de la concentración de sal (por ejemplo cloruro de sodio) o mediante el incremento del pH del regulador de pH (por ejemplo acetato de sodio o fosfato sódico) EJEMPLO 11 Estabilización de la vanante qlucosilada del IFNB mediante la realización de sustitución de C17S Las células CHO K1 se transfectaron con plasmidos que codifican dos vanantes hiper-glucosilada del IFNB [S2N N4T Q51 N E53T] IFNB de humano (PF276) e [S2N N4T C17S Q51 N ?53? IFNB de humano (PF279) Los agolpamientos confluentes para transfeccion primaria estable se expandieron en cuatro botellas T-175 cada una Cuando alcanzaron la confluencia las botellas fueron cambiadas de medio que contenía suero a medio libre de suero basado en medio DMEM/F 12 (Life Tecnologies # 21045 025) suplementado con 1/100 ITSA (Life Technologies # 51300 044) y 1/1000 Ex Cyte (Serologicals Corp # 81 129) Cada día por 15 días se cosecharon 120 mi de cada vanante y se congelaron a 80 C Los sobrenadantes a partir de las cosechas dianas se recolectaron y se filtraron a través de un filtro de 0 22 um (basado en PVDF) El sobrenadante se concentro aproximadamente 15 veces en un sistema Vivaflow 200 equipado con una membrana de polietersulfona con limite de 10000 y la muestra del concentrado se aplico sobre una columna de S Sefarosa equilibrada con acetato de sodio 50 mM NaCI 50 mM pH 5 5 La variante del IFNB se eluyo en un paso con acetato de sodio 50 mM NaCI 0 5 M pH 5 5 La concentración de cloruro de sodio en el eluido a partir de la columna de S-Sefarosa se ajusto a 1 0 M y la muestra se aplico sobre una columna de Fenil Sefarosa equilibrada con acetato de sodio 50 mM cloruro de sodio 1 0 M pH 5 5 Se llevo a cabo un lavado extensivo con el regulador de pH para equilibrio antes de que la variante del IFNB se eluyera con 60% de etilenglicol en acetato de sodio 50 mM pH 5 5 La SDS-PAGE no reducirá después de la punficacion demostró claramente la formación de dimeros con el [S2N N4T Q51 N E53TJ IFNB de humano mientras que no se presentaron dimeros con el [S2N N4T C17S Q51 N E53T] IFNB de humano EJEMPLO 12 Producción, purificación v polietilenqlucosilacion de la vanante C17S+Q49N+Q51T+D110F+F 11 N+R 13T de IFNB de humano Una subclona de CHOK1 (5/G-10) que producía la vanante de glucosilacion [C17S I49N+Q51T+D110F+F1 1 1 N+R1 13T] del IFNB de humano se sembró en 6 botellas giratorias cada una con una superficie expandida de 1700 cm2 (Corning EUA) en 200 mi de medio DMEM/F 12 (LifeTechnologies Cat # 31330) suplementado con 10% de FBS y penicilina/estreptomicina (P/S) Después de 2 días el medio se cambio Después de otros 2 días las dos botellas giratorias estaban casi al 100% de confluencia y el medio se cambio a 300 mi de medio UltraCHO libre de suero (BioWhittaker Cat # 12-724) suplementado con 1/500 EX CYTE (Serologicals Proteins Cat # 81129N) y P/S El crecimiento de las células en este medio promueve una mayor masa celular mayor de la que se logra en el medio que contiene suero Después de 2 días el medio se renovó Después de otros 2 días el medio se cambio al medio de producción medio DMEM/F 12 (Life Technologies Cat # 21041) suplementado con 1/100 ITSA (Life Technologies Cat # 51300- 044) [ITSA se establece para insulina (1 0 g/L)-transferrina (0 55 g/L) selenio (0 67 mg/L) suplementado para cultivos adherentes] 1/500 EC-CYTE y P/S Los medios cosechados a partir de las botellas giratorias fueron agrupados antes de que se tomara una muestra del medio para la determinación de actividad del IFNB Cada día por 21 días se cosecharon 1 8 I de medio y se congelaron a 80°C El medio cosechado a partir de las botellas giratorias se centrifugo y se filtro a través de un filtro de 0 22 um (PVDF) El medio filtrado se diafiltro en un sistema Vivaflow 200 equipado con una membrana de polietersulfona con limite de 10000 y se aplico una columna de S Sefarosa (Pharmacia) La columna de S Sefarosa se equilibro con acetato de sodio 50 mM cloruro de sodio 50 mM pH 5 5 y la vanante del interferon se eluyo con acetato de sodio 50 mM cloruro de sodio 0 5 M pH 5 5 La concentración del cloruro de sodio en el eluido se ajusto a 1 0 M El eluido a partir de la columna de S Sefarosa se aplico sobre una columna de Fenil Sefarosa de alta resolución (Pharmacia) equilibrada con acetato de sodio 50 mM cloruro de sodio 1 0 M pH 5 5 Después de la aplicación la columna se lavo con acetato de sodio 50 mM cloruro de sodio 50 mM pH 5 5 La vanante del IFNB se eluyo con un gradiente a partir de acetato de sodio 50 mM cloruro de sodio 50 mM pH 5 5 a 60% de etilenglicol acetato de sodio 50 mM pH 5 5 en 30 volúmenes de columna Las fracciones que contenían la variante del IFNB completamente glucosilada se recolectaron y se agruparon El etilenglicol a partir del eluido en la Fenil-Sefarosa se removió mediante el paso del eluido a través de una columna de S Sefarosa equilibrada con acetato de sodio 50 mM cloruro de sodio 50 mM pH 5 5 El etilenglicol estuvo en el flujo a través mientras que la vanante del interferon estaba unida a la columna Después de la aplicación la columna se lavo con acetato de sodio 20 mM pH 5 5 y la vanante del interferon se eluyo con fosfato sódico 100 mM pH 7 5 La concentración de fosfato en el eluido se ajusto a regulador de pH de fosfato sódico 15 mM pH 7 2 y se aplico sobre una columna de hidroxiapatita (CHT I cerámica de hidroxiapatita Tipo I Biorad) equilibrada con fosfato sódico 15 mM pH 7 2 La forma completamente glucosilada paso a través de la columna mientras que la forma poco glucosilada con un sitio extra se unió a la columna y se eluyo con un gradiente lineal de fosfato sódico a partir de 15 mM a 200 mM pH 6 8 en 20 volúmenes de columna La pureza de la vanante del [C17S+Q49N+Q51T+D1 10F+F1 1 1 N+R1 ^ IFNB de humano completamente glucosilada se juzgo superior al 95% basándose en SOS PAGE Después de la purificación la vanante se polietilenglucosilo Una solución de almacenamiento recientemente hecha de SCM PEG 10 mg/ml (succinimidil ester de PEG carboximetilado a partir de Shearwater Alabama 12 K o 20 K) se preparo en 96 % de etanol antes de cada experimento Una solución de proteina de 0 1 mg/ml en fosfato sódico 20 mM pH 7 0 se polietilenglucosilo con SCM PEG 20K con excesos molares de 0 75 veces PEG para los posibles sitios de polietilenglucosilacion por ejemplo lisinas y N terminales Después de la incubación por 30 minutos a temperatura ambiente la reacción se detuvo mediante la adición de un exceso de glicina 20 mM pH 8 0 La mezcla de reacción contenía una mezcla de material mono- di- y no-polietilenglucosilado El material mono-polietilenglucosilado se separo a partir de otras especies utilizando ya sea cromatografía de intercambio cationico o cromatografía por exclusión de tamaño con una combinación de ambas El pH en la solución de polietilenglucosilacion se ajusto a pH 2 7 y la mezcla se aplico sobre una columna de SP Sefarosa HR (Pharmacia) equilibrada con citrato de sodio 20 mM pH 2 7 La protema polietilenglucosilada se eluyo a partir de la columna con acetato de sodio 50 mM que contenía cloruro de sodio 1 M y se aplico una columna por exclusión de tamaño Sephacryl S 100 ((16/60) Pharmacia) equilibrada con acetato de sodio 100 mM cloruro de sodio 200 mM pH 5 5 Las fracciones que contenía en material mono polietilenglucosilado se agruparon y se caracterizaron adicionalmente En otro experimento una solución de protema de 0 16 mg/ml en fosfato sódico 20 mM pH 7 0 se polietilenglucosilo con SCM-PEG 12K con excesos molares de 2 veces de PEG para los posibles sitios de polietilenglucosilacion por ejemplo lisinas y N-terminales Después de la incubación por 30 minutos a temperatura ambiente la reacción se detuvo mediante la adición de un exceso de glicina 20 mM pH 8 0 La mezcla de reacción contenía una mezcla de material mono- di tri pohetilenglucosilado junto con material no derivado El material polietilenglucosilado se separo a partir de la protema no modificada utilizando ya sea cromatografía de intercambio cationico o cromatografía por exclusión de tamaño o una combinación de ambas El pH en la solución de polietilenglucosilacion se ajusto a pH 2 7 y la mezcla se aplico sobre una columna de SP Sefarosa HR (Pharmacia) equilibrada con citrato de sodio 20 mM pH 2 7 La proteina polietilenglucosilada se eluyo a partir de la columna con acetato de sodio 50 mM que contenía cloruro de sodio 1 M y se aplico sobre una columna para exclusión de tamaño Sephacryl S-100 ((16/60) Pharmacia) equilibrado con acetato de sodio 100 mM cloruro de sodio 200 mM pH 5 5 Las fracciones que contenían la mezcla de proteina mono- di- y tri polietilenglucosilado se agruparon y se caracterizaron adicionalmente EJEMPLO 13 Producción, purificación y polietilenglucosilacion de la vanante rC17S+K19R+K33R+K45R-fQ49N-t-Q51T+D110F+F111 +R113n de IFNB de humano en botellas giratorias Una subclona de CHOK1 (5/G 10) que produce la vanante de glucosilacion del [C17S+K19R+K33R+K45RKM9N Í51T+D110F+F1 11 N+R1 ^ IFNB de humano se produjo en 6 botellas giratorias como se describe en el ejemplo 12 y se purifico de conformidad con el protocolo utilizado en el ejemplo 12 La pureza de la vanante [C17S+K19R+K33R+K45R+Q49N+Q51T+D110F+F1 11 N+ R1 ^ del IFNB completamente glucosilada se juzgo mayor de 95% con base en SDS PAGE Después de la purificación la vanante fue polietilenglucosilada Una solución de almacenamiento recientemente elaborada de SCM PEG (succinimidil ester de PEG carboximetilatdo a partir de Shearwater Alabama 12 kDa o 20 kDa) se preparo en etanol antes de cada experimento Una solución de proteina de 0 1 mg/ml en fosfato sódico 20 mM pH 7 0 se polietilenglucosilo con SCM PEG 20K con 3 veces el exceso molar de PEG para los posibles sitios de polietilenglucosilacion por ejemplo lisinas y N-terminales Después de la incubación por 30 minutos a temperatura ambiente la reacción se detuvo mediante la adición de un exceso de glicina 20 mM pH 8 0 La mezcla de reacción contenía una mezcla de material mono di y no pohetilenglucosilado El material mono pohetilenglucosilado se separo a partir de otras especies utilizando ya sea cromatografía de intercambio cationico o cromatografía por exclusión de tamaño o una combinación de ambas El pH en la solución de polietilenglucosilacion se ajusto a pH 2 7 y la muestra se aplico sobre una columna de SP-Sefarosa HR (Pharmacia) equilibrada con citrato de sodio 20 mM pH 2 7 La proteina polietilenglucosilada se eluyo a partir de la columna con acetato de sodio 50 mM que contenía cloruro de sodio 1 M y se aplico sobre una columna para exclusión de tamaño Sephacryl S 100 ((16/60) Pharmacia) equilibrado con acetato de sodio 100 mM cloruro de sodio 200 mM pH 5 5 Las fracciones que contenía el material mono pohetilenglucosilado se agruparon y se caracterizaron adicionalmente En otro experimento una solución de proteina de 0 1 mg/ml en fosfato sódico 20 mM pH 7 0 se polietilenglucosilo con (10 mg/ml) SCM PEG 12K con 5 veces de exceso molar de PEG para los posibles sitios de polietilenglucosilacion por ejemplo hsinas y N terminales Después de la incubación por 30 minutos a temperatura ambiente la reacción se detuvo mediante la adición de un exceso de glicina 20 mM pH 8 0 La mezcla de reacción contenía una mezcla de material mono- di tn polietilenglucosilado junto con material no derivado El material polietilenglucosilado se separo a partir de la proteina no modificada utilizando ya sea cromatografía de intercambio cationico o cromatografía por exclusión de tamaño o una combinación de ambas El pH en la solución polietilenglucosilada se ajusto a pH 2 7 y la muestra se aplico sobre una columna de SP-Sefarosa HR (Pharmacia) equilibrada con citrato de sodio 20 mM pH 2 7 La proteina polietilenglucosilada se eluyo a partir de la columna con acetato de sodio 50 mM que contenía cloruro de sodio 1 M y se aplico sobre una columna para exclusión de tamaño Sephacryl S-100 ((16/60) Pharmacia) equilibrada con acetato de sodio 100 mM cloruro de sodio 200 mM pH 5 5 Las fracciones que contenía la mezcla de la proteina mono di- y tn pohetilenglucosilada se agruparon y se caracterizaron adicionalmente LISTADO DE SECUENCIA <110 axygen ApS H Lundbeck A/S <120> Moléculas Semejantes a interferon beta para el tratamiento del evento cerebrovascular <130> 0256wo210 INFB para evento cerebrovascular <140> <141> <160> 51 <170> Patentln Ver 2 1 <210> 1 <211> 840 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial Cassette de e/presion para expresión de IFNB en mamíferos y células de insectos <400> 1 acattctaac tgcaaccttt cgaagccttt gctctggcac aacaggtagt aggcgacact 60 gttcgtgttg tcaacatgac caacaagtgt ctcctccaaa ttgctctcct gttgtgcttc 120 tccactacag ctctttccat gagctacaac ttgcttggat tcctacaaag aagcagcaat _80 tttcagtgtc agaagctcct gtggcaattg aatgggaggc ttgaatactg cctcaaggac 2-0 aggatgaact ttgacatccc tgaggagatt aagcagctgc agcagttcca gaaggaggac 300 gccgcattga ccatctatga gatgctccag aacatctttg ctattttcag acaagattca 360 tctagcactg gctggaatga gactattgtt gagaacctcc tggctaatgt ctatcatcag 20 ataaaccatc tgaagacagt cctggaagaa aaactggaga aagaagattt caccagggga ¿80 aaactcatga gcagtctgca cctgaaaaga tattatggga ggattctgca ttacctgaag 5-0 gccaaggagt acagtcactg tgcctggacc atagtcagag tggaaatcct aaggaacttt 600 tacttcatta acagacttac aggttacctc cgaaactgaa gatctcctag cctgtgcctc 660 tgggactgga caattgcttc aagcattctt caaccagcag atgctgttta agtgactgat 720 ggctaatgta ctgcatatga aaggacacta gaagattttg aaatttttat taaattatga 780 gttattttta tttatttaaa ttttattttg gaaaataaat tatttttggt gcaaaagtca 840 <210> 2 <211> 166 <212> P T <213> Homo sapiens <130> 0256wo210 INFB for stroke <400> 2 Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln 1 5 10 15 Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu 20 25 30 Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp lie Pro Glu Glu lie Lys Gln Leu Gln 35 40 45 Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr lie T/r Glu Met Leu Cln 50 55 60 Asn lie Phe Ala lie Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 65 70 75 80 Glu Thr lie Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln lie Asn 85 90 95 His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu L/s Glu 2sp Phe "rr 100 105 110 Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu L/s Arg T/r Tyr Gly ^ g 115 120 125 lie Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His C/s Ala Tr Thr 130 135 140 lie Val Arg Val Glu lie Leu Arg Asn Phe Tyr Phe lie Asn Arg Leu 145 150 155 160 Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 165 <210> 3 «211> 166 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial variante IFNB <400> 3 Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln 1 5 10 15 Ser Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu 20 25 30 Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp lie Pro Glu Glu lie Lys Gln Leu Gln 35 40 45 Asn Phe Thr Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr lie Tyr Glu Met Leu Gln 50 55 60 Asn lie Phe Ala lie Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 65 70 75 80 Glu Thr lie Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln lie Asn 85 90 95 Has Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Phe Asn Thr 100 105 110 Thr Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 115 120 125 lie Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Tnr 130 135 140 lie Val Arg Val Glu lie Leu Arg Asn Phe Tyr Phe lie Asn Arg beu 145 150 155 160 Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 165 <210> 4 <211> 70 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 4 ggctagcgtt taaacttaag cttcgccacc atgaccaaca agtgcctgct ccagatcgcc 60 ctgctcctgt 70 <210> 5 <211> 70 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 5 acaacctgct cggcttcctg cagaggagtt cgaacttcca gtgccagaag ctcctgtggc agctgaacgg <210> 6 <211> 70 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 6 gaacttcgac atccccgagg aaatcaagca gctgcagcag ttccagaagg aggacgccgc 60 tctgaccatc 70 <210> 7 <211> 70 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 7 ttccgccagg actccagctc caccggttgg aacgagacca tcgtggagaa cctgctggcc aacgtgtacc <210> 8 <211> 70 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223? Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 8 aggagaagct ggagaaggag gacttcaccc gcggcaagct gatgagctcc ctgcacctga 60 agcgctacta 70 <210> 9 <211> 70 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 9 ggagtacagc cactgcgcct ggaccatcgt acgcgtggag atcctgcgca acttctactt 60 catcaaccgc 70 <210> 10 <211> 70 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 10 caccacactg gactagtgga tccttatcag ttgcgcaggt agccggtcag gcggttgatg 60 aagtagaagt 70 <210> 11 <211> 70 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 11 aggcgcagtg gctgtactcc ttggccttca ggtagtgcag gatgcggcca tagtagcgct 60 tcaggtgcag 70 <210> 12 <211> 70 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 12 ctccttctcc agcttctcct ccagcacggt cttcaggtgg ttgatctggt ggtacacgtt 60 ggccagcagg 70 <210> 13 <211> 70 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 13 gagctggagt cctggcggaa gatggcgaag atgttctgca gcatctcgta gatggtcaga gcggcgtcct <210> 14 <211> 70 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 14 cctcggggat gtcgaagttc atcctgtcct tcaggcagta ctccaggcgc ccgttcagcc 60 gccacaggag 70 <210> 15 <211> 70 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 15 caggaagccg agcaggttgt agctcatcga tagggccgtg gtgctgaagc acaggagcag 60 ggcgatctgg 70 <210> 16 <211> 70 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 16 ctgctccaga tcgccctgct cctgtgcttc agcaccacgg ccctatcgat gaagcaccag 60 caccagcatc 70 <210> 17 <211> 70 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 17 cactgcttac tggcttatcg aaattaatac gactcactat agggagaccc aagctggcca 60 gcgtttaaac 70 <210> 18 <211> 70 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 18 caggaagccg agcaggttgt agctcatctg ttggtgttga tgttggtgct gatgctggtg 60 ctggtgcttc 70 <210> 19 ¦s211> 70 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 19 agcagggcga tctggagcag gcacttgttg gtcatggtgg cgaagcttaa gtttaaacgc 60 tagccagctt 70 <210> 20 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 20 ccgtcagatc ctaggctagc ttattgcggt agtttatcac <210> 21 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 21 gagctcggta ccaagctttt aagagctgta at 32 <210> 22 <211> 77 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 22 gctgaacggg cgcctggagt actgcctgaa ggacaggatg aacttcgaca tccccgagga aatccgccag ctgcagc <210> 23 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220 <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 23 tctccacgcg tacgatggtc caggcgcagt ggctg 35 <210> 24 <211> 70 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 24 caccacactg gactagtgga tccttatcag ttgcgcaggt agccggtcag gcggttgatg 60 aagtagaagt 70 <210> 25 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 25 catcagcttg ccggtggtgt tgtcctcctt c 31 <210> 26 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 26 gaaggaggac aacaccaccg gcaagctgat g 31 <210> 27 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 27 cacactggac tagtaagctt ttatcagttg cgcaggtagc 40 <210> 28 <211> 47 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 28 gaggagttcg aacttccagt gccagcgcct cctgtggcag ctgaacg <210> 29 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 29 tttaaactgg atccagccac catgaccaac aag <210> 30 <211> 63 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 30 cggccatagt agcgcttcag gtgcagggag ctcatcagct tgccggtggt gttgtccccc ttc 6 <210> 31 <211> 63 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 31 gaaggaggac aacaccaccg gcaagctgat gagctccctg cacctgaagc gctactatgg ccg 6 <210> 32 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 32 ggcgtcctcc ttggtgaagt tctgcagctg 30 <210> 33 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 33 atatatccca agcttttatc agttgcgcag gtagccggt 39 <:210> 34 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 34 cagctgcaga acttcaccaa ggaggacgcc 30 <210> 35 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 35 cgcggatcca gccaccatga ccaacaagtg cctg 3- <210> 36 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 36 cgcggatcca gccaccatga ccaacaagtg cctg 34 210> 37 211> 30 212> ADN <213> Secuencia Artificial ¿220» <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 37 gtcctccttg gtgaagttga acagctgctt 30 <:210> 38 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 38 atatatccca agcttttatc agttgcgcag gtagccggt 39 <210> 39 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 39 aagcagctgt tcaacttcac caaggaggac 30 <210> 40 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 40 cgcggatcca gccaccatga ccaacaagtg cctg 34 <210> 41 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 41 gtcctccttg gtgaagttca ccagctgctt 30 <210> 42 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> -|0 <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 42 aagcagctgg tgaacttcac caaggaggac 30 <210> 43 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> •jg <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 43 cgcggatcca gccaccatga ccaacaagtg cctg 3«» <210> 44 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador 0 <400> 44 gtcctccttg gtgaagttcc acagctgctt 30 <210> 45 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 45 aagcagctgt ggaacttcac caaggaggac 210> 46 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador 400> 46 cgcggatcca gccaccatga ccaacaagtg cctg <210> 47 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 47 cagcttgccg gtggtgttga actccttctc <210> 48 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 48 gagaaggagt tcaacaccac cggcaagctg <210> 49 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 49 cgcggatcca gccaccatga ccaacaagtg cctg 3* <210> 50 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 50 cagcttgccg gtggtgttca cctccttctc 30 <210> 51 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial iniciador <400> 51 gagaaggagg tgaacaccac cggcaagctg 30 11 12

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1 El uso de una vanante pohpeptidica del interferon ß (IFNB) que comprende una secuencia de aminoácidos la cual difiere de la secuencia de aminoácidos del IFNB humano de tipo silvestre (SEQ ID NO 2) porque se ha introducido al menos un sitio de glucosilacion para la elaboración del medicamento para el tratamiento del evento cerebrovascular o accidente cerebrovascular (CVA) en un primate 2 El uso como se reclama en la reivindicación 1 en donde dicho evento cerebrovascular es un evento cerebrovascular isquémico 3 El uso como se reclama en la reivindicación 2 en donde dicho evento cerebrovascular isquémico se selecciona a partir del grupo consistente evento cerebrovascular embolico evento cerebrovascular cardioembolico evento cerebrovascular trombótico trombosis de vasos sanguíneos grandes infarto lacunar evento cerebrovascular arteria-arteria y evento cerebrovascular cnptogenico 4 - El uso como se reclama en la reivindicación 1 en donde dicho evento cerebrovascular es un evento cerebrovascular hemorragico 5 El uso como se reclama en la reivindicación 4 en donde dicho evento cerebrovascular hemorragico se selecciona a partir del grupo que consiste de evento cerebrovascular intraparenquimal evento cerebrovascular subdural evento cerebrovascular epidural y evento cerebrovascular subaracnoideo 6 - El uso de una vanante polipeptidica de interferon ß (IFNB) que comprende una secuencia de aminoácidos la cual difiere de la secuencia de aminoácidos del IFNB humano de tipo silvestre (SEQ ID NO 2) porque se ha introducido al menos un sitio de glucosilacion para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un ataque isquémico transitorio en un primate 7 - El uso como se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 6 en donde dicho primate es un humano 8 El uso como se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1-7 en donde dicho sitio de glucosilacion es un sitio de N-glucosilacion in vivo 9 El uso como se reclama en la reivindicación 8 en donde la vanante del IFNB esta asialo-glucosilada 10 - El uso como se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1-9 en donde la secuencia de aminoácidos de dicha vanante difiere de la secuencia de aminoácidos del IFNB humano de tipo silvestre (SEQ ID NO 2) en 1-15 residuos de aminoácidos 1 1 El uso como se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 10 en donde dicho al menos un sitio de glucosilacion se introduce mediante una sustitución seleccionada a partir del grupo que consiste de S2N+N4T/S L9N+R11T/S R1 1 N S12N+N14T/S F15N+C17S T Q16N+Q18T/S K19N+L21T/S Q23N+H25T/S G26N+L28T/S R27N+E29T/S L28N+Y30T/S D39T/S K45N+L47T/S Q46N+Q48T/S Q48N+F50T/S Q49N+Q51T/S Q51N+E53T/S R71N+D73T/S Q72N D73N S75N S76N+G78T/S L88T/S Y92T/S N93N+I95T/S L98T/S E 03N+K105T/S E104N+L106T/S E107N+E109T/S K108N+D110T/S D110N F111N+R113T/S y L116N 12 - El uso como se reclama en la reivindicación 11 en donde dichas instituciones se seleccionan a partir del grupo que consiste de S2N+N4T L9N+R11T Q49N+QT51T R71N+D73T y F111N+R113T 13- El uso como se reclama en la reivindicación 12 en donde dichas instituciones se seleccionan a partir del grupo que consiste de 4Q9N+Q51T R71N+D73Ty F11N+R113T 14 El uso como se reclama en la reivindicación 13 en donde dichas sustituciones se seleccionan a partir del grupo que consiste de Q49N+Q51Ty F1 1N+R113T 15- El uso como se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 11-14 en donde dicha vanante comprende las sustituciones seleccionadas a partir del grupo que consiste de Q49N+Q51 T+F111 N+R113T Q49N+Q51T+R71 N+D73T+F111 N+R113T S2N+N4T+F111 N+R113T S2N+N4T+Q49N+Q51T S2N+N4T+Q49N+Q51T+F111N+R113T S2N+N4T+L9N+R11T+Q49N+Q51 T S2N+N4T+L9N+R11 T+F111 N+R113T S2N+N4T+L9N+R11T+Q49N+Q51 T+F111 N+R113T L9N+R11T+Q49N+Q51T L9N+R11T+Q49N+Q51T+F111N+R113T y L9N+R1 1T+F111 N+R113T 16 El uso como se reclama en la reivindicación 15 en donde dicha vanante comprende las sustituciones Q49N+Q51T+F1 1 1 N+R1 13T 17 - El uso como se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 16 en donde el residuo de cisterna localizado en la posición 17 en el IFNB humano de tipo silvestre (SEQ ID NO 2) has sido removido 18 - El uso como se reclama en la reivindicación 17 en donde dicho residuo de cisterna ha sido removido mediante la sustitución C17S 19 El uso como se reclama en la reivindicación 18 en donde dicha vanante comprende las sustituciones seleccionadas a partir del grupo que consiste de C17S+Q49N+Q51T C17S+F1 1 1 N+R1 13T C17S+Q49N+Q51T+F111 N+R1 13T C17S+Q49N+Q51T+R71 N+D73T+F11 1 N+R1 13T S2N+N4T+C17S+F1 1 1 N+R1 13T S2N+N4T+C17S+Q49N+Q51T S2N+N4T+C17S+Q49N+Q51T+F11 1 N+R 3T S2N+N4T+L9N+R11T+C17S+Q49N+Q51T S2N+N4T+L9N+R11T+C17S+F 11 +R 13T S2N+N4T+L9N+R11T+C17S+Q49N+Q51T+F1 1 1 N+R113T L9N+R1 1T+C17S+Q49N+Q51T L9N+R1 1T+C17S+Q49N+Q51T+F11 N+R1 13T y L9N+R1 1T+C17S+F111 N+R113T 20 El uso como se reclama en la reivindicación 19 en donde dicha vanante comprende las sustituciones C17S+Q49N+Q51T+F1 11 N+R1 13T 21 El uso como se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 20 en donde dicha vanante comprende una sustitución en la posición 1 10 22 El uso como se reclama en la reivindicación 21 en donde dicha sustitución se selecciona a partir del grupo que consiste de D1 10F D1 10V D110W D1 10Y 23 El uso como se reclama en la reivindicación 22 en donde dicha sustitución es D1 10F 24 El uso como se reclama en la reivindicación 23 en donde dicha vanante comprende sustituciones seleccionadas a partir del grupo que consiste de C17S+D1 10F+F1 1 N+R1 13T C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111 N+R1 13T C17S+Q49N+Q51T+R71 N+D73T+D1 10F+F11 1 N+R1 13T S2N+N4T+C17S+D1 10F+F111 N+R1 13T S2N+N4T+C17S+Q49N+Q51T+D110F+F1 1 1 N+R113T S2N+N4T+L9N+R11T+C17S+D110F+F1 1 1 N+R1 13T S2N+N4T+L9N+R11T+C17S+Q49N+Q51T+D1 10F+F11 1 N+R1 13T L9N+R11T+C17S+Q49N+Q51T+D1 10F+F111 N+R1 13T y L9N+R1 1T+C17S+D110F+F1 11 N+R1 13T 25 El uso como se reclama en la reivindicación 24 en donde dicha vanante comprende las sustituciones C17S+Q49N+Q51 T+D110F+F1 11 N+R1 13T 26 - El uso como se reclama en la reivindicación 25 en donde dicha vanante tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO 3 27 - El uso como se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 26 en donde una molécula polimerica esta covalentemente unida a un residuo de aminoácido de la vanante dicho residuo de aminoácido comprende un grupo de unión para la molécula polimerica 28 - El uso como se reclama en la reivindicación 27 en donde dicho polímero es una molécula PEG 29 - El uso como se reclama en la reivindicación 27 o 28 en donde dicho grupo de unión es el grupo e amino de un residuo de hsina o del grupo amino N-terminal 30 - El uso como se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 27-29 en donde al menos un residuo de hsina ha sido removido 31 - El uso como se reclama en la reivindicación 30 en donde dicho residuo de lisina se selecciona a partir del grupo que consiste de K19 K33 K45 K52 K99 K105 K108 K115 K123 K134 y K136 32 - El uso como se reclama en la reivindicación 31 en donde dicho residuo de lisina se selecciona a partir del grupo que consiste de K19 K33 K45 y K123 33 - El uso como se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 30 32 en donde dicho residuo de lisina ha sido removido mediante la sustitución de dicho residuo de lisina con un residuo de glicina o de glutamina 34 El uso como se reclama en la reivindicación 33 en donde dicha sustitucion(es) se (son) selecciona(das) a partir del grupo que consiste de K19R K33R K45R K123R K19R+K33R K19R+K45R K19R+K123R K33R+K45R K33R+K123R K45R+K123R K19R+K45R+K123R K19R+K33R+K123R K19R+K33R+K45R K33R+K45R+K123R y K19R+K33R+K45R+K123R 35 El uso como se reclama en la reivindicación 34 en donde dichas sustituciones se seleccionan a partir del grupo que consiste de K19R+K45R+K123R K19R+K33R+K123R K19R+K33R+K45R y K33R+K45R+K123R 36 El uso como se reclama en la reivindicación 35 en donde dichas sustituciones se seleccionan a partir del grupo que consiste de K19R+K33R+K45R 37 - El uso como se reclama en la reivindicación 36 en donde dicha vanante comprende sustituciones seleccionadas a partir del grupo que consiste de C17S+Q49N+Q51T+K19R+K33R+K45R C17S+D110F+F11 N+R113T+K19R+K33R+K45R C17S+Q49N+Q51 T+D110F+F1 11 +R 13T+K19R+K33R+K45R C17S+Q49N+Q51T+R71 N+D73T+D1 10F+F111 N+R1 13T+K19R+K33R+K45 R S2N+N4T+C17S+D1 10F+F1 11 N+R1 13T+K19R+K33R+K45R S2N+N4T+C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111 N+R113T+K19R+K33R+K45R S2N+N4T+L9N+R11T+C17S+D110F+F111N+R113T+K19R+K33R+K45R S2N+N4T+L9N+R11T+C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T+K19R+K3 3R+K45R L9N+R11T+C17S+Q49N+Q51T+D110F+F111N+R113T+K19R+K33R+K45R y L9N+R11 T+C17S+D110F+F111 +R113T+K19R+K33R+K45R 38 El uso como se reclama en la reivindicación 37 en donde dicha vanante comprende las sustituciones C 7S+Q49N+Q51T+D110F+F111 +R113T+K19R+K33R+K45R