KR20150006059A - 섬유모세포 성장 인자 21 변이체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 약리학적으로 효능있고 안정한 인간 섬유모세포 성장 인자 21 (FGF21) 변이체, FGF21 변이체를 포함하는 제약 조성물, 및 그러한 변이체를 사용하여 제2형 당뇨병, 비만, 이상지혈증 및/또는 대사 증후군을 치료하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 섬유모세포 성장 인자 21 (FGF21) 변이체, FGF21 변이체를 포함하는 제약 조성물, 및 제2형 당뇨병, 비만, 이상지혈증 및/또는 대사 증후군을 치료하는 방법에 관한 것이다.
FGF21은 글루코스 및 지질 항상성의 중요한 대사 조절제로서 기능하는 호르몬이다. FGF21은 인슐린의 것과는 뚜렷이 다른 메카니즘인 GLUT1 발현을 상향조절함으로써 지방세포에서의 글루코스 흡수를 촉진한다. 당뇨병 설치류와 원숭이에서, 인간 FGF21은 글루코스의 공복시 혈청 농도를 저하시켰고, 트리글리세리드, 인슐린 및 글루카곤의 공복시 혈청 농도를 감소시켰다. 또한, 식이 유발 비만의 설치류 모델에서, FGF21 투여는 용량 의존적 방식으로 누적 체중 감소를 가져왔다. 따라서, FGF21은 당뇨병, 비만, 이상지혈증 및 대사 증후군의 치료에 잠재적 유용성이 있다.
인간 FGF21의 변이체는 WO2010/084169, WO2010/065439, WO2006/028595 및 WO2005/061712에 기재되었다.
인간 야생형 FGF21 및 공지 FGF21 변이체와 관련된 문제점은 분자의 낮은 효능 및/또는 제약 불안정성이다. 따라서, 효능있고/있거나 안정한 대안적인 FGF21 변이체에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
본 발명은 대안적인 FGF21 변이체를 제공한다. 본 발명의 FGF21 변이체는 인간 야생형 FGF21과 당업계에 개시된 공지 FGF21 변이체를 능가하는 이점이 있다. 이들 이점은 향상된 효능 및/또는 향상된 제약 안정성을 보유하는 것을 포함한다. 향상된 효능 외에도, 본 발명의 FGF21 변이체는 생체내에서의 감소된 단백질분해, 산화에 대한 감소된 감수성, 고농도에서의 저하된 응집 성향, 포유동물 세포계에서의 생산중 번역후 변형 및 단백질분해의 저하된 수준, 및/또는 향상된 화학적 안정성을 포함하여, 치료용 단백질로서의 효율적인 제조 및/또는 제제화에 유용한 하나 이상의 유리한 안정성 특징을 갖는다. 추가적으로, 본 발명의 FGF21 변이체는 제2형 당뇨병, 비만, 이상지혈증 및/또는 대사 증후군의 치료에 잠재적으로 유용하다.
본 발명은 아미노산 서열이 하기 서열 1인 FGF21 변이체를 제공한다:
본 발명은 또한 본 발명의 FGF21 변이체 및 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 FGF21 변이체를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 제2형 당뇨병, 비만, 이상지혈증 및/또는 대사 증후군을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 제약 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 제2형 당뇨병, 비만, 이상지혈증 및/또는 대사 증후군을 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 요법에 사용하기 위한 본 발명의 FGF21 변이체를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명은 제2형 당뇨병, 비만, 이상지혈증 및/또는 대사 증후군의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 FGF21 변이체를 제공한다.
또한, 본 발명은 제2형 당뇨병, 비만, 이상지혈증 및/또는 대사 증후군 치료용 의약의 제조에 있어서 본 발명의 FGF21 변이체의 용도를 제공한다.
전장 인간 야생형 FGF21은 27 아미노산 신호 펩티드를 함유하는 208 아미노산 폴리펩티드이다. 성숙 인간 야생형 FGF21은 27 아미노산 신호 펩티드가 없고, 그에 따라 181 아미노산 폴리펩티드 (서열 2)로 귀결되는 전장 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 FGF21 변이체의 아미노산 위치에서의 변화는 성숙 인간 야생형 FGF21의 폴리펩티드 (서열 2)에서의 아미노산 위치로부터 측정된다. 따라서, "A31C"로서 본원에 기재되는 치환은 성숙 인간 야생형 FGF21 변이체의 위치 31에서 야생형 아미노산 Ala → 아미노산 Cys로의 치환을 언급한다.
특정 변이체에서의 1개 아미노산 잔기의 치환은 전체로서 변이체의 특징에 영향을 미칠 수 있다는 점과, 전체적인 효과는 약리학적 효능 및/또는 제약 안정성에 유익하거나 또는 유해할 수 있다는 점에 유념하는 것이 중요하다. 예를 들어, 1개 아미노산 치환인 P115W는 FGF21 변이체의 효능을 증가시키지만, P115W는 또한 응집을 초래하는 자기회합의 원인이 되는 것으로 생각된다. 따라서, 전체적인 효과는 변이체에 유해하고, 그에 따라 치환 P115W는 본 발명의 FGF21 변이체에 포함시키지 않는다. 또 다른 예는 아미노산 치환 R175L에 관한 것으로, 이는 FGF21 변이체의 효능을 증가시킨다. 그러나, R175L 치환을 갖는 FGF21 변이체는 단백질분해에 취약한 것으로 밝혀졌으며, 따라서 전체적인 효과는 유해하였다. 본 발명의 FGF21 변이체로 관찰된 C-말단 단백질분해에 대처하기 위하여, 위치 180 및 181에서의 아미노산 (위치 180에서 L 및 위치 181에서 G)을 위치 180에서 아미노산 E로 치환하고 181에서의 아미노산은 결실시킨다. 이들 변형은 실질적으로 C-말단 단백질분해를 감소시키지만, 아울러 인간 293 세포-βKlotho-SRE luc 검정에서 측정하여 FGF21 변이체의 약리학적 효능도 25배 감소시킨다. 놀랍게도, 효능은 위치 175에서의 아미노산 잔기 (R175L)를 야생형 R로 복귀시킴으로써 회복된다. 그러므로, 당해 치환의 전체적인 효과는 변이체에 유해하고, 따라서 치환 R175L은 본 발명의 바람직한 FGF21 변이체에 포함시키지 않는다.
본 발명의 FGF21 변이체는 실시예 2에서 서열 1에 대하여 증명하여 보여주는 바와 같이 효능있고 생물학적으로 활성인 변이체이다. 본 발명의 FGF21 변이체는 효능을 향상시킬뿐만 아니라, 다른 아미노산 변화와도 상용성이고 그에 따라 그들은 향상된 안정성 특징 및 증가된 생체내 안정성을 제공하는 아미노산 치환을 함유한다. 효능을 향상시키는 본 발명의 FGF21 변이체에서의 아미노산 치환은 D127K, S167R 및 G174L을 포함한다 (실시예 2 참조).
인간 야생형 FGF21의 농축 변이체 용액을 m-크레졸과 같은 제약 보존제에 노출시키는 것은 변이체의 응집체 형성 성향을 증가시킨다. 추가적인 디술피드 결합의 도입을 통한 구조적 안정화는 인간 야생형 FGF21의 열 안정성뿐만 아니라 보존제 상용성도 향상시킨다. 본 발명의 FGF21 변이체는 생물학적 활성의 훼손없이 열 안정성과 보존제 상용성을 대폭 향상시키는 아미노산 치환 A31C 및 G43C를 혼입한다. A31C/G43C 치환을 또한 포함하는 고효능 FGF21 변이체는 이전에 기재된 바 있다. 그들 보고된 변이체는 야생형 FGF21과 비교하여 현저히 향상된 보존제 상용성을 보이지만, 그들은 보존제의 존재하에서 여전히 응집하려는 경향이 있다. 이러한 변이체 응집은 면역원성의 위험을 증가시키고, 그에 따라 치료용 단백질로서의 변이체의 수용성(acceptability)을 감소시키게 된다.
놀랍게도, 본 발명의 바람직한 FGF21 변이체는 아미노산 치환 L98D 및 L100K를 포함하고, 이들은 고농도에서 현저히 더 낮은 고분자량 응집체 형성을 가져온다. 유리하게는, 아미노산 치환 L98D 및 L100K는 변이체의 효능을 감소시키지 않으며 유해한 응집 문제를 최소화한다.
본 발명의 FGF21 변이체의 제조를 위한 바람직한 시판 발현 시스템은 포유동물 CHO-K1 세포주이다. 그러나, 포유동물 세포주 CHO-K1 및 HEK293은 성숙 인간 야생형 FGF21에 위치 179에서 티로신 측쇄의 황산화를 통해 번역후 변형을 초래할 수 있다. 위치 179 및 180 (존재할 경우)에서의 티로신 잔기의 황산화는 효능을 감소시키며 생성물 불균질성의 바람직하지 않은 원천이다. 따라서, 위치 179 및/또는 180에 Tyr을 갖는 FGF21 변이체가 CHO-K1 또는 HEK293 세포주로부터 발현될 경우, 발현된 변이체의 어느 일부는 위치 179에서 황산화될 수 있고 다른 일부는 위치 180에서 황산화될 수 있으며, 한편으로는 다른 일부가 양쪽 위치 모두에서 황산화될 수 있고 어느 일부는 어느 위치에서도 황산화되지 않을 수 있다. 이는 감소된 효능을 갖는 불균질하고 예측할 수 없는 변이체 집단을 초래한다.
본 발명의 FGF21 변이체는 이러한 유해한 황산화를 해소한 아미노산 치환을 포함한다. 따라서, 아미노산 치환 Y179F가 변이체 중으로 혼입되었다. Y179F는 CHO-K1 및 HEK293 세포에서의 생산으로부터 생기는 황산화를 제거한다. 더욱이, 아미노산 치환 Y179F는 본 발명의 다른 호적한 아미노산 치환과 상용성이고, 효능에 관해서는 중성 변화인 것으로 측정된다.
인간 야생형 FGF21은 생체내에서의 단백질분해에 취약하다. 야생형 FGF21로 마우스 또는 시노몰구스 원숭이의 정맥내 또는 피하 주사 후 혈청으로부터 회수한 주요 단백질분해 단편은 위치 171에서 종결되는 단편이다. 잔기 1 내지 171번을 스패닝하는 FGF21 단편은 시험관내 효능 검정에서 약 100배 효능이 덜한 것으로 측정되었다. 당해 단백질분해 절단부위의 제거는 활성 약물에의 노출을 증가시킴으로써 약효를 향상시킬 수 있다. 아미노산 치환 G170E는 마우스에서 절단을 현저히 둔화시키고 시노몰구스 원숭이에서 24시간 후 측정시 171 위치에서의 단백질분해를 실질적으로 제거시키는 것으로 나타났다. G170E 치환은 효능에 영향을 미치지 않으며 목적하는 물리화학적 안정성 프로파일과 상용성이다. 따라서, 아미노산 치환 G170E는 본 발명의 FGF21 변이체 중으로 혼입된다.
인간 야생형 FGF21은 CHO-K1 제조에서 생산된 카르복시펩티다제에 또한 취약하고, 아미노산 치환 A180E 및 위치 181에서의 아미노산 결실은 이러한 프로세싱을 감속시키고, 그에 따라 발현된 변이체의 길이의 불균질성 (즉, 세포주에 의해 발현된 성숙 변이체에서 아미노산 잔기의 수에 있어서 불균질성)을 감소시키게 된다. 비록 아미노산 치환 A180E 및 위치 181에서의 아미노산 결실이 포유동물 세포 발현에서 C-말단 단백질분해를 제거하지는 않지만, 본 발명의 FGF21 변이체에서 발견된 다른 목적하는 아미노산 치환에 관련해서 효능을 유지하면서 단백질분해의 감속에 상당히 효과적이다. 이 유리한 특징의 견지에서, 아미노산 치환 A180E 및 위치 181에서의 아미노산 결실은 본 발명의 바람직한 FGF21 변이체 중으로 혼입된다.
본 발명은 RNA 형태로 또는 DNA 형태로 존재할 수 있는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 또한 포함하며, DNA는 cDNA 및 합성 DNA를 포함한다. DNA는 이중가닥 또는 단일가닥일 수 있다. 본 발명의 변이체를 코딩하는 코딩 서열은 유전 코드의 중복성 또는 축퇴성의 결과로서 다양할 수 있다.
본 발명의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 다음을 포함할 수 있다: 오직 변이체에 대한 코딩 서열만, 변이체에 대한 코딩 서열과 추가적인 코딩 서열, 예컨대 리더 또는 분비 서열 또는 전구변이체 서열; 변이체에 대한 코딩 서열과 비-코딩 서열, 예컨대 변이체에 대한 코딩 서열의 인트론 또는 비-코딩 서열 5' 및/또는 3'. 따라서 용어 "변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드"는 변이체에 대한 코딩 서열뿐만 아니라 추가적인 코딩 및/또는 비-코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드도 포함할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 그 서열을 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결시킨 후 숙주 세포에서 발현될 것이다. 발현 벡터는 전형적으로 숙주 유기체에서 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 일체 부분으로서 복제가능하다. 통상적으로, 발현 벡터는 목적 DNA 서열로 형질전환된 그들 세포의 검출을 허용하도록 선별마커, 예를 들어 테트라시클린, 네오마이신 및 디히드로폴레이트 리덕타제를 함유할 것이다.
본 발명의 FGF21 변이체는 포유동물 세포, 예컨대 CHO, NS0, HEK293 또는 COS 세포에서; 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescence)에서; 또는 진균 또는 효모 세포에서 쉽사리 생산될 수 있다. 숙주 세포는 당업계 주지의 기술을 이용하여 배양된다. 바람직한 포유동물 숙주 세포는 글루타민 신테타제 (GS) 발현 시스템을 함유하는 CHOK1SV 세포주이다 (US 5,122,464 참조).
관심 폴리뉴클레오티드 서열 (예를 들어, FGF21의 변이체 및 발현 제어 서열)을 함유하는 벡터는 세포 숙주의 타입에 따라 변하게 되는 주지의 방법에 의하여 숙주 세포 중으로 전달될 수 있다. 예를 들어, 염화칼슘 형질전환은 원핵 세포에 대하여 통상적으로 이용되며, 반면에 인산칼슘 처리 또는 전기천공법은 기타 세포 숙주에 대하여 사용될 수 있다.
다양한 단백질 정제 방법이 이용될 수 있고 그러한 방법은 당업계에 알려져 있으며 예를 들어 문헌 [Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-89 (1990)] 및 문헌 [Scopes, Protein Purification : Principles and Practice, 3rd Edition, Springer, NY (1994)]에 기재되어 있다.
본 발명의 FGF21 변이체의 제약 조성물은 제2형 당뇨병, 비만, 이상지혈증 및/또는 대사 증후군을 치료하기 위한 일반적으로 의도되는 목적을 달성하는 당업계에 알려져 있는 임의의 수단에 의하여 투여될 수 있다. 투여의 바람직한 경로는 비-경구이다. 투여되는 투여량은 수용자의 연령, 건강과 체중, 병행 치료의 종류 (존재할 경우), 치료 빈도, 및 목적하는 효과의 본질에 좌우될 것이다. 전형적인 투여량 수준은 표준 임상 기술을 이용하여 최적화될 수 있고 투여 방식과 환자의 상태에 좌우될 것이며 당업자에 의하여 결정될 수 있다.
본 발명의 FGF21 변이체는 제약상 유용한 조성물 제조를 위하여 공지의 방법에 따라 제제화된다. 목적 제제는 적당한 희석제로 또는 임의적인 제약상 허용되는 담체, 보존제, 부형제 또는 안정화제를 함유하는 고순도의 수용액으로 재구성되는 안정한 동결건조 제품이다 (문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995]).
본 발명의 FGF21 변이체는 제약상 허용되는 완충제, 및 허용가능한 안정성 및 투여에 허용가능한 pH를 제공하도록 조정된 pH로 제제화될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 FGF21 조성물은 바이알, 카트리지, 펜 전달 장치, 주사기, 정맥내 투여관 또는 정맥내 투여백과 같은 용기 중으로 넣어질 수 있다.
용어 "이상지혈증"은 지단백질 과생산 또는 결핍을 비롯하여 지단백질 대사의 장애를 의미한다. 이상지혈증은 총 콜레스테롤, 저밀도 지단백질 (LDL) 콜레스테롤 및 트리글리세리드 농도의 상승, 및/또는 혈중 고밀도 지단백질 (HDL) 콜레스테롤 농도의 감소에 의하여 징후가 나타날 수 있다.
용어 "대사 증후군"은 1인에서의 대사 위험 인자의 군을 특징으로 한다. 그들은 다음의 것들을 포함한다: 복부 지방 - 대부분의 남성에서 허리 40인치 이상; 고혈당 - 절식후 적어도 110 밀리그램/데시리터(mg/dl); 고 트리글리세리드 - 혈류중 적어도 150 mg/dl; 저 HDL - 40 mg/dl 미만; 및/또는 130/85 또는 그보다 높은 혈압.
용어 "비만"은 야윈 체중에 비례하여 과량의 피하 지방이 존재하는 상태로서 정의된다 (문헌 [Stedman's Medical Dictionary 28th edition, 2006, Lippincott Williams & Wilkins]).
"환자"는 포유동물, 바람직하게는 인간이다.
용어 "치료하는" (또는 "치료하다" 또는 "치료")는 기존 증상, 장애, 상태 또는 질환의 진행 또는 중증도를 둔화, 감소 또는 역전시키는 것을 의미한다.
용어 "치료 유효량"은 환자에로의 단일 또는 다중 용량 투여시 목적하는 치료를 제공하는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명 변이체의 양 또는 용량을 언급한다.
용어 "제2형 당뇨병"은 인슐린의 이용가능성에도 불구하고 과잉 글루코스 생산을 특징으로 하며, 순환 글루코스 수준은 불충분한 글루코스 클리어런스의 결과로서 과도하게 높은 상태로 잔류한다.
본 발명은 하기 실시예를 참조함으로써 실시될 수 있다. 그러나, 이는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 해석되지 않아야 한다.
실시예
1
CHOK1SV
세포에서의
FGF21
변이체
발현
본 발명의 FGF21 변이체를 CHOK1SV 세포를 사용하여 포유동물 세포 발현 시스템에서 생산하였다. FGF21 변이체를 코딩하는 유전자를 글루타민 신테타제 (GS)-함유 발현 플라스미드 백본 (pEE12.4-기재 플라스미드) 중으로 서브클로닝하였다. FGF21 변이체를 코딩하는 cDNA 서열을 바람직한 신호 펩티드 서열의 코딩 서열과 프레임을 맞추어(in frame) 융합시켜 조직 배양 배지 중으로의 목적 생성물 분비를 증진시켰다. 바람직한 신호 펩티드 서열은 아미노산 서열 서열 3, 서열 4, 서열 5 또는 서열 6으로 나타낸 바와 같은 폴리펩티드이었다.
발현은 바이러스 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터에 의하여 구동되었다. CHOK1SV 세포를 전기천공법과 적당량의 재조합 발현 플라스미드를 사용하여 안정하게 형질감염시키고, 형질감염된 세포를 현탁 배양으로 적당한 세포 밀도로 유지시켰다. 형질감염된 세포의 선별은 메티오닌 술폭시민 (MSX)-함유 무혈청 배지에서의 성장에 의하여 달성하였고 35 내지 37℃와 5 내지 7% CO2에서 인큐베이션하였다.
클론-유래 세포주를 유동 세포 측정기의 사용에 의하여 계측 및 측정하였다. 포유동물 세포에서의 FGF21 변이체 발현은 일반적으로, 서열 1의 아미노산 서열로 나타낸 FGF21 변이체와 같은, 즉 N-말단에 메티오닌 잔기가 없는 천연 N-말단 서열 HPIP를 산출한다.
청정화된 세포 배양 배지를 2시간까지 동안 50 내지 60℃로 가열, 냉각, 바이러스 불활성화를 위하여 세제 (트리톤 X-100)로 처리, 및 Capto MMC (지이 헬스케어, GE Healthcare) 혼합 모드 크로마토그래피 칼럼에 적용하는 과정에 의하여 CHO 세포로부터 배지 중으로 분비된 FGF21 변이체를 정제하였다. FGF 변이체를 pH 8 완충제를 사용하여 칼럼으로부터 용리시키고, 결과로서 일어나는 생성물 풀을 바이러스 불활성화를 위하여 50 mM 시트르산, 150 mM NaCl 용액으로 1시간 동안 3.2 내지 3.5의 pH 범위로 조정하였다. 용액을 트리스 완충제의 첨가에 의하여 pH 6.7 내지 7.3으로 조정하고 FGF 변이체를 페닐 세파로스(Phenyl Sepharose) 고성능 수지 (지이 헬스케어)를 사용하여 소수성 교환 크로마토그래피에 의하여 추가 정제하였다. 소수성 상호작용 칼럼을 pH 7에서의 황산나트륨의 감소하는 구배로 용리시켰다. HIC-정제 FGF 변이체를 NaCl을 함유하는 pH 8의 트리스 완충제 중으로 완충제 교환하고 소스(Source) 30Q 수지 (지이 헬스케어) 상에서 음이온 교환 크로마토그래피에 의하여 추가 정제하였다. 음이온 교환 칼럼을 pH 8에서의 염화나트륨의 증가하는 농도로 용리시켰다. 정제된 FGF 변이체를 플라노바(Planova) 20N (아사히 카세이 메디컬, Asahi Kasei Medical) 바이러스 체류 필터에 통과시키고 뒤이어 재생 셀룰로스막 (밀리포어, Millipore) 상에서 접선 유동 한외여과를 이용하여 10 mM 시트레이트, 150 mM NaCl pH 7 중으로 농축/투석 여과를 행하였다.
실시예
2
3
T3
-
L1
-β
Klotho
섬유모세포
글루코스
흡수 검정
야생형 마우스 βKlotho의 코딩 서열 및 블라스티시딘 내성 마커를 함유하는 CMV-구동 포유동물 발현 벡터의 레트로바이러스 형질도입에 의하여 3T3-L1 섬유모세포로부터 3T3-L1-βKlotho 섬유모세포를 생성하였다. 블라스티시딘-내성 세포를 15 μM 블라스티시딘의 존재하에서 14일 동안 성장 후 선별하였고, βKlotho 변이체 발현은 항-βKlotho 항체로의 이뮤노블롯에 의하여 검증하였다. 3T3-L1-βKlotho 섬유모세포를 실험 용도로 플레이팅시까지 10% 송아지 혈청 및 15 μM 블라스티시딘을 함유한 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)에서 유지시켰다.
글루코스 흡수를 위하여, 3T3-L1-βKlotho 섬유모세포를 96-웰 플레이트에 20,000 세포/웰로 플레이팅하고 10% 송아지 혈청을 함유한 DMEM에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 0.1% 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하고 관심 FGF21 변이체가 들어있거나 들어있지 않은 DMEM에서 3시간 동안 인큐베이션하고, 뒤이어 100 μM 2-데옥시-D-(14C) 글루코스를 함유하고 FGF21 변이체가 들어있거나 들어있지 않은 크렙스-링거 포스페이트 (KRP) 완충제 (15 mM Hepes, pH 7.4, 118 mM NaCl, 4.8 mM KCl, 1.2 mM MgSO4, 1.3 mM CaCl2, 1.2 mM KH2PO4, 0.1% BSA)에서 1시간 인큐베이션을 행하였다. 비-특이적 결합은 1 mM 2-데옥시-D-(14C) 글루코스를 함유하는 크렙스-링거 비카르보네이트/Hepes (KRBH) 완충제에서 선별 웰의 인큐베이션에 의하여 측정되었다. 반응은 세포에 20 μM 시토칼라신 B를 첨가하여 종료하였고 글루코스 흡수는 액체 섬광 계수기를 사용하여 측정하였다.
3T3-L1-βKlotho 섬유모세포 글루코스 흡수 검정에서 서열 1의 FGF21 변이체의 시험관내 효능 (EC50)은 0.051 nM이었다.
실시예
3
물리적 안정성
FGF21
변이체의
물리적 안정성을 다음과 같이 측정하였다.
변이체를
1 내지 2
mg
/
mL
로 150
mM
NaCl
의 존재 또는 부재하에 10
mM
히스티딘
pH
7에서 투석 및 제조하고
SEC
로 분석하여 %
HMW
를 측정하였다 (표 1: "초기").
SEC 분리법은 30 cm x 0.78 cm의 치수를 갖는 5 마이크로미터 칼럼인 토소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience) 3000SWXL상에서 수행하였다. 이동상은 0.5 mL/분의 유량으로 0.01 M 시트레이트, 150 mM NaCl, pH 7이었다. 초기 저농도 샘플은 10 mcL 주입으로서 적용하고 214 nm의 흡수 파장에서 모니터링하였으며, 반면에 30 mg/mL 샘플은 1 mcL 주입으로서 적용하고 280 nm에서 모니터링하였다.
다음으로, 변이체를 30 mg/mL으로 농축하고 재차 분석하였다 (t=0). 서열 7의 FGF21 변이체에 대한 %HMW는 염의 존재하에 히스티딘 완충제에서 농축시 0.15%에서 0.9%로 증가하였다. 서열 1의 FGF21 변이체에 대한 %HMW는 염의 존재하에 히스티딘 완충제에서 농축시 0.15%에서 0.7%로 증가하였다. 염의 부재하에서 서열 7의 FGF21 변이체에 대한 %HMW는 농축시 0.2%에서 3.2%로 증가하였고 서열 1의 FGF21 변이체에 대해서는 0.13%에서 1.0%로 증가하였다. 따라서, 변이체를 150 mM NaCl의 존재하에 30 mg/mL로 제제화하였을 때 서열 7의 FGF21 변이체 및 서열 1의 FGF21 변이체 양쪽 모두 보다 낮은 초기 %HMW 및 보다 낮은 %HMW를 가졌다. 이들 데이터는 서열 1의 FGF21 변이체에는 존재하지만 서열 7의 FGF21 변이체에는 존재하지 않는 L100K 돌연변이의 중요성을 증명해 보여준다.
30 mg/mL 제제를 4주 동안 4℃, 25℃ 및 40℃에서 인큐베이션하여 스트레스 조건하에서의 장기 안정성을 평가하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이, %HMW를 4주차 (t=4주)에서 재차 측정하였다. 서열 7의 FGF21 변이체에 대한 %HMW는 염의 부재하에 40℃에서 3.2%에서 6.6%로 증가하였다. 서열 1의 FGF21 변이체에 대한 %HMW는 40℃에서 1%에서 5.3%로 증가하였다. 서열 7의 FGF21 변이체에 대한 %HMW는 염의 존재하에 40℃에서 0.9%에서 2.3%로 증가하였고 서열 1의 FGF21 변이체에 대해서는 0.7%에서 1.7%로 증가하였다. 25℃에서 4주 후, %HMW의 수준은 서열 1의 FGF21 변이체에 대해서는 불과 1.1%이었고, 반면에 그들은 염의 부재하에서 서열 7의 FGF21 변이체에 대하여 2.9%이었다. 이들 데이터는 서열 1의 FGF21 변이체에 존재하는 L100K 돌연변이 포함의 유익한 영향을 증명해 보여준다.
실시예
4
R175
및
E180
발현
불균질성
일관되고 잘 특징규명된 생성물을 보다 잘 보장해주므로 균질 변이체 생성물의 생산이 바람직하다. 생성물 불균질성을 평가하기 위하여, 샘플의 10 ㎕ 분취량을 90 ㎕의 DPBS와 혼합하였다. 샘플을 하기 조건을 이용하여 액체 크로마토그래피-질량 분광측정 (LC-MS)에 의하여 분석하였다: 이동상 A는 0.05% TFA이고, 이동상 B는 아세토니트릴중 0.04% TFA이고, 칼럼은 PLRPS 2.1 X 50 mm 칼럼이며, 주입량은 15 ㎕이다.
워터스 마이크로매스 엘시티 프레미어(Waters Micromass LCT Premier)TM 질량 분광계를 400 내지 1990 amu의 질량 범위, 극성 ES+, 캐필러리 3000, 샘플 콘 40V로 셋업하였고, 개구부(aperture) 1은 25V, 공급원 온도는 105℃, 콘 가스 유량은 50 L/시간, 탈용매화 온도는 150℃, 및 탈용매화 가스 유량은 600 L/시간이었다.
표 3은 LC/MS 방법으로 측정한 각각의 FGF21 변이체에서의 생성되는 불균질성을 보고한다. 생성물 1-181은 서열 7의 전장 FGF21 변이체를 나타낸다. 서열 7의 FGF21 변이체는 C-말단 절단, 특히 위치 181에서의 아미노산 잔기 글리신의 제거에 취약하다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 서열 7의 FGF21 변이체에 대한 정제 생성물의 33.7%가 의도되는 전장 1-181이었고; 1-180 단편은 정제 생성물의 가장 많은 부분을 차지하였다. 추가로, 소량의 생성물 1-179가 또한 검출되었다.
서열 1의 FGF21 변이체는 유전자 구축물에서 181에서의 아미노산 잔기를 결실시키고 아미노산 잔기 180은 글루탐산 (E)으로 치환시켰다. 이들 변화는 CHO 발현 동안 C-말단을 분해로부터 보호하고, 그에 따라 100% 균질하고 정제된 1-180 생성물이 생성된다.
실시예
5
ob
/
ob
마우스 모델에서의
글루코스
저하
수컷 ob/ob 마우스와 생후주령-매칭(age-matched) ob/m (야윈) 대조군은 도착시 7주령이었고 처리 개시시에는 8 내지 9주령이었다. 도착시, 모든 마우스는 단독으로 수용하여 처리의 개시전에 1 내지 2주 동안 순응하도록 하였다. 마우스에게는 퓨리나 로던트 차우(Purina Rodent Chow) 5015를 급식하였고 자동 급수장치로부터 가정용수를 무제한으로 제공하였다. 마우스를 12시간 명/암 사이클하에 75℉로 세팅한 주위 온도로 수용하였다. 처리의 개시 1 내지 2일 전에, 혈액 샘플을 꼬리 출혈을 통해 수집하였다. 애쿠-체크 애비비아(Accu-Check Avivia) 혈당계 (로슈, Roche)를 사용하여 혈당 수준을 측정하고 메소 스케일(Meso Scale) 마우스/래트 인슐린 검정 키트를 사용하는 인슐린의 검정을 위하여 혈청 샘플을 수집하였다. 처리 개시 당일 (0일차)에, 마우스를 처리전 체중, 혈당, 및 혈청 인슐린에 기초하여 군별로 분류하였다 (BRAT 분류 소프트웨어). 0일차 및 3일차에, 마우스에 10 mL/kg의 부피로 서열 5의 FGF21 변이체를 0.1 내지 30 nmol/kg으로 SQ 투여하였다. 투여 비히클은 0.03% 마우스 혈청 알부민 (MSA; 시그마 A3139)을 함유하는 멸균 PBS (하이클론(HyClone) DPBS/변형 칼슘-마그네슘)이었다. 혈당은 7일 동안 매일 측정하였고 AUC가 측정되었다. 글루코스 저하에 대한 ED50 계산은 AUC에 기초하였다. 간 균질화물을 참수시에 수집하고 간 트리글리세리드를 히타치 모듈라(Hitachi Modular) P 임상 분석기상에서 측정하였다.
14일차에, 비히클-처리 마우스는 348±19.5 mg/dl (평균±SEM)로 측정된 평균 혈당 수준으로 고혈당성이었고, 반면에 ob/m 야윈 대조군 마우스는 165±3.2 mg/dl (평균±SEM)의 혈당 수준을 가졌다. 서열 1의 FGF21 변이체는 혈당을 ob/m 야윈 대조군에 필적하는 수준으로 저하시켰다. 서열 1의 FGF21 변이체의 ED50은 1.296 nmol/kg이었다 (95% 신뢰구간 = -0.07 - 0.30).
서열
서열 1 -
FGF21
변이체
서열 2 - 야생형
FGF21
(호모 사피엔스)
서열 3 - 인간
트랜스페린
(
hTrf
) 신호 펩티드
서열 4 - 인간
섬유모세포
성장 인자 결합 단백질-1 (
hFGFP
-1) 신호 펩티드
서열 5 -
소 리소자임
신호 펩티드
서열 6 -
뮤린
경쇄
(
mkappa
) 신호 펩티드
서열 7 -
FGF21
변이체
서열 8 - (
DNA
)
FGF21
변이체
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<110> Eli Lilly and Company
<120> FIBROBLAST GROWTH FACTOR 21 VARIANTS
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<211> 180
<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> synthetic construct
<400> 1
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Cys His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Cys Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Asp Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asp Lys Ser Pro His Arg Lys Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Arg Leu Val Glu Pro Ser Gln Leu Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Phe Glu
180
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<212> PRT
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His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
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Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
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<223> synthetic construct
<400> 3
Met Arg Leu Ala Val Gly Ala Leu Leu Val Cys Ala Val Leu Gly Leu
1 5 10 15
Cys Leu Ala
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<213> ARTIFICIAL
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<223> synthetic construct
<400> 4
Met Lys Ile Cys Ser Leu Thr Leu Leu Ser Phe Leu Leu Leu Ala Ala
1 5 10 15
Gln Val Leu Leu Val Glu Gly
20
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<220>
<223> synthetic construct
<400> 5
Met Lys Ala Leu Val Ile Leu Gly Phe Leu Phe Leu Ser Val Ala Val
1 5 10 15
Gln Gly
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<220>
<223> synthetic construct
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Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly
20
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<212> PRT
<213> ARTIFICIAL
<220>
<223> synthetic construct
<400> 7
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Cys His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Cys Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Asp Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asp Lys Ser Pro His Arg Lys Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Arg Leu Val Glu Pro Ser Gln Leu Leu Ser
165 170 175
Pro Ser Phe Leu Gly
180
<210> 8
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic construct
<400> 8
caccccatcc ctgactccag tcctctcctg caattcgggg gccaagtccg gcagcggtac 60
ctgtacaccg acgacgccca gcagaccgag tgccacctgg aaatccggga ggacggcacc 120
gtgggctgtg ccgccgacca gtcccctgag tccctgctgc agctgaaggc cctgaagcct 180
ggcgtgatcc agatcctggg cgtgaaaacc tcccggttcc tgtgccagag gcctgatggc 240
gccctgtacg gctccctgca cttcgaccct gaggcctgct ccttccggga ggacctgaag 300
gaagatggct acaacgtgta ccagtccgag gctcacggcc tgcctctgca tctgcctggc 360
gacaagtccc cccaccggaa gcctgctcct aggggccctg ccagattcct gccactgcct 420
ggcctgcctc cagctctgcc tgagcctcct ggcatcctgg cccctcagcc tccagacgtg 480
ggctcctccg accctctgcg gctggtcgag ccttcccagc tgcggagccc tagcttcgag 540
Claims (5)
- 아미노산 서열이
인 섬유모세포 성장 인자 21 (FGF21) 변이체.
- 제1항의 변이체 및 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
- 제1항의 변이체를 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 제2형 당뇨병, 비만, 이상지혈증 및/또는 대사 증후군을 치료하는 방법.
- 제1항에 있어서, 요법에 사용하기 위한 변이체.
- 제1항에 있어서, 제2형 당뇨병, 비만, 이상지혈증 및/또는 대사 증후군의 치료에 사용하기 위한 변이체.
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