JP2015521596A - 線維芽細胞増殖因子２１変異体 - Google Patents

Abstract

本発明は、薬理学的に効力があり安定性のヒト線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）変異体、ＦＧＦ２１変異体を含む医薬組成物、およびそのような変異体を使用して２型糖尿病、肥満症、脂質異常症および／またはメタボリックシンドロームを治療する方法に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）変異体、ＦＧＦ２１変異体を含む医薬組成物および２型糖尿病、肥満症、脂質異常症および／またはメタボリックシンドロームを治療する方法に関する。

ＦＧＦ２１は、グルコースおよび脂質ホメオスタシスの重要な代謝調節剤として機能するホルモンである。ＦＧＦ２１は、インスリンの機序とは異なる機序であるＧＬＵＴ１発現をアップレギュレートすることにより脂肪細胞内へのグルコース取込みを促進する。糖尿病性齧歯類およびサルでは、ヒトＦＧＦ２１は空腹時血清グルコース濃度を低下させ、トリグリセリド、インスリンおよびグルカゴンの空腹時血清濃度を減少させた。さらに、食餌性肥満の齧歯類モデルでは、ＦＧＦ２１の投与は用量依存法で累積的体重減少を引き起こした。そこでＦＧＦ２１には、糖尿病、肥満症、脂質異常症およびメタボリックシンドロームの治療における潜在的有用性がある。

ヒトＦＧＦ２１の変異体は、国際公開第２０１０／０８４１６９号、国際公開第２０１０／０６５４３９号、国際公開第２００６／０２８５９５号および国際公開第２００５／０６１７１２号に記載されている。

ヒト野生型ＦＧＦ２１および公知のＦＧＦ２１変異体に関連する問題は、分子の効力および／または医薬的安定性が低いことである。そこで、効力が高いおよび／または安定性である代替ＦＧＦ２１タンパク質に対する必要が依然としてある。

本発明は、代替ＦＧＦ２１変異体を提供する。本発明の所定のＦＧＦ２１変異体は、ヒト野生型ＦＧＦ２１および当分野において開示されている公知のＦＧＦ２１変異体に比した利点を有する。これらの利点には、延長された半減期、改良された効力および／または改良された医薬的安定性を有することが含まれる。改良された効力に加えて、本発明の所定のＦＧＦ２１変異体は、インビボでのタンパク質分解の低下、酸化に対する感受性の減少、高濃度で凝集する傾向の低下、哺乳動物細胞系における産生中の翻訳後修飾およびタンパク質分解のレベルの低下、および／または改良された化学的安定性を含む、効率的製造および／または治療用タンパク質としての製剤にとって有用である１つ以上の有益な安定性特性を有する。さらに、本発明のＦＧＦ２１変異体は、２型糖尿病、肥満症、脂質異常症および／またはメタボリックシンドロームを治療するために潜在的に有用である。

本発明は、アミノ酸配列が
ＨＰＩＰＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＲＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＣＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＣＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＤＬＫＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＬＰＧＤＫＳＰＨＲＫＰＡＰＲＧＰＡＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＲＬＶＥＰＳＱＬＲＳＰＳＦＥ（配列番号１）であるＦＧＦ２１変異体を提供する。

本発明は、本発明のＦＧＦ２１変異体と、少なくとも１つの医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物をさらに提供する。

本発明は、患者において２型糖尿病、肥満症、脂質異常症および／またはメタボリックシンドロームを治療する方法であって、該患者に本発明のＦＧＦ２１変異体を投与することを含む方法をさらに提供する。

本発明は、患者において２型糖尿病、肥満症、脂質異常症および／またはメタボリックシンドロームを治療する方法であって、該患者に本発明の医薬組成物を投与することを含む方法をさらに提供する。

さらに、本発明は、療法に使用するための本発明のＦＧＦ２１変異体を提供する。
好ましくは、本発明は、２型糖尿病、肥満症、脂質異常症および／またはメタボリックシンドロームの治療に使用するための本発明のＦＧＦ２１変異体を提供する。

さ らに、本発明は、２型糖尿病、肥満症、脂質異常症および／またはメタボリックシンドロームを治療するための医薬品の製造における本発明のＦＧＦ２１変異体の使用を提供する。

全長ヒト野生型ＦＧＦ２１は、２７アミノ酸シグナルペプチドを含有する２０８アミノ酸ポリペプチドである。成熟ヒト野生型ＦＧＦ２１は、１８１アミノ酸ポリペプチド（配列番号２）を生じさせる、２７アミノ酸シグナルペプチドを含まない全長ポリペプチドを含んでいる。本発明のＦＧＦ２１変異体のアミノ酸位置における変化は、ＩｇＧ４ Ｆｃ部分およびリンカーを含まない、成熟ヒト野生型ＦＧＦ２１（配列番号２）のポリペプチド内のアミノ酸位置から決定される。そこで本明細書で「Ａ３１Ｃ」と記載する置換は、成熟ヒト野生型ＦＧＦ２１変異体の３１位での野生型アミノ酸Ａｌａとのアミノ酸Ｃｙｓの置換を意味する。

特定変異体内の１つのアミノ酸残基の置換は該変異体全体の特性に影響を及ぼす可能性があること、および全体的作用は薬理学的効力および／または医薬的安定性にとって有益または有害な可能性があることに留意することが重要である。例えば、１つのアミノ酸置換Ｐ１１５ＷはＦＧＦ２１変異体の効力を増加させる；しかし、Ｐ１１５Ｗはさらに、凝集を誘発する自己会合の原因になると考えられている。このため、この全体的作用は該変異体にとって有害であるので、置換Ｐ１１５Ｗは本発明のＦＧＦ２１変異体内には含まれない。また別の実施例は、ＦＧＦ２１変異体の効力を増加させるアミノ酸置換Ｒ１７５Ｌに関する。しかし、Ｒ１７５Ｌ置換を有するＦＧＦ２１変異体はタンパク質分解に感受性であることが見いだされたので、このためこの全体的作用は有害であった。

本発明のＦＧＦ２１変異体を用いて観察されるＣ末端タンパク質分解に対応するために、１８０位および１８１位のアミノ酸（１８０位のＬおよび１８１位のＧ）は、１８０位でアミノ酸Ｅと置換し、１８１位のアミノ酸は欠失させる。これらの修飾は、Ｃ末端タンパク質分解を実質的に減少させるが、それだけではなくヒト２９３細胞−βＫｌｏｔｈｏ−ＳＲＥ ｌｕｃアッセイにおいて測定するとＦＧＦ２１変異体の薬理学的効力を２５分の１に低下させる。驚くべきことに、１７５位のアミノ酸残基（Ｒ１７５Ｌ）を野生型Ｒに復帰させることにより効力が回復される。このため、この置換の全体的作用は該変異体にとって有害であるので、置換Ｒ１７５Ｌは本発明の好ましいＦＧＦ２１変異体内には含まれない。

本発明の所定のＦＧＦ２１変異体は、実施例２において配列番号１について証明したように強力な生物活性変異体である。本発明の好ましいＦＧＦ２１変異体は、効力を一緒に改良するだけではなく、順に改良された安定性特性および増加したインビボ安定性を提供できる他のアミノ酸変化と適合性であるアミノ酸置換を含有している。効力を改良する本発明の好ましいＦＧＦ２１変異体におけるアミノ酸置換には、Ｄ１２７Ｋ、Ｓ１６７ＲおよびＧ１７４Ｌが含まれる（実施例２を参照）。

医薬保存剤、例えばｍ−クレゾールへのヒト野生型ＦＧＦ２１の濃縮変異体溶液の曝露は、本変異体が凝集体を形成する傾向を増加させる。追加のジスルフィド結合の導入を通しての構造的安定化は、ヒト野生型ＦＧＦ２１の保存適合性ならびに熱安定性を改良する。本発明のＦＧＦ２１変異体は、生物活性を危険に曝すことなく熱安定性および保存適合性を大きく改良するアミノ酸置換Ａ３１ＣおよびＧ４３Ｃを組み込んでいる。Ａ３１Ｃ／Ｇ４３Ｃ置換もまたさらに含む高効力ＦＧＦ２１変異体については以前に記載されている。それらの報告された変異体は、野生型ＦＧＦ２１に比較して有意に改良された保存適合性を提示するが、それらは依然として保存剤の存在下で凝集する傾向がある。この変異体凝集は、免疫原性のリスクを増加させ、それにより該変異体の治療用タンパク質としての受容性を減少させる。

驚くべきことに、本発明の好ましいＦＧＦ２１変異体には、高濃度で生じさせる高分子量凝集体形成が有意に低いアミノ酸置換Ｌ９８ＤおよびＬ１００Ｋが含まれる。有益にも、アミノ酸置換Ｌ９８ＤおよびＬ１００Ｋは、該変異体の効力を減少させず、有害な凝集問題を最小限に抑える。

本発明のＦＧＦ２１変異体を製造するために好ましい市販の発現系は、哺乳動物ＣＨＯ−Ｋ１細胞系である。しかし哺乳動物細胞系ＣＨＯ−Ｋ１およびＨＥＫ２９３は、１７９位でのチロシン側鎖の硫酸化を通して成熟ヒト野生型ＦＧＦ２１への翻訳後修飾を誘発する可能性がある。１７９位および（存在する場合は）１８０位でのチロシン残基の硫酸化は、効力を減少させるので、産物不均質性の望ましくない原因である。そこで、１７９位および／または１８０位でＴｙｒを有するＦＧＦ２１変異体がＣＨＯ−Ｋ１もしくはＨＥＫ２９３細胞系から発現すると、一部の割合の発現した変異体は１７９位で硫酸化され、その他は１８０位で硫酸化される可能性があるが、他方その他は両方の位置で硫酸化され、一部はいずれの位置でも硫酸化されない場合がある。これは、効力が低下している、不均質で予測できない変異体集団をもたらす。

本発明の好ましいＦＧＦ２１変異体には、この有害な硫酸化を解決したアミノ酸置換が含まれる。そこで、該変異体内にはアミノ酸置換Ｙ１７９Ｆが組み込まれている。Ｙ１７９Ｆは、ＣＨＯ−Ｋ１およびＨＥＫ２９３細胞中での産生の結果として生じる硫酸化を排除する。さらに、アミノ酸置換Ｙ１７９Ｆは、本発明の他の好ましいアミノ酸置換と適合性であり、効力に関して中立の変化であると決定されている。

ヒト野生型ＦＧＦ２１は、インビボでのタンパク質分解に感受性である。マウスもしくはカニクイザルへの野生型ＦＧＦ２１の静脈内もしくは皮下注射後の血清から回収された大きなタンパク質分解フラグメントは、１７１位で終了するフラグメントである。残基１〜１７１に及ぶＦＧＦ２１フラグメントは、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）効力アッセイにおいて効力が約１００分の１であると決定されている。そこで、このタンパク質分解切断部位を排除すると、活性薬物への曝露を増加させることによって薬物有効性を改良できる。アミノ酸置換Ｇ１７０Ｅは、マウスにおいて切断を有意に緩徐化し、カニクイザルにおいて２４時間後に測定すると１７１位でのタンパク質分解を実質的に排除することが証明されている。Ｇ１７０Ｅ置換は効力に影響を及ぼさず、所望の物理化学的安定性プロファイルと適合性である。このため、アミノ酸置換Ｇ１７０Ｅは、本発明のＦＧＦ２１変異体内に組み込まれている。

ヒト野生型ＦＧＦ２１は、さらにＣＨＯ−Ｋ１の製造において産生するカルボキシペプチダーゼに感受性であり、アミノ酸置換Ａ１８０Ｅおよび１８１位でのアミノ酸欠失はこのプロセッシングを緩徐化し、これにより発現した変異体の長さの不均質性（つまり、該細胞系によって発現した成熟変異体内のアミノ酸残基数における不均質性）を減少させる。アミノ酸置換Ａ１８０Ｅおよび１８１位でのアミノ酸欠失は、哺乳動物細胞発現におけるＣ末端タンパク質分解を排除しないが、本発明のＦＧＦ２１変異体内で見いだされる他の所望のアミノ酸置換の状況における効力を維持しながらタンパク質分解を緩徐化することに極めて有効である。この有利な特性を考慮に入れて、アミノ酸置換Ａ１８０Ｅおよび１８１位でのアミノ酸欠失が本発明の好ましいＦＧＦ２１変異体内に組み込まれている。

本発明は、ＲＮＡの形態もしくはＤＮＡの形態にあってよい上述の変異体をコードするポリヌクレオチドをさらに含んでおり、該ＤＮＡはｃＤＮＡおよび合成ＤＮＡを含んでいる。該ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であってよい。本発明の変異体をコードするコーディング配列は、遺伝コードの冗長性または縮重の結果として変動する可能性がある。

本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドは、以下を含んでいてよい：該変異体に対するコーディング配列のみ、該変異体に対するコーディング配列および追加のコーディング配列、例えばリーダーもしくは分泌配列または前駆変異体配列；該変異体に対するコーディング配列および非コーディング配列、例えば該変異体に対するコーディング配列のイントロンもしくは非コーディング配列５’および／または３’末端。そこで、用語「変異体をコードするポリヌクレオチド」は、該変異体に対するコーディング配列だけではなく追加のコーディングおよび／または非コーディング配列もまた含むポリヌクレオチドを含んでいる。

本発明のポリヌクレオチドは、配列が発現制御配列に機能的に連結した後に宿主細胞中で発現することになる。発現ベクターは、典型的には宿主染色体ＤＮＡのエピソームもしくは一体部分のどちらかとして宿主生物内で複製可能である。一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を許容するために、選択マーカー、例えばテトラサイクリン、ネオマイシンおよびジヒドロ葉酸レダクターゼを含有する。

本発明のＦＧＦ２１変異体は、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ、ＮＳ０、ＨＥＫ２９３もしくはＣＯＳ細胞；細菌細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）もしくは蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）；または真菌もしくは酵母細胞中で容易に生成できる。宿主細胞は、当分野において周知の技術を使用して培養する。好ましい哺乳動物宿主細胞は、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）発現系を含有するＣＨＯＫ１ＳＶ細胞系である（米国特許第５１２２４６４号明細書を参照）。

当該のポリヌクレオチド配列（例、ＦＧＦ２１の変異体および発現制御配列）を含有するベクターは、細胞宿主のタイプに依存して変動する周知の方法によって、宿主細胞内に転位させることができる。例えば、原核細胞に対しては一般に塩化カルシウム形質転換法が利用されるが、他方他の細胞宿主に対してはリン酸カルシウム処理もしくはエレクトロポレーション法を使用できる。

変異体精製の様々な方法を使用でき、そのような方法は当分野において公知であり、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８２：８３−８９（１９９０）ａｎｄ Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ＮＹ（１９９４）に記載されている。

本発明のＦＧＦ２１変異体の医薬組成物は、２型糖尿病、肥満症、脂質異常症および／またはメタボリックシンドロームを治療するという一般に企図された目的を達成する当分野において公知の任意の手段によって投与することができる。好ましい投与経路は、非経口である。投与される用量は、レシピエントの年齢、健康状態および体重、存在する場合は併用療法の種類、治療頻度および所望の作用の性質に依存するであろう。典型的な用量レベルは、標準臨床技術を使用して最適化することができ、投与様式および患者の状態に依存するが、当業者であれば決定できる。

本発明のＦＧＦ２１変異体は、医薬上有用な組成物を製造するための公知の方法にしたがって調製される。所望の製剤は、適切な希釈剤または最適の医薬上許容される担体、保存剤、賦形剤もしくは安定化剤を含む高純度の水溶液を用いて再構成される安定性凍結乾燥産物である［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９９５］。

本発明のＦＧＦ２１変異体は、医薬上許容されるバッファー、ならびに許容できる安定性および投与のために許容されるｐＨを提供するために調整されたｐＨを用いて調製できる。さらに、本発明のＦＧＦ２１組成物は、例えばバイアル、カートリッジ、ペン型送達器具、シリンジ、静脈内投与用チュービングもしくは静脈内投与用バッグなどの容器内に配置できる。

用語「脂質異常症」は、リポタンパク質過剰産生もしくは欠損症を含むリポタンパク質代謝の障害を意味する。脂質異常症は、血液中の総コレステロール、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールおよびトリグリセリド濃度の上昇および／または高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール濃度の減少によって発現する可能性がある。

用語「メタボリックシンドローム」は、１人の人間における一群のメタボリックリスク因子を特徴とする。これらのリスク因子には、腹部脂肪−大多数の男性において、１０２ｃｍ（４０インチ）以上のウエスト；絶食後高血糖−少なくとも１１０ｍｇ／ｄｌ（ミリグラム／デシリットル）；高トリグリセリド−血流中で少なくとも１５０ｍｇ／ｄＬ；低ＨＤＬ−４０ｍｇ／ｄｌ未満；および／または１３０／８５以上の血圧が含まれる。

用語「肥満症」は、脂肪の少ない体に比して皮下脂肪が過剰な状態であると定義されている（Ｓｔｅｄｍａｎ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ２８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００６，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）。

「患者」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。

用語「治療すること」（または「治療する」もしくは「治療」）は、存在する症状、障害、状態または疾患の進行もしくは重症度を緩徐化する、減少させる、または反転させることを意味する。

用語「治療有効量」は、本明細書に記載したように、患者への単回もしくは複数回投与後に所望の治療を提供する、本発明の量もしくは用量を意味する。

用語「２型糖尿病」は、インスリンを利用できるにもかかわらず過剰なグルコース産生を特徴とし、循環中グルコース濃度は不十分なグルコースクリアランスの結果として過度に高いままである。

本発明は、以下の実施例を参照することによって実施できる。しかし、これは本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。実施例に記載および例示した本発明のＦＧＦ２１タンパク質は、哺乳動物細胞中で発現するので、このためホモダイマーである。

実施例１
ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞中でのＦＧＦ２１変異体の発現
本発明のＦＧＦ２１変異体は、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞を使用して哺乳動物細胞発現系中で産生させる。ＦＧＦ２１変異体をコードする遺伝子をグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）含有発現プラスミド骨格（ｐＥＥ１２．４をベースとするプラスミド）内にサブクローニングする。本発明のＦＧＦ２１変異体をコードするｃＤＮＡ配列は、組織培養培地中への所望の産物の分泌を強化するために好ましいシグナルペプチド配列のコーディング配列とインフレームで融合させる。好ましいシグナルペプチド配列は、アミノ酸配列の配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６に示したポリペプチドである。

発現は、ウイルス性サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって駆動される。ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞は、エレクトロポレーションおよび適切な量の組換え発現プラスミドを用いてトランスフェクトされ、トランスフェクト細胞は、適正な細胞密度で懸濁培養中で維持される。トランスフェクト細胞の選択は、メチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）含有無血清培地中での増殖によって実施し、３５〜３７℃および５〜７％のＣＯ_２中でインキュベートする。

クローンに由来する細胞系は、フローサイトメーターを使用して測定または決定する。哺乳動物細胞中でのＦＧＦ２１変異体の発現は、一般に天然Ｎ末端配列ＨＰＩＰ、つまりＮ末端にメチオニン残基を含まない、例えば配列番号１のアミノ酸配列によって示したＦＧＦ２１変異体を産生する。

ＣＨＯ細胞から培地中に分泌されたＦＧＦ２１変異体は、浄化細胞培養培地を５０〜６０℃へ２時間まで加熱し、冷却し、ウイルス不活性化のために洗浄剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を用いて処理する方法によって精製し、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）混合モードクロマトグラフィーカラムに適用する。ＦＧＦ変異体はｐＨ８のバッファーを使用してカラムから溶出し、その後の産物プールは５０ｍＭのクエン酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液を用いてウイルス不活性化のために１時間にわたり３．２〜３．５のｐＨ範囲へ調整する。この溶液はＴｒｉｓバッファーの添加によってｐＨ６．７〜７．３へ調整し、該ＦＧＦ変異体はフェニルセファロース高性能樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する疎水性交換クロマトグラフィーによってさらに精製する。疎水性相互作用カラムは、硫酸ナトリウム（ｐＨ７）の勾配を減少させながら溶出させる。ＨＩＣ精製ＦＧＦ変異体はＮａＣｌを含有するＴｒｉｓバッファー（ｐＨ８）内へバッファー交換し、Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｑ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）上でのアニオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製する。アニオン交換カラムは、塩化ナトリウム（ｐＨ８）の濃度を増加させながら溶出させる。精製ＦＧＦ２１変異体は、Ｐｌａｎｏｖａ ２０Ｎ（旭化成メディカル社）ウイルス保持フィルターを通過させ、その後に１０ｍＭのクエン酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７）中への再生セルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）上でのタンジェンシャル・フロー・フィルトレーションを使用する濃縮／透析ろ過を実施する。

実施例２
３Ｔ３−Ｌ１−βＫｌｏｔｈｏ線維芽細胞グルコース取込みアッセイ
３Ｔ３−Ｌ１−βＫｌｏｔｈｏ線維芽細胞は、３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞から野生型βＫｌｏｔｈｏのコーディング配列およびブラスチシジン耐性マーカーを含有するＣＭＶ駆動哺乳動物発現ベクターのレトロウイルス形質導入によって生成する。ブラスチシジン耐性細胞は、１５μＭブラスチシジンの存在下で１４日間にわたる増殖後に選択し、βＫｌｏｔｈｏ変異体発現は抗βＫｌｏｔｈｏ抗体を用いた免疫ブロットによって検証する。３Ｔ３−Ｌ１−βＫｌｏｔｈｏ線維芽細胞は、１０％仔ウシ血清および１５μＭのブラスチシジンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で実験使用のためにプレーティングするまで保持する。

グルコース取込みのために、３Ｔ３−Ｌ１−βＫｌｏｔｈｏ線維芽細胞を９６プレート中で２０，０００ｃｅｌｌｓ／ウエルでプレーティングし、１０％仔ウシ血清を含むＤＭＥＭ中で４８時間にわたりインキュベートする。細胞は、当該のＦＧＦ２１変異体を含む、または含まない０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＤＭＥＭ中で３時間にわたりインキュベートし、その後にＦＧＦ２１変異体を含む、または含まない１００μＭの２−デオキシ−Ｄ−（^１４Ｃ）グルコースを含有するクレーブス・リンガー（Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ）リン酸（ＫＲＰ）バッファー（１５ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１１８ｍＭのＮａＣｌ、４．８ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＭｇＳＯ_４、１．３ｍＭのＣａＣｌ_２、１．２ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、０．１％のＢＳＡ）中での１時間のインキュベーションを実施する。非特異的結合は、１ｍＭの２−デオキシ−Ｄ−（^１４Ｃ）グルコースを含有するクレーブス・リンガー重炭酸／Ｈｅｐｅｓ（ＫＲＢＨ）バッファー中の選択セルのインキュベーションによって決定する。この反応は、細胞への２０μＭのサイトカラシンＢの添加によって終了させ、グルコース取込みを液体シンチレーションカウンターを用いて測定する。

３Ｔ３−Ｌ１−βＫｌｏｔｈｏ線維芽細胞グルコース取込みアッセイにおける配列番号１のＦＧＦ２１変異体のインビトロ効力（ＥＣ_５０）は、０．０５１ｎＭである。

実施例３
物理的安定性
ＦＧＦ２１変異体の物理的安定性は以下のように決定した。変異体を透析し、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む、または含まない１０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ７）中の１〜２ｍｇ／ｍＬ中で調製し、ＳＥＣによって分析してＨＭＷ（％）を決定した（表１：「初期」）。

ＳＥＣ分離法は、東ソー・バイオサイエンス事業部製３０００ＳＷＸＬ、３０ｃｍ×０．７８ｃｍの寸法を備える５μカラム上で実施した。移動相は、０．５ｍＬ／分の流量での０．０１Ｍのクエン酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７）である。初期低濃度サンプルは１０μＬの注入液として適用し、吸光波長２１４ｎｍで監視したが、３０ｍｇ／ｍＬのサンプルは１μＬ注入液として適用し、２８０ｎｍで監視した。

次に、変異体を３０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、再び分析した（ｔ＝０）。配列番号７のＦＧＦ２１変異体についてのＨＭＷ（％）は、塩の存在下でヒスチジンバッファー中で濃縮すると０．１５％から０．９％へ増加した。配列番号１のＦＧＦ２１変異体についてのＨＭＷ（％）は、塩を含むヒスチジンバッファー中で濃縮すると０．１５％から０．７％へ増加した。塩の非存在下では、配列番号７のＦＧＦ２１変異体についてのＨＭＷ（％）は、濃縮すると０．２％から３．２％へ増加し、配列番号１のＦＧＦ２１変異体については０．１３％から１．０％へ増加した。そこで、配列番号７のＦＧＦ２１変異体および配列番号１のＦＧＦ２１変異体はどちらも、より低い初期ＨＭＷ（％）および１５０ｍＭのＮａＣｌの存在下で変異体を３０ｍｇ／ｍＬで調製した場合により低いＨＭＷ（％）を有していた。これらのデータは、配列番号１のＦＧＦ２１変異体中に存在するが配列番号７のＦＧＦ２１変異体中には存在していないＬ１００Ｋ突然変異が重要であることを証明していた。

ストレス条件下での長期間安定性を評価するために、３０ｍｇ／ｍＬの製剤を４週間にわたり４℃、２５℃および４０℃でインキュベートした。表１に示したように、ＨＭＷ（％）を４週間後に再び決定した（ｔ＝４週間）。配列番号７のＦＧＦ２１変異体についてのＨＭＷ（％）は、塩の非存在下では４０℃で３．２％から６．６％へ増加した。配列番号１のＦＧＦ２１変異体についてのＨＭＷ（％）は、４０℃で１％から５．３％へ増加した。配列番号７のＦＧＦ２１変異体についてのＨＭＷ（％）は、塩の存在下では、４０℃で０．９％から２．３％へ増加し、配列番号１のＦＧＦ２１変異体については０．７％から１．７％へ増加した。２５℃での４週間後に、ＨＭＷ（％）のレベルは配列番号１のＦＧＦ２１変異体については１．１％に過ぎなかったが、他方塩の非存在下では配列番号７のＦＧＦ２１変異体については２．９％であった。これらのデータは、配列番号１のＦＧＦ２１変異体中に存在するＬ１００Ｋ突然変異を含めることが有益な影響を及ぼすことを証明している。

実施例４
Ｒ１７５およびＥ１８０発現の不均質性
均質変異体産物の産生は、一貫性のある明確に特徴付けられた産物をより良好に保証するので望ましい。産物の不均質性を評価するために、サンプルの１０μＬアリコートを９０μＬのＤＰＢＳと混合した。サンプルは、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）によって、以下の条件を使用して分析した：移動相Ａは０．０５％のＴＦＡ、移動相Ｂはアセトニトリル中の０．０４％のＴＦＡ、カラムはＰＬＲＰＳ ２．１×５０ｍｍカラム、注入量は１５μＬである。

Ｗａｔｅｒｓ Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＴ Ｐｒｅｍｉｅｒ（商標）質量分析計は、４００〜１，９９０ａｍｕ（原子質量単位）の質量範囲、極性ＥＳ＋、キャピラリー３０００、サンプルコーン４０Ｖへ設定したが、アパーチャー１は２５Ｖ、ソース温度は１０５℃、コーンガス流量は５０Ｌ／時、脱溶媒時間は１５０℃、および脱溶媒ガス流量は６００Ｌ／時であった。

表３は、ＬＣ／ＭＳ法によって決定された各ＦＧＦ２１変異体内で生じる不均質性を報告している。産物１〜１８１は、配列番号７の全長ＦＧＦ２１変異体を表している。配列番号７のＦＧＦ２１変異体は、Ｃ末端短縮、特に１８１位でのアミノ酸残基グリシンの除去に感受性である。表３に示したように、配列番号７のＦＧＦ２１変異体の精製産物の３３．７％は企図された全長１〜１８１であった；１〜１８０フラグメントが精製産物の最大部分を構成した。さらに、量は少ないが産物１〜１７９もまた検出された。

配列番号１のＦＧＦ２１変異体は、遺伝子構築物において欠失している１８１位でアミノ酸残基を有しており、アミノ酸残基１８０は、グルタミン酸（Ｅ）に置換されている。これらの変化はＣＨＯ発現中の分解からＣ末端を保護し、１００％均質な精製１〜１８０産物を生じさせる。

実施例５
ｏｂ／ｏｂマウスモデルにおけるグルコース低下
雄性ｏｂ／ｏｂマウスおよび年齢を適応させたｏｂ／ｍ（痩身）コントロールは、到着時には７週齢であり、治療開始時の年齢は８〜９週齢であった。到着後、全マウスは１匹ずつ収容し、治療開始時まで１〜２週間順化させた。マウスはＰｕｒｉｎａ社製齧歯類飼料５０１５で飼養し、自動給水装置から水道水を随意に与えた。マウスは、２４℃（７５°Ｆ）に設定した周囲温度を用いて１２時間明暗周期で収容した。治療開始１〜２日前に、血液サンプルを尾部からの出血によって採取した。血中グルコース濃度はＡｃｃｕ−Ｃｈｅｃｋ Ａｖｉｖｉａ血糖計（Ｒｏｃｈｅ社）を使用して測定し、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ社製マウス／ラット用インスリンアッセイキットを使用するインスリンアッセイのために血清サンプルを収集した。治療開始日（第０日）に、治療前体重、血糖および血清インスリンに基づいてマウスを群にソーティングした（ＢＲＡＴソーティング・ソフトウエア）。第０日および第３日に、マウスに１０ｍＬ／ｋｇの用量で配列番号５のＦＧＦ２１変異体のホモダイマー０．１〜３０ｎｍｏｌ／ｋｇをＳＱ（皮下）投与した。投与ビヒクルは、０．０３％のマウス血清アルブミン（ＭＳＡ；Ｓｉｇｍａ Ａ３１３９）を含有する無菌ＰＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ ＤＰＢＳ／改質−カルシウム−マグネシウム）であった。血糖を７日間にわたり毎日測定し、ＡＵＣを決定した。血糖降下についてのＥＤ_５０計算は、ＡＵＣに基づいた。犠死時に肝ホモジネートを収集し、肝トリグリセリドは日立社製Ｍｏｄｕｌａｒ Ｐ臨床分析装置上で測定した。

第１４日に、ビヒクル処理マウスは３４８±１９．５ｍｇ／ｄｌ（平均値±ＳＥＭ）と測定された平均血糖値を備えて高血糖性であったが、他方ｏｂ／ｍ痩身コントロールマウスは１６５±３．２ｍｇ／ｄｌの血糖値（平均値±ＳＥＭ）を有していた。配列番号１のＦＧＦ２１変異体のホモダイマーは、ｏｂ／ｍ痩身コントロールに匹敵する値へ血糖値を降下させた。配列番号１のＦＧＦ２１変異体のホモダイマーのＥＤ_５０は、１．２９６ｎｍｏｌ／ｋｇ（９５％信頼区間＝−０．０７〜０．３０）であった。

配列
配列番号１−ＦＧＦ２１変異体
ＨＰＩＰＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＲＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＣＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＣＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＤＬＫＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＬＰＧＤＫＳＰＨＲＫＰＡＰＲＧＰＡＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＲＬＶＥＰＳＱＬＲＳＰＳＦＥ
配列番号２−野生型ＦＧＦ２１（ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓ））
ＨＰＩＰＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＲＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＡＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＧＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＬＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＬＰＧＮＫＳＰＨＲＤＰＡＰＲＧＰＡＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＳＭＶＧＰＳＱＧＲＳＰＳＹＡＳ
配列番号３−ヒトトランスフェリン（ｈＴｒｆ）シグナルペプチド
ＭＲＬＡＶＧＡＬＬＶＣＡＶＬＧＬＣＬＡ
配列番号４−ヒト線維芽細胞増殖因子結合タンパク質１（ｈＦＧＦＰ−１）シグナルペプチド
ＭＫＩＣＳＬＴＬＬＳＦＬＬＬＡＡＱＶＬＬＶＥＧ
配列番号５−ウシリゾチームシグナルペプチド
ＭＫＡＬＶＩＬＧＦＬＦＬＳＶＡＶＱＧ
配列番号６−マウス軽鎖（ｍκ）シグナルペプチド
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ
配列番号７−ＦＧＦ２１変異体
ＨＰＩＰＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＲＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＣＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＣＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＤＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＬＰＧＤＫＳＰＨＲＫＰＡＰＲＧＰＡＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＲＬＶＥＰＳＱＬＬＳＰＳＦＬＧ
配列番号８−（ＤＮＡ）ＦＧＦ２１変異体
ＣＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＴＧＡＣＴＣＣＡＧＴＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＴＴＣＧＧＧＧＧＣＣＡＡＧＴＣＣＧＧＣＡＧＣＧＧＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＣＣＧＡＣＧＡＣＧＣＣＣＡＧＣＡＧＡＣＣＧＡＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＧＡＡＡＴＣＣＧＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＣＣＧＴＧＧＧＣＴＧＴＧＣＣＧＣＣＧＡＣＣＡＧＴＣＣＣＣＴＧＡＧＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＧＣＣＣＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＣＧＴＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＴＧＧＧＣＧＴＧＡＡＡＡＣＣＴＣＣＣＧＧＴＴＣＣＴＧＴＧＣＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＡＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＴＡＣＧＧＣＴＣＣＣＴＧＣＡＣＴＴＣＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＣＴＣＣＴＴＣＣＧＧＧＡＧＧＡＣＣＴＧＡＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＡＣＡＡＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧＴＣＣＧＡＧＧＣＴＣＡＣＧＧＣＣＴＧＣＣＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＧＣＧＡＣＡＡＧＴＣＣＣＣＣＣＡＣＣＧＧＡＡＧＣＣＴＧＣＴＣＣＴＡＧＧＧＧＣＣＣＴＧＣＣＡＧＡＴＴＣＣＴＧＣＣＡＣＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＡＧＣＴＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧＧＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＡＣＧＴＧＧＧＣＴＣＣＴＣＣＧＡＣＣＣＴＣＴＧＣＧＧＣＴＧＧＴＣＧＡＧＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＣＧＧＡＧＣＣＣＴＡＧＣＴＴＣＧＡＧ

Claims (5)

1. アミノ酸配列が
   ＨＰＩＰＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＲＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＣＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＣＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＤＬＫＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＬＰＧＤＫＳＰＨＲＫＰＡＰＲＧＰＡＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＲＬＶＥＰＳＱＬＲＳＰＳＦＥ（配列番号１）である線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）変異体。
2. 請求項１に記載の変異体と少なくとも１つの医薬上許容される担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含む医薬組成物。
3. ２型糖尿病、肥満症、脂質異常症および／またはメタボリックシンドロームを治療する方法であって、それを必要とする患者に請求項１に記載の変異体を投与することを含む方法。
4. 療法に使用するための請求項１に記載の変異体。
5. ２型糖尿病、肥満症、脂質異常症および／またはメタボリックシンドロームの治療に使用するための請求項１に記載の変異体。