JP2020518281A - ヒトfgf21変異体、その製造方法、及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
1)野生型ヒトFGF21タンパクのアミノ酸配列において、31番目のAlaと32番目のHisの間に挿入された一つのCys、並びに43番目のGly及び44番目のAlaのいずれか1つまたは2つからCysへの変異(挿入されたCysが変異Cysと分子内ジスルフィド結合を形成)
2)野生型ヒトFGF21タンパクのアミノ酸配列の171番目のProからCysへの変異、及び/又は
3)野生型ヒトFGF21タンパクのアミノ酸配列の24〜31番目のアミノ酸配列フラグメント代替物としての5〜15アミノ酸、好ましくは6〜14アミノ酸、より好ましくは7〜13アミノ酸、さらに好ましくは8〜10アミノ酸、最も好ましくは8アミノ酸のフラグメント。
組換え発現ベクターを宿主細胞に形質転換する工程、
組換え宿主細胞を培養し、組換えタンパクの発現を誘導し、発現したタンパク質を回収して精製する工程
を含む、ヒトFGF21変異体を調製する方法を提供する。
当該遺伝子と発現ベクターとを作動可能に連結して、組換え発現ベクターを得る工程、
組換え発現ベクターにより宿主細胞を形質転換する工程、
組換え宿主細胞を培養し、組換えタンパク質の発現を誘導し、発現させたタンパク質を回収して精製する工程、
SUMO酵素でタンパク質を消化し、タンパク質を再精製する工程
を含む。
クローニングに用いるプライマーは、全て上海生工で合成したものである。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に用いるDNAポリメラーゼ(primer star)、制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、Dpn Iは、全てTakara会社から購入した。DNAマーカーはThermoから購入したものである。通常のDNA生成物回収キットや、アガロースゲル回収キットはTIANGEN会社から購入した。E.coliDH5α菌株、E.coliBL21菌株、pET22b−SUMO−FGF21プラスミド、SUMOプロテアーゼは北京Solarbio(索莱宝)テクノロジー有限会社から購入したものである。Tris、イミダゾールは上海生工から、他の塩類は国薬から、濃縮チューブはミリポアから購入したものである。FPLC機器には、GE会社のKTAシステムを使っており、用いたNi−セファロースクロマトグラフィーカラムと、分子排除クロマトグラフィーカラムであるHiload16/60Superdex75pgは、GE会社から購入したものである。BCAキットはThermoから購入したものである。
pET22b−SUMO−FGF21プラスミドを鋳型とする一度目の変異には、上流プライマー171G−Fと下流プライマー171G−Rを用いてPCR部位特異的変異を行って、FGF21−P171G変異体が得られた。二度目の変異には、FGF21−P171G変異体を鋳型とし、43C−Fを上流プライマー、43C−Rを下流プライマーとしてPCR部位特異的変異を行って、FGF21−G43C−P171G変異体が得られた。三度目の変異には、FGF21−G43C−P171G変異体を鋳型とし、31−32C−Fを上流プライマー、31−32C−Rを下流プライマーとしてPCR部位特異的変異を行って、FGF21−AG変異体が得られた。四度目の変異は、FGF21−AGを鋳型とし、FGF21−LG−Fを上流プライマー、FGF21−LG−Rを下流プライマーとして変異を行った。FGF21−LG変異体が得られた。PCR反応条件は以下のようにする。PCR反応系および反応プログラムにて上記変異過程を行った。
PCR反応工程:
ステップ1、予備変性温度98℃で10分;
ステップ2、変性温度98℃で10秒;
ステップ3、アニーリング温度57℃で5秒;
ステップ4、伸長温度72℃で1分。
ステップ2〜ステップ4からなるサイクルを30回繰り返した。
FGF21変異体菌株は、2%の植菌量で5ml LB培地(100μg/mlアンピシリンを含む)に植菌し、220rpm、37℃で一晩振盪培養した。一晩培養した菌液は、2%の量で、500ml LB培地(100μg/mlアンピシリンを含む)を入れた2000ml三角ボトルに植菌した。OD600が0.8になる時点で1.0M IPTG500ulを加えて、25℃で4時間誘導発現した。4℃、8000r/minで10分間遠心分離し、上清を捨て、菌体を回収して−80℃に凍結保存した。
(1)組換えヒトFGF21変異体の初精製
発現により得られた菌体は、溶解バッファー(50mM Tris、300mM NaCl、pH8.5)に再懸濁した後、超音波粉砕(30%出力、2秒間作動+5秒間停止で、トータル時間は45分間)を行った。4℃、14000rpmで40分間遠心分離し、上清液を回収した。あらかじめバッファーでバランスされたNi−セファロースクロマトグラフィーカラムには、上清液を加えて、4℃で30分間ロータリーミキシングした。溶液がカラムに通液された後、カラムの体積の5倍に相当するバッファーで洗浄して、結合しなかったタンパク質と不純物を除去し、さらにカラムの体積の5倍に相当する30mMイミダゾールを含むバッファー(50mM Tris、300mM NaCl、pH8.5)で非特異性の目的外のタンパク質を溶出させた後、もう一度カラムの体積の5倍に相当する300mMイミダゾールを含むバッファー(50mM Tris、300mM NaCl、pH8.5)を用いて目的タンパク質を溶出して、SDS−PAGEにて精製の結果を検出した(結果は図4に示す)。
透析後の融合タンパク質の検出:分子モル比が0.1%の割合でSUMO酵素を加え、4℃で2h酵素消化し、酵素消化したタンパク質溶液に終濃度が20mMであるイミダゾールを加えて、そしてその液体をあらかじめバッファー(50mM Tris、300mM NaCl、pH8.5)でバランスされたNi−セファロースクロマトグラフィーカラムに加えて、4℃で30分間ロータリーミキシングした。通液した溶液を回収し、サンプルは濃縮チューブで10mg/mlに濃縮し、さらに分子排除クロマトグラフィーバッファー(20mM PBS、100mM NaCl、pH7.2)によりSuperdex75分子排除クロマトグラフィーカラムで精製した。得られたタンパク質は、つまりFGF21変異体タンパクである。本発明の試験において、FGF21及び変異体であるFGF21−LG、FGF21−AGタンパクは、いずれも上に述べた方法で精製し、さらに12%SDS−PAGE電気泳動で検出したものである。なお、FGF21−LGタンパクのSDS−PAGEゲル電気泳動の結果は図5に示し、FGF21−AGタンパクのSDS−PAGEゲル電気泳動の結果は図6に示す。
変異体タンパクを用いて動物血糖を下げる試験を行った。ob/obマウス(南京大学動物パターン所から購入した)モデルは、3グループ各8匹に分けて、それぞれ、ベクター対照グループ(すなわち、生理食塩水を注射した)、FGF21グループ、FGF21−LGグループとする。実施方法は、背中に皮下注射で0.1mg/kg/日で7日間連続投与して、毎日投与前の血糖の値を記録した。図7に示すように、野生型FGF21タンパクと比較して、FGF21−LGグループ(図7)はより強い薬効を示した。同様に、FGF21−AGを用いて同じように試験した。実施方法は、0.6mg/kg/日で、毎日投与前の血糖の値を記録した。この試験により、FGF21−AGは同様に顕著な血糖を下げる作用を有することを証明した。その結果は図8に示す。
FGF21変異体タンパクを用いて動物体重を下げる試験を行った。ob/obマウスは4グループ各8匹に分けて、それぞれ、ベクター対照グループ(すなわち生理食塩水を注射した)、FGF21グループ、ヒトFGF21−LGグループ、FGF21−AGグループとする。精製後のタンパクは0.6mg/kg/日で6日間連続投与して、6日後の体重の変動を記録した。この試験により、野生型FGF21タンパクと比較して、FGF21−LG(図9)とFGF21−AG(図10)グループは顕著な体重減少作用を有し、より強い薬効を有することを実証した。
試験にはヒトFGF21変異タンパクを用いており、FGF21とFGF21−LGに対して円偏光二色性(CD)にて温度改変試験を行い、20〜95℃の範囲において5℃間隔で一つ試験点を取って試験を行った。試験の結果は、FGF21の転化温度が69℃であり、FGF21−LGの転化温度が98℃であった。この試験より、野生型FGF21と比較して、ヒトFGF21−LGはより強い熱安定性(図11)を有することを実証した。同様に、FGF21−AGを用いた試験では類似したCD結果を得た。
Claims (10)
- 野生型ヒトFGF21タンパクのアミノ酸配列への下記のアミノ酸改変:
1)野生型ヒトFGF21タンパクのアミノ酸配列の31番目のAlaと32番目のHisの間に挿入された一つのCys、ならびに43番目のGly及び/又は44番目のAlaからCysへの変異、
2)野生型ヒトFGF21タンパクのアミノ酸配列の171番目のProからCysへの変異、及び/又は
3)野生型ヒトFGF21タンパクのアミノ酸配列の24〜31番目のアミノ酸フラグメント代替物としての5〜15アミノ酸、好ましくは6〜14アミノ酸、より好ましくは7〜13アミノ酸、さらに好ましくは8〜10アミノ酸、最も好ましくは8アミノ酸のフラグメント
を含む、ヒトFGF21変異体。 - 前記アミノ酸フラグメント代替物は、式X1X2X3X4X5X6X7X8で表される8つのアミノ酸のフラグメントであり、X1〜X8は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸から選択されるものであり、好ましくはX1がSer又はAsp、X2がGly又はAsp、X3がPro又はAla、X4がAla又はGln、X5がGly又はGln、X6がLeu又はTyr、X7がSer又はHis、及び/又はX8がSer又はAlaである、請求項1に記載の変異体。
- 前記アミノ酸フラグメント代替物のアミノ酸配列は、DDAQQTEA又はSGPHGLSSである、請求項2に記載の変異体。
- 前記変異体のアミノ酸配列はSEQ ID NO:4又はSEQ ID NO:6に記載のものである、請求項3に記載の変異体。
- 前記野生型ヒトFGF21タンパクのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:1に記載のもの、又はSEQ ID NO:1と90%以上、95%以上、好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するものである、請求項1に記載の変異体。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の変異体をコードする核酸。
- 請求項6に記載の核酸を含むベクターであって、好ましくは発現ベクターであり、より好ましくは原核発現ベクターであるベクター。
- 請求項7に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の変異体と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物。
- 2型糖尿病、肥満、脂質異常症又はメタボリックシンドロームの治療のための医薬品の製造における、請求項1〜5のいずれかに記載の変異体、請求項6に記載の核酸、請求項7に記載のベクター、又は請求項8に記載の宿主細胞の使用。
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