CN116098989A - Fgf21变体、融合蛋白及其应用 - Google Patents

Fgf21变体、融合蛋白及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及一种FGF21变体，进一步涉及FGF21变体融合蛋白、蛋白质多聚体及其应用。本申请所述的FGF21变体、融合蛋白及蛋白质多聚体能够显著提高与靶标的结合力，并能够用于治疗代谢性疾病。

Description

FGF21变体、融合蛋白及其应用
技术领域
本申请涉及成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21，FGF21)变体、包含其的融合蛋白和/或蛋白质多聚体，可用于治疗代谢性疾病。
背景技术
目前，治疗糖尿病的药物主要包括三大类：口服小分子药物、胰岛素和GLP-1受体激动剂类药物。小分子药物长期服用副作用明显，且对糖尿病后期的血糖控制不理想。胰岛素需要每天多次(至少一次)注射，且由于个体剂量差异易引发低血糖。单一的GLP-1受体激动剂不属于一线用药，对糖尿病代谢异常导致的心血管等并发症疗效有限。
胰高血糖素样肽-1(Glucagon like peptide-1，GLP-1)是一种由小肠L细胞分泌的肠促胰素，其可以刺激胰岛β细胞分泌胰岛素，从而维持病患体内胰岛素的平衡。天然GLP-1仅能在体外保持2分钟活性，并不适合作为药物。在过去的几年中，礼来、诺和诺德、GSK等公司竞相改造该蛋白，以期获得长效GLP-1类降糖药物。二型糖尿病有外周胰岛素抵抗、胰岛β细胞的血糖依赖性胰岛素分泌受损两个主要特征。代谢紊乱往往由多种复杂因素导致，因此针对多重代谢通路的治疗将更具潜力。
FGF21属于FGF家族(fibroblast growth factors，FGFs)成员之一，自1976年发现了第一个FGF(FGF1或aFGF)以来，人体内共发现该家族22个成员。FGFs的生物学功能十分多样化，到目前为止，研究发现，FGFs参与调节包括细胞分化、增殖和代谢等一系列生理活动。FGF21基因最早由Nishimura等克隆出来。直到2005年，FGF21作为一个新的代谢调节因子的报道才首次揭示了它的生物学活性，后续研究发现，FGF21作为一种主要由肝脏分泌的因子参与了重要的代谢调控。
近年来，人们发现FGF21具有很好的血糖调节功能。FGF21可以促进脂肪细胞对葡萄糖的吸收，增强胰岛素敏感性，同时与胰岛素相比，FGF21不会引起低血糖等副作用，更能有效保护β胰岛细胞，促进胰岛β细胞的再生与修复，而且由于没有促分裂活性，也不会导致潜在的肿瘤风险，这使得FGF21作为潜在的治疗2型糖尿病非胰岛素类药物有着巨大潜力。另一方面，和通过胰岛素间接作用的GLP类降糖药物不同，FGF21本身也能刺激GLUT1受体，促进葡萄糖向细胞内的转运，因此其本身也有希望成为治疗1型糖尿病的药物。
除了针对糖尿病，FGF21也有很好的降脂作用，可以提高脂质的氧化，调节脂质的分解及酮体生成，从而改善机体脂质紊乱，是一个很有潜力的降脂药。体重升高及血脂导致的心血管疾病也是糖尿病人的一个重要并发症，FGF21在控制血糖的同时，能够很好的调节体脂紊乱，有效防止糖尿病并发症的发生，亦有单独作为一款降脂药、针对非酒精性脂肪肝等疾病成药的潜力。
然而，FGF21在成药性方面也面临着巨大的挑战。这一方面是由于FGF21的半衰期很短，在小鼠模型中其半衰期仅为一小时左右(Xu et al.，2009)。其原因是FGF21在体内会被蛋白酶迅速降解，同时其在体外形成聚集物的倾向也会导致免疫原性，不利于半衰期的延长。另一方面，FGF21在体内的生物学活性也有限，降糖能力和降脂能力都不足以强大到使其单独成为一款可用的药物，这些因素使得目前为止还未有基于FGF21的抗代谢疾病药物面世。
为了增强其在降糖、降脂等方面的生物学活性，需要对FGF21进行改造，增强其与靶蛋白的相互作用，以增强其体内效果。目前为止，尚未发现可直接增强FGF21与靶蛋白相互作用、并直接增强其体内生物学活性的改造方式。
发明内容
一方面，本申请提供了一种FGF21变体，其氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比包括一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代包括第167位处的氨基酸取代。
在某些实施方式中，所述第167位处的氨基酸取代为S167H。
在某些实施方式中，所述一个或多个氨基酸取代还包括选自下述的一个或多个位置处的氨基酸取代：第98位、第171位、第175位、第113位、第114位和第135位。
在某些实施方式中，所述一个或多个氨基酸取代包括氨基酸取代L98R。
在某些实施方式中，所述一个或多个氨基酸取代包括氨基酸取代P171A或P171G。
在某些实施方式中，所述一个或多个氨基酸取代包括氨基酸取代R175L、R175P或R175H。
在某些实施方式中，所述一个或多个氨基酸取代包括氨基酸取代G113R。
在某些实施方式中，所述一个或多个氨基酸取代包括氨基酸取代L114Q。
在某些实施方式中，所述一个或多个氨基酸取代包括氨基酸取代R135C。
在某些实施方式中，所述一个或多个氨基酸取代包含下述任一组所示氨基酸位置处的氨基酸取代：a)L98、S167和P171；b)L98、S167、P171和R175；以及，c)L98、G113、L114、R135、S167、P171和R175。
在某些实施方式中，其包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：3-4和SEQID NO：34-37。
另一方面，本申请提供了一种融合蛋白，其包含本申请所述的FGF21变体。
在某些实施方式中，所述融合蛋白还包含IgG恒定区结构域或其片段。在某些实施方式中，所述IgG恒定区结构域或其片段包括IgG4 Fc结构域。在某些实施方式中，所述IgG4Fc结构域包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：5-6。
在某些实施方式中，所述FGF21变体的N端与所述IgG恒定区结构域或其片段的C端直接或间接相连。在某些实施方式中，所述FGF21变体的N端通过第一接头与所述IgG恒定区结构域或其片段的C端相连。在某些实施方式中，所述第一接头包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：7-8。
在某些实施方式中，所述融合蛋白包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ IDNO：9-14和SEQ ID NO：26-27。
在某些实施方式中，所述融合蛋白包含GLP-1受体激动剂部分。在某些实施方式中，所述GLP-1受体激动剂部分包含GLP-1类似物。在某些实施方式中，所述GLP-1受体激动剂部分包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：28。
在某些实施方式中，所述融合蛋白包含所述IgG恒定区结构域或其片段以及所述GLP-1受体激动剂部分，并且所述GLP-1受体激动剂部分的C端与所述IgG恒定区结构域或其片段的N端直接或间接相连。在某些实施方式中，所述GLP-1受体激动剂部分的C端通过第二接头与所述IgG恒定区结构域或其片段的N端相连。在某些实施方式中，所述第二接头包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：7-8。
在某些实施方式中，包含所述IgG恒定区结构域或其片段、所述GLP-1受体激动剂部分以及所述FGF21变体，并且所述FGF21变体的N端与所述IgG恒定区结构域或其片段的C端直接或间接相连。在某些实施方式中，所述GLP-1受体激动剂部分的C端通过所述第二接头与所述IgG恒定区结构域或其片段的N端相连，且所述FGF21变体的N端通过所述第一接头与所述IgG恒定区结构域或其片段的C端相连。在某些实施方式中，所述融合蛋白包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：16-18。
另一方面，本申请提供了一种蛋白质多聚体，其由两个以上本申请所述的融合蛋白构成。在某些实施方式中，所述的蛋白质多聚体为同源二聚体。
另一方面，本申请提供了一种分离的核酸分子，其编码本申请所述的FGF21变体或本申请所述的融合蛋白。
另一方面，本申请提供了一种载体，其包含本申请所述的分离的核酸分子。
另一方面，本申请提供了一种细胞，其包含本申请所述的载体。
另一方面，本申请提供了制备本申请所述的FGF21变体、本申请所述的融合蛋白或本申请所述的蛋白质多聚体的方法，所述方法包括：在允许所述FGF21变体、所述融合蛋白或所述蛋白质多聚体表达和/或形成的条件下培养本申请所述的细胞。
在某些实施方式中，所述方法进一步包括：回收经表达和/或形成的所述FGF21变体、所述融合蛋白或所述蛋白质多聚体。
另一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含本申请所述的FGF21变体、本申请所述的融合蛋白或本申请所述的蛋白质多聚体，以及任选地一种或多种药学上可接受的载体。
另一方面，本申请提供了本申请所述的FGF21变体、本申请所述的融合蛋白或本申请所述的蛋白质多聚体在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗代谢性疾病。在某些实施方式中，本申请所述的用途，其中所述代谢性疾病选自糖尿病、肥胖和肝脂肪变性。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本公开的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本公开的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本公开的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：
图1显示了本申请的蛋白质多聚体的一个实例的结构示意图。
图2显示了本申请的蛋白质多聚体的一个实例的结构示意图。
图3显示了本申请的融合蛋白S5、S4、S2、S1及S7与βklotho的结合能力。
图4显示了本申请的融合蛋白S6、S4、S2及S7与βklotho的结合能力。
图5显示了本申请的融合蛋白S8、S7及S1的降糖作用。
图6显示了本申请的融合蛋白S8、S7及S1对肝脏的保护效果。
图7显示了本申请的融合蛋白S1及S2的降糖作用。
图8显示了本申请的融合蛋白D1及D2的降糖作用。
图9显示了本申请的融合蛋白D1及D2在降低甘油三酯(TG)方面的作用。
图10显示了本申请的融合蛋白D1及D2在降低总胆固醇方面的作用。
图11显示了本申请的融合蛋白D2与杜拉鲁肽降血糖效果的比较。
图12显示了本申请的融合蛋白S2及D2的纯化结果。
图13显示了本申请的融合蛋白S3、D3、S2的纯化结果。
图14显示了本申请的融合蛋白D3和D2在降糖方面的作用。
图15显示了本申请的融合蛋白S2、S1、S7、S3在降糖方面的作用。
具体实施方式
本申请的其他特点和优越性可通过以下详细的描述体现。但是，应该理解的是，本申请的实施方案仅以示例性的方式给出，对于本领域技术人员，在本申请的实质和范围内做出多种改变和改良是显而易见的。
术语定义
人FGF21野生型序列含有209个氨基酸，具有NCBI参考序列号NP_061986.1；成熟的FGF21序列较FGF21野生型缺少前导序列，其含有181个氨基酸。在本申请中，术语“天然FGF21序列”通常是指成熟的人FGF21序列，具有SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列。
在本申请中，术语“FGF21变体”通常是指与所述天然FGF21的氨基酸序列相比，包含一个或多个氨基酸残基的添加、缺失和/或取代，且基本上仍具有所述天然FGF21的至少一种性质的多肽。所述FGF21变体可通过利用天然或非天然存在的氨基酸在天然FGF21多肽的特定位置进行修饰，所述修饰包含在特定位置插入、替换或删除保守或非保守的一个或多个氨基酸来产生，也包含在特定位置引入非氨基酸结构。在本申请所述的FGF21变体中，按下述SEQ ID NO：1的编号顺序对所述FGF21变体中的氨基酸残基进行编号。
HPIPDSSPLL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKPGVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAPRGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLSMVG PSQGRSPSYA S(SEQ ID NO：1)
本申请所述的FGF-21变体还可包含氨基酸的缺失，其可以是N-端截短、C-端截短或内部缺失，或者这些的任意组合。包含N-端截短、C-端截短和/或内部缺失的这些变体在本申请中被称作“缺失变体”或“片段”。术语“缺失变体”或“片段”在本申请中可互换地使用。所述片段可以是天然存在的(例如剪接变体)或其可以通过人工构建，例如通过基因技术手段。
在本申请中，术语“IgG恒定区结构域”通常是指包括抗体重链恒定区、铰链区和抗体轻链恒定区的多肽结构域或多肽片段。所述的抗体可以是IgG抗体，例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型的抗体。
在本申请中，术语IgG恒定区结构域的“片段”通常是指IgG恒定区结构域的一部分，但仍保留至少其部分活性。例如，所述片段可包括CL、CH1、铰链区、CH2和CH3中的一个或多个结构域或片段。
在本申请中，术语“Fc结构域”通常是指由抗体的铰链区、CH2和CH3恒定区部分组成的结构域。在本申请中，IgG4 Fc结构域可包含如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在本申请中，术语“GLP-1”通常指具有生物学活性的GLP-1(7-37)，其氨基酸序列为：HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR G。本申请所述的“天然GLP-1序列”是指天然GLP-1(7-37)序列。
在本申请中，术语“GLP-1类似物”通常是指保持GLP-1天然生物学活性的其类似物。例如，本申请中所述的GLP-1类似物可包含在天然GLP-1序列中引入1-10个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)、缺失或插入而得到的多肽。所述GLP-1类似物可而延长GLP-1的体内半衰期，并且同时保留GLP-1的天然生物学活性。在某些实施方式中，所述GLP-1类似物可包含如SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列：
HG8EGTFTSDVSSYLEE22QAAKEFIAWLVKGG36G(SEQ ID NO:15)。
HG8EGTFTSDVSSYLEE22QAAKEFIAWLVKGRG(SEQ ID NO:28)。
在本申请中，术语“GLP-1的生物学活性”通常是指GLP-1诱导的多种生物学效应，例如刺激胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌、抑制胃排空、抑制胃运动或肠运动及诱导重量减轻等。GLP-1的显著特征包括其刺激胰岛素分泌而不伴有低血糖相关危险的能力。
在本申请中，术语“保守氨基酸取代”可包括天然氨基酸残基(即存在于野生型FGF21多肽序列给定位置上的残基)被非天然残基(即不存在于野生型FGF21多肽序列给定位置上的残基)取代，使得对该位置上的氨基酸残基的极性或电荷几乎没有或没有影响。保守氨基酸取代还包括通常通过化学上的肽合成而不是通过在生物系统中的合成而掺入的非天然存在的氨基酸残基。这些包括肽模拟物(peptidomimetics)和氨基酸部分的其它反转形式或反向形式。
可根据共有的侧链性质将天然存在的氨基酸残基分为以下几类：
(1)疏水性残基：正亮氨酸、M、A、V、L、I；
(2)中性亲水性残基：C、S、T；
(3)酸性残基：D、E；
(4)碱性残基：N、Q、H、K、R；
(5)影响链方向的残基：G、P；和
(6)芳族残基：W、Y、F。
保守取代可包括这些类别之一的某个成员被同一类别的另一个成员替换。
表1中显示了某些保守氨基酸取代的示例：
氨基酸 保守氨基酸取代
Ala D-Ala，Gly，Aib，β-Ala，L-Cys，D-Cys
Arg D-Arg，Lys，Orn，D-Orn
Asn D-Asn，Asp，D-Asp，Glu，D-Glu，Gln，D-Gln
Asp D-Asp，D-Asn，Asn，Glu，D-Glu，Gln，D-Gln
Cys D-Cys，S-Me-Cys，Met，D-Met，Thr，D-Thr，L-Ser，D-Ser
Gln D-Gln，Asn，D-Asn，Glu，D-Glu，Asp，D-Asp
Glu D-Glu，Asp，D-Asp，Asn，D-Asn，Gln，D-Gln
Gly Ala，D-Ala，Pro，D-Pro，Aib，β-Ala
Ile D-Ile，Val，D-Val，Leu，D-Leu，Met，D-Met
Leu D-Leu，Val，D-Val，Met，D-Met，Ile，D-Ile
Lys D-Lys，Arg，D-Arg，Orn，D-Orn
Met D-Met，S-Me-Cys，Ile，D-Ile，Leu，D-Leu，Val，D-Val
Phe D-Phe，Tyr，D-Tyr，His，D-His，Trp，D-Trp
Pro D-Pro
Ser D-Ser，Thr，D-Thr，allo-Thr，L-Cys，D-Cys
Thr D-Thr，Ser，D-Ser，allo-Thr，Met，D-Met，Val，D-Val
Tyr D-Tyr，Phe，D-Phe，His，D-His，Tip，D-Trp
Val D-Val，Leu，D-Leu，Ile，D-Ile，Met，D-Met
表1
例如，表2中列出了一些保守氨基酸取代的示例，大于0的数值代表两个氨基酸之间的取代为保守氨基酸取代：
C G P S A T D E N Q H K R V M I L F Y W
W -8 -7 -6 -2 -6 -5 -7 -7 -4 -5 -3 -3 2 -6 -4 -5 -2 0 0 17
Y 0 -5 -5 -3 -3 -3 -4 -4 -2 -4 0 -4 -5 -2 -2 -1 -1 7 10
F -4 -5 -5 -3 -4 -3 -6 -5 -4 -5 -2 -5 -4 -1 0 1 2 9
L -6 -4 -3 -3 -2 -2 -4 -3 -3 -2 -2 -3 -3 2 4 2 6
I -2 -3 -2 -1 -1 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 4 2 5
M -5 -3 -2 -2 -1 -1 -3 -2 0 -1 -2 0 0 2 6
V -2 -1 -1 -1 0 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 4
R -4 -3 0 0 -2 -1 -1 -1 0 1 2 3 6
K -5 -2 -1 0 -1 0 0 0 1 1 0 5
H -3 -2 0 -1 -1 -1 1 1 2 3 6
Q -5 -1 0 -1 0 -1 2 2 1 4
N -4 0 -1 1 0 0 2 1 2
E -5 0 -1 0 0 0 3 4
D -5 1 -1 0 0 0 4
T -2 0 0 1 1 3
A -2 1 1 1 2
S 0 1 1 1
P -3 -1 6
G -3 5
C 12  
表2
当形成本申请的融合蛋白时，可以、但并非必须使用接头或连接子。当接头存在时，接头的化学结构可能不是决定性的，因为它主要起间隔的作用。接头可由通过肽键连接在一起的氨基酸构成。在本申请的某些实施方案中，接头由通过肽键连接的1-20个氨基酸构成。例如，所述1-20个氨基酸可选自20种天然存在的氨基酸。在某些实施方式中，所述1-20个氨基酸可选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。在一些实施方案中，所述接头由空间上不受阻碍的多个氨基酸构成。例如，所述空间上不受阻碍的氨基酸可以为甘氨酸和丙氨酸。所述接头可以为富含G的多肽，例如，其可以选自(G)3-S(即“GGGS”)、(G)4-S(即“GGGGS”)和(G)5-S(即“GGGGGS”)。在一些实施方案中，所述接头包含GGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGS或GGGGSGGGGSGGGGSA。其它合适的接头包括：GGGGGSGGGSGGGGS、GGGKGGGG、GGGNGSGG、GGGCGGGG和GPNGG等。本申请的接头可为任何长度或组成的接头。
上文所述接头是示例性的，本申请的接头可以为长得多的接头以及包含其它残基的接头。本申请中所述的接头还可为非肽接头。例如，可以使用烷基接头，例如-NH-(CH2)S-C(O)-，其中s＝2-20。这些烷基接头可被任何无空间位阻的基团进一步取代，所述无空间位阻的基团包括但不限于低级烷基(例如C1-C6)、低级酰基、卤素(例如Cl、Br)、CN、NH2或苯基。示例性的非肽接头还可以为聚乙二醇接头，其中接头的分子量可以为100-5000kD，例如100-500kD。
在本申请中，所述“一个或多个”氨基酸替换中的“多个”通常是指大于1个氨基酸的替换。例如，1～30个、1～20个、1～10个、1～5个、如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、或30个氨基酸的替换。
在本申请中，所述“第一”、“第二”只是为了在描述上进行区分，并没有其它含义。
在本申请中，术语“包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。
在本申请中，术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用，并且在其最广泛的意义下，是指两个或更多个氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物亚单位组成的化合物。所述两个或更多个亚单位可通过肽键连接。在某些实施方式中，所述两个或更多个亚单位可通过其他键连接，如酯键、醚键、氨基等。蛋白质或多肽必须含有至少两个氨基酸并且对于可构成蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数目没有设限。在本申请中，术语“氨基酸”通常是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括氨基酸的D和L光学异构体(例如甘氨酸及其D和L光学异构体)、氨基酸类似物和肽模拟物等。
在本申请中，术语“二聚体”通常是指蛋白质-蛋白质相互作用的一种形式。例如，其可包括两个相关亚单位组成的蛋白质-蛋白质复合物。在本申请中，术语“同源二聚体”通常是指由两个相同的亚单位(例如，单体)构成的二聚体。
在本申请中，术语“同源性”、“同一性”或“相似性”可互换地使用，通常是指两个肽或蛋白质之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可通过比较各序列中可为比较目的来比对的位置而确定。在所比较的分子中，当其序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，那么这些分子在那个位置上是同源的。序列之间的同源性程度随着序列共有的匹配或同源位置的数目而变化。“无关”或“非同源的”序列表示被比较的序列间共有小于40％的同一性，或者小于25％的同一性。
在本申请中，当表示多肽的氨基酸序列同一性时，术语“至少80％序列同一性”通常是指与各参考序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
在本申请中，当与数值关联使用时，术语“约”通常包括如下范围内的数值：该范围具有比所示数值小5％的下限并具有比所示数值大5％的上限。
在本申请中，术语“融合蛋白”通常指由两个或更多个蛋白或多肽融合得到的蛋白。编码所述两个或更多个蛋白或多肽的基因或核酸分子可彼此连接而形成融合基因或融合的核酸分子，该融合基因或融合的核酸分子可编码所述融合蛋白。所述融合基因的翻译产生单一多肽，其具有融合前的所述两个或更多个蛋白或多肽中至少一个、甚至每一个的性质。重组融合蛋白可通过用于生物学研究或治疗的重组DNA技术人工创造。在本申请中，融合蛋白和重组融合蛋白可互换地使用。本申请中所述的融合蛋白通常包含至少两个结构域，介于所述两个结构域之间的接头以及任选地包含第三组分。重组融合蛋白的产生是本领域已知的，并且通常涉及自编码第一蛋白或多肽的cDNA序列去除终止密码子，然后通过连接或重叠延伸PCR以符合读框的方式附接第二蛋白的cDNA序列。该DNA序列然后会由细胞表达成为单一蛋白质。该蛋白质可以经工程化以包括两种原始蛋白质或多肽的完整序列，或仅仅任一的一部分。
除非上下文另外明确规定，否则如在本说明书和权利要求书中所用的，单数形式“一”和“所述”修饰的或未表明是单数或复数提及物包括复数个提及物。例如，术语“药学上可接受的载体”、“所述药学上可接受的载体”包括一个或多个药学上可接受的载体，或包括其混合物。
在本申请中，术语“组合物”通常是两种或更多种物质的组合，例如，活性剂与其它惰性或活性化合物的组合。
在本申请中，术语“药物组合物”通常指包括活性成分与惰性或活性载体的组合，从而使该组合物适于体内或体外或离体的诊断或治疗用途。
在本申请中，术语“治疗有效量”通常指对受试者产生治疗益处所需的活性成分的最小剂量。例如，对于表现出患有或易感2型糖尿病、肥胖症或代谢综合征的患者或为预防其发病的患者而言，“治疗有效量”是指能够诱导、改进或者造成与上述紊乱相关或因与之对抗所致的病理症状、疾病进展、生理情况改善的剂量。本申请中，术语“受试者”或“患者”可为人，但也可为非人动物，更具体而言可为同伴动物(如狗、猫等)、农场动物(如牛、羊、猪、马等)或者实验室动物(如大鼠、小鼠、豚鼠等)等。
在本申请中，当描述序列中氨基酸残基的取代时，表述“XnY”通常表示序列中第n位的残基X被残基Y取代。例如，氨基酸取代“R175L”表示，序列中第175位的残基R被残基L取代。
FGF21变体
FGF21在体内的生物学活性有限，降糖能力和降脂能力都不足以强大到使其单独成为一款可用的药物。为了增强其降糖、降脂等生物学活性，需要对FGF21进行改造，增强其与靶蛋白的相互作用，进而增强其体内效果。
本申请的发明人出人意料地发现，人FGF21的某些变体形式能够显著增强FGF21结合其靶标的能力。
一方面，本申请提供了一种FGF21变体，其氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比包括一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代包括第167位处的氨基酸取代。
在一些实施方式中，所述第167位处的氨基酸取代为S167H。
在一些实施方式中，所述一个或多个氨基酸取代还包括选自下述的一个或多个位置处的氨基酸取代：第98位、第171位、第175位、第113位、第114位和第135位。
在一些实施方式中，所述一个或多个氨基酸取代包括氨基酸取代L98R。
在一些实施方式中，所述一个或多个氨基酸取代包括氨基酸取代P171A或P171G。
在一些实施方式中，所述一个或多个氨基酸取代包括氨基酸取代R175L、R175P或R175H。
在一些实施方式中，所述一个或多个氨基酸取代包括氨基酸取代G113R。
在一些实施方式中，所述一个或多个氨基酸取代包括氨基酸取代L114Q。
在一些实施方式中，所述一个或多个氨基酸取代包括氨基酸取代R135C。
在一些实施方式中，所述一个或多个氨基酸取代包含下述任一组所示氨基酸位置处的氨基酸取代：a)L98、S167和P171；b)L98、S167、P171和R175；以及，c)L98、G113、L114、R135、S167、P171和R175。
在一些实施方式中，其包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：3-4和SEQID NO：26-27。
在一个方面，本申请提供了一种FGF21变体，其包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，
HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLEDGYNVYQSEAHX2X3PLHLPGNKSPHRDPAPRGPAX4FLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLX5MVGX6SQGX7SPSYAS(SEQ ID NO:2)，
其中，X1为L，R，D，E或K；X2为G或R；X3为L或Q；X4为R或C；X5为S，C，R或H；X6为P、C、G或A；X7为R，H，P或L；其中所述FGF21变体与天然FGF21相比，包含在选自X1～X7的至少1处的氨基酸取代，且所述天然FGF21的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在某些实施方式中，与所述天然FGF21相比，所述FGF21变体至少包含在第167位(X5)和/或第175位(X7)的氨基酸取代。例如，所述FGF21变体(SEQ ID NO:2)可在天然FGF21序列(SEQ ID NO:1)的基础上至少包含第167位(X5)的氨基酸取代、第175位(X7)的氨基酸取代或者第167位(X5)以及第175位(X7)的氨基酸取代。
所述第167位的氨基酸取代可选自S167H，S167C和S167R。所述第175位的氨基酸取代可选自R175L，R175H和R175P。在一些实施方式中，所述第167位的氨基酸取代选自S167H，S167C和S167R，且所述第175位的氨基酸取代选自R175L，R175H和R175P。在一些实施方式中，所述第167位的氨基酸取代为S167H，且所述第175位的氨基酸取代选自R175L，R175H和R175P。在某些实施方式中，所述第167位的氨基酸取代为S167H，且所述第175位的氨基酸取代为R175L。
在某些实施方式中，本申请所述的FGF21变体(例如，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)至少包含在第98位(例如，SEQ ID NO:2中的X1)和/或第171位(例如，SEQ ID NO:2中的X6)的氨基酸取代。例如，所述FGF21变体(SEQ ID NO:2)可在天然FGF21序列(SEQ ID NO:1)的基础上至少包含第98位(X1)的氨基酸取代、第171位(X6)的氨基酸取代或者第98位(X1)以及第171位(X6)的氨基酸取代。
所述第98位的氨基酸取代可选自L98D，L98R，L98E和L98K。所述第171位的氨基酸取代可选自P171A，P171C和P171G。在一些实施方式中，所述第98位的氨基酸取代选自L98D，L98R，L98E和L98K，且所述第171位的氨基酸取代选自P171A，P171C和P171G。在一些实施方式中，所述第98位的氨基酸取代为L98R，且所述第171位的氨基酸取代选自P171A和P171G。
在某些实施方式中，本申请所述的FGF21变体(例如，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)除包含在第167位(X5)和/或第175位(X7)的所述氨基酸取代外，还包含第98位(例如，SEQ ID NO:2中的X1)和/或第171位(例如，SEQ ID NO:2中的X6)的氨基酸取代。例如，所述FGF21变体(SEQ ID NO:2)可在天然FGF21序列(SEQ ID NO:1)的基础上至少包含第167位(X5)的所述氨基酸取代以及第98位(X1)的所述氨基酸取代。又例如，所述FGF21变体(SEQ IDNO:2)可在天然FGF21序列(SEQ ID NO:1)的基础上至少包含第167位(X5)的所述氨基酸取代以及第171位(X6)的所述氨基酸取代。在某些实施方式中，所述FGF21变体(SEQ ID NO:2)在天然FGF21序列(SEQ ID NO:1)的基础上至少包含第167位(X5)的所述氨基酸取代、第171位(X6)的所述氨基酸取代以及第98位(X1)的所述氨基酸取代。在某些实施方式中，所述FGF21变体(SEQ ID NO:2)在天然FGF21序列(SEQ ID NO:1)的基础上至少包含第175位(X7)的所述氨基酸取代以及第98位(X1)的所述氨基酸取代。在某些实施方式中，所述FGF21变体(SEQ ID NO:2)在天然FGF21序列(SEQ ID NO:1)的基础上至少包含第175位(X7)的所述氨基酸取代以及第171位(X6)的所述氨基酸取代。在某些实施方式中，所述FGF21变体(SEQ IDNO:2)在天然FGF21序列(SEQ ID NO:1)的基础上至少包含第175位(X7)的所述氨基酸取代、第98位(X1)的所述氨基酸取代以及第171位(X6)的所述氨基酸取代。在某些实施方式中，所述FGF21变体(SEQ ID NO:2)在天然FGF21序列(SEQ ID NO:1)的基础上至少包含第175位(X7)的所述氨基酸取代、第167位(X5)的所述氨基酸取代以及第171位(X6)的所述氨基酸取代。在某些实施方式中，所述FGF21变体(SEQ ID NO:2)在天然FGF21序列(SEQ ID NO:1)的基础上至少包含第175位(X7)的所述氨基酸取代、第167位(X5)的所述氨基酸取代以及第98位(X1)的所述氨基酸取代。在某些实施方式中，所述FGF21变体(SEQ ID NO:2)在天然FGF21序列(SEQ ID NO:1)的基础上至少包含第175位(X7)的所述氨基酸取代、第167位(X5)的所述氨基酸取代、第171位(X6)的所述氨基酸取代以及第98位(X1)的所述氨基酸取代。
在一些实施方式中，本申请的所述FGF21变体(例如，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)还包含第113位(例如，SEQ ID NO:2中的X2)、第114位(例如，SEQ ID NO:2中的X3)和/或第135位(例如，SEQ ID NO:2中的X4)的氨基酸取代。
所述第113位(X2)的氨基酸取代可为G113R。所述第114位(X3)的氨基酸取代可为L114Q。所述第135位(X4)的氨基酸取代可为R135C。
在某些实施方式中，本申请的所述FGF21变体(例如，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)除包含第167位(X5)和/或第175位(X7)的所述氨基酸取代，和/或第98位(例如，SEQ IDNO:2中的X1)和/或第171位(例如，SEQ ID NO:2中的X6)的所述氨基酸取代外，还包含第113位(例如，SEQ ID NO:2中的X2)、第114位(例如，SEQ ID NO:2中的X3)和/或第135位(例如，SEQ ID NO:2中的X4)的所述氨基酸取代。在某些实施方式中，所述FGF21变体(SEQ ID NO:2)在天然FGF21序列(SEQ ID NO:1)的基础上包含第167位(X5)、第175位(X7)、第98位(X1)、第171位(X6)、第113位(X2)、第114位(X3)和第135位(X4)的所述氨基酸取代。
在某些实施方式中，本申请所述的FGF21变体包含如SEQ ID NO：3-4和SEQ ID NO：34-37中任一项所示的氨基酸序列。
融合蛋白及蛋白质多聚体
在另一方面，本申请提供了融合蛋白，其包含本申请所述的FGF21变体。所述融合蛋白还可包含IgG恒定区结构域或其片段，且所述IgG恒定区结构域或其片段与所述FGF21变体融合，从而构成所述融合蛋白。
所述IgG恒定区结构域的片段可以为IgG恒定区结构域的一部分，但仍保留至少其部分活性。在一些实施方式中，IgG恒定区结构域或其片段包含或者为IgG4 Fc结构域。
在一些实施方式中，所述IgG4 Fc结构域包含如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述FGF21变体通过接头融合至所述IgG恒定区结构域或其片段。例如，所述FGF21变体的N端可与所述IgG恒定区结构域或其片段的C端直接或间接相连。在一些实施方式中，所述FGF21变体的N端通过第一接头与所述IgG恒定区结构域或其片段的C端相连。所述第一接头可包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:7)或GGGGSGGGGSGGGGSA(SEQ ID NO:8)。
在某些实施方式中，所述融合蛋白可包含下述任一项所示的氨基酸序列：：SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:26和SEQ ID NO:27。
在某些实施方式中，本申请所述的融合蛋白还包含GLP-1受体激动剂部分。所述GLP-1受体激动剂部分可包括GLP-1类似物。在一些实施方式中，所述GLP-1类似物包含SEQID NO:15或SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述融合蛋白包含本申请所述的FGF21变体，所述IgG恒定区结构域或其片段以及所述GLP-1受体激动剂部分。在某些实施方式中，所述GLP-1受体激动剂部分的C端与所述IgG恒定区结构域或其片段的N端直接或间接相连。在一些实施方式中，所述GLP-1受体激动剂部分的C端通过第二接头与所述IgG恒定区结构域或其片段的N端相连。在一些实施方式中，所述GLP-1受体激动剂部分的C端通过第二接头与IgG恒定区结构域或其片段的N端相连，且所述FGF21变体的N端通过第一接头与IgG恒定区结构域或其片段的C端相连。所述第一接头和所述第二接头可分别独立地包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述融合蛋白包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ IDNO：16-18。
另一方面，本申请提供了蛋白质多聚体，其包含两个或两个以上本申请所述的融合蛋白。在一些实施方式中，所述蛋白质多聚体为同源二聚体。例如，所述蛋白质多聚体可以由两个相同的本申请所述的融合蛋白构成。在某些实施方式中，所述蛋白质多聚体中的两个或更多个单体(即两个或更多个本申请所述的融合蛋白)主要通过非共价相互作用和/或二硫键彼此结合而构成所述蛋白质多聚体。
本申请所述的FGF21变体、融合蛋白、蛋白质多聚体或组合物(如药物组合物)可用于治疗代谢性疾病。所述代谢性疾病可选自糖尿病、肥胖和肝脂肪变性。在一些实施例中，所述代谢性疾病是糖尿病，例如II型糖尿病。在另一些实施方式中，所述代谢性疾病是肥胖症。其他实施方案包括代谢病况或代谢紊乱，例如血脂异常、高血压、肝脂肪变性，例如非酒精性脂肪肝(NASH)、心血管疾病，例如动脉粥样硬化、以及老化。
核酸分子、载体及细胞
在另一个方面，本申请提供了分离的核酸分子，其编码本申请所述的FGF21变体，或者本申请所述的融合蛋白。
所述核酸分子可以是RNA的形式，或者DNA的形式，所述DNA包括cDNA和合成的DNA。DNA可以是双链或单链的。编码本申请的FGF21变体或融合蛋白的编码序列可以由于遗传密码的冗余或简并性的结果而不同。所述核酸分子可包含：仅蛋白的编码序列；蛋白的编码序列和其他部分的编码序列，如引导序列或分泌序列或前蛋白序列；蛋白的编码序列和非编码序列，如内含子或蛋白的编码序列的5’和/或3’非编码序列等。因此，术语“编码蛋白的核酸分子”涵盖这样的多核苷酸，其可不仅仅包含蛋白或多肽的编码序列，还包括其他部分的编码序列和/或非编码序列。
在一些实施方式中，所述分离的核酸分子包含下述任一项所示的核酸序列：SEQID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25。
在另一个方面，本申请提供了载体，其包含本申请所述的核酸分子。所述载体(例如，表达载体)通常可作为附加体或作为宿主染色体DNA的整体的一部分在宿主生物体中复制。一般地，表达载体可含有选择性标记物，例如，四环素、新霉素和二氢叶酸还原酶等，以允许检测被期望的核酸分子转化的那些细胞。例如，pcDNA3.4载体。
在另一个方面，本申请还提供了细胞(例如宿主细胞)，其包含本申请所述的载体。所述细胞可包括，例如，哺乳动物细胞(如CHO、NS0、HEK293或COS细胞)；细菌细胞(如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescence))；或真菌或酵母细胞。在某些实施方式中，所述细胞为HEK293细胞或CHO细胞。
在另一个方面，本申请还提供了制备本申请所述的FGF21变体、本申请所述的融合蛋白或本申请所述的蛋白质多聚体的方法。所述方法包括：在允许所述FGF21变体、所述融合蛋白或所述蛋白质多聚体表达和/或形成的条件下培养本申请所述的细胞(例如，宿主细胞)。在某些实施方式中，所述制备方法还包括：回收经表达和/或形成的所述FGF21变体、所述融合蛋白或所述蛋白质多聚体。可以通过熟知的方法将含有目的核酸分子的载体转移至细胞(例如宿主细胞)中，这样的方法取决于所述细胞的类型而不同。例如，氯化钙转化通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其他宿主细胞。一般而言，可以在《MammalianCell Biotechnology：A Practical Approach》，M.Butler编(IRL Press，1991)和Sambrook等人的著作中找到将细胞培养生产力最大化的原理、方法和实践技术。
在另一个方面，本申请提供一种组合物(如药物组合物)，其包含本申请所述的FGF21变体、本申请所述的融合蛋白或本申请所述的蛋白质多聚体，以及任选地一种或多种药学上可接受的载体、辅料或赋形剂。所述组合物中可包含治疗有效量的本申请所述的FGF21变体、本申请所述的融合蛋白或本申请所述的蛋白质多聚体。
所述药学上可接受的载体、辅料或赋形剂优选在所采用的剂量和浓度下对受试者无毒性。
所述组合物可含有用于改变、保持或保存例如组合物的pH、同渗溶摩、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶出或释放速率、吸收或渗透的配制剂。可由技术人员根据例如预期给药途径、递送方式和所需剂量来确定合适的组合物制剂(参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences)。
可以选择将所述FGF21变体、融合蛋白或蛋白质多聚体组合物用于胃肠外递送。或者，可以选择组合物用于吸入或用于通过消化道递送，例如口服。这类药学上可接受的组合物的制备是本领域技术人员了解的。
当预期胃肠外给药时，用于本申请的组合物可以是无热原、胃肠外可接受的包含所需FGF21变体、融合蛋白或蛋白质多聚体与药学上可接受的溶媒的水溶液形式。对于胃肠外注射的特别合适的溶媒是无菌蒸馏水，其中将FGF21变体、融合蛋白或蛋白质多聚体配制成适当防腐的无菌等渗溶液。又一种制备物可包括所需分子与某种物质(例如可注射微球、可生物蚀解的颗粒、聚合物(例如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂质体)的制剂，所述物质提供用于控释或缓释产品，所述产品然后可通过积存注射递送。还可使用透明质酸，这可具有促进循环中持续时间延长的作用。用于引入所需分子的其它合适方法包括可植入递药装置。
在一个实施方案中，可以配制所述组合物用于吸入。例如，可将本申请所述的FGF21变体、融合蛋白或蛋白质多聚体制成吸入用干粉剂。还可用气溶胶递送用的抛射剂配制FGF21变体、融合蛋白或蛋白质多聚体吸入溶液剂。在又一个实施方案中，可使溶液剂雾化。国际公布号WO 94/20069中更多地描述了经肺给药，其描述了化学修饰蛋白质的经肺递送。
还考虑可口服给予某些制剂。在本申请的一个实施方案中，以这种方式给予的FGF21变体、融合蛋白或蛋白质多聚体可以用或不用常用于配制固体剂型(例如片剂和胶囊剂)中的载体来配制。例如，可以设计胶囊剂以使制剂的活性部分在胃肠道的生物利用度最大化且系统前降解最小化时的点上释放。可包括促进FGF21变体、融合蛋白或蛋白质多聚体吸收的其它物质。还可以使用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、助悬剂、片剂崩解剂和粘合剂。
另一种组合物可包含有效量的所述FGF21变体、融合蛋白或蛋白质多聚体与适用于片剂制备的无毒赋形剂的混合物。通过将片剂溶于无菌水或另一种合适的溶媒中，以单位剂型制备溶液剂。
也可提供其它类型的FGF21变体、融合蛋白或蛋白质多聚体组合物，例如，可包括在持续递送或受控递送制剂中包含FGF21变体、融合蛋白或蛋白质多聚体的制剂。配制多种其它持续递送或受控递送工具的技术，例如脂质体载体、可生物蚀解微粒或多孔珠粒和积存注射剂也为本领域技术人员所知(参见例如国际公布号WO 93/15722，该专利披露了用于药物组合物递送的多孔聚合微粒的控释，以及Wischke&Schwendeman，2008，Int.J.Pharm.364：298-327，和Freiberg&Zhu，2004，Int.J.Pharm.282：1-18，其论述了微球/微粒制剂和用途)。如本文所述的，水凝胶是持续递送或受控递送制剂的实例。
用于体内给药的所述FGF21变体、融合蛋白或蛋白质多聚体组合物通常应该是无菌的。这可通过除菌滤膜过滤实现。如果将组合物冻干，则采用该方法的除菌可在冻干和复溶之前或之后进行。用于胃肠外给药的组合物可以冻干形式保存，或者保存在溶液中。另外，一般将胃肠外组合物装入具有无菌入口的容器中，例如具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内注射用溶液袋或小瓶。
一旦制成组合物，便可将之作为溶液剂、混悬剂、凝胶剂、乳剂、固体剂或作为脱水粉剂或冻干粉剂保存在无菌小瓶中。这类制剂可以随时可用的形式或需要在给药前复溶的形式(例如冻干形式)保存。
在某些实施方式中，本申请涉及用于产生单剂量给药单位的药盒。药盒可各自含有具有干燥蛋白质的第一容器和具有含水制剂的第二容器两者。本申请的范围还包括包含单室预灌装注射器和多室预灌装注射器(例如液体剂注射器和冻干剂注射器(lyosyringe)的药盒)。
所述药物组合物的给药途径与已知方法一致，例如口服；通过静脉内、腹膜内、脑内(脑实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内、门静脉内或病灶内途径注射；通过缓释系统(其也可被注射)；或通过植入装置。需要时，可通过推注或连续通过输注，或者通过植入装置给予组合物。
备选地或另外地，可通过植入在其上已吸收或包封了所需活性成分的膜、海棉或其它合适的材料局部给予组合物。在使用植入装置时，可将该装置植入任何合适的组织或器官，并且可通过扩散、定时释药推注(timed-release bolus)或连续给药递送所需活性成分。
所述组合物可用于治疗代谢性疾病。在一些实施例中，所述代谢性疾病是糖尿病，例如2型糖尿病。在另一些实施方式中，所述代谢性疾病是肥胖症。其他实施方案包括代谢病况或代谢紊乱，例如血脂异常、高血压、肝脂肪变性，例如非酒精性脂肪肝(NASH)、心血管疾病，例如动脉粥样硬化、以及老化。
另一方面，本申请还提供了以下实施方式：
1.FGF21变体，其氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比包括一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代包括第167位处的氨基酸取代，其中所述第167位处的氨基酸取代为S167H。
2.根据实施方式1所述的FGF21变体，其中所述一个或多个氨基酸取代还包括选自下述的一个或多个位置处的氨基酸取代：第98位、第171位、第175位、第113位、第114位和第135位。
3.根据实施方式2所述的FGF21变体，其中所述一个或多个氨基酸取代包括氨基酸取代L98R。
4.根据实施方式2-3中任一项所述的FGF21变体，其中所述一个或多个氨基酸取代包括氨基酸取代P171A或P171G。
5.根据实施方式2-4中任一项所述的FGF21变体，其中所述一个或多个氨基酸取代包括氨基酸取代R175L、R175P或R175H。
6.根据实施方式2-5中任一项所述的FGF21变体，其中所述一个或多个氨基酸取代包括氨基酸取代G113R。
7.根据实施方式2-6中任一项所述的FGF21变体，其中所述一个或多个氨基酸取代包括氨基酸取代L114Q。
8.根据实施方式2-7中任一项所述的FGF21变体，其中所述一个或多个氨基酸取代包括氨基酸取代R135C。
9.根据实施方式1-8中任一项所述的FGF21变体，其中所述一个或多个氨基酸取代包含下述任一组所示氨基酸位置处的氨基酸取代：
a)L98、S167和P171；
b)L98、S167、P171和R175；以及，
c)L98、G113、L114、R135、S167、P171和R175。
10.根据实施方式1-9中任一项所述的FGF21变体，其包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：3-4和SEQ ID NO：34-37。
11.融合蛋白，其包含实施方式1-10中任一项所述的FGF21变体。
12.根据实施方式11所述的融合蛋白，其还包含IgG恒定区结构域或其片段。
13.根据实施方式12所述的融合蛋白，其中所述IgG恒定区结构域或其片段包括IgG4 Fc结构域。
14.根据实施方式13所述的融合蛋白，其中所述IgG4 Fc结构域包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：5-6。
15.根据实施方式12-14任一项所述的融合蛋白，其中所述FGF21变体的N端与所述IgG恒定区结构域或其片段的C端直接或间接相连。
16.根据实施方式15所述的融合蛋白，其中所述FGF21变体的N端通过第一接头与所述IgG恒定区结构域或其片段的C端相连。
17.根据实施方式16所述的融合蛋白，其中所述第一接头包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：7-8。
18.根据实施方式11-17中任一项所述的融合蛋白，其包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：9-14和SEQ ID NO：26-27。
19.根据实施方式11-18中任一项所述的融合蛋白，其还包含GLP-1受体激动剂部分。
20.根据实施方式19所述的融合蛋白，其中所述GLP-1受体激动剂部分包含GLP-1类似物。
21.根据实施方式19-20中任一项所述的融合蛋白，其中所述GLP-1受体激动剂部分包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：28。
22.根据实施方式19-21中任一项所述的融合蛋白，其包含所述IgG恒定区结构域或其片段以及所述GLP-1受体激动剂部分，并且所述GLP-1受体激动剂部分的C端与所述IgG恒定区结构域或其片段的N端直接或间接相连。
23.根据实施方式22所述的融合蛋白，其中所述GLP-1受体激动剂部分的C端通过第二接头与所述IgG恒定区结构域或其片段的N端相连。
24.根据实施方式23所述的融合蛋白，其中所述第二接头包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：7-8。
25.根据实施方式19-24中任一项所述的融合蛋白，其包含所述IgG恒定区结构域或其片段、所述GLP-1受体激动剂部分以及所述FGF21变体，并且所述FGF21变体的N端与所述IgG恒定区结构域或其片段的C端直接或间接相连。
26.根据实施方式25所述的融合蛋白，其中所述GLP-1受体激动剂部分的C端通过所述第二接头与所述IgG恒定区结构域或其片段的N端相连，且所述FGF21变体的N端通过所述第一接头与所述IgG恒定区结构域或其片段的C端相连。
27.根据实施方式25-26中任一项所述的融合蛋白，其包含下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：16-18。
28.蛋白质多聚体，其由两个以上实施方式11-27中任一项所述的融合蛋白构成。
29.根据实施方式28所述的蛋白质多聚体，其为同源二聚体。
30.分离的核酸分子，其编码实施方式1-10中任一项所述的FGF21变体或实施方式11-27中任一项所述的融合蛋白。
31.载体，其包含实施方式30所述的分离的核酸分子。
32.细胞，其包含实施方式31所述的载体。
33.制备实施方式1-10中任一项所述的FGF21变体、实施方式11-27中任一项所述的融合蛋白或实施方式28-29中任一项所述的蛋白质多聚体的方法，所述方法包括：在允许所述FGF21变体、所述融合蛋白或所述蛋白质多聚体表达和/或形成的条件下培养实施方式32所述的细胞。
34.根据实施方式33所述的方法，其进一步包括：回收经表达和/或形成的所述FGF21变体、所述融合蛋白或所述蛋白质多聚体。
35.药物组合物，其包含实施方式1-10中任一项所述的FGF21变体、实施方式11-27中任一项所述的融合蛋白或实施方式28-29中任一项所述的蛋白质多聚体，以及任选地一种或多种药学上可接受的载体。
36.实施方式1-10中任一项所述的FGF21变体、实施方式11-27中任一项所述的融合蛋白或实施方式28-29中任一项所述的蛋白质多聚体在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗代谢性疾病。
37.根据实施方式36所述的用途，其中所述代谢性疾病选自糖尿病、肥胖和肝脂肪变性。
实施例
通过下列实施例进一步理解本申请，这些实施例仅为本申请的示例。本申请在范围上不受限于所例示的实施方案，所述实施方案仅旨在说明本申请的单一方面。任何在作用上等价的方法都包括在本申请范围之内。根据上文的描述和附图，除本文所述之外的对本申请的各种修改对于本领域的技术人员是显而易见的。这些修改也在附属权利要求范围之内。
实施例1：融合蛋白S1-S8表达载体的构建
Figure BDA0003787966020000211
表3
委托苏州金唯智生物科技有限公司合成目的基因(该目的基因5’端依次包含人IgG4的Fc、连接子和FGF21变体，该目的基因编码的融合蛋白S1-S7的氨基酸序列参见表3)，在37℃条件下，利用内切酶HindⅢ和EcoRⅠ(TAKARA，Japan)消化处理目的基因序列和载体质粒pcDNA3.4，采用Gel Extraction Kit试剂盒按厂商说明纯化回收消化产物。利用DNALigation Kit Ver.2.1(TAKARA，Japan)按厂商说明将纯化回收的目的基因和载体连接，16℃恒温处理1小时，得到重组表达质粒。
将上述重组表达质粒转化到感受态细胞DH5a中，取菌体涂布氨苄平板。挑取平板上的单克隆于1ml LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L和琼脂2％，抗生素含量100μg/mL)中培养后提取质粒，经广州艾基生物技术有限公司测序验证正确，采用Invitrogen质粒大提试剂盒提取一系列经验证正确的表达载体，用限制性内切酶PvuⅠ酶切(TAKARA，Japan)，进行线性化后利用乙醇沉淀方法纯化回收，-20℃保藏备用。
实施例2：融合蛋白S1-S8的表达
将HEK293F宿主细胞(Invitrogen，Freestyle 293F)用293 Expression Medium培养基复苏培养，当细胞密度约1×106个细胞/mL时对宿主细胞进行转染。转染约3×107个细胞，实施例1制备的线性化表达载体约37.5μg，采用FreeStyleTM MAX Reagent转染试剂盒进行。转染后细胞于30mL的293 Expression Medium培养基中培养。培养第二天，开始使用遗传霉素G418(Merck)对转化子进行筛选，根据细胞生长情况，每3天更换一次培养基，约14天后，可见有抗性的克隆出现，可进行扩大培养。细胞传代密度约0.5×106个细胞/mL，对获得的混合克隆株用293 Expression Medium培养基进行传代培养。当细胞存活率约90％时，收集细胞培养液。
实施例3：融合蛋白S1-S8的纯化
将实施例2制备的细胞培养液在200g下离心10min，取上清在8000rpm下离心30min后，收集上清，利用Protein A层析柱(EzFast Protein A Diamond，博格隆)对离心后的细胞培养液上清进行亲和纯化，平衡液为20mM PBS，0.15M NaCl，pH7.4；洗脱液为0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH3.2，收集目标吸收峰下蛋白洗脱液，用PBS缓冲液透析后取部分样品进行质谱检测，质谱(Accurate-Mass Q-TOF LC/MS，型号G6530，Agilent Technologies)检测分子量，与理论分子量一致，且为同源二聚体形式。同时对收集的样品经还原与非还原后通过10％SDS-PAGE电泳检测。以融合蛋白S2为例，其纯化结果显示在图12中。其中第1泳道为蛋白分子量标记物，第5泳道为融合蛋白S2发酵上清液，第6泳道为纯化后的融合蛋白S2，而第7泳道为还原后的融合蛋白S2。
实施例4：ELISA法检测融合蛋白与靶标的结合能力
首先，将10μgβKlotho蛋白(AVIVA SYSTEMS BIOLOGY)溶解于10ml蛋白包被液(碳酸盐缓冲液pH9.6)中，混合均匀后在ELISA板的各孔中分别加入100μL，4℃下放置过夜。然后除去包被液，用PBST溶液洗涤4次，各孔中加入200μL封闭液(5g脱脂奶粉加入到100mlPBS溶液)，在37℃下孵育，2h后，除去封闭液，各孔加入不同浓度的融合蛋白样品100μL，用自封袋封好后在37℃下放置，2h后，用PBST溶液洗涤4次，加入100μL的Anti-Human IgG4Fc-HRP(1/1000)(Abcam)，在37℃下孵育1h。最后，用PBST溶液洗涤4次，加入高敏感的TMB底物100μL，2min后加入50μL的终止夜(2M H2SO4)结束反应，用酶标仪测定各孔的OD值读数。
结果如图3和图4所示。图3显示，融合蛋白S7随着浓度的降低与靶标的结合能力显著下降，而与S7相比，增加第167位和/或第175位的氨基酸取代后，融合蛋白S1\S2\S4\S5与靶标的结合能力显著增强。S1\S2\S4\S5在100μg/mL～0.8μg/mL浓度范围内与靶标结合能力均可维持在较高水平，表明第167位和175位与靶标结合能力密切相关。图4显示，增加第113位、114位以及135位的氨基酸取代，融合蛋白与靶标的结合能力依然维持在较高水平。
实施例5：fortebio方法检测融合蛋白与靶标的结合能力
将各融合蛋白样品用缓冲液(PBS缓冲液100ml，加入0.1gBSA搅拌至充分溶解，再加入20μL的吐温20，混合均匀)稀释至40nM，加入到样品板的各孔中，通过亲和力检测系统(OCTET RED 96 SYSTEM)，用带有streptavidin(链霉亲和素)的探针结合生物素化的βKlotho(25nM，AVIVA SYSTEMS BIOLOGY)蛋白后，自动检测其与各融合蛋白的结合情况，结果见表4。KD值越低代表融合蛋白与靶点的结合能力越强。表4显示，与融合蛋白S7相比，增加第167位氨基酸取代的融合蛋白S1与靶标的结合能力有很大提高，在进一步增加第175位的氨基酸取代后，如融合蛋白S2，与靶标的结合能力是S7的2倍。
融合蛋白样品 SEQ ID NO: 浓度(nM) 响应值 KD(M)
S1 9 40 0.1695 <![CDATA[6.30×10<sup>-10</sup>]]>
S7 26 40 0.1428 <![CDATA[8.73×10<sup>-10</sup>]]>
S2 10 40 0.1898 <![CDATA[4.29×10<sup>-10</sup>]]>
表4
实施例6：融合蛋白D1-D3表达载体的构建
Figure BDA0003787966020000231
表5
首先，利用PCR扩增获得上游片段(包含GLP-1部分)和下游片段(Fc-FGF21)，PCR扩增程序为：98℃，预变性5min；98℃，变性10s；56℃退火10s；72℃延伸5s或10s；重复30个循环；72℃继续延伸8min。然后用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并用OMEGA胶回收试剂盒回收上游片段和下游片段。将获得的上游片段与下游片段通过SOE PCR获得全长序列。SOE PCR扩增程序为：98℃，预变性5min；98℃，变性10s；56℃退火10s；72℃延伸15s；重复30个循环；72℃继续延伸8min。然后用Gel Extraction Kit试剂盒(OMEGA，America)回收全长目的基因。
在37℃条件下，利用内切酶HindⅢ和EcoRⅠ(TAKARA，Japan)消化处理全长目的基因序列和载体质粒pcDNA3.4，采用Gel Extraction Kit试剂盒(OMEGA，America)按厂商说明纯化回收消化产物。利用DNA Ligation Kit Ver.2.1(TAKARA，Japan)按厂商说明将纯化回收的目的基因和载体连接，16℃恒温处理1小时，得到重组表达质粒。
将上述重组表达质粒转化到感受态细胞DH5a中，取菌体涂布氨苄平板。挑取平板上的单克隆于1ml LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L和琼脂2％，抗生素含量100μg/mL)中培养后提取质粒，经测序验证正确后，采用Invitrogen质粒大提试剂盒提取一系列经验证正确的表达载体，用限制性内切酶PvuⅠ(TAKARA，Japan)酶切，进行线性化后利用乙醇沉淀方法纯化回收，-20℃保藏备用。
实验过程中用到的引物如下：
上游片段(包含GLP-1部分)扩增引物：
引物AUZ-F：cccaagcttgccgccaccatgaccagactgaccgtgc(SEQ ID NO:29)
引物lfc1-R：gccgtacttgctctcagatccaccgcctccgcttc(SEQ ID NO:30)
下游片段(Fc-FGF21)扩增引物：
引物lfc1-F：gcggaggcggtggatctgagagcaagtacggccc(SEQ ID NO:31)
引物fgf21-R：ccggaattctcatcagctggcgtagctagggct(SEQ ID NO:32)
SOE PCR引物：
引物AUZ-F cccaagcttgccgccaccatgaccagactgaccgtgc(SEQ ID NO:29)
引物fgf21-R：ccggaattctcatcagctggcgtagctagggct(SEQ ID NO:32)
实施例7：融合蛋白D1-D3的表达
将HEK293F宿主细胞(Invitrogen，Freestyle 293F)用293 Expi Medium培养基复苏培养，当细胞密度约1×106个细胞/mL时对宿主细胞进行转染。转染细胞约3×107细胞，线性化表达实施例6构建的载体约30μg，采用Expi Fectamine293 Reagent转染试剂盒进行。转染后细胞于30mL的293 Expi Medium培养基中培养。培养第二天，开始使用遗传霉素G418(merck)对转化子进行筛选，根据细胞生长情况，每3天更换一次培养基，约14天后，可见有抗性的克隆出现，可进行扩大培养。细胞传代密度约0.5×106细胞/mL，对获得的混合克隆株用293 Expression Medium培养基进行传代培养。当细胞存活率约90％时，收集细胞培养液。
实施例8：融合蛋白D1-D3的纯化
将实施例7制备的细胞培养液在200g下离心10min，取上清在8000rpm下离心30min后，收集上清，利用Protein A层析柱(EzFast Protein A Diamond，博格隆)对离心后的细胞培养液上清进行亲和纯化，平衡液为20mM PBS，0.15M NaCl，pH7.4；洗脱液为0.1M甘氨酸洗脱pH3.2，收集目标吸收峰下蛋白洗脱液，用PBS缓冲液透析后取部分样品进行质谱检测，质谱(Accurate-Mass Q-TOF LC/MS，型号G6530，Agilent Technologies)检测分子量，与理论分子量一致，且为同源二聚体形式。同时对收集的样品经还原与非还原后通过10％SDS-PAGE电泳检测。以融合蛋白D2为例，其纯化结果显示在图12中。其中第1泳道为蛋白分子量标记物，第2泳道为融合蛋白D2发酵上清液，第3泳道为纯化后的融合蛋白D2，而第4泳道为还原后的融合蛋白D2。
实施例9：db/db小鼠模型中融合蛋白S1/S7/S8的降糖及保护肝功能药效研究
融合蛋白在db/db小鼠模型(南京大学模式动物研究所)中的药效研究。实验过程为对纯化的融合蛋白用10mM的PBS稀释，对符合实验要求的db/db小鼠随机选择分组，共4组，包括溶媒组，S7组(SEQ ID NO：26)、S1组(SEQ ID NO：9)，S8组(SEQ ID NO：27)，按每只db/db小鼠注射40nM/kg相应的融合蛋白进行计算给药，给药体积为10ml/kg，每个融合蛋白注射9只小鼠，每周给药一次，给药两周。给药后临床观察血糖变化情况(结果见图5)。与S8组相比，给药后第一天和给药第二天，S1组显示出快速降低血糖的作用，同时S1组显示出更平稳的降糖效果。与S7组相比，S1组具有更好的降糖效果。
给药两周后，处死小鼠，检测其血液谷草转氨酶(AST)及谷丙转氨酶(ALT)水平(结果见图6)，以评价药物对肝功能保护作用。数据显示，S7组及S1组显著降低了谷草转氨酶(AST)及谷丙转氨酶(ALT)水平，显示出对肝脏的保护作用。
可见，S1组相对于S7组在降糖及护肝方面均显示出更优的效果。
实施例10：db/db小鼠模型中融合蛋白S1/S2的单次降糖药效研究
db/db模型小鼠(南京大学模式动物研究所)随机分成3组，包括溶媒组，S1组(SEQID NO：9)，S2组(SEQ ID NO：10)，按每只db/db小鼠注射40nM/kg的相应融合蛋白进行计算给药，给药体积为10ml/kg，每个融合蛋白注射9只小鼠，给药一次，给药后临床观察血糖变化情况(结果见图7)。由图7的结果可知，与溶媒组相比，S1组与S2组均能显著降低血糖，S2组显示出相对更优的降糖效果。
实施例11：db/db小鼠模型中融合蛋白D1/D2的降糖及降脂药效研究
db/db模型小鼠(南京大学模式动物研究所)随机分成4组，包括溶媒组，D1组(SEQID NO：16)，D2组(SEQ ID NO：17)，按每只db/db小鼠注射30nM/kg的相应融合蛋白进行计算给药，给药体积为10ml/kg，每个融合蛋白注射9只小鼠，每周给药一次，给药2周。给药后临床观察血糖变化情况(结果见图8)。由图8可知，融合蛋白D1和D2均表现出了较强的降糖能力。
初次给药14天后，检测血清甘油三酯(TG)结果见图9、总胆固醇(TCHO)结果见图10。结果表明，融合蛋白D1和D2具有显著的降甘油三酯及降总胆固醇的效果。
实施例12：融合蛋白D2、杜拉鲁肽在ob/ob小鼠模型中的降糖药效果研究
融合蛋白在ob/ob小鼠模型中(南京大学模式动物研究所)的药效研究，实验过程为对纯化的一系列相应融合蛋白用10mM的PBS稀释，小鼠随机分成4组，包括溶媒组，D2组(SEQ ID NO：17)10nmol/kg、D2组(SEQ ID NO：17)20nmol/kg、杜拉鲁肽(Lily)20nmol/kg组，给药体积为10ml/kg，每个融合蛋白注射9只小鼠，每周给药两次，连续给药3周。每次给药前取样检测血糖变化情况见图11。结果显示，与杜拉鲁肽相比，融合蛋白D2具有更好的降糖效果，且降糖曲线更加平稳。
实施例13表达载体Plasmid-X1的构建
委托苏州金唯智生物科技有限公司合成目的基因(该目的基因依次如表6所示)，在37℃条件下，利用内切酶HindⅢ和EcoRⅠ(TAKARA，Japan)消化处理目的基因序列和载体质粒pCDNA3.4，采用Gel Extraction Kit试剂盒按厂商说明纯化回收消化产物。利用DNALigation Kit Ver.2.1(TAKARA，Japan)按厂商说明将纯化回收的目的基因和载体连接，16℃恒温处理1小时，得到重组表达质粒。
将上述重组表达质粒转化到感受态细胞DH5a中，取菌体涂布氨苄平板。挑取平板上的单克隆于1ml LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L和琼脂2％，抗生素含量100μg/L)中培养后提取质粒，经广州艾基生物技术有限公司测序验证正确，采用Invitrogen质粒大提试剂盒提取一系列经验证正确的表达载体，用限制性内切酶PvuⅠ酶切(TAKARA，Japan)，进行线性化后利用乙醇沉淀方法纯化回收，-20℃保藏备用。
目的基因编码的融合蛋白的名称 融合蛋白的氨基酸序列
D3 SEQ ID NO:18
S3 SEQ ID NO:11
FGF21突变体对照融合蛋白SPC SEQ ID NO:33
S2 SEQ ID NO:10
表6
实施例14融合蛋白表达载体转染细胞并表达
将HEK293F宿主细胞(Invitrogen，Freestyle 293F)用293 Expi Medium培养基复苏培养，当细胞密度约1×106细胞/mL时对宿主细胞进行转染。转染细胞约3×107细胞，线性化表达实施例13制备的载体各约30μg，采用Expi Fectamine293 Reagent转染试剂盒进行。转染后细胞于30mL的293 Expi Medium培养基中培养。培养第二天，开始使用遗传霉素G418(merck)对转化子进行筛选，根据细胞生长情况，每3天更换一次培养基，约14天后，可见有抗性的克隆出现，可进行扩大培养。细胞传代密度约0.5×106个细胞/mL，对获得的混合克隆株用293Expression Medium培养基进行传代培养。当细胞存活率约90％时，收集细胞培养液。
实施例15收集细胞发酵培养液纯化融合蛋白
将实施例14获得的细胞培养液在200g下离心10min，取上清在8000rpm下离心30min后，收集上清，利用Protein A层析柱(EzFast Protein A Diamond，博格隆)对离心后的细胞培养液上清进行亲和纯化，平衡液为20mM PBS，0.15M NaCl，pH7.4；洗脱液为0.1M甘氨酸洗脱pH3.2，收集目标吸收峰下蛋白洗脱液，用PBS缓冲液透析后取部分样品进行质谱检测，质谱(Accurate-Mass Q-TOF LC/MS，型号G6530，Agilent Technologies)检测分子量，与理论分子量一致，且为同源二聚体形式。同时对收集的样品经还原与非还原后通过10％SDS-PAGE电泳检测。结果如图13所示。图13中泳道1-10依次为SPC、S3、D3、S2、Marker、DTT处理的SPC、DTT处理的S3、DTT处理的D3、DTT处理的S2和Marker。
实施例16：db/db小鼠模型中融合蛋白的降糖及改善血脂药效研究
融合蛋白D3和D2在db/db小鼠模型(江苏集萃药康生物科技有限公司)中的药效研究。实验过程为对纯化的融合蛋白用10mM的PBS稀释，对符合实验要求的db/db小鼠随机选择分组，共3组，包括溶媒组，融合蛋白D3和D2按每只db/db小鼠注射10nM/kg相应的融合蛋白进行计算给药，给药体积为10ml/kg，每个融合蛋白注射9只小鼠，每周给药一次，给药两周。给药后临床观察血糖、体重和摄食量的变化情况(结果见图14)。与溶媒对照组相比，具有降血糖活性。
实施例17：ob/ob小鼠模型中融合蛋白的降糖及改善血脂药效研究
融合蛋白在ob/ob小鼠模型(江苏集萃药康生物科技有限公司)中的药效研究。实验过程为对纯化的融合蛋白用10mM的PBS稀释，对符合实验要求的ob/ob小鼠随机选择分组，共6组，包括对照组(仅PBS缓冲液)，S2，S1，S7，S3和SPC，按每只ob/ob小鼠注射20nM/kg相应的融合蛋白进行计算给药，给药体积为10ml/kg，每个融合蛋白注射8只小鼠，单次给药。给药后临床观察血糖、体重和摄食量的变化情况(结果见图15)。与对照组相比，S1、S2、S3在给药后24h显示出较弱的降糖效应；S1、S2、S3、SPC均在给药后48h显示较强的降糖效果(P<0.001、P<0.05)，其中S2的降糖效应维持到120h(P<0.01，P<0.001)，其他仅维持到给药后96h，降糖幅度上S1略优。S7除在给药72h显示较强的降糖效应外，其他时间均未显示明显降糖效应。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。

Claims (10)

1.GLP-1/Fc/FGF21融合蛋白在制备降糖或降脂相关疾病的药物中的应用；
所述的FGF21部分，其氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比包括一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代包括选自下述的一个或多个氨基酸取代：L98R；S167H；P171A或P171G；R175L、R175P或R175H；G113R；L114Q和R135C；
所述GLP-1受体激动剂部分，具有下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：15和SEQID NO：28；
所述的Fc部分为人IgG的Fc或其功能性变体，具有下述任一项所示的氨基酸序列：SEQID NO：5-6。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述FGF21部分包含下述任一组所示氨基酸位置处的氨基酸取代：
a)L98、S167和P171；
b)L98、S167、P171和R175；或，
c)L98、G113、L114、R135、S167、P171和R175。
3.根据权利要求1-2任一项所述的应用，其中所述FGF21部分具有下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：3-4和SEQ ID NO：34-37。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述FGF21变体的N端与所述Fc部分的C端通过连接子相连，所述GLP-1或其功能性变体的C端与Fc部分的N端通过连接子相连，所述的连接子为GS连接子。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其中所述的融合蛋白具有下述任一项所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：16-18。
6.一种分离的核酸分子在制备降糖或降脂相关疾病的药物中的应用，所述分离的核酸分子编码权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白。
7.一种载体在制备降糖或降脂相关疾病的药物中的应用，所述载体包含权利要求6所述的分离的核酸分子。
8.一种细胞在制备降糖或降脂相关疾病的药物中的应用，所述细胞包含权利要求7所述的载体。
9.根据权利要求1-8任一项的应用，其特征在于，所述药物为药物组合物，其可包含治疗有效量的所述的双靶融合蛋白，以及任选地药学上可接受的佐剂。
10.根据权利要求1-9任一项的应用，其特征在于，所述降糖或降脂相关疾病为2型糖尿病、肥胖、非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪肝炎和肝脂肪变性。
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