KR20170049320A - 이중 작용 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생리활성 단백질과 FGF21 변이체 단백질이 면역글로불린의 Fc에 결합되어 약리학적 효능, 체내 지속성 및 단백질의 안정성이 개선된 이중 작용 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 이중 작용 단백질은 개선된 약리학적 효능, 체내 지속성 및 단백질의 안정성을 나타내며, 상기 이중 작용 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 당뇨병, 비만 질환, 이상지질혈증, 대사질환, 비알콜성 지방간 질환, 비알콜성 지방간염 또는 심혈관계 질환을 위한 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

이중 작용 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물{DUAL FUNCTION PROTEINS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE SAME}
본 발명은 생리활성 단백질과 FGF21 변이체 단백질을 포함하는 이중 작용 단백질, 및 이를 포함한 약학적 조성물에 대한 것이다.
글루카곤 유사 펩타이드-1(glucagon-like peptide-1; GLP-1)은 장관 내 L 세포에서 음식물 등의 자극을 받아 분비되는 31개의 아미노산으로 구성된 인크레틴(incretin) 호르몬이다. 췌장의 베타 세포, 뇌 등 타겟 조직에 발현되어 있는 G단백질 결합 단백질 수용체인 GLP-1 수용체를 통하여 세포 내로 신호를 전달하여 활성을 나타낸다. 혈중 분비된 GLP-1은 생체 내 반감기가 2분 이내로 아주 짧은 반감기를 가지는데, 이는 체내의 디펩티딜 펩디데이즈-4(dipeptidyl peptidase-4; DPP-4) 효소에 의한 N-말단 아미노산 절단으로 인한 활성 상실에 기인한다. GLP-1은 췌장의 베타 세포에서 혈중 포도당 농도에 따른 인슐린 분비를 촉진시키기 때문에 저혈당을 유발하지 않으면서 강력한 혈당 강하 작용을 보인다. 또한 GLP-1 투여 시 다양한 동물 모델 및 사람에서 체중 감소가 일어나는데, 이는 GLP-1의 식욕 억제 효과로 인한 음식물 섭취 감소에 기인하다고 알려져 있다. GLP-1은 췌장의 베타 세포에 발현되어 있는 GLP-1 수용체를 통하여 당·지질 독성으로 인한 베타 세포의 사멸 억제를 통한 생존력 증가 및 베타 세포의 증식 촉진을 유도한다. 글루카곤의 과도한 분비는 혈당을 증가시켜 당뇨병 환자에게 나타나는 고혈당 현상의 원인 중 하나로 알려져 있다. 또한, GLP-1은 췌장의 알파 세포에 작용하여 단백질 인산화효소 A(protein kinase A; PKA) 단백질 특이적인 글루카곤 분비 억제를 통하여 공복 혈당 상승을 억제한다고 알려져 있다.
임상적으로 중요한 GLP-1 수용체 효능제는 엑센딘-4(exendin-4)이다. 엑센딘-4는 길라 몬스터(Gila Monster) 도마뱀의 타액선에서 생성된 39개 잔기 폴리펩티드이다. 엑센딘-4는 GLP-1과 52% 아미노산 서열 상동성을 공유하고, 포유동물에서 GLP-1 수용체와 상호작용하는 것으로 알려져 있다(Thorens et al. (1993) Diabetes 42:1678-1682). 시험관 내에서, 엑센딘-4는 인슐린 생성 세포에 의한 인슐린 분비를 촉진하는 것으로 나타났고, 등몰량으로 주어진 경우, 인슐린 생성 세포로부터 인슐린 방출을 유도하는데 있어서 GLP-1보다 강력하다. 또한, 엑센딘-4는 설치류 및 인간 둘 다에서 인슐린 방출을 강력하게 자극하여 혈장 글루코스 수준을 감소시키고, GLP-1보다 오래 작용하지만, 엑센딘-4는 포유동물에서 자연적으로 발생하지 않기 때문에, 이는 GLP-1이 결핍된 포유동물에서 특정한 잠재적 항원 특성을 갖는다.
인간에게 글루코스 조절을 개선하는 GLP-1 및 엑센딘-4 유사체(예를 들어, 리라글루티드(liraglutide) 및 바이에타(byetta))의 능력은 임상에서 확인된 바 있다. 또한, GLP-1은 유도된 증식과 아팝토시스의 억제를 통해 베타 세포 질량을 증가시키는 것으로 보고된 바 있다. 나아가, GLP-1은 식욕을 감소시키는 포만감 신호를 제공하면서 위에서의 산 분비 및 위 배출을 억제하는 장 호르몬으로 작용하는 것이 보고된 바 있다. GLP-1의 이러한 효과는 제2형 당뇨병 환자에게 GLP-1 유사체를 투여하였을 때 관찰된 유익한 체중 감소를 설명할 수 있다. 또한, GLP-1은 허혈 후 설치류 심장에서 심장보호작용을 하는 것으로 나타났다.
지속형 GLP-1 유사체를 개발하기 위해서도 다양한 연구가 시도되었으며, 임상적으로 확인된 지속형 GLP-1 유사체는 둘라글루티드(WO 2005/000892)와 알비글루티드(WO 2003/059934)가 있다. 상기 둘라글루티드는 Fc 융합 GLP-1 유사체이며, 알비글루티드는 알부민 융합 GLP-1 유사체로, 인간에게 1주에 1회 주사할 수 있는 약물동태 프로필을 나타낸다. 두 약물 모두 주 1회 투여만으로 우수한 혈당 강하 효과와 체중 감소 효과를 나타내며, 바이에타 또는 리라글루티드에 비해 치료 편의성이 크게 개선되었다.
한편, 섬유모세포 성장 인자 21(fibroblast growth factor 21; FGF21)은 간에서 합성되며 글루코스 및 지질 항상성에 있어서 중요한 역할을 한다고 알려진 호르몬이다. FGF21은 FGF21 특이적 수용체인 FGF 수용체와 베타-클로토(β-klotho) 복합체가 같이 발현되는 간, 지방, 췌장의 베타 세포, 뇌의 시상 하부 및 근육에서 그 약리 작용을 나타낸다. 현재까지 다양한 당뇨병 및 비만 질환 마우스와 원숭이에서 FGF21은 인슐린 비의존적으로 혈중 글루코스 농도를 저하시키고, 체중을 감소시키며, 혈중 트리글리세리드 및 저비중리포단백질(Low-density lipoprotein, LDL)의 농도를 감소시켰다. 또한 인슐린 감수성 개선 효과도 가져 새로운 항 당뇨병·비만 치료제 타깃으로 잠재성을 가질 수 있음이 알려져 있다(WO 2003/011213).
이에 따라 FGF21을 타깃으로 하는 새로운 항 당뇨병 약제 개발을 위해, 야생형 FGF21을 기반으로 일부 아미노산을 치환, 도입, 제거하여 FGF21 돌연변이를 제작함으로서, FGF21의 생물학적 활성 및 생체 내 안정성을 개선한 시도가 있었다(WO 2010/065439). 그러나, FGF21을 생물치료제로서 직접 사용하는 것과 연관된 문제점은 그의 반감기가 매우 짧다는 것이다(Kharitonenkov, A. et al. (2005) Journal of Clinical Investigation 115:1627-1635). FGF21의 생체 내 반감기는 마우스에서 1 내지 2시간, 원숭이에서 2.5 내지 3시간으로 짧기 때문에 FGF21을 당뇨병 치료제로 개발한다면 매일 투여를 해야 하는 단점이 있다.
현재까지 FGF21 재조합 단백질의 생체 내 반감기를 증가시키기 위하여 다양한 기술들이 보고되었다. FGF21에 고분자 물질인 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)을 연결하여 분자량을 증가시켜, 신장 배설을 억제함으로써 체내 잔류 시간을 증가시킨 예가 있다(WO 2012/066075). 나아가, FGF21 분자에 인간 알부민에 결합하는 지방산을 융합시켜 반감기를 향상시킨 예도 있다(WO 2012/010553). 또한, 인간 FGF 수용체 단독 또는 베타-클로토와의 복합체에 특이적으로 결합하는 아고니스트 항체를 만들어 FGF21의 작용기전과 동일한 약리학적 활성을 나타내면서 반감기를 증가시킨 예도 있다(WO 2012/170438). 나아가, FGF21 분자에 면역글로불린 IgG의 Fc를 연결한 지속형 융합 단백질을 만들어 반감기를 향상시킨 예도 있다(WO 2013/188181).
여러 지속형 기술 중 Fc 융합 기술은 체내 반감기가 증가하면서 독성이나 면역반응 유발과 같은 부작용 우려가 적다는 점에서 가장 많이 활용되고 있다. Fc 융합 FGF21 단백질을 지속형 치료용 약물로 개발하기 위해서는 다음과 같은 여러 조건을 충족해야 한다.
첫째, 융합에 의한 시험관 내 활성 감소가 적어야 한다. FGF21의 N 말단과 C 말단은 모두 FGF21 활성에 관여한다. 이에 따라 융합 위치에 따라 FGF21 융합 단백질의 활성이 크게 달라진다고 알려져 있다. 따라서 FGF21에 돌연변이가 도입된 Fc 융합 FGF21 단백질의 활성은 융합 여부 또는 위치에 따라 달라질 수 있다. 둘째, 융합에 의해 체내 반감기가 증가하여, 인간에서 주1회 간격으로 투여할 수 있는 약물동태 프로필을 나타내야 한다. 셋째, 대부분의 바이오의약품의 경우 환자에서 면역원성이 발생할 수 있다는 점을 감안하면, 융합 링커 또는 돌연변이에 의한 면역원성 위험성이 적어야 한다. 넷째, 융합 위치나 돌연변이 도입에 의한 안정성 문제가 없어야 한다. 다섯째, 융합한 면역글로불린의 종류(isotype)에 따라 원치 않는 면역 반응을 야기할 수 있기 때문에 이에 대한 대안이 필요하다.
FGF21 분자에 면역글로불린 IgG의 Fc를 연결하여 지속형 융합 단백질로 개발하려는 시도는 이미 보고된바 있다(WO 2013/188181). 야생형 FGF21의 N 말단에 Fc가 융합된 Fc-FGF21 구조의 경우, 시험관 내 활성은 야생형 FGF21 대비 큰 차이가 나지 않지만, 생체 내 단백질 분해작용에 의해 반감기가 매우 짧은 것으로 알려져 있다. 이를 개선하기 위해 FGF21의 특정 위치에 단백질 분해작용에 저항성이 있는 여러 개의 돌연변이를 도입해 생체 내 반감기를 개선시킨 사례가 있지만, 다수의 돌연변이 도입으로 인해 면역원성 위험성이 증가할 수 있다. 반면 FGF21 분자의 C 말단에 Fc가 융합된 형태인 FGF21-Fc 구조의 경우, Fc-FGF21 구조에 비해 융합에 의한 활성 감소가 큰 것으로 알려져 있다.
GLP-1과 FGF21은 그 작용 기전 및 생체 내 작용 조직에 따라 병용 투여 시 단일 효과 대비 상승 작용을 가질 수 있으며, 이에 따라 우수한 항 당뇨 효력 및 부가적인 장점이 예상된다. GLP-1과 FGF21 병용 투여 효과 또는 GLP-1/FGF21 이중 작용 단백질의 효과에 대한 연구는 이미 보고된바 있다(WO 2010/142665 및 WO 2011/020319).
GLP-1 및 FGF21의 이중 작용 단백질을 개발하기 위해서는 다양한 문제를 해결해야 한다. 야생형 GLP-1과 야생형 FGF21은 생체 내 반감기가 매우 짧아, 의약품으로 개발하더라도 최소 1일 1회 이상의 투여가 필요할 것으로 예상된다. 환자 편의성을 개선시킬 수 있는 지속형 이중 작용 단백질을 개발하기 위해서는 Fc 융합과 같은 지속형 기술이 필요하다. GLP-1과 FGF21 2개 타겟에 작용하는 이중 작용 약물은 각 약물의 활성을 유지하면서, 생체 내에서 안정하게 유지되기 위한 돌연변이 도입이 필수적이며, 이때 각 돌연변이에 의한 활성 변화, 구조 또는 안정성에 미치는 영향 등에 대한 문제 해결이 필요하다. GLP-1과 FGF21 2개의 타겟에 작용하는 약효 측면에서의 균형이 맞아야 하며, 이를 위해서는 시험관 내 활성, 약물동태 프로필, 동물모델에서의 약리 효능, 인간에서의 임상 효능 평가까지 고려한 약물 설계가 필요하다. 이중 작용 단백질은 인체 내에서는 존재할 수 없는 구조로서, 단일 타겟의 융합 단백질 대비 구조적으로 복잡하다. 또한, 2개 타겟에 대한 균형을 맞추기 위해 돌연변이 또는 링커에 의한 엔지니어링이 도입되므로, 응집에 의한 복합체를 형성할 가능성이 높아질 수 있어, 이를 고려한 단백질 엔지니어링이 필요하다. 나아가, 신규 돌연변이 서열 또는 복잡한 구조로 인해 면역원성 가능성이 높아질 수 있는데, 이를 예측하거나 회피할 수 있는 연구가 필요하다.
본 발명자들은 GLP-1 변이체 단백질 및 FGF21 변이체 단백질을 포함하는 이중작용 단백질의 안정성, 약물동태 프로필 및 약리학적 효능을 개선하기 위해 노력하던 중, GLP-1 변이체 단백질과 면역글로불린의 Fc 영역을 융합하고, 신규한 FGF21 변이체 단백질을 융합시킬 경우, 이중 작용 단백질의 안정성, 약물동태 프로필, 약리학적 효능이 개선되는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 생리활성 단백질 및 FGF21 변이체 단백질을 포함하고, 보다 개선된 약물동태 파라미터를 가지며, 안정성이 높고 응집하여 복합체를 형성할 가능성이 적고, 면역원성 가능성이 적은 이중 작용 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 이중 작용 단백질을 포함하는 FGF21-연관 장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 이중 작용 단백질을 코딩하는 단리된 핵산분자, 상기 핵산분자를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터를 포함하는 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명은, 섬유모세포 성장 인자 21(FGF21) 변이체 단백질; 생리활성 단백질, 이의 변이체 또는 이의 단편; 및 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 이중 작용 단백질로서,
상기 FGF21 변이체 단백질이 하기 (1) 내지 (7)의 변이들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 변이를 포함하는, 이중 작용 단백질을 제공한다:
(1) 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 98번 내지 101번 아미노산이 EIRP(서열번호: 68)로 치환됨;
(2) 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 170번 내지 174번 아미노산이 TGLEAV(서열번호: 69)로 치환됨;
(3) 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 170번 내지 174번 아미노산이 TGLEAN(서열번호: 70)으로 치환됨;
(4) 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 170번 아미노산이 N으로 치환됨;
(5) 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 174번 아미노산이 N으로 치환됨;
(6) 상기 (1) 내지 (5)의 변이들 중 하나 이상의 변이와 함께, 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 180번 아미노산이 E로 치환됨; 및
(7) 야생형 FGF21 단백질의 면역원성 감소를 위한 1 내지 10개의 아미노산 변이를 포함함.
또한, 본 발명은 상술한 바와 같은 이중 작용 단백질을 포함하는, 당뇨병, 비만, 이상지질혈증, 대사증후군, 비알콜성 지방간 질환, 비알콜성 지방간염 또는 심혈관계 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상술한 바와 같은 이중 작용 단백질을 코딩하는 단리된 핵산분자, 상기 핵산분자를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 이중 작용 단백질은 생리활성 단백질과 FGF21 변이체 단백질이 면역글로불린의 Fc 영역에 결합되어 약리학적 효능, 체내 지속성 및 단백질의 안정성이 개선되었다. 또한, 상기 이중 작용 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 당뇨병, 비만 질환, 이상지질혈증, 비알콜성 지방간 질환, 비알콜성 지방간염 또는 심혈관계 질환을 위한 치료제로 이용될 수 있다.
도 1a 내지 1c는 인간 베타-클로토가 과발현된 HEK293 세포주를 사용하여, FGF21 변이체 단백질을 포함하는 융합 단백질(이하, "FGF21 변이체 융합 단백질"로 기재)의 시험관 내 활성을 측정한 그래프이다. 돌연변이 도입에 의해 큰 폭의 활성 감소가 나타난 FGF21 변이체 융합 단백질은 없었다.
도 2a 및 2b는 인간 베타-클로토가 과발현된 HEK293 세포주를 사용하여, FGF21 변이체 융합 단백질에 있어 FGF21의 N 말단과 Fc를 연결하는 링커에 따른 시험관 내 활성을 측정한 그래프이다. 링커 서열에 따라 약간의 활성 차이를 나타내지만 큰 폭의 활성 감소가 나타난 FGF21 변이체 융합 단백질은 없었다.
도 3은 인간 베타-클로토가 과발현된 HEK293 세포주를 사용하여 RGE(Amgen), Fc-FGF21(Lilly) 및 DFD1의 시험관 내 활성을 측정한 그래프이다. DFD1과 RGE(Amgen)은 유사한 수준의 활성을 나타냈고, Fc-FGF21(Lilly)은 다른 물질 대비 2배 정도의 시험관 내 활성을 나타내었다.
도 4는 FGF21의 EIRP 돌연변이가 융합 단백질의 안정성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 DFD4와 DFD13의 안정성을 비교한 그래프이다. DFD13은 DFD4 대비 초기 시점 및 2주 경과 시점까지 고분자량 응집체 비율(HMW %)이 낮은 것으로 확인되었고, 이는 EIRP 돌연변이가 도입됨에 따라 FGF21 변이체 융합 단백질의 안정성이 개선되어 HMW %가 큰 폭으로 감소함을 나타낸다.
도 5는 FGF21 변이체 융합 단백질의 피하 투여 후 96시간 동안의 시간에 따른 혈중 약물 농도 그래프이다. 데이터는 평균값들과 표준편차로 표기되었다.
도 6은 ob/ob 마우스 모델에서 DFD18, DFD72, DFD74 또는 Fc-FGF21(Lilly)를 단회 피하 투여한 후, 혈중 글루코스 수준을 보여주는 그래프이다. DFD18, DFD72, DFD74 모두 지속적인 혈당강하 효과를 나타냈다. 데이터는 평균값들과 평균의 표준오차(standard error of the mean, S.E.M.)로 표기되었다.
도 7은 ob/ob 마우스 모델에서 DFD18, DFD72, DFD74 또는 Fc-FGF21(Lilly)를 단회 피하 투여한 후, 투여 시점부터 14일차까지 측정된 체중 변화를 보여주는 그래프이다. DFD18, DFD72, DFD74 모두 PBS 투여군 대비 체중감소 효과를 나타냈다. 데이터는 평균값들과 평균의 표준오차로 표기되었다.
도 8은 ob/ob 마우스 모델에서 DFD18, DFD72, DFD74 또는 Fc-FGF21(Lilly)를 단회 피하 투여한 후, 투여일(1일차)과 16일차의 당화혈색소 수치 변화를 나타낸 그래프이다. DFD18, DFD72, DFD74 모두 16일차에서 투여일 대비 감소한 수준의 당화혈색소 수치를 나타냈다. 데이터는 평균값들과 평균의 표준오차로 표기되었다.
도 9는 HFD/STZ 마우스 모델에서 DFD72 또는 DFD74를 단회 피하 투여한 후, 혈중 글루코스 수준을 보여주는 그래프이다. DFD72, DFD74 모두 지속적인 혈당강하 효과를 나타냈다. 데이터는 평균값들과 평균의 표준오차로 표기되었다.
도 10은 HFD/STZ 마우스 모델에서 DFD72 또는 DFD74를 단회 피하 투여한 후, 투여 시점부터 14일차까지 측정된 체중 변화를 보여주는 그래프이다. DFD72, DFD74 모두 PBS 투여군 대비 체중감소 효과를 나타냈다. 데이터는 평균값들과 평균의 표준오차로 표기되었다.
도 11은 HFD/STZ 마우스 모델에서 DFD72 또는 DFD74를 단회 피하 투여한 후, 1일차와 13일차의 당화혈색소 수치 변화를 나타낸 그래프이다. DFD72, DFD74 모두 PBS 투여군 대비 당화혈색소 감소량이 큰 것으로 나타났다. 데이터는 평균값들과 평균의 표준오차로 표기되었다.
도 12는 식이 유도 비만 마우스 모델에서 DFD18을 단회 투여한 후, 투여 시점부터 14일차까지 측정된 체중 변화를 보여주는 그래프이다. DFD18은 뛰어난 체중감소 효과를 나타냈다. 데이터는 평균값들과 평균의 표준오차로 표기되었다.
도 13은 인간 GLP-1 수용체가 과발현된 CHO 세포주를 사용하여, GLP-1변이체 및 GLP-1의 C말단과 Fc를 연결하는 힌지에 따른 이중 작용 단백질의 시험관 내 GLP-1 활성을 측정한 그래프이다. 종합적으로, GLP-1(A2G) 서열을 포함하는 이중 작용 단백질(DFD23)의 경우 다른 GLP-1 변이체 서열을 포함하는 이중 작용 단백질 대비 2~3배 정도 낮은 활성을 보였다. GLP-1(A2G) 이외의 변이체 서열을 포함하는 이중 작용 단백질에 대한 GLP-1 활성은 큰 차이를 보이지 않았다.
도 14는 DFD59, DFD69, DFD112, 및 DFD114의 GLP-1 활성과, DFD69, DFD112, 및 DFD114의 FGF21 활성을 나타낸 그래프이다. 인간 GLP-1 수용체가 과발현된 CHO 세포주를 사용하여, 이중 작용 단백질 3종 (DFD69, DFD112 및 DFD114)과 FGF21을 포함하지 않는 Fc 융합 GLP-1 변이체(DFD59)에 대한 시험관 내 GLP-1 활성을 측정하였다. 3종의 이중 작용 단백질은 유사한 EC50 값을 나타내었으며, Fc 융합 GLP-1 변이체(DFD59)는 이중 작용 단백질 대비 약 2배 정도의 활성을 나타내었다. 인간 베타-클로토가 과발현된 HEK293 세포주를 사용하여, 이중 작용 단백질에 있어 FGF21 변이체에 따른 시험관 내 활성을 측정하였다. 3종 이중작용 단백질의 FGF21 부분의 시험관 내 활성은 유사한 것으로 확인되었다.
도 15는 이중 작용 단백질의 피하 투여 후 240시간 동안의 시간에 따른 혈중 약물 농도를 나타낸 그래프이다. 데이터는 평균값들과 표준편차로 표기되었다.
도 16은 db/db 마우스 모델에서 DFD114 또는 DFD59를 단회 피하 투여하고, DFD59와 DFD74를 병용으로 단회 피하 투여한 후, 혈중 글루코스 수준을 보여주는 그래프이다. 이중 작용 단백질 투여군에서 단일 작용 단백질 투여 군 대비 강한 혈당강하 효과를 나타냈다. 데이터는 평균값들과 평균의 표준오차(standard error of the mean, S.E.M.)로 표기되었다.
도 17은 db/db 마우스 모델에서 DFD114 또는 DFD59를 단회 피하 투여하고, DFD59와 DFD74를 병용으로 단회 피하 투여한 후, 투여 시점부터 14일차까지 측정된 체중 변화를 보여주는 그래프이다. 이중 작용 단백질 투여군에서 단일 작용 단백질 투여 군 대비 강한 체중 감소 효과를 나타냈다. 데이터는 평균값들과 평균의 표준오차(standard error of the mean, S.E.M.)로 표기되었다.
도 18은 db/db 마우스 모델에서 DFD114 또는 DFD59를 단회 피하 투여하고, DFD59와 DFD74를 병용으로 단회 피하 투여한 후, 투여일(1일차)과 16일차의 당화혈색소 수치 변화를 나타낸 그래프이다. 당화 혈색소 수치에 있어 이중 작용 단백질 투여군에서 단일 작용 단백질 투여 군 또는 병용 투여군 대비 더 큰 감소 효과를 나타냈다. 데이터는 평균값들과 평균의 표준오차로 표기되었다.
도 19는 HFD/STZ 마우스 모델에서 DFD114, DFD59, DFD74 또는 DFD72를 단회 피하 투여하고, DFD59와 DFD74를 병용으로 단회 피하 투여한 후, 혈중 글루코스 수준을 보여주는 그래프이다. 이중 작용 단백질 투여군에서 단일 작용 단백질 투여 군 대비 강한 혈당 강하 효과를 나타냈다. 데이터는 평균값들과 평균의 표준오차(standard error of the mean, S.E.M.)로 표기되었다.
도 20은 HFD/STZ 마우스 모델에서 DFD114, DFD59, DFD74 또는 DFD72를 단회 피하 투여하고, DFD59와 DFD74를 병용으로 단회 피하 투여한 후, 투여 시점부터 14일차까지 측정된 체중 변화를 보여주는 그래프이다. 이중 작용 단백질 투여군에서 단일 작용 단백질 투여 군 대비 강한 체중 감소 효과를 나타냈다. 데이터는 평균값들과 평균의 표준오차(standard error of the mean, S.E.M.)로 표기되었다.
도 21은 HFD/STZ 마우스 모델에서 DFD114, DFD59, DFD74 또는 DFD72를 단회 피하 투여하고, DFD59와 DFD74를 병용으로 단회 피하 투여한 후, 투여일(1일차)과 16일차의 당화혈색소 수치 변화를 나타낸 그래프이다. 당화혈색소 수치에 있어 이중 작용 단백질 투여군에서 단일 작용 단백질 투여 군 또는 병용 투여군 대비 더 큰 감소 효과를 나타냈다. 데이터는 평균값들과 평균의 표준오차로 표기되었다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 이중 작용 단백질은 섬유모세포 성장 인자 21(FGF21) 변이체 단백질; 생리활성 단백질, 이의 변이체 또는 이의 단편; 및 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하고, 상기 FGF21 변이체 단백질이 하기 (1) 내지 (7)의 변이들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 변이를 포함한다:
(1) 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 98번 내지 101번 아미노산이 EIRP(서열번호: 68)로 치환됨(이하 "EIRP"로 기재);
(2) 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 170번 내지 174번 아미노산이 TGLEAV(서열번호: 69)로 치환됨(이하 "TGLEAV"로 기재);
(3) 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 170번 내지 174번 아미노산이 TGLEAN(서열번호: 70)으로 치환됨(이하 "TGLEAN"으로 기재);
(4) 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 170번 아미노산이 N으로 치환됨;
(5) 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 174번 아미노산이 N으로 치환됨;
(6) 상기 (1) 내지 (5)의 변이들 중 하나 이상의 변이와 함께, 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 180번 아미노산이 E로 치환됨; 및
(7) 야생형 FGF21 단백질의 면역원성 감소를 위한 1 내지 10개의 아미노산 변이를 포함함.
상기 야생형 FGF21 단백질은 글루코스 및 지질 항상성에 있어서 중요한 역할을 한다고 알려진 호르몬으로서, 인간, 마우스, 돼지, 원숭이 등의 포유류에서 유래된 것일 수 있으며, 구체적으로는, 인간 유래의 FGF21 단백질일 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 야생형 FGF21 단백질은 서열번호: 1로 표시되는 인간 야생형 FGF21 단백질일 수 있다.
또한, 상기 FGF21 변이체 단백질에 포함된 변이는, 구체적으로, EIRP, TGLEAV, TGLEAN, G170N 및 G174N 중 어느 하나; TGLEAV, TGLEAN, G170N 및 G174N 중 어느 하나와 EIRP의 조합; EIRP, TGLEAV, TGLEAN, G170N 및 G174N 중 어느 하나와 A180E의 조합; 또는 TGLEAV, TGLEAN, G170N 및 G174N 중 어느 하나, EIRP 및 A180E의 조합일 수 있다. 아울러, 상기 FGF21 변이체 단백질은 야생형 FGF21 단백질에 비해 N 말단 또는 C 말단의 1 내지 10개의 아미노산이 결실된 형태일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 FGF21 변이체 단백질이 서열번호: 6 내지 23의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 FGF21 변이체 단백질이 서열번호: 6 내지 23의 아미노산 서열 중 어느 하나로 표시되면서, 야생형 FGF21 단백질에 비해 N 말단 또는 C 말단의 1 내지 10개의 아미노산이 결실된 형태일 수 있다.
상기 이중 작용 단백질은 FGF21 변이체 단백질의 변이에 의해 도입된 N잔기가 당화(glycosylation)된 것일 수 있다.
상기 생리활성 단백질은 인슐린(insulin), C-펩타이드(C-peptide), 렙틴(leptin), 글루카곤(glucagon), 가스트린(gastrin), 가스트린억제폴리펩타이드(gastric inhibitory polypeptide; GIP), 아밀린(amylin), 칼시토닌(calcitonin), 콜레시스토키닌(cholecystokinin), 펩타이드 YY(peptide YY), 뉴로펩타이드 Y(neuropeptide Y), 뼈형성단백질 6(bone morphogenetic protein 6; BMP-6), 뼈형성단백질 9(bone morphogenetic protein 9; BMP-9), 옥신토모듈린(oxyntomodulin), 옥시토신(oxytocin), 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1), 글루카곤 유사 펩타이드-2(GLP-2), 이리신(irisin), FNDC5(fibronectin type III domain-containing protein 5), 아펠린(apelin), 아디포넥틴(adiponectin), CTRP 패밀리(C1q and tumor necrosis factor related protein), 레지스틴(resistin), 비스파틴(visfatin), 오멘틴(omentin), 레티놀 결합 단백질-4(RBP4), 글리세틴(glicentin), 앙기오포이에틴(angiopoietin), 인터루킨-22(IL-22), 엑센딘-4(exendin-4) 및 성장 호르몬(growth hormone)으로 이루어진 군에서 선택된 1종일 수 있다. 구체적으로, 상기 생리활성 단백질은 GLP-1, 이의 변이체 및 엑센딘-4 중 선택된 1종일 수 있다.
상기 GLP-1 단백질은 장관 내 L 세포에서 음식물 등의 자극을 받아 분비되는 31개의 아미노산으로 구성된 인크레틴 (incretin) 호르몬으로서, 예를 들면, 서열번호: 42의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
상기 GLP-1의 변이체는, 예를 들면, 서열번호: 43 내지 46 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "Fc 영역", "Fc 단편" 또는 "Fc"란, 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 1(CH1), 중쇄 불변 영역 2(CH2) 및 중쇄 불변 영역 3(CH3)을 포함하며, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄의 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 1(CL1)은 포함하지 않는 단백질을 말한다. 또한, 본원에서 사용된 용어 "Fc 영역 변이체"는 Fc 영역 중 일부 아미노산이 치환되거나, 서로 다른 종류의 Fc 영역을 조합하여 제조된 것을 의미한다.
상기 면역글로불린의 Fc 영역은 항체를 구성하는 Fc 영역 전체 또는 이의 단편, 또는 Fc 영역 변이체일 수 있다. 또한, 상기 Fc 영역은 단량체 또는 다량체 형태의 분자를 포함하며, 중쇄 불변 영역의 힌지 영역을 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 Fc 영역 변이체는 힌지 부위에서 절단되는 것을 예방하기 위해 변형될 수 있다. 더불어, 상기 Fc의 힌지 서열은 항체 의존 세포 매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity; ADCC)이나 보체 의존 세포독성(complemant-dependent cytotoxicity; CDC)을 줄이기 위해 아미노산 서열 일부가 치환될 수 있다. 또한, 상기 Fc의 힌지 서열은 Fab 영역의 재배열을 억제하기 위해 아미노산 서열 일부가 치환될 수 있다. 나아가, Fc C-말단의 라이신(K)은 제거될 수 있다.
상기 면역글로불린의 Fc 영역은, 구체적으로, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 IgD의 Fc 영역 중 어느 하나; 또는 이들의 조합으로 이루어진 하이브리드 Fc일 수 있다. 또한, 상기 하이브리드 Fc는, 구체적으로, IgG4 영역 및 IgD의 영역을 포함할 수 있다. 나아가, 상기 IgD Fc의 힌지 서열 일부와 CH2, 및 IgG4 Fc의 CH2와 CH3 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 Fc 단편은 야생형 당쇄, 야생형에 비해 증가된 당쇄, 야생형에 비해 감소한 당쇄, 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 상기 당쇄의 증가, 감소 또는 제거는 화학적 방법, 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전공학적 엔지니어링 방법 등과 같은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 수행될 수 있다.
상기 면역글로불린의 Fc 영역은, 구체적으로, 서열번호: 24 내지 26, 47 및 48 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
상기 이중 작용 단백질은 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 생리활성 단백질, 면역글로불린의 Fc 영역 및 FGF21 변이체 단백질이 순서대로 연결될 수 있다. 또한 상기 이중 작용 단백질은 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 FGF21 변이체 단백질, 면역글로불린의 Fc 영역 및 생리활성 단백질이 순서대로 연결될 수 있다. 구체적으로, 상기 이중 작용 단백질은 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 생리활성 단백질, 면역글로불린의 Fc 영역 및 FGF21 변이체 단백질이 순서대로 연결될 수 있다.
또한, 상기 이중 작용 단백질은 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 GLP-1 변이체 단백질, 면역글로불린의 Fc 영역 및 FGF21 변이체 단백질이 순서대로 연결될 수 있다. 나아가, 상기 이중 작용 단백질은 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 FGF21 변이체 단백질, 면역글로불린의 Fc 영역 및 GLP-1 변이체 단백질이 순서대로 연결될 수 있다. 구체적으로, 상기 이중 작용 단백질은 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 GLP-1 변이체 단백질, 면역글로불린의 Fc 영역 및 FGF21 변이체 단백질이 순서대로 연결될 수 있다.
또한, 상기 이중 작용 단백질은 링커를 더 포함할 수 있다.
상기 이중 작용 단백질은 FGF21 변이체 단백질이 면역글로불린의 Fc 영역의 N 말단 또는 C 말단에 직접 연결된 형태일 수 있으나, 상기 FGF21 변이체 단백질이 링커를 통해 면역글로불린의 Fc 영역에 연결된 형태일 수도 있다.
이때, 상기 링커는 Fc 단편의 N 말단, C 말단 또는 유리기(free radical)에 연결될 수 있고, FGF21 변이체 단백질의 N-말단, C-말단 또는 유리기에 연결될 수 있다. 링커가 펩타이드 링커인 경우, 연결은 임의의 부위에서 일어날 수 있다. 예를 들면, 상기 링커가 상기 면역글로불린의 Fc 영역의 C 말단 및 상기 FGF21 변이체 단백질의 N 말단에 연결되어, 면역글로불린의 Fc 영역과 FGF21 변이체 단백질의 융합 단백질을 형성할 수 있다.
또한, 본 발명의 이중 작용 단백질은 상기 융합 단백질의 면역글로불린의 Fc 영역의 N-말단에 생리활성 단백질이 결합된 형태일 수 있다.
링커 및 Fc가 별개로 발현된 후에 서로 결합될 때, 링커는 당업계에 알려진 가교제일 수 있다. 상기 가교제는, 예를 들어, 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄(1,1-bis (diazoacetyl)-2-phenylethane), 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 4-아지도살리실릭산(4-azidosalicylic acid)과 같은 N-하이드로옥시석신이미드 에스테르(N-hydroxysuccinimide ester), 3,3'-디사이오비스(석신이미딜프로피오네이트)(3,3'-dithiobis(succinimidylpropionate))와 같은 디석신이미딜에스테르(disuccinimidyl esters)를 포함하는 이미도에스테르(imidoesters), 및 비스-N-말레이미도-1,8-옥테인과 같은 이중 기능적 말레이미드(bifunctional maleimides)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 링커는 펩타이드일 수 있다. 구체적으로, 상기 링커는 10 내지 30개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드일 수 있다.
나아가, 상기 링커는 말단에 알라닌이 추가적으로 결합된 링커일 수 있다. 상기 링커는, 구체적으로, 서열번호: 2 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드일 수 있다.
상기 이중 작용 단백질은 하나 이상의 FGF21 변이체 단백질이 결합한 형태인 이량체 또는 다량체 FGF21 변이체 단백질이 면역글로불린의 Fc 영역에 결합한 형태일 수 있다. 또한, FGF21 변이체 단백질이 결합된 면역글로불린의 Fc 영역이 두 개 이상 결합된 이량체 또는 다량체 형태일 수 있다.
나아가, 상기 이중 작용 단백질은, 구체적으로, 서열번호: 58 내지 67 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시될 수 있다. 보다 구체적으로, 서열번호: 65, 66 또는 67의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
상기 FGF21 변이체 단백질은 면역원성 감소 최소화를 위한 1 내지 10개의 아미노산 변이를 추가로 포함할 수 있다. 상기 면역원성은 공지된 통상의 방법으로 예측할 수 있으며, 예를 들면, iTope™과 TCED™ 방법을 이용하여 단백질의 잠재적인 면역원성을 스크리닝할 수 있다.
또한, 상기 면역원성 감소 최소화를 위한 변이는 공지된 통상의 방법으로 설계할 수 있으며, 예를 들면, EpiScreen™ 분석을 수행하여 면역원성 가능성을 평가한 후 면역원성이 관찰될 경우, T-cell 항원결정부 지도작성(epitope mapping)을 통해 면역원성을 유발하는 아미노산 서열을 확인할 수 있으며, 인실리코 예측을 통해 면역원성이 최소화된 변이체를 설계할 수 있다.
본 발명의 다른 측면으로, 본 발명은 상기 이중 작용 단백질을 포함하는 FGF21-연관 장애 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 "FGF21-연관 장애"는, 구체적으로, 비만, 제1형 및 제2형 당뇨병, 췌장염, 이상지질혈증, 비알콜성 지방간 질환(NAFLD), 비알콜성 지방간염(NASH), 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 불내성, 고혈당증, 대사 증후군, 급성 심근경색, 고혈압, 심혈관계 질환, 아테롬성동맥경화증, 말초 동맥 질환, 졸중, 심부전, 관상동맥 심장 질환, 신장 질환, 당뇨병성 합병증, 신경병증, 위마비, 인슐린 수용체에서의 중증 불활성화 돌연변이와 연관된 장애, 및 다른 대사 장애를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, FGF21-연관 장애는 당뇨병, 비만, 이상지질혈증, 대사증후군, 비알콜성 지방간 질환, 비알콜성 지방간염 또는 심혈관계 질환일 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물은 약학적 담체를 더 포함할 수 있다. 약학적 담체는 환자에게 항체를 전달하기에 적절한 비-독성 물질이면 어떠한 담체라도 가능하다. 증류수, 알코올, 지방, 왁스 및 비활성 고체가 담체로 포함될 수 있다. 약학적으로 허용되는 애쥬번트(완충제, 분산제) 또한 약학적 조성물에 포함될 수 있다. 이러한 제형에 있어서 이중 작용 단백질의 농도는 매우 다양할 수 있다.
구체적으로, 상기 약학적 조성물은, 조성물의 pH, 오스몰 농도, 점도, 투명도, 색상, 등장성, 냄새, 무균성, 안정성, 용해 또는 방출 속도, 흡착, 또는 투과를 변형하거나, 유지하거나 또는 보존하기 위한 제제화 물질을 함유할 수 있다. 적합한 제제화 물질은 아미노산(예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신), 항미생물제, 항산화제(예컨대 아스코르브산, 아황산나트륨 또는 아황산수소나트륨), 완충제(예컨대 보레이트, 비카르보네이트, 트리스-HCl, 시트레이트, 포스페이트 또는 다른 유기산), 벌킹제(예컨대 만니톨 또는 글리신), 킬레이트화제(예컨대 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)), 착화제(예컨대 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-시클로덱스트린 또는 히드록시프로필-베타-시클로덱스트린), 충전제, 모노사카라이드, 디사카라이드 및 다른 탄수화물(예컨대 글루코스, 만노스 또는 덱스트린), 단백질(예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 이뮤노글로불린), 착색제, 향미제 및 희석제, 유화제, 친수성 중합체(예컨대 폴리비닐피롤리돈), 저분자량 폴리펩타이드, 염-형성 반대이온(예컨대 나트륨), 보존제(예컨대 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 페네틸 알콜, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 또는 과산화수소), 용매(예컨대 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜), 당 알콜(예컨대 만니톨 또는 소르비톨), 현탁화제, 계면활성제 또는 습윤제(예컨대 플루로닉스; PEG; 소르비탄 에스테르; 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80; 트리톤; 트로메타민; 레시틴; 콜레스테롤 또는 틸록사팔), 안정성 증진제(예컨대 수크로스 또는 소르비톨), 장성 증진제(예컨대 알칼리 금속 할라이드; 바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨; 또는 만니톨 소르비톨), 전달 비히클, 희석제, 부형제 및/또는 제약 아주반트를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 또 다른 측면으로, 본 발명은 상기 이중 작용 단백질을 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는, FGF21-연관 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 특히, FGF21-연관 장애인 당뇨병, 비만, 이상지질혈증, 대사증후군, 비알콜성 지방간 질환, 비알콜성 지방간염 또는 심혈관계 질환의 증상을 가진 포유류에게 본 발명의 이중 작용 단백질의 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
본원의 약학적 조성물은 어떠한 경로로도 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 직접적으로(예, 조직 부위에 주입, 이식 또는 국부적으로 투여함으로써, 국소적으로) 또는 시스템적으로(예, 비경구 또는 경구로) 임의의 적절한 수단에 의하여 동물에게 제공될 수 있다. 본 발명의 조성물이 정맥 내, 피하, 눈(ophthalmic), 복강 내, 근육 내, 구강, 직장, 안와 내(intraorbital), 뇌 내(intracerebral), 두개 내(intracranial), 척추 내(intraspinal), 뇌실 내(intraventricular), 수막강 내(intrathecal), 조내(intracistenal), 캡슐 내(intracapsular), 비 내(intranasal) 또는 에어로졸 투여와 같이 비경구적으로 제공되는 경우, 조성물은 예를 들면, 수성(aqueous) 이거나 생리학적으로 적용가능한 체액 현탁액 또는 용액의 부분을 포함할 수 있다. 이에 따라, 담체 또는 운반체(vehicle)가 생리학적으로 허용가능하므로 조성물에 첨가하여 환자에게 전달될 수 있다. 따라서, 제제를 위한 체액과 같은 담체로 일반적으로 생리식염수를 포함할 수 있다.
또한, 투여 빈도는 사용되는 제제 내의 이중 작용 단백질의 약동학적 파라미터에 따라 달라질 것이다. 전형적으로, 임상의는 목적 효과를 달성하는 투여량에 도달할 때까지 조성물을 투여할 것이다. 따라서, 조성물은 단일 용량으로서, 시간 간격을 둔 2회 이상의 용량(동일한 양의 목적 이중 작용 단백질을 함유하거나 함유하지 않을 수 있음)으로서, 또는 이식 장치 또는 카테터를 통한 연속 주입으로서 투여될 수 있다. 적절한 투여량의 추가의 정밀화는 당업자에 의해 일상적으로 이루어지고, 그들에 의해 일상적으로 수행되는 업무 영역 내에 해당한다.
또한, 이중 작용 단백질의 단위 투여량은 인간에 있어서 0.01 ㎍/체중kg 내지 100 mg/체중kg이며, 구체적으로, 1 ㎍/체중kg 내지 10 mg/체중kg이다. 상기 함량이 최적량이긴 하나, 치료대상 질환 및 부작용의 유무에 따라 달라질 수 있으며, 최적의 투여량은 통상적인 실험을 이용하여 결정될 수 있다. 이중 작용 단백질의 투여는 주기적인 급속 주입(periodic bolus injections)에 의하거나, 외측 공급원(external reservoir) (예, 정맥주사 보유주머니(intravenous bag)) 또는 내측(예, 생체부식성 임플란트(bioerodable implant))으로부터의 지속적인 정맥 내, 피하, 또는 복막 내 투여에 의할 수 있다.
또한, 본 발명의 이중 작용 단백질은 다른 생물학적 활성 분자와 함께 대상 수용체에 투여될 수 있다. 그러나 이중 작용 단백질 및 다른 분자의 최적의 조합, 투여 형태, 정량은 당업계에서 잘 알려진 통상적인 실험을 통하여 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면으로, 본 발명은 상기 이중 작용 단백질을 코딩하는 단리된 핵산분자를 제공한다.
본원에서 사용된 용어 "단리된 핵산 분자"는 전체 핵산이 공급원 세포로부터 단리될 때 그와 함께 자연에서 발견되는 단백질, 지질, 탄수화물, 또는 다른 물질의 약 50% 이상으로부터 분리되었거나, 자연에서는 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되거나, 또는, 보다 큰 폴리뉴클레오티드 서열의 일부로서 자연에서 발생하지 않는 본 발명의 핵산 분자를 의미한다. 구체적으로, 본 발명의 단리된 핵산 분자에는 임의의 다른 오염 핵산 분자, 또는 폴리펩타이드 생산 또는 그의 치료, 진단, 예방 또는 연구 용도에서 그의 사용을 저해하는 그의 천연 환경에서 발견되는 다른 오염물이 실질적으로 존재하지 않는다.
이때, 상기 이중 작용 단백질을 코딩하는 단리된 핵산분자는 코돈의 중복(redundancy)으로 인해 서로 상이한 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 단리된 핵산분자은 상기 이중 작용 단백질을 생산할 수 있는 한 목적에 따라 적절히 변형되거나, N 말단 또는 C 말단에 뉴클레오티드가 첨가될 수 있다.
상기 단리된 핵산분자는, 예를 들어, 서열번호 71 내지 80 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면으로, 본 발명은 상기 단리된 핵산분자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
용어 "발현 벡터"는 숙주 세포의 형질전환에 적합하고 삽입된 이종 핵산 서열의 발현을 지시하거나 제어하는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 의미한다. 상기 벡터는 선형(linear) 핵산, 플라스미드, 파지미드(phagemids), 코스미드(cosmids), RNA 벡터, 바이러스 벡터 및 이의 유사체들을 포함한다. 상기 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 및 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 용어, 목적 단백질의 "이종 핵산 서열의 발현" 또는 "발현"은, 삽입된 DNA 서열의 전사, mRNA 전사체의 번역, 및 Fc 융합 단백질 생산물 또는 항체 또는 항체 단편의 생산을 의미한다.
유용한 발현 벡터는 RcCMV(Invitrogen, Carlsbad) 또는 이의 변이체일 수 있다. 유용한 발현 벡터는 포유류 세포에서 목적 유전자의 연속적인 전사를 촉진하기 위한 인간 CMV(cytomegalovirus) 프로모터, 및 전사 후 RNA의 안정상태 수준을 높이기 위한 우태 성장 인자(bovine growth hormone) 폴리아데닐레이션 신호 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구체예로 발현 벡터는, RcCMV의 변형 벡터인 pAD15일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면으로, 본 발명은 상기 발현벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
본원에서 사용된 용어 "숙주세포"는 재조합 발현 벡터가 도입될 수 있는 원핵 및 진핵 세포를 나타낸다. 본원에서 사용된 용어, "형질전환된" 및 "형질감염된"은 당업계에 공지된 많은 기술에 의한 세포 내로의 핵산(예를 들어, 벡터)을 도입하는 것을 의미한다.
상기 숙주세포는 본 발명의 DNA 서열로 형질 전환되거나 형질 감염시킬 수 있으며, 목적 단백질의 발현 및/또는 분비에 이용될 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주 세포는 불사의 하이브리도마 세포(immotal hybridoma cells), NS/0 골수종 세포(NS/0 myeloma cells), 293 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO cell), HeLa 세포, CAP 세포 (인간 양수 유래 세포), 또는 COS 세포를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다.
[ 실시예 ]
제조예 1. FGF21 변이체 단백질을 포함한 융합 단백질의 제조 및 정제
제조예 1-1. FGF21 변이체 단백질의 발현을 위한 발현벡터의 제조
Fc-FGF21 구조에서 FGF21의 안정성, 활성 및 약물동태 프로필을 개선시키기 위해 FGF21에 대한 돌연변이 연구를 수행하였다.
구체적으로, FGF21 단백질의 3차원 구조 분석을 통해 단백질 활성에 영향이 클 것으로 예측되는 LLLE(FGF21 단백질의 N 말단으로부터 98번 내지 101번 아미노산) 부위와, GPSQG(FGF21 단백질의 N 말단으로부터 170번 내지 174번 아미노산) 부위, A180 부위에 대한 변이체 단백질을 고안하였다.
하기 표 1에 FGF21에 도입된 돌연변이의 위치, 서열 정보, 목적 및 각 돌연변이의 기대효과를 정리하였다(표 1에서 N은 당화(glycosylation)된 아르기닌(N)을 나타냄). 또한, 하기 표 2에는 표 1에 기술된 돌연변이를 포함하는 FGF21 변이체 단백질을 나타내었다.
서열 기호 위치 기존 서열 돌연변이 서열 목적 기대 효과
EIRP 98-101 LLLE EIRP FGF19 서열로 교체 안정성, 약물동태 개선
TGLEAV 170-174 GPSQG TGLEAV FGF19 서열로 교체 약물동태 개선
TGLEAN 170-174 GPSQG TGLEAN FGF19 서열로 교체, N-glycosylation 추가 약물동태 개선
G170N 170 G N 점 돌연변이, N-glycosylation 추가 약물동태 개선
G174N 174 G N 점 돌연변이, N-glycosylation 추가 약물동태 개선
A180E 180 A E 점 돌연변이 약물동태 개선
서열번호 FGF21 변이체 단백질 서열
서열번호: 6 FGF21(EIRP)
서열번호: 7 FGF21(TGLEAV)
서열번호: 8 FGF21(TGLEAN)
서열번호: 9 FGF21(G170N)
서열번호: 10 FGF21(G174N)
서열번호: 11 FGF21(EIRP, TGLEAV)
서열번호: 12 FGF21(EIRP, TGLEAN)
서열번호: 13 FGF21(EIRP, G170N)
서열번호: 14 FGF21(EIRP, G174N)
서열번호: 15 FGF21(EIRP, A180E)
서열번호: 16 FGF21(TGLEAV, A180E)
서열번호: 17 FGF21(TGLEAN, A180E)
서열번호: 18 FGF21(G170N, A180E)
서열번호: 19 FGF21(G174N, A180E)
서열번호: 20 FGF21(EIRP, TGLEAV, A180E)
서열번호: 21 FGF21(EIRP, TGLEAN, A180E)
서열번호: 22 FGF21(EIRP, G170N, A180E)
서열번호: 23 FGF21(EIRP, G174N, A180E)
세 가지 구성요소는 N-말단으로부터 C-말단으로 융합 캐리어, 링커 및 FGF21 변이체의 순서로 발현되도록 발현벡터에 아미노산을 코딩하였다. 하기 표 3에 FGF21 변이체 융합 단백질의 기호, FGF21에 도입된 돌연변이 서열, 융합 캐리어 서열, 링커 서열을 정리하였다(표 3에서 N은 당화(glycosylation)된 아르기닌(N)을 나타냄).
서열번호 물질 코드 FGF21 돌연변이 서열 융합 캐리어 링커 서열
서열번호: 27 DFD1 EIRP, TGLEAV hyFc (서열번호: 26) C (서열번호: 2)
서열번호: 28 DFD3 TGLEAV hyFc (서열번호: 26) AKA (서열번호: 3)
서열번호: 29 DFD4 TGLEAV hyFc (서열번호: 26) GS3 (서열번호: 4)
서열번호: 30 DFD5 TGLEAN hyFc (서열번호: 26) GS3 (서열번호: 4)
서열번호: 31 DFD6 G170N hyFc (서열번호: 26) GS3 (서열번호: 4)
서열번호: 32 DFD6(E.coli) G170N hyFc (서열번호: 26) GS3 (서열번호: 4)
서열번호: 33 DFD7 G174N hyFc (서열번호: 26) GS3 (서열번호: 4)
서열번호: 34 DFD9 없음 hyFc (서열번호: 26) GS3 (서열번호: 4)
서열번호: 35 DFD13 EIRP, TGLEAV hyFc (서열번호: 26) GS3 (서열번호: 4)
서열번호: 36 DFD18 EIRP, TGLEAV, A180E hyFc (서열번호: 26) GS3 (서열번호: 4)
서열번호: 37 DFD72 EIRP, TGLEAN, A180E hyFc (서열번호: 26) GS3 (서열번호: 4)
서열번호: 38 DFD73 EIRP, G170N hyFc (서열번호: 26) GS3 (서열번호: 4)
서열번호: 39 DFD74 EIRP, G170N, A180E hyFc (서열번호: 26) GS3 (서열번호: 4)
서열번호: 40 RGE(Amgen) L98R, P171G, A180E IgG1Fc 변이체 GS3 (서열번호: 4)
서열번호: 41 Fc-FGF21
(Lilly)		 서열번호 X IgG4Fc 변이체
(서열번호: 25)		 GS3A
(서열번호: 5)
상기 FGF21 변이체 융합 단백질을 생산하기 위하여, 각 FGF21 변이체 융합 단백질의 아미노산 서열을 기초로 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 ㈜바이오니아사(한국)에 의뢰하여 합성하였다. 각 FGF21 변이체 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 5' 말단과 3' 말단에 각각 NheI 과 NotI 제한효소 서열을 첨가하였고, 5' 말단의 제한효소 서열 뒤에 단백질 번역을 위한 시작 코돈과 발현된 단백질을 세포 밖으로 분비하게 하는 유도서열(MDAMLRGLCCVLLLCGAVFVSPSHA)을 삽입하였다. 각 FGF21 변이체 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 뒤에는 종결코돈을 삽입하였다. NheI과 NotI 두 제한효소 서열을 이용하여 각 FGF21 변이체 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 pTrans-empty 발현벡터에 클로닝하였다. 상기 pTrans-empty 발현벡터는 독일의 CEVEC사에서 입수하였으며, CMV 프로모터, pUC 유래 복제기원, SV40 유래 복제기원, 암피실린 내성 유전자를 가지는 간단한 구조의 발현벡터이다.
한편, DFD6(E. coli), RGE(Amgen) 융합 단백질의 경우, 대장균 발현을 위해 pET30a 발현벡터에 각 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 삽입하였다.
제조예 1-2. FGF21 변이체 융합 단백질의 발현을 위한 플라스미드 DNA의 제작
상기 제조예 1-1에서 제작한 각 발현벡터를 대장균에 형질전환하여 발현에 쓰일 다량의 플라스미드 DNA를 얻었다. 각 발현벡터는 세포벽이 약화된 대장균 내에 열쇼크를 통해 형질도입하였으며, LB 플레이트에 도말하여 콜로니를 확보하였다. 확보된 콜로니를 LB 배지에 접종한 후 37℃에서 16시간 배양하여 각 발현벡터를 세포 내에 가지는 대장균을 각각 100 ㎖씩 확보하였다. 확보된 대장균은 원심분리를 통해 배양배지를 제거한 후 P1, P2, P3 용액(QIAGEN사, cat. no.:12963)을 첨가하여 세포벽을 깨고 단백질과 DNA를 분리한 DNA 혼탁액을 확보하였다. Qiagen DNA 정제 칼럼을 이용해 확보한 DNA 혼탁액으로부터 플라스미드 DNA를 정제하였다. 용출된 플라스미드 DNA는 아가로즈 젤 전기영동을 통해 확인하였으며, 나노드롭 기기(Thermo scientific사, Nanodrop Lite)를 이용하여 농도와 순도를 측정한 후 발현에 사용하였다.
제조예 1-3. CAP-T 세포에서 융합 단백질의 발현
상기 제조예 1-2에서 분리한 각 플라스미드 DNA로 인간세포주를 형질전환하였다. PEM 배지(Life technologies)에서 배양 중인 CAP-T 세포(CEVEC사)에 PEI 용액(Polyplus사, cat. no.:101-10N)을 이용하여 각 플라스미드 DNA를 형질도입하였다. DNA와 PEI 용액의 혼합액을 인비트로젠사의 Freestyle293 발현 배지를 이용하여 현탁한 세포에 섞고 37℃에서 5시간 배양 후 PEM 배지를 첨가하였다. 37℃에서 5-7일간 배양 후 원심분리를 통해 세포를 제거하여 FGF21 변이체 융합 단백질이 포함된 상등액을 확보하였다.
제조예 1-4. 대장균에서 FGF21 변이체 융합 단백질의 발현
DFD6(E. coli)와 RGE(Amgen) 융합 단백질을 발현하는 플라스미드 DNA를 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질전환시켜, 재조합 대장균을 제조하였다. 융합 단백질을 발현하는 재조합 대장균을 LB 배지 20 ㎖에 접종하여 37℃에서 15시간 동안 진탕 배양한 후, 이들 배양액 일부를 다시 LB 배지 100 ㎖에 접종한 후 37℃에서 16시간 동안 진탕 배양하였다. 배양이 종료된 후 원심분리하여 대장균 펠렛을 확보한 후, 고압력세포파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하여 봉입체(inclusion body)를 회수하였다.
회수된 봉입체는 세척(washing)과 용출(elution), 단백질 재접힘(refolding)과정을 통하여 정제하였다. 구체적으로, 상기에서 얻어진 봉입체를 0.5% 트리톤(Triton) X-100, 50 mM Tris, 1 mM EDTA, 0.1 M NaCl, pH 8.0 버퍼로 2-3회 세척하여 세균 단백질(bacterial protein)을 제거한 후 8 M 우레아 완충액(urea buffer; 8 M urea, 50 mM Tris, 1 mM DTT)으로 재현탁하였다. 8 M 우레아에 들어있는 단백질은 완전히 변성(denature)되어있는 상태이므로 하기와 같이 단백질 재접힘(refolding) 과정을 수행하였다.
먼저, 8 M 우레아 완충액으로부터 20 mM 글리신, pH 9.0 완충액을 이용하여 단계별로 희석시켜 우레아를 제거하였으며 2 M에서부터는 단백질의 안정적 구조회복(folding)을 유도하기 위하여 80 μM이 되도록 황산구리(CuSO4)를 첨가하였다. 재접힘 과정이 끝난 단백질은 pH 7.4의 PBS로 완충액을 교환해 주고 0.22 ㎛ 필터를 이용하여 불순물을 제거한 후 Protein A 친화크로마토그래피 칼럼에 로딩하였다. 1X PBS(pH 7.4) 완충액으로 칼럼을 세척한 후 100 mM 글리신(pH 3.0) 완충액으로 단백질을 용출하여 DFD6(E. coli)융합 단백질을 제조하였다.
RGE(Amgen) 융합 단백질의 경우, 재접힘 과정이 끝난 단백질을 50 mM Tris(pH 8.0) 완충액으로 교환해 주고 0.22 ㎛ 필터를 이용하여 불순물을 제거한 후 음이온교환수지(POROS® HQ 50 ㎛, Thermo Fisher Scientific) 칼럼에 로딩하였다. 50 mM Tris(pH 8.0) 완충액으로 칼럼을 세척한 후, 50 mM Tris(pH 8.0) 완충액을 농도 구배로 흘려준 후 RGE(Amgen) 융합 단백질을 용출하였다. 음이온교환수지를 통해 얻은 RGE(Amgen) 융합 단백질에 황산암모늄(Ammonium sulfate)을 1 M이 되도록 첨가한 후, 소수성 반응 크로마토그래피 (Phenyl sepharose FF, GE Healthcare)칼럼을 이용해 정제하였다. 구체적으로, 1 M 황산암모늄이 첨가된 50 mM Tris(pH 8.0) 완충액으로 칼럼을 세척한 후, 50 mM Tris(pH 8.0) 완충액을 농도 구배로 흘려준 후 용출된 분획을 10% Tris-glycine 겔에 전기영동 하였다. 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루 R(coomassie brilliant blue R)로 가볍게 진탕하면서 염색한 후, 고순도의 FGF21 변이체 융합 단백질이 존재하는 부분을 모은 다음, 최종 완충액 1X PBS, 1 mM EDTA, pH 7.4로 4℃에서 밤새 투석하였다. 투석 후 얻어진 단백질 원액을 30,000 분자량 컷오프 원심분리 필터를 사용하여, 3000 rpm, 4℃에서 농축하였다. FGF21 변이체 융합 단백질의 농도는 BCA 정량분석으로 측정하였다.
제조예 1-5. FGF21 변이체 융합 단백질의 정제
Protein A 친화크로마토그래피 칼럼(GE Healthcare)을 1X PBS(pH 7.4) 완충액으로 평형화하였다. 제조예 1-3에서 제조한 각 FGF21 변이체 융합 단백질을 포함하는 배양 상등액을 0.2 ㎛ 필터로 여과한 후, Protein A 친화크로마토그래피 칼럼에 로딩하였다. 1X PBS(pH 7.4) 완충액으로 칼럼을 세척한 후 100 mM 글리신(pH 3.0) 완충액으로 FGF21 변이체 융합 단백질을 용출하였다. 친화크로마토그래피를 통해 얻은 FGF21 변이체 융합 단백질을 음이온교환수지(POROS® HQ 50 ㎛, Thermo Fisher Scientific) 칼럼을 이용해 정제하였다. 음이온교환수지 칼럼을 50 mM Tris(pH 8.0) 완충액으로 평형화한 후, 친화크로마토그래피에서 용출된 FGF21 변이체 융합 단백질을 로딩하였다. 구체적으로, 50 mM Tris(pH 8.0) 완충액으로 칼럼을 세척한 후, 50 mM Tris(pH 8.0) 완충액을 농도 구배로 흘려준 후 용출된 분획을 분석하였다. 크기 배제 크로마토그래피(SEC-HPLC) 실험법을 이용하여 각 분획을 분석하여 고순도의 FGF21 변이체 융합 단백질이 존재하는 부분을 모은 다음, 제조예 1-4와 동일한 방법으로 농축 및 정량분석을 완료하였다.
실험예 1. 융합 단백질의 시험관 내 활성 측정 결과
실험예 1-1. FGF21 변이 서열에 따른 활성 측정 결과
위 제조예 1에서 제조된 융합 단백질인, DFD4, DFD5, DFD6, DFD6(E. coli), DFD7, DFD9, DFD13, DFD18, DFD72, DFD73 및 DFD74의 시험관 내 활성을 측정하였다.
구체적으로, 융합 단백질의 시험관 내 활성을 평가하기 위해, FGF21의 보조수용체인 베타-클로토를 과발현하도록 제작된 HEK293 세포주((주)유한양행)를 이용하였다. 활성 평가를 위해, 제조예 1-4 및 1-5에서 얻어진 융합 단백질이 포함된 농축물을 3 μM 농도에서 3배 계열 희석하여, 5시간의 혈청 결핍상태로 배양한 인간 베타-클로토 과발현 HEK293 세포주에 20분간 처리한 후 세포를 세포용해 버퍼(Cisbio/cat# 64ERKPEG) 를 첨가한 후 실온에서 60rpm으로 30분간 교반하여 용해시켰다. 용해된 세포액을 세포외 신호조절인산화효소(extracellular signal-regulated kinase; ERK)와 인산화된 ERK를 검출할 수 있는 항체(Cisbio/cat# 64ERKPEG)와 섞은 후 2시간 동안 상온에서 반응시킨 후 형광검출기 (TECAN/ GENiosPro)를 이용하여 형광검출반응을 탐지하였다. 활성은 EC50값을 구하여 비교하였으며, 그 결과를 도 1a 내지 1c에 나타냈다.
도 1a 내지 1c에서 보는 바와 같이, 야생형 FGF21 단백질에 돌연변이 서열을 도입하더라도 시험관 내 활성 저해가 없는 것을 확인할 수 있었으며, 각 융합 단백질의 FGF21의 활성 정도는 유사한 것을 확인하였다. 또한 대장균에서 발현한 시료 DFD6(E-coli)와 동물세포에서 발현한 시료 DFD6을 통해 야생형 FGF21 단백질에 N-당화 돌연변이를 도입하더라도 시험관 내 활성 저해가 없음을 확인하였다.
실험예 1-2. 링커 서열에 따른 활성 측정 결과
위 제조예 1에서 제조된 융합 단백질인, DFD1, DFD3, DFD4, DFD13의 시험관 내 활성을 측정하였다.
구체적으로, 제조예 1-5에서 얻어진 단백질이 포함된 농축물을 이용하여 실험예 1-1과 동일한 방법으로 융합 단백질의 FGF 21 활성을 측정하였으며, 그 결과는 도 2a 및 2b에 나타냈다.
그 결과, 도 2a 및 2b에서 보는 바와 같이, 링커 서열에 따라 약간의 활성 차이를 나타내지만 큰 폭의 활성 감소는 없음을 확인하였다.
실험예 1-3. DFD1 , RGE ( Amgen ), Fc - FGF21 (Lilly)의 실험 결과
위 제조예 1에서 제조된 융합 단백질인 DFD1와 대조 물질로 RGE(Amgen) 및 Fc-FGF21(Lilly)의 시험관 내 활성을 측정하였다.
구체적으로, 제조예 1-5에서 얻어진 단백질이 포함된 농축물과 상기 대조 물질인 단백질을 이용하여 실험예 1-1과 동일한 방법으로 융합 단백질의 FGF 21 활성을 측정하였으며, 그 결과는 도 3에 나타냈다.
그 결과, 도 3에서 보는 바와 같이, DFD1과 RGE(Amgen)은 유사한 수준의 시험관 내 활성을 나타냈고, Fc-FGF21(Lilly)은 다른 물질 대비 약 2배 정도 우수한 시험관 내 활성을 확인하였다.
실험예 2. 융합 단백질의 안정성 평가
실험예 2-1. 안정성 평가 실험 방법
샘플의 초기 상태에서의 단백질 응집체의 양을 측정하기 위하여, 크기 배제 크로마토그래피(SEC-HPLC) 방법을 이용하여 고분자량 응집체의 함량(%)(%HMW)를 측정하였으며, 그 결과는 도 4에 나타냈다.
구체적으로, SEC-HPLC 방법은 토소하스(TosoHaas) 모델 TSK-GEL G3000SWXL 칼럼을 사용하였다. 완충액 1X PBS, 1 mM EDTA, pH 7.4를 칼럼에 1 ml/min의 유속으로 흘려주어 평형화시켰다. 제조예 1-5에서 얻어진 DFD4와 DFD13 단백질 원액을 30,000 분자량 컷오프 원심분리 필터를 사용하여, 3000 rpm, 4℃에서 20 mg/ml 이상의 표적 농도로 농축하였다. BCA 정량분석으로 각 샘플의 농도를 측정한 후, 완충액 1X PBS, 1 mM EDTA, pH 7.4로 희석하여 최종 20 mg/ml이 되도록 하였다. DFD4와 DFD13의 초기 %HMW를 측정하기 위해, 20 mg/ml의 샘플을 1X PBS, 1 mM EDTA, pH 7.4로 희석하여 1 mg/ml이 되도록 한 후, SEC-HPLC 칼럼에 100 ㎕를 주입하여 분석하였다.
또한, 각 샘플의 안정성을 평가하기 위해, 5℃, 25℃ 및 37℃에서 2주 동안 보관하면서 4일, 8일, 14일에 SEC-HPLC 방법을 이용하여, %HMW를 측정하였다.
그 결과, 도 4에서 보는 바와 같이, DFD13은 DFD4 대비 초기 시점 및 2주 경과 시점까지 고분자량 응집체 비율(%HMW)이 낮은 것으로 확인되었고, 이는 EIRP 돌연변이가 도입됨에 따라 FGF21 변이체 융합 단백질의 안정성이 개선되어 %HMW가 큰 폭으로 감소하였다.
실험예 2-2. 안정성 평가 결과
FGF21의 LLLE(98-101)에 도입된 EIRP 돌연변이가 안정성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, DFD4(서열번호: 29)및 DFD13(서열번호: 35)에 대하여 상기 실험예 1-1의 방법과 같이 안정성을 측정하였다. DFD4와 DFD13의 0시간 샘플(초기; 0일)과 4일, 8일 및 14일 동안 보관하면서 분석한 결과를 하기 표 4에 요약하였다(표 4의 N.D.는 검출되지 않음(Not detected)을 의미한다).
20 mg/ml 농도에서 DFD4와 DFD13의 2주간 안정성 (%HMW)
DFD4 DFD13
Day 5℃ 25℃ 37℃ 5℃ 25℃ 37℃
0일 0.91 0.56
4일 4.25 11.64 5.12 0.36 0.34 0.84
8일 6.16 9.99 4.87 N.D. N.D. N.D.
14일 8.15 8.83 4.71 N.D. N.D. 0.32
표 4에서 보는 바와 같이, 보관 초기(보관 0일)에서의 %HMW 양은 DFD4의 경우 0.91%, DFD13의 경우 0.56%로 나타났다. 보관 2주 경과 시점, 25℃ 조건에서 %HMW 양은 DFD4의 경우 8.83%까지 증가하는데 반하여, DFD13의 경우 %HMW가 관찰되지 않았다. DFD13은 DFD4 대비 초기 시점 및 2주 경과 시점까지 %HMW 비율이 낮은 것으로 확인됐다. 이는 EIRP 돌연변이가 도입됨에 따라, FGF21 변이체 융합 단백질의 %HMW 비율이 큰 폭으로 감소함을 나타낸다.
실험예 3. 융합 단백질의 약동역학 측정
실험예 3-1. 약동역학 측정 실험 방법
㈜오리엔트 바이오(Orient BIO, Korea)에서 구입한 6주령의 수컷 ICR 마우스를 약물 처리일 전날에 체중의 평균값이 유사하도록 군분리(채혈 시간당 n=3)한 후, 샘플을 각각 1 mg/kg (RGE의 경우 2 mg/kg) 용량을 단회 피하 투여하였으며, 혈액 샘플은 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72 및 96시간 차에 수집하였다. 온전한(intact) 전체 길이 FGF21 단백질의 혈중 농도를 측정하기 위해, 본 시험에서는 N-말단 및 C-말단 FGF21 단백질에 대해 면역 반응성을 갖는 Intact human FGF21 ELISA Kit(F1231-K01, Eagle Biosciences, USA)를 사용하였다. 마우스에 각 융합 단백질을 피하 주사한 후 96시간까지의 혈액 샘플 내 혈중 농도를 측정하여 각 물질별 약물 동태 파라미터를 산출하였다.
실험예 3-2. 약동역학 활성 측정 결과
마우스에서 융합 단백질들의 피하 투여 후 시간에 따른 혈중 농도 그래프(도 5)를 바탕으로 약물 동태 파라미터를 산출하여 하기 표 5에 나타냈다.
Parameters DFD4 DFD5 DFD6 DFD7 DFD9 DFD13 DFD18 DFD72 DFD73 DFD74 DFD6 (E. coli) RGE*
Tmax (Hour) 12 12 12 4 4 12 12 8 8 8 8 12
Cmax (ng/ml) 1288 1732 2868 696 384 1070 3428 2962 3296 3996 1399 9921
AUClast
(ng·hr/ml)		 25856 40706 100107 14118 4656 28785 104230 115977 123511 206634 37269 325747
Half-life (Hour) 5.5 8.0 14.9 19.7 17.4 7.1 11.0 14.4 16.6 26.0 9.1 12.9
약물의 노출 정도를 나타내는 AUC(Area Under the Curve)를 기준으로 각 융합 단백질들의 약동역학 프로파일을 비교 평가하였다.
표 5에서 보는 바와 같이, DFD4와 DFD13 그리고 DFD6과 DFD73을 서로 비교하여 판단해 볼 때, EIRP 서열 도입에 의해 대략적으로 10 내지 20% 정도 AUC가 증가하였으며, DFD9와 DFD4를 비교해 볼 때, TGLEAV 도입에 의해 약 6배 정도 AUC가 증가하였다.
또한, TGLEAN, G170N, G174N 변이체들은 FGF21의 C말단에서 생체 내에서 단백질 분해(proteolysis) 된다고 알려진 FGF21의 C-말단 부분에 N-당화 도입을 통한 지속성 향상을 목표로 고안되었으며, 각각의 대조 물질 대비 N-당화 도입에 의한 AUC 증가를 확인하였다. 실제로 N-당화 도입에 의한 AUC 개선 효과를 확인하기 위하여, 당화가 일어나지 않는 대장균에서 생산한 물질인 DFD6(E. coli)과 비교하였을 때 인간 세포주에서 생산된 DFD6가 대장균 생산 DFD6(E. coli) 대비 3배 이상 우수한 AUC 수치를 보임으로서, 당화에 의한 약물 동태 프로파일의 개선이 일어남을 입증하였다.
A180E는 기존 암젠사의 특허에 공개되어 있는 돌연변이로서(WO 2009/149171) TGLEAV 또는 G170N이 도입된 변이체들 (DFD13, DFD73)에 A180E를 도입 (DFD18, DFD74)하였을 경우, 약 2 내지 3배 정도 추가적인 AUC 증가가 나타남을 확인하였다.
상기 결과들을 정리해 보면 다양한 변이체들의 도입 및 이들의 조합을 통하여, 야생형 FGF21 융합 단백질인 DFD9 대비 우수한 약물 동태 파라미터의 개선을 확인할 수 있었다. 가장 우수한 AUC 수치를 보여주는 융합 단백질은 EIRP, G170N 및 A180E가 도입된 DFD74로서 DFD9 대비 약 45배 뛰어난 AUC 개선 효과를 보였다. 또한 암젠사의 RGE 물질과 비교 시 RGE의 투여 용량인 2 mg/kg을 고려할 때 DFD74의 경우 RGE 대비 더 우수한 약물 노출 정도를 보인다고 할 수 있다. 전체적인 변이 서열에 의한 약동역학 개선 효과는 표 6에 요약하였다.
변이 서열 기호 변이 위치 대조물질 vs 개선물질 약동역학 파라미터 측정 결과
EIRP 98-101 DFD4 vs DFD13 AUC 개선
DFD6 vs DFD73
TGLEAV 170-174 DFD9 vs DFD4 AUC 개선
TGLEAN 170-174 DFD9 vs DFD5 AUC 개선
G170N 170 DFD9 vs DFD6 AUC 개선
DFD6(E. coli) vs DFD6 AUC 개선
G174N 174 DFD9 vs DFD7 AUC 개선
A180E 180 DFD13 vs DFD18 AUC 개선
DFD73 vs DFD74 AUC 개선
실험예 4. ob/ob 마우스에서 융합 단백질의 활성 평가
실험예 4-1. ob/ob 마우스에서 활성 평가 실험 방법
ob/ob 마우스는 유전적으로 렙틴(leptin)이 결핍되어 고혈당증, 인슐린 저항, 과식증, 지방간 및 비만을 특징으로 하는 마우스로서, 주로 2형 당뇨병에 대한 연구에 있어 널리 사용되고 있다. 수컷 ob/ob 마우스(Harlan, USA)는 라온바이오(Korea)에서 구입하였으며, 도착 시 5 내지 6주령이었고, 3주 동안 순응하여 약물 처리 시에 8 내지 9주령이었다. 약물 처리일(0일) 전날에 체중 및 꼬리 혈당의 평균값이 유사하도록 군분리(군당 n=8)한 후, 각각의 용량에 따라 샘플을 단회 피하 투여하였다. 이때 비히클 처리는 둘베코스 포스페이트 완충 식염수(Dulbecco's phosphate buffered saline, DPBS, Gibco, USA)를 투여하였으며, 혈액 내 글루코스 농도는 글루코닥터 혈당측정기(올메디쿠스, Korea)를 사용하여 측정하였다. 투여 후 하루 간격으로 14일차까지의 비절식 혈당과 체중을 측정하였으며, 투여 전과 시험 종료 후 각 투여 그룹에서의 당화혈색소 수치의 변화 또한 측정하였다. 당화혈색소 수치는 DCA 2000 HbA1c kit (Siemens, 5035C)를 사용하여 산출하였다.
실험예 4-2. ob/ob 마우스에서 활성 평가 결과
수컷 ob/ob 마우스에 DFD18 및 DFD72를 30 또는 100 nmol/kg, 또는 DFD74를 10, 30 또는 100 nmol/kg을 각각 단회 피하 투여 후 시간에 따른 비절식 혈당 및 체중 변화를 관찰하였다.
DFD18, DFD72, DFD74 모두 용량의존적으로 혈당 감소 효과를 나타냄을 확인하였으며, 고용량인 100 nmol/kg에서 세 물질 비교 시, DFD18 대비 DFD72 및 DFD74가 더 우수한 혈당 강하 효과를 나타냈다(도 6). 또한, 본 시험 그룹에 대조 물질로서 사용한 Fc-FGF21(Lilly)의 경우 동일 용량(30 nmol/kg)에서 비교 시, DFD18, DFD72 및 DFD74 대비 낮은 혈당 감소 효과가 관찰되었다.
각 물질 투여에 의한 체중 감소 효과는 고용량인 100 nmol/kg 투여 용량에서 비교 시, DFD72가 ob/ob 마우스에서 약 6%의 체중 감소 효과를 보여 가장 우수하였으며, DFD18 및 DFD74 순으로 체중 감소 효과를 보여주었다(도 7).
시험 종료 후 혈당의 평균 수치를 나타내는 당화혈색소 수치를 측정하여 각 시험그룹의 평균 혈당 변화를 분석하였다. 대조 물질인 Fc-FGF21 (Lilly)를 제외한 모든 투여 그룹에서 투여전과 시험 종료 시 당화혈색소 차이값이 음의 값으로 산출되었으며 따라서 대조 물질 대비 혈당 강하에서 우수성을 확인하였다(도 8).
실험예 5. HFD / STZ 마우스에서 융합 단백질의 활성 평가
실험예 5-1. HFD / STZ 마우스에서 활성 평가 실험 방법
FGF21 변이체 융합 단백질에 대해 추가적인 당뇨 모델에서 혈당 및 체중 감소에 대한 효과를 비교 평가하기 위하여, HFD/STZ 마우스 모델에서 각 융합 단백질들을 비교 평가하였다. HFD/STZ 마우스 모델은 기존 식이 유도 비만 마우스(C57BL/6에 60 kcal% 고지방 사료 8주 이상 급여) 모델이 인슐린 저항성을 유발하지만 고혈당 및 당뇨병적 특징이 미약하기 때문에 이에 대한 단점을 보완하기 위하여 고지방 식이(HFD; high fat diet)와 스트렙토조토신(STZ; streptozotocin)의 저농도 투여로 췌장의 베타 세포 기능 장애와 인슐린 분비 저하를 보일 수 있는 동물 모델이며 제2형 당뇨 약리연구에 적합한 모델로 사용되고 있다.
구체적으로, HFD/STZ 마우스 모델을 유도하기 위하여 C57BL/6(Japan SLC)에 60 kcal% 고지방 사료를 4주 급여 후 STZ 50 mg/kg (Sigma, 85882)를 3일 동안 매일 복강 투여하여 췌장의 베타 세포 기능 장애를 유도하고 2주간의 고지방 사료를 추가 급여한 후, 비절식 혈당이 200 mg/dl이상인 동물을 시험에 사용하였다. 약물 처리일(0일) 전날에 체중 및 꼬리 혈당의 평균값이 유사하도록 군분리(군당 n=6)한 후, 각각의 용량에 따라 샘플을 단회 피하 투여하였다. 이때 비히클 처리는 둘베코스 포스페이트 완충 식염수(Dulbecco's phosphate buffered saline, DPBS, Gibco, USA)를 투여하였으며, 혈액 내 글루코스 농도는 글루코닥터 혈당측정기(올메디쿠스, Korea)를 사용하여 측정하였다. 투여 후 하루 간격으로 14일차까지의 비절식 혈당과 체중을 측정하였으며, 투여 전과 시험 종료 후 각 투여 그룹에서의 당화혈색소 수치의 변화 또한 측정하였다. 당화혈색소 수치는 DCA 2000 HbA1c kit (Siemens, 5035C)를 사용하여 산출하였다.
실험예 5-2. HFD / STZ 마우스에서 활성 평가 결과
수컷 HFD/STZ 마우스에 DFD72, DFD74를 각각 10 nmol/kg 단회 피하 투여 후 시간에 따른 비절식 혈당 감소 및 체중 변화를 관찰하였다.
비절식 혈당 변화에 있어서 DFD72와 DFD74는 유사한 혈당 감소 효과를 보였으며 투여 후 10일차까지 유지되다가 10일차 이후로 약물이 소실되면서 혈당 감소 효과가 사라지는 경향을 확인하였다(도 9). 투여 후 10일 차 이후의 비절식 혈당 변화 양상에 있어서는 DFD72가 DFD74대비 더 지속되는 경향이 관찰되었다.
또한, FGF21 변이체 단백질 투여에 의한 체중 감소 효과는 투여 후 6일차까지 DFD72, DFD74 모두 유사하게 대략 5%정도의 체중 감소 효과가 나타났으며, 10일차 이후로는 체중 감소 효과가 사라지는 경향을 확인하였다(도 10).
시험 종료 후 혈당의 평균 수치를 나타내는 당화혈색소 수치를 측정하여 각 시험 그룹의 평균 혈당 변화를 분석하였다. 비히클 투여 그룹이 시험 종료 후 당화혈색소 수치 변화가 0.25 증가한데 비하여, DFD74 투여 그룹은 0.1이 증가하였으며, DFD72 그룹의 경우 0.27이 감소하였다(도 11).
실험예 6. 식이 유도 비만 마우스에서 융합 단백질의 활성 평가
실험예 6-1. 식이 유도 비만 마우스에서 활성 평가 실험 방법
FGF21 변이체 융합 단백질인 DFD18의 체중 감소 효과를 식이 유도 비만 마우스에서 평가하였다. 식이 유도된 비만을 유발하기 위하여, C57BL/6J 마우스들을 ㈜중앙실험동물로부터 구입하여 60 kcal% 지방을 함유하는 고지방 식이(Research diet) 상에서 8 내지 12주 정도 사육하여 비만 마우스 모델을 제작하였다. 약물 처리일(0일) 전날에 체중의 평균값이 유사하도록 군분리(군당 n=8)한 후, 30 nmol/kg의 용량으로 단회 피하 투여 후 비히클인 PBS 대비 체중 변화를 관찰하였다.
실험예 6-2. 식이 유도 비만 마우스에서 활성 평가 결과
식이 유도 비만 마우스에 30 nmol/kg의 DFD18을 단회 투여한 후, 시간에 따른 체중 변화를 관찰해 볼 때, 투여 후 10일 차까지 계속적인 체중 감소가 일어났으며 투여 후 11일 차에서 최대 체중 감소(~18%) 후 14일 차까지 유지됨을 확인하였다(도 12).
제조예 2. 이중 작용 단백질의 제조 및 정제
제조예 2-1. 이중 작용 단백질의 발현을 위한 발현벡터의 제조
Fc 융합 GLP-1 변이체 구조에서, GLP-1 변이체 단백질 서열 또는 이에 융합되는 Fc 힌지 서열이 시험관 내 활성, 약물동태 프로필 및 약리 효능에 미치는 영향을 확인하고자, 다양한 서열의 Fc 융합 GLP-1 변이체 단백질을 고안하였다. 하기 표 7에 GLP-1 변이체 단백질 서열을 기술하였고, 표 8에 Fc 융합 GLP-1 변이체 단백질 서열을 기술하였다.
서열번호 GLP-1 변이체 단백질 서열
서열번호: 43 GLP-1(A2G)
서열번호: 44 GLP-1(GE)
서열번호: 45 GLP-1(GG)
서열번호: 46 GLP-1(GEG)
서열번호 Fc 융합 GLP-1 변이체 단백질
서열번호: 49 DFD52: GLP1(A2G)-HyFc5
서열번호: 50 DFD53: GLP1(A2G)-HyFc40
서열번호: 51 DFD54: GLP1(GE)-HyFc5
서열번호: 52 DFD55: GLP1(GE)-HyFc40
서열번호: 53 DFD56: GLP1(GG)-HyFc5
서열번호: 54 DFD57: GLP1(GG)-HyFc40
서열번호: 55 DFD58: GLP1(GEG)-HyFc5
서열번호: 56 DFD59: GLP1(GEG)-HyFc40
표 8에서 HyFc5는 서열번호: 47을, HyFc40은 서열번호: 48을 각각 나타낸다.
한편, 이중 작용 단백질 구조에서, GLP-1 변이체 단백질 서열, FGF21 변이체 단백질 서열, GLP-1 변이체에 융합되는 Fc 힌지 서열, 또는 FGF21 변이체 단백질과 Fc 사이에 연결되는 링커 서열이 시험관 내 활성, 약물동태 프로필, 및 약리 효능에 미치는 영향을 확인하고자 다양한 서열의 이중 작용 단백질을 고안하였다. 하기 표 9에 GLP-1 변이체 단백질 및 FGF21 변이체 단백질을 포함하는 이중 작용 단백질 서열을 나타내었다. 각 이중 작용 단백질은 N-말단으로부터 C-말단으로 GPL-1 변이체 단백질, 면역로불린의 Fc 영역, 링커, FGF21 변이체 단백질 순서로 연결되어있다.
서열번호 물질
기호		 GLP-1
변이체 단백질 서열		 융합 캐리어 링커 서열 FGF21
서열변화
서열번호: 58 DFD23 GLP-1(A2G) hyFc40 (서열번호: 48) GS3
(서열번호: 4)		 FGF21(EIRP, TGLEAV)
서열번호: 59 DFD24 GLP-1(GE) hyFc5 (서열번호: 47) GS3
(서열번호: 4)		 FGF21(EIRP, TGLEAV)
서열번호: 60 DFD25 GLP-1(GE) hyFc40 (서열번호: 48) GS3
(서열번호: 4)		 FGF21(EIRP, TGLEAV)
서열번호: 61 DFD26 GLP-1(GG) hyFc5 (서열번호: 47) GS3
(서열번호: 4)		 FGF21(EIRP, TGLEAV)
서열번호: 62 DFD27 GLP-1(GG) hyFc40 (서열번호: 48) GS3
(서열번호: 4)		 FGF21(EIRP, TGLEAV)
서열번호: 63 DFD28 GLP-1(GEG) hyFc5 (서열번호: 47) GS3
(서열번호: 4)		 FGF21(EIRP, TGLEAV)
서열번호: 64 DFD29 GLP-1(GEG) hyFc40 (서열번호: 48) GS3
(서열번호: 4)		 FGF21(EIRP, TGLEAV)
서열번호: 65 DFD69 GLP-1(GEG) hyFc40 (서열번호: 48) GS3
(서열번호: 4)		 FGF21(EIRP, TGLEAV, A180E)
서열번호: 66 DFD112 GLP-1(GEG) hyFc40 (서열번호: 48) GS3
(서열번호: 4)		 FGF21(EIRP, TGLEAN, A180E)
서열번호: 67 DFD114 GLP-1(GEG) hyFc40 (서열번호: 48) GS3
(서열번호: 4)		 FGF21(EIRP, G170N, A180E)
구체적으로, 각 이중 작용 단백질의 아미노산 서열을 기초로 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 ㈜바이오니아사에 의뢰하여 합성하였다. 각 이중 작용 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 5' 말단과 3' 말단에 각각 NheI 과 NotI 제한효소 서열을 첨가하였고, 5' 말단의 제한효소 서열 뒤에 단백질 번역을 위한 시작 코돈과 발현된 단백질을 세포 밖으로 분비하게 하는 유도서열(MDAMLRGLCCVLLLCGAVFVSPSHA)을 삽입하였다. 각 이중 작용 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 뒤에는 종결코돈을 삽입하였다. NheI과 NotI 두 제한효소 서열을 이용하여 각 이중 작용 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 pTrans-empty 발현벡터에 클로닝하였다. pTrans-empty 발현벡터는 독일의 CEVEC사에서 입수 하였으며, CMV 프로모터, pUC 유래 복제기원, SV40 유래 복제기원, 암피실린 내성 유전자를 가지는 간단한 구조의 발현벡터이다.
제조예 2-2. Fc 융합 GLP-1 변이체 및 이중 작용 단백질의 발현을 위한 플라스미드 DNA의 제작
상기 제조예 2-1에서 제작한 각 발현벡터를 대장균에 형질전환하여 발현에 쓰일 다량의 플라스미드 DNA를 얻었다. 각 발현벡터는 세포벽이 약화된 대장균내에 열쇼크를 통해 형질도입한 후, LB 플레이트에 도말하여 콜로니를 확보하였다. 확보된 콜로니를 LB배지에 접종한 후 37℃에서 16시간 배양하여 각 발현벡터를 세포내에 가지는 대장균을 각 100 ml씩 확보하였다. 확보된 대장균은 원심분리를 통해 배양배지를 제거한 후 P1, P2, P3 용액(QIAGEN사, cat. no.:12963)을 첨가하여 세포벽을 깬 뒤, 단백질과 DNA를 분리한 DNA 혼탁액을 확보하였다. Qiagen DNA 정제 칼럼을 이용해 확보한 용액으로부터 플라스미드 DNA를 정제하였다. 용출된 DNA는 아가로즈 젤 전기영동을 통해 확인하였으며, 나노드롭 기기(Thermo scientific사, Nanodrop Lite)를 이용하여 농도와 순도를 측정한 후 발현에 사용하였다.
제조예 2-3. CAP-T 세포에서 Fc 융합 GLP-1 변이체 및 이중 작용 단백질의 발현
상기 제조예 2-2에서 분리한 각 플라스미드 DNA로 인간세포주를 형질전환하였다. PEM 배지(Life technologies)에서 배양 중인 CAP-T 세포(CEVEC사)에 PEI 용액(Polyplus사, cat. no.:101-10N)을 이용하여 각 플라스미드 DNA를 형질도입하였다. DNA와 PEI 용액의 혼합액을 인비트로젠사의 Freestyle293 발현 배지를 이용하여 현탁한 세포에 섞고 37℃에서 5시간 배양 후 PEM 배지를 첨가하였다. 37℃에서 5-7일간 배양 후 원심분리를 통해 세포를 제거하여 각 단백질이 포함된 상등액을 확보하였다.
제조예 2-4. Fc 융합 GLP-1 변이체 및 이중 작용 단백질의 정제
Protein A 친화크로마토그래피 칼럼(GE Healthcare)을 1X PBS(pH 7.4) 완충액으로 평형화하였다. 제조예 2-3에서 제조한 각 Fc 융합 GLP-1 변이체 및 이중 작용 단백질을 포함하는 배양 상등액을 0.2 μm 필터로 여과한 후, Protein A 친화크로마토그래피 칼럼에 로딩하였다. 1X PBS(pH 7.4) 완충액으로 칼럼을 세척한 후 100 mM 글리신(pH 3.0) 완충액으로 각 단백질을 용출하였다. 친화크로마토그래피를 통해 얻은 단백질은 음이온교환수지(POROS® HQ 50 μm, Thermo Fisher Scientific) 칼럼을 이용해 정제하였다. 음이온교환수지 칼럼을 50 mM Tris(pH 8.0) 완충액으로 평형화한 후, 친화크로마토그래피에서 용출한 단백질을 로딩하였다.
50 mM Tris(pH 8.0) 완충액으로 칼럼을 세척한 후, 50 mM Tris(pH 8.0) 완충액을 농도 구배로 흘려준 후 용출된 분획을 분석하였다. 크기 배제 크로마토그래피(SEC-HPLC) 실험법을 이용하여 각 분획을 분석한 후 고순도의 Fc 융합 GLP-1 변이체 및 이중 작용 단백질이 존재하는 부분을 모은 다음 최종 완충액 1X PBS, 1 mM EDTA, pH 7.4로 4℃에서 밤새 투석하였다. 투석이 끝난 후 얻어진 단백질 원액 30,000 MW 컷오프 원심분리 필터를 사용하여, 3000 rpm, 4℃에서 농축하였다. 각 단백질의 농도는 BCA 정량분석으로 측정하였다.
실험예 7. 이중 작용 단백질의 시험관 내 활성 측정 결과
실험예 7-1. DFD23 , 24, 25, 26, 27, 28 및 29의 실험 결과
이중 작용 단백질인 DFD23, DFD24, DFD25, DFD26, DFD27, DFD28, 및 DFD29의 시험관 내 GLP-1 활성을 측정하였다. 구체적으로, 이중 작용 단백질의 GLP-1 활성을 평가하기 위해 인간 GLP-1 수용체가 과발현된 CHO 세포주(Eurofins, HTS163C2)를 구입하여 사용하였다. 활성 평가를 위해 융합 단백질이 포함된 샘플(이하, "샘플"로 기재, 제조예 2-4의 단백질 원액)을 25 nM 농도에서 4배 계열 희석하여 인간 GLP-1 수용체 과발현 CHO 세포주에 30분간 처리한 후 생성된 세포 내 cAMP을 측정하였다 (Cisbio, 62AM4PEB). 각 물질 간의 활성 비교는 EC50 값을 구하여 평가하였다.
도 13에서 보는 바와 같이, GLP-1(A2G) 서열을 포함하는 이중 작용 단백질의 경우 다른 GLP-1 변이체 서열을 포함하는 이중 작용 단백질 대비 2~3배 정도 낮은 활성을 보였다. GLP-1(A2G) 이외의 돌연변이 서열을 포함하는 이중 작용 단백질에 대한 GLP-1 활성은 큰 차이를 보이지 않았다.
실험예 7-2. DFD59 , 69, 112 및 114의 실험 결과
상기 제조예 2에서 제조된 이중 작용 단백질 DFD69, DFD112, 및 DFD114와 Fc 융합 GLP-1 변이체인 DFD59의 시험관 내 GLP-1 활성을 측정하였다. 구체적으로, 각 단백질의 GLP-1 활성을 평가하기 위해 인간 GLP-1 수용체가 과발현된 CHO 세포주(Eurofins, HTS163C2)를 구입하여 사용하였다. 활성 평가를 위해 각 단백질이 포함된 샘플을 25 nM 농도에서 4배 계열로 순차적으로 희석하여 인간 GLP-1 수용체 과발현 CHO 세포주에 30분간 처리한 후 생성된 세포 내 cAMP을 측정하였다 (Cisbio, 62AM4PEB).
도 14에서 보는 바와 같이, 각 물질 간의 활성 비교는 EC50 값을 구하여 평가하였다. 3종의 이중 작용 단백질은 유사한 EC50 값을 나타내었으며, FGF21 변이체를 포함하지 않는 DFD59는 이중 작용 단백질 대비 약 2배의 활성을 나타내었다.
다음으로, DFD69, DFD112, 및 DFD114의 FGF21 부분의 시험관 내 활성을 측정하였다. 구체적으로, 이중 작용 단백질의 FGF21 부분의 시험관 내 활성을 평가하기 위해 FGF21의 보조 수용체인 베타-클로토가 과발현하도록 제작된 HEK293 세포주를 이용하였다. 활성 평가를 위해 이중작용 단백질이 포함된 샘플을 3 μM 농도에서 3배 계열로 순차적으로 희석하여 5시간의 혈청 결핍 상태로 배양한 인간 베타-클로토 과발현 HEK293 세포주에 20분간 처리한 후 세포용해 버퍼(Cisbio/cat# 64ERKPEG) 를 첨가한 후 실온에서 60rpm으로 30분간 교반하여 세포를 용해시켰다. 용해된 세포액은 ERK와 인산화된 ERK를 검출할 수 있는 항체와 섞은 후 2시간 상온에서 반응시킨 후 형광검출기(TECAN/ GENiosPro)를 이용하여 형광검출반응을 탐지하였다. 활성은 EC50 값을 구하여 비교하였다.
그 결과, 도 14에서 보는 바와 같이, 3종 이중작용 단백질 DFD69, DFD112, 및 DFD114의 FGF21 부분의 시험관 내 활성은 모두 유사함을 확인하였다.
실험예 8. 이중 작용 단백질의 약동역학 측정
실험예 8-1. 약동역학 측정 실험 방법
㈜오리엔트 바이오(Orient BIO, Korea)에서 구입한 6주령의 수컷 ICR 마우스를 약물 처리일 전날에 체중의 평균값이 유사하도록 군분리(채혈 시간당 n=3)한 후, 샘플을 각각 1 mg/kg 용량을 단회 피하 투여하였으며, 혈액 샘플은 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 144, 192 및 240 시간차에 수집하였다. 각 이중 작용 단백질의 혈중 농도 정량은 각각의 활성 단백질 부분인 FGF21 부분과 GLP1-Fc 부분으로 나누어서 정량하였다. 이중 작용 단백질 내 온전한(intact) 전체 길이 FGF21 부분의 혈중 농도를 측정하기 위해, N-말단 및 C-말단 FGF21에 대해 면역 반응성을 갖는 Intact human FGF21 ELISA Kit(F1231-K01, Eagle Biosciences, USA)를 사용하였다. 또한 이중작용 단백질 내 active GLP1-Fc부분의 혈중 농도를 측정하기 위해, 내부에서 개발된 GLP-1의 N말단 및 Fc에 면역 반응성을 갖는 항체를 이용하여 ELISA 분석하였다. 마우스에 각 단백질을 단회 피하 주사 후 240시간 까지의 혈액 샘플 내 각 물질별 FGF21과 GLP1-Fc부분의 혈중 농도를 측정하여 각각의 약물 동태 파라미터를 산출하였다.
실험예 8-2. 약동역학 활성 측정 결과
마우스에 각 단백질들의 단회 피하 투여 후 시간에 따른 활성 물질 별 혈중 농도(도 15)를 바탕으로 이중 작용 단백질의 FGF21 부분과 GLP1-Fc 부분에 대한 약물 동태 파라미터를 산출하여 하기 표 10에 나타냈다.
　 FGF21 detection GLP1-Fc detection
Parameters DFD69 DFD112 DFD114 DFD59 DFD69 DFD112 DFD114
Tmax (Hour) 8 8 24 4 4 8 4
Cmax (ng/ml) 2715 3619 3711 5202.1 3234 4454 3616
AUClast (ng·hr/ml) 100907 144395 222504 182852 149083 189338 171687
Half-life (Hour) 13.4 14.2 39.9 20.7 23.3 24.7 27.2
약물의 노출 정도를 나타내는 AUC(Area Under the Curve)를 기준으로 각 이중 작용 단백질들의 약동역학 프로파일을 비교 평가하였다
표 10에서 보는 바와 같이, FGF21 부분의 약물 동태 파라미터는 DFD114가 가장 우수한 약물 노출 정도 (AUC) 및 반감기를 보였으며 DFD112, DFD69 순으로 높은 AUC수치를 나타내었다. DFD114의 경우 DFD69 대비 약 2배 이상 증가한 AUC 수치를 나타내었다. 반면 동일한 GLP-1 변이체 서열을 포함하는 4개 물질(DFD59, DFD69, DFD112 및 DFD114)에 대한 GLP1-Fc 부분에 대한 약물 동태는 모두 유사한 AUC 값을 나타냈다.
실험예 9. db/db 마우스에서 활성 평가
실험예 9-1. db/db 마우스에서 활성 평가 실험 방법
db/db 마우스는 유전적으로 렙틴(leptin) 수용체가 결핍되어 고혈당증, 인슐린 저항, 과식증, 지방간 및 비만을 특징으로 하는 마우스로서, 렙틴이 결핍된 ob/ob 마우스 대비 더 심화된 고혈당 및 비만 양상을 보이며 주로 2형 당뇨병에 대한 연구에 있어 널리 사용되고 있다. 수컷 db/db 마우스(Harlan, USA)는 라온바이오(Korea)에서 구입하였으며, 도착 시 5 내지 6주령이었고, 3주 동안 순응하여 약물 처리 시에 8 내지 9주령이었다. 약물 처리일(0일) 전날에 체중 및 꼬리 혈당의 평균값이 유사하도록 군분리(군당 n=6)한 후, 각각의 용량에 따라 샘플을 단회 피하 투여하였다. 이때 비히클 처리는 둘베코스 포스페이트 완충 식염수(Dulbecco's phosphate buffered saline, DPBS, Gibco, USA)를 투여하였으며, 혈액 내 글루코스 농도는 글루코닥터 혈당측정기(올메디쿠스, Korea)를 사용하여 측정하였다. 투여 후 하루 간격으로 14일차까지의 비절식 혈당과 체중을 측정하였으며, 투여 전과 시험 종료 후(16일) 각 투여 그룹에서의 당화혈색소 수치의 변화 또한 측정하였다. 당화할색소 수치는 DCA 2000 HbA1c kit (Siemens, 5035C)를 사용하여 산출하였다.
실험예 9-2. db/db 마우스에서 활성 평가 결과
수컷 db/db 마우스에 이중 작용 단백질 DFD114를 10, 30 nmol/kg 단회 피하 투여, GLP-1 단독 지속형 물질인 DFD59를 30 nmol/kg 단회 피하 투여, 이중 작용 단백질 DFD114의 각 Fc-FGF21, GLP1-Fc 단독 물질의 병용 투여 대비 우수성을 보기 위하여 각 GLP1-Fc, Fc-FGF21인 DFD59, DFD74를 각각 30 nmol/kg 병용 투여 후 시간에 따른 비절식혈당 및 체중 변화를 관찰하였다.
지속형 GLP1-Fc 단백질인 DFD59의 경우 투여 후 1일차까지 급격한 혈당 강하 효과를 보이지만 2일차 이후로 혈당 감소가 줄어들어 4일 차 이후는 비히클 투여군과 유사한 혈당 수치를 나타내었다. 반면 DFD114 투여 군은 3일차까지 우수한 혈당 강하 효과를 보였으며 4일차 이후로 30 nmol/kg 용량 대비 10 nmol/kg 용량에서 빠르게 혈당 감소 효과가 소실되었으며 투여 용량에 따라 혈당 감소 효과의 지속성의 차이를 보였다. 각 물질의 병용 투여에서는 다른 그룹 대비 가장 지속적인 혈당 감소 효과를 보였으며 이는 GLP-1과 FGF21의 조합이 우수한 혈당 조절 작용이 있음을 보여준다(도 16).
체중 감소 효과에 있어서도 혈당 감소 효과와 유사한 경향으로 DFD59와 DFD74의 병용 투여 군이 가장 우수한 체중 증가 억제 효과를 보였으며 DFD114 30 nmol/kg 투여 군에서도 우수한 체중 증가 억제가 나타났다(도 17).
시험 종료 후 혈당의 평균 수치를 나타내는 당화혈색소 수치를 측정하여 각 시험그룹의 평균 혈당 변화를 분석하였다. 도 18에서 보는 바와 같이, 비히클 처리군에서는 투여 전 대비 시험 종료 후 당화혈색소 수치가 증가하였으며 DFD59 투여 군에서도 비슷한 증가를 보였다. 당화혈색소 변화 수치에 있어서 DFD114 30 nmol/kg 투여 군에서 가장 우수한 당화혈색소 감소를 보였으며, 그 다음 병용 투여, DFD114 10 nmol/kg 투여 군 순으로 당화혈색소 감소 효과를 보였다. 각 투여 그룹 별 당화혈색소 감소 수치를 기준으로 물질을 비교 평가할 때 이중작용 단백질 DFD114는 단독 GLP1-Fc 또는 Fc-FGF21 투여 대비 우수한 평균 혈당 감소 효과를 보임을 입증하였다.
실험예 10. HFD / STZ 마우스에서 융합 단백질의 활성 평가
실험예 10-1. HFD / STZ 마우스에서 활성 평가 실험 방법
이중 작용 단백질에 대한 추가적인 당뇨 모델에서 혈당 및 체중 감소에 대한 효과를 비교 평가하기 위하여 HFD/STZ모델에서 각 단백질들을 비교 평가하였다.
HFD/STZ모델은 기존 식이 유도 비만 마우스(C57BL/6에 60% 고지방 사료 8주 이상 급여) 모델이 인슐린 저항성을 유발하지만 고혈당 및 당뇨병적 특징이 미약하기 때문에 이에 대한 단점을 보완하기 위하여 고지방 식이(HFD; high fat diet)와 STZ(streptozotocin)의 저농도 투여로 췌장의 베타 세포 기능 장애와 인슐린 분비 저하를 보일 수 있는 동물 모델이며 제2형 당뇨 약리연구에 적합한 모델로 사용되고 있는 실정이다. HFD/STZ모델을 유도하기 위하여 C57BL/6에 60% 고지방 사료를 4주 급여 후 STZ 50 mg/kg(Sigma, 85882)를 3일 동안 매일 복강 투여하여 췌장의 베타 세포 기능 장애를 유도하고 2주간의 고지방 사료를 추가 급여 후 비절식 혈당이 200 mg/dl이상인 동물을 시험에 사용하였다. 약물 처리일(0일) 전날에 체중 및 꼬리 혈당의 평균값이 유사하도록 군분리(군당 n=6)한 후, 각각의 용량에 따라 샘플을 단회 피하 투여하였다. 이때 비히클 처리는 둘베코스 포스페이트 완충 식염수(Dulbecco's phosphate buffered saline, DPBS, Gibco, USA)를 투여하였으며, 혈액 내 글루코스 농도는 글루코닥터 혈당측정기(올메디쿠스, Korea)를 사용하여 측정하였다. 투여 후 하루 간격으로 14일 차까지의 비절식 혈당과 체중을 측정하였으며, 투여 전과 시험 종료 후 각 투여 그룹에서의 당화혈색소 수치의 변화 또한 측정하였다. 당화할색소 수치는 DCA 2000 HbA1c kit (Siemens, 5035C)를 사용하여 산출하였다.
실험예 10-2. HFD / STZ 마우스에서 활성 평가 결과
수컷 HFD/STZ마우스에 이중 작용 단백질 DFD114를 3 nmol/kg, 10 nmol/kg, Fc 융합 GLP-1 변이체인 DFD59를 10 nmol/kg, Fc 융합 FGF21 변이체인 DFD72, DFD74를 각 10 nmol/kg, 그리고 이중 작용 단백질 대비 단일 작용 물질의 병용 투여 효과를 비교하기 위하여, DFD59와 DFD74를 각각 10 nmol/kg 단회 병용 투여 후, 시간에 따른 비절식혈당 및 체중 변화를 관찰하였다.
도 19에서 보는 바와 같이, 4일차까지의 혈당 감소에 있어서 지속형 FGF21 단독 물질인 DFD72, DFD74의 경우 서서히 혈당 감소가 일어나지만 GLP-1이 포함된 지속형 단백질인 DFD114, DFD59 및 병용 투여의 경우 투여 1일차부터 강한 혈당 감소 효과가 나타났다. db/db 마우스에서의 결과와 유사하게 DFD59의 경우 초반 급격한 혈당 감소 효과를 보이다가 4일차 이후로 혈당 감소 효과가 점차적으로 소실되었으며 DFD114 저용량인 3 nmol/kg에서도 유사한 양상을 보였다. 고용량 DFD114 10 nmol/kg과 DFD72, DFD74 그리고 병용 투여 군은 유사한 비절식혈당 프로파일을 관찰하였다.
체중 감소 효과에 있어서는 DFD59와 DFD74의 병용 투여 군이 가장 우수한 체중 감소 효과 (7~8%)를 보였으며 DFD114 10 nmol/kg 투여 군에서도 우수한 체중 감소 (~6%)가 나타났다(도 20). DFD59의 경우 투여 후 1일차에 5%의 체중 감소를 보이지만 2일차 이후로 체중 감소 효과가 소실되어 투여 후 7일 이후에는 비히클 투여군과 유사한 양상을 보였으며 지속형 FGF21 단독 투여 군인 DFD72와 DFD74의 경우 투여 후 7일까차지 서서히 4~5%의 체중 감소를 보이며 10일차 이후로 체중 감소 효과가 소실되는 경향이 관찰되었다.
시험 종료 후 혈당의 평균 수치를 나타내는 당화혈색소 수치를 측정하여 각 시험 그룹의 평균 혈당 변화를 분석하였다(도 21). 비히클 처리군에서는 투여 전 대비 시험 종료 후 당화혈색소 수치가 증가하였으며 DFD59 투여 군에서도 비슷한 증가를 보였다. 반면 DFD114는 용량의존적으로 당화혈색소 수치 감소 효과를 보였으며 10 nmol/kg 투여 군에서 -0.42%로 가장 우수한 당화혈색소 감소 효과가 나타났다. DFD59와 DFDD74의 병용 투여군은 DFD114와 유사한 당화 혈색소 수치(-0.38%)를 보였으며, 지속형 FGF21 단독의 경우 DFD72가 DFD74대비 더 우수한 효과가 관찰되었다. 각 투여 그룹별 당화혈색소 감소 수치를 기준으로 물질을 비교 평가할 때, 이중작용 단백질 DFD114는 단독 GLP1-Fc 또는 Fc-FGF21 투여 대비 우수한 평균 혈당 감소 효과를 입증하였다.
실험예 11. 면역원성 예측 및 평가
실험예 11-1. 면역원성 예측 방법 및 결과
이중 작용 단백질에 대한 면역원성 가능성을 예측하기 위해, 각 단백질에 대한 인실리코(in silico) 면역원성 예측을 수행하였다.
구체적으로 iTopeTM과 TCEDTM 방법(Prediction of immunogenicity of therapeutic proteins: validity of computational tools, BioDrugs, 2010)을 이용하여 이중 작용 단백질의 잠재적인 면역원성을 신속하게 스크리닝하였는데, 이 두 방법은 MHC class II 결합 분석에만 의존하는 인실리코 분석 기법보다 더욱 정밀하게 T세포 항원결정부를 예측할 수 있다.
실험예 11-2. 면역원성 체외( Ex vivo ) 평가 방법 및 결과
이중 작용 단백질에 대한 면역원성 가능성을 평가하기 위해 EpiScreenTM 분석(Increased brain bio-distribution and chemical stability and decreased immunogenicity of an engineered variant of GDNF, Exp Neurol, 2015)을 수행하였다. 면역원성이 관찰될 경우 T-cell 항원결정부 지도작성(epitope mapping)을 통해 면역원성을 유발하는 아미노산 서열을 확인할 수 있으며, 인실리코 예측을 통해 면역원성을 최소화할 수 있는 deimmunized 변이체를 설계하고 제조해 면역원성을 재평가할 수 있다.
<110> YUHAN CORPORATION <120> DUAL FUNCTION PROTEINS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE SAME <130> FPD201510-0042 <160> 80 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 181 <212> PRT <213> human FGF21 <400> 1 His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val 1 5 10 15 Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His 20 25 30 Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser 35 40 45 Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln 50 55 60 Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly 65 70 75 80 Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 85 90 95 Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His 100 105 110 Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro 115 120 125 Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 130 135 140 Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val 145 150 155 160 Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly 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ccccgaaagt ctcctgcagc tgaaagcctt gaagcctgga 1020 gttattcaaa tcttgggagt caagactagt aggttcctgt gccagcggcc agatggggcc 1080 ctgtatggat ctctccattt tgaccctgag gcctgcagct tccgggagga gatcagaccc 1140 gacggataca atgtttacca gtccgaagcc cacggcctcc ctctgcatct gcccgggaac 1200 aagtctcctc accgggaccc tgcccccaga ggacctgctc gcttcctgcc actcccaggc 1260 ctgccccccg cattgcctga gccacccgga atcctggccc cccagccccc tgatgtggga 1320 tcctctgacc ctctgagcat ggtgacaggc ctggaggccg tgagaagccc cagctacgct 1380 tcc 1383 <210> 72 <211> 1419 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule coding for DFD24 <400> 72 cacggcgagg ggaccttcac aagcgacgtg tcctcttacc tggaagagca ggccgctaag 60 gaatttatcg catggctcgt caaaggaaga gggaggaaca ccggacgggg cggggaagag 120 aagaagaaag aaaaggagaa ggaagagcag gaggagagag aaaccaaaac acccgagtgt 180 cccagtcaca ctcagcctct gggagtgttt ctcttcccac ctaagcccaa ggataccctt 240 atgatttcta ggacacctga ggtgacctgc gtcgttgtgg acgtgagtca agaggaccca 300 gaggtccagt ttaactggta tgttgacggc gtggaagtgc ataatgcaaa aactaaaccc 360 cgcgaggaac aattcaattc aacctaccgg gtcgtttctg tgttgacagt gctgcatcaa 420 gattggctga acgggaagga gtataagtgt aaagtcagta ataagggact cccctctagt 480 atcgaaaaaa ctatttcaaa ggccaaaggc cagcctagag agccacaggt gtacaccctt 540 cctccatccc aagaggagat gacaaagaac caggtgtctc tgacttgtct cgtgaagggg 600 ttctacccta gtgacatcgc tgtcgaatgg gagtcaaacg gacagccaga gaataattat 660 aagacaactc ctcccgttct ggattctgac ggcagcttct ttctgtactc taggcttact 720 gtggacaaaa gtcgctggca agaagggaac gtcttttcat gttctgttat gcacgaggcc 780 ttgcacaatc attatacaca gaagtctctg agtctctcac tgggcaaagg cgggggaggc 840 agcgggggag gcgggtccgg aggcggggga tctcatccca tccctgactc cagtcctctc 900 ctgcaattcg ggggccaagt ccggcagcgg tacctctaca cagatgatgc tcagcagaca 960 gaagcccacc tggagatcag ggaggatggg accgtggggg gcgctgctga ccagagcccc 1020 gaaagtctcc tgcagctgaa agccttgaag cctggagtta ttcaaatctt gggagtcaag 1080 actagtaggt tcctgtgcca gcggccagat ggggccctgt atggatctct ccattttgac 1140 cctgaggcct gcagcttccg ggaggagatc agacccgacg gatacaatgt ttaccagtcc 1200 gaagcccacg gcctccctct gcatctgccc gggaacaagt ctcctcaccg ggaccctgcc 1260 cccagaggac ctgctcgctt cctgccactc ccaggcctgc cccccgcatt gcctgagcca 1320 cccggaatcc tggcccccca gccccctgat gtgggatcct ctgaccctct gagcatggtg 1380 acaggcctgg aggccgtgag aagccccagc tacgcttcc 1419 <210> 73 <211> 1383 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule coding for DFD25 <400> 73 cacggcgagg ggaccttcac aagcgacgtg tcctcttacc tggaagagca ggccgctaag 60 gaatttatcg catggctcgt caaaggaaga ggggaaaagg agaaggaaga gcaggaggag 120 agagaaacca aaacacccga gtgtcccagt cacactcagc ctctgggagt gtttctcttc 180 ccacctaagc ccaaggatac ccttatgatt tctaggacac ctgaggtgac ctgcgtcgtt 240 gtggacgtga gtcaagagga cccagaggtc cagtttaact ggtatgttga cggcgtggaa 300 gtgcataatg caaaaactaa accccgcgag gaacaattca attcaaccta ccgggtcgtt 360 tctgtgttga cagtgctgca tcaagattgg ctgaacggga aggagtataa gtgtaaagtc 420 agtaataagg gactcccctc tagtatcgaa aaaactattt caaaggccaa aggccagcct 480 agagagccac aggtgtacac ccttcctcca tcccaagagg agatgacaaa gaaccaggtg 540 tctctgactt gtctcgtgaa ggggttctac cctagtgaca tcgctgtcga atgggagtca 600 aacggacagc cagagaataa ttataagaca actcctcccg ttctggattc tgacggcagc 660 ttctttctgt actctaggct tactgtggac aaaagtcgct ggcaagaagg gaacgtcttt 720 tcatgttctg ttatgcacga ggccttgcac aatcattata cacagaagtc tctgagtctc 780 tcactgggca aaggcggggg aggcagcggg ggaggcgggt ccggaggcgg gggatctcat 840 cccatccctg actccagtcc tctcctgcaa ttcgggggcc aagtccggca gcggtacctc 900 tacacagatg atgctcagca gacagaagcc cacctggaga tcagggagga tgggaccgtg 960 gggggcgctg ctgaccagag ccccgaaagt ctcctgcagc tgaaagcctt gaagcctgga 1020 gttattcaaa tcttgggagt caagactagt aggttcctgt gccagcggcc agatggggcc 1080 ctgtatggat ctctccattt tgaccctgag gcctgcagct tccgggagga gatcagaccc 1140 gacggataca atgtttacca gtccgaagcc cacggcctcc ctctgcatct gcccgggaac 1200 aagtctcctc accgggaccc tgcccccaga ggacctgctc gcttcctgcc actcccaggc 1260 ctgccccccg cattgcctga gccacccgga atcctggccc cccagccccc tgatgtggga 1320 tcctctgacc ctctgagcat ggtgacaggc ctggaggccg tgagaagccc cagctacgct 1380 tcc 1383 <210> 74 <211> 1419 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule coding for DFD26 <400> 74 cacggcgagg ggaccttcac aagcgacgtg tcctcttatc tggaaggaca ggccgctaag 60 gagtttatcg catggctcgt caaaggcggc ggcaggaaca ccggacgggg cggggaagag 120 aagaagaaag aaaaggagaa ggaagagcag gaggagagag aaaccaaaac acccgagtgt 180 cccagtcaca ctcagcctct gggagtgttt ctcttcccac ctaagcccaa ggataccctt 240 atgatttcta ggacacctga ggtgacctgc gtcgttgtgg acgtgagtca agaggaccca 300 gaggtccagt ttaactggta tgttgacggc gtggaagtgc ataatgcaaa aactaaaccc 360 cgcgaggaac aattcaattc aacctaccgg gtcgtttctg tgttgacagt gctgcatcaa 420 gattggctga acgggaagga gtataagtgt aaagtcagta ataagggact cccctctagt 480 atcgaaaaaa ctatttcaaa ggccaaaggc cagcctagag agccacaggt gtacaccctt 540 cctccatccc aagaggagat gacaaagaac caggtgtctc tgacttgtct cgtgaagggg 600 ttctacccta gtgacatcgc tgtcgaatgg gagtcaaacg gacagccaga gaataattat 660 aagacaactc ctcccgttct ggattctgac ggcagcttct ttctgtactc taggcttact 720 gtggacaaaa gtcgctggca agaagggaac gtcttttcat gttctgttat gcacgaggcc 780 ttgcacaatc attatacaca gaagtctctg agtctctcac tgggcaaagg cgggggaggc 840 agcgggggag gcgggtccgg aggcggggga tctcatccca tccctgactc cagtcctctc 900 ctgcaattcg ggggccaagt ccggcagcgg tacctctaca cagatgatgc tcagcagaca 960 gaagcccacc tggagatcag ggaggatggg accgtggggg gcgctgctga ccagagcccc 1020 gaaagtctcc tgcagctgaa agccttgaag cctggagtta ttcaaatctt gggagtcaag 1080 actagtaggt tcctgtgcca gcggccagat ggggccctgt atggatctct ccattttgac 1140 cctgaggcct gcagcttccg ggaggagatc agacccgacg gatacaatgt ttaccagtcc 1200 gaagcccacg gcctccctct gcatctgccc gggaacaagt ctcctcaccg ggaccctgcc 1260 cccagaggac ctgctcgctt cctgccactc ccaggcctgc cccccgcatt gcctgagcca 1320 cccggaatcc tggcccccca gccccctgat gtgggatcct ctgaccctct gagcatggtg 1380 acaggcctgg aggccgtgag aagccccagc tacgcttcc 1419 <210> 75 <211> 1383 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule coding for DFD27 <400> 75 cacggcgagg ggaccttcac aagcgacgtg tcctcttatc tggaaggaca ggccgctaag 60 gagtttatcg catggctcgt caaaggcggc ggcgaaaagg agaaggaaga gcaggaggag 120 agagaaacca aaacacccga gtgtcccagt cacactcagc ctctgggagt gtttctcttc 180 ccacctaagc ccaaggatac ccttatgatt tctaggacac ctgaggtgac ctgcgtcgtt 240 gtggacgtga gtcaagagga cccagaggtc cagtttaact ggtatgttga cggcgtggaa 300 gtgcataatg caaaaactaa accccgcgag gaacaattca attcaaccta ccgggtcgtt 360 tctgtgttga cagtgctgca tcaagattgg ctgaacggga aggagtataa gtgtaaagtc 420 agtaataagg gactcccctc tagtatcgaa aaaactattt caaaggccaa aggccagcct 480 agagagccac aggtgtacac ccttcctcca tcccaagagg agatgacaaa gaaccaggtg 540 tctctgactt gtctcgtgaa ggggttctac cctagtgaca tcgctgtcga atgggagtca 600 aacggacagc cagagaataa ttataagaca actcctcccg ttctggattc tgacggcagc 660 ttctttctgt actctaggct tactgtggac aaaagtcgct ggcaagaagg gaacgtcttt 720 tcatgttctg ttatgcacga ggccttgcac aatcattata cacagaagtc tctgagtctc 780 tcactgggca aaggcggggg aggcagcggg ggaggcgggt ccggaggcgg gggatctcat 840 cccatccctg actccagtcc tctcctgcaa ttcgggggcc aagtccggca gcggtacctc 900 tacacagatg atgctcagca gacagaagcc cacctggaga tcagggagga tgggaccgtg 960 gggggcgctg ctgaccagag ccccgaaagt ctcctgcagc tgaaagcctt gaagcctgga 1020 gttattcaaa tcttgggagt caagactagt aggttcctgt gccagcggcc agatggggcc 1080 ctgtatggat ctctccattt tgaccctgag gcctgcagct tccgggagga gatcagaccc 1140 gacggataca atgtttacca gtccgaagcc cacggcctcc ctctgcatct gcccgggaac 1200 aagtctcctc accgggaccc tgcccccaga ggacctgctc gcttcctgcc actcccaggc 1260 ctgccccccg cattgcctga gccacccgga atcctggccc cccagccccc tgatgtggga 1320 tcctctgacc ctctgagcat ggtgacaggc ctggaggccg tgagaagccc cagctacgct 1380 tcc 1383 <210> 76 <211> 1419 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule coding for DFD28 <400> 76 cacggcgagg ggaccttcac aagcgacgtg tcctcttacc tggaagagca ggccgctaag 60 gaatttatcg catggctcgt caaaggaggc gggaggaaca ccggacgggg cggggaagag 120 aagaagaaag aaaaggagaa ggaagagcag gaggagagag aaaccaaaac acccgagtgt 180 cccagtcaca ctcagcctct gggagtgttt ctcttcccac ctaagcccaa ggataccctt 240 atgatttcta ggacacctga ggtgacctgc gtcgttgtgg acgtgagtca agaggaccca 300 gaggtccagt ttaactggta tgttgacggc gtggaagtgc ataatgcaaa aactaaaccc 360 cgcgaggaac aattcaattc aacctaccgg gtcgtttctg tgttgacagt gctgcatcaa 420 gattggctga acgggaagga gtataagtgt aaagtcagta ataagggact cccctctagt 480 atcgaaaaaa ctatttcaaa ggccaaaggc cagcctagag agccacaggt gtacaccctt 540 cctccatccc aagaggagat gacaaagaac caggtgtctc tgacttgtct cgtgaagggg 600 ttctacccta gtgacatcgc tgtcgaatgg gagtcaaacg gacagccaga gaataattat 660 aagacaactc ctcccgttct ggattctgac ggcagcttct ttctgtactc taggcttact 720 gtggacaaaa gtcgctggca agaagggaac gtcttttcat gttctgttat gcacgaggcc 780 ttgcacaatc attatacaca gaagtctctg agtctctcac tgggcaaagg cgggggaggc 840 agcgggggag gcgggtccgg aggcggggga tctcatccca tccctgactc cagtcctctc 900 ctgcaattcg ggggccaagt ccggcagcgg tacctctaca cagatgatgc tcagcagaca 960 gaagcccacc tggagatcag ggaggatggg accgtggggg gcgctgctga ccagagcccc 1020 gaaagtctcc tgcagctgaa agccttgaag cctggagtta ttcaaatctt gggagtcaag 1080 actagtaggt tcctgtgcca gcggccagat ggggccctgt atggatctct ccattttgac 1140 cctgaggcct gcagcttccg ggaggagatc agacccgacg gatacaatgt ttaccagtcc 1200 gaagcccacg gcctccctct gcatctgccc gggaacaagt ctcctcaccg ggaccctgcc 1260 cccagaggac ctgctcgctt cctgccactc ccaggcctgc cccccgcatt gcctgagcca 1320 cccggaatcc tggcccccca gccccctgat gtgggatcct ctgaccctct gagcatggtg 1380 acaggcctgg aggccgtgag aagccccagc tacgcttcc 1419 <210> 77 <211> 1383 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule coding for DFD29 <400> 77 cacggcgagg ggaccttcac aagcgacgtg tcctcttacc tggaagagca ggccgctaag 60 gaatttatcg catggctcgt caaaggaggc ggggaaaagg agaaggaaga gcaggaggag 120 agagaaacca aaacacccga gtgtcccagt cacactcagc ctctgggagt gtttctcttc 180 ccacctaagc ccaaggatac ccttatgatt tctaggacac ctgaggtgac ctgcgtcgtt 240 gtggacgtga gtcaagagga cccagaggtc cagtttaact ggtatgttga cggcgtggaa 300 gtgcataatg caaaaactaa accccgcgag gaacaattca attcaaccta ccgggtcgtt 360 tctgtgttga cagtgctgca tcaagattgg ctgaacggga aggagtataa gtgtaaagtc 420 agtaataagg gactcccctc tagtatcgaa aaaactattt caaaggccaa aggccagcct 480 agagagccac aggtgtacac ccttcctcca tcccaagagg agatgacaaa gaaccaggtg 540 tctctgactt gtctcgtgaa ggggttctac cctagtgaca tcgctgtcga atgggagtca 600 aacggacagc cagagaataa ttataagaca actcctcccg ttctggattc tgacggcagc 660 ttctttctgt actctaggct tactgtggac aaaagtcgct ggcaagaagg gaacgtcttt 720 tcatgttctg ttatgcacga ggccttgcac aatcattata cacagaagtc tctgagtctc 780 tcactgggca aaggcggggg aggcagcggg ggaggcgggt ccggaggcgg gggatctcat 840 cccatccctg actccagtcc tctcctgcaa ttcgggggcc aagtccggca gcggtacctc 900 tacacagatg atgctcagca gacagaagcc cacctggaga tcagggagga tgggaccgtg 960 gggggcgctg ctgaccagag ccccgaaagt ctcctgcagc tgaaagcctt gaagcctgga 1020 gttattcaaa tcttgggagt caagactagt aggttcctgt gccagcggcc agatggggcc 1080 ctgtatggat ctctccattt tgaccctgag gcctgcagct tccgggagga gatcagaccc 1140 gacggataca atgtttacca gtccgaagcc cacggcctcc ctctgcatct gcccgggaac 1200 aagtctcctc accgggaccc tgcccccaga ggacctgctc gcttcctgcc actcccaggc 1260 ctgccccccg cattgcctga gccacccgga atcctggccc cccagccccc tgatgtggga 1320 tcctctgacc ctctgagcat ggtgacaggc ctggaggccg tgagaagccc cagctacgct 1380 tcc 1383 <210> 78 <211> 1383 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule coding for DFD69 <400> 78 cacggcgagg ggaccttcac aagcgacgtg tcctcttacc tggaagagca ggccgctaag 60 gaatttatcg catggctcgt caaaggaggc ggggaaaagg agaaggaaga gcaggaggag 120 agagaaacca aaacacccga gtgtcccagt cacactcagc ctctgggagt gtttctcttc 180 ccacctaagc ccaaggatac ccttatgatt tctaggacac ctgaggtgac ctgcgtcgtt 240 gtggacgtga gtcaagagga cccagaggtc cagtttaact ggtatgttga cggcgtggaa 300 gtgcataatg caaaaactaa accccgcgag gaacaattca attcaaccta ccgggtcgtt 360 tctgtgttga cagtgctgca tcaagattgg ctgaacggga aggagtataa gtgtaaagtc 420 agtaataagg gactcccctc tagtatcgaa aaaactattt caaaggccaa aggccagcct 480 agagagccac aggtgtacac ccttcctcca tcccaagagg agatgacaaa gaaccaggtg 540 tctctgactt gtctcgtgaa ggggttctac cctagtgaca tcgctgtcga atgggagtca 600 aacggacagc cagagaataa ttataagaca actcctcccg ttctggattc tgacggcagc 660 ttctttctgt actctaggct tactgtggac aaaagtcgct ggcaagaagg gaacgtcttt 720 tcatgttctg ttatgcacga ggccttgcac aatcattata cacagaagtc tctgagtctc 780 tcactgggca aaggcggggg aggcagcggg ggaggcgggt ccggaggcgg gggatctcat 840 cccatccctg actccagtcc tctcctgcaa ttcgggggcc aagtccggca gcggtacctc 900 tacacagatg atgctcagca gacagaagcc cacctggaga tcagggagga tgggaccgtg 960 gggggcgctg ctgaccagag ccccgaaagt ctcctgcagc tgaaagcctt gaagcctgga 1020 gttattcaaa tcttgggagt caagactagt aggttcctgt gccagcggcc agatggggcc 1080 ctgtatggat ctctccattt tgaccctgag gcctgcagct tccgggagga gatcagaccc 1140 gacggataca atgtttacca gtccgaagcc cacggcctcc ctctgcatct gcccgggaac 1200 aagtctcctc accgggaccc tgcccccaga ggacctgctc gcttcctgcc actcccaggc 1260 ctgccccccg cattgcctga gccacccgga atcctggccc cccagccccc tgatgtggga 1320 tcctctgacc ctctgagcat ggtgacaggc ctggaggccg tgagaagccc cagctacgag 1380 tcc 1383 <210> 79 <211> 1383 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule coding for DFD112 <400> 79 cacggcgagg ggaccttcac aagcgacgtg tcctcttacc tggaagagca ggccgctaag 60 gaatttatcg catggctcgt caaaggaggc ggggaaaagg agaaggaaga gcaggaggag 120 agagaaacca aaacacccga gtgtcccagt cacactcagc ctctgggagt gtttctcttc 180 ccacctaagc ccaaggatac ccttatgatt tctaggacac ctgaggtgac ctgcgtcgtt 240 gtggacgtga gtcaagagga cccagaggtc cagtttaact ggtatgttga cggcgtggaa 300 gtgcataatg caaaaactaa accccgcgag gaacaattca attcaaccta ccgggtcgtt 360 tctgtgttga cagtgctgca tcaagattgg ctgaacggga aggagtataa gtgtaaagtc 420 agtaataagg gactcccctc tagtatcgaa aaaactattt caaaggccaa aggccagcct 480 agagagccac aggtgtacac ccttcctcca tcccaagagg agatgacaaa gaaccaggtg 540 tctctgactt gtctcgtgaa ggggttctac cctagtgaca tcgctgtcga atgggagtca 600 aacggacagc cagagaataa ttataagaca actcctcccg ttctggattc tgacggcagc 660 ttctttctgt actctaggct tactgtggac aaaagtcgct ggcaagaagg gaacgtcttt 720 tcatgttctg ttatgcacga ggccttgcac aatcattata cacagaagtc tctgagtctc 780 tcactgggca aaggcggggg aggcagcggg ggaggcgggt ccggaggcgg gggatctcat 840 cccatccctg actccagtcc tctcctgcaa ttcgggggcc aagtccggca gcggtacctc 900 tacacagatg atgctcagca gacagaagcc cacctggaga tcagggagga tgggaccgtg 960 gggggcgctg ctgaccagag ccccgaaagt ctcctgcagc tgaaagcctt gaagcctgga 1020 gttattcaaa tcttgggagt caagactagt aggttcctgt gccagcggcc agatggggcc 1080 ctgtatggat ctctccattt tgaccctgag gcctgcagct tccgggagga gatcagaccc 1140 gacggataca atgtttacca gtccgaagcc cacggcctcc ctctgcatct gcccgggaac 1200 aagtctcctc accgggaccc tgcccccaga ggacctgctc gcttcctgcc actcccaggc 1260 ctgccccccg cattgcctga gccacccgga atcctggccc cccagccccc tgatgtggga 1320 tcctctgacc ctctgagcat ggtgacaggc ctggaggcca acagaagccc cagctacgag 1380 tcc 1383 <210> 80 <211> 1380 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid molecule coding for DFD114 <400> 80 cacggcgagg ggaccttcac aagcgacgtg tcctcttacc tggaagagca ggccgctaag 60 gaatttatcg catggctcgt caaaggaggc ggggaaaagg agaaggaaga gcaggaggag 120 agagaaacca aaacacccga gtgtcccagt cacactcagc ctctgggagt gtttctcttc 180 ccacctaagc ccaaggatac ccttatgatt tctaggacac ctgaggtgac ctgcgtcgtt 240 gtggacgtga gtcaagagga cccagaggtc cagtttaact ggtatgttga cggcgtggaa 300 gtgcataatg caaaaactaa accccgcgag gaacaattca attcaaccta ccgggtcgtt 360 tctgtgttga cagtgctgca tcaagattgg ctgaacggga aggagtataa gtgtaaagtc 420 agtaataagg gactcccctc tagtatcgaa aaaactattt caaaggccaa aggccagcct 480 agagagccac aggtgtacac ccttcctcca tcccaagagg agatgacaaa gaaccaggtg 540 tctctgactt gtctcgtgaa ggggttctac cctagtgaca tcgctgtcga atgggagtca 600 aacggacagc cagagaataa ttataagaca actcctcccg ttctggattc tgacggcagc 660 ttctttctgt actctaggct tactgtggac aaaagtcgct ggcaagaagg gaacgtcttt 720 tcatgttctg ttatgcacga ggccttgcac aatcattata cacagaagtc tctgagtctc 780 tcactgggca aaggcggggg aggcagcggg ggaggcgggt ccggaggcgg gggatctcat 840 cccatccctg actccagtcc tctcctgcaa ttcgggggcc aagtccggca gcggtacctc 900 tacacagatg atgctcagca gacagaagcc cacctggaga tcagggagga tgggaccgtg 960 gggggcgctg ctgaccagag ccccgaaagt ctcctgcagc tgaaagcctt gaagcctgga 1020 gttattcaaa tcttgggagt caagactagt aggttcctgt gccagcggcc agatggggcc 1080 ctgtatggat ctctccattt tgaccctgag gcctgcagct tccgggagga gatcagaccc 1140 gacggataca atgtttacca gtccgaagcc cacggcctcc ctctgcatct gcccgggaac 1200 aagtctcctc accgggaccc tgcccccaga ggacctgctc gcttcctgcc actcccaggc 1260 ctgccccccg cattgcctga gccacccgga atcctggccc cccagccccc tgatgtggga 1320 tcctctgacc ctctgagcat ggtgaaccct tcccagggca gaagccccag ctacgagtcc 1380 1380

Claims (26)

  1. 섬유모세포 성장 인자 21(FGF21) 변이체 단백질; 생리활성 단백질, 이의 변이체 또는 이의 단편; 및 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 이중 작용 단백질로서,
    상기 FGF21 변이체 단백질이 하기 (1) 내지 (7)의 변이들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 변이를 포함하는, 이중 작용 단백질:
    (1) 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 98번 내지 101번 아미노산이 EIRP(서열번호: 68)로 치환됨;
    (2) 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 170번 내지 174번 아미노산이 TGLEAV(서열번호: 69)로 치환됨;
    (3) 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 170번 내지 174번 아미노산이 TGLEAN(서열번호: 70)으로 치환됨;
    (4) 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 170번 아미노산이 N으로 치환됨;
    (5) 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 174번 아미노산이 N으로 치환됨;
    (6) 상기 (1) 내지 (5)의 변이들 중 하나 이상의 변이와 함께, 야생형 FGF21 단백질의 N 말단으로부터 180번 아미노산이 E로 치환됨; 및
    (7) 야생형 FGF21 단백질의 면역원성 감소를 위한 1 내지 10개의 아미노산 변이를 포함함.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 이중 작용 단백질이 FGF21 변이체 단백질의 변이에 의해 도입된 N 잔기에 당화(glycosylation)된, 이중 작용 단백질.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 생리활성 단백질은 인슐린(insulin), C-펩타이드(C-peptide), 렙틴(leptin), 글루카곤(glucagon), 가스트린(gastrin), 가스트린억제폴리펩타이드(gastric inhibitory polypeptide; GIP), 아밀린(amylin), 칼시토닌(calcitonin), 콜레시스토키닌(cholecystokinin), 펩타이드 YY(peptide YY), 뉴로펩타이드 Y(neuropeptide Y), 뼈형성단백질 6(bone morphogenetic protein 6; BMP-6), 뼈형성단백질 9(bone morphogenetic protein 9; BMP-9), 옥신토모듈린(oxyntomodulin), 옥시토신(oxytocin), 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1), 글루카곤 유사 펩타이드-2(GLP-2), 이리신(irisin), FNDC5(fibronectin type III domain-containing protein 5), 아펠린(apelin), 아디포넥틴(adiponectin), CTRP 패밀리(C1q and tumor necrosis factor related protein), 레지스틴(resistin), 비스파틴(visfatin), 오멘틴(omentin), 레티놀 결합 단백질-4(RBP4), 글리세틴(glicentin), 앙기오포이에틴(angiopoietin), 인터루킨-22(IL-22), 엑센딘-4(exendin-4) 및 성장 호르몬(growth hormone)으로 이루어진 군에서 선택된 1종인, 이중 작용 단백질.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 생리활성 단백질은 GLP-1, 이의 변이체 및 엑센딘-4 중 선택된 1종인, 이중 작용 단백질.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 GLP-1의 변이체가 서열번호: 43 내지 46 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는, 이중 작용 단백질.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 야생형 FGF21 단백질은 서열번호: 1로 표시되는, 이중 작용 단백질.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 FGF21 변이체 단백질이 서열번호: 6 내지 23 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는, 이중 작용 단백질.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 이중 작용 단백질이 링커를 더 포함하는, 이중 작용 단백질.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 링커가 FGF21 변이체 단백질과 상기 면역글로불린의 Fc 영역을 연결하는, 이중 작용 단백질.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 링커가 상기 면역글로불린의 Fc 영역의 C 말단 및 상기 FGF21 변이체 단백질의 N 말단에 연결된, 이중 작용 단백질.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 링커가 10 내지 30개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩타이드인, 이중 작용 단백질.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 링커가 서열번호: 2 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는, 이중 작용 단백질.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 면역글로불린의 Fc 영역이 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 IgD의 Fc 영역 중 어느 하나 또는 이들의 조합으로 이루어진 하이브리드 Fc인, 이중 작용 단백질.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 하이브리드 Fc가 IgG4 영역 및 IgD의 영역을 포함하는, 이중 작용 단백질.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 이중 작용 단백질이 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 생리활성 단백질, 면역글로불린의 Fc 영역 및 FGF21 변이체 단백질이 순서대로 연결된, 이중 작용 단백질.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 이중 작용 단백질의 면역글로불린의 Fc 영역과 FGF21 변이체 단백질 사이에 링커가 추가로 연결된, 이중 작용 단백질.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 링커가 상기 면역글로불린의 Fc 영역의 C 말단 및 상기 FGF21 변이체 단백질의 N 말단에 연결된, 이중 작용 단백질.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 링커가 10 내지 30개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩타이드인, 이중 작용 단백질.
  19. 제16항에 있어서,
    상기 링커가 서열번호: 2 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는, 이중 작용 단백질.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 이중 작용 단백질이 서열번호: 65의 아미노산 서열로 표시되는, 이중 작용 단백질.
  21. 제1항에 있어서,
    상기 이중 작용 단백질이 서열번호: 66의 아미노산 서열로 표시되는, 이중 작용 단백질.
  22. 제1항에 있어서,
    상기 이중 작용 단백질이 서열번호: 67의 아미노산 서열로 표시되는, 이중 작용 단백질.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 이중 작용 단백질을 포함하는, 당뇨병, 비만, 이상지질혈증, 대사증후군, 비알콜성 지방간 질환, 비알콜성 지방간염 또는 심혈관계 질환 치료용 약학적 조성물.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 이중 작용 단백질을 코딩하는 단리된 핵산분자.
  25. 제24항의 핵산분자를 포함하는 발현벡터.
  26. 제25항의 발현벡터를 포함하는 숙주세포.
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