MX2008013459A

MX2008013459A - Composiciones de anticuerpos glucagon/compuesto de peptido 1 similar al glucagon (glp-1).

Info

Publication number: MX2008013459A
Application number: MX2008013459A
Authority: MX
Inventors: Thomas Charles Boone; Kevin Graham; Wenyan Shen; Katherine Ann Winters; Murielle Veniant-Ellison
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2006-04-20
Filing date: 2007-04-20
Publication date: 2008-10-30
Also published as: JP2009534424A; EP2015776A1; AU2007240315A1; WO2007124463A1; CA2649751A1

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones que comprenden anticuerpos que se enlazan a glucagón ligado a compuestos GLP-1, así como también a métodos para usar las composiciones para tratar por ejemplo, trastornos metabólicos, expresión intensificada de insulina, y promover la secreción de insulina en un sujeto.

Description

COMPOSICIONES DE ANTICUERPOS GLUCAGON/COMPUESTO DE PEPTIDO 1 SIMILAR AL GLUCAGON (GLP-1) ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El péptido 1 similar al glucagón (GLP-1) y el glucagón de péptido relacionado, se producen vía procesamiento diferencial de proglucagon y tienen actividades biológicas opuestas. El proglucagon mismo es producido en células-a del páncreas y en las células L enteroendocrinas , las cuales están localizadas principalmente en el intestino delgado distal y colon. En el páncreas, el glucagón es selectivamente desdoblado del proglucagon. En el intestino por el contrario, el proglucagon es procesado para formar GLP-1 y péptido 2 similar al glucagón (GLP-2), el cual corresponde a residuos de aminoácido 78-107 y 126-158 de proglucagon, respectivamente (véase por ejemplo, Irwing and Wong, 1995, Mol. Endocrinol . 9:267-277 y Bell et al., 1983, Nature 304:368-371). Por convención, la numeración de los aminoácidos de GLP-1 se basa en el GLP-1 (1-37) formado de desdoblamiento de proglucagon. Las formas biológicamente activas son generadas a partir de procesamiento adicional de este péptido, el cual, en una numeración convencional, proporciona GLP-1 (7-37) -OH y GLP-1 (7-36) -NH2. Tanto el GLP-1 (7-37) -OH (o simplemente GLP-1 (7-37)) como GLP-1 (7-36)-NH2, tienen las mismas actividades. Por conveniencia, el REF . : 197480 término "GLP-1", es usado para referirse a ambas de estas formas. El primer aminoácido de estos péptidos procesados es His7 en esta numeración convencional. Otra numeración convencional reconocida en la técnica, sin embargo, asume que la numeración de los péptidos procesados comienza con Hys como posición 1 en lugar de la posición 7. De este modo, en este esquema de numeración, GLP-1 (1-31) es el mismo como GLP-1 (7-37), y GLP-1 (1-30) es el mismo como GLP-1 (7-36). El glucagón es secretado de células-a del páncreas, en respuesta a azúcar baja en la sangre, con el órgano objetivo principal para glucagón siendo el hígado. El glucagón estimula el rompimiento del glicógeno e inhibe la biosíntesis del glicógeno. También inhibe la síntesis de ácido graso, pero mejora la gluconeogénesis . El resultado de estas acciones es incrementar significantemente la liberación de glucosa al hígado. El GLP-1, por el contrario, reduce la secreción de glucagón, mientras estimula la secreción de insulina, absorción de glucosa y formación de A P cíclico (cAMP) en respuesta a la absorción de nutrientes por el intestino. Varios datos clínicos proporcionan evidencia de estas actividades. La administración de GLP, por ejemplo, para diabéticos tipo 2 escasamente controlados, normaliza sus niveles de glucosa en la sangre en ayunas (véase por ejemplo, Gutniak, et al., 1992, New Eng. J. Med. 326: 1316-1322). El GLP-1 tiene un número de otras actividades importantes. Por ejemplo, el GLP-1 también inhibe la motilidad gástrica y secreción gástrica (véase por ejemplo, Tolessa, 1998, J. Clin. Invest. 102:764-774). Este efecto, algunas veces referido como el efecto de freno ileal, resulta en una fase de retardo en la disponibilidad de nutrientes, de este modo, reduciendo significantemente la necesidad de respuesta rápida de insulina. Los estudios también indican que el GLP-1 puede promover la diferenciación y replicación celular, lo cual en cambio, ayuda en la preservación de las células de isleta pancreática y un incremento en la masa de células-ß. (Véase por ejemplo, Andreasen et al., 1994, Digestión 55:221-228; Wang, et al., 1997, J. Clin. Invest. 99:2883-2889; Mojsov, 1992, Int. J. Pep. Prot, Res. 40 : 333-343; y Xu et al., 1999, Diabetes 4^:2270-2276). La evidencia también indica que el GLP-1 puede incrementar la saciedad y reducción de absorción de alimento (véase por ejemplo, Toft-Nielsen et al., 1999, Diabetes Care 22: 1 137-1143; Flint et al., 1998, J. Clin. Invest. 101:515-520; Gutswiller et al., 1999 Gut 44:81-86) . Otra investigación indica que GLP-1 induce genes específicos de células-ß, que incluyen transportador de GLUT-1, receptor de insulina y hexocinasa-1 (véase por ejemplo, and Merkel, 2000, Eur . J. Endocrinol 143:717-725) . Tal inducción podría invertir la tolerancia a glucosa a menudo asociada con el envejecimiento.

Debido a que juega un papel principal en la regulación de la homeostasis metabólica, el GLP-1 es un objetivo atractivo para tratar una variedad de trastornos metabólicos , que incluyen diabetes, obesidad y síndrome metabólico. Tratamientos actuales para diabetes incluyen inyección de insulina y administración de sulfonilureas . Ambos procedimientos, sin embargo, tienen desventajas significantes. Las inyecciones de insulina, por ejemplo, requieren consideraciones de dosificación complicadas, y el tratamiento con sulfonilureas a menudo llega a ser inefectivo con el tiempo. Las ventajas potenciales de terapia de GLP-1 incluyen: 1) la secreción de insulina debido a seguridad incrementada, es dependiente de la hiperglicemia , 2) supresión de secreción de glucagón el cual en cambio, suprime el rendimiento de glucosa excesiva, y 3) disminución del vacío gástrico, el cual en cambio, disminuye la absorción de nutrientes y previene el incremento súbito de glucosa. Un obstáculo principal para el tratamiento efectivo con GLP-1 sin embargo, ha sido la vida media muy corta del péptido, la cual es típicamente solamente de algunos minutos (véase por ejemplo, Hoist, 1994, Gastroenterology 107:1848-1855) . Se han desarrollado varios análogos con la meta de extender la vida media de la molécula. Algunos de estos sin embargo, tienen efectos secundarios gastrointestinales significantes que incluyen, vómito y náuseas (véase por ejemplo, Agerso et al., 2002, Diabetologia 45:195-202). Por consiguiente, de este modo, permanece una necesidad de moléculas mejoradas que tienen actividad de tipo GLP-1, para uso en el tratamiento de varias enfermedades metabólicas tales como diabetes, obesidad y síndrome metabólico .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se proporcionan composiciones que comprenden un anticuerpo anti-glucagón ligado a un compuesto GLP-1. En algunas composiciones, el anticuerpo se enlaza específicamente al glucagón humano. También se proporcionan métodos para tratar una variedad de enfermedades administrando una cantidad efectiva de la composición. Tales métodos pueden ser usados para tratar por ejemplo, diabetes, tolerancia a la glucosa deteriorada, resistencia a insulina, varios trastornos lípidos, obesidad, enfermedades cardiovasculares y trastornos óseos. Algunas composiciones, por ejemplo, comprenden un anticuerpo que se enlaza al glucagón y un compuesto de GLP-1 ligado al anticuerpo que enlaza al glucagón, en donde el compuesto de GLP-1 tiene una actividad de GLP-1. En ciertas composiciones, el anticuerpo comprende (i) una región variable de cadena pesada y (ii) una región variable de cadena ligera; y el compuesto GLP-1 está ligado a ya sea la región variable de cadena pesada o la región variable de cadena ligera. En algunas composiciones, el término carboxi del compuesto GLP-1 está ligado al término amino de la región variable de cadena ligera, y/o el término carboxi del compuesto GLP-1 está ligado al término amino de la región variable de cadena pesada. Una variedad de compuestos GLP-1 puede ser unida al anticuerpo anti-glucagón . En un aspecto, un compuesto GLP-1 en una composición como se proporciona en la presente, comprende un péptido GLP-1 que tiene al menos, 90% de identidad de secuencia a la SEC ID NO:l y tiene una actividad de GLP-1. En ciertas composiciones, el compuesto GLP-1 comprende la secuencia de aminoácido de fórmula I (SEC ID NO: 92) . Xaai- Xaa2- Xaa3— Xaa^— Xaa5_ Xaa6_ Xaa7_ Xaag— Xaag— Xaaio- X an-Xaai2-Xaai3_Xaai4_Xaai5_Xa ig—X i7—Xaai8- Xaaigo-X a2o_Xaa2i_ Xaa22—X a23—Xaa24_Xaa25_Xaa26—X3327-?3¾28— sa29_Xaa3o—Xaa3i—Xaa32~ Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-C (O) -Ri (Fórmula I, SEC ID NO: 92) en donde, Ri es OR2 o NR2R3; R2 y R3 son independientemente hidrógeno o alquilo (Ci-C8) ; Xaa en la posición 1 es: L-histidina, D-histidina, desamino-histidina , 2-amino- histidina, 3-hidroxi-histidina , homohistidina , a-fluororaetil-histidina o a-metil-histidina ; Xaa en la posición 2 es Gly, bAla (ácido 2-aminopropiónico ) , Asp, Ala, ácido 1-amino-ciclopentancarboxilico, ácido 2-aminoisobutirico o aminoácidos alfa-alfa disustituidos; Xaa en la posición 3 es Glu, Asp, o Lys; Xaa en la posición 4 es Gly, Thr o Hys; Xaa en la posición 5 es Thr, Ala, Gly, Ser, Leu, lie, Val, Glu, Asp, o Lys; Xaa en la posición 6 es: Hys, Trp, Phe, o Tyr; Xaa en la posición 7 es Thr o Gly; Xaa en la posición 8 es Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, o Lys; Xaa en la posición 9 es Asp, Asn o Glu; Xaa en la posición 10 es Val, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lie, Tyr, Glu, Asp, Trp, o Lys; Xaa en la posición 11 es Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, o Lys; Xaa en la posición 12 es Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, Trp, Tyr, Asn, Lys, Homolisina, Ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, o ácido homoglutámico ; Xaa en la posición 13 es Tyr, Phe, Trp, Glu, Asp, Gln, Lys, Homolisina, Ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, o ácido homoglutámico ; Xaa en la posición 14 es Leu, Ala, Gly, Ser, Thr, lie, Val, Glu, Asp, Met, Trp, Tyr, Asn, Gln, Lys, Homolisina, Ornitina, -carboxi-fenilalanina , ácido beta-glutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 15 es Glu, Asp, Lys, Homolisina, Ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico , o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 16 es Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, Asn, Lys, Homolisina, Ornitina, 4-carboxi-fenilalanina , ácido beta-glutámico, Ácido beta-homoglutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 17 es Gln, Asn, Arg, Glu, Asp, Lys, Ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 18 es Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Arg, Glu, Asp, Asn, Lys, Homolisina, Ornitina, 4-carboxi-fenilalanina , ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 19 es Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, Asn, Lys, Homolisina, Ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 20 es Lys, Homolisina, Arg, Gln, Glu, Asp, Thr, Hys, Ornitina, 4 -carboxi-fenilalanina , ácido beta-glutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 21 es Leu, Glu, Asp, Thr, Lys, Homolisina, Ornitina, 4 -carboxi-fenilalanina , ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 22 es Phe, Trp, Asp, Glu, Lys, Homolisina, Ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 23 es lie, Leu, Val, Ala, Phe, Asp, Glu, Lys, Homolisina, Ornitina, 4 -carboxi-fenilalanina , ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 24 es Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, Lys, Homolisina, Ornitina, 4-carboxi-fenilalanina , ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 25 es Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp, Asn, o Lys; Xaa en la posición 26 es Leu, Gly, Ala, Ser, Thr, lie, Val, Glu, Asp, o Lys; Xaa en la posición 27 es Val, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, lie, Glu, Asp, Asn, o Lys; Xaa en la posición 28 es Asn, Lys, Arg, Glu, Asp, o Hys; Xaa en la posición 29 es Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, o Lys; Xaa en la posición 30 es Gly, Arg, Lys, Glu, Asp, Thr, Asn, o Hys; Xaa en la posición 31 es Pro, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, o Lys; Xaa en la posición 32 es Thr, Gly, Asn, Ser, Lys, o es omitido; Xaa en la posición 33 es Gly, Asn, Ala, Ser, Thr, lie, Val, Leu, Phe, Pro, o es omitido; Xaa en la posición 34 es Gly, Thr, o es omitido; Xaa en la posición 35 es Thr, Asn, Gly o es omitido; Xaa en la posición 36 es Gly o es omitido; Xaa en la posición 37 es Gly o es omitido; siempre que cuando el aminoácido en la posición 32, 33, 34, 35, 36 o 37 es omitido, entonces cada aminoácido corriente abajo de aquel aminoácido es también omitido, y en donde el compuesto tiene una actividad GLP-1. El compuesto GLP-1 en algunas composiciones, de este modo comprende la secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEC ID NO: 1-35, SEC ID NO: 126, o SEC ID NO: 127. En algunas composiciones, el anticuerpo que es ptécnica de la composición como se proporciona en la presente, comprende: (a) una o más CDRs de cadena ligera (LC) , seleccionadas del grupo que consiste de: (i) una CDR1 de LC con al menos 60% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 76; (ii) una CDR2 de LC con al menos 60% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 77; y (iii) una CDR3 de LC con al menos 60% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 78; (b) una o más CDRs de cadena pesada (HC) seleccionadas del grupo que consiste de (i) una CDR1 de HC con al menos 60% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 84; (ii) una CDR2 de HC con al menos 60% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 85; y (iii) una CDR3 de HC con al menos 60% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 86; o (c) una o más CDR de LC de (a) y una o más CDRs de HC de (b) . El anticuerpo puede comprender dos, tres, cuatro, cinco, o las seis CDRs de la CDRs listada anteriormente en (a) y (b) . En ciertas composiciones, el anticuerpo que es ptécnica de la composición incluye un anticuerpo que comprende : (a) una o más CDR de LC seleccionadas del grupo que consiste de: (i) una CDR1 de LC con la secuencia de aminoácido como se expone en la SEC ID NO: 76; (ii) una CDR2 de LC con la secuencia de aminoácido como se expone en la SEC ID NO: 77; y (iii) una CDR3 de LC con la secuencia de aminoácido como se expone en la SEC ID NO: 78; (b) una o más CDRs de HC seleccionadas del grupo que consiste de (i) una CDR1 de HC con la secuencia de aminoácido como se expone en la SEC ID NO: 84; (ii) una CDR2 de HC con la secuencia de aminoácido como se expone en la SEC ID NO: 85; y (iii) una CDR3 de HC con la secuencia de aminoácido como se expone en la SEC ID NO: 86; o (c) una o más CDR de LC de (a) y una o más CDRs de HC de (b) . El anticuerpo puede comprender dos, tres, cuatro, cinco, o las seis CDRs a partir de las CDRs listadas anteriormente en (a) and (b) . En algunos casos, el anticuerpo de una composición comprende la CDR3 de LC con la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 78 y/o la CDR3 de HC con la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 86. En otras composiciones, el anticuerpo puede comprender al menos, dos o tres CDRs a partir de las CDR listadas anteriormente en (a) y (b) . Ciertas composiciones incluyen un anticuerpo que comprende (a) una región variable de cadena ligera (VL) que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 79; o (b) una región variable de cadena pesada (VH) que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 83; o (c) a VL de (a) y a VH de (b) . El anticuerpo en tales composiciones puede consistir de dos VH idénticos y dos VL idénticos. En algunas composiciones, el anticuerpo comprende: (a) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEC ID NOs : 40-81 ; (b) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEC ID NOs: 39 o 82-91 ; o (c) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEC ID NOs: 41-81 y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEC ID NOs: 39 o 82-91. Los polipéptidos también se proporcionan en la presente, que comprenden una región variable de cadena ligera de anticuerpo que se enlaza al glucagón, ligado a un análogo de GLP-1. Ciertos de tales polipéptidos tienen la secuencia e aminoácido de cualquiera de las SEC ID NO: 41-74. La invención además proporciona anticuerpos que comprenden un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEC ID NO: 41-74. La invención también proporciona polipéptidos que comprenden una región variable de cadena pesada de anticuerpo que se enlaza al glucagón ligado a un péptido GLP-1. En ciertos aspectos, el polipéptido es una proteina de fusión que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 83. En ciertas de tales proteínas de fusión, el compuesto GLP-1 comprende, la SEC ID NO: 1-35, SEC ID NO: 126, o SEC ID NO: 127. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad efectiva de una composición como se proporciona en la presente. También se describen métodos para tratar un sujeto con varias enfermedades, que incluyen por ejemplo varios trastornos metabólicos. Tales métodos en general, involucran administrar al sujeto una cantidad efectiva de la composición farmacéutica como se proporciona en la presente. Ejemplos específicos de enfermedades metabólicas que pueden ser tratadas incluyen, pero no se limita a, diabetes, obesidad y síndrome metabólico. También se proporcionan métodos para intensificar la expresión de insulina y para promover la secreción de insulina en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto, una cantidad efectiva de la composición farmacéutica como se proporciona en la presente. Además, la invención proporciona métodos para tratar un sujeto administrando al sujeto, una cantidad efectiva de una composición que comprende un anticuerpo que se enlaza al glucagón y un compuesto GLP-1 ligado a este, en donde el compuesto GLP-1 tiene actividad de GLP-1. Las enfermedades que pueden ser tratadas con tales composiciones incluyen aquellas solo listadas anteriormente. También se describen en la presente, métodos para intensificar la expresión de insulina y para promover la secreción de insulina en un sujeto, que comprenden, administrar al sujeto una cantidad efectiva de la composición que comprende un anticuerpo que se enlaza a glucagón; y un compuesto de GLP-1 ligado a este, en donde el compuesto GLP-1 tiene actividad de GLP-1. Modalidades especificas llegarán a ser evidentes a partir de la siguiente descripción más detallada de ciertas modalidades preferidas y reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 representa una gráfica que muestra un ensayo para GLP (A2G) -AG159LC : AGI59 IgG2 (GLP (A2G) -AG159) , para determinar si el constructo podría mantener las propiedades de enlace al receptor GLP-1 en la presencia de glucagón. El ensayo de enlace al ligando se realizó como se describe en los Ejemplos, con adición de 0, 1, 10 o 100 nM de glucagón. La Figura 2 representa una gráfica que muestra un ensayo para determinar la actividad agonista del receptor GLP-1 de GLP (A2G ) -AGI 59LC : AGI59 IgG2 (GLP (A2G) -AG159) , en la presencia de glucagón. También se representa en la gráfica, la curva de respuesta de dosis de la activación del receptor GLP-1 por el glucagón solo (sin GLP (A2G) -AG159 ) ( ) . La Figura 3 representa una gráfica que muestra que la presencia de GLP (A2G) -AG159LC : AGI 59 IgG2 (GLP (A2G) -AG159) , dependientemente de la dosis, reduce la actividad inducida por glucagón. La Figura 4 representa una gráfica que muestra los resultados para GLP (A2G) -AG159LC : AGI59 IgG2 (un constructo en el cual GLP(A2G) se fusionó a la cadena ligera del anticuerpo AG159) y varias otras fusiones de anticuerpo. Las fusiones de anticuerpo incluyen los siguientes péptidos GLP-1 fusionados a la cadena ligera (LC) de AG159: A2G/K28N/R30T (SEC ID NO:28), A2G/Q17N/A19T (SEC ID NO:23), A2G/V10Q/V27Q (SEC ID NO: 9), y A2G/W25Q/V27Q (SEC ID NO: 12) . Estas fusiones LC se aparearon con cadenas pesadas IgG2 AG159 para dar los siguientes anticuerpos, los cuales se probaron: GLP (A2G/K28N/R30T) -AG159LC : AG159 IgG2, GLP (A2G/Q17N/A19T ) -AG159LC: AG159 IgG2, GLP (A2G/V10Q/V27Q) -AG159LC : AG159 IgG2, y GLP (A2G/W25Q/V27Q) -AG159LC : AGI 59 IgG2. La dosificación fue 12 ug/ratón . La Figura 5 representa una gráfica que muestra que, para cada una de las composiciones probadas, la glucosa en la sangre se redujo por las primeras 6 horas después de una inyección única y se regresó a los niveles de linea base 24 horas después de una inyección individual. Las fusiones de anticuerpos probadas incluyen los siguientes péptidos GLP-1 fusionados a la cadena ligera (LC) de AG159 : GLP (A2G) (SEC IDNO:126), GLP (A2G/G31N/+G32/+T33 ) (SEC ID NO:31), GLP (A2G/G29N/G31/T) (SEC ID NO: 29) y GLP (A2G/K28N/R30T ) (SEC ID NO: 28) . Estas fusiones de LC se aparearon con cadenas pesadas IgG2 de AG159 para dar los siguientes anticuerpos, los cuales se probaron: GLP (A2G) -AG159LC : AGI 59 IgG2, GLP (A2G/G31N/+G32/+T33) -AG159LC: AG159 IgG2, GLP (A2G/G29N/G31/T) -AG159LC : AGI 59 IgG2, y GLP (A2G/K28N/R30T) -AG159LC: AG159 IgG2. La Figura 6 representa una gráfica que muestra que GLP ( 2G) -AG159LC : AGI 59 IgG2, reducen los niveles de glucosa en la sangre en una manera dependiente de la dosis. La Figura 7 representa una gráfica que muestra un estudio de respuesta de dosis conducido en ratones normal estimulados por una prueba de tolerancia a la glucosa con una composición en la cual, el GLP (A2G/R30G) se fusionó a la cadena ligera de AG159 y se apareó con la cadena pesada de AG159 para dar la fusión de anticuerpo GL (A2G/R30G) -AG159LC: AG159 IgG2. La Figura 8 representa una gráfica que muestra las diferencias en actividad entre la unión de GLP(A2G) a ya sea la LC o HC de AG159, de manera tal que el anticuerpo resultante fue respectivamente GLP (A2G ) -AGI 59LC : AGI 59 IgG2 (referido como LC de GLP (A2G) -AG159 en la FIG. 8) y AG159LC : GLP (A2G) -AGI59 IgG2 (referido como HC de GLP (A2G) -AG159 en la FIG. 8). Ambos constructos fueron igualmente efectivos en la reducción de los niveles de glucosa en la sangre . La Figura 9 representa una gráfica que muestra los niveles de glucosa en la sangre en ratones tratados con GLP (A2G/R30G) -AG159LC: AG159 IgG2. La glucosa en la sangre se midió durante una prueba de tolerancia a la glucosa cada 24 horas hasta que los niveles de glucosa en la sangre regresaron a los valores originales. La Figura 10 representa una gráfica que representa los resultados de un experimento de taquifilaxis en ratones tratados con GLP (A2G/R30G) -AG159LC : AG159 IgG2. La Figura 11 representa una gráfica que muestra la neutralización de AG159 de actividad reportera estimulada por glucagón . La Figura 12 representa una gráfica que muestra que AG159 rompe el enlace de 125I-glucagón al receptor de glucagón humano . La Figura 13 representa una gráfica que muestra que AG159 reduce la glucosa en la sangre en ratones ob/ob.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los encabezados de sección usados en la presente, son para propósitos de organización solamente, y no están para ser construidos como limitantes de la materia objeto descrita. Todas las referencias citadas en esta solicitud están expresamente incorporadas por referencia en la presente para cualquier propósito. Como se usa en esta especificación y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno", y "el", incluyen referencias plurales a menos que el contexto claramente lo dicte de otro modo.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente, tienen el significado comúnmente entendido por una persona experta en la técnica a la cual pertenece esta invención. Las siguientes referencias proporcionan a uno de habilidad con una definición general de muchos de los términos usados en esta invención: Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECFINOLOGY (Walker ed., 1988); THE GLOSSARY OF GENETICS, 5TH ED., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); and Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991). Como se usa en la presente, los siguientes términos tienen los significados descritos para ellos, a menos que se especifique de otro modo. "Actividad insulinotrópica" , se refiere a la capacidad para incrementar la síntesis de insulina, liberación o secreción en una manera dependiente de la dosis. El efecto insulinotrópico puede resultar de cualquiera de un número de diferentes mecanismos, que incluyen pero no se limitan a, un incremento en el número de células positivas a insulina y/o debido a un incremento en la cantidad de insulina sintetizada o liberada de las células positivas a insulina existentes en un periodo de tiempo dado. La actividad insulinotrópica puede ser ensayada usando métodos conocidos en la técnica, tales como experimentos in vivo e in vitro, que miden la actividad de enlace al receptor GLP-1 o activación del receptor (por ejemplo, ensayos usando células isleta pancreáticas o células de insulinoma como se describe en el documento EP 619,322 y Patente Estadounidense No. 5,120,712, y ensayos como se describen en la presente). En humanos, la actividad insulinotrópica puede ser medida examinando niveles de insulina o niveles de péptido-C. El término "proteína aislada" referido en la presente, significa que una proteína de sujeto (1) está libre de al menos, algunas otras proteínas con las cuales podría encontrarse típicamente en la naturaleza, (2) está esencialmente libre de otras proteínas a partir de la misma fuente, por ejemplo, de las mismas especies, (3) está expresada por una célula a partir de diferentes especies, (4) ha sido separada de al menos, aproximadamente 50 porciento de polinucleótidos , lípidos, carbohidratos, u otros materiales con los cuales está asociado en la naturaleza, (5) no está asociado (por interacción covalente o no covalente), con porciones de una proteína con las cuales la "proteína aislada" está asociada en la naturaleza, (6) está preferiblemente asociada (por interacción covalente o no covalente) con un polipéptido con el cual no está asociado en la naturaleza, o (7) no ocurre en la naturaleza. Tal proteína aislada puede ser codificada por ADN genómico, ADNc, ARNm u otro ARN, de origen sintético, o cualquier combinación de los mismos. Preferiblemente, la proteina aislada está sustancialmente libre de proteínas o polipéptidos u otros contaminantes que se encuentran en su ambiente natural que podrían interferir con su uso (terapéutico, diagnóstico, profiláctico, investigación o de otro modo) . " Polipéptido" y "proteína", son usados intercambiablemente en la presente e incluyen una cadena molecular de aminoácidos ligados a través de enlaces peptídicos. Los términos no se refieren a una longitud específica del producto. De este modo, "péptidos" y "oligopéptidos" , están incluidos dentro de la definición de polipéptido. Los términos incluyen modificaciones post-traduccionales del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones , fosforilaciones y similares. Además, fragmentos de proteínas, análogos, proteínas mutadas o variantes, proteínas de fusión y similares, están incluidos dentro del significado de polipéptido. El término "fragmento de polipéptido", se refiere a un polipéptido el cual puede ser monomérico o multimérico, que tiene una supresión amino-terminal , una supresión carboxilo-terminal y/o una supresión interna o sustitución de un polipéptido que se produce recombinantemente o que se origina naturalmente. En ciertas modalidades, un fragmento de polipéptido puede comprender una cadena de aminoácido de al menos 5, hasta aproximadamente 500 aminoácidos de longitud. Se apreciará que en ciertas modalidades, los fragmentos son al menos, de 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 o 450 aminoácidos de longitud. Fragmentos de polipéptido particularmente útiles incluyen, dominios funcionales, que incluyen dominios de enlace. En el caso de un anticuerpo como se proporciona en la presente, los fragmentos útiles incluyen, pero no se limitan a: una región de CDR, especialmente una región de CDR3 de la cadena ligera o pesada; un dominio variable de una cadena ligera o pesada; una porción de una cadena de anticuerpo o solo su región variable que incluye dos CDRs; y similares. El término "anticuerpo" o "péptido anticuerpo" como se usa en la presente, se refiere a una proteina monomérica o multimérica que comprende una o más cadenas de polipéptido que pueden enlazarse específicamente a un antígeno y pueden ser capaz de inhibir o modular la actividad biológica del antígeno. Los términos como se usan en la presente, de este modo incluyen una inmunoglobulina intacta de cualquier isotipo, o un fragmento del mismo que puede competir con el anticuerpo intacto por el enlace específico al antígeno objetivo e incluye, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, humanizados, completamente humanos y biespecí fieos . Un anticuerpo intacto en general, comprenderá al menos, do cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas ligeras de longitud completa, pero en algunos casos, pueden incluir pocas cadenas tales como anticuerpos que se originan naturalmente en camélidos, que pueden comprender solamente cadenas pesadas. Anticuerpos pueden ser derivados solamente de una fuente única, o pueden ser "quiméricos", esto es, diferentes porciones del anticuerpo pueden ser derivadas de dos anticuerpos diferentes. Por ejemplo, las regiones CDR pueden ser derivadas de una fuente murina o rata, mientras la región de estructura de la región V se deriva de una fuente de animal diferente, tal como un humano. Los anticuerpos o fragmentos de enlace como se describe en la presente, pueden ser producidos en hibridomas, por técnicas de ADN recombinante , o por desdoblamiento químico o enzimático de anticuerpos intactos. A menos que se indique de otro modo, el término "anticuerpo" incluye, además de anticuerpos que comprende dos cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas ligeras de longitud completa, derivados, variantes, fragmentos y muteínas de las mismas, ejemplos de las cuales se describen abajo. De este modo, el término incluye un polipéptido que comprende toda o ptécnica de una región variable de cadena ligera y/o pesada, que puede enlazarse específicamente a un antígeno (por ejemplo, glucagón) . El término anticuerpo de este modo, incluye fragmentos inmunológicamente funcionales e incluyen, por ejemplo, F(ab), F(ab'), F(ab')2, Fv y fragmentos Fv de cadena sencilla.

El término "cadena ligera", incluye una cadena ligera de longitud completa y fragmentos de la misma que tienen secuencia de región variable suficiente para conferir especificidad de enlace. Una cadena ligera de longitud completa incluye, un domino de región variable, VL, y un dominio de región constante, CL. El dominio de región variable de la cadena ligera está en el término amino del polipéptido. Las cadenas ligeras incluyen, cadenas capa y cadenas lambda. El término "cadena pesada", incluye una cadena pesada de longitud completa y fragmentos de la misma que tienen suficiente secuencia de región variable para conferir especificidad de enlace. Una cadena pesada de longitud completa incluye un dominio de región variable, VH, y tres dominios de región constante, CH1, CH2 y CH3. El dominio VH está en el término amino del polipéptido, y los dominios CH están en el termino carboxilo, con el CH3 siendo más cercano al extremo -COOH. Las cadenas pesadas de conformidad con la invención, pueden ser de cualquier isotipo, que incluye IgG (que incluye subtipos IgGl, IgG2, IgG3 y IgG4), IgA (que incluye subtipos IgAi y IgA2) , IgM e IgE. El término "fragmento inmunológicamente funcional" (o simplemente "fragmento"), de una cadena de inmunoglobulina , como se usa en la presente, se refiere a una porción de una cadena ligera o cadena pesada de anticuerpo que carece al menos, de los aminoácidos presentes en una cadena de longitud completa pero la cual es capaz de enlazarse específicamente a un antígeno. Tales fragmentos son biológicamente activos en que pueden enlazarse específicamente al antígeno objetivo y pueden competir con anticuerpos intactos para el enlace específico a un epítope dado. En un aspecto de la invención, tal fragmento retendrá al menos, una CDR presente en la cadena ligera o pesada de longitud completa, y en algunas modalidades, comprenderá una porción o cadena ligera y/o pesada sencilla de la misma. Estos fragmentos biológicamente activos pueden ser producidos por técnicas de ADN recombinante, o pueden ser producidos por desdoblamiento enzimático o químico de anticuerpos intactos. Los fragmentos de inmunoglobulina inmunológicamente funcionales de la invención incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos de dominio Fab, Fab' , F(ab' ) 2, Fv, y anticuerpos de cadena sencilla y pueden ser derivados de cualquier fuente de mamífero, que incluye pero no se limita a humano, ratón, rata, camélidos o conejos. Se contempla además, que una porción funcional de los anticuerpos inventivos, por ejemplo, una o más CDRs, podrían ser covalentemente unidas a una segunda proteína o a una molécula pequeña para crear un agente terapéutico dirigido a un objetivo particular en el cuerpo, que posee propiedades terapéuticas bifuncionales, o que tiene una vida media de suero prolongada.

Un "fragmento Fab", está comprendido de una cadena ligera y las regiones variables y CH1 de una cadena pesada. La cadena pesada de una molécula Fab, no puede formar un enlace disulfuro con otra molécula de cadena pesada. Un "fragmento Fab'", contiene una cadena ligera y una porción de una cadena pesada que contiene el dominio VH y el dominio CH1, de manera tal que el enlace disulfuro intercadena puede ser formado entre la cadena ligera y la cadena pesada. Un fragmento "F(ab')2", contiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que contienen una porción de la región constante entre los dominios CH1 y CH2 , de manera tal que un enlace disulfuro intercadena se forma entre las dos cadenas pesadas. Un fragmento F(ab')2 de este modo, está compuesto de dos fragmentos Fab' que son mantenidos en conjunto por un enlace disulfuro entre las dos cadenas pesadas . La "región Fv", comprende las regiones variables de tanto las cadenas pesada como ligera, pero carece de las regiones constantes. "Anticuerpos de cadena sencilla" son moléculas de Fv, en las cuales las regiones variables de cadena ligera y pesada han sido conectadas por un enlazador flexible para formar una cadena de polipéptido único, el cual forma una región de enlace al antigeno. Los anticuerpos de cadena sencilla son discutidos en detalle en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO 88/01649 y Patentes Estadounidenses Nos. 4,946,778 y 5,260,203, descripciones las cuales están incorporadas por referencia. Un "anticuerpo de dominio", es un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional que contiene solamente, la región variable de una cadena pesada o la región variable de una cadena ligera. En algunos casos, dos o más regiones VH están covalentemente unidas con un péptido enlazador para crear un anticuerpo de dominio bivalente. Las dos regiones VH de un anticuerpo de dominio bivalente pueden dirigir el mismo o diferentes antigenos. Un "anticuerpo bivalente", comprende dos sitios de enlace al antigeno. En algunos casos, los dos sitios de enlace tienen las mismas especificidades de antigeno. Sin embargo, los anticuerpos bivalentes pueden ser biespeci fieos (véase aba o) . Un "anticuerpo multiespecifico" , es uno que dirige más de un antigeno o epitope". Un anticuerpo "biespecifico" , "dual-especifico" o "bifuncional" , es un anticuerpo híbrido que tiene dos diferentes sitios de enlace al antígeno. Los anticuerpos biespecificos son una especie de anticuerpo multiespecí fico y pueden ser producidos por una variedad de métodos que incluyen, pero no se limitan a, fusión de hibridomas o enlace de fragmentos Fab' . Véase por ejemplo, & Lachmann (1990), Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al. (1992), J. Immunol. 148:1547-1553. Los dos sitios de enlace de un anticuerpo biespecifico se enlazarán a dos diferentes epitopes, los cuales pueden residir en los mismos o diferentes objetivos de proteina. El término "antigeno", se refiere a una molécula o una porción de una molécula capaz de ser enlazada por un agente de enlace selectivo, tal como un anticuerpo, y adicionalmente , capaz de ser usado en un animal para producir anticuerpos capaz de enlazarse a un epitope de tal antigeno. Un antigeno puede tener uno o más epitopes. El término "epitope", incluye cualquier determinante, preferiblemente un determinante de polipéptido, capaz de enlace especifico a un receptor de células T o inmunoglobulina . Un epitope es una región de un antigeno que se une por un anticuerpo. En ciertas modalidades, los determinantes de epitope incluyen, agrupamientos de superficies químicamente activas de moléculas tales como, aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, fosforilo o sulfonilo y, en ciertas modalidades, pueden tener características estructurales tri-dimensionales específicas, y/o características de carga específica. En ciertas modalidades, un anticuerpo se dice, se enlaza específicamente a un antígeno cuando reconoce preferencialmente su antígeno objetivo en una mezcla completa de proteínas y/o macromoléculas . Un anticuerpo se dice, se enlaza específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación de equilibrio es <10"7 o 1CT8 M. En algunas modalidades, la constante de disociación de equilibrio puede ser < 10"9 M o < 10"10 M. El término "que se origina naturalmente", como se usa en la presente y se aplica a un objeto, se refiere al hecho de que el objeto puede ser encontrado en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polinucleótido o polipéptido que está presente en un organismo (que incluye virus), que pueden ser aislados de una fuente en la naturaleza y que no han sido intencionalmente modificados por el hombre, es el que se origina naturalmente. El término "polinucleótido" , como se refiere en la presente, significa polímeros de ácido nucleico de doble hebra o hebra sencilla de al menos, 10 bases de longitud. En ciertas modalidades, los nucleótidos que comprenden el polinucleótido pueden ser ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. Dichas modificaciones incluyen modificaciones de base, tales como bromuridina, modificaciones de ribosa, tales como arabinósido y 2', 3'-didesoxiribosa y modificaciones de enlace internucleótido, tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato y fosforoamidato . El término "polinucleótido" , específicamente incluye formas de hebra doble y sencilla de ADN . El término "polinucleótido aislado" como se usa en la presente, debe significar un polinucleótido de ADNc, genómico, u origen sintético o alguna combinación del mismo, el cual en virtud de su origen, el polinucleótido aislado (19 no está asociado con toda o una porción de un polinucleótido en el cual el polinucleótido aislado se encuentra en la naturaleza, (2) está ligado a un polinucleótido al cual no está ligado en la naturaleza, o (3) no se origina en la naturaleza como ptécnica de una secuencia más grande. El término "oligonucleótido" referido en la presente, incluye nucleótidos modificados y que se originan naturalmente, ligados en conjunto por enlaces de oligonucleótido que se originan naturalmente y/o que no se originan naturalmente. Los oligonucleótidos son una subserie de polinucleótidos que comprenden miembros que son en general, de hebra sencilla y tienen una longitud de 200 bases o algunas pocas. En ciertas modalidades, los oligonucleótidos son de 10 hasta 60 bases en longitud. En ciertas modalidades, los oligonucleótidos son de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 hasta 40 bases en longitud. Los oligonucleótidos pueden ser de hebra sencilla o doble hebra, por ejemplo, para uso en la construcción de un gen mutante. Los oligonucleótidos como se proporcionan en la presente, pueden ser oligonucleótidos sentido o antisentido con referencia a una secuencia que codifica la proteina. A menos que se especifique de otro modo, el extremo del lado izquierdo de las secuencias de polinucleótido de hebra sencilla son el extremo de 5'; la dirección del lado izquierdo de las secuencias de polinucleótido de doble hebra es referida como la dirección de 50' . La dirección de adición de 5' a 3' de los transcriptos nacientes de ARN, es referida como la dirección de transcripción; las regiones de secuencia en la hebra de ADN que tienen la misma secuencia como el ARN y las cuales son 5' al extremo 5' del transcripto de ARN, son referidas como "secuencias corriente arriba"; las regiones de secuencia en la hebra de ADN que tienen la misma secuencia como el ARN al cual están 3' al extremo 3' del transcripto de ARN, son referidas como "secuencias corriente abajo". El término "vector" es usado para referirse a cualquier molécula (por ejemplo, ácido nucleico, plásmido, o virus), usada para transferir información codificante a una célula hospedera. El término "vector de expresión", se refiere a un vector que es adecuado para transformación de una célula hospedera y contiene secuencias de ácido nucleico que dirigen/controlan la expresión de secuencias de ácido nucleico heterólogas insertadas. La expresión incluye, pero no se limita a, procesos tales como transcripción, traducción y empalme de ARN, si los intrones están presentes. El término "célula hospedera", es usado para referirse a una célula en la cual ha sido introducida, o es capaz de ser introducida con una secuencia de ácido nucleico y además expresar o ser capaz de expresar un gen seleccionado de interés. El término incluye la progenie de la célula precursora, si o no la progenie es idéntica en morfología o en características genéticas a la precursora original, tan pronto como el gen seleccionado esté presente. El término "identidad", como se conoce en la técnica, se refiere a una relación entre las secuencias de dos o más moléculas peptídicas o dos o más moléculas de ácido nucleico, como se determina comparando las secuencias de las mismas. En la técnica, "identidad", también significa el grado de relevancia de secuencia entre moléculas de ácido nucleico o polipéptidos , como el caso puede ser, como se determina por el apareamiento entre cadenas de dos o más nucleótidos o dos o más secuencias de aminoácido. "Identidad", mide el porcentaje de apareamientos idénticos entre la más pequeña de dos o más secuencias con alineaciones de apertura (si las hay), dirigidas por un modelo matemático particular o programa de computadora (es decir, "algoritmos" ) . El término "similitud", es usado en la técnica con respecto a un concepto relacionado, pero contrario a "identidad", "similitud" se refiere a una medida de relevancia, la cual incluye tanto apareamientos idénticos como apareamientos de sustitución conservador. Si dos secuencias de polipéptido tienen por ejemplo, 10/20 aminoácidos idénticos, y el resto son todas sustituciones no conservadoras, entonces el porcentaje de identidad y similitud podría ser 50%. Si en el mismo ejemplo, existe cinco posiciones más en donde existen sustituciones conservadoras, entonces el porcentaje de identidad permanece al 50%, pero el porcentaje de similitud podría ser 75% (15/20) . Por lo tanto, en casos en donde existan sustituciones conservadoras, la similitud de porcentaje entre dos polipéptidos será superior que el porcentaje de identidad entre estos dos polipéptidos. La identidad y similitud de polipéptidos y ácidos nucleicos relacionados puede ser fácilmente calculada por métodos conocidos. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, (Lesk, A.M., ed.), 1988, Oxford University Press, New York; BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, (Smith, D. W., ed.), 1993, Academic Press, New York; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, Part 1, (Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds . ) , 1994, Humana Press, New Jersey; von Heinje, G., SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1987, Academic Press; SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, (Gribskov, M. and Devereux, J. , eds.), 1991, M. Stockton Press, New York; Carillo et al, 1988, SIAM J. Applied Math., 48:1073; y Durbin et al, 1998, BIOLOGICAL SEQUENCE ANALYSIS, Cambridge University Press. Los métodos preferidos para determinar la identidad son designados para dar el apareamiento más grande entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad se describen en programas de computadora públicamente disponibles. Los métodos de programas de computadora preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, paquete de programa GCG, que incluye GAP (Devereux et al, 1984, Nucí. Acid. Res., L2:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), BLASTP, BLASTN, y FASTA (Altschul et al, 1990, J. Mol. Biol, 215:403-410). El programa BLASTX está disponible públicamente a partir del Centro Nacional para Información de Biotecnología (NCBI) y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al, 1990, supra) . El algoritmo Smith Waterman bien conocido, también puede ser usado para determinar la identidad. Ciertos esquemas de alineamiento para alinear dos secuencias de polinucleótido o aminoácido, pueden resultar en el apareamiento de solamente una región corta de dos secuencias, y esta región pequeña alineada puede tener identidad de secuencia muy alta aún aunque no exista relación significante entre las dos secuencias de longitud total. Por consiguiente, en ciertas modalidades, el método de alineamiento seleccionado (programa GAP) , resultará en un alineamiento que recorre al menos, 50 aminoácidos contiguos del polipéptido objetivo. En algunas modalidades, el alineamiento puede comprender al menos, 60, 70, 80, 90, 100, 110 o 120 aminoácidos del polipéptido objetivo. Si los polinucleótidos están alineados usando GAP, el alineamiento puede recorrer al menos, aproximadamente 100, 150 o 200 nucleótidos, los cuales pueden ser contiguos. Por ejemplo, usando el algoritmo GAP de computadora (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, I), dos polipéptidos para los cuales el porcentaje de identidad de secuencia está siendo determinado, son alineados para apareamiento óptimo de sus aminoácidos respectivos (la "trayectoria apareada", como se determina por el algoritmo) . En ciertas modalidades, una penalización de apertura gap la cual se calcula como tres veces la diagonal promedio) ; en donde la "diagonal promedio", es el promedio de la diagonal de la matriz de comparación siendo usada; la "diagonal" es el registro o número asignado a cada apareamiento de aminoácido perfecto por la matriz de comparación particular) , y una penalización de extensión gap (la cual es usualmente un décimo de la penalización de apertura gap) , asi como también una matriz de comparación tal como PAM250 o BLOSUM 62, son usadas en conjunto con el algoritmo. En ciertas modalidades, una matriz de comparación estándar (véase Dayhoff et al, 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5:345-352, para la matriz de comparación PAM 250; Henikoff et al., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci USA, 89:10915-10919 para la matriz de comparación BLOSUM 62), también es usada para el algoritmo. En ciertas modalidades, el parámetro para una comparación de secuencia de polipéptido incluye lo siguiente: Algoritmo: Needleman et al. , 1970, J. Mol. Biol., 48:443-453; Matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff et al. , 1992, supra; Penalización gap: 12 Penalización de longitud gap: 4 Umbral de similitud: 0 El programa GAP puede ser útil con los parámetros anteriores. Para las secuencias de nucleótido, los parámetros pueden incluir una penalización gap de 50 y una penalización de longitud gap de 3, que es una penalización de 3 para cada símbolo en cada gap. En ciertas modalidades, los parámetros mencionados anteriormente son los parámetros por defecto para comparaciones de polipéptidos (junto con no penali zaciones para gaps de extremo), usando el algoritmo GAP. Como se usa en la presente, veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas de tres y una sola letra siguen el empleo convencional. Véase IMMUNOLOGY-A SYNTHESIS , 2nd Edition, (E. S. Golub and D. R. Gren, Eds. ) , Sinauer Associates: Sunderland, MA, 1991, incorporada en la presente por referencia para cualquier propósito. Los estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos ) de los veinte aminoácidos convencionales; aminoácidos no naturales tales como aminoácidos a, a-disustituidos , N-alquil aminoácidos, ácido láctico, y otros aminoácidos no convencionales, también pueden ser componentes adecuados para polipéptidos , como se proporciona en la presente. Ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, e-?, N, N-trimetillisina, e-?-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina , N- formilmetionina, 3-metilhistidina , 5-hidroxilisina , o-N-metilarginina , y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina ) . En la notación de polipéptido usada en la presente, la dirección de lado izquierdo es la dirección amino terminal y la dirección de lado derecho es la dirección carboxilo terminal, de conformidad con el empleo y convención estándar. El término "corriente abajo", cuando se usa con referencia a un compuesto GLP-1, significa posiciones que están localizadas hacia el extremo carboxilo del polipéptido, relativo a la posición siendo referenciada , es decir, a la derecha de la posición siendo referenciada . El término "corriente arriba", cuando se usa con referencia a un compuesto GLP-1, significa posiciones que están localizadas hacia el extremo aminoterminal del polipéptido con relación a la posición siendo referenciada , es decir, a la izquierda de la posición siendo referenciadas . La Nomenclatura y Simbolismo IUPAC-IUB recomendado para Aminoácidos y Péptidos, han sido publicados en Biochem. J. , 1984, 219, 345-373; Eur. J. Biochem., 1984, 138, 9-37; 1985, 152, 1; 1993, 213, 2; Internat. J. Pept . Prot . Res., 1984, 24, siguiendo la p84; J. Biol. Chem., 1985, 260,14-42; Puré Appl . Chem. , 1984, 56, 595-624; Amino Acids and Peptides, 1985, 16, 387-410; Biochemical Nomenclature and Related Documents, 2nd edition, Portland Press, 1992, páginas 39-69. En la valoración de neutralización y enlace al anticuerpo de conformidad con la invención, un anticuerpo se enlaza específicamente y/o sustancialmente inhibe el enlace de glucagón a su receptor y/o previene la activación del receptor de glucagón cuando un exceso de anticuerpo reduce la cantidad de receptor unido a, o activado por el glucagón por al menos, aproximadamente 20%, 40%, 60%, 80%, 85% o más (como se mide en un ensayo de enlace competitivo in vitro o ensayo funcional in vitro respectivamente). Un anticuerpo que se enlaza específicamente, puede esperarse por tener una constante de disociación de equilibrio para enlace al glucagón de menos de o igual a 10~8 molar, óptimamente menos de o igual a 10-9 o 10"10 molar.

El término "agente" es usado en la presente para denotar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto elaborado de materiales biológicos. Como se usa en la presente, los términos "etiqueta" o "etiquetado", se refiere a la incorporación de un marcador detectable, por ejemplo, por incorporación de un aminoácido radioetiquetado, o unido a un polipéptido o ácido nucleico de un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente o una enzima que tiene una actividad detectable, o unida a un polipéptido de porciones de biotina que pueden ser detectadas por avidina etiquetada (por ejemplo, est reptavidina , que comprende preferiblemente un marcador detectable tal como un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente o una actividad enzimática que puede ser detectada, entre otros, por métodos colorimét ricos u ópticos) . En ciertas modalidades, la etiqueta también puede ser terapéutica. Los varios métodos de etiquetado de polipéptidos y g 1 i copr o t e i n a s son conocidos en la técnica y pueden ser usados ventajosamente en los métodos descritos en la presente. Ejemplos de etiquetas para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99raTc, 11 xIn, 125I, 131I), etiquetas fluorescentes (por ejemplo, isocianato de fluoresceína o FITC, rodamina o fósforos de lantánido) , etiquetas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, ß-galactosidasa , luciferasa, fosfatasa alcalina) , etiquetas quimioluminiscentes , etiquetas de hapteno, tales como grupos biotinilo, y epitopes de polipéptido predeterminados, reconocidos por un reportero secundario (por ejemplo, secuencias de par de cierre de leucina, sitios de enlace para anticuerpos secundarios, dominios de enlace metálicos o marcas de epitopes). En ciertas modalidades, las etiquetas son unidas por brazos espaciadores (tales como (CH2)r en donde n < aproximadamente 20) de varias longitudes para reducir la obstrucción esférica potencial. El término "muestra biológica", como se usa en la presente, incluye pero no se limita a, cualquier cantidad de una sustancia de una objeto vivo u objeto vivo anterior. Tales objetos vivos incluyen pero no se limitan a, humanos, ratones, monos, ratas, conejos y otros animales. Tales sustancias incluyen, pero no se limitan a, sangre, suero, orina, células, órganos, tejidos, hueso, médula ósea, nodos linfáticos y piel. El término "agente farmacéutico o fármaco" como se usa en la presente, se refiere a un compuesto o composición química capaz de inducir un efecto terapéutico cuando se administra apropiadamente a un paciente.

II. REVISIÓN Se proporcionan en la presente, composiciones que comprenden un anticuerpo anti-glucagón (es decir, un anticuerpo que se enlaza al glucagón) , que está ligado a un compuesto GLP-1. Típicamente, el anticuerpo no se enlaza solamente al glucagón, sino también neutraliza el glucagón de manera tal que el glucagón no puede activar el receptor del glucagón. El anticuerpo de la composición típicamente se enlaza al glucagón humano e incluye al menos, una porción de la región variable de cadena ligera o cadena pesada. Los resultados con ciertas composiciones, muestran inesperadamente, que el anticuerpo de la composición es capaz de enlazarse al glucagón, mientras el GLP-1 es todavía capaz de enlazarse al receptor GLP-1, debido a la combinación de estas dos entidades. Tales composiciones de este modo, tienen actividades duales. También se proporcionan polipéptidos que incluyen al menos, una porción de la región variable de cadena ligera o cadena pesada de un anticuerpo de glucagón fusionado a un compuesto GLP-1, el cual opcionalmente puede ser combinado con una o más de otras cadenas ligeras o pesadas o fragmentos de las mismas para formar un anticuerpo. El anticuerpo de la composición puede ser un anticuerpo quimérico, humanizado o completamente humano, que incluye fragmentos inmunológicamente funcionales. También se describen polipéptidos que son capaces de exhibir propiedades inmunológicas de enlace de sitios de enlace al antigeno del anticuerpo. El compuesto GLP-1 que está ligado al anticuerpo anti-glucagón, puede ser GLP-1 nativo, cualquiera de los análogos de GLP-1 que son conocidos en la técnica, o uno de los análogos de GLP-1 descrito en la presente, que tiene una actividad de GLP-1 nativo. En algunas composiciones, el anticuerpo anti-glucagón y el compuesto GLP-1, son ptécnica de una proteina de fusión en la cual, las dos moléculas están unidas directamente o vía un enlazador peptidico. En otras composiciones, el anticuerpo y compuesto GLP-1, no son ptécnica de una proteina de fusión y preferentemente, están unidos vía un enlazador no peptidico. También se describen ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos y polipéptidos, asi como también métodos para expresar los anticuerpos usando estos ácidos nucleicos. Como se describe en más detalle abajo, los compuestos GLP-1 que se proporcionan, pueden ser administrados terapéuticamente o profilácticamente para tratar una variedad de enfermedades. Ejemplos de enfermedades que pueden ser tratadas con los compuestos incluyen, pero no se limitan a, diabetes, tolerancia a la glucosa deteriorada, resistencia a la insulina, hiperglicemia , síndrome metabólico, varios trastornos lípidos, obesidad, enfermedades coronarias, trastornos óseos y síndrome de intestino irritable .

III. Composiciones de Anticuerpo/Compuesto GLP-1 y Polipéptidos Las composiciones que se proporcionan, en general comprenden un anticuerpo que se enlaza al glucagón y uno o más compuestos GLP-1 que están ligados al anticuerpo. Cuando se usa para describir la relación entre el anticuerpo anti-glucagón y el compuesto GLP-1, el término "ligado", significa que las dos moléculas están unidas en conjunto, con cada molécula que todavía retiene al menos, una de sus actividades nativas (por ejemplo, el anticuerpo mantiene la capacidad para enlazarse al glucagón, y el compuesto GLP-1 mantiene una actividad de GLP-1) . El anticuerpo en algunas composiciones es un anticuerpo completamente humano. Típicamente, el anticuerpo es un anticuerpo neutralizante que puede enlazarse al glucagón e inhibir su capacidad para activar el receptor de glucagón (por ejemplo, en un ensayo in vitro o in vivo, tal como se describe en la presente) . Más de un compuesto GLP-1 puede ser ligado al anticuerpo, y estos pueden ser los mismos o diferentes. El anticuerpo y los compuestos pueden o no pueden ser unidos vía un enlazador. De este modo, por ejemplo, el (los) compuesto (s) GLP-1 y el anticuerpo, pueden ser químicamente conjugados entre sí vía grupos reactivos naturalmente presentes en, o introducidos en las moléculas sin el uso de un enlazador. En otros casos, el compuesto y el anticuerpo son fusionados entre si como ptécnica de una proteina de fusión, ya sea directamente o vía un enlazador peptidico. En otras composiciones, un enlazador sintético o peptidico se usa para enlazar el compuesto GLP-1 y el anticuerpo. Detalles adicionales con respecto a opciones para enlazar el anticuerpo y compuesto (s) GLP-1 se listan abajo. El (los) compuesto (s) puede ser ligado al N o C-término del anticuerpo o ambos. En ciertas modalidades, el compuesto GLP-1 está ligado a la región variable de la cadena ligera y/o pesada del anticuerpo que se enlaza al glucagón. De este modo, en ciertas composiciones, tanto las cadenas ligeras como pesadas del anticuerpo están ligadas a un compuesto GLP-1. El compuesto unido a las diferentes cadenas puede ser el mismo o diferente . Los anticuerpos de algunas composiciones que son proporcionadas, tienen una afinidad de enlace (Ka) para glucagón de al menos, 104 o 105/M x segundo. Otros anticuerpos tienen un ka de al menos, 106, 107, 108 o 109/M x segundo. Ciertos anticuerpos que se proporcionan tienen una relación de baja disociación. Algunos anticuerpos, por ejemplo, tienen un Kdisoc de 1 x 10~ s_1, 1 x 10"5s_1 o inferior. Los anticuerpos en algunas composiciones tienen una vida media de al menos, un día in vitro o in vivo (por ejemplo, cuando se administra a un sujeto humano) . El anticuerpo en ciertas composiciones tiene una vida media de al menos, dos o tres días. En otra modalidad, el anticuerpo tiene una vida media de cuatro días o más. Todavía otros anticuerpos tienen una vida media de siete u ocho días o más. En otra modalidad, el anticuerpo o porción que se enlaza al antígeno del mismo, se deriva o modifica de manera tal que tiene una vida media más larga comparada con el anticuerpo no modificado o no derivatizado . También se proporcionan polipéptidos que contienen sitios de enlace al glucagón, opcionalmente fusionados con uno o más compuestos de GLP-1. En ciertas modalidades, una composición de anticuerpo/GLP-1 comprende al menos, un anticuerpo anti-glucagón, al menos un enlazador y al menos un compuesto GLP-1. Enlazadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, un enlazador peptídico, un enlazador alquilo, un enlazador PEG, y un enlazador que resulta de un proceso enzimático o químico, usado para conectar dos polipéptidos. En algunas composiciones, al menos un anticuerpo anti-glucagón comprende dos cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas ligeras de longitud completa. En otras composiciones, al menos un anticuerpo anti-glucagón comprende al menos, una cadena pesada truncada y/o al menos una cadena ligera truncada. De este modo, por ejemplo en ciertas composiciones, el anticuerpo es un fragmento que retiene la capacidad para enlazarse al glucagón. Ciertos fragmentos de anticuerpo ejemplares incluyen, pero no se limitan a, un Fab, Fab 1 , F(ab' )2r Fv, y un Fv (scFv) de cadena sencilla. El C-término del compuesto GLP-1 en algunas composiciones, está ligado al N-término de la cadena ligera y/o pesada del anticuerpo, mientras en otras composiciones, el N-término del compuesto GLP-1 está ligado al C-término de la cadena ligera y/o pesada. En algunas composiciones, el compuesto GLP-1 está ligado vía su N- o C-término a otra molécula vía su N- o C-término. Algunas composiciones de anticuerpo/GLP-1 comprenden un anticuerpo anti-glucagón y un compuesto GLP-1. Otras composiciones comprenden un anticuerpo y dos compuestos. Todavía otras composiciones comprenden un anticuerpo y más de dos compuestos GLP-1. Ciertas composiciones comprenden más de un anticuerpo y un compuesto GLP-1. Otras composiciones comprenden más de un anticuerpo y más de un compuesto. En ciertas composiciones, un primer compuesto GLP-1 está ligado a la cadena pesada de un anticuerpo anti-glucagón y un segundo compuesto GLP-1 que tiene la misma o diferente secuencia de aminoácido como el primero compuesto, está ligado a la cadena ligera del anticuerpo. El anticuerpo y compuesto en algunas composiciones de este tipo, están ligados vía un enlazador. En otras composiciones, al menos un compuesto GLP-1 es fusionado a la cadena pesada de un anticuerpo anti-glucagón. En todavía otras composiciones, el compuesto GLP-1 es fusionado a la cadena ligera de un anticuerpo anti-glucagón. En algunas composiciones, un primer compuesto GLP-1 es fusionado a la cadena pesada de un anticuerpo anti-glucagón y un segundo compuesto GLP-1, que tiene la misma o diferente secuencia de aminoácido como el primer compuesto, es fusionado a la cadena ligera del anticuerpo. En ciertas modalidades, la cadena pesada de un anticuerpo anti-glucagón, es fusionada al menos, a dos compuestos de GLP-1 que tienen la misma o diferente secuencia. En ciertas modalidades, la cadena ligera del anticuerpo es fusionada al menos a dos compuestos de GLP-1 que tienen la misma o diferente secuencia. En ciertas modalidades, la cadena pesada del anticuerpo es fusionada al menos, a dos primeros compuestos de GLP-1 que tienen la misma o diferente secuencia y la cadena ligera del anticuerpo es fusionada al menos, a dos segundos compuestos de GLP-1 que tienen la misma o diferente secuencia . Ciertas composiciones tienen una relación de dos compuestos de GLP-1 por un anticuerpo anti-glucagón. De este modo, en algunas modalidades, la composición comprende un primer compuesto GLP-1 ligado a una primera cadena pesada de anticuerpo anti-glucagón y un segundo compuesto de GLP-1 ligado a una segunda cadena pesada del anticuerpo. En ciertas modalidades, tal composición comprende un primer compuesto GLO-1 ligado a una primera cadena ligera de un anticuerpo de glucagón y un segundo compuesto GLP-1 ligado a una segunda cadena ligera del anticuerpo. Otras composiciones que comprenden una relación de dos compuestos GLP-1 por un anticuerpo de glucagón serán aparentes para aquellos de habilidad ordinaria en la técnica. Algunas composiciones comprenden cuatro compuestos de GLP-1 por anticuerpo anti-glucagón. De este modo, en algunas modalidades, una composición comprende un primer compuesto GLP-1 ligado a una primera cadena pesada de un anticuerpo de glucagón, un segundo compuesto ligado a una segunda cadena pesada del anticuerpo, un tercer compuesto ligado a una primera cadena ligera del anticuerpo, y un cuarto compuesto ligado a una segunda cadena ligera del anticuerpo. En ciertas composiciones, tal composición comprende un primer compuesto GLP-1 ligado al N-término de una primera cadena pesada de un anticuerpo de glucagón, un segundo compuesto ligado al C-término de la primera cadena pesada del anticuerpo, un tercer compuesto ligado al N-término de una segunda cadena pesada del anticuerpo, y un cuarto compuesto ligado al C-término de la segunda cadena pesada del anticuerpo. En otras composiciones, un primer compuesto GLP-1 y un segundo compuesto GLP-1 están ligados al N-término de una primera cadena pesada de un anticuerpo anti-glucagón, y un tercer compuesto GLP-1 y un cuarto compuesto GLP-1, están ligados al N-término de una segunda cadena pesada del anticuerpo. Otras varias composiciones también están incluidas en la presente, como uno de habilidad en la técnica puede designar composiciones adicionales que comprenden una relación de cuatro compuestos GLP-1 por un anticuerpo anti-glucagón . Todavía otras composiciones comprenden, ocho compuestos GLP-1 por un anticuerpo anti-glucagón . Por ejemplo, algunas composiciones comprenden, un primer compuesto GLP-1 ligado al N-término de una primera cadena pesada de un anticuerpo anti-glucagón, un segundo compuesto ligado al C-término de la primera cadena pesada del anticuerpo, un tercer compuesto ligado al N-término de una segunda cadena pesada del anticuerpo, un cuarto compuesto ligado al C-término de la segunda cadena pesada del anticuerpo, un quinto compuesto ligado al N-término de una primera cadena ligera del anticuerpo, un sexto compuesto ligado al C-término de la primera cadena ligera del anticuerpo, un séptimo compuesto ligado al N- término de una segunda cadena ligera del anticuerpo, y un noveno compuesto ligado al C-término de la segunda cadena ligera del anticuerpo. Otras composiciones comprenden, aun primer y segundo compuesto GLP-1 ligado al N-término de una primera cadena pesada de un anticuerpo anti-glucagón, un tercero y un cuarto compuesto ligado al N-término de una segunda cadena pesada del anticuerpo, un quinto y sexto compuesto ligado al N-término de una primera cadena ligera del anticuerpo, y un séptimo y un octavo compuesto ligado al N- término de una segunda cadena ligera del anticuerpo. Otras combinaciones adicionales que incluyen relaciones similares, están incluidas como un experto en la técnica puede designar composiciones adicionales de anticuerpo/GLP-1 , que comprenden una relación de ocho compuestos GLP-1 por un anticuerpo anti-glucagón .

A. Anticuerpos El anticuerpo de la composición puede ser un anticuerpo quimérico, humanizado o completamente humano, asi como también un fragmento inmunológicamente funcional de tales anticuerpos (por ejemplo, un fragmento F(ab), F(ab' ) , F(ab' )2r Fv, Fv de cadena sencilla, un anticuerpo de dominio o una inmunoadhesión) . La composición puede también incluir un polipéptido que tiene la capacidad para enlazarse al glucagón (por ejemplo, un polipéptido que incluye sitios de enlace al antigeno de anticuerpo) . Un anticuerpo ejemplar que se enlaza al glucagón que es empleado en algunas de las composiciones que se proporcionan, es referido como AG159. Este anticuerpo es un anticuerpo completamente humano. Las secuencias de cadena pesada y ligera de longitud completa, las secuencias de región variable de cadena pesada y ligera y las CDRs de cadena pesada y ligera, son expuestas en las Tablas 1 y 2 abajo. Uno de habilidad en la técnica puede generar e identificar anticuerpos adicionales que se enlazan al glucagón usando los métodos y técnicas descritos en la presente. Por ejemplo, los anticuerpos de glucagón ejemplares y métodos para elaborarlos, se describen en la Patente Estadounidense No. 5,770,445. 1. Anticuerpos Ejemplares que se Originan Naturalmente Algunas composiciones incluyen un anticuerpo que tiene una estructura típicamente asociada con anticuerpos que se originan naturalmente. Las unidades estructurales de estos anticuerpos típicamente comprenden uno o más tetrámeros, cada uno compuesto de dos acoplamientos idénticos de cadenas de polipéptido, aunque algunas especies de mamíferos también producen anticuerpos que tienen solamente una cadena pesada única. En un anticuerpo típico, cada par o acoplamiento incluye una cadena "ligera" de longitud completa, y una cadena "pesada" de longitud completa. Cada cadena de inmunoglobulina individual está compuesta de varios "dominios de inmunoglobulina", cada uno que consiste de aproximadamente 90 hasta 110 aminoácidos y que expresan un patrón de plegado característico. Estos dominios son las unidades básicas de las cuales están compuestos los polipéptidos de anticuerpo. La porción amino-terminal de cada cadena típicamente incluye un dominio variable que es responsable de un reconocimiento antigénico. La porción carboxi-terminal es más evolucionariamente conservada que el otro extremo de la cadena y se refiere como la "región constante" o "región C". Las cadenas ligeras humanas en general, son clasificadas como cadenas ligeras kapa y lambda, y cada una de estas contiene un dominio variable y un dominio constante. Las cadenas pesadas son típicamente clasificadas como cadenas mu, delta, gama, alfa, o épsilon, y estas definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA, y IgE, respectivamente. El IgG tiene varios subtipos, que incluye pero no se limita a, IgGi, IgG2, IgG3, e IgG4. Los subtipos IgM incluyen IgMi e IgM2. Los subtipos IgA incluyen IgAi e IgA2. En humanos, los isotipos IgA e IgD, contiene cuatro a cadenas pesadas y cuatro cadenas ligeras; los isotipos IgG e IgE, contienen dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras; y el isotipo IgM contiene cinco cadenas pesadas y cinco cadenas ligeras. La región de cadena pesada C típicamente comprende, uno o más dominios que pueden ser responsables de la función efectora.

El número de dominios de región constante de cadena pesada dependerá del isotipo. Las cadenas pesadas IgG, por ejemplo, cada una contiene tres dominios de región C conocidos como CH1, CH2 y CH3. En las cadenas pesadas y ligeras de longitud completa, las regiones variables y constante están unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada que también incluye una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos. Véase por ejemplo, Fundamental Immunology, 2nd ed., Ch. 7 (Paul, W., ed.) 1989, New York: Raven Press (por este medio, incorporada por referencia en su totalidad para todos los propósitos). Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada típicamente forman el sitio de enlace al antígeno. Las regiones variables típicamente exhiben la misma estructura general de regiones de armazón relativamente conservadas (FR), unidas por tres regiones hipervariables , también llamadas regiones que determinan la complementariedad o CDRs . Las CDR de las dos cadenas de cada par están típicamente incluidas dentro de las regiones de estructura, las cuales pueden permitir el enlace a un epítope especifico. De N-terminal a C-terminal, tanto las regiones variables de cadena pesada como ligera, típicamente comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR . La asignación de aminoácidos a tal domino es típicamente de conformidad con las definiciones de Kabat et al., como se explica en más detalle abajo. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (1991, National Institutes of Health, Bethesda, Md.); véase también Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol 196:901-917; Chothia et al, 1989, Nature 342:878-883. Los CDR constituyen los puntos de contacto de superficie principal para enlace al antigeno. Véase por ejemplo, Chothia and Lesk, supra. Además, las CDR3 de la cadena ligera y, especialmente, las CDR3 de la cadena pesada, pueden constituir las determinantes más importantes en el enlace al antigeno dentro de las regiones variables de la cadena pesada y ligera. Véase por ejemplo, Chothia and Lesk, supra; Desiderio et al. (2001), J. Mol. Biol. 310: 603-15; Xu and Davis (2000), Immunity 13(1): 37-45; Desmyter et al. (2001), J. Biol. Chem. 276(28): 26285-90; y Muyldermans (2001), J. Biotechnol. 74(4): 277-302. En algunas modalidades, la CDR3 de cadena pesada parece constituir el área principal de contacto entre el antigeno y el anticuerpo. Desmyter et al, supra. Los esquemas de selección in vitro en los cuales la CDR3 sola es variada, pueden ser usados para variar las propiedades de enlace de un anticuerpo. Muyldermans, supra; Desiderio, supra. Las CDRs pueden ser localizadas en una secuencia de región variable de cadena pesada en la siguiente forma. La CDR1 inicia a aproximadamente el residuo 31 del anticuerpo maduro y es usualmente de aproximadamente 5-7 aminoácidos de longitud, y es casi siempre precedido por Cys-Xxx-Xxx-Xxx- Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx (SEC ID NO: 93) (en donde "Xxx" es cualquier aminoácido) . El residuo después de la CDR1 de cadena pesada, es casi siempre un triptofano, a menudo un Typ-Val, Trp-Ile, o Trp-Ala. Catorce aminoácidos son casi siempre entre los últimos residuos en la CDR1 y los primeros en la CDR2, y CDR2 típicamente contiene 16 hasta 19 aminoácidos. La CDR2 puede ser inmediatamente precedida por Leu-Glu-Trp-Ile-Gly (SEC ID NO: 94) y puede ser inmediatamente seguida por Lys/7rg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala. Otros aminoácidos pueden preceder o seguir a CDR2. Treinta y dos aminoácidos son casi siempre entre los últimos residuos en la CDR2 y los primeros en la CDR3 y la CDR3 puede ser desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 25 residuos de largo. Un Cys-Xxx-Xxx casi siempre inmediatamente precede a CDR3, y un Trp-Gly-Xxx-Gly (SEC ID NO: 95), casi siempre sigue a CDR3. Las CDR de cadena ligera pueden ser localizadas en una secuencia de cadena ligera en la siguiente forma. La CDR1 inicia a aproximadamente el residuo 24 del anticuerpo maduro y es usualmente de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 17 residuos de largo. Es casi siempre precedida por una Cys. Existen casi siempre 15 aminoácidos entre el último residuo de la CDR1 y el primer residuo de la CDR2, y la CDR2 es casi siempre de 7 residuos de largo. La CDR2 es típicamente precedida por Ile-Tyr, Val-Tyr, Ile-Lys, Ile-Phe. Existen casi siempre 32 residuos entre la CDR2 de cadena ligera y CDR3, y CDR3 es usualmente de aproximadamente 7 hasta 10 aminoácidos de longitud. La CDR3 es casi siempre precedida por Cys y usualmente seguida por Phe-Gly-Xxx-Gly (SEC ID NO: 96) . Uno de habilidad en la técnica, se dará cuenta que las longitudes de las regiones de estructura que circundan las CDRs, pueden contener inserciones o supresiones que hacen su longitud diferente de aquella que es típica. Como significa aquí, la longitud de las regiones de estructura de cadena pesada caen dentro de los siguientes intervalos: FR1 0 a 41 aminoácidos; FR2, 5 a 24 aminoácidos; FR3 13 a 42 aminoácidos; y FR4, 0 a 21 aminoácidos. Además, la invención contempla que las longitudes de las regiones de estructura de cadena ligera caen dentro de los siguientes intervalos: FR1, 6 a 35 aminoácidos; FR2, 4 a 25 aminoácidos; FR3 2 a 42 aminoácidos; y FR4, 0 a 23 aminoácidos. Los anticuerpos que se originan naturalmente, típicamente incluyen una secuencia señal, la cual dirige el anticuerpo en la trayectoria celular para secreción de proteína y la cual no está presente en el anticuerpo maduro. Un polinucleótido que codifica un anticuerpo como se proporciona en la presente, puede codificar una secuencia señal que se origina naturalmente, o una secuencia señal heteróloga como se describe abajo. Anticuerpos pueden ser madurados in vitro para producir anticuerpos con propiedades alteradas, tales como una afinidad superior para un antígeno o una constante de disociación más baja. La variación de solamente residuos dentro de las CDR, particularmente las CDR3s, puede resultar en anticuerpos que se enlazan al mismo antígeno, pero con mayor afinidad. Véase por ejemplo, Schier et al, 1996, J. Mol. Biol. 263:551-67; Yang et al, 1995, J. Mol Biol. 254:392-403. La invención abarca anticuerpos creados por una variedad de esquemas de selección in vitro, tales como maduración de afinidad y/o intercambio de cadena (Kang et al, 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. 88:1 1120- 23), o intercambio de ADN (Stemmer, 1994, Nature 370:389-391), por el cual los anticuerpos pueden ser seleccionados para tener propiedades ventajosas. En muchos esquemas, un anticuerpo conocido es aleatorizado en ciertas posiciones, a menudo dentro de las CDRs, in vitro y sometido a un proceso de selección por medio del cual anticuerpos con propiedades deseadas, tales como afinidad incrementada por un cierto antigeno, pueden ser aislados. Véase por ejemplo, van den Beucken et al, 2001, J. Mol Biol. 310:591-601; Desiderio et al, 2001, J. Mol Biol. 310:603-15; Yang et al, 1995, J Mol Biol 254:392-403; Schier et al, 1996, J. Mol Biol 263:551-67. Típicamente, tales anticuerpos mutados pueden comprender varios residuos alterados en una o más CDRs, dependiendo del diseño de la mutagénesis y etapas de selección. Véase por ejemplo, van den Beucken et al., supra. Ejemplos específicos de algunas de las cadenas ligera y pesada de longitud completa de los anticuerpos que son proporcionados y su secuencia correspondiente de aminoácido, incluyen aquellos listados en la Tabla 1, la cual proporciona las secuencias de cadena ligera y pesada de AG159. Las secuencias adicionales relacionadas con las cadenas ligera y pesada se listan en la Tabla 2. Los C-términos de algunas secuencias de cadena pesada pueden terminar ...SLSPGK O....SLSPG, dependiendo del hospedero en el cual se expresa la proteina. Que tal Usina C-terminal pueda o no pueda estar presente, es indicado como se muestra en las Tablas 1 y 2, encerrando el símbolo para lisina en paréntesis, es decir, (K) . En células CHO, por ejemplo, la lisina C-terminal es desdoblada, resultando en la secuencia al C-término de ...SLSPG en lugar de SLSPGK.

Tabla 1: Cadenas Ligera y Pesada Ref. Interna Nombre Secuencia de Aminoácido SEC ID No. abrev./tipo NO: de cadena forma madura H1 /pesada QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAP 82 de AG150 lgG1 GKGLEWVAVIYYDGSNKYYADSVKGRFTISRDITKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCARASRGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV DYFPEPVTVS NSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEY CKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VD SRWQQG VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(K) forma madura H2/pesada QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAP 89 de AG159 !gG2 GKGLE VAVIYYDGSNKYYADSVKGRFTISRDITKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCARASRGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSW SGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTC VDHKP SNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQFNSTFRWSVLTWHQDWL GKEY C VSNKGLPAPIE KTISKT GQPREPQVYTLPPSREEMT NQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPE YKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVD S RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (K) AG159 Kapa L1 /ligera 40 EIVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPG QAPRLLISDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPED FAVYYCQQRS WITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQ LKSGTASWCLL NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV HQGLSSPVT KSFNRGEC Tabla 2 REF. INTERNA SECUENCIA SEC lü NO. NO: lgG2 maduro QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMH RQAPGKGLEWVAVIYYDGSNK 39 AG I 59 (secuencia YYADSVKGRFTISRDITK TLYLQMNSLRAEDTAVYYCARASRGFDYWGQGTLVTVSS sin lisina ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVS NSGALTSGVHTFPAVLQ C-terminal, por SSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNT VDKTVERKCCVECPPCPAPPVAG ejemplo, como se PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQF WYVDGVEVHNAKTKPREEQ expresa en células FNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGIjPAPIEKTISKT GQPREPQVYTLPP CHO) SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE ESNGQPE YKTTPPMLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Forma madura de EIVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLISDASNRATGI 75 cadena ligera PARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWITFGOGTRLEIKRTVAAPSVFI AGI S 9 FPPSDEQLKSGTASWCLLNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKMKVYACEVTHQGLSSPVTKSF RGEC región constante RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLL FYPREA VQWKVDNALQSGNSQESVTE 80 kapa humana QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC cadena ligera MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCEIVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLAWY 81 AGJ 59 que incluye QQKPGQAPRLLISDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNW péptido señal ITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLL FYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR GEC región ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ 87 constante IgG l SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYIC V HK.PSNTK.VDK VEPKSCDKTHTCPPCPAPE humana LLGGPSVFLFPP PKDTL ISRTPEVTC WDVSHEDPEVKF WYVDGVEVHNAKT P REEQYNSTYRWSVLTVLHQD L GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSRDELTK QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN YKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSV HEALH HYTQKSLSLSPGK péptido señal ciue MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHW 88 Incluye HC de VRQAPGKGLE VAVIYYDGSNKYYADSVKGRFTISRDITKNTLYLQMNSLRAEDTAVY AGI 59 IgG l YCARASRGFDY GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV DYFPEP VTVS NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC VNHKPSNTKV DKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP PKDTLMISRTPEVTCVWDVSHE DPEVKF!W VDGVEVHNA KPREEQY STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS KA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPG(K) región ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ 90 constante igG2 SSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTC VDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAG humana PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVQF YVDGVEVHNAKTKPREEQ FNSTFRWSVLTWHQD L GKEYKC VSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPP SREEMTK QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY TTPPMLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (K) péptido señal que MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMH 91 incluye HC de VRQAPGKGLEWVAVIYYDGSNKYYADSVKGRFTISRDITKNTLYLQMNSLRAEDTAVY AG I 59 lgG2 YCARASRGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKV DKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV DVSHEDPEV QFWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAP IEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTK QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN YKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV HEALHNHYTQKSLSLSPG ( K) La cadena ligera listada en la Tabla 1, puede ser combinada con cualquiera de las cadenas pesadas mostradas en la Tabla 1 para formar un anticuerpo. De este modo, los anticuerpos incluidos en ciertas composiciones incluyen aquellos en los cuales Ll es combinado con ya sea Hl o H2. En algunos casos, los anticuerpos incluyen al menos una cadena pesada y una cadena ligera a partir de aquella listada en la Tabla 1. En otros casos, los anticuerpos contienen dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. Como un ejemplo, un anticuerpo puede incluir dos cadenas ligeras Ll y dos cadenas pesadas Hl, o dos cadenas ligeras Ll y dos cadenas pesadas H2. Otras composiciones incluyen anticuerpos que son variantes de anticuerpos formados por combinación de las cadenas ligera y pesada mostradas en la Tabla 1, y que comprenden cadenas ligera y/o pesada que cada una tiene al menos, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% de identidad a las secuencias de aminoácido de estas cadenas. En algunos casos, tales anticuerpos incluyen al menos, una cadena ligera y una cadena pesada, mientras en otros casos, las formas variantes contienen dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. 2. Dominios Variables de Anticuerpos Ciertas composiciones de anticuerpo/compuesto GLP-1, incluyen un anticuerpo que comprende una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 79 y/o una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 83, y fragmentos inmunológicamente funcionales, derivados, muteinas y variantes de estas regiones variables de cadena ligera y cadena pesada. Las secuencias de dominio variable son mostradas en la Tabla 3.

Tabla 3 El anticuerpo de algunas composiciones comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de la SEC ID NO: 79 a solamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 residuos de aminoácido, en donde cada una de tales diferencias de secuencia es independientemente ya sea una supresión, inserción o sustitución de un aminoácido. La región variable de cadena ligera en algunos anticuerpos, comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácido de la región variable de cadena ligera de la SEC ID NO: 79. Se proporcionan ciertas composiciones que incluyen un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende, una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de la SEC ID NO: 83 a solamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 residuos de aminoácido, en donde cada una de tales diferencias de secuencia es independientemente ya sea una supresión, inserción o sustitución de un aminoácido. La región variable de cadena pesada en algunos anticuerpos comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácido de la SEC ID NO: 83. 3. CDRs de Anticuerpos Las regiones que determinan la complementariedad (CDRs) y regiones de estructura (FR) de un anticuerpo dado, pueden ser identificadas usando el sistema descrito por Kabat et al., en Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242, 1991. Ciertos anticuerpos de la composición que son descritos en la presente, comprenden una o más secuencias de aminoácido que son idénticas o tienen sustancial identidad de secuencia con las secuencias de aminoácido de una o más de las CDR como se resume en la Tabla 4.

Tabla 4: CDRs Los anticuerpos de ciertas composiciones de anticuerpo/compuesto GLP-1, que son proporcionados pueden incluir uno, dos, tres, cuatro, cinco o todas las seis CDR listadas anteriormente. Algunos anticuerpos incluyen tanto la CDR de cadena ligera y/o la CDR de cadena pesada. Ciertos anticuerpos tienen formas variantes de las CDRs listadas en la Tabla 4, con una o más (es decir, 2, 3, 4, 5 o 6) de las CDRs que cada una tiene al menos, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95%, de identidad de secuencia a una secuencia de CDR listada en la Tabla 4. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento puede incluir tanto una CDR de cadena ligera como una CDR de cadena pesada que cada una tiene al menos, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95%, de identidad de secuencia con la secuencia CDR3 de cadena ligera y la CDR3 de cadena pesada, respectivamente, listadas en la Tabla 4. Las secuencias de CDR de algunos de los anticuerpos que son proporcionados, pueden también diferir de la secuencias de CDR listadas en la Tabla 4, de manera tal que la secuencia de aminoácido para cada CDR dado difiere de la secuencia listada en la Tabla 4, por no más de 1, 2, 3, 4 o 5 residuos de aminoácido. Las diferencias de las secuencias listadas usualmente son sustituciones conservadoras (véase abajo). Los polipéptidos que comprenden una o más de las CDR de cadena pesada o ligera, pueden ser producidos usando un vector adecuado para expresar los polipéptidos en una célula hospedera adecuada, como se describe en mayor detalle abajo. Las regiones variables de cadena ligera y pesada y las CDRs que son descritas en la Tabla 3 y 4, pueden ser usadas para preparar cualquiera de los varios tipos de fragmentos inmunológicamente funcionales que son conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos de dominio, fragmentos Fab, fragmentos Fab' , fragmentos F(ab' )2/ fragmentos Fv, anticuerpos de cadena única y scFvs. 4. Anticuerpos Monoclonales Ciertas composiciones de anticuerpo/compuesto GLP-1 que son proporcionadas incluyen, un anticuerpo monoclonal que se enlaza al glucagón (por ejemplo, glucagona humana). Los anticuerpos monoclonales pueden ser producidos usando cualquiera de las técnicas conocidas en el técnica, por ejemplo, inmortalizando células del bazo recolectadas de animal transgénico después de la terminación del programa de inmunización. Las células del bazo pueden ser inmortalizadas usando cualquier técnica conocida en el técnica, por ejemplo, fusionándolas con células de mieloma para producir hibridomas. Células de mieloma para uso en procedimientos de fusión produciendo hibridoma, preferiblemente no están produciendo anticuerpos, tienen alta eficiencia de fusión y deficiencias enzimáticas que las proporcionan incapaces de crecer en cierto medio selectivo, el cual soporta el crecimiento de solamente las células fusionadas deseadas (hibridomas). Ejemplos de lineas de células adecuadas para uso en las fusiones de ratón incluyen Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NSl/l.Ag 41, Sp210-Agl4, FO, NSO/U, ¡MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XX0 Bul; ejemplos de lineas de células usadas en fusiones de rata incluyen, R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F y 4B210. Otras lineas de células empleadas para fusiones celulares son U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 y UC729-6. En algunos casos, una linea de hibridoma de célula se produce inmunizando un animal (por ejemplo, un animal transgénico que tiene secuencias de inmunoglobulina humana) con un inmunógeno de glucagón; recolectar células del bazo a partir del animal inmunizado; fusionar las células del bazo recolectadas a una linea de células de mieloma, con ello, generando células de hibridoma; estableciendo lineas de células de hibridoma a partir de las células de hibridoma, e identificar una linea de célula de hibridoma que produce un anticuerpo que se enlaza a un glucagón. Anticuerpos monoclonales secretados por una linea de células de hibridoma, pueden ser purificados usando cualquier técnica conocida en el técnica. Los hibridomas o mAbs, pueden además, se seleccionados para identificar mAbs con propiedades particulares, tales como la capacidad para bloquear una actividad inducida por glucagón. Ejemplos de tales selecciones se proporcionan en los ejemplos siguientes.

. Anticuerpos Quiméricos y Humanizados Otras composiciones de anticuerpo/compuesto GLP-1, incluyen un anticuerpo quimérico o humanizado. Los anticuerpos monoclonales para uso como agentes terapéuticos pueden ser modificados en varias formas antes del uso. Un ejemplo es un anticuerpo "quimérico", el cual es un anticuerpo compuesto de segmentos de proteina a partir de diferentes anticuerpos que son covalentemente unidos para producir cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulina funcional o porciones inmunológicamente funcionales de las mismas. En general, una porción de la cadena pesada y/o cadena ligera, es idéntica con u homologa a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras el resto de la(s) cadena (s) es/son idéntica (s) con u homologas a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo. Para métodos que se refieren a anticuerpos quiméricos, véase por ejemplo, la patente Estadounidense 4,816,567; y Morrison et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1985), las cuales se incorporan en la presente por referencia. El injerto de CDR se describe por ejemplo, en las Patentes Estadounidenses Nos. 6,180,370, 5,693,762, 5,693,761, 5,585,089, y 5,530,101, las cuales todas están por este medio, incorporadas por referencia para todos los propósitos. En general, la meta de elaborar un objetivo quimérico es crear una quimera en la cual, el número de aminoácidos a partir de las especies de paciente propuestas, se maximiza. Un ejemplo es el anticuerpo "de CDR injertada", en el cual, el anticuerpo comprende una o más regiones que determinan la complementariedad (CDR) , a partir de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras el resto de la(s) cadena (s) de anticuerpo es/son idénticas con u homologas a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo. Para uso en humanos, la región V o CDRs seleccionadas de un anticuerpo de roedor, a menudo son injertadas en un anticuerpo humano, reemplazando las regiones V que se originan naturalmente o CDRs del anticuerpo humano. Un tipo útil de anticuerpo quimérico es un anticuerpo "humanizado". En general, un anticuerpo humanizado es producido a partir de un anticuerpo monoclonal originado inicialmente en un animal no humano. Ciertos residuos de aminoácido en este anticuerpo monoclonal, típicamente de porciones que no reconocen antígeno del anticuerpo, son modificados para ser homologas a residuos correspondientes en un anticuerpo humano de isotipo correspondiente. La humanización puede ser realizada por ejemplo, usando varios métodos sustituyente al menos, una porción de una región variable de roedor para las regiones correspondientes de un anticuerpo humano (véase por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 5,585,089, y 5,693,762; Jones et al, 1986, Nature 321:522-25; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-27; Verhoeyen et al, 1988., Science 239:1534-36). 6. Anticuerpos Completamente Humanos También se proporcionan composiciones en las cuales el anticuerpo es un anticu4erpo completamente humano. Como se nota anteriormente, el AG159 Ab descrito en la presente, es un ejemplo de un anticuerpo anti-glucagón completamente humano. Los métodos son disponibles para elaborar otros anticuerpos completamente humanos específicos para glucagón sin exponer seres humanos al antígeno ("anticuerpos completamente humanos") . Medios para implementar la producción de anticuerpos completamente humanos es la "humanización" del sistema inmune humoral de ratón. La introducción de un loci de inmunoglobulina humana (Ig) en ratones en los cuales los genes endógenos Ig han sido inactivados, es uno de los medios para producir anticuerpos monoclonales completamente humanos (MAbs) en ratón, un animal que puede ser inmunizado con cualquier antígeno deseable. Usando anticuerpos completamente humanos, se puede minimizar las respuestas inmunogénicas y alérgicas que pueden algunas veces, ser causadas administrando ratones o Mabs derivatizados de ratones a humanos como agentes terapéuticos. Los anticuerpos completamente humanos pueden ser producidos inmunizando animales transgénicos (usualmente ratones), que son capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos en la ausencia de producción de inmunoglobulina endógeno. Los antígenos para este propósito, típicamente tienen seis o más aminoácidos contiguos, y opcionalmente, son conjugados a un portador, tal como un hapteno. Véase por ejemplo, Jakobovits et al., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:2551-2555; Jakobovits et al, 1993, Nature 362:255-258; y Bruggermann et al., 1993, Year in Immunol 7:33. En un ejemplo de tal método, los animales transgénicos son producidos incapacitando el loci de inmunoglobulina de ratón endógena que codifica las cadenas de inmunoglobulina pesada y ligera ahí, e insertando en el genoma de ratón, fragmentos grandes de ADN de genoma humano que contiene el loci que codifica las proteínas de cadena pesada y ligera humana. Los animales parcialmente modificados, los cuales tienen menos del complemento completo del loci de inmunoglobulina humana, son entonces reproducidos por cruza para obtener un animal que tiene todas las modificaciones deseadas del sistema inmune. Cuando se administra a un inmunógeno, estos animales transgénicos producen anticuerpos que son inmunoespecí fieos para el inmunógeno, pero tienen secuencias de aminoácido humana en lugar de murina, que incluyen las regiones variables. Para detalles adicionales de tales métodos, véase por ejemplo, los documentos W096/33735 y WO94/02603, los cuales están por este medio, incorporados por referencia. Métodos adicionales que se refieren a ratones transgénicos para elaborar anticuerpos humanos, se describen en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,545,807; 6,713,610; 6,673,986; 6,162,963; 5,545,807; 6,300,129; 6,255,458; 5,877,397; 5,874,299 y 5,545,806; en las Publicaciones de PCT WO91/10741, WO90/04036, y en los documentos EP 546073B1 y EP 546073A1, de los cuales todos están incorporados en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos. Los ratones transgénicos descritos anteriormente, referidos en la presente como ratones "HuMab", contienen un minilocus de gen de inmunoglobulina humana, que codifica las secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada (µ y ?) y ligera ? humana no reacomodadas , junto con mutaciones objetivo que inactivan el loci de cadena µ y ? endógeno (Lonberg et al., 1994, Nature 368: 856-859). Por consiguiente, el ratón exhibe expresión reducida de IgM o K de ratón y en respuesta a la inmunización, y la cadena ligera y pesada humana introducida, los transgenes se someten a interrupción de clase y mutación somática para generar anticuerpos monoclonales IgG K humanos de alta afinidad (Lonberg et al, supra . ; Lonberg and Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol, 13: 65-93; Harding and Lonberg, 1995, Ann . N Y. Acad. Sci 764: 536-546). La preparación de ratón HuMab se describe en detalle en Taylor et al., 1992, Nucleic Aclds Research, 20: 6287-6295; Chen et al., 1993, International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1994, J. Immunol. 152: 2912-2920; Lonberg et al., 1994, Nature 368: 856-859; Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacology 113:49-101; Taylor et al., 1994, International Immunology 6: 579-591; Lonberg and Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding and Lonberg, 1995, Ann . N Y. Acad. Sci. 764:536-546; Fishwild et al . , 1996, Nature Biotechnology 14: 845-851; las referencias mencionadas anteriormente están por este medio, incorporadas por referencia en su totalidad para todos los propósitos. Véase además, Patentes Estadounidenses Nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; y 5,770,429; asi como también la Patente Estadounidense No. 5,545,807; Publicaciones Internacionales Nos. WO 93/1227; WO 92/22646; y WO 92/03918, descripciones de todas las cuales están por este medio incorporadas por referencia en su totalidad para todos los propósitos. Las tecnologías utilizadas para producir anticuerpos humanos en estos ratones transgénicos se describen también en el documento WO 98/24893, y en Méndez et al., 1997, Nature Genetics 15:146-156, los cuales están por este medio incorporados por referencia. Por ejemplo, las cepas de ratones transgénicos HCo7 y HCol2, pueden ser usadas para generar anticuerpos anti-glucagón humano. Usando tecnología de hibridoma, el MAbs humano específico del antígeno con la especificidad deseada, puede ser producido y seleccionado a partir de ratones transgénicos tales como aquellos descritos anteriormente. Tales anticuerpos pueden ser clonados y expresados usando un vector adecuado y células hospederas (véase por ejemplo, los Ejemplos siguientes), o los anticuerpos pueden ser recolectados a partir de células de hibridoma cultivadas. Los anticuerpos completamente humanos pueden también ser derivados de bibliotecas de exhibición de fago (como se describe en Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol. 227:381; y Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581). Las técnicas de exhibición de fago imitan selección inmune a través de la exhibición de repertorios de anticuerpo sobre la superficie de bacteriófago filamentoso, y subsecuente selección de fago por su enlace a un antigeno de elección. Una de tales técnicas es descrita en la Publicación de PCT No. WO99/10494 (por este medio incorporada por referencia), la cual describe el aislamiento de anticuerpos agonísticos funcionales y de alta afinidad para receptores MPL -y msk-usando tal procedimiento. 7. Anticuerpos Biespecificos o Bifuncionales Los anticuerpos incluidos en las composiciones descritas en la presente, también pueden ser anticuerpos biespecificos y bifuncionales, que incluyen una o más CDRs o una o más regiones variables como se describe anteriormente. Un anticuerpo biespecífico o bifuncional en algunos casos, es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares diferentes de cadena ligera/pesada y dos diferentes sitios de enlace. Los anticuerpos biespecificos pueden ser producidos por una variedad de métodos que incluyen, pero no se limitan a, fusión de hibridomas o enlace de fragmentos Fab' . Véase por ejemplo, Songsivilai & Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148: 1547-1553. 8. Anticuerpos Variantes Ejemplares Los anticuerpos de ciertas composiciones que se proporcionan en la presente, son formas variantes de los anticuerpos descritos anteriormente (por ejemplo, aquellos que tienen las secuencias listadas en las Tablas 1 y 2) . Por ejemplo, algunos de los anticuerpos son unos que tienen una o más sustituciones de aminoácidos conservativos en una o más de las cadenas pesada o ligera, regiones variables o CDRs listadas en las Tablas 1 y 2. Aminoácidos que se originan naturalmente, pueden ser divididos en clases basadas en propiedades de cadenas laterales comunes: 1) hidrofóbico: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; 2) hidrofilico neutral: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; 3) acidico: Asp, Glu; 4) residuos que influencian la operación de cadena: Gly, Pro; y 5) aromático: Trp, Tyr, Phe .

Las sustituciones de aminoácidos conservativos pueden involucrar intercambio de un miembro de una de estas clases con otro miembro de la misma clase. Las sustituciones de aminoácido conservativos pueden abarcar residuos de aminoácidos que no se originan naturalmente, los cuales son típicamente incorporados por síntesis peptídica química en lugar de síntesis en sistemas biológicos. Estos incluyen formas peptidomiméticas y otras invertidas o inversas de porciones de aminoácidos. Sustituciones no conservadoras pueden involucrar el intercambio de un miembro de una de las clases anteriores para un miembro de otra clase. Tales residuos sustituidos pueden ser introducidos en regiones del anticuerpo que son homólogos con anticuerpos humanos, o en las regiones no homologas de la molécula. En la elaboración de tales cambios, de conformidad con ciertas modalidades, puede ser considerado el índice hidropático de aminoácidos. El perfil hidropático de una proteína se calcula asignando a cada aminoácido un valor numérico ("índice hidropático") y después, promediar repetitivamente estos valores a lo largo de la cadena peptídica. A cada aminoácido ha sido asignado un índice hidropático en base a sus características de carga e hidrofobicidad . Ellos son: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteina/cistina (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptofano (-0.9); tirosina (-1.3); prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5); glutamina (-3.5); aspartato (-3.5); asparagina (-3.5); lisina (-3.9); y arginina (-4.5) . La importancia del perfil hidropático en conferir función biológica interactiva en una proteina se entiende en la técnica (véase por ejemplo Kyte et al., 1982, J. Mol, Biol, 157:105-131). Se sabe que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tienen un índice hidropático similar o registro y todavía retienen una actividad biológica similar. Haciendo cambios basados en el índice hidropático, en ciertas modalidades, la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de +2, se incluyen. En algunos aspectos, aquellos los cuales están dentro de +1 están incluidos, y en otros aspectos, aquellos dentro de +0 está incluidos. También se entiende en la técnica, que la sustitución de aminoácidos similares puede hacerse efectivamente en base a la hidrofilicidad, particularmente en donde la proteína biológicamente funcional o péptido por este medio creado, es propuesto para uso en modalidades inmunológicas , como en el presente caso. En ciertas modalidades, la hidrofilicidad promedio local más grande de una proteína, como se gobierna por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y enlace al antigeno o i nmunogen i c i dad , esto es, con una propiedad biológica de la proteina . Los siguientes valores de hidrofilicidad han sido asignados a estos residuos de aminoácidos: arginina (+3.0) ; lisina (+3.0) ; aspartato (+3.0 + 1) ; glutamato (+3.0 + 1) ; serina (+0.3) ; asparagina (+0.2) ; glutamina (+0.2) ; glicina (0) ; treonina ( -0.4) ; prolina (-0.5 ± 1) ; alanina (-0.5) ; histidina (-0.5) ; cisteina (-1.0) ; metionina (-1.3) ; valina ( -1.5) ; leucina (-1.8) ; isoleucina (-1.8) ; tirosina ( -2.3) ; fenilalanina (-2.5) y triptofano (-3.4) . Haciendo cambios basados en valores de hidrofilicidad similares, en ciertas modalidades, la sustitución de aminoácido cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de +_ 2 están incluidos, en otras modalidades, aquellos los cuales están dentro de +_ están incluidos, y en todavía otras modalidades, aquellos dentro de +_0.5 están incluidos. En algunos casos, uno puede también identificar epítopes de secuencias de aminoácido primario en base a la hidrofilicidad. Estas regiones también son referidas como "regiones nucleares epitópicas". Las sustituciones de aminoácido conservadoras ejemplares son expuestas en la Tabla 5.

Tabla 5 Sustituciones de Aminoácidos Un experto en la técnica será capaz de determinar variantes adecuadas de las cadenas de polipéptido como se expone en la presente, usando técnicas bien conocidas. Un experto en la técnica puede identificar áreas adecuadas de la molécula que pueden ser cambiadas sin destruir la actividad dirigiendo regiones que no se creen importantes por su actividad. El experto en la técnica también será capaz de identificar residuos y porciones de las moléculas que son conservadas entre polipéptidos similares. En modalidades preferidas, aún áreas que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura, pueden ser sometidas a sustituciones de aminoácido conservativo sin destruir la actividad biológica o sin afectar adversamente la estructura del polipéptido. Adicionalmente , un experto en la técnica puede revisar los estudios de función de estructura, identificando residuos en polipéptidos similares que son importantes para actividad o estructura. En vista de tal comparación, se puede predecir la importancia de residuos de aminoácido en una proteina, que corresponden a residuos de aminoácido importantes para actividad o estructura en proteínas similares. Un experto en la técnica puede optar por sustituciones de aminoácido químicamente similares para tales residuos de aminoácido importantes pronosticados. Un experto en la técnica, también puede analizar la estructura tri-dimensional y secuencia de aminoácido con relación a tal estructura en polipéptidos similares. En vista de tal información, un experto en la técnica puede predecir el alineamiento de residuos de aminoácido de un anticuerpo con respecto a su estructura tridimensional. Un experto en la técnica puede elegir hacer cambios radicales a los residuos de aminoácido pronosticados para estar en la superficie de la proteína, puesto que tales residuos pueden estar involucrados en interacciones importantes con otras moléculas. Sin embargo, un experto en la técnica puede generar variantes de prueba que contienen una sustitución de aminoácido único en cada residuo de aminoácido deseado. Estas variantes pueden entonces ser seleccionada usando ensayos para determinar la actividad de glucagón, tal como se describe en la presente, (véase ejemplos abajo), de este modo, proporcionando información con respecto a cuales aminoácidos pueden ser cambiados y cuales no deben ser cambiados. En otras palabras, basados en la información recolectada de tales experimentos de rutina, un experto en la técnica puede determinar fácilmente las posiciones de aminoácido en donde las sustituciones adicionales deben ser evitadas ya sea solas o en combinación con otras mutaciones. Se han relacionado un número de publicaciones científicas con la predicción de estructura secundaria. Véase, Moult, 1996, Curr. Op . in Biotech. 7:422-427; Chou et al., 1974, Biochemistry 13:222-245; Chou et al., 1974, Biochemistry 1 13:211-222; Chou et al., 1978, Adv. Enzymol Relat. Areas Mol. Biol 47:45-148; Chou et al., 1979, Ann . Rev. Biochem. 47:251-276; y Chou et al., 1979, Biophys. J. 26:367-384. Sin embargo, programas de computadora están actualmente disponibles para ayudar con la predicción de estructura secundaria. Un método para predecir estructura secundaria se basa en la modelación de homología. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tienen la misma identidad de secuencia mayor de 30%, o similitud mayor de 40%, a menudo tienen topologías estructurales similares. El crecimiento reciente de la base de datos de proteína estructural (PDB), ha proporcionado capacidad de predicción mejorada de la estructura secundaria, que incluye el número potencial de pliegues dentro de una estructura de polipéptido o proteína. Véase Holm et al., 1999, Nucí. Acid. Res. 27:244-247. Se ha sugerido (Brenner et al., 1997, Curr. Op. Struct. Biol. 7:369-376) que existe un número limitado de pliegues en un polipéptido o proteína dado y que una vez que un número crítico de estructuras han sido resultas, la predicción estructural llegará a ser dramáticamente más exacta. Métodos adicionales para predecir estructura secundaria incluyen "engarzado" (Jones, 1997, Curr. Opin . Struct. Biol. 7:377-87; Sippl et al., 1996, Structure 4:15-19), "análisis de perfil" (Bo ie et al., 1991, Science 253:164-170; Gribskov et al, 1990, Meth. Enzym. 183:146-159; Gribskov et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. 84:4355-4358), y "enlace evolucionarlo" (véase Holm, 1999, supra; y Brenner, 1997, supra) . En algunas modalidades de la invención, las sustituciones de aminoácido son elaboradas que: (1) reducen la susceptibilidad a proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a oxidación, (3) alteran la afinidad de enlace para formar complejos de proteina, (4) alteran las afinidades de enlace al antigeno o ligando, y/o (4) confieren o modifican otras propiedades funcionales o fisicoquímicas en tales polipéptidos . Por ejemplo, sustituciones de aminoácido múltiple o único (en ciertas modalidades, sustituciones de aminoácido conservativo) , pueden hacerse en la secuencia que se origina naturalmente. Las sustituciones pueden hacerse en tal porción del anticuerpo que cae fuera del (los) dominio (s) que forman los contactos intermoleculares). En tales modalidades, las sustituciones de aminoácido conservadoras pueden ser usadas para que no cambien sustancialmente las características estructurales de la secuencia precursora (por ejemplo, uno o más aminoácidos de reemplazo que no alteran la estructura secundaria que caracteriza el anticuerpo nativo o precursor). Ejemplos de estructuras secundarias y terciaras de polipéptido reconocidas en la técnica se describen en, Proteins , Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed.), 1984, W. H. New York: Freeman and Company; Introduction to Protein Structure (Branden and Tooze, eds . ) , 1991, New York: Garland Publishing; y Thornton et al., 1991, Nature 354:105, las cuales están cada una incorporadas en la presente por referencia.

Las variantes de anticuerpos usadas en algunas composiciones pueden incluir anticuerpos que comprenden, un fragmento Fe modificado o una región constante de cadena pesada modificada. Un fragmento Fe, el cual permanece para "fragmento que cristaliza", o una región constante de cadena pesada, puede ser modificado por mutación para conferir en un anticuerpo, las características alteradas. Véase por ejemplo, Burton and Woof, 1992, Advances in Immunology 5V. 1-84; Ravetch and Holland, 2001, Annu . Rev. Immunol. 19: 275-90; Shields et al., 2001, Journal of Biol Chem. 276: 6591-6604; Telleman and Junghans, 2000, Immunology 100: 245-251; Medesan et al., 1998, Eur. J. Immunol. 28: 2092-2100; todas las cuales están incorporadas en la presente por referencia) . Tales mutaciones pueden incluir sustituciones, adiciones, supresiones o cualquier combinación de los mismos, y son típicamente producidas por mutagénesis dirigida al sitio usando uno o más oligonucleótido ( s ) mutagénicos de conformidad con los métodos descritos en la presente, así como también de conformidad con los métodos conocidos en la técnica (véase por ejemplo, aniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3rd Ed., 2001, Cold Spring Harbor, N.Y. y Berger and Kimmel, METHODS IN ENZYMOLOGY, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Inc., San Diego, CA. , las cuales se incorporan en la presente por referencia) .

Los anticuerpos en algunas composiciones descritas en la presente, abarcan variantes de glicosilacion de los anticuerpos descritos en la presente, en donde el número y/o tipo de sitio (s) de glicosilacion ha sido alterado, comparado con las secuencias de aminoácido del polipéptido precursor. En ciertas modalidades, las variantes de proteina de anticuerpo comprenden un número mayor o menor de sitios de glicosilacion N-ligados que tienen el anticuerpo nativo. Un sitio de glicosilacion N-ligado es caracterizado por la secuencia: Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en donde el residuo de aminoácido designado como X, puede ser cualquier residuo de aminoácido excepto prolina. La sustitución de residuos de aminoácido para crear esta secuencia, proporciona un nuevo sitio potencial para la adición de una cadena de carbohidrato N-ligada. Alternativamente, las sustituciones que eliminan o alteran esta secuencia, prevendrán la adición de una cadena de carbohidrato N-ligada presente en el polipéptido nativo. Por ejemplo, la glicosilacion puede ser reducida por la supresión de un Asn o sustituyendo el Asn con un aminoácido diferente. En otras modalidades, uno o más sitios nuevos N-ligados son creados. Los anticuerpos típicamente tienen un sitio de glicosilacion N-ligado en la región Fe. Variantes de anticuerpo preferidas adicionales incluyen, variantes de cisteína en donde uno o más residuos de cisteína en la secuencia de aminoácido nativo o precursor son suprimidos de o sustituidos con otro aminoácido (por ejemplo, serina) . Las variantes de cisteina son empleadas, entre otras cosas, cuando los anticuerpos deben ser replegados en una conformación biológicamente activa. Las variantes de cisteina pueden tener pocos residuos de cisteina que el anticuerpo nativo, y típicamente tienen aún un número para minimizar las interacciones que resultan de las cisteínas no apareadas. Las cadenas ligera y pesada, dominios de región variable y CDRs que son descritas, pueden ser usadas para preparar polipéptidos que contienen una región que se enlaza al antígeno que puede enlazarse específicamente al glucagón (por ejemplo, glucagón humano) . Por ejemplo, una o más de las CDR listadas en la Tabla 2, pueden ser incorporadas en una molécula (por ejemplo, un polipéptido) , convalentemente o no covalentemente para hacer una inmunoadhesina . Una inmunoadhesina puede incorporar las CDR(s) como ptécnica de una cadena de polipéptido más grande, puede covalentemente ligar las CDR(s) a otra cadena de polipéptido, o puede incorporar las CDR(s) no covalentemente. Las CDR(s) permiten a la inmunoadhesina enlazarse específicamente a un antígeno particular de interés (por ejemplo, glucagón o un epítope del mismo) . Miméticos (por ejemplo, "péptidos miméticos" o "peptidomiméticos" ) , basados en los dominios de región variable y las CDRs que se describen en la presente, también se proporcionan. Estos análogos pueden ser péptidos, no péptidos o combinaciones de regiones peptidicas y no peptidicas. Fauchere, 1986, Adv. Drug Res. 15: 29; Veber and Freidinger, 1985, TINS p.392; y Evans et al., 1987, J. Med. Chem. 30:1229, las cuales se incorporan en la presente por referencia para cualquier propósito. Los miméticos peptidicos que son estructuralmente similares a péptidos terapéuticamente útiles, pueden ser usados para producir un efecto terapéutico o profiláctico similar. Tales compuestos son a menudo desarrollados con la ayuda de modelación molecular computarizada . En general, peptidomiméticos de la invención son proteínas que son estructuralmente similares a un anticuerpo que exhibe una actividad biológica deseada, pero tienen uno o más enlaces peptidicos opcionalmente reemplazados por un enlace seleccionado de: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2 -, -CH=CH-(cis y trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, y -CH2SO-, por métodos bien conocidos en la técnica. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso con D-aminoácidos del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina), puede ser usada en ciertas modalidades de la invención, para generar proteínas más estables. Además, péptidos restringidos que comprenden una secuencia consenso o una variación de secuencia consenso sustancialmente idéntica, pueden ser generados por métodos conocidos en la técnica (Rizo and Gierasch, 1992, Ann . Rev. Biochem. 61:387), incorporada aquí por referencia, por ejemplo, agregando residuos de cisteina capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares los cuales ciclizan el péptido . Los oligómeros que contienen uno o más polipéptidos de anticuerpo anti-glucagón, pueden ser usados en algunas composiciones. Los oligómeros pueden estar en la forma de dimero, trímeros u oligómeros superiores covalentemente ligados o no covalentemente ligados. Los oligómeros que comprenden dos o más polipéptidos de anticuerpos anti-glucagón, están contemplados para uso, con un ejemplo siendo un homodímero. Otros oligómeros incluyen heterodímeros , homotrímeros , heterotrímeros , homotetrámeros , heterotetrámeros , etc.

B. Compuestos GLP-1 Una variedad de compuestos GLP-1 puede ser ligada al anticuerpo anti-glucagón de la composición, que incluye, el GLP-1 mismo y una amplia variedad de análogos de GLP-1. Como se usa en la presente, el término "GLP-1", se refiere al péptido 1 similar al glucagón como se describe en el Antecedente anterior. El término carboxilo de GLP-1 (1-31) -OH, puede ser desdoblado para producir GLP-1 ( l-30-NH2. Como se discute anteriormente, tanto GLP-1 (1-31) -OH, también referido como GLP-1(1-31) y GLP-1 (1-30) -NH2, tienen las mismas actividades. Por conveniencia, los términos "GLP-1" y "GLP-1 nativo", son usados para referirse a ambas de estas formas biológicamente activas. Como se discute anteriormente, existen dos diferentes numeraciones convencionales usadas en la técnica. La numeración convencional adoptada en la presente, es una en la cual la histidina N-terminal de GLP-1 es considerada como el residuo número uno. De este modo, el GLP-1 nativo (es decir, GLP-1 ( 1-31 ) -OH) , tiene la siguiente secuencia de aminoácido: ^is-^la-^lu-^ly-^hr-^he-^hr-^er-^sp-^Val-iiSer-12Ser-13Tyr-14Leu-15Glu-16Gly-17Gln-18Ala-19Ala-20Lys-21Glu-22Phe-23Ile-24Ala-25Trp-26Leu-2Val-28Lys-29Gly-30Arg-31Gly (SEC ID NO: 1) . Los aminoácidos localizados entre el N-término y C-término, son numerados consecutivamente como se muestra. De este modo, por ejemplo, la posición de aminoácido 2 es Ala y la posición de aminoácido en 20 es Lys . Del mismo modo, cuando se hace referencia en la presente a elaborar una sustitución en una posición especificada, aplica el mismo sistema de numeración. Por lo tanto, por ejemplo, una sustitución de Ala en la posición 16, significa que el Gly en la posición 16 ha sido sustituido con Ala. Si los aminoácidos son agregados al término amino del GLP-1 (1-31), las posiciones son consecutivamente numeradas en orden decreciente, de manera tal que el aminoácido inmediatamente corriente arriba de la posición 1 es un aminoácido-1 , y el siguiente aminoácido corriente arriba está en la posición -2 y asi sucesivamente. Si los aminoácidos se agregan al término carboxilo de GLP-1, las posiciones son consecutivamente numeradas en orden incrementado, de manera tal que el aminoácido inmediatamente corriente abajo de la posición 31, es el aminoácido 32, y el siguiente aminoácido corriente abajo está en la posición 33 y asi sucesivamente. Las alteraciones a la secuencia GLP-1 nativa, están indicadas en paréntesis y tienen la forma: x PosiciónNo y, en donde x es el aminoácido en el número de posición indicada en la secuencia GLP-1 nativa, y y es el aminoácido sustituido en esta posición. De este modo por ejemplo, A2G significa que la alanina en la posición 2 de la secuencia GLP-1 nativa, ha sido sustituida con glicina. Las sustituciones múltiples son separadas por una barra inclinada (/). Los aminoácidos agregados al C-término están indicados con un signo de ( + ) , seguido por la ubicación de la adición. Un "compuesto GLP-1", como se usa en la presente, se refiere a una molécula que comprende un péptido GLP-1 y puede incluir uno o más componentes adicionales (por ejemplo, un componente que extiende la vida media del compuesto in vivo) . El término "péptido GLP-1", como se usa en la presente, se refiere a GLP-1 nativo o un péptido con una o más alteraciones en la secuencia de aminoácido del GLP-1 (1-31) -OH nativo o GLP-1 (1-30) -NH2, pero que retiene al menos, una actividad del GLP-1 nativo. El término también incluye miembros de la familia exendina tales como exendina-3 y exendina-4 (véase por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5, 424, 286), o péptidos con una o más alteraciones en la secuencia de aminoácido de la exendina, siempre que el péptido retenga al menos, una actividad GLP-1. La exendina-4, por ejemplo, tiene la siguiente secuencia de aminoácido: His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala- Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (SEC ID NO: 127) . La exendina-3 tiene la siguiente secuencia de aminoácido : Hys Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser La frase "actividad GLP-1", o equivalentes gramaticales de la misma, se refieren ampliamente a cualquier actividad asociada con GLP-1 y las exendinas. Ejemplos de tales actividades incluyen pero no se limitan a, actividad insulinotrópica, inhibición de motilidad gástrica, inhibición de secreción gástrica, promoción de proliferación y replicación de células-ß, incremento en masa de células-ß, incremento en saciedad y reducción en absorción de alimento cuando se administra a un sujeto. El término "péptido GLP-1", también incluye variantes, fragmentos y derivados de los péptidos GLP-1 que son equivalentes funcionales a uno de los péptidos GLP-1 que se describe en la presente en tal variante, fragmento o derivado, tiene una secuencia de aminoácido similar (por ejemplo, que comprende sustituciones conservadoras), y retiene, en alguna extensión, al menos una actividad del péptido GLP-1. "Variantes de GLP-1", incluyen péptidos que son "sustancialmente idénticos", (véase definición supra) , a los péptidos GLP-1 descritos en la presente. Tales variantes incluyen proteínas que tienen alteraciones de aminoácido tales como supresiones, inserciones y/o sustituciones. Típicamente, tales alteraciones son conservadoras en naturaleza (véase por ejemplo, Creighton 1984, Proteins, W.H. Freeman and Company) , de manera que la actividad de la proteína variante es sustancialmente similar con una de los péptidos GLP-1 que son descritos en la presente. En el caso de sustituciones, el aminoácido que reemplaza otro aminoácido, usualmente tiene propiedades químicas y/o estructurales similares. Una variante GLP-1 puede tener al menos, 60%, 70%, o 7%, preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de aminoácido con un péptido GLP-1 como se describe en la presente, siempre que la variante todavía tenga una actividad GLP-1. Un "derivado GLP-1", como se usa en la presente, se refiere a uno de los péptidos GLP-1 en los cuales uno o más aminoácidos han sido: 1) sustituidos con el D-aminoácido correspondiente, 2) alterados a un residuo de aminoácido que no se origina naturalmente, y/o 3) químicamente modificados. Ejemplos de modificación química incluyen, pero no se limitan a, alquilación, acilación, desamidación, esterificación, fosforilación y glicosilación de la estructura peptídica y/o cadenas laterales de aminoácido. Un "fragmento GLP-1", se refiere a formas truncadas de los péptidos GLP-1 listados en la presente, o variante so derivados de los mismos. Los fragmentos típicamente son truncados por 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos relativos a los péptidos GLP-1 expuestos en la presente. La truncación puede ser en ya sea el término amino y/o carboxilo. Numerosos ejemplos de péptidos GLP-1 que son adecuados para uso en ciertas composiciones se describen por ejemplo, en las Patentes Estadounidenses Nos. 6,329,336; 6,703,365; 5,705,483; 5,977,071; 6,133,235; 6,410,513; 6,388,053; 6,358,924; 5,512,549; 6,006,753; 5,545,618; 5,118,666; 5,120,712; 5,614,492; 5,958,909; 6,162,907; 6,849,708; 6,828,303; 6,284,727; 6,344,180; 6,506,724; 6,858,576; 6,884,579; 6,528,486; 5,846,937; 5,990,077; 6,770,620; 6,620,910; 5,545,618; 6,569,832; y 6,268,343, cada una de las cuales está incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Otros péptidos GLP-1 que pueden ser ligados al anticuerpo anti-glucagón en ciertas composiciones, son descritos por ejemplo, en las siguientes solicitudes de Patente Estadounidense publicadas: US 2004/0053370; US 2004/0127399; US 2003/0221201; 2003/0226155; US 2004/0023334; US 2004/0143104; 2005/0107318; US 2004/0106547; US 2004/0176307; 2004/0052862; US 2004/0082507; US 2004/0146985; 2004/0053370; US 2003/0199672; y US 2001/001 1071, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Todavía otros péptidos GLP-1 que pueden ser usados en ciertas composiciones se describen por ejemplo, en las siguientes solicitudes de PCT publicadas: WO 00/34331; WO 0034332; WO 02/46227; WO 03/060071; WO 2005/003296; WO 03/018516; WO 01/98331; WO 03/059934; WO 2004/078777; WO 99/30731; WO 98/43658; WO 00/16797; WO 00/15224; WO 03/103572; WO 03/087139; WO 2004/110472; WO 03/018516; WO 2005/000892; WO 03/028626; WO 2004/020404; WO 2004/020405; WO 2004/019872; WO 03/020746; WO 2004/094461; WO 91/1 1457; WO 87/06941; WO 90/11296; WO 00/34332; WO 2004/093823; WO 03/040309; WO 2004/022004; WO 99/64061; WO 03/011892; WO 2004/029081; WO 2004/005342; WO 90/01540; O 02/22151; WO 99/43341; WO 96/29342; WO 98/08871; WO 99/43705; WO 99/43706; WO 99/43707; WO 99/43708; WO 2004/105781; WO 2004/105790; WO 2005/027978; WO 04/074315; WO 2005/028516; y WO 2005/046716. Péptidos GLP-1 adicionales que pueden ser usados en algunas composiciones son descritos en las Patentes Europeas Nos. s. 0 733 644; 1 364 967; 0 699, 686; 0 619 322; 1 083 924; 0 512 042; yl 061 946, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia en su totalidad. Ciertos péptidos GLP-1 que están en algunas composiciones comprenden la secuencia de aminoácido de la fórmula I (SEC ID NO:92) : Xaai- Xaa2— Xaa3— Xaa4— Xaa5—Xaa6— Xaa7— Xaag- Xaag- Xaaio- Xaai - Xaai2-Xaai3— Xaai4— Xa i5— Xa i6— Xaai7— Xaai8—Xaai9o— Xaa2o— aa2i — Xaa22—Xsa23—Xaa24—Xaa25—Xaa26— 3^27—Xs^28—?^^29—?333?—Xaa3i—Xaa32— Xaa33-Xaa3 -Xaa35-Xaa36-Xaa37-C (O) -Ri (Fórmula I, SEC ID NO: 92) en donde, Ri es OR2 o NR2R3; R2 y R3 son independientemente hidrógeno o alquilo (Ci-Cg) ; Xaa en la posición 1 es: L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino- histidina, 3-hidroxi-histidina, homohist idina , a-fluorometil-histidina o a-metil-hist idina ; Xaa en la posición 2 es Gly, bAla (ácido 2-aminopropiónico) , Asp, Ala, ácido 1-amino-ciclopentancarboxilico, ácido 2-aminoisobutírico o aminoácidos alfa-alfa disustituidos; Xaa en la posición 3 es Glu, Asp, o Lys; Xaa en la posición 4 es Gly, Thr o Hys; Xaa en la posición 5 es Thr, Ala, Gly, Ser, Leu, lie, Val, Glu, Asp, o Lys; Xaa en la posición 6 es: Hys, Trp, Phe, o Tyr; Xaa en la posición 7 es Thr o Gly; Xaa en la posición 8 es Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, o Lys; Xaa en la posición 9 es Asp, Asn o Glu; Xaa en la posición 10 es Val, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lie, Tyr, Glu, Asp, Trp, o Lys; Xaa en la posición 11 es Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, o Lys; Xaa en la posición 12 es Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, Trp, Tyr, Asn, Lys, Homolisina, Ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 13 es Tyr, Phe, Trp, Glu, Asp, Gln, Lys, Homolisina, Ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 14 es Leu, Ala, Gly, Ser, Thr, lie, Val, Glu, Asp, Met, Trp, Tyr, Asn, Gln, Lys, Homolisina, Ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, ácido beta-glutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 15 es Glu, Asp, Lys, Homolisina, Ornitina, 4 -carboxi-fenilalanina , ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 16 es Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, ile, Val, Glu, Asp, Asn, Lys, Homolisina, Ornitina, 4-carboxi-fenilalanina , ácido beta-glutámico, Ácido beta-homoglutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 17 es Gln, Asn, Arg, Glu, Asp, Lys, Ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 18 es Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Arg, Glu, Asp, Asn, Lys, Homolisina, Ornitina, 4-carboxi-fenilalanina , ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 19 es Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, Asn, Lys, Homolisina, Ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 20 es Lys, Homolisina, Arg, Gln, Glu, Asp, Thr, Hys, Ornitina, 4 -carboxi-fenilalanina , ácido beta-glutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 21 es Leu, Glu, Asp, Thr, Lys, Homolisina, Ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 22 es Phe, Trp, Asp, Glu, Lys, Homolisina, Ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 23 es lie, Leu, Val, Ala, Phe, Asp, Glu, Lys, Homolisina, Ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 24 es Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, Lys, Homolisina, Ornitina, 4-carboxi-fenilalanina , ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 25 es Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp, Asn, o Lys; Xaa en la posición 26 es Leu, Gly, Ala, Ser, Thr, lie, Val, Glu, Asp, o Lys; Xaa en la posición 27 es Val, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, lie, Glu, Asp, Asn, o Lys; Xaa en la posición 28 es Asn, Lys, Arg, Glu, Asp, o Hys; Xaa en la posición 29 es Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, o Lys; Xaa en la posición 30 es Gly, Arg, Lys, Glu, Asp, Thr, Asn, o Hys; Xaa en la posición 31 es Pro, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, o Lys; Xaa en la posición 32 es Thr, Gly, Asn, Ser, Lys, o es omitido; Xaa en la posición 33 es Gly, Asn, Ala, Ser, Thr, lie, Val, Leu, Phe, Pro, o es omitido; Xaa en la posición 34 es Gly, Thr, o es omitido; Xaa en la posición 35 es Thr, Asn, Gly o es omitido ; Xaa en la posición 36 es Gly o es omitido; Xaa en la posición 37 es Gly o es omitido; siempre que cuando el aminoácido en la posición 32, 33, 34, 35, 36 o 37 es omitido, entonces cada aminoácido corriente abajo de aquel aminoácido es también omitido, y en donde el compuesto tiene una actividad GLP-1. De este modo, por ejemplo, si el aminoácido en la posición 32 es omitido, entonces no existen también aminoácidos en las posiciones 33-37. De manera similar, si el aminoácido en la posición 33 es omitido, no existen también aminoácidos en las posiciones 34-37. Y si el aminoácido en la posición 34 es omitido, entonces no existe aminoácido en la posición 35-37, ya si sucesivamente. En ciertas composiciones, el péptido GLP-1 comprende la secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEC ID NO: 1-35, o SEC ID NO: 126, como se muestra en la Tabla 6 abajo, o exendina-3 o exendina 4 (SEC ID NO: 27) . El péptido GLP-1 en algunas otras composiciones, comprende las SEC ID NO: 1-35, SEC ID NO: 126, o SEC ID NO: 127, con no más de 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácido conservativo, siempre que la variante tenga una actividad GLP-1 (por ejemplo, actividad insulinotrópica) . En todavía otras composiciones, el péptido GLP-1 tiene al menos, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, o 95% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 1-35, SEC ID NO: 126, o SEC ID NO: 127.

Tabla 6 Identiflcador de péptido GLP-1 Péptido GLP-1 SEC ID NO: GLP (A2G) HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG 126 GLP1 (A2G/V27E/K28N/R30G) HGEGTFTSD SSYLEGQAAKEFIAWLENGGG 2 GLPKA2G/ V27K/K28N/R30G) HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIA LKNGGG 3 GLP1 (A2G/R30G) HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGGG 4 GLP1 (C-término delta A2G HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWL 5 HGEGTFTSDVSSYLEGQAA EFIAWLKNGGP GLP1 (quimera A2G) SSGAPPPS 6 GLP(A2G/V10Q) HGEGTFTSDQSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG 7 GLP (A2G/V10Q/L14Q) HGEGTFTSDQSSYQEGQAAKEFIAWLVKGRG 8 GLP (A2G/V10Q/V27Q) HGEGTFTSDQSSYLEGQAAKEFIAWLQKGRG 9 GLP(A2G/L14Q) HGEGTFTSDVSSYQEGQAAKEFIA LVKGRG 10 GLP(A2G/W25Q) HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAQLVKGRG 1 1 GLP (A2G/W25Q/V27Q) HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAQLQ GRG 12 GLP(A2G/V27Q) HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLQKGRG 13 GLP (A2N/G4T) HNETTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG 14 GLP (A2G/E3N) HGNGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG 15 GLP (E3N) HANGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG 16 GLP (A2G/T5N) HGEGNFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG 17 GLP(A2G/D9N/S11T) HGEGTFTS VTSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG 18 GLP (A2G/V10N/S12T) HGEGTFTSDNSTYLEGQAAKEFIAWLVKGRG 19 GLP (A2G/S12N/L14T) HGEGTFTSDVSNYTEGQAAKEFIAWLVKGRG 20 GLP(A2G/L14N/G16T) HGEGTFTSDVSSY ETQAAKEFIAWLVKGRG 21 GLP (A2G/G16N/A18T) HGEGTFTSDVSSYLENQTAKEFIAWLVKGRG 22 GLP (A2G/Q17N/A19T) HGEGTFTSDVSSYLEGNATKEFIAWLVKGRG 23 GLP (A2G/A18N/K20T) HGEGTFTSDVSSYLEGQNATEFIAWLVKGRG 24 GLP (A2G/A19N/E21T) HGEGTFTSDVSSYLEGQANKTFIAWLVKGRG 25 GLP (A2G/ 25N/V27T) HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFI NLTKGRG 26 GLP (A2G/V27N/G29T) HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLNKTRG 27 GLP (A2G/K28N/ 30T) HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVNGTG 28 GLP(A2G/G29N/G31T) HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKNRT 29 HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGNG GLP(A2G/R30N/+T32) T 30 HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRN GLP (A2G/G31N/+G32/+T33 ) GT 31 HGEGTFTSDVSSYLEGQAAK.EFIAWLVKGRG GLP(A2G/+N32/+G33/+T34) NGT 32 GLP (A2G/+G32/+N33/+G34/+T HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG 33 35) GNGT GLP (A2G/+G32/+T33/+G34/+N HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG 35/+G36/+T37) GTGNGT 34 GLP(A2G/+G32/+S33/+G34/+N HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG 35/+G36/+T36) / GSGNGT 35 C. Enlace de Anticuerpo y Compuesto GLP-1 Como se notó anteriormente, cuando el término "ligado" se usa con referencia al anticuerpo anti-glucagón y el compuesto GLP-1, estas dos moléculas pueden o no pueden ser unidas por un enlazador. En ciertas modalidades, si se usa un enlazador para servir como un espaciador entre el anticuerpo y compuesto, puede ser usada una variedad de diferentes estructuras químicas. Por ejemplo, en ciertas modalidades, un enlazador comprende residuos de aminoácidos ligados en conjunto por enlaces peptídicos, es decir, un enlazador que comprende un péptido. De este modo, en ciertas modalidades, un enlazador es un péptido que tiene entre 1 y 20 residuos de aminoácido, que incluye todos los números entre aquellos puntos finales. Los residuos de aminoácido usados en enlazadores pueden ser residuos de aminoácidos convencionales o no convencionales. En ciertas modalidades, los residuos de aminoácido en un enlazador pueden ser glicosilados y/o derivatizados de otra manera. En ciertas modalidades, los residuos de aminoácido en un enlazador se seleccionan de glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y lisina. En ciertas modalidades, un enlazador comprende una mayoría de residuos de aminoácido que son estéricamente obstruidos, tales como glicina y/o alanina. De este modo, en ciertas modalidades, un enlazador se selecciona de poliglicina (por ejemplo, Gly)4, (Gly)5), un poly (Gly-Ala) , y una polialanina. Ciertos enlazadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a: (Gly) 3LyS (Gly) 4 (SEC ID NO:); (Gly) 3ASnGlySeT (Gly) 2 (SEC ID NO:); (Gly) 3CyS (Gly) 4 (SEQ ID NO:); GlyProAsnGlyGly (SEC ID NO:); y GlyGlyGlyAlaPro (SEQ ID NO:). Para explicar la nomenclatura anterior, por ejemplo, (Gly) 3Lys (Gly) 4 , significa Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly. En ciertas modalidades, un enlazador comprende una combinación de residuos Gly y Ala. En ciertas modalidades, un enlazador comprende 10 o pocos residuos de aminoácido. En ciertas modalidades, un enlazador comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos de aminoácido. En ciertas modalidades, un enlazador comprende 11-30 residuos de aminoácido, que incluyen todos los números entre aquellos puntos finales. Ejemplos adicionales de enlazadores específicos que pueden ser usados en las composiciones como se proporciona en la presente incluyen, GSGSATGGSGSTASSGSGSATGGGGGG (SEC ID NO: 36); GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGG (SEC ID NO: 37); y SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGG (SEC ID NO: 38).

En ciertas modalidades, un enlazador peptídico puede resultar de los sitios de enzima de restricción usado para clonar dos polipéptidos en una secuencia codificante única. En ciertas modalidades, los sitios de enzima de restricción son agregados a la secuencia codificante de uno o ambos de los polipéptidos. En ciertas modalidades, se dicta la secuencia de aminoácido de tales enlazadores, al menos en ptécnica, por los sitios de enzima de restricción seleccionados por los procedimientos de clonación. En ciertas modalidades, se proporcionan enlazadores no peptidicos. Ciertos enlazadores no peptidicos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, enlazadores de alquilo, tales como -NH- (CH2) S-C (O) -, en donde s =2-20. Tales enlazadores de alquilo pueden, en ciertas modalidades, comprender además, sustituciones que incluyen pero no se limitan a, grupos no estéricamente obstruidos tales como alquilo inferior (por ejemplo, Ci-C6) , acilo inferior, halógeno (por ejemplo, Cl, Br) , CN, NH2, fenilo, etc. Un enlazador no peptídico ejemplar no limitante es un enlazador PEG, en donde n es un número de manera tal que el enlazador tiene un peso molecular de 100 hasta 5000 kD. En ciertas modalidades, n es un número tal que el enlazador tiene un peso molecular de 100 hasta 500 kD, que incluye todos los puntos entre estos puntos finales. En ciertas modalidades, un enlazador puede resultar de un proceso químico y/o enzimático usado para conectar dos polipéptidos entre sí. Ciertos procesos químicos y/o enzimáticos ejemplares para conectar péptidos se describen, por ejemplo, en Pierce Applications Handbook and Catalog (2003/2004) (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) .

D. Ejemplos Específicos de Composiciones de Anticuerpo/Compuesto GLP-1 Algunos ejemplos específicos de composiciones que se proporcionan, son unos en los cuales el anticuerpo comprende una o más de las CDRs de cadena ligera (SEC ID NOS: 76-78) y/o una o más de las CDRs de cadena pesada de AG159 (SEC ID NOS: 84-86), con la región variable de cadena ligera y/o la región variable de cadena pesada ligada (por ejemplo, fusionada) a un péptido GLP-1 que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 1-35, SEC ID NO: 126 o SEC ID NO: 127, o cualquiera de los otros péptidos GLP-1 descritos en la presente. En otras composiciones, el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera y/o una región variable de cadena pesada (SEC ID NO: 79 y 83, respectivamente) de AG159, con la región variable de cadena ligera y/o región variable de cadena pesada fusionada a un polipéptido GLP-1 que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 1-35, SEC ID NO: 126 o SEC ID NO: 127, o cualquiera de otros péptidos GLP-1 descritos en la presente. En todavía otras composiciones, el anticuerpo comprende la cadena pesada madura (SEC ID NO: 82 u 89) y/o la cadena ligera madura (SEC ID NO: 0) de AG159, con la región variable de cadena ligera y/o la región variable de cadena pesada fusionada a un péptido GLP-1 que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 1-35, SEC ID NO: 126 o SEC ID NO: 127, o cualquiera de los otros péptidos GLP-1 descritos en la presente . Como ya se describió en detalle anteriormente, estos péptidos GLP-1 pueden ser ligados al anticuerpo AG159 o fragmentos en una variedad de diferentes formas, que incluyen, por ejemplo, tales péptidos GLP-1 múltiples (mismos o diferentes entre sí) , están unidos en números variantes y ubicaciones al anticuerpo. Ciertas composiciones ejemplares que se proporcionan se listan en la Tabla 6. Se debe entender que estas composiciones particulares son proporcionadas simplemente para ilustrar ejemplos específicos de las composiciones generales descritas en la presente y que las composiciones no están limitadas a estas formas particulares. La primera columna de la Tabla 6, indica la estructura general de la composición. En general, pero no siempre, la forma recortada adoptada aquí es LC:HC, con la forma de cadena ligera listada antes del colon y la forma de cadena pesada listada después del colon. Como se indica anteriormente, alteraciones a la secuencia GLP-1 nativa están indicadas en paréntesis y tiene la forma: x PosiciónNo y, en donde en donde x es el aminoácido en el número de posición indicada en la secuencia GLP-1 nativa, y y es el aminoácido sustituido en esta posición. Las sustituciones múltiples son separadas por una barra inclinada (/) . Los aminoácidos agregados al C-término están indicados con un signo de (+) , seguido por la ubicación de la adición. Si el péptido GLP-1 está unido al LC, esto es indicado como GLP-AG159LC:AGI5, con el péptido GLP-1 siendo listado a la izquierda del colon. Si el péptido GLP-1 está unido a la HC, esto es indicado como AG159LC:GLP-AG159, es decir, con el péptido GLP-1 siendo listado a la derecha del colon. El péptido GLP-1 y la cadena ligera o pesada del anticuerpo ALG159, son fusionados en conjunto vía un enlazador (por ejemplo SEC ID Nos: 36-38) . En estas composiciones especificas, el anticuerpo AG159 se muestra por ser ya sea el isotipo IgGl o IgG2, pero podría ser de cualquiera de los otros isotipos de inmunoglobulina. En estas fusiones, el término carboxi del péptido GLP-1 es fusionado al término amino del anticuerpo AG159 vía un enlazador (por ejemplo, SEC ID NOs:36-38). Sin embargo, como se notó anteriormente, los péptidos GLP-1 pueden ser unidos en otras ubicaciones y en otras orientaciones. Ciertas composiciones comprenden una fusión de polipéptido de cadena ligera que tiene la secuencia e aminoácido de la SEC ID NO: 1-74 o SEC ID NO: 129. En ciertas composiciones, la fusión de polipéptido de cadena ligera es apareada con una cadena pesada de AG159 (SEC ID NO: 82 u 89). Algunas composiciones contienen dos pares idénticos de la fusión de cadena ligera de la SEC ID NO: 41-74 y dos pares idénticos de la cadena pesada de AG159 para formar un anticuerpo con estructura tetramérica. Otras composiciones son similares, excepto que el péptido GLP-1 (por ejemplo, SEC ID NO: 1-35, SEC ID NO: 126, o SEC ID NO: 127), es fusionado al polipéptido de cadena pesada de AG159 (SEC ID NO: 82 u 89), en lugar de la cadena ligera. Tales fusiones de polipéptido de cadena pesada pueden ser apareadas con la cadena ligera de AG159 (SEC ID NO: 40 o 75), y algunas composiciones contienen dos pares idénticos de la fusión de cadena pesada y dos pares idénticos de la cadena ligera de AG159, para formar un anticuerpo con estructura tetramérica. Como se describe en detalla anteriormente, las composiciones de anticuerpo/compuesto GLP-1 proporcionadas en la presente, incluyen aquellas en las cuales el anticuerpo y/o el péptido GLP-1, son variantes de aquellas listadas en las tablas aquí. Las alteraciones pueden ser en el anticuerpo y/o en el péptido GLP-1. De este modo por ejemplo, ciertas composiciones incluyen una cadena de polipéptido que tiene al menos, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% de identidad con las secuencias de aminoácido de las cadenas listadas en las Tablas 1-4 o 7. Otras composiciones incluyen el polipéptido de la Tabla 7, con no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 sustituciones de aminoácido, las cuales típicamente son sustituciones conservadoras como se describe anteriormente. En otra modalidad, se proporcionan polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácido como se expone en cualquiera de las SEC ID NOS: 41-74 o SEC ID NO: 128 o 129.

Tabla 7 # de Referencia Secuencia de usión de Aminoácido de la Cadena Ligera o Sl-C ID interna Pesada de G.?.?- 1 (incluye secuencia enlazadora) NO: AG159LC:GLP(A HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGGSGSATGGSGSTASSGSGSATGGGGGG 128 2G) -AG159IgG2 QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIYYDGSNK YYADSVKGRFTISRDIT NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARASRGFDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSW SGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTC VDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAG PSVFLFPPKP DTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ FNSTFRWSVLTWHQD LNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTIS TKGQPREPQVYTLPP SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQG VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK GLPl (A2G) - HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGGSGSATGGSGSTASSGSGSATGGGGGG 129 AG159LC : AGI59 EIVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLAWYQQ PGQAPRLLISDASNRATGI IgG2 PARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWITFGQGTRLEI RTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLL NFYPREAKVQ KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYE HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GLPl (A2G/K28E HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLENGGGGSGSATGGSGSTASSGSGSATGGGGG 41 /G29N/R30G) - GEIVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLISDASNRAT AG159LC : AGI59 GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWITFGQGTRLEIKRTVAAPS IgG2 VFIFPPSDEQL SGTASWCLL NFYPREAKVQW VDNALQSGNSQESVTEQDSKDS TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GLPl (A2G/G29N HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLKNGGGGSGSATGGSGSTASSGSGSATGGGGG 42 /R30G) - GEIVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLISDASNRAT AG159LC:AG159 GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRS WITFGQGTRLEI RTVAAPS IgG2 VFIFPPSDEQLKSGTASWCLLN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GLPl (A2G/R30G HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIA LVKGGGGSGSATGGSGSTASSGSGSATGGGGG 43 ) - GEIVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLISDASNRAT AG159LC: AG159 GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWITFGQGTRLEIKRTVAAPS IgG2 VFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC delraC-término HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLGSGSATGGSGSTASSGSGSATGGGGGGEIVL 44 GI,P1-AG1.59C:AG159 TQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYIJA YQQKPGQAPRLLISDASNRATGIPAR lgG2 FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Quimera LC de HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLKNGGPSSGAPPPSGSGSATGGSGSTASSGSG 45 GLP1-AC.159:AG159 ?ATGGGGGGEIVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLI IfiC.2 SDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWITFGQGTRLEI KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GLP(A2G/V10Q) HGEGTFTSDQSSYLEGQAAKEFIAWLVK.GRGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGG 46 EIVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLISDASNRATG AG159LC:AG159 IPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWITFGQGTRLEIKRTVAAPSV IgG2 FIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GLP(A2G/V10Q/ HGEGTFTSDQSSYQEGQAAKEFIAWLVKGRGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGG 47 L14Q) -AG159 EIVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLISDASNRATG LC:AG159 IgG2 IPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWITFGQGTRLEIKRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GL (A2G/V10Q/ HGEGTFTSDQSSYLEGQAA EFIAWLQKGRGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGG 48 V27Q) -AG159 EIVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLISDASNRATG LC:AG159 IgG2 IPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWITFGQGTRLEIKRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLS ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GLP(A2G/L14Q) HGEGTFTSDVSSYQEGQAAKEFIAWLVKGRGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGG 49 -AG159 EIVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLA YQQKPGQAPRLLISDASNRATG LC.-AG159 IgG2 IPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWITFGQGTRLEIKRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQW VDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC LP(A2G/W25Q) - HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAQLV GRGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGG 50 AG159 EIVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLA YQQKPGQAPRLLISDASNRATG LC:AG159 IgG2 IPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWITFGQGTRLEIKRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT SFNRGEC GLP (A2G/W25Q/ HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAQLQKGRGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGG 51 V27Q) -AG159 EIVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLISDASNRATG LC:AG159 IgG2 IPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWITFGQGTRLEIKRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GLP (A2G/V27Q) HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLQKGRGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGG 52 -AG159 EIVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLISDASNRATGI LC:AG159 IgG2 PARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSN ITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GLP (A2N/G4T) - HNETTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGE 53 AG159 IVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLISDASNRATGIP LC:AG159 IgG2 ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GLP (A2G/E3N) - HGNGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGE 54 AG159 IVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLISDASNRATGIP LC:AG159 IgG2 ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GLP (E3N) - HANGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIA LVKGRGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGE 55 AG159 IVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLISDASNRATGIP LC:AG159 IgG2 ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASWCLLN FYPREAKVQ KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYE HKVYACEVTHQGLSSPVTKSF RGEC GLP (A2G/T5N) - HGEGNFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGE 56 AG159 IVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLISDASNRATGIP LC:AG159 IgG2 ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GLP(A2G/D9N/S HGEGTFTS VTSYLEGQAAKEFIA LVKGRGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGE 57 11T) -AG159 IVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLISDASNRATGIP LC:AG159 IgG2 ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRS WITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREA VQW VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYE HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GLP(A2G/V10N/ HGEGTFTSDNSTYLEGQAAKEFIAWLVKGRGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGE 58 S12T) -AG159 IVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLA YQQKPGQAPRLLISDASNRATGIP LC:AG159 IgG2 ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSN ITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASWCLL NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GLP(A2G/S12N/ HGEGTFTSDVSNYTEGQAAKEFIAWLVKGRGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGE 59 L14T) -AG159 IVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLISDASNRATGIP LC:AG159 IgG2 ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRS WITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQ KVDNALQSGNSQESVTEQDS DSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GLP(A2G/L14N/ HGEGTFTSDVSSYNETQAAKEFIAWLV GRGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGE 60 G16T) -AG159 IVtiTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLISDASNRATGIP LC:AG159 IgG2 ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSN ITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GLP (A2G/G16N/ HGEGTFTSDVSSYLENQTAKEFIAWLVKGRGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGE 61 A18T) -AG159 IVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLISDASNRATGIP LC:AG159 IgG2 ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSN ITFGQGTRLEI RTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQW VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT SFNRGEC GLP(A2G/Q17N/ HGEGTFTSDVSSYLEGNATKEFIAWLVKGRGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGE 62 A19T) -AG1S9 IVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLISDASNRATGIP LC:AG159 IgG2 ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQL SGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNAIjQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GLP(A2G/A18N/ HGEGTFTSDVSSYLEGQNATEFIAWLVKGRGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGE 63 20T) -AG159 IVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLA YQQKPGQAPRLLISDASNRATGIP LC:AG159 IgG2 ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GLP(A2G/A19N/ HGEGTFTSDVSSYLEGQAN TFIAWLVKGRGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGE 64 E21T) -AG159 IVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLA YQQKPGQAPRLLISDASNRATGIP LC:AG159 IgG2 ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSN ITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKH VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GLP{A2G/W25N/ HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIANLTKGRGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGE 65 V27T) -AG159 IVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLISDASNRATGIP LC-.AG159 IgG2 ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASWCLL NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS DSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GLP(A2G/V27N/ HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLNKTRGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGE 66 G29T) -AG159 IVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLISDASNRATGIP LC:AG159 IgG2 ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSN ITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQL SGTASWCLL FYPREAKVQ VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GLP(A2G/K28N/ HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLV GTGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGE 67 R30T) -AG159 IVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLISDASNRATGIP LC:AG159 IgG2 ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRS ITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASWCLL NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF RGEC GLP(A2G/G29N/ HGEGTFTSDVSSYLEGQAA EFIA LVKNRTSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGE 68 G31T) -AG159 IVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLISDASNRATGIP LC:AG159 IgG2 ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRS WITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GLP(A2G/R30N/ HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGNGTSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGG 69 +T32) -AG159 EIVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLISDASNRATGI LC:AG159 IgG2 PARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQ KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GLP (A2G/G31N/ HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRNGTSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG 70 +G32/+T33) - GEIVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYIAWYQQKPGQAPRLLISDASNRATG AG159 IPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWITFGQGTRLEIKRTVAAPSVF LC:AG159 IgG2 IFPPSDEQLKSGTASWCLL FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GLP (A2G/+N32/ HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGNGTSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGG 71 +G33/+T34) - GGEIVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLISDASNRAT AG159 GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWITFGQGTRLEIKRTVAAPSV LC:AG159 IgG2 FIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GLP(A2G/+G32/ HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGGNGTSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG 72 +N33/+G34/+T3 GGGEIVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLISDASNRA 5) -AG159 TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWITFGQGTRLEIKRTVAAPS LC:AG159 IgG2 VFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GLP(A2G/+G32/ HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGGTGNGTSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 73 +T33/+G34/+N3 GGGGGEIVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLISDASN 5/+G36/+T37) - RATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWITFGQGTRLEIKRTVAA AG159 PSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD LC:AG159 IgG2 STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC GLP(A2G/+G32/ HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGGSGNGTSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 74 +S33/+G34/+N3 GGGGGEIVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLISDASN 5/+G36/+T36) / RATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRS WITFGQGTRLEIKRTVAA -AG159 PSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLL FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV EQDSKD LC:AG159 IgG2 STYSLSSTLTLS ADYEKH VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC E . Componentes opcionales En algunas composiciones, el compuesto GLP-1 y/o el anticuerpo anti-glucagón son modificados para incluir componentes adicionales. Por ejemplo, el compuesto GLP-1 o anticuerpo, puede ser ligado a un o más polímeros solubles en agua. Los polímeros solubles en agua adecuados o mezclas de los mismos incluyen, pero no se limitan a, carbohidratos N-ligados u O-ligados, azúcares (por ejemplo, varios polisacáridos tales como quitosan, goma de xantano, celulosa y sus derivados, goma de acacia, goma de karaya, goma guar, carragenano, y agarosa) , fosfatos, polietilenglicol (PEG) (que incluye las formas de PEG que han sido usadas para derivatizar proteínas, que incluyen mono-alcoxi (C1-C10) , o ariloxi-polietilenglicol ) , monometoxi-polietilenglicol , dextran (tal como dextran de bajo peso molecular de, por ejemplo, aproximadamente 6 kD) , celulosa, u otros carbohidratos a base de polímeros, poli- (N-vinil pirrolidona) , polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol , copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), polixoetileno-polioxipropileno, alcohol polivinílico, y copolímeros de los mencionados anteriormente. En ciertas composiciones, el compuesto GLP-1 es formado en complejos con cationes de metales divalentes adecuados. Los complejos de metales divalentes de compuestos GLP-1 pueden ser administrados subcutáneamente como suspensiones, y tienen una velocidad reducida de liberación in vivo, debido a que tales complejos de compuestos GLP-1 son en general, insolubles en soluciones acuosas de aproximadamente pH fisiológico. Ejemplos no limitantes de cationes de metales divalentes adecuados para formar complejos con un compuesto GLP-1 incluyen, Zn++, Mn++, Fe++, Ca++, Co++, Cd++, Ni++, y similares. Los complejos de metales divalentes de compuestos GLP-1 se pueden obtener, por ejemplo, usando técnicas como se describe en el documento O 01/98331, las cuales se incorporan en la presente por referencia .

IV. Ácidos Nucleicos También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican uno o ambas cadenas de un anticuerpo o la fusión de un péptido GLP-1 y una cadena de un anticuerpo anti-glucagón como se describen en este documento, asi como también ácidos nucleicos que codifican un fragmento, derivado, muteina o variante de tales anticuerpos o fusiones. También proporcionados son polinucleótidos suficientes para uso como sondas de hibridización, cebadores RCP o cebadores de secuenciaraiento para identificar, analizar, mutar o amplificar un polinucleótido que codifica un polipéptido o cadena de anticuerpo. Los ácidos nucleicos pueden tener cualquier longitud. Pueden tener, por ejemplo 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1000, 1500, 3000, 5000, o más nucleótidos en longitud, y/o pueden comprender una o más secuencias adicionales, por ejemplo, secuencias reguladoras y/o ser ptécnica de un ácido nucleico grande, por ejemplo, un vector. Los ácidos nucleicos pueden ser de ramificación sencilla o ramificación doble y pueden comprender nucleótidos de ARN y/o ADN, y variantes artificiales de los mismos (por ejemplo, ácido nucleicos del péptido) . ADN que codifica polipéptidos de anticuerpo (por ejemplo, únicamente dominio variable de cadena pesada o ligera, o longitud completa) puede ser aislado a partir de células B de ratones que han sido inmunizados con glucagón o un fragmento inmunogénico del mismo. El ADN puede ser aislado por procedimientos convencionales tal como reacción en cadena de polimerasa (RCP) . El fago exhibido es otros ejemplos de una técnica conocida por lo cual los derivados de anticuerpos pueden ser preparados. En un procedimiento, se expresan los polipéptidos que son componentes de un anticuerpo de interés en cualquier sistema de expresión recombinante adecuado, y los polipéptidos expresados son dejados a ensamblarse para formar moléculas de anticuerpo. En otro aspecto, se proporcionan los vectores que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención o una porción del mismo (por ejemplo, un fragmento que contiene uno o más CDR o uno o más dominios de regiones variables) . Ejemplos de vectores incluye, pero no se limitan a, plásmidos, vectores virales, vectores de mamífero no episomal y vectores de expresión, por ejemplo, vectores de expresión recombinante . Los vectores de expresión recombinante de la invención pueden comprender un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para expresión del ácido nucleico en la célula hospedera. Los vectores de expresión recombinante incluyen uno o más secuencias reguladoras, seleccionadas en las bases de las células hospederas a ser usadas para expresión, las cuales están operablemente unidas a la secuencia de ácido nucleico a ser expresado. Secuencias reguladoras incluyen aquellas de expresión constitutiva directa de una secuencia de nucleótido en muchos tipos de células hospederas (por ejemplo, intensificador del gen SV40 temprano, promotor del virus de sarcoma Rous y promotor de citomegalovirus ) , aquellos de expresión directa de la secuencia de nucleótido únicamente en ciertas células hospederas (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas del tejido, véase Voss et al., 1986, Trends Biochem. Sci 11:287, Maniatis et al . , 1987, Sciences 236:1237, incorporados por referencia en este documento en su totalidad) , y aquellos de expresión inducible directa de una secuencia de nucleótido para tratamiento o condición particular (por ejemplo, el promotor de metalot ionina en células de mamífero y el promotor responsable de tet y/o responsable de estreptomicina en sistemas tanto procariótico como eucariótico (véase id. ) . Será apreciado por aquellos expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión puede depender de tales factores como los elegidos de la célula hospedera a ser transformada, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Los vectores de expresión de la invención pueden ser introducidos en las células hospederas para de esta forma producir proteínas o péptidos, que incluyen proteínas o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como se describe en este documento. En otro aspecto, la presente invención proporciona células hospederas en las cuales se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Una célula hospedera puede ser cualquier célula procariótica (por ejemplo, E. coli) o célula eucariótica (por ejemplo, levadura, de insecto, o células de mamífero (por ejemplo, células CHO) ) . El vector de ADN puede ser introducido en células procariót icas o eucarióticas vía técnicas de transformación o transfección convencionales. Para transfección estable de células de mamífero, se conoce que, dependiendo del vector de expresión y técnica de transfección usada, únicamente una fracción pequeña de células pueden integrar el ADN en su genoraa. Para identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, para resistencia a antibióticos) es generalmente introducido en las células hospederas junto con el gen de interés. Marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos, los cuales confieren resistencia a fármacos, tal como G418, higromicina y metatrexato. Las células establemente transfectadas con el ácido nucleico introducido pueden ser identificadas por selección de fármaco (por ejemplo, células que han incorporado el gen marcador seleccionable podrán sobrevivir, mientras las otras células morirán), entre otros métodos.

V. Preparación de anticuerpos Los anticuerpos no humanos que se proporcionan puede ser, por ejemplo, derivados de cualquier animal que produce anticuerpo, tal como ratón, rata, conejo, gato, cabra, burro, o primates no humanos (tal como mono (por ejemplo, monos cinomólogos o rhesus) o simio (por ejemplo, chimpancés)). Pueden ser usados anticuerpos no humanos, por ejemplo, en cultivo celular in vitro y aplicaciones a base de cultivo celular, o cualquier otra aplicación en donde puede ser prevenida una respuesta inmune al anticuerpo que no es originada o es insignificante, no es una preocupación, o es deseada. En ciertas modalidades de la invención, los anticuerpos pueden ser producidos por inmunización con glucagón humano. Los anticuerpos pueden ser policlonal, monoclonal o pueden ser sintetizados en células hospederas que expresan ADN recombinante . Se pueden preparar anticuerpos completamente humanos como se describe anteriormente inmunizando animales transgénicos que contienen inmunoglobulina loci humana o seleccionando un fago que exhibe biblioteca que expresa un repertorio de anticuerpos humanos. Se pueden producir anticuerpos monoclonales (mAbs) por una variedad de técnicas, que incluyen metodología de anticuerpo monoclonal convencional, por ejemplo, la técnica de hibridización de célula estomática estándar de Kohler and Milstein, 1975, Nature 256: 495. Alternativamente, se pueden emplear anticuerpos monoclonales, por ejemplo, la transformación viral u oncogénica de linfocitos B. Un sistema animal adecuado para preparar hibridomas es el sistema murina, el cual es un procedimiento muy bien establecido. Se conocen en la técnica protocolos de inmunización y técnicas para aislar esplenocitos inmunizados por fusión. Para tales procedimientos, las células B de los ratones inmunizados son fusionadas con un asociado de fusión inmortalizado adecuado, tal como linea celular de mieloma de murina. Si se desea, ratas y otros mamíferos además pueden ser inmunizados en lugar de ratones y las células B de tales animales pueden ser fusionadas con la línea celular de mieloma murina para formar hibridomas. Alternativamente, se puede usar una línea celular de mieloma de una fuente diferente a la del ratón. También se conocen bien en la técnica procedimientos de fusión de elaborar hibridomas. Los anticuerpos de cadena sencilla que se proporcionan pueden ser formados enlazando fragmentos (región Fv) de dominio variable de cadena pesa y ligera (véase, por ejemplo, SEC ID NO: 70 y 83) vía un puente de aminoácido (enlazador peptídico corto) , resultando en una cadena sencilla de polipéptido. Tal cadena Fvs sencilla (scFvs) puede ser preparada fusionando ADN que codifica un enlazador peptídico entre ADNs que codifican los dos polipéptidos de dominio variable (VL y VH) . Los polipéptidos resultantes pueden plegarse hacia atrás en ellos mismos para formar monómeros que se enlazan al antígeno, o pueden formar multímeros (por ejemplo, dímeros, trímeros o tetrámeros), dependiendo de la longitud de un enlazado flexible entre los dos dominios variables (Kortt et al., 1997, Prot . Eng. 10:423; Kortt et al., 2001, Biomol. Eng. 18:95-108). Combinando diferentes polipéptidos que comprenden VL y VH, se puede formar scFvs multiméricos que se enlazan a diferentes epitopes (Kriangkum et al . , 2001, Biomol. Eng . 18:31-40). Las técnicas desarrolladas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla incluyen aquellos descritos en la Patente Estadounidense No. 4,946,778; Bird, 1988, Science 242:423; Huston et al., 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879; ard et al., 1989, Nature 334:544, de Graaf et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178:379-87. Los anticuerpos proporcionados en este documento que son de una subclase, pueden ser cambiados a anticuerpos de diferentes subclases usando métodos de cambio de subclase. De esta forma, los anticuerpos IgG pueden ser derivados a partir de un anticuerpo IgM, por ejemplo, y vice versa. Tales técnicas permiten la preparación de nuevos anticuerpos que poseen las propiedades de enlace al antigeno de un anticuerpo proporcionado (el anticuerpo precursor) , pero también exhiben propiedades biológicas asociadas con un isotipo de anticuerpo o subclase diferente a partir del anticuerpo precursor. Se pueden emplear técnicas de ADN recombinante . Se puede emplear el ADN clonado que codifica polipéptidos de anticuerpo particular en tales procedimientos, por ejemplo, el ADN que codifica el dominio constante de un anticuerpo del isotipo deseado. Véase, por ejemplo, Lantto et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178:303-16. Sin embargo, si un IgG4 es deseado, se puede también desear para introducir una mutación de punto (CPSCO -> CPPCP) en la región articulación como se describe en Bloom et al., 1997, Protein Science 6:407, incorporado por referencia en este documento) para aliviar una tendencia a formar enlaces de disulfuro de cadena intra-H que puede conducir a heterogeneidad en los anticuerpos IgG . También se conocen técnicas para derivar anticuerpos que tienen diferentes propiedades (es decir, afinidades que varían para el antígeno al cual se enlazan) . Una de las técnicas, referida como intercambio de cadena, involucra repertorios del gen del dominio variable que exhibe inmunoglobulina en la superficie del bacteriófago filamentoso, a menudo referido como exhibición de fago. El intercambio de cadena ha sido usado para preparar anticuerpos de alta afinidad para el hapteno 2-feniloxazol-5-ona, como se describe por arks et al., 1992, BioTechnology, 10:779. Se pueden lograr modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o bioquímicas de los anticuerpos y fragmentos descritos en este documento creando sustituciones en la secuencia de aminoácido de las cadenas pesadas y ligeras que significativamente difieren en su efecto en mantener (a) la estructura del marco molecular en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) la voluminosidad de la cadena lateral. Una "sustitución de aminoácido conservador" puede involucrar una sustitución de un residuo de aminoácido nativo con un residuo no nativo que tiene poco o no tiene efecto en la polaridad o carga del residuo de aminoácido en la posición. Además, cualquier residuo nativo en el polipéptido puede también ser sustituido con alanina, como ha sido previamente descrito para mutagénesis de exploración de alanina . Pueden ser implementadas sustituciones de aminoácido (si son conservadoras o no conservadoras) de los anticuerpos objeto por aquellos expertos en el técnica aplicando técnicas de rutina. Se pueden usar sustituciones de aminoácido para identificar residuos importantes del anticuerpo proporcionado en este documento, o para incrementar o disminuir la afinidad de estos anticuerpos para glucagón humano.

VI . Expresión de Anticuerpos Anti-glucagón Se pueden preparar anticuerpos anti-glucagón por cualquiera de un número de técnicas convencionales. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos anti-glucagón por sistemas de expresión recombinante, usando cualquier técnica conocida en el técnica. Véase, por ejemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimensión in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.) Plenum Press, New York (1980); y Anticuerpos: A Laboratory Manual, Harlow and Lañe (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988) . Los anticuerpos de la presente invención pueden ser expresados en lineas celulares de hibridoma o en lineas celulares diferentes a hibridomas. Constructos de expresión que codifican los anticuerpos pueden ser usados para transformar una célula hospedera de mamífero, insecto o microbiana. La- transformación puede ser realizada usando cualquier método conocido introduciendo polinucleótidos en una célula hospedera, que incluye, por ejemplo, empacar el polinucleótido en un virus o bacteriófago y traducir una célula hospedera con el constructo por procedimientos de transfección conocidos en la técnica, como se ejemplifica en las Patentes Estadounidenses Nos. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 y 4,959,455 (dichas patentes son incorporadas en este documento por referencia para cualquier propósito) . El procedimiento de transformación opcional usando dependerá del tipo de célula hospedera a ser transformada. Son bien conocidos en la técnica métodos para introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero e incluyen, pero no se limitan a, transfección mediada por dextran, precipitación de fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplasto, electroporación, encapsulación de los polinucleótidos en liposomas, mezclar ácido nucleico con lípidos positivamente cargados, y microinyecciones directas del ADN en núcleos.

Constructos de expresión recombinante de la invención típicamente comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende uno o más de los siguientes: una región constante de cadena pesada; una región variable de cadena pesada; una región constante de cadena ligera; una región variable de cadena ligera; uno o más CDR de la cadena ligera o pesada den anticuerpo anti-glucagón. El vector es típicamente seleccionado para ser funcional en la célula hospedera particular empleada (es decir, puede ocurrir que el vector es compatible con el mecanismo de la célula hospedera, permitiendo amplificación y/o expresión del gen) . En algunas modalidades, se usan vectores que emplean ensayos de complementación proteína-fragmento usando proteínas reporteras, tal como reductasa de dihidrofolato (véase, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 6,720,964, la cual es incorporada por referencia). Vectores de expresión adecuados pueden ser adquiridos, por ejemplo, de Invitrogen Life Technologies o BD Biosciences (antes "Clontech"). Otros vectores útiles para clonar y expresar los anticuerpos y fragmentos de la invención, incluyen aquellos descritos en Bianchi and McGrew, Biotech Biotechnol Bioeng 84(4):439-44 (2003), el cual es incorporado por la presente para referencia. Se discuten vectores de expresión adecuados adicionales, por ejemplo, en Methds Enzymol, vol. 185 (D.V. Goeddel. Ed.), 1990, New York: Academic Press, el cual es incorporado por la presente para referencia. Típicamente, vectores de expresión usados en cualquiera de las células hospederas contienen secuencias para mantenimiento de plásmido o virus y para clonar y expresión de secuencias de nucleótido exógenas. Tales secuencias, colectivamente referidas como "secuencias de flaqueo" típicamente incluyen uno o más de las siguientes secuencias de nucleótido operativamente ligada: un promotor, uno o más secuencias intensificadoras , un origen de replicación, una secuencia de terminación transcripcional , una secuencia de intrón completa que contiene un sitio de empalme donador y aceptor, una secuencia que codifica una secuencia líder para secreción de polipéptido, una ribosoma que se enlaza al sitio, una secuencia de poliadenilación, una región poliligada para insertar el ácido nucleico que codifica el polipéptido a ser expresado, y un elemento marcador seleccionable . Opcionalmente , el vector puede contener una secuencia que codifica una "marca", que es, una molécula de oligonucleótido localizada en el extremo 5' ó 3' de la secuencia codificante, la secuencia de oligonucleótido que codifica PolyHys (tal como hexaHys), u otra "marca" para la cual existen anticuerpos comercialmente disponibles, tal como FLAG®, HA (hemaglutinina del virus de influeza) o myc. La marca es típicamente fusionada a la proteína de anticuerpo en expresión, y puede servir como un medio para purificación por afinidad del anticuerpo a partir de la célula hospedera. La purificación por afinidad puede ser lograda, por ejemplo, por cromatografía en columna usando anticuerpos contra la marca como una matriz de afinidad. Opcionalmente , la marca puede ser subsecuentemente removida a partir del polipéptido de anticuerpo purificado por varios medios tal como usando cierta peptidasa por desdoblamiento. Las secuencias de flanqueo en el vector de expresión pueden ser homologas (es decir, a partir de las mismas especies y/o cepa como la célula hospedera), heterólogas (es decir, a partir de especies diferentes a las especies de célula o cepa hospedera), híbridas (es decir, una combinación de secuencias de flanqueo a partir de más de una fuente), sintéticas o nativas. Como tal, la fuente de una secuencia de flanqueo puede ser cualquier organismo procariótico o eucariótico, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, siempre que la secuencia de flanqueo es funcional en, y puede ser activada por, el mecanismo de la célula hospedera. Las secuencias de flaqueo útiles en los vectores de esta invención, pueden ser obtenidas por cualquiera de los métodos variados bien conocidos en la técnica. Típicamente, las secuencias de flanqueo útiles en este documento han sido previamente identificadas por mapeo y/o restricción de digestión de endonucleasa y puede de esta forma ser aisladas a partir de la fuente de tejido apropiado usando las endonucleasas de restricción apropiadas. En algunos casos, puede ser conocida la secuencia completa de nucleotido de una secuencia de flanqueo. Aquí, la secuencia de flanqueo puede ser sintetizada usando los métodos descritos en este documento para síntesis o clonación de ácido nucleico. Cuando toda o únicamente una porción de la secuencia de flanqueo es conocida, se puede obtener usando RCP y/o seleccionando una biblioteca genómica con un oligonucleótido adecuado y/o fragmento de secuencia de flanqueo a partir de la misma u otra especie. Cuando la secuencia de flanqueo no es conocida, un fragmento de ADN que contiene una secuencia de flanqueo puede ser aislado a partir de una pieza grande de ADN que puede contener, por ejemplo, una secuencia codificante o aún otro gen o genes. El aislamiento se puede lograr por digestión de endonucleasa de restricción para producir el fragmento de ADN apropiado seguido por aislamiento usando purificación en gel de agarosa, cromatografía en columna Qiagen® (Chatswort, CA) , u otros métodos conocidos por el experto en la técnica. La selección de enzimas adecuadas para lograr este propósito será fácilmente aparente al experto en la técnica. Un origen de replicación es típicamente una ptécnica de vectores de expresión procarióticas , particularmente aquellas adquiridas comercialmente, y el origen ayuda en la amplificación del vector en una célula hospedera. Si el vector de selección no contiene un origen de sitio de replicación, puede ser químicamente sintetizado en base a una secuencia conocida, y ligada en el vector. Por ejemplo, el origen de replicación a partir de plásmido pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) es adecuado para la mayoría de bacterias gram-negativas y varios orígenes (por ejemplo, SV40, polioma, adenovirus, virus de estomatitis vesicular (VSV) , o virus del papiloma tal como HPV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamífero. Generalmente, un origen de replicación de mamífero no se necesario para vectores de expresión del mamífero (por ejemplo, el origen SV40 es a menudo usado únicamente porque contiene el promotor temprano) . Los vectores de expresión y clonación de la presente invención típicamente pueden contener un promotor que es reconocido por el organismo hospedera y operablemente ligado a ácido nucleico que codifica en anticuerpo anti-glucagón. Los promotores son secuencias no transcritas localizadas corriente arriba (es decir, 5' ) para el codón de partida de un gen estructural (generalmente dentro de aproximadamente 100 hasta 1000 bp) la transcripción de control del gen estructural. Los promotores son convencionalmente agrupados en una de dos clases: promotores inducibles y promotores constitutivos. Los promotores inducibles inician niveles elevados de transcripción de ADN y su control en respuesta a algunos cambios en condiciones de cultivo, tal como la presencia a ausencia de un nutriente o un cambio en temperatura. Los promotores constitutivos, por otra ptécnica, inician la producción del producto de gen continuo; es decir, existe poco o nada de control experimental sobre la expresión del gen. Son bien conocidos un número grande de promotores, reconocidos por una variedad de células hospederas potenciales. Un promotor adecuado es operablemente ligado al ADN que codifica un anticuerpo anti-glucagón removiendo el promotor de la fuente de ADN por digestión de la enzima de restricción o amplificar el promotor por reacción de cadena de polimerasa e insertando la secuencia del promotor deseada en el vector. Promotores adecuados para uso con levaduras hospederas son también bien conocidos en la técnica. Intensificadores de levadura son venta osamente usados con promotores de levadura. Los promotores adecuados para uso con células hospederas de mamífero son bien conocidos e incluyen, pero no se limitan a, aquellos obtenidos a partir de los genomas de virus tal como virus de polioma, virus fowlpox, adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus de papiloma bobino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus , retrovirus, virus de la hepatitis B y más preferiblemente Virus 40 Símico (SV40) .

Otros promotores de mamífero adecuados incluyen promotores heterologos de mamífero, por ejemplo, promotores de golpe de calor y el promotor de actina. Promotores particulares útiles en la práctica de los vectores de expresión recombinante de la invención incluyen, pero no se limita a: la región del promotor SV40 temprano (Bernoist and Chambón, 1981, Nature 290: 304-10); el promotor CMV; el promotor contenido en la repetición terminal 3' larga de virus de sarcoma Rous (Yamamoto et al., 1980, Cell 22: 787-97; el promotor timidina cinasa de herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 78: 1444-45); las secuencias reguladoras del gen metalot ionina (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39-42); vectores de expresión procariótica tal como el promotor beta-lactamasa (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A., 75: 3727-31); o el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. . 80: 21-25). También disponibles para uso son las siguientes regiones de control transcripcional animal, las cuales exhiben especificidad de tejido y se han utilizado en animales transgénicos : región de control del gen elastasa I que es activo en células acinosas pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38: 639-46; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515); la región de control del gen de insulina que es activa en células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315: 115-22); la región de control de virus del tumor mamario en ratones que es activo en células testiculares , de mama, linfoides y mástil (Leder et al., 1986, Cell 45: 485-95); la región de control del gen albúmina que es activo en el hígado (Pinker et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268-76); la región de control del gen de proteína alfa-feto que es activo en el hígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-48; Hammer et al., 1987, Sciences 235: 53-58); la región de control del gen alfa 1-antitripsina que es activo en el hígado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1: 161-71); la región de control del gen beta-globina que es activo en células mieloide (Mogram et al., 1985, Nature 315: 338-40; Kollias et al., 1986, Cell 46: 89-94); la región de control del gen de proteína mielina básica que es activo en las células oligodendrocito en el cerebro (Readhead et al., 1987, Cell 48; 703-12); la región de control del gen miosina 2 de cadena ligera que es activo en el músculo esqueleto (Sani, 1985, Nature 314: 283-86); la región de control del gen de la hormona que libera gonadotrópico que es activo en el hipotálamo (Masón et al., 1986, Sciences 234: 1372-78); y más particularmente la región de control del gen inmunoglobulina que es activo en las células linfoides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647-58; Adames et al., 1985, Nature 318: 533-38; Alexander et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7 : 1436-44) .

Un intensificador de secuencia puede ser insertado en el vector para incrementar la transcripción en eucariotas superiores de un ácido nucleico que codifica en anticuerpo anti-glucagón . Intensificadores son elementos que actúan cys de ADN, usualmente aproximadamente 10-300 bp en longitud, que actúa en promotores para incrementar la transcripción. Los intensificadores son relativamente independientes en orientación y posición. Se ha encontrado 5' y 3' para la unidad de transcripción. Se conocen varios intensificadores de secuencias disponibles de genes de mamífero (por ejemplo, globina, elastasa, albúmina, proteína alfa-feto e insulina) . También se puede usar un intensificador de secuencia de un virus. El intensificador SV40, el intensificador del promotor citomegalovirus temprano, el intensificador de polioma e intensificadores de adenovirus son elementos intensificadores ejemplares para la activación de promotores eucarióticos . Mientras un intensificador puede ser empalmado en el vector en una posición 5' ó 3' a una molécula de ácido nucleico, es típicamente colocado en un sitio 5' al promotor. En vectores de expresión, una secuencia de terminación de transcripción es típicamente localizada a 3' del extremo de una región que codifica el polipéptido y sirve para transcripción terminada. Una secuencia de terminación de la transcripción usada para expresión en células típicamente procarióticas es un fragmento rico en G-C seguido por una secuencia Poli-T. Mientras la secuencia es fácilmente clonada a partir de una biblioteca o aún adquirida comercialmente como ptécnica de un vector, puede ser fácilmente sintetizada usando métodos para síntesis de ácido nucleico tal como aquellos descritos en este documento. Un elemento de gen marcador seleccionable que codifica una proteína necesariamente para la supervivencia y crecimiento de una célula hospedera que crece en un medio de cultivo selectivo. Genes marcadores de selección típicos usados en vectores de expresión que codifica proteínas que (a) confiere resistencia a antibióticos y otras toxinas, por ejemplo ampicilina, tetraciclina o canamicina para células hospederas procarióticas ; (b) deficiencias autoxotrópicas de complemento de la célula; o (c) proporcionar nutrientes críticos no disponibles a partir del medio complejo. Ejemplos de marcadores seleccionables incluyen el gen de resistencia a canamicina, el gen de resistencia a ampicilina y el gen de resistencia a tetraciclina. También se puede usar un gen de resistencia a neomicina bacteriana para selección en células hospederas tanto procarióticas como eucarióticas . Se pueden usar otros genes de selección para amplificar el gen que será expresado. La amplificación es un proceso por el cual los genes que no pueden ser expresados en copia única a niveles suficientemente elevados para permitir la supervivencia y crecimiento de las células bajo ciertas condiciones de selección son reiterados en serie dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes . Ejemplos de marcadores seleccionables amplificables adecuados para células de mamífero incluyen reductasa de dihidrofolato (DHFR) y timidina cinasa menos promotor. En el uso de estos marcadores, los transformantes de células de mamífero se colocan bajo presión de selección en donde únicamente los transformantes son excepcionalmente adaptados para sobrevivir por virtud del gen del selección presente en el vector. La presión de selección es impuesta, cultivando las células transformadas bajo condiciones en las cuales la concentración del agente de selección en el medio es sucesivamente incrementada, de esta forma permitiendo la supervivencia de únicamente aquellas células en las cuales el gen de selección ha sido amplificado. Bajo estas circunstancias, el ADN adyacente al gen de selección, tal como ADN que codifica un anticuerpo de la invención, es coamplificado con el gen de selección. Como un resultado, se sintetizan cantidades incrementadas de polipéptido anti-glucagón a partir del ADN amplificado. Un sitio que se enlaza a ribosoma es usualmente necesario para el inicio de la traducción de ARNm y se caracteriza por una secuencia Shine-Dalgarno (procariota) o una secuencia Kozal (eucariota). El elemento es típicamente localizado en 3' al promotor y 5' a la secuencia del polipéptido a ser expresado. En algunos casos, por ejemplo cuando se desea la glicosilación en un sistema de expresión de célula hospedera, se pueden manipular varias presecuencias para mejorar la glicosilación o rendimiento. Por ejemplo, se puede alterar el sitio de desdoblamiento de peptidasa de un péptido de señal particular, o pro-secuencias agregadas, las cuales también pueden afectar la glicosilación. El producto de proteina final puede tener, en la posición 1 (en relación al primer aminoácido de la proteina madura) uno o más incidentes de aminoácidos adicionales para expresión, el cual no puede ser totalmente removido. Por ejemplo, el producto de proteina final puede tener uno o dos residuos de aminoácido encontrados en el sitio de desdoblamiento de peptidasa, unido al término amino. Alternativamente, el uso de algunos sitios de desdoblamiento de enzima puede resultar en una activa todavía ligeramente truncada del polipéptido deseado, si la enzima se corta en tal área dentro del polipéptido maduro. Cuando un vector de expresión comercialmente disponible carece algunas veces de las secuencias de flanqueo deseadas como se describe anteriormente, el vector puede ser modificado ligando individualmente estas secuencias en el vector. Después que el vector ha sido elegido y modificado como se desee, una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-glucagón es insertado en el sitio apropiado del vector. El vector completado que contiene las secuencias que codifican el anticuerpo inventivo o fragmento del mismo inmunológicamente funcional es insertado en una célula hospedera adecuada para expresión de amplificación y/o polipéptido. La transformación de un vector de expresión para un anticuerpo anti-glucagon-1 en una célula hospedera seleccionadle puede ser lograda por métodos bien conocidos que incluyen métodos tales como transíección, infección, cloruro de calcio, electroporación, microinyección, lipofección, método DEAE-dextrano u otras técnicas conocidas. El método seleccionado será en ptécnica una función del tipo de célula hospedera a ser usada. Estos métodos y otros métodos adecuados son bien conocidos por el experto en la técnica. La célula hospedera transformada, cuando se cultiva bajo condiciones apropiadas, se sintetiza en un anticuerpo anti-glucagón que puede subsecuentemente ser recolectado a partir del medio de cultivo (si la célula hospedera es secreta en el medio) o directamente de la célula hospedera producida (si no es secretada) . La selección de una célula hospedera apropiada puede depender de varios factores, tal como niveles de expresión deseados, modificaciones de polipéptido que son deseables o necesarias para la actividad (tal como glicosilación o fosforilación) y de fácil plegado en una molécula biológicamente activa. Son bien conocidas en la técnica lineas celulares de mamífero disponibles como hospederos para expresión e incluyen, pero no se limita a, muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC) , tal como células de ovario de hámster Chino (CHO) , células HeLa, células de riñon de hámster bebé (BHK) , células de riñon de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humanas (por ejemplo, Hep G2 ) y un número de otras líneas celulares. En ciertas modalidades, la mejor línea celular para expresar un constructo de ADN particular puede ser seleccionada probando varias líneas celulares para detectar cual tiene los mejores niveles de niveles de expresión y produce anticuerpos con propiedades que se enlazan a glucagón.

VII. Utilidades Terapéuticas Ejemplares En vista de las variadas actividades asociadas con GLP-1 (véase antecedente) , las composiciones que comprenden compuestos GLP-1 que se describen en este documento pueden ser usadas generalmente para: 1) estimular la liberación de insulina, 2) reducir los niveles de glucosa en la sangre, 3) incrementar los niveles de insulina de plasma, 4) estimular la transcripción de genes específicos a la célula ß (por ejemplo, transportador GLUT-1, receptor de insulina y hexocinasa-1 ) , incrementar la masa de la célula ß inhibiendo la apoptosis de la célula ß e incrementando la proliferación y replicación de la célula ß, 6) inducir saciedad de esta forma reducir la ingestión de alimento y promover la pérdida de peso, 7) reducir la secreción gástrica, 8) retardar el vaciado gástrico y 9) reducir la motilidad gástrica. Las composiciones que comprenden compuestos GLP-1 pueden de esta forma ser usados para tratar un número de formas diferentes de diabetes y enfermedades cercanamente relacionadas a esta, que incluyen pero no se limitan a, diabetes mellitus de Tipo I o Tipo II, tolerancia a la glucosa afectada, resistencia a la insulina, diabetes autoinmune latente en adulto (LADA) , diabetes gestacional, síndrome metabólico y diabetes de inicio en la madurez del joven (MODY) . De esta forma, las composiciones que comprenden compuestos GLP-1 pueden ser usadas para tratar individuos que tienen sensibilidad disminuida a insulina debido a infección, estrés, apoplejía o debido a una disminución en sensibilidad inducida durante el embarazo. Otros tipos de diabetes que pueden ser tratadas son aquellas en las cuales la diabetes está ligada a otras enfermedades endocrinas tal como glucagonoma, aldosteronismo primario, síndrome de Cushing y somatostatinoma o diabetes que surge debido a la administración de ciertos fármacos u hormonas (por ejemplo, farmacéuticos que contienen estrógeno, fármacos psicoactivos , fármacos antihipertensivos y diuréticos de tiazida). Las composiciones que comprenden compuestos GLP-1 pueden también ser usados para tratar varias enfermedades coronarias y enfermedades asociadas con trastornos de lipido, que incluyen, por ejemplo, hipertensión, enfermedad de la técnicaria coronaria, hiperlipidemia , enfermedad cardiovascular, ateroesclerosis e hipercolesteremia y infarto al miocardio. También se pueden tratar trastornos óseos, osteoporosis y otras enfermedades relacionadas con las composiciones que comprenden compuestos de GLP-1. Enfermedades adicionales que pueden ser tratadas con las composiciones que comprenden compuestos GLP-1 incluyen: obesidad, síndrome del intestino irritable, apoplejía, cambios catabólicos después de cirugía, infarto al miocardio) e hiperglicemia . Los compuestos GLP-1 pueden también ser usados como un sedante. Las composiciones que comprenden compuestos GLP-1 pueden también ser usados profilácticamente, incluyendo individuos tratados en riesgo de desarrollar una enfermedad tal como las listadas anteriormente. Como un ejemplo específico, los compuestos pueden ser administrados profilácticamente a un individuo en riesgo de desarrollar diabetes no dependiente de insulina o llegar a ser obeso. Tales individuos incluyen, por ejemplo, aquellos que tienen tolerancia a la glucosa afectada, aquellos que tienen sobrepeso y aquellos con una predisposición genética a las enfermedades precedentes (por ejemplo, individuos de familias con una historia de diabetes) . Se pueden tratar una variedad de diferentes sujetos con las composiciones que comprenden compuestos GLP-1. El término "sujeto" o "paciente" como se usa en este documento, típicamente se refiere a un mamífero, y a menudo, pero no necesariamente, es un humano que tiene o está en riesgo de una de las enfermedades precedentes. El sujeto, sin embargo, puede también ser un primate no humano (por ejemplo, simio, mono, gorila, chimpancé) . El sujeto puede también ser un mamífero diferente a un primate tal como un animal de veterinaria (por ejemplo, un caballo, bovino, oveja o cerdo), un animal doméstico (por ejemplo, gato o perro) o un animal de laboratorio (por ejemplo, ratón o rata) .

VII . Composiciones Farmacéuticas A. Composición Las composiciones compuesto GLP-l/anticuerpo que se proporcionan en este documento puede ser usadas como el ingrediente activo en composiciones farmacéuticas formuladas para el tratamiento de las enfermedades listadas en la sección en utilidades terapéuticas. De esta forma, las composiciones GLP-l/anticuerpo que se describen pueden ser usadas en la preparación de un medicamento para uso en varias aplicaciones terapéuticas, incluyendo aquellas listadas supra . Además a la composición compuesto GLP-l/anticuerpo, las composiciones farmacéuticas pueden también incluir uno o más de otros agentes terapéuticos que son útiles en el tratamiento de uno o más de los trastornos variados para los cuales los compuestos GLP-1 tienen utilidad. Clases generales de otros agentes terapéuticos que pueden ser combinados con ciertas composiciones compuesto GLP-l/anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, agentes liberadores de insulina, inhibidores de secreción de glucagón, inhibidores de proteasa, antagonistas de glucagón, agentes anti-obesidad, compuestos que reducen el consumo calórico, moduladores del receptor de estrógeno selectivo, hormonas esferoides y no esferoides, factores de crecimiento y nutrientes de dieta. Tales agentes terapéuticos adicionales pueden incluir, por ejemplo, agentes para tratar hiperglicemia, diabetes, hipertensión, obesidad y trastornos óseos. Ejemplos de otros agentes terapéuticos para tratar diabetes que pueden ser incluidos en las composiciones, incluye aquellos usados en el tratamiento de trastornos de lipido. Ejemplos específicos de tales agentes incluyen, pero no se limitan a, secuestrantes del ácido biliar (por ejemplo, colestiramina , lipostabil, tetrahidrolipstatina ) , inhibidores de reductasa HMG-CoA (véase, por ejemplo las Patentes Estadounidenses Nos. 4,346,227; 5,354,772; 5,177,080; 5,385,929 y 5,753,675), ácido nicotinico, inhibidores MTP (véase, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 5,595,872; 5,760,246; 5,885,983; y 5,962,440), inhibidores de lipoxigenasa , derivados de ácido fibrico, inhibidores de absorción de colesterol, inhibidores de escualeno sintasa (véase, por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 4,871,721; 5,712,396; y 4,924,024) e inhibidores del cotransportador sodio ileal/ácido biliar. Otros agentes anti-diabéticos que pueden ser incorporados en las composiciones incluyen meglitinidas , tiazolidindionas , biguanidas, secretagogos de insulina, sensibilizadores de insulina, inhibidores de glicógeno fosforilasa, agonistas PPAR-alfa, agonistas PPAR-gama. Un inhibidor de actividad dipeptidilpeptidasa IV puede también ser incluido para inhibir el desdoblamiento del el N-término del análogo GLP-1. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas comprenden una cantidad efectiva de una o una pluralidad de las composiciones compuesto GLP-l/anticuerpo junto con un diluyente, portador, solubilizador , emulsificador , preservativo y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, los materiales de formulación aceptable son no tóxicos a los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas. En modalidades preferidas, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición compuesto GLP-l/anticuerpo. En ciertas modalidades, los materiales de formulación aceptables son preferiblemente no tóxicos a receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas. En ciertas modalidades, la composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o preservar, por ejemplo, el pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución o liberación, adsorción o penetración de la composición. En tales modalidades, los materiales de formulación adecuadas incluye, pero no se limitan a, aminoácidos (tal como glicina, glutamina, aspargina, arginia o lisina) ; antimicrobianos; antioxidantes (tal como ácido ascórbico, sulfito de sodio o sulfito hidrógeno de sodio) ; amortiguadores (tal como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos); agentes de volumen (tal como manitol o glicina); agentes quelantes (tal como ácido etilendiamina tetraacético (EDTA) ) ; agentes que forman complejos (tal como cafeína, polivinilpirrolidona , beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina) ; rellenadores ; monosacáridos ; disacáridos; y otros carbohidratos (tal como glucosa, mañosa o dextrinas); proteínas (tal como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas ) ; colorantes, saborizantes y agentes de dilución; agentes emulsificantes ; polímeros hidrofílicos (tal como polivinilpirrolidona ) ; polipéptidos de peso molecular bajo; contraiones que forman sal (tal como sodio) ; preservativos (tal como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, trimenosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorohexidina , ácido ascórbico o peróxido de hidrógeno); solventes (tales como glicerina, propilen glicol o polietilen glicol); alcoholes de azúcar (tal como manitol o sorbitol) ; agentes de suspensión; tensoactivos o agentes humectantes (tal como pluronicos, PEG, ésteres de sorbitan, polisorbato tal como polisorbato 20, polisorbato 80, tritón, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes intensificadores de estabilidad (tal como sacarosa o sorbitol); agentes que intensifican la tonicidad (tal como haluros de metal álcali, preferiblemente cloruro de sodio o potasio, manitol sorbitol); vehículos de suministro; diluyentes; excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. Véase REMINGTON' S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18ava edición, (A.R. Gennaro, ed.), 1990, Mack Publishing Company. En ciertas modalidades, la composición farmacéutica óptima puede ser determinada por un experto en la técnica dependiendo de, por ejemplo, la ruta planeada de administración, formato de suministro y dosificación deseada. Véase, por ejemplo, REMINGTON ' S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra. En ciertas modalidades, tales composiciones puede influenciar el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de separación in vivo de anticuerpos . En ciertas modalidades, el vehículo o portador primario en una composición farmacéutica puede ya sea acuoso o no acuoso en la naturaleza. Por ejemplo, un vehículo o portador adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o fluido cerebroespinal artificial, posiblemente suplementado con otros materiales comunes en composiciones para administración parenteral. Salina amortiguada neutral o salina mezclada con albúmina de suero son vehículos ejemplares adicionales. En modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas comprenden amortiguador Tris de aproximadamente pH 7.0-8.5, o amortiguador de acetato de aproximadamente pH 4.0-5.5, y puede además incluir sorbitol o un sustituto adecuado del mismo. En ciertas modalidades, se pueden preparar composiciones de anticuerpo anti-glucagón para almacenaje mezclando la composición seleccionada que tiene el grado sedeado de pureza con agentes de formulación opcional (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra) en la forma de una pasta liofilizada o una solución acuosa. Además, en ciertas modalidades, las composiciones GLP-l/anticuerpo pueden ser formuladas como un liofilizado usando excipientes apropiados tal como sacarosa. Las composiciones farmacéuticas se pueden seleccionar para suministro parenteral. Alternativamente, las composiciones pueden ser seleccionadas para inhalación o para suministro a través del tracto digestivo, tal como oralmente. La preparación de tales composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de la experiencia de la técnica. Los componentes de formulación están presentes preferiblemente en concentraciones que son aceptables al sitio de administración. En ciertas modalidades, se usan los amortiguadores para mantener la composición a pH fisiológico o a un pH ligeramente menor, típicamente dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 8. Cuando se contempla administración parenteral, las composiciones terapéuticas para uso en esta invención puede ser proporcionada en la forma de un pirógeno libre, solución acuosa parenteralmente aceptable que comprende la composición deseada, que comprende el compuesto GLP-1 en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo particularmente aceptable para inyección parenteral es agua destilada estéril en la cual la composición GLP-1 /anticuerpo se formula como una solución isotónica, estéril, apropiadamente preservada. En ciertas modalidades, la preparación puede involucrar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bio-erosionables , compuestos poliméricos (tal como ácido poliláctico o ácido poliglicólico) , perlillas o liposomas, que pueden proporcionar liberación controlada o sostenida del producto, el cual puede ser suministrado vía inyección de depósito. En ciertas modalidades, el ácido hialurónico puede también ser usado, teniendo el efecto de promover la duración sostenida en la circulación. En ciertas modalidades, los dispositivos de suministro de fármaco implantables pueden ser usados para introducir la composición de anticuerpo/GLP-1 deseada. Las composiciones farmacéuticas pueden ser formuladas para inhalación. En estas modalidades, las composiciones farmacéuticas que comprenden composiciones de anticuerpo/compuesto GLP-1, son ventajosamente formuladas como un polvo inhalable, seco. En modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas también pueden ser formuladas con un propulsor para suministro de aerosol. En ciertas modalidades, las soluciones pueden ser nebulizadas. La administración pulmonar y métodos de formulación por lo tanto, son además descritos en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US94/001875, la cual se incorpora por referencia y describe suministro pulmonar de proteínas químicamente modificadas. También se contempla que las formulaciones pueden ser administradas oralmente. Las composiciones farmacéuticas que comprenden las composiciones de anticuerpo/compuesto GLP-1 que son administras en esta forma, pueden ser formuladas con o sin portadores cotidianamente usados en la formación de compuestos de formas de dosificación sólidas, tales como tabletas y cápsulas. En ciertas modalidades, una cápsula puede ser diseñada para liberar la porción activa de la formulación en el punto en el tracto gastrointestinal cuando la biodisponibilidad es maximizada y se minimiza la degradación pre-sistémica . Agentes adicionales pueden ser incluidos para facilitar la absorción de las composiciones. Diluyentes, saborizantes , ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes desintegranes de tableta y aglutinantes, también pueden ser empleados. Una composición farmacéutica es preferiblemente proporcionada para comprender una cantidad efectiva de una o una pluralidad de composiciones de anticuerpo/compuesto GLP-1 en una mezcla con excipientes no tóxicos que son adecuados para la manufactura de tabletas. Disolviendo las tabletas en agua estéril, u otro vehículo apropiado, las soluciones pueden ser preparadas en forma de dosis unitaria. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato o bicarbonato de sodio, lactosa o fosfato de calcio; o agentes enlazantes, tales como almidón, gelatina o acacia; o agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Las composiciones farmacéuticas adicionales serán evidentes para aquellos expertos en la técnica, que incluyen formulaciones que involucran composiciones de anticuerpo/compuesto GLP-1 en formulaciones de suministro controlado o sostenido. Las técnicas para formular una variedad de otros medios de suministro sostenido o liberado, tal como portadores de liposoma, microparticulas bio-erosionables o perlillas porosas e inyecciones de depósito, también se conocen por aquellos expertos en la técnica. Véase por ejemplo, Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US93/00829, la cual se incorpora por referencia y describe liberación controlada de microparticulas poliméricas porosas para suministro de composiciones farmacéuticas. Preparaciones de liberación sostenida pueden incluir matrices poliméricas semipermeables en la forma de artículos formados, por ejemplo, películas o microcápsulas . Las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, poliláctidos (como se describe en la Patente Estadounidense NO. 3,773,919 y Publicación de Solicitud de Patente Europea No. EP 058481, cada una de las cuales se incorpora por referencia) , copolímeros de ácido L-glutámico y gama etil-L-glutamato (Sidman et al., 1983, Biopolymers 22:547-556), poli (2-hidroxietil-metacrilato) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 y Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), acetato de viniletileno (Langer et al., supra) o ácido poli-D ( - ) -3-hidroxibutírico (Publicación de Solicitud de Patente Europea No. EP 133,988). Las composiciones de liberación sostenida pueden incluir también liposomas que pueden ser preparadas por cualquiera de los varios métodos conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Eppstein et al., 1985, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:3688-3692; Publicaciones de Solicitud de Patente Europea Nos. EP 036,676; EP 088,046 y EP 143,949, incorporadas por referencia. Las composiciones farmacéuticas usadas para administración in vivo, son típicamente proporcionadas como preparaciones estériles. La esterilización puede ser realizada por filtración a través de membranas de filtración estériles. Cuando la composición es liofilizada, la esterilización usando este método se puede conducir ya sea antes o después de la liofilización y reconstitución. Las composiciones farmacéuticas para administración parenteral, pueden ser almacenadas en una forma liofilizada o en una solución. Las composiciones parenterales en general, son colocadas en un contenedor que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica . Una vez que se ha formulado la composición farmacéutica, puede ser almacenada en viales estériles como una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido, cristal, o como un polvo deshidratado o liofilizado. Tales formulaciones pueden ser almacenadas ya sea en una forma lista para usar o en una forma (por ejemplo, liofilizada ) , que es reconstituida antes de la administración. Los kits para producir una unidad de administración de dosis única también se proporcionan. Los kits pueden contener cada uno tanto un primer contenedor que tiene una proteina seca y un segundo contenedor que tiene una formulación acuosa. En ciertas modalidades de esta invención, se proporcionan kits que contienen jeringas prellenadas de cámaras múltiples y sencillas (por ejemplo, jeringas para líquidos y jeringas para preparaciones liofilizadas ) .

B. Dosificación Como se señaló anteriormente, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. Una "cantidad efectiva" se refiere generalmente a una cantidad que es una cantidad suficiente, pero no tóxica, del ingrediente activo (por ejemplo, el compuesto GLP-l/composición de anticuerpo) para lograr el efecto deseado, el cual es una reducción o eliminación en la severidad y/o frecuencia de síntomas y/o mejora o remedio del daño. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad que es suficiente para remediar un estado o síntomas de enfermedad, o de otra forma prevenir, dificultar, retardar o revertir el progreso de una enfermedad o cualquier otro síntoma indeseable. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad que es efectiva para prevenir, dificultar, o retardar el comienzo de un estado o síntoma de enfermedad. En general, la toxicidad y eficacia terapéutica del compuesto GLP-l/composición de anticuerpo se puede determinar de acuerdo con procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos celulares y/o animales experimentales, incluyendo, por ejemplo, determinar el LD50 (la dosis letal a 50% de la población) y el ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población) . La relación de dosis entre efectos de tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación LD5o/ED5o. Son deseables las composiciones que exhiben altos índices terapéuticos. Los datos obtenidos del cultivo celular y/o estudios de animales se pueden usar en la formulación de un intervalo de dosificaciones para humanos. La dosificación del ingrediente activo típicamente se alinea dentro de un intervalo de concentraciones de circulación que incluyen el ED50 con poca o nada de toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. La cantidad de ingrediente activo administrada dependerá de varios factores que se pueden valorar por el médico tratante, tal como la severidad de la enfermedad, la edad y tamaño del sujeto a ser tratado y la enfermedad particular por si misma. En general, sin embargo, la cantidad total del compuesto GLP-l/composición de anticuerpo por si misma que se administra típicamente varía desde 1 pg/kg de peso corporal/día a 100 mg/kg/día. En algunos casos, la dosificación varía desde 10 pg/kg/día a 10 mg/kg/día. En otros regímenes de tratamiento, el compuesto GLP-1 /composición de anticuerpo se administra a 50 ug/kg/día a 5 mg/kg/día o desde 100 ug/kg/día a 1 mg/kg/día. La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos de la composición particular en la formulación usada. Típicamente, un médico administra la composición hasta que se alcanza una dosificación que logre el efecto deseado. Por lo tanto, la composición se puede administrar como una dosis única, o como dos o más dosis (lo cual puede o no puede contener la misma cantidad de la molécula deseada) en el tiempo, o como una infusión continua vía un dispositivo de implante o catéter. Además, el refinamiento de la dosificación apropiada está hecho de manera rutinaria por aquéllos de experiencia ordinaria en la técnica y está dentro del ámbito de tareas realizadas en forma rutinaria por ellos. Las dosificaciones apropiadas pueden ser comprobadas a través del uso de datos de respuesta de dosis apropiada. En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar a pacientes durante un periodo de tiempo prolongado. La administración crónica de un anticuerpo en una composición minimiza la respuesta alérgica o inmune adversa comúnmente asociada con anticuerpos que se levantan contra un antigeno humano en un animal no humano, por ejemplo, un anticuerpo no completamente humano o anticuerpo no humano producido en una especie no humana.

C. Administración Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente se pueden administrar en una variedad de formas diferentes. Los ejemplos incluyen administrar una composición que contiene un portador farmacéuticamente aceptable via métodos oral, intranasal, rectal, tópica, intraperitoneal , intravenosa, intramuscular, subcutánea, subdérmica, transdérmica, intratecal, e intracraneal. Para administración oral, el ingrediente activo se puede administrar en formas de dosificación sólida, tales como cápsulas, tabletas, y polvos, o en formas de dosificaciones liquidas, tales como elixires, jarabes, y suspensiones. Los componentes activos se pueden encapsular en cápsulas de gelatina junto con ingredientes inactivos y portadores en polvo, tales como glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, fécula, celulosa o derivados de celulosa, estearato de magnesio, ácido esteárico, sacarina de sodio, talco, carbonato de magnesio. Los ejemplos de ingredientes inactivos adicionales que se pueden adicionar para proporcionar color, sabor, estabilidad, capacidad de amortiguamiento, dispersión deseables, u otras características conocidas deseables son óxido de hierro rojo, gel de sílice, lauril sulfato de sodio, dióxido de titanio, y tinta blanca comestible. Los diluyentes similares se pueden usar para hacer tabletas comprimidas. Ambas tabletas y cápsulas se pueden manufacturar como productos de liberación sostenida para proporcionar liberación continua de medicación por un periodo de horas. Las tabletas comprimidas pueden estar revestidas con azúcar o revestidas con película para enmascarar cualquier sabor indeseable y proteger la tableta de la atmósfera, o revestida entéricamente para desintegración selectiva en el tracto gastrointestinal. Las formas de dosificación líquida para administración oral pueden contener colorantes y saborizantes para incrementar la aceptación del paciente. El ingrediente activo, solo o en combinación con otros componentes adecuados, puede ser colocado en formulaciones de aerosol (es decir, las mismas pueden ser "nebulizadas" ) para ser administrado vía inhalación. Las formulaciones en aerosol se pueden colocar en propulsores aceptables presurizados, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno.

Las formulaciones adecuadas para administración rectal incluyen, por ejemplo, supositorios, los cuales consisten del ingrediente activo envasado con una base de supositorio. Las bases de supositorio adecuadas incluyen triglicéridos naturales o sintéticos o hidrocarburos de parafina. Además, también es posible usar cápsulas de gelatina rectales las cuales consisten de una combinación del ingrediente activo envasado con una base, incluyendo, por ejemplo, triglicéridos líquidos, polietilenglicoles , e hidrocarburos de parafina. Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral, tales como, por ejemplo, por vías intraarticular (en las articulaciones), intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal , y subcutánea, incluidas soluciones de inyección estéril isotónica, acuosa y no acuosa, las cuales pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacteriostatos , y solutos que vuelven la formulación isotónica con la sangre del receptor propuesto, y suspensiones acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes , agentes espesantes, estabilizadores, y preservativos. Los componentes usados para formular las composiciones farmacéuticas son preferiblemente de alta pureza y están sustancialmente libres de contaminantes potencialmente peligrosos (por ejemplo, al menos grado de Alimento Nacional (por sus siglas en inglés, NF) , generalmente al menos grado analítico, y más típicamente al menos grado farmacéutico). Además, las composiciones propuestas para uso in vivo son usualmente estériles. Al grado que un compuesto dado se debe sintetizar previo a su uso, el producto resultante típicamente está sustancialmente libre de cualesquiera agentes potencialmente tóxicos, particularmente cualesquiera endotoxinas, las cuales se pueden presentar durante el proceso de síntesis o purificación. Las composiciones para administración parenteral también son estériles, sustancialmente isotónicas y están hechas bajo condiciones GMP.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos, incluyendo los experimentos conducidos y resultados alcanzados, son provistos para propósitos ilustrativos solamente y no están construidos como limitativos de la invención.

Ejemplo 1: Producción de Anticuerpos Monoclonales Humanos Contra Glucagón Los anticuerpos monoclonales completamente humanos para glucagón se prepararon por Medarex usando cepas de ratón transgénico, cada uno de los cuales expresa genes de anticuerpo humano. Los métodos para preparar tales anticuerpos monoclonales se describen en Chen et al. (1993, EMBO J. 12:811-820), y en el Ejemplo 1 de Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. O 01/09187 (incorporada como referencia). Ver también Fishwild et al. (1996, Nature Biotechnology L4: 845-851), Patentes Norteamericanas Nos. 5,545,806, 5,625,825, y 5,545,807, y Ejemplo 2 de la Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO 01/09187 (incorporada como referencia). Para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos para glucagón, se inmunizaron ratones Hu ab con glucagón humano recombinante purificado. Los métodos para inmunización se describen en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO 04/035747; Lonberg et al. (1994, Nature 368:856-859; Fishwild et al., supra. , y Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO 98/24884, las enseñanzas de cada una de éstas se incorporan como referencia) . Los ratones con títulos suficientes de inmunoglobulina humana anti-glucagón se usaron para producir anticuerpos monoclonales en células de hibridoma. Los métodos para producir tales hibridomas se describen en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO 04/035747. El anticuerpo seleccionado de una selección de hibridomas fue designado AG159. El anticuerpo se seleccionó en ptécnica porque podría neutralizar el glucagón in vitro e in vivo.

Ejemplo 2 : Clonación de las Cadenas Ligeras y Pesadas de Anticuerpo An i-Glucagón El hibridoma que expresa anticuerpo AG159 monoclonal que enlaza glucagón se utilizó como una fuente para aislar el ARN total usando reactivo TRIzol© (Invitrogen) . El ADNc de primera hebra se sintetizó usando un cebador aleatorio con y adaptador de extensión (5'-GGC CGG ATA GGC CTC CAN NNN NNT -3'; SEC ID NO: 101) y un 5' RACE (amplificación rápida de extremos de ADNc) se realizó usando el Kit GeneRacer™ (Invitrogen). Para preparar el ADNc que codifica la cadena ligera completa, el cebador delantero fue el cebador anidado GeneRacer™ (5' GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA -3'; SEC ID NO: 102) y un cebador inverso designado para reconocer una región conservada de la secuencia de ADNc encontrada en la región no traducida 3' de cadenas kappa humana (5'- GGG GTC AGG CTG GAA CTG AGG -3'; SEC ID NO: 103). Para preparar el ADNc que codifica la cadena pesada de región variable, el cebador delantero fue el cebador anidado GeneRacer™ (5' GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA -3'; SEC ID NO: 104) y un cebador inverso designado para reconocer una región conservada en la secuencia de codificación en la región Fe de cadenas IgG humanas (5'- TGA GGA CGC TGA CCA CAC G -3'; SEC ID NO: 105) . Los productos RACE se clonaron en pCR4-TOPO y las secuencias de ADN se determinaron. Las secuencias de ADN de consenso se determinaron y utilizaron para designar cebadores para cadena kappa de longitud completa y amplificación de PCR de cadena pesada de región variable. Una serie de cebadores se utilizó para extender la secuencia de ADN que codifica la cadena ligera madura para incluir una secuencia de péptido de señal VK-1 (MDMRVPAQLL GLLLLWLRGA RC; SEC ID NO: 106) . El primer cebador 5' codifica los últimos siete aminoácidos del péptido de señal y 14 aminoácidos de la cadena ligera madura (5'- GTG GTT GAG AGG TGC CAG ATG TGA AAT TGT GCT GAC CCA GTC TCC AGC CAC CCT GTC TTT GTC TC-3'; SEC ID NO: 107) y el cebador inverso 3' codifica el codón de terminación y término carboxilo asi como también un sitio de restricción Salí (5'- CTT GTC GAC TCA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT C-3' ; SEC ID NO: 108). El producto resultante se amplificó adicionalmente usando un cebador 5' el cual codifica 15 aminoácidos codificados del péptido de señal (5'-CCG CTC AGC TCC TGG GGC TCC TGC TGC TGT GGC TGA GAG GTG CCA GAT-3'; SEC ID NO: 109) y el mismo cebador inverso como se utilizó previamente. La fracción final se realizó en un cebador 5' el cual codificó el amino terminal de la secuencia de señal, un sitio de endonucleasa de restricción Xjal y una secuencia Kozak optimizada (5'- CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGA CAT GAG GGT GCC CGC TCA GCT CCT GGG-3 ' ; SEC ID NO: 110) y el mismo cebador inverso. El producto de PCR resultante se purificó, se digirió con Xbal y Salí, se aisló con gel y se ligó en el vector de expresión de mamífero pDSRal9 (véase Publicación de Solicitud Internacional No. WO 90/41363, la cual se incorpora en la presente para referencia para cualquier propósito) . Una serie de cebadores se utilizó para extender la secuencia de ADN que codifica la cadena pesada madura para incluir una secuencia de péptido de señal VK-1 (MDMRVPAQLL GLLLLWLRGA RC; SEC ID NO: 106) . El primer cebador 5' codifica los últimos siete aminoácidos del péptido de señal y 6 aminoácidos de la cadena pesada madura (5'- GTG GTT GAG AGG TGC CAG ATG TCA GGT GCA GCT GGT GGA G-3'; SEC ID NO: 111) y el cebador inverso 3' codifica el extremo carboxilo de la región variable, incluyendo un sitio BsmBI de hebra de sentido que se presenta naturalmente (5'- GTG GAG GCA CTA GAG ACG GTG ACC AGG GTT CC-3'; SEC ID NO: 112) . El producto resultante se amplificó adicionalmente usando un cebador 5' el cual codifica 15 aminoácidos codificados del péptido de señal (5'-CCG CTC AGC TCC TGG GGC TCC TGC TGC TGT GGC TGA GAG GTG CCA GAT-3'; SEC ID NO: 113) y el mismo cebador inverso como se utilizó previamente. La fracción final se realizó en un cebador 5' el cual codificó el amino terminal de la secuencia de señal, un sitio de endonucleasa de restricción Xbal y una secuencia Kozak optimizada (5'- CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGA CAT GAG GGT GCC CGC TCA GCT CCT GGG-3 ' ; SEC ID NO: 114) y el cebador inverso previo. El producto de PCR resultante se purificó, se digirió con Xbal y BsmBI, se aisló con gel y se ligó en el vector de expresión de mamífero pDSRal9 que contiene la región constante IgGl humana.

Construcción de los genes de fusión de cadena de anticuerpo GLP-1 (A2QAG159 Una secuencia de ADN que codifica el sito Xbal en dirección 5', secuencia Kozak optimizada, péptido GLP-1 (A2G) y una secuencia enlazante y ptécnica del ADNc de LC o HC AG159 que contiene un sitio de restricción único se sintetizaron por Picoscript (Houston, TX) (MD RVPAQLLGLLLLWLRGARCHGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGGSGSATG GSGSTASSGSGSATGGGGGG; SEC ID NO: 1 15) . Utilizando un sitio Kpnl único que se presenta naturalmente para la cadena kappa, el fragmento Xbal-KpnL del gen sintetizado se utilizó para reemplazar el fragmento sinónimo en el constructo pDSRal9 de cadena kappa AG159, resultando en el gen de fusión de LC GLP-1 (A2G) -AG159. De manera similar usando un sitio PvuII único que se presenta naturalmente en la secuencia de ADN de cadena pesada AG159, la secuencia de ADN GLP-1 (A2G) sintetizada se cortó con Xbal y PvuII y se utilizó para reemplazar el fragmento sinónimo en el constructo de cadena pesada AG159 para crear el gen de fusión de cadena pesada de GLP-1 (A2G) -AG159 IgGl.

El isotipo de la región constante de cadena pesada de AG159 se cambió de IgGl a IgG2 reemplazando el fragmento BsmBI-Salí que contiene la región constante de IgGl con la región constante de IgG2 que se ha amplificado por PCR para producir sitios de restricción similares en los extremos 5' y 3' del gen.

Construcción de Plásmidos de Expresión de Cadena Ligera Kappa AG159 y Cadena Ligera Kappa GLP-1 (A2G) -AG159 La LC AG159 de longitud completa se amplificó por PCR con cebadores para introducir nuevos sitios de restricción en cualquier extremo del gen para propósitos de clonación. El cebador 5' incluyó un sitio de restricción Salí, una secuencia Kozak optimizada y el amino terminal de la secuencia de señal VK-1 ( 5 ' -AAC CTC GAG GTC GAC TAG ACC ACC ATG GAC ATG AGG GTG CCC GCT-3'; SEC ID NO: 116) mientras que el cebador 3' codificó el carboxilo terminal y codón de terminación, asi como un sitio de restricción Notl ( 5 ' -AAC CGT TTA AAC GCG GCC GCT CAA CAC TCT CCC CTG TTG AA-3'; SEC ID NO: 117). El fragmento resultante se purificó, digirió con Dalí y Notl y se clonó en los vectores de expresión pDC323 y pDSRa24. El mismo proceso se realizó utilizando constructo de LC GLP-1 (A2G) -AG159 como un modelo.

Construcción de Plásmidos de Expresión de Cadena Pesada de AG159 IgGl, AG159 IgG2 , GLP-1 (A2G) -AG159 IgGl y GLP- 1 (A2G) -AGI 59 IgG2 El fragmento de región variable de cadena pesada de AG159 IgGl, descrito anteriormente, se amplificó por PCR usando un cebador 5' que codifica un sitio Salí, secuencia Kozak optimizada y el amino terminal de la secuencia de señal (SEC ID 106 descrita anteriormente) y un cebador 3' que codifica el carboxilo terminal, codón de paro y sitio de restricción Noti ( 5 ' -AAC CGT TTA AAC GCG GCC GCT CAT TTA CCC GGA GAC AGG GA-3'; SEC ID NO: 118). El fragmento PCR resultante se purificó, digirió con Salí y Notl , se aisló con gel y se clonó en los vectores de expresión pDC324 y pDSRa24. El mismo proceso se realizó utilizando los constructos GLP-1(A2G)-AG159 IgGl, AG159 IgG2 y GLP-1 (A2G) -AG159 IgG2 como modelos .

Construcción de diferentes mutantes de cadena Kappa GLP-1 (A2G) -AGI 59 Para proteger el péptido GLP-1 (A2G) contra escisión proteolitica de la proteina de fusión, se hicieron cambios por mutagénesis dirigida al sitio usando PCR. Usando la secuencia de ADN de cadena Kappa GLP-1 (A2G) -AG159 como un modelo, la PCR se hizo para introducir un sitio de restricción BamHI nuevo en la secuencia de ADN que codifica el péptido enlazante. Un cebador delantero que contiene un sitio BamHI (5'-GCT TGG CTG GTT AAA GGT CGT GGC GGA TCC GGC AGC GCT-3'; SEC ID NO: 119) y un cebador inverso que alineó a la región de secuencia que contiene el sitio Kpnl previamente mencionado (5'-AGG TTT CTG TTG GTA CCA GGC-3'; SEC ID NO: 120) se utilizaron para amplificar una región que codifica el enlazante y los primeros 35 aminoácidos de la LC AG159. Un cebador 5' es alineado en la región de promotor de vector en dirección 5' del sitio de restricción XBal (5'-TTT CAG GTC CCG GAT CCG GTG-3"; SEC ID NO: 121) fue apareado con cebadores 3' específicos que contienen los cambios deseados y un sitio de restricción BamHI (5'-GCT GCC GGA TCC GCC ACC ACC ATT TTT CAG CCA AGC GAT GAA - 3 ' ; SEC ID NO: 122) , (5'-GCT GCC GGA TCC GCC ACC ACC TTT AAC CAG CCA-3'; SEC ID NO: 123) , (5'-GCT GCC GGA TCC CAG CCA AGC GAT GAA TTC TTT AGC-3'; SEC ID NO: 124) , (5'-GCT GCC GGA TCC GCT GGG AGG CGG AGC ACC ACT ACT CGG TCC GCC GTT CTT CAG CCA AGC GAT GAA TTC-3'; SEC ID NO: 125) . Los productos de PCR separados se purificaron, digirieron con las enzimas de restricción apropiadas (Xbal y BamHI, o con BamHI y Kpnl) y se ligaron en el vector de expresión pDSRa20 que contiene el ADN de LC AG159 digerido con Xbal y Kpnl.

Ejemplo 3: Ensayos in vitro Ensayo de Reportero Funcional de Receptor Glucagón Para identificar el compuesto/composiciones de anticuerpo con actividad neutralizante, se generaron lineas de célula reportera que expresan receptores de glucagón humano o de rata. Los niveles cAMP incrementados se midieron a través de la expresión mejorada de un gen reportero de luciferasa. Brevemente, las células CH0K1 que expresan el receptor de glucagón humano o de rata, además de albergar un constructo de gen reportero luciferasa regulado por niveles AMP cíclicos, se colocaron en placas 2 días previo al ensayo, luego se cultivaron a 37°C, 5% C02. La tarde previo al ensaño, las células se lavaron, el medio se reemplazó con medio libre de suero que contiene 0.5% albúmina de suero bovino libre de proteasa (BSA) , y luego se cultivaron durante la noche. Las células se expusieron a un intervalo de concentraciones de composición de prueba con 1 nM ó 0.1 nM glucagón, para células que expresan receptor de glucagón humano o de rata respectivamente, por un período de 6 horas a 37°C en medio que contiene 0.5% BSA libre de proteasa y 100 µ? IBMX. Los lisados de célula se sometieron a ensayo para actividad de luciferasa usando el Sistema de Ensayo de Luciferasa (Promega Corporation, Madison, WI). La actividad de luciferasa se midió usando Luminoskan Ascent (Thermo Electron Corporation, Marietta, OH) . Los análisis de regresión no lineal de las curvas de concentración de compuesto resultantes se realizaron usando GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) . El "IC50" representa la concentración del compuesto/composición de anticuerpo a la cual la actividad estimulada por glucagón se redujo por 50%.

Ensayo de Reportero Funcional GLP-1R Para comparar la potencia del compuesto/composiciones de anticuerpo GLP-1, se generaron lineas de células reporteras que expresan receptores de GLP-1 humano o de ratón. Los niveles cA P incrementado se midieron a través de la expresión mejorada de un gen reportero de luciferasa. Brevemente, las células CHOK1 que expresan el receptor de GLP-1 humano o de ratón, además de albergar un constructo de gen reportero luciferasa regulado por niveles AMP cíclicos, se colocaron en placas 2 días previo al ensayo, luego se cultivaron a 37°C, 5% C02. La tarde previo al ensaño, las células se lavaron, el medio se reemplazó con medio libre de suero que contiene 0.5% albúmina de suero bovino libre de proteasa (BSA) , y luego se cultivaron durante la noche. Las células se expusieron a un intervalo de concentraciones de composición de prueba o GLP-1 por un período de 6 horas a 37°C en medio que contiene 0.5% BSA libre de proteasa y 100 µ? IBMX. Los Usados de célula se sometieron a ensayo para actividad de luciferasa usando el Sistema de Ensayo de Luciferasa (Promega Corporation, Madison, WI). La actividad de luciferasa se midió usando Luminoskan Ascent (Thermo Electron Corporation, Marietta, OH) . Los análisis de regresión no lineal de las curvas de concentración de compuesto resultantes se realizaron usando GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) . El "IC50" representa la concentración del compuesto/composición de anticuerpo GLP-1 a la cual 50 por ciento de la actividad máxima se logró.

Preparación de Membrana Las células CHOK1 que expresan ya sea receptor GLP-2 humano o de ratón (o receptor de glucagón humano o de rata) se recolectaron de placas de cultivo de 150 mm usando PBS . Las células se sedimentaron a 1500 rpm por 10 minutos. Las pelotillas resultantes se homogenizaron en 15 mi de amortiguador de sacarosa enfriado con hielo (25 mM Tris-HC, 0.32 M Sacarosa, 0.25 g/1 azida de sodio, pH 7.4) con una homogenizador de Teflón, equipado de vidrio, motorizado. El homogenado se centrifugó a 48,00 x g a 4°C por 10 minutos, se resuspendió en 25 mi de amortiguador de ensayo (50 mM Tris-HC1, 5 mM MgCl2, 10 mg/ml BSA libre de proteasa, 0.1 mg/ml STI, y 0.1 mg/ml Pefabloc, pH 7.4) con un Tissue-Tearor (Biospec Products), luego se centrifugó de nuevo a 48,000 X g por 10 minutos. Las pelotillas se homogenizaron por una tercera vez en 15 mi de amortiguador de ensayo usando el Tissue-Tearor y de nuevo se centrifugó a 48, 000 X g por 10 minutos. La pelotilla resultante se resuspendió en amortiguador de ensayo a una concentración de peso húmedo de 4 mg/ml.

Ensayos de Enlace de Ligando Se realizaron ensayos de enlace en placas de fondo en U de 96 cavidades. La membranas (200 µg de tejido), se incubaron a temperatura ambiente por 2 horas en un amortiguador de ensayo que contiene 0.2 nM de 125I-GLP-1 (o 0.2 nM de 125I-Glucagón ) ( PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA) , y con un intervalo de concentraciones de composición de prueba o GLP-1 (o glucagón) en un volumen total de 100 µ? . Además, se valoró el enlace no especifico en la presencia de 1 µ? de GLP-1 no etiquetado. La reacción se terminó por filtración rápida a través de placas de filtro de fibra de vidrio GF/C Unfilter-96 (FilterMate 196 Packard Harvester, PerkinElmer, Shelton, CT) , pre-remo adas en polietilenimina al 0.5%, seguidas por tres lavados con 300 µ? de 50 mM de Tris-HCl frío, a pH 7. . Se determinó la radiactividad unida usando una escintilación de microplaca y contador luminiscente (Packard Instrument Company, PerkinElmer, Shelton, CT) . Se realizaron análisis de regresión no lineal de curvas de concentración resultantes, usando GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) . Te "IC5o" representa la concentración del compuesto el cual reduce el enlace máximo específico 125I-GLP-1 (o 125I-glucagoón) por 50 porciento .

E emplo 4 : Actividad Neutralizante de Glucagón de Anticuerpo AGI59 Se clonaron regiones variables de anticuerpo a partir del ADNc y se confirmaron por análisis espectrométrico de masas de anticuerpo purificado del hibridoma. El AG159 clonado se verificó por tener la actividad neutralizante de glucagón en el enlace al receptor y ensayos de activación del receptor, así como también reduciendo la glucosa en la sangre en un modelo de ratón diabético (Figuras 11-13) . En la Figura 11, se muestra la neutralización AG159 de la actividad del reportero estimulada por el glucagón. Las células que expresan receptor de glucagón recombinante , se incubaron con 0.1 nM de glucagón además de un intervalo de concentraciones de AG159 o IgG de control. El IC50 para AG159 en este ensayo es 4 nM (Figura 11) . En la Figura 12, las fracciones de membrana cruda de células que expresan recombinantemente el receptor de glucagón, fueron incubadas con 200 pM de 125I-glucagón, con un intervalo de dosis de AG159 o anticuerpo de control. El IC50 para AG159 en este ensayo de enlace de 125i-glucagón es 0.2 nM (Figura 12) . La figura 13 muestra niveles de glucosa medidos en ratones ob/ob en respuesta a AG159.

Ejemplo 5: Ensayos In vivo Se usó el modelo de ratón diabético db/db en esta selección, para examinar además, composiciones con respecto a la glucosa en la sangre al alimento y se monitoreó esta medición a 1, 2, 4, 6 y 24h o cada 24 horas, hasta que todos lo niveles de glucosa en la sangre fueron nuevamente a niveles de linea base. Los ratones db/db son comercialmente disponibles de Ratones Congénitos de Mutación Espontánea-Cepa The Jackson Laboratory JAX® GEMM®, y son homocigotos para la mutación espontánea a diabetes (Leprdb) . Estos ratones llegaron a ser identificablemente obesos alrededor de 3 a 4 semanas de edad. El criterio de selección para cada ratón para entrar al estudio es glucosa en la sangre de al menos, 300 mg/dL. Ratones db/db a 8.5 semanas de edad (para un estudio crónico de 1-2 semanas), hasta aproximadamente 10-11 semanas de edad (para un estudio agudo de 1-3 días), se inyectaron una vez con cada molécula probada (experimento agudo) o múltiples veces (experimento crónico) . Al día del experimento, los ratones se sangraron a las 9 am (valor de linea base) y después se manejaron inmediatamente sobre el inyector, quien entonces inyecta el constructo GLP-1 apropiado o +/- control. Los ratones son entonces colocados en una jaula fresca sin algún alimento, para limitar cualquier variabilidad en los niveles de glucosa en la sangre, asociados con comportamientos alimenticios. Los niveles de glucosa en la sangre a 1 hr, 4 hr, 6 hr, y 24 hrs, son normalmente medidos. Cuando en el punto de tiempo de 24 horas, los valores de glucosa en la sangre están por debajo, de donde inician, los niveles de glucosa en la sangre son medidos cada 24 horas hasta que la glucosa en la sangre regresa a los niveles de linea base. Los ratones fueron alimentados con alimento normal después de un punto de tiempo de 6 horas. Ratones C57B16 (delgados normales), se usaron de 10 a 12 semanas de edad. Estos ratones son comercialmente disponibles a través de cualquier vendedor, tal como Jackson Laboratories o Charles River, y son considerados por ser normales. El término "delgado", es usado para contrastar estos ratones a ratones db/db obesos. Ratones C57B16, son aleatorizados en peso corporal. Se realizó un sangrado a las 9 am para determinar la glucosa en la sangre en la linea base y los compuestos o PBS, se administraron para colocar el ratón en una jaula sin alimento. Después de 4-5 horas, se realizó una prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (la prueba de tolerancia la glucosa mide la capacidad del cuerpo para metabolizar la glucosa), usando 2 g/kg de dosis de glucosa. Los niveles de glucosa en la sangre se midieron 30 minutos y 90 minutos después que la carga de glucosa se administró y 24 horas o hasta que los niveles de glucosa en la sangre fueron nuevamente a los valores originales. De estos estudios, el efecto intensificado de la acción de GLP-1 en utilización de glucosa, puede verse como PBS contrario a (-) control.

Ejemplo 6: Actividad de Enlace de Anticuerpo AGI59 Las regiones variables se clonaron del ADNc y se confirmaron por análisis e spec t r o f o t orné t r i co de masas de anticuerpo purificado del hibridoma. El AG159 clonado se verificó por tener actividad neutralizante del glucagón en los ensayos de activación del receptor y enlace al receptor. El GLP(A2G) (SEC I DNO:126) , se fusionó al N-término de ya sea la cadena pesada o ligera de AG159 (véase Ejemplo 2 anterior) . Los plásmidos se co-trans f ectaron en células CHO para producir proteínas de fusión de longitud completa. La estructura de anticuerpo resultante fue AGI 59LC : GLP ( A2G ) -AGI 59 IgG2 y GL P ( A2 G ) -AG 159 LC:AG159 IgG2. Por análisis in vitro (véase Ejemplo 3) , las dos proteínas de fusión se mostraron por tener enlace igual (IC50 5-10 nM al receptor humano) y activación (EC50 = 0.1 nM para activación del receptor humano y 5 nM para el receptor murino) . Además, el constructo de anticuerpo en el cual se fusionó GLP(A2P) a la cadena ligera, también se muestra por activar el receptor humano en la presencia de glucagón. Además, se establece que el anticuerpo fusionado es todavía activo en la neutralización del glucagón en la presencia del receptor GLP-1. Estos datos in vitro, demuestran que el análogo GLP-1 de fusión es b i - fun c i ona 1. Más específicamente, GL P ( A26 ) -AG 159LC : AG 159 IgG2 ( GL P ( A2 G ) -AG 159 ) fue ensayado para determinar si el constructo podría mantener las propiedades de enlace al receptor en la presencia de glucagón. El ensayo de enlace al ligando se realizó como se describe, con la adición de 0, 1, 10 o 100 nM de glucagón. Como se muestra en la Figura 1, GLP(A2G)-AG159, compite para enlace 125I-GLP-1 al receptor GLP-1 humano en la presencia de glucagón. En otro experimento, se evaluó GL P ( A2 G ) -AG 159 para la actividad contra el receptor GLP-1 en la presencia de glucagón. El ensayo reportero de GLP-1R se realizó como se describe anteriormente en el Ejemplo 3, con la adición de un intervalo de concentraciones de glucagón. Como se muestra en la Figura 2, GL P ( A2 G ) -AG 159 , activa al receptor GLP-1 humano en la presencia de glucagón. También se representa en la gráfica la curva de respuesta de dosis de la activación del receptor GLP-1 por glucagón solo (sin GL P ( AG2 ) -AG 159 ) ( ) . Los datos representados en la Figura 2 se muestran en una forma diferente en la Figura 3. En la Figura 3, la actividad atribuible a una concentración especifica a GL P ( A2 G ) -AG 159 (sin glucagón) , es sustraída de la actividad total para todas las dosis de glucagón con la concentración de GL P ( A2 G ) -AG 159 respectiva, de manera tal que la actividad restante es atribuible al Glucagón. Como se muestra en la figura 3, la presencia de GL P ( A2 G ) -AG 159 dependient emente de la dosis, reduce la actividad inducida por glucagón.

Ejemplo 7 : Resultados con Fusiones de Anticuerpo que Incluyen, Diferentes Análogos de GLP-1 Se prepararon una variedad de fusiones entre un compuesto GLP-1 y AG159, y se probaron por su capacidad de enlace como se describe en los ejemplos anteriores. La Tabla 8 abajo, muestra los resultados de un número de proteínas de fusión en las cuales, el C-término del GLP-1 nativo ha sido modificado (las secuencias para las fusiones se listan en las Tablas 1 y 7) .

Tabla 8 = no determinado.

Para reducir la proteólisis, se diseñaron una serie de análogos de GLP-1 mutantes de sustitución como se describe anteriormente, con la meta de investigar si la introducción de sitios consenso de glicosilación (NTX) ; podrían proteger sitios desdoblados. Además, los residuos de glutamina se sustituyeron a posiciones seleccionadas con la teoría que la propensidad de glucamina para estructura helicoidal podría promover un péptido más estable con purificación y protección de características de desdoblamiento. Estos análogos de GLP-1 se fusionaron a la cadena ligera de AG159 y se probaron (las secuencias para estas fusiones se listan en las Tablas 1 y 7). Los resultados se muestran en la Tabla 9.

Tabla 9: Glutamina y Glicosilación de fusiones Ab/Compuesto GLP-1 Ejemplo 8: Resultados In vivo Los experimentos se condujerton con un número de diferentes moléculas de fusión que incluyen AG159 y diferentes análogos de GLP1, para determinar la capacidad para reducir los niveles de glucosa en la sangre como una función de tiempo. Estos experimentos se condujeron como se describe en el Ejemplo 3, con ratones Db/db siendo inyectados una vez con diferentes composiciones (secuencias de los diferentes análogos son descritas en las Tablas 1 y 7) . La Figura 4 muestra los resultados de una variedad de fusiones AG159/compuesto GLP-1. Las fusiones de anticuerpo incluyen ya sea GLO(A2G) o uno de los siguientes péptidos GLP-1 fusionados a la cadena ligera (LC) de AG159: A2G/K28N/R30T (SEC ID NO: 28), A2G/Q17N/A19T (SEC ID NO: 23), A2G/V10Q/V27Q (SEC ID NO: 9), y A2G/W25Q/V27Q (SEC ID NO: 12) . Estas fusiones de LC se aparearon con cadenas pesadas IgG2 de AG159, para dar los siguientes anticuerpos, los cuales fueron probados: GLP (A2G/K28N/R30T ) -AG159LC : AG159 IgG2, GLP (A2G/Q17N/A19T) -AG159LC: AG159 IgG2, GLP (A2G/V10Q/V27Q) -AG159LC: AG159 IgG2, y GL (A2G/W25Q/V27Q) -AG159LC : AG159 IgG2. Las dosificaciones fueron 12 ug/ratón. Las secuencias para estas fusiones se listan en las Tablas 1 y 7 anteriores. Como se puede ver en la figura 4, la glucosa en la sangre se redujo a 1 hora con la mayoría de los análogos, con GLP (A2G) -AG159LC : AGI 59 IgG2 y GLP (A2G/K28N/R30T) - AG159LC : AG159 IgG2 mostrando el mayor efecto de reducción de glucosa en la sangre. Los niveles de glucosa en la sangre regresaron nuevamente a niveles de linea base 24 horas después de la inyección individual. El efecto máximo se observó entre 4 y 6 horas después de la inyección individual. Se condujo otra serie de experimentos con otra serie de péptidos GLP-1 fusionados a AG159LC. Las fusiones de anticuerpo probadas incluyen los siguientes péptidos GLP-1: GLP (A2G) (SEC ID NO: 126), GLP (A2G/G31N/+G32 /+T33 ) (SEC ID NO: 31), GLP (A2G/G29N/G31/T) (SEC ID NO: 29) y GLP (A2G/K28N/R30T) (SEC ID NO: 28). Estas fusiones de LC se aparearon con cadenas pesadas IgG2 de AG159, para dar los siguientes anticuerpos, los cuales fueron probados: GLP(A2G)-AG159LC: AG159 IgG2, GLP (A2G/G31N/+G32/+T33) -AGI 59LC : AGI 59 IgG2, GLP (A2G/G29N/G31/T) -AG159LC: AG159 IgG2, y GLP (A2G/K28N/R30T ) -AG159LC : AGI 59 IgG2. Las dosificaciones en este caso fueron 1 mg/kg. Como se puede ver en la Figura 5, para cada uno de los análogos probados, la glucosa en la sangre se redujo para las primeras 6 horas después de una inyección individual y se regresó a los niveles de linea base 24 horas después de una inyección individual. El efecto máximo se observó entre 4 y 6 horas después de la inyección.

Ejemplo 9: Curvas de Respuesta Se condujo una determinación de respuesta de dosis in vivo, usando ratones db/db como se describe en el Ejemplo 3. La composición usada en un experimento fue una en la cual, el GLP-1 (A2G) se fusionó a la LC de AG159, para dar el anticuerpo GLP (A2G) -AG159LC : AGI 59 IgG2 (véase Tabla 8 para la secuencia) . La dosificación fue ya sea, 7 ug, 12 ug o 25 ug. Como se puede ver en la Figura 6, los niveles de glucosa en la sangre se encontraron por reducir en una forma dependiente de dosis. Los resultados también demuestran que la composición opera en el mecanismo de acción. Se condujo otro estudio de respuesta de dosis en ratones normales con una composición en la cual, un análogo de GLP (A2G/R30G) (SEC ID NO:4), se fusionó a la LC de AG159 para dar el anticuerpo GLP (A2G/R30G) AG159LC : AG159 HC IgG2. La respuesta de dosis de esta composición fue más aparente al punto de tiempo de 30 minutos posteriores a la inyección de glucosa durante la prueba de tolerancia a la glucosa (Figura 7), y después de 24 y 48 horas después de la inyección de la composición de anticuerpo. Existe algún efecto mínimo debido a que esta respuesta de dosis se realizó en ratones normoglicémicos . Es más estimulante reducir la glucosa en la sangre en un modelo animal en donde la glucosa en la sangre es normal, que en un modelo de animal hiperglicémico (ratones db/db) .

Ejemplo 10 : Comparación in vivo de GLP-1 fusionado a LC contra HC Este experimento se diseñó para determinar si la unión de un compuesto GLP-1 a la LC o H de AG159, resulta en diferencias en actividad. Los constructos probados fueron unos en los cuales el GLP(A2G) se unió a ya sea LC o HC de AG159 para dar los siguientes constructos de anticuerpo GLP (A2G) AGI 59LC : AGI59 IgG2 ( GLP (A2G ) -AGI 59 LC) y AG159LC:GLP-1-AG159 IgG2 (GLP (A2G) -AG159 HC) . Como se puede ver en la Figura 8, ambos constructos fueron esencialmente igualmente efectivos en la reducción de los niveles de glucosa en la sangre.

Ejemplo 10: Experimentos de GTT Delgados Se condujo otro experimento con la proteina de fusión en la cual el análogo de GLP-1 A2G/R30G se fusionó a AG159 para dar el constructo de anticuerpo GLP (A2G/R30G) AG159LC:AG159 HC IgG2, o simplemente R30G (véase Tablas 1 y 7 para secuencias) . Este experimento se realizó para determinar si R30G puede reducir la glucosa en la sangre por un periodo largo en ratones normales. Se agregó una prueba de tolerancia a la glucosa al diseño experimental para permitir incrementar la lectura en la ventana de eficacia. Se aleatorizaron ratones C57B16 en el peso corporal. Se realizaron sangrados a 9 am para determinar los niveles de glucosa en la sangre en la línea base cuando se administra ya sea R30G o PBS . Después de un ayuno de 4-5 horas, se realizó una prueba de tolerancia de glucosa intraperitoneal usando una dosis de 2 g/kg. Los niveles de glucosa en la sangre se midieron 30 minutos y 90 minutos después de la carga de glucosa y cada 24 horas hasta que los niveles de glucosa en la sangre regresaron a los valores originales. Como se muestra en la Figura 9, el tratamiento con la composición R30G, mejora la tolerancia a la glucosa.

Ejemplo 12 : Experimentos de Dosis Múltiples Un problema con ciertos compuestos GLP-1 es que pueden perder eficacia después de inyecciones múltiples (determinación de taquifilaxis ) . Se condujo otro experimento con el anticuerpo GLP (A2G/R30G) AG159LC : AG159 HC IgG2, o simplemente R30G, para determinar si este fue el caso con esta molécula. Se inyectó R30G al día 1 en ratones delgados, como se describe en el ejemplo 5. Cuatro horas después de la primera inyección, se realizó una prueba de tolerancia a la glucosa para demostrar eficacia máxima. Al segundo y tercer día, se inyectó compuesto o vehículo. Al cuarto día, 4 horas después de la inyección del vehículo o compuesto, se realizó una segunda prueba de tolerancia a la glucosa. Como se muestra en la Figura 10, fue evidente que no se observó taquifilaxis notable. De este modo, R30G fue tan eficaz para reducir la glucosa en la sangre durante la segunda prueba de tolerancia a la glucosa como lo fue durante la primera prueba de tolerancia a la glucosa. Se entiende que los ejemplos y modalidades descritas en la presente son para propósitos ilustrativos solamente y que varias modificaciones y cambios en vista de los mismos, serán sugeridos para personas expertas en la técnica y están incluidos dentro del espíritu y alcance de esta solicitud y campo de las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes citadas en la presente, están por este medio incorporadas por referencia en su totalidad para todos los propósitos, en la misma magnitud como si cada publicación individual, patente o solicitud de patente, fuera específicamente e individualmente indicada para ser así incorporada por referencia. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Composición, caracterizada porque comprende: (a) un anticuerpo que se enlaza al glucagón; y (b) un compuesto GLP-1 ligado al anticuerpo que se enlaza al glucagón, en donde el compuesto GLP-1 tiene una actividad GLP-1.
2. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el anticuerpo es un anticuerpo neutralizante.
3. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque (a) el anticuerpo comprende (i) una región variable de cadena pesada y (ii) una región variable de cadena ligera; y (b) el compuesto GLP-1 está ligado a ya sea la región variable de cadena pesada o la región variable de cadena ligera.
4. Composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el compuesto GLP-1 está ligado a la región variable de cadena ligera.
5. Composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el término carboxi del compuesto GLP-1 está ligado al término amino de la región variable de cadena ligera.
6. Composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el compuesto GLP-1 y la región variable de cadena ligera están ligadas por un enlazador .
7. Composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el compuesto GLP-1 está ligado a la región variable de cadena pesada.
8. Composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el término carboxi del compuesto GLP-1 está ligado al término amino de la región variable de cadena pesada.
9. Composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el compuesto GLP-1 y la región variable de cadena pesada están ligadas por un enlazador .
10. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el anticuerpo y el compuesto GLP-1 están ligados por una conjugación química.
11. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el anticuerpo y el compuesto GLP-1 están ligados vía un enlazador sintético.
12. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el anticuerpo y el compuesto GLP-1 están ligados vía un enlazador peptídico.
13. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el anticuerpo y el compuesto GLP-1 forman una proteína de fusión.
14. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el anticuerpo está ligado a una pluralidad de compuestos de GLP-1.
15. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el anticuerpo está ligado a múltiples compuestos GLP-1 diferentes.
16. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el compuesto GLP-1 comprende un péptido GLP-1 que tiene al menos, 90% de identidad de secuencia a la SEC ID NO : 1 y tiene una actividad de GLP-1.
17. Composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el compuesto GLP-1 tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO : 1 con no más de 5 sustituciones de aminoácido conservadoras.
18. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el compuesto GLP-1 comprende una molécula de exendina.
19. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el compuesto GLP-1 comprende exendina 3 o exendina 4.
20. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el compuesto GLP-1 tiene al menos, 90% de identidad de secuencia a la exendina-3 o exendina 4. 21. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el compuesto GLP-1 comprende un péptido GLP-1 que comprende la secuencia de aminoácido de la fórmula I (SEC ID NO: 92) . Xaai-Xaa ~Xaa3—Xa zj—Xaas—Xaa6—Xaa7—Xaag—Xaag—X a io— Xaan-Xaai2-X ai3—Xaai —Xaai5—Xaai6-X ai —Xa i8—Xaaigo-Xaa2o—^332i — Xaa22—Xaa23—X 2 -Xaa25—Xaa26— aa27—Xaa28—Xaa2g—Xaa30—X a3i—Xaa32— Xaa33-Xaa34-Xaa35- aa36- aa37-C (O) -Ri (Fórmula I, SEC ID NO: 92) en donde, Ri es OR2 o NR2R3 ; R2 y R3 son independientemente hidrógeno o alquilo
(Ci-C8) ; Xaa en la posición 1 es: L-histidina, D-histidina, desamino-hist idina , 2-amino- histidina, 3-hidroxi-hist idina , homohist idina , a-fluorometil-hist idina o a-metil-histidina ; Xaa en la posición 2 es Gly, bAla (ácido 2-aminopropiónico ) , Asp, Ala, ácido 1-amino-ciclopentancarboxilico, ácido 2-aminoisobutí rico o aminoácidos alfa-alfa disustituidos; Xaa en la posición 3 es Glu, Asp, o Lys; Xaa en la posición 4 es Gly, Thr o Hys;
Xaa en la posición 5 es Thr, Ala, Gly, Ser, Leu, lie, Val, Glu, Asp, o Lys; Xaa en la posición 6 es: Hys, Trp, Phe, o Tyr; Xaa en la posición 7 es Thr o Gly; Xaa en la posición 8 es Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, o Lys; Xaa en la posición 9 es Asp, Asn o Glu; Xaa en la posición 10 es Val, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lie, Tyr, Glu, Asp, Trp, o Lys; Xaa en la posición 11 es Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, o Lys; Xaa en la posición 12 es Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, Trp, Tyr, Asn, Lys, Homolisina, Ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 13 es Tyr, Phe, Trp, Glu, Asp, Gln, Lys, Homolisina, Ornitina, 4 -carboxi-fenilalanina , ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 14 es Leu, Ala, Gly, Ser, Thr, lie, Val, Glu, Asp, Met, Trp, Tyr, Asn, Gln, Lys, Homolisina, Ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, ácido beta-glutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 15 es Glu, Asp, Lys, Homolisina, Ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 16 es Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, Asn, Lys, Homolisina, Ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, ácido beta-glutámico , Ácido beta-homoglutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 17 es Gln, Asn, Arg, Glu, Asp, Lys, Ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 18 es Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Arg, Glu, Asp, Asn, Lys, Homolisina, Ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 19 es Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, Asn, Lys, Homolisina, Ornitina, 4-carboxi-fenilalanina , ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 20 es Lys, Homolisina, Arg, Gln, Glu, Asp, Thr, Hys, Ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, ácido beta-glutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 21 es Leu, Glu, Asp, Thr, Lys,
Homolisina, Ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 22 es Phe, Trp, Asp, Glu, Lys, Homolisina, Ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, o ácido homoglutámico;
Xaa en la posición 23 es lie, Leu, Val, Ala, Phe, Asp, Glu, Lys, Homolisina, Ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, ácido beta-glutámico , ácido beta-homoglutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 24 es Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, Lys, Homolisina, Ornitina, 4-carboxi-fenilalanina , ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, o ácido homoglutámico; Xaa en la posición 25 es Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp, Asn, o Lys; Xaa en la posición 26 es Leu, Gly, Ala, Ser, Thr, lie, Val, Glu, Asp, o Lys; Xaa en la posición 27 es Val, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, lie, Glu, Asp, Asn, o Lys; Xaa en la posición 28 es Asn, Lys, Arg, Glu, Asp, o
Hys; Xaa en la posición 29 es Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, o Lys; Xaa en la posición 30 es Gly, Arg, Lys, Glu, Asp, Thr, Asn, o Hys; Xaa en la posición 31 es Pro, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, lie, Val, Glu, Asp, o Lys; Xaa en la posición 32 es Thr, Gly, Asn, Ser, Lys, o es omitido; Xaa en la posición 33 es Gly, Asn, Ala, Ser, Thr, lie, Val, Leu, Phe, Pro, o es omitido; Xaa en la posición 34 es Gly, Thr, o es omitido; Xaa en la posición 35 es Thr, Asn, Gly o es omitido ; Xaa en la posición 36 es Gly o es omitido; Xaa en la posición 37 es Gly o es omitido; siempre que cuando el aminoácido en la posición 32, 33, 34, 35, 36 o 37 es omitido, entonces cada aminoácido corriente abajo de aquel aminoácido es también omitido, y en donde el compuesto tiene una actividad GLP-1. 22. Composición de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el compuesto GLP-1 comprende un péptido GLP-1 que comprende la secuencia de aminoácido de cualquiera de la SEC ID NO: 1-35, SEC ID NO: 126 o SEC ID NO: 127, con no más de 5 sustituciones de aminoácido conservadoras . 23. Composición de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el compuesto GLP-1 comprende un péptido GLP-1 que comprende la secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEC ID NO: 1-35, SEC ID NO: 126 o SEC ID NO: 127. 24. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el anticuerpo comprende : (a) una región variable de cadena ligera (VL) que tiene al menos, 90% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 79, o (b) una región variable de cadena pesada (VH) que tiene al menos, 90% de identidad de secuencia con la SEC ID NO : 83 ; o (c) una VL de (a) y una VH de (b) . 25. Composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el anticuerpo consiste de dos VH idénticas y dos VL idénticas.
26. Composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el anticuerpo comprende una VL que tiene al menos, 95% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 79, y una VH que tiene al menos, 95% de identidad de secuencia con la SEC ID NO: 83.
27. Composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque el anticuerpo consiste de dos VH idénticas y dos VL idénticas.
28. Composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el anticuerpo comprende una VL que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 79; y una VH que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO:83.
29. Composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque el anticuerpo consiste de dos VH idénticas y dos VL idénticas.
30. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el anticuerpo comprende : (a) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEC ID NO: 40-81; (b) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEC ID NOS: 39 u 82-91; o (c) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de conformidad con cualquiera de las SEC ID NOS: 40-81 y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEC ID NOS: 39 u 82-91.
31. Composición de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque el anticuerpo consiste de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas.
32. Composición de conformidad con la reivindicación 1, 24 o 30, caracterizada porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
33. Composición de conformidad con la reivindicación 1, 24 o 30, caracterizada porque el anticuerpo es un scFv, Fab, Fab' o (Fab')2-
34. Composición de conformidad con la reivindicación 1, 24 o 30, caracterizada porque el anticuerpo es un anticuerpo humano o humanizado.
35. Polipéptido, caracterizado porque comprende una región variable de cadena ligera de anticuerpo de enlace al glucagon ligada a un péptido GLP-1.
36. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEC ID NO: 41-74 o 129.
37. Anticuerpo, caracterizado porque se enlaza a un glucagon que comprende el polipéptido de conformidad con la reivindicación 36.
38. Polipéptido, caracterizado porque comprende una región variable de cadena pesada de anticuerpo que se enlaza al glucagon, ligada a un compuesto GLP-1.
39. Polipéptido de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 128.
40. Anticuerpo, caracterizado porque se enlaza al glucagon que comprende el polipéptido de conformidad con la reivindicación 39.
41. Composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad efectiva de la composición de conformidad con la reivindicación 1, 24 o 30.
42. Método para tratar un sujeto con un trastorno metabólico, caracterizado porque comprende administrar al sujeto, una cantidad efectiva de la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 41, en donde el trastorno metabólico se selecciona del grupo de diabetes, obesidad y síndrome metabólico.
43. Método para intensificar la expresión de insulina en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto, una cantidad efectiva de la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 41.
44. Método para promover la secreción de insulina en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto, una cantidad efectiva de la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 41.
45. Método para tratar un sujeto con un trastorno metabólico, caracterizado porque comprende administrar al sujeto, una cantidad efectiva de la composición de conformidad con la reivindicación 1, 24 o 30, en donde el trastorno metabólico se selecciona del grupo de diabetes, obesidad y síndrome metabólico.
46. Método para intensificar la expresión de insulina en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto, una cantidad efectiva de la composición de conformidad con la reivindicación 1, 24 o 30.
47. Método para promover la secreción de insulina en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto, una cantidad efectiva de la composición de conformidad con la reivindicación 1, 24 o 30.