CN110357959B

CN110357959B - Gcgr抗体及其与glp-1的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用

Info

Publication number: CN110357959B
Application number: CN201810316473.0A
Authority: CN
Inventors: 汪笑峰; 张�成; 章华; 药辰江; 姜艳; 毕良亮; 景书谦
Original assignee: Gmax Biopharm LLC
Current assignee: Gmax Biopharm LLC
Priority date: 2018-04-10
Filing date: 2018-04-10
Publication date: 2023-02-28
Anticipated expiration: 2038-04-10
Also published as: WO2019196603A1; US20210122827A1; CN110357959A; TW201945392A; US11542336B2; EP3778634A4; CA3096556A1; EP3778634A1

Abstract

本文提供了GCGR抗体及其与GLP‑1的融合蛋白质，以及其药物组合物。本文还提供了GCGR抗体及其与GLP‑1的融合蛋白质用于治疗、预防或改善高血糖症、二型糖尿病、代谢综合症、或血脂异常的一种或多种症状方法。

Description

GCGR抗体及其与GLP-1的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用

技术领域

本文提供了能与GCGR特异性结合的抗体及其与GLP-1的融合蛋白质，以及其药物组合物。本文还提供了GCGR抗体及其与GLP-1的融合蛋白质用于治疗、预防或改善高血糖症、二型糖尿病、代谢综合症、或血脂异常的一种或多种症状方法。

发明背景

人胰高血糖素是与胰岛素一起作用的重要激素类物质，参与人体血液中葡萄糖含量的调控。胰高血糖素和胰岛素都是多肽类激素。胰高血糖素是在胰腺的α胰岛细胞产生的，胰岛素是在β胰岛细胞产生的。当血糖水平降低时，胰高血糖素主要通过刺激一些靶细胞(主要是肝细胞)释放葡萄糖，胰高血糖素和胰岛素调节血糖的作用正好相反，胰岛素在血糖升高时刺激细胞摄取并储存葡萄糖，降低血糖浓度。

天然人胰高血糖素是由29个氨基酸残基： His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg- Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr。

胰高血糖素通过结合其受体并激活下游信号通路，胰高血糖素受体(简称GCGR)属于七次跨膜G蛋白偶联受体家族分泌素亚型，配体-受体结合后，通过激活第二信使腺苷酸环化酶来行使功能，升高肝细胞内cAMP水平，继而启动葡萄糖的从头合成途径和肝糖原降解途径，使得血糖浓度升高(Wakelam等，1986，Nature 323:68-71；Pittner和Fain，1991，Biochem J.277:371-8)。

糖尿病是常见的葡萄糖代谢症，其特征是高血糖，分为胰岛素绝对不足的一型糖尿病和胰岛素相对不足的二型糖尿病。一型糖尿病患者表现出高血糖和低胰岛素血症，并且对该病的常规治疗措施为提供胰岛素。但是，在某些一型或二型糖尿病中，绝对或相对高的胰高血糖素导致高血糖。在健康的动物或糖尿病模型动物中，用选择性或特异性的抗体清除血液循环中的胰高血糖素可以使血糖水平下降(Brand等，1996，Diabetes 45:1076)。这些研究表明，抑制胰高血糖素或拮抗胰高血糖素受体可以作为糖尿病常规高血糖治疗的辅助手段。

通过靶向胰高血糖素受体的抗体阻断胰高血糖素和胰高血糖素受体的结合，也可以作为控制或降低血糖的一种手段，从而成为治疗糖尿病的新方法(US 2008/036341 A2和US 2012/0128679 A1)。但在实际的动物实验及临床试验中却发现，直接使用胰高血糖素受体的抗体，阻断胰高血糖素信号通路，会引起显著的负反馈，血液中生成浓度特别高的胰高血糖素，短暂升高的肝转氨酶，以及胰岛α细胞的显著增生(Kostic等，2018，Diabetes ObesMetab.20:283-91；Gu等，2009，JPET 331:871-881)。

GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质(GLP-1融合蛋白质)，一方面， GCGR抗体部分通过抑制胰高血糖素与其受体的结合，降低细胞内cAMP 水平，降低血糖；另外一方面，GLP-1部分，同样具有降低血糖的作用。这样GLP-1融合蛋白质中的两个部分：GCGR的抗体以及GLP-1部分同时起到降低血糖的作用，二者具有协同增效的作用，可以更大幅度地降低血糖，从而提高降血糖的药效。

另外，在协同增效的背景下，抗胰高血糖素抗体的临床剂量也不需要用到特别高，即在低剂量下，配合GLP-1激动剂一起，就可以显著降低血糖，这比单独使用高剂量的GCGR的抗体，能更大幅度地降低血糖，从而避免了使用高剂量胰高血糖素受体的抗体引起的副作用，比如胰岛α细胞的增生。更进一步来说，GLP-1激动剂能促进胰岛素分泌，而胰岛素又会拮抗胰高血糖素的生成(Mari等，2016，Diabetes Obes Metab.18:834-9)，给予GLP-1融合蛋白质，其中的GLP-1部分能够抑制胰高血糖素的升高，同样也降低了GCGR抗体显著升高胰高血糖素的负反馈作用，这样会显著降低药物的毒副作用。

GLP-1融合蛋白质中的GCGR抗体部分的降糖效果和GLP-1部分降糖效果都会叠加，通过双重作用来治疗高血糖症、二型糖尿病、代谢综合症和包括血脂异常的其它相关症状。这比单独使用GLP-1激动剂降糖幅度更大，也比单独使用胰高血糖素受体的抗体毒副作用更低，GLP-1融合蛋白质具有更显著的降血糖效果，又更安全。

发明内容

本文提供了能与GCGR特异性结合的抗体，该抗体是GCGR的拮抗剂。

本文还提供了一个能与GCGR特异性结合的抗体，其抗体包含一个、两个、三个、四个、五个、或六个氨基酸序列，其中每个氨基酸序列独立地选自于以下所列的氨基酸序列：

a.轻链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、及SEQ ID NO:20；

b.轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO:11、及SEQ ID NO:14；

c.轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、及SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、及SEQ ID NO:21；

d.重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、及SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:31、及SEQ ID NO:34；

e.重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:32、及SEQ ID NO:35；及

f.重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:33、及SEQ ID NO:36。

本文还提供了一个GLP-1融合蛋白质，其包含一个能与GCGR特异性结合的抗体，和一个，二个，三个，四个，五个，六个，七个，或八个GLP-1 片段；该融合蛋白质通过一个肽接头序列(Linker)将一GLP-1片段的羧基端与一GCGR抗体轻链或重链的氨基端连接或者将一GLP-1片段的氨基端与一GCGR抗体轻链或重链的羧基端连接。

本文进一步提供了一个GLP-1融合蛋白质，其包含一个能与GCGR特异性结合的抗体，和一个，二个，三个，四个，五个，六个，七个，或八个反向GLP-1片段；该融合蛋白质通过一个肽接头序列(Linker)将一反向 GLP-1片段的羧基端与一GCGR抗体轻链或重链的氨基端连接或者将一反向GLP-1片段的氨基端与一GCGR抗体轻链或重链的羧基端连接。

本文提供了一个GLP-1融合蛋白质，其包含一个GCGR抗体和二个 GLP-1片段；该融合蛋白质通过一个肽接头序列(Linker)将一GLP-1片段的羧基端与一GCGR抗体轻链的氨基端连接：N'-GLP-1-Linker-R-C'；或者将一GLP-1片段的羧基端和一GCGR抗体重链的氨基端连接： N'-GLP-1-Linker-R-C'；其中:N'代表融合蛋白质多肽链的氨基端,C'代表融合蛋白质多肽链的羧基端,GLP-1代表GLP-1片段，R为GCGR抗体的轻链或者重链的氨基酸序列,及Linker代表肽接头序列。

本文提供了一个GLP-1融合蛋白质，其包含一个GCGR抗体和二个反向GLP-1片段；该融合蛋白质通过一个肽接头序列(Linker)将一反向GLP-1 片段的氨基端与一GCGR抗体轻链的羧基端连接：N'-R-Linker-反向 GLP-1-C'；或者将一反向GLP-1片段的氨基端和一GCGR抗体重链的羧基端连接：N'-R-Linker-反向GLP-1-C'；其中:N'代表融合蛋白质多肽链的氨基端,C'代表融合蛋白质多肽链的羧基端,反向GLP-1代表反向GLP-1片段，R为GCGR抗体的轻链或者重链的氨基酸序列,及Linker代表肽接头序列。

本文提供了一个多核苷酸，其编码本文中所述的一个GCGR抗体。

本文提供了一个多核苷酸，其编码本文中所述的一个GCGR抗体与 GLP-1的融合蛋白质。

本文提供了一个载体，其包含编码本文中所述的一个GCGR抗体的多核苷酸。

本文提供了一个载体，其包含编码本文中所述的一个GCGR抗体与 GLP-1的融合蛋白质的多核苷酸。

本文提供了一个宿主细胞，其包含本文中所述的一个载体。

本文提供了一个药用组合物，其包含本文所述的一个GCGR抗体和一个药用可接受载体。

本文提供了一个药用组合物，其包含本文所述的一个GCGR抗体与 GLP-1的融合蛋白质和一个药用可接受载体。

本文提供了本文所述的一个GCGR抗体在制备用于治疗、预防或改善二型糖尿病的药物中的用途。

本文提供了本文所述的一个GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质在制备用于治疗、预防或改善二型糖尿病的药物中的用途。

本文提供了本文所述的一个GCGR抗体在制备用于治疗、预防或改善高血糖症的药物中的用途。

本文提供了本文所述的一个GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质在制备用于治疗、预防或改善高血糖症的药物中的用途。

本文提供了本文所述的一个GCGR抗体在制备用于治疗、预防或改善代谢综合症的药物中的用途。

本文提供了本文所述的一个GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质在制备用于治疗、预防或改善代谢综合症的药物中的用途。

本文提供了本文所述的一个GCGR抗体在制备用于治疗、预防或改善血脂异常的其它相关的药物中的用途。

本文提供了本文所述的一个GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质在制备用于治疗、预防或改善血脂异常的其它相关的药物中的用途。

本文提供了本文所述的一个GCGR抗体在制备用于同时治疗、预防或改善高血糖症、二型糖尿病、代谢综合症、或血脂异常的其它相关二种及二种以上病症的药物中的用途。

本文提供了本文所述的一个GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质在制备用于同时治疗、预防或改善高血糖症、二型糖尿病、代谢综合症、或血脂异常的其它相关二种及二种以上病症的药物中的用途。

本文提供了治疗、预防或改善高血糖症的方法，其包括给予受试者治疗有效量的本文所述的一个GCGR抗体。

本文提供了治疗、预防或改善高血糖症的方法，其包括给予受试者治疗有效量的本文所述的一个GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质。

本文提供了治疗、预防或改善二型糖尿病的方法，其包括给予受试者治疗有效量的本文所述的一个GCGR抗体。

本文提供了治疗、预防或改善二型糖尿病的方法，其包括给予受试者治疗有效量的本文所述的一个GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质。

本文提供了治疗、预防或改善代谢综合症的方法，其包括给予受试者治疗有效量的本文所述的一个GCGR抗体。

本文提供了治疗、预防或改善代谢综合症的方法，其包括给予受试者治疗有效量的本文所述的一个GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质。

本文提供了治疗、预防或改善血脂异常的方法，其包括给予受试者治疗有效量的本文所述的一个GCGR抗体。

本文提供了治疗、预防或改善血脂异常的方法，其包括给予受试者治疗有效量的本文所述的一个GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质。

本文提供了治疗、预防或改善高血糖症、代谢综合症和包括血脂异常的一种或多种症状方法，其包括给予受试者治疗有效量的本文所述的一个 GCGR抗体。

本文提供了治疗、预防或改善高血糖症、代谢综合症、或血脂异常的一种或多种症状方法，其包括给予受试者治疗有效量的本文所述的一个 GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质。

附图简述

图1：显示了流式细胞术(FACS)检测小鼠腹水抗体L5H5(其包含 SEQ ID NO:85与SEQ ID NO:95)与hGCGR特异性结合的结果，灰色峰为500nM小鼠腹水抗体L5H5和空白细胞CHO-DHFR-结合的阴性对照，实线峰分别为500nM(1a)、50nM(1b)和5nM(1c)的小鼠腹水抗体L5H5和CHO-DHFR-hGCGR的结合曲线，相对于灰色峰阴性对照有明显右移，证明了L5H5和CHO-DHFR-hGCGR的特异性结合。

图2：显示了流式细胞术(FACS)检测小鼠腹水抗体L4H4(其包含 SEQ ID NO:84与SEQ ID NO:94)与hGCGR特异性结合的结果，灰色峰为500nM小鼠腹水抗体L4H4和空白细胞CHO-DHFR-结合的阴性对照，实线峰分别为500nM(2a)、50nM(2b)和5nM(2c)的小鼠腹水抗体L4H4和CHO-DHFR-hGCGR的结合曲线，相对于灰色峰阴性对照有明显右移，证明了L4H4和CHO-DHFR-hGCGR的特异性结合。

图3：显示了直接cAMP实验检测hGCGR抗体L7H7(其包含SEQ ID NO:87与SEQ IDNO:97)拮抗胰高血糖素激活hGCGR信号通路的浓度抑制曲线(IC₅₀＝139nM,R²＝0.99)。

图4：显示了直接cAMP实验检测小鼠腹水GCGR抗体(L4H4和L5H5) 拮抗梯度稀释的胰高血糖素激活hGCGR信号通路的Schild曲线。随着抗 GCGR抗体浓度的提高，胰高血糖素激活hGCGR的S型曲线有明显的右移。

图5：显示了报告基因实验检测GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质GLP-1-Linker-L7H7，以及GMA102激活hGLP-1R信号通路的激活性曲线 (EC₅₀分别为106pM和16pM,R²＝0.99)。

图6：显示了高脂饲料诱导的C57BL/6肥胖小鼠中单次皮下注射 L4H4、GMA102(每两天一次)，以及二者联合用药后，第14天检测口服糖耐量的结果。

具体实施方式

定义

除非本文另外定义，与本文相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员所理解的含义。通常，与本文所述药物学、生物学、生物化学、细胞和组织培养学、生物学、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质核酸化学以及杂交相关的命名法和技术为本领域熟知和经常使用的。

本文使用标准的单字母或三字母缩写表明多聚核苷酸和多肽序列。多肽序列在书写时，带有氨基的首个氨基酸残基(N')在最左而带有羧基的最末氨基酸残基(C')在最右,例如本文所涉及的GLP-1片段序列：SEQ ID NO:119,SEQ ID NO:120,SEQ ID NO:121,SEQID NO:122,及SEQ ID NO:123。反向多肽序列指将多肽序列的氨基酸出现顺序逆向排列后形成的序列，例如上述GLP-1片段序列所形成的反向GLP-1片段序列：SEQ ID NO:127,SEQID NO:128,SEQ ID NO:129,SEQ ID NO:130,及SEQ ID NO:131。单链核酸序列和双链核酸序列的上游链的5’端在左而它们的3’端在右。多肽的具体部分可由氨基酸残基编号表示，例如氨基酸80至130，或由该位点的实际残基表示例如Lys80至Lys130。也可通过解释其与参比序列的差异描述具体的多肽或多聚核苷酸序列。

术语“肽”、“多肽”、和“蛋白”均指包含两个或多个通过肽健相互连接的氨基酸的分子。这些术语涵盖例如天然和人工蛋白和蛋白序列的多肽类似物(例如突变蛋白、变异体和融合蛋白)以及转录后或否则为共价或非共价修饰的蛋白。肽、多肽或蛋白可为单体或多聚体。

术语“多肽片段”指与对应的全长蛋白相比具有氨基端和/或羧基端缺失的多肽。片段长度可为，例如，至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、20、50、70、80、90、100、150、或200个氨基酸。片段长度可为，例如，最多1000、750、500、250、200、175、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、14、13、12、11、或10个氨基酸。片段可在其一端或两端进一步包含一个或多个附加氨基酸，例如，来自不同天然蛋白质的氨基酸序列(例如，Fc或亮氨酸拉链结构域)或人工氨基酸序列 (例如，人工接头序列)。

本文的多肽包括以任何原因和经任何方法修饰的多肽，例如，以：(1) 降低蛋白水解敏感性，(2)降低氧化敏感性，(3)改变形成蛋白复合物的亲和性，(4)改变结合亲和性，以及(5)赋予或修饰其它物理化学或功能性质。类似物包含多肽的突变蛋白。例如，可在天然序列(例如在形成分子内接触的结构域之外的多肽部分)中进行单个或多个氨基酸替换(例如，保守氨基酸替换)。“保守氨基酸替换”为不显著改变母体序列结构特性者 (例如，替换氨基酸不应破坏母体序列中出现的螺旋或干扰其它赋予母体序列特性或对其功能是必须的二级结构类型)。

多肽的“变异体”包含相对于另一多肽序列在氨基酸序列中插入、缺失和/或替换了一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。本文的变异体包括融合蛋白。

多肽的“衍生物”为经化学修饰的多肽，例如通过与其它化学部分例如聚乙二醇、白蛋白(例如人血清白蛋白)结合、磷酸化和糖基化。

除非另外说明，术语“抗体”包括两个全长重链和两个全长轻链的抗体，以及其衍生物，变异体、片段、和突变蛋白，其实例见下文。

术语“抗体”为包含与抗原结合部分并任选为允许抗原结合部分采取促进该抗体与该抗原结合的构象的支架或框架部分的蛋白。抗体的实例包括完整抗体、抗体片段(例如抗体的抗原结合部分)、抗体衍生物、和抗体类似物。该抗体可包含例如可选择的蛋白支架或具有移植CDRs或CDRs衍生物的人工支架。该支架包括但不限于包含被引入的例如以稳定化该抗体的三维结构的抗体衍生支架以及包含例如生物相容性多聚体的全合成支架。参见，例如，Korndorfer等，2003，Proteins 53:121-129；Roque等，2004,Biotechnol.Prog.20:639-654。此外，该抗体可以是模拟肽抗体(“PAMs”) 或包含模拟抗体的支架，其如支架一样利用纤维蛋白连接素。

抗体可具有例如天然免疫球蛋白的结构。“免疫球蛋白”为四聚体分子。在天然的免疫球蛋白中，各四聚体由两个相同的多肽链对组成，各对具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。各链的氨基端包括约100至110氨基酸的可变结构域，主要与抗原识别相关。各链的羧基端部分确定了主要与效应器作用相关的恒定区。人的抗体轻链分为κ和λ轻链。重链分为μ、δ、α或ε，并确定了抗原的同种型，例如分别为IgM、IgD、 IgG、IgA、和IgE。在轻链和重链中，可变和恒定区由约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链也包括约10多个氨基酸的“D”区。参见，Fundamental Immunology Ch.7(Paul编辑，第2版，RavenPress，1989)。各轻/重链对的可变区形成抗体结合位点，这样一个完整的免疫球蛋白具有两个结合位点。

天然免疫球蛋白链显示出由三个高度可变区连接的相对保守骨架区 (FR)的相同基本结构，也被称作互补决定区或CDRs。从N端到C端，轻和重链均包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、和FR4。各结构域氨基酸的分配与Kabat等在Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第5版，U.S.Dept.of Health and Human Services, PHS，NIH，NIH Publication No.91-3242，1991中的定义一致。

除非另外指明，“抗体”指完整的免疫球蛋白或其可与完整抗体竞争特异性结合的抗原结合部分。可由重组DNA技术或通过酶或化学裂解完整抗体生产抗原结合部分。抗原结合部分包括，尤其是，Fab、Fab’、F(ab’)₂、 Fv、结构域抗体(dAbs)，包括互补决定区(CDRs)的片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双链抗体(diabodies)、三链抗体(triabodies)、四链抗体 (tetrabodies)和至少包含足以赋予多肽特异抗原结合的免疫球蛋白的一部分的多肽。

Fab片段为具有V_L、V_H、C_L、和C_H1结构域的单价片段；F(ab’)₂片段为具有两个在铰链区由二硫键连接的Fab片段的二价片段；Fv片段具有 V_H和V_L结构域；dAb片段具有V_H结构域、V_L结构域，或V_H或V_L结构域的抗原结合片段(美国专利号US 6,846,634及US 6,696,245；美国专利申请公开号US 2005/0202512、US 2004/0202995、US 2004/0038291、US 2004/0009507、及US 2003/0039958；Ward等，1989，Nature 341:544-546)。

单链抗体(scFv)为一融合蛋白，其中的V_L和V_H区由接头(例如，合成的氨基酸残基序列)连接以形成连续蛋白质的抗体，其中该接头足够长以允许该蛋白链折叠回自身并形成单价抗原结合位点(参见，例如，Bird等， 1988，Science 242:423-26；和Huston等，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85:5879-83)。

双链抗体为包含两个多肽链的二价抗体，其中各多肽链包含由接头连接的V_H和V_L结构域，该接头很短以致于不允许两个结构域在相同链上的配对，因此允许各结构域与另一多肽链上的互补结构域配对(参见，例如， Holliger等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6444-48；和Poljak等， 1994，Structure 2:1121-23)。如果双链抗体的两个多肽链是相同的，那么由它们配对得到的双链抗体将具有相同的抗原结合位点。具有不同序列的多肽链可用于制备具有不同抗原结合位点的双链抗体。相似地，三链抗体和四链抗体分别为包含三个和四个多肽链的抗体并分别形成三个和四个抗原结合位点，其可相同或不同。

本文使用Kabat等在Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版,U.S.Dept.of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH Publication No.91-3242，1991中描述的方法鉴定给定抗体的互补决定区(CDRs)和框架区(FR)。可向分子中共价或非共价并入一个或多个CDRs使其成为抗体。抗体可以较大多肽链并入CDR(s)。可将CDR(s)共价连接至另一乡肽链，或非共价并入CDR(s)。CDRs允许抗体与具体的相关抗原特异性结合。

抗体可有一个或多个结合位点。如果多于一个结合位点，该结合位点可与另一个相同或不同。例如，天然人免疫球蛋白通常具有两个相同的结合位点，而“双特异性”或“双功能”抗体具有两个不同的结合位点。

术语“鼠源抗体”包括具有一个或多个来源于小鼠免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。

术语“人源化抗体”是将小鼠抗体分子的互补决定区序列移植到人抗体可变区框架中而制成的抗体。

术语“抗原结合结构域”、“抗原结合区”或“抗原结合位点”为包含与抗原相互作用的氨基酸残基并有助于抗体对抗原的特异性和亲和力的抗体的部分。对与其抗原特异性结合的抗体而言，这将包括至少部分的至少一个其 CDR结构域。

术语“表位”为与抗体(例如，通过抗体)结合的分子部分。表位可包含分子的非连续部分(例如，在多肽中，在多肽的一级序列中不连续的氨基酸残基在该多肽的三级和四级结构中相互足够接近以致于被一个抗体结合)。

两个多聚核苷酸或两个多肽序列的“相同百分比”由使用GAP计算机程序(GCGWisconsin Package；version 10.3(Accelrys，San Diego，CA)的一部分)使用其默认参数比较序列测定。

术语“多聚核苷酸”、“寡聚核苷酸”和“核酸”可在全文中交替使用并包括 DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如mRNA)、使用核苷酸类似物(例如，肽核酸和非天然核苷酸类似物)生成的DNA或 RNA类似物及其杂交体。核酸分子可为单链或双链。在一个实施方案中，本文的核酸分子包含编码本文提供抗体或其片段、衍生物、突变蛋白或变异体连续的开放阅读框。

如果它们的序列可反向平行排列则两个单链多聚核苷酸是相互“互补的”，这样一个多聚核苷酸中的各核苷酸与另一多聚核苷酸中的互补核苷酸相反，不会引入空隙并且各序列的5’或3’端没有未配对的核苷酸。如果两个多聚核苷酸可在中等严格条件下相互杂交那么一个多聚核苷酸与另一多聚核苷酸“互补”。因此，一个多聚核苷酸可与另一多聚核苷酸互补，但并不是它的互补序列。

术语“载体”为可用于将与其相连的另一核酸引入细胞的核酸。载体的一种类型为“质粒”，其指可连接附加核酸区段的线性或环状双链DNA分子。载体的另一类型为病毒载体(例如，复制缺陷逆转录病毒、腺病毒和腺病毒伴随病毒)，其中可将附加DNA区段引入病毒基因组。某些载体可在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如，包含细菌复制起点的细菌载体以及游离型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非游离型哺乳动物载体) 在引入宿主细胞时整合入宿主细胞的基因组中并因此与宿主基因组一起复制。“表达载体”为可引导所选多聚核苷酸表达的载体类型。

如果调控序列影响核苷酸序列的表达(例如，表达水平、时间或位点) 那么核苷酸序列与调控序列“可操作地相连”。“调控序列”为可影响与其可操作相连的核酸的表达(例如，表达水平、时间或位点)的核酸。调控基因，例如，直接对受调控核酸发挥作用或通过一个或多个其它分子(例如，与调控序列和/或核酸结合的多聚核苷酸)的作用。调控序列的实例包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。调控序列的进一步实例描述于例如Goeddel，1990,Gene Expression Technology: Methods in Enzymology,Volume 185,Academic Press,San Diego,CA；和 Baron等,1995,Nucleic Acids Res.23:3605-06。

术语“宿主细胞”为用于表达核酸例如本文提供核酸的细胞。宿主细胞可为原核生物，例如大肠杆菌，或者其可为真核生物，例如单细胞真核生物(例如，酵母或其它真菌)、植物细胞(例如烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(例如，人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤。通常，宿主细胞为可用多肽编码核酸转化或转染的培养细胞，其可接着在宿主细胞中表达。短语“重组宿主细胞”可用于表述用预期表达的核酸转化或转染的宿主细胞。宿主细胞也可为包含该核酸但是不以期望水平表达的细胞，除非向该宿主细胞引入了调控序列这样其与核酸可操作地相连。应理解的是术语宿主细胞不仅指具体的受试者细胞也指该细胞的子代或可能的子代。由于例如突变或环境影响后续世代会出现某些修饰，该子代事实上可能与母体细胞不同但是仍然属于本文使用的术语范围。

胰高血糖素受体

胰高血糖素受体属于七次跨膜的G蛋白偶联受体家族的B型，其通过异源三聚体鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)与一个或多个胞内信号传导途径偶联(Jelinek等，1993，Science 259:1614-16)。截止目前的研究发现， GCGR主要表达在肝脏、肾、大脑、脂肪组织、胰腺和心脏(Ahren等，2015， Peptides 67:74-81；Jazayeri等，2016，Nature 533:274-7)，主要参与人体内的糖代谢过程，因此也与糖尿病、血脂异常相关病症紧密关联(Lee等，2016， Diabetologia 59:1372-5)，本文中所使用的“人GCGR”和“hGCGR”均指代人源的胰高血糖素受体，可交替使用。本文中所使用的“鼠GCGR”和“mGCGR”均指代鼠源的胰高血糖素受体，也可交替使用。

在一个实施方案中，本文提供的抗体是与人GCGR特异性结合的抗体。在另一个实施方案中，本文提供的抗体是与细胞膜上的GCGR特异性结合的抗体，并且该抗体能抑制或者阻断胰高血糖素信号在这些细胞内的传导。在另一个实施方案中，本文提供的抗体是与人GCGR特异性结合的抗体，并且该抗体能与其它物种的GCGR结合(例如猴子或小鼠)，并阻断在这些物种中胰高血糖素的信号传导。在进一步的实施例中，本文提供的抗体是与人GCGR结合的鼠源抗体，并且该抗体能与其它物种的GCGR结合(例如猴子)。

在一个实施方案中，GCGR的氨基酸和多聚核苷酸序列如下所列，序列数据来源于美国国立生物技术信息中心的GeneBank数据库以及欧洲生物信息研究所的Uniprot数据库：

人(Homo sapiens)多聚核苷酸(SEQ ID NO：77)；登录号：BC104854；

人(Homo sapiens)氨基酸(SEQ ID NO：73)；登录号：P47871；

猴子(Rhesus macaque)多聚核苷酸(SEQ ID NO：78)；登录号： XM_015120592；

猴子(Rhesus macaque)氨基酸(SEQ ID NO：74)；登录号： A0A1D5QZY8；

大鼠(Rattus norvegicus)多聚核苷酸(SEQ ID NO:79)；登录号： X68692；

大鼠(Rattus norvegicus)氨基酸(SEQ ID NO:75)；登录号：P30082；

小鼠(Mus musculus)多聚核苷酸(SEQ ID NO：80)；登录号：BC031885；及

小鼠(Mus musculus)氨基酸(SEQ ID NO：76)；登录号：Q61606。

胰高血糖素受体抗体(GCGR抗体)

在一个实施方案中，本文提供的是GCGR抗体。在另一个实施方案中，本文提供的GCGR抗体是完整GCGR抗体。在另一个实施方案中，本文提供的GCGR抗体是GCGR抗体片段。在另一个实施方案中，本文提供的 GCGR抗体是GCGR抗体衍生物。在另一个实施方案中，本文提供的GCGR 抗体是GCGR抗体突变蛋白质。在进一步的实施方案中，本文提供的GCGR 抗体是GCGR抗体变异体。

在一个实施方式中，本文提供的GCGR抗体包含一个、两个、三个、四个、五个、或六个氨基酸序列，其中每个氨基酸序列独立地选自于以下所列氨基酸序列：

表1列出本文提供的GCGR抗体的轻链CDRs的氨基酸序列，以及其相应的多聚核苷酸编码序列。表2列出本文提供的GCGR抗体的重链CDRs 的氨基酸序列，以及其相应的多聚核苷酸编码序列。

表1：轻链CDRs的氨基酸序列及其多聚核苷酸编码序列

表2：重链CDRs的氨基酸序列及其多聚核苷酸编码序列

在一个实施方案中，本文提供的抗体包含与表1和表2中所列的CDR 氨基酸序列中之一相差5、4、3、2、或1个单氨基酸添加、替换和/或缺失的序列。在另一个实施方案中，本文提供的抗体包含与表1和表2中所列的CDR氨基酸序列中之一相差4、3、2、或1个单氨基酸添加、替换和 /或缺失的序列。

在另一个实施方案中，本文提供的抗体包含与表1和表2中所列的CDR 氨基酸序列中之一相差3、2、或1个单氨基酸添加、替换和/或缺失的序列。

在另一个实施方案中，本文提供的抗体包含与表1和表2中所列的CDR 氨基酸序列中之一相差2或1个单氨基酸添加、替换和/或缺失的序列。

在进一步的实施方案中，本文提供的抗体包含与表1和表2中所列的 CDR氨基酸序列中之一相差1个单氨基酸添加、替换和/或缺失的序列。

在一个实施方案中，本文提供的GCGR抗体包含一个或两个氨基酸序列，其中每个氨基酸序列独立地选自于以下所列氨基酸序列：

a.轻链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、及 SEQ ID NO:20；及

b.重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、及SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:31、及SEQ ID NO:34。

在另一个实施方案中，本文提供的GCGR抗体包含一个或两个氨基酸序列，其中每个氨基酸序列独立地选自于以下所列氨基酸序列：

a.轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO:11、及SEQ ID NO:14；及

b.重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:32、及SEQ ID NO:35。

a.轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:12、及SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、及SEQ ID NO:21；及

b.重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:33、及SEQ ID NO:36。

在另一个实施方案中，本文提供的GCGR抗体包含一个，两个，三个，或四个氨基酸序列，其中每个氨基酸序列独立地选自于以下所列的氨基酸序列：

b.重链CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、及SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:31、及SEQ ID NO:34；

c.轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO:11、及SEQ ID NO:14；及

d.重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:32、及SEQ ID NO:35。

c.轻链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、及SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、及SEQ ID NO:21；及

d.重链CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:33、及SEQ ID NO:36。

在进一步的实施方案中，本文提供的GCGR抗体包含一个，两个，三个，或四个氨基酸序列，其中每个氨基酸序列独立地选自于以下所列的氨基酸序列：

a.轻链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO:11、及SEQ ID NO:14；

b.重链CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:32、及SEQ ID NO:35；

在一个实施方案中，本文提供的GCGR抗体包含一个，两个，或三个氨基酸序列，其中每个氨基酸序列独立地选自于以下所列的氨基酸序列： SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、 SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、及SEQID NO:21。

在另一个实施方案中，本文提供的GCGR抗体包含一个，两个，或三个氨基酸序列，其中每个氨基酸序列独立地选自于以下所列的氨基酸序列： SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、 SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQID NO:35、及SEQ ID NO:36。

在一个实施方案中，本文提供的GCGR抗体包含一个独立地选自于以下所列的轻链和重链CDR1氨基酸序列的组合：SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:28、 SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:13与SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:16与SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:18与SEQ ID NO:34、及SEQ ID NO:20与SEQ ID NO:34。

在另一个实施方案中，本文提供的GCGR抗体包含一个独立地选自于以下所列的轻链和重链CDR2氨基酸序列的组合：SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:5与SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:8与SEQ ID NO:29、 SEQ ID NO:11与SEQ ID NO:32、及SEQ ID NO:14与SEQ ID NO:35。

在进一步的实施方案中，本文提供的GCGR抗体包含一个独立地选自于以下所列的轻链和重链CDR3氨基酸序列的组合：SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:6与SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:9与SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO:12与SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:15与SEQID NO:36、 SEQ ID NO:17与SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:19与SEQ ID NO:36、及 SEQ ID NO:21与SEQ ID NO:36。

在一个实施方案中，本文提供的GCGR抗体包含：

a.一个独立地选自于以下所列的轻链和重链CDR1氨基酸序列的组合：SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:10与SEQ ID NO:31、SEQ ID NO: 13与SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:16与SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:18 与SEQ ID NO:34、及SEQ ID NO:20与SEQ ID NO:34；和

b.一个独立地选自于以下所列的轻链和重链CDR2氨基酸序列的组合：SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:8与SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:11与SEQ ID NO:32、及SEQ ID NO:14与SEQ ID NO:35。

在另一个实施方案中，本文提供的GCGR抗体包含：

b.一个独立地选自于以下所列的轻链和重链CDR3氨基酸序列的组合：SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:6与SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:12与SEQ ID NO:33、SEQ ID NO: 15与SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:17与SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:19 与SEQ ID NO:36、及SEQ ID NO:21与SEQ ID NO:36。

在另一个实施方案中，本文提供的GCGR抗体包含：

a.一个独立地选自于以下所列的轻链和重链CDR2氨基酸序列的组合：SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:8与SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:11与SEQ ID NO:32、及SEQ ID NO:14与SEQ ID NO:35；和

在进一步实施方案中，本文提供的GCGR抗体包含：

a.一个独立地选自于以下所列的轻链和重链CDR1氨基酸序列的组合：SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:10与SEQ ID NO:31、SEQ ID NO: 13与SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:16与SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:18 与SEQ ID NO:34、及SEQ ID NO:20与SEQ ID NO:34；

b.一个独立地选自于以下所列的轻链和重链CDR2氨基酸序列的组合：SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:8与SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:11与SEQ ID NO:32、及SEQ ID NO:14与SEQ ID NO:35；和

c.一个独立地选自于以下所列的轻链和重链CDR3氨基酸序列的组合：SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:6与SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:12与SEQ ID NO:33、SEQ ID NO: 15与SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:17与SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:19 与SEQ ID NO:36、及SEQ ID NO:21与SEQ ID NO:36。

a.轻链可变结构域氨基酸序列：SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、 SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、及SEQ ID NO:90；及与其任一序列有至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％相同的氨基酸序列；及

b.重链可变结构域氨基酸序列：SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、 SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、及SEQ ID NO:97；及与其任一序列有至少80％、至少85％、至少90％、或至少 95％相同的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，本文提供的GCGR抗体的多聚核苷酸编码序列包含一个或两个多聚核苷酸编码序列，其中每个多聚核苷酸编码序列独立地选自于以下所列多聚核苷酸序列：

a.轻链可变结构域多聚核苷酸编码序列：SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ IDNO:100、及SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO: 103、及SEQ ID NO:104、SEQ IDNO:105、SEQ ID NO:106、及SEQ ID NO: 107；及与其任一序列有至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％相同的多聚核苷酸编码序列；及

b.重链可变结构域多聚核苷酸编码序列：SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ IDNO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO: 113、及SEQ ID NO:114；及与其任一序列有至少80％、至少85％、至少 90％、或至少95％相同的多聚核苷酸编码序列。

在一个实施方案中，本文提供的GCGR抗体包含一个独立地选自于以下所列的氨基酸序列：SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、 SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、及SEQ ID NO:90。

在另一个实施方案中，本文提供的GCGR抗体包含一个独立地选自于以下所列的氨基酸序列：SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、 SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、及SEQ ID NO:97。

在一个实施方案中，本文提供的GCGR抗体包含一个独立地选自于以下所列的轻链与重链可变结构域氨基酸序列的组合：SEQ ID NO:81与SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:82与SEQID NO:92、SEQ ID NO:83与SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO:84与SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:85与SEQ ID NO:95、 SEQ ID NO:86与SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:87与SEQ ID NO:97、SEQ IDNO:88与SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:89与SEQ ID NO:97、及SEQ ID NO:90与SEQ ID NO:97。

在一个实施方案中，本文提供的GCGR抗体包含一个独立地选自于以下所列的氨基酸序列：SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、 SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQID NO:95、 SEQ ID NO:96、及SEQ ID NO:97。

在另一个实施方案中，本文提供的GCGR抗体包含一个独立地选自于以下所列的轻链与重链可变结构域氨基酸序列的组合：SEQ ID NO:81与 SEQ ID NO:91(L1H1)、SEQ IDNO:82与SEQ ID NO:92(L2H2)、SEQ ID NO:84与SEQ ID NO:94(L4H4)、SEQ ID NO:85与SEQID NO:95(L5H5)、 SEQ ID NO:86与SEQ ID NO:96(L6H6)、SEQ ID NO:87与SEQ ID NO: 97(L7H7)、SEQ ID NO:88与SEQ ID NO:97(L8H7)、及SEQ ID NO:89与 SEQ ID NO:97(L9H7)。

本文也可用“LxHy”符号来指代所提供的GCGR抗体，其中“x”对应于轻链可变区序列代号；“y”对应于重链可变区序列代号。例如，L2H2指具有包含SEQ ID NO:82(L2)氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO:92 (H2)氨基酸序列的重链可变区的完整抗体。

在一个实施方案中，本文提供的GCGR抗体包含一或两个氨基酸序列，其中每个氨基酸序列独立地选自于以下所列的氨基酸序列：

a.轻链恒定氨基酸序列：SEQ ID NO:115及SEQ ID NO:116；及

b.重链恒定氨基酸序列：SEQ ID NO:117及SEQ ID NO:118。

在另一个实施方案中，本文提供的GCGR抗体包含一或两个氨基酸序列，其中每个氨基酸序列独立地选自于以下所列的轻链和重链恒定氨基酸序列的组合：SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:117、及SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:118。

在一个实施方案中，本文提供的GCGR抗体包含本文所列轻链及重链CDRs，以及FRs(框架)的氨基酸序列。FRs的氨基酸序列包含于轻链或者重链可变结构域氨基酸序列中，未单独陈列。在一个实施方案中，该抗体包含一个本文所列的轻链CDR1序列。在另一个实施方案中，该抗体包含一个本文所列的轻链CDR2序列。在另一个实施方案中，该抗体包含一个本文所列的轻链CDR3序列。在另一个实施方案中，该抗体包含一个本文所列的重链CDR1序列。在另一个实施方案中，该抗体包含一个本文所列的重链CDR2序列。在另一个实施方案中，该抗体包含一个本文所列的重链CDR3序列。在另一个实施方案中，该抗体包含一个本文的轻链FR1 序列。在另一个实施方案中，该抗体包含一个本文的轻链FR2序列。在另一个实施方案中，该抗体包含一个本文的轻链FR3序列。在另一个实施方案中，该抗体包含一个本文的轻链FR4序列。在另一个实施方案中，该抗体包含一个本文的重链FR1序列。在另一个实施方案中，该抗体包含一个本文的重链FR2序列。在另一个实施方案中，该抗体包含一个本文的重链 FR3序列。在进一步的实施方案中，该抗体包含一个本文的重链FR4序列。

在一个实施方案中，该抗体的轻链CDR3序列与本文所列轻链CDR3 氨基酸序列SEQID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO: 19、及SEQ ID NO:21之一相差不得超过6、5、4、3、2、或1个单氨基酸添加、替换和/或缺失。在另一个实施方案中，该抗体的重链CDR3序列与本文所列重链CDR3氨基酸序列SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:36相差最多不超过6、5、4、3、2、或1个单氨基酸添加、替换和/或缺失。在进一步的实施方案中，该抗体的轻链CDR3序列与本文所列轻链CDR3氨基酸序列SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、及SEQ ID NO:21之一相差不得超过6、5、4、3、2、或1个单氨基酸添加、替换和/或缺失，并且该抗体的重链CDR3序列与本文所列重链CDR3氨基酸序列SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:36相差最多不超过6、5、4、3、2、或1个单氨基酸添加、替换和/或缺失。在另一个实施方案中，该抗体进一步包含1、2、3、4、5、或6个本文所列轻重链CDR轻重链序列组合。

在一个实施方案中，本文提供的GCGR抗体包含一个轻链可变结构域氨基酸序列，该序列选择于本文所列的L1(SEQ ID NO:81)、L2(SEQ ID NO: 82)、L4(SEQ ID NO:84)、L5(SEQ ID NO:85)、L6(SEQ ID NO:86)、L7 (SEQ ID NO:87)、L8(SEQ ID NO:88)、及L9(SEQID NO:89)轻链可变结构域序列。在一个实施方案中，该GCGR抗体的轻链可变结构域氨基酸序列与L1(SEQ ID NO:81)、L2(SEQ ID NO:82)、L4(SEQ ID NO:84)、L5 (SEQ ID NO:85)、L6(SEQ ID NO:86)、L7(SEQ ID NO:87)、L8(SEQ ID NO: 88)、及L9(SEQ ID NO:89)之一的轻链可变结构域氨基酸序列存在15、14、 13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1个氨基酸的差异的，其中各序列的差异独立为一个氨基酸残基的缺失、插入或替换。在另一个实施方案中，该GCGR抗体的轻链可变结构域氨基酸序列与L1(SEQ ID NO: 81)、L2(SEQ ID NO:82)、L4(SEQ ID NO:84)、L5(SEQ ID NO:85)、L6 (SEQ ID NO:86)、L7(SEQ ID NO:87)、L8(SEQID NO:88)、及L9(SEQ ID NO:89)之一的轻链可变结构域氨基酸序列有至少70％、至少75％、至少 80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、或至少99％相同。在另一个实施方案中，该GCGR抗体的轻链可变结构域多聚核苷酸编码序列与L1(SEQ ID NO:81)、L2(SEQ ID NO:82)、L4(SEQ ID NO:84)、L5(SEQ ID NO:85)、L6(SEQ ID NO:86)、L7(SEQ IDNO:87)、L8(SEQ ID NO:88)、及L9(SEQ ID NO:89)之一的多聚核苷酸编码序列有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、或至少99％相同。在另一个实施方案中，该GCGR抗体的轻链可变结构域多聚核苷酸编码序列包含在中等条件下与L1(SEQ ID NO:81)、L2(SEQ ID NO:82)、L4(SEQ ID NO:84)、L5(SEQ ID NO:85)、L6(SEQ IDNO:86)、L7(SEQ ID NO:87)、 L8(SEQ ID NO:88)、及L9(SEQ ID NO:89)之一的轻链可变结构域的多聚核苷酸编码序列互补序列杂交的多聚核苷酸序列。在进一步的实施方案中，该GCGR抗体的轻链可变结构域多聚核苷酸编码序列包含在严格条件下与 L1(SEQ ID NO:81)、L2(SEQ ID NO:82)、L4(SEQ ID NO:84)、L5(SEQ ID NO:85)、L6(SEQ ID NO:86)、L7(SEQ ID NO:87)、L8(SEQ ID NO:88)、及L9(SEQ ID NO:89)之一的轻链可变结构域的多聚核苷酸编码序列互补序列杂交的多聚核苷酸序列。

在一个实施方案中，本文提供的GCGR抗体包含一个重链可变结构域氨基酸序列，该序列选择于本文所列H1(SEQ ID NO:91)、H2(SEQ ID NO: 92)、H4(SEQ ID NO:94)、H5(SEQ ID NO:95)、H6(SEQ ID NO:96)、及 H7(SEQ ID NO:97)重链可变结构域序列。在另一个实施方案中，该GCGR 抗体的重链可变结构域氨基酸序列与H1(SEQ ID NO:91)、H2(SEQID NO: 92)、H4(SEQ ID NO:94)、H5(SEQ ID NO:95)、H6(SEQ ID NO:96)、及 H7(SEQ IDNO:97)之一的重链可变结构域序列存在15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1个氨基酸差异，其中各序列的差异独立为一个氨基酸残基的缺失、插入或替换。在另一个实施方案中，该GCGR 抗体的重链可变结构域氨基酸序列与H1(SEQ ID NO:91)、H2(SEQ ID NO: 92)、H4(SEQ ID NO:94)、H5(SEQ ID NO:95)、H6(SEQ ID NO:96)、及 H7(SEQ ID NO:97)之一的重链可变结构域序列有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、或至少99％相同。在另一个实施方案中，该GCGR抗体的重链可变结构域多聚核苷酸编码序列与H1(SEQ ID NO:91)、H2(SEQ ID NO:92)、H4(SEQ ID NO:94)、H5 (SEQ ID NO:95)、H6(SEQ ID NO:96)、及H7(SEQ ID NO:97)之一的重链可变结构域多聚核苷酸编码序列有至少70％、至少75％、至少80％、至少 85％、至少90％、至少95％、至少97％、或至少99％相同。在另一个实施方案中，该GCGR抗体的重链可变结构域多聚核苷酸编码序列包含在中等严格条件下与H1(SEQ ID NO:91)、H2(SEQ ID NO:92)、H4(SEQ ID NO: 94)、H5(SEQ IDNO:95)、H6(SEQ ID NO:96)、及H7(SEQ ID NO:97)之一的重链可变结构域的多聚核苷酸编码序列互补序列杂交的多聚核苷酸序列。在一个实施方案中，该GCGR抗体的重链可变结构域多聚核苷酸编码序列包含在严格条件下与H1(SEQ ID NO:91)、H2(SEQ ID NO:92)、H4(SEQ ID NO:94)、H5(SEQ ID NO:95)、H6(SEQ ID NO:96)、及H7(SEQ ID NO:97)之一的重链可变结构域的多聚核苷酸编码序列互补序列杂交的多聚核苷酸序列。

在一个实施方案中，本文提供的抗体是一包含L1H1(SEQ ID NO:81与 SEQ ID NO:91)、L2H2(SEQ ID NO:82与SEQ ID NO:92)、L3H3(SEQ ID NO:83与SEQ ID NO:93)、L4H4(SEQ ID NO:84与SEQ ID NO:94)、 L5H5(SEQ ID NO:85与SEQ ID NO:95)、L6H6(SEQ IDNO:86与SEQ ID NO:96)、L7H7(SEQ ID NO:87与SEQ ID NO:97)、L8H7(SEQ ID NO:88 与SEQID NO:97)、L9H7(SEQ ID NO:89与SEQ ID NO:97)、或L10H7(SEQ ID NO:90与SEQ ID NO:97)组合的抗体，或其一的期望表型(例如，IgA、 IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgE、或IgD)，或其一Fab或F(ab')2 片段。

在一个实施方案中，本文提供的抗体是一包含L1H1(SEQ ID NO:81与 SEQ ID NO:91)、L2H2(SEQ ID NO:82与SEQ ID NO:92)、L4H4(SEQ ID NO:84与SEQ ID NO:94)、L5H5(SEQ ID NO:85与SEQ ID NO:95)、L6H6(SEQ ID NO:86与SEQ ID NO:96)、L7H7(SEQ ID NO:87与SEQ ID NO:97)、L8H6(SEQ ID NO:88与SEQ ID NO:97)或L9H7(SEQ ID NO:89 与SEQID NO:97)组合的抗体，或其一类转换的抗体(例如，IgA、IgG1、 IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgE、和IgD)，或其一Fab或F(ab')2片段。

本文提供的抗体可包含本领域已知的恒定区中任何一个。轻链恒定区可为例如κ或λ型轻链恒定区，例如小鼠κ或λ型轻链恒定区。重链恒定区可为例如α、δ、ε、γ、或μ型重链恒定区，例如小鼠α、δ、ε、γ、或μ型重链恒定区。在一个实施方案中，该轻链或重链恒定区为天然恒定区的片段、衍生物、变异体、或突变蛋白。

在一个实施方案中，本文提供的抗体进一步包含人恒定轻链κ或λ结构域或其片段。轻链恒定区的氨基酸序列如下：

人恒定轻链κ结构域氨基酸序列：(SEQ ID NO:115)；及

人恒定轻链λ结构域氨基酸序列：(SEQ ID NO:116)。

在另一个实施方案中，本文提供的抗体进一步包含人重链恒定结构域或其片段。重链恒定区氨基酸序列序列如下：

人重链恒定区氨基酸序列(hIgG2)：(SEQ ID NO:117)；及

人重链恒定区氨基酸序列(hIgG4)：(SEQ ID NO:118)。

在一个实施方式中，本文所提供的GCGR抗体选自鼠源抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、抗原结合抗体片段、单链抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体、Fab片段、F(ab’)x片段、结构域抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgGl抗体、IgG2抗体、IgG3 抗体、或IgG4抗体。

在一个实施方式中，本文提供的GCGR抗体为GCGR单克隆抗体。

在另一个实施方式中，本文提供的GCGR抗体为一单克隆抗体,该单克隆抗体包含一个选自于以下所列的氨基酸序列的组合：SEQ ID NO:81 与SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:82与SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:83与 SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:84与SEQ ID NO:94、SEQ IDNO:85与SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:86与SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:87与SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO:88与SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:89与SEQ ID NO:97、及SEQ ID NO:90与SEQ IDNO:97。

在一个实施方式中，本文提供的GCGR抗体为鼠源GCGR抗体。在另一个实施方式中，本文提供的GCGR抗体为人源化GCGR抗体。

在一个实施方式中，本文提供的GCGR抗体降低人信号传导的IC₅₀值为大约1nM至大约300nM或大约1nM至大约150nM。

抗体和抗体片段

在一个实施方案中，本文提供的抗体为完整抗体(包括具有全长重和/ 或轻链的多克隆、单克隆、嵌合、人源化、或人类抗体)。在另一个实施方案中，本文提供的抗体为抗体片段，列如F(ab’)₂、Fab、Fab’、Fv、Fc、或 Fd片段，单结构域抗体、单链抗体、最大抗体(maxibodies)、微抗体 (minibodies)、内抗体(intrabodies)、二链抗体、三链抗体、四链抗体、 v-NAR、或bis-scFv(参见，例如Hollinger and Hudson，2005，Nature Biotechnology23:1126-1136)。在另一个实施方案中，本文提供的抗体包括如美国专利号6703199中所公开的抗体多肽，包括纤维结合素多肽单抗体。在进一步的实施方案中，本文提供的抗体包括如美国专利出版物 2005/0238646中所公开的单链多肽。

在一个实施方案中，单克隆抗体的基因的可变区是使用核苷酸引物扩增在杂交瘤中表达。这些引物可由本领域普通技术人员合成或从商业来源购买。鼠和人可变区引物包括V_Ha、V_Hb、V_Hc、V_Hd、C_H1、V_L、和C_L区的引物可从商业来源购买。这些引物可用于扩增重链或轻链可变区，然后将其分别插入载体例如IMMUNOZAP^TMH或IMMUNOZAP^TML(Stratagene) 中。然后将这些载体引入大肠杆菌、酵母或哺乳动物为基础的表达系统。这些方法可使用于生产大量包含V_H和V_L结构域融合的单链蛋白(参见Bird 等，1988，Science 242:423-426)。

本领域技术人员应理解的是一些蛋白质，例如抗体，可能进行可多种转录后修饰。这些修饰的类型和程度取决于用于表达该蛋白的宿主细胞系以及培养条件。该类修饰包括糖基化作用、甲硫氨酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺作用的变化。抗体的羧端碱性残基(例如赖氨酸或精氨酸)因羧肽酶的频繁修饰作用而可能丢失(参见，Harris， 1995，Journal of Chromatography 705:129-134)。

鼠单克隆抗体可使用常用的杂交瘤细胞方法来生产。该单克隆抗体可通过多种已确立的技术分离和纯化。该类分离技术包括蛋白A-琼脂糖的亲和色谱法、分子排阻色谱法、和离子交换色谱法(参见，例如，Coligan第 2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页；Baines等，“Purification of Immunoglobulin G(IgG),”Methods in Molecular Biology，第10卷，第79-104页(The Humana Press，Inc.，1992))。该单克隆抗体可使用基于抗体的特殊性质(例如，重链或轻链同种型、结合特异性等)筛选的适当配基通过亲和色谱法来纯化。亲和色谱的适当配基的实例包括蛋白A、蛋白G、抗恒定区(轻链或重链) 抗体、抗独特型抗体以及TGF-结合蛋白或其片段或变异体。

可使用抗体结合位点中央的互补决定区(CDRs)对分子进行亲和力成熟化的改造，来得到亲和性增加的抗体，例如针对c-erbB-2的亲和性增加的抗体(Schier等，1996，J.Mol.Biol.263:551-567)。因此，该类技术可用于制备人GCGR的抗体。

例如可在检测是否存在人GCGR的体外或体内测定法中使用针对人 GCGR的抗体。

也可通过任何传统技术制备抗体。例如，可从天然表达这些抗体的细胞将其纯化(例如，可从生产抗体的杂交瘤将其纯化)或使用本领域任何已知的技术在重组表达系统中生产。参见，例如，Monoclonal Antibodies, Hybridomas:ANew Dimension in BiologicalAnalyses,Kennet等编辑，Plenum Press(1980)；和Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow and Land编辑, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988)。这在下文的核酸部分讨论。

可通过任何已知技术制备抗体并筛选期望性质。一些技术涉及分离编码相关抗体(例如，抗GCGR抗体)的多肽链(或其部分)的核酸，并通过重组DNA技术操作核酸。该核酸可与另一相关核酸融合或经修饰(例如通过诱变或其它传统技术)以添加、缺失或替换一个或多个氨基酸残基。

当需要提高根据本文包含一个或多个上述CDRs的抗体的亲和性时，可通过多种亲和成熟方案包括维持CDRs(Yang等，1995，J.Mol.Biol.254: 392-403)、链替换(Marks等，1992，Bio/Technology 10:779-783)、使用大肠杆菌的突变株(Low等，1996，J.Mol.Biol.250:350-368)DNA重排(Patten 等，1997，Curr.Opin.Biotechnol.8:724-733)、噬菌体展示(Thompson等， 1996，J.Mol.Biol.256:7-88)以及其它PCR技术(Crameri等，1998，Nature 391：288-291)。所有这些亲和力成熟方法讨论于Vaughan等，1998，NatureBiotechnology 16:535-539中。

在一个实施方案中，本文提供的抗体为抗GCGR片段。该片段可完全由抗体衍生序列组成或可包含附加序列。抗原结合片段的实例包括Fab、 F(ab’)2、单链抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体和结构域抗体，其它实例提供于Lunde等，2002，Biochem.Soc.Trans.30:500-06。

可经氨基酸桥(短肽接头)连接重链和轻链可变结构域(Fv区)形成单链抗体，从而得到单多肽链。已通过将编码肽接头的DNA融合在编码两个可变结构域多肽(V_L和V_H)的DNAs之间制备该单链Fvs(scFvs)。所得多肽可折叠回自身形成抗原结合单体，或它们可形成多聚体(例如，二聚体、三聚体或四聚体)，取决于两个可变结构域之间的柔性接头的长度(Kortt 等，1997，Prot.Eng.10:423；Kortt等2001，Biomol.Eng.18:95-108)。通过组合包含多肽的不同V_L和V_H，可形成与不同表型结合的多体scFvs (Kriangkum等，2001，Biomol.Eng.18:31-40)。已研发的用于生产单链抗体的技术包括美国专利号4946778；Bird，1988，Science 242:423；Huston等， 1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Ward等，1989，Nature 334:544-546；de Graaf等，2002，Methods Mol Biol.178:379-87申描述的那些。来源于本文提供的抗体的单链抗体包括但不限于包含可变结构域组合 L1H1的scFvs，均涵盖于本文。

也可通过抗体的蛋白水解作用例如根据传统方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整的抗体获得来源于抗体的抗原结合片段。举例而言，可用胃蛋白酶酶裂解抗体提供称作F(ab’)2的SS片段生产抗体片段。可使用巯基还原剂进一步裂解这一片段产生3.5S Fab’单价片段。可选择的方案有，使用巯基保护基团进行该裂解反应得到二硫键的裂解；另外还可以使用木瓜蛋白酶的酶裂解直接产生两个单价Fab片段和一个Fc片段。这些方法描述于例如Goldenberg，美国专利号4,331,647，Nisonoff等，1960，Arch.Biochem. Biophys.89:230；Porter，1959，Biochem.J.73:119；Edelman等，Methods in Enzymology l:422(Academic Press，1967)；以及Andrews和Titus,J.A. Current Protocols in Immunology(Coligan等编辑，John Wiley&Sons, 2003)，第2.8,1-2.8.10页和第2.10A.1-2.10A.5页。其它裂解抗体的方法，例如制备重链以形成单价重、轻链片段(Fd)，进一步裂解片段或也可使用其它酶、化学或基因技术，只要片段与可被该完整抗体识别的抗原结合。

另一种形式的抗体片段为包含一个或多个抗体互补决定区(CDRs)的肽。可通过构建编码相关CDR的多肽获得CDRs。例如可通过使用聚合酶链式反应用抗体生成细胞的mRNA作为模板合成可变区制备该类多肽，参见，例如，Larrick等，1991，Methods:A Companionto Methods in Enzymology 2:106；Courtenay-Luck，“Genetic Manipulation ofMonoclonal Antibodies,” Monoclonal Antibodies:Production,Engineering andClinical Application，Ritter等编辑，166页(Cambridge University Press，1995)；和Ward等，“Genetic Manipulation and Expression of Antibodies,”MonoclonalAntibodies: Principles and Applications，Birch等编辑，137页(Wiley-Liss，Inc.，1995)。该抗体片段可进一步包含本文所述抗体的至少一个可变结构域。因此，例如，V区结构域可为单体并且是V_H或V_L结构域，其可以如下文所述的至少等于1x 10^-7M或更高的亲和力独立与GCGR结合。

该可变区结构域可为任何天然可变结构域或其基因工程形式。基因工程形式指使用重组DNA工程技术生产的可变区结构域。该基因工程形式包括例如通过向特异抗体的氨基酸序列插入、缺失或改变从特异抗体可变区产生的。具体实例包括包含只含一个CDR以及任选来自一个抗体的一个或多个框架氨基酸和来自另一抗体的可变区结构域剩余部分，并由基因工程组装成的可变区结构域。

可变区结构域可与至少一个其它抗体结构域或其片段在C端氨基酸共价连接。因此，举例而言，存在于可变区结构域的V_H结构域可与免疫球蛋白C_H1结构域或其片段相连。相似地，V_L结构域可与C_K结构域或其片段相连。以这种方式，例如，该抗体可为Fab片段，其中抗原结合结构域包含它们的C端分别与C_H1和C_K结构域共价连接的联合V_H和V_L结构域。可用其它氨基酸延长C_H1结构域，例如以提供铰链区或如Fab’片段中的部分铰链结构域或提供其它结构域，例如抗体C_H2和C_H3结构域。

抗体的衍生物和变异体

例如可通过随机诱变或通过定点诱变(例如寡聚核苷酸诱导的定点诱变)改变编码对应于氨基酸序列L1和H1的核苷酸序列以产生与未突变多聚核苷酸相比包含一个或多个具体核苷酸替换、缺失或插入的经改变的多聚核苷酸。用于产生该类改变的技术实例描述于Walder等，1986，Gene 42:133；Bauer等，1985，Gene 37:73；Craik,1985,BioTechniques,3:12-19； Smith等，1981,Genetic Engineering:Principles andMethods，Plenum Press；以及美国专利号4518584和4737462。这些和其它方法可用于产生例如与未衍生化抗体相比具有期望性质例如亲和性、亲和力或对GCGR的特异性增强、体内或体外活性或稳定性增强或体内副作用降低的抗GCGR抗体的衍生物。

本文领域的其它抗GCGR抗体衍生物包括抗GCGR抗体或其片段与它蛋白或多肽的共价或聚集结合物，例如通过表达包含与抗GCGR抗体多肽的N端或C端融合的异源多肽的重组融合蛋白。例如，该结合肽可为异源信号(或引导)多肽，例如酵母α因子前导肽或例如表位标签的肽。包含融合蛋白的抗体可包含被添加以辅助抗体的纯化或鉴定的肽(例如多聚组氨酸)。抗体也可与FLAG肽连接，如Hopp等，1988,Bio/Technology 6:1204 和美国专利5011912所述。FLAG肽具有高抗原性并提供被特异单克隆抗体(mAb)可逆结合的表位，允许已表达重组蛋白的快速检测和方便纯化。可商业购买(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)用于制备其中FLAG肽与给定多肽融合的融合蛋白的试剂，在另一个实施方案中，包含一个或多个抗体的寡聚体可用作GCGR拮抗剂或用更高级的寡聚体。寡聚体可以是共价连接的或非共价连接的二聚体、三聚体或更高的寡聚体形式。可使用包含两个或更多个抗体的寡具体，其中一个实例为同型二聚体。其它寡聚体包括异二聚体、同型三聚体、异三聚体、同型四聚体、杂四聚体等。

一个实施方案是针对包含多个抗体的寡聚体，它们通过与抗体融合的肽部分之间的共价或非共价相互作用连接。该类肽可为肽接头(spacers) 或具有促进寡聚化作用性质的肽。亮氨酸拉链和某些来源于抗体的多肽为可促进抗体寡聚化的肽，如下文详细描述。

在具体的实施方案中，寡聚体包含两个至四个抗体。寡聚体的抗体可为任何形式，如上文所述任何形式，例如变异体或片段。优选地，该寡聚体包含具有GCGR结合活性的抗体。

在一个实施方案中，使用来源于免疫球蛋白的多肽制备寡聚体。制备包含一些与抗体衍生多肽(包括Fc结构域)的不同部位融合的异源多肽已描述于例如Ashkenazi等，1991，PNAS USA 88:10535；Byrn等，1990,Nature 344:677；和Hollenbaugh等，Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins, Current Protocols inImmunology,Suppl.4，第10.19.1-10.19.11页。本文的一个实施方案是针对包含两个由融合抗GCGR抗体的胰高血糖素结合片段与抗体的Fc区产生的融合蛋白的二聚体。可通过以下方式制备二聚体：例如在适当的表达载体中插入编码融合蛋白的基因融合，在用重组表达载体转化的宿主细胞中表达该融合基因并允许已表达融合蛋白像抗体分子一样组装，其中Fc部分之间的链间二硫键形成二聚体。

如本文所使用术语“Fc多肽”包括来源于抗体Fc区的天然和突变蛋白形式的多肽。也包括包含促进二聚体化的铰链区的该类多肽的截短形式。包含Fc部分(以及由其形成的寡聚体)的融合蛋白提供了在蛋白A或蛋白G柱子上进行亲和层析法方便纯化的优势。

PCT申请W0 93/10151(以参考形式并于本文)中一种适当的Fc多肽为从N端铰链区延伸至人IgG1抗体的Fc区的天然C端的单链多肽。另一种可用的Fc多肽为美国专利5457035和Baum等，1994,EMBO J.13:3992-4001中描述的Fc突变蛋白。该突变蛋白的氨基酸序列与W0 93/10151中所示天然Fc序列的氨基酸序列相同，除了氨基酸19从亮氨酸变为丙氨酸，氨基酸20从亮氨酸变为谷氨酰胺以及氨基酸22从甘氨酸变为丙氨酸。该突变蛋白表现出对Fc受体的亲和力降低。在其它实施方案中，抗GCGR抗体的重链和/或轻链可被取代为抗体重链和/或轻链的可变部分。

或者，该寡聚体为包含多个抗体的融合蛋白，包含或不包含接头肽 (spacerpeptides)。这些适当的接头肽描述于美国专利4751180和4935233。

制备寡聚抗体的另一种方法涉及使用亮氨酸拉链。亮氨酸拉链结构域为促进它们所存在的蛋白寡聚化作用的肽。最初发现亮氨酸拉链存在于数种DNA结合蛋白中(Landschulz等，1988，Science 240:1759)，此后发现存在于各种不同蛋白中。在已知的亮氨酸拉链中为可二聚体化或三聚体化的天然肽或其衍生物。适用于生产可溶寡聚蛋白的亮氨酸拉链结构域的实例描述于PCT申请W0 94/10308，来源于肺表面活性蛋白D(SPD)的亮氨酸拉链描述于Hoppe筝，1994，FEBS Letters 344:191，以参考形式并于本文。允许与其融合的异源蛋白稳定三聚体化的经修饰的亮氨酸拉链的使用描述于Fanslow等，1994，Semin.Immunol.6:267-78。在一种方法中，在适当的宿主细胞中表达包含与亮氨酸拉链肽融合的抗GCGR抗体片段或衍生物的重组融合蛋白，从培养物上清中收集可溶寡聚抗GCGR抗体片段或其衍生物。

在另一个实施方案中，该抗体衍生物可包含至少本文公开的CDRs之一。举例而言，可将一个或多个CDR整合入已知的抗体骨架区(IgG1，IgG2 等)或与适当的载体结合以增强其半衰期。适当载体包括但不限于Fc、白蛋白、转铁蛋及类似物质。这些和其它适当的载体为本领域已知。该结合 CDR肽可为单体、二聚体、四聚体或其它形式。在一个实施方案中，一个或多个水溶性多聚体在结合剂的一个或多个特异位点结合，例如在氨基端。在一个实例中，抗体衍生物包含一个或多个水溶性多聚体附着物包括但不限于聚乙二醇、聚氧乙烯二醇或聚丙二醇。参见，例如，美国专利号4640835、 4496689、4301144、4670417、4791192和4179337，在一些实施方案中，衍生物包含一个或多个一甲氧基.聚乙二醇、葡聚糖、纤维素或其它基于碳水化合物的聚合物，聚(N-乙烯基吡咯酮).聚乙二醇、聚氧乙烯多元醇 (例如甘油)和聚乙烯醇，以及该类聚合物的混合物。在一些实施方案中，一个或多个水溶性聚合物与一个或多个侧链随机结合。在一些实施方案中。 PEG可提高结合剂例如抗体的治疗作用。一些该类方法描述于例如美国专利号6133426，其以参考形式以任何目的并于本文。

应当理解的是本文提供的抗体可具有至少一个氨基酸替换，只要该抗体保留了结合特异性。因此，抗体结构的修饰包含于本文范畴。这些可包括不破坏抗体GCGR结合能力的氨基酸替换，其可为保守或非保守的。保守氨基酸替换可包括非天然氨基酸残基，其通常经化学肽合成整合而不是生物系统合成。这些包括拟肽和其它反向或倒转形式的氨基酸部分。保守氨基酸替换也可涉及用非天然残基替换天然氨基酸残基这样对该位点氨基酸残基的极性或电荷作用很小或没有作用。非保守替换可涉及一类氨基酸或氨基酸类似物的一个成员与具有不同物理性质(例如，体积、极性、疏水性、电荷)的另一类氨基酸的成员交换。

而且，本领域技术人员可生成在各期望氨基酸残基上包含氨基酸替换的待测变异体。可使用本领域技术人员已知的活性测定法筛选该类变异体。该类变异体可用于收集关于适当变异体的信息。举例而言，如果发现某一氨基酸残基可引起活性破坏、非期望的降低或不当的活性，可避免具有该类变化的变异体。换言之，基于从这些常规试验收集的信息，本领域技术人员可轻松确定应避免进一步替换(单独或与其它突变组合)的氨基酸。

技术人员可使用已知技术确定如本文所列的多肽的适当变异体。在一些实施方案中，本领域技术人员可通过靶向对于活性不重要的区域鉴定经改变后不会破坏活性的分子适当区域。在一些实施方案中，可鉴定在相似多肽中保守的残基或分子部分。在一些实施方案中，甚至可保守替换对于生物活性或结构重要的区域而不破坏生物活性或不会有不利作用于多肽结构。此外，本领域技术人员可考察结构.功能研究鉴定对活性或结构重要的相似多肽中的残基。鉴于这一对比，可预测对应于在相似蛋白中对活性或结构重要的氨基酸残基的蛋白质中氨基酸残基的重要性。本领域技术人员可为这些经预测重要的氨基酸残基选择化学相似氨基酸替换。

本领域技术人员也可分析与相似多肽的结构相关的三维结构和氨基酸序列。鉴于该类信息，本领域技术人员可预测就三维结构而言抗体的氨基酸残基比对。在一些实施方案中，本领域技术人员可选择不对经预测在蛋白质表面的氨基酸残基进行显著改变，因为该类残基可能参与与其它分子的重要相互作用。许多科学出版物致力于二级结构的预测。参见，Moult， 1996，Curr.Op.Biotech.7:422-427，Chou等，1974，Biochemistry 13:222-245； Chou等，1974，Biochemistry 113:211-222；Chou等，1978，Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.47:45-148；Chou等，1979，Ann.Rev.Biochem.47:251-276 和Chou等，Biophys.J.26:367-384。此外，目前可使用计算机程序辅助预测二级结构。举例而言，序列同一性大于30％或相似性大于40％的两个多肽或蛋白质通常具有相似的高级结构。近期蛋白结构数据库(PDB)的增长增强了二级结构的可预测性，包括多肽或蛋白结构中潜在的折叠数量。参见， Holm等，1999，Nucl.Acid.Res.27:244-247。已表明(Brenner等，1997，Curr.Op.Struct.Biol.7:369-376)在给定多肽或蛋白质中存在有限数量的折叠并且一旦确定了临界数量的结构，结构预测将变得显著更加精确。

预测二级结构的其它方法包括“穿接(threading)”(Jones，1997，Curr.Opin.Struct.Biol.,7:377-87；Sippl等，1996，Structure 4:15-19；“图谱分析 (profileanalysis)”(Bowie等，1991，Science 253:164-170；Gribskov等， 1990，Meth.Enzym.183:146-159；Gribskov等，1987，Proc.Nat.Acad.Sci. USA 84:4355-4358和“进化联系(evolutionary linkage)”(参见Holm,supra (1999),and Brenner,supra(1997))。在一些实施方案中，抗体变异体包括糖基化变异体，其中与母体多肽的氨基酸序列相比改变了糖基化位点的数量和/或类型。在一些实施方案中，变异体与天然蛋白质相比具有更多或更少数量的N连接糖基化位点。或者，去除该序列的替换可移除现有的N 连接糖链。也提供了N连接糖链的重排，其中去除了一个或多个N连接糖链位点(通常为天然存在的那些)并创造了一个或多个新的N连接位点。其它优选抗体变异体包括半胱氨酸变异体，与母体氨基酸序列相比其中缺失或由另一氨基酸(例如丝氨酸)替换一个或多个半胱氨酸残基。当抗体必须折叠成生物活性构象时(例如在分离可溶包涵体之后)可用半胱氨酸变异体。半胱氨酸变异体通常比天然蛋白质具有较少的半胱氨酸残基，并通常具有偶数个半胱氨酸以最小化未配对半胱氨酸引起的相互作用。

本领域技术人员可在需要该类替换时确定期望的氨基酸替换(保守或非保守)。在一些实施方案中，氨基酸替换可用于鉴定人GCGR抗体的重要残基或者增加或降低本文所述人GCGR抗体的亲和力。

根据一些实施方案，优选的氨基酸替换为以下：(1)降低蛋白质水解敏感性，(2)降低氧化敏感性，(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲和力， (4)改变结合亲和力和/或(4)赋予或修饰该类多肽上的其它物理化学或功能性质。根据一些实施方案，可在天然存在序列中(在一些实施方案中，在形成分子间接触的结构域之外的多肽部分)进行单个或多个氨基酸替换 (在一些实施方案中为保守氨基酸替换)。在一些实施方案中，保守氨基酸替换通常不会本质上改变母体序列的结构特性(例如，替换氨基酸不应破解存在于母体序列中的螺旋或干扰特征化母体序列的其它类型二级结构)。本领域认可的多肽二级和三级结构的实例描述于Proteins，Structures and Molecular Principles，Creighton编辑，W.H.Freeman and Company(1984)； Introduction to Protein Structure，Branden andTooze编辑,Garland Publishing (1991)；以及Thornton等，1991,Nature 354:105，其以参考形式并于本文。

在一些实施方案中，本文提供的抗体可与多聚体、脂类或其它部分 (moieties)化学键合。

抗原结合试剂可包含至少一个本文描述的CDRs，其掺入生物相容性骨架结构中。在一个实例中，该生物相容性骨架结构包含足以形成构象稳定结构支持或骨架或支架的多肽或其部分，其可在局限的表面区域展示可与抗原结合的一个或多个氨基酸序列(例如，CDRs、可变区等)。该类结构可为天然存在多肽或多肽“折叠”(结构基序)，或相对与天然多肽或折叠可具有一个或多个修饰，例如氨基酸添加、缺失或替换。这些支架可来源于任何物种(或多于一个物种)的多肽，例如，人类、其它哺乳动物、其它脊椎动物、无脊椎动物、细菌或病毒。

生物可溶性骨架结构通常是基于蛋白质支架或骨架而不是免疫球蛋白结构域。举例而言，可使用基于纤维结合素、锚蛋白、脂质运载蛋白 (lipocalin)、新抑癌蛋白、细胞色素b、CP1锌指蛋白、PST1、卷曲螺旋、 LACI-D1、Z结构域和淀粉酶抑肽结构域(参见，例如，Nygren和Uhlen,1997, Current Opinion in Structural Biology 7:463-469)。

此外，本领域技术人员可认识到适当的结合剂包括这些抗体的部分，例如一个或多个重链CDR1、CDR2、CDR3，轻链CDR1、CDR2和CDR3，如本文所具体公开。至少一个重链CDR1、CDR2、CDR3、CDR1，CDR2 和CDR3区具有至少一个氨基酸替换，只要该抗体保留了非替换CDR的结合特异性。该抗体的非CDR部分可为非蛋白分子，其中该结合剂交叉阻断本文公开的抗体与人GCGR的结合和/或抑制经该受体的胰高血糖素的信号传导。该抗体的非CDR部分可为非蛋白质分子，其中该抗体在竞争结合测定法中显示出与至少抗体L4H4/L5H5之一所显示相似的与人胰高血糖素肽的结合类型，和/或中和胰高血糖素的活性。抗体的非CDR部分可由氨基酸组成，其中该抗体为重组结合蛋白或合成肽，并且该重组结合蛋白交叉阻断本文公开的抗体与人GCGR的结合和/或中和体内或体外胰高血糖素活性。抗体的非CDR部分可由氨基酸组成，其中该抗体为重组抗体，并且该重组抗体在竞争结合测定法中显示出与至少抗体L4H4/L5H5之一所显示相似的与人GCGR肽的结合类型，和/或中和胰高血糖素信号传导。

GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质

在一个实施方案中，本文提供了一个GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质，其包含一个能与GCGR特异性结合的抗体，和一个，二个，三个，四个，五个，六个，七个，或八个GLP-1片段或反向GLP-1片段；该融合蛋白质通过一肽接头序列(Linker)将一GLP-1片段的羧基端与一GCGR抗体轻链或重链的氨基端连接，或者将一反向GLP-1片段的氨基端与一GCGR 抗体轻链或重链的羧基端连接。

在另一个实施方案中，本文提供了一个GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质，其包含一个与GCGR特异性结合的抗体，和一个，二个，三个，或四个GLP-1片段；该融合蛋白质通过一个肽接头序列(Linker)将一GLP-1 片段的羧基端与一GCGR抗体轻链或重链的氨基端连接。

在另一个实施方案中，本文提供了一个GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质，其包含一个能与GCGR特异性结合的抗体，和一个，二个，三个，或四个反向GLP-1片段；该融合蛋白质通过一个肽接头序列(Linker)将一反向GLP-1片段的氨基端与一GCGR抗体轻链或重链的羧基端连接。

在另一个实施方案中，本文提供了一个GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质，其包含一个能与GCGR特异性结合的抗体，和二个GLP-1片段；该融合蛋白质通过一个肽接头序列(Linker)将一GLP-1片段的羧基端与一 GCGR抗体轻链或者重链的氨基端连接。

在另一个实施方案中，本文提供了一个GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质，其包含一个能与GCGR特异性结合的抗体，和二个反向GLP-1片段；该融合蛋白质通过一个肽接头序列(Linker)将一反向GLP-1片段的氨基端与一GCGR抗体轻链或者重链的羧基端连接。

在另一个实施方案中，本文提供了一个GLP-1融合蛋白质，其包含一个GCGR抗体和二个GLP-1片段；该融合蛋白质通过一个肽接头序列 (Linker)将一GLP-1片段的羧基端与一GCGR抗体轻链的氨基端连接： N'-GLP-1-Linker-R-C'；或者将一GLP-1片段的羧基端和一GCGR抗体重链的氨基端连接：N'-GLP-1-Linker-R-C'；其中:N'代表融合蛋白质多肽链的氨基端,C'代表融合蛋白质多肽链的羧基端,GLP-1代表一GLP-1片段，R 为一GCGR抗体的轻链或者重链的氨基酸序列,及Linker代表一肽接头序列。

另一个实施方案中，本文提供了一个GLP-1融合蛋白质，其包含一个 GCGR抗体和二个反向GLP-1片段；该融合蛋白质通过一个肽接头序列 (Linker)将一反向GLP-1片段的氨基端与一GCGR抗体轻链的羧基端连接： N'-R-Linker-反向GLP-1-C'；或者将一反向GLP-1片段的氨基端和一GCGR 抗体重链的羧基端连接：N'-R-Linker-反向GLP-1-C'；其中:N'代表融合蛋白质多肽链的氨基端,C'代表融合蛋白质多肽链的羧基端,反向GLP-1代表一反向GLP-1片段，R为一GCGR抗体的轻链或者重链的氨基酸序列,及 Linker代表一肽接头序列。

在进一步的实施方案中，本文提供了一个GLP-1融合蛋白质，其包含一个GCGR抗体和二个GLP-1片段；该融合蛋白质通过一个肽接头序列 (Linker)将一GLP-1片段的羧基端与GCGR抗体轻链的氨基端连接： N'-GLP-1-Linker-R-C'；其中:N'代表融合蛋白质多肽链的氨基端,C'代表融合蛋白质多肽链的羧基端,GLP-1代表一GLP-1片段，R为一GCGR抗体的轻链的氨基酸序列,及Linker代表一肽接头序列。

在一实施方案中，在本文提供的GLP-1融合蛋白质中，所述的GLP-1 片段各自独立地选自于以下之一的氨基酸序列：SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ IDNO:122、及SEQ ID NO:123。在一实施方案中，在本文提供的GLP-1融合蛋白质中，所述的反向GLP-1片段各自独立地选自于以下之一的氨基酸序列：SEQ ID NO:127、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、及SEQ ID NO:131。

在一实施方案中，在本文提供的GLP-1融合蛋白质中，所述的肽接头 (Linker)的序列自独立包含从1个至200个氨基酸胺，从2个至100个氨基酸胺，从5个至50个氨基酸胺，从6个至25个氨基酸胺，或从10个至 20个氨基酸胺。

在另一个实施方案中，在本文提供的GLP-1融合蛋白质中，所述的肽接头(Linker)的序列包含全长的、部分的、或者重复的独立选自以下之一的氨基酸序列：SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125、及SEQ ID NO:126。

核酸

一方面，本文提供分离的核酸分子。该核酸分子包含例如编码全部或部分抗体的多聚核苷酸，例如本文抗体或GLP-1融合蛋白质的一条链或两条链，或其片段、衍生物、突变蛋白或变异体；足以用作杂交探针的多聚核苷酸；PCR引物或用于鉴定、分析、突变或扩增编码多肽的多聚核苷酸的测序引物；用于抑制多聚核苷酸表达的反义核酸以及其互补序列。该核酸可为任何长度。例如它们的长度可为5、10、15、20、25、30、35、40、 45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、 750、1000、1500、3000、5000或更多个核苷酸，和/或包含一个或多个附加序列，例如调控序列，和/或是较大核酸例如载体的一部分。该核酸可为单链或双链并包含RNA和/或DNA核苷酸以及其人工变异体(例如，肽核酸)。

可从经GCGR抗原免疫的小鼠B细胞中分离编码抗体多肽(例如，重链或轻链、仅可变结构域或全长)的核酸。可通过常规方法例如聚合酶链式反应(PCR)分离抗体或GLP-1融合蛋白质的核酸。

编码重链和轻链可变区的核酸序列如上文所示。熟练的技术人员可理解由于遗传密码的简并性，本文公开的各多肽序列可由更多数量的其他核酸序列编码。本文提供编码本文提供的抗体或GLP-1融合蛋白质的各简并核苷酸序列。

本文进一步提供在具体杂交条件下与其他核酸(例如，包含任何 L4H4/L5H5的核苷酸序列的核酸)杂交的核酸。杂交核酸的方法为本领域熟知。参见，例如，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Son (1989)，6.3.1-6.3.6。如本文定义，例如，中等严格条件使用包含5x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)的预洗溶液、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)、约 50％甲酰胺的杂交缓冲液、6x SSC和55℃的杂交温度(或其他相似的杂交溶液，例如包含绚50％甲酰胺的，以42℃杂交)，并且洗脱条件为60℃，使用0.5x SSC、0.1％SDS。严格杂交条件在6x SSC中于45℃杂交，然后于68℃在0.1x SSC、0.2％SDS中洗涤一次或多次。此外，本领域技术人员可操作杂交和/或洗涤条件以增加或降低杂交严格度这样包含相互之间至少65、70、75、80、85、90、95、98或99％同源的核苷酸序列的核酸通常仍可以相互杂交。影响杂交条件选择的基本参数和设计适当条件的指导列于例如Sambrook，Fritsch和Maniatis，1989，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press，第9和11章；Current Protocols in Molecular Biology，1995，Ausubel等编辑，John Wiley&Sons，Inc.，第 2.10和6.3-6.4节)并可由具有本领域普通技术的人员基于例如DNA的长度和/或碱基组成轻松确定。可通过突变在核酸中引入变化，藉此导致其编码的多肽(例如，抗原结合蛋白)氨基酸序列的变化。可使用本领域已知的任何技术引入突变。在一个实施方案中，使用例如定点诱变方案改变一个或多个具体氨基酸残基。在另一个实施方案中，使用例如随机诱变方案改变一个或多个随机选择的残基。无论其如何生成，可表达突变多肽并筛选期望性质。

可将突变引入核酸而不显著改变其编码多肽的生物学活性。例如，可进行引起非必需氨基酸残基处氨基酸替换的核苷酸替换。在一个实施方案中，突变本文为L1至L10和H1至H7或GLP-1融合蛋白质提供的核苷酸序列或其片段、变异体或衍生物这样其编码包含本文所示L1至L10和H1 至H7的氨基酸残基的一个或多个缺失或替换，成为两个或多个序列相异的残基。在另一个实施方案中，诱变作用在本文所示L1至L10和H1至H7 或GLP-1融合蛋白质的一个或多个氨基酸残基附近插入一个氨基酸成为两个或多个序列相异的残基。或者，可将一个或多个突变引入核酸以选择性改变其编码多肽的生物学活性(例如，与GCGR结合)。例如，该突变可在数量上或性质上改变生物学活性。量变的实例包括增加、降低或消除该活性。质变的实例包括改变抗体或GLP-1融合蛋白质的抗原特异性。

在另一方面，本文提供适于用做引物或检测本文核酸序列的杂交探针的核酸分子。本文的核酸分子可仅包含编码本文全长多肽的核酸序列的一部分，例如，可用作探针或引物或编码本文多肽活性部分的片段(例如， GCGR结合部分)的片段。

基于本文核酸序列的探针可用于检测该核酸或相似核酸，例如编码本文多肽的转录物。该探针可包含标记基团，例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。该类探针可用于鉴定表达该多肽的细胞。

在另一方面本文提供包含编码本文多肽或其部分的核酸的载体。载体的实例包括但是不限于质粒、病毒载体、非游离基因哺乳动物载体和表达载体，例如重组表达载体。

本文的重组表达载体可包含适于该核酸在宿主细胞中表达的形式的本文核酸。该重组表达载体包括一个或多个调控序列，基于用于表达的宿主细胞进行筛选，其与该预表达的核酸序列可操作性相连。调控序列包括引导核苷酸序列在多个种类宿主细胞中组成型表达的(例如，SV40早期基因增强剂、劳斯氏肉瘤病毒启动子和细胞巨化病毒启动子)，引导仅在某些宿主细胞中核苷酸序列的表达的(例如，组织特异调控序列，参见Voss等， 1986，Trends Biochem.Sci.11:287，Maniatis等，1987，Science 236:1237，其完整内容以参考形式并于本文)以及引导核苷酸序列响应具体处理或条件的诱导型表达的(例如，哺乳动物细胞中的金属硫堇启动子和原核和真核系统二者中的四环霉素反应(tet-sesponsive)启动子和/或链霉素反应启动子(同前))。本领域技术人员应理解表达载体的设计取决于例如用于转化的宿主细胞的选择、所需蛋白表达水平等因素。本文的表达载体可引入宿主细胞，藉此生产由本文所述核酸编码的蛋白或肽，包括融合蛋白或肽。

另一方面，本文提供可引入本文表达载体的宿主细胞。宿主细胞可为任何原核或真核细胞。原核宿主细胞包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或杆菌。更高级的真核细胞包括昆虫细胞、酵母细胞以及哺乳动物源的确立细胞系。适当哺乳动物宿主细胞系的实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或它们的衍生物例如Veggie CHO和在无血清培养基中生长的相关细胞系(参见Rasmussen等，1998，Cytotechnology 28:31)或CHO 株DXB-11，其缺失DHFR(参见Urlaub等，1980，Proc.Natl.Acad,Sci.USA 77:4216-20)。其它CHO细胞系包括CHO-K1(ATCC#CCL-61)、EM9(ATCC #CRL-1861)，和UV20(ATCC#CRL-1862)，其它宿主细胞包括猴肾细胞的COS-7系(ATCC#CRL-1651)(参见Gluzman等，1981，Cell 23:175)、 L细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL-163)，AM-1/D细胞(描述于美国专利序列号6210924)、HeLa细胞、BHK(ATCC CRL-10)细胞系、来源于非洲绿猴肾细胞系CV1的CV1/EBNA细胞系(ATCC CCL-70)(参见McMahan等，1991，EMBO J.10:2821)、人胚肾细胞例如293，293EBNA 或MSR 293、人上皮A431细胞、人C010205细胞、其它经转化灵长动物细胞系、正常二倍体细胞、来源于初生组织体外培养物的细胞株、初移植体、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。用于细菌、真菌、酵母和哺乳细胞宿主的适当克隆和表达载体描述于Pouwels等(CloningVectors:A Laboratory Manual,Elsevier,1985)。

可通过传统转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。对于稳定的哺乳动物转染而言，取决于使用的表达载体和转染技术，已知只有一小部分细胞可将外源DNA鏊合入它们的基因组中。为了鉴定和筛选这些整合子，通常将编码筛选标记(例如抗生素抗性)的基因与所关注基因一起引入宿主细胞。优选的筛选标记包括可赋予药物(如G418、潮霉素和甲氨喋呤)抗性的那些。在其它方法中可通过药物筛选鉴别包含被引入核酸的稳定转染细胞(例如，整合了筛选基因的细胞可存活，而其它细胞则死亡)。

可在提高多肽表达的条件下培养已转化细胞，可通过常规蛋白纯化方法回收多肽。一种该纯化方法描述于下文实施例。预用于本文的多肽包括基本同源的重组哺乳动物抗GCGR抗体或GLP-1融合蛋白质多肽，其基本不含污染性内源材料。

GCGR抗体的活性

GCGR抗体的活性是指本文提供的抗体具有与GCGR特异性结合，抑制或者阻断胰高血糖素信号传导后显示出的治疗性作用，例如治疗高血糖症、二型糖尿病、代谢综合症、和血脂异常。术语“降低胰高血糖素信号传导的生物学活性”或者“抑制或阻断胰高血糖素信号传导的生物学活性”指 GCGR抗体或其与GLP-1融合蛋白质在体内与GCGR结合并抑制或者阻断胰高血糖素引起该受体下游的细胞应急反应。反应包括但是不限于降低肝糖原输出、降低血糖、以及相关的脂肪代谢变化。在一个实施方案中，本文提供了能与人GCGR特异性结合的鼠源抗体或人源化抗体。该类抗体包括可减少或中和胰高血糖素信号传导的拮抗或中和抗体。

在一个实施方案中，本文提供的抗体与人GCGR结合时的K_d为大约 0.01nM至大约1000nM、大约0.1nM至大约500nM、大约0.5nM至大约 200nM、大约1nM至大约200nM、或大约10nM至大约100nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗体与人GCGR结合时的K_d为大约1nM至大约200nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗体与人GCGR结合时的 K_d为大约1nM至大约100nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗体与人GCGR结合时的K_d为大约1nM、大约2nM、大约5nM、大约10nM、大约20nM、大约30nM、大约40nM、大约50nM、大约60nM、大约70 nM、大约80nM、大约90nM、或大约100nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗体与人GCGR结合时的K_d为大约100nM、大约110nM、大约 120nM、大约130nM、大约140nM、大约150nM、大约160nM、大约170nM、大约180nM、大约190nM、或大约200nM。

在一个实施方案中，本文提供的抗体在降低人胰高血糖素信号传导的 IC₅₀值为大约0.01nM至大约500nM、大约0.1nM至大约200nM、大约 0.5nM至大约200nM、大约1nM至大约200nM、或大约10nM至大约 100nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗体在降低人胰高血糖素信号传导的IC₅₀值为大约1nM至大约200nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗体在降低人胰高血糖素信号传导的IC₅₀值为大约10nM至大约100 nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗体在降低人胰高血糖素信号传导的IC₅₀值为大约1nM、大约2nM、大约5nM、大约10nM、大约20nM、大约30nM、大约40nM、大约50nM、大约60nM、大约70nM、大约80 nM、大约90nM、或大约100nM。在另一个实施方案中，本文提供的抗体在降低人胰高血糖素信号传导的IC₅₀值为大约100nM、大约110nM、大约120nM、大约130nM、大约140nM、大约150nM、大约160nM、大约170nM、大约180nM、大约190nM、或大约200nM。

在一个实施方式中，本文提供的GCGR抗体与人GCGR结合时，具有一个或多个以下所列的性质：

a.当与人GCGR结合时以与所述参比抗体基本类似的K_d；

b.当抑制人GCGR的胰高血糖素激活时以与所述参比抗体基本类似的IC₅₀；和

c.在人GCGR上与所述参比抗体交叉竞争结合。

在一个实施方式中,所述参比抗体包含轻链可变结构域氨基酸序列 SEQ ID NO:87和重链可变结构域氨基酸序列SEQ ID NO:97的组合。在另一实施方式中,所述参比抗体为单克隆抗体L4H4、L5H5、或L7H7。

在本文中，术语“基本相似”意为与参比抗体的IC₅₀或K_d可比或是参比抗体的IC₅₀或K_d值的大约200％、大约180％、大约160％、大约150％、大约140％、大约120％、大约110％、大约100％、大约99％、大约98％、大约97％、大约95％、大约90％、大约85％、大约80％、大约75％、大约 70％、大约65％、或大约50％。在一个实施方案中，参比抗体包括，例如，具有轻链SEQ ID NO:87和重链SEQ ID NO:97组合的抗体。在另一个实施方案中，参比抗体包括GCGR抗体L4H4、L5H5、或L7H7。

GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质(GLP-1融合蛋白质)的生物学活性

GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质的生物学活性包含GLP-1的生物学活性和GCGR抗体活性两个方面。GCGR抗体的活性如前文所述。“GLP-1 生物学活性”指GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质在体内结合并激活 GLP-1受体并引起细胞应激反应，并显示出治疗作用的生物学活性，例如高血糖症、二型糖尿病、代谢综合症和包括血脂异常的其它相关症状。前述细胞应激反应包括但是不限于降低肝糖原输出、降低血糖，以及相关的脂肪代谢变化。综合了GLP-1和GCGR抗体的生物学活性，本文所述的 GLP-1融合蛋白质可以用于治疗多种与GLP-1R和GCGR相关联的疾病和病症。该融合蛋白质通过作用于GLP-1R和/或GCGR发挥其生物学作用，因此可以用本文所述的GLP-1融合蛋白质治疗对“增加GLP-1R刺激”或对“降低GCGR刺激”做出有利应答的疾病和病症的受试者。这些受试者称为“需要GLP-1R刺激治疗”或“需要降低GCGR刺激”的受试者。包括高血糖症、二型糖尿病、代谢综合症、和血脂异常的其它相关症状。

在一个实施方案中，GCGR抗体或GLP-1融合蛋白质的生物学活性变化是用直接cAMP检测方法来检测的，量化GCGR抗体或GLP-1融合蛋白质在体外抑制GCGR的功能。

药物组合物

在一个实施方案中，本文提供了一药物组合物，其中包含本文提供的一个GCGR抗体及一种或多种可药用载体。

在另一个实施方案中，本文提供了一药物组合物，其包括本文提供的一个GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质，与一种或多种可药用载体。

本文所使用的术语“载体”包括载体、药用辅料或者在使用的剂量和浓度下将细胞或哺乳动物暴露于其中无害的稳定剂。

治疗方法

在一个实施方案中，本文提供了治疗、预防、或改善二型糖尿病的方法，其包括给予受试者治疗有效量的本文提供的GCGR抗体或其药用组合物。

在另一个实施方案中，本文提供了治疗、预防、或改善二型糖尿病的方法，其包括给予受试者治疗有效量的本文提供的GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质,或其药用组合物。

在另一个实施方案中，本文提供了治疗、预防、或改善高血糖症的方法，其包括给予受试者治疗有效量的本文提供的GCGR抗体，或其药用组合物。

在另一个实施方案中，本文提供了治疗、预防、或改善高血糖症的方法，其包括给予受试者治疗有效量的本文提供的GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质,或其药用组合物。

在另一个实施方案中，本文提供了治疗、预防、或改善代谢综合症的方法，其包括给予受试者治疗有效量的本文提供的GCGR抗体,或其药用组合物。

在另一个实施方案中，本文提供了治疗、预防、或改善代谢综合症的方法，其包括给予受试者治疗有效量的本文提供的GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质,或其药用组合物。

在另一个实施方案中，本文提供了治疗、预防、或改善血脂异常的方法，其包括给予受试者治疗有效量的本文提供的GCGR抗体，或其药用组合物。

在进一步的实施方案中，本文提供了治疗、预防、或改善血脂异常的方法，其包括给予受试者治疗有效量的本文提供的GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质,或其药用组合物。

在本文提供的任意一项用途，其所述的药用组合物是用于静脉或皮下注射。

本文中，术语“受试者”指哺乳动物，包括人类，可与术语“患者”交替使用。

术语“治疗”包括减轻或预防至少一种症状或病症的其它方面，或者减轻疾病严重性。本文提供的GCGR抗体或GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质不需要产生完全治愈的效果，或根除疾病的所有症状或表现，即可构成有效治疗剂。如相关领域所公认，作为治疗剂的药物可减少给定疾病状态的严重程度，但不需消除疾病的所有表现即可被认为是有效的治疗剂。相似地，预防给药治疗不需在预防症状出现上完全有效即可构成有效预防剂。只减少疾病的影响(例如，通过减少其症状的数量或严重度，或通过提高另一治疗效果，或通过产生另一有效作用)，或者减少受试者中疾病发生或加重的可能性就已经足够。本文的一个实施方案涉及包含以足以诱导反应具体病症严重性的指示剂高于基线水平的持续改善的量和时间给予患者GCGR抗体或GCGR抗体与GLP-1融合蛋白质的方法。

GCGR抗体或GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质药物组合物可采用任意适当技术包括但不限于肠道外、局部或吸入给药。如果是注射，可通过例如关节内、静脉内、肌肉内、损伤区内、腹膜内或皮下途径，以快速注射或连续输注给予药用组合物。可考虑例如在疾病或损伤部位局部给药，如透皮给药和埋植剂持续释放给药。吸入给药包括例如鼻腔或口腔吸入、采用喷雾剂、以气雾剂形式吸入抗体等等。其它选择包括口腔制剂包括片剂、糖浆剂或锭剂。

以包含一个或更多其它组分例如生理学可接受载体、辅料或稀释剂的组合物形式给予本文提供的GCGR抗体或GLP-1融合蛋白质是有利的。组合物可任选额外包含一个或更多如下所述的生理学活性剂。在多个具体实施方案中，组合物包含除一个或更多本文提供的抗体(例如鼠源抗体或人源化抗体)或GLP-1融合蛋白质之外的一个、两个、三个、四个、五个或六个生理学活性剂。

在一个实施方案中，药物组合物包含本文提供的鼠源抗体或人源化抗体或GLP-1融合蛋白质以及一个或更多选自以下的物质：pH适合于抗体或 GLP-1融合蛋白质的缓冲液、抗氧化剂例如抗坏血酸、低分子量多肽(例如含少于10个氨基酸的多肽)、蛋白质、氨基酸、糖例如糊精、络合物例如EDTA、谷胱甘肽、稳定剂和辅料。根据适当工业标准，也可加入防腐剂。可使用适当辅料溶液作为稀释剂将组合物配制成冻干粉末。适当组分在所用剂量和浓度下对受者无毒。可用于药物处方组分的进一步实例见 Remington'sPharmaceutical Sciences，第16版(1980)和20版(2000)，Mack Publishing Company提供医学从业者使用的试剂盒，其包括一种或更多本文提供的抗体或GLP-1融合蛋白质以及治疗本文讨论任何病症的标签或其它说明。在一个实施方案中，试剂盒包括以上述组合物形式装在一个或多个管型瓶中的一种或多种抗体或GLP-1融合蛋白质的无菌制剂。

给药剂量和频率可根据以下因素而改变：给药途径、所用具体抗体或 GLP-1融合蛋白质、所治疾病的性质和严重度、症状为急性还是慢性以及患者的体积和总体症状。可通过本领域熟知的方法确定适当剂量，例如在临床试验中包括剂量放大研究。

本文提供的抗体或GLP-1融合蛋白质可在例如一段时间内按规律间隔给药一次或多次。在具体实施方案中，在至少一个月或更长时间给药一次给予鼠源抗体或人源化抗体或GLP-1融合蛋白质，例如一个、两个或三个月或者甚至不确定。对于治疗慢性症状，长期治疗通常最有效。但是，对于治疗急性症状，短期给药例如从一周至六周就已足够。通常，给予人类抗体直至患者表现出所选体征或指示剂高于基线水平的医学相关改善度为止。

本文提供的治疗方案的一个实例包括以适当剂量一周一次或者更长的皮下注射抗体或GLP-1融合蛋白质治疗高血糖症、二型糖尿病、代谢综合症和包括血脂异常等引起的症状。可持续每周或每月给予抗体或GLP-1融合蛋白质直到达到所需结果例如病人症状消退。可按需要重新治疗，或者，可选择地，给予维持剂量。

可在使用抗体或GLP-1融合蛋白质例如人类抗体或GLP-1融合蛋白质治疗之前、进行中和/或之后监测病人的血糖浓度、体重，以检测其压力的任何变化。对于某些病症，血糖的变化可随例如疾病进程等因素而变化。可用已知技术测定其血糖浓度。

本文的方法和组合物的具体实施方案涉及使用例如抗体或GLP-1融合蛋白质和一个或多个胰高血糖素拮抗剂、两个或更多本文提供的抗体或 GLP-1融合蛋白质，或者本发明抗体或GLP-1融合蛋白质和一个或更多其它胰高血糖素拮抗剂。在进一步的实施方案中，单独或与其它用于治疗使患者痛苦的症状的药剂组合给予抗体或GLP-1融合蛋白质。这些药剂的实例包括蛋白质以及非蛋白质药物。当联合给予多种药物时，如本领域所熟知其剂量应相应调整。“联合给药”组合疗法不限于同时给药，也包括在涉及给予患者至少一种其它治疗剂的疗程中至少给予一次抗原和蛋白的治疗方案。

另一方面，本文提供制备治疗高血糖症、二型糖尿病、代谢综合症、和血脂异常及相关病症药剂的方法，其包含本文提供的抗体或GLP-1融合蛋白质与药学可接受辅料中的混合物，用于治疗上述疾病的相关病症。药剂制备方法如上所述。

本文进一步提供可特异性结合至人GCGR的抗体或GLP-1融合蛋白质相关的组合物、试剂盒和方法。也提供了核酸分子及其衍生物和片段，其包含编码与GCGR结合的多肽的全部或部分的多聚核苷酸，例如编码全部或部分抗GCGR抗体、抗体片段、抗体衍生物或GLP-1融合蛋白质的核酸。本文进一步提供包含该类核酸的载体和质粒以及包含该类核酸和/或载体和质粒的细胞和细胞系。所提供方法包括，例如，制备、鉴定或分离与人 GCGR结合的抗体或GLP-1融合蛋白质例如抗GCGR抗体或GLP-1融合蛋白质的方法，测定该抗体或GLP-1融合蛋白质是否与GCGR结合的方法、以及将与GCGR结合的抗体或GLP-1融合蛋白质给予动物模型的方法。

下面通过具体实例，对本文的技术方案作进一步的说明。

本文中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

1、免疫用抗原的制备

接种CHO-DHFR-细胞至6孔板中。培养24小时(hr)后，细胞中转染克隆有hGCGR基因(核苷酸序列见SEQ ID NO:77及氨基酸序列见SEQ ID NO:73)的pTM15质粒。转染是按照Invitrogen公司推荐Lipofectamine 2000 的转染条件进行。48hr后，再换为含有10nM MTX的完全培养基，每隔3 天(d)换液，待两周左右，出现稳定生长的克隆，消化分散细胞集落，待长至50％愈合度时，逐渐提高MTX的浓度进行加压筛选，直至MTX的浓度为300nM。待两周左右，出现稳定生长的克隆。消化分散细胞集落，将细胞传代，继续培养细胞,待传代细胞长至100％愈合度。利用V5标签的抗体 (Life Technologies)对构建的稳定细胞株分别进行FACS检测，根据FACS 检测结果鉴定加压后的细胞群体。筛选后的CHO-DHFR-hGCGR细胞膜上有大量hGCGR表达。最后经过亚克隆和进一步鉴定后，选出2株hGCGR细胞为高表达的稳定细胞株。这些高表达hGCGR的细胞株可被作为制备抗体的免疫原(参考实施例2)。此外，在某些实施方案中，hGCGR胞外区和hIgG Fc的融合蛋白也可以作为制备抗体的免疫原，其制备方法如下：亚克隆 hGCGR胞外区,hIgG2Fc和肽接头(Linker)的融合蛋白序列基因于pTM5 质粒。通过悬浮HEK293细胞进行大量瞬时表达，获得细胞上清液，然后通过亲和层析纯化得到hGCGR胞外区融合蛋白。

2、抗体的制备

将免疫原和氢氧化铝佐剂混匀，皮下注射BALB/c小鼠(6-8周龄)，此后每周加强免疫小鼠一次。经过总共6次免疫后，通过剪尾的方式采血。离心分离血清，用FACS检测血清效价。达到适合抗体滴度时，断颈处死小鼠，无菌状态下获取脾脏细胞。另外收集生长状态处于对数生长期的 SP2/0细胞，离心细胞，将沉淀细胞用无血清培养至重悬，再次离心-重悬，计数。混合脾脏细胞和SP2/0细胞，保证SP2/0和脾脏细胞数量接近，混合以后再“洗涤-离心”3次。弹散最后一次离心后的细胞沉淀，逐滴加入预温的PEG-1500，上下吹吸后，缓慢加入30mL预热的无血清培养基以终止 PEG的融合作用。再次离心后弹散细胞沉淀，加入融合培养基，将脾细胞和饲养层细胞铺于96孔板中,每孔加入100μL培养基。融合后的杂交瘤细胞和饲养层细胞一起在96孔板中进行培养，并进行HAT(次黄嘌呤、氨甲喋呤和胸苷)筛选，以除去非融合的细胞。10d后收取培养板中的杂交瘤细胞上清进行ELISA检测。

3、ELISA筛选抗体

将过表达hGCGR的CHO-DHFR-hGCGR细胞和不表达hGCGR的 CHO-DHFR-细胞分别接种至96孔板。待细胞长至90％愈合度，除去细胞培养上清，PBS洗两遍，加入100％甲醇4℃固定，然后加入100μL新鲜配制的0.6％H₂O₂-PBS，室温处理20分钟(min)，PBS洗两遍。经过1％BSA (溶于PBS中)封闭后，加入杂交瘤细胞上清4℃孵育90min。多次洗涤后，每孔加入100μL稀释的羊抗鼠Fc-HRP二抗(Sigma-Aldrich)，37℃孵育30min。洗涤5次后,每孔加入100μLTMB显色底物，37℃反应15 min，加入50μL 2M H₂SO₄终止显色，读取OD 450值。此外，在某些实施方案中，使用包含hGCGR的N端结构域的氨基酸序列与hFc的融合蛋白作为包被抗原，包被96孔板。经过1％BSA(溶于PBS中)封闭后，加入杂交瘤细胞上清4℃孵育90min。之后步骤同上述ELISA方法筛选抗 hGCGR单克隆抗体。阳性对照为免疫小鼠的血清；阴性对照为细胞培养基上清。经过ELISA的初步检测，筛选到了数个分泌抗hGCGR抗体的阳性杂交瘤细胞株。选取这些分泌抗hGCGR抗体的杂交瘤株，进行克隆化以获得能稳定分泌抗hGCGR抗体的细胞株。最后选取阳性杂交瘤细胞制备的腹水抗体进行FACS验证(参考实例10)。

4、抗体基因的克隆及亚克隆

收集分泌抗体的杂交瘤细胞，按照QIAGEN的mRNA抽提试剂盒操作规程，提取杂交瘤细胞的mRNA。然后将提取后的mRNA反转录成cDNA，逆转录引物为小鼠轻、重链恒定区的特异性引物，重链逆转录引物为 (5’-TTTGGRGGGAAGATGAAGAC-3’)，轻链逆转录引物为 (5’-TTAACACTCTCCCCTGTTGAA-3’)和(5’- TTAACACTCATTCCTGTTGAA-3’)。RT-PCR的反应条件为：25℃5min； 50℃60min；70℃15min。将反转录的cDNA用0.1mM的TE稀释至500 μL，加入到超滤离心管(Amicon Ultra-0.5)中，2000g离心10min；弃滤液，再加500μL的0.1mM的TE，2000g离心10min；弃滤液，将制备管倒置到新的离心管中，2000g离心10min，得到纯化后的cDNA；取10μL 的纯化后的cDNA作为模板，加入4μL的5x tailing buffer(Promega)，4μL 的dATP(1mM)和10U的末端转移酶(Promega)后混匀，37℃孵育5min 后再65℃孵育5min；然后以加上PolyA尾的cDNA为模板，PCR扩增抗体的轻、重链可变区基因。上游引物均为OligodT，重链下游引物为 (5’-TGGACAGGGATCCAGAGTTCC-3’)和(5’- TGGACAGGGCTCCATAGTTCC-3’)，轻链下游引物为(5’- ACTCGTCCTTGGTCAACGTG-3’)。PCR反应条件：95℃5min；95℃30 s，56℃30s，72℃1min 40cycles；72℃7min；PCR产物连接到PMD 18-T 载体(Takara Bio)后进行测序。基于已测序得到的抗体的DNA序列设计 PCR引物，从而将完整轻链、重链信号肽和可变域以及小鼠IgG1恒定区与表达载体pTM5相连。

5、抗体的人源化及优化

首先，根据筛选所得的鼠源抗体轻、重链可变区序列，使用NCBI数据库搜索与筛选所得的鼠源的抗体可变区序列同源的人源抗体生殖细胞系基因序列(Ig Germline GeneSequence)，并将除CDR序列外，同源性最高的人源基因序列做为模板序列进行CDR嫁接，得到人源化的抗体可变区序列。合成人源化抗体轻、重链的基因，与人IgG2或者IgG4恒定区序列拼接后得到完整的重组人源化抗体序列。重组抗体按照实例8进行表达，并按照步骤10中的FACS技术验证其针对GCGR的亲和力，遴选出亲和力表现最优秀的抗体。最后通过定点突变，对人源化抗体的可变区序列进行改造，进一步提高其对GCGR的亲和力。

6、人源化hGCGR抗体的基因克隆与亚克隆

优化后的人源化抗体重链及轻链可变区序列外包合成。合成时重链可变区5’端带入Nhe1酶切位点，3’端带入Sal1酶切位点，从而将完整的重链可变区序列与已装入重链恒定区的表达载体pTM5相连。同样，合成时轻链可变区5’端带入Nhe1酶切位点，3’端带入Bsiw1酶切位点，从而将完整的轻链可变区序列与已装入轻链恒定区的表达载体pTM5相连。

7、人源化hGCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质的构建

优化后的人源化抗体在轻链的N端或者C端与GLP-1及其衍生物序列进行融合组成GLP-1融合蛋白质。两者的序列由肽接头序列(Linker)做为桥梁进行连接。信号肽-GLP-1-Linker的核苷酸序列由金斯瑞生物科技有限公司合成。以合成基因为模板，PCR扩增“信号肽-GLP-1-Linker”部分的序列。另以人源化抗体的核苷酸序列为模板，扩增融合蛋白质的抗体部分的序列。然后通过overlapping PCR将融合蛋白质核酸序列的“信号肽-GLP-1-Linker”部分与抗体部分连接，引物两端添加Nhe1和Not1的酶切位点，从而将完整的融合蛋白质序列与表达载体pTM5相连。

8、GCGR抗体和GLP-1的融合蛋白质的瞬时表达

接种5×10⁵/mL的悬浮HEK293或者CHO表达细胞株至转瓶中。经过 37℃，5％CO₂旋转培养24hr后，密度达到1×10⁶/mL后被用于转染。转染过程中使用polyethylenimine(PEI)作为转染介质，将其与的DNA混合。两者混合物在静置孵育15min后被加入到细胞培养中。细胞在接受PEI与 DNA混合物后继续37℃，5％CO₂旋转培养24hr后，向细胞培养液中加入胰蛋白胨作为表达需要的添加物。最后在表达完成后(96hr以上)收集细胞上清用于抗体的纯化分离。

9、GCGR抗体和GLP-1的融合蛋白质的纯化分离

收集的实例8中的细胞上清经过高速(8000rpm)离心去除细胞以及细胞碎片后，再用0.22m滤膜过滤澄清。澄清后的上清被用于纯化。纯化过程由层析仪完成。上清首先流过蛋白A/G亲和层析柱。上清中包含的抗体在此期间与蛋白A/G亲和层析柱的配基相结合后被滞留于柱内。然后用低pH值(小于等于3.0)的洗脱缓冲液灌洗层析柱解离与层析柱结合的抗体。收集到的抗体洗脱液用1M的Tris-HCl迅速中和。得到的抗体洗脱液经过透析后置换成PBS或者其他缓冲体系。

10、流式细胞仪验证功能性GCGR抗体的结合活性

用含10mM EDTA的PBS消化、收集10⁵个CHO-DHFR-hGCGR细胞，分别加入1.5mL EP管，离心后弃上清。阴性对照样本用流式上样缓冲液 (PBS，2％FBS)重悬。阳性处理组细胞每管加200μL特定浓度的hGCGR 抗体，室温孵育；孵育完成后1500rpm离心，弃上清，用流式上样缓冲液洗一次细胞沉淀，再离心，将细胞重悬；向细胞重悬液加入1:50稀释的FITC 标记的羊抗鼠荧光二抗，200μL/孔，室温避光孵育30min；离心，弃上清，再用流式上样缓冲液洗一次，离心，最后用流式上样缓冲液将细胞沉淀重悬，上机检测。重组抗hGCGR的功能性抗体和表达GCGR的CHO-DHFR-CHO-GCGR细胞有特异性结合。图1显示的实验结果中，灰色峰为500nM小鼠腹水抗体L5H5和空白细胞CHO-DHFR-结合的阴性对照，实线峰分别为500nM(1a)、50nM(1b)和5nM(1c)的小鼠腹水抗体L5H5和CHO-DHFR-hGCGR的结合曲线，相对于灰色峰阴性对照有明显右移，证明了L5H5和CHO-DHFR-hGCGR的特异性结合。图2显示的实验结果中，灰色峰为500nM小鼠腹水抗体L4H4和空白细胞 CHO-DHFR-结合的阴性对照，实线峰分别为500nM(2a)、50nM(2b) 和5nM(2c)的小鼠腹水抗体L4H4和CHO-DHFR-hGCGR的结合曲线，相对于灰色峰阴性对照有明显右移，证明了L4H4和CHO-DHFR-hGCGR 的特异性结合。

11、cAMP实验检测GCGR抗体和GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质在体外拮抗GCGR的生物学活性

以每孔30000个接种表达hGCGR的CHO-DHFR-细胞至96孔细胞培养板，置于37℃，5％CO₂培养箱中过夜。第二天除去细胞上清，加入杂交瘤细胞培养上清或梯度稀释的抗体45μL/孔。室温放置30min，再加入胰高血糖素多肽(Phoenix Pharmaceuticals，50pM)45μL/孔。然后将96 孔细胞培养板置于37℃，5％CO₂培养箱中继续孵育30min后，加10μL/ 孔的10％Triton X-100，室温裂解，用排枪混合均匀。采用cAMP试剂盒 (CisBio)检测实验中产生的cAMP。取上述10μL/孔细胞裂解液于白色 384孔板中，加入5μL/孔1:20稀释的cAMP-d2，最后加5μL/孔1:20稀释的Anti-cAMP-Eu3±cryptate，室温孵育1hr。在Envision 2103酶标仪上读取时间分辨荧光665nm/620nm信号比值，然后采用Prism5.0计算IC₅₀值。图3显示了直接cAMP实验检测hGCGR抗体L7H7拮抗胰高血糖素激活 hGCGR信号通路的浓度抑制曲线(IC₅₀＝139nM,R2＝0.99)。

Schild作图分析：采用以上直接cAMP方法，分别固定抗GCGR抗体 (L4H4和L5H5)浓度为3160nM、1000nM、316nM、0nM，连续稀释胰高血糖素(100nM至1fM)，检测存在GCGR抗体的情况下，采用Prism5.0 计算使得胰高血糖素剂量响应曲线2倍右移所需抗体浓度的负对数，即抗体的pA2。图4显示直接cAMP实验检测小鼠腹水GCGR抗体，拮抗梯度稀释的胰高血糖素激活hGCGR信号通路的Schild曲线。随着抗GCGR抗体浓度的提高，胰高血糖素激活其受体的S型曲线有明显的右移。

12、报告基因实验检测GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质在体外激活GLP-1R

以每孔40000个接种共表达hGLP-1R-CRE-Luciferase的CHO-DHFR- 细胞至96孔细胞培养板，37℃培养过夜。第二天除去培养基上清，用无血清培养基清洗细胞表面两次，吸去残液，再加入100L用无血清培养基稀释纯化抗体或GMA102，37℃孵育4小时。刺激结束后，加入100L Bright Glo化学发光底物(Promega)，最后将细胞裂解物转移至白色96孔板，在SpectraMax L酶标仪(Molecular Devices)上读取相对荧光强度。图5显示了报告基因实验检测GCGR抗体/GLP-1融合蛋白质 GLP-1-Linker-L7H7，以及GMA102激活hGLP-1R信号通路的激活性曲线 (EC₅₀分别为106pM和16pM)。其中，GMA102是本公司开发的长效 GLP-1激动剂(Li等，Biochem Pharmacol.2018，150:46-53；CN 201410349725)，具有激活细胞内cAMP信号通路，显著降低小鼠的血糖和体重，正处于临床二期开发阶段。

13、普通ICR小鼠药效试验评估GCGR抗体L4H4单独或联合GMA102 (本公司的GLP-1R抗体与GLP-1的融合蛋白质)的体内药效

各组动物禁食过夜(自由饮水)后，尾尖采血，以罗氏卓越型血糖仪 (下同)测定血糖水平(0min)，之后皮下注射给药(0.1mL/10g体重，正常对照组给予PBS，给药组：L4H4单独使用2.5、5、10mg/kg，或者分别联用GMA102剂量2.5、5mg/kg，GMA102由于是人源化抗体融合蛋白，在小鼠内存在抗药抗体，因而每两天给一次药，鼠源L4H4仅给一次药)，在皮下注射后30min各组动物葡萄糖溶液灌胃(2g/kg，0.1mL/10g体重)，并于糖负荷后30、60和120min尾尖采血，测定血糖水平。给药第2天，为了减少对动物的刺激，仅测定各组动物禁食5h(自由饮水) 后(0min)及葡萄糖负荷后30min的血糖水平。之后连续测定给药四天、六天、八天、十天、十二天后糖负荷后血糖值。

将GMA102和抗GCGR抗体L4H4联用后，表3显示了从第二天到第八天，单用GMA102、L4H4，以及联用GMA102和L4H4都明显降低小鼠的口服糖耐量，而且联用的效果比单用效果更明显，具有协同增效的作用。以血糖浓度变化的线下面积AUC表示(mean±SD),N＝6。

14、高脂饲料诱导的C57BL/6肥胖小鼠药效实验评价L4H4单独或联合GMA102的体内药效

60％高脂饲料诱导C57BL/6小鼠建立肥胖模型(DIO mice)。小鼠购入后正常饮食饲养一周后，随机挑选一定数量的老鼠作为正常对照组给予普通小鼠饲料喂养，剩余动物给予高脂饲料。连续饲喂8周(wk)，每周称量一次体重和进食量。随后将高脂饲料组老鼠按体重随机分组。各组动物禁食过夜(自由饮水)后，尾尖采血，以罗氏卓越型血糖仪(下同)测定血糖水平(0min)，之后皮下注射给药(0.1mL/10g体重，正常对照组给予 PBS，给药组：L4H4单独使用2.5、5mg/kg，GMA102单独使用2.5mg/kg，抗L4H4和低剂量、高剂量的GMA102联用，L4H4每周一次，GMA102 每两天一次给药)。监测动物的体重、耗食量、随机血糖水平、空腹血糖、 OGTT和糖化血红蛋白。图6显示了高脂饲料诱导的C57BL/6肥胖小鼠中单次皮下注射L4H4、GMA102，以及联用GMA102和L4H4都显著降低肥胖小鼠的口服糖耐量，而且联用的效果比单用效果更明显，也具有协同增效的作用。单次用药至两周后，仍然具有明显的降血糖效果，表明L4H4 抗体具有明显长效的作用。注：与模型组组相比，*表示P<0.05，**表示 P<0.01；与L4H4-5mg/kg组相比，Δ表示P<0.05，ΔΔ表示P<0.01；与 GMA102-2.5mg/kg组相比，☆表示P<0.05，☆☆表示P<0.01。

15、GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质在食蟹猴上的药代动力学实验

给予雌雄各半共6只食蟹猴皮下单次GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质注射，剂量为2mg/kg，并在给药前(0min)，给药后2hr，4hr，8hr， 12hr，24hr，2d，4d，6d，8d，10d，12d，18d，28d进行给药侧肢静脉取全血0.6mL置于离心管中在冰上待其自然凝固后离心提取血清，超低温保存(-80℃)至检测为止。血清样品中的GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质的GLP-1部分以及hGCGR抗体部分是用ELISA方法对其进行分别定量，并通过软件分析确定两者在食蟹猴体内的半衰期。

16、高脂饲料诱导的肥胖食蟹猴药效实验评价GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质在灵长类哺乳动物体内的药效

高脂饲料诱导食蟹猴建立肥胖食蟹猴模型(DIO cynomolgus monkey)，用于评价皮下注射给予GLP-1-Linker-L7H7在该动物模型上的体内药效。将高脂饲料组猴子按体重随机分为GLP-1-Linker-L7H7(10mg/kg)给药组和模型组，每两天皮下注射药物1次，共持续8wk，模型组给予等量的空白制剂。实验周期内采集猴子体重、摄食量、血糖以及行为学观察数据。实验周期结束后，检测胆固醇和甘油三酯；检测血清转氨酶、胰岛素、胰高血糖素和糖化血红蛋白等。

提供以上例用于向本领域普通技术人员充分公开和说明如何制造和使用要求保护的实施方式，而不意味着限制本文披露的范围。对本领域技术人员而言显而易见的修饰都在本文权利要求书的范围内。将本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请都通过参考并入本文，就如同每个出版物、专利或专利申请均被具体和单独地通过参考并入本文一样。

序列表

<110> 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司

<120> GCGR抗体及其与GLP-1的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用

<130> 2018

<160> 131

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 1

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ile Tyr Met Tyr

1 5 10

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 2

Asp Thr Ser Asn Leu Val Ser

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

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Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 4

Lys Ser Ser Gln Arg Ile Val His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 5

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 6

Phe Gln Gly Ser His Ile Pro Trp Thr

1 5

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 7

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Phe Gly Phe Ser Phe Met Asn

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<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

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<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

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Gln Gln Ser Lys Glu Ile Pro Phe Thr

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<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

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Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Thr

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<210> 11

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<212> PRT

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Leu His Phe Trp Ser Ser Pro Leu Thr

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<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

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Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

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Ala

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 14

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

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Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr

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<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens(智人)

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Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu

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Ala

<210> 17

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<212> PRT

<213> Homo sapiens(智人)

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Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr

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<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens(智人)

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Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Thr Ser Asn Asn Asn Asn Tyr Leu

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Ala

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<212> PRT

<213> Homo sapiens(智人)

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Gln Gln Tyr Phe Ser Thr Pro Ile Thr

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<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens(智人)

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Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Asn Pro Asn Ser Lys Asn Tyr Phe

1 5 10 15

Ala

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens(智人)

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Gln Gln Tyr Tyr Ile Thr Pro Tyr Thr

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<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

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Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe Gly Met His

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<210> 23

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 23

Tyr Ile Ser Arg Gly Ser Ser Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 24

<211> 14

<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 24

Thr Pro Tyr Asp Tyr Asp Gly Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 25

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 25

Gly Tyr Ala Leu Thr Asn Tyr Trp Ile Asp

1 5 10

<210> 26

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 26

Asn Val Tyr Pro Glu Gly Gly Phe Val Asn Tyr Asn Glu Asn Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 27

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 27

Asp Tyr Asp Gly Phe Asp Phe

1 5

<210> 28

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 28

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Ile Met His

1 5 10

<210> 29

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 29

Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Glu Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Ala Phe Glu

1 5 10 15

Asp

<210> 30

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 30

Asp Thr Thr Ile Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 31

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 31

Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala Trp Thr

1 5 10

<210> 32

<211> 16

<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 32

Tyr Ile Ser Phe Thr Gly Thr Thr Ser Tyr Thr Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 33

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 33

Ser Val Ile Phe Thr Ile Asp Ser

1 5

<210> 34

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 34

Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Met His

1 5 10

<210> 35

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 35

Gly Ile Asn Pro Asp Asn Gly Gly Pro Ser Tyr Ser Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 36

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 36

Glu Thr His Asp Tyr Asp Lys Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 37

<211> 30

<212> DNA

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 37

agtgccagct caagtgtaat ttacatgtac 30

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 38

gacacatcca acctggtttc t 21

<210> 39

<211> 27

<212> DNA

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 39

cagcagtaca gtggttaccc gtacacg 27

<210> 40

<211> 48

<212> DNA

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 40

aaatctagtc agaggattgt acatagtgat gggaagacct atttagaa 48

<210> 41

<211> 21

<212> DNA

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 41

aaagtttcca accgattttc t 21

<210> 42

<211> 27

<212> DNA

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 42

tttcaaggtt cacatattcc gtggacg 27

<210> 43

<211> 45

<212> DNA

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 43

agagccagcg aaagtgttga taattttggc tttagtttta tgaac 45

<210> 44

<211> 21

<212> DNA

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 44

agtgcatcca accaaggatc c 21

<210> 45

<211> 27

<212> DNA

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 45

cagcaaagta aggagattcc tttcacg 27

<210> 46

<211> 33

<212> DNA

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 46

agggcctccg gcaacatcca caattacctg acc 33

<210> 47

<211> 18

<212> DNA

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 47

aatgccaagg ccctggcc 18

<210> 48

<211> 27

<212> DNA

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 48

ctgcactttt ggagcagccc cctgacc 27

<210> 49

<211> 51

<212> DNA

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 49

aagtcctccc agtccctgct gtactccaac aatcagaaga attacctggc c 51

<210> 50

<211> 21

<212> DNA

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 50

tgggcctcca caagggagtc c 21

<210> 51

<211> 27

<212> DNA

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 51

cagcagtact acagctaccc cctgacc 27

<210> 52

<211> 51

<212> DNA

<213> Homo sapiens(智人)

<400> 52

aagtccagcc agagtgtttt atatagctcc aacaataaga actacttagc t 51

<210> 53

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens(智人)

<400> 53

cagcaatctt atagtactcc gctcact 27

<210> 54

<211> 51

<212> DNA

<213> Homo sapiens(智人)

<400> 54

aagtccagcc agagtgtttt atacacctcc aacaataaca actacttagc t 51

<210> 55

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens(智人)

<400> 55

cagcaatatt ttagtactcc gatcacc 27

<210> 56

<211> 51

<212> DNA

<213> Homo sapiens(智人)

<400> 56

aagtccagcc agagtgtttt atacaacccc aacagtaaga attacttcgc t 51

<210> 57

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens(智人)

<400> 57

caacaatatt atatcactcc gtacact 27

<210> 58

<211> 30

<212> DNA

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 58

ggattcactt tcagtaactt tggaatgcac 30

<210> 59

<211> 51

<212> DNA

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 59

tacattagta gaggcagtag caacatctac tatgcagaca cagtgaaggg c 51

<210> 60

<211> 42

<212> DNA

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 60

accccctatg attacgacgg atattactat gctatggact ac 42

<210> 61

<211> 30

<212> DNA

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 61

ggatacgccc tcactaacta ctggatagat 30

<210> 62

<211> 51

<212> DNA

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 62

aatgtttacc ctgaaggtgg ttttgtcaat tacaatgaga actttaaggg c 51

<210> 63

<211> 21

<212> DNA

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 63

gattacgacg ggtttgactt c 21

<210> 64

<211> 30

<212> DNA

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 64

ggatacacat tcaccagtta tattatgcac 30

<210> 65

<211> 51

<212> DNA

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 65

tatattaatc cttacaatga aggcactaag tataatgagg cgttcgaaga c 51

<210> 66

<211> 33

<212> DNA

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 66

gatactacga taggtgactg gtacttcgat gtt 33

<210> 67

<211> 33

<212> DNA

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 67

ggctactcaa tcaccagtga ttatgcctgg acc 33

<210> 68

<211> 48

<212> DNA

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 68

tacataagtt tcactggtac cactagctac accccatctc tcaaaagt 48

<210> 69

<211> 24

<212> DNA

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 69

agtgtgattt ttactataga ctcc 24

<210> 70

<211> 30

<212> DNA

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 70

ggatacacat tcactgaata caccatgcac 30

<210> 71

<211> 51

<212> DNA

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 71

ggtattaatc ctgacaatgg tggtcctagc tacagccaga aattcaaggg c 51

<210> 72

<211> 30

<212> DNA

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 72

gaaacacatg attacgacaa gtttgcttac 30

<210> 73

<211> 477

<212> PRT

<213> Homo sapiens(智人)

<400> 73

Met Pro Pro Cys Gln Pro Gln Arg Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Ala Cys Gln Pro Gln Val Pro Ser Ala Gln Val Met Asp Phe Leu

20 25 30

Phe Glu Lys Trp Lys Leu Tyr Gly Asp Gln Cys His His Asn Leu Ser

35 40 45

Leu Leu Pro Pro Pro Thr Glu Leu Val Cys Asn Arg Thr Phe Asp Lys

50 55 60

Tyr Ser Cys Trp Pro Asp Thr Pro Ala Asn Thr Thr Ala Asn Ile Ser

65 70 75 80

Cys Pro Trp Tyr Leu Pro Trp His His Lys Val Gln His Arg Phe Val

85 90 95

Phe Lys Arg Cys Gly Pro Asp Gly Gln Trp Val Arg Gly Pro Arg Gly

100 105 110

Gln Pro Trp Arg Asp Ala Ser Gln Cys Gln Met Asp Gly Glu Glu Ile

115 120 125

Glu Val Gln Lys Glu Val Ala Lys Met Tyr Ser Ser Phe Gln Val Met

130 135 140

Tyr Thr Val Gly Tyr Ser Leu Ser Leu Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu

145 150 155 160

Ala Ile Leu Gly Gly Leu Ser Lys Leu His Cys Thr Arg Asn Ala Ile

165 170 175

His Ala Asn Leu Phe Ala Ser Phe Val Leu Lys Ala Ser Ser Val Leu

180 185 190

Val Ile Asp Gly Leu Leu Arg Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Ile Gly Asp

195 200 205

Asp Leu Ser Val Ser Thr Trp Leu Ser Asp Gly Ala Val Ala Gly Cys

210 215 220

Arg Val Ala Ala Val Phe Met Gln Tyr Gly Ile Val Ala Asn Tyr Cys

225 230 235 240

Trp Leu Leu Val Glu Gly Leu Tyr Leu His Asn Leu Leu Gly Leu Ala

245 250 255

Thr Leu Pro Glu Arg Ser Phe Phe Ser Leu Tyr Leu Gly Ile Gly Trp

260 265 270

Gly Ala Pro Met Leu Phe Val Val Pro Trp Ala Val Val Lys Cys Leu

275 280 285

Phe Glu Asn Val Gln Cys Trp Thr Ser Asn Asp Asn Met Gly Phe Trp

290 295 300

Trp Ile Leu Arg Phe Pro Val Phe Leu Ala Ile Leu Ile Asn Phe Phe

305 310 315 320

Ile Phe Val Arg Ile Val Gln Leu Leu Val Ala Lys Leu Arg Ala Arg

325 330 335

Gln Met His His Thr Asp Tyr Lys Phe Arg Leu Ala Lys Ser Thr Leu

340 345 350

Thr Leu Ile Pro Leu Leu Gly Val His Glu Val Val Phe Ala Phe Val

355 360 365

Thr Asp Glu His Ala Gln Gly Thr Leu Arg Ser Ala Lys Leu Phe Phe

370 375 380

Asp Leu Phe Leu Ser Ser Phe Gln Gly Leu Leu Val Ala Val Leu Tyr

385 390 395 400

Cys Phe Leu Asn Lys Glu Val Gln Ser Glu Leu Arg Arg Arg Trp His

405 410 415

Arg Trp Arg Leu Gly Lys Val Leu Trp Glu Glu Arg Asn Thr Ser Asn

420 425 430

His Arg Ala Ser Ser Ser Pro Gly His Gly Pro Pro Ser Lys Glu Leu

435 440 445

Gln Phe Gly Arg Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Ser Ala Glu Thr Pro

450 455 460

Leu Ala Gly Gly Leu Pro Arg Leu Ala Glu Ser Pro Phe

465 470 475

<210> 74

<211> 491

<212> PRT

<213> Rhesus macaque(猕猴)

<400> 74

Met Pro Pro Cys Gln Pro Arg Arg Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Ala Cys Gln Pro Gln Ala Pro Ser Ala Gln Val Met Asp Phe Leu

20 25 30

Phe Glu Lys Trp Lys Leu Tyr Gly Asp Gln Cys His His Asn Leu Ser

35 40 45

Leu Leu Pro Pro Pro Thr Glu Leu Val Cys Asn Arg Thr Phe Asp Lys

50 55 60

Tyr Ser Cys Trp Pro Asp Thr Pro Ala Asn Thr Thr Ala Asn Ile Ser

65 70 75 80

Cys Pro Trp Tyr Leu Pro Trp His His Lys Val Gln His Arg Phe Val

85 90 95

Phe Lys Arg Cys Gly Pro Asp Gly Gln Trp Val Arg Gly Pro Arg Gly

100 105 110

Gln Pro Trp Arg Asp Ala Ser Gln Cys Gln Met Asp Gly Glu Glu Leu

115 120 125

Glu Val Gln Lys Glu Val Ala Lys Met Tyr Ser Ser Phe Gln Val Met

130 135 140

Tyr Thr Val Gly Tyr Ser Leu Ser Leu Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu

145 150 155 160

Ala Val Leu Gly Gly Ile Ser Lys Leu His Cys Thr Arg Asn Ala Ile

165 170 175

His Ala Asn Leu Phe Val Ser Phe Val Leu Lys Ala Ser Ser Val Leu

180 185 190

Val Ile Asp Gly Leu Leu Arg Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Ile Gly Asp

195 200 205

Asp Leu Ser Val Ser Ile Trp Leu Ser Asp Gly Ala Val Ala Gly Cys

210 215 220

Arg Val Ala Ala Val Phe Met Gln Tyr Gly Val Val Ala Asn Tyr Cys

225 230 235 240

Trp Leu Leu Val Glu Gly Leu Tyr Leu His Asn Leu Leu Gly Leu Ala

245 250 255

Thr Leu Pro Glu Arg Ser Phe Phe Ser Leu Tyr Leu Gly Ile Gly Trp

260 265 270

Gly Ala Pro Met Leu Phe Ile Ile Pro Trp Val Val Val Arg Cys Leu

275 280 285

Phe Glu Asn Ile Gln Cys Trp Thr Ser Asn Asp Asn Met Gly Phe Trp

290 295 300

Trp Ile Leu Arg Phe Pro Val Phe Leu Ala Ile Leu Ile Asn Phe Phe

305 310 315 320

Ile Phe Ile Arg Ile Val His Leu Leu Val Ala Lys Leu Arg Ala Arg

325 330 335

Glu Met His His Thr Asp Tyr Lys Phe Arg Leu Ala Lys Ser Thr Leu

340 345 350

Thr Leu Ile Pro Leu Leu Gly Val His Glu Val Val Phe Ala Phe Val

355 360 365

Thr Asp Glu His Ala Gln Gly Thr Leu Arg Phe Ala Lys Leu Phe Phe

370 375 380

Asp Leu Phe Leu Ser Ser Phe Gln Gly Leu Leu Val Ala Val Leu Tyr

385 390 395 400

Cys Phe Leu Asn Lys Glu Val Gln Ser Glu Leu Arg Arg His Trp His

405 410 415

Arg Trp Arg Leu Gly Lys Val Leu Gln Glu Glu Arg Gly Thr Ser Asn

420 425 430

His Lys Ala Pro Ser Ala Pro Gly Gln Gly Leu Pro Gly Lys Lys Leu

435 440 445

Gln Ser Gly Arg Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Ser Ala Glu Ile Pro

450 455 460

Leu Ala Gly Gly Leu Pro Arg Leu Ala Glu Ser Pro Phe Ser Thr Leu

465 470 475 480

Leu Gly Pro Gln Leu Gly Leu Asp Ser Gly Thr

485 490

<210> 75

<211> 485

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus(褐家鼠)

<400> 75

Met Leu Leu Thr Gln Leu His Cys Pro Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Val

1 5 10 15

Val Leu Ser Cys Leu Pro Lys Ala Pro Ser Ala Gln Val Met Asp Phe

20 25 30

Leu Phe Glu Lys Trp Lys Leu Tyr Ser Asp Gln Cys His His Asn Leu

35 40 45

Ser Leu Leu Pro Pro Pro Thr Glu Leu Val Cys Asn Arg Thr Phe Asp

50 55 60

Lys Tyr Ser Cys Trp Pro Asp Thr Pro Pro Asn Thr Thr Ala Asn Ile

65 70 75 80

Ser Cys Pro Trp Tyr Leu Pro Trp Tyr His Lys Val Gln His Arg Leu

85 90 95

Val Phe Lys Arg Cys Gly Pro Asp Gly Gln Trp Val Arg Gly Pro Arg

100 105 110

Gly Gln Ser Trp Arg Asp Ala Ser Gln Cys Gln Met Asp Asp Asp Glu

115 120 125

Ile Glu Val Gln Lys Gly Val Ala Lys Met Tyr Ser Ser Tyr Gln Val

130 135 140

Met Tyr Thr Val Gly Tyr Ser Leu Ser Leu Gly Ala Leu Leu Leu Ala

145 150 155 160

Leu Val Ile Leu Leu Gly Leu Arg Lys Leu His Cys Thr Arg Asn Tyr

165 170 175

Ile His Gly Asn Leu Phe Ala Ser Phe Val Leu Lys Ala Gly Ser Val

180 185 190

Leu Val Ile Asp Trp Leu Leu Lys Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Ile Gly

195 200 205

Asp Asp Leu Ser Val Ser Val Trp Leu Ser Asp Gly Ala Val Ala Gly

210 215 220

Cys Arg Val Ala Thr Val Ile Met Gln Tyr Gly Ile Ile Ala Asn Tyr

225 230 235 240

Cys Trp Leu Leu Val Glu Gly Val Tyr Leu Tyr Ser Leu Leu Ser Ile

245 250 255

Thr Thr Phe Ser Glu Lys Ser Phe Phe Ser Leu Tyr Leu Cys Ile Gly

260 265 270

Trp Gly Ser Pro Leu Leu Phe Val Ile Pro Trp Val Val Val Lys Cys

275 280 285

Leu Phe Glu Asn Val Gln Cys Trp Thr Ser Asn Asp Asn Met Gly Phe

290 295 300

Trp Trp Ile Leu Arg Ile Pro Val Leu Leu Ala Ile Leu Ile Asn Phe

305 310 315 320

Phe Ile Phe Val Arg Ile Ile His Leu Leu Val Ala Lys Leu Arg Ala

325 330 335

His Gln Met His Tyr Ala Asp Tyr Lys Phe Arg Leu Ala Arg Ser Thr

340 345 350

Leu Thr Leu Ile Pro Leu Leu Gly Val His Glu Val Val Phe Ala Phe

355 360 365

Val Thr Asp Glu His Ala Gln Gly Thr Leu Arg Ser Thr Lys Leu Phe

370 375 380

Phe Asp Leu Phe Phe Ser Ser Phe Gln Gly Leu Leu Val Ala Val Leu

385 390 395 400

Tyr Cys Phe Leu Asn Lys Glu Val Gln Ala Glu Leu Leu Arg Arg Trp

405 410 415

Arg Arg Trp Gln Glu Gly Lys Ala Leu Gln Glu Glu Arg Met Ala Ser

420 425 430

Ser His Gly Ser His Met Ala Pro Ala Gly Thr Cys His Gly Asp Pro

435 440 445

Cys Glu Lys Leu Gln Leu Met Ser Ala Gly Ser Ser Ser Gly Thr Gly

450 455 460

Cys Glu Pro Ser Ala Lys Thr Ser Leu Ala Ser Ser Leu Pro Arg Leu

465 470 475 480

Ala Asp Ser Pro Thr

485

<210> 76

<211> 485

<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 76

Met Pro Leu Thr Gln Leu His Cys Pro His Leu Leu Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Val Leu Ser Cys Leu Pro Glu Ala Pro Ser Ala Gln Val Met Asp Phe

20 25 30

Leu Phe Glu Lys Trp Lys Leu Tyr Ser Asp Gln Cys His His Asn Leu

35 40 45

Ser Leu Leu Pro Pro Pro Thr Glu Leu Val Cys Asn Arg Thr Phe Asp

50 55 60

Lys Tyr Ser Cys Trp Pro Asp Thr Pro Pro Asn Thr Thr Ala Asn Ile

65 70 75 80

Ser Cys Pro Trp Tyr Leu Pro Trp Tyr His Lys Val Gln His Arg Leu

85 90 95

Val Phe Lys Arg Cys Gly Pro Asp Gly Gln Trp Val Arg Gly Pro Arg

100 105 110

Gly Gln Pro Trp Arg Asn Ala Ser Gln Cys Gln Leu Asp Asp Glu Glu

115 120 125

Ile Glu Val Gln Lys Gly Val Ala Lys Met Tyr Ser Ser Gln Gln Val

130 135 140

Met Tyr Thr Val Gly Tyr Ser Leu Ser Leu Gly Ala Leu Leu Leu Ala

145 150 155 160

Leu Val Ile Leu Leu Gly Leu Arg Lys Leu His Cys Thr Arg Asn Tyr

165 170 175

Ile His Gly Asn Leu Phe Ala Ser Phe Val Leu Lys Ala Gly Ser Val

180 185 190

Leu Val Ile Asp Trp Leu Leu Lys Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Ile Gly

195 200 205

Asp Asp Leu Ser Val Ser Val Trp Leu Ser Asp Gly Ala Met Ala Gly

210 215 220

Cys Arg Val Ala Thr Val Ile Met Gln Tyr Gly Ile Ile Ala Asn Tyr

225 230 235 240

Cys Trp Leu Leu Val Glu Gly Val Tyr Leu Tyr Ser Leu Leu Ser Leu

245 250 255

Ala Thr Phe Ser Glu Arg Ser Phe Phe Ser Leu Tyr Leu Gly Ile Gly

260 265 270

Trp Gly Ala Pro Leu Leu Phe Val Ile Pro Trp Val Val Val Lys Cys

275 280 285

Leu Phe Glu Asn Val Gln Cys Trp Thr Ser Asn Asp Asn Met Gly Phe

290 295 300

Trp Trp Ile Leu Arg Ile Pro Val Phe Leu Ala Leu Leu Ile Asn Phe

305 310 315 320

Phe Ile Phe Val His Ile Ile His Leu Leu Val Ala Lys Leu Arg Ala

325 330 335

His Gln Met His Tyr Ala Asp Tyr Lys Phe Arg Leu Ala Arg Ser Thr

340 345 350

Leu Thr Leu Ile Pro Leu Leu Gly Val His Glu Val Val Phe Ala Phe

355 360 365

Val Thr Asp Glu His Ala Gln Gly Thr Leu Arg Ser Thr Lys Leu Phe

370 375 380

Phe Asp Leu Phe Leu Ser Ser Phe Gln Gly Leu Leu Val Ala Val Leu

385 390 395 400

Tyr Cys Phe Leu Asn Lys Glu Val Gln Ala Glu Leu Met Arg Arg Trp

405 410 415

Arg Gln Trp Gln Glu Gly Lys Ala Leu Gln Glu Glu Arg Leu Ala Ser

420 425 430

Ser His Gly Ser His Met Ala Pro Ala Gly Pro Cys His Gly Asp Pro

435 440 445

Cys Glu Lys Leu Gln Leu Met Ser Ala Gly Ser Ser Ser Gly Thr Gly

450 455 460

Cys Val Pro Ser Met Glu Thr Ser Leu Ala Ser Ser Leu Pro Arg Leu

465 470 475 480

Ala Asp Ser Pro Thr

485

<210> 77

<211> 1431

<212> DNA

<213> Homo sapiens(智人)

<400> 77

atgcccccct gccagccaca gcgacccctg ctgctgttgc tgctgctgct ggcctgccag 60

ccacaggtcc cctccgctca ggtgatggac ttcctgtttg agaagtggaa gctctacggt 120

gaccagtgtc accacaacct gagcctgctg ccccctccca cggagctggt gtgcaacaga 180

accttcgaca agtattcctg ctggccggac acccccgcca ataccacggc caacatctcc 240

tgcccctggt acctgccttg gcaccacaaa gtgcaacacc gcttcgtgtt caagagatgc 300

gggcccgacg gtcagtgggt gcgtggaccc cgggggcagc cttggcgtga tgcctcccag 360

tgccagatgg atggcgagga gattgaggtc cagaaggagg tggccaagat gtacagcagc 420

ttccaggtga tgtacacagt gggctacagc ctgtccctgg gggccctgct cctcgccttg 480

gccatcctgg ggggcctcag caagctgcac tgcacccgca atgccatcca cgcgaatctg 540

tttgcgtcct tcgtgctgaa agccagctcc gtgctggtca ttgatgggct gctcaggacc 600

cgctacagcc agaaaattgg cgacgacctc agtgtcagca cctggctcag tgatggagcg 660

gtggctggct gccgtgtggc cgcggtgttc atgcaatatg gcatcgtggc caactactgc 720

tggctgctgg tggagggcct gtacctgcac aacctgctgg gcctggccac cctccccgag 780

aggagcttct tcagcctcta cctgggcatc ggctggggtg cccccatgct gttcgtcgtc 840

ccctgggcag tggtcaagtg tctgttcgag aacgtccagt gctggaccag caatgacaac 900

atgggcttct ggtggatcct gcggttcccc gtcttcctgg ccatcctgat caacttcttc 960

atcttcgtcc gcatcgttca gctgctcgtg gccaagctgc gggcacggca gatgcaccac 1020

acagactaca agttccggct ggccaagtcc acgctgaccc tcatccctct gctgggcgtc 1080

cacgaagtgg tcttcgcctt cgtgacggac gagcacgccc agggcaccct gcgctccgcc 1140

aagctcttct tcgacctctt cctcagctcc ttccagggcc tgctggtggc tgtcctctac 1200

tgcttcctca acaaggaggt gcagtcggag ctgcggcggc gttggcaccg ctggcgcctg 1260

ggcaaagtgc tatgggagga gcggaacacc agcaaccaca gggcctcatc ttcgcccggc 1320

cacggccctc ccagcaagga gctgcagttt gggaggggtg gtggcagcca ggattcatct 1380

gcggagaccc ccttggctgg tggcctccct agattggctg agagcccctt c 1431

<210> 78

<211> 1473

<212> DNA

<213> Rhesus macaque(猕猴)

<400> 78

atgcccccct gtcagccacg tcgacccctg ctactgttgc tgctgctgct ggcctgccag 60

ccacaggccc cctccgctca ggtgatggac ttcctgtttg agaagtggaa actctacggt 120

gaccagtgtc accacaacct gagcctgctg ccccctccca cggagctggt ctgtaacaga 180

accttcgaca agtattcctg ctggccagac acccccgcca ataccacggc caacatctcc 240

tgcccctggt acctgccttg gcaccacaaa gtgcaacacc gcttcgtgtt caagagatgc 300

gggcccgatg gtcagtgggt gcgtggaccc cgggggcagc cttggcgtga cgcctctcag 360

tgccagatgg acggcgagga gcttgaggtc cagaaggagg tggctaagat gtacagcagc 420

ttccaggtga tgtacacggt gggctacagc ctgtccctgg gggccctgct cctcgccttg 480

gccgtcctgg ggggcatcag caagctgcac tgcacccgca acgccatcca cgcgaacctg 540

tttgtgtcct tcgtgctgaa ggccagctcc gtgctggtca tcgatgggct gctcaggacc 600

cgctacagcc agaagattgg cgacgacctc agtgtcagca tctggctcag tgatggagcg 660

gtggccggct gccgtgtggc cgcggtgttc atgcaatatg gcgtcgtggc caactactgc 720

tggctgctgg tggagggcct gtacctgcac aacctgctgg gcctggccac cctccctgag 780

aggagcttct tcagcctcta cctgggcatc ggctggggtg cccccatgct gttcatcatc 840

ccctgggtgg tggtcaggtg tctgttcgag aacatccagt gctggaccag caatgacaac 900

atgggcttct ggtggatcct gcggttcccc gtcttcctgg ccatcctgat caacttcttc 960

atcttcatcc gcattgttca cctgcttgtg gccaagctgc gggcgcggga gatgcaccac 1020

acagactaca agttccgact ggccaagtcc acactgaccc tcatccccct gctgggtgtc 1080

cacgaagtgg tcttcgcctt cgtgacggac gagcacgccc agggcaccct gcgcttcgcc 1140

aagctcttct tcgacctctt cctcagctcc ttccagggcc tgctggtggc tgtcctctac 1200

tgcttcctca acaaggaggt gcagtcggaa cttcggcggc attggcaccg ctggcgcctg 1260

ggcaaagtgc tgcaggagga gcggggcacc agcaaccaca aggccccatc tgcgcctggc 1320

caaggccttc ctggcaagaa gctgcagtct gggagggatg gtggcagcca ggactcatct 1380

gcggagatcc ccttggctgg tggcctccct aggttggctg agagcccctt ctcaactctg 1440

ctgggacccc agctagggct ggactcaggc acc 1473

<210> 79

<211> 1455

<212> DNA

<213> Rattus norvegicus(褐家鼠)

<400> 79

atgctcctca cccagctcca ctgtccctac ctgctgctgc tgctggtggt gctgtcatgt 60

ctgccaaagg caccctctgc ccaggtaatg gactttttgt ttgagaagtg gaagctctat 120

agtgaccagt gccaccacaa cctaagcctg ctgcccccac ctactgagct ggtctgcaac 180

agaactttcg acaagtactc ctgctggcct gacacccctc ccaacaccac tgccaacatt 240

tcctgcccct ggtacctacc ttggtaccac aaagtgcagc accgcctagt gttcaagagg 300

tgtgggcctg atgggcagtg ggttcgaggg ccacgggggc agtcatggcg cgacgcctcc 360

caatgtcaga tggatgatga cgagatcgag gtccagaagg gggtagccaa gatgtatagc 420

agctaccagg tgatgtacac tgtgggctac agtctgtccc tgggggcctt gctcctggcg 480

ctggtcatcc tgctgggcct caggaagctg cactgcaccc ggaactacat ccacgggaac 540

ctgttcgcgt ccttcgtgct caaggctggc tctgtgctgg tcattgattg gctgctcaag 600

acacgctata gccagaagat tggagatgac ctcagtgtga gcgtctggct cagtgatggg 660

gcggtggctg gctgcagagt ggccacagtg atcatgcagt acggcatcat agccaactac 720

tgctggttgc tggtggaggg tgtgtacctg tacagcctgc tgagcatcac caccttctcg 780

gagaagagct tcttctccct ctatctgtgc atcggctggg gatctcccct gctgtttgtc 840

atcccctggg tggtggtcaa gtgtctgttt gagaatgtcc agtgctggac cagcaatgac 900

aatatgggat tctggtggat cctgcgtatc cctgtactcc tggccatact gatcaatttt 960

ttcatctttg tccgcatcat tcatcttctt gtggccaagc tgcgtgccca tcagatgcac 1020

tatgctgatt acaagttccg gctagccagg tccacgctga ccctcattcc tctgctggga 1080

gtccacgaag tggtctttgc ctttgtgact gatgagcatg cccagggcac cctgcgctcc 1140

accaagctct tttttgacct gttcttcagc tccttccagg gtctgctggt ggctgttctc 1200

tactgtttcc tcaacaagga ggtgcaggca gagctactgc ggcgttggag gcgatggcaa 1260

gaaggcaaag ctcttcagga ggaaaggatg gccagcagcc atggcagcca catggcccca 1320

gcagggactt gtcatggtga tccctgtgag aaacttcagc ttatgagtgc aggcagcagc 1380

agtgggactg gctgtgagcc ctctgcgaag acctcattgg ccagtagtct cccaaggctg 1440

gctgacagcc ccacc 1455

<210> 80

<211> 1455

<212> DNA

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 80

atgcccctca cccagctcca ctgtccccac ctgctgctgc tgctgttggt gctgtcatgt 60

ctgccagagg caccctctgc ccaggtaatg gactttttgt ttgagaagtg gaagctctat 120

agtgaccaat gccaccacaa cctaagcctg ctgcccccac ctactgagct ggtctgtaac 180

agaaccttcg acaagtactc ctgctggcct gacacccctc ccaacaccac tgccaacatt 240

tcctgcccct ggtacctacc ttggtaccac aaagtgcagc accgcctagt gttcaagagg 300

tgtgggcccg atgggcagtg ggttcgaggg ccacgggggc agccgtggcg caacgcctcc 360

caatgtcagt tggatgatga agagatcgag gtccagaagg gggtggccaa gatgtatagc 420

agccagcagg tgatgtacac cgtgggctac agtctgtccc tgggggcctt gctccttgcg 480

ctggtcatcc tgctgggcct caggaagctg cactgcaccc gaaactacat ccatgggaac 540

ctgtttgcgt cctttgtgct caaggctggc tctgtgttgg tcatcgattg gctgctgaag 600

acacggtaca gccagaagat tggcgatgac ctcagtgtga gcgtctggct cagtgacggg 660

gcgatggccg gctgcagagt ggccacagtg atcatgcagt acggcatcat agccaactat 720

tgctggttgc tggtagaggg cgtgtacctg tacagcctgc tgagccttgc caccttctct 780

gagaggagct tcttttccct ctacctgggc attggctggg gtgcgcccct gctgtttgtc 840

atcccctggg tggtggtcaa gtgtctgttt gagaatgttc agtgctggac cagcaatgac 900

aacatgggat tctggtggat cctgcgtatt cctgtcttcc tggccttact gatcaatttt 960

ttcatctttg tccacatcat tcaccttctt gtggccaagc tgcgtgccca tcagatgcac 1020

tatgctgact ataagttccg gctggccagg tccacgctga ccctcatccc tctgctgggg 1080

gtccacgagg tggtctttgc ctttgtgact gacgagcatg cccaaggcac cctgcgctcc 1140

accaagctct tttttgacct gttcctcagc tccttccagg gtctgctggt ggctgttctc 1200

tactgtttcc tcaacaagga ggtgcaggca gagctgatgc ggcgttggag gcaatggcaa 1260

gaaggcaaag ctcttcagga ggaaaggttg gccagcagcc atggcagcca catggcccca 1320

gcagggcctt gtcatggtga tccctgtgag aaacttcagc ttatgagtgc aggcagcagc 1380

agtgggactg gctgtgtgcc ctctatggag acctcgctgg ccagtagtct cccaaggttg 1440

gctgacagcc ccacc 1455

<210> 81

<211> 107

<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 81

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ile Tyr Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Arg Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 82

<211> 113

<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 82

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Arg Ile Val His Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asn Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Ile Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 83

<211> 112

<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 83

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Phe

20 25 30

Gly Phe Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Met Glu Glu Asp Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Ile Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

<210> 84

<211> 108

<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 84

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr

20 25 30

Leu Thr Trp Phe Gln Gln Arg Arg Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Ala Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Asp Tyr Tyr Cys Leu His Phe Trp Ser Ser Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

100 105

<210> 85

<211> 114

<212> PRT

<213> Mus musculus (小鼠)

<400> 85

Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Asn Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr His Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

100 105 110

Lys Arg

<210> 86

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<220>

Claims

1.一个能与人GCGR特异性结合的抗体，所述抗体包含：

a.由SEQ ID NO:13的氨基酸序列组成的轻链CDR1；

b.由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成的轻链CDR2；

c.由SEQ ID NO:15的氨基酸序列组成的轻链CDR3；

d.由SEQ ID NO:34的氨基酸序列组成的重链CDR1；

e.由SEQ ID NO:35的氨基酸序列组成的重链CDR2；及

f.由SEQ ID NO:36的氨基酸序列组成的重链CDR3。

2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含：

a.轻链可变结构域，其由SEQ ID NO:87的氨基酸序列组成；及

b.重链可变结构域，其由SEQ ID NO:97的氨基酸序列组成。

3.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含或进一步包含一或两个氨基酸序列，其中每个氨基酸序列独立地选自于由以下所列的氨基酸序列所组成的组：

a.轻链恒定氨基酸序列：SEQ ID NO:115及SEQ ID NO:116；及

b.重链恒定氨基酸序列：SEQ ID NO:117及SEQ ID NO:118。

4.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体为鼠源GCGR抗体或人源化GCGR抗体。

5.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体为GCGR单克隆抗体。

6.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体为鼠源抗体、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、抗原结合抗体片段、单链抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体、Fab片段、F(ab’)x片段、结构域抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgGl抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、或IgG4抗体。

7.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体的降低人Glucagon信号传导的IC₅₀值为1nM至300nM。

8.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体的降低人Glucagon信号传导的IC₅₀值为1nM至150nM。

9.一个GCGR抗体与GLP-1的融合蛋白质(GLP-1融合蛋白质)，其中所述的融合蛋白质包含权利要求1所述的GCGR抗体、和一个GLP-1片段或反向GLP-1片段；其中如下二者择一：所述GLP-1片段的羧基端通过一肽接头序列(Linker)与所述GCGR抗体轻链或重链的氨基端连接，或所述反向GLP-1片段的氨基端通过一肽接头序列(Linker)与所述GCGR抗体轻链或重链的羧基端连接。

10.根据权利要求9所述的融合蛋白质，其中所述GLP-1融合蛋白质还包含一个，二个，三个，或四个额外的GLP-1片段。

11.权利要求9所述的融合蛋白质，其中所述GLP-1融合蛋白质还包含一个，二个，三个，或四个额外的反向GLP-1片段。

12.权利要求10所述的融合蛋白质，其中所述GLP-1融合蛋白质包含二个GLP-1片段。

13.权利要求11所述的融合蛋白质，其中所述GLP-1融合蛋白质包含二个反向GLP-1片段。

14.根据权利要求9所述的融合蛋白质，其中所述的GCGR抗体、GLP-1片段、反向GLP-1片段、和肽接头序列(Linker)通过以下所述中一方式融合形成所述的融合蛋白质：

通过肽接头序列(Linker)将所述GLP-1片段的羧基端和所述GCGR抗体轻链或者重链的氨基端连接：N'-GLP-1-Linker-R-C'；

通过肽接头序列(Linker)将所述反向GLP-1片段的氨基端和所述GCGR抗体轻链或者重链的羧基端连接：N'-R-Linker-反向GLP-1-C'；

其中:N'代表多肽链的氨基端,C'代表多肽链的羧基端,GLP-1代表一GLP-1片段，反向GLP-1代表一反向GLP-1片段，R为权利要求1所述的GCGR抗体的轻链或者重链的氨基酸序列,及Linker代表一肽接头。

15.根据权利要求9所述的GLP-1融合蛋白质，所述的肽接头(Linker)的序列包含全长的、部分的、或者重复的氨基酸，其独立选自由SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125、及SEQ IDNO:126组成的组。

16.根据权利要求9所述的GLP-1融合蛋白质，其中所述的GLP-1片段包含一个氨基酸序列，其独立选自由SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、及SEQID NO:123组成的组；或者其中所述的反向GLP-1片段包含一个氨基酸序列，其独立选自由SEQ IDNO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、及SEQ IDNO:131组成的组。

17.一种多核苷酸，其编码权利要求1所述的GCGR抗体或权利要求9所述的GLP-1融合蛋白质。

18.一种载体，其包含权利要求17中所述的多核苷酸。

19.一种宿主细胞，其包含权利要求18中所述的载体。

20.一种药用组合物，其包含与药用可接受载体混合的权利要求1所述的GCGR抗体或者权利要求9所述的GLP-1融合蛋白质。

21.一种权利要求1所述的GCGR抗体，权利要求9所述的GLP-1融合蛋白质，或权利要求20所述的药用组合物在制备用于预防或治疗高血糖症的药物中的用途。

22.一种权利要求1所述的GCGR抗体，权利要求9所述的GLP-1融合蛋白质，或权利要求20所述的药用组合物在制备用于预防或治疗二型糖尿病的药物中的用途。

23.一种权利要求1所述的GCGR抗体，权利要求9所述的GLP-1融合蛋白质，或权利要求20所述的药用组合物在制备用于预防或治疗代谢综合症的药物中的用途。

24.一种权利要求1所述的GCGR抗体，权利要求9所述的GLP-1融合蛋白质，或权利要求20所述的药用组合物在制备用于预防或治疗血脂异常的药物中的用途。

25.一种权利要求1所述的GCGR抗体，权利要求9所述的GLP-1融合蛋白质，或权利要求20所述的药用组合物在制备用于同时治疗高血糖症、二型糖尿病、代谢综合症、或血脂异常中的二种病症的药物中的用途。

26.一种权利要求1所述的GCGR抗体，权利要求9所述的GLP-1融合蛋白质，或权利要求20所述的药用组合物在制备用于同时治疗高血糖症、二型糖尿病、代谢综合症、或血脂异常中的三种病症的药物中的用途。

27.一种权利要求1所述的GCGR抗体，权利要求9所述的GLP-1融合蛋白质，或权利要求20所述的药用组合物在制备用于同时治疗高血糖症、二型糖尿病、代谢综合症和血脂异常的药物中的用途。

28.根据权利要求21至27中任一项所述用途，其所述的药用组合物是用于静脉或皮下注射。