TW201945392A - Gcgr抗體及其與glp-1的融合蛋白質，以及其藥物組合物和應用 - Google Patents

Gcgr抗體及其與glp-1的融合蛋白質，以及其藥物組合物和應用 Download PDF

Info

Publication number
TW201945392A
TW201945392A TW108109317A TW108109317A TW201945392A TW 201945392 A TW201945392 A TW 201945392A TW 108109317 A TW108109317 A TW 108109317A TW 108109317 A TW108109317 A TW 108109317A TW 201945392 A TW201945392 A TW 201945392A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
seq
antibody
amino acid
glp
gcgr
Prior art date
Application number
TW108109317A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI842699B (zh
Inventor
成 張
章華
汪笑峰
藥晨江
姜豔
畢良亮
書謙 景
Original Assignee
中國大陸商鴻運華寧（杭州）生物醫藥有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 中國大陸商鴻運華寧（杭州）生物醫藥有限公司 filed Critical 中國大陸商鴻運華寧（杭州）生物醫藥有限公司
Publication of TW201945392A publication Critical patent/TW201945392A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI842699B publication Critical patent/TWI842699B/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2869—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against hormone receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本文提供了GCGR抗體及其與GLP-1之融合蛋白質，以及其藥物組合物。本文進一步提供了GCGR抗體及其與GLP-1之融合蛋白質用於治療、預防或改善高血糖症、二型糖尿病、代謝綜合症、或血脂異常之一種或多種症狀方法。

Description

GCGR抗體及其與GLP-1的融合蛋白質，以及其藥物組合物和應用
本文提供了能與GCGR特異性結合之抗體及其與GLP-1之融合蛋白質，以及其藥物組合物。本文進一步提供了GCGR抗體及其與GLP-1之融合蛋白質用於治療、預防或改善高血糖症、二型糖尿病、代謝綜合症、或血脂異常之一種或多種症狀方法。
人胰高血糖素係與胰島素一起作用之重要激素類物質，參與人體血液中葡萄糖含量之調控。胰高血糖素及胰島素均為多肽類激素。胰高血糖素係在胰腺之α胰島細胞產生的，胰島素係在β胰島細胞產生的。當血糖水平降低時，胰高血糖素主要藉由刺激一些靶細胞(主要係肝細胞)釋放葡萄糖，胰高血糖素及胰島素調節血糖之作用正好相反，胰島素在血糖升高時刺激細胞攝取並儲存葡萄糖，降低血糖濃度。
天然人胰高血糖素係由29個胺基酸殘基組成：His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr。
胰高血糖素藉由結合其受體並激活下游信號通路，胰高血糖素受體(簡稱GCGR)屬於七次跨膜G蛋白偶聯受體家族分泌素亞型，配體-受體結合後，藉由激活第二信使腺苷酸環化酶來行使功能，升高肝細胞內cAMP水平，繼而啟動葡萄糖之從頭合成途徑及肝糖原降解途徑，使得血糖濃度升高(Wakelam等，1986，Nature 323:68-71；Pittner及Fain，1991，Biochem J . 277:371-8)。
糖尿病係常見之葡萄糖代謝症，其特徵是高血糖，分為胰島素絕對不足之一型糖尿病及胰島素相對不足之二型糖尿病。一型糖尿病患者表現出高血糖及低胰島素血症，並且對該病之常規治療措施為提供胰島素。但是，在某些一型或二型糖尿病中，絕對或相對高之胰高血糖素導致高血糖。在健康之動物或糖尿病模型動物中，用選擇性或特異性之抗體清除血液循環中之胰高血糖素可以使血糖水平下降(Brand等，1996，Diabetes 45:1076)。此等研究表明，抑制胰高血糖素或拮抗胰高血糖素受體可以作為糖尿病常規高血糖治療之輔助手段。
藉由靶向胰高血糖素受體之抗體阻斷胰高血糖素及胰高血糖素受體之結合，亦可以作為控制或降低血糖之一種手段，從而成為治療糖尿病之新方法(US 2008/036341 A2及US 2012/0128679 A1)。但在實際之動物實驗及臨床試驗中卻發現，直接使用胰高血糖素受體之抗體，阻斷胰高血糖素信號通路，會引起顯著之負反饋，血液中生成濃度特別高之胰高血糖素，短暫升高之肝轉胺酶，以及胰島α細胞之顯著增生(Kostic等，2018，Diabetes Obes Metab. 20:283-91；Gu等，2009，JPET 331:871-881)。
GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質(GLP-1融合蛋白質)，一方面，GCGR抗體部分藉由抑制胰高血糖素與其受體之結合，降低細胞內cAMP水平，降低血糖；另外一方面，GLP-1部分，同樣具有降低血糖之作用。此GLP-1融合蛋白質中之兩個部分：GCGR之抗體以及GLP-1部分同時起到降低血糖之作用，二者具有協同增效之作用，可以更大幅度地降低血糖，從而提高降血糖之藥效。
另外，在協同增效之背景下，抗胰高血糖素抗體之臨床劑量亦不需要用到特別高，亦即在低劑量下，配合GLP-1促效劑一起，就可以顯著降低血糖，其比單獨使用高劑量之GCGR之抗體，能更大幅度地降低血糖，從而避免了使用高劑量胰高血糖素受體之抗體引起之副作用，比如胰島α細胞之增生。更進一步來說，GLP-1促效劑能促進胰島素分泌，而胰島素又會拮抗胰高血糖素之生成(Mari等，2016，Diabetes Obes Metab. 18:834-9)，給予GLP-1融合蛋白質，其中之GLP-1部分能夠抑制胰高血糖素之升高，同樣亦降低了GCGR抗體顯著升高胰高血糖素之負反饋作用，此會顯著降低藥物之毒副作用。
GLP-1融合蛋白質中之GCGR抗體部分之降糖效果及GLP-1部分降糖效果都會疊加，藉由雙重作用來治療高血糖症、二型糖尿病、代謝綜合症及包含血脂異常之其他相關症狀。這比單獨使用GLP-1促效劑降糖幅度更大，亦比單獨使用胰高血糖素受體之抗體毒副作用更低，GLP-1融合蛋白質具有更顯著之降血糖效果，又更安全。
本文提供了能與GCGR特異性結合之抗體，該抗體為GCGR之拮抗劑。
本文進一步提供了一個能與GCGR特異性結合之抗體，其抗體包括一個、兩個、三個、四個、五個、或六個胺基酸序列，其中各胺基酸序列獨立地選自於以下所列之胺基酸序列：
a. 輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18及SEQ ID NO: 20；
b. 輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 14；
c. 輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19及SEQ ID NO: 21；
d. 重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 25及SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 31及SEQ ID NO: 34；
e. 重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 32及SEQ ID NO: 35；及
f. 重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 33及SEQ ID NO: 36。
本文進一步提供了一個GLP-1融合蛋白質，其包括一個能與GCGR特異性結合之抗體，及一個、兩個、三個、四個、五個、六個，七個或八個GLP-1片段；該融合蛋白質藉由一個肽連接子(Linker)將GLP-1片段之羧基端與GCGR抗體輕鏈或重鏈之胺基端連接或者將一GLP-1片段之胺基端與一GCGR抗體輕鏈或重鏈之羧基端連接。
本文進一步提供了一個GLP-1融合蛋白質，其包括一個能與GCGR特異性結合之抗體，及一個、兩個、三個、四個、五個、六個，七個或八個反向GLP-1片段；該融合蛋白質藉由一個肽連接子(Linker)將反向GLP-1片段之羧基端與GCGR抗體輕鏈或重鏈之胺基端連接或者將反向GLP-1片段之胺基端與一CGR抗體輕鏈或重鏈之羧基端連接。
本文提供了一個GLP-1融合蛋白質，其包括一個GCGR抗體及兩個GLP-1片段；該融合蛋白質藉由一個肽連接子(Linker)將GLP-1片段之羧基端與GCGR抗體輕鏈之胺基端連接：N'-GLP-1-連接子-R-C'; 或者將一GLP-1片段之羧基端及一GCGR抗體重鏈之胺基端連接：N'-GLP-1-連接子-R-C'；其中: N' 代表融合蛋白質多肽鏈之胺基端、C' 代表融合蛋白質多肽鏈之羧基端、GLP-1代表GLP-1片段，R為GCGR抗體之輕鏈或者重鏈之胺基酸序列、及Linker代表肽連接子。
本文提供了一個GLP-1融合蛋白質，其包括一個GCGR抗體及兩個反向GLP-1片段；該融合蛋白質藉由一個肽連接子(Linker)將一反向GLP-1片段之胺基端與一GCGR抗體輕鏈之羧基端連接：N'-R-連接子-反向GLP-1-C'; 或者將一反向GLP-1片段之胺基端及一GCGR抗體重鏈之羧基端連接：N'-R-連接子-反向GLP-1-C'；其中：N'代表融合蛋白質多肽鏈之胺基端，C'代表融合蛋白質多肽鏈之羧基端，反向GLP-1代表反向GLP-1片段，R為GCGR抗體之輕鏈或者重鏈之胺基酸序列，及連接子代表肽連接子。
本文提供了一個聚核苷酸，其編碼本文中所述之一個GCGR抗體。
本文提供了一個聚核苷酸，其編碼本文中所述之一個GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質。
本文提供了一個載體，其包括編碼本文中所述之一個GCGR抗體之聚核苷酸。
本文提供了一個載體，其包括編碼本文中所述之一個GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質之聚核苷酸。
本文提供了一個宿主細胞，其包括本文中所述之一個載體。
本文提供了一個醫藥組合物，其包括本文所描述之一個GCGR抗體及一個醫藥學上可接受之載體。
本文提供了一個醫藥組合物，其包括本文所描述之一個GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質及一個醫藥學上可接受之載體。
本文提供了本文所描述之一個GCGR抗體在製備用於治療、預防或改善二型糖尿病之藥物中之用途。
本文提供了本文所描述之一個GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質在製備用於治療、預防或改善二型糖尿病之藥物中之用途。
本文提供了本文所描述之一個GCGR抗體在製備用於治療、預防或改善二型糖尿病併發症之藥物中之用途。
本文提供了本文所描述之一個GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質在製備用於治療、預防或改善二型糖尿病併發症之藥物中之用途。
本文提供了本文所描述之一個GCGR抗體在製備用於治療、預防或改善高血糖症之藥物中之用途。
本文提供了本文所描述之一個GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質在製備用於治療、預防或改善高血糖症之藥物中之用途。
本文提供了本文所描述之一個GCGR抗體在製備用於治療、預防或改善代謝綜合症之藥物中之用途。
本文提供了本文所描述之一個GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質在製備用於治療、預防或改善代謝綜合症之藥物中之用途。
本文提供了本文所描述之一個GCGR抗體在製備用於治療、預防或改善血脂異常之其他相關之藥物中之用途。
本文提供了本文所描述之一個GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質在製備用於治療、預防或改善血脂異常之其他相關之藥物中之用途。
本文提供了本文所描述之一個GCGR抗體在製備用於同時治療、預防或改善高血糖症、二型糖尿病、代謝綜合症、或血脂異常之其他相關兩種或更多種病症之藥物中之用途。
本文提供了本文所描述之一個GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質在製備用於同時治療、預防或改善高血糖症、二型糖尿病、代謝綜合症、或血脂異常之其他相關兩種或更多種病症之藥物中之用途。
本文提供了治療、預防或改善高血糖症之方法，其包含向個體投與治療有效量之本文所描述之一個GCGR抗體。
本文提供了治療、預防或改善高血糖症之方法，其包含向個體投與治療有效量之本文所描述之一個GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質。
本文提供了治療、預防或改善二型糖尿病之方法，其包含向個體投與治療有效量之本文所描述之一個GCGR抗體。
本文提供了治療、預防或改善二型糖尿病之方法，其包含向個體投與治療有效量之本文所描述之一個GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質。
本文提供了治療、預防或改善代謝綜合症之方法，其包含向個體投與治療有效量之本文所描述之一個GCGR抗體。
本文提供了治療、預防或改善代謝綜合症之方法，其包含向個體投與治療有效量之本文所描述之一個GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質。
本文提供了治療、預防或改善血脂異常之方法，其包含向個體投與治療有效量之本文所描述之一個GCGR抗體。
本文提供了治療、預防或改善血脂異常之方法，其包含向個體投與治療有效量之本文所描述之一個GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質。
本文提供了治療、預防或改善高血糖症、代謝綜合症及包含血脂異常之一種或多種症狀方法，其包含向個體投與治療有效量之本文所描述之一個GCGR抗體。
本文提供了治療、預防或改善高血糖症、代謝綜合症、或血脂異常之一種或多種症狀方法，其包含向個體投與治療有效量之本文所描述之一個GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質。
定義
除非本文另外定義，與本文相關之科學及技術術語應具有一般熟習此項技術者所理解之含義。通常，與本文所描述藥物學、生物學、生物化學、細胞及組織培養學、生物學、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白質核酸化學以及雜交相關之命名法及技術為此項技術中熟知及經常使用的。
本文使用標準之單字母或三字母縮寫表明多聚核苷酸及多肽序列。多肽序列在書寫時，帶有胺基之首個胺基酸殘基(N')在最左而帶有羧基之最末胺基酸殘基(C')在最右、例如本文涉及之GLP-1片段序列：SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、及SEQ ID NO:123。反向多肽序列指將多肽序列之胺基酸出現順序逆向排列後形成之序列，例如上述GLP-1片段序列所形成之反向GLP-1片段序列： SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、及SEQ ID NO: 131。單鏈核酸序列及雙鏈核酸序列之上游鏈之5'端在左而其3'端在右。多肽之具體部分可由胺基酸殘基編號表示，例如胺基酸80至130，或由該位點之實際殘基表示例如Lys80至Lys130。亦可藉由解釋其與參考序列之差異描述具體的多肽或多聚核苷酸序列。
術語「肽」、「多肽」及「蛋白」均指包括兩個或多個藉由肽鍵相互連接之胺基酸之分子。此等術語涵蓋例如天然及人工蛋白及蛋白序列之多肽類似物(例如突變蛋白、變異體及融合蛋白)以及轉錄後或否則為共價或非共價修飾之蛋白。肽、多肽或蛋白可為單體或多聚體。
術語「多肽片段」係指與對應之全長蛋白相比具有胺基端及/或羧基端缺失之多肽。片段長度可為，例如，至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、50、70、80、90、100、150、或200 個胺基酸。片段長度可為，例如，最多1000、750、500、250、200、175、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、14、13、12、11、或10個胺基酸。片段可在其一端或兩端進一步包括一個或多個附加胺基酸，例如，來自不同天然蛋白質之胺基酸序列(例如，Fc或白胺酸拉鏈結構域)或人工胺基酸序列(例如，人工連接子)。
本文之多肽包含以任何原因及經任何方法修飾之多肽，例如，以：(1)降低蛋白水解敏感性，(2)降低氧化敏感性，(3)改變形成蛋白複合物之親和性，(4)改變結合親和性，以及(5)賦予或修飾其他物理化學或功能性質。類似物包括多肽之突變蛋白。例如，可在天然序列(例如在形成分子內接觸之結構域之外的多肽部分)中進行單個或多個胺基酸取代(例如，保守胺基酸取代)。「保守胺基酸取代」為不顯著改變母體序列結構特性者(例如，取代胺基酸不應破壞母體序列中出現之螺旋或干擾其他賦予母體序列特性或對其功能為必須之二級結構類型)。
多肽之「變異體」包括相對於另一多肽序列在胺基酸序列中插入、缺失及/或取代了一個或多個胺基酸殘基之胺基酸序列。本文之變異體包含融合蛋白。
多肽之「衍生物」為經化學修飾之多肽，例如藉由與其他化學部分例如聚乙二醇、白蛋白(例如人血清白蛋白)結合、磷酸化及糖基化。
除非另外說明，術語「抗體」包含兩個全長重鏈及兩個全長輕鏈之抗體，以及其衍生物，變異體、片段及突變蛋白，其實例見下文。
術語「抗體」為包括與抗原結合部分並任選為允許抗原結合部分採取促進該抗體與該抗原結合之構形之支架或構架部分之蛋白。抗體之實例包含完整抗體、抗體片段(例如抗體之抗原結合部分)、抗體衍生物及抗體類似物。該抗體可包括例如可選擇之蛋白支架或具有移植CDR或CDR衍生物之人工支架。該支架包含但不限於包括被引入之例如以穩定化該抗體之三維結構之抗體衍生支架以及包括例如生物相容性多聚體之全合成支架。參見，例如，Korndorfer等，2003，Proteins 53:121-129; Roque 等，2004、Biotechnol. Prog. 20:639-654。此外，該抗體可為模擬肽抗體(「PAM」)或包括模擬抗體之支架，其如支架一樣利用纖維蛋白連接素。
抗體可具有例如天然免疫球蛋白之結構。「免疫球蛋白」為四聚體分子。在天然之免疫球蛋白中，各四聚體由兩個相同之多肽鏈對組成，各對具有一個「輕」鏈(約25 kDa)及一個「重」鏈(約50-70kDa)。各鏈之胺基端包含約100至110胺基酸之可變結構域，主要與抗原識別相關。各鏈之羧基端部分判定了主要與效應作用相關之恆定區。人之抗體輕鏈分為κ及λ輕鏈。重鏈分為μ、δ、α或ε，並判定了抗原之同型，例如分別為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。在輕鏈及重鏈中，可變及恆定區由約12 或更多個胺基酸之「J」區連接，重鏈亦包含約10多個胺基酸之「D」區。參見，Fundamental Immunology Ch.7(Paul 編輯，第2 版，Raven Press，1989)。各輕/重鏈對之可變區形成抗體結合位點，此類完整之免疫球蛋白具有兩個結合位點。
天然免疫球蛋白鏈顯示出由三個高度可變區連接之相對保守構架區(FR)之相同基本結構，亦被稱作互補決定區或CDR。自N端至C端，輕及重鏈均包括結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。各結構域胺基酸之分配與Kabat 等在Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5 版，U.S. Dept. of Health and Human Services、PHS，NIH，NIH Publication No. 91-3242，1991中之定義一致。
除非另外指明，「抗體」係指完整之免疫球蛋白或其可與完整抗體競爭特異性結合之抗原結合部分。可由重組DNA技術或藉由酶或化學裂解完整抗體生產抗原結合部分。抗原結合部分包含，尤其係，Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv、結構域抗體(dAbs)，包含互補決定區(CDR)之片段、單鏈抗體(scFv)、嵌合抗體、雙鏈抗體(diabodies)、三鏈抗體(triabodies)、四鏈抗體(tetrabodies)及至少包括足以賦予多肽特異抗原結合之免疫球蛋白之一部分之多肽。
Fab片段為具有VL 、VH 、CL 及CH1 結構域之單價片段；F(ab')2 片段為具有兩個在鉸鏈區由二硫鍵連接之Fab 片段之二價片段；Fv片段具有VH 及VL 結構域；dAb 片段具有VH 結構域、VL 結構域，或VH 或VL 結構域之抗原結合片段(美國專利號US 6,846,634及US 6,696,245；美國專利申請公開號US 2005/0202512、US 2004/0202995、US 2004/0038291、US 2004/0009507及US 2003/0039958； Ward 等，1989，Nature 341:544-546)。
單鏈抗體(scFv)為一融合蛋白，其中之VL 及VH 區由連接子(例如，合成之胺基酸殘基序列)連接以形成連續蛋白質之抗體，其中該連接子足夠長以允許該蛋白鏈摺疊回自身並形成單價抗原結合位點(參見，例如，Bird 等，1988，Science 242:423-26；及Huston 等，1988、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-83)。
雙鏈抗體為包括兩個多肽鏈之二價抗體，其中各多肽鏈包括由連接子連接之VH 及VL 結構域，該連接子很短以致於不允許兩個結構域在相同鏈上之配對，因此允許各結構域與另一多肽鏈上之互補結構域配對(參見，例如，Holliger等，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-48；及Poljak 等，1994，Structure 2:1121-23)。若雙鏈抗體之兩個多肽鏈相同，則由其配對得到之雙鏈抗體將具有相同之抗原結合位點。具有不同序列之多肽鏈可用於製備具有不同抗原結合位點之雙鏈抗體。相似地，三鏈抗體及四鏈抗體分別為包括三個及四個多肽鏈之抗體並分別形成三個及四個抗原結合位點，其可相同或不同。
本文使用Kabat等在Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版、U.S. Dept. of Health and Human Services、PHS、NIH、NIH Publication No.91-3242，1991中描述之方法鑑定給定抗體之互補決定區(CDR)及構架區(FR)。可向分子中共價或非共價併入一個或多個CDR使其成為抗體。抗體可以較大多肽鏈併入CDR(s)。可將CDR(s)共價連接至另一多肽鏈，或非共價併入CDR(s)。CDR允許抗體與具體之相關抗原特異性結合。
抗體可有一個或多個結合位點。若多於一個結合位點，該結合位點可與另一個相同或不同。例如，天然人免疫球蛋白通常具有兩個相同之結合位點，而「雙特異性」或「雙功能」抗體具有兩個不同之結合位點。
術語「鼠源抗體」包含具有一個或多個來源於小鼠免疫球蛋白序列之可變區及恆定區之抗體。
術語「人源化抗體」係將小鼠抗體分子之互補決定區序列移植到人抗體可變區構架中而製成之抗體。
術語「抗原結合結構域」、「抗原結合區」或「抗原結合位點」為包括與抗原相互作用之胺基酸殘基並有助於抗體對抗原之特異性及親和力之抗體之部分。對與其抗原特異性結合之抗體而言，其將包含至少部分之至少一個其CDR結構域。
術語「抗原決定基」為與抗體(例如，藉由抗體)結合之分子部分。抗原決定基可包括分子之非連續部分(例如，在多肽中，在多肽之一級序列中不連續之胺基酸殘基在該多肽之三級及四級結構中相互足夠接近以致於被一個抗體結合)。
兩個多聚核苷酸或兩個多肽序列之「一致性百分比」由使用GAP電腦程式(GCG Wisconsin Package；version 10.3 (Accelrys，San Diego，CA)之一部分)使用其預設參數比較序列測定。
術語「多聚核苷酸」、「寡聚核苷酸」及「核酸」可在全文中交替使用並包含DNA 分子(例如，cDNA或基因組DNA)、RNA分子(例如mRNA)、使用核苷酸類似物(例如，肽核酸及非天然核苷酸類似物)生成之DNA或RNA類似物及其雜交體。核酸分子可為單鏈或雙鏈。在一個實施中，本文之核酸分子包括編碼本文提供抗體或其片段、衍生物、突變蛋白或變異體連續之開放閱讀框架。
若其序列可反向平行排列則兩個單鏈多聚核苷酸係相互「互補的」，此類多聚核苷酸中之各核苷酸與另一多聚核苷酸中之互補核苷酸相反，不會引入空隙並且各序列之5'或3'端沒有未配對之核苷酸。若兩個多聚核苷酸可在中等嚴格條件下相互雜交則一個多聚核苷酸與另一多聚核苷酸「互補」。因此，一個多聚核苷酸可與另一多聚核苷酸互補，但並非其互補序列。
術語「載體」為可用於將與其相連之另一核酸引入細胞之核酸。載體之一種類型為「質體」，其指可連接附加核酸區段之線性或環狀雙鏈DNA 分子。載體之另一類型為病毒載體(例如，複製缺陷反轉錄病毒、腺病毒及腺病毒伴隨病毒)，其中可將附加DNA區段引入病毒基因組。某些載體可在其被引入之宿主細胞中自主複製(例如，包括細菌複製起點之細菌載體以及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如，非游離型哺乳動物載體)在引入宿主細胞時整合入宿主細胞之基因組中並因此與宿主基因組一起複製。「表現載體」為可引導所選多聚核苷酸表現之載體類型。
若調節序列影響核苷酸序列之表現(例如，表現量、時間或位點)則核苷酸序列與調節序列「可操作地相連」。「調節序列」為可影響與其可操作相連之核酸之表現(例如，表現量、時間或位點)之核酸。調節基因，例如，直接對受調控核酸發揮作用或藉由一個或多個其他分子(例如，與調節序列及/或核酸結合之多聚核苷酸)之作用。調節序列之實例包含啟動子、增強子及其他表現控制元件(例如，聚腺苷酸化信號)。調節序列之進一步實例描述於例如Goeddel，1990、Gene Expression Technology: Methods in Enzymology、Volume 185、Academic Press、San Diego、CA；及Baron 等、1995、Nucleic Acids Res. 23:3605-06。
術語「宿主細胞」為用於表現核酸例如本文提供核酸之細胞。宿主細胞可為原核生物，例如大腸桿菌，或者其可為真核生物，例如單細胞真核生物(例如，酵母或其他真菌)、植物細胞(例如菸草或番茄植物細胞)、動物細胞(例如，人細胞、猴細胞、倉鼠細胞、大鼠細胞、小鼠細胞或昆蟲細胞)或雜交瘤。通常，宿主細胞為可用多肽編碼核酸轉化或轉染之培養細胞，其可接著在宿主細胞中表現。短語「重組宿主細胞」可用於表述用預期表現之核酸轉化或轉染之宿主細胞。宿主細胞亦可為包括該核酸但是不以期望水平表現之細胞，除非向該宿主細胞引入了調節序列，如此其與核酸可操作地相連。應理解，術語宿主細胞不僅指具體之個體細胞亦指該細胞之子代或可能之子代。由於例如突變或環境影響後續世代會出現某些修飾，該子代事實上可能與母體細胞不同但是仍然屬於本文使用之術語範疇。
胰高血糖素受體
胰高血糖素受體屬於七次跨膜之G蛋白偶聯受體家族之B型，其藉由異源三聚體鳥嘌呤核苷酸結合蛋白(G 蛋白)與一個或多個胞內信號傳導途徑偶聯(Jelinek等，1993，Science 259:1614-16)。截止目前之研究發現，GCGR主要表現在肝臟、腎、大腦、脂肪組織、胰腺及心臟(Ahren等，2015，Peptides 67:74-81；Jazayeri等，2016，Nature 533:274-7)，主要參與人體內之糖代謝過程，因此亦與糖尿病、血脂異常相關病症緊密關聯(Lee等，2016，Diabetologia 59:1372-5)，本文中所使用之「人GCGR」及「hGCGR」均指代人源之胰高血糖素受體，可交替使用。本文中所使用之「鼠GCGR」及「mGCGR」均指代鼠源之胰高血糖素受體，亦可交替使用。
在一個實施中，本文提供之抗體係與人GCGR特異性結合之抗體。在另一個實施中，本文提供之抗體係與細胞膜上之GCGR特異性結合之抗體，並且該抗體能抑制或者阻斷胰高血糖素信號在此等細胞內之傳導。在另一個實施中，本文提供之抗體係與人GCGR特異性結合之抗體，並且該抗體能與其他物種之GCGR結合(例如猴子或小鼠)，並阻斷在此等物種中胰高血糖素之信號傳導。在另外的實施例中，本文提供之抗體係與人GCGR結合之鼠源抗體，並且該抗體能與其他物種之GCGR結合(例如猴子)。
在一個實施中，GCGR之胺基酸及多聚核苷酸序列如下所列，序列數據來源於美國國立生物技術資訊中心之GeneBank數據庫以及歐洲生物資訊研究所之Uniprot數據庫：
人(Homo sapiens )多聚核苷酸(SEQ ID NO：77)；寄存號：BC104854；
人(Homo sapiens )胺基酸(SEQ ID NO：73)；寄存號：P47871；
猴子(Rhesus macaque )多聚核苷酸(SEQ ID NO：78)；寄存號：XM_015120592;
猴子(Rhesus macaque )胺基酸(SEQ ID NO：74)；寄存號：A0A1D5QZY8;
大鼠(Rattus norvegicus )多聚核苷酸(SEQ ID NO: 79)；寄存號：X68692；
大鼠(Rattus norvegicus )胺基酸(SEQ ID NO: 75)；寄存號：P30082；
小鼠(Mus musculus )多聚核苷酸(SEQ ID NO：80)；寄存號：BC031885；及
小鼠(Mus musculus )胺基酸(SEQ ID NO：76)；寄存號：Q61606。
胰高血糖素受體抗體(GCGR抗體)。
在一個實施中，本文提供GCGR抗體。在另一個實施中，本文提供之GCGR抗體係完整GCGR抗體。在另一個實施中，本文提供之GCGR抗體係GCGR抗體片段。在另一個實施中，本文提供之GCGR抗體係GCGR抗體衍生物。在另一個實施中，本文提供之GCGR抗體係GCGR抗體突變蛋白。在另外的實施中，本文提供之GCGR抗體係GCGR抗體變異體。
在一個實施例中，本文提供之GCGR抗體包括一個、兩個、三個、四個、五個、或六個胺基酸序列，其中各胺基酸序列獨立地選自於以下所列胺基酸序列：
a. 輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18及SEQ ID NO: 20；
b. 輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 14；
c. 輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19及SEQ ID NO: 21；
d. 重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 25及SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 31及SEQ ID NO: 34；
e. 重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 32及SEQ ID NO: 35；及
f. 重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 33及SEQ ID NO: 36。
表1列出本文提供之GCGR抗體之輕鏈CDR之胺基酸序列，以及其相應之多聚核苷酸編碼序列。表2列出本文提供之GCGR抗體之重鏈CDR之胺基酸序列，以及其相應之多聚核苷酸編碼序列。
表1：輕鏈CDR之胺基酸序列及其多聚核苷酸編碼序列
表2：重鏈CDR之胺基酸序列及其多聚核苷酸編碼序列
在一個實施中，本文提供之抗體包括與表1及表2中所列之CDR胺基酸序列中之一者相差5、4、3、2、或1個單胺基酸添加、取代及/或缺失之序列。在另一個實施中，本文提供之抗體包括與表1及表2中所列之CDR胺基酸序列中之一者相差4、3、2、或1個單胺基酸添加、取代及/或缺失之序列。
在另一個實施中，本文提供之抗體包括與表1及表2中所列之CDR胺基酸序列中之一者相差3、2、或1個單胺基酸添加、取代及/或缺失之序列。
在另一個實施中，本文提供之抗體包括與表1及表2中所列之CDR胺基酸序列中之一者相差2或1個單胺基酸添加、取代及/或缺失之序列。
在另外的實施中，本文提供之抗體包括與表1及表2中所列之CDR胺基酸序列中之一者相差1個單胺基酸添加、取代及/或缺失之序列。
在一個實施中，本文提供之GCGR抗體包括一個或兩個胺基酸序列，其中各胺基酸序列獨立地選自於以下所列胺基酸序列：
a.輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18及SEQ ID NO: 20；及
b.重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 25及SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 31及SEQ ID NO: 34。
在另一個實施中，本文提供之GCGR抗體包括一個或兩個胺基酸序列，其中各胺基酸序列獨立地選自於以下所列胺基酸序列：
a.輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 14；及
b.重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 32及SEQ ID NO: 35。
在另一個實施中，本文提供之GCGR抗體包括一個或兩個胺基酸序列，其中各胺基酸序列獨立地選自於以下所列胺基酸序列：
a.輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19及SEQ ID NO: 21；及
b.重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 33及SEQ ID NO: 36。
在另一個實施中，本文提供之GCGR抗體包括一個，兩個，三個，或四個胺基酸序列，其中各胺基酸序列獨立地選自於以下所列之胺基酸序列：
a. 輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18及SEQ ID NO: 20；
b. 重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 25及SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 31及SEQ ID NO: 34；
c. 輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 14；及
d. 重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 32及SEQ ID NO: 35。
在另一個實施中，本文提供之GCGR抗體包括一個，兩個，三個，或四個胺基酸序列，其中各胺基酸序列獨立地選自於以下所列之胺基酸序列：
a. 輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18及SEQ ID NO: 20；
b. 重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 25及SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 31及SEQ ID NO: 34；
c. 輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19及SEQ ID NO: 21；及
d. 重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 33及SEQ ID NO: 36。
在另外的實施中，本文提供之GCGR抗體包括一個，兩個，三個，或四個胺基酸序列，其中各胺基酸序列獨立地選自於以下所列之胺基酸序列：
a. 輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 14；
b. 重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 32及SEQ ID NO: 35；
c. 輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19及SEQ ID NO: 21；及
d. 重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 33及SEQ ID NO: 36。
在一個實施中，本文提供之GCGR抗體包括一個，兩個，或三個胺基酸序列，其中各胺基酸序列獨立地選自於以下所列之胺基酸序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20及SEQ ID NO: 21。
在另一個實施中，本文提供之GCGR抗體包括一個，兩個，或三個胺基酸序列，其中各胺基酸序列獨立地選自於以下所列之胺基酸序列：SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35及SEQ ID NO: 36。
在一個實施中，本文提供之GCGR抗體包括一個獨立地選自於以下所列之輕鏈及重鏈CDR1胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 1與SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 4與SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 7與SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 10與SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 13與SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 16與SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 18與SEQ ID NO: 34及SEQ ID NO: 20與SEQ ID NO: 34。
在另一個實施中，本文提供之GCGR抗體包括一個獨立地選自於以下所列之輕鏈及重鏈CDR2胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 2與SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 5與SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 8與SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 11與SEQ ID NO: 32及SEQ ID NO: 14與SEQ ID NO: 35。
在另外的實施中，本文提供之GCGR抗體包括一個獨立地選自於以下所列之輕鏈及重鏈CDR3胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 3與SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 6與SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 9與SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 12與SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 15與SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 17與SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 19與SEQ ID NO: 36及SEQ ID NO: 21與SEQ ID NO: 36。
在一個實施中，本文提供之GCGR抗體包括：
a. 一個獨立地選自於以下所列之輕鏈及重鏈CDR1胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 1與SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 4與SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 7與SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 10與SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 13與SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 16與SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 18與SEQ ID NO: 34及SEQ ID NO: 20與SEQ ID NO: 34；及
b. 一個獨立地選自於以下所列之輕鏈及重鏈CDR2胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 2與SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 5與SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 8與SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 11與SEQ ID NO: 32及SEQ ID NO: 14與SEQ ID NO: 35。
在另一個實施中，本文提供之GCGR抗體包括：
a. 一個獨立地選自於以下所列之輕鏈及重鏈CDR1胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 1與SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 4與SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 7與SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 10與SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 13與SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 16與SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 18與SEQ ID NO: 34及SEQ ID NO: 20與SEQ ID NO: 34；及
b. 一個獨立地選自於以下所列之輕鏈及重鏈CDR3胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 3與SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 6與SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 9與SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 12與SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 15與SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 17與SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 19與SEQ ID NO: 36及SEQ ID NO: 21與SEQ ID NO: 36。
在另一個實施中，本文提供之GCGR抗體包括：
a. 一個獨立地選自於以下所列之輕鏈及重鏈CDR2胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 2與SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 5與SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 8與SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 11與SEQ ID NO: 32及SEQ ID NO: 14與SEQ ID NO: 35；及
b. 一個獨立地選自於以下所列之輕鏈及重鏈CDR3胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 3與SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 6與SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 9與SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 12與SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 15與SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 17與SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 19與SEQ ID NO: 36及SEQ ID NO: 21與SEQ ID NO: 36。
在進一步實施中，本文提供之GCGR抗體包括：
a. 一個獨立地選自於以下所列之輕鏈及重鏈CDR1胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 1與SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 4與SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 7與SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 10與SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 13與SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 16與SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 18與SEQ ID NO: 34及SEQ ID NO: 20與SEQ ID NO: 34；
b. 一個獨立地選自於以下所列之輕鏈及重鏈CDR2胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 2與SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 5與SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 8與SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 11與SEQ ID NO: 32及SEQ ID NO: 14與SEQ ID NO: 35；及
c. 一個獨立地選自於以下所列之輕鏈及重鏈CDR3胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 3與SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 6與SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 9與SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 12與SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 15與SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 17與SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 19與SEQ ID NO: 36及SEQ ID NO: 21與SEQ ID NO: 36。
在一個實施中，本文提供之GCGR抗體包括：
a. 輕鏈及重鏈CDR1、CDR2及CDR3胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23及SEQ ID NO: 24；
b. 輕鏈及重鏈CDR1、CDR2及CDR3胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26及SEQ ID NO: 27；
c. 輕鏈及重鏈CDR1、CDR2及CDR3胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29及SEQ ID NO: 30；
d. 輕鏈及重鏈CDR1、CDR2及CDR3胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32及SEQ ID NO: 33；
e. 輕鏈及重鏈CDR1、CDR2及CDR3胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35及SEQ ID NO: 36；
f. 輕鏈及重鏈CDR1、CDR2及CDR3胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35及SEQ ID NO: 36；
g. 輕鏈及重鏈CDR1、CDR2及CDR3胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35及SEQ ID NO: 36；及
h. 輕鏈及重鏈CDR1、CDR2及CDR3胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35及SEQ ID NO: 36。
在一個實施中，本文提供之GCGR抗體包括一個或兩個胺基酸序列，其中各胺基酸序列獨立地選自於以下所列胺基酸序列：
a. 輕鏈可變結構域胺基酸序列：SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89及SEQ ID NO: 90；及與其任一序列有至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%一致性之胺基酸序列；及
b. 重鏈可變結構域胺基酸序列：SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 96及SEQ ID NO: 97；及與其任一序列有至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%一致性之胺基酸序列。
在另一個實施中，本文提供之GCGR抗體之多聚核苷酸編碼序列包括一個或兩個多聚核苷酸編碼序列，其中各多聚核苷酸編碼序列獨立地選自於以下所列多聚核苷酸序列：
a. 輕鏈可變結構域多聚核苷酸編碼序列：SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100及SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103及SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106及SEQ ID NO: 107；及與其任一序列有至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%一致性之多聚核苷酸編碼序列；及
b. 重鏈可變結構域多聚核苷酸編碼序列：SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113及SEQ ID NO: 114；及與其任一序列有至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%一致性之多聚核苷酸編碼序列。
在一個實施中，本文提供之GCGR抗體包括一個獨立地選自於以下所列之胺基酸序列：SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89及SEQ ID NO: 90。
在另一個實施中，本文提供之GCGR抗體包括一個獨立地選自於以下所列之胺基酸序列：SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 96及SEQ ID NO: 97。
在一個實施中，本文提供之GCGR抗體包括一個獨立地選自於以下所列之輕鏈與重鏈可變結構域胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 81與SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 82與SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 83與SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 84與SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 85與SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 86與SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 87與SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 88與SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 89與SEQ ID NO: 97及SEQ ID NO: 90與SEQ ID NO: 97。
在一個實施中，本文提供之GCGR抗體包括一個獨立地選自於以下所列之胺基酸序列：SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 96及SEQ ID NO: 97。
在另一個實施中，本文提供之GCGR抗體包括一個獨立地選自於以下所列之輕鏈與重鏈可變結構域胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 81與SEQ ID NO: 91(L1H1)、SEQ ID NO: 82與SEQ ID NO: 92(L2H2)、SEQ ID NO: 84與SEQ ID NO: 94(L4H4)、SEQ ID NO: 85與SEQ ID NO: 95(L5H5)、SEQ ID NO: 86與SEQ ID NO: 96(L6H6)、SEQ ID NO: 87與SEQ ID NO: 97(L7H7)、SEQ ID NO: 88與SEQ ID NO: 97(L8H7)及SEQ ID NO: 89與SEQ ID NO: 97(L9H7)。
本文亦可用「LxHy」符號來指代所提供之GCGR抗體，其中「x」對應於輕鏈可變區序列代號；「y」對應於重鏈可變區序列代號。例如，L2H2指具有包括SEQ ID NO: 82(L2)胺基酸序列之輕鏈可變區及包括SEQ ID NO: 92(H2)胺基酸序列之重鏈可變區之完整抗體。
在一個實施中，本文提供之GCGR抗體包括一或兩個胺基酸序列，其中各胺基酸序列獨立地選自於以下所列之胺基酸序列：
a. 輕鏈恆定胺基酸序列：SEQ ID NO: 115及SEQ ID NO: 116；及
b. 重鏈恆定胺基酸序列：SEQ ID NO: 117及SEQ ID NO: 118。
在一個實施中，本文提供之GCGR抗體包括一或兩個胺基酸序列，其中各胺基酸序列獨立地選自於以下所列之胺基酸序列：
a. 輕鏈恆定胺基酸序列：SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 132及SEQ ID NO: 133；及
b. 重鏈恆定胺基酸序列：SEQ ID NO: 117及SEQ ID NO: 118。
在一個實施中，本文提供之GCGR抗體包括一或兩個胺基酸序列，其中各胺基酸序列獨立地選自於以下所列之輕鏈及重鏈恆定胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 115及SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 115及SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 116及SEQ ID NO: 117及SEQ ID NO: 116及SEQ ID NO: 118。
在另一個實施中，本文提供之GCGR抗體包括一或兩個胺基酸序列，其中各胺基酸序列獨立地選自於以下所列之輕鏈及重鏈恆定胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 115及SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 115及SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 116及SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 116及SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 132及SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 132及SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 133及SEQ ID NO: 117及SEQ ID NO: 133及SEQ ID NO: 118。
在一個實施中，本文提供之GCGR抗體包括本文所列輕鏈及重鏈CDR，以及FR (構架)之胺基酸序列。FR之胺基酸序列包括於輕鏈或者重鏈可變結構域胺基酸序列中，未單獨陳列。在一個實施中，該抗體包括一個本文所列之輕鏈CDR1序列。在另一個實施中，該抗體包括一個本文所列之輕鏈CDR2序列。在另一個實施中，該抗體包括一個本文所列之輕鏈CDR3序列。在另一個實施中，該抗體包括一個本文所列之重鏈CDR1序列。在另一個實施中，該抗體包括一個本文所列之重鏈CDR2序列。在另一個實施中，該抗體包括一個本文所列之重鏈CDR3序列。在另一個實施中，該抗體包括一個本文之輕鏈FR1序列。在另一個實施中，該抗體包括一個本文之輕鏈FR2序列。在另一個實施中，該抗體包括一個本文之輕鏈FR3序列。在另一個實施中，該抗體包括一個本文之輕鏈FR4序列。在另一個實施中，該抗體包括一個本文之重鏈FR1序列。在另一個實施中，該抗體包括一個本文之重鏈FR2序列。在另一個實施中，該抗體包括一個本文之重鏈FR3序列。在另外的實施中，該抗體包括一個本文之重鏈FR4序列。
在一個實施中，該抗體之輕鏈CDR3序列與本文所列輕鏈CDR3胺基酸序列SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19及SEQ ID NO: 21之一者相差不得超過6、5、4、3、2、或1個單胺基酸添加、取代及/或缺失。在另一個實施中，該抗體之重鏈CDR3序列與本文所列重鏈CDR3胺基酸序列SEQ ID NO: 33或SEQ ID NO: 36相差最多不超過6、5、4、3、2、或1個單胺基酸添加、取代及/或缺失。在另外的實施中，該抗體之輕鏈CDR3序列與本文所列輕鏈CDR3胺基酸序列SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19及SEQ ID NO: 21之一者相差不得超過6、5、4、3、2、或1個單胺基酸添加、取代及/或缺失，並且該抗體之重鏈CDR3序列與本文所列重鏈CDR3胺基酸序列SEQ ID NO: 33或SEQ ID NO: 36相差最多不超過6、5、4、3、2、或1個單胺基酸添加、取代及/或缺失。在另一個實施中，該抗體進一步包括1、2、3、4、5、或6個本文所列輕重鏈CDR輕重鏈序列組合。
在一個實施中，本文提供之GCGR抗體包括一個輕鏈可變結構域胺基酸序列，該序列選擇於本文所列之L1 (SEQ ID NO: 81)、L2 (SEQ ID NO: 82)、L4 (SEQ ID NO: 84)、L5 (SEQ ID NO: 85)、L6 (SEQ ID NO: 86)、L7 (SEQ ID NO: 87)、L8 (SEQ ID NO: 88)及L9 (SEQ ID NO: 89)輕鏈可變結構域序列。在一個實施中，該GCGR抗體之輕鏈可變結構域胺基酸序列與L1 (SEQ ID NO: 81)、L2 (SEQ ID NO: 82)、L4 (SEQ ID NO: 84)、L5 (SEQ ID NO: 85)、L6 (SEQ ID NO: 86)、L7 (SEQ ID NO: 87)、L8 (SEQ ID NO: 88)及L9 (SEQ ID NO: 89)中之一者的輕鏈可變結構域胺基酸序列存在15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1個胺基酸之差異的，其中各序列之差異獨立為一個胺基酸殘基之缺失、插入或取代。在另一個實施中，該GCGR抗體之輕鏈可變結構域胺基酸序列與L1 (SEQ ID NO: 81)、L2 (SEQ ID NO: 82)、L4 (SEQ ID NO: 84)、L5 (SEQ ID NO: 85)、L6 (SEQ ID NO: 86)、L7 (SEQ ID NO: 87)、L8 (SEQ ID NO: 88)及L9 (SEQ ID NO: 89)中之一者的輕鏈可變結構域胺基酸序列有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、或至少99%一致性。在另一個實施中，該GCGR抗體之輕鏈可變結構域多聚核苷酸編碼序列與L1 (SEQ ID NO: 81)、L2 (SEQ ID NO: 82)、L4 (SEQ ID NO: 84)、L5 (SEQ ID NO: 85)、L6 (SEQ ID NO: 86)、L7 (SEQ ID NO: 87)、L8 (SEQ ID NO: 88)及L9 (SEQ ID NO: 89)中之一者的多聚核苷酸編碼序列有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、或至少99%一致性。在另一個實施中，該GCGR抗體之輕鏈可變結構域多聚核苷酸編碼序列包括在中等條件下與L1 (SEQ ID NO: 81)、L2 (SEQ ID NO: 82)、L4 (SEQ ID NO: 84)、L5 (SEQ ID NO: 85)、L6 (SEQ ID NO: 86)、L7 (SEQ ID NO: 87)、L8 (SEQ ID NO: 88)及L9 (SEQ ID NO: 89)中之一者的輕鏈可變結構域之多聚核苷酸編碼序列互補序列雜交之多聚核苷酸序列。在另外的實施中，該GCGR抗體之輕鏈可變結構域多聚核苷酸編碼序列包括在嚴格條件下與L1 (SEQ ID NO: 81)、L2 (SEQ ID NO: 82)、L4 (SEQ ID NO: 84)、L5 (SEQ ID NO: 85)、L6 (SEQ ID NO: 86)、L7 (SEQ ID NO: 87)、L8 (SEQ ID NO: 88)及L9 (SEQ ID NO: 89)中之一者的輕鏈可變結構域之多聚核苷酸編碼序列互補序列雜交之多聚核苷酸序列。
在一個實施中，本文提供之GCGR抗體包括一個重鏈可變結構域胺基酸序列，該序列選擇於本文所列H1 (SEQ ID NO: 91)、H2 (SEQ ID NO: 92)、H4 (SEQ ID NO: 94)、H5 (SEQ ID NO: 95)、H6 (SEQ ID NO: 96)及H7(SEQ ID NO: 97)重鏈可變結構域序列。在另一個實施中，該GCGR抗體之重鏈可變結構域胺基酸序列與H1 (SEQ ID NO: 91)、H2 (SEQ ID NO: 92)、H4 (SEQ ID NO: 94)、H5 (SEQ ID NO: 95)、H6 (SEQ ID NO: 96)及H7(SEQ ID NO: 97)中之一者的重鏈可變結構域序列存在15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1個胺基酸差異，其中各序列之差異獨立為一個胺基酸殘基之缺失、插入或取代。在另一個實施中，該GCGR抗體之重鏈可變結構域胺基酸序列與H1 (SEQ ID NO: 91)、H2 (SEQ ID NO: 92)、H4 (SEQ ID NO: 94)、H5 (SEQ ID NO: 95)、H6 (SEQ ID NO: 96)及H7(SEQ ID NO: 97)中之一者的重鏈可變結構域序列有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、或至少99%一致性。在另一個實施中，該GCGR抗體之重鏈可變結構域多聚核苷酸編碼序列與H1 (SEQ ID NO: 91)、H2 (SEQ ID NO: 92)、H4 (SEQ ID NO: 94)、H5 (SEQ ID NO: 95)、H6 (SEQ ID NO: 96)及H7(SEQ ID NO: 97)中之一者的重鏈可變結構域多聚核苷酸編碼序列有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、或至少99%一致性。在另一個實施中，該GCGR抗體之重鏈可變結構域多聚核苷酸編碼序列包括在中等嚴格條件下與H1 (SEQ ID NO: 91)、H2 (SEQ ID NO: 92)、H4 (SEQ ID NO: 94)、H5 (SEQ ID NO: 95)、H6 (SEQ ID NO: 96)及H7(SEQ ID NO: 97)中之一者的重鏈可變結構域之多聚核苷酸編碼序列互補序列雜交之多聚核苷酸序列。在一個實施中，該GCGR抗體之重鏈可變結構域多聚核苷酸編碼序列包括在嚴格條件下與H1 (SEQ ID NO: 91)、H2 (SEQ ID NO: 92)、H4 (SEQ ID NO: 94)、H5 (SEQ ID NO: 95)、H6 (SEQ ID NO: 96)及H7 (SEQ ID NO: 97)中之一者的重鏈可變結構域之多聚核苷酸編碼序列互補序列雜交之多聚核苷酸序列。
在一個實施中，本文提供之抗體係一包括L1H1 (SEQ ID NO: 81與SEQ ID NO: 91)、L2H2 (SEQ ID NO: 82與SEQ ID NO: 92)、L3H3 (SEQ ID NO: 83與SEQ ID NO: 93)、L4H4 (SEQ ID NO: 84與SEQ ID NO: 94)、L5H5 (SEQ ID NO: 85與SEQ ID NO: 95)、L6H6 (SEQ ID NO: 86與SEQ ID NO: 96)、L7H7 (SEQ ID NO: 87與SEQ ID NO: 97)、L8H7(SEQ ID NO: 88與SEQ ID NO: 97)、L9H7(SEQ ID NO: 89與SEQ ID NO: 97)、或L10H7 (SEQ ID NO: 90與SEQ ID NO: 97)組合之抗體，或其一之期望表型(例如，IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgE、或IgD)，或其一Fab或F(ab')2片段。
在一個實施中，本文提供之抗體係一包括L1H1 (SEQ ID NO: 81與SEQ ID NO: 91)、L2H2 (SEQ ID NO: 82與SEQ ID NO: 92)、L4H4 (SEQ ID NO: 84與SEQ ID NO: 94)、L5H5 (SEQ ID NO: 85與SEQ ID NO: 95)、L6H6 (SEQ ID NO: 86與SEQ ID NO: 96)、L7H7 (SEQ ID NO: 87與SEQ ID NO: 97) 、L8H6 (SEQ ID NO: 88與SEQ ID NO: 97)或L9H7 (SEQ ID NO: 89與SEQ ID NO: 97)組合之抗體，或其一類轉換之抗體(例如，IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgE及IgD)，或其一Fab或F(ab')2片段。
本文提供之抗體可包括此項技術中已知之恆定區中任何一者。輕鏈恆定區可為例如κ或λ型輕鏈恆定區，例如小鼠κ或λ型輕鏈恆定區。重鏈恆定區可為例如α、δ、ε、γ、或μ型重鏈恆定區，例如小鼠α、δ、ε、γ、或μ型重鏈恆定區。在一個實施中，該輕鏈或重鏈恆定區為天然恆定區之片段、衍生物、變異體、或突變蛋白。
在一個實施中，本文提供之抗體進一步包括人恆定輕鏈κ或λ結構域或其片段。輕鏈恆定區之胺基酸序列如下：
人恆定輕鏈κ結構域胺基酸序列：(SEQ ID NO: 115)；及
人恆定輕鏈λ結構域胺基酸序列：(SEQ ID NO: 116)。
在一個實施中，本文提供之抗體進一步包括人恆定輕鏈κ或λ結構域或其片段。輕鏈恆定區之胺基酸序列如下：
人恆定輕鏈κ結構域胺基酸序列：(SEQ ID NO: 132)；及
人恆定輕鏈λ結構域胺基酸序列：(SEQ ID NO: 133)。
在另一個實施中，本文提供之抗體進一步包括人重鏈恆定結構域或其片段。重鏈恆定區胺基酸序列序列如下：
人重鏈恆定區胺基酸序列(hIgG2)：(SEQ ID NO: 117)；及
人重鏈恆定區胺基酸序列(hIgG4)：(SEQ ID NO: 118)。
在一個實施例中，本文所提供之GCGR抗體選自鼠源抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單株抗體、多株抗體、重組抗體、抗原結合抗體片段、單鏈抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、Fab片段、F(ab')x片段、結構域抗體、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgGl抗體、IgG2抗體、IgG3抗體、或IgG4抗體。
在一個實施例中，本文提供之GCGR抗體為GCGR單株抗體。
在另一個實施例中，本文提供之GCGR抗體為一單株抗體、該單株抗體包括一個選自於以下所列之胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 81與SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 82與SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 83與SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 84與SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 85與SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 86與SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 87與SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 88與SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 89與SEQ ID NO: 97，及SEQ ID NO: 90與SEQ ID NO: 97。
在一個實施例中，本文提供之GCGR抗體為鼠源GCGR抗體。在另一個實施例中，本文提供之GCGR抗體為人源化GCGR抗體。
在一個實施例中，本文提供之GCGR抗體降低人信號傳導之IC50 值為大約1 nM 至大約300 nM或大約1 nM至大約150 nM。
抗體及抗體片段
在一個實施中，本文提供之抗體為完整抗體(包含具有全長重及/或輕鏈之多株、單株、嵌合、人源化、或人類抗體)。在另一個實施中，本文提供之抗體為抗體片段，例如F(ab')2 、Fab、Fab'、Fv、Fc、或Fd片段，單結構域抗體、單鏈抗體、最大抗體(maxibodies)、微型抗體(minibodies)、內抗體(intrabodies)、二鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、v-NAR、或bis-scFv (參見，例如Hollinger and Hudson，2005，Nature Biotechnology 23:1126-1136)。在另一個實施中，本文提供之抗體包含如美國專利號6703199中所揭示之抗體多肽，包含纖維結合素多肽單抗體。在另外的實施中，本文提供之抗體包含如美國專利出版物2005/0238646中所揭示之單鏈多肽。
在一個實施中，單株抗體之基因之可變區係使用核苷酸引子擴增在雜交瘤中表現。此等引子可由一般熟習此項技術者合成或購自商業來源。鼠及人可變區引子包含VHa 、VHb 、VHc 、VHd 、CH1 、VL 及CL 區之引子可購自商業來源。此等引子可用於擴增重鏈或輕鏈可變區，然後將其分別插入載體例如IMMUNOZAPTM H或IMMUNOZAPTM L (Stratagene)中。然後將此等載體引入大腸桿菌、酵母或哺乳動物為基礎之表現系統。此等方法可使用於生產大量包括VH 及VL 結構域融合之單鏈蛋白(參見Bird等，1988，Science 242:423-426)。
此項技術中技術人員應理解，一些蛋白質，例如抗體，可能進行可多種轉錄後修飾。此等修飾之類型及程度取決於用於表現該蛋白之宿主細胞株以及培養條件。該類修飾包含糖基化作用、甲硫胺酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬胺酸異構化及天冬醯胺脫醯胺作用之變化。抗體之羧端鹼性殘基(例如離胺酸或精胺酸)因羧肽酶之頻繁修飾作用而可能丟失(參見，Harris，1995，Journal of Chromatography 705:129-134)。
鼠單株抗體可使用常用之雜交瘤細胞方法來生產。該單株抗體可藉由多種已確立之技術分離及純化。該類分離技術包含蛋白A-瓊脂糖之親和層析法、分子排阻層析法及離子交換層析法(參見，例如，Coligan第2.7.1-2.7.12頁及第2.9.1-2.9.3頁；Baines等，「Purification of Immunoglobulin G(IgG)」，Methods in Molecular Biology，第10卷，第79-104頁(The Humana Press，Inc.，1992))。該單株抗體可使用基於抗體之特殊性質(例如，重鏈或輕鏈同型、結合特異性等)篩選之適當配糖基藉由親和層析法來純化。親和層析之適當配糖基之實例包含蛋白A、蛋白G、抗恆定區(輕鏈或重鏈)抗體、抗獨特型抗體以及TGF-β結合蛋白或其片段或變異體。
可使用抗體結合位點中央之互補決定區(CDR)對分子進行親和力成熟化之改造，來得到親和性增加之抗體，例如針對c-erbB-2之親和性增加之抗體(Schier等，1996，J.Mol. Biol. 263:551-567)。因此，該類技術可用於製備人GCGR之抗體。
例如可在偵測是否存在人GCGR之活體外或活體內測定法中使用針對人GCGR之抗體。
亦可藉由任何傳統技術製備抗體。例如，可自天然表現此等抗體之細胞將其純化(例如，可自生產抗體之雜交瘤將其純化)或使用此項技術中任何已知之技術在重組表現系統中生產。參見，例如，Monoclonal Antibodies、Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses、Kennet等編輯，Plenum Press(1980)；及Antibodies: A Laboratory Manual、Harlow and Land編輯、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988)。其在下文之核酸部分論述。
可藉由任何已知技術製備抗體並篩選期望性質。一些技術係關於分離編碼相關抗體(例如，抗GCGR抗體)之多肽鏈(或其部分)之核酸，並藉由重組DNA技術操作核酸。該核酸可與另一相關核酸融合或經修飾(例如藉由誘變或其他傳統技術)以添加、缺失或取代一個或多個胺基酸殘基。
當需要提高根據本文包括一個或多個上述CDR之抗體之親和性時，可藉由多種親和成熟方案包含維持CDR (Yang等，1995，J.Mol. Biol. 254: 392-403)、鏈取代(Marks等，1992，Bio/Technology 10:779-783)、使用大腸桿菌之突變株(Low等，1996，J.Mol. Biol. 250:350-368) DNA重排(Patten等，1997，Curr. Opin. Biotechnol. 8:724-733)、噬菌體展示(Thompson等，1996，J.Mol. Biol. 256:7-88)以及其他PCR技術(Crameri等，1998，Nature 391：288-291)。所有此等親和力成熟方法論述於Vaughan等，1998，Nature Biotechnology 16:535-539 中。
在一個實施中，本文提供之抗體為抗GCGR片段。該片段可完全由抗體衍生序列組成或可包括附加序列。抗原結合片段之實例包含Fab、F(ab')2、單鏈抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體及結構域抗體，其他實例提供於Lunde等，2002，Biochem. Soc. Trans. 30:500-06。
可經胺基酸橋(短肽連接子)連接重鏈及輕鏈可變結構域(Fv區)形成單鏈抗體，從而得到單多肽鏈。已藉由將編碼肽連接子之DNA融合在編碼兩個可變結構域多肽(VL 及VH )之DNAs之間製備該單鏈Fv (scFv)。所得多肽可摺疊回自身形成抗原結合單體，或其可形成多聚體(例如，二聚體、三聚體或四聚體)，取決於兩個可變結構域之間的柔性連接子之長度(Kortt等，1997，Prot.Eng. 10:423；Kortt等2001，Biomol. Eng. 18:95-108)。藉由組合包括多肽之不同VL 及VH ，可形成與不同表型結合之多體scFvs(Kriangkum等，2001，Biomol. Eng. 18:31-40)。已研發之用於生產單鏈抗體之技術包含美國專利第4946778號; Bird，1988，Science 242:423; Huston等，1988、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Ward等，1989，Nature 334:544-546; de Graaf等，2002，Methods Mol Biol. 178:379-87申描述之彼等者。來源於本文提供之抗體之單鏈抗體包含但不限於包括可變結構域組合L1H1之scFv，均涵蓋於本文。
亦可藉由抗體之蛋白水解作用例如根據傳統方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整之抗體獲得來源於抗體之抗原結合片段。舉例而言，可用胃蛋白酶酶裂解抗體提供稱作F(ab')2之SS片段生產抗體片段。可使用巰基還原劑進一步裂解此片段以產生3.5S Fab'單價片段。可選擇之方案有，使用巰基保護基團進行該裂解反應得到二硫鍵之裂解；另外進一步可以使用木瓜蛋白酶之酶裂解直接產生兩個單價Fab片段及一個Fc片段。此等方法描述於例如Goldenberg，美國專利第4,331,647號，Nisonoff等，1960，Arch. Biochem. Biophys. 89:230; Porter，1959，Biochem. J. 73:119; Edelman等，Methods in Enzymology l:422(Academic Press，1967)； 以及Andrews及Titus、J.A. Current Protocols in Immunology (Coligan等編輯，John Wiley & Sons、2003)，第2.8,1-2.8.10頁及第2.10A.1-2.10A.5頁。其他裂解抗體之方法，例如製備重鏈以形成單價重、輕鏈片段(Fd)，進一步裂解片段或亦可使用其他酶、化學或基因技術，只要片段與可被該完整抗體識別之抗原結合。
另一種形式之抗體片段為包括一個或多個抗體互補決定區(CDR)之肽。可藉由構築編碼相關CDR之多肽獲得CDR。例如可藉由使用聚合酶鏈式反應用抗體生成細胞之mRNA作為模板合成可變區製備該類多肽，參見，例如，Larrick等，1991，Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106；Courtenay-Luck，「Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies,」 Monoclonal Antibodies: Production、Engineering and Clinical Application，Ritter等編輯，166頁(Cambridge University Press，1995)；及Ward等，「Genetic Manipulation and Expression of Antibodies,」 Monoclonal Antibodies: Principles and Applications，Birch等編輯，137頁(Wiley-Liss，Inc.，1995)。該抗體片段可進一步包括本文所描述抗體之至少一個可變結構域。因此，例如，V區結構域可為單體並且係VH 或VL 結構域，其可以如下文所述之至少等於1 × 10-7 M或更高之親和力獨立與GCGR結合。
該可變區結構域可為任何天然可變結構域或其基因工程形式。基因工程形式係指使用重組DNA工程技術生產之可變區結構域。該基因工程形式包含例如藉由向特異抗體之胺基酸序列插入、缺失或改變自特異抗體可變區產生的。具體實例包含包括只含一個CDR以及任選來自一個抗體之一個或多個構架胺基酸及來自另一抗體之可變區結構域剩餘部分，並由基因工程組裝成的可變區結構域。
可變區結構域可與至少一個其他抗體結構域或其片段在C端胺基酸共價連接。因此，舉例而言，存在於可變區結構域之VH 結構域可與免疫球蛋白CH1 結構域或其片段相連。相似地，VL 結構域可與CK 結構域或其片段相連。以此方式，例如，該抗體可為Fab片段，其中抗原結合結構域包括其C端分別與CH1 及CK 結構域共價連接之聯合VH 及VL 結構域。可用其他胺基酸延長CH1 結構域，例如以提供鉸鏈區或如Fab'片段中之部分鉸鏈結構域或提供其他結構域，例如抗體CH2 及CH3 結構域。
抗體之衍生物及變異體
例如可藉由隨機誘變或藉由定點誘變(例如寡聚核苷酸誘導之定點誘變)改變編碼對應於胺基酸序列L1及H1之核苷酸序列，以產生與未突變多聚核苷酸相比包括一個或多個具體核苷酸取代、缺失或插入之經改變之多聚核苷酸。用於產生該類改變之技術實例描述於Walder等，1986，Gene 42:133；Bauer等，1985，Gene 37:73；Craik、1985、BioTechniques、3:12-19; Smith等，1981、Genetic Engineering: Principles and Methods，Plenum Press；以及美國專利第4518584號及第4737462號。此等及其他方法可用於產生例如與未衍生化抗體相比具有期望性質(例如親和性、親和力或對GCGR之特異性增強、活體內或活體外活性或穩定性增強或活體內副作用降低)之抗GCGR抗體之衍生物。
本文領域之其他抗GCGR抗體衍生物包含抗GCGR抗體或其片段與它蛋白或多肽之共價或聚集結合物，例如藉由表現包括與抗GCGR抗體多肽之N端或C端融合之異源多肽之重組融合蛋白。例如，該結合肽可為異源信號(或引導)多肽，例如酵母α因子前導肽或例如抗原決定基標籤之肽。包括融合蛋白之抗體可包括被添加以輔助抗體之純化或鑑定之肽(例如多聚組胺酸)。抗體亦可與FLAG肽連接，如Hopp等，1988、Bio/Technology 6:1204及美國專利5011912所述。FLAG肽具有高抗原性並提供被特異單株抗體(mAb)可逆結合之抗原決定基，允許已表現重組蛋白之快速偵測及方便純化。可商業購買(Sigma-Aldrich，St. Louis，MO)用於製備其中FLAG肽與給定多肽融合之融合蛋白之試劑，在另一個實施中，包括一個或多個抗體之寡聚體可用作GCGR拮抗劑或用更高級之寡聚體。寡聚體可為共價連接之或非共價連接之二聚體、三聚體或更高之寡聚體形式。可使用包括兩個或更多個抗體之寡聚體，其中一個實例為同型二聚體。其他寡聚體包含異二聚體、同型三聚體、異三聚體、同型四聚體、雜四聚體等。
一個實施係針對包括多個抗體之寡聚體，其藉由與抗體融合之肽部分之間的共價或非共價相互作用連接。該類肽可為肽間隔物(spacer)或具有促進寡聚化作用性質之肽。白胺酸拉鏈及某些來源於抗體之多肽為可促進抗體寡聚化之肽，如下文詳細描述。
在具體之實施中，寡聚體包括兩個至四個抗體。寡聚體之抗體可為任何形式，如上文所述任何形式，例如變異體或片段。較佳地，該寡聚體包括具有GCGR結合活性之抗體。
在一個實施中，使用來源於免疫球蛋白之多肽製備寡聚體。製備包括一些與抗體衍生多肽(包含Fc結構域)之不同部位融合之異源多肽已描述於例如Ashkenazi等，1991，PNAS USA 88:10535；Byrn等，1990、Nature 344:677; 及Hollenbaugh等，Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins、Current Protocols in Immunology、Suppl. 4，第10.19.1-10.19.11頁。本文之一個實施係針對包括兩個由融合抗GCGR抗體之胰高血糖素結合片段與抗體之Fc區產生之融合蛋白之二聚體。可藉由以下方式製備二聚體：例如在適當之表現載體中插入編碼融合蛋白之基因融合，在用重組表現載體轉化之宿主細胞中表現該融合基因並允許已表現融合蛋白像抗體分子一樣組裝，其中Fc部分之間的鏈間二硫鍵形成二聚體。
如本文所使用術語「Fc多肽」包含來源於抗體Fc區之天然及突變蛋白形式之多肽。亦包含包括促進二聚體化之鉸鏈區之該類多肽之截短形式。包括Fc部分 (以及由其形成之寡聚體)之融合蛋白提供了在蛋白A或蛋白G柱上進行親和層析法方便純化之優勢。
PCT申請W0 93/10151 (以引用之形式併入至本文中)中一種適當之Fc多肽為自N端鉸鏈區延伸至人IgG1抗體之Fc區之天然C端的單鏈多肽。另一種可用之Fc多肽為美國專利5457035及Baum等，1994、EMBO J. 13:3992-4001中描述之Fc突變蛋白。該突變蛋白之胺基酸序列與W0 93/10151中所示天然Fc序列之胺基酸序列相同，除了胺基酸19自白胺酸變為丙胺酸，胺基酸20自白胺酸變為麩醯胺酸以及胺基酸22自甘胺酸變為丙胺酸。該突變蛋白表現出對Fc受體之親和力降低。在其他實施中，抗GCGR抗體之重鏈及/或輕鏈可被取代為抗體重鏈及/或輕鏈之可變部分。
或者，該寡聚體為包括多個抗體之融合蛋白，包括或不包括間隔肽(spacer peptide)。此等適當之間隔肽描述於美國專利4751180及4935233。
製備寡聚抗體之另一種方法係關於使用白胺酸拉鏈。白胺酸拉鏈結構域為促進其所存在之蛋白寡聚化作用之肽。最初發現白胺酸拉鏈存在於數種DNA結合蛋白中(Landschulz等，1988，Science 240:1759)，此後發現存在於各種不同蛋白中。在已知之白胺酸拉鏈中為可二聚體化或三聚體化之天然肽或其衍生物。適用於生產可溶寡聚蛋白之白胺酸拉鏈結構域之實例描述於PCT申請W0 94/10308，來源於肺表面活性蛋白D (SPD)之白胺酸拉鏈描述於Hoppe等，1994，FEBS Letters 344:191，以引用之形式併入於本文中。允許與其融合之異源蛋白穩定三聚體化之經修飾之白胺酸拉鏈之使用描述於Fanslow等，1994，Semin. Immunol. 6:267-78。在一種方法中，在適當之宿主細胞中表現包括與白胺酸拉鏈肽融合之抗GCGR抗體片段或衍生物之重組融合蛋白，自培養物上清液中收集可溶寡聚抗GCGR抗體片段或其衍生物。
在另一個實施中，該抗體衍生物可包括至少本文揭示之CDR之一。舉例而言，可將一個或多個CDR整合入已知之抗體構架區(IgG1，IgG2等)或與適當之載體結合以增強其半衰期。適當載體包含但不限於Fc、白蛋白、運鐵蛋白及類似物質。此等及其他適當之載體為此項技術中已知。該結合CDR肽可為單體、二聚體、四聚體或其他形式。在一個實施中，一個或多個水溶性多聚體在結合劑之一個或多個特異位點結合，例如在胺基端。在一個實例中，抗體衍生物包括一個或多個水溶性多聚體附著物，包含但不限於聚乙二醇、聚氧乙烯二醇或聚丙二醇。參見，例如，美國專利第4640835號、第4496689號、第4301144號、第4670417號、第4791192號及第4179337號，在一些實施中，衍生物包括一個或多個一甲氧基.聚乙二醇、葡聚糖、纖維素或其他基於碳水化合物之聚合物，聚(N-乙烯基吡咯酮).聚乙二醇、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)及聚乙烯醇，以及該類聚合物之混合物。在一些實施中，一個或多個水溶性聚合物與一個或多個側鏈隨機結合。在一些實施中。PEG可提高結合劑例如抗體之治療作用。一些該類方法描述於例如美國專利第6133426號，其以引用之形式以任何目之併入至本文中。
應當理解，本文提供之抗體可具有至少一個胺基酸取代，只要該抗體保留了結合特異性。因此，抗體結構之修飾包括於本文範疇內。此等可包含不破壞抗體GCGR結合能力之胺基酸取代，其可為保守或非保守的。保守胺基酸取代可包含非天然胺基酸殘基，其通常經化學肽合成整合而非生物系統合成。此等包含擬肽及其他反向或倒轉形式之胺基酸部分。保守胺基酸取代亦可係關於用非天然殘基取代天然胺基酸殘基，如此對該位點胺基酸殘基之極性或電荷作用很小或沒有作用。非保守取代可係關於一類胺基酸或胺基酸類似物之一個成員與具有不同物理性質(例如，體積、極性、疏水性、電荷)之另一類胺基酸之成員交換。
而且，熟習此項技術者可生成在各期望胺基酸殘基上包括胺基酸取代之待測變異體。可使用熟習此項技術者已知之活性測定法篩選該類變異體。該類變異體可用於收集關於適當變異體之資訊。舉例而言，若發現某一胺基酸殘基可引起活性破壞、非期望之降低或不當之活性，可避免具有該類變化之變異體。換言之，基於自此等常規試驗收集之資訊，熟習此項技術者可輕鬆判定應避免進一步取代(單獨或與其他突變組合)之胺基酸。
技術人員可使用已知技術判定如本文所列之多肽之適當變異體。在一些實施中，熟習此項技術者可藉由靶向對於活性不重要之區域鑑定經改變後不會破壞活性之分子適當區域。在一些實施中，可鑑定在相似多肽中保守之殘基或分子部分。在一些實施中，甚至可保守取代對於生物活性或結構重要之區域而不破壞生物活性或不會有不利作用於多肽結構。此外，熟習此項技術者可考察結構.功能研究鑑定對活性或結構重要之相似多肽中之殘基。鑒於此對比，可預測對應於在相似蛋白中對活性或結構重要之胺基酸殘基之蛋白質中胺基酸殘基之重要性。熟習此項技術者可為此等經預測重要之胺基酸殘基選擇化學相似胺基酸取代。
熟習此項技術者亦可分析與相似多肽之結構相關之三維結構及胺基酸序列。鑒於該類資訊，熟習此項技術者可預測就三維結構而言抗體之胺基酸殘基比對。在一些實施中，熟習此項技術者可選擇不對經預測在蛋白質表面之胺基酸殘基進行顯著改變，因為該類殘基可能參與與其他分子之重要相互作用。許多科學出版物致力於二級結構之預測。參見，Moult，1996，Curr. Op. Biotech. 7:422-427，Chou等，1974，Biochemistry 13:222-245; Chou等，1974，Biochemistry 113:211-222; Chou等，1978，Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45-148; Chou等，1979，Ann. Rev. Biochem. 47:251-276及Chou等，Biophys. J.26:367-384。此外，目前可使用電腦程式輔助預測二級結構。舉例而言，序列同一性大於30%或相似性大於40%之兩個多肽或蛋白質通常具有相似之高級結構。近期蛋白結構數據庫(PDB)之增長增強了二級結構之可預測性，包含多肽或蛋白結構中潛在之摺疊數目。參見，Holm等，1999，Nucl. Acid. Res. 27:244-247。已表明(Brenner等，1997，Curr.Op. Struct. Biol. 7:369-376)在給定多肽或蛋白質中存在有限數目之摺疊並且一旦判定了臨界數目之結構，結構預測將變得顯著更加精確。
預測二級結構之其他方法包含「穿接(threading)」(Jones，1997，Curr. Opin. Struct. Biol.、7:377-87; Sippl等，1996，Structure 4:15-19；「圖譜分析(profile analysis)」 (Bowie等，1991，Science 253:164-170；Gribskov等，1990，Meth. Enzym. 183:146-159; Gribskov等，1987，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84:4355-4358及「進化聯繫(evolutionary linkage)」(參見Holm、supra(1999)、and Brenner、supra(1997))。在一些實施中，抗體變異體包含糖基化變異體，其中與母體多肽之胺基酸序列相比改變了糖基化位點之數目及/或類型。在一些實施中，變異體與天然蛋白質相比具有更多或更少數目之N連接糖基化位點。或者，移除該序列之取代可移除現有的N連接糖鏈。亦提供了N連接糖鏈之重排，其中移除了一個或多個N連接糖鏈位點(通常為天然存在之彼等者)並創造了一個或多個新的N連接位點。其他較佳抗體變異體包含半胱胺酸變異體，與母體胺基酸序列相比其中缺失或由另一胺基酸(例如絲胺酸)取代一個或多個半胱胺酸殘基。當抗體必須摺疊成生物活性構形時(例如在分離可溶包涵體之後)可用半胱胺酸變異體。半胱胺酸變異體通常比天然蛋白質具有較少之半胱胺酸殘基，並通常具有偶數個半胱胺酸以最小化未配對半胱胺酸引起之相互作用。
熟習此項技術者可在需要該類取代時判定期望之胺基酸取代(保守或非保守)。在一些實施中，胺基酸取代可用於鑑定人GCGR抗體之重要殘基或者增加或降低本文所描述人GCGR抗體之親和力。
根據一些實施，較佳之胺基酸取代為以下：(1)降低蛋白質水解敏感性，(2)降低氧化敏感性，(3)改變形成蛋白質複合物之結合親和力，(4)改變結合親和力及/或(4)賦予或修飾該類多肽上之其他物理化學或功能性質。根據一些實施，可在天然存在序列中(在一些實施中，在形成分子間接觸之結構域之外的多肽部分)進行單個或多個胺基酸取代(在一些實施中為保守胺基酸取代)。在一些實施中，保守胺基酸取代通常不會本質上改變母體序列之結構特性(例如，取代胺基酸不應破解存在於母體序列中之螺旋或干擾特徵化母體序列之其他類型二級結構)。此項技術中認可之多肽二級及三級結構之實例描述於Proteins，Structures and Molecular Principles，Creighton編輯，W.H. Freeman and Company(1984); Introduction to Protein Structure，Branden and Tooze 編輯、Garland Publishing(1991)；以及Thornton等，1991、Nature 354:105，其以引用之形式併入至本文中。
在一些實施中，本文提供之抗體可與多聚體、脂類或其他部分(moieties)化學鍵合。
抗原結合試劑可包括至少一個本文描述之CDR，其摻入生物相容性骨架結構中。在一個實例中，該生物相容性骨架結構包括足以形成構形穩定結構支援或骨架或支架之多肽或其部分，其可在侷限之表面區域展示可與抗原結合之一個或多個胺基酸序列(例如，CDR、可變區等)。該類結構可為天然存在之多肽或多肽「摺疊」(結構基序)，或相對與天然多肽或摺疊可具有一個或多個修飾，例如胺基酸添加、缺失或取代。此等支架可來源於任何物種(或多於一個物種)之多肽，例如，人類、其他哺乳動物、其他脊椎動物、無脊椎動物、細菌或病毒。
生物可溶性骨架結構通常係基於蛋白質支架或骨架而非免疫球蛋白結構域。舉例而言，可使用基於纖維結合素、錨蛋白、脂質運載蛋白(lipocalin)、新抑癌蛋白、細胞色素b、CP1鋅指蛋白、PST1、捲曲螺旋、LACI-D1、Z結構域及澱粉酶抑肽結構域(參見，例如，Nygren及Uhlen、1997、Current Opinion in Structural Biology 7:463-469)。
此外，熟習此項技術者可認識到適當之結合劑包含此等抗體之部分，例如一個或多個重鏈CDR1、CDR2、CDR3，輕鏈CDR1、CDR2及CDR3，如本文所具體揭示。至少一個重鏈CDR1、CDR2、CDR3、CDR1，CDR2及CDR3區具有至少一個胺基酸取代，只要該抗體保留了非取代CDR之結合特異性。該抗體之非CDR部分可為非蛋白分子，其中該結合劑交叉阻斷本文揭示之抗體與人GCGR之結合及/或抑制經該受體之胰高血糖素之信號傳導。該抗體之非CDR部分可為非蛋白質分子，其中該抗體在競爭結合測定法中顯示出與至少抗體L4H4/L5H5中之一者所顯示相似的與人胰高血糖素肽之結合類型，及/或中和胰高血糖素之活性。抗體之非CDR部分可由胺基酸組成，其中該抗體為重組結合蛋白或合成肽，並且該重組結合蛋白交叉阻斷本文揭示之抗體與人GCGR之結合及/或中和活體內或活體外胰高血糖素活性。抗體之非CDR部分可由胺基酸組成，其中該抗體為重組抗體，並且該重組抗體在競爭結合測定法中顯示出與至少抗體L4H4/L5H5中之一者所顯示相似之與人GCGR肽之結合類型，及/或中和胰高血糖素信號傳導。
GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質
在一個實施中，本文提供了一個GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質，其包括一個能與GCGR特異性結合之抗體，及一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個或八個GLP-1片段或反向GLP-1片段；該融合蛋白質藉由一肽連接子(Linker)將一GLP-1片段之羧基端與一GCGR抗體輕鏈或重鏈之胺基端連接，或者將一反向GLP-1片段之胺基端與一GCGR抗體輕鏈或重鏈之羧基端連接。
在另一個實施中，本文提供了一個GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質，其包括一個與GCGR特異性結合之抗體，及一個、兩個、三個或四個GLP-1片段；該融合蛋白質藉由一個肽連接子(Linker)將一GLP-1片段之羧基端與一GCGR抗體輕鏈或重鏈之胺基端連接。
在另一個實施中，本文提供了一個GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質，其包括一個能與GCGR特異性結合之抗體，及一個、兩個、三個或四個反向GLP-1片段；該融合蛋白質藉由一個肽連接子(Linker)將反向GLP-1片段之胺基端與GCGR抗體輕鏈或重鏈之羧基端連接。
在另一個實施中，本文提供了一個GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質，其包括一個能與GCGR特異性結合之抗體，及兩個GLP-1片段；該融合蛋白質藉由一個肽連接子(Linker)將一GLP-1片段之羧基端與一GCGR抗體輕鏈或者重鏈之胺基端連接。
在另一個實施中，本文提供了一個GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質，其包括一個能與GCGR特異性結合之抗體，及兩個反向GLP-1片段；該融合蛋白質藉由一個肽連接子(Linker)將一反向GLP-1片段之胺基端與一GCGR抗體輕鏈或者重鏈之羧基端連接。
在另一個實施中，本文提供了一個GLP-1融合蛋白質，其包括一個GCGR抗體及兩個GLP-1片段；該融合蛋白質藉由一個肽連接子(Linker)將一GLP-1片段之羧基端與一GCGR抗體輕鏈之胺基端連接：N'-GLP-1-連接子-R-C'; 或者將一GLP-1片段之羧基端及一GCGR抗體重鏈之胺基端連接：N'-GLP-1-連接子-R-C'；其中: N' 代表融合蛋白質多肽鏈之胺基端、C' 代表融合蛋白質多肽鏈之羧基端、GLP-1代表一GLP-1片段，R為一GCGR抗體之輕鏈或者重鏈之胺基酸序列、及Linker代表一肽連接子。
另一個實施中，本文提供了一個GLP-1融合蛋白質，其包括一個GCGR抗體及兩個反向GLP-1片段；該融合蛋白質藉由一個肽連接子(Linker)將一反向GLP-1片段之胺基端與一GCGR抗體輕鏈之羧基端連接：N'-R-連接子-反向GLP-1-C'; 或者將一反向GLP-1片段之胺基端及一GCGR抗體重鏈之羧基端連接：N'-R-連接子-反向GLP-1-C'；其中: N' 代表融合蛋白質多肽鏈之胺基端、C' 代表融合蛋白質多肽鏈之羧基端、反向GLP-1代表一反向GLP-1片段，R為一GCGR抗體之輕鏈或者重鏈之胺基酸序列、及Linker代表一肽連接子。
在另外的實施中，本文提供了一個GLP-1融合蛋白質，其包括一個GCGR抗體及兩個GLP-1片段；該融合蛋白質藉由一個肽連接子(Linker)將一GLP-1片段之羧基端與GCGR抗體輕鏈之胺基端連接：N'-GLP-1-連接子-R-C'; 其中: N' 代表融合蛋白質多肽鏈之胺基端、C' 代表融合蛋白質多肽鏈之羧基端、GLP-1代表一GLP-1片段，R為一GCGR抗體之輕鏈之胺基酸序列、及Linker代表一肽連接子。
在一實施中，在本文提供之GLP-1融合蛋白質中，所述之GLP-1片段各自獨立地選自於以下中之一者的胺基酸序列：SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 120、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 122及SEQ ID NO: 123。在一實施中，在本文提供之GLP-1融合蛋白質中，所述之反向GLP-1片段各自獨立地選自於以下中之一者的胺基酸序列：SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130及SEQ ID NO: 131。
在一實施中，在本文提供之GLP-1融合蛋白質中，所述之肽連接子(Linker)之序列自獨立包括自1個至200個胺基酸胺，自2個至100個胺基酸胺，自5個至50個胺基酸胺，自6個至25個胺基酸胺，或自10個至20個胺基酸胺。
在另一個實施中，在本文提供之GLP-1融合蛋白質中，所述之肽連接子(Linker) 之序列包括全長的，部分的，或者重複的獨立選自以下中之一者的胺基酸序列：SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 125及SEQ ID NO: 126。
核酸
在一個態樣中，本文提供分離之核酸分子。該核酸分子包括例如編碼全部或部分抗體之多聚核苷酸，例如本文抗體或GLP-1融合蛋白質之一條鏈或兩條鏈，或其片段、衍生物、突變蛋白或變異體；足以用作雜交探針之多聚核苷酸；PCR引子或用於鑑定、分析、突變或擴增編碼多肽之多聚核苷酸之測序引子；用於抑制多聚核苷酸表現之反義核酸以及其互補序列。該核酸可為任何長度。例如其長度可為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1000、1500、3000、5000或更多個核苷酸，及/或包括一個或多個附加序列，例如調節序列，及/或係較大核酸例如載體之一部分。該核酸可為單鏈或雙鏈並包括RNA及/或DNA核苷酸以及其人工變異體(例如，肽核酸)。
可自經GCGR抗原免疫之小鼠B細胞中分離編碼抗體多肽(例如，重鏈或輕鏈、僅可變結構域或全長)之核酸。可藉由常規方法例如聚合酶鏈式反應(PCR)分離抗體或GLP-1融合蛋白質之核酸。
編碼重鏈及輕鏈可變區之核酸序列如上文所示。熟練之技術人員可理解由於遺傳密碼之簡並性，本文揭示之各多肽序列可由更多數目之其他核酸序列編碼。本文提供編碼本文提供之抗體或GLP-1融合蛋白質之各簡並核苷酸序列。
本文進一步提供在具體雜交條件下與其他核酸(例如，包括任何L4H4/L5H5之核苷酸序列之核酸)雜交之核酸。雜交核酸之方法為此項技術中熟知。參見，例如，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Son(1989)，6.3.1-6.3.6。如本文定義，例如，中等嚴格條件使用包括5×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)之預洗溶液、0.5% SDS、1.0 mM EDTA (pH 8.0)、約50%甲醯胺之雜交緩衝液、6x SSC及55℃之雜交溫度(或其他相似之雜交溶液，例如包括約50%甲醯胺的，以42℃雜交)，並且溶離條件為60℃，使用0.5× SSC、0.1% SDS。嚴格雜交條件在6× SSC中於45℃雜交，然後於68℃在0.1× SSC、0.2% SDS中洗滌一次或多次。此外，熟習此項技術者可操作雜交及/或洗滌條件以增加或降低雜交嚴格度，如此包括相互之間至少65、70、75、80、85、90、95、98或99%同源之核苷酸序列之核酸通常仍可以相互雜交。影響雜交條件選擇之基本參數及設計適當條件之指導列於例如Sambrook，Fritsch及Maniatis，1989、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press，第9及11章；Current Protocols in Molecular Biology，1995，Ausubel等編輯，John Wiley & Sons，Inc.，第2.10及6.3-6.4節)並可由具有此項技術中普通技術之人員基於例如DNA之長度及/或鹼基組成輕鬆判定。可藉由突變在核酸中引入變化，藉此導致其編碼之多肽(例如，抗原結合蛋白)胺基酸序列之變化。可使用此項技術中已知之任何技術引入突變。在一個實施中，使用例如定點誘變方案改變一個或多個具體胺基酸殘基。在另一個實施中，使用例如隨機誘變方案改變一個或多個隨機選擇之殘基。無論其如何生成，可表現突變多肽並篩選期望性質。
可將突變引入核酸而不顯著改變其編碼多肽之生物學活性。例如，可進行引起非必需胺基酸殘基處胺基酸取代之核苷酸取代。在一個實施中，突變本文為L1至L10及H1至H7或GLP-1融合蛋白質提供之核苷酸序列或其片段、變異體或衍生物，如此其編碼包括本文所示L1至L10及H1至H7之胺基酸殘基之一個或多個缺失或取代，成為兩個或多個序列相異之殘基。在另一個實施中，誘變作用在本文所示L1至L10及H1至H7或GLP-1融合蛋白質之一個或多個胺基酸殘基附近插入一個胺基酸成為兩個或多個序列相異之殘基。或者，可將一個或多個突變引入核酸以選擇性改變其編碼多肽之生物學活性(例如，與GCGR結合)。例如，該突變可在數目上或性質上改變生物學活性。量變之實例包含增加、降低或消除該活性。質變之實例包含改變抗體或GLP-1融合蛋白質之抗原特異性。
在另一個態樣中，本文提供適於用做引子或偵測本文核酸序列之雜交探針之核酸分子。本文之核酸分子可僅包括編碼本文全長多肽之核酸序列之一部分，例如，可用作探針或引子或編碼本文多肽活性部分之片段(例如，GCGR結合部分)之片段。
基於本文核酸序列之探針可用於偵測該核酸或相似核酸，例如編碼本文多肽之轉錄物。該探針可包括標記基團，例如放射性同位素、螢光化合物、酶或酶輔因子。該類探針可用於鑑定表現該多肽之細胞。
在另一個態樣中本文提供包括編碼本文多肽或其部分之核酸之載體。載體之實例包含但不限於質體、病毒載體、非游離基因哺乳動物載體及表現載體，例如重組表現載體。
本文之重組表現載體可包括適於該核酸在宿主細胞中表現之形式之本文核酸。該重組表現載體包含一個或多個調節序列，基於用於表現之宿主細胞進行篩選，其與該預表現之核酸序列可操作性相連。調節序列包含引導核苷酸序列在多個種類宿主細胞中組成型表現之(例如，SV40早期基因增強劑、勞斯氏肉瘤病毒啟動子及細胞巨化病毒啟動子)，引導僅在某些宿主細胞中核苷酸序列之表現的(例如，組織特異調節序列，參見Voss等，1986，Trends Biochem. Sci.11:287，Maniatis等，1987，Science 236:1237，其完整內容以引用之形式併入至本文中)以及引導核苷酸序列回應具體處理或條件之誘導型表現之(例如，哺乳動物細胞中之金屬硫堇啟動子及原核及真核系統二者中之四環黴素反應(tet-sesponsive)啟動子及/或鏈黴素反應啟動子(同前))。熟習此項技術者應理解，表現載體之設計取決於例如用於轉化之宿主細胞之選擇、所需蛋白表現量等因素。本文之表現載體可引入宿主細胞，藉此生產由本文所描述核酸編碼之蛋白或肽，包含融合蛋白或肽。
在另一態樣中，本文提供可引入本文表現載體之宿主細胞。宿主細胞可為任何原核或真核細胞。原核宿主細胞包含革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如大腸桿菌或桿菌。更高級之真核細胞包含昆蟲細胞、酵母細胞以及哺乳動物源之確立細胞株。適當哺乳動物宿主細胞株之實例包含中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或其衍生物例如Veggie CHO及在無血清培養基中生長之相關細胞株(參見Rasmussen等，1998，Cytotechnology 28:31)或CHO株DXB-11，其缺失DHFR (參見Urlaub等，1980，Proc. Natl. Acad、Sci. USA 77:4216-20)。其他CHO細胞株包含CHO-K1 (ATCC #CCL-61)、EM9 (ATCC #CRL-1861)，及 UV20 (ATCC# CRL-1862)，其他宿主細胞包含猴腎細胞之COS-7系(ATCC #CRL-1651) (參見Gluzman等，1981，Cell 23:175)、L細胞、C127細胞、3T3細胞(ATCC CCL-163)，AM-1/D細胞(描述於美國專利第6210924號)、HeLa細胞、BHK (ATCC CRL-10)細胞株、來源於非洲綠猴腎細胞株CV1之CV1/EBNA細胞株(ATCC CCL-70) (參見McMahan等，1991，EMBO J.10:2821)、人胚腎細胞例如293，293 EBNA或MSR 293、人上皮A431細胞、人C010205細胞、其他經轉化靈長動物細胞株、正常二倍體細胞、來源於初生組織活體外培養物之細胞株、初移植體、HL-60、U937、HaK或Jurkat細胞。用於細菌、真菌、酵母及哺乳細胞宿主之適當選殖及表現載體描述於Pouwels等(Cloning Vectors: A Laboratory Manual、Elsevier、1985)。
可藉由傳統轉化或轉染技術將載體DNA引入原核或真核細胞中。對於穩定之哺乳動物轉染而言，取決於使用之表現載體及轉染技術，已知只有一小部分細胞可將外源DNA鏊合入其基因組中。為了鑑定及篩選此等整合子，通常將編碼篩選標記(例如抗生素抗性)之基因與所關注基因一起引入宿主細胞。較佳之篩選標記包含可賦予藥物(如G418、潮黴素及甲胺喋呤)抗性之彼等。在其他方法中可藉由藥物篩選鑑別包括被引入核酸之穩定轉染細胞(例如，整合了篩選基因之細胞可存活，而其他細胞則死亡)。
可在提高多肽表現之條件下培養已轉化細胞，可藉由常規蛋白純化方法回收多肽。一種該純化方法描述於下文實施例。預用於本文之多肽包含基本同源之重組哺乳動物抗GCGR抗體或GLP-1融合蛋白質多肽，其基本不含污染性內源材料。
GCGR抗體之活性
GCGR抗體之活性係指本文提供之抗體具有與GCGR特異性結合，抑制或者阻斷胰高血糖素信號傳導後顯示出之治療性作用，例如治療高血糖症、二型糖尿病、代謝綜合症及血脂異常。術語「降低胰高血糖素信號傳導之生物學活性」或者「抑制或阻斷胰高血糖素信號傳導之生物學活性」係指GCGR抗體或其與GLP-1融合蛋白質在活體內與GCGR結合並抑制或者阻斷胰高血糖素引起該受體下游之細胞應急反應。反應包含但不限於降低肝糖原輸出、降低血糖、以及相關之脂肪代謝變化。在一個實施中，本文提供了能與人GCGR特異性結合之鼠源抗體或人源化抗體。該類抗體包含可減少或中和胰高血糖素信號傳導之拮抗或中和抗體。
在一個實施中，本文提供之抗體與人GCGR結合時之Kd 為大約0.01 nM至大約1000 nM、大約0.1 nM至大約500 nM、大約0.5 nM至大約200 nM、大約1 nM至大約200 nM、或大約10 nM至大約100 nM。在另一個實施中，本文提供之抗體與人GCGR結合時之Kd 為大約1 nM至大約200 nM。在另一個實施中，本文提供之抗體與人GCGR結合時之Kd 為大約1 nM至大約100 nM。在另一個實施中，本文提供之抗體與人GCGR結合時之Kd 為大約1 nM、大約2 nM、大約5 nM、大約10 nM、大約20 nM、大約30 nM、大約40 nM、大約50 nM、大約60 nM、大約70 nM、大約80 nM、大約90 nM、或大約100 nM。在另一個實施中，本文提供之抗體與人GCGR結合時之Kd 為大約100 nM、大約110 nM、大約120 nM、大約130 nM、大約140 nM、大約150 nM、大約160 nM、大約170 nM、大約180 nM、大約190 nM、或大約200 nM。
在一個實施中，本文提供之抗體在降低人胰高血糖素信號傳導之IC50 值為大約0.01 nM至大約500 nM、大約0.1 nM至大約200 nM、大約0.5 nM至大約200 nM、大約1 nM至大約200 nM、或大約10 nM至大約100 nM。在另一個實施中，本文提供之抗體在降低人胰高血糖素信號傳導之IC50 值為大約1 nM至大約200 nM。在另一個實施中，本文提供之抗體在降低人胰高血糖素信號傳導之IC50 值為大約10 nM至大約100 nM。在另一個實施中，本文提供之抗體在降低人胰高血糖素信號傳導之IC50 值為大約1 nM、大約2 nM、大約5 nM、大約10 nM、大約20 nM、大約30 nM、大約40 nM、大約50 nM、大約60 nM、大約70 nM、大約80 nM、大約90 nM、或大約100 nM。在另一個實施中，本文提供之抗體在降低人胰高血糖素信號傳導之IC50 值為大約100 nM、大約110 nM、大約120 nM、大約130 nM、大約140 nM、大約150 nM、大約160 nM、大約170 nM、大約180 nM、大約190 nM、或大約200 nM。
在一個實施例中，本文提供之GCGR抗體與人GCGR結合時，具有一個或多個以下所列之性質：
a.當與人GCGR結合時以與所述參考抗體基本類似之Kd ；
b.當抑制人GCGR之胰高血糖素激活時以與所述參考抗體基本類似之IC50 ；及
c.在人GCGR上與所述參考抗體交叉競爭結合。
在一個實施例中，所述參考抗體包括輕鏈可變結構域胺基酸序列SEQ ID NO: 87及重鏈可變結構域胺基酸序列SEQ ID NO: 97之組合。在另一實施例中，所述參考抗體為單株抗體L4H4、L5H5、或L7H7。
在本文中，術語「基本相似」意謂與參考抗體之IC50 或Kd 可比或係參考抗體之IC50 或Kd 值之大約200%、大約180%、大約160%、大約150%、大約140%、大約120%、大約110%、大約100%、大約99%、大約98%、大約97%、大約95%、大約90%、大約85%、大約80%、大約75%、大約70%、大約65%、或大約50%。在一個實施中，參考抗體包含，例如，具有輕鏈SEQ ID NO: 87及重鏈SEQ ID NO: 97組合之抗體。在另一個實施中，參考抗體包含GCGR抗體L4H4、L5H5、或L7H7。
GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質(GLP-1融合蛋白質)之生物學活性
GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質之生物學活性包括GLP-1之生物學活性及GCGR抗體活性兩個方面。GCGR抗體之活性如前文所述。「GLP-1生物學活性」係指GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質在活體內結合並激活GLP-1受體並引起細胞應激反應，並顯示出治療作用之生物學活性，例如高血糖症、二型糖尿病、代謝綜合症及包含血脂異常之其他相關症狀。前述細胞應激反應包含但不限於降低肝糖原輸出、降低血糖，以及相關之脂肪代謝變化。綜合了GLP-1及GCGR抗體之生物學活性，本文所描述之GLP-1融合蛋白質可以用於治療多種與GLP-1R及GCGR相關聯之疾病及病症。該融合蛋白質藉由作用於GLP-1R及/或GCGR發揮其生物學作用，因此可以用本文所描述之GLP-1融合蛋白質治療對「增加GLP-1R刺激」或對「降低GCGR刺激」做出有利應答之疾病及病症之個體。此等個體稱為「需要GLP-1R刺激治療」或「需要降低GCGR刺激」之個體。包含高血糖症、二型糖尿病、代謝綜合症及血脂異常之其他相關症狀。
在一個實施中，GCGR抗體或GLP-1融合蛋白質之生物學活性變化係用直接cAMP偵測方法來偵測的，量化GCGR抗體或GLP-1融合蛋白質在活體外抑制GCGR之功能。
藥物組合物
在一個實施中，本文提供了一藥物組合物，其中包括本文提供之一個GCGR抗體及一種或多種可藥用載體。
在另一個實施中，本文提供了一藥物組合物，其包含本文提供之一個GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質，與一種或多種可藥用載體。
本文所使用之術語「載體」包含載體、藥用輔料或者在使用之劑量及濃度下將細胞或哺乳動物暴露於其中無害之穩定劑。
治療方法
在一個實施中，本文提供了治療、預防、或改善二型糖尿病之方法，其包含向個體投與治療有效量之本文提供之GCGR抗體或其醫藥組合物。
在另一個實施中，本文提供了治療、預防、或改善二型糖尿病之方法，其包含向個體投與治療有效量之本文提供之GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質、或其醫藥組合物。
在一個實施中，本文提供了治療、預防、或改善二型糖尿病併發症之方法，其包含向個體投與治療有效量之本文提供之GCGR抗體或其醫藥組合物。
在另一個實施中，本文提供了治療、預防、或改善二型糖尿病併發症之方法，其包含向個體投與治療有效量之本文提供之GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質、或其醫藥組合物。
在另一個實施中，本文提供了治療、預防、或改善高血糖症之方法，其包含向個體投與治療有效量之本文提供之GCGR抗體，或其醫藥組合物。
在另一個實施中，本文提供了治療、預防、或改善高血糖症之方法，其包含向個體投與治療有效量之本文提供之GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質、或其醫藥組合物。
在另一個實施中，本文提供了治療、預防、或改善代謝綜合症之方法，其包含向個體投與治療有效量之本文提供之GCGR抗體、或其醫藥組合物。
在另一個實施中，本文提供了治療、預防、或改善代謝綜合症之方法，其包含向個體投與治療有效量之本文提供之GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質、或其醫藥組合物。
在另一個實施中，本文提供了治療、預防、或改善血脂異常之方法，其包含向個體投與治療有效量之本文提供之GCGR抗體，或其醫藥組合物。
在另外的實施中，本文提供了治療、預防、或改善血脂異常之方法，其包含向個體投與治療有效量之本文提供之GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質、或其醫藥組合物。
在本文提供之任一項用途中，其所述之醫藥組合物係用於靜脈或皮下注射。
在本文提供之任一項用途，進一步包括向個體投與治療有效量之一種GLP-1R抗體與GLP-1之融合蛋白質。
在一個實施中，本文所描述之GLP-1R抗體與GLP-1之融合蛋白質包括
a.輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 134；
b.輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 135；
c.輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 136；
d.重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 137；
e.重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 138；及
f.重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 139。
在另一個實施中，本文所描述之GLP-1R抗體與GLP-1之融合蛋白質包括以下所列之輕鏈與重鏈可變區胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 140與SEQ ID NO: 141。
其他GLP-1R抗體與GLP-1之融合蛋白質之實例揭示於US 10,059,773 and US 2018/0000934，其揭示內容藉由引用併入本文。
本文中，術語「個體」指哺乳動物，包含人類，可與術語「患者」交替使用。
術語「治療」包含減輕或預防至少一種症狀或病症之其他方面，或者減輕疾病嚴重性。本文提供之GCGR抗體或GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質不需要產生完全治癒之效果，或根除疾病之所有症狀或表現，即可構成有效治療劑。如相關領域所公認，作為治療劑之藥物可減少給定疾病狀態之嚴重程度，但不需消除疾病之所有表現即可被認為係有效之治療劑。相似地，預防給藥治療不需在預防症狀出現上完全有效即可構成有效預防劑。只減少疾病之影響(例如，藉由減少其症狀之數目或嚴重度，或藉由提高另一治療效果，或藉由產生另一有效作用)，或者減少個體中疾病發生或加重之可能性就已經足夠。本文之一個實施係關於包括以足以誘導反應具體病症嚴重性之指示劑高於基線水平之持續改善之量及時間給予患者GCGR抗體或GCGR抗體與GLP-1融合蛋白質之方法。
GCGR抗體或GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質藥物組合物可採用任意適當技術包含但不限於腸道外、局部或吸入給藥。若係注射，哦可藉由例如關節內、靜脈內、肌肉內、損傷區內、腹膜內或皮下途徑，以快速注射或連續輸注給予醫藥組合物。可考慮例如在疾病或損傷部位局部給藥，如透皮給藥及埋植劑持續釋放給藥。吸入給藥包含例如鼻腔或口腔吸入、採用噴霧劑、以氣霧劑形式吸入抗體等等。其他選擇包含口腔製劑包含片劑、糖漿劑或錠劑。
以包括一個或更多其他組分(例如生理學可接受載體、輔料或稀釋劑之組合物)形式給予本文提供之GCGR抗體或GLP-1融合蛋白質係有利的。組合物可視情況額外包括一個或更多如下所述之生理學活性劑。在多個具體實施中，組合物包括除一個或更多本文提供之抗體(例如鼠源抗體或人源化抗體)或GLP-1融合蛋白質之外的一個、兩個、三個、四個、五個或六個生理學活性劑。
在一個實施中，藥物組合物包括本文提供之鼠源抗體或人源化抗體或GLP-1融合蛋白質以及一個或更多選自以下之物質：pH適合於抗體或GLP-1融合蛋白質之緩衝液、抗氧化劑例如抗壞血酸、低分子量多肽(例如含少於10個胺基酸之多肽)、蛋白質、胺基酸、糖例如糊精、絡合物例如EDTA、谷胱甘肽、穩定劑及輔料。根據適當工業標準，亦可加入防腐劑。可使用適當輔料溶液作為稀釋劑將組合物配製成凍乾粉末。適當組分在所用劑量及濃度下對受者無毒。可用於藥物處方組分之進一步實例見Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版 (1980) 及20版 (2000)，Mack Publishing Company 提供醫學從業者使用之套組，其包含一種或更多本文提供之抗體或GLP-1融合蛋白質以及治療本文論述任何病症之標籤或其他說明。在一個實施中，套組包含以上述組合物形式裝在一個或多個管型瓶中之一種或多種抗體或GLP-1融合蛋白質之無菌製劑。
給藥劑量及頻率可根據以下因素而改變：給藥途徑、所用具體抗體或GLP-1融合蛋白質、所治疾病之性質及嚴重度、症狀為急性進一步係慢性以及患者之體積及總體症狀。可藉由此項技術中熟知之方法判定適當劑量，例如在臨床試驗中包含劑量放大研究。
本文提供之抗體或GLP-1融合蛋白質可在例如一段時間內按規律間隔給藥一次或多次。在具體實施中，在至少一個月或更長時間給藥一次給予鼠源抗體或人源化抗體或GLP-1融合蛋白質，例如一個、兩個或三個月或者甚至不確定。對於治療慢性症狀，長期治療通常最有效。但是，對於治療急性症狀，短期給藥例如自一週至六週就已足夠。通常，給予人類抗體直至患者表現出所選體徵或指示劑高於基線水平之醫學相關改善度為止。
本文提供之治療方案之一個實例包含以適當劑量一週一次或者更長之皮下注射抗體或GLP-1融合蛋白質治療高血糖症、二型糖尿病、二型糖尿病併發症、代謝綜合症及包含血脂異常等引起之症狀。可持續每週或每月給予抗體或GLP-1融合蛋白質直到達到所需結果例如病人症狀消退。可按需要重新治療，或者，可選擇地，給予維持劑量。
可在使用抗體或GLP-1融合蛋白質例如人類抗體或GLP-1融合蛋白質治療之前、進行中及/或之後監測病人之血糖濃度、體重，以偵測其壓力之任何變化。對於某些病症，血糖之變化可隨例如疾病進程等因素而變化。可用已知技術測定其血糖濃度。
本文之方法及組合物之具體實施係關於使用例如抗體或GLP-1融合蛋白質及一個或多個胰高血糖素拮抗劑、兩個或更多本文提供之抗體或GLP-1融合蛋白質，或者本發明抗體或GLP-1融合蛋白質及一個或更多其他胰高血糖素拮抗劑。在另外的實施中，單獨或與其他用於治療使患者痛苦之症狀之藥劑組合給予抗體或GLP-1融合蛋白質。此等藥劑之實例包含蛋白質以及非蛋白質藥物。當聯合給予多種藥物時，如此項技術中所熟知其劑量應相應調整。「聯合給藥」組合療法不限於同時給藥，亦包含在係關於給予患者至少一種其他治療劑之療程中至少給予一次抗原及蛋白之治療方案。
在另一態樣中，本文提供製備治療高血糖症、二型糖尿病、二型糖尿病併發症、代謝綜合症及血脂異常及相關病症藥劑之方法，其包括本文提供之抗體或GLP-1融合蛋白質與藥學可接受輔料中之混合物，用於治療上述疾病之相關病症。藥劑製備方法如上所述。
本文進一步提供可特異性結合至人GCGR之抗體或GLP-1融合蛋白質相關之組合物、套組及方法。亦提供了核酸分子及其衍生物及片段，其包括編碼與GCGR結合之多肽之全部或部分之多聚核苷酸，例如編碼全部或部分抗GCGR抗體、抗體片段、抗體衍生物或GLP-1融合蛋白質之核酸。本文進一步提供包括該類核酸之載體及質體以及包括該類核酸及/或載體及質體之細胞及細胞株。所提供方法包含，例如，製備、鑑定或分離與人GCGR結合之抗體或GLP-1融合蛋白質例如抗GCGR抗體或GLP-1融合蛋白質之方法，測定該抗體或GLP-1融合蛋白質是否與GCGR結合之方法、以及將與GCGR結合之抗體或GLP-1融合蛋白質給予動物模型之方法。
下面藉由具體實例，對本文之技術方案作進一步之說明。
本文中，若非特指，所採用之原料及設備等均可自市場購得或係此項技術中常用的。下述實例中之方法，如無特別說明，均為此項技術中之常規方法。
1、免疫用抗原之製備
接種CHO-DHFR-細胞至6孔板中。培養24小時(hr)後，細胞中轉染選殖有hGCGR基因(核苷酸序列見SEQ ID NO: 77及胺基酸序列見SEQ ID NO: 73)之pTM15質體。轉染係按照Invitrogen公司推薦Lipofectamine 2000之轉染條件進行。48 hr後，再換為含有10 nM MTX之完全培養基，每隔3天(d)換液，待兩週左右，出現穩定生長之純系，消化分散細胞集落，待長至50%癒合度時，逐漸提高MTX之濃度進行加壓篩選，直至MTX之濃度為300 nM。待兩週左右，出現穩定生長之純系。消化分散細胞集落，將細胞傳代，繼續培養細胞、待傳代細胞長至100%癒合度。利用V5標籤之抗體(Life Technologies)對構築之穩定細胞株分別進行FACS偵測，根據FACS偵測結果鑑定加壓後之細胞群體。篩選後之CHO-DHFR-hGCGR細胞膜上有大量hGCGR表現。最後經過次選殖及進一步鑑定後，選出2株hGCGR細胞為高表現之穩定細胞株。此等高表現hGCGR之細胞株可被作為製備抗體之免疫原(參考實施例2)。此外，在某些實施中，hGCGR胞外區及hIgG Fc之融合蛋白亦可以作為製備抗體之免疫原，其製備方法如下：次選殖hGCGR胞外區、hIgG2 Fc及肽連接子(Linker)之融合蛋白序列基因於pTM5質體。藉由懸浮HEK293細胞進行大量瞬時表現，獲得細胞上清液液，然後藉由親和層析純化得到hGCGR胞外區融合蛋白。
2、抗體之製備
將免疫原及氫氧化鋁佐劑混勻，皮下注射BALB/c小鼠(6-8週齡)，此後每週加強免疫小鼠一次。經過總共6次免疫後，藉由剪尾之方式採血。離心分離血清，用FACS偵測血清效價。達到適合抗體滴度時，斷頸處死小鼠，無菌狀態下獲取脾臟細胞。另外收集生長狀態處於對數生長期之SP2/0細胞，離心細胞，將沈澱細胞用無血清培養至重懸，再次離心-重懸，計數。混合脾臟細胞及SP2/0細胞，保證SP2/0及脾臟細胞數目接近，混合以後再「洗滌-離心」3次。彈散最後一次離心後之細胞沈澱，逐滴加入預溫之PEG-1500，上下吹吸後，緩慢加入30 mL預熱之無血清培養基以終止PEG之融合作用。再次離心後彈散細胞沈澱，加入融合培養基，將脾細胞及飼養層細胞鋪於96 孔板中、每孔加入100 µL培養基。融合後之雜交瘤細胞及飼養層細胞一起在96孔板中進行培養，並進行HAT(次黃嘌呤、胺甲喋呤及胸苷)篩選，以除去非融合之細胞。10 d後收取培養板中之雜交瘤細胞上清液進行ELISA偵測。
3、ELISA 篩選抗體
將過表現hGCGR之CHO-DHFR-hGCGR細胞及不表現hGCGR之CHO-DHFR-細胞分別接種至96孔板。待細胞長至90%癒合度，除去細胞培養上清液，PBS洗兩遍，加入100%甲醇4℃固定，然後加入100 µL新鮮配製之0.6% H2 O2 -PBS，室溫處理20分鐘(min)，PBS洗兩遍。經過1% BSA(溶於PBS中)封閉後，加入雜交瘤細胞上清液4℃孵育90 min。多次洗滌後，每孔加入100 µL 稀釋之羊抗鼠Fc-HRP二抗(Sigma-Aldrich)，37℃孵育30 min。洗滌5次後、每孔加入100 µL TMB顯色基質，37℃反應15 min，加入50 µL 2 M H2 SO4 終止顯色，讀取OD 450值。此外，在某些實施中，使用包括hGCGR之N 端結構域之胺基酸序列與hFc之融合蛋白作為包被抗原，包被96孔板。經過1% BSA(溶於PBS中)封閉後，加入雜交瘤細胞上清液4℃孵育90 min。之後步驟同上述ELISA方法篩選抗hGCGR單株抗體。陽性對照為免疫小鼠之血清；陰性對照為細胞培養基上清液。經過ELISA之初步偵測，篩選到了數個分泌抗hGCGR抗體之陽性雜交瘤細胞株。選取此等分泌抗hGCGR抗體之雜交瘤株，進行選殖以獲得能穩定分泌抗hGCGR抗體之細胞株。最後選取陽性雜交瘤細胞製備之腹水抗體進行FACS驗證(參考實例10)。
4、抗體基因之選殖及次選殖
收集分泌抗體之雜交瘤細胞，按照QIAGEN之mRNA抽提套組操作規程，提取雜交瘤細胞之mRNA。然後將提取後之mRNA反轉錄成cDNA，反轉錄引子為小鼠輕、重鏈恆定區之特異性引子，重鏈反轉錄引子為(5'-TTTGGRGGGAAGATGAAGAC-3')，輕鏈反轉錄引子為 (5'-TTAACACTCTCCCCTGTTGAA-3')及(5'- TTAACACTCATTCCTGTTGAA-3')。RT-PCR之反應條件為：25℃ 5 min；50℃ 60 min；70℃ 15 min。將反轉錄之cDNA用0.1 mM之TE稀釋至500 µL，加入到超濾離心管(Amicon Ultra-0.5)中，2000 g離心10 min；棄濾液，再加500 µL之0.1 mM之TE，2000 g離心10 min；棄濾液，將製備管倒置到新之離心管中，2000 g離心10 min，得到純化後之cDNA；取10 µL之純化後之cDNA作為模板，加入4 µL之5 ×加尾緩衝液(tailing buffer) (Promega)，4 µL之dATP(1 mM)及10 U之末端轉移酶(Promega)後混勻，37℃孵育5 min後再65℃孵育 5 min；然後以加上PolyA尾之cDNA為模板，PCR擴增抗體之輕、重鏈可變區基因。上游引子均為OligodT，重鏈下游引子為(5'-TGGACAGGGATCCAGAGTTCC-3')及(5'- TGGACAGGGCTCCATAGTTCC-3')，輕鏈下游引子為(5'- ACTCGTCCTTGGTCAACGTG-3')。PCR反應條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min 40個循環；72℃ 7 min；PCR產物連接到PMD 18-T載體(Takara Bio)後進行測序。基於已測序得到之抗體之DNA序列設計PCR引子，從而將完整輕鏈、重鏈信號肽及可變域以及小鼠IgG1恆定區與表現載體pTM5相連。
5、抗體之人源化及優化
首先，根據篩選所得之鼠源抗體輕、重鏈可變區序列，使用NCBI數據庫搜索與篩選所得之鼠源之抗體可變區序列同源之人源抗體生殖細胞株基因序列(Ig Germline Gene Sequence)，並將除CDR序列外，同源性最高之人源基因序列做為模板序列進行CDR嫁接，得到人源化之抗體可變區序列。合成人源化抗體輕、重鏈之基因，與人IgG2 或者IgG4 恆定區序列拼接後得到完整之重組人源化抗體序列。重組抗體按照實例8進行表現，並按照步驟10中之FACS技術驗證其針對GCGR之親和力，遴選出親和力表現最優秀之抗體。最後藉由定點突變，對人源化抗體之可變區序列進行改造，進一步提高其對GCGR之親和力。
6、人源化hGCGR抗體之基因選殖與次選殖
優化後之人源化抗體重鏈及輕鏈可變區序列外包合成。合成時重鏈可變區5'端帶入Nhe1酶切位點，3'端帶入Sal1酶切位點，從而將完整之重鏈可變區序列與已裝入重鏈恆定區之表現載體pTM5相連。同樣，合成時輕鏈可變區5'端帶入Nhe1酶切位點，3'端帶入Bsiw1酶切位點，從而將完整之輕鏈可變區序列與已裝入輕鏈恆定區之表現載體pTM5相連。
7、人源化hGCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質之構築
優化後之人源化抗體在輕鏈之N端或者C端與GLP-1及其衍生物序列進行融合組成GLP-1融合蛋白質。兩者之序列由肽連接子(Linker)做為橋樑進行連接。信號肽-GLP-1-Linker之核苷酸序列由金斯瑞生物科技有限公司合成。以合成基因為模板，PCR擴增「信號肽-GLP-1-連接子」部分之序列。另以人源化抗體之核苷酸序列為模板，擴增融合蛋白質之抗體部分之序列。然後藉由重疊PCR將融合蛋白質核酸序列之「信號肽-GLP-1-連接子」部分與抗體部分連接，引子兩端添加Nhe1及Not1之酶切位點，從而將完整之融合蛋白質序列與表現載體pTM5相連。
8、GCGR抗體及GLP-1之融合蛋白質之瞬時表現
接種5×105 /mL之懸浮HEK293或者CHO表現細胞株至轉瓶中。經過37℃，5% CO2 旋轉培養24 hr後，密度達到1×106 /mL後被用於轉染。轉染過程中使用聚乙烯亞胺(PEI)作為轉染介質，將其與之DNA混合。兩者混合物在靜置孵育15 min後被加入到細胞培養中。細胞在接受PEI與DNA混合物後繼續37℃，5% CO2 旋轉培養24 hr後，向細胞培養液中加入胰蛋白腖作為表現需要之添加物。最後在表現完成後(96 hr以上)收集細胞上清液用於抗體之純化分離。
9、GCGR抗體及GLP-1之融合蛋白質之純化分離
收集之實例8中之細胞上清液經過高速(8000 rpm)離心移除細胞以及細胞碎片後，再用0.22 　m濾膜過濾澄清。澄清後之上清液被用於純化。純化過程由層析儀完成。上清液首先流過蛋白A/G親和層析柱。上清液中包括之抗體在此期間與蛋白A/G親和層析柱之配糖基相結合後被滯留於柱內。然後用低pH值(小於等於3.0)之溶離緩衝液灌洗層析柱解離與層析柱結合之抗體。收集到之抗體溶離液用1 M之Tris-HCl迅速中和。得到之抗體溶離液經過透析後置換成PBS或者其他緩衝體系。
10、流式細胞儀驗證功能性GCGR抗體之結合活性
用含10 mM EDTA之PBS消化、收集105 個CHO-DHFR-hGCGR細胞，分別加入1.5 mL EP管，離心後棄上清液。陰性對照樣本用流式上樣緩衝液(PBS，2% FBS)重懸。陽性處理組細胞每管加200 µL特定濃度之hGCGR抗體，室溫孵育；孵育完成後1500 rpm離心，棄上清液，用流式上樣緩衝液洗一次細胞沈澱，再離心，將細胞重懸；向細胞重懸液加入1:50稀釋之FITC標記之羊抗鼠螢光二抗，200 µL/孔，室溫避光孵育30 min；離心，棄上清液，再用流式上樣緩衝液洗一次，離心，最後用流式上樣緩衝液將細胞沈澱重懸，上機偵測。重組抗hGCGR之功能性抗體及表現GCGR之CHO-DHFR-CHO-GCGR 細胞有特異性結合。圖1顯示之實驗結果中，灰色峰為500 nM小鼠腹水抗體L5H5及空白細胞CHO-DHFR-結合之陰性對照，實線峰分別為500 nM(1a)、50 nM(1b)及5 nM(1c)之小鼠腹水抗體L5H5及CHO-DHFR-hGCGR之結合曲線，相對於灰色峰陰性對照有明顯右移，證明了L5H5及CHO-DHFR-hGCGR之特異性結合。圖2顯示之實驗結果中，灰色峰為500 nM小鼠腹水抗體L4H4及空白細胞CHO-DHFR-結合之陰性對照，實線峰分別為500 nM(2a)、50 nM(2b)及5 nM(2c)之小鼠腹水抗體L4H4及CHO-DHFR-hGCGR之結合曲線，相對於灰色峰陰性對照有明顯右移，證明了L4H4及CHO-DHFR-hGCGR之特異性結合。
11、cAMP實驗偵測GCGR抗體及GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質在活體外拮抗GCGR之生物學活性
以每孔30000個接種表現hGCGR之CHO-DHFR-細胞至96孔細胞培養板，置於37℃，5% CO2 培養箱中過夜。第二天除去細胞上清液，加入雜交瘤細胞培養上清液或梯度稀釋之抗體45 µL/孔。室溫放置30 min，再加入胰高血糖素多肽(Phoenix Pharmaceuticals，50 pM)45 µL/孔。然後將96孔細胞培養板置於37℃，5% CO2 培養箱中繼續孵育30 min後，加10 µL/孔之10% Triton X-100，室溫裂解，用排槍混合均勻。採用cAMP套組(CisBio)偵測實驗中產生之cAMP。取上述10 µL/孔細胞裂解液於白色384孔板中，加入5 µL/孔1:20稀釋之cAMP-d2，最後加5 µL/孔1:20稀釋之抗cAMP-Eu3±穴狀化合物，室溫孵育1 hr。在Envision 2103酶標儀上讀取時間分辨螢光665 nm/620 nm信號比值，然後採用Prism5.0計算IC50 值。圖3展示直接cAMP實驗偵測hGCGR抗體L7H7拮抗胰高血糖素激活hGCGR信號通路之濃度抑制曲線(IC50 = 139 nM、R2 = 0.99)。
Schild作圖分析：採用以上直接cAMP方法，分別固定抗GCGR抗體(L4H4及L5H5)濃度為3160 nM、1000 nM、316 nM、0 nM，連續稀釋胰高血糖素(100 nM至1 fM)，偵測存在GCGR抗體之情況下，採用Prism5.0計算使得胰高血糖素劑量反應曲線2倍右移所需抗體濃度之負對數，即抗體之pA2。圖4顯示直接cAMP實驗偵測小鼠腹水GCGR抗體，拮抗梯度稀釋之胰高血糖素激活hGCGR信號通路之Schild曲線。隨著抗GCGR抗體濃度之提高，胰高血糖素激活其受體之S型曲線有明顯之右移。
12、報導基因實驗偵測GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質在活體外激活GLP-1R
以每孔40000個接種共表現hGLP-1R-CRE-螢光素酶之CHO-DHFR-細胞至96孔細胞培養板，37℃培養過夜。第二天除去培養基上清液，用無血清培養基清洗細胞表面兩次，吸去殘液，再加入100 　L用無血清培養基稀釋純化抗體或GMA102，37℃孵育4小時。刺激結束後，加入100 　L Bright Glo化學發光基質(Promega)，最後將細胞裂解物轉移至白色96孔板，在SpectraMax L酶標儀(Molecular Devices)上讀取相對螢光強度。圖5展示報導基因實驗偵測GCGR抗體/GLP-1融合蛋白質GLP-1-連接子-L7H7，以及GMA102激活hGLP-1R信號通路之激活性曲線(EC50 分別為106 pM及16 pM)。其中，GMA102係本公司開發之長效GLP-1促效劑(Li等，Biochem Pharmacol. 2018，150:46-53；CN 201410349725)，具有激活細胞內cAMP信號通路，顯著降低小鼠之血糖及體重，正處於臨床二期開發階段。
13、普通ICR小鼠藥效試驗評估GCGR抗體L4H4單獨或聯合GMA102(本公司之GLP-1R抗體與GLP-1之融合蛋白質)之活體內藥效
各組動物禁食過夜(自由飲水)後，尾尖採血，以羅氏卓越型血糖儀(下同)測定血糖水平(0 min)，之後皮下注射給藥(0.1 mL/10 g 體重，正常對照組給予 PBS，給藥組：L4H4單獨使用2.5、5、10 mg/kg，或者分別聯用GMA102劑量2.5、5 mg/kg，GMA102由於係人源化抗體融合蛋白，在小鼠內存在抗藥抗體，因而每兩天給一次藥，鼠源L4H4僅給一次藥)，在皮下注射後 30 min 各組動物葡萄糖溶液灌胃(2 g/kg，0.1 mL/10 g 體重)，並於糖負荷後 30、60 及 120 min 尾尖採血，測定血糖水平。給藥第 2 天，為了減少對動物之刺激，僅測定各組動物禁食 5 hr( 自由飲水)後(0 min)及葡萄糖負荷後30 min 之血糖水平。之後連續測定給藥四天、六天、八天、十天、十二天後糖負荷後血糖值。
將GMA102及抗GCGR抗體L4H4聯用後，表3展示自第二天到第八天，單用GMA102、L4H4，以及聯用GMA102及L4H4都明顯降低小鼠之口服糖耐量，而且聯用之效果比單用效果更明顯，具有協同增效之作用。以血糖濃度變化之線下面積AUC表示 (mean±SD)、N = 6。

表3 : ICR小鼠中單次皮下注射L4H4、GMA102,以及二者聯合用藥後，在不同天偵測口服糖耐量
備註：VS PBS，*、P＜0.05、**、P＜0.01 ；VS L4H4-2.5mg/kg、#、P＜0.05s ##、P＜0.01 ；VS L4H4-5mg/kg、Δ、P＜0.05、Δ Δ、P＜0.01 ；VS L4H4-10mg/kg、☆ ，P＜0.05、☆☆ P＜0.01 ；VS GMA102-5mg/kg、P＜0.05、 P＜0.01。


14、高脂飼料誘導之C57BL/6肥胖小鼠藥效實驗評價L4H4單獨或聯合GMA102(本公司之GLP-1R抗體與GLP-1之融合蛋白質)之活體內藥效
60%高脂飼料誘導C57BL/6小鼠建立肥胖模型(DIO小鼠)。小鼠購入後正常飲食飼養一週後，隨機挑選一定數目之老鼠作為正常對照組給予普通小鼠飼料餵養，剩餘動物給予高脂飼料。連續飼喂8週(wk)，每週稱量一次體重及進食量。隨後將高脂飼料組老鼠按體重隨機分組。各組動物禁食過夜(自由飲水)後，尾尖採血，以羅氏卓越型血糖儀(下同)測定血糖水平(0 min)，之後皮下注射給藥(0.1 mL/10 g 體重，正常對照組給予 PBS，給藥組：L4H4單獨使用2.5、5 mg/kg，GMA102單獨使用2.5 mg/kg，抗L4H4及低劑量、高劑量之GMA102聯用，L4H4每週一次，GMA102每兩天一次給藥)。監測動物之體重、耗食量、隨機血糖水平、空腹血糖、OGTT及糖化血紅蛋白。圖6展示高脂飼料誘導之C57BL/6肥胖小鼠中單次皮下注射L4H4、GMA102，以及聯用GMA102及L4H4都顯著降低肥胖小鼠之口服糖耐量，而且聯用之效果比單用效果更明顯，亦具有協同增效之作用。單次用藥至兩週後，仍然具有明顯之降血糖效果，表明L4H4抗體具有明顯長效之作用。注：與模型組組相比，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與L4H4-5mg/kg組相比，Δ表示P＜0.05，ΔΔ表示P＜0.01；與GMA102-2.5 mg/kg組相比，☆表示P＜0.05，☆☆表示P＜0.01。
15、GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質在食蟹猴上之藥代動力學實驗
給予雌雄各半共6隻食蟹猴皮下單次GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質注射，劑量為2 mg/kg，並在給藥前(0 min)，給藥後2 hr，4 hr，8 hr，12 hr，24 hr，2 d，4 d，6 d，8 d，10 d，12 d，18 d，28 d進行給藥側肢靜脈取全血0.6 mL置於離心管中在冰上待其自然凝固後離心提取血清，超低溫保存(-80℃)至偵測為止。血清樣品中之GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質之GLP-1部分以及hGCGR抗體部分係用ELISA方法對其進行分別定量，並藉由軟體分析判定兩者在食蟹猴體內之半衰期。
16、GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質在恆河猴上之藥代動力學實驗
給予雌雄各半共2隻健康恆河猴皮下單次GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質(GLP-1-連接子-L7H7)注射，劑量為2 mg/kg，並在給藥前(0 min)，給藥後2h、4h、8h、12h、24h、2天、4天、6天、8天、10天、12天、16天、20天、25天、30天、40天、50天及60天經非給藥肢靜脈取全血0.6 mL置於已有8 μL DDP-IV酶抑制劑(Millipore)之離心管中，放在冰上待其自然凝固後離心提取血清，超低溫保存(-80℃)至偵測為止。血清樣品中之GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質之GLP-1部分以及hGCGR抗體部分係用ELISA方法對其進行分別定量，並藉由軟體分析判定兩者在恆河猴體內之半衰期。
PK研究顯示，GLP-1部分之半衰期T1/2 約為38小時，而GLP-1-連接子-L7H7之抗體部分半衰期T1/2 約為131小時。PK曲線及參數見圖7及表4。
表4：GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質(GLP-1-連接子-L7H7)藥代動力學參數
17、實驗研究GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質單次給藥對健康恆河猴靜脈葡萄糖耐量(IVGTT)影響
給予雌雄各半共4隻健康恆河猴皮下單次注射給藥：GLP-1-連接子-L7H7及陽性對照GMA102(本公司之GLP-1R抗體與GLP-1之融合蛋白質)，劑量為2 mg/kg。所有動物試驗前一天晚上禁食14-16小時過夜，試驗當天動物麻醉後經下肢靜脈注射50%葡萄糖溶液(0.25 g/kg)，分別於給糖前5 min、3 min及給糖後3 min、5 min、7 min，10 min、20 min及30 min經前臂靜脈採集血樣0.8 mL，EDTA2K抗凝，離心後分離血漿，用於胰島素及血糖之偵測。
採用Roche cobas 6000分析儀系列E601偵測胰島素(U/mL)。結果如圖8及圖9所示，注射前，二組動物分泌等量之胰島素，而注射後48小時後，GLP-1-連接子-L7H7組比陽性對照組分泌更多之胰島素。採用Roche cobas 6000分析儀系列C501偵測血糖Glucose (mmol/L)，結果如圖10及圖11所示，注射前，二組猴子之血糖相當，而注射後48小時後，GLP-1-連接子-L7H7組比陽性對照組之降糖幅度更大。
提供以上例用於向一般熟習此項技術者充分揭示及說明如何製造及使用要求保護之實施例，而不意謂限制本文揭示之範疇。對熟習此項技術者而言顯而易見之修飾均在本文申請專利範圍之範疇內。將本說明書中引用之所有出版物、專利及專利申請均藉由引用併入本文，就如同各出版物、專利或專利申請均被具體及單獨地藉由引用併入本文一樣。
圖1：展示流式細胞術(FACS)偵測小鼠腹水抗體L5H5 (其包括SEQ ID NO: 85與SEQ ID NO: 95)與hGCGR特異性結合之結果，灰色峰為500 nM小鼠腹水抗體L5H5及空白細胞CHO-DHFR-結合之陰性對照，實線峰分別為500 nM(1a)、50 nM (1b)及5 nM(1c)之小鼠腹水抗體L5H5及CHO-DHFR-hGCGR之結合曲線，相對於灰色峰陰性對照有明顯右移，證明了L5H5及CHO-DHFR-hGCGR之特異性結合。
圖2：展示流式細胞術(FACS)偵測小鼠腹水抗體L4H4 (其包括SEQ ID NO: 84與SEQ ID NO: 94)與hGCGR特異性結合之結果，灰色峰為500nM小鼠腹水抗體L4H4及空白細胞CHO-DHFR-結合之陰性對照，實線峰分別為500 nM (2a)、50 nM (2b)及5 nM (2c)之小鼠腹水抗體L4H4及CHO-DHFR-hGCGR之結合曲線，相對於灰色峰陰性對照有明顯右移，證明了L4H4及CHO-DHFR-hGCGR之特異性結合。
圖3：展示直接cAMP實驗偵測hGCGR抗體L7H7 (其包括SEQ ID NO: 87與SEQ ID NO: 97)拮抗胰高血糖素激活hGCGR信號通路之濃度抑制曲線(IC50 = 139 nM，R2 = 0.99)。
圖4：展示直接cAMP實驗偵測小鼠腹水GCGR抗體(L4H4及L5H5)拮抗梯度稀釋之胰高血糖素激活hGCGR信號通路之Schild曲線。隨著抗GCGR抗體濃度之提高，胰高血糖素激活hGCGR之S型曲線有明顯之右移。
圖5：展示報導基因實驗偵測GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質GLP-1-連接子-L7H7，以及GMA102激活hGLP-1R信號通路之激活性曲線(EC50 分別為106 pM及16 pM，R2 = 0.99)。
圖6：展示高脂飼料誘導之C57BL/6肥胖小鼠中單次皮下注射L4H4、GMA102(每兩天一次)，以及二者聯合用藥後，第14天偵測口服糖耐量之結果。
圖7：展示健康恆河猴藥代實驗週期內hGCGR抗體與GLP-1融合蛋白質GLP-1-連接子-L7H7之藥代(PK)時間曲線。
圖8：展示在健康恆河猴靜脈葡萄糖耐量試驗(IVGTT)中，單次皮下注射陽性對照藥及GLP-1-連接子-L7H7前之胰島素變化。
圖9：展示在健康恆河猴靜脈葡萄糖耐量試驗(IVGTT)中，單次皮下注射陽性對照藥及GLP-1-連接子-L7H7後48小時之胰島素變化。
圖10：展示在健康恆河猴靜脈葡萄糖耐量試驗(IVGTT)中，單次皮下注射陽性對照藥及GLP-1-連接子-L7H7前之血糖變化。
圖11：展示在健康恆河猴靜脈葡萄糖耐量試驗(IVGTT)中，單次皮下注射陽性對照藥及GLP-1-連接子-L7H7後48小時之血糖變化。
Figure TW201945392A_D0008
Figure TW201945392A_D0009
Figure TW201945392A_D0010
Figure TW201945392A_D0011
Figure TW201945392A_D0012
Figure TW201945392A_D0013
Figure TW201945392A_D0014
Figure TW201945392A_D0015
Figure TW201945392A_D0016
Figure TW201945392A_D0017
Figure TW201945392A_D0018
Figure TW201945392A_D0019
Figure TW201945392A_D0020
Figure TW201945392A_D0021
Figure TW201945392A_D0022
Figure TW201945392A_D0023
Figure TW201945392A_D0024
Figure TW201945392A_D0025
Figure TW201945392A_D0026
Figure TW201945392A_D0027
Figure TW201945392A_D0028
Figure TW201945392A_D0029
Figure TW201945392A_D0030
Figure TW201945392A_D0031
Figure TW201945392A_D0032
Figure TW201945392A_D0033
Figure TW201945392A_D0034
Figure TW201945392A_D0035
Figure TW201945392A_D0036
Figure TW201945392A_D0037
Figure TW201945392A_D0038
Figure TW201945392A_D0039
Figure TW201945392A_D0040
Figure TW201945392A_D0041
Figure TW201945392A_D0042
Figure TW201945392A_D0043
Figure TW201945392A_D0044
Figure TW201945392A_D0045
Figure TW201945392A_D0046
Figure TW201945392A_D0047
Figure TW201945392A_D0048
Figure TW201945392A_D0049
Figure TW201945392A_D0050
Figure TW201945392A_D0051
Figure TW201945392A_D0052
Figure TW201945392A_D0053
Figure TW201945392A_D0054
Figure TW201945392A_D0055
Figure TW201945392A_D0056
Figure TW201945392A_D0057
Figure TW201945392A_D0058
Figure TW201945392A_D0059
Figure TW201945392A_D0060
Figure TW201945392A_D0061
Figure TW201945392A_D0062
Figure TW201945392A_D0063
Figure TW201945392A_D0064
Figure TW201945392A_D0065
Figure TW201945392A_D0066
Figure TW201945392A_D0067
Figure TW201945392A_D0068
Figure TW201945392A_D0069
Figure TW201945392A_D0070
Figure TW201945392A_D0071
Figure TW201945392A_D0072
Figure TW201945392A_D0073
Figure TW201945392A_D0074
Figure TW201945392A_D0075
Figure TW201945392A_D0076
Figure TW201945392A_D0077
Figure TW201945392A_D0078
Figure TW201945392A_D0079
Figure TW201945392A_D0080
Figure TW201945392A_D0081
Figure TW201945392A_D0082
Figure TW201945392A_D0083
Figure TW201945392A_D0084
Figure TW201945392A_D0085
Figure TW201945392A_D0086
Figure TW201945392A_D0087
Figure TW201945392A_D0088
Figure TW201945392A_D0089
Figure TW201945392A_D0090
Figure TW201945392A_D0091
Figure TW201945392A_D0092
Figure TW201945392A_D0093

Claims (44)

  1. 一種能與人GCGR特異性結合之抗體，該抗體包括一、兩、三、四、五、或六個胺基酸序列，其中各胺基酸序列獨立地選自以下所列之胺基酸序列： a.輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18及SEQ ID NO: 20； b.輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 14； c.輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19及SEQ ID NO: 21； d. 重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 25及SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 31及SEQ ID NO: 34； e.重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 32及SEQ ID NO: 35；及 f.重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 33及SEQ ID NO: 36。
  2. 如請求項1之抗體，其中該抗體包括一或兩個胺基酸序列，其中各胺基酸序列獨立地選自以下所列之胺基酸序列： a.輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18及SEQ ID NO: 20；及 b.重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 25及SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 31及SEQ ID NO: 34。
  3. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體包括或進一步包括一或兩個胺基酸序列，其中各胺基酸序列獨立地選自以下所列之胺基酸序列： a.輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 14；及 b.重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 32及SEQ ID NO: 35。
  4. 如請求項1至3中任一項之抗體，其中該抗體包括或進一步包括一或兩個胺基酸序列，其中各胺基酸序列獨立地選自以下所列之胺基酸序列： a.輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19及SEQ ID NO: 21；及 b.重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 33及SEQ ID NO: 36。
  5. 如請求項1至4中任一項之抗體，其中該抗體包括或進一步包括一或兩個胺基酸序列，其中各胺基酸序列獨立地選自以下所列之胺基酸序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20及SEQ ID NO: 21。
  6. 如請求項1至5中任一項之抗體，其中該抗體包括或進一步包括一或兩個胺基酸序列，其中各胺基酸序列獨立地選自以下所列之胺基酸序列：SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35及SEQ ID NO: 36。
  7. 如請求項1至6中任一項之抗體，其中該抗體包括或進一步包括一個獨立地選自以下所列之輕鏈及重鏈CDR1胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 1與SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 4與SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 7與SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 10與SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 13與SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 16與SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 18與SEQ ID NO: 34，及SEQ ID NO: 20與SEQ ID NO: 34。
  8. 如請求項1至7中任一項之抗體，其中該抗體包括或進一步包括一個獨立地選自以下所列之輕鏈及重鏈CDR2胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 2與SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 5與SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 8與SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 11與SEQ ID NO: 32，及SEQ ID NO: 14與SEQ ID NO: 35。
  9. 如請求項1至8中任一項之抗體，其中該抗體包括或進一步包括一個獨立地選自以下所列之輕鏈及重鏈CDR3胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 3與SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 6與SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 9與SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 12與SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 15與SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 17與SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 19與SEQ ID NO: 36，及SEQ ID NO: 21與SEQ ID NO: 36。
  10. 如請求項1至9中任一項之抗體，其中該抗體包括一或兩個胺基酸序列，其中各胺基酸序列獨立地選自於以下所列之胺基酸序列： a.輕鏈可變結構域胺基酸序列：SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89及SEQ ID NO: 90；及與其任一序列有至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%一致性之胺基酸序列；及 b.重鏈可變結構域胺基酸序列：SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 96及SEQ ID NO: 97；及與其任一序列有至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%一致性之胺基酸序列。
  11. 如請求項1至10中任一項之抗體，其中該抗體之多聚核苷酸編碼序列包括一或兩個多聚核苷酸序列，其中各多聚核苷酸列獨立地選自於以下所列多聚核苷酸序列： a.輕鏈可變結構域多聚核苷酸編碼序列：SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100及SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103及SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106及SEQ ID NO: 107；及與其任一序列有至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%一致性之多聚核苷酸序列；及 b.重鏈可變結構域多聚核苷酸編碼序列：SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113及SEQ ID NO: 114；及與其任一序列有至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%一致性之多聚核苷酸序列。
  12. 如請求項1至11中任一項之抗體，其中該抗體包括或進一步包括一個獨立地選自於以下所列之胺基酸序列：SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89及SEQ ID NO: 90。
  13. 如請求項1至12中任一項之抗體，其中該抗體包括或進一步包括一個獨立地選自於以下所列之胺基酸序列：SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 96及SEQ ID NO: 97。
  14. 如請求項1至13中任一項之抗體，其中該抗體包括一個獨立地選自於以下所列之輕鏈與重鏈可變區胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 81與SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 82與SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 83與SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 84與SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 85與SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 86與SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 87與SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 88與SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 89與SEQ ID NO: 97，及SEQ ID NO: 90與SEQ ID NO: 97。
  15. 如請求項1至14中任一項之抗體，其中該抗體包括或進一步包括一個獨立地選自於以下所列之胺基酸序列：SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 96及SEQ ID NO: 97。
  16. 如請求項1至15中任一項之抗體，其中該抗體包括一個獨立地選自於以下所列之輕鏈與重鏈可變區胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 81與SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 82與SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 84與SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 85與SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 86與SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 87與SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 88與SEQ ID NO: 97，及SEQ ID NO: 89與SEQ ID NO: 97。
  17. 如請求項1至16中任一項之抗體，其中該抗體進一步包括一或兩個胺基酸序列，其中各胺基酸序列獨立地選自於以下所列之胺基酸序列： a.輕鏈恆定胺基酸序列：SEQ ID NO: 115及SEQ ID NO: 116； 輕鏈恆定胺基酸序列：SEQ ID NO: 132及SEQ ID NO: 133；及 b. 重鏈恆定胺基酸序列：SEQ ID NO: 117及SEQ ID NO: 118。
  18. 如請求項1至17中任一項之抗體，其中該抗體為鼠源GCGR抗體或人源化GCGR抗體。
  19. 如請求項1至18中任一項之抗體，其中該抗體為GCGR單株抗體。
  20. 如請求項1至19中任一項之抗體，其中該抗體為單株抗體、該單株抗體包括一個選自於以下所列之胺基酸序列之組合： SEQ ID NO: 81與SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 82與SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 83與SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 84與SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 85與SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 86與SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 87與SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 88與SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 89與SEQ ID NO: 97，及SEQ ID NO: 90與SEQ ID NO: 97。
  21. 如請求項1至20中任一項之抗體，其特徵在於：該抗體為鼠源抗體、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單株抗體、多株抗體、重組抗體、抗原結合抗體片段、單鏈抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、Fab片段、F(ab')x片段、結構域抗體、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgGl抗體、IgG2抗體、IgG3抗體、或IgG4抗體。
  22. 如請求項1至21中任一項之抗體，其中該抗體之降低人Glucagon信號傳導之IC50 值為大約1 nM至大約300 nM或大約1 nM 至大約150 nM。
  23. 一種GCGR抗體與GLP-1之融合蛋白質(GLP-1融合蛋白質)，其結構特徵在於：所述之融合蛋白質包括請求項1至22中任一項之一個GCGR抗體及一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、或八個GLP-1片段或反向GLP-1片段；該融合蛋白質藉由一肽連接子(Linker)將GLP-1片段之羧基端與GCGR抗體輕鏈或重鏈之胺基端連接，或者將反向GLP-1片段之胺基端與GCGR抗體輕鏈或重鏈之羧基端連接。
  24. 如請求項23之融合蛋白質，其所述之融合蛋白質包括一個GCGR抗體，及一個、兩個、三個、或四個GLP-1片段；該融合蛋白質藉由一個肽連接子(Linker)將GLP-1片段之羧基端與GCGR抗體輕鏈或重鏈之胺基端連接。
  25. 如請求項23之融合蛋白質，其所述之融合蛋白質包括一個GCGR抗體，及一個、兩個、三個、或四個反向GLP-1片段；該融合蛋白質藉由一個肽連接子(Linker)將反向GLP-1片段之胺基端與GCGR抗體輕鏈或重鏈之羧基端連接。
  26. 如請求項23之融合蛋白質，其所述之融合蛋白質包括一個GCGR抗體，及兩個GLP-1片段；該融合蛋白質藉由一個肽連接子(Linker)將GLP-1片段之羧基端與GCGR抗體輕鏈或者重鏈之胺基端連接。
  27. 如請求項23之融合蛋白質，其所述之融合蛋白質包括一個GCGR抗體，及兩個反向GLP-1片段；該融合蛋白質藉由一個肽連接子(Linker)將反向GLP-1片段之胺基端與GCGR抗體輕鏈或者重鏈之羧基端連接。
  28. 如請求項23之融合蛋白質，其中所述之GCGR抗體、GLP-1片段、反向GLP-1片段及肽連接子(Linker)藉由以下中之方式融合形成所述之融合蛋白質： 藉由肽連接子(Linker)將GLP-1片段之羧基端及GCGR抗體輕鏈或者重鏈之胺基端連接：N'-GLP-1-連接子-R-C'; 藉由肽連接子(Linker)將反向GLP-1片段之胺基端及GCGR抗體輕鏈或者重鏈之羧基端連接：N'-R-連接子-反向GLP-1-C'; 其中：N' 代表多肽鏈之胺基端、C' 代表多肽鏈之羧基端、GLP-1代表GLP-1片段，反向GLP-1代表反向GLP-1片段，R為如請求項1至22之GCGR抗體之輕鏈或者重鏈之胺基酸序列，及連接子代表肽連接子。
  29. 如請求項23至28中任一項之GLP-1融合蛋白質，其中所述之肽連接子(Linker)之序列包括全長的、部分的、或者重複的獨立選自以下中之一者的胺基酸序列：SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 125及SEQ ID NO: 126。
  30. 如請求項23至29中任一項之GLP-1融合蛋白質，其中所述之GLP-1片段包括獨立選自以下中之一者的胺基酸序列：SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 120、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 122及SEQ ID NO: 123；或者其中所述之反向GLP-1片段包括獨立選自以下中之一者的胺基酸序列：SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130及SEQ ID NO: 131。
  31. 一種聚核苷酸，其編碼如請求項1至22中任一項之GCGR抗體或請求項23至30中任一項之GLP-1融合蛋白質。
  32. 一種載體，其包括請求項31中之聚核苷酸。
  33. 一種宿主細胞，其包括請求項32中之載體。
  34. 一種醫藥組合物，其包括與醫藥學上可接受之載體混合之如請求項1至22中任一項之GCGR抗體或如請求項23至30中任一項之GLP-1融合蛋白質。
  35. 一種包括如請求項1至22中任一項之GCGR抗體或如請求項23至30中任一項之GLP-1融合蛋白質或如請求項34之醫藥組合物，在製備用於預防或治療高血糖症之藥物中之用途。
  36. 一種包括如請求項1至22中任一項之GCGR抗體或如請求項23至30中任一項之GLP-1融合蛋白質或如請求項34之醫藥組合物，在製備用於預防或治療二型糖尿病之藥物中之用途。
  37. 一種包括如請求項1至22中任一項之GCGR抗體或如請求項23至30中任一項之GLP-1融合蛋白質或如請求項34之醫藥組合物，在製備用於預防或治療二型糖尿病併發症之藥物中之用途。
  38. 一種包括如請求項1至22中任一項之GCGR抗體或如請求項23至30中任一項之GLP-1融合蛋白質或如請求項34之醫藥組合物，在製備用於預防或治療代謝綜合症之藥物中之用途。
  39. 一種包括如請求項1至22中任一項之GCGR抗體或如請求項23至30中任一項之GLP-1融合蛋白質或如請求項34之醫藥組合物，在製備用於預防或治療血脂異常之藥物中之用途。
  40. 一種包括如請求項1至22中任一項之GCGR抗體或如請求項23至30中任一項之GLP-1融合蛋白質或如請求項34之醫藥組合物，在製備用於同時治療高血糖症、二型糖尿病、二型糖尿病併發症、代謝綜合症、或血脂異常中兩種或更多種病症之藥物中之用途。
  41. 如請求項35至40中任一項之用途，其中所述之醫藥組合物係用於靜脈或皮下注射。
  42. 如請求項35至41中任一項之用途，進一步包括注射一種GLP-1R抗體與GLP-1之融合蛋白質。
  43. 如請求項42之用途，其中所述之GLP-1R抗體與GLP-1之融合蛋白質包括: a.輕鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 134； b.輕鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 135； c.輕鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 136； d.重鏈CDR1胺基酸序列：SEQ ID NO: 137； e.重鏈CDR2胺基酸序列：SEQ ID NO: 138；及 f.重鏈CDR3胺基酸序列：SEQ ID NO: 139。
  44. 如請求項43之用途，其中所述之GLP-1R抗體與GLP-1之融合蛋白質包括以下所列之輕鏈與重鏈可變區胺基酸序列之組合：SEQ ID NO: 140與SEQ ID NO: 141。
TW108109317A 2018-04-10 2019-03-19 Gcgr抗體及其與glp-1的融合蛋白質，以及其藥物組合物和應用 TWI842699B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810316473.0 2018-04-10
CN201810316473.0A CN110357959B (zh) 2018-04-10 2018-04-10 Gcgr抗体及其与glp-1的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201945392A true TW201945392A (zh) 2019-12-01
TWI842699B TWI842699B (zh) 2024-05-21

Family

ID=68163932

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW108109317A TWI842699B (zh) 2018-04-10 2019-03-19 Gcgr抗體及其與glp-1的融合蛋白質，以及其藥物組合物和應用

Country Status (6)

Country Link
US (1) US11542336B2 (zh)
EP (1) EP3778634A4 (zh)
CN (1) CN110357959B (zh)
CA (1) CA3096556A1 (zh)
TW (1) TWI842699B (zh)
WO (1) WO2019196603A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115947849A (zh) * 2018-12-21 2023-04-11 江苏恒瑞医药股份有限公司 双特异性蛋白
WO2022083720A1 (zh) * 2020-10-23 2022-04-28 江苏恒瑞医药股份有限公司 Glp1-gcgr抗体融合蛋白变体及包含其的组合物

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4331647A (en) 1980-03-03 1982-05-25 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4737462A (en) 1982-10-19 1988-04-12 Cetus Corporation Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of interferon-β
US4518584A (en) 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5011912A (en) 1986-12-19 1991-04-30 Immunex Corporation Hybridoma and monoclonal antibody for use in an immunoaffinity purification system
US5262522A (en) 1991-11-22 1993-11-16 Immunex Corporation Receptor for oncostatin M and leukemia inhibitory factor
NZ257942A (en) 1992-10-23 1996-04-26 Immunex Corp Preparing a mammalian protein by expression of a fusion protein containing a leucine zipper domain
US5457035A (en) 1993-07-23 1995-10-10 Immunex Corporation Cytokine which is a ligand for OX40
US6133426A (en) 1997-02-21 2000-10-17 Genentech, Inc. Humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies
EP0985039B1 (en) 1997-06-12 2008-02-20 Novartis International Pharmaceutical Ltd. Artificial antibody polypeptides
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
US6210924B1 (en) 1998-08-11 2001-04-03 Amgen Inc. Overexpressing cyclin D 1 in a eukaryotic cell line
GB9928787D0 (en) 1999-12-03 2000-02-02 Medical Res Council Direct screening method
GB0025144D0 (en) 2000-10-13 2000-11-29 Medical Res Council Concatenated nucleic acid sequences
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20040202995A1 (en) 2003-04-09 2004-10-14 Domantis Nucleic acids, proteins, and screening methods
CA2649751A1 (en) * 2006-04-20 2007-11-01 Amgen Inc. Glp-1 compound/glucagon antibody compositions
US20080036341A1 (en) 2006-08-11 2008-02-14 Nilsen John Ceiling storage container mounting system
CL2007002668A1 (es) 2006-09-20 2008-05-09 Amgen Inc Proteina de union a antigeno que se une al receptor de glucagon humano; acido nucleico que la codifica; metodo de produccion; composicion farmaceutica que la comprende; y su uso para tratar o prevenir la diabetes tipo 2.
AR070844A1 (es) 2008-03-27 2010-05-05 Lilly Co Eli Fragmento fab o anticuerpo monoclonal humanizado que comprende el fragmento fab, y su uso para la manufactura de un medicamento antagonista del polipeptido del receptor de glucagon para el tratamiento o prevencion de diabetes de tipo 1 o 2
BR112012005208A2 (pt) * 2009-09-08 2016-11-22 Neopharm Co Ltd antiocorpos contra o receptor de glucagon e seu uso
JO3756B1 (ar) * 2010-11-23 2021-01-31 Regeneron Pharma اجسام مضادة بشرية لمستقبلات الجلوكاجون
WO2013059531A1 (en) 2011-10-20 2013-04-25 Genentech, Inc. Anti-gcgr antibodies and uses thereof
MX2015015339A (es) * 2013-05-07 2016-07-15 Rinat Neuroscience Corp Anticuerpos de receptor anti-glucagon y metodos de uso de los mismos.
CN104231083A (zh) * 2013-06-09 2014-12-24 杭州鸿运华宁生物医药工程有限公司 抗胰高血糖素受体的抗体及其用途
CN104371019B (zh) 2013-08-13 2019-09-10 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 一种能与glp-1r特异性结合的抗体及其与glp-1的融合蛋白质
CN104926934B (zh) * 2014-09-23 2016-11-09 蒋先兴 胃泌酸调节素类似物
EP3277830A4 (en) * 2015-04-02 2018-11-21 REMD Biotherapeutics, Inc. Methods for treating obesity and nonalcoholic fatty liver disease or nonalcoholic steatohepatitis using glucagon receptor antagonistic antibodies
US20180126000A1 (en) * 2016-06-02 2018-05-10 Abbvie Inc. Glucocorticoid receptor agonist and immunoconjugates thereof
CN106084031B (zh) * 2016-06-02 2020-03-31 中国药科大学 一类glp-1r/gcgr双重激动剂在用于降糖和减肥药物中的运用
KR102708864B1 (ko) * 2016-08-30 2024-09-25 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 글루카곤 수용체 신호전달을 간섭함에 의한 중증 인슐린 저항성의 치료 방법

Also Published As

Publication number Publication date
CA3096556A1 (en) 2019-10-17
EP3778634A1 (en) 2021-02-17
US20210122827A1 (en) 2021-04-29
US11542336B2 (en) 2023-01-03
EP3778634A4 (en) 2022-04-06
CN110357959B (zh) 2023-02-28
WO2019196603A1 (zh) 2019-10-17
CN110357959A (zh) 2019-10-22
TWI842699B (zh) 2024-05-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2021052349A1 (zh) Gipr抗体及其与glp-1的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用
TWI832847B (zh) Gipr抗體及其與glp-1的融合蛋白質，以及其藥物組合物和應用
WO2021008519A1 (zh) ETA抗体与TGF-βTrap的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用
TWI842699B (zh) Gcgr抗體及其與glp-1的融合蛋白質，以及其藥物組合物和應用
TWI826351B (zh) Ｒ抗體,其藥物組合物及其應用
WO2020248967A1 (zh) Eta抗体与bnp的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用
WO2019238093A1 (zh) APJ抗体及其与Elabela的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用
WO2024051802A1 (zh) Gipr抗体及其与fgf21的融合蛋白，以及其药物组合物和应用
WO2022206857A1 (zh) 一种能与人内皮素受体特异性结合的抗体及其在糖尿病肾病和慢性肾病治疗中的应用