DE69839147T2 - Künstliche antikörperpolypeptide - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Erzeugung und Selektion bindender und katalytischer Polypeptide durch die Verfahren der Molekularbiologie, unter Verwendung sowohl kombinatorischer Chemie als auch rekombinanter DNA. Die Erfindung betrifft in spezifischer Weise die Erzeugung sowohl von Nukleinsäurebibliotheken als auch davon abgeleiteter Polypeptidbibliotheken, die das Molekulargerüst von Fibronektin Typ III (Fn3), das in einer oder mehreren seiner Schleifenregionen modifiziert wurde, codieren. Die Erfindung betrifft außerdem die „künstlichen Miniantikörper" oder „Monobodies", d. h. diejenigen Polypeptide, die ein Fn3-Gerüst umfassen, auf das Schleifenregionen übertragen wurden, die befähigt sind, an eine Vielzahl verschiedener molekularer Strukturen zu binden (wie etwa Antikörperbindungsstellen).
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Antikörperstruktur
  • Ein Standardantikörper (Ab) ist eine tetramere Struktur, die aus zwei identischen schweren Immunglobulin(Ig)-Ketten und zwei identischen leichten Ketten besteht. Die schweren und die leichten Ketten eines Ab bestehen aus verschiedenen Domänen. Jede leichte Kette besitzt eine variable Domäne (VL) und eine konstante Domäne (CL), wogegen jede schwere Kette eine variable Domäne (VH) und drei oder vier konstante Domänen (CH) besitzt (Alzari et al., 1988). Jede Domäne, bestehend aus ~110 Aminosäureresten, wird zu einer charakteristischen β-Sandwichstruktur gefaltet, die aus zwei β-Faltblättern, die gegeneinander gepackt angeordnet sind – der Immunglobulinfaltung – aufgebaut ist. Die VH- und VL-Domänen besitzen jeweils drei Komplementaritäts-bestimmende Regionen (CDR1-3), die Schleifen oder Biegungen darstellen, die β-Stränge an einem Ende der Domänen verbinden (1: A, C). Die variablen Regionen sowohl der leichten als auch der schweren Ketten tragen allgemein zur Antigenspezifität bei, obwohl der Beitrag der einzelnen Ketten zur Spezifität nicht immer gleich ist. Antikörpermoleküle haben sich so entwickelt, dass sie eine große Anzahl von Molekülen binden, indem sie sechs dem Zufallsprinzip unterworfene Schleifen (CDRs) verwenden. Jedoch stellen die Größe der Antikörper und die Komplexität der sechs Schleifen eine wesentliche Hürde beim Design dar, wenn das Endergebnis ein relativ kleiner Peptidligand sein soll.
  • Antikörper-Substrukturen
  • Die funktionellen Substrukturen von Antikörpern können durch Proteolyse und durch rekombinante Verfahren hergestellt werden. Diese beinhalten das Fab-Fragment, das die VH-CH1-Domänen der schweren Kette und die VL-CL1-Domänen der leichten Kette umfasst, verbunden durch eine einzelne zwischen den Ketten liegende Disulfidbindung, sowie das Fv-Fragment, das nur die VH- und VL-Domänen umfasst. In einigen Fällen behält eine einzelne VH-Domäne eine signifikante Affinität bei (Ward et al., 1989). Es ist außerdem gezeigt worden, dass eine bestimmte monomere leichte κ-Kette spezifisch an ihr zugehöriges Antigen binden wird (L. Masat et al., 1994). Für getrennte leichte oder schwere Ketten ist manchmal herausgefunden worden, dass sie eine gewisse Antigen-bindende Aktivität beibehalten (Ward et al., 1989). Diese Antikörperfragmente sind aufgrund ihrer Größe, geringen Löslichkeit oder geringen konformativen Stabilität nicht für eine Strukturanalyse unter Verwendung von NMR-Spektroskopie geeignet.
  • Eine weitere funktionelle Substruktur ist ein einzelkettiges Fv (scFv), bestehend aus den variablen Regionen der schweren und leichten Immunglobulinkette bei kovalenter Verbindung durch einen Peptidlinker (S-z Hu et al., 1996). Diese kleinen Proteine (Mr 25.000) behalten im allgemeinen Spezifität und Affinität für Antigen in einem einzelnen Polypeptid bei und können einen passenden Baustein für größere, Antigen-spezifische Moleküle bereitstellen. Verschiedene Gruppen haben über Bioverteilungsstudien bei mit Xenotransplantat versehenen, Thymus-losen Mäusen unter Verwendung von scFv, das reaktiv gegenüber einer Vielzahl von Tumorantigenen ist, berichtet, wobei eine spezifische Tumorlokalisation beobachtet wurde. Jedoch begrenzt die kurze Überlebensdauer von scFvs im Blutkreislauf die Exposition der Tumorzellen gegenüber den scFvs, was Grenzen für das Ausmaß der Aufnahme setzt. Als Ergebnis betrug die Tumoraufnahme der scFvs bei Tierstudien allgemein nur 1–5% ID/g im Gegensatz zu intakten Antikörpern, die sich in Tumoren mit 30–40% ID/g lokalisieren können und Mengenniveaus von immerhin 60–70% ID/g erreichten.
  • Ein kleines Proteingerüst, das als „Minibody" (Mini-Antikörper) bezeichnet wurde, wurde unter Verwendung eines Teils der Ig VH-Domäne als Matrize erstellt (Pessi et al., 1993). Minibodies mit hoher Affinität (Dissoziationskonstante (Kd)~10–7 M) gegenüber Interleukin-6 wurden durch gemäß Zufallsprinzip erstellte Schleifen, die CDR1 und CDR2 von VH entsprechen, gefolgt von der Selektion von Mutanten unter Verwendung des Phage-Display-Verfahrens (Martin et al., 1994) identifiziert. Diese Versuche zeigten, dass das Wesentliche der Antikörperfunktion auf ein kleineres System übertragen werden kann. Jedoch hatte der „Minibody" die begrenzte Löslichkeit der VH-Domäne geerbt (Bianchi et al., 1994).
  • Es ist berichtet worden, dass Kamelen (Camelus dromedarius) oft variable leichte Kettendomänen fehlen, wenn IgG-artiges Material aus ihrem Serum analysiert wird, was nahelegt, dass eine hinreichende Antikörper-Spezifität und Affinität alleine aus VH-Domänen (drei CDR-Schleifen) abgeleitet werden kann. Davies und Riechmann haben jüngst gezeigt, dass "kamelartig gemachte" VH-Domänen mit hoher Affinität (Kd~10–7 M) und hoher Spezifität erzeugt werden können, indem eine zufällige Ausgestaltung („Randomisierung") nur bei CDR3 vorgenommen wird. Um die Löslichkeit und die Suppression unspezifischer Bindung zu verbessern, wurden drei Mutationen in die Gerüstregion eingeführt (Davies & Riechmann, 1995). Es ist jedoch nicht definitiv gezeigt worden, dass die „kamelartige Umgestaltung" allgemein verwendet werden kann, um die Löslichkeit und Stabilität von VHs zu verbessern.
  • Eine Alternative zu dem Miniantikörper („Minibody") ist der „Diabody". Diabodies sind kleine zweiwertige und bispezifische Antikörperfragmente, d. h. sie besitzen zwei Antigen-Bindungsstellen. Die Fragmente umfassen eine variable Domäne der schweren Kette (VH), verbunden mit einer variablen Domäne der leichten Kette (VL) auf derselben Polypeptidkette (VH-VL). Diabodies sind in ihrer Größe ähnlich zu einem Fab-Fragment. Durch die Verwendung eines Linkers, der zu kurz ist, um eine Paarung zwischen den beiden Domänen auf derselben Kette zu erlauben, werden die Domänen dazu gezwungen, mit den komplementären Domänen einer anderen Kette zu paaren und zwei Antigenbindungsstellen auszubilden. Diese dimeren Antikörperfragmente oder „Diabodies" sind zweiwertig und bispezifisch (P. Holliger et al., PNAS 90: 6444–6448 (1993)).
  • Seit der Entwicklung der monoklonalen Antikörpertechnologie ist eine große Anzahl an 3D-Strukturen der Antikörperfragmente in komplexierten und/oder freien Zuständen durch Röntgenkristallographie aufgelöst worden (Webster et al., 1994; Wilson & Stanfield, 1994). Die Analyse der Antikörperstrukturen hat offen gelegt, dass fünf der sechs CDRs eine begrenzte Anzahl an Peptidrückgrat-Konformationen besitzen, was es einem somit erlaubt, die Rückgrat-Konformation der CDRs unter Verwendung der so genannten kanonischen Strukturen vorherzusagen (Lesk & Tramontano, 1992; Rees et al., 1994). Die Analyse hat außerdem offen gelegt, dass die CDR3 der VH-Domäne (VH-CDR3) für gewöhnlich die größte Kontaktoberfläche besitzt, und dass ihre Konformation zu variantenreich ist, um kanonische Strukturen zu definieren; für VH-CDR3 ist außerdem bekannt, dass es eine große Variation bei der Länge besitzt (Wu et al., 1993). Daher müssen die Strukturen wesentlicher Regionen der Antikörper-Antigen-Grenzfläche nach wie vor experimentell bestimmt werden.
  • Der Vergleich der Kristallstrukturen zwischen den freien und komplexierten Zuständen hat mehrere Typen konformativer Umordnungen aufgedeckt. Diese beinhalten Seitenkettenumordnungen, Segmentverschiebungen, große Umordnungen von VH-CDR3 und Veränderungen der relativen Position der VH- und VL-Domänen (Wilson & Stanfield, 1993). Im freien Zustand wird für CDRs, insbesondere solche, die bei der Bindung große konformative Veränderungen durchma chen, erwartet, dass sie flexibel sind. Da die Röntgenkristallographie nicht für die Charakterisierung flexibler Molekülteile geeignet ist, waren strukturelle Studien im Lösungszustand nicht möglich, um dynamische Bilder der Konformation von Antigenbindungsstellen bereitzustellen.
  • Nachahmen der Antikörper-Bindungsstelle
  • CDR-Peptide und organische CDR-Mimetika sind hergestellt worden (Dougall et al., 1994). CDR-Peptide sind kurze, typischerweise zyklische Peptide, die den Aminosäuresequenzen von CDR-Schleifen von Antikörpern entsprechen. CDR-Schleifen sind verantwortlich für Antikörper-Antigen-Interaktionen. Organische CDR-Mimetika sind Peptide, die CDR-Schleifen entsprechen, die an ein Gerüst angeheftet sind, z. B. an eine kleine organische Verbindung.
  • Für CDR-Peptide und organische CDR-Mimetika ist gezeigt worden, dass sie eine gewisse Bindungsaffinität beibehalten (Smyth & von Itzstein, 1994). Jedoch sind sie, wie erwartet, zu klein und zu flexibel, um die vollständige Affinität und Spezifität beizubehalten. Maus-CDRs sind ohne Verlust an Affinität auf die humane Ig-Gerüststruktur transplantiert worden (Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988), auch wenn diese „Humanisierung" die oben genannten Probleme, die für Lösungsstudien spezifisch sind, nicht löst.
  • Nachahmung natürlicher Selektionsprozesse für Antikörper
  • Im Immunsystem werden spezifische Antikörper selektiert und aus einer großen „Bibliothek" amplifiziert (Affinitätsreifung). Diese Prozesse können in vitro unter Verwendung kombinatorischer Bibliothekstechniken reproduziert werden. Die erfolgreiche Präsentation von Antikörperfragmenten auf der Oberfläche von Bakteriophagen hat es möglich gemacht, eine große Anzahl von CDR-Mutationen zu erzeugen und zu durchmustern (McCafferty et al., 1990; Barbas et al., 1991; Winter et al., 1994). Es wird eine steigende Anzahl von Fabs und Fvs (und ihrer Derivate) durch diese Technik erzeugt, was eine reiche Quelle für strukturelle Studien bereitstellt. Die kombinatorische Technik kann mit Antikörper-Nachahmern kombiniert werden.
  • Eine Anzahl von Proteindomänen, die potentiell als Proteingerüste dienen können, ist in Form von Fusionen mit Phagen-Capsid-Proteinen exprimiert worden (Übersichtsartikel in Clackson & Wells, Trends Biotechnol. 12: 173–184 (1994)). Tatsächlich sind mehrere dieser Proteindomänen bereits als Gerüste zur Präsentation zufälliger Peptidsequenzen verwendet worden, dies beinhaltend Trypsininhibitor aus Rinderpankreas (Roberts et al., PNAS 89: 2429–2433 (1992)), menschliches Wachstumshormon (Lowman et al., Biochemistry 30: 10832–10838 (1991), Venturini et al., Protein Peptide Letters 1: 70–75 (1994)) und die IgG-bindende Domäne von Streptococcus (O'Neil et al., Techniques in Protein Chemistry V (Crabb, L,. Herausgeber) S. 517–524, Aca demic Press, San Diego (1994)). Diese Gerüste haben eine einzelne nach dem Zufallsprinzip erstellte Schleife oder Region präsentiert.
  • Forscher haben den kleinen, 74 Aminosäuren großen α-Amylase-Inhibitor Tendamistat als ein Präsentationsgerüst auf dem filamentösen Phagen M13 verwendet (McConnell und Hoess, 1995). Tendamistat ist ein β-Faltblatt-Protein aus Streptomyces tendae. Es besitzt eine Reihe von Merkmalen, die es zu einem attraktiven Gerüst für Peptide machen, einschließlich seiner kleinen Größe, Stabilität und der Verfügbarkeit von hochauflösenden NMR- und Röntgenstrukturdaten. Die Gesamttopologie von Tendamistat ist ähnlich der einer Immunglobulindomäne, mit zwei β-Faltblättern, die durch eine Reihe von Schleifen verbunden sind. Im Gegensatz zu Immunglobulindomänen werden die β-Faltblätter von Tendamistat durch zwei statt eine Disulfidbindung zusammengehalten, was für die beträchtliche Stabilität des Proteins verantwortlich ist. In Analogie mit den CDR-Schleifen, die sich in Immunglobulinen finden, können die Schleifen von Tendamistat einer ähnlichen Funktion dienen und können leicht durch In vitro-Mutagenese einer Zufallsveränderung unterzogen werden.
  • Tendamistat ist jedoch aus Streptomyces tendae abgeleitet. Somit, obwohl Tendamistat antigen für Menschen sein kann, kann seine kleine Größe seine Antigenität reduzieren oder inhibieren. Außerdem ist die Stabilität von Tendamistat unsicher. Weiterhin wird die Stabilität, die für Tendamistat beschrieben wird, der Gegenwart von zwei Disulfidbindungen zugeschrieben. Disulfidbindungen sind jedoch ein signifikanter Nachteil für solche Moleküle, da sie unter reduzierenden Bedingungen gebrochen werden können und korrekt ausgebildet werden müssen, um eine nützliche Proteinstruktur zu ergeben. Weiterhin müssen sich korrekte Größen ergeben können, um eine nützliche Proteinstruktur auszubilden. Weiterhin ist die Größe der Schleifen in Tendamistat relativ klein, was somit die Größe der Inserts begrenzt, die in dem Gerüst untergebracht werden können. Darüber hinaus ist wohlbekannt, dass die Ausbildung korrekter Disulfidbindungen in neu synthetisierten Peptiden kein direkt ablaufender Weg ist. Wenn ein Protein im zytoplasmatischen Raum von E. coli, dem gebräuchlichsten Wirtsbakterium für die Protein-Überexpression, exprimiert wird, so werden Disulfidbindungen für gewöhnlich nicht ausgebildet, was es potentiell schwer macht, große Mengen an künstlich erstellten Molekülen herzustellen.
  • Es besteht somit ein anhaltender Bedarf für kleine, einzelkettige künstliche Antikörper für eine Vielzahl therapeutischer, diagnostischer und katalytischer Anwendungen.
  • Ely K et al, (1995) Protein Engineering 8(8): 823–827 offenbart ein gebräuchliches molekulares Gerüst für zwei nicht verwandte RGD-Moleküle. Eines der Proteine, die das RGD-Signal enthalten, ist das Zell-bindende Typ III-Molekül von Fibronektin (FNIII10).
  • Le G et al, (1993) Protein Engineering 6(7): 745–754 beschreibt das Installieren von RGD-Sequenzen in "Präsentationsgerüste", d. h. die Immunglobulin VL-Domäne REI und humanes Interleukin-1β.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung stellt einen Fibronektin-Typ-III-(Fn3-)Polypeptid-Monobody bereit, umfassend eine Vielzahl an Fn3-β-Strang-Domänensequenzen, die mit einer Vielzahl von Schleifenbereichsequenzen verbunden sind, wobei sich eine oder mehrere der Schleifenbereichsequenzen des Monobody durch Deletion, Insertion oder Austausch von wenigstens zwei Aminosäuren von den entsprechenden Schleifenbereichsequenzen im Wildtyp-Fn3 unterscheidet und in der Lage ist, an einen spezifischen Bindungspartner (SBP) unter Ausbildung eines Peptid:SBP-Komplexes oder an eine Übergangszustandanalogon-Verbindung (TSAC) zu binden.
  • Bevorzugt umfassen einer oder mehrere der Schleifenbereiche des Monobody die folgenden Aminosäurereste:
    • i) von 15 bis 16 in einer AB-Schleife eingeschlossen,
    • ii) von 22 bis 30 in einer BC-Schleife eingeschlossen,
    • iii) von 39 bis 45 in einer CD-Schleife eingeschlossen,
    • iv) von 51 bis 55 in einer DE-Schleife eingeschlossen,
    • v) von 60 bis 66 in einer EF-Schleife eingeschlossen, und
    • vi) von 76 bis 87 in einer FG-Schleife eingeschlossen.
  • Die Erfindung stellt außerdem ein Nukleinsäuremolekül bereit, das einen Fn3-Polypeptid-Monobody der Erfindung codiert, ebenso wie einen Expressionsvektor, der dieses Nukleinsäuremolekül umfasst, und eine Wirtszelle, die diesen Vektor umfasst.
  • Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren bereit, um einen Fn3-Polypeptid-Monobody herzustellen. Das Verfahren umfasst das Bereitstellen einer DNA-Sequenz, codierend für (eine) Bereichssequenz(en), wobei wenigstens ein Schleifenbereich dieser Sequenz eine singuläre Restriktionsenzymstelle enthält. Die DNA-Sequenz wird an der singulären Restriktionsstelle geschnitten. Dann wird ein vorab ausgewähltes DNA-Segment in die Restriktionsstelle eingesetzt. Das vorab ausgewählte DNA-Segment codiert ein Peptid, das befähigt ist, an einen spezifischen Bindungspartner (SBP) oder eine Übergangszustandanalogon-Verbindung (TSAC) zu binden. Das Einsetzen des vorab ausgewählten DNA-Segments in die DNA-Sequenz erbringt ein DNA-Molekül, das einen Polypeptid-Monobody mit einer Insertion codiert. Das DNA-Molekül wird dann exprimiert, um den Polypeptid-Monobody hervorzubringen.
  • Außerdem wird ein Verfahren zur Herstellung eines Fn3-Polypeptid-Monobody bereitgestellt, bei dem man: eine replizierbare DNA-Sequenz bereitstellt, die eine Vielzahl der Fn3-β-Strang-Domänensequenzen, die mit einer Vielzahl der Schleifenbereichsequenzen verbunden sind, codiert, wobei die Nukleotidsequenz von wenigstens einem Schleifenbereich bekannt ist. Es werden Primer für die Polymerasekettenreaktion (PCR) bereitgestellt oder herstellt, die zu der bekannten Schleifensequenz hinreichend komplementär sind, um unter PCR-Bedingungen hybridisierbar zu sein, wobei wenigstens einer der Primer eine modifizierte Nukleinsäuresequenz enthält, die in die DNA-Sequenz eingefügt werden soll. Es wird eine PCR unter Verwendung der replizierbaren DNA-Sequenz und der Primer durchführt. Das Reaktionsprodukt der PCR wird dann exprimiert, um einen Polypeptid-Monobody hervorzubringen.
  • Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Fn3-Polypeptid-Monobody bereit. Das Verfahren umfasst, dass man eine replizierbare DNA-Sequenz bereitstellt, die eine Vielzahl von Fn3-β-Strang-Domänensequenzen, die mit einer Vielzahl von Schleifenbereichsequenzen verbunden sind, codiert, wobei die Nukleotidsequenz von wenigstens einem Schleifenbereich bekannt ist. Es wird eine ortspezifische Mutagenese von wenigstens einem Schleifenbereich durchführt, um so eine Insertionsmutation zu erzeugen. Die resultierende DNA, die die Insertionsmutation umfasst, wird dann exprimiert.
  • Ferner wird eine variabel gestaltete Nukleinsäurebibliothek bereitgestellt, die Fn3-Polypeptid-Monobodies codiert, und die eine Vielzahl von Nukleinsäure-Spezies umfasst, die eine Vielzahl von Fn3-β-Strang-Domänensequenzen, die mit einer Vielzahl von Schleifenbereichsequenzen verbunden sind, codieren, wobei eine oder mehrere der Schleifenbereichsequenzen des Monobody durch Deletion, Insertion oder Austausch von wenigstens zwei Aminosäuren gegenüber den entsprechenden Schleifenbereichsequenzen in wildtypischem Fn3 variieren, und wobei die β-Strang-Domänen des Monobody wenigstens 50% Aminosäuresequenz-Gesamthomologie gegenüber der entsprechenden Aminosäuresequenz der β-Strang-Domänensequenzen des wildtypischen Fn3 besitzen. Die Erfindung stellt außerdem eine Peptid-Display-Bibliothek bereit, die von der variabel gestalteten Nukleinsäurebibliothek der Erfindung abgeleitet ist. Bevorzugt wird das Peptid der Peptid-Display-Bibliothek auf der Oberfläche eines Bakteriophagen präsentiert, z. B. eines M13-Bakteriophagen oder eines fd-Bakteriophagen oder eines Virus.
  • Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zum Identifizieren der Aminosäuresequenz eines Polypeptidmoleküls bereit, welches in der Lage ist, an einen spezifischen Bindungspartner (SBP) unter Ausbildung eines Polypeptid:SBP-Komplexes zu binden, wobei die Dissoziati onskonstante des Polypeptid:SBP-Komplexes weniger als 10–6 Mol/Liter ist. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte, bei denen man:
    • (a) eine Peptid-Display-Bibliothek der Erfindung bereitstellt,
    • (b) die Peptid-Display-Bibliothek von (a) mit einem immobilisierten oder abtrennbaren SBP in Kontakt bringt,
    • (c) die Peptid:SBP-Komplexe von den freien Peptiden abtrennt,
    • (d) die Replikation der abgetrennten Peptide von (c) veranlasst, um so zu einer neuen Peptid-Display-Bibliothek zu führen, die sich von der in (a) unterscheidet, indem sie eine niedrigere Diversität aufweist und angereichert ist mit präsentierten Peptiden, die in der Lage sind, das SBP zu binden,
    • (e) optional die Stufen (b), (c) und (d) mit der neuen Bibliothek von (d) wiederholt und
    • (f) die Nukleinsäuresequenz des Bereichs, der das präsentierte Peptid einer Spezies von (d) codiert, bestimmt und folglich die Peptidsequenz, die in der Lage ist, an den SBP zu binden, ableitet.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Herstellung einer variabel gestalteten Nukleinsäurebibliothek bereit, die Fn3-Polypeptid-Monobodies codiert, und die eine Vielzahl von Nukleinsäure-Spezies aufweist, die jeweils eine Vielzahl von Schleifenregionen umfassen, wobei die Spezies eine Vielzahl von Fn3-β-Strang-Domänensequenzen, die mit einer Vielzahl von Schleifenbereichsequenzen verbunden sind, codieren, wobei eine oder mehrere der Schleifenbereichsequenzen durch Deletion, Insertion oder Austausch von wenigstens zwei Aminosäuren gegenüber den entsprechenden Schleifenbereichsequenzen in wildtypischem Fn3 variieren, und wobei die β-Strang-Domänensequenzen des Monobody wenigstens 50% Aminosäuresequenz-Gesamthomologie gegenüber den entsprechenden Aminosäuresequenzen der β-Strang-Domänensequenzen des wildtypischen Fn3 besitzen, wobei das Verfahren die Stufen umfasst, bei denen man:
    • (a) einen Fn3-Polypeptid-Monobody mit einer vorbestimmten Sequenz herstellt,
    • (b) das Polypeptid mit einem spezifischen Bindungspartner (SBP) in Kontakt bringt, um so einen Polypeptid:SBP-Komplex auszubilden, wobei die Dissoziationskonstante des Polypeptid:SBP-Komplexes weniger als 106 Mol/Liter ist,
    • (c) die Bindungsstruktur des Polypeptid:SBP-Komplexes durch Kernspinresonanzspektroskopie oder Röntgenkristallographie bestimmt, und
    • (d) die variabel gestaltete Nukleinsäure-Bibliothek herstellt, wobei die Abwandlung an Positionen der Nukleinsäuresequenz durchgeführt wird, welche nach der in (c) bereitgestellten Information zu einem oder mehreren Polypeptiden mit verbesserter Bindung an das SBP führen.
  • Es wird außerdem ein Verfahren zum Identifizieren der Aminosäuresequenz eines Polypeptid-Moleküls, das in der Lage ist eine chemische Reaktion mit einer katalytischen Konstante (kcat) und einer nicht katalytischen Konstante (kuncat) so zu katalysieren, dass das Verhältnis von kcat/kuncat größer als 10 ist, bereitgestellt. Das Verfahren umfasst die Stufen, bei denen man:
    • (a) eine Peptid-Display-Bibliothek der Erfindung bereitstellt,
    • (b) die Peptid-Display-Bibliothek von (a) mit einer immobilisierten oder abtrennbaren Übergangszustandanalogon-Verbindung (TSAC), die den ungefähren molekularen Übergangszustand der chemischen Reaktion repräsentiert, in Kontakt bringt,
    • (c) die Peptid:TSAC-Komplexe von den freien Peptiden abtrennt,
    • (d) die Replikation der abgetrennten Peptide von (c) verursacht, um so zu einer neuen Peptid-Display-Bibliothek zu führen, die sich von der in (a) unterscheidet, indem sie eine geringere Diversität aufweist und indem sie angereichert ist mit präsentierten Peptiden, die in der Lage sind, an TSAC zu binden,
    • (e) optional die Stufen (b), (c) und (d) mit der neuen Bibliothek von (d) wiederholt und
    • (f) die Nukleinsäuresequenz des Bereichs, der das präsentierte Peptid einer Spezies aus (d) codiert, bestimmt und daraus die Peptidsequenz ableitet.
  • Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Herstellung einer variabel gestalteten Nukleinsäurebibliothek bereit, die Fn3-Polypeptid-Monobodies codiert, und die eine Vielzahl von Nukleinsäure-Spezies aufweist, die jeweils eine Vielzahl von Schleifenregionen umfassen, wobei die Spezies eine Vielzahl von Fn3-β-Strang-Domänensequenzen, die mit einer Vielzahl von Schleifenbereichsequenzen verbunden sind, codieren, wobei eine oder mehrere der Schleifenbereichsequenzen durch Deletion, Insertion oder Austausch von wenigstens zwei Aminosäuren gegenüber den entsprechenden Schleifenbereichsequenzen in wildtypischem Fn3 variieren, und wobei die β-Strang-Domänensequenzen des Monobody wenigstens 50% Aminosäuresequenz-Gesamthomologie gegenüber den entsprechenden Aminosäuresequenzen der β-Strang-Domänensequenzen des wildtypischen Fn3 besitzen, wobei das Verfahren die Stufen umfasst, bei denen man:
    • (a) einen Fn3-Polypeptid-Monobody mit einer vorbestimmten Sequenz herstellt, wobei das Polypeptid in der Lage ist, eine chemische Reaktion mit einer katalytischen Konstante (kcat) und einer nicht katalytischen Konstante (k) so zu katalysieren, dass das Verhältnis von kcat/kuncat größer als 10 ist,
    • (b) das Polypeptid mit einer immobilisierten oder abtrennbaren Übergangszustandanalogon-Verbindung (TSAC), die den ungefähren molekularen Übergangszustand der chemischen Reaktion repräsentiert, in Kontakt bringt,
    • (c) die Bindungsstruktur des Polypeptid:TSAC-Komplexes durch Kernspinresonanzspektroskopie oder Röntgenkristallographie bestimmt und
    • (d) die variabel gestaltete Nukleinsäure-Bibliothek herstellt, wobei die Abwandlung an Positionen in der Nukleinsäuresequenz durchgeführt wird, welche nach den in (c) bereitgestellten Informationen zu einem oder mehreren Polypeptiden mit einer verbesserten Bindung an TSAC oder zu einer Stabilisation von TSAC führen.
  • Die Erfindung stellt außerdem ein Kit für die Durchführung beliebiger Verfahren der Erfindung bereit. Die Erfindung stellt weiterhin eine Zusammensetzung, z. B. ein Polypeptid, hergestellt unter Verwendung des Kits oder identifiziert durch ein beliebiges Verfahren der Erfindung, bereit.
  • Die folgenden Abkürzungen sind beim Beschreiben der Aminosäuren, Peptide oder Proteine verwendet worden: Ala oder A, Alanin; Arg oder R, Arginin; Asn oder N, Asparagin; Asp oder D, Asparaginsäure; Cys oder C, Cystein; Gln oder Q, Glutamin; Glu oder E, Glutaminsäure; Gly oder G, Glycin; His oder H, Histidin; Ile oder I, Isoleucin; Leu oder L, Leucin; Lys oder K, Lysin; Met oder M, Methionin; Phe oder F, Phenylalanin; Pro oder P, Prolin; Ser oder S, Serin; Thr oder T, Threonin; Trp oder W, Tryptophan; Tyr oder Y, Tyrosin; Val oder V, Valin.
  • Die folgenden Abkürzungen sind beim Beschreiben von Nukleinsäuren, DNA oder RNA, verwendet worden: A, Adenosin; T, Thymidin; G, Guanosin; C, Cytosin.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1: β-Strang- und Schleifentopologie (A, B) und MOLSCRIPT-Darstellung (C, D; Kraulis, 1991) der VH-Domäne von Anti-Lysozym-Immunglobulin D1.3 (A, C; Bhat et al., 1994) und der 10. Typ-III-Domäne von humanem Fibronektin (B, D; Main et al., 1992). Die Position komplementaritätsbestimmender Regionen (CDRs, hypervariable Regionen) und die Integrin-Bindungs-Arg-Gly-Asp(RGD)-Sequenz sind angezeigt.
  • 2: Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 110) und Restriktionsstellen des synthetischen Fn3-Gens. Die Restenummerierung steht in Übereinstimmung mit Main et al. (1992). Die erstellten Restriktionsenzymstellen sind oberhalb der Aminosäuresequenz angezeigt. β-Stränge sind durch Unterstreichung angezeigt. Die N-terminale „mq"-Sequenz ist für eine nachfolgende Klonierung in einen Expressionsvektor angefügt worden. Das His-Tag(Novagen)-Fusionsprotein besitzt eine zusätzliche Sequenz, MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH, (SEQ ID NO: 114), die der oben gezeigten Fn3-Sequenz vorangeht.
  • 3: A, Kurzwellige UV-CD-Spektren von wildtypischem Fn3 bei 25°C und 90°C. Fn3 (50 μM) wurde in Natriumacetat (50 mM, pH 4,6) gelöst. B, thermische Denaturierung von Fn3, überwacht bei 215 nm. Die Temperatur wurde mit einer Rate von 1°C/min erhöht.
  • 4: A, Cα-Spur der Kristallstruktur des Komplexes aus Lysozym (HEL) und dem Fv-Fragment des Anti-Hühnereiweiß-Lysozym(anti-HEL)-Antikörpers D1.3 (Bhat et al., 1994). Die Seitenketten der Reste 99–102 von VH CDR3, die den Kontakt mit HEL herstellen, sind ebenfalls gezeigt. B, Kontaktoberfläche für jeden Rest der D1.3 VH-HEL und VH-VL-Interaktionen, aufgetragen gegenüber der Restenummer von D1.3 VH. Die Oberfläche und die Sekundärstruktur wurden unter Verwendung des Programms DSSP (Kabsh und Sander, 1983) bestimmt. C und D, schematische Darstellungen der β-Faltblattstruktur der F-Strang-Schleife-G-Strang-Gruppierungen von D1.3 VH (C) und Fn3 (D). Die Kästchen bezeichnen Reste in den β-Strängen, und die Ovale solche, die sich nicht in den Strängen befinden. Die schattierten Kästchen zeigen Reste, deren Seitenketten in signifikantem Maße verborgen liegen. Die unterbrochenen Linien zeigen Wasserstoffbindungen an.
  • 5: Erstelltes Fn3-Gen unter Anzeige von DNA- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NO: 111 bzw. SEQ ID NO: 112). Die Aminosäurenummerierung ist gemäß Main et al. (1992) erfolgt. Die zwei einer Zufallsänderung bzw. zufälligen Ausgestaltung unterzogenen („randomisierten”) Schleifen in den kombinatorischen Bibliotheken sind in Kästchen eingeschlossen.
  • 6: Karte von Plasmid pAS45. Das Plasmid pAS45 ist der Expressionsvektor von His-Tag-Fn3.
  • 7: Karte von Plasmid pAS25. Das Plasmid pAS25 ist der Expressionsvektor von Fn3.
  • 8: Karte von Plasmid pAS38. pAS38 ist ein Phagemid-Vektor für die Oberflächenpräsentation von Fn3.
  • 9. (Ubiquitin-1) Charakterisierung der ligandenspezifischen Bindung angereicherter Klone unter Verwendung von Phagenenzym-gebundenem Immunolösungs-Assay (ELISA). Die Wells der Mikrotiterplatte wurden mit Ubiquitin (1 μg/Well; "Ligand (+)") beschichtet und dann mit BSA geblockt. Die Phagenlösung in TBS mit etwa 1010 Kolonie-bildenden Einheiten (cfu) wurde zu einem Well hinzugegeben, und es wurde mit TBS gewaschen. Gebundene Phagen wurden mit Anti-Phagen-Antikörper-POD-Konjugat (Pharmacia) mit Turbo-TMB (Pierce) als Substrat detektiert. Die Messung der Extinktion erfolgte unter Verwendung eines Molecular Devices SPEC-TRAmax 250 Mikroplatten-Spektrophotometers. Als Kontrolle wurden Wells ohne den immobilisierten Liganden verwendet. 2-1 und 2-2 bezeichnen angereicherte Klone aus Bibliothek 2, eluiert mit freiem Liganden bzw. Säure. 4-1 und 4-2 bezeichnen angereicherte Klone aus Bibliothek 4, eluiert mit freiem Liganden bzw. Säure.
  • 10: (Ubiqitin-2) Kompetitiver Phagen-ELISA angereicherter Klone. Phagenlösungen mit etwa 1010 cfu wurden zunächst vor der Bindung an ein ligandenbeschichtetes Well bei 4°C für 1 Stunde mit freiem Ubiquitin inkubiert. Die Wells wurden gewaschen, und die Phagen wurden detektiert wie oben beschrieben.
  • 11: Kompetitiver Phagen-ELISA des Ubiquitin-bindenden Monobody 411. Die Versuchsbedingungen sind die gleichen wie oben für Ubiquitin beschrieben. Der ELISA wurde in Gegenwart von freiem Ubiquitin in der Bindelösung durchgeführt. Die Versuche wurden mit vier verschiedenen Präparationen des gleichen Klons durchgeführt.
  • 12: (Fluorescein-1) Phagen-ELISA für vier Klone, pL625.1, (enthaltend SEQ ID NO: 115) pLB25.4, (enthaltend SEQ ID NO: 116), pL624.1 (enthaltend SEQ ID NO: 117) und pLB24.3 (enthaltend SEQ ID NO: 118). Die Versuchsbedingungen sind die gleichen wie bei Ubiquitin-1 oben.
  • 13: (Fluorescein-2) Kompetitiver ELISA für vier Klone. Die Versuchsbedingungen sind die gleichen wie bei Ubiquitin-2 oben.
  • 14: 1H,15N-HSQC-Spektrum eines Fluoreszenz-Eindungs-Monobody, L625.5. Es wurden etwa 20 μM Protein in 10 mM Natriumacetatpuffer (pH 5,0), enthaltend 100 mM Natriumchlorid, gelöst. Das Spektrum wurde bei 30°C auf einem Varian Unity INOVA 600 NMR-Spektrometer aufgenommen.
  • 15: Charakterisierung der Bindungsreaktion von Ubi4-Fn3 an das Ziel, Ubiquitin.
    • (a) Phagen-ELISA-Analyse der Bindung von Ubi4-Fn3 an Ubiquitin. Es wurde die Bindung von Ubi4-Phagen an mit Ubiquitin beschichtete Wells gemessen. Der Kontrollversuch wurde mit Wells durchgeführt, die kein Ubiquitin enthielten.
    • (b) Kompetitiver Phagen-ELISA von Ubi4-Fn3. Ubi4-Fn3-Phagen wurden vorab mit löslichem Ubiquitin in den angezeigten Konzentrationen inkubiert, gefolgt von der Phagen-ELISA-Detektion in mit Ubiquitin beschichteten Wells.
    • (c) Kompetitiver Phagen-ELISA-Test der Spezifität des Ubi4-Klons. Die Ubi4-Phagen wurden vorab mit 250 μg/ml an löslichen Proteinen präinkubiert, gefolgt von Phagen-ELISA wie in (b).
    • (d) ELISA unter Verwendung freier Proteine.
  • 16: Gleichgewichts-Entfaltungskurven für Ubi4-Fn3 (ausgefüllte Symbole) und wildtypisches Fn3 (offene Symbole). Die Quadrate bezeichnen die Daten, die in TBS (Tris HCl-Puffer (50 mM, pH 7,5), enthaltend NaCl (150 mM)), gemessen wurden. Die Kreise bezeichnen Daten, die in Gly-HCl-Puffer (20 mM, pH 3,3), enthaltend NaCl (300 mM)), gemessen wurden. Die Kurven zeigen den „Best Fit" der Übergangskurve, basierend auf dem Zwei-Zustände-Modell. Parameter, die die Übergänge charakterisieren, sind in Tabelle 7 aufgelistet.
  • 17: (a) 1H,15-N-HSQC-Spektrum von [15N]-Ubi4-K Fn3. (b). Differenz (δWildtyp – δUbi4) der chemischen Verschiebungen von 1H(b) und 15N(c), aufgetragen gegenüber der Restzahl. Werte für die Reste 82–84 (gezeigt als ausgefüllte Kreise), wobei die Ubi4-K-Deletionen auf null gesetzt sind. Offene Kreise zeigen Reste an, die in dem Ubi4-K-Protein mutiert sind. Die Positionen der β-Stränge sind mit Pfeilen angezeigt.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Während des letzten Jahrzehnts ist das Immunsystem als eine reiche Quelle von de novo-Katalysatoren genutzt worden. Für katalytische Antikörper ist gezeigt worden, dass sie Chemoselektivität, Enantioselektivität, große Beschleunigungen der Geschwindigkeitsrate und sogar eine Befähigung zur Umleitung chemischer Reaktionen besitzen. In den meisten Fällen sind diese Antikörper gegen Übergangszustandanalogon(TSA)-Haptene erzeugt worden. Diese TSA-Haptene sind stabile niedermolekulare Verbindungen, die erstellt wurden, um die Strukturen der energetisch instabilen Übergangszustandsspezies, die kurzzeitig (ungefähre Halbwertszeit 1013 s) entlang Reaktionswegen zwischen Recktanten und Produkten erscheinen, nachzuahmen. Man nimmt an, dass Anti-TSA-Antikörper ebenso wie natürliche Enzyme selektiv an den Übergangszustand binden und diesen stabilisieren, wodurch sie den Übergang von Recktanten zu Produkten erleichtern. Daher verringert der Antikörper bei der Bindung die Energie des tatsächlichen Übergangszustands und steigert die Reaktionsgeschwindigkeit. Diese Katalysatoren können programmiert werden, um an geometrische und elektrostatische Merkmale des Übergangszustands zu binden, sodass die Reaktionsroute durch die Neutralisierung unvorteilhafter Ladungen, die Überwindung entropischer Barrieren und die Vorgabe stereoelektronischer Merkmale der Reaktion kontrolliert werden kann. Durch dieses Mittel sind sogar Reaktionen, die ansonsten hochgradig benachteiligt sind, katalysiert worden (Janda et al. 1997). Weiterhin sind in vielen Fällen Katalysatoren für Reaktionen hergestellt worden, für die es keine bekannten natürlichen oder durch den Menschen hergestellten Enzyme gibt.
  • Der Erfolg eines jeden kombinatorischen chemischen Systems beim Erlangen einer bestimmten Funktion hängt von der Größe der Bibliothek und der Möglichkeit, auf deren Mitglieder zuzugreifen, ab. Am häufigsten werden die Antikörper, die in einem Tier gegen ein Hapten erzeugt werden, das den Übergangszustand einer Reaktion nachahmt, zunächst auf die Bindung an das Hapten durchmustert und dann wiederum auf katalytische Aktivität hin durchmustert. Ein verbessertes Verfahren erlaubt die direkte Selektion auf Katalyse über Antikörperbibliotheken in Phagen, wodurch Chemie und Replikation miteinander verbunden werden.
  • Eine Bibliothek von Antikörperfragmenten kann auf der Oberfläche von filamentösen Phagenviren erzeugt werden, indem man nach dem Zufallsprinzip erstellte Antikörpergene dem Gen hinzufügt, das das Hüllprotein des Phagen codiert. Jeder Phage exprimiert und präsentiert dann multiple Kopien eines einzelnen Antikörperfragments auf seiner Oberfläche. Da jeder Phage sowohl das auf der Oberfläche präsentierte Antikörperfragment als auch die DNA, die das Fragment codiert, besitzt, kann das Antikörperfragment, das an ein Ziel bindet, identifiziert werden, indem man die zugehörige DNA amplifiziert.
  • Immunchemiker verwenden als Antigene Materialien, die sowenig chemische Reaktivität wie möglich besitzen. Es ist fast immer der Fall, dass man sich wünscht, dass der schließliche Antikörper mit nativen Strukturen interagiert. Bei der reaktiven Immunisierung ist das Konzept genau umgekehrt. Man immunisiert mit Verbindungen, die hochreaktiv sind, sodass bei der Bindung an das Antikörpermolekül während des Induktionsprozesses eine chemische Reaktion erfolgt. Später wird diese gleiche chemische Reaktion Teil des Mechanismus des katalytischen Ereignisses sein. In gewissem Sinne immunisiert man mit einer chemischen Reaktion anstatt mit einer Substanz als solcher. Reaktive Immunogene können als analog zu den Mechanismus-basierten Inhibitoren betrachtet werden, die Enzymologen verwenden, mit dem Unterschied, dass sie in umgekehrter Weise verwendet werden, da sie einen Mechanismus induzieren, statt einen Mechanismus zu inhibieren.
  • Vom Menschen hergestellte katalytische Antikörper besitzen ein beträchtliches kommerzielles Potential bei vielen verschiedenen Anwendungen. Auf katalytischen Antikörpern basierende Produkte sind erfolgreich bei Prototyp-Versuchen in therapeutischen Anwendungen verwendet worden, wie etwa bei der Prowirkstoff-Aktivierung und Kokain-Inaktivierung, sowie bei nichttherapeutischen Anwendungen, wie etwa für Biosensoren und die organische Synthese.
  • Katalytische Antikörper sind theoretisch als therapeutische Mittel attraktiver als nichtkatalytische Antikörper, da sie, weil katalytisch, in niedrigeren Dosierungen verwendet werden können, und außerdem, weil ihre Wirkungen ungewöhnlicher Weise irreversibel sind (beispielsweise Spaltung einer Peptidbindung anstelle des Bindens). Bei der Therapie können gereinigte katalytische Antikörper einem Patienten direkt verabreicht werden, oder alternativ kann die patienteneigene katalytische Antikörperantwort durch die Immunisierung mit einem geeigneten Hapten ausgelöst werden. Katalytische Antikörper können auch als klinisch-diagnostische Werkzeuge oder als regioselektive oder stereoselektive Katalysatoren bei der Synthese von Feinchemikalien verwendet werden.
  • I. Mutation von Fn3-Schleifen und Transplantation von Ab-Schleifen auf Fn3
  • Ein ideales Gerüst für die CDR-Transplantation ist hochgradig löslich und stabil. Es ist klein genug für die Strukturanalyse, jedoch groß genug, um multiple CDRs zu beherbergen, um so eine feste Bindung und/oder hohe Spezifität zu erreichen.
  • Es wurde eine neue Strategie zur Erzeugung eines künstlichen Ab-Systems auf dem Gerüst eines bestehenden Nicht-Ab-Proteins entwickelt. Ein Vorteil dieses Ansatzes gegenüber der Minimierung eines Ab-Gerüsts besteht darin, dass man die Weitergabe der unerwünschten Eigenschaften der Abs (Antikörper) vermeiden kann.
  • Die Fibronektin Typ III-Domäne (Fn3) wurde als Gerüst verwendet. Fibronektin ist ein großes Protein, das wesentliche Rollen bei der Bildung von extrazellulärer Matrix und Zell-ZellInteraktionen spielt; es besteht aus zahlreichen Wiederholungseinheiten dreier Typen (I, II und III) kleiner Domänen (Baron et al., 1991). Fn3 selbst ist das Musterbeispiel einer großen Unterfamilie (Fn3-Familie oder s-Typ-Ig-Familie) der Immunglobulin-Superfamilie (IgSF). Die Fn3-Familie beinhaltet Zelladhäsionsmoleküle, Zelloberflächenhormon und Zytokin-Rezeptoren, Chaperonine und Kohlenhydrat-Bindungsdomänen (für Übersichtsartikel siehe: Bork & Doolittle, 1992; Jones, 1993; Bork et al., 1994; Campbell & Spitzfaden, 1994; Harpez & Chothia, 1994).
  • Jüngst haben kristallographische Studien offenbart, dass die Struktur der DNA-Bindedomänen des Transkriptionsfaktors NF-κB ebenfalls nahe verwandt mit der Fn3-Faltung ist (Ghosh et al., 1995; Müller et al., 1995). Diese Proteine sind alle an der spezifischen molekularen Erkennung beteiligt, und in den meisten Fällen werden Ligandenbindungsstellen durch Oberflächen-Schleifen ausgebildet, was nahelegt, dass das Fn3-Gerüst eine exzellente Rahmenstruktur für den Aufbau spezifischer Bindeproteine darstellt. Die 3D-Struktur von Fn3 ist durch NMR (Main et al., 1992) und Röntgenkristallographie (Leahy et al., 1992; Dickinson et al., 1994) bestimmt worden. Die Struktur wird am besten als ein β-Sandwich beschrieben, das ähnlich demjenigen der Ab-VH-Domäne ist, mit dem Unterschied, dass Fn3 sieben β-Stränge statt neun besitzt (1). Es gibt drei Schleifen an jedem Ende von Fn3; die Positionen der Schleifen BC, DE und FG entsprechen ungefähr denjenigen von CDR 1, 2 bzw. 3 der VH-Domäne (1C, D).
  • Fn3 ist klein (~95 Reste), monomer, löslich und stabil. Es ist eines von wenigen Mitgliedern von IgSF, das keine Disulfidbindungen besitzt; VH besitzt eine zwischen den Strängen liegende Disulfidbindung (1A) und besitzt marginale Stabilität unter reduzierenden Bedingungen. Fn3 ist in E. coli exprimiert worden (Aukhil et al., 1993). Zusätzlich sind 17 Fn3-Domänen allein in humanem Fibronektin vorhanden, was wichtige Informationen über konservierte Reste liefert, die oft wichtig für die Stabilität und Faltung sind (für das Sequenz-Alignment, siehe Main et al., 1992 und Dickinson et al., 1994). Anhand der Sequenzanalyse sind große Variationen in den Schleifen BC und FG zu erkennen, was nahelegt, dass die Schleifen nicht entscheidend für die Stabilität sind. NMR-Studien haben gezeigt, dass die FG-Schleife hochgradig flexibel ist; die Flexibilität ist im Hinblick auf die spezifische Bindung des 10. Fn3 an α5β1-Integrin durch das Motiv Arg-Gly-Asp (RGD) (SEQ ID NO: 113) impliziert worden. In der Kristallstruktur des humanen Wachstumshormon-Rezeptorkomplexes (de Vos et al., 1992) interagiert die zweite Fn3-Domäne des Rezeptors über die Schleifen FG und BC mit Hormon, was nahelegt, dass es möglich ist, eine Bindungsstelle unter Verwendung der beiden Schleifen herzustellen.
  • Das zehnte Typ III-Modul von Fibronektin besitzt eine Faltung, die ähnlich derjenigen von Immunglobulindomänen ist, mit sieben β-Strängen, die zwei antiparallele β-Faltblätter ausbilden, die gegeneinander gepackt sind (Main et al., 1992). Die Struktur des Typ II-Moduls besteht aus sieben β-Strängen, die ein Sandwich aus zwei antiparallelen β-Faltblättern bilden, eines, das drei Stränge (ABE) enthält, und das andere mit vier Strängen (C'CFG) (Williams et al., 1988). Das dreisträngige β-Faltblatt besteht aus den Resten Glu-9-Thr-14 (A), Ser-17-Asp-23 (B), und Thr-56-Ser-60 (E). Die Mehrheit der konservierten Reste trägt zu dem hydrophoben Kern bei, wobei die unveränderlichen hydrophoben Reste Trp-22 und Try-68 in Richtung des N-terminalen bzw. C-terminalen Endes des Kerns angeordnet liegen. Die β-Stränge sind viel weniger flexibel und scheinen ein starres Gerüst bereitzustellen, auf dem funktionelle flexible Schleifen aufgebaut werden. Die Topologie ist ähnlich derjenigen von Immunglobulin-C-Domänen.
  • Genkonstruktion und Mutagenese
  • Es wurde ein synthetisches Gen für das zehnte Fn3 von humanem Fibronektin (2) erstellt, welches passende Restriktionsstellen zur Erleichterung der Mutagenese einbezieht und spezifische Codons für eine Proteinexpression auf hohem Niveau (Gribskov et al., 1984) verwendet.
  • Das Gen wurde wie folgt zusammengebaut: (1) die Gensequenz wurde in fünf Teile geteilt, mit Grenzen an erstellten Restriktionsstellen (2); (2) für jedes Teil wurde ein Paar von Oligonukleotiden, die entgegengesetzte Stränge codieren und komplementäre Überlappungen von 15 Basen besitzen, synthetisiert; (3) die beiden Oligonukleotide wurden aneinander hybridisiert, und einzelsträngige Regionen wurden unter Verwendung des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase aufgefüllt; (4) das doppelsträngige Oligonukleotid wurde unter Verwendung von Restriktionsenzymstellen an den Enden des Fragments in den pET3a-Vektor (Novagen) kloniert, und seine Sequenz wurde mittels eines Applied Biosystems DNA-Sequenzierers unter Verwen dung des vom Hersteller bereitgestellten Didesoxy-Terminationsprotokolls bestätigt; (5) die Schritte 2–4 wurden wiederholt, um das vollständige Gen zu erhalten (Plasmid pAS25) (7).
  • Obwohl das vorliegende Verfahren mehr Zeit beansprucht, um ein Gen zusammenzubauen als das Einschritt-Verfahren mit Polymerasekettenreaktion (PCR) (Sandhu et al., 1992), fanden keine Mutationen in dem Gen statt. Durch die eine geringe Wiedergabetreue besitzende Replikation mittels Taq-Polymerase wären wahrscheinlich Mutationen eingeführt worden und hätten ein zeitaufwändiges Gen-Editieren erfordert. Das Gen wurde außerdem in den pET15b(Novagen)-Vektor (pEW1) kloniert. Beide Vektoren exprimierten das Fn3-Gen unter der Kontrolle des Bakteriophagen T7-Promotors (Studier et al. 1990); pAS25 exprimierte nur das 96 Reste große Fn3-Protein, während pEW1 Fn3 als ein Fusionsprotein mit Poly-Histidin-Peptid (His-Tag) exprimierte. Rekombinante DNA-Manipulationen wurden gemäß Molecular Cloning (Sambrook et al., 1989) durchgeführt, solange nicht anders angegeben.
  • Mutationen wurden in das Fn3-Gen entweder unter Verwendung von Kassetten-Mutagenese oder Techniken der Oligonukleotid-basierten positionsspezifischen Mutagenese (Deng & Nickoloff, 1992) eingeführt. Kassetten-Mutagenese wurde unter Verwendung des gleichen Protokolls für die Genkonstruktion, wie es oben beschrieben ist, durchgeführt; ein doppelsträngiges DNA-Fragment, das eine neue Sequenz codiert, wurde in einen Expressionsvektor (pAS25 und/oder pEW1) kloniert. Es können viele Mutationen erzeugt werden, indem man einen neu synthetisierten Strang (der Mutationen codiert) und ein für die Gensynthese verwendetes Oligonukleotid kombiniert. Die resultierenden Gene wurden sequenziert, um zu bestätigen, dass die vorgesehenen Mutationen und keine anderen Mutationen durch Mutagenesereaktionen eingeführt wurden.
  • Design und Synthese von Fn3-Mutanten mit Antikörper-CDRs
  • Es wurden zwei Kandidatenschleifen (FG und BC) für die Transplantation identifiziert. Antikörper mit bekannten Kristallstrukturen wurden untersucht, um Kandidaten als Quellen für auf Fn3 zu transplantierende Schleifen zu identifizieren. Der Anti-Hühnereiweiß-Lysozym (HEL)-Antikörper D1.3 (Bhat et al., 1994) wurde als Quelle für eine CDR-Schleife ausgewählt. Die Gründe für diese Auswahl waren wie folgt: (1) Es sind hochauflösende Kristallstrukturen des freien und komplexierten Zustands verfügbar (4 A; Bhat et al., 1994), (2) Es sind thermodynamische Daten für die Bindungsreaktion verfügbar (Tello et al., 1993), (3) D1.3 ist als Musterbeispiel für die Antikörper-Strukturanalyse und die Antikörpererstellung verwendet worden (Verhoeyen et al., 1988; McCafferty et al., 1990) (4) Versuche der positionsspezifischen Mutagenese haben gezeigt, dass CDR3 der schweren Kette (VH-CDR3) einen größeren Beitrag zur Affinität liefert als die anderen CDRs (Hawkins et al., 1993), und (5) kann ein Bindungstest leicht durchgeführt werden. Die Zielsetzung für diesen Versuch war das Transplantieren von VH-CDR3 von D1.3 auf das Fn3-Gerüst ohne signifikanten Verlust an Stabilität.
  • Eine Analyse der Struktur von D1.3 (4) zeigte, dass nur die Reste 99–102 („RDYR") einen direkten Kontakt mit dem Hühnereiweiß-Lysozym (HEL) herstellen (4B), obwohl VH-CDR3 als länger definiert ist (Bhat et al., 1994). Es ist anzumerken, dass die C-terminale Hälfte von VH-CDR3 (Reste 101–104) einen signifikanten Kontakt mit der VL-Domäne herstellt (4B). Es ist außerdem klar geworden, dass D1.3 VH-CDR3 (4C) eine kürzere Wendung zwischen den Strängen F und G besitzt als die FG-Schleife von Fn3 (4D). Daher wurden mutante Sequenzen durch die Verwendung von RDYR (99–102) von D1.3 als Kern erstellt, wobei unterschiedliche Grenzen und Schleifenlängen hergestellt wurden (Tabelle 1). Kürzere Schleifen können die D1.3 CDR3-Konformation besser nachahmen und dadurch eine höhere Affinität erzielen, jedoch können sie auch die Stabilität signifikant reduzieren, indem sie wildtypische Interaktionen von Fn3 entfernen. Tabelle 1: Aminosäuresequenzen von D1.3 VH CDR3, VH8 CDR3 und Fn3 FG-Schleife und Auflistung der geplanten Mutanten
    Figure 00180001
  • Unterstreichungen zeigen Reste in β-Strängen an. Fettgedruckte Buchstaben zeigen ersetzte Reste an.
  • Zusätzlich wurde eine Anti-HEL-Einzel-VH-Domäne, die als VH8 bezeichnet wird (Ward et al., 1989) als Matrize ausgewählt. VH8 wurde durch Bibliotheks-Durchmusterung selektiert, und, trotz des Fehlens der VL-Domäne, besitzt VH8 eine Affinität für HEL von 27 nM, vermutlich aufgrund seiner längeren VH-CDR3 (Tabelle 1). Daher wurde seine VH-CDR3 auf Fn3 transplantiert. Längere Schleifen können an dem Fn3-Gerüst vorteilhaft sein, da sie eine höhere Affinität bereitstellen können und außerdem nahe an der Schleifenlänge von wildtypischem Fn3 liegen. Die 3D-Struktur von VH8 war nicht bekannt, und daher wurde die VH8-CDR3-Sequenz einem Alignment mit derjenigen von D1.3 VH-CDR3 unterzogen; es wurden zwei Schleifen erstellt (Tabelle 1).
  • Mutanten-Konstruktion und Produktion
  • Es wurden Versuche der positionsspezifischen Mutagenese durchgeführt, um die konzipierten Sequenzen zu erhalten. Es wurden zwei mutante Fn3, D1.3-1 und D1.3-4 (Tabelle 1) erhalten, und beide wurden als lösliche His-Tag-Fusionsproteine exprimiert. D1.3-4 wurde gereinigt, und der His-Tag-Anteil wurde durch Thrombinspaltung entfernt. D1.3-4 ist bei pH 7,2 mit bis zu wenigstens 1 mM löslich. Es wurde keine Aggregation des Proteins während der Probenherstellung und der Aufnahme der NMR-Daten beobachtet.
  • Proteinexpression und Reinigung
  • E. coli BL21 (DE3) (Novagen) wurde mit einem Expressionsvektor (pAS25, pEW1 und deren Derivate), der ein Gen für den Wildtyp oder eine Mutante enthält, transformiert. Die Vermehrung der Zellen erfolgte in M9-Minimalmedium und M9-Medium, das mit Bactotrypton (Difco), enthaltend Ampicillin (200 μg/ml), supplementiert worden war. Für die Isotopenmarkierung ersetzten 15N NH4Cl und/oder 13C-Glukose die unmarkierten Komponenten. 500 ml Medium in einem 2 Liter-Baffle-Kolben (Kolben mit Schikanen) wurden mit 10 ml einer Übernachtkultur angeimpft und bei 37°C geschüttelt. Es wurde Isopropylthio-β-galaktosid (IPTG) mit einer Endkonzentration von 1 mM hinzugegeben, um die Proteinexpression zu starten, wenn die OD (600 nm) eins erreichte. Die Zellen wurden durch Zentrifugation 3 Stunden nach der Zugabe von IPTG geerntet und bis zur Verwendung gefroren auf –70°C gehalten.
  • Fn3 ohne His-Tag wurde wie folgt gereinigt. Die Zeilen wurden in 5 ml/(g Zellen) an Tris (50 mM, pH 7,6), enthaltend Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA; 1 mM) und Phenylmethylsulfonyl-Fluorid (1 mM), suspendiert. HEL wurde mit einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml hinzugegeben. Nach Inkubieren der Lösung für 30 Minuten bei 37°C wurde diese dreimal für 30 Sekunden auf Eis mit Ultraschall behandelt. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation entfernt. Es wurde Ammoniumsulfat zu der Lösung hinzugegeben, und das Präzipitat wurde durch Zentrifugation wiedergewonnen. Das Pellet wurde in 5–10 ml Natriumacetat (50 mM, pH 4,6) gelöst, und unlösliches Material wurde durch Zentrifugation entfernt. Die Lösung wurde auf eine Sephacryl S 100HR-Säule (Pharmacia), die in dem Natriumacetatpuffer äquilibriert worden war, aufgetragen. Fraktionen, die Fn3 enthalten, wurden dann auf eine ResourceS-Säule (Pharmacia), die in Natriumacetat (50 mM, pH 4,6) äquilibriert worden war, aufgetragen und mit einem linearen Gradienten aus Natriumchlorid (0–0,5 M) eluiert. Das Protokoll kann angepasst werden, um mutante Proteine mit abweichenden Oberflächenladungseigenschaften zu reinigen.
  • Fn3 mit His-Tag wurde wie folgt gereinigt. Die lösliche Fraktion wurde hergestellt wie oben beschrieben, mit dem Unterschied, dass Natriumphosphat-Puffer (50 mM, pH 7,6), enthaltend Natriumchlorid (100 mM), den Tris-Puffer ersetzte. Die Lösung wurde auf eine Hi-Trap-Chelier-Säule (Pharmacia), die vorab mit Nickel beladen und in dem Phosphatpuffer äquilibriert worden war, aufgetragen. Nach dem Waschen der Säule mit dem Puffer wurde His-Tag-Fn3 in dem Phosphatpuffer, der 50 mM EDTA enthält, eluiert. Fraktionen, die His-Tag-Fn3 enthalten, wurden vereint und auf eine Sephacryl S 100-HR-Säule aufgetragen, was hochgradig reines Protein ergibt. Der His-Tag-Anteil wurde abgespalten, indem man das Fusionsprotein mit Thrombin behandelte, wobei man das Protokoll verwendete, das von Novagen bereitgestellt wurde. Die Abtrennung von Fn3 von dem His-Tag-Peptid und Thrombin erfolgte durch eine ResourceS-Säule unter Verwendung des obigen Protokolls.
  • Das wildtypische und zwei bislang untersuchte mutante Proteine werden als lösliche Proteine exprimiert. Wenn eine Mutante in Form von Einschlusskörpern (unlösliches Aggregat) exprimiert wird, so wird zunächst untersucht, ob es als ein lösliches Protein bei niedrigerer Temperatur (z. B. 25–30°C) exprimiert werden kann. Wenn dies nicht möglich ist, so werden die Einschlusskörper durch Niedriggeschwindigkeitszentrifugation, folgend auf die Zelllyse gemäß obiger Beschreibung, gesammelt. Das Pellet wird mit Puffer gewaschen, mit Ultraschall behandelt und zentrifugiert. Die Einschlusskörper werden in Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,6), enthaltend Guanidiniumchlorid (GdnCl, 6 M), solubilisiert und werden auf eine Hi-Trap-Cheliersäule geladen. Das Protein wird mit dem GdnCl und 50 mM EDTA enthaltenden Puffer eluiert.
  • Konformation von mutantem Fn3, D1.3-4
  • Das 1H-NMR-Spektrum des His-Tag-D1.3-4-Fusionsproteins ähnelt stark dem des Wildtyps, was nahelegt, dass die Mutante in eine ähnliche Konformation gefaltet wird wie die des Wildtyps. Das Spektrum von D1.3-4 nach der Entfernung des His-Tag-Peptids zeigte eine große spektrale Streuung. Eine große Streuung des Amidprotons (7–9,5 ppm) und eine große Anzahl von Downfield-Cα-Protonen (5,0–6,5 ppm) sind charakteristisch für ein β-Faltblattprotein (Wüthrich, 1986).
  • Das 2D-NOESY-Spektrum von D1.3-4 lieferte weitere Anhaltspunkte für eine beibehaltene Konformation. Die Region in dem Spektrum zeigte Interaktionen zwischen Upfield-Methylprotonen (< 0,5 ppm) und Methyl-Methylen-Protonen. Die Val72-γ-Methyl-Resonanzen wurden in dem wildtypischen Spektrum gut aufgetrennt (–0,07 und 0,37 ppm; (Baron et al., 1992)). Resonanzen, die den beiden Methylprotonen entsprechen, sind in dem D1.3-4-Spektrum vorhanden (–0,07 und 0,44 ppm). Der Kreuzpeak zwischen diesen zwei Resonanzen und andere konservierte Kreuzpeaks zeigen an, dass die zwei Resonanzen in dem D1.3-4-Spektrum mit hoher Wahrscheinlichkeit diejenigen von Val72 sind und dass andere Methylprotonen sich in einer nahezu identischen Umgebung wie der bei wildtypischem Fn3 befinden. Geringfügige Unterschiede zwischen den beiden Spektren liegen wahrscheinlich an einer kleinen strukturellen Störung aufgrund der Mutationen. Val72 befindet sich auf dem F-Strang, wo es einen Teil des zentralen hydrophoben Kerns von Fn3 ausbildet (Main et al., 1992). Es liegt nur vier Reste von den mutierten Resten der FG-Schleife entfernt (Tabelle 1). Die Ergebnisse sind bemerkenswert, da D1.3-4 trotz des Vorliegens von 7 Mutationen und 3 Deletionen in der Schleife (mehr als 10% der gesamten Reste; 12, Tabelle 2), eine 3D-Struktur aufrechterhält, die im wesentlichen identisch zu derjenigen des Wildtyps (mit Ausnahme der mutierten Schleife) ist. Daher liefern die Ergebnisse eine starke Unterstützung dafür, dass die FG-Schleife nicht signifikant zu der Faltung und Stabilität des Fn3-Moleküls beiträgt, und dass die FG-Schleife somit in ausgedehnter Weise mutiert werden kann. Tabelle 2: Sequenzen von Oligonukleotiden
    Figure 00220001
  • Die Restriktionsenzymstellen sind unterstrichen. N und K bezeichnen ein äquimolares Gemisch aus A, T, G und C bzw. ein solches aus G und T.
  • Struktur- und Stabilitätsmessungen
  • Die Strukturen der Antikörper wurden unter Verwendung quantitativer Verfahren (z. B. DSSP (Kabsch & Sander, 1983) und PDBfit (D. McRee, The Scripps Research Institute)), ebenso wie mittels Computergraphiken (z. B. Quinta (Molecular Simulations) und What if (G. Vriend, Europein Molecular Biology Laborstory)) analysiert, um die Strang-Schleife-Strang-Strukturen von Antikörpern und Fn3 aufeinander zu legen.
  • Die Stabilität von FnAbs (Fn-Antikörpern) wurde durch Messen von durch Temperatur und chemischen Denaturierungsmitteln induzierten Entfaltungsreaktionen (face et al., 1989) bestimmt. Die durch Temperatur induzierte Entfaltungsreaktion wurde unter Verwendung eines Circulardichroismus-(CD)-Polarimeters gemessen. Die Elliptizität bei 222 und 215 nm wurde aufgezeichnet, wobei die Probentemperatur langsam erhöht wurde. Es wurden Probenkonzentrationen zwischen 10 und 50 μM verwendet. Nachdem die Basislinie der Entfaltung etabliert worden war, wurde die Temperatur gesenkt, um die Umkehrbarkeit der Entfaltungsreaktion zu untersuchen. Die freie Energie der Entfaltung wurde durch Anpassen der Daten an die Gleichung für den Zwei-Zustands-Übergang (Becktel & Schellman, 1987; Pace et al., 1989) bestimmt. Es wurde eine nicht-lineare Least-Squares-Anpassung (Anpassung gemäß der kleinsten Quadrate) unter Verwendung des Programms Igor (WaveMetrics) auf einem Macintosh-Computer durchgeführt.
  • Es wurde die Struktur und Stabilität der beiden selektierten mutanten Fn3 untersucht; die erste Mutante war D1.3-4 (Tabelle 2), und die zweite Mutante, die als AS40 bezeichnet wurde, enthielt vier Mutationen in der BC-Schleife (A26V27T28V29) → TQRQ). AS40 wurde zufällig aus der oben beschriebenen BC-Schleifen-Bibliothek ausgewählt. Beide Mutanten wurden als lösliche Proteine in E. coli exprimiert und wurden auf wenigstens 1 mM konzentriert, was NMR-Studien erlaubt.
  • Der Wechselpunkt (midpoint) der thermischen Denaturierung für beide Mutanten betrug etwa 69°C, im Vergleich zu etwa 79°C für das wildtypische Protein. Diese Ergebnisse zeigten an, dass die ausgedehnten Mutationen an den beiden Oberflächenschleifen nicht zu einer dramatischen Abnahme der Stabilität von Fn3 führten, und sie zeigten somit die Machbarkeit der Einführung einer großen Anzahl von Mutationen in beide Schleifen.
  • Die Stabilität wurde außerdem mittels Guanidiniumchlorid (GdnCl)- und Harnstoffinduzierter Entfaltungsreaktionen bestimmt. Die vorläufigen Entfaltungskurven wurden unter Verwendung eines Fluorometers aufgezeichnet, das mit einer motorgetriebenen Spritze ausgestattet war; GdnCl oder Harnstoff wurden kontinuierlich zu der Proteinlösung in der Küvette hinzugegeben. Basierend auf den vorläufigen Entfaltungskurven, wurden getrennte Proben mit einer variierenden Konzentration eines Denaturierungsmittels hergestellt, und die Fluoreszenz (Anregung bei 290 nm, Emission bei 300–400 nm) oder CD (Elliptizität bei 222 und 215 nm) wurden gemessen, nachdem die Proben für wenigstens eine Stunde bei der Messtemperatur äquilibriert worden waren. Die Kurve wurde durch das „Least-Squares-Verfahren" an die Gleichung für das Zwei-Zustandsmodell angepasst (Santoro & Bolen, 1988; Koide et al., 1993). Die Veränderung der Proteinkonzentration wurde kompensiert, wenn nötig.
  • Sobald die Umkehrbarkeit der thermischen Entfaltungsreaktion festgestellt ist, erfolgt die Messung der Entfaltungsreaktion durch ein Microcal MC-2 Differential-Scan-Kalorimeter (DSC). Die Zelle (~1,3 ml) wird mit FnAb-Lösung (0,1–1 mM) gefüllt, und ΔCp (= ΔH/ΔT) wird gemessen, wobei die Temperatur langsam angehoben wird. Tm (Wechselpunkt der Entfaltung), ΔH der Entfaltung und ΔG der Entfaltung werden durch Anpassen der Übergangskurve (Privalov & Potekhin, 1986) mit der von Microcal gelieferten Software Origin bestimmt.
  • Thermische Entfaltung
  • Ein temperaturinduziertes Entfaltungsexperiment an Fn3 wurde unter Verwendung von Circulardichroismus-(CD)-Spektroskopie durchgeführt, um die Veränderungen der Sekundärstruktur zu überwachen. Das CD-Spektrum von nativem Fn3 zeigt ein schwaches Signal nahe 222 nm (3A), was konsistent ist mit der vorherrschenden β-Struktur von Fn3 (Perczel et al., 1992). Ein kooperativer Entfaltungsübergang wird bei 80–90°C beobachtet, was klar eine hohe Stabilität von Fn3 anzeigt (36). Die freie Energie der Entfaltung konnte aufgrund des Fehlens einer Post-Übergangs-Basislinie nicht bestimmt werden. Das Ergebnis ist konsistent mit der hohen Stabilität der ersten Fn3-Domäne von humanem Fibronektin (Litvinovich et al., 1992), was somit anzeigt, dass Fn3-Domänen im allgemeinen hochstabil sind.
  • Bindungsassays
  • Die Bindungsreaktion von FnAbs wurde unter Verwendung eines isothermen Titrationskalorimeters (ITC) und Fluoreszenzspektroskopie quantitativ charakterisiert.
  • Die Enthalpieveränderung (ΔH) der Bindung wurde unter Verwendung eines Microcal Omega ITC (Wiseman et al., 1989) gemessen. Die Probenzelle (~1,3 ml) wurde mit FnAbs-Lösung (≤ 100 μM, verändert gemäß Kd) gefüllt, und die Referenzzelle wurde mit destilliertem Wasser gefüllt; das System wurde bei einer gegebenen Temperatur äquilibriert, bis eine stabile Basislinie erhalten wurde; 5–20 μl einer Ligandenlösung (≤ 2 mM) wurden innerhalb einer kurzen Zeitspanne (20 sec) über eine motorgetriebene Spritze injiziert, gefolgt von einer Äquilibrierungsverzögerung (4 Minuten); die Injektion wurde wiederholt, und die Hitzeerzeugung/Absorption wurde für jede Injektion gemessen.
  • Anhand der Veränderung bei der beobachteten Wärmeänderung als Funktion der Ligandenkonzentration wurden ΔH und Kd bestimmt (Wiseman et al., 1989). ΔG und ΔS der Bindereaktion wurden aus den zwei direkt gemessenen Parametern abgeleitet. Die Abweichung von der theoretischen Kurve wurde bestimmt, um unspezifische (auf multiple Stellen bezogene) Bindung zu bestimmen. Es wurden außerdem Versuche durchgeführt, indem man einen Liganden in die Zelle einbrachte und mit einem FnAb titrierte. Es sollte betont werden, dass nur ITC eine direkte Messung von ΔH ergibt und es dadurch ermöglicht wird, die enthalpischen und entropischen Beiträge zu der Bindungsenergie zu bewerten. ITC wurde erfolgreich verwendet, um die Bindungsreaktion von D1.3 Ab (Tello et al., 1993; Bhat et al., 1994) zu überwachen.
  • Die intrinsische Fluoreszenz wird überwacht, um die Bindungsreaktionen mit Kd im Sub-μM-Bereich zu messen, wo die Bestimmung von Kd durch ITC schwierig ist. Die Trp-Fluoreszenz (Anregung bei ~290 nm, Emission bei 300–350 nm) und die Tyr-Fluoreszenz (Anregung bei 260 nm, Emission bei ~303 nm) wird überwacht, wenn die Fn3-Mutanten-Lösung (≤ 10 μM) mit Ligandenlösung (≤ 100 μM) titriert wird. Die Kd der Reaktion wird durch die nicht-lineare Least-Squares-Anpassung der bimolekularen Bindungsgleichung bestimmt. Die Anwesenheit sekundärer Bindungsstellen wird unter Verwendung von Scatchard-Analyse untersucht. Bei allen Bindungsassays werden Kontrollversuche unter Verwendung von wildtypischem Fn3 (oder nicht-verwandten FnAbs) anstelle der FnAbs von Interesse durchgeführt.
  • II. Produktion von Fn3-Mutanten mit FnAbs hoher Affinität und Spezifität
  • Es wurde Bibliotheks-Durchmusterung durchgeführt, um FnAbs zu selektieren, die an spezifische Liganden binden. Dies ist komplementär zu dem oben beschriebenen Modellierungsansatz. Der Vorteil einer kombinatorischen Durchmusterung besteht darin, dass man leicht eine große Anzahl von Varianten (≥ 108) produzieren und durchmustern kann, was mit Ansätzen spezifischer Mutagenese („rationales Design") nicht machbar ist. Es wurde die Technik des Phage Display (Smith, 1985; O'Neil & Hoess, 1995) verwendet, um den Prozess der Durchmusterung durchzuführen. Fn3 wurde an ein Phagenhüllprotein (pIII) fusioniert und auf der Oberfläche filamentöser Phagen präsentiert. Diese Phagen beherbergen ein einzelsträngiges DNA-Genom, das das Gen enthält, das für das Fn3-Fusionsprotein codiert. Die Aminosäuresequenz definierter Regionen von Fn3 wurde unter Verwendung einer degenerierten Nukleotidsequenz einer zufälligen Abwandlung unterzogen, wodurch eine Bibliothek konstruiert wurde. Phagen, die Fn3-Mutanten mit den gewünschten Bindungsfähigkeiten präsentierten, wurden in vitro selektiert, wiedergewonnen und amplifiziert. Die Aminosäuresequenz eines selektierten Klons kann leicht identifiziert werden, indem man das Fn3-Gen des selektierten Phagen sequenziert. Man folgte den Protokollen von Smith (Smith & Scott, 1993) mit geringfügigen Modifikationen.
  • Die Zielsetzung bestand darin, FnAbs zu erzeugen, die eine hohe Affinität gegenüber kleinen Proteinliganden besitzen. HEL und die B1-Domäne des Staphylokokken-Proteins G (hier im Folgenden als Protein G bezeichnet) wurden als Liganden verwendet. Protein G ist klein (56 Aminosäuren) und hochstabil (Minor & Kim, 1994; Smith et al., 1994). Seine Struktur wurde mit tels NMR-Spektroskopie als eine Helix, die gegen ein viersträngiges β-Faltblatt gepackt ist, bestimmt (Gronenborn et al., 1991). Die resultierenden FnAb-Protein-G-Komplexe (~150 Reste) gehören zu den kleinsten bis heute erzeugten Protein-Protein-Komplexen und befinden sich gut im Bereich direkter NMR-Verfahren. Die kleine Größe, die hohe Stabilität und Löslichkeit beider Komponenten und die Fähigkeit, jede mit stabilen Isotopen zu markieren (13C und 15N; siehe unten für Protein G) macht die Komplexe zu einem idealen Modellsystem für NMR-Studien an Protein-Protein-Interaktionen.
  • Der erfolgreiche Schleifenaustausch von Fn3 (bei der Mutante D1.3-4) zeigt, dass mindestens zehn Reste ohne den Verlust der allgemeinen Faltung mutiert werden können. Hierauf basierend, wurde zunächst eine Bibliothek konstruiert, bei der nur Reste in der FG-Schleife einer zufälligen Abwandlung unterzogen werden. Nachdem die Ergebnisse der Schleifenaustauschversuche an der BC-Schleife erhalten wurden, wurde auf die Mutationsstellen ausgedehnt, die die BC-Schleife und andere Stellen beinhalten.
  • Konstruktion des Fn3-Phage-Display-Systems
  • Ein auf Phage M13 basierender Expressionsvektor, pASM 1, wurde wie folgt konstruiert: ein Oligonukleotid, das das Signalpeptid von OmpT codiert, wurde an das 5'-Ende des Fn3-Gens kloniert; ein Genfragment, das die C-terminale Domäne von M13 pIII codiert, wurde aus dem wildtypischen Gen-III-Gen von M13 mp18 unter Verwendung von PCR (Corey et al., 1993) hergestellt, und das Fragment wurde an dem 3'-Ende des OmpT-Fn3-Gens inseriert; eine Spacer-Sequenz wurde zwischen Fn3 und pIII eingesetzt. Das resultierende Fragment (OmpT-Fn3-pIII) wurde in die multiple Klonierungsstelle von M13 mp18 kloniert, wo sich das Fusionsgen unter der Kontrolle des lac-Promotors befindet. Dieses System wird das Fn3-pIII-Fusionsprotein ebenso produzieren wie das wildtypische pIII-Protein. Man nimmt an, dass die Co-Expression von wildtypischem pIII die Anzahl an Fusions-pIII-Protein reduziert, wodurch die Infektivität des Phagen gesteigert wird (Corey et al., 1993) (es sind fünf Kopien von pIII auf einem Phagenpartikel vorhanden). Zusätzlich kann eine kleinere Anzahl an Fusions-pIII-Protein dabei vorteilhaft sein, fest bindende Proteine zu selektieren, da der chelierende Effekt aufgrund multipler Bindungsstellen kleiner sein sollte als derjenige mit allen fünf Kopien des Fusions-pIII (Bass et al., 1990). Dieses System hat erfolgreich die Serinprotease Trypsin präsentiert (Corey et al., 1993). Die Phagen wurden unter Verwendung von E. coli K91kan (Smith & Scott, 1993) gemäß einem Standardverfahren (Sambrook et al., 1989) erzeugt und gereinigt, mit dem Unterschied, dass die Phagenpartikel durch eine zweite Polyethylenglykol-Präzipitation und Säurepräzipitation gereinigt wurden.
  • Die erfolgreiche Präsentation von Fn3 auf Fusionsphagen ist durch ELISA unter Verwendung eines Antikörpers gegen Fibronektin (Sigma) bestätigt worden, was klar anzeigt, dass es möglich ist, Bibliotheken unter Verwendung dieses Systems zu konstruieren.
  • Ein alternatives System unter Verwendung von fUSE5 (Parmley & Smith, 1988) kann ebenfalls verwendet werden. Das Fn3-Gen wird unter Verwendung der Sfil-Restriktionsstellen, die bei der Fn3-Gen-PCR an den 5'- und 3'-Enden eingeführt wurden, in fUSE5 inseriert. Dieses System präsentiert nur das Fusions-pIII-Protein (bis zu fünf Kopien) auf der Oberfläche eines Phagen. Phagen werden hergestellt und gereinigt wie beschrieben (Smith & Scott, 1993). Dieses System ist verwendet worden, um viele Proteine zu präsentieren, und es ist robust. Der Vorteil von fUSE5 besteht in seiner geringen Toxizität. Diese beruht auf der geringen Kopienzahl der Replikationsform (RF) im Wirt, was es wiederum schwierig macht, eine hinreichende Menge an RF für die Bibliothekskonstruktion herzustellen (Smith & Scott, 1993).
  • Konstruktion von Bibliotheken
  • Die erste Bibliothek wurde aus der Fn3-Domäne konstruiert, die auf der Oberfläche von MB-Phagen präsentiert wird, wobei sieben Reste (77–83) in der FG-Schleife (4D) einer zufälligen Abwandlung unterzogen wurden. Diese „Randomisierung" wird durch die Verwendung eines Oligonukleotids erreicht, das eine degenerierte Nukleotidsequenz enthält. Ein doppelsträngiges Nukleotid wurde durch das gleiche Protokoll hergestellt wie für die Gensynthese (siehe oben), mit dem Unterschied, dass ein Strang eine (NNK)6(NNG)-Sequenz an den Mutationsstellen aufwies, wobei N einem äquimolaren Gemisch aus A, T, G und C entspricht, und K einem äquimolaren Gemisch aus G und T entspricht. Das (NNG)-Codon an Rest 83 war erforderlich, um die SacI-Restriktionsstelle (2) zu erhalten. Das (NNK)-Codon codiert alle 20 Aminosäuren, wogegen das NNG-Codon 14 codiert. Daher enthielt diese Bibliothek ~109 unabhängige Sequenzen. Die Bibliothek wurde konstruiert, indem man das doppelsträngige Nukleotid in den wildtypischen Phagenvektor, pASM1, ligierte, bei Transfektion von E. coli XL 1 blue (Stratagene) unter Verwendung von Elektroporation. XL 1 blue besitzt den lacIq-Phänotyp und unterdrückt somit die Expression des Fn3-pIII-Fusionsproteins in Abwesenheit des lac-Induktors. Die anfängliche Bibliothek wurde auf diese Weise vermehrt, um die Selektion gegen toxische Fn3-pIII-Klone zu vermeiden. Phagen, die das randomisierte Fn3-pIII-Fusionsprotein präsentieren, wurden hergestellt, indem man Phagen mit K91kan als Wirt vermehrte. K91kan unterdrückt nicht die Produktion des Fusionsproteins, da es kein lacIq besitzt. Es wurde außerdem eine weitere Bibliothek erzeugt, bei der die BC-Schleife (Reste 26–20) randomisiert wurde.
  • Selektion präsentierter FnAbs
  • Das Durchmustern der Fn3-Phagenbibliotheken wurde unter Verwendung des „Biopanning"-Protokolls (Smith & Scott, 1993) durchgeführt; ein Ligand wird biotinyliert, und es wurde die starke Interaktion von Biotin-Streptavidin verwendet, um den Liganden an einer mit Streptavidin beschichteten Schale zu immobilisieren. Die Experimente wurden bei Raumtemperatur (~22°C) durchgeführt. Für die anfängliche Wiedergewinnung von Phagen aus einer Bibliothek wurden 10 μg eines biotinylierten Liganden an einer mit Streptavidin beschichteten Polystyrol-Schale (35 mm, Falcon 1008) immobilisiert, und es wurde dann eine Phagenlösung (enthaltend ~1011 pfu (Plaque-bildende Einheiten)) hinzugegeben. Nach dem Waschen der Schale mit einem geeigneten Puffer (typischerweise TEST, Tris-HCl (50 mM, pH 7,5), NaCl (150 mM) und Tween 20 (0,5%)) wurden die gebundenen Phagen durch eine der oder durch Kombination der folgenden Bedingungen eluiert: niedriger pH, Zugabe eines freien Liganden, Harnstoff (bis zu 6 M) und, im Falle von Anti-Protein G-FnAbs, das Spalten des Protein G-Biotin-Linkers durch Thrombin. Die wieder gewonnenen Phagen wurden unter Verwendung des Standardprotokolls unter Verwendung von K91kan als Wirt (Sambrook et al., 1989) amplifiziert. Der Selektionsprozess wurde 3–5-mal wiederholt, um positive Klone zu konzentrieren. Ab der zweiten Runde wurde die Menge an Ligand graduell gesenkt (auf ~1 μg), und der biotinylierte Ligand wurde mit einer Phagenlösung gemischt, bevor er auf eine Schale übertragen wurde (G. P. Smith, persönliche Anmerkung). Nach der letzten Runde wurden 10–20 Klone gepickt, und ihre DNA-Sequenz wird bestimmt. Die Ligandenaffinität der Klone wurde zunächst durch das Phagen-ELISA-Verfahren (siehe unten) gemessen.
  • Um die potentielle Bindung des Fn3-Gerüsts (Hintergrundbindung) an einen Liganden zu unterdrücken, kann wildtypisches Fn3 als ein Kompetitor zu den Puffern hinzugegeben werden. Zusätzlich können nicht-verwandte Proteine (z. B. Rinderserumalbumin, Cytochrom C und RNase A) als Kompetitoren verwendet werden, um hochspezifische FnAbs zu selektieren.
  • Bindungs-Assay
  • Die Bindungsaffinität von FnAbs an der Phagenoberfläche wird semi-quantitativ charakterisiert, indem man die Phagen-ELISA-Technik (Li et al., 1995) verwendet. Wells von Mikrotiterplatten (Nunc) werden mit einem Ligandenprotein beschichtet (oder mit Streptavidin, gefolgt von der Bindung eines biotinylierten Liganden) und mit der „Blotto-Lösung" (Pierce) geblockt. Gereinigte Phagen (~1010 pfu), die aus einzelnen Plaque (M13)/Kolonien (fUSE5) hervorgehen, werden zu jedem Well hinzugegeben und übersacht bei 4°C inkubiert. Nach dem Waschen der Wells mit einem geeigneten Puffer (siehe oben) werden gebundene Phagen durch das Standard-ELISA-Protokoll unter Verwendung von Anti-M13-Ab (Kaninchen, Sigma) und Anti-Kaninchen-Ig- Peroxidase-Konjugat (Pierce) oder unter Verwendung von Anti-M13-Ab-Peroxidase-Konjugat (Pharmacia) detektiert. Colorimetrische Assays werden unter Verwendung von TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin, Pierce) durchgeführt. Die hohe Affinität von Protein G gegenüber Immunglobulinen stellt ein spezielles Problem dar; Antikörper können nicht bei der Detektion verwendet werden. Daher, um Anti-Protein-G-FnAbs zu detektieren, werden Fusionsphagen in Wells immobilisiert, und die Bindung wird dann unter Verwendung von biotinyliertem Protein G, gefolgt von der Detektion unter Verwendung von Streptavidin-Peroxidase-Konjugat, gemessen.
  • Produktion löslicher FnAbs
  • Nach der vorläufigen Charakterisierung von mutanten Fn3s unter Verwendung von Phagen-ELISA werden mutante Gene in den Expressionsvektor pEW1 subkloniert. Mutante Proteine werden als His-Tag-Fusionsproteine produziert und gereinigt, und ihre Konformation, Stabilität und Ligandenaffinität werden charakterisiert.
  • Somit ist Fn3 das vierte Beispiel eines monomeren Immunglobulin-artigen Gerüsts, das für die Erstellung von Bindeproteinen verwendet werden kann. Eine erfolgreiche Selektion neuer Bindeproteine ist außerdem basiert auf Minibody-, Tendamistat- und kamelhaft gemachten Immunglobulin-VH-Domänen-Gerüsten durchgeführt worden (Martin et al., 1994; Davies & Riechmann, 1995; McConnell & Hoess, 1995). Das Fn3-Gerüst besitzt Vorteile gegenüber diesen Systemen. Bianchi et al. berichteten, dass die Stabilität eines Minibody 2,5 kcal/mol betrug, signifikant weniger als die von Ubi4-K. Es ist bisher keine detaillierte strukturelle Charakterisierung von Minibodies beschrieben worden. Tendamistat und die VH-Domäne enthalten Disulfidbindungen, und somit kann die Präparation korrekt gefalteter Proteine schwierig sein. Davies und Riechmann berichteten, dass die Ausbeuten ihrer kamelhaft gemachten VH-Domänen weniger als 1 mg pro Liter Kultur betrug (Davies & Riechmann, 1996).
  • Somit kann die Fn3-Rahmenstruktur als Gerüst für die molekulare Erkennung verwendet werden. Seine kleine Größe, Stabilität und gut charakterisierte Struktur machen Fn3 zu einem attraktiven System. Angesichts der ubiquitären Gegenwart von Fn3 bei einer breiten Vielfalt von an der Liganden-Bindung beteiligten natürlichen Proteinen, kann man Fn3-basierte Bindeproteine gegen verschiedene Klassen von Targets erstellen.
  • Die folgenden Beispiele sind dazu gedacht, die Erfindung zu veranschaulichen, nicht jedoch diese einzuschränken.
  • BEISPIEL I
  • Konstruktion des Fn3-Gens
  • Es wurde ein synthetisches Gen für das zehnte Fn3 von Fibronektin (1) auf Basis der Aminosäurereste 1416–1509 von humanem Fibronektin (Kornblihtt, et al., 1985) und dessen dreidimensionaler Struktur (Main, et al., 1992) erstellt. Das Gen wurde so erstellt, dass es passende Restriktionsstellen für die Mutagenese enthält, und es wurden dann die so genannten „bevorzugten Codons" für die Proteinexpression auf hohem Niveau (Gribskov, et al., 1984) verwendet. Zusätzlich wurde ein Glutaminrest nach dem N-terminalen Methionin eingefügt, um eine partielle Prozessierung des N-terminalen Methionins zu vermeiden, die oft die NMR-Spektren verschlechtert (Smith, et al., 1994). Die chemischen Reagenzien waren von analytischer Qualität oder besser und wurden bei der Sigma Chemical Company und J. T. Baker erworben, solange nicht anders angezeigt. Rekombinante DNA-Prozeduren wurden durchgeführt, wie in „Molecular Cloning" (Sambrook, et. al, 1989) beschrieben, solange nicht anders angegeben. Gebrauchs-Oligonukleotide wurden bei Operon Technologies erworben. Die Restriktions- und Modifikationsenzyme stammten von New England Biolabs.
  • Das Gen wurde auf folgende Weise zusammengesetzt. Zunächst wurde die Gensequenz (5) in fünf Teile geteilt, mit Grenzen an den angezeigten Restriktionsstellen: Fragment 1, NdeI-PstI (Oligonukleotide FN1F und FN1R (Table 2); Fragment 2, PstI-EcoRI (FN2F und FN2R); Fragment 3, EcoRI-SalI (FN3F und FN3R); Fragment 4, SalI-SacI (FN4F und FN4R); Fragment 5, SacI-BamHI (FN5F und FN5R). Zweitens wurde für jeden Teil ein Paar von Oligonukleotiden synthetisiert, die entgegengesetzte Stränge codieren und komplementäre Überlappungen von etwa 15 Basen besitzen. Diese Oligonukleotide wurden als FN1F-FN5R bezeichnet und sind in Tabelle 2 gezeigt. Drittens wurde jedes Paar (z. B. FN1F und FN1R) aneinander hybridisiert, und einzelsträngige Regionen wurden unter Verwendung des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase aufgefüllt. Viertens wurde das doppelsträngige Oligonukleotid mit den relevanten Restriktionsenzymen an den Enden des Fragments verdaut und in das pBlueScript SK-Plasmid (Stratagene) kloniert, das mit den gleichen Enzymen wie den für die Fragmente verwendeten verdaut worden war. Die DNA-Sequenz des eingesetzten Fragments wurde durch DNA-Sequenzierung unter Verwendung eines Applied Biosystems DNA-Sequenziergeräts und des vom Hersteller gelieferten Didesoxy-Terminationsprotokolls bestätigt. Zum Schluss wurden die Stufen 2–4 wiederholt, um das gesamte Gen zu erhalten.
  • Das Gen wurde außerdem in die Vektoren pET3a und pET15b (Novagen) (bzw. pAS45 und pAS25) kloniert. Die Karten der Plasmide sind in den 6 und 7 gezeigt. E. coli BL21 (DE3) (Novagen), das diese Vektoren enthielt, exprimierte das Fn3-Gen unter der Kontrolle des Bakte riophagen T7-Promotors (Studier et al., 1990); pAS24 exprimierte nur das 96 Reste große Fn3-Protein, während pAS45 Fn3 als ein Fusionsprotein mit Poly-Histidin-Peptid (His-Tag) exprimiert. Es wurde eine auf hohem Niveau stattfindende Expression des Fn3-Proteins und seiner Derivate in E. coli als eine intensive Bande auf der mit CBB gefärbten SDS-PAGE detektiert.
  • Die Bindungsreaktion der Monobodies wird quantitativ mittels Fluoreszenzspektroskopie unter Verwendung gereinigter löslicher Monobodies charakterisiert.
  • Die intrinsische Fluoreszenz wird überwacht, um Bindungsreaktionen zu messen. Die Trp-Fluoreszenz (Anregung bei ~290 nm, Emission bei 300–350 nm) und die Tyr-Fluoreszenz (Anregung bei ~260 nm, Emission bei ~303 nm) wird überwacht, wenn die Fn3-Mutanten-Lösung (≤ 100 μM) mit einer Ligandenlösung titriert wird. Wenn ein Ligand fluoreszent ist (z. B. Fluorescein), so kann die Fluoreszenz des Liganden verwendet werden. Die Kd der Reaktion wird durch nicht-lineare Least Squares-Anpassung der bimolekularen Bindungsgleichung bestimmt.
  • Wenn die intrinsische Fluoreszenz nicht verwendet werden kann, um die Bindungsreaktion zu überwachen, so werden Monobodies mit Fluorescein-NHS (Pierce) markiert, und es wird Fluoreszenz-Polarisation verwendet, um die Bindungsreaktion zu überwachen (Burke et al., 1996).
  • BEISPIEL II
  • Modifikationen zur Einbeziehung von Restriktionsstellen in das Fn3-Gen
  • Die Restriktionsstellen wurden in das synthetische Fn3-Gen eingebaut, ohne die Aminosäuresequenz von Fn3 zu verändern. Die Positionen der Restriktionsstellen wurden so ausgewählt, dass die Genkonstruktion ohne das Synthetisieren langer (> 60 Basen) Oligonukleotide vervollständigt werden konnte, und derart, dass zwei Schleifenregionen durch das Verfahren der Kassettenmutagenese mutiert (einschließlich Randomisierung) werden konnten (d. h. Austauschen eines Fragments durch ein anderes synthetisches Fragment, das Mutationen enthält). Zusätzlich wurden die Restriktionsstellen so ausgewählt, dass die meisten Stellen in dem Vektor für den Phage-Display singulär waren. Singuläre Restriktionsstellen erlauben es einem, Monobody-Klone zu rekombinieren, die bereits selektiert wurden, um einen größeren Sequenzraum bereitzustellen.
  • BEISPIEL III
  • Konstruktion von M13-Phage-Display-Bibliotheken
  • Ein Vektor für den Phage-Display, pAS38 (für seine Karte, siehe 8) wurde wie folgt konstruiert. Das XbaI-BamHI-Fragment von pET12a, codierend für das Signalpeptid von OmpT, wurde an das 5'-Ende des Fn3-Gens kloniert. Die C-terminale Region (von den Oligonukleotiden FN5F und FN5R, siehe Tabelle 2) des Fn3-Gens wurde durch ein neues Fragment ersetzt, das aus den Oligonukleotiden FN5F und FN5R' (Tabelle 2) bestand, und das eine MluI-Stelle und eine Linkersequenz zur Herstellung eines Fusionsproteins mit dem pIII-Protein des Bakteriophagen M13 einführte. Ein Genfragment, das die C-terminale Domäne von M13 pIII codiert, wurde unter Verwendung von PCR (Corey, et al., 1993) aus dem wildtypischen Gen III von M13mp18 hergestellt, und das Fragment wurde am 3'-Ende des OmpT-Fn3-Fusionsgens unter Verwendung der Stellen MluI und HindIII inseriert.
  • Phagen wurden unter Verwendung eines Helferphagen, M13K07, gemäß einem Standardverfahren (Sambrook, et al, 1989) hergestellt und gereinigt, mit dem Unterschied, dass die Phagenpartikel durch eine zweite Polyethylenglykol-Präzipitation gereinigt wurden. Die erfolgreiche Präsentation von Fn3 auf Fusionsphagen wurde mittels ELISA (Harlow & Lane, 1988) bestätigt, wobei ein Antikörper gegen Fibronektin (Sigma) und ein herkömmlicher Anti-FN3-Antikörper (Cocalico Biologicals, PA, USA) verwendet wurden.
  • BEISPIEL IV
  • Bibliotheken, die Schleifenvariationen in der AB-Schleife enthalten
  • Eine Nukleinsäure-Phage-Display-Bibliothek mit Variabilität in der AB-Schleife wird mittels der folgenden Verfahren hergestellt. Die Randomisierung wird durch die Verwendung von Oligonukleotiden erreicht, die eine degenerierte Nukleotidsequenz enthalten. Die Reste, die einer Abwandlung unterzogen werden sollen, werden durch überprüfen der Röntgen- und NMR-Strukturen von Fn3 (Protein Datenbank-Zugangsnummern 1FNA bzw. 1TTF) identifiziert. Oligonukleotide, die NNK für die abgewandelten Reste enthalten, werden synthetisiert (N und K bezeichnen hier ein äquimolares Gemisch von A, T, G und C, bzw. ein äquimolares Gemisch von G und T) (siehe Oligonukleotide BC3, FG2, FG3 und FG4 in Tabelle 2 als Beispiele). Das NNK-Gemisch codiert für alle zwanzig Aminosäuren und ein Stopcodon (TAG). TAG wird jedoch in E. coli XL-1 blue unterdrückt. Einzelsträngige DNAs von pAS38 (und dessen Derivaten) werden unter Verwendung eines Standardprotokolls hergestellt (Sambrook, et al., 1989).
  • Positionsspezifische Mutagenese wird durchgeführt, indem man veröffentlichten Verfahren folgt (siehe z. B. Kunkel, 1985), wobei ein Muta-Gene Kit (BioRad) verwendet wird. Die Bibliotheken werden durch Elektroporation kompetenter Zellen von E. coli XL-1 Blue (200 μl; Stratagene) mit 1 μg der Plasmid-DNA unter Verwendung einer BTX-Elektrozell-Manipulator „ECM 395 1 mm gap"-Küvette konstruiert. Ein Teil der transformierten Zellen wird auf einer LB-Agarplatte ausplattiert, die Ampicillin enthält (100 μg/ml), um die Transformationseffizienz zu bestimmen. Typischerweise werden mit 1 μg an DNA 3 × 108 Transformanten erhalten, und somit enthält eine Bibliothek 108 bis 109 unabhängige Klone. Phagemid-Partikel wurden hergestellt wie oben beschrieben.
  • BEISPIEL V
  • Schleifenvariationen in der BC-, CD-, DE-, EF- oder FG-Schleife
  • Eine Nukleinsäure-Phage-Display-Bibliothek mit fünf variabel veränderten Resten (Reste Nummer 26–30) in der BC-Schleife und eine mit sieben variabel veränderten Resten (Reste Nummer 78–84) in der FG-Schleife wurden unter Verwendung der in Beispiel IV oben beschriebenen Verfahren hergestellt. Andere Nukleinsäure-Phage-Display-Bibliotheken mit Abwandlungen in der CD-, DE- oder EF-Schleife können durch ähnliche Verfahren hergestellt werden.
  • BEISPIEL VI Schleifen-Abwandlungen in der FG- und BC-Schleife
  • Es wurde eine Nukleinsäure-Phage-Display-Bibliothek mit sieben variabel abgewandelten Resten (Reste Nummer 78–84) in der FG-Schleife und fünf variabel abgewandelten Resten (Reste Nummer 26–30) in der BC-Schleife hergestellt. Abwandlungen in der BC-Schleife wurden durch positionsspezifische Mutagenese (Kunkel et al.) unter Verwendung des in Tabelle 1 beschriebenen Oligonukleotids BC3 erzeugt. Mittels Nutzung der BC-Schleifenbibliothek als Ausgangsmaterial und unter Verwendung positionsspezifischer Mutagenese wurden Abwandlungen in der FG-Schleife eingeführt, was somit in Bibliotheken resultiert, die Variationen sowohl der BC- als auch der FG-Schleifen enthalten. Das Oligonukleotid FG2 besitzt die abwandelnden Reste 78–84, und das Oligonukleotid FG4 besitzt die abwandelnden Reste 77–81 und eine Deletion der Reste 82–84.
  • Es wurde eine Nukleinsäure-Phage-Display-Bibliothek mit fünf abgewandelten Resten (Reste 78–84) in der FG-Schleife und einer Deletion von drei Resten (Reste 82–84) in der FG-Schleife, sowie mit fünf abgewandelten Resten (Reste 26–30) in der BC-Schleife hergestellt. Die kürzere FG-Schleife wurde in einem Versuch hergestellt, die Flexibilität der FG-Schleife zu reduzieren; für diese Schleife war durch die NMR-Studien von Main, et al. (1992) gezeigt worden, dass sie in Fn3 hochflexibel ist. Eine hochflexible Schleife kann nachteilig bei der Ausbildung einer Bindungsstelle mit hoher Affinität sein (es wird ein großer Entropie-Verlust bei der Liganden-Bindung erwartet, da die flexible Schleife starrer werden sollte). Außerdem besitzen andere Fn3-Domänen (neben menschlichen) kürzere FG-Schleifen (für das Sequenz-Alignment, siehe 12 in Dickinson et al., (1994)).
  • Die Randomisierung wurde unter Verwendung von Oligonukleotiden erreicht, die eine degenerierte Nukleotidsequenz enthalten (Oligonukleotid BC3 zum Abwandeln der BC-Schleife und Oligonukleotide FG2 und FG4 zum Abwandeln der FG-Schleifen).
  • Es wurde positionsspezifische Mutagenese durchgeführt, indem man veröffentlichten Verfahren folgte (siehe z. B. Kunkel, 1985). Die Konstruktion der Bibliotheken erfolgte durch Elektrotransformation von E. coli XL-1 Blue (Stratagene). Typischerweise enthält eine Bibliothek 108 bis 109 unabhängige Klone. Bibliothek 2 enthält fünf abgewandelte Reste in der BC-Schleife und sieben abgewandelte Reste in der FG-Schleife. Bibliothek 4 enthält fünf abgewandelte Reste in jeder der BC- und FG-Schleifen, und die Länge der FG-Schleife wurde um drei Reste verkürzt.
  • BEISPIEL VII
  • fd-Phage-Display-Bibliotheken, die mit Schleifen-Abwandlungen konstruiert werden
  • Phage-Display-Bibliotheken werden unter Verwendung des fd-Phagen als genetischem Vektor konstruiert. Das Fn3-Gen wird in fUSE5 (Parmley & Smith, 1988) unter Verwendung der Sfil-Restriktionsstellen, die mittels PCR an den 5'- und 3'-Enden des Fn3-Gens eingeführt wurden, inseriert. Die Expression dieses Phagen resultiert in der Präsentation des Fusions-pIII-Proteins auf der Oberfläche des fd-Phagen. Abwandlungen in den Fn3-Schleifen werden unter Verwendung positionsspezifischer Mutagenese wie oben beschrieben, oder durch Subklonieren der in M13-Phagen konstruierten Fn3-Bibiotheken in den fUSE5-Vektor eingeführt.
  • BEISPIEL VIII
  • Weitere Phage-Display-Bibliotheken
  • T7-Phagen-Bibliotheken (Novagen, Madison, WI) und bakterielle Pilus-Expressionssysteme (Invitrogen) sind ebenfalls nützlich, um das Fn3-Gen zu exprimieren.
  • BEISPIEL IX
  • Isolierung von Polypeptiden, die an makromolekulare Strukturen binden
  • Die Selektion von durch Phagen präsentierten Monobodies wurde gemäß den Protokollen von Barbas und Mitarbeitern (Rosenbaum & Barbas, 1995) durchgeführt. Kurz dargestellt, wurde etwa 1 μg eines Zielmoleküls („Antigen") in Natriumcarbonat-Puffer (100 mM, pH 8,5) in den Wells einer Mikrotiterplatte (Maxisorp, Nunc) immobilisiert, indem man übernacht bei 4°C in einem luftdichten Behälter inkubierte. Nach dem Entfernen dieser Lösung wurden die Wells dann mit einer 3%igen Lösung von BSA (Sigma, Fraktion V) in TBS geblockt, indem man die Platte bei 37°C für 1 Stunde inkubierte. Eine Phagemid-Bibliothekslösung (50 μl) mit etwa 1012 Koloniebildenden Einheiten (cfu) an Phagemid wurde für 1 Stunde bei 37°C in jedem Well adsorbiert. Die Wells wurden dann dreimal (einmal für die erste Runde) mit einem geeigneten Puffer gewaschen (typischer Weise TEST, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl und 0,5% Tween20). Gebundener Phage wurde mit einer sauren Lösung (typischerweise 0,1 M Glycin-HCl, pH 2,2; 50 μl) eluiert, und der wiedergewonnene Phage wurde dann umgehend mit 3 μl Tris-Lösung neutralisiert. Alternativ wurde gebundener Phage durch Inkubieren der Wells mit 50 μl an TBS, enthaltend das Antigen (1–10 μM), eluiert. Der wiedergewonnene Phage wurde unter Verwendung des Standard-Protokolls unter Verwendung der XL1Blue-Zellen als Wirt (Sambrook et al.) amplifiziert. Der Selektionsprozess wurde 5-6-mal wiederholt, um positive Klone zu konzentrieren. Nach der letzten Runde wurden einzelne Klone gepickt, und ihre Bindungsaffinitäten und DNA-Sequenzen wurden bestimmt.
  • Die Bindungsaffinitäten der Monobodies an der Phagenoberfläche wurden unter Verwendung der Phagen-ELISA-Technik (Li, et al., 1995) charakterisiert. Wells von Mikrotiterplatten (Nunc) wurden mit einem Antigen beschichtet und mit BSA geblockt. Gereinigte Phagen (108–1011 cfu), die aus einer einzelnen Kolonie hervorgehen, wurden zu jedem Well hinzugegeben und für 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach dem Waschen der Wells mit einem geeigneten Puffer (siehe oben) wurde gebundener Phage durch das Standard-ELISA-Protokoll unter Verwendung von Anti-M13-Antikörper (Kaninchen, Sigma) und Anti-Kaninchen-Ig-Peroxidase-Konjugat (Pierce) detektiert. Die colorimetrischen Assays wurden unter Verwendung von Turbo-TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin, Pierce) als Substrat durchgeführt.
  • Die Bindungsaffinitäten der Monobodies an der Phagenoberfläche wurden unter Verwendung des kompetitiven ELISA-Verfahrens (Djavadi-Ohaniance, et al., 1996) weiter charakterisiert. Bei diesem Versuch wird ein Phagen-ELISA in derselben Weise wie oben beschrieben durchgeführt, mit dem Unterschied, dass die Phagenlösung einen Liganden in variierten Konzentrationen enthält. Die Phagenlösung wurde bei 4°C für eine Stunde inkubiert, bevor die Bindung eines immobilisierten Liganden im Well einer Mikrotiterplatte erfolgte. Die Affinitäten für Monobodies aus dem Phage-Display werden durch die Abnahme des ELISA-Signals abgeschätzt, wenn die freie Ligandenkonzentration erhöht wird.
  • Nach der vorläufigen Charakterisierung von auf der Oberfläche von Phagen präsentierten Monobodies unter Verwendung von Phagen-ELISA wurden Gene für positive Klone in den Expressionsvektor pAS45 subkloniert. E. coli BL21(DE3) (Novagen) wurde mit einem Expressionsvektor (pAS45 und dessen Derivaten) transformiert. Zellen wurden in M9-Minimalmedium und M9-Medium, supplementiert mit Bactotrypton (Difco), enthaltend Ampicillin (200 μg/ml), herangezüchtet. Für die Isotopenmarkierung ersetzten 15N NH4Cl und/oder 13C-Glukose unmarkierte Komponenten. Stabile Isotope wurden bei Isotec und Cambridge Isotope Labs erworben. 500 ml Medium in einem 2 l-Bafflekolben wurden mit 10 ml an Übernachtkultur angeimpft und bei etwa 140 rpm bei 37°C bewegt. IPTG wurde mit einer Endkonzentration von 1 mM hinzugegeben, um die Proteinexpression zu induzieren, wenn die OD (600 nm) etwa 1,0 erreichte. Die Zellen wurden 3 Stunden nach der Zugabe von IPTG durch Zentrifugation geerntet und bis zum Gebrauch gefroren auf –70°C gehalten.
  • Fn3 und Monobodies mit His-Tag wurden wie folgt gereinigt. Zellen wurden in 5 ml/(g Zellen) an 50 mM Tris (pH 7,6), enthaltend 1 mM Phenylmethylsulfonyl-Fluorid, suspendiert. HEL (Sigma, 3× kristallisiert) wurde mit einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml hinzugegeben. Nach Inkubation der Lösung für 30 min bei 37°C wurde diese dreimal für 30 Sekunden auf Eis mit Ultraschall behandelt, um die Zellen aufzubrechen. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 15.000 rpm in einer Sorval RC-2B-Zentrifuge unter Verwendung eines SS-34-Rotors entfernt. Zu der Lösung wird konzentriertes Natriumchlorid mit einer Endkonzentration von 0,5 M hinzugegeben. Die Lösung wurde dann auf einer 1 ml His TrapTM Cheliersäule (Pharmacia) appliziert, die vorab mit Nickelchlorid (0,1 M, 1 ml) beladen worden war, und in dem Tris-Puffer (50 mM, pH 8,0), der 0,5 M Natriumchlorid enthält, äquilibriert. Nach Waschen der Säule mit dem Puffer wurde das gebundene Protein mit einem Tris-Puffer (50 mM, pH 8,0), der 0,5 M Imidazol enthält, eluiert. Der His-Tag-Anteil wurde abgespalten, falls nötig, indem man das Fusionsprotein unter Verwendung des von Novagen (Madison, WI) bereitgestellten Protokolls mit Thrombin behandelte. Fn3 wurde von dem His-Tag-Peptid und Thrombin abgetrennt, wobei dies durch eine Resources®-Säule (Pharmacia) unter Verwendung eines linearen Gradienten aus Natriumchlorid (0–0,5 M) in Natriumacetatpuffer (20 mM, pH 5,0) erfolgte.
  • Kleine Mengen an löslichen Monobodies wurden wie folgt hergestellt. XL-1-Blue-Zellen, die Derivate von pAS38 (Plasmide, die Fn3-pIII-Fusionsproteine codieren) enthalten, wurden in LB-Medium bei 37°C unter heftigem Schütteln vermehrt, bis die OD (600 nm) etwa 1,0 erreichte; IPTG wurde zu der Kultur mit einer Endkonzentration von 1 mM hinzugegeben, und die Zellen wurden übernacht bei 37°C weiter vermehrt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation aus dem Medium entfernt, und der Überstand wurde auf ein mit einem Liganden beschichtetes Mikrotiter-Well appliziert. Obwohl XL-1-Blue-Zellen, die pAS38 und dessen Derivate enthalten, FN3-pIII-Fusionsproteine exprimieren, werden aufgrund der Spaltung des Linkers zwischen den Regionen von Fn3 und pIII durch proteolytische Aktivitäten von E. coli (Rosenblum & Barbas, 1995) auch lösliche Proteine produziert. Die Bindung eines Monobody an den Liganden wurde durch das Standard-ELISA-Protokoll unter Verwendung eines gebräuchlichen Antikörpers gegen Fn3 (erworben von Cocalico Biologicals, Reamstown, PA) untersucht. Lösliche Monobodies, die aus der periplasmatischen Fraktion von E. coli-Zellen unter Verwendung eines Standard-Verfahrens des osmotischen Schocks gewonnen wurden, wurden ebenfalls verwendet.
  • BEISPIEL X
  • Ubiquitin-bindender Monobody
  • Ubiquitin ist ein kleines (76 Reste großes) Protein, das am Abbauweg in Eukaryoten beteiligt ist. Es ist ein globuläres Einzeldomänen-Protein. Hefe-Ubiquitin wurde bei der Sigma Chemical Company erworben und wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
  • Die Bibliotheken 2 und 4, die in Beispiel VI oben beschrieben sind, wurden verwendet, um Ubiquitin-bindende Monobodies zu selektieren. Ubiquitin (1 μg in 50 μl Natriumbicarbonat-Puffer (100 mM, pH 8,5)) wurde in den Wells einer Mikrotiterplatte immobilisiert, gefolgt von Blocken mit BSA (3% in TBS). Das Panning wurde durchgeführt wie oben beschrieben. In den beiden ersten Runden wurde 1 μg Ubiquitin pro Well immobilisiert, und gebundener Phage wurde mit einer sauren Lösung eluiert. Von der dritten bis zur sechsten Runde wurde 0,1 μg an Ubiquitin pro Well immobilisiert, und der Phage wurde entweder mit einer sauren Lösung oder mit TBS, enthaltend 10 μM Ubiquitin, eluiert.
  • Die Bindung der selektierten Klone wurde zunächst im polyklonalen Modus getestet, d. h. vor dem Isolieren einzelner Klone. Selektierte Klone aus allen Bibliotheken zeigten eine signifikante Bindung an Ubiquitin. Diese Ergebnisse sind in 9 dargestellt. Die Bindung des immobilisierten Ubiquitins bei den Klonen wurde durch weniger als 30 μM an löslichem Ubiquitin in den kompetitiven ELISA-Versuchen nahezu vollständig inhibiert (siehe 10). Die Sequenzen der BC- und FG-Schleifen der Ubiquitin-bindenden Monobodies sind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3: Sequenzen Ubiquitin-bindender Monobodies
    Figure 00380001
  • Der Klon 411, der der am stärksten angereicherte Klon war, wurde unter Verwendung von Phagen-ELISA charakterisiert. Der Klon 411 zeigte selektive Bindung und Inhibition der Bindung in Gegenwart von etwa 10 μM Ubiquitin in Lösung (11).
  • BEISPIEL XI
  • Verfahren für die Immobilisierung kleiner Moleküle
  • Zielmoleküle wurden in den Wells einer Mikrotiterplatte (Maxisorp, Nunc) wie hier im Folgenden beschrieben immobilisiert, und die Wells wurden mit BSA geblockt. Zusätzlich zur Verwendung von Trägerprotein wie im Folgenden beschrieben kann ein Konjugat eines Zielmoleküls in Biotin hergestellt werden. Der biotinylierte Ligand kann dann am Well einer Mikrotiterplatte immobilisiert werden, das mit Streptavidin beschichtet wurde.
  • Zusätzlich zur Verwendung eines Trägerproteins wie unten beschrieben könnte man ein Konjugat eines Zielmoleküls und Biotin (Pierce) herstellen und einen biotinylierten Liganden an einem Mikrotiterplatten-Well immobilisieren, das mit Streptavidin beschichtet wurde (Smith and Scott, 1993).
  • Kleine Moleküle können mit einem Trägerprotein, wie etwa Rinderserumalbumin (BSA, Sigma), konjugiert und passiv an dem Mikrotiterplatten-Well adsorbiert werden. Alternativ können auch Verfahren der chemischen Konjugation verwendet werden. Zusätzlich können andere feste Träger als Mikrotiterplatten problemlos verwendet werden.
  • BEISPIEL XII
  • Fluorescein bindender Monobody
  • Fluorescein ist als ein Target für die Selektion von Antikörpern aus kombinatorischen Bibliotheken verwendet worden (Barbas, et al. 1992). NHS-Fluorescein wurde von Pierce erhalten und gemäß den Herstelleranweisungen bei der Herstellung von Konjugaten mit BSA (Sigma) verwendet. Es wurden zwei Typen von Fluorescein-BSA-Konjugaten hergestellt, mit ungefähren molaren Verhältnissen von 17 (Fluorescein) zu eins (BSA).
  • Der Selektionsprozess wurde 5–6-mal wiederholt, um positive Klone zu konzentrieren. Bei diesem Versuch wurde die Phagenbibliothek mit einem Proteingemisch (BSA, Cytochrom C (Sigma, Pferd) und RNaseA (Sigma, Rind), jeweils 1 mg/ml) bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert, bevor die Zugabe zu den Liganden-beschichteten Wells erfolgte. Gebundener Phage wurde in TBS mit 10 4M löslichem Fluorescein anstelle einer sauren Elution eluiert. Nach der letzten Runde wurden einzelne Klone gepickt, und ihre Bindungsaffinitäten (siehe unten) und DNA-Sequenzen wurden bestimmt. Tabelle 4: Klone aus Bibliothek #2
    Figure 00400001
  • Die vorläufige Charakterisierung der Bindungsaffinitäten ausgewählter Klone erfolgte unter Verwendung von Phagen-ELISA und kompetitivem Phagen-ELISA (siehe 12 (Fluorescein-1) und 13 (Fluorescein-2)). Die vier getesteten Klone zeigten eine spezifische Bindung an die mit Ligand beschichteten Wells, und die Bindungsreaktionen werden durch lösliches Fluorescein inhibiert (siehe 13).
  • BEISPIEL XIII
  • Digoxigenin bindender Monobody
  • Digoxigenin-3-O-methyl-carbonyl-e-aminocapronsäure-NHS (Boehringer Mannheim) wird verwendet, um ein Digoxigenin-BSA-Konjugat herzustellen. Die Kopplungsreaktion wird nach Herstelleranweisungen durchgeführt. Das Digoxigenin-BSA-Konjugat wird in den Wells einer Mikrotiterplatte immobilisiert und für das Panning verwendet. Das Panning wird 5 bis 6-mal wiederholt, um bindende Klone anzureichern. Da Digoxigenin in wässriger Lösung nur schwach löslich ist, werden die gebundenen Phagen unter Verwendung saurer Lösung von dem Well eluiert. Siehe Beispiel XIV.
  • BEISPIEL XIV
  • TSAC (Übergangszustandanalogon-Verbindung)-bindende Monobodies
  • Carbonat-hydrolysierende Monobodies werden wie folgt selektiert. Ein Übergangszustandanalogon für die Carbonat-Hydrolyse, 4-Nitrophenylphosphonat, wird durch eine Arbuzov-Reaktion synthetisiert, wie zuvor beschrieben (Jacobs und Schultz, 1987). Das Phosphonat wird dann an das Trägerprotein, BSA, unter Verwendung von Carbodiimid gekoppelt, gefolgt von ausgedehnter Dialyse (Jacobs and Schultz, 1987). Das Hapten-BSA-Konjugat wird in den Wells einer Mikrotiterplatte immobilisiert, und die Monobody-Selektion wird durchgeführt wie oben beschrieben. Die katalytischen Aktivitäten der selektierten Monobodies werden unter Verwendung von 4-Nitrophenylcarbonat als Substrat getestet.
  • Andere Haptene, die nützlich für die Produktion katalytischer Monobodies sind, sind in H. Suzuki (1994) und in N. R. Thomas (1994) zusammengefasst.
  • BEISPIEL XV
  • NMR-Charakterisierung von Fn3 und Vergleich des von Hefe sekretierten Fn3 mit dem von E. coli sekretierten
  • Es wurden Versuche mit Kernspinresonanz (NMR) durchgeführt, um die Kontaktoberfläche zwischen FnAb und einem Zielmolekül zu identifizieren, z. B. von Monobodies gegenüber Fluorescein, Ubiquitin, RNaseA und löslichen Derivaten von Digoxigenin. Diese Information wird dann verwendet, um die Affinität und Spezifität des Monobody zu verbessern. Gereinigte Monobody-Proben werden in einem geeigneten Puffer für die NMR-Spektroskopie gelöst, wobei hierfür eine Amicon Ultrafiltrationszelle mit einer YM-3-Membran verwendet wird. Die Puffer werden mit 90% H2O/10% D2O (destillierte Qualität, Isotec) oder mit 100% D2O hergestellt. Deuterierte Verbindungen (z. B. Acetat) werden verwendet, um starke Signale von diesen zu eliminieren.
  • Die Durchführung der NMR-Versuche erfolgt auf einem Varian Unity INOVA 600 Spektrometer, ausgestattet mit vier RF-Kanälen und einer Dreifach-Resonanzsonde mit Pulsfeldgradienten-Fähigkeit. Die NMR-Spektren werden unter Verwendung von Weiterverarbeitungsprogrammen, wie etwa Felix (Molecular Simulations), nmrPipe, PIPP und CAPP (Garrett, et al., 1991; Delaglio, et al., 1995) auf UNIX-Arbeitsstationen analysiert. Sequenz-spezifische Resonanzzuordnungen erfolgen mittels gut etablierter Strategie unter Verwendung eines Satzes dreifacher Resonanzversuche (CBCA(CO)NH und HNCACB) (Grzesiek & Bax, 1992; Wittenkind & Mueller, 1993).
  • Der Kern-Overhauser-Effekt (NOE) wird zwischen 1H-Kernen beobachtet, die sich näher als etwa 5 A sind, was es einem erlaubt, Informationen über den Abstand zwischen Protonen zu erhalten. Es wird eine Reihe von Doppel- und Dreifach-Resonanzversuchen (Tabelle 5; für jüngere Übersichtsartikel über diese Techniken, siehe Bax & Grzesiek, 1993 und Kay, 1995) durchgeführt, um Zwänge im Bezug auf den Abstand (d. h. NOE) und den Torsionswinkel (J-Kopplung) zu ermitteln. Es werden Isotopen-gefilterte Versuche durchgeführt, um die Resonanzzuordnungen des gebundenen Liganden zu bestimmen und um die Abstandszwänge innerhalb des Liganden und diejenigen zwischen FnAb und dem Liganden zu erhalten. Details der Sequenz-spezifischen Resonanzzuordnungen und der NOE-Peak-Zuordnung sind an anderer Stelle im Detail beschrieben worden (Clore & Gronenborn, 1991; Pascal, et al., 1994b; Metzler, et al., 1996). Tabelle 5. NMR-Versuche zur Strukturbestimmung
    Bezeichnung des Versuchs Referenz
    1. Referenzspektren
    2D-1H, 15N-HSQC (Bodenhausen & Ruben, 1980; Kay, et al., 1992)
    2D-1H, 13C-HSQC (Bodenhausen & Ruben, 1980; Vuister & Bax, 1992)
    2. Rückgrat- und Seitenkettenresonanz-Zuordnungen bei 13C/15N-markiertem Protein
    3D-CBCA(CO)NH (Grzesiek & Bax, 1992)
    3D-HNCACB (Wittenkind & Mueller, 1993)
    3D-C(CO)NH (Logan et al, 1992; Grzesiek et al., 1993)
    3D-H(CCO)NH
    3D-HBHA(CBCACO)NH (Grzesiek & Bax, 1993)
    3D-HCCH-TOCSY (Kay et al., 1993)
    3D-HCCH-COSY (Ikura et al., 1991)
    3D-1H, 15N-TOCSY-HSQC (Zhang et al., 1994)
    2D-HB(CBCDCE)HE (Yamazaki et al., 1993)
    3. Resonanzzuordnungen bei unmarkiertem Liganden
    2D-Isotop-gefilterte 1H-TOCSY
    2D-Isotop-gefilterte 1H-COSY
    2D-Isotop-gefilterte 1H-NOESY (Ikura & Bax, 1992)
    4. Strukturelle Zwänge
    Im markierten Protein
    3D-1H, 15N-NOESY-HSQC (Zhang et al., 1994)
    4D-1H, 13C-HMQC-NOESY-HMQC (Vuister et al., 1993)
    4D-1H, 13C, 15N-HSQC-NOESY-HSQC (Muhandiram et al., 1993; Pascal et al., 1994a)
    Im unmarkierten Liganden
    2D-Isotop-gefilterte 1H-NOESY (Ikura & Bax, 1992)
    Interaktionen zwischen Protein und Ligand
    3D-Isotop-gefilterte 1H, 15N-NOESY-HSQC
    3D-Isotop-gefilterte 1H, 13C-NOESY-HSQC (Lee et al., 1994)
    5. Torsionswinkel-Zwänge
    J-modulierte 1H, 15N-HSQC (Billeter et al., 1992)
    3D-HNHB (Archer et al., 1991)
  • Die Rückgrat-1H-, 15N- und 13C-Resonanz-Zuordnungen für einen Monobody werden mit denjenigen von wildtypischem Fn3 verglichen, um strukturelle Veränderungen bei der Mutante zu bestimmen. Sobald diese Daten bestätigen, dass die Mutante die allgemeine Struktur beibehält, wird eine strukturelle Verfeinerung unter Verwendung experimenteller NOE-Daten durchgeführt. Da erwartet wird, dass der strukturelle Unterschied bei einem Monobody gering ist, kann die wildtypische Struktur als das Ausgangsmodell verwendet werden, nachdem die Aminosäuresequenz modifiziert wurde. Die Mutationen werden durch interaktives molekulares Modellieren in die wildtypische Struktur eingeführt, und dann wird bei der Struktur unter Verwendung eines Programms des molekularen Modellierens, wie etwa Quants (Molecular Simulations), eine Energie- Minimierung vorgenommen. Die Lösungsstruktur wird unter Verwendung von Zyklen des dynamischen simulierten Annealing (Nilges et al., 1988) mit dem Programm X-PLOR (Brunger, 1992) verfeinert. Typischerweise wird eine Gesamtheit von fünfzig Strukturen berechnet. Die Gültigkeit der verfeinerten Strukturen wird durch Berechnen einer kleineren Anzahl von Strukturen von zufällig erzeugten Anfangsstrukturen in X-PLOR unter Verwendung des YASAP-Protokolls (Nilges, et al., 1991) bestätigt. Die Struktur eines Monobody-Ligaeden-Komplexes wird berechnet, indem man zunächst beide Komponenten einzeln unter Verwendung intramolekularer NOEs verfeinert und die beiden dann unter Verwendung intermolekularer NOEs verbindet.
  • Beispielsweise ist das 1H,15N-HSQC-Spektrum für den Fluorescein-bindenden Antikörper LB25.5 in 14 gezeigt. Das Spektrum zeigt eine gute Verteilung (die Peaks sind verteilt), was anzeigt, dass LB25.5 in eine globuläre Konformation gefaltet wird. Weiterhin ähnelt das Spektrum demjenigen für wildtypisches Fn3, was anzeigt, dass die Gesamtstruktur von LB25.5 ähnlich derjenigen von Fn3 ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Liganden-bindenden Monobodies erhalten werden können, ohne die Gesamtfaltung des Fn3-Gerüsts zu verändern.
  • Versuche einer Störung der chemischen Verschiebung werden durchgeführt, indem man den Komplex zwischen einem Isotop-markierten FnAb und einem unmarkierten Liganden ausbildet. Die Ausbildung eines stöchiometrischen Komplexes wird verfolgt, indem man das HSQC-Spektrum aufzeichnet. Da die chemische Verschiebung extrem empfindlich gegenüber der Kernumgebung ist, resultiert die Ausbildung eines Komplexes für gewöhnlich in wesentlichen Änderungen der chemischen Verschiebung für die Resonanzen von Aminosäureresten in der Grenzfläche. Es werden Isotopen-editierte NMR-Versuche (2D HSQC und 3D CBCA(CO)NH) verwendet, um die Resonanzen zu identifizieren, die bei der markierten Komponente des Komplexes gestört werden; d. h. bei dem Monobody. Obwohl die Möglichkeit von Artefakten aufgrund konformativer Veränderungen mit großer Reichweite stets berücksichtigt werden muss, so werden wesentliche Unterschiede für Reste, die sich an zusammenhängenden Oberflächen häufen, mit größter Wahrscheinlichkeit aus direkten Kontakten entstehen (Chen et al., 1993; Gronenborn & Clore, 1993).
  • Ein alternatives Verfahren zur Kartierung der Interaktionsoberfläche verwendet Messungen des Amid-Wasserstoff-Austauschs (HX). Die HX-Raten für jedes Amidproton werden für sowohl freien 15N-markierten Monobody als auch für mit einem Liganden komplexierten Monobody gemessen. Es wird erwartet, dass die Liganden-Bindung in verminderten Amid-HX-Raten für Monobody-Reste in der Grenzfläche zwischen den beiden Proteinen resultiert und somit die Bindungsoberfläche identifiziert. Die HX-Raten für Monobodies in dem Komplex werden gemessen, indem man es gestattet, dass HX nach vom Transfer des Komplexes auf D2O für eine variable Zeitspanne stattfindet; der Komplex wird dissoziiert, indem man den pH verringert, und das HSQC- Spektrum wird bei niedrigem pH aufgezeichnet, wo Amid-HX langsam ist. Fn3 ist stabil und bei niedrigem pH löslich, was der Vorbedingung für die Versuche gerecht wird.
  • BEISPIEL XVI
  • Konstruktion und Analyse eines für Ubiquitin spezifischen Fn3-Display-Systems
  • Es wurde ein Fn3-Display-System erstellt und synthetisiert, Ubiquitin-bindende Klone wurden isoliert, und eine wesentliche Fn3-Mutante unter diesen Klonen wurde biophysikalisch charakterisiert.
  • Die Genkonstruktion und der Phage-Display von Fn3 wurden durchgeführt wie in den Beispielen I und II oben. Das Fn3-Phagen-pIII-Fusionsprotein wurde über einen Phagemid-Display-Vektor exprimiert, während die anderen Komponenten des M13-Phagen, einschließlich des wildtypischen pIII, unter Verwendung eines Helferphagen (Bass et al., 1990) produziert wurden. Somit sollte ein durch dieses System erzeugter Phage weniger als eine Kopie von Fn3, das auf der Oberfläche präsentiert wird, enthalten. Die Oberflächenpräsentation von Fn3 auf dem Phagen wurde mittels ELISA unter Verwendung eines Anti-Fn3-Antikörpers detektiert. Nur Phagen, die den Fn3-pIII-Fusionsvektor enthalten, reagierten mit dem Antikörper.
  • Nachdem bestätigt wurde, dass die Phagenoberfläche Fn3 präsentiert, wurde eine Phage-Display-Bibliothek von Fn3 konstruiert wie in Beispiel III. Es wurden zufällige Sequenzen in die BC- und FG-Schleifen eingeführt. Bei der ersten Bibliothek wurden fünf Reste (77–81) nach dem Zufallsprinzip verändert, und drei Reste (82–84) wurden aus der FG-Schleife deletiert. Die Deletion hatte den Zweck, die Flexibilität zu reduzieren und die Bindungsaffinität der FG-Schleife zu verbessern. Es wurden außerdem fünf Reste (26–30) in der BC-Schleife nach Zufallsprinzip verändert, um eine größere Kontaktoberfläche mit dem Zielmolekül bereitzustellen. Somit enthält die resultierende Bibliothek fünf nach Zufallsprinzip veränderte Reste in jeder der Schleifen BC und FG (Tabelle 6). Diese Bibliothek enthielt etwa 108 unabhängige Klone.
  • Durchmusterung der Bibliothek
  • Die Bibliothek wurde unter Verwendung von Ubiquitin als Zielmolekül durchmustert. Bei jeder Runde des Panning wurden Fn3-Phagen an eine mit Ubiquitin beschichtete Oberfläche adsorbiert, und gebundene Phagen wurden in kompetitiver Weise mit löslichem Ubiquitin eluiert. Das Wiedergewinnungsverhältnis verbesserte sich von 4,3 × 10–7 in der zweiten Runde auf 4,5 × 10–6 in der fünften Runde, was eine Anreicherung der bindenden Klone nahelegt. Nach fünf Runden des Panning wurden die Aminosäuresequenzen der einzelnen Klone bestimmt (Tabelle 6). Tabelle 6. Sequenzen in den abgewandelten Schleifen angereicherter Klone
    Figure 00460001
    • aN bezeichnet ein äquimolares Gemisch aus A, T, G und C; K bezeichnet ein äquimolares Gemisch aus G und T.
  • Ein als Ubi4 bezeichneter Klon dominierte den angereicherten Pool der Fn3-Varianten. Daher wurde die weitere Untersuchung auf diesen Ubi4-Klon fokussiert. Ubi4 enthält vier Mutationen in der BC-Schleife (Arg 30 in der BC-Schleife war konserviert), sowie fünf Mutationen und drei Deletionen in der FG-Schleife. Somit waren 13% (12 von 94) der Reste in Ubi4 gegenüber der Wildtypsequenz verändert.
  • 15 zeigt eine Phagen-ELISA-Analyse von Ubi4. Der Ubi4-Phage bindet an das Zielmolekül, Ubiquitin, mit einer signifikanten Affinität, wogegen ein Phage, der die wildtypische Fn3-Domäne präsentiert, oder ein Phage ohne präsentierte Moleküle wenig detektierbare Bindung an Ubiquitin zeigt (15a). Zusätzlich zeigte der Ubi4-Phage ein etwas erhöhtes Niveau der Hintergrundbindung an der Kontrolloberfläche, der die Ubiquitin-Beschichtung fehlte. Ein Experiment mit kompetitivem ELISA zeigt, dass die IC50 (Konzentration an freiem Liganden, die eine 50%ige Inhibition der Bindung bewirkt) der Bindungsreaktion etwa 5 μM beträgt (15b). BSA, Rinder-Ribonuklease A und Cytochrom C zeigen wenig Inhibition der Ubi4-Ubiquitin-Bindungsreaktion (15c), was anzeigt, dass die Bindungsreaktion von Ubi4 an Ubiquitin aus spezifischer Bindung resultiert.
  • Charakterisierung einer Mutanten von Fn3-Protein
  • Das Expressionssystem erbrachte 50–100 mg an Fn3-Protein pro Liter Kultur. Ein ähnliches Mengenniveau der Proteinexpression wurde für den Ubi4-Klon und andere mutante Fn3-Proteine beobachtet.
  • Ubi4-Fn3 wurde als ein unabhängiges Protein exprimiert. Obwohl eine Mehrheit von Ubi4 in E. coli als ein lösliches Protein exprimiert wurde, so wurde für seine Löslichkeit herausgefunden, dass diese signifikant reduziert ist, wenn man sie mit der von wildtypischem Fn3 verglich. Ubi4 war bei niedrigem pH-Wert mit bis zu –20 μM löslich, mit viel geringerer Löslichkeit bei neutralem pH-Wert. Diese Löslichkeit war nicht hoch genug für eine detaillierte strukturelle Charakterisierung unter Verwendung von NMR-Spektroskopie oder Röntgenkristallographie.
  • Die Löslichkeit des Ubi4-Proteins wurde verbessert, indem man einen Löslichkeitsschwanz, GKKGK, als C-terminale Verlängerung anfügte. Das Gen für Ubi4-Fn3 wurde unter Verwendung von PCR in den Expressionsvektor pAS45 subkloniert. Der C-terminale Löslichkeits-Tag, GKKGK, wurde bei diesem Schritt eingebaut. E. coli BL21 (DE3) (Novagen) wurde mit dem Expressionsvektor (pAS45 und dessen Derivate) transformiert. Die Zellen wurden in M9-Minimalmedium und M9-Medium, das mit Bactotrypton (Difco), enthaltend Ampicillin (200 μg/ml), supplementiert war, vermehrt. Für die Isotopenmarkierung ersetzte 15N NH4Cl das unmarkierte NH4Cl in den Medien. 500 ml Medium in einem 2 Liter großen Baffle-Kolben wurden mit 10 ml an Übernachtkultur angeimpft und bei 37°C geschüttelt. IPTG wurde mit einer Endkonzentration von 1 mM hinzugegeben, um die Proteinexpression zu starten, wenn die OD (600 nm) eins erreicht. Die Zellen wurden 3 Stunden nach der Zugabe von IPTG durch Zentrifugation geerntet und bis zur Verwendung gefroren bei –70°C gelagert.
  • Proteine wurden wie folgt gereinigt. Die Zellen wurden in 5 ml/(g Zellen) an Tris (50 mM, pH 7,6), enthaltend Phenylmethylsulfonyl-Fluorid (1 mM), suspendiert. Hühnereiweiß-Lysozym (Sigma) wurde mit einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml hinzugegeben. Nach dem Inkubieren der Lösung für 30 Minuten bei 37°C wurde diese dreimal für 30 Sekunden auf Eis mit Ultraschall behandelt. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation entfernt. Konzentriertes Natriumchlorid wurde mit einer Endkonzentration von 0,5 M zu der Lösung hinzugegeben. Die Lösung wurde auf eine Hi-Trap-Cheliersäule (Pharmacia) aufgetragen, die vorab mit Nickel beladen und in dem Tris-Puffer, enthaltend Natriumchlorid (0,5 M), äquilibriert worden war. Nach dem Waschen der Säule mit dem Puffer wurde His-Tag-Fn3 eluiert, wobei der Puffer 500 mM Imidazol enthielt. Das Protein wurde unter Verwendung einer ResourceS-Säule (Pharmacia) mit einem NaCl-Gradienten in einem Natriumacetatpuffer (20 mM, pH 4,6) weiter gereinigt.
  • Mit dem GKKGK-Schwanz (SEQ ID NO: 109) wurde die Löslichkeit des Ubi4-Proteins auf bis zu über 1 mM bei niedrigem pH-Wert und auf bis zu –50 μM bei neutralem pH-Wert gestei gert. Daher wurden weitere Analysen an Ubi4 mit seiner C-terminalen Verlängerung (hier im Folgenden als Ubi4-K bezeichnet) durchgeführt. Es ist berichtet worden, dass die Löslichkeit eines Minibody signifikant gesteigert werden kann, indem man drei Lys-Reste an den N- oder C-Terminus anfügt (Bianchi et al., 1994). Im Falle des Proteins Rop ist ein nicht-strukturierter C-terminaler Schwanz entscheidend für das Aufrechterhalten der Löslichkeit (Smith et al., 1995).
  • Die Oligomerisierungszustände des Ubi4-Proteins wurden unter Verwendung einer Größenausschlusssäule bestimmt. Das wildtypische Fn3-Protein war bei niedrigen und neutralen pH-Werten monomer. Jedoch war der Peak des Ubi4-K-Proteins signifikant breiter als der von wildtypischem Fn3 und eluierte nach dem wildtypischen Protein. Dies deutet auf Interaktionen zwischen Ubi4-K und dem Säulenmaterial hin, was die Verwendung von Größenausschlusschromatographie zur Bestimmung des Oligomerisierungszustands von Ubi4 ausschließt. NMR-Studien legen nahe, dass das Protein bei niedrigem pH-Wert monomer ist.
  • Das Ubi4-K-Protein behielt eine Bindungsaffinität an Ubiquitin bei, wie durch ELISA bewertet (15d). Jedoch scheiterte ein Versuch zur Bestimmung der Dissoziationskonstante unter Verwendung eines Biosensors (Affinity Sensors, Cambridge, U. K.) aufgrund einer hohen Hintergrundbindung von Ubi4-K-Fn3 an die Sensormatrix. Diese Matrix besteht hauptsächlich aus Dextran, was mit unserer Beobachtung übereinstimmt, dass Interaktionen zwischen Ubi4-K und dem quervernetzten Dextran der Größenausschlusssäule stattfinden.
  • Beispiel XVII
  • Stabilitätsmessungen bei Monobodies
  • Durch Guanidin-Hydrochlorid (GuHCl) induzierte Entfaltungsreaktionen und Reaktionen erneuter Faltung wurden durch Messen der Tryptophan-Fluoreszenz verfolgt. Die Durchführung der Versuche erfolgte auf einem Spectronic AB-2 Spektrofluorometer, das mit einer Motorbetriebenen Spritze (Hamilton Co.) ausgestattet war. Die Küvettentemperatur wurde auf 30°C gehalten. Das Spektrofluorometer und die Spritze wurden durch einen Einzelcomputer unter Verwendung eines im Haus hergestellten Interface kontrolliert. Dieses System nimmt automatisch eine Reihe von Spektren nach der GuHCl-Titration auf. Ein Versuch startete mit 1,5 ml Pufferlösung, die 5 μM an Protein enthielt. Ein Emissionsspektrum (300–400 nm; Anregung bei 290 nm) wurde nach einer Verzögerungszeit (3–5 Minuten) nach jeder Injektion (50 oder 100 μl) einer GuHCl enthaltenden Pufferlösung aufgezeichnet. Diese Schritte wurden wiederholt, bis das Lösungsvolumen die vollständige Kapazität einer Küvette (3,0 ml) erreicht hatte. Die Fluoreszenzintensitäten wurden als Verhältnisse gegenüber der Intensität an einem isofluoreszenten Punkt, der in separaten Versuchen bestimmt wurde, normalisiert. Die Entfaltungskurven wurden mittels ei nes Zwei-Zustands-Modells unter Verwendung einer nicht-linearen Least-Squares-Routine (Santoro & Bolen, 1988) angepasst. Zwischen den Versuchen mit Verzögerungszeiten (Zeit zwischen einer Injektion und dem Beginn der Aufnahme des Spektrums) von 2 Minuten und 10 Minuten wurden keine signifikanten Unterschiede beobachtet, was anzeigt, dass die Entfaltungs/Rückfaltungsreaktionen bei den verwendeten Verzögerungszeiten bei jedem Konzentrationspunkt nahezu ein Gleichgewicht erreichten.
  • Die konformative Stabilität von Ubi4-K wurde unter Verwendung des oben beschriebenen GuHCl-induzierten Entfaltungsverfahrens gemessen. Die Messungen wurden unter zwei Sätzen von Bedingungen durchgeführt; erstens bei einem pH von 3,3 in Gegenwart von 300 mM Natriumchlorid, wo Ubi4-K hochgradig löslich ist, und zweitens in TBS, das für die Bibliotheksdurchmusterung verwendet wurde. Unter beiden Bedingungen war die Entfaltungsreaktion reversibel, und wir detektierten keine Anzeichen der Aggregation oder irreversiblen Entfaltung. 16 zeigt die Entfaltungsübergänge von Ubi4-K und wildtypischem Fn3 mit dem N-terminalen (His)6-Tag und dem C-terminalen Löslichkeits-Tag. Die Stabilität des wildtypischen Fn3 wurde durch die Anfügung dieser Tags nicht signifikant beeinflusst. Parameter, die die Entfaltungsübergänge charakterisieren, sind in Tabelle 7 aufgelistet. Tabelle 7. Stabilitätsparameter für Ubi4 und wildtypisches Fn3, wie bestimmt durch GuHCl-induzierte Entfaltung
    Protein ΔG0 (kcal mol–1) mG (kcal mol–1 M–1)
    Ubi4 (pH 7,5) 4,8 ± 0,1 2,12 ± 0,04
    Ubi4 (pH 3,3) 6,5 ± 0,1 2,07 ± 0,02
    Wildtyp (pH 7,5) 7,2 ± 0,2 1,60 ± 0,04
    Wildtyp (pH 3,3) 11,2 ± 0,1 2,03 ± 0,02
    ΔG0 ist die freie Energie der Entfaltung in Abwesenheit von Denaturierungsmittel; mG ist die Abhängigkeit der freien Energie der Entfaltung von der GuHCl-Konzentration. Für die Lösungsbedingungen, siehe Figur 4 Bildlegende.
  • Obwohl die eingeführten Mutationen in den beiden Schleifen die Stabilität von Ubi4-K im Vergleich zum wildtypischen Fn3 natürlich verringerten, bleibt die Stabilität von Ubi4 vergleichbar mit der eines „typischen" globulären Proteins. Es ist außerdem anzumerken, dass die Stabilität des wildtypischen Proteins und des Ubi4-K-Proteins bei pH 3,3 größer war als bei pH 7,5.
  • Das Ubi4-Protein besaß im Vergleich zu wildtypischem Fn3 eine signifikant reduzierte Löslichkeit, jedoch wurde die Löslichkeit durch das Anfügen eines Löslichkeitsschwanzes verbessert. Da die beiden mutierten Schleifen die einzigen Unterschiede zwischen wildtypischem Protein und den Ubi4-Proteinen umfassen, müssen diese Schleifen den Ursprung der reduzierten Löslichkeit darstellen. An diesem Punkt ist nicht klar, ob die Aggregation von Ubi4-K durch Interaktionen zwischen den Schleifen oder durch Interaktionen zwischen den Schleifen und den nicht variablen Regionen des Fn3-Gerüsts verursacht wird.
  • Das Ubi4-K-Protein behielt die allgemeine Faltung von Fn3 bei, was zeigt, dass dieses Gerüst eine große Anzahl von Mutationen in den zwei getesteten Schleifen beherbergen kann. Obwohl die Stabilität des Ubi4-K-Proteins signifikant niedriger ist als die des wildtypischen Fn3-Proteins, so besitzt das Ubi4-Protein nach wie vor eine konformative Stabilität, die mit derjenigen für kleine globuläre Proteine vergleichbar ist. Die Verwendung einer hochstabilen Domäne als Gerüst ist klar vorteilhaft für die Einführung von Mutationen, ohne dabei die allgemeine Faltung des Gerüsts zu beeinflussen. Zusätzlich ist die von GuHCl induzierte Entfaltung des Ubi4-Proteins nahezu vollständig reversibel. Dies erlaubt die Präparation eines korrekt gefalteten Proteins, selbst wenn eine Fn3-Mutante in einer falsch gefalteten Form, wie etwa in Einschlusskörpern, exprimiert wird. Die mäßige Stabilität von Ubi4 bei Bedingungen, die für die Bibliotheksdurchmusterung verwendet werden, zeigt an, dass Fn3-Varianten auf der Phagenoberfläche gefaltet werden. Dies legt nahe, dass ein Fn3-Klon durch seine Bindungsaffinität in der gefalteten Form, nicht in einer denaturierten Form, selektiert wird. Dickinson et al. schlugen vor, dass Val 29 und Arg 30 in der BC-Schleife Fn3 stabilisieren. Val 29 stellt den Kontakt mit dem hydrophoben Kern her, und Arg 30 bildet Wasserstoffbindungen mit Gly 52 und Val 75 aus. In Ubi4-Fn3 ist Val 29 durch Arg ersetzt, während Arg 30 konserviert wird. Die FG-Schleife wurde auch in der Bibliothek mutiert. Diese Schleife ist in der wildtypischen Struktur flexibel und zeigt eine große Variation der Länge unter humanen Fn3-Domänen (Main et al., 1992). Diese Beobachtungen legen nahe, dass Mutationen in der FG-Schleife weniger Einfluss auf die Stabilität besitzen könnten. Zusätzlich ist der N-terminale Schwanz von Fn3 benachbart zu der molekularen Oberfläche, die von den Schleifen BC und FG ausgebildet wird (1 und 17) und bildet keine gut definierte Struktur aus. Für Mutationen im N-terminalen Schwanz würde nicht erwartet, dass sie stark schädliche Wirkungen auf die Stabilität besitzen. Somit könnten Reste im N-terminalen Schwanz gute Stellen für die Einführung zusätzlicher Mutationen sein.
  • Beispiel XVIII
  • NMR-Spektroskopie von Ubi4-Fn3
  • Ubi4-Fn3 wurde unter Verwendung einer Amicon-Ultrafiltrationseinheit in [2H]-Gly-HCl-Puffer (20 mM, pH 3,3), enthaltend NaCl (300 mM), gelöst. Die endgültige Proteinkonzentration betrug 1 mM. Es wurden NMR-Versuche auf einem Varian Unity 'NOVA 600 Spektrometer durchgeführt, das mit einer Dreifach-Resonanzsonde mit Pulsfeldgradient ausgestattet war. Die Sondentemperatur wurde auf 30°C eingestellt. Es wurden HSQC-, TOCSY-HSQC- und NOESY-HSQC-Spektren unter Verwendung veröffentlichter Verfahren (Kay et al., 1992; Zhang et al., 1994) aufgezeichnet. Die NMR-Spektren wurden unter Verwendung der Software NMRPipe und NMR View (Johnson & Blevins, 1994; Delaglio et al., 1995) auf UNIX-Arbeitsstationen weiterverarbeitet und analysiert. Sequenz-spezifische Resonanzzuordnungen erfolgten unter Verwendung von Standardprozeduren (Wüthrich, 1986; Clore & Gronenborn, 1991). Die Zuordnungen für wildtypisches Fn3 (Baron et al., 1992) wurden unter Verwendung eines 15N-markierten Proteins, das in Natriumacetatpuffer (50 mM, pH 4,6) gelöst war, bei 30°C bestätigt.
  • Die dreidimensionale Struktur von Ubi4-K wurde unter Verwendung dieses heteronukleären NMR-Spektroskopieverfahrens charakterisiert. Ein Spektrum von hoher Qualität kann mit einer 1 mM Lösung von 15N-markiertem Ubi4 (17a) bei niedrigem pH aufgenommen werden. Die Linienbreite der Amidpeaks von Ubi4-K war ähnlich der von wildtypischem Fn3, was nahelegt, dass Ubi4-K unter den verwendeten Bedingungen monomer ist. Vollständige Zuordnungen für Rückgrat 1H- und 15N-Kerne wurden unter Verwendung von Standard-1H,15N-Doppelresonanztechniken erreicht, mit Ausnahme einer Reihe von His-Resten im N-terminalen (His)6-Tag. Es gab wenige schwache Peaks im HSQC-Spektrum, die aus einer geringer vorhandenen Spezies zu stammen schienen, die den N-terminalen Met-Rest enthält. Die Analyse mittels Massenspektroskopie zeigte, dass eine Mehrheit von Ubi4-K den N-terminalen Met-Rest nicht enthielt. 17 zeigt bei den 1HN- und 15N-bezogenen chemischen Verschiebungen Unterschiede zwischen Ubi4-K und wildtypischem Fn3. Es lassen sich nur kleine Unterschiede bei den chemischen Verschiebungen beobachten, mit Ausnahme solcher in und nahe der mutierten BC- und FG-Schleifen. Diese Ergebnisse zeigen klar an, dass Ubi4-K die allgemeine Faltung von Fn3 beibehält, und dies trotz der ausgedehnten Mutationen in den zwei Schleifen. Einige wenige Reste in der N-terminalen Region, die nah zu den zwei mutierten Schleifen ist, zeigen ebenfalls signifikante chemische Unterschiede zwischen den beiden Proteinen. Ein HSQC-Spektrum wurde außerdem an einer 50 μM-Probe von Ubi4-K in TBS aufgezeichnet. Dieses Spektrum war ähnlich zu demjenigen, das bei niedrigem pH gewonnen wurde, was anzeigt, dass die allgemeine Konformation von Ubi4 zwischen pH 7,5 und 3,3 aufrecht erhalten wird.
  • Die vorstehende detaillierte Beschreibung und die Beispiele sind nur für die Klarheit des Verständnisses angegeben worden. Es sind keine unnötigen Einschränkungen daraus abzuleiten. Die Erfindung ist nicht auf die gezeigten und beschriebenen exakten Details beschränkt, da Abwandlungen, die für den Fachmann ersichtlich sind, in die durch die Ansprüche definierte Erfindung einbezogen sind.
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Claims (43)

  1. Fibronektin-Typ-III-(Fn3-)Polypeptid-Monobody, umfassend eine Vielzahl an Fn3-β-Strang-Domänensequenzen, die mit einer Vielzahl von Schleifenbereichsequenzen verbunden sind, wobei sich eine oder mehrere der Schleifenbereichsequenzen des Monobody durch Deletion, Insertion oder Austausch von wenigstens zwei Aminosäuren von den entsprechenden Schleifenbereichsequenzen im Wildtyp-Fn3 unterscheidet und in der Lage ist, an einen spezifischen Bindungspartner (SBP) unter Ausbildung eines Peptid:SBP-Komplexes oder an eine Übergangszustandanalogon(TSAC)-Verbindung zu binden.
  2. Monobody nach Anspruch 1, wobei das Fn3 die zehnte Typ-III-Domäne von humanem Fibronektin umfaßt.
  3. Monobody nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei wenigstens ein Schleifenbereich des Monobody in der Lage ist, an einen spezifischen Bindungspartner (SBP) unter Ausbildung eines Polypeptid:SBP-Komplexes mit einer Dissoziationskonstante von weniger als 10–6 Mol/Liter zu binden.
  4. Monobody nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei wenigstens ein Schleifenbereich des Monobody in der Lage ist, eine chemische Reaktion mit einer katalytischen Konstante (kcat) und einer nicht katalytischen Konstante (kuncat) so zu katalysieren, daß das Verhältnis von kcat/kuncat größer als 10 ist.
  5. Monobody nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei einer oder mehrere der Schleifenbereiche die Aminosäurereste umfaßt: i) von 15 bis 16 in einer AB-Schleife eingeschlossen, ii) von 22 bis 30 in einer BC-Schleife eingeschlossen, iii) von 39 bis 45 in einer CD-Schleife eingeschlossen, iv) von 51 bis 55 in einer DE-Schleife eingeschlossen, v) von 60 bis 66 in einer EF-Schleife eingeschlossen und/oder vi) von 76 bis 87 in einer FG-Schleife eingeschlossen.
  6. Monobody nach einem der Ansprüche 1–5, wobei einer oder mehrere der Schleifenbereiche die FG- und/oder BC-Schleifen umfassen, wie sie in Anspruch 5 definiert sind.
  7. Monobody nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei sich die Schleifenbereichsequenzen des Monobody von den Wildtyp-Fn3-Schleifenbereichsequenzen durch die Deletion oder den Austausch von wenigstens 2 Aminosäuren unterscheiden.
  8. Monobody nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei sich die Schleifenbereichsequenzen des Monobody von den Wildtyp-Fn3-Schleifenbereichsequenzen durch die Insertion von 3 bis 25 Aminosäuren unterscheiden.
  9. Verfahren zur Herstellung eines Fibronektin-Typ-III-(Fn3-)Polypeptid-Monobody nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei dem man: (a) eine DNA-Sequenz bereitstellt, die eine Vielzahl der Fn3-β-Strang-Domänensequenzen, die mit einer Vielzahl von Schleifenbereichsequenzen verbunden sind, codiert, wobei wenigstens ein Schleifenbereich eine singuläre Restriktionsenzymstelle enthält, (b) die DNA-Sequenz an der nur einmal vorhandenen Restriktionsstelle schneidet, (c) in die Restriktionsstelle ein DNA-Segment einfügt, das ein Peptid codiert, welches in der Lage ist, an einen Liganden zu binden, wie z. B. an einen spezifischen Bindungspartner (SBP) oder an ein Übergangszustandanalogon (TSAC), um so ein DNA-Molekül hervorzubringen, welches das Segment und die DNA-Sequenz von (a) umfaßt, und (d) das DNA-Molekül exprimiert, um so den Polypeptid-Monobody hervorzubringen.
  10. Verfahren zur Herstellung eines Fibronektin-Typ-III-(Fn3-)Polypeptid-Monobody nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem man: (a) eine replizierbare DNA-Sequenz bereitstellt, die eine Vielzahl der Fn3-β-Strang-Domänensequenzen, die mit einer Vielzahl der Schleifenbereichsequenzen verbunden sind, codiert, wobei die Nukleotidsequenz von wenigstens einem Schleifenbereich bekannt ist, (b) Primer für die Polymerasekettenreaktion (PCR) herstellt, die zu der bekannten Schleifensequenz hinreichend komplementär sind, um unter PCR-Bedingungen hybridisierbar zu sein, wobei wenigstens einer der Primer eine modifizierte Nukleinsäuresequenz enthält, die in die DNA eingefügt werden soll, (c) eine PCR unter Verwendung der DNA-Sequenz von (a) und den Primern von (b) durchführt, (d) die Reaktionsprodukte von (c) anhybridisiert und verlängert, um so ein DNA-Produkt zu erhalten, und (e) den Polypeptid-Monobody, der von dem DNA-Produkt von (d) codiert wird, exprimiert.
  11. Verfahren zur Herstellung eines Fibronektin-Typ-III-(Fn3-)Polypeptid-Monobody nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem man: (a) eine replizierbare DNA-Sequenz bereitstellt, die eine Vielzahl von Fn3-β-Strang-Domänensequenzen, die mit einer Vielzahl von Schleifenbereichsequenzen verbunden sind, codiert, wobei die Nukleotidsequenz von wenigstens einem Schleifenbereich bekannt ist, (b) eine ortspezifische Mutagenese von wenigstens einem Schleifenbereich durchführt, um so eine DNA-Sequenz mit einer Insertionsmutation zu erzeugen, und (c) den Polypeptid-Monobody, der von der DNA-Sequenz mit der Insertionsmutation codiert wird, exprimiert.
  12. Nukleinsäuresequenz, wie z. B. die DNA-Sequenz, die einen Polypeptid-Monobody nach einem der Ansprüche 1 bis 8 codiert.
  13. Nukleinsäuresequenz, die eine variable Sequenz aus von 6 bis 75 Nukleinsäurebasen umfaßt, die in einen Beliebigen der Schleifenbereiche eines Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 12 eingefügt ist.
  14. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 13, die so konstruiert ist, daß vermieden wird, daß ein oder mehrere Codons entweder Cystein oder das Stop-Codon codieren.
  15. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 13 oder 14, wobei die variable Nukleinsäuresequenz in der AB-Schleife angeordnet ist.
  16. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 13 oder 14, wobei die variable Nukleinsäuresequenz in der BC-Schleife angeordnet ist.
  17. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 13 oder 14, wobei die variable Nukleinsäuresequenz in der CD-Schleife angeordnet ist.
  18. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 13 oder 14, wobei die variable Nukleinsäuresequenz in der DE-Schleife angeordnet ist.
  19. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 13 oder 14, wobei die variable Nukleinsäuresequenz in der EF-Schleife angeordnet ist.
  20. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 13 oder 14, wobei die variable Nukleinsäuresequenz in der FG-Schleife angeordnet ist.
  21. Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 12 bis 20, wobei die Fn3-β-Strang-Domänensequenzen, die mit einer Vielzahl von Schleifenbereichsequenzen verbunden sind, die SEQ ID NO: 111 umfassen.
  22. Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 12 bis 20, wobei die Fn3-β-Strang-Domänensequenzen, die mit einer Vielzahl von Schleifenbereichsequenzen verbunden sind, die SEQ ID NO: 114 umfassen.
  23. Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 12 bis 22, wobei einer oder mehrere der Monobody-Schleifenbereichsequenzen RYDR umfassen, welche die Basen 5 bis 9 von SEQ ID NO: 1 sind.
  24. Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 12 bis 22, wobei einer oder mehrere der Monobody-Schleifenbereichsequenzen AVVSYY umfassen, welche die Basen 4 bis 9 von SEQ ID NO: 2 sind.
  25. Expressionsvektor, umfassend eine Expressionskassette, die mit einem Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 12 bis 24 funktionsfähig verknüpft ist.
  26. Expressionsvektor nach Anspruch 25, umfassend ein Plasmid auf Phagen-Basis vom Typ M13.
  27. Expressionsvektor nach Anspruch 25, umfassend ein Plasmid auf Phagen-Basis vom Typ fUSE5/fd.
  28. Wirtszelle, umfassend einen Vektor nach einem der Ansprüche 25 bis 27.
  29. Replizierbare DNA, die eine Vielzahl von Fn3-β-Strang-Domänensequenzen codiert, die mit einer Vielzahl von Schleifenbereichsequenzen verbunden sind, für die Verwendung bei einem Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11.
  30. Variable Nukleinsäure-Bibliothek, die Fn3-Polypeptid-Monobodies codiert, umfassend eine Vielzahl an Nukleinsäuresequenzen nach einem der Ansprüche 12 bis 24.
  31. Verfahren zur Herstellung einer variablen Nukleinsäure-Bibliothek nach Anspruch 30, bei dem man: (a) einen Fn3-Polypeptid-Monobody mit einer vorbestimmten Sequenz herstellt, (b) das Polypeptid mit einem spezifischen Bindungspartner (SBP) in Kontakt bringt, um so einen Polypeptid:SBP-Komplex auszubilden, wobei die Dissoziationskonstante des Polypeptid:SBP-Komplexes weniger als 10–6 Mol/Liter ist, (c) die Bindungsstruktur des Polypeptid:SBP-Komplexes bestimmt, wie z. B. durch Kernspinresonanzspektroskopie oder Röntgenkristallographie, und (d) die variable Nukleinsäure-Bibliothek herstellt, wobei die Variation in Positionen der Nukleinsäuresequenz durchgeführt wird, welche nach der in (c) bereitgestellten Information zu einem oder mehreren Polypeptiden mit verbesserter Bindung an das SBP führen.
  32. Verfahren zur Herstellung einer variablen Nukleinsäure-Bibliothek nach Anspruch 30, bei dem man (a) einen Fn3-Polypeptid-Monobody mit einer vorbestimmten Sequenz herstellt, wobei das Polypeptid in der Lage ist, eine chemische Reaktion mit einer katalytischen Konstante (kcat) und einer nicht katalytischen Konstante (kuncat) so zu katalysieren, daß das Verhältnis von Kcat/kuncat größer als 10 ist, (b) das Polypeptid mit einem immobilisierten oder abtrennbaren Übergangszustandanalogon (TSAC), das den ungefähren molekularen Übergangszustand der chemischen Reaktion repräsentiert, in Kontakt bringt, (c) die Bindungsstruktur des Polypeptid:TSAC-Komplexes durch Kernspinresonanzspektroskopie oder Röntgenkristallographie bestimmt und (d) die variable Nukleinsäure-Bibliothek herstellt, wobei die Variation in Positionen in der Nukleinsäuresequenz durchgeführt wird, welche nach den in (c) bereitgestellten Informationen zu einem oder mehreren Polypeptiden mit einer verbesserten Bindung an oder zu einer Stabilisation des TSAC führen.
  33. Peptid-Display-Bibliothek, welche von einer variablen Nukleinsäure-Bibliothek nach Anspruch 30 abgeleitet ist.
  34. Peptid-Display-Bibliothek nach Anspruch 33, wobei das Peptid auf der Oberfläche eines Bakteriophagen oder Virus präsentiert wird.
  35. Peptid-Display-Bibliothek nach Anspruch 34, wobei der Bakteriophage M13 oder fd ist.
  36. Verfahren zum Identifizieren der Aminosäuresequenz eines Polypeptidmoleküls, welches in der Lage ist, an einen spezifischen Bindungspartner (SBP) unter Ausbildung eines Polypeptid:SBP-Komplexes zu binden, wobei die Dissoziationskonstante des Polypeptid:SBP-Komplexes weniger als 10–6 Mol/Liter ist, bei dem man: (a) eine Peptid-Display-Bibliothek nach einem der Ansprüche 30 bis 32 bereitstellt, (b) die Peptid-Display-Bibliothek von (a) mit SBP in Kontakt bringt, (c) den Polypeptid:SBP-Komplex von dem freien Peptid abtrennt, (d) die Replikation des abgetrennten Peptids von (c) bereitstellt, um so zu einer neuen Peptid-Display-Bibliothek zu führen, die sich von der in (a) unterscheidet, indem sie eine niedrigere Diversität aufweist und angereichtert ist mit präsentierten Peptiden, die in der Lage sind, das SBP zu binden, (e) wahlweise die Stufen (b), (c) und (d) mit der neuen Bibliothek von (d) wiederholt und (f) die Nukleinsäuresequenz des Bereichs, der das präsentierte Peptid einer Spezies von (d) codiert, bestimmt und die Aminosäuresequenz, die in der Lage ist, an das SBP zu binden, ableitet.
  37. Verfahren zum Identifizieren der Aminosäuresequenz eines Polypeptid-Moleküls, das in der Lage ist, eine chemische Reaktion mit einer katalytischen Konstante (kcat) und einer nicht katalytischen Konstante (kuncat) so zu katalysieren, daß das Verhältnis von kcat/kuncat größer als 10 ist, bei dem man: (a) eine Peptid-Display-Bibliothek nach einem der Ansprüche 30 bis 32 bereitstellt, (b) die Peptid-Display-Bibliothek von (a) mit einem Übergangszustandanalogon (TSAC), das den ungefähren molekularen Übergangszustand der chemischen Reaktion repräsentiert, in Kontakt bringt, (c) den Peptid:TSAC-Komplex von dem freien Peptid abtrennt, (d) die Replikation der abgetrennten Peptide von (c) verursacht, um so zu einer neuen Peptid-Display-Bibliothek zu führen, die sich von der in (a) unterscheidet, indem sie eine geringere Diversität aufweist und indem sie angereichert ist mit präsentierten Peptiden, die in der Lage sind, an TSAC zu binden, (e) wahlweise die Stufen (b), (c) und (d) mit der neuen Bibliothek von (d) wiederholt und (f) die Nukleinsäuresequenz des Bereichs, der das präsentierte Peptid einer Spezies aus (d) codiert, bestimmt und daraus die Peptidsequenz ableitet.
  38. Verfahren nach Anspruch 36 oder 37, bei dem man weiterhin das Polypeptid herstellt.
  39. Verwendung eines Monobody nach einem der Ansprüche 1 bis 8 für das Screening und/oder die Auswahl von Bindungsliganden und/oder Zielmolekülen.
  40. Verwendung nach Anspruch 39, umfassend die Ausbildung eines Komplexes des Monobody und eines Bindungsliganden und/oder Zielmoleküls und dann die Auswahl nach diesem Komplex, wodurch hinsichtlich des Bindungsliganden und/oder Zielmoleküls selektiert wird.
  41. Verwendung eines Fibronektin-Typ-III-(Fn3-)Polypeptids als ein Gerüst für Transplantate von Complementary Determining Regions (CDR).
  42. Monobody nach einem der Ansprüche 1 bis 8, welcher in der Lage ist, an eines oder mehrere unter: Ubiquitin, Fluorescein, Digoxigenin und TSAC zu binden.
  43. Verwendung eines Fibronektin-Typ-III-(Fn3-)Polypeptid-Monobody, umfassend eine Vielzahl an Fn3-β-Strang-Domänensequenzen, die mit einer Vielzahl an Schleifenbereichsequenzen verbunden sind, wobei einer oder mehrere der Schleifenbereichsequenzen des Monobody sich durch Deletion, Insertion oder Austausch von wenigstens zwei Aminosäuren von der entsprechenden Schleifenbereichsequenz in Wildtyp-Fn3 unterscheidet, als ein Gerüst für die molekulare Erkennung oder für die Konstruktion von Bindungsproteinen.
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