JP2022513164A - 胎盤由来同種ｃａｒ－ｔ細胞およびその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞集団を開示し、該Ｔ細胞は、臍帯血、胎盤灌流液、またはこれらの混合物に由来する胎盤Ｔ細胞である。このような細胞集団は、末梢血単核細胞Ｔ細胞に由来するものなどの細胞の代替集団よりもいくつかの態様において改善されることが示される。また、血液癌、例えば、Ｂ細胞癌などの癌、またはその症状の治療を、それを必要とする患者において行う方法も開示する。これらの方法は、患者における癌またはその症状を緩和するのに有効な量の、本発明のいずれか１つのＴ細胞集団を患者に投与すること含む。
【選択図】なし

Description

本発明は、部分的には、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞およびＣＡＲ療法に関する。

ＣＡＲ療法は、癌に対する重要なツールとして浮上している。しかしながら、これらの療法は、典型的には、患者自身の細胞、例えば、エフェクター細胞集団としての末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来するＴ細胞の使用に依存する。各患者の細胞を採集し、試験し、ＣＡＲ治療用に変えなければならないため、ＣＡＲ療法は、１）非常に高価であり、２）この療法を実施したいおよび／または実施できる特定のセンターでのみ利用可能である。これらの欠点は、それを必要とする多くの集団にとって、ＣＡＲ療法がほとんど利用できないという結果をもたらす。本発明は、部分的には、これらおよび他の問題を緩和することを目的とする同種の市販品（ｏｆｆ－ｔｈｅ－ｓｈｅｌｆ）のＣＡＲ療法を作り出すことを対象とする。

自家ＣＡＲ－Ｔ療法は、血液癌患者の標準治療の一部となっている。ＣＡＲ－Ｔ療法の細胞の供給源は、患者のＰＭＢＣからのものである。同種ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の開発は、ＰＢＭＣを原料物質としても使用する臨床治験に入っている。ＵＣＢ－Ｔ細胞は異なる生物学的特性を有し、このことが、ＵＣＢ－Ｔ細胞を同種細胞療法の原料物質に適したものにする。これらは、ＰＢＭＣから増殖されたＴ細胞と比較して、優勢なＴｃｍおよびＴｎａｉｖｅ表現型を有し、増殖活性の増加を示し、より長いテロメア／より高いテロメラーゼ活性を保持する（Ｏｋａｓ，ｅｔ．ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１０；Ｆｒｕｍｅｎｔｏ，ｅｔ．ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２０１３）。それらは、ＨＬＡミスマッチおよび同種活性化不全に対するより大きな免疫耐性を有する（Ｂａｒｋｅｒ，ｅｔ．ａｌ．Ｂｌｏｏｄ，２００１；Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２００６）。それらは、治療目的のために臨床規模に拡大することができる。

Ｔ細胞およびＮＫ細胞は、同種反応性の主要な細胞媒介物質である。Ｔ細胞受容体は、同種反応性に関与する主要な受容体である。Ｔ細胞受容体遺伝子の不活性化は、同種反応性の低減をもたらした。宿主ＮＫ細胞は、ＨＬＡミスマッチのドナー細胞を殺傷するか、またはＨＬＡ分子を発現しない。ＮＫ細胞殺傷を回避する１つの機構は、ＮＫ細胞機能を阻害するＨＬＡ－Ｅ分子の発現に通じる。

我々は、血液癌および固形癌の治療のための同種プラットフォームで使用するための分娩後ヒト胎盤由来Ｔ細胞の使用のための独自のプラットフォームを開発した。本研究では、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療のためのＣＤ１９ ＣＡＲ－ＴおよびＣＤ２０ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法胎盤Ｔ細胞の両方による概念実証を示している。より大きな免疫耐性および同種応答不全を示す胎盤由来Ｔ細胞（Ｐ－Ｔ細胞）にもかかわらず、我々は、Ｔ細胞受容体ａ定常遺伝子（ＴＲＡＣ）ノックアウト（ＫＯ）、例えば、Ｐ－Ｔ細胞上の内因性Ｔ細胞受容体の発現から生じる任意の潜在的なＧｖＨＤを回避するための追加のリスク軽減戦略としてのＣＲＩＳＰＲ媒介性Ｔ細胞受容体ａ定常遺伝子（ＴＲＡＣ）ノックアウト（ＫＯ）を想定し、実証している。必要に応じて、これらの細胞は、Ｂ２Ｍを発現しないように、またキメラＨＬＡ－Ｅ分子を発現して、Ｔ／ＮＫ細胞によるそれらの同種反応性／クリアランスを低減することができるように、さらに遺伝子組換えされ得る。

本発明は、ＣＡＲ療法のための細胞源としての胎盤由来細胞の使用を目的とする。これらの細胞には、胎盤から、胎盤灌流液からおよび臍帯血から単離された細胞、ならびにこれらの組み合わせが含まれる。本実施例では、臍帯血由来および／または胎盤灌流液由来の細胞が使用されており、これらの胎盤由来細胞は、ＰＢＭＣ由来のものなどの他の細胞源由来のＴ細胞よりも優れていることが示されている。

本明細書において、出願人は、胎盤由来細胞が、この集団の１つの利点を表す、ＰＢＭＣのものよりも少ないエフェクター／メモリー細胞を有するよりナイーブな表現型を有することを発見した。さらに、出願人は、胎盤由来Ｔ細胞の最大３６００倍の増殖を実証している。これらの発見に基づいて、本発明の一態様は、ＣＡＲ療法のための細胞型としての胎盤由来Ｔ細胞、例えば、臍帯血由来Ｔ細胞またはエクスビボ増殖臍帯血由来Ｔ細胞の使用である。

出願人はまた、そのようにする方法を開発し、このような細胞が、例示的なＣＡＲで高効率で形質導入され、標的を欠く細胞を殺傷せずに、標的を発現する細胞を容易に殺傷することができることを示した。この殺傷、またはその欠如は、標的を発現しているが、標的を欠かない腫瘍細胞に応答して誘発されるエフェクターサイトカイン発現の発現と相関した。

出願人はまた、胎盤由来Ｔ細胞がＰＢＭＣよりも著しく同種反応性が低いことも実証している。したがって、いくつかの実施形態では、本発明はＣＡＲ療法で使用するための胎盤由来細胞、例えば、臍帯血由来細胞または増殖臍帯血由来細胞の使用を教示する。

出願人によって発見された追加の利益は、胎盤由来Ｔ細胞のナイーブ表現型がＴｒｅｇ細胞の枯渇を可能にし、そうでなければＣＡＲ療法の有効性を低減させる可能性があることである。このような枯渇は、活性化Ｔ細胞上でのＣＤ２５の発現のために、ＰＢＭＣにとっては不可能／非実践的である。

同種ＣＡＲ療法を作り出すためのさらなる努力において、出願人はＴＣＲ、ここではＴＲＡＣの一部をノックアウトした。出願人は、ＣＲＩＳＰＲを使用して、胎盤由来Ｔ細胞の遺伝子改変を高効率で行う方法を開発した。このような遺伝子改変の使用は、胎盤由来Ｔ細胞の同種利点をさらに増強すると予想される。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞の遺伝子改変を教示して、ＴＣＲ遺伝子、例えばＴＲＡＣをノックアウトするなどの同種反応性を低減する。

本出願では特定のＣＡＲが使用されているが、１）胎盤由来Ｔ細胞を使用すること、２）Ｔ細胞遺伝子、例えばＴＲＡＣなどのＴＣＲ遺伝子がノックアウトされていること、および３）それらの組み合わせ、という利点が、任意のＣＡＲに適用可能でありＣＡＲ療法を著しく改善し、低減されたＧＶＨＤを有する同種治療を提供することが予想される。

Ｔ／ＮＫ駆動型同種反応性を回避するための戦略を示す。

胎盤由来同種ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成するプロセスの概要を示す。

胎盤由来の単離されたＴ細胞の表現型を示す。

２０日における胎盤由来Ｔ細胞のインビトロ増殖を示す。

１３日目以降の再刺激後の２０日におけるインビトロで増殖した胎盤由来Ｔ細胞の表現型を示す。

１５日におけるＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子改変胎盤由来Ｔ細胞のインビトロ増殖を示す。

１５日目のＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子改変Ｐ－Ｔ細胞のＴ細胞分化状態を示す。

Ｔエフェクターメモリー（Ｔ ｅｍ）およびＴエフェクター（Ｔ ｅｆｆ）細胞上でのＣＤ５７発現を示す。

１５日目のＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子改変Ｐ－Ｔ細胞の表現型解析を示す。

Ｐ－Ｔ細胞における滴定ＣＤ１９ ＣＡＲウイルスベクターの１５日目のＣＤ１９ ＣＡＲ発現を示す。

異なる胎盤ドナーからの複数のＰ－Ｔ調製物で再現された１５日目のＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ表現型を示す。

異なる胎盤ドナーからの複数のＰ－Ｔ調製物で再現された１５日目のＣＤ１９ ＣＡＲ発現を示す。

１４日目のＵＣＢ ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞対ＣＤ１９＋／ＣＤ１９－標的（上部パネル）の細胞傷害性、および１４日目のＵＣＢ ＣＤ２０ ＣＡＲ－Ｔ細胞対ＣＤ２０＋／ＣＤ２０－標的（下部パネル）の細胞傷害性を示す。

１４日目のＵＣＢ ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞対ＣＤ１９＋／ＣＤ１９－標的のサイトカイン放出を示す。

１５日目のＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ活性対ＣＤ１９＋／－標的を試験する４時間フロー細胞傷害性アッセイを示す。

１５日目のＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ活性対ＣＤ１９＋／－標的のＡＣＥＡ動力学細胞傷害性アッセイを示す。

２４時間サイトカイン放出アッセイ：１５日目のＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ活性対ＣＤ１９＋Ｄａｕｄｉの結果を示す。

２４時間サイトカイン放出アッセイ：１５日目のＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ活性対ＣＤ１９＋Ｎａｌｍ６の結果を示す。

播種性ＣＤ１９＋Ｄａｕｄｉ－ＬｕｃマウスモデルにおけるＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ活性を示す。

Ｄａｕｄｉ－ｌｕｃ播種性モデルにおける腫瘍細胞再チャレンジに対するＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ活性を示す。

ＵＣＢ－Ｔ細胞におけるＴＲＡＣノックアウト効率を示す。

ＣＲＩＳＰＲを使用した１５日目のＰ－Ｔ ＴＲＡＣ ＫＯ効率を示す。

ＴＲＡＣ ＫＯのＰ－Ｔ ＣＤ１９ ＣＡＲ発現に及ぼす影響を示す。

ＴＲＡＣ ＫＯのＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ活性に及ぼす影響を示す。

細胞傷害性アッセイによって測定したＰ－Ｔ細胞の同種反応性を示す。

増殖アッセイによって測定したＰ－Ｔ細胞の同種反応性を示す。

ＮＣＧマウスモデルにおけるＰ－Ｔ Ｔｒｅｇの頻度および同種反応の欠如を示す。

本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞集団を提供し、該Ｔ細胞は胎盤Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、該胎盤Ｔ細胞は、臍帯血Ｔ細胞、胎盤灌流液Ｔ細胞、またはこれらの混合物である。いくつかの実施形態では、該胎盤Ｔ細胞は、臍帯血Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、該胎盤Ｔ細胞は、臍帯血Ｔ細胞と胎盤灌流液Ｔ細胞との混合物である。

他の実施形態では、Ｔ細胞集団該ＣＡＲは、トランスフェクションによって細胞に導入されている。いくつかの実施形態では、該ＣＡＲは、ウイルス形質導入によって細胞に導入されている。他の実施形態では、該ＣＡＲは、レトロウイルスベクターを用いたウイルス形質導入によって細胞に導入されている。さらに他の実施形態では、該ＣＡＲは、レンチウイルスベクターを用いたウイルス形質導入によって細胞に導入されている。

これらの細胞は、いくつかの態様では、例えば末梢血単核由来細胞とは異なり、実際には、該細胞よりも改善されることが示されている。

いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞集団は、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも高い割合のＣＤ４５ＲＡを発現する細胞を有する。他の実施形態では、該Ｔ細胞集団は、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも高い割合のＣＤ２７を発現する細胞を有する。他の実施形態では、該Ｔ細胞集団は、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも高い割合のＣＣＲ７を発現する細胞を有する。他の実施形態では、該Ｔ細胞集団は、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも高い割合のＣＤ１２７を発現する細胞を有する。他の実施形態では、該Ｔ細胞集団は、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも低い割合のＣＤ５７を発現する細胞を有する。他の実施形態では、該Ｔ細胞集団は、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも高い割合のＣＤ６２Ｌを発現する細胞を有する。他の実施形態では、該Ｔ細胞集団は、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも低い割合のＣＤ２５を発現する細胞を有する。他の実施形態では、該Ｔ細胞集団は、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも高い割合のＬａｇ－３＋を発現する細胞を有する。他の実施形態では、該Ｔ細胞集団は、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも低い割合のＴｉｍ－３を発現する細胞を有する。

いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞集団は、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも、癌細胞株の高いインビトロ殺傷を呈する。他の実施形態では、該Ｔ細胞集団は、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも、癌細胞株に対するインビトロチャレンジにおいて、より多くの量のパーフォリンを発現する。他の実施形態では、該Ｔ細胞集団は、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも、癌細胞株に対するインビトロチャレンジにおいて、より多くの量のＧＭ－ＣＳＦを発現する。他の実施形態では、該Ｔ細胞集団は、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも、癌細胞株に対するインビトロチャレンジにおいて、より多くの量のＴＮＦ－ａを発現する。他の実施形態では、該Ｔ細胞集団は、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも、癌細胞株に対するインビトロチャレンジにおいて、より多くの量のＩＬ－２を発現する。他の実施形態では、該Ｔ細胞集団は、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも、癌細胞株に対するインビトロチャレンジにおいて、より多くの量のグランザイムＢを発現する。

いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞集団は、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも、インビボ癌モデルにおいて生存率の増加をもたらす。他の実施形態では、該Ｔ細胞集団は、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも、インビボ癌モデルにおいて体重減少の低下をもたらす。他の実施形態では、該Ｔ細胞集団は、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも、インビボ癌モデルにおいて移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の減少をもたらす。

他の実施形態では、該末梢血単核細胞Ｔ細胞集団もまた、該ＣＡＲを発現する。他の実施形態では、該ＣＡＲは、トランスフェクションによって該末梢血単核細胞Ｔ細胞集団に導入されている。他の実施形態では、該ＣＡＲは、ウイルス形質導入によって該末梢血単核細胞Ｔ細胞集団に導入されている。他の実施形態では、該ＣＡＲは、レトロウイルスベクターを用いたウイルス形質導入によって該末梢血単核細胞Ｔ細胞集団に導入されている。他の実施形態では、該ＣＡＲは、レンチウイルスベクターを用いたウイルス形質導入によって該末梢血単核細胞Ｔ細胞集団に導入されている。他の実施形態では、該末梢血単核細胞Ｔ細胞集団に導入されている該ＣＡＲは、該Ｔ細胞集団によって発現される同一のＣＡＲである。

いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞集団は宿主に対する免疫原性を低減させるさらなる遺伝子変化を含む。他の実施形態では、該遺伝子変化は、遺伝子ノックアウトである。他の実施形態では、該遺伝子ノックアウトは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ノックアウトである。他の実施形態では、該遺伝子ノックアウトは、Ｔ細胞受容体アルファ定常遺伝子（ＴＲＡＣ）ノックアウトである。他の実施形態では、該さらなる遺伝子変化は、トランスフェクション、レトロウイルス形質導入、またはレンチウイルス形質導入によって達成される。他の実施形態では、該さらなる遺伝子変化は、ＣＲＩＳＰＲ、ターレン（ｔａｌｅｎ）、またはジンクフィンガー技術の使用によって達成される。

本発明はまた、癌またはその症状の治療を、それを必要とする患者において行う方法を提供し、本方法は、患者において癌またはその症状を緩和するのに有効な量の本発明のうちのいずれか１つのＴ細胞集団を患者に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、該癌は血液癌である。他の実施形態では、該血液癌は、Ｂ細胞癌である。他の実施形態では、Ｔ細胞集団は、該患者に対して同種である。

本明細書で使用する場合、「胎盤灌流液」とは、胎盤、例えば、ヒト胎盤の少なくとも一部、例えば、胎盤血管系を通って通過した灌流溶液を意味し、胎盤を通過する間に灌流溶液によって採集された複数の細胞を含む。

本明細書で使用する場合、「胎盤灌流液細胞」は、胎盤灌流液から単離されるか、または単離可能な、有核細胞、例えば、総有核細胞を意味する。

本明細書で使用する場合、「腫瘍細胞抑制」、「腫瘍細胞増殖の抑制」などは、例えば、腫瘍細胞集団を、該腫瘍細胞集団における腫瘍細胞のうちの１つ以上の腫瘍細胞を殺傷することによって、例えば、本明細書に記載される３段階方法を使用して産生されるＴ細胞またはＴ細胞集団を、腫瘍細胞集団と接触させるか、または近接させることによって、例えば、腫瘍細胞集団を、本明細書に記載される３段階方法を使用して産生されるＴ細胞またはＴ細胞集団と接触させることによって、腫瘍細胞集団の成長を遅らせることを含む。ある特定の実施形態では、該接触はインビトロまたはエクスビボで行われる。他の実施形態では、該接触はインビボで行われる。

本明細書で使用する場合、「造血細胞」という用語は、造血幹細胞および造血前駆細胞を含む。

本明細書で使用する場合、「＋」は、特定の細胞マーカーの存在を示すために使用されるとき、細胞マーカーがアイソタイプ対照にわたって蛍光活性化細胞選別において検出可能に存在するか、または定量的もしくは半定量的ＲＴ－ＰＣＲにおいてバックグラウンドより上で検出可能であることを意味する。

本明細書で使用する場合、「－」は、特定の細胞マーカーの存在を示すために使用されるとき、細胞マーカーがアイソタイプ対照にわたって蛍光活性化細胞選別において検出可能に存在しないか、または定量的もしくは半定量的ＲＴ－ＰＣＲにおいてバックグラウンドより上で検出可能でないことを意味する。

本明細書で使用する場合、「キメラ抗原受容体」または代替として「ＣＡＲ」は、最も単純な実施形態では、典型的には２つのポリペプチドのセットを指し、これは、免疫エフェクター細胞中にあるとき、標的細胞、典型的には癌細胞に対する特異性を、および細胞内シグナル生成を細胞に提供する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、以下に定義される刺激分子および／または共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書において「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも称される）を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドのセットは、互いに連続している。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのセットは、二量体化分子の存在の際に、ポリペプチドを互いに結合することができ、例えば、抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに結合することができる二量体化スイッチを含む。一態様では、刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体と会合するゼータ鎖である。一態様では、細胞質シグナル伝達ドメインは、少なくとも１つの共刺激分子に由来する１つ以上の機能的シグナル伝達ドメインをさらに含む。一態様では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、１つ以上の共刺激分子に由来する２つの機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、１つ以上の共刺激分子に由来する少なくとも２つの機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様では、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ－ｔｅｒ）に任意のリーダー配列を含む。一態様では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＮ末端にリーダー配列をさらに含み、リーダー配列は、細胞処理およびＣＡＲの細胞膜への局在化中に、抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）から任意に切断される。

本明細書に記載のものなどの特定の腫瘍マーカーＸを標的とする抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ、またはＴＣＲ）を含むＣＡＲは、ＸＣＡＲとも称される。例えば、ＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメインを含むＣＡＲは、ＣＤ１９ＣＡＲと称される。

本明細書で使用する場合、「シグナル伝達ドメイン」は、第２のメッセンジャーを生成することによって、またはこのようなメッセンジャーに応答することによってエフェクターとして機能することによって、定義されたシグナル伝達経路を介して細胞活性を調節するために細胞内で情報を伝達することによって作用するタンパク質の機能部分を指す。

本明細書で使用する場合、本明細書で使用する「抗体」は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子に由来するタンパク質、またはポリペプチド配列を指す。抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル、多鎖もしくは単鎖、またはインタクト免疫グロブリンであり得、天然源または組換え源に由来してもよい。抗体は、免疫グロブリン分子の四量体であり得る。

本明細書で使用する場合、「抗体断片」は、抗原のエピトープと（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布によって）特異的に相互作用する能力を保持する抗体の少なくとも１つの部分を指す。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＨドメインおよびＣＨＩドメインから構成されるＦｄ断片、線状抗体、ｓｄＡｂなどの単一ドメイン抗体（ＶＬまたはＶＨのいずれか）、ラクダ科ＶＨＨドメイン、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片などの抗体断片から形成される多重特異性抗体、ならびに抗体の単離されたＣＤＲまたは他のエピトープ結合断片が挙げられるが、これらに限定されない。抗原結合断片はまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ－ＮＡＲおよびビス－ｓｃＦｖに組み込むことができる（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６，２００５を参照されたい）。抗原結合断片は、フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）などのポリペプチドに基づいてスキャフォールドに移植することもできる（フィブロネクチンポリペプチドミニボディを記載する、米国特許第６，７０３，１９９号を参照されたい）。

本明細書で使用する場合、「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片と、重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片とを含む融合タンパク質を指し、軽鎖および重鎖可変領域は、例えば、合成リンカー、例えば、短い柔軟なポリペプチドリンカーを介して連続して連結され、単鎖ポリペプチドとして発現することができ、ｓｃＦｖは、それが由来するインタクトな抗体の特異性を保持する。特に明記しない限り、本明細書で使用する場合、ｓｃＦｖは、例えば、ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端に関して、いずれかの順序でＶＬおよびＶＨ可変領域を有してもよく、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含んでもよく、またはＶＨ－リンカー－ＶＬを含んでもよい。

抗体またはその抗体断片を含む本発明のＣＡＲの部分は、抗原結合ドメインが、例えば、単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体または二重特異性抗体を含む連続ポリペプチド鎖の一部として発現される様々な形態で存在し得る（Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｉｎ：Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｈｏｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６）。一態様では、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインは、抗体断片を含む。さらなる態様では、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体断片を含む。所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１），“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（「Ｋａｂａｔ」ナンバリングスキーム）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）ＪＭＢ ２７３，９２７－９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」ナンバリングスキーム）によって記載されるもの、またはこれらの組み合わせを含む、いくつかの周知のスキームのうちのいずれかを使用して決定することができる。

本明細書で使用する場合、「結合ドメイン」または「抗体分子」は、タンパク質、例えば、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む免疫グロブリン鎖またはその断片を指す。用語「結合ドメイン」または「抗体分子」は、抗体および抗体断片を包含する。一実施形態では、抗体分子は、多重特異性抗体分子であり、例えば、これは複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、複数の第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第１のエピトープに対する結合特異性を有し、複数の第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第２のエピトープに対する結合特異性を有する。一実施形態では、多重特異性抗体分子は、二重特異性抗体分子である。二重特異性抗体は、２つ以下の抗原に対する特異性を有する。二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列と、第２のエピトープに対する結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列とによって特徴付けられる。

本明細書で使用する場合、「抗体重鎖」は、それらの天然に存在する立体配座において抗体分子中に存在する２つのタイプのポリペプチド鎖のうちの大きい方を指し、通常、抗体が属する部類を決定する。

本明細書で使用する場合、「抗体軽鎖」は、それらの天然に存在する立体配座において抗体分子中に存在する２つのタイプのポリペプチド鎖のうちのより小さい方を指す。カッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。

本明細書で使用する場合、「組換え抗体」は、例えば、バクテリオファージまたは酵母発現系によって発現される抗体などの、組換えＤＮＡ技術を使用して生成される抗体を指す。この用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって生成され、そのＤＮＡ分子が抗体タンパク質、または抗体を特定するアミノ酸配列を発現する抗体を意味するものと解釈されるべきであり、このＤＮＡまたはアミノ酸配列は、当該技術分野において入手可能で周知である組換えＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を使用して得られている。

本明細書で使用する場合、「抗原」または「Ａｇ」は、免疫応答を誘発する（ｐｒｏｖｏｋｅ）分子を指す。この免疫応答は、抗体産生、または特異的免疫担当細胞の活性化、またはその両方のいずれかを伴い得る。当業者であれば、事実上全てのタンパク質またはペプチドを含むいかなる巨大分子も抗原として機能することができることを理解するであろう。さらに、抗原は、組換えＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。当業者であれば、いかなるＤＮＡも、免疫応答を誘発する（ｅｌｉｃｉｔ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含み、したがって、本明細書で使用する「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者であれば、抗原が遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要がないことを理解するであろう。本発明が、限定されないが、２つ以上の遺伝子の部分ヌクレオチド配列の使用を含み、これらのヌクレオチド配列が、所望の免疫応答を誘発するポリペプチドをコードするために様々な組み合わせで配置されることは、容易に明らかである。さらに、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要がまったくないことを当業者は理解するであろう。抗原が生成され、合成され得ること、または生体試料に由来し得ること、またはポリペプチド以外の巨大分子であり得ることは容易に明らかである。かかる生体試料としては、組織試料、腫瘍試料、細胞、または他の生体成分を有する体液を挙げることができるが、これらに限定されない。

本明細書で使用する場合、「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ含有細胞、例えばＣＡＲＴ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。例えば、ＣＡＲＴ細胞における免疫エフェクター機能の例としては、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性およびヘルパー活性が挙げられる。

一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができる。例示的な一次細胞内シグナル伝達ドメインとしては、一次刺激、または抗原依存性シミュレーションに関与する分子に由来するものが含まれる。一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは共刺激細胞内ドメインを含むことができる。例示的な共刺激細胞内シグナル伝達ドメインとしては、共刺激シグナル、または抗原非依存性刺激に関与する分子に由来するものが含まれる。例えば、ＣＡＲＴの場合、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体の細胞質配列を含み得、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共受容体または共刺激分子由来の細胞質配列を含み得る。

一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ）またはΓＴＡＭとして知られているシグナル伝達モチーフを含み得る。一次細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例としては、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲｉｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、およびＤＡＰ１２に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用する場合、「ゼータ」または代替的に「ゼータ鎖」、「ＣＤ３－ゼータ」もしくは「ＴＣＲ－ゼータ」は、ＧｅｎＢａｎ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＢＡＧ３６６６４．１として提供されるタンパク質として、または非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの等価残基として定義され、「ゼータ刺激ドメイン」または代替的に「ＣＤ３－ゼータ刺激ドメイン」もしくは「ＴＣＲ－ゼータ刺激ドメイン」は、Ｔ細胞活性化に必要な初期シグナルを機能的に伝達するのに十分であるゼータ鎖の細胞質ドメインまたはその機能的誘導体からのアミノ酸残基として定義される。一態様では、ゼータの細胞質ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＢＡＧ３６６６４．１の残基５２～１６４、またはその機能的オルソログである、非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの等価残基を含む。一態様では、「ゼータ刺激ドメイン」または「ＣＤ３－ゼータ刺激ドメイン」は、配列番号１８として提供される配列である。一態様では、「ゼータ刺激ドメイン」または「ＣＤ３－ゼータ刺激ドメイン」は、配列番号２０として提供される配列である。

本明細書で使用する場合、「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって増殖などであるが、これらに限定されないＴ細胞による共刺激応答を媒介するＴ細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子は、効率的な免疫応答に寄与する抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子としては、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡおよびＴｏｌｌリガンド受容体、ならびにＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）が挙げられるが、これらに限定されない。このような共刺激分子のさらなる例としては、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドが挙げられる。

共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分であり得る。共刺激分子は、以下のタンパク質ファミリーで表すことができる：ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、およびＮＫ細胞活性化受容体。かかる分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＡＭ－１、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ２８７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。

細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子の細胞内部分全体、または天然細胞内シグナル伝達ドメイン全体、またはその機能的断片もしくは誘導体を含むことができる。

本明細書で使用する場合、「４－ＩＢＢ」は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＡＡ６２４７８．２として提供されるアミノ酸配列、または非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの等価残基を有するＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーを差し、「４－１ＢＢ共刺激ドメイン」は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＡＡ６２４７８．２のアミノ酸残基２１４～２５５、または非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの等価残基として定義される。一態様では、「４－１ＢＢ共刺激ドメイン」は、配列番号１４として提供される配列、または非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの等価残基である。

本明細書で使用する場合、「免疫エフェクター細胞」は、免疫応答、例えば、免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞を指す。免疫エフェクター細胞の例としては、Ｔ細胞、例えば、アルファ／ベータＴ細胞およびガンマ／デルタＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、肥満細胞、および骨髄由来食細胞が挙げられる。

本明細書で使用する場合、「免疫エフェクター機能または免疫エフェクター応答」は、例えば、標的細胞の免疫攻撃を増強または促進する免疫エフェクター細胞の機能または応答を指す。例えば、免疫エフェクター機能または応答は、標的細胞の殺傷または成長もしくは増殖の阻害を促進するＴ細胞またはＮＫ細胞の特性を指す。Ｔ細胞の場合、一次刺激および共刺激は、免疫エフェクター機能または応答の例である。

本明細書で使用する場合、「抗癌効果」は、限定されないが、例えば、腫瘍体積の減少、癌細胞の数の減少、転移の数の減少、寿命の延長、癌細胞増殖の減少、癌細胞生存率の減少、または癌性状態に関連する様々な生理学的症状の改善が含まれる、様々な手段によって示され得る生物学的効果を指す。「抗癌効果」は、そもそも、ペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、および抗体が癌の発生を予防する能力によっても示され得る。「抗腫瘍効果」という用語は、限定されないが、例えば、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞の数の減少、腫瘍細胞増殖の減少、または腫瘍細胞生存率の減少が含まれる、様々な手段によって示され得る生物学的効果を指す。

本明細書で使用する場合、「自家」は、後に個体に再導入される同じ個体に由来する任意の物質を指す。

本明細書で使用する場合、「同種」は、その物質が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する任意の物質を指す。２つ以上の個体は、１つ以上の遺伝子座における遺伝子が同一でない場合、互いに同種であると言われる。いくつかの態様では、同じ種の個体由来の同種物質は、抗原的に相互作用するのに十分に遺伝的に異なっていてもよい。

遺伝子付加／改変の方法は当該技術分野で周知であり、本発明に適用可能である。例えば、ＣＡＲ送達または遺伝子ノックアウトの方法は、安定もしくは一過性のトランスフェクション方法によって、またはレンチウイルスもしくはレトロウイルス形質導入によって実行することができる。遺伝子改変は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ、ターレン、または他のこのような技術の使用によって、これらまたは他の方法を用いて実行することができる。

実施例１：出発物質、ＭＮＣ分離、およびＴ細胞単離
出発物質胎盤血（Ｐｌａｃｅｎｔａ Ｂｌｏｏｄ）（ヒト臍帯血（ＵＣＢ）および／またはヒト胎盤灌流液（ＨＰＰ）の両方を含む）を、ＬｉｆｅｂａｎｋＵＳＡを通じてインフォームドコンセントを得て採集する。採集後、出発物質を、ヘタスターチＲＢＣ沈降またはＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ密度勾配細胞分離を使用して単核細胞（ＭＮＣ）について濃縮させる。次いで、ＭＮＣに、ＣＤ２５＋Ｔ制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を枯渇させるために陽性選択のプロセスを受けさせ、続いて、Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉビーズ細胞分離キットを使用してＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞について陽性選択を受けさせる。単離されたＴ細胞のアリコートを、細胞が凍結される前に、血清学および滅菌試験ならびに表現型分析のために採集する。

単離されたＰ－Ｔ細胞の表現型は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）とは異なる。Ｐ－Ｔ細胞は、＞７８％のＣＤ３＋ＣＤ５６－Ｔ細胞を含有し、主に、低頻度のＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７＋ＣＤ２７＋セントラルメモリーＴ細胞およびＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７－ＣＤ２７＋エフェクターメモリーＴ細胞を有するＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ２７＋ナイーブＴ細胞から構成される。ＣＤ２５の枯渇は、Ｐ－Ｔ細胞内のＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｔｒｅｇの頻度を０．５％を下回るまで著しく低減させた。

追加の出発物質を、まだ試験されていないが、ＣＤ３４造血幹細胞／前駆体由来胎盤Ｔ細胞を含むようにする。前駆体のＴ細胞への増殖および分化の過程は、５０～６０日かかる場合がある。現在のプロトコルを有する以下に示される集団は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞の顕著な集団が存在するが、完全に分化した単一陽性Ｔ細胞を容易に選択／濃縮することができることに留意することが重要である。

胎盤灌流液由来Ｔ細胞の評価は完了しているが、現在の手順で得られる細胞数、生存率、およびＴ細胞純度は低いため、単離手順を最適化する必要がある。

実施例２：Ｔ細胞の活性化および増殖
非改変Ｐ－Ｔ細胞：
単離されたＰ－Ｔ細胞を解凍し、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｔｒｅｇの除去のためにＭｉｌｔｅｎｙｉ抗ＣＤ２５ビーズを使用してＣＤ２５枯渇を受けさせ（Ｔ細胞単離工程の前に含めることができる）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（１：１のビーズ：細胞比）を使用して、またはＭｉｌｔｅｎｙｉからの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ナノ粒子トランザクト（Ｔｒａｎｓａｃｔ）（１：１００の容量希釈）を使用して活性化する。次いで、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７＋１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５、または１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２＋１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７を使用して細胞を増殖させる。追加の再刺激を１２～１４日目に完了し、細胞をＧｒｅｘ容器内で最長２１日まで増殖させ、増殖倍率を最大化させる。

非改変Ｐ－Ｔ細胞は、２０日目まで培養したとき、初期刺激で最大６００倍まで、１４日目の再刺激（ＲＳ）で最大３，６００倍まで増殖させることができる。

様々な培養条件下で、非改変の２０日間増殖させたＰ－Ｔは、解凍後（ＰＴ）の、非培養ＰＢＭＣと比較して早い分化表現型を呈し、主にＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞およびＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２＋セントラルメモリーＴ細胞から構成されたが、解凍後の非培養ＰＢＭＣは、主に、より分化したＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ－／＋ＣＤ６２Ｌ－エフェクターメモリーおよび末端エフェクターＴ細胞から構成された。Ｐ－Ｔ細胞の早期分化状態を考慮すると、追加のラウンドの刺激は実現可能であり、胎盤由来の同種ＣＡＲ－Ｔの「市販品」製造を支持するために増殖倍率を著しく増加させるべきであり、一方で患者において持続するセントラルメモリーＴ細胞と、腫瘍細胞を直ちに標的とし、殺傷するエフェクターＴ細胞とのバランスの取れた混合物を維持するべきである。

ＣＡＲ改変Ｐ－Ｔ細胞：
単離されたＴ細胞（凍結前にＣＤ２５枯渇を受けた）を解凍し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉからの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ナノ粒子トランザクト（１：１００の容量希釈）を使用して活性化した。次いで、細胞を、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を使用して、Ｇｒｅｘ容器中で増殖させた。３日目に、ウイルス前スピン法を使用して、レトロネクチンでコーティングしたプレート上でＣＤ１９ ＣＡＲレンチウイルス（ＬＶ）またはレトロウイルス（ＲＶ）のいずれかで細胞を形質導入した。次いで、培地供給を２～３日ごとに行いながら、細胞を１５日目まで培養した。

ＣＤ１９ ＣＡＲ改変Ｐ－Ｔ細胞は、再刺激することなく、培養中で１５日後に２３７～３３６倍増殖することができる。

１５日間の培養後、ＣＤ１９ ＣＡＲ改変Ｐ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９ ＣＡＲ ＰＢＭＣ由来のＴ細胞と比較して、異なるＴ細胞分化表現型を呈した。Ｐ－Ｔ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ナイーブ／幹細胞メモリーＴ細胞およびＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７－エフェクターＴ細胞の良好な混合物からなり、一方、ＰＢＭＣ由来のＣＤ１９ ＣＡＲのＴ細胞は、主に、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７－エフェクターメモリーＴ細胞およびＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７－エフェクターＴ細胞から構成された。Ｐ－Ｔ ＮＴ（形質導入されていない）およびＰ－Ｔ ＣＤ１９ ＣＡＲ ＲＶ細胞は、Ｐ－Ｔ ＣＤ１９ ＣＡＲ ＬＶ細胞よりも多くのＴナイーブ／ｓｃｍ Ｔ細胞から構成された。

さらに、ＰＢＭＣ由来のエフェクターメモリーＴ細胞（Ｔ ｅｍ）およびエフェクターＴ細胞（Ｔ ｅｆｆ）は、著しく高いレベルの疲弊マーカーＣＤ５７を発現したが、Ｐ－Ｔ細胞発現は低かった。

低ＣＤ５７発現と共に、Ｐ－Ｔ細胞内のエフェクターＴ細胞およびナイーブ／幹細胞メモリーＴ細胞のより高い頻度および混合は、ＣＡＲ－Ｔ産物を表し、このＣＡＲ－Ｔ産物は、腫瘍細胞を効率的に標的化して殺傷することができ、同時に、そのより分化したＴ細胞サブセットを経時的に自己再生および補充する能力を維持する。

全体として、１５日目のＰ－Ｔ ＮＴおよびＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞は、高レベルのＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２７、ＣＣＲ７、ＣＤ１２７、およびＣＤ２８を発現し、低レベルの疲弊マーカーＣＤ５７、ならびに免疫チェックポイントマーカー（免疫応答の負の調節因子）ＰＤ－１、Ｌａｇ－３、およびＴｉｍ－３を発現した。

ＣＤ１９ ＣＡＲ形質導入効率は、ＣＤ１９ Ｆｃ－Ｆｉｔｃ試薬で細胞をインキュベートし、フローサイトメトリーを使用してＣＤ１９ ＣＡＲ＋細胞の割合を定量化することによって測定した。１５日目までに、Ｐ－Ｔ細胞は、全てのＭｓ ｓｃＦｖ ＬＶまたはＲＶ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｕｉｌｄｅｒ、ＳｉｇｎａＧｅｎ、またはＳｏｒｒｅｎｔｏから）で形質導入されたときにＣＤ１９ ＣＡＲを発現し、全て４－１ＢＢ共刺激ドメインから構成されるＨｕ ｓｃＦｖ ＪＫ２およびＪＬ配列で形質導入されたときにＣＤ１９ ＣＡＲを発現した。Ｐ－Ｔ細胞は、ＣＤ２８共刺激ドメインを含有するＨｕ ｓｃＦｖ ＪＫ１配列で形質導入したときには、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現しなかった。各ＣＤ１９ ＣＡＲの最適なＭＯＩ／濃度を、下記のように決定した：Ｖｅｃｔｏｒ ＢｕｉｌｄｅｒのＭｓ ｓｃＦｖ ＣＤ１９ ＣＡＲ ＬＶについてＭＯＩ ５０、ＳｉｇｎａＧｅｎのＭｓ ｓｃＦｖ ＣＤ１９ ＣＡＲ ＬＶについてＭＯＩ １００、ＳｉｇｎａＧｅｎのＨｕ ｓｃＦｖ ＣＤ１９ ＣＡＲ ＬＶについてＭＯＩ ２００、およびＳｏｒｒｅｎｔｏ Ｍｓ ｓｃＦｖ ＣＤ１９ ＣＡＲ ＲＶについて２．５倍（計算された力価は不明）。

１５日目のＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞は、形質導入に使用されるウイルスベクターにかかわらず、高い生存率およびＣＤ３＋ＣＤ５６－Ｔ細胞の純度を呈した。Ｖｅｃｔｏｒ ＢｕｉｌｄｅｒのＭｓ ｓｃＦｖ ＣＤ１９ ＣＡＲ ＬＶで形質導入されたＰ－Ｔ細胞は、ＳｉｇｎａＧｅｎによって産生された同じＭｓ ｓｃＦｖ ＣＤ１９ ＣＡＲ ＬＶ配列と比較して、著しく高いＣＤ４＋Ｔ細胞をもたらした。ＳｏｒｒｅｎｔｏのＭｓ ｓｃＦｖ ＣＤ１９ ＣＡＲで形質導入されたＰ－Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の最大頻度、ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のバランスの取れた混合物をもたらした。

各ＣＤ１９ ＣＡＲウイルス型について最適化されたＭＯＩ／濃度を使用すると、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現は、１５日目のＰ－Ｔ細胞で２２～７０％の範囲であった。Ｖｅｃｔｏｒ ＢｕｉｌｄｅｒのＭｓ ｓｃＦｖ ＣＤ１９ ＣＡＲ ＬＶは、そのＣＤ１９ ＣＡＲ発現の大部分をＣＤ４＋Ｔ細胞上で発現したが、一方、ＳｏｒｒｅｎｔｏのＭｓ ｓｃＦｖ ＣＤ１９ ＣＡＲ ＲＶは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上でＣＤ １９ ＣＡＲ発現の等しい混合、ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞内でのＣＤ１９ ＣＡＲ発現の最も高い全体的な頻度をもたらした。

実施例３：ＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ２０ ＣＡＲのインビトロ活性
癌細胞株に対する１５日目のＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞溶解活性
活性化ＵＣＢ－Ｔ細胞を、スパイノキュレーション（ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）を使用して、ＵＣＢ－Ｔ培養の２～４日目にＣＤ１９ ＣＡＲレトロウイルスまたはレンチウイルスで形質導入した。ＣＡＲベクターがＭｙｃタグを含有する場合、ＦＩＴＣ標識組換えＣＤ１９－Ｆｃ融合タンパク質または抗Ｍｙｃ ＰＥ抗体のいずれかを使用して、ＣＡＲ発現を検出した。ＵＣＢ－ＣＡＲ－Ｔ活性を、以下の２つのアッセイを使用して評価した。

ＣＤ１９ ＣＡＲ形質導入ＵＣＢ－Ｔ細胞は、ＰＢＭＣ ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞に匹敵するレベルでＣＤ１９＋Ｄａｕｄｉ癌標的を特異的に殺傷するが、ＣＤ１９－Ｋ５６２細胞を殺傷しない。

ＣＤ２０ ＣＡＲ形質導入ＵＣＢ－Ｔ細胞は、ＰＢＭＣ ＣＤ２０ ＣＡＲ Ｔ細胞と同等のレベルでＣＤ２０＋Ｄａｕｄｉ癌標的を特異的に殺傷するが、ＣＤ２０－Ｍｏｌｐ８細胞を殺傷しない。

ＣＤ１９ ＣＡＲ形質導入ＵＣＢ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９＋Ｄａｕｄｉ癌標的に応答して、炎症誘発性サイトカインＩＦＮ－ｇおよびＧＭ－ＣＳＦ、ならびに細胞溶解エフェクタータンパク質パーフォリンを特異的に分泌するが、ＣＤ１９－Ｋ５６２細胞に応答しない。

インビトロでは、Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の機能活性も、４時間フローサイトメトリーに基づく細胞傷害性アッセイおよび動力学ＡＣＥＡ細胞傷害性アッセイにおいて、ＣＤ１９＋バーキットリンパ腫（Ｄａｕｄｉ）およびＣＤ１９＋急性リンパ芽球性白血病（Ｎａｌｍ６）細胞株と対比して評価した。ＣＤ１９－Ｋ５６２細胞を陰性対照として含め、両方のアッセイにおいて非特異的殺傷を評価した。

４時間フローおよびＡＣＥＡ動力学細胞傷害性アッセイの両方において、Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９＋ＤａｕｄｉおよびＮａｌｍ６細胞を特異的に殺傷したが、ＣＤ１９－Ｋ５６２細胞を殺傷しなかった。４時間細胞傷害性アッセイにおいて、Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ対Ｎａｌｍ６標的の活性は、ＰＢＭＣ ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞のものと同等であったが、一方ＡＣＥＡ動力学細胞傷害性アッセイにおいては、Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ活性は、ＤａｕｄｉおよびＮａｌｍ６標的の両方に対してＰＢＭＣ ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞と同等であった。

さらに、Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロ機能活性を、サイトカイン放出アッセイにおいて、ＣＤ１９＋バーキットリンパ腫（Ｄａｕｄｉ）およびＣＤ１９＋急性リンパ芽球性白血病（Ｎａｌｍ６）細胞株と対比して評価した。Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を、１：１のＥ：Ｔ比で２４時間、ＣＤ１９＋標的と共培養し、細胞培養上清を採集し、様々なサイトカインおよびエフェクタータンパク質の分泌について分析した。ＣＤ１９ ＣＡＲ ＲＶで形質導入されたＰ－Ｔ細胞の３つのドナーを、ＰＢＭＣ由来のＣＤ１９ ＣＡＲ ＲＶ Ｔ細胞と評価／比較した。

さらに、Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９＋ＤａｕｄｉおよびＮａｌｍ６標的と共培養すると、抗原特異的な様式で、炎症誘発性サイトカインおよびエフェクタータンパク質（ＧＭ－ＣＳＦ、パーフォリン、ＴＮＦ－ａ、ＩＦＮ－ｇ、ＩＬ２、グランザイムＢ、およびグランザイムＡ）を分泌した。ＣＤ１９＋ＤａｕｄｉおよびＮａｌｍ６標的の両方に対して、Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＰＢＭＣ由来のカウント部分と比較して、より高い濃度のＧＭ－ＣＳＦ、パーフォリン、ＴＮＦ－ａ、グランザイムＢ、および特にＩＬ２を分泌した。ＩＬ２の著しく高い分泌は、分化が少なく、幹細胞様集団がより多いことを示し、より大きなＴ細胞増殖、増強されたＴ細胞機能、および生存を促進し得る。

実施例４：Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔのインビボ活性
インビボでは、Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性を、ＮＳＧマウスにおける播種性リンパ腫異種移植片モデルを使用して評価した。Ｄａｕｄｉ細胞（３×１０６）を発現するルシフェラーゼを、０日目に静脈内（ＩＶ）注射し、続いてＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＩＶ注射した。表１に概説したＣＤ８＋ＣＤ１９ ＣＡＲ＋頻度に従ってＰ－Ｔ細胞を投与した（Ｐ－Ｔ：ＲＶ：７日目に１４×１０６の１回投与、ＬＶ：７日目に２０×１０６の１回投与、または７日目、１０日目、および１４日目に２０×１０６の３回投与）。生物発光イメージング（ＢＬＩ）および生存率を主要評価項目として使用した。

Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞は、非ＴＲＡＣ改変Ｔ細胞の２０×１０６の３回用量であっても、このマウスモデルにおいて良好な忍容性を示し、かつ安全であった。全てのＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞は、腫瘍負荷を著しく低減し、生存率を改善した。処置の４週間後、ビヒクル群は１００％の死亡率を有したが、Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ処置群の全ての動物（Ｎ＝５）は、体重減少を含む臨床症状なしに生存したままであった。Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ ＬＶ処置群、ならびにＰＢＭＣ ＣＤ１９ ＣＡＲ（７ＭＭ）処置群は、腫瘍負荷を管理した。Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ ＬＶ細胞による複数回投与（３×）は、単回投与を超える改善を示し、７ＭＭのＰＢＭＣ ＣＤ１９－ＣＡＲ ＲＶ処置群よりもわずかに良好な腫瘍管理および生存率を呈した（両方とも合計で２．１ＭＭのＣＤ１９－ＣＡＲ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞で投与）。特に、Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ ＬＶ細胞単回投与（０．６ＭＭのＣＤ１９－ＣＡＲ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞）は、２ＭＭのＰＢＭＣ ＣＤ１９ ＣＡＲ ＲＶ処置群（０．６ＭＭのＣＤ１９－ＣＡＲ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞もまた）よりも腫瘍負荷を低減し、かつ生存率を改善した。驚くべきことに、Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ ＲＶ処置マウスは、１０９日目まで１００％の生存率で、全ての処置群よりも性能が優れ、腫瘍細胞を根絶した。未分化Ｔ細胞表現型は、ナイーブ／ｓｃｍおよびエフェクターＴ細胞の両方、ＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞との良好な混合、より大きなＣＤ８＋ＣＤ１９ ＣＡＲ＋の発現、ならびにより大きなサイトカイン分泌（特に、Ｔ細胞機能／生存率を支持するＩＬ２）と共に、全て本明細書に記載され、Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞、特にＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ ＲＶ Ｔ細胞でインビボで観察されるより大きな有効性および増強された生存率に全体的に寄与すると考えられる。

次いで、Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ ＲＶ処置群からの生存マウスを、追加のＤａｕｄｉ腫瘍細胞で再チャレンジした。１２２日目に、Ｄａｕｄｉ細胞（３×１０６）を発現するルシフェラーゼを、Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ ＲＶ処置した生存マウス、ならびに年齢適合（６ヶ月齢）ナイーブＮＳＧマウスに静脈内（ＩＶ）注射して、新しいビヒクル対照群として機能させた。

この研究はまだ進行中であるが、１５１日目（再チャレンジ後２８日）に、Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ ＲＶ再チャレンジ群内で著しく低いＢＬＩ（腫瘍負荷）を観察し、臨床症状（体重減少）を観察しなかったが、一方ビヒクル対照群ではＢＬＩの増加および体重減少を検出した。ＢＬＩ、体重、および生存率は引き続き監視され、改善されると予想される。

実施例５：ＵＣＢ－Ｔ細胞におけるＴ細胞受容体（ＴＲＡＣ）ノックアウト
ＴＲＡＣは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を使用して、ＴＲＡＣ遺伝子座の第１のエクソンに対して標的化した。Ｃａｓ９およびｇＲＮＡの化学的に改質したＲＮＡ形態を、ヌクレオフェクション（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）（Ｌｏｎｚａ）を介してＰ－Ｔ培養の６～８日目にＰ－Ｔ細胞にトランスフェクトした。遺伝子改変効率を、ＴＣＲ_α／βまたはＣＤ３に対する抗体を使用したフローサイトメトリーによって監視した。

３つの別個の実験において、ＴＲＡＣノックアウト効率をトランスフェクションの３日後に測定した。Ｘ軸上の日付は、トランスフェクションの時間を示す。Ｐ－Ｔ活性化方法および培養条件（ＩＬ２を有するダイナビーズまたはＩＬ７およびＩＬ１５を有するトランザクト）にかかわらず、９０％超のＴＲＡＣ遺伝子ノックアウトを達成した。Ｂ．細胞増殖および生存性は、ＣＲＩＳＰＲプロセスによって最小限の影響を受けた。異なる群間で細胞増殖および生存性に有意な変化はない。

さらに、Ｐ－Ｔ細胞を、３日目にＣＤ１９ ＣＡＲ ＬＶまたはＲＶで形質導入した後、６日目にＣＲＩＳＰＲを使用してトランスフェクションおよびＴＲＡＣ ＫＯを行った場合、１５日目のＰ－Ｔ ＮＴ－ＴＲＡＣ ＫＯおよびＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＴＲＡＣ ＫＯ細胞は、＞９７％のＴＲＡＣ ＫＯ効率を呈した。

さらに、ＴＲＡＣ ＫＯは、Ｐ－Ｔ細胞におけるＣＤ１９＋ＤａｕｄｉおよびＮａｌｍ６標的と対比して、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現またはインビトロ細胞溶解活性に有意な変化をもたらさなかった。

実施例６：インビトロアッセイで測定したＵＢＣ－Ｔ細胞の同種反応性
２つの独立したアッセイを使用して、Ｐ－Ｔ細胞に対するＰＭＢＣ、またはＰＢＭＣに対するＰ－Ｔ細胞の同種反応性を測定した。最初のアッセイでは、同種反応性を、４時間の共培養において、１人のドナーから別のドナーに対する細胞の殺傷活性として測定した。標的細胞をＰＫＨ２６で標識し、細胞傷害性を全標的細胞に対する死滅標的細胞の割合として表した。２番目のアッセイでは、同種反応性を、別のドナーと共培養したときの１人のドナーのＴ細胞の優先的増殖として測定した。２人のドナー由来の細胞を異なる染料（ＣＦＳＥおよびＰＫＨ２６）で標識し、１：１の比で４日間共培養する。染料の希釈は、細胞増殖を示し、高強度を有する細胞の割合の減少または平均蛍光強度の変化として表すことができる。

２つの別個の実験では、ＰＢＭＣ（複数可）由来のＴ細胞を、Ｐ－Ｔ細胞と共培養した。１人のドナーからのＰＢＭＣは、高い効率で別のドナーからのＰＢＭＣを殺傷した。しかし、ＰＢＭＣはＰ－Ｔ細胞（ＣＢＴ）を殺傷しなかった。別の実験では、ＰＭＢＣ由来Ｔ細胞（ＰＢＴ）は、高効率で癌細胞株ＲＰＭＩ８２２６（ＲＰＭＩ）を殺傷した。しかし、それらは、Ｐ－Ｔ細胞（ＣＢＴ）を殺傷する際に最小限の活性を有した。Ｐ－Ｔ細胞もＰＢＭＣ由来Ｔ細胞を殺傷しなかった。

Ｐ－Ｔ細胞および対照ＰＢＭＣをＰＫＨ２６で標識し、ＰＢＭＣをＣＦＳＥで標識した。ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣ、ＰＨＫ２６標識Ｐ－Ｔ（ＣＢＴ）、およびＣＦＳＥまたはＰＫＨ２６のいずれかで標識したＰＢＭＣの混合培養物を対照として機能させた。ＰＫＨ２６－ｈｉ Ｐ－Ｔ（ＣＢＴ）細胞の割合はＰ－Ｔのみの培養物と比較して低く、ＰＢＭＣとの共培養におけるＰ－Ｔ細胞の優先的な増殖を示している。

この結果と一致して、Ｐ－Ｔ細胞のＭＦＩは、Ｐ－Ｔ細胞のみと比較してＰＢＭＣとの共培養においても低下し、より良好な増殖を示すＰＢＭＣ対照とのＰＢＭＣとの比較においても低下した。対照的に、共培養中のＰＢＭＣのＭＦＩは、ＰＢＭＣのみと比較して、またはＰＢＭＣ培養物とのＰＢＭＣと比較して増加した。

実施例７：動物モデルにおけるＰ－Ｔ細胞の同種反応性
ＧｖＨＤのＮＣＧマウスモデルにおいて、非改変の２１日間増殖させたＰ－Ｔ細胞の同種反応性（異種同種反応性）を試験した。このモデルでは、ＰＢＭＣは体重減少として測定可能なＧｖＨＤを引き起こす。３人のドナーおよび対照ＰＭＢＣ由来の３，０００万個のＣＤ２５枯渇Ｐ－Ｔ細胞を、ＩＶ経路を介してＮＣＧマウスに注入した。動物の体重を経時的に監視した。

動物の体重変化を、細胞注入当日の体重に対する割合で表した。各線は、１匹のマウスを表す。ＰＢＭＣ群の５匹の動物は全て２８日間にわたって体重が減少し、犠牲にしなければならなかった。Ｐ－Ｔ群には有意な体重減少はなく、異種ＧｖＨＤを誘発しなかった。Ｐ－Ｔ細胞は、Ｔｒｅｇを除去するために増殖前にＣＤ２５が枯渇したため、ＧｖＨＤの欠如は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－ＦｏｘＰ３＋免疫制御性Ｔ細胞に起因しない。追加のＧｖＨＤ研究は、Ｐ－ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＴおよびＰ－ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＴＲＡＣ ＫＯ Ｔ細胞の同種反応性を評価するために進行中である。

本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際に、記載されるものに加えて、本発明の様々な修正は、前述の説明および添付の図面から当業者には明白になるであろう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。

本明細書に引用される全ての参考文献は、各個々の刊行物、特許または特許出願が、あらゆる目的のために、その全体が参照により組み込まれることを具体的かつ個別に指示されている場合と同程度まで、参照によりその全体が、あらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。刊行物の引用は、出願日前のその開示のためのものであり、本発明が、先行発明のためにこのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。

本明細書で使用する場合、「ゼータ」または代替的に「ゼータ鎖」、「ＣＤ３－ゼータ」もしくは「ＴＣＲ－ゼータ」は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＢＡＧ３６６６４．１として提供されるタンパク質として、または非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの等価残基として定義され、「ゼータ刺激ドメイン」または代替的に「ＣＤ３－ゼータ刺激ドメイン」もしくは「ＴＣＲ－ゼータ刺激ドメイン」は、Ｔ細胞活性化に必要な初期シグナルを機能的に伝達するのに十分であるゼータ鎖の細胞質ドメインまたはその機能的誘導体からのアミノ酸残基として定義される。一態様では、ゼータの細胞質ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＢＡＧ３６６６４．１の残基５２～１６４、またはその機能的オルソログである、非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの等価残基を含む。

本明細書で使用する場合、「４－ＩＢＢ」は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＡＡ６２４７８．２として提供されるアミノ酸配列、または非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの等価残基を有するＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーを指し、「４－１ＢＢ共刺激ドメイン」は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＡＡ６２４７８．２のアミノ酸残基２１４～２５５、または非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの等価残基として定義される。

Claims (42)

1. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞集団であって、前記Ｔ細胞が胎盤Ｔ細胞である、Ｔ細胞集団。
2. 前記胎盤Ｔ細胞が、臍帯血Ｔ細胞、胎盤灌流液Ｔ細胞、またはこれらの混合物である、請求項１に記載のＴ細胞集団。
3. 前記胎盤Ｔ細胞が、臍帯血Ｔ細胞である、請求項１に記載のＴ細胞集団。
4. 前記胎盤Ｔ細胞が、臍帯血Ｔ細胞と胎盤灌流液Ｔ細胞との混合物である、請求項１に記載のＴ細胞集団。
5. 前記ＣＡＲが、トランスフェクションによって前記細胞に導入されている、請求項１～４のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
6. 前記ＣＡＲが、ウイルス形質導入によって前記細胞に導入されている、請求項１～４のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
7. 前記ＣＡＲが、レトロウイルスベクターを用いたウイルス形質導入によって前記細胞に導入されている、請求項６に記載のＴ細胞集団。
8. 前記ＣＡＲが、レンチウイルスベクターを用いたウイルス形質導入によって前記細胞に導入されている、請求項６に記載のＴ細胞集団。
9. 前記Ｔ細胞集団が、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも高い割合のＣＤ４５ＲＡを発現する細胞を有する、請求項１～８のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
10. 前記Ｔ細胞集団が、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも高い割合のＣＤ２７を発現する細胞を有する、請求項１～９のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
11. 前記Ｔ細胞集団が、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも高い割合のＣＣＲ７を発現する細胞を有する、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
12. 前記Ｔ細胞集団が、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも高い割合のＣＤ１２７を発現する細胞を有する、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
13. 前記Ｔ細胞集団が、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも低い割合のＣＤ５７を発現する細胞を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
14. 前記Ｔ細胞集団が、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも高い割合のＣＤ６２Ｌを発現する細胞を有する、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
15. 前記Ｔ細胞集団が、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも低い割合のＣＤ２５を発現する細胞を有する、請求項１～１４のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
16. 前記Ｔ細胞集団が、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも高い割合のＬａｇ－３＋を発現する細胞を有する、請求項１～１５のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
17. 前記Ｔ細胞集団が、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも低い割合のＴｉｍ－３を発現する細胞を有する、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
18. 前記Ｔ細胞集団が、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも、癌細胞株の高いインビトロ殺傷を呈する、請求項１～１７のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
19. 前記Ｔ細胞集団が、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも、癌細胞株に対するインビトロチャレンジにおいて、より多くの量のパーフォリンを発現する、請求項１～１８のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
20. 前記Ｔ細胞集団が、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも、癌細胞株に対するインビトロチャレンジにおいて、より多くの量のＧＭ－ＣＳＦを発現する、請求項１～１９のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
21. 前記Ｔ細胞集団が、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも、癌細胞株に対するインビトロチャレンジにおいて、より多くの量のＴＮＦ－ａを発現する、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
22. 前記Ｔ細胞集団が、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも、癌細胞株に対するインビトロチャレンジにおいて、より多くの量のＩＬ－２を発現する、請求項１～２１のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
23. 前記Ｔ細胞集団が、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも、癌細胞株に対するインビトロチャレンジにおいて、より多くの量のグランザイムＢを発現する、請求項１～２２のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
24. 前記Ｔ細胞集団が、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも、インビボ癌モデルにおいて生存率の増加をもたらす、請求項１～２３のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
25. 前記Ｔ細胞集団が、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも、インビボ癌モデルにおいて体重減少の低下をもたらす、請求項１～２４のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
26. 前記Ｔ細胞集団が、末梢血単核細胞Ｔ細胞集団よりも、インビボ癌モデルにおいて移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の減少をもたらす、請求項１～２５のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
27. 前記末梢血単核細胞Ｔ細胞集団が、前記ＣＡＲも発現する、請求項９～２６のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
28. 前記ＣＡＲが、トランスフェクションによって前記末梢血単核細胞Ｔ細胞集団に導入されている、請求項２７に記載のＴ細胞集団。
29. 前記ＣＡＲが、ウイルス形質導入によって前記末梢血単核細胞Ｔ細胞集団に導入されている、請求項２７に記載のＴ細胞集団。
30. 前記ＣＡＲが、レトロウイルスベクターを用いたウイルス形質導入によって、前記末梢血単核細胞Ｔ細胞集団に導入されている、請求項２９に記載のＴ細胞集団。
31. 前記ＣＡＲが、レンチウイルスベクターを用いたウイルス形質導入によって、前記末梢血単核細胞Ｔ細胞集団に導入されている、請求項２９に記載のＴ細胞集団。
32. 前記末梢血単核細胞Ｔ細胞集団に導入されている前記ＣＡＲが、前記Ｔ細胞集団によって発現される同一のＣＡＲである、請求項１～３１のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
33. 前記Ｔ細胞集団が、宿主に対する免疫原性を低減するためのさらなる遺伝子変化を含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
34. 前記遺伝子変化が、遺伝子ノックアウトである、請求項３３に記載のＴ細胞集団。
35. 前記遺伝子ノックアウトが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ノックアウトである、請求項３４に記載のＴ細胞集団。
36. 前記遺伝子ノックアウトが、Ｔ細胞受容体アルファ定常遺伝子（ＴＲＡＣ）ノックアウトである、請求項３４に記載のＴ細胞集団。
37. 前記さらなる遺伝子変化が、トランスフェクション、レトロウイルス形質導入、またはレンチウイルス形質導入によって達成される、請求項３３～３６のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
38. 前記さらなる遺伝子変化が、ＣＲＩＳＰＲ、ターレン、またはジンクフィンガー技術の使用によって達成される、請求項３３～３６のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
39. 癌またはその症状の治療を、それを必要とする患者において行う方法であって、前記方法が、前記患者において前記癌またはその症状を緩和するのに有効な量の請求項１～３８のいずれか一項に記載のＴ細胞集団を前記患者に投与する工程を含む、方法。
40. 前記癌が血液癌である、請求項３９に記載の方法。
41. 前記血液癌が、Ｂ細胞癌である、請求項４０に記載の方法。
42. 前記Ｔ細胞集団が、前記患者に対して同種である、請求項３９～４１のいずれか一項に記載の方法。

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