JP2021534802A

JP2021534802A - 複数のｈｌａ−ｇアイソフォームに対するキメラ抗原レセプター

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Publication number: JP2021534802A
Application number: JP2021511646A
Authority: JP
Inventors: ロウストウ，マリア; アンナ，フランソワ; デモイェン，ピエールラングラード; コーマルティン，ジュリアン
Original assignee: アンヴェクティエスアー
Priority date: 2018-08-31
Filing date: 2019-08-30
Publication date: 2021-12-16
Anticipated expiration: 2039-08-30
Also published as: BR112021003757A2; MX2021002316A; US11505608B2; US20230250175A1; CN112912105A; IL281097A; US11325977B2; US20220281981A1; ZA202101358B; CA3110905A1; KR20210112295A; US20210040217A1; US11117971B2; AU2019328677A1; JP7394840B2; WO2020043899A1; EP3843778A1; SG11202101849XA; US20210403574A1

Abstract

【課題】複数のＨＬＡ−Ｇアイソフォームに対するキメラ抗原レセプターに関する。【解決手段】本発明は、全てではないが、複数のヒト白血球抗原（ＨＬＡ−Ｇ）アイソフォームに対するキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）に関する。より詳しくは、本発明は、それぞれＨＬＡ−Ｇ β２Ｍフリー又はβ２Ｍ会合免疫抑制アイソフォームに特異的なＣＡＲに関するものである。【選択図】なし

Description

本発明は、免疫学、細胞生物学、及び分子生物学の分野に関する。ある態様では、本発明の分野は、免疫療法に関する。より詳細には、本発明は、複数のヒト白血球抗原（ＨＬＡ−Ｇ）アイソフォームに対するキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）に関する。

何年もの間、癌処置の基礎は、手術、化学療法、及び放射線療法であった。しかしながら、過去数年間で、免疫療法が、癌処置の効果的なツールとして浮上してきた。

遺伝子工学の進歩が、Ｔ細胞などのヒト免疫細胞に導入して、抗原特異性をリダイレクトし、エフェクター免疫細胞の機能を強化することができる、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と呼ばれる合成腫瘍標的受容体の設計につながった。ＣＡＲは、１９８０年代半ばに最初に開発され、それ以来、これらの受容体への関心が高まっている。これらの受容体は、ＨＬＡ−ペプチド複合体とは独立に特定の抗原認識を提供することによって、Ｔ細胞を発現する固有のＴＣＲ特異性をバイパスするために最初に作製された。プロトタイプの一本鎖ＣＡＲは、１９９３年にEshharらによる研究で最初に説明され、この一本鎖ＣＡＲでは、Ｔ細胞の特異的活性化及び標的化は、標的抗原特異的抗体ドメインと、Ｆｃイプシロン受容体のγシグナル伝達サブユニット又はＴ細胞受容体ＣＤ３複合体のζシグナル伝達サブユニットとからなる分子を介して媒介された（Eshhar et al., 1993, Proc Natl Acad Sci. U S A., 90, 720-4）。それ以来、多くのグループが、単一の腫瘍に対する特異性及び強化されたシグナル伝達エンドドメイン（endodomain）を備えたＣＡＲ分子を考案してきた。今日、ＣＡＲの結合ドメインは、典型的には、ライブラリーから選択され、柔軟なリンカーによって結合されたモノクローナル抗体（Ｍａｂ）の軽鎖及び重鎖可変断片を含む一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の抗原結合ドメイン又は抗体結合断片（Ｆａｂ）からなる。ｓｃＦｖは、それが由来する完全な抗体と同じ特異性及び同様の親和性を保持し、目的の標的に特異的に結合することができる。従って、ＣＡＲは、単一の融合分子内で抗原特異性とＴ細胞活性化特性を組み合わせている。実際、ｓｃＦｖは、ＣＤ３ζを含む細胞内シグナル伝達モジュールに連結され、抗原結合時にＴ細胞の活性化を誘導する。モジュール構造は、共刺激を模倣しようとして、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインのみを備えた第１世代のＣＡＲから、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０などのシグナル伝達エンドドメインをＣＤ３ζに連結する第２世代及び第３世代ＣＡＲに拡張されている。一般に、スペーサー又はヒンジドメインは、エンドドメインとｓｃＦＶとの間のリンカーとして働く。そのようなヒンジドメインの組み込みは、柔軟性、空間的構成及び／又は近接性を改善するだけでなく、ＣＡＲ細胞の拡大（Qin et al, Journal of Hematology & Oncology.2017; 10:68）又は腫瘍の局在（Watanabe et al, Oncoimmunology. 2016; 5(12): e1253656）も改善する。したがって、最適化されたヒンジドメインを含むＣＡＲを開発することが重要である。

ＣＡＲは、ＭＨＣに依存しないメカニズムでＴ細胞が癌を標的にすることを可能にする。ＣＡＲのリガンド結合は、受容体親和性、抗原密度、及び空間特性において、ペプチド／ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）に結合するＴＣＲのリガンド結合とは異なり；特定の標的分子に最適なＣＡＲを設計するための実験的アプローチは、インビトロ又はヒト腫瘍異種移植モデルにおける形質導入Ｔ細胞の機能アッセイに依存している。ＴＣＲ／ｐＭＨＣ認識で観察されるように、ＣＡＲが標的分子と連続的に結合し、組織化されたシナプスにクラスター化する可能性が低いため、ＣＡＲ認識にはＴＣＲよりも高いリガンド密度が必要であると考えられる。これらの受容体の最適な構成及び適用は、親和性と特異性に加えて、コンストラクトの設計、シグナル伝達ドメイン、ベクター送達システム、レシピエントの免疫細胞集団、及び製造に依存している。

固形腫瘍に対するＣＡＲＴ細胞の成功を達成するための多くの試みが行われてきたが、結果は時に失望するものであった。固形腫瘍へのＣＡＲＴ細胞療法の適用で遭遇する３つの主な障害は、（１）適切な腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の同定、（２）腫瘍部位への養子移植細胞の導入の制限、（３）腫瘍微小環境の免疫抑制効果、及び（４）望ましくない又は形質転換されていない細胞の潜在的な安全性問題である。

標的の選択に関して、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）はその母親の認識及び破壊の免疫系から胎児に防御を付与し、胎児−母体間の寛容を提供することができる分子として描かれる。生理学的機能に加えて、ＨＬＡ−Ｇは最近、免疫チェックポイント（ＩＣＰ）分子として確認されたが、それはその特定のレセプターとの相互作用を通して免疫細胞サブセットに浸透するというエフェクター機能を阻害するものである。ＨＬＡ−Ｇは、非常に限定された組織発現を伴う多様な起源の多数の腫瘍滲出液中で発現される。いくつかの悪性転換では、腫瘍細胞によるＨＬＡ−Ｇの発現は劇的に上昇し、強力に免疫抑制的となる。前臨床モデルは、癌細胞上でのＨＬＡ−Ｇの発現はそれらをより転移性にし、患者の生存を有意に減少させることを示している(Lin A et al.. Int J Cancer. 2012 Jul 1;131(1):150-7. doi: 10.1002/ijc.26375 ; Lin A et al. Hum Immunol. 2013 Apr;74(4):439-46. doi: 10.1016/j.humimm.2012.11.021)。

ＨＬＡ−Ｇは絨毛癌細胞で最初に同定された、非古典的ＨＬＡクラスＩの分子である。古典的なＨＬＡクラスＩの分子とは異なり、ＨＬＡ−Ｇは限定された多型によって特徴付けられ、その発現、構造及び機能も異なる。ＨＬＡＧの一次転写産物は選択的スプライシングを受け、７つのアイソフォームの発現をもたらし、その４つは膜結合型（ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３及びＨＬＡ−Ｇ４）であり、残りの３つは可溶型（ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６及びＨＬＡ−Ｇ７）である。ＨＬＡ−Ｇ１とＨＬＡ−Ｇ５は最も研究されたアイソフォームであり、古典的ＨＬＡクラスＩ分子の典型的な構造を示しており：β２ミクログロブリン（β２Ｍ）とペプチドに非共有結合した３つの球状ドメインで構成される重鎖であるが、他のアイソフォームはより短く、重鎖の１つ又は２つのドメインを欠き、β２Ｍと結合しない。

ＣＡＲ免疫療法を開発するための基本的な基準は、適切なＴＡＡの同定、遺伝子導入エフェクター細胞のアクセシビリティ及び免疫抑制腫瘍微小環境の可逆性であること、そしてまた腫瘍細胞によるＨＬＡ−Ｇの新規発現(neo-expression)及び腫瘍微小環境の免疫抑制効果へのその寄与並びにＩＣＰとしての及び免疫逃避機構におけるその役割について考慮すると、ＨＬＡ−Ｇはこの分子を遮断できる新規免疫療法を開発するための例外的な候補である。さらに、同種異系ＨＬＡ−Ｇに対する刺激機能又は細胞応答が報告されておらず、ＨＬＡ−Ｇ発現が組織限定的であることを考慮すると、ＨＬＡ−Ｇに対する細胞溶解性ＣＡＲ細胞の生成は、癌免疫療法の分野において新たな可能性を開くといえよう。

国際公開第２０１６／１６０６２２号は、ＨＬＡ−Ｇに対する抗体及びＣＡＲ細胞内でのそれらの使用を開示している。しかしながら、ＨＬＡ−ＧｍＲＮＡは異なるタンパク質アイソフォームにスプライシングされるので、免疫抑制性アイソフォームを発現する細胞の大部分を除去するために、異なるＨＬＡ−Ｇアイソフォーム（β２Ｍ会合(β2M-associated)ＨＬＡアイソフォーム及びより小さなβ２Ｍフリーアイソフォーム）及び／又は最も豊富なアイソフォームを特異的に認識することができるＣＡＲを開発する必要があるのみならず、ＣＡＲ細胞の拡大及び選択を改善するために最適化されたスペーサードメイン並びに選択マーカーを含むＣＡＲコンストラクトも開発する必要がある。

最大数のＨＬＡ−Ｇアイソフォームを目指して、本発明者らは、新規抗ＨＬＡ−Ｇ特異的モノクローナル抗体（Ｍａｂ）のｓｃＦｖ誘導体を用いて、ＨＬＡ−Ｇに対するいくつかのキメラ抗原レセプターを開発した。これらのＭａｂはＨＬＡ−Ｇに対して高い親和性を示し、この分子の発現の異型遺伝子性を考慮して、分子の異なるエピトープに向けられている [Alegre et al, Eur. J. Immunol. 2013. 43: 1933-1939; Alegre E et al, 2014, Journal of Immunology Research, 2014: 657625]。本発明者らは、また、抗ＨＬＡ−ＧＣＡＲ細胞の効力を改善するために、抗原結合ドメインとエンドドメインとの間のスペーサードメインを最適化した。本発明者らは、最終的に、形質導入されたＣＡＲ細胞の選択を可能にする切断可能なリンカー及びレポーターを含むＣＡＲコンストラクトを設計した。

本発明は、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を提供するが、前記ＣＡＲは、１〜６個のＨＬＡ−Ｇアイソフォーム、好ましくは２〜５個のＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的に結合し、好ましくはそのようなＣＡＲはＨＬＡ−Ｇアイソフォームの識別を可能にする。すなわち、ＣＡＲは、７つのＨＬＡ−Ｇアイソフォームの全てを認識するものではなく、また全てに結合するものでもない。

一態様では、ＣＡＲはβ２ＭフリーＨＬＡ−Ｇ又はβ２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的に結合する。又は、ＣＡＲは、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ５及びＨＬＡ−Ｇ６からなる群から選択されるＨＬＡ−Ｇアイソフォームと特異的に結合する。別の態様では、ＣＡＲは、ＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５の両方に、若しくはＨＬＡ−Ｇ２及びＨＬＡ−Ｇ６の両方に、及び／又はＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍフリー及びＨＬＡ−Ｇ５／β２Ｍフリーアイソフォームの両方に特異的に結合する。

本発明は、特に、ＮからＣ末端に向かって連続的に、（ａ）ペプチドシグナル配列、ｂ）抗ＨＬＡ−Ｇ抗体又はその抗原結合フラグメント、ｃ）任意にスペーサードメイン、ｄ）膜貫通ドメイン、ｅ）細胞内ドメイン、及び任意にｆ）切断可能なリンカー及び任意にｇ）切断型ヒトＣＤ１９ドメインを含む抗ＨＬＡ−Ｇキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を提供する。

一態様では、スペーサードメインは、（ｉ）ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン、（ｉｉ）ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン及びＣＨ３ヒトＩｇＧ４ドメイン、若しくは（ｉｉｉ）変異ＣＨ２ヒトＩｇＧ４ドメイン、ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン及びＣＨ３ヒトＩｇＧ４ヒンジドメインを含むか、又はそれらからなる。好ましくは、スペーサードメインは、（ｉ）配列番号２５、（ｉｉ）配列番号２５及び配列番号２７、若しくは（ｉｉｉ）配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７で示される配列、又は８０％を超える、好ましくは９０％を超える、さらに好ましくは９５％を超える同一性を示す相同配列を含むか、若しくはそれからなる。

別の態様では、シグナルペプチドは、ＣＤ８ａシグナルペプチド、マウスＩｇカッパシグナルペプチド、ヒトＩｇＧ４シグナルペプチド、ＩＬ２シグナルペプチド、ヒトＩｇＧ２シグナルペプチド、及びガウシアｌｕｃシグナルペプチドからなる群から選択される。

特定の態様では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ３及びＣＤ８膜貫通ドメインから選択され、好ましくは膜貫通ドメインはＣＤ２８膜貫通ドメインである。

好ましくは、本発明の抗ＨＬＡ−ＧＣＡＲは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインと、ＣＤ２８、４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ１４９、ＤＡＰ１０、ＣＤ３０、ＩＬ２−Ｒ、ＩＬ７ｒ６、ＩＬ２１−Ｒ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＣＤ２７、ＣＤ１３７及びＤＮＡＭ−１共刺激ドメインから選択される少なくとも１つの共刺激ドメインとを含む細胞内ドメインを含み、好ましくは２つの共刺激ドメインは４１ＢＢ及びＣＤ２８共刺激ドメインである。

１つの態様では、切断可能なリンカーは、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｂ２Ａ及びＦ２Ａからなる群より選択される。

別の態様では、切断型ヒトＣＤ１９ドメインは、配列番号２９で示される配列からなる。

特に、ＣＡＲ、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体又はその抗原結合フラグメント、好ましくはｓｃＦＶは、β２ＭフリーＨＬＡ−Ｇ又はβ２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇアイソフォームに選択的に結合するが、全てのＨＬＡ−Ｇアイソフォームに結合するものではない。

別の態様では、ＣＡＲ、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体若しくはその抗原結合フラグメント、好ましくはｓｃＦＶ、又はＣＡＲを発現する細胞は、ＨＬＡ−Ｇのアルファ１ドメインに結合しない。

好ましくは、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下を含む抗ＨＬＡ−ＧｓｃＦｖである：
（ａ）（ｉ）重鎖可変領域は、配列番号１、若しくは配列番号１と８０％超、好ましくは９０％超、さらに好ましくは９５％超の同一性を示す相同配列を含み、（ｉｉ）軽鎖可変領域は、配列番号２、若しくは配列番号２と８０％超、好ましくは９０％超、さらに好ましくは９５％超の同一性を示す相同配列を含むか、又は
（ｂ）（ｉ）重鎖可変領域は、配列番号３、若しくは配列番号３と８０％超、好ましくは９０％超、さらに好ましくは９５％超の同一性を示す相同配列を含み、（ｉｉ）軽鎖可変領域は、配列番号４、若しくは配列番号４と８０％超、好ましくは９０％超、さらに好ましくは９５％超の同一性を示す相同配列を含む。

好ましくは、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、β２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇ、好ましくはＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５の両方に特異的に結合するｓｃＦｖであり、ｓｃＦｖは以下を含む：
（ａ）（ｉ）重鎖可変領域は、配列番号１、若しくは配列番号１と８０％超、好ましくは９０％超、さらに好ましくは９５％超の同一性を示す相同配列を含み、（ｉｉ）軽鎖可変領域は、配列番号２、若しくは配列番号２と８０％超、好ましくは９０％超、さらに好ましくは９５％超の同一性を示す相同配列を含むか、又は
（ｂ）（ｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ（相補性決定領域）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号１を含み、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号２を含む。

或いは、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、β２ＭフリーＨＬＡ−Ｇ、好ましくはＨＬＡ−Ｇ２及びＨＬＡ−Ｇ６の両方及び／又はＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍフリー及びＨＬＡ−Ｇ５／β２Ｍフリーの両方のアイソフォームに特異的に結合するｓｃＦｖであり、ｓｃＦｖは以下を含む：
（ａ）（ｉ）重鎖可変領域は、配列番号３、若しくは配列番号３と８０％超、好ましくは９０％超、さらに好ましくは９５％超の同一性を示す相同配列を含み、（ｉｉ）軽鎖可変領域は、配列番号４、若しくは配列番号４と８０％超、好ましくは９０％超、さらに好ましくは９５％超の同一性を示す相同配列を含むか、又は
（ｂ）（ｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ（相補性決定領域）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号３を含み、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号４を含む。

好ましくは、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインと、ＣＤ２８、４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ１４９、ＤＡＰ１０、ＣＤ３０、ＩＬ２−Ｒ、ＩＬ７ｒ６、ＩＬ２１−Ｒ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＣＤ２７、ＣＤ１３７及びＤＮＡＭ−１共刺激ドメインから選択される少なくとも１つの共刺激ドメインとを含み、好ましくは２つの共刺激ドメインは４１ＢＢ及びＣＤ２８共刺激ドメインである。

好ましくは、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ３及びＣＤ８膜貫通ドメインから選択され、好ましくは、膜貫通ドメインはＣＤ２８膜貫通ドメインである。

好ましくは、ＣＡＲは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに連結するヒンジ領域、好ましくは（ｉ）ＣＤ２８ヒンジ、（ｉｉ）ＣＤ８アルファヒンジ、（ｉｉｉ）ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン、（ｉｖ）ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン及びＣＨ３ヒトＩｇＧ４ドメイン、並びに（ｖ）変異ＣＨ２ヒトＩｇＧ４ドメイン、ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン及びＣＨ３ヒトＩｇＧ４ヒンジドメインからなる群の中で選択されるヒンジ領域をさらに含む。

また、本発明は少なくとも２つの異なる抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、抗原結合ドメインの少なくとも１つは、ＨＬＡ−Ｇのβ２Ｍドメイン会合ＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的に結合し；抗原結合ドメインの少なくとも別の１つは、ＨＬＡ−Ｇのβ２ＭドメインフリーのＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的に結合する、多重特異性ＣＡＲコンストラクトにも関する。

好ましくは、多重特異性ＣＡＲコンストラクトは、（ｉ）配列番号１１、１２及び１３の配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）を含むドメイン、（ｉｉ）配列番号１４、１５及び１６の配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含むドメイン、（ｉｉｉ）配列番号５、６及び７の配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）を含むドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号８、９及び１０の配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含むドメインを含む二重特異性ＣＡＲコンストラクトであり、任意に各ＣＤＲは、任意に１、２、３又は４個のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含んでもよい。

本発明はまた、本発明のＣＡＲをコードする核酸分子、核酸分子を含む発現ベクター、及び本発明のＣＡＲ若しくは本発明の核酸分子を含む細胞、又は本発明の発現ベクターを想定しており、好ましくは、細胞はＴ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、単球及び樹状細胞からなる群より選択され、好ましくは細胞はＴ細胞、Ｂ細胞又はＮＫ細胞である。

本発明はまた、本発明の、核酸分子、発現ベクター又は細胞及び任意に薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。好ましくは、本発明の細胞若しくは本発明の医薬組成物は、癌の治療に使用するためのもの、又はウイルス感染の治療に使用するためのものである。このような使用のための細胞又は医薬組成物は、ＨＬＡ−Ｇを標的としないＣＡＲ療法と組み合わせて投与することができる。

一態様では、医薬組成物は（ｉ）β２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇ；好ましくはＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５の両方に特異的に結合するＣＡＲを含む細胞、並びにβ２ＭフリーＨＬＡ−Ｇ、好ましくはＨＬＡ−Ｇ２及びＨＬＡ−Ｇ６の両方に、及び／又はＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍフリー及びＨＬＡ−Ｇ５／β２Ｍフリーアイソフォームの両方に特異的に結合するＣＡＲを含む細胞；を含み、或いは（ｉｉ）ＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５の両方に若しくはβ２ＭフリーＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的に結合するＣＡＲ、並びにＨＬＡ−Ｇ２及びＨＬＡ−Ｇ６の両方に若しくはβ２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的に結合するＣＡＲを含む細胞を含む。

本発明は最終的に、β２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇアイソフォーム、好ましくはＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５の両方に特異的に結合する抗ＨＬＡ−Ｇ抗体に関する。そのような抗体は、以下を含む：
（ａ）（ｉ）重鎖可変領域は、配列番号１若しくは配列番号１と８０％超、好ましくは９０％超、さらに好ましくは９５％超の同一性を示す相同配列を含み、（ｉｉ）軽鎖可変領域は、配列番号２、若しくは配列番号２と８０％超、好ましくは９０％超、さらに好ましくは９５％超の同一性を示す相同配列を含むか、又は
（ｂ）（ｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ（相補性決定領域）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、配列番号１を含み、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号２を含む。

（Ａ）ＨＬＡ−Ｇレセプター（Ｂ）ＨＬＡ−Ｇ一次転写産物の選択的スプライシングにより７つのＨＬＡ−Ｇアイソフォーム、４つの膜結合及び３つの可溶性アイソフォームを生成する（Ｃ）ＨＬＡ−Ｇの免疫抑制機能。フローサイトメトリーにより分析したモノクローナル抗体特異性。（Ａ）１５Ｅ７モノクローナル抗体は、β２ＭフリーＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的である。（Ｂ）１５Ｅ７抗体によって標識された細胞株を発現する細胞表面ＨＬＡ−Ｇ１。（Ｃ）ＬＦＴＴ−１抗体によって標識された細胞株を発現する細胞表面ＨＬＡ−Ｇ１。（Ａ）１５Ｅ７の第３のＣＡＲの生成構造。（Ｂ）ＬＦＴＴ−１の第３のＣＡＲの生成構造。（Ａ）３つのＨＬＡ−ＧＣＡＲ鎖であって、それらのヒンジに依存する鎖、及び（Ｂ）得られるＨＬＡ−ＧＣＡＲタンパク質の模式図。（Ａ）Ｊｕｒｋａｔ及びマウスＮＫＴ１．２細胞株上の抗ＨＬＡ−ＧＣＡＲ１５Ｅ７及びＬＦＴＴ−１発現をフローサイトメトリーにより分析した。（Ｂ）ＨＬＡ−ＧＣＡＲ１５Ｅ７及びＬＦＴＴ−１細胞表面発現を免疫蛍光法により測定した。（Ａ）活性化分析の原理。（Ｂ）１５Ｅ７（左パネル）及びＬＦＴＴ−１（右パネル）抗体によるＨＬＡ−Ｇ１の結合。（Ｃ）エフェクターＨＬＡ−ＧＣＡＲ細胞活性化の代表的な図。（Ｄ）エフェクターＨＬＡ−ＧＣＡＲ細胞は、ＨＬＡ−Ｇ発現標的細胞の存在下で強く活性化された。フローサイトメトリーによって分析されたＣＡＲの特異性。（Ａ）ＪｕｒｋａｔＨＬＡ−ＧＣＡＲ１５Ｅ７は、ＨＬＡ−Ｇ／β２Ｍ^ｎｅｇ発現細胞の存在下で強く活性化された。（Ｂ）ＮＫＴ１．２ＨＬＡ−ＧＣＡＲＬＦＴＴ−１はＪｅｇ−３細胞株の存在下で強く活性化された。ＨＬＡ−ＧＣＡＲＴ細胞の細胞溶解性機能を、Ｋ５６２、Ｋ５６２−ＨＬＡ−Ｇ１及びＪＥＧ−３腫瘍細胞について（Ａ）腫瘍細胞の溶解を調査し、（Ｂ）エフェクターＣＡＲ細胞上のＣＤ１０７ａ発現を調査した。ＨＬＡ−ＧＣＡＲのＩＦＮ−γ分泌を、Ｋ５６２、Ｋ５６２−ＨＬＡ−Ｇ１及びＪＥＧ−３腫瘍細胞との共インキュベーション後に調べた。ＨＬＡ−ＧＣＡＲ−Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍機能（Ａ）ＨＬＡ−ＧＣＡＲ−Ｔ細胞を用いたマウスでのインビボ実験のスキーム（Ｂ）ＮＧＳマウスでのＨＬＡ−Ｇ腫瘍細胞に対するＣＡＲ−Ｔ細胞のインビボ細胞毒性。

発明の詳細な説明
序論
本発明は、抗ＨＬＡ−Ｇ特異的抗体の抗原結合ドメイン、任意に（ｉ）ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン、（ｉｉ）ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン及びＣＨ３ヒトＩｇＧ４ドメイン、若しくは（ｉｉｉ）変異ＣＨ２ヒトＩｇＧ４ドメイン、ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン及びＣＨ３ヒトＩｇＧ４ヒンジドメインを含むか又はそれらからなるヒンジドメインにより大部分が構成される細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、ＣＡＲ設計の生成に応じて１、２又は３つの共刺激構造、任意に切断可能リンカー及び任意にレポーターを含む細胞内ドメインとを含むキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）に関する。

特に、本発明のＣＡＲは、１〜６個、好ましくは２〜５個のＨＬＡ−Ｇアイソフォーム、より好ましくはＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ５及びＨＬＡ−Ｇ６から選択されるものに特異的に結合する。

本発明はまた、ＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５アイソフォームの両方、又はＨＬＡ−Ｇ２及びＨＬＡ−Ｇ６アイソフォームの両方に特異的に結合するＣＡＲに関する。

さらに、多重特異性ＣＡＲコンストラクト、好ましくは、β２ＭフリーのＨＬＡ−Ｇアイソフォームを、好ましくはＨＬＡ−Ｇ２及びＨＬＡ−Ｇ６の両方及び／又はＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍフリー及びＨＬＡ−Ｇ５／β２Ｍフリーアイソフォームの両方を認識する１つのドメインを含む二重特異性ＣＡＲコンストラクト；及びβ２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇアイソフォーム、好ましくはＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５アイソフォームを認識する１つのドメインが提供される。

一態様では、本発明はさらに、β２Ｍ（ベータ−２−ミクログロブリン）フリーＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的に結合するＣＡＲに関する。別の態様では、本発明はさらに、β２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的に結合するＣＡＲに関する。

本発明は特に、ＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５の両方、又はＨＬＡ−Ｇ２及びＨＬＡ−Ｇ６アイソフォームの両方に特異的に結合するモノクローナル抗体又は一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）分子に関する。本発明はまた、β２ＭフリーＨＬＡ−Ｇアイソフォーム、好ましくはＨＬＡ−Ｇ２及びＨＬＡ−Ｇ６の両方及び／又はＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍフリー及びＨＬＡ−Ｇ５／β２Ｍフリーアイソフォームの両方に特異的に結合するモノクローナル抗体又は一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）分子に関する。本発明はさらに、β２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇアイソフォーム、好ましくはＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５アイソフォームに特異的に結合するモノクローナル抗体又は一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）分子に関する。

本発明はまた、細胞、好ましくはＴ細胞などの免疫細胞に形質導入することができ、それによってコードされたＣＡＲを発現するように操作された組換え免疫細胞を作製することができる核酸コンストラクト又は核酸コンストラクトを含有するベクターに関する。また、本発明のＣＡＲを発現するように形質導入された細胞、細胞集団、及びＣＡＲを発現する細胞を含有する医薬組成物が提供される。

本発明は特に、２つの異なるＣＡＲ、特に、β２ＭフリーＨＬＡ−Ｇアイソフォーム、好ましくはＨＬＡ−Ｇ２及びＨＬＡ−Ｇ６の両方及び／又はＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍフリー及びＨＬＡ−Ｇ５／β２Ｍフリーの両方に特異的に結合するＣＡＲ；及びβ２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇアイソフォーム、好ましくはＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５アイソフォームに特異的に結合するＣＡＲを発現する免疫細胞に関し得る。

組成物の中には、養子細胞療法などの投与のための医薬組成物及び製剤がある。また、ＣＡＲ発現細胞を調製し、この細胞及び組成物を被験者、例えば患者に投与するための方法も提供される。

略語

定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。

本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）、「エンジニアリングされた細胞受容体」、「キメラ細胞受容体」、又は「キメラ免疫受容体」（ＩＣＲ）という用語は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）に抗原結合特異性を移植するエンジニアリングされた受容体を指し、したがって、抗原結合ドメインの抗原結合特性を、Ｔ細胞の溶解能力及び自己複製などの免疫細胞の免疫原性活性と組み合わせる。特に、ＣＡＲは、抗原に結合することができる細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、任意選択によるヒンジドメイン、及び少なくとも１つの細胞内ドメインを含む融合タンパク質を指す。「抗原に結合できる細胞外ドメイン」、「外部ドメイン」、「エクトドメイン」、及び「抗原結合ドメイン」という用語は、本明細書では互換的に使用され、標的抗原に結合できる任意のオリゴペプチド又はポリペプチド（例えばＨＬＡ−Ｇアイソフォーム）を意味する。特に、本明細書で使用される「抗原結合ドメイン」又は「抗原特異的標的ドメイン」という用語は、特定の抗原、例えばＨＬＡ−Ｇ抗原を標的とし、それに結合するＣＡＲの領域を指す。ＣＡＲが宿主細胞で発現されると、このドメインは、受容体の細胞外ドメイン（エクトドメイン）を形成する。ＣＡＲの抗原結合ドメインは、典型的には抗体に由来し、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の抗原結合ドメイン又は抗原結合断片（Ｆａｂ）からなり得る。「細胞内ドメイン」、「内部ドメイン」、「細胞質ドメイン」、及び「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、本明細書で互換的に使用され、細胞内の生物学的プロセスの活性化又は阻害を引き起こすシグナルを伝達するドメインとして機能することが知られている任意のオリゴペプチド又はポリペプチドを意味する。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを含む核酸配列が形質導入された細胞の免疫エフェクター機能、例えばサイトカインの分泌を含む細胞溶解活性及びヘルパー活性を促進するシグナルを生成することができる。「膜貫通ドメイン」という用語は、細胞膜にまたがることが知られており、細胞外ドメインとシグナル伝達ドメインを連結するように機能し得る任意のオリゴペプチド又はポリペプチドを意味する。これは、単一のアルファヘリックス、膜貫通ベータバレル、グラミシジンＡのベータ−ヘリックス、又はその他の構造であり得る。典型的には、膜貫通ドメインは、内在性タンパク質としても知られる膜貫通タンパク質の単一の膜貫通アルファヘリックスを示す。

キメラ抗原受容体は、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間のリンカーとして機能する「ヒンジドメイン」を任意に含み得る。本明細書で使用される「ヒンジ」、「スペーサー」、又は「リンカー」という用語は、例えば、柔軟性、改善された空間構成、及び／又は近接性を与えるために、ポリペプチドコンストラクトの２つ以上のドメイン間で典型的にコードされる可変長のアミノ酸配列を指す。

本明細書で使用する場合、用語「切断可能なリンカー」は、タンパク質分解的に切断され得る、又はプロテアーゼ若しくは酵素によって消化され得る、又は自己切断する可変長のペプチド鎖を指す。ペプチドリンカーの切断後、その完全性は一般に損なわれ、切断可能なリンカーの両側（Ｃ及びＮ末端）に位置するドメインの分離を生じる。「切断可能なリンカー」は一般に、切断部位を含む。本明細書で使用する場合、用語「切断部位」は、プロテアーゼなどの切断剤によって特異的に切断され得るか、又は自己切断するアミノ酸の特定の配列をいう。ｓｃＦｖに関連して使用される「リンカー」という用語は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を１つに連結するために、単独で又は組み合わせて使用されるグリシン及び／又はセリン残基などのアミノ酸からなるペプチドリンカーを指す。

キメラ抗原受容体は、任意にシグナルペプチドを含み得る。「シグナルペプチド」、「標的シグナル」、「局在化シグナル」、「輸送ペプチド」、又は「リーダー配列」という用語は、分泌経路に向かう、新しく合成されたタンパク質の大部分のＮ末端に存在する短いペプチドを指す。シグナルペプチドのコアは、疎水性アミノ酸の長いストレッチを含み得る。シグナルペプチドは、成熟ポリペプチドから切断されてもよいし、切断されなくてもよい。

本明細書で使用される「抗体（antibody）」及び「抗体（antibodies）」という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ抗体、キメラ抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体などの抗体結合フラグメント、単一ドメイン抗体、抗原結合断片（Ｆａｂ）、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合可変断片（ｓｄＦｖ）イントラボディ、ナノボディ、及びこれらのいずれかのエピトープ結合断片を指す。特に、抗体には、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、即ち、抗原結合部位を含む分子が含まれる。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ_２）、又はサブクラスであり得る。特に断らない限り、用語「抗体」には無傷の免疫グロブリン及び「抗体フラグメント」又は「抗原結合フラグメント」が含まれ、これらは目的の分子（又はＨＬＡ−Ｇアイソフォームなどの類似した目的の分子の群）に特異的に結合して、他の分子への結合を実質的に排除する。「抗体」という用語はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロ複合体抗体（例えば、二重特異性抗体）などの遺伝子操作された形態を含む。好ましくは、抗体という用語は、モノクローナル抗体を指し、さらにより好ましくは、モノクローナル抗体に由来するｓｃＦｖを指す。

構造に関しては、抗体は、ジスルフィド結合によって相互連結された重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）を有し得る。軽鎖には、ラムダ（λ）及びカッパ（κ）の２種類がある。各重鎖及び軽鎖には、定常領域及び可変領域（又は「ドメイン」）が含まれる。軽鎖及び重鎖可変領域には、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」領域が含まれる。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲が定義されている（参照により本明細書に組み込まれる、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991を参照されたい）。フレームワーク領域は、鎖内の非共有相互作用によってＣＤＲを正しい向きに配置するための足場を形成するように機能する。ＣＤＲは、主に抗原のエピトープへの結合に関与する。各鎖のＣＤＲは、典型的には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と呼ばれ、Ｎ末端から順番に数字が付されている。本発明による抗体のＶＬ及びＶＨドメインは、４つのフレームワーク領域又は「ＦＲ」を含み得、これらは、当技術分野及び本明細書では、それぞれ「フレームワーク領域１」又は「ＦＲ１」；「フレームワーク領域２」又は「ＦＲ２」；「フレームワーク領域３」又は「ＦＲ３」；及び「フレームワーク領域４」又は「ＦＲ４」と呼ばれる。これらのフレームワーク領域は、３つの相補性決定領域又は「ＣＤＲ」によって中断され、これらは、当技術分野では、それぞれ「相補性決定領域１」又は「ＣＤＲ１」；「相補性決定領域２」又は「ＣＤＲ２」；及び「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ３」と呼ばれる。これらのフレームワーク領域及び相補性決定領域は、好ましくは、以下の順序で作動可能に連結されている：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４（アミノ末端からカルボキシ末端へ）。

本明細書で使用される「抗体重鎖」は、抗体の立体構造に存在する２つのタイプのポリペプチド鎖のうちの大きい方を指す。

本明細書で使用される「抗体軽鎖」は、抗体の立体構造に存在する２つのタイプのポリペプチド鎖のうちの小さい方を指し、κ軽鎖及びλ軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。

「ｓｃＦｖ」という用語は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片及び重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片を含むタンパク質を指し、これらの軽鎖及び重鎖可変領域は、例えば、合成リンカー、例えば、短い柔軟なポリペプチドリンカーを介して隣接して連結され、一本鎖ポリペプチドとして発現することができ、ｓｃＦｖは、それが由来する無傷の抗体の特異性を保持する。特段の記載がない限り、本明細書で使用されるｓｃＦｖは、例えば、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端に関して、ＶＬ及びＶＨ可変領域をいずれかの順序で有し得、ＶＬ−リンカー−ＶＨを含んでもよいし、又はＶＨ−リンカー−ＶＬを含んでもよい。リンカーは、フレームワーク配列の一部を含み得る。

本明細書で使用される「由来する（derive from）」及び「由来する（derived from）」という用語は、親化合物又はタンパク質の構造に由来する構造を有し、その構造が本明細書に開示されるものと十分に類似し、その類似性に基づき、特許請求される化合物と同じ又は類似の特性、活性、及び有用性を示すことが当業者によっておそらく期待される化合物を指す。例えば、モノクローナル抗体に由来するｓｃＦｖは、モノクローナル抗体と同じ特性を共有する、例えば、同一又は類似のＶＨ及びＶＬ又を共有し、及び／又は同じエピトープを認識する抗体断片を指す。

本明細書で使用される「抗原」という用語は、抗体分子、Ｔ細胞受容体、又はＣＡＲなどの特定の体液性又は細胞性免疫の産物によって特異的に結合され得る化合物、組成物、又は物質を指す。本発明が無傷の抗原及びその抗原断片を含むことは容易に明らかである。抗原が作製され得るか、合成され得るか、又は生物学的試料に由来し得るものであることは容易に明らかである。そのような生物学的試料としては組織試料、腫瘍試料、細胞又は生物学的な液体を挙げることができるが、これらに限定されない。好ましくは、本明細書では用語「抗原」は、ＨＬＡ−Ｇ、特にＨＬＡ−Ｇのアイソフォームを指す。

本明細書で使用する場合、用語「ＨＬＡ−Ｇ」及び「ヒト白血球抗原Ｇ」は、この名前に関連する特定の分子及び、ＨＬＡ−Ｇ（その数種類のアイソフォーム（限定されないが、膜結合アイソフォーム（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４）、可溶性アイソフォーム（例えば、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６、ＨＬＡ−Ｇ７）及び膜結合アイソフォームのタンパク質分解切断によって生成される可溶性形態（例えば、ｓＨＬＡ−Ｇ１）を含むが、限定されない）のうちの任意の一つを含む）に対して、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する、他のあらゆる分子を指す。ＨＬＡ−Ｇ配列の例を以下に示す。

本明細書で使用される「結合する」又は「結合」は、抗原を認識して接触するペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、及び抗体（抗体断片を含む）を指す。好ましくは、「結合する」又は「結合」は、抗原−抗体タイプの相互作用を指す。「特異的に結合する」又は「免疫特異的に結合する」は、抗体が特定の抗原を認識するが、サンプル中の他の分子を実質的に認識しないか、これに結合もしないことを意味する。場合によっては、「特異的結合」又は「特異的に結合する」という用語は、抗体、タンパク質、又はペプチドと第２の化学種との相互作用に関して使用することができ、相互作用が特定の構造（例えば、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存することを意味する。本明細書で使用される「特異的結合」という用語は、少なくとも１０^−６Ｍの結合親和性での抗体と抗原との間の接触を意味する。ある態様では、抗体は、少なくとも約１０^−７Ｍ、好ましくは１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍ、１０^−１０Ｍの親和性で結合する。

用語「ＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的に結合する抗体」又は「ＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的に結合するＣＡＲ」及び類似の用語は、本明細書で使用する場合、１つ又は数種のＨＬＡ−Ｇアイソフォームを特異的に認識し、他の抗原（他のＨＬＡ−Ｇアイソフォームを含む）を認識しないか又は弱く認識する抗体又は抗体フラグメントを指す。好ましくは、１つ若しくは数種のＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントは、他のＨＬＡ−Ｇアイソフォームを含む他の抗原又はそのフラグメントに対する親和性と比較した場合、この若しくはこれらのＨＬＡ−Ｇアイソフォーム又はそのフラグメントに対してより高い親和性を有する。

抗体の親和性は、単一の抗原−抗体部位での特定の抗原との結合の尺度であり得、本質的に、抗体の抗原結合部位と特定のエピトープとの間の相互作用に存在する全ての吸引力及び反発力の合計である。特定の抗原（例えばＨＬＡ−Ｇアイソフォーム）に対する抗体の親和性は、抗体結合部位の親和性を表す、式Ｋｄ＝［Ａｇ］［Ａｂ］／［Ａｇ］［Ａｂ］によって定義される解離平衡定数Ｋで表すことができ、式中、［Ａｇ］は遊離抗原の濃度（Ｍ）であり、［Ａｂ］は遊離抗体の濃度（Ｍ）であり、［ＡｇＡｂ］は抗原−抗体複合体の濃度（Ｍ）である。抗原と抗体が共に強く反応する場合、遊離抗原も遊離抗体もほとんど存在しないため、抗体の平衡定数又は親和性は低くなる。抗体に対する平均の親和性は、少なくとも１０^−６Ｍである。ある態様では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、少なくとも約１０^−６Ｍ、好ましくは少なくとも１０^−７Ｍ、１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍ又は１０^−１０Ｍの親和性で、１〜６個、好ましくは２〜５個のＨＬＡ−Ｇアイソフォームに結合する。結合親和性は、当業者に利用可能な任意の方法によって、特に表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定することができる。

本明細書で使用される「刺激リガンド」は、抗原提示細胞（例えば、ＡＰＣ、樹状細胞、及びＢ細胞など）上に存在する場合、Ｔ細胞上の同族の結合パートナー（「刺激分子」とも呼ばれる）と特異的に結合し、それによって、限定されるものではないが活性化、免疫応答の開始、及び増殖などを含むＴ細胞による一次応答を媒介することができるリガンドを意味する。

本明細書で使用される「共刺激リガンド」という用語は、Ｔ細胞上の同族の結合パートナー（本明細書では「刺激分子」と呼ばれる）と特異的に結合し、それによって、例えば、ペプチドがロードされたＭＨＣ分子とのＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、限定されるものではないが増殖、活性化、及び分化などを含むＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供する抗原提示細胞（例えば、ＡＰＣ、樹状細胞、及びＢ細胞など）上の分子を含む。

本明細書で使用される「共刺激分子」は、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくともいくつかの側面のために刺激的に免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞）の活性化を調節する細胞質シグナル伝達配列を提供する免疫細胞によって発現される分子を指す。一態様では、シグナルは、例えば、ペプチドがロードされたＭＨＣ分子とのＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって開始される一次シグナルであり、これは、限定されるものではないが増殖、活性化、及び分化などを含むＴ細胞応答への媒介をもたらす。刺激的に作用する一次細胞質シグナル伝達配列（「一次シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。特に、この用語は、抗原提示細胞上に存在する共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、限定されるものではないが増殖活性化及び分化などのＴ細胞による共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上の同族結合パートナーを指す。

本明細書で使用される「刺激分子」は、抗原提示細胞上に存在する同族の刺激リガンドと特異的に結合するＴ細胞上の分子を意味する。

本明細書で使用される「共刺激シグナル」は、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーションなどの一次シグナルと組み合わせて、Ｔ細胞増殖の活性化及び分化など、及び／又は重要な分子のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションをもたらすシグナルを指す。

「刺激」又は「刺激性の」という用語は、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）とその同族リガンドとが結合し、それによって、限定されるものではないがＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達などのシグナル伝達事象を媒介することによって誘導される一次応答を意味する。刺激は、ＴＧＦ−βのダウンレギュレーション及び／又は細胞骨格構造の再構成などの、特定の分子の発現の変化を媒介することができる。

本明細書で使用する場合、「レポーター」又は「選択マーカー」は、遺伝子導入することが求められる細胞の集団から発現細胞、特にＣＡＲコンストラクトで遺伝子導入された細胞の検出及び／又は選択を可能にするポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。特定のコンストラクトに連結されると、それは、細胞中のそのようなコンストラクトの存在及び／又は定量化を確立できるようになる。

本明細書で使用される「免疫細胞」は、例えば、骨髄で産生される造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来する白血球（white blood cell）（白血球（leukocyte））、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞）、及び骨髄由来細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞）などの、自然免疫及び獲得免疫に関与する細胞を指す。特に、免疫細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、特にＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＡＰＣ細胞、樹状細胞、及び単球を含む包括的ではないリストから選択することができる。

本発明によれば、免疫細胞、好ましくはＴ細胞のドナー及びレシピエントは、単一の個体又は異なる複数の個体、例えば、自己、同種異系の又は異種の個体であり得る。本明細書で使用する場合、用語「自己」は、個体から得られ、そして後に同じ個体に移植されて戻される細胞又は組織を指す。本明細書で使用する場合、用語「同種異系」は同一種の異なる個体から得られた細胞又は組織を指し、ドナー及びレシピエントは遺伝的に同一でない。本明細書において、同種異系の細胞移植又は組織移植は、ドナーとレシピエントが同一種の異なる個体である細胞又は組織の移植を含む。用語「異種」は、異なる種の生物に由来するか、又は異なる種の生物から得られるものを意味する。本明細書において、異種細胞移植又は組織移植は、ドナーとレシピエントが異なる種の異なる個体である細胞又は組織の移植を含む。

「処置」という用語は、疾患又は疾患の症状の治療、防止、予防、及び遅延などの患者の健康状態を改善することを目的としたあらゆる行為を指す。処置は、疾患の治癒的処置及び／又は予防的処置の両方を指す。治癒的処置は、治癒をもたらす処置、又は疾患若しくは疾患の症状若しくはそれが直接的又は間接的に引き起こす苦痛を軽減する、改善する、及び／又は排除する、軽減する、及び／又は安定化させる処置として定義される。予防的処置は、疾患の予防をもたらす処置、並びに疾患の進行及び／又は発生率又はその発生リスクを低減及び／又は遅延させる処置の両方を含む。特定の実施形態では、そのような用語は、疾患、障害、感染症、又は感染症に関連する症状の改善又は根絶を指す。他の実施形態では、この用語は、癌の広がり又は悪化を最小限に抑えることを指す。本発明による処置は、必ずしも１００％又は完全な処置を意味するわけではない。むしろ、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有すると認識する様々な程度の処置である。

本明細書で使用する場合、用語「障害」若しくは「疾患」は、遺伝的若しくは発生上のエラー、感染、毒物、栄養欠乏若しくは不均衡、毒性、又は好ましくない環境因子の影響から生じる、不正確に機能する身体の器官、部分、構造、若しくはシステムを指す。好ましくは、これらの用語は健康障害又は疾患、例えば、正常な身体的又は精神的機能を破壊する病気を指す。より好ましくは、障害という用語は、動物及び／又はヒトに影響を及ぼす免疫及び／又は炎症性疾患、例えば、癌などを指す。

本明細書で使用する場合、用語「免疫疾患」は、被験者自体の細胞、組織及び／又は器官に対する免疫学的反応によって引き起こされる細胞、組織及び／又は器官の損傷を特徴とする、対象の病態を指す。用語「炎症性疾患」は、炎症、例えば慢性炎症によって特徴付けられる対象の病態を指す。自己免疫障害は、炎症を伴っても伴わなくてもよい。さらに、炎症は自己免疫障害に起因してもしなくてもよい。

本明細書で使用する場合、用語「癌」は、異常細胞の急速且つ制御されない増殖によって特徴付けられる疾患として定義される。癌細胞は局所的に広がることができ、又は血流及びリンパ系を介して身体の他の部位に広がることもできる。

本明細書で使用する用語「養子細胞療法」又は「養子Ｔ細胞療法」又は「ＡＣＴ」は、患者への細胞の導入を意味し、この場合、細胞は、対象への導入の前に操作されているか、又はそうでなければ改変されている。ＡＣＴの例としては、対象の血液又は腫瘍、Ｔ細胞などの免疫細胞からの採取である。次に、これらの免疫細胞を、培養液中においてエクスビボで刺激し、そして増殖させる。次に、細胞にＣＡＲなどの新しい分子を発現させる１つ以上の核酸コンストラクトを細胞に形質導入し、操作された免疫細胞に、疾患、例えば癌と闘うための新しいメカニズムを提供する。場合によっては、ＣＡＲは、ＨＬＡ−Ｇなどの腫瘍又は癌によって発現された抗原を特異的に認識する抗原結合ドメインを含む。ＡＣＴ法で利用される典型的な免疫細胞には、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）又はＴ細胞がある。ＡＣＴで使用される免疫細胞は、患者／対象自身から、又は普遍的なドナーから得ることができる。ＡＣＴはまた、対象に戻して注入された組換え細胞と競合し得る、対象自身のリンパ球のリンパ球枯渇の任意選択段階を伴ってもよい。

用語「ＣＡＲ療法」又は「ＣＡＲ細胞療法」は、本明細書では互換的に使用され、ＣＡＲを発現するよう免疫細胞が改変され、例えば、ウイルス感染又は癌などの疾患を予防又は治療する治療のタイプを指す。そのような免疫細胞には、自己由来のものと同種異系由来のものがあり得る。免疫細胞は、例えばＢリンパ球、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞又はナチュラルキラーＴ細胞などであり得る。例えば、ＣＡＲ細胞療法は、患者からの免疫細胞を獲得し、ＣＡＲの発現を可能にするＣＡＲ遺伝子を免疫細胞へ導入し（そのようなＣＡＲが、患者の疾患に関与する抗原に向けられる）、改変された免疫細胞集団を拡大させ、そしてその細胞を患者への再注入することによって提供される。本明細書で使用する場合、用語「抗腫瘍効果」は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移の数の減少、余命の増加、又は癌性病態に関連する種々の生理学的症状の改善によって示され得る生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」はまた、本発明の細胞及びＣＡＲの、最初に発生する腫瘍の予防能力、又は転移形成を制限する能力によって示され得る。

本明細書で使用する場合、用語「細胞溶解性」又は「細胞毒性」は標的細胞の死（例えば、アポトーシスによる）に至る、Ｔ細胞又はＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞などの細胞毒性細胞によって媒介される免疫応答の結果を指す。

本明細書で使用する場合、用語「対象」、「宿主」、「個体」又は「患者」は、ヒト及び獣医学的対象、特に動物、好ましくは哺乳動物、さらにより好ましくは成人及び子供を含むヒトを指す。しかしながら、用語「対象」はまた、非ヒト動物、特に、とりわけイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ及び非ヒト霊長類などの哺乳動物を包含する。

本明細書で使用する場合、語句「副作用」は、予防剤又は治療剤の望ましくない及び有害な効果を包含する。副作用は常に望ましくないが、望ましくない作用は必ずしも有害ではない。治療（例えば、予防薬又は治療薬）による有害作用は害であり、不快であり、又は危険であり得る。患者が典型的に経験する望ましくない効果は多数あり、当技術分野で知られている。

本明細書で使用する場合、用語「組み合わせて」は、２つ以上の療法（例えば、予防剤及び／又は治療剤）の使用を指す。用語「組み合わせて」の使用は、疾患又は障害を有する対象に療法（例えば、予防薬及び／又は治療薬）が投与される順序を制限しない。

本明細書で使用する場合、「調節する」という用語は、治療若しくは化合物の非存在下での対象の応答のレベルと比較して、及び／又は他の点では同一であるが未治療の対象の応答のレベルと比較して、対象の応答のレベルの検出可能な増加若しくは減少を媒介することを意味する。この用語は、ネイティブシグナル又は応答を混乱させる及び／又は影響し、それによって対象、好ましくはヒトにおける有益な治療応答を媒介することを包含する。

本明細書で使用する場合、「医薬又は獣医学的組成物」は、本発明の抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の抗原結合ドメインを含むような、１つ以上の活性薬剤の調製物を指す、任意に、生理学的に好適な担体及び賦形剤などの他の化学成分を含む。医薬組成物又は獣医学組成物の目的は、生物への活性薬剤の投与を容易にすることである。本発明の組成物は、任意の従来の投与経路又は使用に好適な形態であり得る。一実施形態では、「組成物」は、典型的には活性薬剤、例えば、化合物若しくは組成物、及び不活性（例えば、検出可能な薬剤若しくは標識）又は活性な天然若しくは非天然の担体、例えば、アジュバント、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、防腐剤、アジュバントなどとの組み合わせを意図し、薬学的に許容される担体を含む。

本明細書で言及される「許容されるビヒクル」又は「許容される担体」は、医薬又は獣医学的組成物を製剤化する際に有用であることが当業者に知られている任意の既知の化合物又は化合物の組み合わせである。

「治療有効量」は対象に投与されたときに、標的疾患若しくは障害を治療するために、又は所望の効果を生じるために必要とされる活性薬剤の量である。「有効量」は、薬剤、疾患及びその重症度、並びに治療される対象の年齢、体重、及び特徴に応じて変化するであろう。

本明細書で使用する場合、用語「薬剤」は、障害又は疾患に対する治癒的又は予防的特性を有する任意の物質又は組成物を指す。

用語「遺伝子導入された」又は「形質転換された」又は「形質導入された」は、本明細書中では互換的に使用され、そしてキメラ抗原レセプター細胞の産生に適用され、特に、外来性又は外因性ヌクレオチド配列が細胞に導入されるプロセスを指す。外因性核酸は、宿主細胞に安定的に又は一時的に導入され得る。「遺伝子導入された」又は「形質転換された」又は「形質導入された」細胞は、外因性核酸で遺伝子導入された、形質転換された、又は形質導入されたものである。いくつかの実施形態では、この形質導入がベクター、好ましくはレンチウイルスベクターを介して行われる。

本明細書で使用される「核酸コンストラクト」、及び「ベクター」という用語は同等であり、ＤＮＡ又はＲＮＡなどのパッセンジャー核酸配列を宿主細胞に移入するのに役立つ核酸分子を指す。ベクターは、複製起点、選択可能なマーカー、及び任意選択による配列又は遺伝子の挿入に適した部位を含み得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクター又は宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。ベクターはまた、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位などの正しい翻訳開始配列、及び開始コドン、終止コドン、及び転写終止配列を含む発現要素を含み得る。核酸コンストラクトはまた、所与の遺伝子の転写レベルを指示するために、エンハンサー、サイレンサー、及び境界要素／インスレーターなどの他の調節領域を含み得る。作動可能に連結された遺伝子及び／又は核酸配列の発現を誘導することができるベクターはまた、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれることがある。核酸コンストラクト、ファージミド、ウイルスゲノム、コスミド、及び人工染色体を含むいくつかの一般的なタイプのベクターが存在する。核酸コンストラクトは、遺伝子又は配列の安定的又は一過性の発現のためのベクターであり得る。核酸コンストラクトは、核酸コンストラクトの複製起点（ｏｒｉ）を含み得る。特に、核酸コンストラクトは、限定されるものではないが、プラスミド、ウイルス、コスミド、ファージ、ＢＡＣ、ＹＡＣなど、異なる宿主間の遺伝子導入のために設計することができる。そのようなベクターは、市販のベクターから調製され得るか、又は当技術分野で公知の技術に従って、例えば、バキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス又はＡＡＶから産生され得る。好ましくは、これらの用語はレンチウイルスベクターに言及する。

本明細書で使用する場合、用語「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、及び／又は転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。遺伝子の発現レベルは、細胞又は組織試料中のｍＲＮＡ又はタンパク質の量を測定することによって決定され得る。一態様では、一試料からの遺伝子の発現レベルは、対照又は参照試料からのその遺伝子の発現レベルと直接比較され得る。別の態様では、一試料からの遺伝子の発現レベルは、化合物の投与後の同一試料からのその遺伝子の発現レベルと直接比較され得る。

用語「機能的変異体」又は「生物学的同等物」は、本明細書で使用する場合、互換的に使用され、そして親ポリペプチドに対して実質的又は有意な配列同一性又は類似性を有するポリペプチド（ＣＡＲ又はタンパク質）を指す、この機能的変異体は、それの改変体であるポリペプチドの生物学的活性を保持する。本明細書中で特に断らない限り、本明細書中で言及される任意のポリヌクレオチド、ポリペプチド又はタンパク質はまた、その同等物を含むことが意図される。例えば、同等物は少なくとも約７０％の相同性若しくは同一性、又は少なくとも８０％の相同性若しくは同一性、及び、或いは少なくとも約８５％、或いは少なくとも約９０％、或いは少なくとも約９５％、又は９８％の相同性若しくは同一性を意図しており、参照タンパク質、ポリペプチド、又は核酸と実質的に同等の生物学的活性を示す。或いは、ポリヌクレオチドに言及する場合、その同等物はストリンジェントな条件下で参照ポリヌクレオチド又はその補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドである。抗体に関する場合、用語「同等物」又は「生物学的同等物」は、ＥＬＩＳＡ又は他の適切な方法によって測定される、エピトープタンパク質又はフラグメントに特異的に結合する抗体の能力が類似しているか又は保存されていることを意味する。生物学的に同等の抗体には、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体、ペプチド、抗体フラグメント、抗体変異体、抗体誘導体及び抗体模倣物が含まれるが、これらに限定されない。ＣＡＲに関する場合、機能的変異体は、例えば、親ＣＡＲと類似の程度、同一程度、又はより高い程度で標的細胞を認識する能力を保持する、本明細書中に記載されるＣＡＲ（親ＣＡＲ）の変異体を包含する。親ＣＡＲに関して、機能的変異体は、例えば、アミノ酸配列において親ＣＡＲと少なくとも約５０％、７５％、８０％、９０％、９８％以上同一であり得る。

「変異体」又は「等価物」とはまた、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって、親ポリペプチド配列のそれとは異なるポリペプチド配列を意味する。例えば、本発明の文脈では、変異体は、モノクローナル抗体若しくはそのフラグメントの変異体、又はＣＡＲの変異体であり得る。典型的には、変異体は１〜５０個のアミノ酸の修飾、好ましくは１〜４０個のアミノ酸の修飾を含む。特に、変異体は、その親と比較して１〜３０個のアミノ酸の変化、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個のアミノ酸変の化を有し得る。変異体は、１つ若しくはいくつかのアミノ酸置換、及び／又は１つ若しくはいくつかのアミノ酸挿入、及び／又は１つ若しくはいくつかのアミノ酸欠失を含み得る。いくつかの実施形態では、例えば上記のように、変異体は１つ又はいくつかの保存的置換を含んでもよい。いくつかのさらなる実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメント、特にｓｃＦｖの変異体は、親ＭａｂのＣＤＲドメインに１つ又はいくつかのアミノ酸修飾を含み得る。いくつかの他の実施形態では、親Ｍａｂの変異体は、少なくとも１つのフレームワークドメインに１つ又はいくつかのアミノ酸修飾を含み得る。

本明細書で使用する場合、「親ポリペプチド」又は「ポリペプチド親」とは、後に修飾されて変異体を生成する未修飾ポリペプチドを意味する。本発明の文脈では、親ポリペプチドは、抗体、好ましくはモノクローナル抗体、さらにより好ましくはｓｃＦｖであり得る。

本明細書で使用する場合、「相同性」、「同一性」若しくは「類似性」は、２つ以上の核酸若しくはポリペプチド配列の文脈で使用する場合、同一であるか、又は同一であるというヌクレオチド若しくはアミノ酸残基の指定されたパーセンテージ、例えば、特定の領域（例えば、本明細書に記載の抗体若しくは本明細書に記載の抗体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）にわたって、少なくとも６０％の同一性、好ましくは少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれを超える同一性を有する２つ以上の配列若しくはサブ配列を指す。相同性は、比較の目的で整列され得る各配列内での位置を比較することによって決定することができる。比較される配列中での位置が、同一の塩基又はアミノ酸によって占められているならば、その分子はその位置で相同である。配列間の相同性の程度は、配列間で共有するマッチング位置、又は相同位置の数の関数である。配列に関する用語「同一性のパーセンテージ」は、前記配列間の同一性又は相同性のレベルを示し、当技術分野でそれ自体公知の手法によって決定し得る。典型的には、２つの核酸配列間の同一性のパーセンテージは、ＧＣＧプログラムパッケージ（Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1996, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711）（Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453）のＧＡＰなどのコンピュータープログラムによって決定される。例えば、ＤＮＡ配列（特に、５．０のＧＡＰ生成ペナルティー及び０．３のＧＡＰ伸長ペナルティー）用に調節された設定を使用して、核酸分子は、ＧＣＧプログラムパッケージの一部として利用可能なPileupアラインメントソフトウェアを使用して、互いに整列され得る。２つの配列間の同一性パーセントの決定はまた、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。２つの配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの非限定的な例の１つは、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1. 又はKarlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264-2268のアルゴリズム、その改訂版Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5877に記載のものである。そのようなアルゴリズムは、Altschul et al, 1990, J. MoI. Biol. 215:403のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメータを、例えばスコア＝１００、ワード長＝１２にセットして実施し、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラムパラメーターを、例えば、スコア−５０、ワード長＝３にセットして実施し、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較の目的のためにギャップアラインメントを得るには、Altschul et al, 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載があるように、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴを利用することができる。或いは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いて、分子間の遠隔関係（Ｉｄ）を検出する反復検索を行うこともできる。ＢＬＡＳＴ、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを使用するとき、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる（例えば、ＮＣＢＩのウェブサイトを参照されたい）。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、Myers and Miller, 1988, CABIOS 4:11-17のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、PAM 120 weight residue table、１２のギャップ長ペナルティー、及び４のギャップペナルティーを使用することができる。アラインメント及び相同性パーセント又は配列同一性パーセントは例えば、当技術分野で公知のソフトウェアプログラムを使用して決定することができる。好ましくは、アラインメントのためにデフォルトパラメータが使用される。好ましいアライメントプログラムは、デフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴである。特に、好ましいプログラムは、以下のデフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰである：Genetic code = standard; filter = none; strand = both; cutoff = 60; expect = 10; Matrix = BLOSUM62; Descriptions = 50 sequences; sort by = HIGH SCORE; Databases = non-redundant, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + SwissProtein + SPupdate + PIR。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス:ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLASTに見出すことができる。２つのアミノ酸配列を比較するために、例えば、ＥＭＢＬ−ＥＢＩによって提供され、www.ebi.ac.uk/Tools/services/web/toolform.ebi?tool=emboss_needle&context=proteinから入手可能な、タンパク質の対での配列アラインメントのためのツール「Emboss needle」を、（Ｉ）マトリックス：BLOSUM62、（ｉｉ）ギャップオープン：１０、（ｉｉｉ）ギャップ拡張０．５、（ｉｖ）出力書式：対、（ｖ）エンドギャップペナルティ：false、（ｖｉ）エンドギャップオープン：１０、（ｖｉｉ）エンドギャップ拡張：０．５のデフォルト値により使用することができる。

ヌクレオチド又はアミノ酸配列間の配列同一性は、配列のアラインメントを比較することによって決定することができる。比較される配列中での同等の位置が、同一の塩基又はアミノ酸によって占められているならば、その分子はその位置で相同である。同一性パーセントとしてのアラインメントの得点化は、比較される配列によって共有される位置での同一のアミノ酸又は塩基の数の関数である。配列を比較する場合、最適なアラインメントは、配列における可能な挿入及び欠失を考慮に入れるために、１つ以上の配列にギャップが導入されることを必要とし得る。配列比較法は、比較される配列中の同一分子の数が同じである場合、比較される２つの配列間のより高い関連性を反映する、可能な限り少ないギャップを有する配列アラインメントが多くのギャップを有するものよりも高いスコアを獲得するように、ギャップペナルティーを使用し得る。最大同一性パーセントの計算は、ギャップペナルティーを考慮した、最適なアラインメントの生成を伴う。

この用語はまた、欠失及び／又は付加を有する配列、並びに置換、特に保存的置換を有する配列を含む。好ましくは、同一性は少なくとも約２５アミノ酸又はヌクレオチド長の領域にわたって、又はより好ましくは少なくとも５０〜１００アミノ酸又はヌクレオチド長の領域にわたって存在する。「無関係」又は「非相同」配列は、本明細書で開示の配列の１つと５０％未満の同一性、又は代わりに４０％未満の同一性、好ましくは３０％未満の同一性を共有する。

ＨＬＡ−Ｇ抗原
「ＨＬＡ−Ｇ」は、少なくとも７つのアイソフォームを含むヒト白血球抗原Ｇを示す。その発現は主に、絨毛外栄養膜細胞層上の胎児−母体インターフェース；胎盤、羊膜；胸腺、角膜、気管支上皮細胞、及び膵臓などの少数の健康な成人組織；並びに間葉系幹細胞、少数の活性化単球；並びに赤血球及び内皮前駆体などの異なるタイプの細胞に限定される。可溶性ＨＬＡ−Ｇは、血漿、脳脊髄液、悪性腹水、胸水、精子などの体液中にも見いだされる。ＨＬＡ−Ｇ遺伝子は一部の組織では活性でないが、プロゲステロンや抗癌剤などのある種の分子によってその発現を誘導することができる。さらに、この分子は、癌、多発性硬化症、炎症性疾患及びウイルス感染などの病態でも、又は同種異系移植後にも新規に発現する(neo-expressed)。可溶性ＨＬＡ−Ｇ（ｓＨＬＡ−Ｇ）は個体の血清／血漿中に検出できる。

ＨＬＡ−Ｇは、遺伝的多様性が低いこと、組織に限定された発現、７種のアイソフォームの存在、及び免疫抑制作用によって古典的ＨＬＡクラスＩ分子とは異なる。この分子は、図１Ａに模式化した白血球免疫グロブリン様レセプターＢ１（ＬＩＬＲＢ１／ＩＬＴ２／ＣＤ８５ｊ）、ＬＩＬＲＢ２（ＩＬＴ４／ＣＤ８５ｄ）及びＫＩＲ２ＤＬ４（又はＣＤ１５８ｄ）の３つのレセプターに直接結合することにより、免疫抑制作用を発揮する。ＬＩＬＲＢレセプターでは、認識サイトはＨＬＡ−Ｇのα３ドメインを通して行われ、ペプチドの影響を受ける可能性は低い。ＬＩＬＬＲＢ１は、Ｂ細胞、一部のＴ細胞、一部のＮＫ細胞、及び全ての単球／樹状細胞によって発現されるが、ＬＩＬＬＲＢ２は骨髄特異的であり、その発現は単球／樹状細胞に限定される。ＫＩＲ２ＤＬ４はＨＬＡ−Ｇの特異的レセプターであり、ＮＫ細胞のＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔサブセットによってのみ発現される。ＬＩＬＬＲＢ１及びＬＩＬＬＲＢ２は、α３ドメイン及びＢ２Ｍ（ＨＬＡ−Ｇが最も高い親和性のリガンドである）によって広範囲の古典的ＨＬＡ分子と結合することが示されているが、ＫＩＲ２ＤＬ４については、ＨＬＡ−Ｇが唯一の既知のリガンドである。さらに、ＬＩＬＲＢ１及びＬＩＬＲＢ２は、単量体構造よりもＨＬＡ−Ｇ多量体に対して高い親和性を示すことが示されている。ＬＩＬＲＢ１とＬＩＬＲＢ２のリガンドへの結合様式の違いを考慮することが重要である：ＬＩＬＲＢ１はβ２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇ重鎖に対して高い親和性を示すが、ＬＩＬＲＢ２は、芳香族アミノ酸Ｐｈｅ−１９５及びＴｙｒ−１９７を参加させて、β２Ｍよりも多くのα３ドメインに結合することにより、著しく明確なＭＨＣＩ結合認識を示す。このことは、後者のレセプターのβ２Ｍ非依存性ＨＬＡ−Ｇ結合と、β２Ｍフリーのアイソフォームに対するより高い親和性を説明する。

これらのレセプターと結合することにより、ＨＬＡ−Ｇは免疫系のダウンレギュレーターとして作用し、その機能のいくつかは、以前に報告されている：すなわち、図１Ｃに示す、子宮及び末梢血ＮＫ細胞の細胞溶解機能の阻害、細胞毒性Ｔリンパ球の抗原特異的細胞溶解機能、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の同種異系増殖反応、Ｔ細胞及び末梢血ＮＫ細胞の増殖、並びに樹状細胞の成熟と機能である。さらに、ＨＬＡ−Ｇは抑制性細胞の生成を誘導することができる。しかし、古典的なＨＬＡクラスＩ分子とは異なり、ＨＬＡ−Ｇでは刺激機能は今まで報告されておらず、同種異系ＨＬＡ−Ｇに対する反応も報告されていない。

ＨＬＡ−Ｇは全ての免疫細胞サブセットを阻害することができる：したがって、抗腫瘍反応の全ての段階をブロックすることができる。この分子は多くの種類の原発腫瘍、転移、悪性滲出液中に発現し、また腫瘍細胞や腫瘍浸潤細胞にも認められる。腫瘍細胞株によるＨＬＡ−Ｇ発現は、細胞毒性Ｔリンパ球及びＮＫ細胞による破壊からそれらを保護することを示した。このように、悪性細胞によるＨＬＡ−Ｇの発現は、腫瘍浸潤ＮＫ、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）の活性を阻害することにより、腫瘍免疫の排除を妨げる可能性がある。

ＨＬＡ−Ｇの発現は、主に固有の遺伝子プロモーターによって転写レベルで、また、選択的スプライシング、ｍＲＮＡの安定性、翻訳及び細胞表面へのタンパク質輸送によって転写後レベルで制御される。

ＨＬＡ−Ｇの一次転写産物は、選択的スプライシングを受け、７つのアイソフォームの発現をもたらし、４つは膜結合型（ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３及びＨＬＡ−Ｇ４）であり、３つは可溶型（ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６及びＨＬＡ−Ｇ７）である。ＨＬＡ−Ｇ１とＨＬＡ−Ｇ５は、古典的ＨＬＡクラスＩ分子の典型的な構造を示しており：β２ミクログロブリン（β２Ｍ）とペプチドに非共有結合した３つの球状ドメインで構成される重鎖であるが、他のアイソフォームはより短く、重鎖の１つ又は２つのドメインを欠き、β２Ｍとは結合しない（図１Ａ）。

ＨＬＡ−Ｇ１とＨＬＡ−Ｇ５は、最も豊富なアイソフォームと考えられているが、これはおそらく他のアイソフォームに対する抗体の多様性が欠如しており、特にβ２Ｍフリーアイソフォームに対する抗体が欠如しているためであろう。

ＨＬＡ−Ｇ１アイソフォームは、β２ミクログロブリンに会合したα１、α２、α３ドメインを有する完全なアイソフォームである。ＨＬＡ−Ｇ２アイソフォームはα２ドメインを有さないが、ＨＬＡ−Ｇ３はα２及びα３ドメインを有さず、ＨＬＡ−Ｇ４はα３ドメインを有さない。ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３及びＨＬＡ−Ｇ４のいずれのアイソフォームもβ２Ｍと結合しない。可溶性ＨＬＡ−Ｇ５及びＨＬＡ−Ｇ６アイソフォームは、それぞれＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ２と同じ追加の球状ドメインを含む。ＨＬＡ−Ｇ７アイソフォームは、イントロン２によってコードされる２つのアミノ酸に連結されたα１ドメインのみを有する。ＨＬＡ−Ｇ５アイソフォームはβ２Ｍと結合するが、アイソフォームＨＬＡ−Ｇ６とＨＬＡ−Ｇ７はβ２Ｍと結合しない。

さらに、ＨＬＡ−Ｇ分子は、ＨＬＡ−Ｇ重鎖の４２位（Ｃｙｓ４２−Ｃｙｓ４２結合）及び１４７位（Ｃｙｓ４２−Ｃｙｓ１４７結合）の２つの独特のシステイン残基間のジスルフィド結合の生成を通して二量体を形成することができる。この二量体化は、α３ドメインのＨＬＡ−Ｇレセプター結合部位を上方に露出させる斜めの向きを有しており、レセプターに接近しやすくなっている。したがって、ＨＬＡ−Ｇ二量体は単量体よりも高い親和性及び遅い解離速度でレセプターに結合し、単量体よりも効率的にシグナルを伝達する。

別名はＨＬＡ−Ｇ組織適合抗原クラスＩ若しくはＧ又はＭＨＣ−Ｇである。ＨＬＡ−Ｇは以下のアクセッション番号でデータベースに記載されている：遺伝子ＩＤ：３１３５、ＵｎｉＧｅｎｅＨｓ．５１２１５２。このタンパク質は、アクセッション番号：Ｐ１７６９３でＵｎｉＰｒｏｔに開示されている。タンパク質及びｍＲＮＡの配列のＧｅｎＢａｎｋエントリーは、それぞれＮＰ＿００２１１８．１及びＮＭ＿００２１２７．５である。

ＨＬＡ−Ｇアイソフォーム配列を比較する場合、ＨＬＡ−Ｇ１は一般に、標準的な配列、すなわち、各位置における最も頻度の高い核酸又は塩基又はアミノ酸を反映するＤＮＡ、ＲＮＡ、又はアミノ酸の配列として選択されるが、このことは、データベースが一般的にこのアイソフォーム配列を「ＨＬＡ−Ｇ」という名称で言及する理由である。ＨＬＡ−Ｇ２〜Ｇ７はＨＬＡ−Ｇ１とはアミノ酸欠失及び／又は置換により異なる。ＨＬＡ−Ｇヒトアイソフォームは、ＨＬＡ−Ｇ１にはＰ１７６９３−１、ＨＬＡ−Ｇ２にはＰ１７６９３−２、ＨＬＡ−Ｇ３にはＰ１７６９３−３、ＨＬＡ−Ｇ４にはＰ１７６９３−４、ＨＬＡ−Ｇ５にはＰ１７６９３−５、ＨＬＡ−Ｇ６にはＰ１７６９３−６、ＨＬＡ−Ｇ７にはＰ１７６９３−７のＵｎｉｐｒｏｔアクセス番号で記載されている。

ＨＬＡ−Ｇアイソフォームに対する抗体
本発明は、７つのＨＬＡ−Ｇアイソフォームのうちの１つ〜６つ、好ましくは２つ〜５つのＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的に結合するが、全てのＨＬＡ−Ｇアイソフォームには特異的に結合又は認識しない抗体を提供する。例えば、抗体は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的に結合することができる。ＨＬＡ−ＧアイソフォームはＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６及びＨＬＡ−Ｇ７からなる群から選択することができ、好ましくはＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ５及びＨＬＡ−Ｇ６からである。

例えば、本発明のＣＡＲの抗体又は抗原結合ドメインは、以下を認識する：
− 抗体又は抗原結合ドメインによって認識されるエピトープがＨＬＡ−Ｇのα２ドメイン上にあるならば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ４及びＨＬＡ−Ｇ５、
− 抗体又は抗原結合ドメインによって認識されるエピトープがＨＬＡ−Ｇのα３ドメイン上にあるならば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ５及びＨＬＡ−Ｇ６、
− 抗体又は抗原結合ドメインによって認識されるエピトープがＨＬＡ−Ｇのβ２Ｍドメイン上にあるか、又はβ２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇに特異的なドメイン上にあるならばＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５。

特定の実施形態では、抗体又はそのフラグメントは、ＨＬＡ−Ｇアイソフォームの全ては認識しない、すなわち、本発明のＣＡＲの抗体又は抗原結合ドメインは、ＨＬＡ−Ｇのα１ドメインのエピトープを認識しない。

一態様では、抗体はＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５アイソフォームに特異的に結合することができる。それで、抗体は実質的に他のＨＬＡ−Ｇアイソフォーム、特にＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ６及びＨＬＡ−Ｇ７と結合しない。より具体的には、抗体はβ２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的である。この文脈において、抗体は、β２Ｍを欠くＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５アイソフォームと実質的に結合しない。

本明細書では、抗体１５Ｅ７が提供される。特に、１５Ｅ７は、配列番号３で開示される重鎖配列及び配列番号４で開示される軽鎖配列を有するｓｃＦｖ抗体である。Ｋａｂａｔによると、抗体１５Ｅ７のＣＤＲは以下の配列を有する：
− 配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１；
− 配列番号１２の重鎖ＣＤＲ２、
− 配列番号１３の重鎖ＣＤＲ３、
− 配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ１、
− 配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ２、及び
− 配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ３。

したがって、本発明は、
（ａ）（ｉ）配列番号３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２及び３を含む重鎖、並びに（ｉｉ）配列番号４の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２及び３を含む軽鎖；
（ｂ）（ｉ）配列番号１１、１２及び１３の配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）を含む重鎖、並びに（ｉｉ）配列番号１４、１５及び１６の配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含む軽鎖（各ＣＤＲは、任意に、１、２、３又は４つのアミノ酸置換、欠失又は挿入を含んでもよい）；又は
（ｃ）配列番号３及び４の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、又は配列番号３と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の同一性を有する重鎖可変領域、並びに配列番号４と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の同一性を有する軽鎖可変領域
を有する抗体に関する。

前記抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体又はヒト化抗体であり得る。前記抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、二重特異性抗体、単鎖抗体フラグメント、又は複数の異なる抗体フラグメントを含む多重特異性抗体から選択される抗体フラグメントであり得る。前記抗体は、毒性物質又は検出可能な標識に結合又は共有結合することができる。

別の態様では、この抗体は、ＨＬＡ−Ｇ２及びＨＬＡ−Ｇ６アイソフォームに特異的に結合することができる。それで、抗体は実質的に他のＨＬＡ−Ｇアイソフォーム、特にＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５及びＨＬＡ−Ｇ７のようなβ２Ｍサブユニット会合アイソフォームとは結合しない。より具体的には、この抗体はβ２ＭフリーＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的であり、ＨＬＡ−Ｇ２及びＨＬＡ−Ｇ６及び／又はＨＬＡ−Ｇ１−β２Ｍフリーアイソフォーム及びＨＬＡ−Ｇ５−β２Ｍフリーアイソフォームの両方と特異的に結合する。

本明細書では、抗体ＬＦＴＴ−１が提供される。特に、ＬＦＴＴ−１は、配列番号１で開示される重鎖配列及び配列番号２で開示される軽鎖配列を有するｓｃＦｖ抗体である。Ｋａｂａｔによると、抗体ＬＦＴＴ−１のＣＤＲは以下の配列を有する：
− 配列番号５の重鎖ＣＤＲ１；
− 配列番号６の重鎖ＣＤＲ２、
− 配列番号７の重鎖ＣＤＲ３、
− 配列番号８の軽鎖ＣＤＲ１、
− 配列番号９の軽鎖ＣＤＲ２、及び
− 配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ３。

したがって、本発明は、
（ａ）（ｉ）配列番号１の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２及び３を含む重鎖、並びに（ｉｉ）配列番号２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２及び３を含む軽鎖；
（ｂ）（ｉ）配列番号５、６及び７の配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）を含む重鎖、並びに（ｉｉ）配列番号８、９及び１０の配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含む軽鎖（任意に、各ＣＤＲは、任意に１、２、３又は４つのアミノ酸置換、欠失又は挿入を含んでもよい）；或いは
（ｃ）配列番号１及び２の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、又は配列番号１と少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する重鎖可変領域、並びに配列番号２と少なくとも８０、８５、９０又は９５％の同一性を有する軽鎖可変領域
を有する抗体に関する。

特定の実施形態では、抗体は多重特異性抗体であり、好ましくは二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、同一又は異なる抗原上の２つの異なるエピトープを認識する２つの異なるＦ（ａｂ）フラグメントを含む。特に、本発明の二重特異性抗体は、同一のＨＬＡ−Ｇアイソフォーム又は異なるＨＬＡ−Ｇアイソフォーム上の異なるエピトープに結合する。好ましくは、二重特異性抗体は異なるＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的に結合し、ＨＬＡ−Ｇ／β２Ｍフリーアイソフォームを認識するＦ（ａｂ）と、β２Ｍドメイン会合ＨＬＡ−Ｇアイソフォームを認識する第２のＦ（ａｂ）とを含む。

一実施形態では、二重特異性抗体は、β２ＭフリーのＨＬＡ−Ｇアイソフォーム、好ましくはＨＬＡ−Ｇ２及びＨＬＡ−Ｇ６の両方に、及び／又はＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍフリー及びＨＬＡ−Ｇ５／β２Ｍフリーアイソフォームの両方に特異的に結合する１つのＦ（ａｂ）と、β２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇアイソフォーム、好ましくはＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５アイソフォームに特異的に結合する１つの他のＦ（ａｂ）とを含む。この特定の実施形態では、二重特異性抗体は、上記のＣＤＲ（配列番号５〜１０）を有するＬＦＴＴ−１抗体由来の１つのＦ（ａｂ）と、上記のＣＤＲ（配列番号１１〜１６）を有する１５Ｅ７抗体の１つのＦ（ａｂ）とを含む。

別の実施形態では、二重特異性抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、Ｆｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）、続いて第１の抗体（抗体１）Ｆａｂ重鎖（ＣＨ１−ＶＨ）及び第２の抗体（抗体２）の連続Ｆａｂ重鎖（ＣＨ１−ＶＨ）から構築され、後者はポリペプチドリンカー配列によって結合される連続重鎖を含む。タンパク質発現中に、得られた重鎖は二量体を構築するが、共発現した抗体１及び抗体２の軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）は、それらの同族重鎖と集合して(assemble)、最終的なタンデムＦ（ａｂ）’２−Ｆｃ分子を形成する。好ましくは抗体１及び抗体２は異なり、好ましくはそれぞれＬＦＴＴ−１抗体及び１５Ｅ７抗体である。

一実施形態では、抗体又はそのフラグメントは、ＨＬＡ−Ｇアイソフォームの全てとは結合せず、又はそれらの全ては認識しない。特に、全てではないが１つ又はいくつかのＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的に結合する抗体又はそのフラグメントは、少なくとも１０^−６ＭのＫｄ親和性定数を有する。ある態様では、抗体又はそのフラグメントは、少なくとも約１０^−７Ｍ、好ましくは少なくとも約１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍ、１０^−１０Ｍの高い親和性で、全てではないが１つ又はいくつかのＨＬＡ−Ｇアイソフォームに結合する。

特定の形態では、抗体又はそのフラグメントは、ＨＬＡ−Ｇアイソフォームのアルファ１ドメインと結合せず、又はそれを認識しない。このことは、そのような抗体若しくはそのフラグメントは、アルファ−１ドメインを欠き、アルファ２及びアルファ３ドメイン又はアルファ３ドメインのみを含むＨＬＡ−Ｇアイソフォーム、例えば、Tronik-Le Roux et al., Molecular Oncology 11(2017)1561-1578に記載があるものなどのＨＬＡ−Ｇアイソフォームと結合し、或いは認識できることを意味する。例えば、そのような抗体又はそのフラグメントは、アルファ２、アルファ３又はβ２Ｍドメインに結合することができる。

本発明の抗体又は抗体フラグメントの配列は、ＣＡＲを調製するため、又は医薬組成物を調製するための方法で使用され得る。或いは、本発明の抗体又は抗体フラグメントは、ＨＬＡ−Ｇアイソフォームを検出するために、免疫測定法などの診断試験で使用され得る。

抗体又は抗体フラグメントは、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）及び表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）又は当業者に公知の他の手法などの免疫測定法によって同定され得る。

好ましくは、１つ又はいくつかのＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的に結合する抗体（その抗体フラグメントを含む）は、他の抗原と有意に交差反応しない（すなわち、日常的な免疫学的測定法において検出可能ではない）。抗体は、ウェスタンブロット法（ＷＢ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）及び酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、特に競合ＥＬＩＳＡなどの実験手法を用いて決定されるように、交差反応性抗原よりも高い親和性で抗原に結合する場合に、抗原に特異的に結合する。

ＨＬＡ−Ｇアイソフォームに対するキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）
ＣＡＲは、典型的には、エクトドメイン（細胞外ドメイン）及びエンドドメイン（細胞質ドメイン）を含み、好ましくは、それらはヒンジドメイン及び膜貫通ドメインによって結合される。特に、本発明のＣＡＲは、任意に、切断可能なリンカー及びレポーターを含む。細胞の表面に発現されるエクトドメインは、抗原結合ドメインすなわちレセプタードメインを含み、任意に、プロセシングのために抗原結合ドメインを小胞体に向けるシグナルペプチドを含む。細胞外ドメインは、標的抗原を特異的に認識する抗原結合ドメインを含む。非限定的な例として、抗原結合ドメインは、抗体、好ましくはｓｃＦｖなどの一本鎖抗体であり得る。スペーサー領域は、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに連結し、抗原結合ドメインが抗原を認識できるように配向できるよう十分に柔軟に設計される。膜貫通ドメインは典型的には疎水性アルファヘリックスであり、典型的には、細胞膜の脂質二重層を横切って広がる。ＣＡＲのエンドドメインは、活性化シグナルを細胞内部的に細胞質に広げ、そのことによりＣＡＲを発現する細胞を刺激する、シグナル伝達ペプチドからなる。エンドドメインは、下に説明するように、いくつかのシグナル伝達ドメインを含み得る。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び以下に定義するような刺激分子及び／又は共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのセットは、二量体化分子の存在下で、ポリペプチドを互いに結合することができ、例えば、抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに結合することができる二量体化スイッチを含む。一態様では、細胞質シグナル伝達ドメインは、以下に定義するような少なくとも１つの共刺激分子に由来する１つ以上の機能的シグナル伝達ドメインをさらに含む。

一態様では、ＣＡＲは細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様では、ＣＡＲは細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、並びに共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメイン及び刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。

好ましくは、ＣＡＲは細胞外抗原結合ドメイン、任意選択によるヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、並びに１つ以上の共刺激分子に由来する２つの機能的シグナル伝達ドメイン及び刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様では、ＣＡＲはＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ−ｔｅｒ）に任意選択によるリーダー配列又はペプチドシグナル配列を含む。

特定の実施形態では、ＣＡＲは、本発明のＣＡＲでトランスフェクトされることが求められる細胞集団からの、発現細胞の同定及び選択を容易にするために、好ましくはＣＡＲ融合タンパク質のカルボキシ末端（Ｃ−ｔｅｒ）で連続的に、切断可能なリンカー及びレポーターをさらに含む。本発明によれば、操作されたＣＡＲは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又はそれ以上の成分を有し、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの成分は、特定のＨＬＡ−Ｇアイソフォームに対する免疫細胞の標的化又は結合を容易にする。好ましくは、この少なくとも１つの成分は前節で定義したモノクローナル抗体に由来する。好ましくは、この成分はｓｃＦｖである。

好ましくは、抗ＨＬＡ−ＧＣＡＲは、ＮからＣ末端に向かって連続的に：任意にペプチドシグナル配列、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体又はそのフラグメント、好ましくは抗ＨＬＡ−ＧｓｃＦｖ、スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、少なくとも１つの細胞内ドメイン、切断可能リンカー及び切断型ヒトＣＤ１９レポーターを含むか、又はそれらからなる。以下、これらの構成要素の全てについて、より具体的に説明する。

特に、本発明のＣＡＲ、特に本発明の抗原結合ドメイン、抗体若しくはｓｃＦｖは、１〜６、好ましくは２〜５のＨＬＡ−Ｇアイソフォーム、より好ましくは１つ若しくは２つのＨＬＡ−Ｇアイソフォーム又は２つ若しくは３つのＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的に結合し得るが、ＨＬＡ−Ｇアイソフォームの全てには結合しない。例えば、ＣＡＲは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的に結合することができる。ＨＬＡ−Ｇアイソフォームは、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６及びＨＬＡ−Ｇ７からなる群から選択することができ、好ましくはＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ５及びＨＬＡ−Ｇ６からである。

一態様では、ＣＡＲは、ＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５アイソフォームなどのβ２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇアイソフォームと特異的に結合することができる。それで、ＣＡＲは、実質的に他のＨＬＡ−Ｇアイソフォーム、特にＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ６及びＨＬＡ−Ｇ７と結合しない。より具体的には、ＣＡＲは、β２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的である。この文脈において、ＣＡＲは、β２Ｍを欠くＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５アイソフォームと実質的に結合しない。

別の態様では、ＣＡＲは、ＨＬＡ−Ｇ２及びＨＬＡ−Ｇ６アイソフォームに特異的に結合することができる。それで、ＣＡＲは、実質的に他のＨＬＡ−Ｇアイソフォーム、特にＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５及びＨＬＡ−Ｇ７と結合しない。より具体的には、ＣＡＲは、β２ＭフリーＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的であり、ＨＬＡ−Ｇ２及びＨＬＡ−Ｇ６の両方及び／又はＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍフリーアイソフォーム及びＨＬＡ−Ｇ５／β２Ｍフリーアイソフォームの両方と特異的に結合することができる。

抗原結合ドメイン
本発明のＣＡＲの外部ドメインは、抗原結合ドメインである。特に、この抗原結合ドメインは、上の節で定義した抗体に由来する。

ＣＡＲ分子による抗原標的化又は抗原認識は、最も一般的にはモノクローナル抗体から構築された一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の使用を含む。しかしながら、代替の標的化部分には、リガンド（Altenschmidt et al. (1996) Clin. Cancer Res. 2: 1001-8; Muniappan, et al. (2000) Cancer Gene Ther. 7: 128-134）、ペプチド（Pameijer et al. (2007) Cancer Gene Ther. 14:91-97）、キメラリガンド（Davies et al. (2012) Mol. Med.18:565-576）、レセプター誘導体（Zhang et al. (2012) J Immunol.189:2290-9）及び単一ドメイン抗体（Sharifzadeh et al. (2012) Cancer Res.72:1844-52）が含まれる。標的抗原、特に上で定義したＨＬＡ−Ｇアイソフォームを特異的に認識し、結合する任意の所望の抗体又はその抗体フラグメントは、本発明のＣＡＲに組み込み得る。

一実施形態では、そのような抗原結合ドメインは、抗体、好ましくは単鎖抗体である。好ましくは、抗体はヒト化抗体又は非ヒト化マウス抗体である。特に、そのような抗原結合ドメインは、フラグメント抗原結合（Ｆａｂ）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆｖフラグメント、組換えＩｇＧ（ｒＩｇＧ）フラグメント、一本鎖抗体フラグメント、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（例えば、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ）フラグメント、ダイアボディ、及び抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体から選択される抗体フラグメントである。特定の実施形態では、抗体は、ｓｃＦｖなどの可変重鎖領域及び／又は可変軽鎖領域を含む一本鎖抗体フラグメントである。特に、そのような抗原結合ドメインは、Ｆａｂ及びｓｃＦｖから選択される。

抗体フラグメントは無傷の抗体のタンパク質分解的消化並びに組換え宿主細胞による産生を含むが、これらに限定されない、種々の手法によって作製することができる。いくつかの実施形態では、抗体は、合成リンカー（例えばペプチドリンカー）によって結合した２つ以上の抗体領域又は鎖を有するものなどの天然に存在しない配置を含むフラグメント、及び／又は天然に存在する無傷の抗体の酵素消化によっては産生されない配置を含むフラグメントなど、組換えにより産生されたフラグメントである。いくつかの態様では、抗体フラグメントはｓｃＦｖである。

抗原標的化ドメインがｓｃＦｖである実施形態では、ｓｃＦｖは、フレキシブルリンカーによって連結された抗原特異的ｍＡｂの、可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）領域に由来し得る。ｓｃＦｖは、それが由来する完全抗体と同じ特異性及び類似の親和性を保持する（Muniappan et al. (2000) Cancer Gene Ther. 7: 128-134）。ｓｃＦｖを調製するには種々の方法を使用することができ、これには米国特許第４，６９４，７７８号; Bird et al. (1988) Science 242:423-442; Ward et al. (1989) Nature 334:54454;及びSkerra et al. (1988) Science 242: 1038-1041に記載がある方法が含まれる。特定の実施形態では、ｓｃＦｖがヒト化ｓｃＦｖであってもよく、又は完全ヒトｓｃＦｖであってもよい。

ＨＬＡ−Ｇの特定のアイソフォームに特異的に結合する抗原結合ドメインは、関連抗原と、例えば１〜５個、好ましくは２〜４個の他の異なるＨＬＡ−Ｇアイソフォームと、交差反応性であり得る。

いくつかの態様では、抗原結合ドメインは、他の抗体のエピトープと類似又は重複するエピトープなどの特定のエピトープへの結合、他の抗体との結合について競合する能力、及び／又は特定の結合親和性を含む結合特性などの、１つ以上の特定の機能的特徴を有する抗体又はそのフラグメントに由来してもよい。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメイン、そのようなものを含むＣＡＲ、及びそのようなＣＡＲを含む細胞は、標的抗原ネガティブ細胞と比較して、標的抗原発現細胞に対する結合優先性を示す。いくつかの実施形態では、結合優先性は非発現細胞と比較して、抗原発現に対して有意に大きい程度の結合が測定される場合に観察される。場合によっては、標的抗原又は抗原発現細胞に対して観察される結合のトータルの程度は、非抗原特異的ドメイン、ＣＡＲ、又は細胞に対して観察される結合の程度とほぼ同じか、少なくとも同じか、又はそれより大きい。提供された実施形態のいずれにおいても、親和性又は競合などの結合特性の比較は、上記のような当技術分野で公知の分析法による測定により得る。

別の実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、少なくとも１０^−６ＭのＫｄ親和定数で１つ又はいくつかのＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的に結合する。特定の態様では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、少なくとも約１０^−７Ｍ、好ましくは少なくとも約１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍ、１０^−１０Ｍの高い親和性で、１つ又はいくつかのＨＬＡ−Ｇアイソフォームに結合する。好ましくは、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、約１０^−９Ｍの親和性で１つ又はいくつかのＨＬＡ−Ｇアイソフォームに結合する。

一態様では、ＣＡＲの抗原結合フラグメントは、ＨＬＡ−Ｇ２及びＨＬＡ−Ｇ６の両方、及び／又はＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍフリー及びＨＬＡ−Ｇ５／β２Ｍフリーアイソフォームの両方に特異的に結合することができる。それで、ＣＡＲの抗原結合フラグメントは、実質的に他のＨＬＡ−Ｇアイソフォーム、特にＨＬＡ−Ｇ１及びβ２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇ５アイソフォーム、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、及びＨＬＡ−Ｇ７とは結合しない。より具体的には、ＣＡＲの抗原結合フラグメントは、β２ＭフリーＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的であり、β２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇアイソフォームに実質的に結合しない。

特定の実施形態では、ＣＡＲの抗原結合フラグメントはｉ）配列番号１、又は配列番号１と少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域；及び／又は
（ｉｉ）配列番号２、又は配列番号２と少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む。

さらなる特定の実施形態では、ＣＡＲの抗原結合フラグメントは、（ｉ）配列番号１の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２及び３を含む重鎖、並びに（ｉｉ）配列番号２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２及び３を含む軽鎖を含む。

さらなる特定の実施形態では、ＣＡＲの抗原結合フラグメントは、（ｉ）配列番号５、６及び７の配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）を含む重鎖、並びに（ｉｉ）配列番号８、９及び１０の配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含む軽鎖を含み、任意に、各ＣＤＲは任意に１、２、３又は４個のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含んでもよい。

別の態様では、ＣＡＲの抗原結合フラグメントは、ＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５アイソフォームなどのβ２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇアイソフォームと特異的に結合することができる。そしで、ＣＡＲの抗原結合フラグメントは、実質的に他のＨＬＡ−Ｇアイソフォーム、特にＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ６及びＨＬＡ−Ｇ７などのβ２Ｍフリーアイソフォームとは結合しない。この文脈において、ＣＡＲの抗原結合フラグメントは、β２Ｍを欠くＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５アイソフォームと実質的に結合しない。

特定の実施形態では、ＣＡＲの抗原結合フラグメントはｉ）配列番号３、又は配列番号３と少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域；及び／又は
（ｉｉ）配列番号４、又は配列番号４と少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む。

さらなる特定の実施形態では、ＣＡＲの抗原結合フラグメントは、（ｉ）配列番号３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２及び３を含む重鎖、並びに（ｉｉ）配列番号４の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２及び３を含む軽鎖を含む。

さらなる特定の実施形態では、ＣＡＲの抗原結合フラグメントは、（ｉ）配列番号１１、１２及び１３の配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）を含む重鎖、並びに（ｉｉ）配列番号１４、１５及び１６の配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含む軽鎖を含み、任意に、各ＣＤＲは任意に１、２、３又は４個のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含んでもよい。

特に、ＣＡＲの抗原結合フラグメントは、ＨＬＡ−Ｇアイソフォームの全てとは結合せず、又は全ては認識しない。一実施形態では、ＣＡＲの抗原結合フラグメントは、ＨＬＡ−Ｇアイソフォームのアルファ１ドメインと結合せず、又はそれを認識しない。このことは、そのような抗原結合フラグメントは、アルファ−１ドメインを欠くＨＬＡ−Ｇアイソフォーム、例えばTronik-Le Roux et al., Molecular Oncology 11(2017)1561-1578に記載のものなどの、アルファ２及びアルファ３ドメイン又はアルファ３ドメインのみを含むＨＬＡ−Ｇアイソフォームを認識できることを意味する。例えば、そのような抗原結合フラグメントは、アルファ２、アルファ３又はβ２Ｍドメインに結合することができる。

特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、多重特異性抗原結合ドメイン、好ましくは二重特異性抗原結合ドメインである。例えば、二重特異性抗原結合フラグメントは、ＨＬＡ−Ｇ／β２Ｍフリーアイソフォームを認識するドメインと、β２Ｍドメイン会合ＨＬＡ−Ｇアイソフォームを認識する第２のドメインとを含む。さらにより好ましくは、二重特異性抗原結合ドメインは、ＨＬＡ−Ｇ２及びＨＬＡ−Ｇ６の両方及び／又はＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍフリー及びＨＬＡ−Ｇ５／β２Ｍフリーアイソフォームの両方に特異的に結合する１つのドメイン、並びにβ２Ｍサブユニット会合ＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５アイソフォームに特異的に結合する別のドメインを含む。好ましくは、二重特異性抗原結合フラグメントは、上記のＣＤＲ（配列番号５〜１０）を有するＬＦＴＴ−１抗体及び上記のＣＤＲ（配列番号１１〜１６）を有する１５Ｅ７抗体の両方に由来する。

特定の実施形態では、ＣＡＲの抗原結合フラグメントは、（ｉ）配列番号１１、１２及び１３の配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）を含むドメイン、（ｉｉ）配列番号１４、１５及び１６の配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含むドメイン、（ｉｉｉ）配列番号５、６及び７の配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）を含むドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号８、９及び１０の配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含むドメインを含む二重特異性抗原結合ドメインであり、任意に各ＣＤＲは、任意に１、２、３又は４個のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含んでもよい。

ＣＡＲに適したそのような二重特異性抗原結合ドメインは例えば、タンデム型ｓｃＦｖ又はナノボディであり得る(De Munter et al., Molecular sciences 2018）。

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、抗ＨＬＡ−Ｇモノクローナル抗体のＣＤＲ配列を含むｓｃＦｖを含む。ＣＤＲは、従来の方法を使用して決定され得る。所与のＣＤＲ又はＦＲの正確なアミノ酸配列の境界は、Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.（「Ｋａｂａｔ」ナンバリングスキーム）、Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948（「Ｃｈｏｔｈｉａ」ナンバリングスキーム）、MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), “Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography,” J. Mol. Biol. 262, 732-745.”（「Ｃｏｎｔａｃｔ」ナンバリングスキーム）、Lefranc M P et al, “IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains,” Dev Comp Immunol, 2003 January; 27(l):55-77（「ＩＭＧＴ」ナンバリングスキーム）及びHonegger A and Pluckthun A, “Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool,” J Mol Biol, 2001 Jun. 8; 309(3):657-70（「Ａｈｏ」ナンバリングスキーム）に記載のものを含む多くの公知のスキームのいずれかを使用して、容易に決定することができる。

特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖはまた、ペプチドリンカーを含み得る。ｓｃＦｖのＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインを連結するペプチドリンカーは、Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌペアリング部位及び抗原結合部位の忠実度を損なうことなく、一方の可変領域ドメインのカルボキシル末端を他方の可変ドメインのアミノ末端に連結する。ペプチドリンカーは、１０〜３０のアミノ酸長で変化し得る。一実施形態では、ｓｃＦｖペプチドリンカーは、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ又はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒの１つ以上の反復を含む。一実施形態ではフレキシブルポリペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ_３Ｓｅｒ）_３及び（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３を含むが、これらに限定されない。

膜貫通ドメインとヒンジドメイン
ヒンジドメイン
Ｔ細胞が抗原提示細胞と相互作用すると、約１５ｎｍの膜間距離を有する免疫シナプスが形成される。この距離はＴＣＲとペプチド−ＭＨＣ複合体の構造によって決まる。この空間的分離は、リン酸化カスケード及びＴ細胞活性化の効果的なトリガーに重要である。人為的に短縮すると、このタンパク質はシナプス内に留まる機会を得て、活性化シグナルの抑制をもたらす。

標的細胞表面上の特定のｓｃＦｖによって認識されるエピトープの位置は、一般に固定されていることを考えると、ＣＡＲにおける細胞外スペーサー（ヒンジモジュール）の長さ及び剛性は、ｓｃＦｖとの最大の立体適合性及びコンパクトなシナプスの形成を確実にするために調節される必要がある。いくつかの態様では、免疫グロブリン定常領域の一部は、抗原結合ドメイン、例えばｓｃＦｖと膜貫通ドメインとの間のスペーサー領域として働く。スペーサーは、スペーサーの非存在下と比較して、抗原結合後の細胞の応答性を増加させる長さであり得る。スペーサードメインは、好ましくはＣＡＲと抗原との結合を促進し、細胞内のシグナル伝達を増強する配列を有する。結合を促進することが期待されるアミノ酸の例としては、システイン、荷電アミノ酸並びに潜在的なグリコシル化部位のセリン及びトレオニンなどがあり、これらのアミノ酸はスペーサードメインを構成するアミノ酸として用いることができる。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間、及び／又は膜貫通ドメインと細胞質ドメインとの間にヒンジ配列を含む。ヒンジドメインは、１５０アミノ酸まで、好ましくは１０〜１００アミノ酸、さらにより好ましくは５０〜１００アミノ酸長であり得る。当業者は、ヒンジ配列が柔軟性を促進するアミノ酸の短い配列であることを理解するのであろう（例えば、Woof et al, Nat. Rev. Immunol, 4(2): 89-99 (2004)を参照されたい）。ヒンジ配列は、任意の適切な分子に由来するか、又はそれから得られる任意の適切な配列であり得る。いくつかの実施形態では、ヒンジ配列の長さは、ＣＡＲと結合エピトープとの間の距離に基づいて最適化され得、例えば、より長いヒンジは膜近位エピトープに最適であり得る。

ヒンジは免疫グロブリンのＦｃ領域、例えば、ＩｇＧ１のＦｃ領域、ＩｇＧ２のＦｃ領域、ＩｇＧ３のＦｃ領域、ＩｇＧ４のＦｃ領域、ＩｇＥのＦｃ領域、ＩｇＭのＦｃ領域、又はＩｇＡのＦｃ領域に由来し得るか、又はその少なくとも一部を含み得る。特定の実施形態では、ヒンジドメインは、そのＣＨ２及びＣＨ３ドメイン内にあるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＭ、又はＩｇＡ免疫グロブリンＦｃ領域の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、スペーサードメインはまた、対応する免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部を含み得る。いくつかの実施形態では、ヒンジは、改変された免疫グロブリンのＦｃ領域、例えば、改変されたＩｇＧ１のＦｃ領域、改変されたＩｇＧ２のＦｃ領域、改変されたＩｇＧ３のＦｃ領域、改変されたＩｇＧ４のＦｃ領域、改変されたＩｇＥのＦｃ領域、改変されたＩｇＭのＦｃ領域又は改変されたＩｇＡのＦｃ領域に由来するか、又はその少なくとも一部を含む。改変された免疫グロブリンのＦｃ領域は、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）へのスペーサードメインの結合障害を引き起こす１つ以上のアミノ酸の置換、改変、又は欠失をもたらす１つ以上の変異（例えば、点変異、挿入、欠失、複製）を有し得る。いくつかの態様では、改変された免疫グロブリンのＦｃ領域は、ＦｃｙＲＩ、ＦｃｙＲ２Ａ、ＦｃｙＲ２ＢＩ、ＦｃｙＲ２Ｂ２、ＦｃｙＲ３Ａ、ＦｃｙＲ３Ｂ、ＦｃｓＲＩ、ＦｃｓＲ２、ＦｃａＲＩ、Ｆｃａ／μΚ、又はＦｃＲｎを含むが、これらに限定されない、１つ以上のＦｃＲへのスペーサードメインの結合障害を引き起こす１つ以上のアミノ酸の置換、改変、又は欠失をもたらす、１つ以上の変異と共に設計される。

例示的なヒンジとしては、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ２８ヒンジ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４（ヒンジ−Ｆｃ部分）配列（１つの研究ではＣＤ４、ＣＤ７、及びＩｇＤ）ＩｇＧ４ヒンジ単独、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに連結されたＩｇＧ４ヒンジ、又はＣＨ３ドメインに連結されたＩｇＧ４ヒンジが挙げられ、これらはHudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153、国際公開第２０１４０３１６８７号、米国特許第８，８２２，６４７号又は米国特許出願公開第２０１４／０２７１６３５号に記載がある。ヒンジドメインとして、本発明は、ＣＤ８ａの残基１１８〜１７８（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１７５９．３）、ＣＤ８の残基１３５〜１９５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ３５６６４）、ＣＤ４の残基３１５〜３９６（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００６０７．１）、又はＣＤ２８の残基１３７〜１５２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００６１３０．１）の全部又は一部に関する。また、スペーサードメインとしては、抗体Ｈ鎖又はＬ鎖の定常領域の一部（ＣＨＩ領域又はＣＬ領域）を用いることができる。さらに、スペーサードメインは、人工的に合成された配列であってもよい。特に、本発明のＣＡＲは、ＣＤ８ａ、ＣＤ２８、及びＩｇＧ１／ＩｇＧ４（ヒンジ−Ｆｃ部分）配列（１つの研究ではＣＤ４、ＣＤ７、及びＩｇＤ）から選択されるヒンジを含む。この選択は、これらの配列が比較的中性であり、フレキシブルであり、構造的に十分に特徴付けられているという事実に基づいている。

好ましくは、ヒンジドメインは、（ｉ）ＣＤ２８ヒンジ、（ｉｉ）ＣＤ８アルファヒンジ（ｉｉｉ）ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン、（ｉｖ）ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン及びＣＨ３ヒトＩｇＧ４ドメイン若しくは（ｖ）変異ＣＨ２ヒトＩｇＧ４ドメイン、ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン及びＣＨ３ヒトＩｇＧ４ヒンジドメインを含むか、又はそれらからなる。さらにより好ましくは、ヒンジドメインは（ａ）配列番号１８、（ｂ）配列番号１９、（ｃ）配列番号２５、（ｄ）配列番号２５及び配列番号２７、又は（ｅ）配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７、若しくはそれらと少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する配列を含むか、若しくはそれらからなる。

一態様では、ヒンジドメインは、（ｉ）ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン、（ｉｉ）ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン及びＣＨ３ヒトＩｇＧ４ドメイン、若しくは（ｉｉｉ）変異ＣＨ２ヒトＩｇＧ４ドメイン、ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン及びＣＨ３ヒトＩｇＧ４ヒンジドメインを含むか、又はそれらからなる。特に、ヒンジドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって連続的に（ｉ）ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン及びＣＨ３ヒトＩｇＧ４ドメイン、若しくは（ｉｉ）変異ＣＨ２ヒトＩｇＧ４ドメイン、ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン及びＣＨ３ヒトＩｇＧ４ヒンジドメインを含むか、又はそれらからなる。

一実施形態では、本発明のＣＡＲは、配列番号２５に示す配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％の同一性を有する配列を含むか、若しくはそれからなるヒトＩｇＧ４ヒンジドメインを含むか、若しくはそれからなるスペーサードメインを含む。

別の実施形態では、本発明のＣＡＲは、（ｉ）配列番号２７に示す配列又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％の同一性を有する配列を含むか、若しくはそれからなるＣＨ３ヒトＩｇＧ４ドメイン、及び（ｉｉ）配列番号２５に示す配列又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％の同一性を有する配列を含むか、若しくはそれからなるヒトｌｇＧ４ヒンジドメインを含むか若しくはそれらからなるスペーサードメインを含む。

一実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＣＨ２ヒトＩｇＧ４ドメインにおける変異が、例えばWatanabe et al. Oncoimmunology. 2016;5(12):e1253656で開示されたような、アミノ酸ＥＦＬＧ（１１３−１１６）ＰＶＡ及びＮ１７７Ｑの変異からなる、変異ヒトＩｇＧ４ドメインをさらに含む。好ましくは、変異ＣＨ２ヒトＩｇＧ４ドメインは、配列番号２６で示される配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列を含むか、若しくはそれらからなる。

好ましい実施形態では、本発明のＣＡＲは連続的に、（ｉ）配列番号２６に示す配列、若しくはそれと少なくとも８０、８５、９０、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列を含むか、若しくはそれからなる変異ＣＨ２ヒトＩｇＧ４ドメイン、（ｉｉ）配列番号２７に示す配列、若しくはそれと少なくとも８０、８５、９０、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列を含むか、若しくはそれからなるＣＨ３ヒトＩｇＧ４ドメイン、及び（ｉｉｉ）配列番号２５に示す配列、若しくはそれと少なくとも８０、８５、９０、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列を含むか、若しくはそれからなるヒトＩｇＧ４ヒンジドメインを含むか、又はそれらからなるヒンジドメインを含む。

特に、本発明のＣＡＲは、好ましくは配列番号１８の配列又はそれと少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する配列を含むか、若しくはそれからなるＣＤ８ａヒンジドメインを含む。

本発明の別の特定のＣＡＲは、好ましくは配列番号１９の配列又はそれと少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する配列を含むか、若しくはそれからなるＣＤ２８ヒンジドメインを含む。

膜貫通ドメイン
膜貫通モジュールは、レセプターを細胞表面に固定するように機能する。膜貫通ドメインに関して、ＣＡＲは、ＣＡＲの抗原結合ドメインに融合される膜貫通ドメインを含むように設計することができる。特に、ＣＡＲは、ＣＡＲの抗原結合ドメイン及びエンドドメインの両方に融合される膜貫通ドメインを含むように設計することができる。

一実施形態では、ＣＡＲのドメインの１つと天然に関連する膜貫通ドメインが使用される。いくつかの場合には、膜貫通ドメインは、アミノ酸置換によって選択又は改変されて、同一又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの、そのようなドメインの結合を回避し、レセプター複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にすることができる。膜貫通ドメインは、天然又は合成源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合又は膜貫通タンパク質に由来し得る。典型的には、この膜貫通ドメインは、内在性タンパク質としても知られる、膜貫通タンパク質の単一の膜貫通ヘリックスを意味する。このドメインは、通常、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ８、ＦｃＲＩγの膜貫通配列を、また頻度はより低いがＣＤ４、ＣＤ７、ＯＸ４０及びＭＨＣ（Ｈ２−Ｋｂ）を含み、その選択は隣接のスペーサー及び細胞内配列による。ＣＤ３ζとＦｃＲＩγに基づく膜貫通モジュールは、内因性ＴＣＲへのＣＡＲの効率的な取り込みを保証する。例えば、国際公開第２００８／０４５４３７号のＣＡＲは、ヒトＣＤ８アルファ又はＣＤ２８に由来する膜貫通部分、及び、特に、アミノ酸１３５〜２０５位、１３５〜２０３位又は１３５〜１８２位（UniProtKB/Swiss-Prot P01732のアミノ酸番号付けによる）（それぞれは、１６４位及び１８１位にシステイン残基を含む）を有する非改変ＣＤ８ヒンジ領域を有するキメラＴ細胞レセプタータンパク質を記載する。国際公開第９５／３００１４号は、１７８位にシステイン残基を含む、アミノ酸１３２〜１９１位（UniProtKB/Swiss-Prot P01731のアミノ酸番号付けによる）を有する未改変マウスＣＤ８ヒンジ領域を使用する。特に、米国特許出願公開第２００８／０２６０７３８号は、１６４位のシステインがセリンで置換されている、アミノ酸１３１〜１７０位又は１３６〜１６９位（UniProtKB/Swiss-Prot P01732のアミノ酸番号付けによる）を有する改変ＣＤ８ヒンジ領域を使用する。したがって、ＣＡＲドメイン特性に従ってどの膜貫通ドメインを選択するかは、当業者に知られているだろう。

本発明で特に使用される膜貫通領域は、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、Ｈ２−Ｋｂ、ＦｃｓＲＩｙ、ＧＩＴＲ又はＣＤ３ζに由来し（すなわち、少なくともこれらの膜貫通領域を含み）得、及び／又はその機能的変異体（その構造特性、例えば膜貫通特性の実質的部分を保持するものなど）を含有する膜貫通領域を使用することができる。例えば、Kahlon et al. (2004) Cancer Res. 64:9160-9166; Schambach et al. (2009) Methods Mol. Biol. 506: 191-205; Jensen et al. (1998) Biol. Blood Marrow Transplant 4:75-83; Patel et al. (1999) Gene Ther. 6:412; Song et al. (2012) Blood 119:696- 706; Carpenito et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:3360-5; Hombach et al. (2012) Oncoimmunology 1 :458-66)及びGeiger et al. (2001) Blood 98:2364-71を参照されたい。

或いは、膜貫通ドメインは合成であってもよく、その場合、それはロイシン及びバリンなどの疎水性残基を主に含む。好ましくはフェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットは合成膜貫通ドメインの各末端に見出されるであろう。本発明の膜貫通ドメインは、膜中で熱力学的に安定である。それは、単一のアルファヘリックス、膜貫通ベータバレル、グラミシジンＡのベータ−ヘリックス、又は他の任意の構造であり得る。

任意に、好ましくは２〜１０アミノ酸長の短いオリゴ又はポリペプチドリンカーは、膜貫通ドメインとＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインとの間に連結を形成し得る。グリシン−セリン二重鎖は、適切なリンカーを提供し得る。

一実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ８、ＦｃＲＩγ ＣＤ４、ＣＤ７、ＯＸ４０、及びＭＨＣ（Ｈ２−Ｋｂ）膜貫通ドメインから選択される。好ましくは、本発明のＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８及びＣＤ２８膜貫通ドメインから選択される。さらにより好ましくは、本発明のＣＡＲの膜貫通ドメインは、好ましくは配列番号２０の配列又はそれと少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する配列を含むか、若しくはそれからなるＣＤ２８膜貫通ドメインである。

細胞内ドメイン
ある実施形態では、Ｔ細胞レセプターζ鎖に由来するものなどの細胞質又は細胞内シグナル伝達ドメインは、標的抗原とキメラレセプターとの結合に続いて、Ｔリンパ球増殖及びエフェクター機能に対する刺激シグナルを産生するために、キメラレセプターの少なくとも一部として使用される。

ＣＡＲのシグナル伝達モジュールの役割は、細胞外ドメインが抗原を認識すると、直ちに活性化シグナルを免疫細胞に伝達することである。Ｔ細胞では、活性化は、ＴＣＲ複合体のＣＤ３ζサブユニットの細胞質部分で、免疫レセプターのチロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）のリン酸化から始まる。したがって、今日までに実施されたほとんどのＣＡＲ設計において、ＣＤ３ζからのシグナル伝達配列は、細胞溶解活性を誘発するモジュールとして使用される。

ＣＤ３ζ鎖のみを含む第一世代のＣＡＲは、専ら活性化シグナルを細胞に送った。これは、腫瘍細胞に対する細胞毒性反応をもたらしたが、活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖を強化することはなかった。原則として、増殖シグナルはＣＡＲ−Ｔ細胞上に存在する天然のコレセプターによって潜在的に供給され得る；しかしながら、多くの腫瘍は、対応するリガンドを発現しない。したがって、第２世代のＣＡＲは、この困難を克服するために、ＣＤ３ζに融合した共刺激ＣＤ２８ドメインを追加で含む細胞質ドメインを含む。このＣＡＲの設計は、Ｔ細胞に活性化と増殖の両シグナルを提供し、その結果、細胞は活性化され、標的細胞を破壊し、増殖する。ＣＤ２８の他に、ＣＤ１３４（ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＣＤ２７、ＣＤ２４４（２Ｂ４）などの共刺激レセプター由来のシグナル伝達配列をＣＡＲで試験することに成功した。

第３世代のＣＡＲは、２つ以上の共刺激配列（４−１ＢＢ−ＣＤ２８−ＣＤ３ζなど）を組み合わせることに基づいている。これらのレセプターは、より広範囲のサイトカイン（ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＩＦＮγを含む）を分泌し、活性化誘導細胞死に対して感受性が低く、マウスモデルでの腫瘍除去においてより高い有効性を示す。いわゆる第３世代ＣＡＲは例えば、相加効果又は相乗効果のために、少なくとも２つ又は３つの融合したシグナル伝達ドメインを有するので、１つ又は複数のエンドドメインを使用し得る。

本発明のＣＡＲは、上述のような第１世代、第２世代、又は第３世代のＣＡＲであってもよい。好ましくは、ＣＡＲは、第２世代又は第３世代のＣＡＲである。さらにより好ましくは、ＣＡＲは、Ｔ細胞によって発現される場合には第３世代のＣＡＲであり、ＮＫ又はＮＫＴ細胞によって発現される場合には第１世代のＣＡＲである。

いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達エンドドメインは、同じ分子内に存在する細胞外抗原標的化ドメインが抗原に結合する場合に、細胞内にシグナルを伝達する。

Ｔ細胞の活性化は、２つの異なる種類の細胞質シグナル伝達エンドドメイン、すなわち、ＴＣＲ複合体（一次細胞質シグナル伝達エンドドメイン）を介して抗原依存性一次活性化を開始するための配列、及び二次又は共刺激シグナル（二次細胞質シグナル伝達エンドドメイン又は共刺激エンドドメイン）を提供するために抗原非依存的に作用するための配列によって伝達される。したがって、いくつかの実施形態は、一次細胞質シグナル伝達エンドドメインのみを有するＣＡＲを含むが、他の実施形態では、本発明のＣＡＲは一次シグナル伝達エンドドメイン及び二次細胞質シグナル伝達エンドドメインを含む。

本発明のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが配置されている免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化を始動させるか、又は引き起こす。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊な機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性又はサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を使用することができるが、多くの場合、鎖全体を使用することは必ずしも必要ない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分が使用される限り、そのような切断部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、無傷の鎖の代わりに使用し得る。このように、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断部分を含むことを意味する。

本発明で特に使用される細胞内ドメイン配列の例には、リンパ球レセプター鎖の細胞内シグナル伝達ドメイン、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体タンパク質、Ｆｃレセプターサブユニット、ＩＬ−２レセプターサブユニット、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＦｃｓＲＩ、ＤＡＰ１０、及びＤＡＰ１２に由来するものが含まれる。本発明のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する細胞質シグナル伝達配列を含むことが特に好ましい。具体的に、ＩＴＡＭの例としては、ＣＤ３の残基５１〜１６４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９３２１７０）、ＦｃｓＲＩｙの残基４５〜８６（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００４０９７）、ＦｃｓＲｉの残基２０１〜２４４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００１３０）、ＣＤ３γの残基１３９〜１８２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００００６４）、ＣＤ３５の残基１２８〜１７１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００７２３）、ＣＤ３の残基１５３〜２０７（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００７２４）、ＣＤ５の残基４０２〜４９５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５５０２２）、ＣＤ２２の残基７０７〜８４７（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１７６２）、ＣＤ７９ａの残基１６６〜２２６（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１７７４）、ＣＤ７９ｂの残基１８２〜２２９（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００６１１）、及びＣＤ６６ｄの残基１７７〜２５２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１８０６）、並びにそれらの変異体が挙げられる。参照された残基は、ＧｅｎＢａｎｋからのアミノ酸配列情報に基づき、そして各タンパク質の前駆体（シグナルペプチド配列などを含む）の完全長に基づいている。本発明のＣＡＲで使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの好ましい例としては、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）の細胞質配列、及び抗原レセプター結合後のシグナル伝達を開始するために協調して作用するコレセプター、及びこれらの配列の任意の誘導体又は変異体、並びに同じ機能的能力を有する任意の合成配列が挙げられる。

好ましい実施形態では、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを単独で、又は本発明のＣＡＲの文脈において有用な任意の他の所望の細胞質ドメインと組み合わせて含むように設計することができる。１つの特定の態様では、本発明のＣＡＲは、好ましくは配列番号２２の配列又はそれと少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する配列を含むか、若しくはそれからなるＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。

ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ζ鎖部分及び共刺激シグナル伝達領域を含むことができる。共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部を指す。

本発明で使用し得る共刺激分子の例としては、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦレセプタータンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカインレセプター、インテグリン、シグナリングリンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞レセプター、Ｔｏｌｌリガンドレセプター、Ｂ７−Ｈ３、ＢＡＦＦＲ、ＢＴＬＡ、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８ａ、ＣＤ８、ＣＤｌｌａ、ＬＦＡ−１（ＣＤｌｌａ／ＣＤ１８）、ＣＤｌｌｂ、ＣＤｌｌｃ、ＣＤｌｌｄ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１９ａ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ６９、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Tactile）、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３、ＣＲＴＡＭ、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤＳ、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１０、ＧＡＤＳ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＩＡ４、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ２Ｒβ，ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒａ、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡＤ、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ７、ＫＩＲＤＳ２、ＬＡＴ、ＬＦＡ−１、ＬＩＧＨＴ、ＬＴＢＲ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＰＤ−１、ＰＳＧＬＩ、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＰ−７６、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＶＬＡ−ｌ、ＶＬＡ−６、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。

刺激リガンドは、当技術分野で周知であり、とりわけ、ペプチド、抗ＣＤ３抗体、スーパーアゴニスト抗ＣＤ２８抗体、及びスーパーアゴニスト抗ＣＤ２抗体を負荷したＭＨＣクラスＩ分子を包含する。

一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、リンパ球レセプター鎖の細胞内シグナル伝達ドメイン、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体タンパク質、Ｆｃレセプターサブユニット、ＩＬ−２レセプターサブユニット、ＣＤ３、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＦｃｓＲＩ、ＤＡＰ１０、及びＤＡＰ１２から選択される少なくとも１つの細胞内ドメインを含む。

一実施形態では、本発明のＣＡＲの共刺激ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３４（ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＣＤ２７、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＣＤ１４９、ＤＡＰ１０、ＣＤ３０、ＩＬ２−Ｒ、ＩＬ７ｒ６、ＩＬ２１−Ｒ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＣＤ２７及びＤＮＡＭ−１から選択される。これらの異なる共刺激ドメインは、異なるサイトカインプロファイルを産生し、今度はそれが標的細胞媒介細胞毒性及び腫瘍微小環境に対して影響を及ぼす。特に、共刺激ドメインは、ＣＤ３ζと融合する。一実施形態では、本発明のＣＡＲの共刺激ドメインは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ及びＯＸ４０から選択される。

本発明のＣＡＲでは、任意の適切なエンドドメインを使用し得るが、特定の実施形態では、本発明は細胞内ドメインとして、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζのエンドドメインの全て又は一部の使用を特に意図している。本発明のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメイン内の細胞質シグナル伝達配列は、ランダム又は特定の順序で互いに連結され得る。２つ以上の細胞内エンドドメインを含むＣＡＲでは、ドメインを連結するために、上記のようなオリゴペプチドリンカー、又はポリペプチドリンカーを細胞内エンドドメイン間に挿入することができる。任意に、好ましくはアミノ酸長が２〜１０の間の、短いオリゴペプチドリンカー又はポリペプチドリンカーで連結を形成してもよい。グリシン−セリンダブレット又は連続配列は、特に適切なリンカーを提供する。特に、ペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ）_３−Ｓｅｒリンカー、又はそのダブレット若しくはトリプレットなどのその任意の反復であってもよい。

本明細書で使用する場合、用語「４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域」は、この名称に関連する特定のタンパク質フラグメント、及び配列番号２１で示される４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域の配列と、少なくとも７０％、又は代わりに少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する任意の他の分子を指す。４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域の例示的配列は、米国特許出願公開第２０１３０２６６５５１Ａ１号で提供されている。

ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインの配列の例は、米国特許第５，６８６，２８１号；Geiger, T. L. et al., Blood 98: 2364-2371 (2001); Hombach A. et al., J Immunol 167: 6123-6131 (2001); Maher J. et al. Nat Biotechnol 20: 70-75 (2002); Haynes N. M. et al., J Immunol 169: 5780-5786 (2002); Haynes N. M. et al., Blood 100: 3155-3163 (2002)で提供されている。

ＯＸ４０共刺激シグナル伝達領域の配列の非限定的な例は、米国特許出願公開第２０１２／２０１４８５５２Ａ１号に開示されている。

特定の実施形態では、本発明のＣＡＲは、好ましくは配列番号２１の配列又はそれと少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する配列を含むか、若しくはそれからなる４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域を含む。

シグナルペプチド
抗原標的化ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、及びシグナル伝達エンドドメインに加えて、本発明のＣＡＲは、ＣＡＲのＮ末端に連結されたシグナルペプチド配列をさらに含むことができる。シグナルペプチド配列は、多くの分泌タンパク質及び膜タンパク質のＮ末端に存在し、典型的には１５〜３０アミノ酸長を有する。上記のタンパク質分子の多くは、シグナルペプチド配列を有するので、これらのシグナルペプチドは、本発明のＣＡＲのためのシグナルペプチドとして使用することができる。

一実施形態では、抗原結合ドメインを含む配列はシグナルペプチドをさらに含む。抗原結合ドメインが抗原結合フラグメント、好ましくはｓｃＦｖを含む実施形態では、シグナルペプチドは抗原結合フラグメント又はｓｃＦｖのアミノ末端に位置し得る。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域がＮ末端である場合、シグナルペプチドは、重鎖可変領域のアミノ末端に位置し得る。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域がＮ末端である場合、リーダー配列は、軽鎖可変領域のアミノ末端に位置し得る。リーダー配列は、任意の適切なシグナル配列を含み得る。一実施形態では、本発明のＣＡＲ、好ましくは抗体又は抗原結合フラグメント、さらにより好ましくはｓｃＦｖは、ＣＤ８ａ、マウスＩｇカッパシグナルペプチド、ヒトＩｇＧ４シグナルペプチド、ＩＬ２シグナルペプチド、ヒトＩｇＧ２シグナルペプチド及びガウシアルシフェラーゼシグナルペプチドからなる群から選択されるシグナルペプチドを含む。一実施形態では、本発明のＣＡＲ、好ましくはｓｃＦｖは配列番号１７、２４、７５、７６、７７、及び７８からなる群から選択されるシグナルペプチドを含む。

特定の実施形態では、本発明のＣＡＲは、好ましくは配列番号１７の配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する配列を含むか、若しくはそれからなるＣＤ８ａシグナルペプチドを含む。

切断可能なリンカー
特定の実施形態では、本発明のＣＡＲは切断可能なリンカーをさらに含む。切断可能なリンカーは、タンパク質又はポリペプチドの生成後、特に本発明のＣＡＲの翻訳後に切断される、ペプチド、ポリペプチド又はポリペプチドの一部であり得る。

特に、切断可能なリンカーは、自己切断可能な、自己切断する、自己切断ペプチド又はリンカーであり、これらの用語は、本明細書では互換的に使用される。

一実施形態では、切断可能なリンカーは２Ａペプチドを含む。「２Ａ」又は「２Ａ様」配列は、ペプチド結合スキッピングを引き起こすことができる、ペプチドの大きなファミリーの一部である。特に、２Ａ媒介「自己切断」のメカニズムは、最近、２ＡペプチドのＣ末端におけるグリシル−プロリルペプチド結合の形成をスキップするリボソームであることが発見された。２Ａペプチド媒介切断は、翻訳後に始まる。翻訳のスキップ及び再開に成功すると、２つの「切断された」タンパク質が生じる：２Ａの上流のタンパク質はＣ末端プロリンを除く完全な２Ａペプチドに結合し、２Ａの下流のタンパク質は、Ｎ末端で１つのプロリンに結合する。スキップに成功しても、リボソームが脱落し、翻訳を中断すると、２Ａの上流のタンパク質だけが生じる。いくつかの２Ａペプチドが、ピコルナウイルス、昆虫ウイルス及びＣ型ロタウイルスで同定されている。

本発明の切断可能なリンカーの例としては、例えば、Kim et al. (2011) PLoS ONE 6(4): el8556及びLiu et al (2017) Sci Rep. 2017; 7: 2193に記載がある、ブタテスコウイルス−１２Ａ（Ｐ２Ａ）、ＦＭＤＶ２Ａ（Ｆ２Ａ）；ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）；及びThosea asignaウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）及び軟化病ウイルス２Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

好ましくは、切断可能なリンカーは、配列番号２８に示す配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する配列を含むか、若しくはそれからなるＰ２Ａである。

一実施形態では、切断可能リンカーのＮ末端は、ＣＡＲエンドドメインのＣ末端に作動可能に連結され、及び／又は切断可能リンカーのＣ末端は、レポーターのＮ末端に作動可能に連結される。

レポーター
安全性の理由で、追跡目的のために、又は望ましくない改変されたＣＡＲ発現細胞の排除のために、本発明のＣＡＲコンストラクトは、選択マーカー又はレポーターをさらに含み得る。特に、ＣＡＲ細胞は、自己切断リンカーを用いて操作されて、レポーターとＣＡＲを共発現し、例えば抗体によってＣＡＲ細胞を選択又は排除する可能性を提供することができる。

特定の実施形態では、レポーターのＮ末端は、レポーター分子の放出を可能にするために、上記の２Ａリンカーなどの切断可能なリンカーによって、抗ＨＬＡ−ＧＣＡＲに連結される。次いで、このレポーターを使用して、目的の細胞へのＣＡＲコンストラクトの成功裡の送達又は目的の細胞での発現を確認することができる。

特に、レポーターは、ｃ−ｍｙｃタグ、ＣＤ２０、ＣＤ５２（Ｃａｍｐａｔｈ）、切断型ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）、切断型ＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）、若しくはそれらの任意の部分若しくは組み合わせ、又は細胞内で発現及び／又は検出することができる任意の他のマーカー分子からなる群の中で選択される。

好ましい実施形態では、レポーターはＣＤ１９レポーター、好ましくは、３１４〜５５６位のアミノ酸が除去された（すなわち、３１３アミノ酸が除去された）ヒト切断型ＣＤ１９（ｈＣＤ１９ｔ）レポーターである。特定の実施形態では、切断型ヒトＣＤ１９は、アクセッション番号ＮＰ＿００１１７１５６９．１で知られているヒトＣＤ１９（アミノ酸１〜３１３）の細胞外及び膜貫通部分を含む、GeneArtによって合成されたものである。

好ましくは、レポーターは、配列番号２８に示す配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する配列を含むか、若しくはそれからなるヒト切断型ＣＤ１９レポーターである。

本発明の特定のＣＡＲ
特定の実施形態では、本発明のＣＡＲは、シグナルペプチド、好ましくはＣＤ８ａシグナルペプチド；好ましくは、特に上で詳述した、ｓｃＦｖとしての１つ若しくはいくつかのＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的な抗原結合ドメイン；任意に、好ましくは（ｉ）ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン（ｉｉ）ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン及びＣＨ３ヒトＩｇＧ４ドメイン、又は（ｉｉｉ）変異ＣＨ２ヒトＩｇＧ４ドメイン、ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン及びＣＨ３ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン、若しくは（ｉｖ）ＣＤ２８ヒンジ、（ｖ）ＣＤ８ａヒンジ；を含むか若しくはそれらからなるヒンジ；膜貫通ドメイン、好ましくはＣＤ２８膜貫通ドメイン；好ましくはＣＤ２８、４−１ＢＢ及びＯＸ４０共刺激シグナル伝達領域から選択される共刺激シグナル伝達領域、より好ましくは４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域；並びにＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、及び任意に切断可能なリンカー、好ましくは２Ａリンカー及びレポーター、好ましくはｈＣＤ１９ｔレポーターを含む。

一実施形態では、ＣＡＲコンストラクトは、（ｉ）配列番号１１、１２及び１３の配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）を含むドメイン、（ｉｉ）配列番号１４、１５及び１６の配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含むドメイン、（ｉｉｉ）配列番号５、６及び７の配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）を含むドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号８、９及び１０の配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含むドメインを含む二重特異性ＣＡＲコンストラクトであり、任意に各ＣＤＲは、任意に１、２、３又は４個のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含んでもよい。

より具体的には、本発明のＣＡＲは、配列番号３２、３３、３４、３５、３６、３７、８３若しくは８５のポリペプチド配列、又は配列番号３２、３３、３４、３５、３６、３７、８３若しくは８５の配列と少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有し、同じ機能を有する配列を含むか、若しくはそれからなってもよい。

ＣＡＲの変動
本発明の範囲には、本明細書に記載の本発明のＣＡＲの機能的部分が含まれる。用語「機能的部分」は、ＣＡＲについて使用される場合、本発明のＣＡＲの任意の部分又はフラグメントを指し、その部分又はフラグメントは、それがその一部であるＣＡＲ（親ＣＡＲ）の生物学的活性を保持する。機能的部分は、例えば、抗原若しくは標的細胞を認識する能力を保持するＣＡＲの部分、又は親ＣＡＲと類似の程度、同程度、若しくはより高い程度で疾患を検出、治療、若しくは予防するＣＡＲの部分を包含する。親ＣＡＲについては、機能性部分は例えば、親ＣＡＲの約１０％、２５％、３０％、５０％、６８％、８０％、９０％、９５％、又はそれより多くを含むことができる。

機能的部分は、その部分のアミノ末端若しくはカルボキシ末端、又は両末端に追加のアミノ酸を含むことができ、この追加のアミノ酸は、親ＣＡＲのアミノ酸配列には見出されない。望ましくは、追加のアミノ酸は生物学的機能を妨害せず、例えば、標的細胞を認識し、癌を検出し、癌を治療又は予防するなどである。より望ましくは、追加のアミノ酸は、親ＣＡＲの生物学的活性と比較して、生物学的活性を増強する。

本発明の範囲には、本明細書で説明した本発明のＣＡＲ又は抗体の機能的変異体、又は生物学的同等物が含まれる。機能的変異体は、例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する親ポリペプチドのアミノ酸配列を含み得る。或いはさらに、機能的変異体は、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を有する親ポリペプチドのアミノ酸配列を含み得る。この場合、非保存的アミノ酸置換が、機能的変異体の生物学的活性を妨害又は阻害しないことが好ましい。非保存的アミノ酸置換は、機能的変異体の生物学的活性を増強させ、その結果、親ペプチドと比較して機能的変異体の生物学的活性を増加させ得る。

そのような生物学的変異体（その機能的部分を含む）は、１つ以上の天然に存在するアミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含むことができる。

そのような生物学的変異体（その機能的部分を含む）は、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎ−アシル化、例えばジスルフィド架橋を介して環化させるか、若しくは酸付加塩に変換させるか、及び／又は任意に二量体化若しくは重合させるか、若しくは複合化させることができる。

そのような生物学的変異体（その機能的部分を含む）は、当技術分野で公知の方法によって得ることができる。ポリペプチドは、ポリペプチド又はタンパク質を作製する任意の適切な方法によって作製し得る。ポリペプチド及びタンパク質をデノボ合成する適切な方法は、文献、例えばChan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2000; Peptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed. Westwood et al., Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2001及び米国特許第５，４４９，７５２号に記載がある。また、ポリペプチド及びタンパク質は、標準的な組換え方法を使用して、本明細書中に記載の核酸を使用して組換え的に産生することができる。例えば、Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001;及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994を参照されたい。

ＣＡＲ発現のための核酸コンストラクト及びベクター
本発明はまた、上記の抗体をコードする核酸、又は本発明のＣＡＲをコードする核酸に関する。そのような核酸は、ＣＡＲを発現する細胞を作製するために、細胞、特に免疫細胞に形質導入することができる。特に、核酸コンストラクトは、上記の、外部ドメイン、細胞内ドメイン、膜貫通、任意にヒンジドメイン、及び任意に切断可能なリンカー、レポーター及び／又は上記のシグナルペプチドをコードする配列を含む。

一実施形態では、核酸コンストラクトは、ＮからＣ末端に向かって連続的に：任意選択によるペプチドシグナル配列、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体若しくはそのフラグメント、好ましくは抗ＨＬＡ−ＧｓｃＦｖ、スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、少なくとも１つの細胞内ドメイン、並びに任意選択による切断可能リンカー及びレポーターを含むか、又はそれらからなる。

さらなる実施形態では、核酸コンストラクトは、タグ、好ましくはフラッグタグをさらに含む。例えば、フラッグタグは、配列番号２３、配列番号６０、又は配列番号７９を含むか、又はそれらからなる。

いくつかの実施形態では、核酸コンストラクトは、以下を含む：
（ｉ）上記の抗ＨＬＡ−ＧｓｃＦｖをコードする核酸配列；
（ｉｉ）好ましくは（ｉ）ＣＤ２８ヒンジ、（ｉｉ）ＣＤ８アルファヒンジ、（ｉｉｉ）ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン、（ｉｖ）ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン及びＣＨ３ヒトＩｇＧ４ドメイン、又は（ｖ）変異ＣＨ２ヒトＩｇＧ４ドメイン、ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン及びＣＨ３ヒトＩｇＧ４ヒンジドメインからなる群から選択される、ヒンジをコードする任意選択による核酸配列
（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン、好ましくはＣＤ２８膜貫通ドメインをコードする核酸配列；
（ｉｉｉ）エンドドメイン、好ましくは４−１ＢＢドメイン及び／又はＣＤ３ζドメインをコードする核酸配列；
（ｉｖ）任意選択による切断可能なリンカー、好ましくはＰ２Ａ切断可能なリンカー；
（ｖ）任意選択による、レポーター、好ましくはｈＣＤ１９ｔレポーター；及び／又は
（ｖｉ）好ましくは、ＣＤ８ａ、マウスＩｇカッパシグナルペプチド、ヒトＩｇＧ４シグナルペプチド及びＩＬ２シグナルペプチドからなる群より選択される、任意選択によるシグナルペプチド。

いくつかの実施形態では、核酸コンストラクトは、以下を含む：
（ｉ）配列番号５、６及び７のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３をそれぞれコードする核酸配列、例えば、それぞれ配列番号４２、４３及び４４；並びに
（ｉｉ）配列番号８、９及び１０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３をそれぞれコードする核酸配列、例えば、それぞれ配列番号４５、４６及び４７。

或いは、核酸コンストラクトは、以下を含む：
（ｉ）配列番号１１、１２及び１３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３をそれぞれコードする核酸配列、例えば、それぞれ配列番号４８、４９及び５０、並びに
（ｉｉ）配列番号１４、１５及び１６のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３をそれぞれコードする核酸配列、例えば、それぞれ配列番号５１、５２及び５３。

特定の実施形態では、核酸コンストラクトは、以下を含むか、又は実質的に以下からなる：
（ｉ）配列番号１又は配列番号１と少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する配列、例えば配列番号３８をコードする核酸配列；
（ｉｉ）配列番号２又は配列番号２と少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する配列、例えば配列番号３９をコードする核酸配列；
（ｉｉｉ）任意に、（ａ）配列番号１８、（ｂ）配列番号１９、（ｃ）配列番号２５、（ｄ）配列番号２５及び配列番号２７、若しくは（ｅ）配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７、又は、これらと少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する配列、例えば、それぞれ（ａ）配列番号５５、（ｂ）配列番号５６、（ｃ）配列番号６２、（ｄ）配列番号６２及び配列番号６４、若しくは（ｅ）配列番号６２、配列番号６３及び配列番号６４をコードする核酸配列；
（ｉｖ）膜貫通ドメイン、好ましくはＣＤ２８膜貫通ドメイン、さらにより好ましくは配列番号５７又は配列番号８０をコードする核酸配列；
（ｖ）エンドドメイン、好ましくは４−１ＢＢドメイン、例えば配列番号５８若しくは８１、及び／又はＣＤ３ζエンドドメイン、例えば配列番号５９若しくは８２、好ましくは４−１ＢＢドメイン及びＣＤ３ζエンドドメインをコードする核酸配列；
（ｖｉ）任意に、切断可能なリンカー、好ましくはＰ２Ａ切断可能なリンカーをコードする核酸配列、さらにより好ましくは配列番号２８又は配列番号２８と少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する配列、例えば配列番号６５をコードする核酸配列；
（ｖｉｉ）任意に、レポーター、好ましくはｈＣＤ１９ｔレポーターをコードする核酸配列、さらにより好ましくは配列番号２９又は配列番号２９と少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する配列、例えば配列番号６６をコードする核酸配列；
（ｖｉｉｉ）任意に、シグナルペプチド、好ましくはＣＤ８αシグナルペプチド、さらにより好ましくは配列番号５４又は６１をコードする核酸配列。

さらなる実施形態では、核酸コンストラクトは、タグ、好ましくは、例えば配列番号２３、又はそれに対して少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する配列のフラッグタグをコードする核酸配列をさらに含む。

別の特定の実施形態では、核酸コンストラクトは、以下を含むか、又は実質的に以下からなる：
（ｉ）配列番号３又は配列番号３と少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する配列、例えば配列番号４０をコードする核酸配列；及び／又は
（ｉｉ）配列番号４又は配列番号４と少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する配列、例えば配列番号４１をコードする核酸配列；
（ｉｉｉ）任意に、（ａ）配列番号１８、（ｂ）配列番号１９、（ｃ）配列番号２５、（ｄ）配列番号２５及び配列番号２７、若しくは（ｅ）配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７、又は、これらと少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する配列、例えば、それぞれ（ａ）配列番号５５、（ｂ）配列番号５６、（ｃ）配列番号６２、（ｄ）配列番号６２及び配列番号６４、若しくは（ｅ）配列番号６２、配列番号６３及び配列番号６４をコードする核酸配列；
（ｉｖ）膜貫通ドメイン、好ましくはＣＤ２８膜貫通ドメイン、さらにより好ましくは配列番号５７又は配列番号８０をコードする核酸配列；
（ｖ）エンドドメイン、好ましくは４−１ＢＢドメイン、例えば配列番号５８若しくは８１、及び／又はＣＤ３ζエンドドメイン、例えば配列番号５９若しくは８２、好ましくは４−１ＢＢドメイン及びＣＤ３ζエンドドメインをコードする核酸配列；
（ｖｉ）任意に、切断可能なリンカー、好ましくはＰ２Ａ切断可能なリンカーをコードする核酸配列、さらにより好ましくは配列番号２８又は配列番号２８と少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する配列、例えば配列番号６５をコードする核酸配列；
（ｖｉｉ）任意に、レポーター、好ましくはｈＣＤ１９ｔレポーターをコードする核酸配列、さらにより好ましくは配列番号２９又は配列番号２９と少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する配列、例えば配列番号６６をコードする核酸配列；
（ｖｉｉｉ）任意に、シグナルペプチド、好ましくはＣＤ８αシグナルペプチド、さらにより好ましくは配列番号５４又は６１をコードする核酸配列。

さらなる実施形態では、核酸コンストラクトは、タグ、好ましくは、例えば配列番号２３、又はそれと少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する配列のフラッグタグをコードする核酸配列をさらに含む。

別の特定の実施形態では、核酸コンストラクトは、ＮからＣ末端に向かって連続的に以下を含むか、又はそれらからなる：
（ｉ）任意に、シグナルペプチド、好ましくはＣＤ８αシグナルペプチド、さらにより好ましくは配列番号５４又は６１、
（ｉｉ）配列番号３０、若しくは配列番号３０と少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する配列；例えば配列番号６７をコードする核酸配列；又は配列番号３１、若しくは配列番号３１と少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する配列；例えば配列番号６８をコードする核酸配列；
（ｉｉｉ）任意に、（ａ）配列番号１８、（ｂ）配列番号１９、（ｃ）配列番号２５、（ｄ）配列番号２５及び配列番号２７、若しくは（ｅ）配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７、又は、これらと少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する配列、例えば、それぞれ（ａ）配列番号５５、（ｂ）配列番号５６、（ｃ）配列番号６２、（ｄ）配列番号６２及び配列番号６４、若しくは（ｅ）配列番号６２、配列番号６３及び配列番号６４；をコードする核酸配列；
（ｉｖ）膜貫通ドメイン、好ましくはＣＤ２８膜貫通ドメイン、さらにより好ましくは配列番号５７又は配列番号８０をコードする核酸配列；
（ｖ）エンドドメイン、好ましくは４−１ＢＢドメイン、例えば配列番号５８若しくは８１、及び／又はＣＤ３ζエンドドメイン、例えば配列番号５９若しくは８２、好ましくは４−１ＢＢドメイン及びＣＤ３ζエンドドメインをコードする核酸配列；
（ｖｉ）任意に、切断可能なリンカー、好ましくはＰ２Ａ切断可能なリンカーをコードする核酸配列、さらにより好ましくは配列番号２８又は配列番号２８と少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する配列、例えば配列番号６５をコードする核酸配列；
（ｖｉｉ）任意に、レポーター、好ましくはｈＣＤ１９ｔレポーターをコードする核酸配列、さらにより好ましくは配列番号２９又は配列番号２９と少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する配列、例えば配列番号６６をコードする核酸配列。

特定の実施形態では、本発明は、本発明の特定のＣＡＲ、好ましくは、配列番号３２、３３、３４、３５、３６、３７、８３若しくは８５に示す配列で記載されるＣＡＲ、より好ましくは配列番号６９、７０、７１、７２、７３、７４、８４若しくは８６、又はそれらと少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する配列を含むか、若しくはそれからなる核酸配列若しくはコンストラクトをコードする核酸配列を提供する。

キメラレセプターをコードするオープンリーディングフレームの配列は、ゲノムＤＮＡ供給源、ｃＤＮＡ供給源又はその他からＰＣＲによって生成されたｃＤＮＡ供給源から得ることができる。そうでなければ、それは化学的に合成されてもよく、それらの組み合わせでもよい。ゲノムＤＮＡのサイズ及びイントロンの数によっては、イントロンがｍＲＮＡを安定化するか、又は免疫細胞、特にＴ細胞特異的発現を提供することが見出されているので、ｃＤＮＡ又はその組み合わせを使用することが望ましい（Barthel and Goldfeld, 2003）。また、ｍＲＮＡを安定化するために、内因性又は外因性の非コード領域を使用することがさらに有利であり得る。

本発明のキメラ抗原レセプターの発現のために、キメラレセプターのＮ末端成分をコードする核酸配列の、天然に存在するか又は内因性の転写開始領域は、標的宿主細胞内でキメラレセプターを生成するために使用され得る。或いは、構成的又は誘導的発現を可能にする外因性転写開始領域を使用することができ、この場合、発現は標的宿主、所望の発現レベル、標的宿主の性質などに依存して制御することができる。

同様に、キメラレセプターを表面膜に導くシグナル配列は、キメラレセプターのＮ末端成分の内因性シグナル配列であり得る。いくつかの場合には、任意に、この配列を異なるシグナル配列と交換することが望ましいかもしれない。しかしながら、選択されたシグナル配列は、キメラレセプターが細胞表面上に提示されるよう、ＣＡＲを発現するであろう免疫細胞の分泌経路と適合すべきである。

本発明によれば、核酸コンストラクトは細胞に形質転換又は導入され、転写及び翻訳されて生成物（すなわち、キメラレセプター）を産生する。したがって、核酸コンストラクトは、ＣＡＲの転写を指示するための少なくとも１つのプロモーターをさらに含むことができる。

一実施形態では、プロモーターは、本発明のキメラレセプターをコードする核酸配列に作動可能に連結され、すなわち、プロモーターはキメラレセプターをコードするＤＮＡからのメッセンジャーＲＮＡの転写を促進するように配置される。プロモーターは、ゲノム起源であってもよく、又は合成的に生成することもできる。免疫細胞、特にＴ細胞で使用するための種々のプロモーターは、当技術分野で周知である（例えば、Marodon et al. (2003)）によって開示されたＣＤ４プロモーター）。プロモーターは構成的であっても誘導的であってもよいが、誘導は、特定の細胞型若しくは特定のレベルの成熟、又は例えば薬物（例えば、テトラサイクリン若しくはドキソルビシン）と関連している。誘導的プロモーターの例としては、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。或いは、多くの周知のウイルスプロモーターもまた適切である。目的のプロモーターには、β−アクチンプロモーター、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、免疫グロブリンプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、レトロウイルスプロモーター、及びフレンド脾臓フォーカス形成ウイルスプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、並びに、ヒト遺伝子プロモーター、例えば、限定されないがアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターが挙げられる。プロモーターはエンハンサーと関連していてもよいし、していなくてもよく、エンハンサーは特定のプロモーターと天然に関連していてもよいし、又は異なるプロモーターと関連していてもよい。

同様に、終結領域は、キメラレセプターのＣ末端成分をコードする核酸配列の、天然に存在するか又は内因性転写終結領域によって提供され得る。或いは、終結領域が異なる供給源に由来してもよい。ほとんどの場合、終結領域の供給源は、一般に、組換えタンパク質の発現に重要であるとは考えられず、発現に悪影響を及ぼすことなく、多種多様な終結領域を使用することができる。当業者によって理解されるように、いくつかの場合には、ＣＡＲの抗原結合ドメイン末端のいくつかのアミノ酸は、例えば、通常は１０以下、より通常には５以下の残基が削除され得る。また、境界に少数のアミノ酸、通常は１０以下、より通常には５以下の残基を導入することは望ましいことがあり得る。アミノ酸の欠失又は挿入は、構築の必要性の結果であり、便利な制限部位、操作の容易さ、発現レベルの改善などを提供し得る。さらに、異なるアミノ酸による１つ以上のアミノ酸の置換は、類似の理由で起こり得るが、通常は、いずれか１つのドメイン中で約５個を超えるアミノ酸を置換することはない。

別の実施形態では、核酸コンストラクトはプロモーター、リボソーム結合部位及び開始コドンなどの正しい翻訳開始配列、終止コドン、並びに転写終止配列をさらに含む。

本発明の核酸コンストラクトはまた、エンハンサー、サイレンサー及び境界エレメント／インスレーターなどの他の調節領域を含み得、所与の遺伝子の転写レベルを指示する。

本発明のキメラレセプターをコードする核酸コンストラクトは、従来の方法で調製することができる。ほとんどの部分で、天然の配列が使用され得るので、天然の遺伝子は種々の成分の適切な結合を可能にするように、適切に単離及び操作され得る。したがって、キメラレセプターのＮ末端及びＣ末端タンパク質をコードする核酸配列は、遺伝子の望ましくない部分を欠失させる適切なプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することによって単離され得る。或いは、クローン化遺伝子の制限消化物を使用して、キメラコンストラクトを生成することができる。いずれの場合においても、配列は、平滑末端であるか、又は相補的な重複を有する制限部位を提供するよう選択することができる。

キメラコンストラクトを調製するための種々の操作は、インビトロで実施することができ、特定の実施形態では、キメラコンストラクトは、標準的な形質転換又は遺伝子導入方法を使用して、適切な宿主中でのクローン化及び発現のためにベクターに導入される。したがって、各操作の後、ＤＮＡ配列の結合から得られるコンストラクトをクローン化し、ベクターを単離し、配列をスクリーニングして、配列が所望のキメラレセプターをコードすることを確実にする。配列は、制限分析、配列決定などによってスクリーニングすることができる。

ＣＡＲは、発現ベクターを使用して調製し得る。本開示の態様は、ＨＬＡ−ＧＣＡＲをコードする核酸配列、及び上記のＣＡＲをコードする核酸配列を含むベクターに関する。

例えば、本発明の核酸コンストラクトは、限定されないがプラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、ウイルス、及びコスミドを含むベクターにクローン化することができる。特に興味深いベクターとして、発現ベクター、複製ベクター、プローブ作製ベクター、及び配列決定ベクターが挙げられる。核酸コンストラクト及び宿主細胞によれば、本発明のベクターは、プロモーター、ターミネーター、複製起点、選択マーカー、多重クローン化部位、パッケージング部位などを含むことができる。いくつかの他の実施形態では、ベクターはＣＡＲをコードする配列の上流のKozakコンセンサス配列を含むか、又は実質的にそれからなるか、又はさらにそれからなる。いくつかの実施形態では、ベクターが抗生物質耐性を付与するポリヌクレオチドを含む。

特に、本発明のベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。哺乳類細胞への遺伝子導入のために、多くのウイルスに基づくシステムが開発されている。ウイルスベクター技術は当技術分野で周知であり、例えば、Sambrook, et al.（(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York）、並びに他のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス及びレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、ベクターは統合レンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターは、非増殖性細胞に形質導入し、低い免疫原性を示すことができるという点で、オンコレトロウイルス由来のベクターよりも追加の利点を有する。一般に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び国際公開第０１／９６５８４号；国際公開第０１／２９０５８号及び米国特許第６，３２６，１９３号に記載されているような１つ以上の選択マーカーを含有する。

特に、ＣＡＲの発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターはまた、ウイルスベクターを介して遺伝子導入又は感染されることが求められる細胞の集団からの発現細胞の同定及び選択を容易にするために、選択マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子のいずれか、又はその両方を含有することができ、他の態様では、選択マーカーは、別個のＤＮＡ片上に担持され得、同時遺伝子導入法で使用され得る。宿主細胞内での発現を可能にするために、選択マーカー及びレポーター遺伝子の両方を適切な調節配列と隣接させてもよい。有用な選択マーカーとしては、例えば、抗生物質耐性遺伝子などが挙げられる。

一態様では、用語「ベクター」は非分裂及び／又はゆっくり分裂する細胞に感染及び形質導入し、且つ標的細胞のゲノムに組み入る能力を保持する組換えベクターを意図する。いくつかの態様では、ベクターは、野生型ウイルスに由来するか、又はそれに基づいている。さらなる態様では、ベクターは、野生型レトロウイルスに由来するか、又はそれに基づいている。特に、レトロウイルスは、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、又はテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）などの白血病ウイルスから選択することができる。外来性エンハンサー及びプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）前初期（ＩＥ）エンハンサー及びプロモーター、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭＭＳＶ）のエンハンサー及びプロモーター（Ｕ３領域）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＵ３領域、脾臓フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）のＵ３領域、又は天然モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモーターに結合したＨＣＭＶＩＥエンハンサーであり得る。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えば、ヒト細胞に遺伝子を挿入するために最も広く用いられている方法となっている。ウイルスベクターはまた、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ（ＨＳＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、パピローマウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスなどから誘導することができる。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号及び同第５，５８５，３６２号を参照されたい。

好ましくは、本発明のベクターはレンチウイルスベクターである。特に、ベクターは霊長類及び非霊長類レンチウイルスに由来する。霊長類レンチウイルスの例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因病原体、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。非霊長類レンチウイルス群としては、プロトタイプ「スローウイルス」ビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）のほか、関連ヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、馬伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、及び最近報告された猫免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）及び牛免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が挙げられる。先行技術の組換えレンチウイルスベクターは、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第６，９２４，１２３号；同第７，０５６，６９９号；同第７，０７，９９３号；同第７，４１９，８２９号及び同第７，４４２，５５１号を参照されたい（これらは参照により本明細書に組み込まれる）。

本開示で使用するための市販のレトロウイルスベクターは、Lentigen Corp.製の、ｐＦＢ−ｎｅｏベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標））、InvitrogenのpLentiシリーズバージョン４、６及び６．２「ViraPower」システム；City of Hope Research Instituteの研究室で作製され使用されているｐＨＩＶ−７−ＧＦＰ、Clontech製の「Lenti-X」レンチウイルスベクター、ｐＬＶＸ；Sigma-Aldrich製のｐＬＫＯ．１−ｐｕｒｏ；Open Biosystems製のｐＬｅｍｉＲ；並びにCharite Medical School, Institute of Virology (CBF), Berlin, Germanyの研究室で作製され使用されているｐＬＶを含むがこれらに限定されない。

本開示によるウイルスベクターは、特定のウイルスの成分に限定される必要がないことは明らかであろう。ウイルスベクターは、２つ以上の異なるウイルスに由来する成分を含んでもよく、合成成分を含んでもよい。ベクター成分は、標的細胞特異性などの所望の特徴を得ることができるよう、操作することができる。

米国特許第６，９２４，１２３号は、特定のレトロウイルス配列が標的細胞ゲノムへの組み込みを容易にすることを開示している。この特許は、各レトロウイルスゲノムがビリオンタンパク質及び酵素をコードする、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖと呼ばれる遺伝子を含むことを教示する。これらの遺伝子は、長末端反復配列（ＬＴＲ）と呼ばれる領域によって両端が挟まれている。ＬＴＲはプロウイルスの組込み及び転写に関与する。それらはエンハンサー−プロモーター配列としても働く。したがって、本発明のベクターは、１つ以上の組込みの特徴を含むことができる。

いくつかの実施形態では、ベクターゲノムによってコードされない粒子の成分は、例えばヘルパーウイルス戦略を使用して、宿主細胞で発現されるさらなる核酸配列（通常、ｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子のいずれか又は両方を含む「パッケージングシステム」）によってトランスで提供される。ウイルスベクター粒子の作製に必要とされる配列のセットは、一過性の遺伝子導入によって宿主細胞に導入され得るか、又は宿主細胞ゲノムに組み込まれ得るか、又はヘルパー配列などの混合した方法で提供され得る。含まれる技術は、当業者に公知である。例えば、レトロウイルスコンストラクトは、複製能力のないレトロウイルスベクターをパッケージングするのに必要な全てのビリオンタンパク質をトランスにコードする、複製能力のないレトロウイルスゲノムに由来する少なくとも１つのレトロウイルスヘルパーＤＮＡ配列を含むパッケージングプラスミドであり、複製能力のあるヘルパーウイルスを産生することなく、高力価で複製能力のないレトロウイルスベクターをパッケージングすることができるビリオンタンパク質を産生するためである。

パッケージングプロセスでは、本発明のＣＡＲを発現するパッケージングプラスミド及びレトロウイルスベクターは、ウイルスを産生し得る哺乳動物細胞、例えば、ヒト胚性腎細胞、例えば、２９３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３、ATCC、Rockville、Md）の第１の集団に一過性に同時遺伝子導入されて、高力価の組換えレトロウイルス含有上清を産生する。本発明の別の方法では、この一過性に遺伝子導入された細胞の第１の集団は、次いで、哺乳動物標的細胞（例えば、ヒトリンパ球）と同時培養され、高効率で標的細胞に外来遺伝子を形質導入する。本発明のさらに別の方法では、上記の一過性にトランスフェクトされた細胞の第１の集団からの上清を、哺乳動物標的細胞（例えば、ヒトリンパ球又は造血幹細胞）とともにインキュベートし、高効率で標的細胞に外来遺伝子を形質導入する。

本発明の核酸コンストラクトは、ベクターに挿入され、当技術分野で公知の技術を使用してレトロウイルス又はレンチウイルス粒子にパッケージングされる。次に、組換えウイルスを単離し、インビボ又はエクスビボのいずれかで対象の細胞に送達することができる。特定の態様では、パッケージングプラスミドは、ヒト胚性腎細胞、例えば、２９３細胞などの、ウイルスを産生し得る哺乳動物細胞の第１の集団で安定に発現される。レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターは、選択マーカーとの同時遺伝子導入又はシュードタイプ化ウイルスによる感染のいずれかによって細胞に導入される。両方の場合とも、ベクターは組み込まれる。或いは、ベクターはエピソーム的に維持されたプラスミドに導入することができる。

抗ＨＬＡ−ＧＣＡＲ発現細胞
本発明は、本明細書に記載のＣＡＲを発現する細胞に関する。この細胞は、ＣＡＲを発現することができる免疫細胞、又はＣＡＲをコードする発現ベクターを保有する細菌細胞などの細胞を含む、あらゆる種類のものであってよい。

本発明のＣＡＲをコードする異種核酸配列を発現する文脈において、「宿主細胞」はベクターを複製することができ、及び／又はベクターによってコードされる異種遺伝子を発現することができる細胞を指す。「細胞」という用語はそれらの子孫も含み、これは任意の世代及びその後のすべての世代である。故意の又は故意でない変異のために、すべての子孫が同一というわけではない可能性があることは理解されている。宿主細胞は、本発明の核酸コンストラクト又はベクターによって遺伝子導入され得る。形質転換細胞は、一次対象細胞及びその子孫を含む。本明細書中で使用する場合、用語「操作された」及び「組換え」細胞又は宿主細胞は、例えば、ベクター、より具体的にはＣＡＲなどの外因性核酸配列が導入された細胞を指すことが意図される。したがって、組換え細胞は、組換えで導入された核酸を含まない天然に存在する細胞と区別可能である。

ＣＡＲをコードする核酸コンストラクトで細胞を形質導入すると、細胞はＣＡＲによって特定されるＨＬＡ−Ｇアイソフォームを認識するであろう。したがって、本発明はまた、本発明のＣＡＲを発現する細胞に関する。特に、本発明の抗ＨＬＡ−ＧＣＡＲ発現細胞は、本発明のＣＡＲを発現することができる免疫細胞である。ある実施形態では、免疫細胞は、少なくとも本発明のＣＡＲを含むよう遺伝子導入される。

細胞は、β２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇアイソフォーム、好ましくはＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５アイソフォームの両方に特異的に結合するＣＡＲを含むことができる。或いは、細胞は、β２ＭフリーＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的に結合するＣＡＲ、好ましくはＨＬＡ−Ｇ２及びＨＬＡ−Ｇ６アイソフォームの両方及び／又はＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍフリー及び／又はＨＬＡ−Ｇ５／β２Ｍフリーアイソフォームを含み得る。

一実施形態では、細胞は少なくとも２つの異なるＣＡＲを発現する。例えば、細胞は、β２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇアイソフォーム、好ましくはＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５の両方に特異的に結合するＣＡＲ、並びに異なる抗原に特異的に結合する別のＣＡＲを含み得る。或いは、細胞はβ２ＭフリーＨＬＡ−Ｇアイソフォーム、好ましくはＨＬＡ−Ｇ２及びＨＬＡ−Ｇ６及び／又はＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍフリー及び／又はＨＬＡ−Ｇ５／β２Ｍフリーアイソフォームに特異的に結合するＣＡＲ、並びに異なる抗原に特異的に結合する別のＣＡＲを含み得る。特に、細胞は、β２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇアイソフォーム、好ましくはＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５の両方に特異的に結合するＣＡＲ、並びにβ２ＭフリーＨＬＡ−Ｇアイソフォーム、好ましくはＨＬＡ−Ｇ２及びＨＬＡ−Ｇ６、及び／又はＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍフリー及び／又はＨＬＡ−Ｇ５／β２Ｍフリーアイソフォームに特異的に結合するＣＡＲの両方を含み得る。

好ましくは、細胞は、上記のＬＦＴＴ−１抗体に由来する抗原結合フラグメントを含むＣＡＲ、及び上記の１５Ｅ７抗体に由来する抗原結合フラグメントを含むＣＡＲを含む。

好ましくは、そのような細胞は（ｉ）配列番号１１、１２及び１３の配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）を含む１つの重鎖、及び（ｉｉ）配列番号１４、１５及び１６の配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含む１つの軽鎖を含む第１のＣＡＲ、並びに（ｉ）配列番号５、６及び７の配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）を含む１つの重鎖、及び（ｉｉ）配列番号８、９及び１０の配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含む１つの軽鎖を含む第２のＣＡＲを含み、任意に、各ＣＤＲは１、２、３又は４個のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含み得る。より望ましくは、したがってそのような細胞は、配列番号３２、３３、３４若しくは８５で示される配列若しくはこれらと少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する配列を含むか、又はそれからなる第１のＣＡＲ、並びに配列番号３５、３６、３７若しくは８３若しくはこれらと少なくとも８０、８５、９０若しくは９５％の同一性を有する配列を含むか、又はそれからなる第２のＣＡＲを含む。

或いは、細胞は、ＨＬＡ−Ｇ／β２Ｍフリーアイソフォーム、好ましくはＨＬＡ−Ｇ２及びＨＬＡ−Ｇ６の両方及び／又はＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍフリー及びＨＬＡ−Ｇ５／β２Ｍフリーアイソフォームの両方を認識するドメインと、β２Ｍドメイン、好ましくはＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５の両方に会合するＨＬＡ−Ｇアイソフォームを認識する第２のドメインとを含む、上記の二重特異性抗原結合ドメインを含む二重特異性ＣＡＲを発現することができる。

任意に、本発明のＣＡＲ抗ＨＬＡ−Ｇを発現する細胞は、好ましくは癌又はウイルス感染などの疾患に関与する抗原、好ましくは癌治療又はウイルス治療において標的とされる抗原を標的とするＣＡＲをさらに発現する。そのような抗原がＨＬＡ−Ｇでないことは理解されるであろう。

本発明の細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得る。好ましくは、細胞は真核細胞、例えば哺乳動物細胞であり、典型的にはヒト、ネコ又はイヌ細胞、より典型的にはヒト細胞、好ましくは初代ヒト細胞である。

好ましくは、細胞は免疫細胞である。細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、及びＣＤ８^＋Ｔ細胞を含むＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、単球及び樹状細胞からなる群から選択することができ、好ましくは細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞である。

細胞は、自己細胞、同系細胞、同種異系細胞、及び場合によっては異種細胞であり得る。例えば、本発明で用いることができる適切な免疫細胞には、自己Ｔリンパ球細胞、同種異系Ｔ細胞、異種Ｔ細胞、前述のいずれかの前駆細胞、形質転換腫瘍又は異種免疫エフェクター細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、細胞毒リンパ球又は活性化されたときに標的細胞を殺滅する能力のある他の細胞が含まれる。

免疫細胞はヒト又は非ヒト対象から単離されてもよく、幹細胞、例えば、胚性幹細胞、複能性幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、成体幹細胞又は他の再プログラム化された細胞から誘導されてもよい。本明細書中に記載の核酸コンストラクトの導入のための細胞は、生物学的試料、例えば、対象から得られたもの又は対象に由来するものなどの試料から単離され得る。いくつかの実施形態では、細胞が単離される対象は、疾患若しくは病態を有するもの、又は細胞療法を必要とするもの、又は細胞療法が行われるものである。いくつかの実施形態における対象は、そのために細胞が単離され、加工され、及び／又は操作された養子細胞療法などの特定の治療介入を必要とするヒトである。いくつかの実施形態では、細胞は、血液、骨髄、リンパ、又はリンパ器官に由来し、自然免疫系又は適応免疫系の細胞などの、例えば、骨髄細胞又はリンパ球細胞（リンパ球、典型的にはＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を含む）などの免疫系の細胞である。

いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞又は他の細胞型、例えば、全Ｔ細胞集団、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、及びそれらの亜集団、例えば、機能、活性化状態、成熟度、分化の可能性、増殖、再循環、局在化、及び／又は持続能力、抗原特異性、抗原受容体のタイプ、特定の器官又は区画における存在、マーカー又はサイトカイン分泌プロファイル、及び／又は分化の程度によって定義されるものの１つ又は複数のサブセットを含む。

特定の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、例えば、動物Ｔ細胞、哺乳動物Ｔ細胞、ネコＴ細胞、イヌＴ細胞又はヒトＴ細胞である。Ｔ細胞及び／又はＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞のサブタイプ及び亜集団には、ナイーブＴ（ＴＮ）細胞、エフェクターＴ細胞（ＴＥＦＦ）、メモリーＴ細胞、及びそれらのサブタイプ、例えば、幹細胞メモリーＴ（ＴＳＣＭ）、セントラルメモリーＴ（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ（ＴＥＭ）、又は最終分化エフェクターメモリーＴ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、未成熟Ｔ細胞、成熟Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞毒性Ｔ細胞、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞、自然発生及び適応調節Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、ヘルパーＴ細胞、例えば、ＴＨ１細胞、ＴＨ２細胞、ＴＨ３細胞、ＴＨ１７細胞、ＴＨ９細胞、ＴＨ２２細胞、濾胞性ヘルパーＴ細胞、α／βＴ細胞、及びδ／γＴ細胞がある。市販のＴ細胞株の非限定的な例には、系統ＢＣＬ２（ＡＡＡ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９０２（商標））、ＢＣＬ２（Ｓ７０Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９００（商標））、ＢＣＬ２（Ｓ８７Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９０１（商標））、ＢＣＬ２Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２８９９（商標））、ＮｅｏＪｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２８９８（商標））、ＴＡＬＬ−１０４細胞毒性ヒトＴ細胞株（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１１３８６）が含まれる。さらなる例には、限定されるものではないが、成熟Ｔ細胞株、例えば、Deglis、ＥＢＴ−８、ＨＰＢ−ＭＬｐ−Ｗ、ＨＵＴ７８、ＨＵＴ１０２、Karpas３８４、Ｋｉ２２５、Ｍｙ−Ｌａ、Ｓｅ−Ａｘ、ＳＫＷ−３、ＳＭＺ−１、及びＴ３４など；並びに未成熟Ｔ細胞株、例えば、ＡＬＬ−ＳＩＬ、Ｂｅｌ３、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＣＭＬ−Ｔ１、ＤＮＤ−４１、ＤＵ．５２８、ＥＵ−９、ＨＤ−Ｍａｒ、ＨＰＢ−ＡＬＬ、Ｈ−ＳＢ２、ＨＴ−１、ＪＫ−Ｔ１、Ｊｕｒｋａｔ、Ｋａｒｐａｓ４５、ＫＥ−３７、ＫＯＰＴ−Ｋ１、Ｋ−Ｔｌ、Ｌ−ＫＡＷ、Loucy、ＭＡＴ、ＭＯＬＴ−１、ＭＯＬＴ３、ＭＯＬＴ−４、ＭＯＬＴ１３、ＭＯＬＴ−１６、ＭＴ−１、ＭＴ−ＡＬＬ、Ｐ１２／Ichikawa、Peer、ＰＥＲ０１１７、ＰＥＲ−２５５、ＰＦ−３８２、ＰＦＩ−２８５、ＲＰＭＩ−８４０２、ＳＴ−４、ＳＵＰ−Ｔ１〜Ｔ１４、ＴＡＬＬ−１、ＴＡＬＬ−１０１、ＴＡＬＬ−１０３／２、ＴＡＬＬ−１０４、ＴＡＬＬ−１０５、ＴＡＬＬ−１０６、ＴＡＬＬ−１０７、ＴＡＬＬ−１９７、ＴＫ−６、ＴＬＢＲ−１、−２、−３、及び−４、ＣＣＲＦ−ＨＳＢ−２（ＣＣＬ−１２０．１）、Ｊ．ＲＴ３−Ｔ３．５（ＡＴＣＣＴＩＢ−１５３）、Ｊ４５．０１（ＡＴＣＣＣＲＬ−１９９０）、Ｊ．ＣａＭ１．６（ＡＴＣＣＣＲＬ−２０６３）、ＲＳ４；１１（ＡＴＣＣＣＲＬ−１８７３）、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（ＡＴＣＣＣＲＭ−ＣＣＬ−１１９）など；並びに皮膚Ｔ細胞リンパ腫株、例えば、ＨｕＴ７８（ＡＴＣＣＣＲＭ−ＴＩＢ−１６１）、ＭＪ［Ｇ１１］（ＡＴＣＣＣＲＬ−８２９４）、ＨｕＴ１０２（ＡＴＣＣＴＩＢ−１６２）が含まれる。そのような市販細胞株の非限定的な例示的供給源としては、American Type Culture Collection又はATCC（http://www.atcc.org/）及びGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures（https://www.dsmz.de/）が挙げられる。

いくつかの実施形態では、細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞などである。ＮＫ細胞は、単離されるか、又は市販の供給源から得ることができる。市販のＮＫ細胞株の非限定的な例には、系統ＮＫ−９２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２４０７（商標））、ＮＫ−９２ＭＩ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２４０８（商標））が含まれる。さらなる例には、限定されるものではないが、ＮＫ系統ＨＡＮＫ１、ＫＨＹＧ−１、ＮＫＬ、ＮＫ−ＹＳ、ＮＯＩ−９０、及びＹＴが含まれる。そのような市販細胞株の非限定的な例示的供給源としては、American Type Culture Collection又はＡＴＣＣ（http://www.atcc.org/）及びGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures（https://www.dsmz.de/）が挙げられる。

特定の実施形態では、本発明のＣＡＲを提示する宿主細胞は、細胞毒性Ｔ細胞（ＴＣ、細胞毒性Ｔリンパ球、ＣＴＬ、Ｔキラー細胞、溶解性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はキラーＴ細胞としても知られる）及びＮＫ細胞から選択される。

いくつかの実施形態では、細胞は、Ｂ細胞、単球又は顆粒球、例えば、骨髄細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、肥満細胞、好酸球、及び／又は好塩基球である。

ＣＡＲ発現細胞を調製するための方法
遺伝子を細胞に導入して細胞内で遺伝子を発現させる方法は当技術分野で公知である。

特に、ベクター及び／又は外因性核酸を含む細胞を作製するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)を参照されたい。発現ベクターの文脈では、ベクターは、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、又は昆虫細胞に当技術分野の任意の方法によって容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、以下でより具体的に説明される物理的、化学的、又は生物学的手段によって宿主細胞に導入することができる。

いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載されるように、対象から細胞を単離すること、それらを調製すること、処理すること、培養すること、及び／又はエンジニアリングすること、及び凍結保存の前又は後にそれらを同じ患者に再導入することを含む。

本明細書では特に、抗ＨＬＡ−ＧＣＡＲ発現細胞を作製する方法が提供され、この方法は：（ｉ）本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸配列を、単離された細胞の集団に形質導入する工程、（ｉｉ）工程（ｉ）の前記核酸配列の形質導入に成功した前記単離された細胞の亜集団を選択し、それによって抗ＨＬＡ−ＧＣＡＲ発現細胞を作製する工程を含むか、或いは本質的にそれからなるか、又はさらにそれからなる。一態様では、単離された細胞は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞からなる群から選択される。

ここで、さらにより具体的に、（ｉ）免疫細胞集団（例えば、血液細胞）の獲得（ｉｉ）特定の細胞集団（例えば、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞）の単離（ｉｉｉ）単離した細胞集団に、本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸配列を形質導入すること、並びに（ｉｉ）工程（ｉｉｉ）の前記核酸配列により成功裡に形質導入した、前記単離細胞のサブ集団を選択すること（これにより抗ＨＬＡ−ＧＣＡＲ発現を作製することになる）工程を含むか、又は代替的に、基本的にそれからなるか、又はさらにそれからなる、抗ＨＬＡ−ＧＣＡＲ発現細胞を作製する方法を提供する。以下に、これらの異なる工程を詳細に説明する。

細胞採取
本明細書で開示される細胞の増殖及び遺伝子改変の前に、細胞は、対象から−例えば、自己療法を含む実施形態では−又は商業的に入手可能な培養物から得られ得る。

細胞は、組織、体液（例えば、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿及び汗）を含む試料、及び対象から直接採取された他の試料、並びに分離、遠心分離、遺伝子操作（例えば、ウイルスベクターによる形質導入）、洗浄、及び／又はインキュベーションなどの１つ以上の処理工程から得られた試料から得ることができる。

細胞は、全血、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、白血球、骨髄、胸腺組織、リンパ節組織、臍帯血、感染部位からの組織、腹水、胸水、組織生検、腫瘍、白血病、リンパ腫、腸関連リンパ組織、粘膜関連リンパ組織、脾臓、他のリンパ組織、肝臓、肺、胃、腸、結腸、腎臓、膵臓、乳房、骨、前立腺、子宮頸部、精巣、卵巣、扁桃、若しくは他の器官、及び／又はこれらに由来する細胞を含む多数の非限定的供給源から得ることができる。細胞療法、例えば養子細胞療法の文脈では、試料には、自己及び同種異系の供給源からの試料が含まれる。

いくつかの例では、対象の循環血液からの細胞は、例えば、アフェレーシス又は白血球アフェレーシスによって得られる。いくつかの態様では、試料は、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球細胞、赤血球細胞、及び／又は血小板を含むリンパ球を含有し、いくつかの態様では、赤血球細胞及び血小板以外の細胞を含有する。

いくつかの実施形態では、上記のような、利用可能であり、当業者に公知である任意の数のＴ細胞株又はＮＫ細胞株が使用され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、健康なドナー由来、癌と診断された患者由来、自己免疫疾患若しくは炎症性疾患と診断された患者由来、又は感染症と診断された患者由来であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、異なる表現型特性を示す混合細胞集団の一部であり得る。

細胞単離
当業者に知られているように、各種の方法は、対象から免疫細胞を単離するために容易に利用可能であるか、又は例えば、Life TechnologiesのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）システム；STEMcell TechnologiesのＥａｓｙＳｅｐ（商標）、ＲｏｂｏＳｅｐ（商標）、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）、ＳｅｐＭａｔｅ（商標）；Miltenyi BiotecのＭＡＣＳ（商標）細胞分離キット、細胞表面マーカー発現並びに他の市販の細胞分離及び単離キット（例えば、Pierce,Rockford,ILのＩＳＯＣＥＬＬ）を使用して、本出願に適合させることができる。免疫細胞の特定のサブ集団は、独特の細胞表面マーカーに特異的なそうしたキットにおいて利用可能なビーズ又は他の結合剤の使用によって単離され得る。例えば、MACS（商標）ＣＤ４＋及びＣＤ８＋マイクロビーズを用いて、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し得る。ヒト疾患の治療的介入としての、抗原特異的Ｔ細胞を単離し、拡大する戦略もまた、臨床試験において検証されている（Riddell et al., 1992; Walter et al., 1995; Heslop et al., 1996）。

いくつかの実施形態では、細胞の単離は、１つ以上の調製及び／又は非親和性ベースの細胞分離工程を含む。いくつかの例では、細胞を洗浄し、遠心分離し、及び／又は１つ以上の試薬の存在下でインキュベートして、例えば、望ましくない成分を除去し、所望の成分を濃縮し、特定の試薬に感受性を有する細胞を溶解又は除去する。いくつかの例では、細胞は、密度、付着特性、サイズ、感受性、及び／又は特定の成分に対する抵抗性などの１つ以上の特性に基づいて分離される。

いくつかの実施形態では、対象から採取された血液細胞は洗浄されて、例えば、血漿画分を除去し、そして細胞を、その後の処理工程のために適切な緩衝液又は培地中に置く。いくつかの実施形態では、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、カルシウム及び／又はマグネシウム及び／又は二価カチオンの多く若しくは全てを欠く。いくつかの態様では、洗浄工程は、製造者の指示に従って、半自動化された「フロースルー」遠心分離機（例えば、Cobe 2991細胞プロセッサー、Baxter）によって行われる。いくつかの態様では、洗浄工程は、製造者の指示に従って、接線流濾過（ＴＦＦ）によって行われる。いくつかの実施形態では、細胞は、洗浄後に、例えばＣａ^２＋／Ｍｇ^２＋を含まないＰＢＳなどの様々な生体適合性緩衝液中に再懸濁される。ある実施形態では、血液細胞試料の成分は除去され、細胞は培養培地に直接再懸濁される。

いくつかの実施形態では、単離方法は、表面マーカー、例えば、表面タンパク質、細胞内マーカー又は核酸などの１つ以上の特異的分子の、細胞内での発現又は存在に基づく異なる細胞型の分離を含む。いくつかの実施形態では、そうしたマーカーに基づく分離の、任意の公知の方法が使用され得る。いくつかの実施形態では、分離は、親和性又は免疫親和性に基づく分離である。例えば、いくつかの態様における単離は、１つ以上のマーカー、典型的には細胞表面マーカーの細胞による発現、又は発現レベルに基づき、例えばそうしたマーカーと特異的に結合する抗体又は結合パートナーとのインキュベーションによる細胞及び細胞集団の分離を含み、その後、一般には洗浄工程、及び抗体又は結合パートナーに結合しなかった細胞からの抗体又は結合パートナーと結合した細胞の分離が続く。そのような分離工程は、試薬に結合した細胞がさらなる使用のために保持されるポジティブ選択、及び／又は抗体若しくは結合パートナーに結合していない細胞が保持されるネガティブ選択に基づくことができる。いくつかの例では、両方の画分は、さらなる使用のために保持される。いくつかの態様では、不均一な集団における細胞型を特異的に同定する抗体が利用可能でない場合には、分離は、所望の集団以外の細胞によって発現されるマーカーに基づいて最良に行われるので、ネガティブ選択は特に有用であり得る。

いくつかの実施形態では、複数回の分離工程が実施され、この場合、１回の工程でポジティブ又はネガティブ選択された画分は、引き続きポジティブ又はネガティブ選択などの別の分離工程に供される。いくつかの例では、単一の分離工程は、例えば、ネガティブ選択のために標的化されたマーカーにそれぞれ特異的な複数の抗体又は結合パートナーと共に細胞をインキュベートすることによって、複数のマーカーを発現する細胞を同時に枯渇させることができる。同様に、複数の細胞型は、種々の細胞型上で発現される複数の抗体又は結合パートナーと共にインキュベートすることによって、同時にポジティブ選択され得る。

例えば、いくつかの態様では、ポジティブ又は高レベルの１つ以上の表面マーカー、例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、及び／又はＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞を発現する細胞などのＴ細胞の特定のサブ集団は、正又は負の選択手法によって単離される。例えば、ＣＤ３／ＣＤ２８結合磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ細胞エキスパンダー）を用いて、ＣＤ３＋Ｔ細胞を増殖させることができる。

いくつかの実施形態では、単離は、ポジティブ選択による特定の細胞集団の濃縮、又はネガティブ選択による特定の細胞集団の枯渇により行われる。いくつかの実施形態では、ポジティブ又はネガティブ選択は、ポジティブ又はネガティブ選択されたそれぞれの細胞上で発現されるか、又は比較的高いレベルで発現（マーカー＋）されるか、１つ以上の表面マーカーに特異的に結合する１つ以上の抗体又は他の結合剤と共に細胞をインキュベートすることによって達成される。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は，Ｂ細胞、単球、又は他の白血球などの非Ｔ細胞上で発現されるマーカー、例えばＣＤ１４のネガティブ選択によって、試料から分離される。いくつかの態様では、ＣＤ４又はＣＤ８の選択工程は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞及びＣＤ８＋細胞毒Ｔ細胞を分離するために使用される。そのようなＣＤ４＋及びＣＤ８＋集団は、１つ以上のナイーブＴ細胞サブ集団、メモリーＴ細胞サブ集団、及び／又はエフェクターＴ細胞サブ集団上で発現される、又は比較的高い程度で発現されるマーカーに対するポジティブ又はネガティブ選択によって、サブ集団にさらに選別することができる。

いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋細胞は、それぞれのサブ集団に関連する表面抗原に基づくポジティブ又はネガティブ選択などによって、ナイーブ細胞、中央記憶細胞、エフェクター記憶細胞、及び／又は中央記憶幹細胞について、さらに濃縮されるか、又は枯渇される。いくつかの実施形態では、中央記憶Ｔ（ＴＣＭ）細胞の濃縮は、効力を増大させるために、例えば、投与後の長期生存、増殖、及び／又は生着を改善するために実施され、これはいくつかの態様において、そのようなサブ集団では特に強固である。Terakura et al. (2012) Blood. 1:72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＴＣＭ富化ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞を組み合わせることは、効力をさらに増強する。

実施形態では、記憶Ｔ細胞は、ＣＤ８＋末梢血リンパ球のＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ６２Ｌサブセットの両方に存在する。ＰＢＭＣは、抗ＣＤ８及び抗ＣＤ６２Ｌ抗体を使用するなどして、ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ８＋及び／又はＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ８画分について濃縮又は枯渇させることができる。

いくつかの態様では、中央記憶Ｔ（ＴＣＭ）細胞の濃縮は、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、及び／又はＣＤ１２７のポジティブ又は高表面発現に基づき；いくつかの態様では、それは、ＣＤ４５ＲＡ及び／又はグランザイムＢを発現又は高発現する細胞のネガティブ選択に基づく。いくつかの態様では、ＴＣＭ細胞が濃縮されたＣＤ８＋集団の単離は、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ４５ＲＡを発現する細胞の枯渇、及びＣＤ６２Ｌを発現する細胞のポジティブ選択又は濃縮によって行われる。一態様では、中央記憶Ｔ（ＴＣＭ）細胞の濃縮は、ＣＤ４発現に基づいて選択された細胞の負の画分から始まり、これは、ＣＤ１４及びＣＤ４５ＲＡの発現に基づくネガティブ選択、及びＣＤ６２Ｌに基づくポジティブ選択に供される。いくつかの態様では、そのような選択は同時に実行され、他の態様では、いずれかの順序で連続的に行われる。いくつかの態様では、ＣＤ８＋細胞集団又はサブ集団を調製する際に使用されるのと同じＣＤ４発現に基づく選択工程は、ＣＤ４＋細胞集団又はサブ集団を生成するためにも使用されるが、その場合、ＣＤ４に基づく分離からのポジティブ画分及びネガティブ画分の両方が保持され、この方法の後続工程において使用（任意に１回以上のさらなるポジティブ又はネガティブ選択工程の後で）されるように行われる。

いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞の濃縮は、ＣＤ５６及びＣＤ１６のポジティブ又は高表面発現、並びにＣＤ３のネガティブ発現、及び／又は任意にＮＫｐ４６又はＮＫｐ３０レセプターの存在に基づく。

いくつかの態様では、分離されるべき細胞の試料又は組成物は、磁気応答性粒子又は常磁性ビーズ（Dynabeads又はMACSビーズ）などのマイクロ粒子などの、小さい、磁化可能な、又は磁気応答性の材料とともにインキュベートされる。磁気応答性材料、例えば粒子は、分離することが所望される、例えばネガティブ又はポジティブ選択することが所望される、細胞、複数の細胞、又は細胞集団上に存在する分子、例えば表面マーカーに特異的に結合する結合パートナー、例えば抗体に、一般的には直接又は間接的に付着される。いくつかの実施形態では、磁性粒子又はビーズは、抗体又は他の結合パートナーなどの特異的結合メンバーに結合した磁気応答性材料を含む。磁気分離法に使用される多くの周知の磁気応答性材料がある。適切な磁性粒子には、Moldayの米国特許第４，４５２，７７３号及び欧州特許第４５２３４２Ｂ号に記載されたものが含まれ、これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。コロイドサイズの粒子、例えばOwenの米国特許第４，７９５，６９８号及びLibertiらの米国特許第５，２００，０８４号に記載されているものは、他の例である。

インキュベーションは一般に、磁性粒子又はビーズに付着したこのような抗体又は結合パートナーに特異的に結合する抗体又は結合パートナー又は分子（例えば、二次抗体又は他の試薬）が、試料内の細胞上に存在する場合、細胞表面分子に特異的に結合する条件下で実施される。

いくつかの態様では、試料は磁場中に置かれ、そしてそれに付着した磁気応答性又は磁化可能な粒子を有する細胞は、磁石に引き付けられ、非標識細胞から分離される。ポジティブ選択では磁石に引き寄せられる細胞が保持され、ネガティブ選択では引き寄せられない細胞（非標識細胞）が保持される。いくつかの態様では、ポジティブ及びネガティブ選択の組み合わせは、同じ選択工程の間に行われ、その場合、ポジティブ及びネガティブ画分は保持され、そしてさらに処理されるか、又はさらなる分離工程に供される。

ある実施形態では、磁気応答性粒子は一次抗体又は他の結合パートナー、二次抗体、レクチン、酵素、若しくはストレプトアビジンでコーティングされる。ある実施形態では、磁性粒子は、１つ以上のマーカーに特異的な一次抗体のコーティングを介して細胞に付着する。ある実施形態では、ビーズではなく細胞が一次抗体又は結合パートナーで標識され、次いで細胞型特異的二次抗体被覆又は他の結合パートナー（例えばストレプトアビジン）被覆の磁性粒子が加えられる。ある実施形態では、ストレプトアビジン被覆磁性粒子は、ビオチン化一次抗体又は二次抗体と共に使用される。

いくつかの実施形態では、磁気応答性粒子は、後にインキュベート、培養、及び／又は操作される細胞に付着したままであり、いくつかの態様では、粒子は患者に投与するために細胞に付着したままである。いくつかの実施形態では、磁化可能又は磁気応答性粒子は細胞から除去される。細胞から磁化可能な粒子を除去するための方法は公知であり、例えば、競合する非標識抗体、磁化可能な粒子、又は切断可能なリンカーなどに結合された抗体の使用を含む。いくつかの実施形態では、磁化可能粒子は生分解性である。

特定の実施形態では、単離又は分離は、方法の単離、細胞調製、分離、処理、インキュベーション、培養、及び／又は製剤化の工程のうちの１つ以上を実施するシステム、デバイス、又は装置を使用して実施される。いくつかの態様では、このシステムは、例えば、エラー、ユーザの取扱い、及び／又は汚染を最小限に抑えるために、これらの工程のそれぞれを、閉鎖された環境又は滅菌された環境で実行するために使用される。一例では、システムは国際公開第２００９／０７２００３号、又は米国特許出願公開２０１１／０００３３８０号に記載されているシステムである。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団は、複数の細胞表面マーカーが染色された細胞が、流体の流れで運ばれるフローサイトメトリーによって回収され、濃縮（又は枯渇）される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞集団は、分取スケール（ＦＡＣＳ）−ソーティングによって回収され、濃縮（又は枯渇）される。ある実施形態では、本明細書に記載の細胞集団は、ＦＡＣＳベースの検出システムと組み合わせた微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）チップの使用によって回収及び濃縮（又は枯渇）される（例えば、国際公開第２０１０／０３３１４０号、Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573；及びGodin et al. (2008) J Biophoton. l(5):355-376を参照されたい）。両方の場合に、細胞は、複数のマーカーで標識することができ、高純度で、明確なＴ細胞サブセットの単離を可能にする。いくつかの実施形態では、抗体又は結合パートナーは、ポジティブ及び／又はネガティブ選択のための分離を容易にするために、１つ以上の検出マーカーで標識される。例えば、分離は、蛍光標識抗体への結合に基づき得る。いくつかの例では、１つ以上の細胞表面マーカーに特異的な抗体又は他の結合パートナーの結合に基づく細胞の分離は、分取スケール（ＦＡＣＳ）及び／又は微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）チップを含む蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などによって、例えばフローサイトメトリー検出システムと組み合わせて、流体の流れの中で行われる。そのような方法は、複数のマーカーに基づくポジティブ及びネガティブ選択を同時に可能にする。

いくつかの実施形態では、方法は、赤血球細胞を溶解することによる末梢血からの白血球細胞の調製、及びパーコール勾配又はフィコール勾配による遠心分離などの密度ベースの細胞分離方法を含む。

前述の分離工程のいずれにおいても、分離は、特定の細胞集団又は特定のマーカーを発現する細胞の１００％の濃縮又は除去をもたらさない。例えば、マーカーを発現する細胞などの特定の型の細胞のポジティブ選択又は濃縮は、そうした細胞の数又はパーセンテージを増加させることをいうが、マーカーを発現しない細胞の完全な不在をもたらさない。同様に、マーカーを発現する細胞などの特定の型の細胞のネガティブ選択、除去、又は枯渇は、そうした細胞の数又はパーセンテージを減少させることを指すが、そうした細胞全ての完全な除去をもたらさない。

或いは、細胞は、Ｔ細胞については、BCL2(AAA)Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９０２（商標））株、ＢＣＬ２（Ｓ７０Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９００（商標））株、ＢＣＬ２（Ｓ８７Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９０１（商標））株、ＢＣＬ２Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２８９９（商標））株、ＮｅｏＪｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２８９８（商標））株、ＴＡＬＬ−１０４（ＡＴＴＣ（登録商標）ＣＲＬ−１１３８６）株、及びＮＫ細胞については、ＮＫ−９２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２４０７（商標））株、ＮＫ−９２ＭＩ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２４０８（商標））株を含むが、これらに限定されない、市販の細胞培養物から入手し得る。そうした市販細胞株の非限定的な例示的供給源としては、American Type Culture Collection又はＡＴＣＣ（http://www.atcc.org/）及びGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures（https://www.dsmz.de/）が挙げられる。

細胞の調製及び増殖
所望のＣＡＲを発現するための免疫細胞の遺伝子改変の前又は後にかかわらず、一般に知られている方法、又は米国特許第６，３５２，６９４号；同第６，５３４，０５５号；同第６，９０５，６８０号；同第６，６９２，９６４号；同第５，８５８，３５８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，９０５，６８１号；同第７，１４４，５７５号；同第７，０６７，３１８号；同第７，１７２，８６９号；同第７，２３２，５６６号；同第７，１７５，８４３号；同第５，８８３，２２３号；同第６，９０５，８７４号；同第６，７９７，５１４号；同第６，８６７，０４１号及び米国特許出願公開第２００６／０１２１００５号、Life Technologies Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）システム活性化及び増殖キット；BD Biosciences Ｐｈｏｓｆｌｏｗ（商標）活性化キット、Miltenyi Biotec ＭＡＣＳ（商標）活性化／増殖キット、並びに関連する細胞の活性化部分に特異的な他の市販の細胞キットに記載があるものなどの、本発明の用途に容易に適合する方法で、細胞を活性化及び増殖させることができる。ＨＬＡ−Ｇ抗原によりエクスビボで刺激すると、選択されたＣＡＲ発現細胞サブ集団を活性化し、増殖させることができる。或いは、細胞は、ＨＬＡ−Ｇ抗原との相互作用により、インビボで活性化され得る。

インキュベーション及び／又は操作は、ユニット、チャンバー、ウェル、カラム、チューブ、チューブセット、バルブ、バイアル、培養皿、バッグ、又は培養用の若しくは細胞を培養するための他の容器などの培養容器中で実施され得る。

いくつかの実施形態では、細胞は遺伝子操作の前又はそれに関連してインキュベート及び／又は培養される。インキュベーション工程は、培養（culture）、培養（cultivation）、刺激、活性化、及び／又は増殖を含むことができる。いくつかの実施形態では、組成物又は細胞は、刺激条件又は刺激剤の存在下でインキュベートされる。そのような条件には、集団中の細胞の増殖、拡大、活性化、及び／又は生存を誘導するために、抗原曝露を模倣するために、及び／又は組換え抗原レセプターの導入のためなどの遺伝子操作のために細胞を刺激するために設計されたものが含まれる。条件は、特定の培地、温度、酸素含有量、二酸化炭素含有量、時間、薬剤、例えば栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン、及び／又はサイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性レセプター、並びに細胞を活性化するように設計された任意の他の薬剤などの刺激因子のうちの１つ以上を含むことができる。

いくつかの実施形態では、本発明の免疫細胞は、組織又は細胞と共培養することによってインビトロで増殖させることができる。細胞はまた、インビボで、例えば、対象に細胞を投与した後の対象の血液中で増殖させることもできる。

一般に、本発明のＴ細胞は、例えば、Ｔ細胞の活性化シグナルを生成するために、Ｔ細胞の表面上でＣＤ３ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤と共刺激分子とを接触させることによって増殖させることができる。例えば、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）、又はフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）のような分裂促進レクチンのような化学物質を使用して、Ｔ細胞の活性化シグナルを生成することができる。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞集団は、例えば、表面に固定化された、抗ＣＤ３抗体、若しくはその抗原結合フラグメント、若しくは抗ＣＤ２抗体との接触によって、又はカルシウムイオノフォアと組み合わせたタンパク質キナーゼＣアクチベーター（例えば、ブリオスタチン）との接触によって、インビトロで刺激され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞集団は、ムロモナブ−ＣＤ３（ＯＫＴ３）との接触によってインビトロで刺激され得る。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激する条件下で、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と共にインキュベートすることができる。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、非分裂ＰＢＭＣなどの培養開始組成物フィーダー細胞に添加（例えば、得られる細胞集団が、増殖される最初の集団中の各Ｔリンパ球当たり少なくとも約５、１０、２０、又は４０個以上のＰＢＭＣフィーダー細胞を含むように）することによって、そして培養物をインキュベートすることによって（例えば、Ｔ細胞の数を増大させるのに十分な時間）、増殖される。いくつかの態様では、非分裂フィーダー細胞がガンマ線照射ＰＢＭＣフィーダー細胞を含むことができる。いくつかの実施形態では、細胞分裂を防止するために、ＰＢＭＣには、約３０００〜３６００ｒａｄの範囲のガンマ線が照射される。いくつかの態様では、フィーダー細胞は、Ｔ細胞集団の添加の前に培養培地に添加される。

特定の実施形態では、共刺激分子は、抗原結合後にＣＡＲによって産生されるＴ細胞の活性化、増殖、及び細胞毒性を増強するために使用される。共刺激リガンドとしては、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、Ｂ７−Ｈ３、ＢＡＦＦＲ，ＢＴＬＡ、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８ａ、ＣＤ８β、ＣＤ１ａ、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１９ａ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ４０ＭＩＣＡ、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Tactile）、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤＳ、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１０、ＧＡＤＳ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＨＬＡ−Ｇ、ＩＡ４、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒａ、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡＤ、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ７、ＫＩＲＤＳ２、ＬＡＴ、ＬＦＡ−１、ＬＩＧＨＴ、ＬＴＢＲ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＳＧＬ１、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＰ−７６、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＶＬＡ１、ＶＬＡ−６、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ｒＣＡＭ）、リンホトキシンβレセプター３、ＴＲ６、ＩＬＴ３及びＩＬＴ４が挙げられるが、これらに限定されない。共刺激リガンドはまた、とりわけ、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子、例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、と特異的に結合する抗体も包含するが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞集団は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）ＩＬ−１５、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ複合体、ＩＬ−１８及びＩＬ−１２を用いてインビトロで増殖させることができる。

Ｔ細胞及びＮＫ細胞培養に適切な条件には、増殖及び生存に必要な因子（例えば、血清（例えば、ウシ胎児又はヒト血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＴＧＦ、及びＴＮＦ、又は当業者に知られている細胞の増殖のための他の任意の添加物）を含みうる適切な培地（例えば、最小必須培地又はＲＰＭＩ培地１６４０又はX-Vivo10、X-Vivo15及びX-Vivo20（Lonza））が含まれる。好ましい実施形態では、Ｔ細胞は、ＯＫＴ３及びＩＬ−２への曝露によってインビトロで刺激される。細胞の増殖のための他の添加剤には、界面活性剤、プラズマネート及び還元剤（Ｎ−アセチル−システイン及び２−メルカプトエタノールなどの）が挙げられるが、これらに限定されない。培地は、ＲＰＭＩ１６４０、AIM-V、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ−ＭＥＭ、Ｆ−１２、X-Vivo10、X-Vivo15、及びX-Vivo20（Optimizer）を含むことができ、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム及びビタミンが添加されており、血清フリーか、又は適切な量の血清（若しくは血漿）若しくはホルモンの既定のセット、及び／又はＴ細胞の増殖と拡大に十分な量のサイトカインで強化されている。

抗生物質、例えば、ペニシリン及びストレプトマイシンは、対象に注入されるべき細胞の培養物には含まれず、実験培養物にのみ含まれる。標的細胞は増殖をサポートするのに必要な条件下、例えば、適切な温度（例えば、摂氏３７度）及び雰囲気（例えば、空気＋５％ＣＯ_２）で維持される。様々な刺激時間に曝露されたＴ細胞は、異なる特徴を示し得る。

いくつかの実施形態では、調製方法は、単離、インキュベーション、及び／又は操作の前又は後のいずれかに、細胞を凍結、例えば凍結保存するための工程を含む。いくつかの実施形態では、凍結及びその後の解凍工程は細胞集団中の顆粒球を除去し、ある程度の単球を除去する。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、血漿及び血小板を除去するための洗浄工程の後に、凍結溶液中に懸濁される。いくつかの態様では、様々な既知の凍結溶液及びパラメータのいずれかを使用することができる。一例では、２０％ＤＭＳＯ及び８％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有するＰＢＳ、又は他の適切な細胞凍結培地の使用が含まれる。次いで、これを、ＤＭＳＯ及びＨＳＡの最終濃度がそれぞれ１０％及び４％になるように、培地で１：１に希釈する。次いで、細胞を−８０℃まで１℃／分の速度で凍結させ、液体窒素貯蔵タンクの気相中に貯蔵する。

本発明の方法において、ＮＫ細胞又はＴ細胞は、好ましくは患者に投与する前に、少なくとも約５日間、好ましくは約１０日間以上、より好ましくは約１５日間以上、最も好ましくは約２０日間以上、エクスビボで増殖させる。

別の実施形態では、ＮＫ細胞又はＴ細胞は、患者に投与する前に、０日目の増殖と比較して、少なくとも約１００倍、好ましくは少なくとも約２００倍、及びより好ましくは少なくとも約４００倍、好ましくは少なくとも約６００倍、より好ましくは少なくとも約１０００倍、及びさらにより好ましくは少なくとも約１５００倍増殖される。

細胞の形質導入と選択
本発明の核酸コンストラクトを免疫細胞に形質導入して、本発明の抗ＨＬＡ−ＧＣＡＲを発現する免疫細胞を作製することができる。ある実施形態では、細胞は、少なくとも１つの本発明のＣＡＲを含むよう形質導入される。

キメラ核酸コンストラクトは、裸のＤＮＡとして、又は適切なベクター中で、対象自身の免疫細胞に導入できることが意図されている。裸のＤＮＡを使用するエレクトロポレーションによって、免疫細胞、特にＴ細胞を安定に遺伝子導入する方法は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許第６，４１０，３１９号を参照されたい。裸のＤＮＡは一般に、発現のために適切な配向でプラスミド発現ベクターに含まれる、本発明のキメラレセプターをコードするＤＮＡを指す。有利なことに、裸のＤＮＡの使用は、本発明のキメラレセプターを発現するＴ細胞を産生するために必要な時間を減少させる。核酸コンストラクトを宿主細胞に導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション法、微粒子銃法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法などが含まれる。

或いは、目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法は、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用を含む。上記のベクターなどの、種々のウイルスベクターを使用して、本発明の核酸コンストラクトを免疫細胞に導入することができる。本発明の方法に従って使用する適切なベクターは、対象の免疫細胞中で複製しない。

一実施形態では、本発明のＣＡＲをコードする核酸コンストラクトは、ウイルスベクター、特に上記のレンチウイルスベクターによって免疫細胞に導入される。

或いは、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学手段には、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散系、及び水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベースの系が含まれる。インビトロ及びインビボで送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。

宿主細胞に外因性核酸を導入するために、又はそうでなければ細胞を本発明のインヒビターに曝露するために使用される方法にかかわらず、宿主細胞中の組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、種々の分析が行われ得る。そのような分析には、例えば、当業者に周知の「分子生物学的」分析（例えば、サザンブロット及びノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ及びＰＣＲ）；「生化学的」分析（例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット）によって、又は本明細書に記載の分析によって、特定のペプチドの存在又は非存在を検出し、本発明の範囲内にある薬剤を同定する）が含まれる。標的細胞を認識する能力及び抗原特異性についてＣＡＲを試験する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Clay et al, J. Immunol.,163: 507-513 (1999)は、サイトカイン（例えば、インターフェロンγ、顆粒球／単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子ａ（ＴＮＦ−α）又はインターロイキン２（ＩＬ−２））の放出を測定する方法を教示する。さらに、ＣＡＲ機能はZhao et al, J. Immunol., 174: 4415-4423 (2005)の記載のように、細胞の細胞毒性を測定することによって評価することができる。

遺伝子導入又は形質導入された免疫細胞が、所望の調節を有する表面膜タンパク質として所望のレベルでキメラレセプターを発現できることが確立されると、宿主細胞中で所望のシグナル誘導を提供するという点で、キメラレセプターが機能的であるかどうかを決定することができる。続いて、形質導入された免疫細胞を、対象にさらに再導入又は投与して、対象の抗腫瘍応答を活性化させることができる。投与を容易にするために、本発明の形質導入されたＴ細胞は、医薬組成物に作製するか、又は薬学的に許容される担体又は希釈剤と共に、インビボでの投与に適切なインプラントに作製することができる。

本発明のＣＡＲを発現する細胞が対象に投与されると、いくつかの態様では、遺伝子操作された細胞集団及び／又は抗体の生物学的活性は、いくつかの公知の方法のいずれかによって測定される。評価のパラメータには、インビボでの、例えば、イメージングによる、又はエクスビボでの、例えば、ＥＬＩＳＡによる、遺伝子操作された又は天然のＴ細胞又は他の免疫細胞の抗原への特異的結合が含まれる。特定の実施形態では、標的細胞を破壊するエンジニアリングされた細胞の能力は、例えば、Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), and Herman et al. J. Immunological Methods , 285(1): 25-40 (2004)に記載されている細胞毒性アッセイなどの当技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて測定することができる。特定の実施形態では、細胞の生物学的活性はまた、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＭＩＰ−１α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−γ、又はＩＬ−２などの特定のサイトカインの発現及び／又は分泌をアッセイすることによって測定することができる。

いくつかの態様では、生物学的活性は、腫瘍の量又は負荷の減少、腫瘍の安定化、無増悪生存率、又は全生存率などの臨床転帰を評価することによって測定される。

医薬組成物又は獣医学組成物
本発明はまた、上記の抗ＨＬＡ−Ｇ抗体又は抗体フラグメント、ＣＡＲ、核酸コンストラクト、ベクター及び／又は細胞を含む医薬組成物又は獣医学組成物に関する。

特定の態様では、本発明は、上記のＣＡＲを含む、及び／又はＣＡＲをコードする上記の核酸コンストラクトを含む細胞、好ましくは免疫細胞を含む、医薬組成物又は獣医学組成物に関する。一態様では、医薬組成物又は獣医学組成物は、少なくとも２つの異なる細胞集団を含み得、第１の集団は、β２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇに、好ましくはＨＬＡ−Ｇ１とＨＬＡ−Ｇ５の両方に特異的に結合するＣＡＲを含む細胞を有し、第２の集団は、β２ＭフリーＨＬＡ−Ｇに、好ましくはＨＬＡ−Ｇ２とＨＬＡ−Ｇ６の両方に、及び／又はＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍ−フリーとＨＬＡ−Ｇ５／β２Ｍ−フリーアイソフォームの両方に特異的に結合するＣＡＲを含む細胞を有する。別の態様では、医薬組成物又は獣医学組成物は、少なくとも２つのＣＡＲを含む細胞集団を含み得、第１のＣＡＲは、β２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇに、好ましくはＨＬＡ−Ｇ１とＨＬＡ−Ｇ５の両方に特異的に結合し、第２のＣＡＲは、β２ＭフリーＨＬＡ−Ｇに、好ましくはＨＬＡ−Ｇ２とＨＬＡ−Ｇ６の両方に、及び／又はＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍ−フリー及び／又はＨＬＡ−Ｇ５／β２Ｍ−フリーアイソフォームに特異的に結合する。別の態様では、医薬組成物又は獣医学組成物は、β２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇへの、好ましくはＨＬＡ−Ｇ１とＨＬＡ−Ｇ５の両方への、及びβ２ＭフリーＨＬＡ−Ｇへの、好ましくはＨＬＡ−Ｇ２とＨＬＡ−Ｇ６の両方への、さらにより好ましくはＨＬＡ−Ｇ２とＨＬＡ−Ｇ６の両方への、及び／又はＨＬＡ−Ｇ１／β２ＭフリーとＨＬＡ−Ｇ５／β２Ｍフリーアイソフォームの両方への特異的結合を可能にする二重特異性ＣＡＲを含む細胞集団を含み得る。

さらなる態様では、医薬組成物又は獣医学的組成物は、β２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇ及び／又はβ２ＭフリーＨＬＡ−Ｇアイソフォームを標的とする、上記のＣＡＲ若しくは少なくとも２つのＣＡＲ又は二重特異性ＣＡＲを発現する細胞の第１集団、及びＨＬＡ−Ｇを認識しないが、抗腫瘍及び／又は抗ウイルス療法などのＣＡＲ療法で目的の標的であることが知られている抗原を認識したＣＡＲを発現する細胞の第２集団を含み得る。そのようなＣＡＲ発現細胞の第２集団がＨＬＡ−Ｇを標的としないことは理解されるであろう。

本発明はまた、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞などの、本発明のＣＡＲ発現細胞を複数含む医薬組成物又は獣医学的組成物に関する。医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤をさらに含み得る。医薬組成物は、任意に、１つ以上のさらなる薬学的に活性なポリペプチド及び／又は化合物を含み得る。

一実施形態では、医薬組成物又は獣医学的組成物に含まれる本発明のＣＡＲ発現細胞の濃度は、少なくとも０．００１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも６０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも６５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも９０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも９５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌである。少なくとも１０５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１１５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１３５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２７５ｍｇ／ｍｌ又は少なくとも３００ｍｇ／ｍｌである。

別の実施形態では、医薬組成物又は獣医学組成物に含まれる本発明のＣＡＲ発現細胞の濃度は、０．００１〜０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．０１〜０．１ｍｇ／ｍｌ、０．１〜１ｍｇ／ｍｌ、１〜１０ｍｇ／ｍｌ、１０〜５０ｍｇ／ｍｌ、５０〜１００ｍｇ／ｍｌ、５０〜１５０ｍｇ／ｍｌ、５０〜２００ｍｇ／ｍｌ、５０〜２５０ｍｇ／ｍｌ、５０〜３００ｍｇ／ｍｌ、１００〜２００ｍｇ／ｍｌ、１００〜３００ｍｇ／ｍｌ、又は２００〜３００ｍｇ／ｍｌである。

別の実施形態では、医薬組成物又は獣医学的組成物は、本発明のＣＡＲ発現細胞を、特に少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、少なくとも７００個、少なくとも１０００個、少なくとも１５００個、少なくとも２０００個、少なくとも３０００個、少なくとも５０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも１００万個、少なくとも１０００万個、又は少なくとも１億個の本発明のＣＡＲ発現細胞を含む。

本発明の医薬組成物又は獣医学的組成物は、局所、経腸、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下又は眼内投与などを含む任意の従来の投与経路用に製剤化することができる。

好ましくは、本発明の医薬組成物又は獣医学組成物は、経腸又は非経口投与経路によって投与され得る。非経口的に投与される場合、本発明の医薬組成物又は獣医学組成物は、好ましくは静脈内経路投与によって投与される。経腸的に投与される場合、本発明の医薬組成物又は獣医学組成物は、好ましくは経口投与によって投与される。

本発明の製剤は、本発明の製剤であるヒト血液と等張性であり得ること、すなわち、本発明の製剤は、ヒト血液と実質的に同じ浸透圧を有することは当業者に理解されるであろう。そのような等張製剤は、一般に、約２５０ｍＯＳｍ〜約３５０ｍＯＳｍの浸透圧を有する。等張性は、例えば、蒸気圧又は氷冷タイプの浸透圧計によって測定することができる。製剤の張度は、張度調節剤の使用によって調節される。「張度調節剤」は、製剤の等張性を提供するために製剤に添加することができる、薬学的に許容される不活性物質である。本発明に適した張度調節剤には糖類、塩及びアミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。

非経口、髄腔内、又は脳室内投与のための組成物及び製剤は、緩衝剤、希釈剤、並びに浸透増強剤、カーダー化合物(carder compound)、及び他の薬学的に許容される担体又は賦形剤などの他の適切な添加剤（ただし、これらに限定されない）を含有し得る無菌水溶液を含んでもよい。

本発明の医薬組成物又は獣医学組成物は、薬学的に許容されるビヒクルをさらに含み得る。したがって、本発明のさらなる態様は、本明細書で開示の実施形態に記載の、担体及び１つ以上の産物−例えば、抗ＨＬＡ−ＧＣＡＲ、核酸、ベクター、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体又は抗体フラグメント−を含む細胞を含む組成物に関する。製剤は滅菌することができ、所望であれば、製剤の産物−例えば、抗ＨＬＡ−ＧＣＡＲ、核酸、ベクター、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体又は抗体フラグメントを含む細胞−と有害に相互作用しない担体及び賦形剤などの補助剤と混合することができる。

好ましくは、特許請求される組成物のいずれか１つを含むがこれに限定されない、本発明の医薬組成物又は獣医学組成物は、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞を、以下に記載の薬学的又は生理学的に受容される担体、希釈剤又は賦形剤の１つ以上と組み合わせて含み得る。望ましくは、本発明の組換え細胞の所望の免疫増強効果に悪影響を及ぼさない、薬学的に許容される形態が使用される。

投与を容易にするために、形質導入された免疫細胞、好ましくは、本発明のＣＡＲをコードする核酸コンストラクトで形質導入されたＴ細胞及び／又はＮＫ細胞は、適切な薬学的に許容される担体又は希釈剤とともに、インビボでの投与のための医薬組成物に作製することができる。そのような組成物を製造する手段は、当技術分野で報告されている（例えば、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins, 21st edition (2005)を参照されたい）。

特に、ＣＡＲ発現細胞の集団を含む製剤は、薬学的に許容される賦形剤を含み得る。製剤に含まれる賦形剤は、例えば、ＣＡＲコンストラクト、使用する細胞のサブ集団、及び投与様式に依存して、異なる目的を有する。ＣＡＲ発現細胞の集団を含む製剤は、典型的には動物血清（例えば、ウシ血清アルブミン）などの非ヒト成分の非存在下で調製され、培養されている。

製剤又は組成物はまた、結合分子又は細胞で治療される特定の適応症、疾患、又は病態に有用な２つ以上の活性成分、好ましくは結合分子又は細胞に相補的な活性を有するものであって、それぞれの活性が互いに悪影響を及ぼさないものを含有し得る。そのような活性成分は、意図する目的に対して、有効な量で組み合わされて適切に存在する。

いくつかの態様において、医薬組成物又は獣医学組成物は、組成物の送達が治療される部位の感作の前に起こり、及び感作を引き起こすのに十分な時間がとれるように、長期放出、遅延放出、及び持続放出送達系を使用し得る。当技術分野で公知の手段を使用して、組成物が標的組織又は臓器に到達するまで、組成物の放出及び吸着を防止又は最小限に抑えることができ、又は組成物の長期放出を確実にすることができる。そのようなシステムは、組成物の反復投与を回避することができ、それによって、対象及び医師に対する利便性を増大させる。

対象、投薬計画及び投与
本発明は、医薬として使用するための、又は対象の疾患又は障害の治療に使用するための、本発明の医薬組成物又は本発明のＣＡＲ発現細胞に関する。本発明はまた、対象の疾患又は障害を治療するための医薬の製造における、本発明の医薬組成物又は本発明のＣＡＲ発現細胞の使用に関する。最後に、本発明の医薬組成物又は本発明のＣＡＲ発現細胞の治療有効量を対象に投与することを含む、対象の疾患又は障害を治療するための方法に関する。

本発明のヒト被験者は、胎児期のヒト、新生児、子供、乳児、青年又は成人、特に少なくとも４０歳の成人、好ましくは少なくとも５０歳の成人、さらにより好ましくは少なくとも６０歳の成人、さらにより好ましくは少なくとも７０歳の成人であり得る。

いくつかの実施形態では、対象は、疾患、養子細胞療法のための、及び／又はサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）などの毒性転帰を評価するための、検証された動物モデルである。

いくつかの実施形態では、対象は、例えば、化学療法、放射線、及び／又は造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）、例えば、同種異系ＨＳＣＴを含む別の免疫療法及び／又は他の療法による治療後に、持続性若しくは再発性疾患を有する。いくつかの実施形態では、投与は、対象が別の治療に抵抗性を有するようになった場合にも、対象を効果的に治療する。いくつかの実施形態では、対象は再発していないが、再発の危険性がある（例えば、再発の高い危険性がある）と決定され、したがって、化合物又は組成物は、例えば、再発の可能性を減少させるか、又は再発を予防するために、予防的に投与される。

いくつかの実施形態では、本発明は、疾患、病態又は障害を有するか、有する危険性があるか、又は有することが疑われる対象に、本発明のＣＡＲ発現細胞又はＣＡＲ発現細胞を含有する組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、細胞及び組成物は、例えば養子Ｔ細胞療法などの養子細胞療法によって治療される、特定の疾患又は病態を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、細胞又は組成物は、疾患又は病態を有するか、又はその危険性がある対象などの対象に投与される。いくつかの態様では、この方法は、それによって治療し、例えば、疾患又は病態の１つ以上の症状を改善する。好ましい実施形態では、対象は、免疫疾患、好ましくは癌と診断されている。自己免疫疾患又は癌の診断方法は、当業者に周知である。

特定の実施形態では、対象は本発明の免疫細胞又は本発明の医薬組成物若しくは獣医学組成物の投与の前に、少なくとも１つの治療系統、好ましくはいくつかの治療系統を既に受けている。

好ましくは、治療は定期的に、好ましくは毎日と毎月の間、より好ましくは毎日と２週間の間、より好ましくは毎日と毎週の間、さらにより好ましくは治療は毎日施される。特定の実施形態では、治療には、１日に数回、好ましくは１日に２回又は３回、さらにより好ましくは１日に３回投与される。

本発明のベクター、本発明の免疫細胞、又は本発明の医薬組成物若しくは獣医学組成物での治療の期間は、好ましくは１日〜２０週間、より好ましくは１日〜１０週間、さらにより好ましくは１日〜４週間、なお一層好ましくは１日〜２週間である。特定の実施形態では、治療期間は約１週間である。或いは、病気が続く限り治療は続き得る。

医薬組成物又は獣医学組成物の形態、投与経路、及び本発明の免疫細胞又は本発明の医薬組成物の投与量は、感染の型及び重症度、並びに患者に応じて、特にその年齢、体重、性別、及び全身の身体状態に応じて、当業者により調節され得る。本発明の組成物は、局所治療又は全身治療が所望されるかどうかに依存して、多くの方法で投与され得る。

養子細胞療法の場合、養子細胞療法のための細胞の投与方法は公知であり、提供される方法及び組成物との関連で使用され得る。例えば、養子Ｔ細胞治療法は、例えば、Gruenbergらの米国特許出願公開第２００３／０１７０２３８号；Rosenbergの米国特許第４，６９０，９１５号；Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85に記載がある。例えば、Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338を参照されたい。

当業者は、投与には２つ以上の経路を使用することができるが、特定の経路が別の経路よりもより迅速且つより有効な反応を提供できることを認識するであろう。例えば、皮内送達は、メラノーマの治療のためには吸入よりも有利に使用され得る。局所又は全身送達は、体腔への製剤の適用又は点滴、エアロゾルの吸入又は吹送を含む投与によって、又は筋肉内、静脈内、門脈内、肝臓内、腹腔内、皮下、又は皮内投与を含む非経口導入によって達成することができる。

全身（静脈内、ＩＶ）注射は、その投与が容易であることから臨床応用に好まれているが、いくつかの前臨床研究は（Carpenito, et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:3360-3365; Song, et al. (2011) Cancer Res. 71:4617-4627; Parente-Pereira, et al. (2011) J. Clin. Immunol. 31:710-718）、Ｔ細胞の局所（腫瘍内、ＩＴ又は腹腔内、ＩＰ）投与は、腫瘍へのＴ細胞輸送の増加に部分的に起因すると思われる、最適な治療効果をもたらし得ることを示唆している。例えば、ＣＡＲＴ細胞は、ＩＰ経路又はＩＴ経路を介して送達された場合、最小限の全身吸収で接種部位に留まることが示されている（Parente-Pereira, et al. (2011) J. Clin. Immunol. 31:710-718）。対照的に、静脈内投与後、ＣＡＲＴ細胞は最初に肺に到達し、その後、脾臓、肝臓、及びリンパ節に再分布される。さらに、ＲＮＡＣＡＲエレクトロポレーションされたＴ細胞は、Ｔ細胞上でのＣＡＲの発現が一過性の性質であるために、局所投与に特に適切であり得る（Zhao, et al. (2010) Cancer Res. 70:9053-9061）。さらに、臨床研究は、Ｔ細胞の腫瘍内及び腹腔内注射の両方の実行可能性及び安全性を示している（Canevari, et al. (1995) J. Natl. Cancer Inst. 87:1463-1469; Duval, et al. (2006) Clin. Cancer Res. 12:1229-1236）。全体として、組換えＴ細胞の局所投与経路は、最適な治療効果を提供し、「標的上、臓器外」毒性の可能性を減少させ得る。したがって、一実施形態では、本発明のＣＡＲ発現細胞は、局所的に、好ましくは腫瘍内注射及び腹腔内注射によって投与される。

いくつかの実施形態での医薬組成物は、疾患又は病態を治療又は予防するのに有効な量、例えば、治療有効量又は予防有効量のＣＡＲ細胞を含む。いくつかの実施形態での治療的又は予防的有効性は、治療された対象の定期的な評価によってモニターされる。数日以上にわたる反復投与の場合、病態に応じて、所望の疾患症状の抑制が生じるまで治療を繰り返す。しかしながら、他の投薬計画が有用であり得、他の投薬計画に決定することができる。所望の用量は、組成物の単回ボーラス投与によって、組成物の複数回ボーラス投与によって、又は組成物の連続注入投与によって送達することができる。投与される本発明の免疫細胞又は本発明の医薬組成物の量は、当業者に周知の標準的な手順によって決定することができる。治療有効量が患者に投与されるように、患者の生理学的データ（例えば、レシピエントの年齢、サイズ、体重及び健康状態、体重、もしあれば同時治療の種類、治療の頻度、並びに所望の効果の性質）、及び投与経路を考慮して、適切な投薬量を決定する。具体的には、適切な投与量及び投与スケジュールは、臨床試験又は十分に確立された細胞ベースの治療法（例えば、Topalian & Rosenberg (1987) Acta Haematol. 78 Suppl 1:75-6；米国特許第４，６９０，９１５号を参照されたい）に基づくことができ、或いは代替の連続注入戦略を採用することができる。

いくつかの実施形態では、有効な量若しくは数の細胞又はそれらの細胞を含む医薬組成物は、非経口的に投与される。いくつかの実施形態では、投与を静脈内投与とすることができる。いくつかの実施形態では、投与は腫瘍内への注射によって直接行うことができる。

ある実施形態では、ＣＡＲを発現するよう遺伝子操作された細胞の文脈において、対象には、約１００万〜約１０００億細胞、例えば約１００万〜約５００億細胞（例えば、約５００万細胞、約２５００万細胞、約５億細胞、約１０億細胞、約５０億細胞、約２００億細胞、約３００億細胞、約４００億細胞、又は前記値の任意の２つで定義される範囲）、例えば約１０００万〜約１０００億細胞（例えば、約２０００万細胞、約３０００万細胞、約４０００万細胞、約６０００万細胞、約７０００万細胞、約８０００万細胞、約９０００万細胞、約１００億細胞、約２５０億細胞、約５００億細胞、約７５０億細胞、約９００億細胞、又は前記値の任意の２つで定義される範囲）、及びいくつかの場合では、約１億細胞〜約５００億細胞（例えば、約１億２０００万細胞、約２億５０００万細胞、約３億５０００万細胞、約４億５０００万細胞、約６億５０００万細胞、約８億細胞、約９億細胞、約３０億細胞、約３００億細胞、約４５０億細胞）若しくはこれらの範囲内の任意の値、及び／又は対象の体重１ｋｇ当たりのそのような数の細胞が投与される。例えば、いくつかの実施形態では、細胞又は細胞集団の投与は、体重１ｋｇ当たり約１０^３〜約１０^９（それらの範囲内の細胞数の全ての整数値を含む）細胞の投与を含むことができ、例えば、本発明の細胞組成物は、単回用量又は複数回用量で投与することができるが、この場合、それぞれの用量は少なくとも１０細胞／ｋｇ体重、少なくとも１００細胞／ｋｇ体重；少なくとも１０００細胞／ｋｇ体重；少なくとも１０，０００細胞；少なくとも１００，０００細胞；少なくとも１００万細胞；少なくとも１０００万細胞；少なくとも１億細胞；少なくとも１０億細胞又は少なくとも１００億細胞／ｋｇ体重を含む。

特に、所望の治療応答を達成するためには、十分な数の形質導入された免疫細胞が導入されるであろう。望ましくは、有効量又は十分な数の単離された形質導入細胞が組成物中に存在し、そして長期、特異的、抗腫瘍又は抗感染性因子応答が確立されて、そのような治療が不在の場合に生じるであろうよりも、腫瘍のサイズ若しくは再増殖又は感染性因子の増殖を減少させるように、対象に導入される。望ましくは形質導入された免疫細胞、好ましくは対象に再導入されたＴ細胞の量は、形質導入された免疫細胞が存在しない他の同じ条件と比較した場合、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は１００％の腫瘍サイズの減少を引き起こす。

本発明の組成物は、単位投薬形態で提供することができ、この場合、各投薬単位は、例えば注射剤は、単独で、又は他の活性薬剤と適切に組み合わせて、所定量の組成物を含有する。本明細書中で使用する単位投薬形態という用語は、ヒト及び動物対象のための単位用量として適切な、物理的に不連続な単位を指し、各単位は、適切な場合には、薬学的に許容される希釈剤、担体、又はビヒクルを伴って、単独で、又は所望の効果を生じるのに十分な量で計算された他の活性薬剤と組み合わされて、所定量の本発明の組成物を含有する。本発明の新規な単位投薬形態の仕様は、特定の対象における医薬組成物に関連する特定の薬力学に依存する。

細胞又は細胞集団は、１つ又は複数の用量で投与することができる。いくつかの実施形態では、前記の有効量又は有効細胞数を、単回用量として投与することができる。いくつかの実施形態では、前記の有効量又は有効細胞数は、ある期間にわたって２回分以上の用量として投与することができる。投与のタイミングは管理医師の判断の範囲内であり、患者の臨床状態に依存する。個々の必要性は変化するが、特定の疾患又は病態に対する所与の細胞型の有効量の最適範囲の決定は、当業者の範囲内である。有効量は、治療的又は予防的便益を提供する量を意味する。

本発明の目的のためには、投与される本発明のＣＡＲ物質の量又は用量は、妥当な時間枠にわたって対象の治療的又は予防的応答を生じるのに十分であるべきである。例えば、本発明のＣＡＲ物質の用量は、抗原、例えば、ＨＬＡ−Ｇアイソフォームに結合するのに十分であるべきであり、又は投与時から約２時間以上、例えば約１２〜約２４時間以上の期間で、疾患を検出、治療又は予防するのに十分であるべきである。ある実施形態では、期間はさらに長くてもよい。用量は、特定の本発明のＣＡＲ物質の効力及び対象の病態、並びに治療される対象の体重によって決定されるであろう。

本発明の目的のために、例えば、哺乳動物への所定用量のそのようなＴ細胞を投与した際に、標的細胞が溶解される程度、又はＩＦＮ−γが本発明のＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質を発現するＴ細胞によって分泌される程度を、それぞれ異なる用量のＴ細胞が与えられた哺乳動物のセットの中で比較することを含む分析法は、哺乳動物に投与すべき開始用量を決定するために使用し得る。特定の用量の投与の際に、標的細胞が溶解する程度、又はＩＦＮ−γが分泌される程度は、当技術分野で公知の方法によって分析することができる。

使用
疾患又は障害の治療及び併用療法における使用
一態様では、治療されるべき疾患又は障害は、増殖性の疾患又は障害、好ましくは癌；感染性の疾患又は障害、好ましくはウイルス感染；炎症性の疾患又は障害；及び免疫性の疾患又は障害、好ましくは自己免疫又は自己免疫疾患、アレルギー及び移植片対宿主拒絶から選択される病態である。いくつかの実施形態では、病態は癌であり得る。

本発明は、それを必要とする宿主の、ＨＬＡ−Ｇタンパク質による免疫ダウンレギュレーションを妨害又は中和するための、本発明の抗体、細胞、核酸コンストラクト、ベクター及び／又は医薬組成物の使用に関する。

特に、本発明の細胞、核酸コンストラクト、ベクター及び／又は医薬組成物は、例えばＨＩＶ−１、Ｂ型肝炎ウイルス及びＣ型肝炎ウイルスへの感染などのウイルス感染の治療に特に適している。

特に、本発明の細胞、核酸コンストラクト、ベクター及び／又は医薬組成物は癌、特に固形腫瘍又は造血癌の治療に特に適しており、より好ましくは、良好な選択的単一標的の利用度が限られている場合である。

免疫系は悪性細胞の形質転換の際に誘導される腫瘍特異的抗原又は分子の発現に基づき、腫瘍細胞を特異的に同定し、除去することができる。この過程は腫瘍免疫監視と呼ばれる。腫瘍免疫監視にもかかわらず、機能中の免疫系の存在下でも腫瘍は依然発生することができる。これは、腫瘍免疫編集を介して起こり、これは１）ほとんどの免疫原性腫瘍細胞が細胞毒性Ｔ細胞やＮＫ細胞によって除去される消失相、２）免疫原性の低下した腫瘍細胞が選択される平衡相、及び３）宿主免疫系に応答しなくなった変異体が維持される逃避相（Urosevic and Dummer, 2008）の３つの主要な相を含むプロセスである。ＨＬＡ−Ｇは、腫瘍細胞の除去を減少させることにより、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の細胞毒性機能を阻害することにより、及びトロゴサイトーシス（すなわち、生存ＨＬＡ−Ｇ分子の細胞間移動）により、コンピテントな細胞毒性細胞を腫瘍抗原に非応答性にすることにより、腫瘍免疫編集のあらゆる段階で関与する（LeMaoult et al., 2007; Caumartin et al., 2007）。したがって、本発明のキメラコンストラクトは、疾患、障害、又は特定の病態を有するか、又は有することが疑われる対象、特に癌を有するか、又は有することが疑われる対象に適用される。特に、本発明のキメラコンストラクトは、癌を有するか、又は有することが疑われる対象に適用され、それによって、これらの対象の腫瘍のサイズを減少させるか、又は腫瘍の増殖若しくは再増殖を防止するか、或いは免疫抑制微小環境の誘導を防止する。

したがって、本発明はまた、それを必要とする対象の腫瘍の増殖を阻害する方法、及び／又はそれを必要とする癌患者を治療する方法に関する。腫瘍は、固形腫瘍又は液体腫瘍であり得る。いくつかの実施形態では、腫瘍又は癌は、ＨＬＡ−Ｇを発現又は過剰発現する。特定の実施形態では、これらの方法は、有効量の単離された細胞を対象若しくは患者に投与することを含むか、又は代替的に実質的にそれからなるか、又はさらにそれからなる。さらなる実施形態では、本発明のＣＡＲを発現する細胞は、Ｔ細胞又はＮＫ細胞である。単離された細胞は、治療中の対象又は患者に対して同種異系又は自家であり得る。さらなる態様では、腫瘍は、ＨＬＡ−Ｇ抗原を発現、又は過剰発現し、その治療を行う対象は、診断によって選択されている。

一実施形態では、本発明は、本発明のキメラコンストラクトを対象の免疫細胞、好ましくはＴ細胞又はＮＫ細胞に導入することにより、形質転換された免疫細胞を対象に再導入し、それによって本発明のＣＡＲを発現させることにより、対象の腫瘍を低減又は除去するための抗腫瘍応答をもたらすことにより、対象での増殖を低減、又は腫瘍形成を予防するための方法に関する。核酸コンストラクトを対象に送達する工程は、一般に、本発明の核酸コンストラクトを単離された免疫細胞（例えば、ＰＢＭＣから単離された自己免疫細胞又は同種異系の第三者由来免疫細胞ドナーに由来する免疫細胞）に導入する工程、及び形質転換された免疫細胞を対象に導入する工程を含み、それによって、養子Ｔ細胞治療法におけるように、対象の腫瘍を減少又は除去するために抗腫瘍応答をもたらす。例えば、免疫細胞はＴ細胞を含み得、対象は、腫瘍又は癌、例えば、ＨＬＡ−Ｇ発現癌に罹患しているか、又は罹患していると考えられているか、又は罹患していると診断されている。例えば、本発明の例示的な核酸コンストラクトによってコードされる抗ＨＬＡ−ＧＣＡＲ分子は、抗ＨＬＡ−ＧＣＡＲ分子を発現するように操作された組換え免疫細胞の形態で対象に投与され得る。

上記の方法によって得られた、本発明のＣＡＲ発現細胞、又はそのような細胞に由来する細胞株は、対象の疾患、障害、又は病態の治療における薬剤として使用され得る。いくつかの実施形態では、このような薬剤は癌を治療するために使用することができる。

いくつかの実施形態では、対象に治療を施すことは、対象から、又は１つ以上のドナーから採取された免疫細胞を使用する養子細胞療法（ＡＣＴ）を含んでもよい。したがって、その細胞は、対象に対して異種、同種異系、又は自家の細胞であり得る。一般に、細胞は対象の自家細胞である。

いくつかの実施形態では、細胞療法、例えば養子細胞療法、例えば養子Ｔ細胞療法は、細胞療法を受ける対象から、又はそのような対象に由来する試料から、細胞を単離及び／又はそうでなければ調製する、自家移入によって実施される。したがって、いくつかの態様では、細胞は治療を必要とする対象、例えば患者に由来し、細胞は単離及び処理の後に、同じ対象に投与される。

いくつかの実施形態では、細胞療法、例えば養子細胞療法、例えば、養子Ｔ細胞療法は同種異系導入によって実施され、この場合、細胞は細胞療法を受ける対象以外の対象、又は最終的に細胞療法を受ける対象以外の対象、例えば、第１の対象から単離され、及び／又はそうでなければ調製される。そのような実施形態では、次いで、細胞は同じ種の異なる対象、例えば、第２の対象に投与される。いくつかの実施形態では、第１及び第２の対象は、遺伝的に同一である。いくつかの実施形態では、第１及び第２の対象は、遺伝的に類似である。いくつかの実施形態では、第２の対象は、第１の対象と同じＨＬＡクラス又はスーパータイプを発現する。本発明の細胞は、癌細胞などの標的細胞を殺滅することが可能であり得る。標的細胞は、抗原発現の定義されたパターン、例えば、抗原Ａ又は抗原Ｂの発現によって認識可能であり得る。

いくつかの実施形態では、ＡＣＴは、対象から、又は１つ以上のドナーから一次免疫細胞を単離すること、前述の実施形態のいずれかの核酸コンストラクト又は複数のコンストラクトで一次免疫細胞を形質導入すること、形質導入された一次免疫細胞でＣＡＲを発現すること、及び形質導入された免疫細胞を対象に送達することを含み得る。ＡＣＴは、形質導入された免疫細胞を対象に送達する前に、免疫細胞を刺激及び／又は増殖させることをさらに含み得る。

例えばいくつかの実施形態では、ＡＣＴは、自家Ｔ細胞又は同種異系Ｔ細胞を採取すること、及び、Ｔ細胞が炎症促進性サイトカインの発現を媒介するＣＡＲを発現するように、これらのＴ細胞を１つ以上の核酸コンストラクトで形質導入すること、次いで、それらを必要とする対象にその細胞を注入することを含み得る。

本発明はまた、それを必要とする対象に、有効量の核酸コンストラクト、ベクター又は複数のベクター、又は前述の実施形態のいずれかによる形質導入された免疫細胞若しくは医薬組成物を送達すること、それによって癌を治療することを含む、癌を治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、癌の治療は、腫瘍細胞負荷の減少によって、又は生存期間の増加によって測定され得る。

本発明はさらに、前述の実施形態のいずれかによる、治療有効量の、核酸コンストラクト若しくは複数のコンストラクト、ベクター若しくは複数のベクター、組換え細胞、又は医薬組成物を対象に投与することを含む免疫療法の方法を提供する。本発明の細胞による治療は、標準的なアプローチでしばしば起こる腫瘍細胞の逃避又は放出を防止するのに役立ち得る。

特定の実施形態では、ＣＡＲ発現細胞は、それらの治療又は予防効力が増大するように、任意の数の方法で改変される。例えば、ＣＡＲは、リンカーを介して直接的又は間接的に標的部分に結合され得る。化合物、例えばＣＡＲを標的部分へ結合させることは、当技術分野で公知である。例えば、Wadhwa et al., J. Drug Targeting 1995;3(2): 111-127、及び米国特許第５，０８７，６１６号を参照されたい。特に、本発明は、単離された細胞がＣＡＲを発現するように遺伝子的に改変され、そしてＣＡＲ細胞がそれを必要とする対象に注入される、細胞療法の型を含む。そのような投与は、疾患又は障害の細胞が破壊の標的となるように、標的に特異的な仕方で細胞の活性化（例えば、Ｔ細胞の活性化）を促進することができる。細胞がＴ細胞である場合、ＣＡＲＴ細胞は、抗体療法とは異なり、インビボで複製することができ、その結果、標的化された疾患、障害、又は病態の持続的な制御につながり得る長期持続をもたらす。

本明細書で開示のＣＡＲ発現細胞は、単独か、又は希釈剤、公知の抗癌治療剤、及び／又は免疫刺激性であるサイトカイン若しくは他の細胞集団などの他の成分との組み合わせのいずれかで投与され得る。それらは、一次治療として、二次治療として、三次治療として、又はさらなる治療として投与され得る。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲを発現する細胞は、組み合わせ治療の一部として、別の治療的介入（例えば、抗体又は操作された細胞又はレセプター又は薬剤（例えば、細胞毒性薬剤又は治療薬剤））と任意の順序で、同時に又は順次、投与される。いくつかの実施形態の細胞又は抗体は、１つ以上の追加の治療剤と共に、又は別の治療介入と関連して、任意の順序で同時に又は順次、同時投与される。いくつかの状況において、細胞集団が１つ以上の追加治療薬の効果を増強するか、又はその逆を増強するように、細胞は十分に近い時間に別の治療と同時投与される。いくつかの実施形態では、細胞又は抗体は、１つ以上のさらなる治療剤の前に投与される。いくつかの実施形態では、細胞又は抗体は、抗癌剤などの１つ以上の追加の治療剤の後に投与される。「抗癌」剤は、例えば、癌細胞を殺滅すること、癌細胞のアポトーシスを誘導すること、癌細胞の増殖速度を低下させること、転移の発生率又は数を減少させること、腫瘍サイズを縮小させること、腫瘍成長を阻害すること、腫瘍又は癌細胞への血液の供給を減少させること、癌細胞又は腫瘍に対する免疫応答を促進すること、癌の進行を妨害又は阻害すること、又は癌を有する対象の寿命を増加させることによって、対象中の癌に負の影響を及ぼすことができる。より一般的には、これらの他の組成物は、細胞の増殖を完全に抑えるか、又は阻害するのに有効な組み合わせの量で提供される。このプロセスは、癌細胞と、本発明のＣＡＲを発現する細胞及び薬剤又は複数の因子とを同時に接触させることを含み得る。これは、細胞と両方の薬剤を含む単一の組成物又は薬理学的製剤とを接触させることによって、又は細胞と２つの別個の組成物又は製剤とを同時に接触させることによって達成され得、この場合、一方の組成物は発現コンストラクトを含み、他方は第２の薬剤を含む。

特定の実施形態では、本発明のＨＬＡ−Ｇアイソフォームに抗するＣＡＲを発現する細胞は、ＨＬＡ−Ｇを認識しないが、抗腫瘍及び／又は抗ウイルスＣＡＲ療法などの他のＣＡＲ療法において有用であることが知られている、他のＣＡＲ発現細胞と任意の順序で、同時又は順次になどの組合せ治療の一部として投与される。そのようなＣＡＲ発現細胞は、疾患、好ましくは癌又はウイルス感染に関与する抗原（好ましくは癌治療又はウイルス治療において標的化される抗原）を標的化する。そのような抗原は、ＨＬＡ−Ｇでないことは理解されるであろう。

本発明の文脈では、細胞療法は、化学療法、放射線療法、又は免疫療法介入、並びに免疫チェックポイント阻害剤などのプロアポトーシス又は細胞周期調節剤と併用して同様に使用され得ることが意図される。

或いは、本発明の治療は、数分から数週間の範囲の間隔で、他の薬剤治療に先行しても後続してもよい。他の薬剤及び本発明が個体に別々に適用される実施形態では、薬剤及び本発明の治療が、依然、有利に組み合わされた効果を細胞に及ぼすことができるように、一般に、各送達時間の間で、有意な期間が満了しないことを確実にする。そのような場合には、互いに約１２〜２４時間以内に、より好ましくは互いに約６〜１２時間以内に、両方の様式で細胞と接触し得ることが企図される。いくつかの状況では、しかしながら、治療期間をかなりの程度延長することが望ましい場合があるが、その場合、それぞれの投与の間に、数日（２、３、４、５、６又は７）から数週間（１、２、３、４、５、６、７又は８）が経過する。

治療サイクルは必要であれば反復されると予測される。本発明の細胞治療と組み合わせて、種々の標準的な治療、及び外科的介入が適用され得ることもまた意図される。

標的癌
ＨＬＡ−Ｇは、その場で、多くのヒト固形悪性腫瘍及び悪性造血疾患（乳癌、卵巣癌、腎明細胞癌、結腸直腸癌、胃癌、食道癌、肺癌、肝細胞癌、並びに急性骨髄性白血病及び慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）を含む）で異常発現する。悪性腫瘍におけるＨＬＡ−Ｇの異種発現は、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、胃癌（ＧＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、食道扁平上皮癌（ＥＳＣＣ）、乳癌、肝細胞癌、及びＢ−ＣＬＬの患者の芳しくない臨床転帰と有意に相関する。さらに、血清可溶性ＨＬＡ−Ｇは、正常な健常対照又は良性疾患症例と比較すると、様々なタイプの癌患者（メラノーマ、急性白血病、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、リンパ増殖性疾患、乳癌又は卵巣癌、非小細胞肺癌、食道癌、結腸直腸癌；胃癌及び肝細胞癌の患者を含む）で増加する。

本発明のＣＡＲ発現細胞、核酸コンストラクト、ベクター又は医薬組成物によって治療され得る癌は、血管新生されていないか、又はまだ実質的に血管新生されていない腫瘍、並びに血管新生された腫瘍を含む。

本発明のＣＡＲ発現細胞、核酸コンストラクト、ベクター又は医薬組成物は、舌、口及び咽頭の癌を含む口腔及び咽頭の癌；食道癌、胃癌及び結腸直腸癌を含む消化器系の癌；肝細胞癌及び胆管癌を含む肝臓及び胆管の癌；気管支原性癌、肺癌及び喉頭癌を含む呼吸器系の癌；骨肉腫を含む骨及び関節の癌；メラノーマを含む皮膚の癌；乳癌；女性の子宮癌、子宮内膜癌、卵巣癌、及び子宮頸癌を含む生殖器の癌、男性の前立腺癌及び精巣癌；腎細胞癌及び尿管又は膀胱の移行上皮癌を含む腎臓の管の癌；消化管間質腫瘍、膵臓癌、腎臓癌、結腸癌、子宮頸癌、脳癌（神経膠腫、多形性神経膠芽腫及び髄芽腫を含む）；甲状腺癌、副腎癌及び多発性内分泌腫瘍症候群を伴う癌を含む内分泌系の癌；ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫；Ｂ細胞リンパ腫、単球性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、バーキットリンパ腫、Ｔ及びＢリンパ腫、多発性骨髄腫及び形質細胞腫；急性及び慢性の両白血病、原血球性白血病、急性非リンパ性白血病（ＡＮＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、赤白血病、骨髄性又はリンパ性白血病；及び神経芽細胞腫を含むその他及び不特定の部位の癌を治療するために使用され得る。好ましくは、癌は腎細胞癌（ＲＣＣ）、メラノーマ、腎臓癌及び膀胱癌の群から選択される。

癌は非固形腫瘍（例えば、血液腫瘍、例えば、白血病及びリンパ腫）を含み得るか、又は固形腫瘍を含み得る。本明細書で使用する場合、「固形腫瘍」は、通常、嚢胞又は液体領域を含まない組織の異常な塊である。固形腫瘍には良性のものと悪性のものがある。異なる種類の固形腫瘍は、それらを形成する細胞の種類（肉腫、癌腫、リンパ腫など）に応じて命名される。

肉腫及び癌腫などの固形腫瘍の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、及びその他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ系悪性腫瘍、膵癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞腫脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、精上皮腫、膀胱癌、メラノーマ、及びＣＮＳ腫瘍（神経膠腫（脳幹神経膠腫及び混合膠腫などの）、神経膠芽腫（多形神経膠芽腫としても知られる）星状細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽腫、シュワン腫頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫瘍、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫及び脳転移）が含まれる。

血液癌とは、血液又は骨髄癌のことである。血液の（又は血行性の）癌の例としては、急性白血病を含む白血病（急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病及び骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病及び赤白血病など）、慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、及び慢性リンパ球性白血病など）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（無痛性及び高グレード形態）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、有毛細胞白血病及び骨髄異形成が挙げられる。

いくつかの態様では、癌細胞はＨＬＡ−Ｇを発現又は過剰発現する。特定の実施形態では、癌細胞は、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６及びＨＬＡ−Ｇ７から選択される、好ましくはＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ５又はＨＬＡ−Ｇ６から選択される、より好ましくはＨＬＡ−Ｇ１又はＨＬＡ−Ｇ２から選択される、１〜６の、好ましくは２〜５のＨＬＡ−Ｇアイソフォームを発現又は過剰発現する。

好ましくは、癌細胞は、ＨＬＡ−Ｇ１及び／又はＨＬＡ−Ｇ５を発現又は過剰発現するか；又は癌細胞は、ＨＬＡ−Ｇ２及び／又はＨＬＡ−Ｇ６を発現又は過剰発現する。好ましくは、そのような癌細胞がこれらの特定のＨＬＡ−Ｇアイソフォームを発現する場合、本発明のＣＡＲはそれぞれＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５、又はＨＬＡ−Ｇ２及びＨＬＡ−Ｇ６に特異的に結合する。

診断及び予後診断における使用
本明細書で開示される抗ＨＬＡ−Ｇモノクローナル抗体又はｓｃＦｖはまた、診断方法及び予後方法に有用である。したがって、本発明は、対象のＨＬＡ−Ｇ関連医学的病態の診断における、本明細書で開示される抗体の使用に関する。

本明細書で開示されたモノクローナル抗体又はｓｃＦｖは、ＨＬＡ−Ｇポリペプチドの局在化及び／又は定量に関連する当技術分野で公知の方法（例えば、適切な生理学的試料内のＨＬＡ−Ｇポリペプチドのレベルの測定に使用するため、診断方法に使用するため、ポリペプチドの画像化に使用するためなど）に有用である。本明細書で開示されたモノクローナル抗体又はｓｃＦｖは、細胞を単離するためのウェスタンブロット法、アフィニティークロマトグラフ法、又はフローサイトメトリーベースの細胞分析若しくは細胞選別若しくは免疫沈降などの標準的な手法によってＨＬＡ−Ｇポリペプチドを単離するのに有用である。本明細書で開示されたＨＬＡ−Ｇ抗体は、生物学的試料、例えば、哺乳動物の血清又は細胞からの天然のＨＬＡ−Ｇポリペプチド、及び宿主系で発現された、組換えにより産生されたＨＬＡ−Ｇポリペプチドの精製を容易にし得る。さらに、ＨＬＡ−Ｇモノクローナル抗体又はｓｃＦｖは、ポリペプチド発現の量及びパターンを評価するために、ＨＬＡ−Ｇポリペプチド（例えば、血漿中、細胞溶解物又は細胞上清）を検出するために使用することができる。本明細書で開示されたＨＬＡ−Ｇ抗体は、臨床試験手順の一部として、組織中のＨＬＡ−Ｇレベルをモニターするために、例えば、所与の治療計画の効力を決定するために、診断的に使用され得る。検出は、ＨＬＡ−Ｇ抗体又はそのフラグメントが検出可能に標識されるように、本明細書で開示されたＨＬＡ−Ｇ抗体を検出可能な物質にカップリング（すなわち、物理的に連結）することによって容易にすることができる。「標識された」という用語は、抗体に関して、検出可能な物質を抗体にカップリング（すなわち、物理的に連結）することによる抗体の直接標識、並びに直接標識される別の化合物との反応性による抗体の間接標識を包含することが意図される。間接標識の非限定的な例としては、蛍光標識された二次抗体を用いる一次抗体の検出、及び蛍光標識されたストレプトアビジンで検出され得るように、ビオチンによるＤＮＡプローブの末端標識が挙げられる。

本開示の検出方法は、生物学的試料中のＨＬＡ−Ｇポリペプチドの発現レベルを検出するのに、インビトロ及びインビボで使用され得る。ＨＬＡ−Ｇポリペプチドの検出のためのインビトロ手法には、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、免疫沈降、放射免疫測定法、及び免疫蛍光法（例えば、ＩＨＣ）が含まれる。さらに、ＨＬＡ−Ｇポリペプチドの検出のためのインビボ手法は、標識抗ＨＬＡ−Ｇ抗体を対象に導入することを含む。単なる例として、抗体は、放射性マーカーで標識することができるが、標準的な画像化手法によって対象内でのその存在及び位置を検出することができる。

いくつかの態様では、迅速な結合及び細胞取り込み及び／又は徐放を容易にする構造的改変を含むＨＬＡ−Ｇ抗体は、インビボ画像化検出方法において有用である。いくつかの態様では、ＨＬＡ−Ｇ抗体は、迅速な結合及び細胞取り込み及び／又は徐放を容易にするために、抗体のＣＨ２定常重鎖領域に欠失を含有する。いくつかの態様では、迅速な結合及び細胞取り込み及び／又は徐放を容易にするために、Ｆａｂフラグメントが使用される。いくつかの態様では、迅速な結合及び細胞取り込み及び／又は徐放を容易にするために、Ｆ（ａｂ）’２フラグメントが使用される。

したがって、本発明はまた、対象が、ＨＬＡ−Ｇポリペプチドの発現又は活性の増加（例えば、前癌細胞の検出）に関連する医学的疾患又は病態を発症するリスクがあるかどうかを決定するための予後（又は予測）測定法を提供する。そのような測定法は、ＨＬＡ−Ｇポリペプチドの発現によって特徴付けられるか、又は関連する、医学的疾患又は病態の発症前に個人を予防的に治療するために、予後又は予測の目的で使用することができる。

本開示の別の態様では、対象内でＨＬＡ−Ｇ発現を決定する方法を提供し、それによって、その対象に対する適切な治療又は予防化合物を選択する。

或いは、予後測定法を利用して、癌及び／又は固形腫瘍を有するか、又は発症する展開の危険性がある対象を同定することができる。したがって、本開示は、ＨＬＡ−Ｇアイソフォームの発現レベルの増加に関連する疾患又は病態を同定するための方法であって、対象から試験試料が得られ、ＨＬＡ−Ｇアイソフォームが検出され、対照試料と比較して増加したレベルのＨＬＡ−Ｇポリペプチドの存在が、ＨＬＡ−Ｇアイソフォームの発現レベルの増加に関連する疾患又は病態を有しているか、又は発症の危険性がある対象について予測する方法を提供する。いくつかの態様では、ＨＬＡ−Ｇアイソフォームの発現レベルの増加に関連する疾患又は病態は、進行性の癌及び／又は固形腫瘍からなる群から選択される。

別の実施形態では、本開示は、ＨＬＡ−Ｇ発現の増加に関連する障害又は病態に対して、化合物で対象を効果的に治療できるかどうかを決定する方法であって、対象から生物学的試料が得られ、上記のようにＨＬＡ−Ｇ抗体又はＳｃＦｖを用いてＨＬＡ−Ｇアイソフォームを検出する方法を提供する。対象から得られた生物学的試料中のＨＬＡ−Ｇポリペプチドの発現レベルが決定され、疾患を有さない対象から得られた生物学的試料中に見出されるＨＬＡ−Ｇ発現レベルと比較される。健康な対象から得られた試料と比較して、疾患又は病態を有する疑いのある対象から得られた試料でのＨＬＡ−Ｇのレベルの上昇は、試験された対象のＨＬＡ−Ｇ関連疾患又は病態の指標となる。

ＨＬＡ−Ｇアイソフォームの発現レベルの上昇が、疾患を有する対象が特定のタイプの療法又は治療に応答する可能性が高いかどうかの指標となることが知られている多くの病態が存在する。したがって、生物学的試料中のＨＬＡ−Ｇアイソフォームを検出する方法は、予後の方法として、例えば、対象が療法又は治療に応答する可能性を評価するために使用することができる。

本開示のさらなる態様は、患者がＨＬＡ−ＧＣＡＲ療法に応答する可能性が高いか、又は応答しない可能性が高いかを決定するための方法に関する。特定の実施形態では、この方法は、患者から単離された腫瘍試料を有効量のＨＬＡ−Ｇ抗体と接触させること、及び腫瘍試料に結合した任意の抗体の存在を検出することを含む。さらなる実施形態では、腫瘍試料に結合した抗体の存在は、患者がＨＬＡ−ＧＣＡＲ療法に応答する可能性が高いことを示し、腫瘍試料に結合した抗体の非存在は、患者がＨＬＡ−Ｇ療法に応答しない可能性が高いことを示す。
いくつかの実施形態では、本方法は、ＨＬＡ−ＧＣＡＲ療法に応答する可能性が高いと判定された患者に有効量のＨＬＡ−ＧＣＡＲ療法薬を投与する追加の工程を含む。

本開示のさらなる態様は、患者が、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６及びＨＬＡ−Ｇ７から選択される、好ましくはＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ５又はＨＬＡ−Ｇ６から、より好ましくはＨＬＡ−Ｇ１又はＨＬＡ−Ｇ２から、さらにより好ましくはＨＬＡ−Ｇ１及びＧ５又はＨＬＡＧ−２及びＧ６から特に選択される腫瘍によって発現されるアイソフォームに依存して、患者がＨＬＡ−ＧＣＡＲ療法に応答する可能性が高いか、又は応答しない可能性が高いかを決定するための方法に関する。治療前のＨＬＡ−Ｇ発現アイソフォームの同定により、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６及びＨＬＡ−Ｇ７から、好ましくはＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ５又はＨＬＡ−Ｇ６から、より好ましくはＨＬＡ−Ｇ１又はＨＬＡ−Ｇ２から選択される１〜６個、好ましくは２〜５個のＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的に結合する、さらにより好ましくはＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５アイソフォーム、又はＨＬＡ−Ｇ２及びＨＬＡ−Ｇ６アイソフォームの両方に結合する、最も適切なＣＡＲの選択（細胞療法などの効率的な治療に使用するための）が可能になる。

キット
本明細書に記載の組成物のいずれもが、本発明によって提供されるキットに含まれ得る。したがって、キットは、適切な容器手段中に、本発明の組換え／操作された細胞、及び／又は本発明の核酸コンストラクトをコードするベクター、及び／又は本発明の核酸コンストラクト若しくは関連試薬を含む。いくつかの実施形態では、キットは、癌又は感染症を治療するための追加の薬剤をさらに含み、追加の薬剤は、核酸コンストラクト若しくは細胞又は本発明のキットの他の要素と組み合わせてもよく、或いはキット中で別々に提供されてもよい。いくつかの実施形態では、個体から試料を採取する、及び／又は試料を分析する手段は、キット中に提供され得る。ある実施形態では、キットは例えば、細胞、緩衝液、細胞培地、ベクター、プライマー、制限酵素、塩などを含む。キットはまた、滅菌された、薬学的に許容される緩衝液及び／又は他の希釈剤を含有するための手段を含み得る。

キットの要素は、水性媒体中又は凍結乾燥形態でパッケージ化し得る。キットの容器手段は一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジ又は他の容器手段を含み、その中に、要素が配置され得、そして好ましくは、一定分量に適切に分割されているであろう。キット中に２つ以上の要素が存在する場合、そのキットはまた、一般に、第２、第３、又は他の追加の容器を含み、その中に追加の要素が別々に配置され得る。しかしながら、要素の様々な組み合わせを１つのバイアル中に含めてもよい。そのような容器は、所望のバイアルが保持される射出成形又はブロー成形プラスチック容器を含み得る。また、本発明のキットは、典型的には商業的に販売するために、要素を閉じ込めて収容するための手段を含むであろう。そのような容器は、所望のバイアルが保持される射出成形又はブロー成形プラスチック容器を含み得る。

キットの要素が１つ及び／又はそれ以上の液体溶液で提供される場合、液体溶液は水溶液であり、滅菌水溶液が特に好ましい。組成物はまた、シリンジ適合性組成物に製剤化され得る。この場合、容器手段がそれ自身、シリンジ、ピペット、及び／又は他のそのような器具であってもよく、それから、製剤は体の感染領域に適用され、動物に注射され、及び／又はキットの他の要素に適用され、及び／又は混合されてもよい。しかしながら、キットの要素は、乾燥粉末として提供されてもよい。試薬及び／又は要素が乾燥粉末として提供される場合には、適切な溶媒の添加によって粉末を再構成することができる。溶媒はまた、別の容器手段の中に提供されることが想定されている。

本発明の特定の実施形態では、細胞治療に使用される細胞はキットで提供され、場合によっては、細胞が実質的にキットの唯一の要素である。キットは、所望の細胞を作製するための試薬及び材料を含み得る。特定の実施形態では、試薬及び材料は、所望の配列を増幅するためのプライマー、ヌクレオチド、適切な緩衝液又は緩衝試薬、塩などを含み、いくつかの場合には、試薬は、本明細書に記載のＣＡＲをコードするベクター及び／又はＤＮＡ、及び／又はそのための調節エレメントを含む。

特定の実施形態では、キット中には、個体から１つ以上の試料を抽出するのに適した１つ以上の器具が存在する。器具は、シリンジ、メスなどであり得る。

本発明のいくつかの場合で、キットは、細胞療法の実施形態に加えて、例えば、化学療法及び／又は免疫療法などの第２の癌療法も含む。キットは、特定の癌に合わせて個体用に調製され得、本明細書で上記したように、個体用のそれぞれの第２の癌療法を含む。

実施例
結果
抗ＨＬＡ−Ｇ抗体パラトープの特異性
ＨＬＡ−Ｇの異なるアイソフォームは、β２Ｍ及びペプチドに会合しているか否かにかかわらず、１〜３個の球状ドメインを含有して発現され得ることは以前に記載した。異なる特異的抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、ＨＬＡ−Ｇの異なる領域又は「エピトープ」に対して以前に作製されていた。抗ＨＬＡ−Ｇモノクローナル抗体の特異性は、以前にＨＬＡ−Ｇの異なるアイソフォームに対して決定されていた。簡潔に言えば、図２Ａに示すように、１５Ｅ７抗体はＨＬＡ−Ｇ１／５ β２Ｍフリー及びＨＬＡ−Ｇ６に対して高い親和性を提示し、このＭａｂがβ２Ｍに会合しないＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的であることを示している。図２Ｂに示すように、Ｋ５６２ＨＬＡ−Ｇ１ｐは、ＨＬＡ−Ｇ β２Ｍ−会合アイソフォームに特異的なＭＥＭ−Ｇ／０９モノクローナル抗体と比較して、１５Ｅ７モノクローナル抗体での染色後に、Ｋ５６２ＨＬＡ−Ｇ１Ｌｖよりも高い割合のＨＬＡ−Ｇ β２Ｍ−フリーを提示する（データは示さず）。同様に、１５Ｅ７の特異性をＪｕｒｋａｔｗｔ、ＪｕｒｋａｔＨＬＡ−Ｇ１Ｌｖ及びＪｅｇ−３細胞株に対して評価したところ、図２Ｂに示すように、１５Ｅ７モノクローナル抗体は、ＨＬＡ−Ｇ β２Ｍフリーアイソフォームに対して高い親和性を提示することが示された。

ＬＦＴＴ−１モノクローナル抗体の特異性を、同じ実験を行って決定した。１５Ｅ７抗体とは異なり、ＬＦＴＴ−１抗体は、β２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇアイソフォーム及び染色されたＫ５６２ＨＬＡ−Ｇ１Ｌｖ、ＪｕｒｋａｔＨＬＡ−Ｇ１Ｌｖ及びＪｅｇ−３細胞株に対して高度に特異的であり、これは図２Ｃに示されている。

ＣＡＲコンストラクトの検証
１５Ｅ７及びＬＦＴＴ−１モノクローナル抗体パラトープに基づいて、ＨＬＡ−Ｇに対する２つの異なるキメラ抗原レセプターを作製した。既に報告されている（Pule et al. 2005 Molecular Therapy）第３世代のＣＡＲに対応したＣＡＲの設計は、シグナルペプチド、１５Ｅ７若しくはＬＦＴＴ−１のいずれかのｓｃＦｖ、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）を含むか、若しくはそれらからなるスペーサードメイン；（ｉ）ＣＤ８ａ若しくはＣＤ２８ヒンジ、（ｉｉ）ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン、（ｉｉｉ）ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン及びＣＨ３ヒトＩｇＧ４ドメイン、又は（ｉｖ）変異ＣＨ２ヒトＩｇＧ４ドメイン、ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン及びＣＨ３ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン；、ＣＤ２８膜貫通領域、並びに４−１ＢＢとＣＤ３ζの２つの共活性化セグメントから構成される。図３はＣＤ８ａ又はＣＤ２８ヒンジドメインを有する１５Ｅ７及びＬＦＴＴ−１に基づくＣＡＲ構造の概略設計の要約であり、図４は、切断可能リンカーＰ２Ａ及びレポーターとしての切断型ｈＣＤ１９を有する１５Ｅ７及びＬＦＴＴ−１に基づくＣＡＲ構造の概略設計の要約である。

異なるエフェクター宿主細胞：Ｊｕｒｋａｔ細胞株（ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞）及びＮＫＴ１．２（マウスｉＮＫＴ）にＣＡＲコンストラクトを移植し、ＣＡＲ表面発現をフローサイトメトリー及び免疫蛍光顕微鏡法により評価した。ＪｕｒｋａｔＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７の８７．６％及びＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１ＣＡＲ形質導入細胞の８３．２％が、その表面にキメラレセプターを発現し、これは抗ＦＬＡＧ抗体によって検出され、エフェクター細胞がＣＡＲコンストラクトを強く発現したことを示している（図５Ａ）。同様に、ＮＫＴ１．２ＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７及びＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１ＣＡＲは、それぞれ８５．２％及び８５．１％が抗ＦＬＡＧ抗体で染色されたため、それらの表面でＨＬＡ−ＧＣＡＲを強く発現した。図５Ｂに示すように、ＣＡＲ細胞の表面発現は、免疫蛍光顕微鏡によっても決定した。

活性化アッセイ：ＣＡＲ／ＨＬＡ−Ｇ１相互作用による膜獲得
免疫細胞は、ＡＰＣ又は腫瘍細胞抗原−提示細胞などの標的細胞から細胞表面膜パッチを獲得することが以前に実証された。エフェクター細胞による標的細胞からの膜獲得は、（ｉ）細胞間接触を必要とし、（ｉｉ）迅速であり、且つ（ｉｉｉ）獲得側細胞の活性化状態に依存する能動的プロセスであり、獲得側細胞の活性化状態は、（ｉｖ）エフェクター細胞の抗原特異的活性化を反映する。従って、膜転移は、機能的に成熟した免疫細胞の活性化に関連している。

これらの原理に基づいて、標的対象：ＨＬＡ−Ｇ分子に直面したときのエフェクター細胞の活性化度を決定するための試験を設計した。実験はＪｕｒｋａｔＴ細胞株をエフェクター細胞及び標的細胞として使用することによって設定し、これはバイスタンダータンパク質相互作用を回避することを可能にした。これは、細胞間接触はＣＡＲ−抗原相互作用によってのみ媒介されることを意味する。抗ＨＬＡ−ＧＣＡＲで遺伝子導入された細胞のみが活性化されることが予想され、したがって、図６Ａに示されるように、標的細胞でチャレンジされた場合、膜獲得を示すであろうが、対照細胞（Ｊｕｒｋａｔｗｔ）では非常に低いか又は膜転移を示さない。

ＨＬＡ−Ｇ形質導入Ｊｕｒｋａｔ標的細胞上で主に発現されるアイソフォームを特徴付けるために、ＨＬＡ−Ｇアイソフォーム発現を、抗ＨＬＡ−Ｇ β２Ｍ会合ＭＥＭ−Ｇ／０９抗体及び抗ＨＬＡ−Ｇ−α３ β２Ｍフリー１５Ｅ７抗体を用いてフローサイトメトリーにより測定した。図６Ｂは、ＪｕｒｋａｔＨＬＡ−Ｇ１標的細胞がβ２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇ１アイソフォームのみを発現し、１５Ｅ７染色後に染色が観察されないことを示し、このことは、ＨＬＡ−Ｇ−α３ β２Ｍフリーアイソフォームが発現されないことを意味する。

次いで、膜転移のレベルを評価し、そうでなければ、標的にチャレンジされたエフェクター細胞の活性化の程度を評価した。ＪｕｒｋａｔＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７及びＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１ＣＡＲ細胞において、それらが対照のＪｕｒｋａｔｗｔに直面したとき、膜獲得はそれぞれ５．９１％及び５．３８％であった。しかし、標的細胞上に発現されるＨＬＡ−Ｇアイソフォーム（ＨＬＡ−Ｇ１Ｂ２Ｍ会合）の性質を考慮すると、ＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１ＣＡＲのみがエフェクター細胞に特異的に結合し、エルゴ活性化することが期待される。実際、ＪｕｒｋａｔＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１ＣＡＲ取得は、２１．７％まで増加したが、ＪｕｒｋａｔＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７ＣＡＲ活性化は５．６％に留まった。これらの結果を図６Ｃに示す。

その後、対照である非特異的細胞：Ｊｕｒｋａｔｗｔ細胞株にベースラインを設定した「活性化指標」比に基づき、特定の標的細胞によりチャレンジされたＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７ＣＡＲ及びＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１ＣＡＲ細胞の活性化度を検討した。図６Ｄに示すように、ＪｕｒｋａｔＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１ＣＡＲは、ＪｕｒｋａｔＨＬＡ−Ｇ１Ｌｖによりチャレンジされると３倍超活性化する。しかし、Ｊｕｒｋａｔ対照でチャレンジされた場合、活性は増加せず、非特異的標的（Ｊｕｒｋａｔｗｔ及びＪｕｒｋａｔＨＬＡ−Ｇ１Ｌｖ）でチャレンジされた場合、ＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７ＣＡＲ細胞も活性化されない。

最後に、ＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７ＣＡＲ及びＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１ＣＡＲコンストラクトの特異性及び生物活性を確認するために、他の免疫細胞サブセットの活性化状態を評価した。図７Ａに示すように、ＪｕｒｋａｔＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７ＣＡＲは、Ｋ５６２ｗｔ細胞を対照として使用し、特異的標的：Ｋ５６２ＨＬＡ−Ｇ１ｐ（ほとんどの場合、ＨＬＡ−Ｇのβ２Ｍフリーアイソフォームを発現する）によりチャレンジされた。再度、３倍超の活性の増加が認められた。また、ＮＫＴ１．２ＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７及びＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１ＣＡＲ細胞を試験し、Ｊｅｇ−３（ヒト絨毛癌細胞、β２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇ１アイソフォームを発現する）でチャレンジした。図７Ｂに示すように、ＮＫＴ１．２ＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７又はＮＫＴ１．２対照細胞と比較してＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１ＣＡＲ細胞のみが、有意に活性化された。

ＨＬＡ−ＧＣＡＲＴ細胞の細胞溶解機能及びＩＦＮ−γ分泌
エフェクター細胞を発現する１５Ｅ７及びＬＦＴＴ−１ＣＡＲの細胞毒性機能を、ＪＥＧ−３、Ｋ５６２及びＫ５６２−ＨＬＡ−Ｇ１トランスフェクト細胞株に対して評価した（図８及び９）。そうするために、標的細胞をＣＦＳＥで標識した後、示されたエフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ）でＣＡＲ−Ｔ細胞と２４時間、共培養した。共インキュベーションの２４時間後、培地を回収してＩＦＮ−γ分泌を測定し、細胞を回収してフローサイトメトリーにより標的細胞溶解を調べた。

使用したヒンジとは無関係に、Ｋ５６２細胞は、その表面でＨＬＡ−Ｇタンパク質を発現しなかったので、Ｋ５６２細胞株は抗ＨＬＡ−ＧＬＦＴＴ−１及び１５Ｅ７ＣＡＲ−Ｔ細胞によって溶解されなかった（図８Ａ）。Ｋ５６２−ＨＬＡ−Ｇ１Ｐ細胞株は、β２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇ１アイソフォーム及びβ２Ｍフリーアイソフォームの両方をそれらの表面で発現し（それぞれ図２Ｂ及び２Ｃ）、活性化されているが形質導入されていないＴ細胞と比較して、１０：１のＥ：Ｔ比でＬＦＴＴ−１及び１５Ｅ７ＣＡＲ−Ｔ細胞によってほぼ完全に溶解された。ＩｇＧ４＋ＣＨ３ヒンジ１５Ｅ７ＣＡＲ−Ｔ及びＬＦＴＴ−１細胞は、それらのＩｇＧ４又はＩｇＧ４＋ｍＣＨ２−ＣＨ３対応物と比較して、わずかに低い効率を示した。ＣＤ１０７ａの発現は、その細胞毒性機能に応じてエフェクターＣＡＲ−Ｔ細胞上で決定された（図８Ｂ）。ＪＥＧ−３細胞株のみが、β２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇ１アイソフォームを発現しており（図２Ｃ）、ＬＦＴＴ−１ＣＡＲ−Ｔ細胞はＪＥＧ−３腫瘍細胞を溶解することができた（図８Ａ）。ＣＤ１０７ａの発現は、ＬＦＴＴ−１ＣＡＲ−Ｔセルのみで決定された（図８Ｂ）。

図９に示すように、ＨＬＡ−ＧネガティブＫ５６２細胞株に対しては、ＬＦＴＴ−１及び１５Ｅ７ＣＡＲ−Ｔ細胞でＩＦＮ−γの分泌は測定されなかったが、Ｋ５６２−ＨＬＡ−Ｇ１Ｐ細胞株とのインキュベーション後、両ＣＡＲ−Ｔ細胞は強くＩＦＮ−γを分泌する。ＪＥＧ−３細胞株に対しては、ＬＦＴＴ−１ＣＡＲ−Ｔ細胞のみがＩＦＮ−γを分泌しており、ＪＥＧ−３細胞の溶解と一致しており、また、ＬＦＴＴ−１ＣＡＲ−Ｔ細胞上のＣＤ１０７ａ細胞の表面発現と一致している（図８）。

ＮＧＳマウスでのインビボ実験
ＨＬＡ−ＧＣＡＲ−Ｔ細胞のインビボでの機能を調べるために、ルシフェラーゼ（Ｋ５６２−ＨＬＡ−Ｇ１Ｐ−ｌｕｃ）を発現するＫ５６２−ＨＬＡ−Ｇ１Ｐ腫瘍細胞をＮＧＳマウスにインプラントした後、ＨＬＡ−ＧＣＡＲ−Ｔ細胞を接種し、ＨＬＡ−Ｇ腫瘍細胞に対するＨＬＡ−ＧＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞毒性をモニターした（図１０）。

そうするために、活性化された対照細胞及びＨＬＡ−ＧＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を、以前に記載されたように作製した。簡単に述べると、ヒトＴ細胞を選別し、活性化し、次いで１５Ｅ７−ＩｇＧ４ヒンジ−ＣＡＲ又はＬＦＦＴ１−ＩｇＧ４ヒンジ−ＣＡＲコンストラクトのいずれかで形質導入又は非導入とし、形質導入後９日目まで培養液中で維持し、インビボ実験前に休止状態に戻した。

次に、Ｋ５６２−ＨＬＡ−Ｇ１Ｐ−ｌｕｃ細胞の静脈内接種の２４時間前に１８匹のＮＧＳ雌マウスに放射線を照射した。Ｋ５６２−ＨＬＡ−Ｇ１細胞接種後３日目に、以下に対応して６匹のマウスの３つの群とした：（ｉ）１．１０６個の活性化したが形質導入されていないヒトＣＤ８Ｔ細胞（対照群）を６匹のマウスに接種した、（ｉｉ）１．１０６個の１５Ｅ７−ＩｇＧ４−ＣＡＲ−Ｔ細胞を６匹のマウスに接種した、及び（ｉｉｉ）１．１０６個のＬＦＴＴ１−ＩｇＧ４−ＣＡＲ−Ｔ細胞を６匹のマウスに接種した。次に、Ｋ５６２−ＨＬＡ−Ｇ１Ｐ−ｌｕｃ腫瘍増殖をモニターし、Ｔ細胞対照に対するＨＬＡ−ＧＣＡＲＴ細胞の細胞毒性を評価した。

材料及び方法
細胞株
Ｊｕｒｋａｔ細胞株は、ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションＴＩＢ−１５２）から購入したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞である。Ｊｕｒｋａｔ細胞株に、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１、又はＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７ＣＡＲレンチウイルスそれぞれを形質導入した。Ｊｕｒｋａｔｗｔ及びＪｕｒｋａｔ形質導入細胞株を、２ｍＭＬ−グルタミン、１ｍｇ／ｍｌのペニシリン及びストレプトマイシン（Gibco）、並びに１０％熱不活化ＦＣＳ（Invitrogen）を添加したＲＰＭＩ１６４０（Invitrogen）で培養した。

ＮＫＴ１．２は、Kronenberg博士によって親切にも提供されたハイブリドーママウス細胞株である。これらはまた、それぞれＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１又はＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７ＣＡＲレンチウイルスのいずれかで形質導入し、１ｍｇ／ｍｌのペニシリン及びストレプトマイシン（Gibco）を添加したX-Vivo 10（Lonza）で培養した。

Ｋ５６２細胞は、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection CCL-243）から購入したヒト白血病細胞である。Ｋ５６２ｗｔ細胞をＨＬＡ−Ｇ１をコードするベクターでヌクレオフェクションすることにより、Ｋ５６２−ＨＬＡ−Ｇ１ｐ細胞を得、ＨＬＡ−Ｇ１をコードするレンチウイルスの形質導入により、Ｋ５６２−ＨＬＡ−Ｇ１Ｌｖ細胞を得た。２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍｇ／ｍｌのペニシリン及びストレプトマイシン（Gibco）、並びに１０％の熱不活性化ＦＣＳ（Invitrogen）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Invitrogen）中で、これらの細胞株を培養した。

Ｊｅｇ−３細胞株は、ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションＨＴＢ−３６）から購入したヒト絨毛癌細胞である。これらを、１ｍｇ／ｍｌのペニシリン及びストレプトマイシン（Ｘ）、並びに１０％熱不活化ＦＣＳ（Invitrogen）を添加したＭＥＭ（Ｘ）で培養した。

ＨＬＡ−Ｇ−ＣＡＲＪｕｒｋａｔ細胞
ＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１及びＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７ＣＡＲコンストラクトを、既に説明したように作製した［７］。簡単に説明すると、抗ＨＬＡ−Ｇ認識ドメインは、ＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍ会合特異的抗体ＬＦＴＴ−１又はＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍを含まない特異的抗体１５Ｅ７に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。ＩｇＧ１ヒンジ領域に由来する短いスペーサーを使用して、このｓｃＦｖを膜貫通ドメインに連結させた。ＨＬＡ−ＧＣＡＲ内部ドメインは、ＣＤ２８、ＯＸ４０、及びＣＤ３ζ活性化分子の融合によって構成されていた。ＣＡＲコンストラクトを、ＣＭＶ前初期プロモーター下で、特定のプライマーを用いたＰＣＲによる抽出後、消化／ライゲーションによってｐＴｒｉｐプラスミドベクターにクローン化した。ＭａｂのｓｃＦｖの軽鎖及び重鎖をコードするアミノ酸配列は、ＬＦＴＴ−１については配列番号１（ＶＨ）、２（ＶＬ）及び３１（ｓｃＦＶ）に、１５Ｅ７については配列番号３（ＶＨ）、４（ＶＬ）及び３０（ｓｃＦＶ）に詳述されている。ＣＡＲ配列は、１５Ｅ７ＣＡＲについては、配列番号８３及び８４（それぞれアミノ酸配列及び核酸コード配列）に開示され、ＬＦＴＴ−１ＣＡＲについては、配列番号８５及び８６（それぞれアミノ酸配列及び核酸コード配列）に開示される。

ＨＬＡ−ＧＪｕｒｋａｔ細胞
ＨＬＡ−Ｇを発現する安定したＪｕｒｋａｔ細胞株を、形質導入によって作製し、レンチウイルス粒子を次のように作製した：Zhao et al.［３８］に従ってネイティブＨＬＡ−Ｇ１ｃＤＮＡ（ＮＭ＿００２１２７．５）修飾Ｋ３３４Ａ及びＫ３３５Ａに対応する特定の配列を、ＣＭＶ前初期プロモーター下で、特定のプライマーを用いたＰＣＲによる抽出後、消化／ライゲーションによってｐＴｒｉｐプラスミドベクターに個別にクローン化した。

レンチウイルスベクター
ＨＩＶ−１由来のベクター粒子を、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）と組換えプラスミドｐＴＲＩＰ、ＶＳＶ由来の糖タンパク質をコードするエンベロープ発現プラスミド、Indiana血清型糖タンパク質、及びｐ８．７４キャプシド形成プラスミドのリン酸カルシウム共トランスフェクションによって作製した。ウイルスストックを、形質導入ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞からの細胞溶解物のリアルタイムＰＣＲによって漸増し、１ｍｌ当たりの形質導入単位（ＴＵ）として表した。ＪｕｒｋａｔＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１、ＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７ＣＡＲ細胞、及びＪｕｒｋａｔＨＬＡ−Ｇを作製するために、１×１０^５のＪｕｒｋａｔ細胞を、５００μｌのｃＲＰＭＩ培地及び１０^６ＴＵ（２９３Ｔ）のＴｒｉｐＣＭＶ−ＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１−ＣＡＲ、ＴｒｉｐＣＭＶ−ＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７−ＣＡＲ、又はＴｒｉｐＣＭＶ−ＨＬＡ−Ｇベクターそれぞれを含む１２ウェルプレートに播種した。細胞を３７℃で１時間培養し、次いで、３７℃、１２００ｇで１時間遠心分離した。その後、１ｍｌのｃＲＰＭＩ培地を添加し、３７℃で培養した。２週間後、陽性細胞を抗ＨＬＡ−Ｇ抗体を使用したフローサイトメトリーで選別した。ＨＬＡ−Ｇの発現を、ＪｕｒｋａｔＨＬＡ−ＧＣＡＲ活性化アッセイの前にフローサイトメトリーによって評価した。同じ手順を行い、Ｋ５６２ＨＬＡ−Ｇ１Ｌｖ及びＮＫＴ１．２ＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１ＣＡＲ又はＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７ＣＡＲ細胞を得た。

フローサイトメトリー
eBiosciences（Paris; France）からのＰＥ結合マウスＩｇＧ１（クローンP.3.6.8.2.1. 12-4714）、BD BiosciencesからのＦＩＴＣ結合ラットＩｇＧ２ａ（クローン：R35-95 553929, Le Pont de Claix; France）及びＭＥＭ−Ｇ／０９（Exbio, Praha）。フローサイトメトリーは、対応する細胞株をモノクローナル抗体と共にＲＴで１時間インキュベートし、２回洗浄し、ＰＥ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（405307、Biolegend, USA）と共にＲＴで３０分間インキュベートした。フローサイトメトリー分析は、LSR FORTESSA（Beckton Dickinson, Le Pont-de-Claix, France）を用いて実施し；データはFlowJo Xソフトウェア（Tree star, Ashland, USA）を用いて分析した。ポジティブ標識集団の％は、アイソタイプ対照の９９％によって示されるものよりも高い染色強度を有するものとして定義した。

活性化分析
ＪｕｒｋａｔＨＬＡ−ＧＣＡＲエフェクター細胞及びＪｕｒｋａｔ又はＪｕｒｋａｔＨＬＡ−Ｇ１腫瘍細胞のいずれかを、製造業者の仕様に従って、ＰＫＨ２６及びＰＫＨ６７蛍光色素（Sigma）でそれぞれ標識した。

トロゴサイトーシス原理に基づく活性化分析のために、以前に報告されているように［Caumartin J et al,(2007)Trogocytosis-based generation of suppressive NK cells,EMBO J 26:1423-33］、ＪｕｒｋａｔＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１又はＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７ＣＡＲ（「アクワイアラー(acquirer)」細胞）を、Ｊｕｒｋａｔ又はＪｕｒｋａｔＨＬＡ−Ｇ１細胞（「ドナー」細胞）と、１：１のエフェクター−腫瘍比で、２×１０^６細胞／ｍＬの総濃度で、３７℃、５％ＣＯ_２加湿インキュベーター中で１時間共培養した。共インキュベーションの終わりに、細胞を氷上に置き、全てのさらなる工程を４℃未満で行った。ＣＡＲエフェクター細胞による腫瘍細胞膜の獲得をフローサイトメトリーで調べた。

ベクターの作製
ベクタープラスミドｐＴＲＩＰ（血清型インディアナ（ＩＮＤ）であるＶＳＶ由来の糖タンパク質をコードする）及び組み込みレンチウイルスベクター粒子（ＩＬＶ）の作製のためのｐ８．７４カプシド化プラスミドと、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）との一過性リン酸カルシウム同時遺伝子導入によって、ＨＩＶ−１由来のベクター粒子を作製した。ベクター遺伝子導入能力は、以前に報告されているように（Coutant, F., et al., PLoS One, 2008. 3(12): p. e3973）、２９３Ｔ細胞の形質導入後の定量的ＰＣＲによって決定し、ベクターの形質導入単位（ＴＵ）／ｍＬで表した。

Ｔ細胞の単離と活性化
フィコールの単離後、３人の異なる健康なドナー（EFS、Rungis）の血液試料からＰＢＭＣを抽出した。Ｔ細胞を、カラム精製（Miltenyi）によって選別し、ＣＤ３＋ＣＤ２８＋被覆マイクロビーズ（Miltenyi）で活性化し、次いで、１０％ＦＣＳ１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Gibco）、５０μＭベータ−メルカプトエタノール（Gibco）、非必須アミノ酸、１０ｍＭ Hepes（Gibco）及び１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Gibco）を補充したRPMI 1640 Glutamax（Gibco）中、３７℃、５％ＣＯ_２で４８時間培養した。次に、細胞を洗浄し、ゆっくりと振盪しながら４時間、１Ｍ／ｍｌの２００μｌ中、ＭＯＩ２０のレンチウイルスベクターで形質導入した。次いで、細胞をＵ底９６ウェルプレートに移した。２４時間後、細胞を１．１０^６細胞／ｍｌに調整し、５０Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ２を添加した（Preprotech）。２〜３日毎に、細胞を計数し、ＩＬ２を含む完全培地中で１．１０^６細胞／ｍｌに調整した。８日後、細胞を機能分析に使用した。

細胞毒性分析及び活性化プロファイル
ＪＥＧ−３、Ｋ５６２及びＫ５６２−ＨＬＡ−Ｇ１標的細胞について細胞毒性分析を行った。

簡潔に言えば、分析の２４時間前に、３．１０^５個のＪＥＧ−３細胞を１／１０，０００でＣＦＳＥ（CellTrace, Thermofisher）により標識し；３．１０^５個のＫ５６２又は３．１０^５個のＫ５６２−ＨＬＡ−Ｇ１細胞を１／２０，０００希釈でＣＦＳＥにより標識した。次いで、標的細胞をＵ底９６ウェルプレートに蒔いた。ＣＡＲＴ細胞を１ｘＰＢＳ（Gibco）中で洗浄した後、示されたエフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ）で標的細胞と共培養した。

共インキュベーションの２４時間後、培地を回収し、細胞をＰＢＳ−ＥＤＴＡ０．１％中に回収した（ＪＥＧ−３の場合は引きはがした）。洗浄後、製造業者の推奨に従い、ＣＤ４（クローンＳＫ３Ｐｅｒｃｐ、BD Pharmingen）、ＣＤ８（クローンＳＫ１ＰＥ−Ｃｙ７、Biolegend）、ＣＤ１９（クローンＬＴ１９ＦＩＴＣ又はＰＥ、Miltenyi）、ＣＤ２５（クローンＭ−Ａ２５１ＢＶ４２１、BD Horizon）、ＣＤ６９（クローンＦＮ５０ＢＶ７１１、BD Horizon）、ＰＤ−１（クローンＥＨ１２．２Ｈ７ＡＰＣ、Biolegend）及びLive/dead（ｅＦｌｕｏｒ７８０、Thermofisher）に対する抗体で細胞を標識した。Attuneサイトメーター（Thermofisher）を用いて獲得し、FlowJoソフトウェアにより結果を分析した。

ＩＦＮγ分泌分析
ＩＦＮγの定量は、製造業者の説明書に従って、ＣＢＡキット（BD Biosciences）を用いて共培養培地上で直接行った。

脱顆粒分析
共培養細胞を、以前の記載のように調製し（Ｅ：Ｔ比１０）、抗ＣＤ１０７ａ（クローンＨ４Ａ３ＰＥ、Biolegend）を、共培養物に直接添加した。共インキュベーションの１時間後、モネンシン（GolgiStop, BD Bioscience）を添加した。共インキュベーション実験の５時間後に細胞を回収し、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９及びLive/dead抗体で標識した。Attuneサイトメーターを用いて獲得し、FlowJoソフトウェアにより結果を分析した。

インビボ実験
ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒγｃ欠損（ＮＳＧ）マウス（６〜８週齢、The Jackson laboratory, Sacramento, CA, USA）を照射（２．５Ｇｙ）し、Ｋ５６２−ＨＬＡ−Ｇ１Ｐ（１．１０６個／マウス）の腫瘍細胞を発現する適切な数のルシフェラーゼを静注した。Ｋ５６２−ＨＬＡ−Ｇ１Ｐ−Ｌｕｃモデルには、３日目にＴ細胞（形質導入されていないもの、されたもの）を尾静脈に注射した。移植後１７日目まで３〜４日毎にインプラントをモニターし、次いでＢＬＩ測定によって週１回モニターした：マウスは、画像化（IVIS Lumina Series III、Perkin Elmer、Massachusetts、USA）の１０分前以内に３ｍｇのルシフェリン（VivoGlo Luciferin、＃Ｐ１０４３、Promega、Wisconsin、USA）の腹腔内投与を受けた。

統計分析
データは平均値＋／−標準偏差（ＳＤ）として表す。スチューデントのｔ検定を使用して、０．０５未満のＰ値が有意であると見なした。代表的な実験を示す図では、エラーバーは３連のＳＤを表す。

結論
ＣＡＲ免疫療法の基本的な開発基準は、適正な腫瘍関連抗原の特定、遺伝子導入エフェクター細胞の接近性、免疫抑制性腫瘍微小環境の可逆性であることを考えると、ＨＬＡ−Ｇは、この目的のための非常に興味深い候補であることは明らかであるように思われる。ＨＬＡ−Ｇは、免疫調節に重要な役割を果たすことからＩＣＰと考えられ、この分子が多様な起源の多数の腫瘍滲出液中に発現していることも広く報告されていて、それに対する細胞性又は体液性応答はこれまで報告されていない。さらに、ＨＬＡ−Ｇは特異な分子であり、その機能は特徴づけられているが、そのタンパク質構造は非常に複雑で不均一であることが判明している。したがって、ＨＬＡ−Ｇ機能を阻害するには、単に１つのアプローチだけでは十分ではないだろう。

本明細書では、抗ＨＬＡ−Ｇモノクローナル抗体（Ｍａｂ）のｓｃＦｖを用いてＨＬＡ−Ｇに向かうものと、ＨＬＡ−Ｇアイソフォームの大部分、すなわち古典的ＨＬＡアイソフォーム及びより小さいβ２Ｍフリーアイソフォームを狙う分子の異なるエピトープに向かうものと、２つのＣＡＲを作製することを提案する。したがって、ＨＬＡ−Ｇ免疫抑制アイソフォームを発現する細胞のほとんどを排除することが期待される。本発明の核酸コンストラクトで形質導入されたエフェクター細胞を作製し、これらのＣＡＲ分子は細胞表面で高度に発現され、生物学的機能性を有する。また、抗ＨＬＡ−ＧＣＡＲＮＫＴ細胞を作製した。ＮＫＴ細胞は、Ｔ又はＮＫカウンターパートよりもＣＡＲ療法のためのより良い免疫細胞であることが以前に報告された。さらに、ＣＡＲＮＫＴ細胞は、より高い効率で固形腫瘍に浸潤することが示された。固形腫瘍細胞は、ＨＬＡ−Ｇを高度に発現するため（Paul et al. 1999 Cancer Research, Rouas-Freiss et al. 2007 Semin Cancer Biol, Yaghi et al. 2016 Oncotarget）、抗ＨＬＡ−ＧＮＫＴＣＡＲは、ＨＬＡ−Ｇに連結された免疫抑制環境を回避する革新的な方法であり得ると思われる。

要約すると、本発明の第３世代組換えコンストラクトＣＡＲは、（ｉ）形質導入細胞の表面上で正しく発現されること、（ｉｉ）各ＣＡＲすなわちＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７ＣＡＲ及びＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１ＣＡＲは、それぞれ、ＨＬＡ−Ｇ β２Ｍフリー又はβ２Ｍ会合免疫抑制アイソフォームに特異的であること、及び（ｉｉｉ）ＨＬＡ−Ｇに対するＣＡＲを発現するエフェクター細胞は、適切に活性化されることが、本明細書で実証された。

Claims

抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）であって、１〜６個のＨＬＡ−Ｇアイソフォーム、好ましくは２〜５個のＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的に結合する、ＣＡＲ。
β２ＭフリーＨＬＡ−Ｇアイソフォーム又はβ２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的に結合する、請求項１に記載のＣＡＲ。
ＨＬＡ−Ｇのアルファ１ドメインに結合しない、請求項１又は２に記載のＣＡＲ。
ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ５及びＨＬＡ−Ｇ６からなる群から選択されるＨＬＡ−Ｇアイソフォームと特異的に結合するか、或いはＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５の両方、若しくはＨＬＡ−Ｇ２及びＨＬＡ−Ｇ６の両方、及び／又はＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍフリー及びＨＬＡ−Ｇ５／β２Ｍフリーの両方のアイソフォームに特異的に結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
前記抗原結合ドメインは、β２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇ、好ましくはＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５の両方に特異的に結合するｓｃＦｖであって、
（ａ）（ｉ）重鎖可変領域は、配列番号１、若しくは配列番号１と８０％超、好ましくは９０％超、さらに好ましくは９５％超の同一性を示す相同配列を含み、（ｉｉ）軽鎖可変領域は、配列番号２、若しくは配列番号２と８０％超、好ましくは９０％超、さらに好ましくは９５％超の同一性を示す相同配列を含む、又は
（ｂ）（ｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ（相補性決定領域）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号１を含み、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号２を含むｓｃＦｖである、
或いは、前記抗原結合ドメインは、β２ＭフリーＨＬＡ−Ｇ、好ましくはＨＬＡ−Ｇ２及びＨＬＡ−Ｇ６の両方及び／又はＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍフリー及びＨＬＡ−Ｇ５／β２Ｍフリーの両方のアイソフォームに特異的に結合するｓｃＦｖであって、
（ｃ）（ｉ）重鎖可変領域は、配列番号３、若しくは配列番号３と８０％超、好ましくは９０％超、さらに好ましくは９５％超の同一性を示す相同配列を含み、（ｉｉ）軽鎖可変領域は、配列番号４、若しくは配列番号４と８０％超、好ましくは９０％超、さらに好ましくは９５％超の同一性を示す相同配列を含む、又は
（ｄ）（ｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ（相補性決定領域）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号３を含み、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号４を含むｓｃＦｖである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
前記抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は、
（ａ）（ｉ）重鎖可変領域は、配列番号１、若しくは配列番号１と８０％超、好ましくは９０％超、さらに好ましくは９５％超の同一性を示す相同配列を含み、（ｉｉ）軽鎖可変領域は、配列番号２、若しくは配列番号２と８０％超、好ましくは９０％超、さらに好ましくは９５％超の同一性を示す相同配列を含むか、又は
（ｂ）（ｉ）重鎖可変領域は、配列番号３、若しくは配列番号３と８０％超、好ましくは９０％超、さらに好ましくは９５％超の同一性を示す相同配列を含み、（ｉｉ）軽鎖可変領域は、配列番号４、若しくは配列番号４と８０％超、好ましくは９０％超、さらに好ましくは９５％超の同一性を示す相同配列を含む、
抗ＨＬＡ−ＧｓｃＦｖである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
前記細胞内ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインと、任意にＣＤ２８、４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ１４９、ＤＡＰ１０、ＣＤ３０、ＩＬ２−Ｒ、ＩＬ７ｒ６、ＩＬ２１−Ｒ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＣＤ２７、ＣＤ１３７及びＤＮＡＭ−１共刺激ドメインから選択される少なくとも１つの共刺激ドメインとを含み、好ましくは２つの前記共刺激ドメインは４１ＢＢ及びＣＤ２８共刺激ドメインである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
前記膜貫通ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ３及びＣＤ８膜貫通ドメインから選択され、好ましくは、前記膜貫通ドメインはＣＤ２８膜貫通ドメインである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
Ｎ末端からＣ末端に向かって連続的に、ペプチドシグナル配列、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体又はその抗原結合フラグメント、スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン、切断可能リンカー、及び切断型ヒトＣＤ１９ドメインを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
前記抗原結合ドメインを前記膜貫通ドメインに連結するヒンジ領域、好ましくは（ｉ）ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン、（ｉｉ）ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン及びＣＨ３ヒトＩｇＧ４ドメイン、（ｉｉｉ）変異ＣＨ２ヒトＩｇＧ４ドメイン、ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン及びＣＨ３ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン、（ｉｖ）ＣＤ２８ヒンジドメイン、並びに（ｖ）ＣＤ８ａヒンジドメインからなる群から選択されるヒンジ領域をさらに含む、請求項９に記載のＣＡＲ。
前記ヒンジドメインは、（ｉ）配列番号２５、（ｉｉ）配列番号２５及び配列番号２７、（ｉｉｉ）配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７、（ｉｖ）配列番号１８若しくは（ｖ）配列番号１９の配列、又はそれと８０％超、好ましくは９０％超、さらに好ましくは９５％超の同一性を示す相同配列を含むか、或いはそれからなる、請求項１０に記載のＣＡＲ。
前記シグナルペプチドは、ＣＤ８ａシグナルペプチド、マウスＩｇカッパシグナルペプチド、ヒトＩｇＧ４シグナルペプチド、ＩＬ２シグナルペプチド、ヒトＩｇＧ２シグナルペプチド、及びガウシアｌｕｃシグナルペプチドからなる群から選択される、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
前記切断可能リンカーは、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｂ２Ａ及びＦ２Ａからなる群から選択される、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
前記切断型ヒトＣＤ１９ドメインは、配列番号２９の配列からなる、請求項９〜１３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
少なくとも２つの異なる抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む多重特異性ＣＡＲコンストラクトであって、前記抗原結合ドメインの少なくとも１つは、ＨＬＡ−Ｇのβ２Ｍドメインに会合したＨＬＡ−Ｇアイソフォームと特異的に結合し、前記抗原結合ドメインの少なくとも別のものは、ＨＬＡ−Ｇのβ２Ｍドメインに会合しないＨＬＡ−Ｇアイソフォームと特異的に結合し、好ましくは、前記多重特異性ＣＡＲコンストラクトは、（ｉ）配列番号１１、１２及び１３の配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）を含むドメイン、（ｉｉ）配列番号１４、１５及び１６の配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含むドメイン、（ｉｉｉ）配列番号５、６及び７の配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）を含むドメイン、（ｉｖ）配列番号８、９及び１０の配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、２及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含むドメインを含む二重特異性ＣＡＲコンストラクトであり、任意に、各ＣＤＲは任意に１、２、３又は４個のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含み得る、多重特異性ＣＡＲコンストラクト。
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の前記ＣＡＲをコードする、核酸分子。
請求項１６に記載の前記核酸分子を含む、発現ベクター。
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＣＡＲ、又は請求項１６に記載の核酸分子、又は請求項１７に記載の発現ベクターを含む細胞であって、好ましくは、Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、単球及び樹状細胞からなる群から選択され、好ましくは、Ｔ細胞、Ｂ細胞又はＮＫ細胞である、細胞。
請求項１６に記載の核酸分子、請求項１７に記載の発現ベクター、又は請求項１８に記載の細胞を含み、かつ任意に薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
請求項１９に記載の医薬組成物であって、
（ｉ）β２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇ、好ましくはＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５の両方に、特異的に結合する細胞であって、好ましくは請求項５に記載のＣＡＲを含む細胞、並びにβ２ＭフリーＨＬＡ−Ｇ、好ましくはＨＬＡ−Ｇ２及びＨＬＡ−Ｇ６の両方、及び／又はＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍフリー及びＨＬＡ−Ｇ５／β２Ｍフリーの両方のアイソフォームに、特異的に結合する細胞であって、好ましくは請求項５に記載のＣＡＲを含む細胞、を含む医薬組成物、或いは
（ｉｉ）ＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５の両方に若しくはβ２ＭフリーＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的に結合するＣＡＲ、好ましくは請求項５に記載のＣＡＲ、を含む細胞、並びにＨＬＡ−Ｇ２及びＨＬＡ−Ｇ６の両方に、若しくはβ２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇアイソフォームに、特異的に結合するＣＡＲ、好ましくは請求項５に記載のＣＡＲを含む細胞、を含む医薬組成物。
癌の治療に使用するため、若しくはウイルス感染の治療に使用するための、請求項１８に記載の細胞又は請求項１９〜２０のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、好ましくは、ＨＬＡ−Ｇを標的としないＣＡＲ療法と組み合わせて投与される、細胞又は医薬組成物。
ＨＬＡ−Ｇ β２Ｍ会合アイソフォームに、好ましくはＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５の両方に、特異的に結合する抗ＨＬＡ−Ｇ抗体であって、好ましくは、
（ａ）（ｉ）重鎖可変領域は、配列番号１、若しくは配列番号１と８０％超、好ましくは９０％超、さらに好ましくは９５％超の同一性を示す相同配列を含み、かつ
（ｉｉ）軽鎖可変領域は、配列番号２、若しくは配列番号２と８０％超、好ましくは９０％超、さらに好ましくは９５％超の同一性を示す相同配列を含む、又は
（ｂ）（ｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ（相補性決定領域）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号１を含み、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号２を含む、
抗ＨＬＡ−Ｇ抗体。
前記抗ＨＬＡ−Ｇ抗体若しくはその抗原結合フラグメント、好ましくはｓｃＦｖは、β２ＭフリーＨＬＡ−Ｇ若しくはβ２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇアイソフォームに選択的に結合するが、ＨＬＡ−Ｇアイソフォームの全てには結合しない、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＣＡＲ又は請求項２２に記載の抗ＨＬＡ−Ｇ抗体。