TWI694083B - 嵌合抗原受體、核酸、嵌合抗原受體表達質體、表達嵌合抗原受體細胞、其用途以及用於治療癌症之醫藥組合物 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種嵌合抗原受體、單離的核酸、嵌合抗原受體表達質體、表達嵌合抗原受體細胞、用於治療癌症之醫藥組合物以及表達嵌合抗原受體細胞之用途。嵌合抗原受體與人類白細胞抗原G專一性結合。核酸編碼所述嵌合抗原受體。嵌合抗原受體表達質體可表現所述嵌合抗原受體。表達嵌合抗原受體細胞係將嵌合抗原受體轉導至免疫細胞中而得。用於治療癌症之醫藥組合物，包含表達嵌合抗原受體細胞和醫藥上可接受載劑。藉此，表達嵌合抗原受體細胞可用於誘導哺乳類動物之腫瘤細胞死亡。
Description
本發明是有關於一種含有抗原或抗體的醫藥製品，特別是一種嵌合抗原受體、編碼嵌合抗原受體的核酸、嵌合抗原受體表達質體、表達嵌合抗原受體細胞、治療癌症之醫藥組合物以及表達嵌合抗原受體細胞之用途。
癌症又名為惡性腫瘤，為細胞不正常增生，且這些增生的細胞可能侵犯身體的其他部分，為由控制細胞分裂增殖機制失常而引起的疾病。全世界罹患癌症的人口有不斷增加的趨勢，癌症係國人十大死因之一，且已連續二十七年為居十大死因之榜首。
常規的腫瘤治療方法包括手術治療、放射線治療、化學治療及標靶治療等。腫瘤免疫治療為上述治療方法以外的另一種治療腫瘤的方法，係透過激活患者自身免疫系統，利用腫瘤細胞或腫瘤抗原物質誘導機體的特異性細胞免
疫和體液免疫反應，增強機體的抗癌能力，阻止腫瘤的生長、擴散和復發，以達到清除或控制腫瘤的目的。
腫瘤免疫治療主要有三大方向-腫瘤疫苗、細胞治療和免疫檢查點抑制劑，其中嵌合抗原受體免疫細胞技術為近年來發展非常迅速的細胞治療。習知技術中，嵌合抗原受體免疫細胞是將能識別某種腫瘤抗原的抗體的抗原結合部與CD3-δ鏈或FcεRIγ的胞內部分在體外偶聯為一個嵌合蛋白，藉由基因轉導的方法轉染患者的免疫細胞，使其表達嵌合抗原受體，其在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治療上有著顯著的療效，被認為是最有前景的腫瘤治療方式之一。但目前嵌合抗原受體免疫細胞的細胞治療因缺乏獨特的腫瘤相關抗原、免疫細胞歸位至腫瘤位址的效率低及無法克服實體性腫瘤的免疫抑制性微環境，使得嵌合抗原受體在實體性腫瘤的功效受到極大限制。
本發明之目的是在提供一種嵌合抗原受體、單離的核酸、嵌合抗原受體表達質體、表達嵌合抗原受體細胞、其用途以及用於治療癌症之醫藥組合物。所述嵌合抗原受體具有優異的專一性結合腫瘤細胞能力。所述核酸編碼所述嵌合抗原受體。而所述嵌合抗原受體表達質體包含所述核酸。所述表達嵌合抗原受體細胞包含所述嵌合抗原受體表達質體，其表現所述嵌合抗原受體，可以專一性的靶向腫瘤細胞，避免脫靶效應，進而有效地毒殺腫瘤細胞，是以可用以
製備誘導哺乳類動物之腫瘤細胞死亡之藥物。而所述用於治療癌症之醫藥組合物包含所述表達嵌合抗原受體細胞，可有效地毒殺腫瘤細胞進而治療癌症。
依據本發明之一態樣之一實施方式是提供一種嵌合抗原受體，其與人類白細胞抗原G(human leukocyte antigen G,HLA-G)專一性結合，所述嵌合抗原受體包含從N端至C端依序排列之如序列辨識編號1所示之一抗HLA-G抗體、如序列辨識編號2所示之一HLA-G受體以及如序列辨識編號3所示之一共刺激域。
依據前述之嵌合抗原受體，可更包含如序列辨識編號4所示之自殺蛋白，其係連接於所述共刺激域之C端。
依據前述之嵌合抗原受體，可更包含一2A胜肽，所述2A胜肽串接所述HLA-G受體及所述共刺激域。
本發明之一態樣之另一實施方式是提供一種單離的核酸，其係編碼如前段所述之嵌合抗原受體。所述核酸包含依序排列之如序列辨識編號11所示之一編碼抗HLA-G抗體片段、如序列辨識編號12所示之一編碼HLA-G受體片段以及如序列辨識編號13所示之一編碼共刺激域片段。
依據前述之單離的核酸，可更包含如序列辨識編號14所示之一自殺基因，其係連接於所述編碼共刺激域片段之3’端。
依據前述之單離的核酸，可更包含編碼2A胜肽序列，所述編碼2A胜肽序列串接所述編碼HLA-G受體片段及所述編碼共刺激域片段。
本發明之一態樣之再一實施方式是提供一種嵌合抗原受體表達質體，所述嵌合抗原受體表達質體包含依序排列之如序列辨識編號15所示之一起動子以及如前段所述之核酸。
依據前述之嵌合抗原受體表達質體，可更包含如序列辨識編號14所示之一自殺基因，其係連接於所述核酸之3’端。
本發明之一態樣之又一實施方式是提供一種表達嵌合抗原受體細胞，包含免疫細胞和如前段所述之嵌合抗原受體表達質體。
依據前述之表達嵌合抗原受體細胞，其中所述免疫細胞可為T細胞或自然殺手細胞。較佳地，所述自然殺手細胞可為NK-92細胞株或初代自然殺手細胞。
本發明之一態樣之又一實施方式是提供一種用於治療癌症之醫藥組合物，包含如前段所述之表達嵌合抗原受體細胞，以及醫藥上可接受載劑。
依據前述之用於治療癌症之醫藥組合物，可更包含化療藥物。較佳地，所述化療藥物可為阿黴素(doxorubicin)、替莫唑胺(temozolomide)、吉西他濱(gemcitabine)或卡鉑(carboplatin)。
本發明之另一態樣之一實施方式是提供一種如前段所述之表達嵌合抗原受體細胞之用途，其係用於製備誘導哺乳類動物之腫瘤細胞死亡之藥物。
依據前述之表達嵌合抗原受體細胞之用途，所述腫瘤細胞可為乳癌細胞、多形性膠質母細胞瘤細胞、胰臟癌細胞或卵巢癌細胞。
上述發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖繪示本發明之抗HLA-G抗體之蛋白質結構示意圖；第2圖繪示本發明之嵌合抗原受體表達質體之構築示意圖；第3圖為本發明之實施例1之表達嵌合抗原受體細胞之嵌合抗原受體表達量分析圖；第4A圖、第4B圖、第4C圖、第4D圖、第4E圖、第4F圖、第4G圖、第4H圖和第4I圖為本發明之實施例1之表達嵌合抗原受體細胞誘導腫瘤細胞死亡的分析結果圖；第5圖為本發明之實施例2之表達嵌合抗原受體細胞之嵌合抗原受體表達量分析圖；第6A圖、第6B圖、第6C圖、第6D圖、第6E圖、第6F圖、第6G圖、第6H圖和第6I圖為本發明之實施例2之表達
嵌合抗原受體細胞誘導腫瘤細胞死亡的分析結果圖；第7圖為本發明之實施例3之表達嵌合抗原受體細胞之嵌合抗原受體表達量分析圖；第8A圖、第8B圖、第8C圖、第8D圖、第8E圖、第8F圖、第8G圖、第8H圖和第8I圖為本發明之實施例3之表達嵌合抗原受體細胞誘導腫瘤細胞死亡的分析結果圖；第9A圖、第9B圖、第9C圖、第9D圖、第9E圖、第9F圖、第9G圖和第9H圖為分析腫瘤細胞接受化學治療後HLA-G表現量的免疫螢光染色結果圖；第10A圖、第10B圖、第10C圖、第10D圖和第10E圖為腫瘤細胞接受化學治療後HLA-G表現量的流式細胞術分析結果圖；以及第11圖繪示本發明之嵌合抗原受體於本發明之表達嵌合抗原受體細胞質膜內的理論結構和作用機制示意圖。
本說明書揭露內容提出一種嵌合抗原受體、編碼所述嵌合抗原受體的核酸、包含所述核酸的嵌合抗原受體表達質體、包含所述嵌合抗原受體表達質體的表達嵌合抗原受體細胞、其用途以及包含表達嵌合抗原受體細胞的用於治療癌症之醫藥組合物。以腫瘤細胞之細胞試驗，證明本發明之嵌合抗原受體具有優異的專一性結合腫瘤細胞能力，特別是與腫瘤細胞之細胞膜上所表現的人類白細胞抗原G專一性結合，因而可使表現本發明之嵌合抗原受體的表達嵌合抗
原受體細胞專一性的靶向腫瘤細胞，避免脫靶效應，進而有效地毒殺腫瘤細胞，是以可用以製備誘導哺乳類動物之腫瘤細胞死亡之藥物。而所述本發明之用於治療癌症之醫藥組合物，包含本發明之表達嵌合抗原受體細胞，並可進一步的包含化療藥物，可有效地毒殺腫瘤細胞進而治療癌症。
本說明書中所述之「人類白細胞抗原G(human leukocyte antigen G,HLA-G)」係由HLA-G基因所編碼，為非典型第一類主要組織相容性複合體(major histocompatibility complex,MHC)，重鏈大約45kDa。HLA-G在胎兒來源的胎盤細胞上表達，在免疫應答的負調節中十分活躍，其主要作用在於抑制細胞毒性免疫細胞功能。
茲以下列具體試驗例進一步示範說明本發明，用以有利於本發明所屬技術領域通常知識者，可在不需過度解讀的情形下完整利用並實踐本發明，而不應將這些試驗例視為對本發明範圍的限制，但用於說明如何實施本發明的材料及方法。
本發明之嵌合抗原受體，其與人類白細胞抗原G專一性結合，所述嵌合抗原受體包含從N端至C端依序排列之如序列辨識編號1所示之抗HLA-G抗體、如序列辨識編號2所示之HLA-G受體以及如序列辨識編號3所示之共刺激
域。較佳地，其於共刺激域之C端可更連接如序列辨識編號4所示之自殺蛋白，以及更包含如序列辨識編號10所示之2A胜肽串接所述HLA-G受體及所述共刺激域。詳細地說，序列辨識編號1所示之抗HLA-G抗體中包含重鏈(HC)免疫球蛋白可變域序列和輕鏈(LC)免疫球蛋白可變域序列。其中重鏈免疫球蛋白可變域序列為如序列辨識編號5所示之CDRH1、如序列辨識編號6所示之CDRH2以及如序列辨識編號7所示之CDRH3。輕鏈免疫球蛋白可變域序列為如序列辨識編號8所示之CDRL2以及如序列辨識編號9所示之CDRL3。請參照第1圖，繪示本發明之抗HLA-G抗體之蛋白質結構示意圖，其中灑點的環狀區域表示本發明之抗HLA-G抗體中的可變域。而序列辨識編號2所示之HLA-G受體為殺傷細胞免疫球蛋白樣受體2DS4(killer cell immunoglobulin-like receptor 2DS4,KIR2DS4)。序列辨識編號3所示之共刺激域為DNAX活化蛋白12(DNAX activating protein 12,DAP12)。序列辨識編號4所示之自殺蛋白為iCas9蛋白。
本發明之單離的核酸係編碼本發明之嵌合抗原受體。所述核酸包含依序排列之如序列辨識編號11所示之編碼抗HLA-G抗體片段、如序列辨識編號12所示之編碼HLA-G受體片段以及如序列辨識編號13所示之編碼共刺激域片段。較佳地，其於共刺激域片段之3’端可更連接如序列辨識編號14所示之自殺基因，以及可更包含如序列辨識編號15所示之編碼2A胜肽序列串接所述編碼HLA-G受體片
段及所述編碼共刺激域片段。序列辨識編號11所示之編碼抗HLA-G抗體片段係編碼如序列辨識編號1所示之抗HLA-G抗體，序列辨識編號12所示之編碼HLA-G受體片段係編碼如序列辨識編號2所示之HLA-G受體，序列辨識編號13所示之編碼共刺激域片段係編碼如序列辨識編號3所示之共刺激域，序列辨識編號14所示之自殺基因係編碼如序列辨識編號4所示之自殺蛋白，序列辨識編號15所示之編碼2A胜肽序列係編碼如序列辨識編號10所示之2A胜肽。
請參照第2圖，繪示本發明之嵌合抗原受體表達質體之構築示意圖。詳細地說，於本試驗例中所示之一實施例，嵌合抗原受體表達質體為Lenti-EF1a-CAR-100517-S1A質體，其內插子(insert)片段包含依序排列之啟動子、編碼抗HLA-G抗體片段、編碼HLA-G受體片段以及編碼共刺激域片段。啟動子為如序列辨識編號16所示的EF-1 alpha啟動子，編碼抗HLA-G抗體片段的序列如如序列辨識編號11所示，編碼HLA-G受體片段的序列如序列辨識編號12所示，編碼共刺激域片段的序列如序列辨識編碼13所示。此外，內插子上還包含如序列辨識編號17所示之編碼訊息胜肽片段、如序列辨識編號14所示之自殺基因以及序列辨識編號15所示之編碼2A胜肽序列。編碼訊息胜肽片段連接於編碼抗HLA-G抗體片段的5’端，自殺基因連接於共刺激域片段的3’端，編碼2A胜肽序列串接所述編碼HLA-G受體片段及所述編碼共刺激域片段。再將內插子片段構築於Creative Biolabs載體
(Creative Biolabs,NY,USA)上，以得到Lenti-EF1a-CAR-100517-S1A質體。所使用的載體為慢病毒(lentivirus)載體系統，因此可將構築完成的嵌合抗原受體表達質體轉染至表現細胞中生產慢病毒，後續可利用慢病毒將嵌合抗原受體轉導至免疫細胞中。
二、本發明之表達嵌合抗原受體細胞、其用途以及用於治療癌症之醫藥組合物
本發明之表達嵌合抗原受體細胞係將本發明之嵌合抗原受體利用慢病毒轉導至免疫細胞中而得到。較佳地，所述免疫細胞可為T細胞或自然殺手細胞。更佳地，所述自然殺手細胞可為NK-92細胞株或初代自然殺手細胞。詳細地說，將構築完成的Lenti-EF1a-CAR-100517-S1A質體，先利用lipofectamine 3000(Invitrogen)轉染至293T細胞株中以製備帶有本發明之嵌合抗原受體的慢病毒，再將含有製備完成的慢病毒的上清液和8μg/ml的聚凝胺(polybrene,Sigma-Aldrich)的Opti-MEM(Invitrogen)培養初代T細胞3天，以將本發明之嵌合抗原受體轉導至初代T細胞中。以及將含有製備完成的慢病毒的上清液和50μg/ml的魚精蛋白(Protamine sulfate,Sigma-Aldrich)的Opti-MEM(Invitrogen)培養初代自然殺手細胞或NK-92細胞株7天，以將本發明之嵌合抗原受體轉導至初代自然殺手細胞或NK-92細胞株中，可得本發明之表達嵌合抗原受體細胞。所得到的表達嵌合抗原受體細胞具有誘導哺乳類動物之腫瘤細胞死亡的效果，是以可用以
製備誘導哺乳類動物之腫瘤細胞死亡之藥物。較佳地，腫瘤細胞可為乳癌細胞、多形性膠質母細胞瘤細胞、胰臟癌細胞或卵巢癌細胞。
本發明之用於治療癌症之醫藥組合物包含本發明之表達嵌合抗原受體細胞以及醫藥上可接受載劑。較佳地，所述用於治療癌症之醫藥組合物可更包含化療藥物。更佳地，所述化療藥物可為阿黴素(doxorubicin)、替莫唑胺(temozolomide)、吉西他濱(gemcitabine)或卡鉑(carboplatin)。
以下的試驗例將以數據證明本發明之表達嵌合抗原受體細胞以及包含本發明之表達嵌合抗原受體細胞之用於治療癌症之醫藥組合物對於多種哺乳類動物之腫瘤細胞皆具有良好的誘導其死亡的效果。試驗上所使用的腫瘤細胞分別為人類乳癌細胞株MDA-MB-231、人類惡性腦瘤細胞株DBTRG-05MG(以下簡稱DBTRG)、人類胰臟癌細胞株AsPC1以及人類卵巢癌細胞株SKOV3。所使用的腫瘤細胞株皆購自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。人類乳癌細胞株MDA-MB-231細胞株為三陰性乳腺癌細胞株，即荷爾蒙受體(ER、PR)和HER-2受體為陰性，其培養於含10%胎牛血清(FBS)的RPMI培養液中。人類惡性腦瘤細胞株DBTRG培養於含10%胎牛血清的DMEM培養液中。人類胰臟癌細胞株AsPC1培養於含10%胎牛血清的RPMI培養液中。人類
卵巢癌細胞株SKOV3培養於含10%胎牛血清的McCoy’s 5A培養液中。
2.1.實施例1
於本試驗例中，將本發明之嵌合抗原受體轉導至NK-92細胞株可得到本發明之實施例1之表達嵌合抗原受體細胞，再將所得到的實施例1之表達嵌合抗原受體細胞以流式細胞術分析其嵌合抗原受體的表達量。請參照第3圖，為本發明之實施例1之表達嵌合抗原受體細胞之嵌合抗原受體表達量分析圖，第3圖中分別為未轉導本發明之嵌合抗原受體之親代NK-92細胞株的嵌合抗原受體表達量分析圖，以及實施例1之表達嵌合抗原受體細胞於轉導後第3天和第7天的嵌合抗原受體表達量分析圖。由第3圖的數據可見，親代NK-92細胞株的平均螢光強度(mean fluorescence intensity,MFI)僅有9.98%，而實施例1之表達嵌合抗原受體細胞在轉導後第3天和第7天的平均螢光強度可分別達20.11%和65.07%，顯示實施例1之表達嵌合抗原受體細胞確實可穩定表現本發明之嵌合抗原受體。
進一步測試本發明之實施例1之表達嵌合抗原受體細胞以及包含本發明之實施例1之表達嵌合抗原受體細胞之用於治療癌症之醫藥組合物，誘導乳癌細胞、多形性膠質母細胞瘤細胞、胰臟癌細胞和卵巢癌細胞死亡的效果。
先分別將人類乳癌細胞株MDA-MB-231、人類惡性腦瘤細胞株DBTRG、人類胰臟癌細胞株AsPC1以及人類卵巢癌細胞株SKOV3以1×105cells/well的密度種於
12孔盤，再培養48小時後進行試驗。試驗上每種腫瘤細胞分為6個組別，分別為未處理的控制組、處理化療藥物的試驗組1、處理親代NK-92細胞株的試驗組2、處理親代NK-92細胞株和化療藥物的試驗組3、處理實施例1之表達嵌合抗原受體細胞的試驗組4以及處理實施例1之表達嵌合抗原受體細胞和化療藥物的試驗組5。其中於人類乳癌細胞株MDA-MB-231的組別中，所使用的化療藥物為阿黴素(200nM)；於人類惡性腦瘤細胞株DBTRG的組別中，所使用的化療藥物為替莫唑胺(80μg/ml)；於人類胰臟癌細胞株AsPC1的組別中，所使用的化療藥物為吉西他濱(20μM)；於人類卵巢癌細胞株SKOV3的組別中，所使用的化療藥物為卡鉑(20μM)。而於試驗組4和試驗組5中，所處理的實施例1之表達嵌合抗原受體細胞的細胞數為1×105cells，於試驗組2和試驗組3中所處理的親代NK-92細胞株的細胞數亦為1×105cells。再將經處理的各組細胞以Annexin V-FITC和核酸染劑propidium iodide(PI)進行細胞染色，並以流式細胞儀檢測細胞凋亡和死亡的狀況，並計算染上Annexin V-FITC和/或PI的細胞百分比(即雙變量流式細胞儀散點圖中第一象限、第二象限和第四象限中的細胞百分比)的總和而得到細胞毒殺作用。每個組別皆進行獨立的三重複試驗後，統計細胞毒殺作用結果。
請參照第4A圖、第4B圖、第4C圖、第4D圖、第4E圖和第4F圖，為本發明之實施例1之表達嵌合抗原受體細胞誘導腫瘤細胞死亡的分析結果圖。其中第4A圖為實施
例1之表達嵌合抗原受體細胞誘導人類乳癌細胞株MDA-MB-231死亡的分析結果圖，第4B圖為第4A圖三重複試驗後的統計圖，第4C圖為實施例1之表達嵌合抗原受體細胞誘導人類惡性腦瘤細胞株DBTRG死亡的分析結果圖，第4D圖為第4C圖三重複試驗後的統計圖，第4E圖為實施例1之表達嵌合抗原受體細胞誘導人類胰臟癌細胞株AsPC1死亡的分析結果圖，第4F圖為第4E圖三重複試驗後的統計圖，第4G圖為實施例1之表達嵌合抗原受體細胞誘導人類卵巢癌細胞株SKOV3死亡的分析結果圖，第4H圖為第4G圖三重複試驗後的統計圖，第4I圖為第4A圖、第4C圖、第4E圖和第4G圖三重複試驗後的統計圖。圖中P表示親代NK-92細胞株，H表示實施例1之表達嵌合抗原受體細胞，D表示阿黴素，T表示替莫唑胺，G表示吉西他濱，C表示卡鉑。
由第4A圖和第4B圖的結果顯示，在未處理的控制組，僅見約10%的人類乳癌細胞株MDA-MB-231死亡，而處理阿黴素的試驗組1和處理親代NK-92細胞株的試驗組2，雖人類乳癌細胞株MDA-MB-231死亡率有增加，但不具有統計意義的差異。而處理親代NK-92細胞株和阿黴素的試驗組3，人類乳癌細胞株MDA-MB-231死亡率可提高至40%，與試驗組2相比具有統計意義的差異(p<0.05)。而處理實施例1之表達嵌合抗原受體細胞的試驗組4其誘導的人類乳癌細胞株MDA-MB-231死亡率可達約60%，與試驗組2相比具有統計意義的差異(p<0.001)，此
外，處理實施例1之表達嵌合抗原受體細胞和阿黴素的試驗組5其誘導的人類乳癌細胞株MDA-MB-231死亡率更可高達約80%，與試驗組4相比具有統計意義的差異(p<0.05)，與試驗組3相比亦具有統計意義的差異(p<0.01)。
由第4C圖和第4D圖的結果顯示，在未處理的控制組，僅見不到10%的人類惡性腦瘤細胞株DBTRG死亡，而處理替莫唑胺的試驗組1和處理親代NK-92細胞株的試驗組2，雖人類惡性腦瘤細胞株DBTRG死亡率有增加，但不具有統計意義的差異。而處理親代NK-92細胞株和替莫唑胺的試驗組3，人類惡性腦瘤細胞株DBTRG死亡率可提高至40%，與試驗組2相比具有統計意義的差異(p<0.05)。而處理實施例1之表達嵌合抗原受體細胞的試驗組4其誘導的人類惡性腦瘤細胞株DBTRG死亡率可超過60%，與試驗組2相比具有統計意義的差異(p<0.001)。此外，處理實施例1之表達嵌合抗原受體細胞和替莫唑胺的試驗組5其誘導的人類惡性腦瘤細胞株DBTRG的死亡率更可超過80%，與試驗組4相比具有統計意義的差異(p<0.05)，與試驗組3相比亦具有統計意義的差異(p<0.001)。
由第4E圖和第4F圖的結果顯示，在未處理的控制組，僅見不到10%的人類胰臟癌細胞株AsPC1死亡，而處理吉西他濱的試驗組1和處理親代NK-92細胞株的試驗組2，雖人類胰臟癌細胞株AsPC1死亡率有增加，但不具有統計意義的差異。而處理親代NK-92細胞株和吉西他濱的試驗組3，人類胰臟癌細胞株AsPC1死亡率可提高至約30
%，但仍不具有統計意義的差異。而處理實施例1之表達嵌合抗原受體細胞的試驗組4其誘導的人類胰臟癌細胞株AsPC1死亡率可接近40%，與試驗組2相比具有統計意義的差異(p<0.01)。此外，處理實施例1之表達嵌合抗原受體細胞和吉西他濱的試驗組5其誘導的人類胰臟癌細胞株AsPC1的死亡率更達約60%，與試驗組4相比具有統計意義的差異(p<0.001)，與試驗組3相比亦具有統計意義的差異(p<0.001)。
由第4G圖和第4H圖的結果顯示，在未處理的控制組，僅見不到10%的人類卵巢癌細胞株SKOV3死亡，而處理卡鉑的試驗組1和處理親代NK-92細胞株的試驗組2，雖人類卵巢癌細胞株SKOV3死亡率有增加，但不具有統計意義的差異。而處理親代NK-92細胞株和卡鉑的試驗組3，人類卵巢癌細胞株SKOV3死亡率可提高至約30%，與試驗組2相比具有統計意義的差異(p<0.05)。而處理實施例1之表達嵌合抗原受體細胞的試驗組4其誘導的人類卵巢癌細胞株SKOV3死亡率可接近40%，與試驗組2相比具有統計意義的差異(p<0.01)。此外，處理實施例1之表達嵌合抗原受體細胞和卡鉑的試驗組5其誘導的人類卵巢癌細胞株SKOV3的死亡率更達約60%，與試驗組4相比具有統計意義的差異(p<0.05)，與試驗組3相比亦具有統計意義的差異(p<0.01)。
由第4I圖的結果顯示，處理實施例1之表達嵌合抗原受體細胞對於人類乳癌細胞株MDA-MB-231、人類惡
性腦瘤細胞株DBTRG、人類胰臟癌細胞株AsPC1和人類卵巢癌細胞株SKOV3皆具有優異的毒殺作用，是以本發明之表達嵌合抗原受體細胞可用以製備誘導哺乳類動物之腫瘤細胞死亡之藥物。較佳地，所述腫瘤細胞可為乳癌細胞、多形性膠質母細胞瘤細胞、胰臟癌細胞或卵巢癌細胞。此外，同時處理實施例1之表達嵌合抗原受體細胞和化療藥物，對於人類乳癌細胞株MDA-MB-231、人類惡性腦瘤細胞株DBTRG、人類胰臟癌細胞株AsPC1和人類卵巢癌細胞株SKOV3的毒殺作用更為顯著，顯示本發明之用於治療癌症之醫藥組合物，可以有效地毒殺腫瘤細胞進而治療癌症。較佳地，本發明之用於治療癌症之醫藥組合物可進一步的包含化療藥物，所述化療藥物可包含但不限於阿黴素、替莫唑胺、吉西他濱和卡鉑。
2.2.實施例2
於本試驗例中，將本發明之嵌合抗原受體轉導至初代自然殺手細胞可得到本發明之實施例2之表達嵌合抗原受體細胞，再將所得到的實施例2之表達嵌合抗原受體細胞以流式細胞術分析其嵌合抗原受體的表達量。請參照第5圖，為本發明之實施例2之表達嵌合抗原受體細胞之嵌合抗原受體表達量分析圖。第5圖中分別為未轉導本發明之嵌合抗原受體之親代初代自然殺手細胞的嵌合抗原受體表達量分析圖，以及實施例2之表達嵌合抗原受體細胞於轉導後第3天和第7天的嵌合抗原受體表達量分析圖。由第5圖的數據可見，親代初代自然殺手細胞的平均螢光強度為22.09
%，而實施例2之表達嵌合抗原受體細胞在轉導後第3天和第7天的平均螢光強度可分別達29.02%和50.21%，顯示實施例2之表達嵌合抗原受體細胞確實可穩定表現本發明之嵌合抗原受體。
進一步測試本發明之實施例2之表達嵌合抗原受體細胞以及包含本發明之實施例2之表達嵌合抗原受體細胞之用於治療癌症之醫藥組合物，誘導乳癌細胞、多形性膠質母細胞瘤細胞、胰臟癌細胞和卵巢癌細胞死亡的效果。
先分別將人類乳癌細胞株MDA-MB-231、人類惡性腦瘤細胞株DBTRG、人類胰臟癌細胞株AsPC1以及人類卵巢癌細胞株SKOV3以1×105cells/well的密度種於12孔盤，再培養48小時後進行試驗。試驗上每種腫瘤細胞分為6個組別，分別為未處理的控制組、處理化療藥物的試驗組1、處理親代初代自然殺手細胞的試驗組2、處理親代初代自然殺手細胞和化療藥物的試驗組3、處理實施例2之表達嵌合抗原受體細胞的試驗組4以及處理實施例2之表達嵌合抗原受體細胞和化療藥物的試驗組5。其中於人類乳癌細胞株MDA-MB-231的組別中，所使用的化療藥物為阿黴素(200nM)；於人類惡性腦瘤細胞株DBTRG的組別中，所使用的化療藥物為替莫唑胺(80μg/ml)；於人類胰臟癌細胞株AsPC1的組別中，所使用的化療藥物為吉西他濱(20μM)；於人類卵巢癌細胞株SKOV3的組別中，所使用的化療藥物為卡鉑(20μM)。而於試驗組4和試驗組5中，所處理的實施例2之表達嵌合抗原受體細胞的細胞數為1×105
cells，於試驗組2和試驗組3中所處理的親代初代自然殺手細胞的細胞數亦為1×105cells。再將經處理的各組細胞以Annexin V-FITC和PI進行細胞染色，並計算染上Annexin V-FITC和/或PI的細胞百分比的總和而得到細胞毒殺作用。每個組別皆進行獨立的三重複試驗後，統計細胞毒殺作用結果。
請參照第6A圖、第6B圖、第6C圖、第6D圖、第6E圖、第6F圖、第6G圖、第6H圖和第6I圖，為本發明之實施例2之表達嵌合抗原受體細胞誘導腫瘤細胞死亡的分析結果圖。其中第6A圖為實施例2之表達嵌合抗原受體細胞誘導人類乳癌細胞株MDA-MB-231死亡的分析結果圖，第6B圖為第6A圖三重複試驗後的統計圖。第6C圖為實施例2之表達嵌合抗原受體細胞誘導人類惡性腦瘤細胞株DBTRG死亡的分析結果圖，第6D圖為第6C圖三重複試驗後的統計圖。第6E圖為實施例2之表達嵌合抗原受體細胞誘導人類胰臟癌細胞株AsPC1死亡的分析結果圖，第6F圖為第6E圖三重複試驗後的統計圖。第6G圖為實施例2之表達嵌合抗原受體細胞誘導人類卵巢癌細胞株SKOV3死亡的分析結果圖，第6H圖為第6G圖三重複試驗後的統計圖。第6H圖為第6G圖的統計圖，第6I圖為第6A圖、第6C圖、第6E圖和第6G圖三重複試驗後的統計圖。圖中P表示親代初代自然殺手細胞，H表示實施例2之表達嵌合抗原受體細胞，D表示阿黴素，T表示替莫唑胺，G表示吉西他濱，C表示卡鉑。
由第6A圖和第6B圖的結果顯示，在未處理的控制組，僅見約10%的人類乳癌細胞株MDA-MB-231死亡，而處理阿黴素的試驗組1和處理親代初代自然殺手細胞的試驗組2，雖人類乳癌細胞株MDA-MB-231死亡率有增加，但不具有統計意義的差異。而處理親代初代自然殺手細胞和阿黴素的試驗組3，人類乳癌細胞株MDA-MB-231死亡率可提高至約30%，與試驗組2相比具有統計意義的差異(p<0.05)。而處理實施例2之表達嵌合抗原受體細胞的試驗組4其誘導的人類乳癌細胞株MDA-MB-231死亡率超過50%，與試驗組2相比具有統計意義的差異(p<0.01)。此外，處理實施例2之表達嵌合抗原受體細胞和阿黴素的試驗組5其誘導的人類乳癌細胞株MDA-MB-231死亡率更可高達約80%，與試驗組4相比具有統計意義的差異(p<0.05)，與試驗組3相比亦具有統計意義的差異(p<0.01)。
由第6C圖和第6D圖的結果顯示，在未處理的控制組，僅見不到10%的人類惡性腦瘤細胞株DBTRG死亡，而處理替莫唑胺的試驗組1和處理親代初代自然殺手細胞的試驗組2，雖人類惡性腦瘤細胞株DBTRG死亡率有增加，但不具有統計意義的差異。而處理親代初代自然殺手細胞和替莫唑胺的試驗組3，人類惡性腦瘤細胞株DBTRG死亡率可提高至接近30%。而處理實施例2之表達嵌合抗原受體細胞的試驗組4其誘導的人類惡性腦瘤細胞株DBTRG死亡率可超過20%，與試驗組2相比具有統計意義的差異(p<0.05)。此外，處理實施例2之表達嵌合抗原受體細胞和
替莫唑胺的試驗組5其誘導的人類惡性腦瘤細胞株DBTRG的死亡率更可接近60%，與試驗組4相比具有統計意義的差異(p<0.01)，與試驗組3相比亦具有統計意義的差異(p<0.05)。
由第6E圖和第6F圖的結果顯示，在未處理的控制組，僅見不到10%的人類胰臟癌細胞株AsPC1死亡，而處理吉西他濱的試驗組1和處理親代初代自然殺手細胞的試驗組2，雖人類胰臟癌細胞株AsPC1死亡率有增加，但不具有統計意義的差異。而處理親代初代自然殺手細胞和吉西他濱的試驗組3，人類胰臟癌細胞株AsPC1死亡率可提高至約30%，與試驗組2相比具有統計意義的差異(p<0.05)。而處理實施例2之表達嵌合抗原受體細胞的試驗組4其誘導的人類胰臟癌細胞株AsPC1死亡率約為20%，與試驗組2相比具有統計意義的差異(p<0.01)。此外，處理實施例2之表達嵌合抗原受體細胞和吉西他濱的試驗組5其誘導的人類胰臟癌細胞株AsPC1的死亡率更達約50%，與試驗組4相比具有統計意義的差異(p<0.01)，與試驗組3相比亦具有統計意義的差異(p<0.05)。
由第6G圖和第6H圖的結果顯示，在未處理的控制組，僅見不到10%的人類卵巢癌細胞株SKOV3死亡，而處理卡鉑的試驗組1，雖人類卵巢癌細胞株SKOV3死亡率有增加，但不具有統計意義的差異。處理親代初代自然殺手細胞的試驗組2的細胞毒殺作用與控制組相當。而處理親代初代自然殺手細胞和卡鉑的試驗組3，人類卵巢癌細胞株
SKOV3死亡率可超過20%，與試驗組2相比具有統計意義的差異(p<0.05)。而處理實施例2之表達嵌合抗原受體細胞的試驗組4其誘導的人類卵巢癌細胞株SKOV3死亡率約為20%，與試驗組2相比具有統計意義的差異(p<0.05)。此外，處理實施例2之表達嵌合抗原受體細胞和卡鉑的試驗組5其誘導的人類卵巢癌細胞株SKOV3的死亡率更可達接近50%，與試驗組4相比具有統計意義的差異(p<0.01)，與試驗組3相比亦具有統計意義的差異(p<0.05)。
由第6I圖的結果顯示，處理實施例2之表達嵌合抗原受體細胞對於乳癌細胞、多形性膠質母細胞瘤細胞、胰臟癌細胞或卵巢癌細胞皆具有優異的毒殺作用，是以本發明之表達嵌合抗原受體細胞可用以製備誘導哺乳類動物之腫瘤細胞死亡之藥物。此外，同時處理實施例2之表達嵌合抗原受體細胞和化療藥物，對於乳癌細胞、多形性膠質母細胞瘤細胞、胰臟癌細胞或卵巢癌細胞的毒殺作用更為顯著，顯示本發明之用於治療癌症之醫藥組合物，較佳地可包含化療藥物，可以有效地毒殺腫瘤細胞進而治療癌症。
2.3.實施例3
於本試驗例中，將本發明之嵌合抗原受體轉導至初代T細胞可得到本發明之實施例3之表達嵌合抗原受體細胞，再將所得到的實施例3之表達嵌合抗原受體細胞以流式細胞術分析其嵌合抗原受體的表達量。請參照第7圖，為本發明之實施例3之表達嵌合抗原受體細胞之嵌合抗原受體表達量分析圖，第7圖中分別為未轉導本發明之嵌合抗原
受體之初代T細胞的嵌合抗原受體表達量分析圖，以及實施例3之表達嵌合抗原受體細胞於轉導後第3天和第7天的嵌合抗原受體表達量分析圖。由第7圖的數據可見，初代T細胞的平均螢光強度僅有9.36%，而實施例3之表達嵌合抗原受體細胞在轉導後第3天和第7天的平均螢光強度可分別達34.1%和88.64%，顯示實施例3之表達嵌合抗原受體細胞確實可穩定表現本發明之嵌合抗原受體。
進一步測試本發明之實施例3之表達嵌合抗原受體細胞以及包含本發明之實施例3之表達嵌合抗原受體細胞之用於治療癌症之醫藥組合物，誘導乳癌細胞、多形性膠質母細胞瘤細胞、胰臟癌細胞和卵巢癌細胞死亡的效果。
先分別將人類乳癌細胞株MDA-MB-231、人類惡性腦瘤細胞株DBTRG、人類胰臟癌細胞株AsPC1以及人類卵巢癌細胞株SKOV3以1×105cells/well的密度種於12孔盤，再培養48小時後進行試驗。試驗上每種腫瘤細胞分為6個組別，分別為未處理的控制組、處理化療藥物的試驗組1、處理初代T細胞的試驗組2、處理初代T細胞和化療藥物的試驗組3、處理實施例3之表達嵌合抗原受體細胞的試驗組4以及處理實施例3之表達嵌合抗原受體細胞和化療藥物的試驗組5。其中於人類乳癌細胞株MDA-MB-231的組別中，所使用的化療藥物為阿黴素(200nM)；於人類惡性腦瘤細胞株DBTRG的組別中，所使用的化療藥物為替莫唑胺(80μg/ml)；於人類胰臟癌細胞株AsPC1的組別中，所使用的化療藥物為吉西他濱(20μM)；於人類卵巢癌細胞
株SKOV3的組別中，所使用的化療藥物為卡鉑(20μM)。而於試驗組4和試驗組5中，所處理的實施例3之表達嵌合抗原受體細胞的細胞數為1×105cells，於試驗組2和試驗組3中所處理的初代T細胞的細胞數亦為1×105cells。再將經處理的各組細胞以Annexin V-FITC和PI進行細胞染色，並以流式細胞儀檢測細胞凋亡和死亡的狀況，並計算染上Annexin V-FITC和/或PI的細胞百分比的總和而得到細胞毒殺作用。每個組別皆進行獨立的三重複試驗後，統計細胞毒殺作用結果。
請參照第8A圖、第8B圖、第8C圖、第8D圖、第8E圖、第8F圖、第8G圖、第8H圖和第8I圖，為本發明之實施例3之表達嵌合抗原受體細胞誘導腫瘤細胞死亡的分析結果圖。其中第8A圖為實施例3之表達嵌合抗原受體細胞誘導人類乳癌細胞株MDA-MB-231死亡的分析結果圖，第8B圖為第8A圖三重複試驗後的統計圖。第8C圖為實施例3之表達嵌合抗原受體細胞誘導人類惡性腦瘤細胞株DBTRG死亡的分析結果圖，第8D圖為第8C圖三重複試驗後的統計圖。第8E圖為實施例3之表達嵌合抗原受體細胞誘導人類胰臟癌細胞株AsPC1死亡的分析結果圖，第8F圖為第8E圖三重複試驗後的統計圖。第8G圖為實施例3之表達嵌合抗原受體細胞誘導人類卵巢癌細胞株SKOV3死亡的分析結果圖，第8H圖為第8G圖的統計圖。第8H圖為第8G圖的統計圖，第8I圖為第8A圖、第8C圖、第8E圖和第8G圖三重複試驗後的統計圖。圖中P表示親代初代T細胞，H表示
實施例3之表達嵌合抗原受體細胞，D表示阿黴素，T表示替莫唑胺，G表示吉西他濱，C表示卡鉑。
由第8A圖和第8B圖的結果顯示，在未處理的控制組，僅見約10%的人類乳癌細胞株MDA-MB-231死亡，而處理阿黴素的試驗組1和處理親代初代T細胞的試驗組2，雖人類乳癌細胞株MDA-MB-231死亡率有增加，但不具有統計意義的差異。而處理親代初代T細胞和阿黴素的試驗組3，人類乳癌細胞株MDA-MB-231死亡率可提高至約20%，與試驗組2相比具有統計意義的差異(p<0.01)。而處理實施例3之表達嵌合抗原受體細胞的試驗組4其誘導的人類乳癌細胞株MDA-MB-231死亡率超過30%，與試驗組2相比具有統計意義的差異(p<0.001)。此外，處理實施例3之表達嵌合抗原受體細胞和阿黴素的試驗組5其誘導的人類乳癌細胞株MDA-MB-231死亡率更可達接近50%，與試驗組4相比具有統計意義的差異(p<0.05)，與試驗組3相比亦具有統計意義的差異(p<0.001)。
由第8C圖和第8D圖的結果顯示，在未處理的控制組，僅見不到20%的人類惡性腦瘤細胞株DBTRG死亡，而處理替莫唑胺的試驗組1和處理親代初代T細胞的試驗組2，雖人類惡性腦瘤細胞株DBTRG死亡率有增加，但不具有統計意義的差異。而處理親代初代T細胞和替莫唑胺的試驗組3，人類惡性腦瘤細胞株DBTRG死亡率可提高至30%，但仍不具有統計意義的差異。而處理實施例3之表達嵌合抗原受體細胞的試驗組4其誘導的人類惡性腦瘤細胞
株DBTRG死亡率可超過50%，與試驗組2相比具有統計意義的差異(p<0.001)。此外，處理實施例3之表達嵌合抗原受體細胞和替莫唑胺的試驗組5其誘導的人類惡性腦瘤細胞株DBTRG的死亡率更可接近80%，與試驗組4相比具有統計意義的差異(p<0.05)，與試驗組3相比亦具有統計意義的差異(p<0.001)。
由第8E圖和第8F圖的結果顯示，在未處理的控制組，僅見不到20%的人類胰臟癌細胞株AsPC1死亡，而處理吉西他濱的試驗組1雖人類胰臟癌細胞株AsPC1死亡率有增加，但不具有統計意義的差異。處理親代初代T細胞的試驗組2，其細胞毒殺作用和控制組相當。而處理親代初代T細胞和吉西他濱的試驗組3，人類胰臟癌細胞株AsPC1死亡率可提高至超過30%，與試驗組2相比具有統計意義的差異(p<0.05)。而處理實施例3之表達嵌合抗原受體細胞的試驗組4其誘導的人類胰臟癌細胞株AsPC1死亡率可提高至超過50%，與試驗組2相比具有統計意義的差異(p<0.001)。此外，處理實施例3之表達嵌合抗原受體細胞和吉西他濱的試驗組5其誘導的人類胰臟癌細胞株AsPC1的死亡率更達約60%，與試驗組4相比具有統計意義的差異(p<0.01)，與試驗組3相比亦具有統計意義的差異(p<0.01)。
由第8G圖和第8H圖的結果顯示，在未處理的控制組，僅見不到10%的人類卵巢癌細胞株SKOV3死亡，而處理卡鉑的試驗組1和處理親代初代T細胞的試驗組2，雖
人類卵巢癌細胞株SKOV3死亡率有增加，但不具有統計意義的差異。而處理親代初代自然殺手細胞和卡鉑的試驗組3，人類卵巢癌細胞株SKOV3死亡率可達約30%，與試驗組2相比具有統計意義的差異(p<0.05)。而處理實施例3之表達嵌合抗原受體細胞的試驗組4其誘導的人類卵巢癌細胞株SKOV3死亡率可達接近60%，與試驗組2相比具有統計意義的差異(p<0.001)。此外，處理實施例3之表達嵌合抗原受體細胞和卡鉑的試驗組5其誘導的人類卵巢癌細胞株SKOV3的死亡率更可達超過60%，與試驗組4相比具有統計意義的差異(p<0.05)，與試驗組3相比亦具有統計意義的差異(p<0.001)。
由第8I圖的結果顯示，處理實施例3之表達嵌合抗原受體細胞對於乳癌細胞、多形性膠質母細胞瘤細胞、胰臟癌細胞或卵巢癌細胞皆具有優異的毒殺作用，是以本發明之表達嵌合抗原受體細胞可用以製備誘導哺乳類動物之腫瘤細胞死亡之藥物。此外，同時處理實施例3之表達嵌合抗原受體細胞和化療藥物，對於乳癌細胞、多形性膠質母細胞瘤細胞、胰臟癌細胞或卵巢癌細胞的毒殺作用更為顯著，顯示本發明之用於治療癌症之醫藥組合物，較佳地可包含化療藥物，可以有效地毒殺腫瘤細胞進而治療癌症。
2.4.處理化療藥物會增加腫瘤細胞細胞膜上人類白細胞抗原G的表現
本試驗例進一步的探討同時處理本發明之表達嵌合抗原受體細胞和化療藥物的組別具有更優異的毒殺腫瘤細胞效果的原因。
先分別將人類乳癌細胞株MDA-MB-231、人類惡性腦瘤細胞株DBTRG、人類胰臟癌細胞株AsPC1以及人類卵巢癌細胞株SKOV3以2×105cells/well的密度種於6孔盤，再培養至隔天待細胞貼附後進行試驗。試驗上每種腫瘤細胞分為2個組別，分別為未處理的控制組以及處理化療藥物48小時的試驗組。其中於人類乳癌細胞株MDA-MB-231的組別中，所使用的化療藥物為阿黴素(200nM)；於人類惡性腦瘤細胞株DBTRG的組別中，所使用的化療藥物為替莫唑胺(80μg/ml)；於人類胰臟癌細胞株AsPC1的組別中，所使用的化療藥物為吉西他濱(20μM)；於人類卵巢癌細胞株SKOV3的組別中，所使用的化療藥物為卡鉑(20μM)。再將經處理的各組腫瘤細胞以免疫螢光染色法和流式細胞儀檢測腫瘤細胞於細胞表面的人類白細胞抗原G的表現。
請參照第9A圖、第9B圖、第9C圖、第9D圖、第9E圖、第9F圖、第9G圖和第9H圖，為分析腫瘤細胞接受化學治療後HLA-G表現量的免疫螢光染色結果圖。其中第9A圖為控制組的人類乳癌細胞株MDA-MB-231的免疫螢光染色結果圖，第9B圖為處理阿黴素的人類乳癌細胞株MDA-MB-231的免疫螢光染色結果圖，第9C圖為控制組的人類惡性腦瘤細胞株DBTRG的免疫螢光染色結果圖，第9D
圖為處理替莫唑胺的人類惡性腦瘤細胞株DBTRG的免疫螢光染色結果圖，第9E圖為控制組的人類胰臟癌細胞株AsPC1的免疫螢光染色結果圖，第9F圖為處理吉西他濱的人類胰臟癌細胞株AsPC1的免疫螢光染色結果圖，第9G圖為控制組的人類卵巢癌細胞株SKOV3的免疫螢光染色結果圖，第9H圖為處理卡鉑的人類卵巢癌細胞株SKOV3的免疫螢光染色結果圖。其中Pan-cadherin為上皮-間質細胞轉化相關蛋白質，其可表示細胞膜的位置；而細胞核的位置以DAPI的染色結果表示(藍色螢光處)。
由第9A圖第9B圖的結果顯示，處理阿黴素可增加人類乳癌細胞株MDA-MB-231細胞膜上人類白細胞抗原G的表現。由第9C圖和第9D圖的結果顯示，處理替莫唑胺可增加人類惡性腦瘤細胞株DBTRG細胞膜上人類白細胞抗原G的表現。由第9E圖和第9F圖的結果顯示，處理吉西他濱可增加人類胰臟癌細胞株AsPC1細胞膜上人類白細胞抗原G的表現。由第9G圖和第9H圖的結果顯示，處理卡鉑可增加人類卵巢癌細胞株SKOV3細胞膜上人類白細胞抗原G的表現。
請再參照第10A圖、第10B圖、第10C圖、第10D圖和第10E圖，為腫瘤細胞接受化學治療後HLA-G表現量的流式細胞術分析結果圖。其中第10A圖為人類乳癌細胞株MDA-MB-231的流式細胞術分析結果圖，第10B圖為人類惡性腦瘤細胞株DBTRG的流式細胞術分析結果圖，第10C圖為人類胰臟癌細胞株AsPC1的流式細胞術分析結果
圖，第10D圖為人類卵巢癌細胞株SKOV3的流式細胞術分析結果圖，第10E圖為第10A圖至第10D圖的統計圖。
第10A圖至第10E圖的結果顯示，控制組的人類乳癌細胞株MDA-MB-231的平均螢光強度僅有12.27%，而試驗組的人類乳癌細胞株MDA-MB-231的平均螢光強度增加至64.45%，其具有統計意義的差異(p<0.001)。控制組的人類惡性腦瘤細胞株DBTRG的平均螢光強度僅有14.01%，而試驗組的人類惡性腦瘤細胞株DBTRG的平均螢光強度為22.33%，其具有統計意義的差異(p<0.001)。控制組的人類胰臟癌細胞株AsPC1的平均螢光強度僅有13.18%，而試驗組的人類胰臟癌細胞株AsPC1的平均螢光強度可增加至41.44%，其具有統計意義的差異(p<0.01)。控制組的人類卵巢癌細胞株SKOV3的平均螢光強度僅有14.69%，而試驗組的人類卵巢癌細胞株SKOV3的平均螢光強度為38.58%，其具有統計意義的差異(p<0.01)。
由第9A圖至第10E圖的結果顯示，處理化療藥物可增加腫瘤細胞細胞膜上人類白細胞抗原G的表現，而本發明之表達嵌合抗原受體細胞所表達的嵌合抗原受體可專一性的與人類白細胞抗原G結合，是以處理過化療藥物後再處理本發明之表達嵌合抗原受體細胞，或同時處理本發明之表達嵌合抗原受體細胞和化療藥物，可具有更優異的毒殺腫瘤細胞效果。
請參照第11圖，繪示本發明之嵌合抗原受體於本發明之表達嵌合抗原受體細胞質膜內的理論結構和作用機制示意圖。本發明之表達嵌合抗原受體細胞為經遺傳工程改造的自然殺手細胞或T細胞，其表達本發明之嵌合抗原受體，而本發明之嵌合抗原受體係由抗HLA-G抗體(scFv)、HLA-G受體(KIR)和共刺激域(DAP12)所組成的腫瘤靶向受體複合物，較佳地，可更包含自殺蛋白-iCas9。本發明之表達嵌合抗原受體細胞可專一性的辨識腫瘤細胞膜上的人類白細胞抗原G，進而對腫瘤細胞進行毒殺作用。較佳地，當腫瘤細胞處理化療藥物時，可以正調控腫瘤細胞質膜上的人類白細胞抗原G表達，使本發明之表達嵌合抗原受體細胞與腫瘤細胞表面上特異性識別的人類白細胞抗原G結合後觸發信號轉導，產生信號級聯導致本發明之表達嵌合抗原受體細胞的活化和增殖，進而引發溶解顆粒的胞吐作用並殺死標靶的腫瘤細胞。
綜上所述，本發明之嵌合抗原受體具有優異的專一性結合腫瘤細胞能力，特別是與腫瘤細胞之細胞膜上所表現的人類白細胞抗原G專一性結合，因而可使表現本發明之嵌合抗原受體的表達嵌合抗原受體細胞專一性的靶向腫瘤細胞，避免脫靶效應，進而有效地毒殺腫瘤細胞，是以可用以製備誘導哺乳類動物之腫瘤細胞死亡之藥物。本發明之用於治療癌症之醫藥組合物，包含本發明之表達嵌合抗原受體細胞，可有效地毒殺腫瘤細胞進而治療癌症。而進一步包含化療藥物的用於治療癌症之醫藥組合物，其可進一步誘導
腫瘤細胞的細胞膜大量表現人類白細胞抗原G，因而可增進表達嵌合抗原受體細胞對於腫瘤細胞的毒殺作用，是以具有更優異的腫瘤細胞毒殺作用。
然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作各種的更動與潤飾，因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。
<110> 中國醫藥大學附設醫院
<120> 嵌合抗原受體、核酸、嵌合抗原受體表達質體、表達嵌合抗原受體細胞、其用途以及用於治療癌症之醫藥組合物
<160> 17
<210> 1
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗HLA-G抗體
<400> 1
<210> 2
<211> 75
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-G受體
<400> 2
<210> 3
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共刺激域片段
<400> 3
<210> 4
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> iCas9
<400> 4
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 5
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 6
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 7
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 8
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3
<400> 9
<210> 10
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A胜肽
<400> 10
<210> 11
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼抗HLA-G抗體片段
<400> 11
<210> 12
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼HLA-G受體片段
<400> 12
<210> 13
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼共刺激域片段
<400> 13
<210> 14
<211> 1317
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> iCas9
<400> 14
<210> 15
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A胜肽
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<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 啟動子
<400> 16
<210> 17
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼訊息胜肽片段
<400> 17
Claims (17)
- 一種嵌合抗原受體，其與人類白細胞抗原G(human leukocyte antigen G,HLA-G)專一性結合，該嵌合抗原受體包含：從N端至C端依序排列之如序列辨識編號1所示之一抗HLA-G抗體、如序列辨識編號2所示之一HLA-G受體以及如序列辨識編號3所示之一共刺激域。
- 如申請專利範圍第1項所述之嵌合抗原受體，更包含如序列辨識編號4所示之一自殺蛋白，其係連接於該共刺激域之C端。
- 如申請專利範圍第1項所述之嵌合抗原受體，更包含一2A胜肽，該2A胜肽串接該HLA-G受體及該共刺激域。
- 一種單離的核酸，其係編碼如申請專利範圍第1項所述之嵌合抗原受體，該核酸包含：依序排列之如序列辨識編號11所示之一編碼抗HLA-G抗體片段、如序列辨識編號12所示之一編碼HLA-G受體片段以及如序列辨識編號13所示之一編碼共刺激域片段。
- 如申請專利範圍第4項所述之核酸，更包含如序列辨識編號14所示之一自殺基因，其係連接於該編碼共刺激域片段之3’端。
- 如申請專利範圍第4項所述之核酸，更包含一編碼2A胜肽序列，該編碼2A胜肽序列串接該編碼HLA-G受體片段及該編碼共刺激域片段。
- 一種嵌合抗原受體表達質體，其包含：依序排列之如序列辨識編號15所示之一起動子以及如申請專利範圍第4項所述之核酸。
- 如申請專利範圍第7項所述之嵌合抗原受體表達質體，更包含如序列辨識編號14所示之一自殺基因，其係連接於該核酸之3’端。
- 一種表達嵌合抗原受體細胞，包含：一免疫細胞；以及如申請專利範圍第7項或第8項所述之嵌合抗原受體表達質體。
- 如申請專利範圍第9項所述之表達嵌合抗原受體細胞，其中該免疫細胞為一T細胞。
- 如申請專利範圍第9項所述之表達嵌合抗原受體細胞，其中該免疫細胞為一自然殺手細胞。
- 如申請專利範圍第11項所述之表達嵌合抗原受體細胞，其中該自然殺手細胞為NK-92細胞株或初代自然殺手細胞。
- 一種用於治療癌症之醫藥組合物，包含：如申請專利範圍第9項所述之表達嵌合抗原受體細胞；以及一醫藥上可接受載劑。
- 如申請專利範圍第13項所述之用於治療癌症之醫藥組合物，更包含一化療藥物。
- 如申請專利範圍第13項所述之用於治療癌症之醫藥組合物，其中該化療藥物為阿黴素(doxorubicin)、替莫唑胺(temozolomide)、吉西他濱(gemcitabine)或卡鉑(carboplatin)。
- 一種如申請專利範圍第9項所述之表達嵌合抗原受體細胞之用途，其係用於製備誘導哺乳類動物之一腫瘤細胞死亡之藥物。
- 如申請專利範圍第16項所述之表達嵌合抗原受體細胞之用途，其中該腫瘤細胞為一乳癌細胞、一多形性膠質母細胞瘤細胞、一胰臟癌細胞或一卵巢癌細胞。
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