TWI717880B - Hla-g特異性嵌合抗原受體、核酸、hla-g特異性嵌合抗原受體表達質體、表達hla-g特異性嵌合抗原受體細胞、其用途以及用於治療癌症之醫藥組合物 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種HLA-G特異性嵌合抗原受體、單離的核酸、HLA-G特異性嵌合抗原受體表達質體、表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞、用於治療癌症之醫藥組合物以及表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞之用途。HLA-G特異性嵌合抗原受體與人類白細胞抗原G專一性結合。表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞係將HLA-G特異性嵌合抗原受體轉導至免疫細胞中而得。用於治療癌症之醫藥組合物，包含表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞和醫藥上可接受載劑。藉此，表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞可用於誘導哺乳類動物之腫瘤細胞死亡。

Description

HLA-G特異性嵌合抗原受體、核酸、HLA-G特異性嵌合 抗原受體表達質體、表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞、其用途以及用於治療癌症之醫藥組合物
本發明是有關於一種含有抗原或抗體的醫藥製品，特別是一種嵌合抗原受體、編碼嵌合抗原受體的核酸、嵌合抗原受體表達質體、表達嵌合抗原受體細胞、治療癌症之醫藥組合物以及表達嵌合抗原受體細胞之用途。
癌症又名為惡性腫瘤，為細胞不正常增生，且這些增生的細胞可能侵犯身體的其他部分，為由控制細胞分裂增殖機制失常而引起的疾病。全世界罹患癌症的人口有不斷增加的趨勢，癌症係國人十大死因之一，且已連續二十七年為居十大死因之榜首。
常規的腫瘤治療方法包括手術治療、放射線治療、化學治療及標靶治療等。腫瘤免疫治療為上述治療方法 以外的另一種治療腫瘤的方法，係透過激活患者自身免疫系統，利用腫瘤細胞或腫瘤抗原物質誘導機體的特異性細胞免疫和體液免疫反應，增強機體的抗癌能力，阻止腫瘤的生長、擴散和復發，以達到清除或控制腫瘤的目的。
腫瘤免疫治療主要有三大方向-腫瘤疫苗、細胞治療和免疫檢查點抑制劑，其中嵌合抗原受體免疫細胞技術為近年來發展非常迅速的細胞治療。習知技術中，嵌合抗原受體免疫細胞是將能識別某種腫瘤抗原的抗體的抗原結合部與CD3-δ鏈或FcεRIγ的胞內部分在體外偶聯為一個嵌合蛋白，藉由基因轉導的方法轉染患者的免疫細胞，使其表達嵌合抗原受體，其在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治療上有著顯著的療效，被認為是最有前景的腫瘤治療方式之一。但目前嵌合抗原受體免疫細胞的細胞治療因缺乏獨特的腫瘤相關抗原、免疫細胞歸位至腫瘤位址的效率低及無法克服實體性腫瘤的免疫抑制性微環境，使得嵌合抗原受體在實體性腫瘤的功效受到極大限制。
本發明之目的是在提供一種HLA-G特異性嵌合抗原受體、單離的核酸、HLA-G特異性嵌合抗原受體表達質體、表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞、用於治療癌症之醫藥組合物以及表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞之用途。所述HLA-G特異性嵌合抗原受體具有優異的專一性結合腫瘤細胞能力。所述核酸編碼所述HLA-G特異性 嵌合抗原受體。而所述HLA-G特異性嵌合抗原受體表達質體包含所述核酸。所述表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞包含所述HLA-G特異性嵌合抗原受體表達質體，其表現所述HLA-G特異性嵌合抗原受體，可以專一性的靶向腫瘤細胞，避免脫靶效應，進而有效地毒殺腫瘤細胞，是以可用以製備誘導哺乳類動物之腫瘤細胞死亡之藥物。而所述用於治療癌症之醫藥組合物包含所述表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞，可有效地毒殺腫瘤細胞進而治療癌症。
依據本發明之一態樣之一實施方式是提供一種HLA-G特異性嵌合抗原受體，包含抗原辨識域、跨膜域、IL2受體β鏈訊息傳遞域和CD3ζ訊息傳遞域。前述抗原辨識域包含對人類白細胞抗原G(human leukocyte antigen G,HLA-G)具特異性之單株抗體片段，且抗原辨識域之胺基酸序列如序列辨識編號1所示。前述跨膜域之胺基酸序列如序列辨識編號2所示。前述IL2受體β鏈訊息傳遞域之胺基酸序列如序列辨識編號3所示。前述CD3ζ訊息傳遞域之胺基酸序列如序列辨識編號4所示。
依據前述之HLA-G特異性嵌合抗原受體，可更包含如序列辨識編號5所示之信號肽鏈，其係連接於抗原辨識域之N端。
依據前述之HLA-G特異性嵌合抗原受體，可更包含CD8鉸鏈區域，其中前述CD8鉸鏈區域連接抗原辨識域和跨膜域。
本發明之一態樣之另一實施方式是提供一種單離的核酸，其係編碼如前段所述之HLA-G特異性嵌合抗原受體。所述核酸包含依序排列之如序列辨識編號12所示之一編碼抗原辨識域片段、如序列辨識編號13所示之一編碼跨膜域片段、如序列辨識編號14所示之一編碼IL2受體β鏈訊息傳遞域片段以及如序列辨識編號15所示之一編碼CD3ζ訊息傳遞域片段。
依據前述之單離的核酸，可更包含如序列辨識編號16所示之一編碼信號肽鏈片段，其係連接於編碼抗原辨識域片段之5’端。
依據前述之單離的核酸，可更包含一編碼CD8鉸鏈區域序列，前述編碼CD8鉸鏈區域序列連接編碼抗原辨識域片段及編碼跨膜域片段。
本發明之一態樣之再一實施方式是提供一種HLA-G特異性嵌合抗原受體表達質體，所述嵌合抗原受體表達質體包含依序排列之如序列辨識編號18所示之一起動子以及如前段所述之核酸。
本發明之一態樣之又一實施方式是提供一種表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞，包含免疫細胞和如前段所述之HLA-G特異性嵌合抗原受體表達質體。
依據前述之表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞，其中所述免疫細胞可為T細胞或自然殺手細胞。較佳地，所述自然殺手細胞可為NK-92細胞株或初代自然殺手細胞。
本發明之一態樣之又一實施方式是提供一種用於治療癌症之醫藥組合物，包含如前段所述之表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞，以及醫藥上可接受載劑。
依據前述之用於治療癌症之醫藥組合物，可更包含化療藥物。較佳地，所述化療藥物可為阿黴素(doxorubicin)、替莫唑胺(temozolomide)、吉西他濱(gemcitabine)或卡鉑(carboplatin)。
本發明之另一態樣之一實施方式是提供一種如前段所述之表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞之用途，其係用於製備誘導哺乳類動物之腫瘤細胞死亡之藥物。
依據前述之表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞之用途，所述腫瘤細胞可為乳癌細胞、多形性膠質母細胞瘤細胞、胰臟癌細胞或卵巢癌細胞。
上述發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：
第1圖繪示本發明之抗原辨識域之蛋白質結構示意圖；
第2圖繪示本發明之HLA-G特異性嵌合抗原受體表達質體之構築示意圖；
第3A圖、第3B圖、第3C圖、第3D圖、第3E圖、第3F圖、第3G圖和第3H圖為本發明之實施例1之表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞誘導腫瘤細胞死亡的分析結果圖；
第4A圖、第4B圖、第4C圖、第4D圖、第4E圖、第4F圖、第4G圖和第4H圖為本發明之實施例2之表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞誘導腫瘤細胞死亡的分析結果圖；以及
第5圖為分析腫瘤細胞接受化學治療後HLA-G表現量的流式細胞術分析結果統計圖。
本說明書揭露內容提出一種HLA-G特異性嵌合抗原受體、編碼所述HLA-G特異性嵌合抗原受體的核酸、包含所述核酸的HLA-G特異性嵌合抗原受體表達質體、包含所述HLA-G特異性嵌合抗原受體表達質體的表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞、其用途以及包含表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞的用於治療癌症之醫藥組合物。說明書中以腫瘤細胞之細胞試驗，證明本發明之HLA-G特異性嵌合抗原受體具有優異的專一性結合腫瘤細胞能力，特別是與腫瘤細胞之細胞膜上所表現的人類白細胞抗原G(human leukocyte antigen G,HLA-G)專一性結合，因而可使表現本發明之HLA-G特異性嵌合抗原受體的表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞專一性的靶向腫瘤細胞，避免脫靶效應，進而有效地毒殺腫瘤細胞，是以可用以 製備誘導哺乳類動物之腫瘤細胞死亡之藥物。而所述本發明之用於治療癌症之醫藥組合物，包含本發明之表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞，並可進一步的包含化療藥物，可有效地毒殺腫瘤細胞進而治療癌症。
本說明書中所述之「人類白細胞抗原G(human leukocyte antigen G,HLA-G)」係由HLA-G基因所編碼，為非典型第一類主要組織相容性複合體(major histocompatibility complex,MHC)，重鏈大約45kDa。HLA-G在胎兒來源的胎盤細胞上表達，在免疫應答的負調節中十分活躍，其主要作用在於抑制細胞毒性免疫細胞功能。
茲以下列具體試驗例進一步示範說明本發明，用以有利於本發明所屬技術領域通常知識者，可在不需過度解讀的情形下完整利用並實踐本發明，而不應將這些試驗例視為對本發明範圍的限制，但用於說明如何實施本發明的材料及方法。
[試驗例] 一、本發明之HLA-G特異性嵌合抗原受體、單離的核酸以及HLA-G特異性嵌合抗原受體表達質體
本發明之HLA-G特異性嵌合抗原受體，包含如序列辨識編號1所示之抗原辨識域、如序列辨識編號2所示之跨膜域、如序列辨識編號3所示之IL2受體β鏈訊息傳遞域和如序列辨識編號4所示之CD3ζ訊息傳遞域。抗原辨識域包含對人類白細胞抗原G(human leukocyte antigen G, HLA-G)具特異性之單株抗體片段。較佳地，其於抗原辨識域之N端可更連接如序列辨識編號5所示之信號肽鏈，以及更包含如序列辨識編號11所示之CD8鉸鏈區域連接所述抗原辨識域和跨膜域。詳細地說，序列辨識編號1所示之抗原辨識域中包含重鏈(HC)免疫球蛋白可變域序列和輕鏈(LC)免疫球蛋白可變域序列。其中重鏈免疫球蛋白可變域序列為如序列辨識編號6所示之CDRH1、如序列辨識編號7所示之CDRH2以及如序列辨識編號8所示之CDRH3。輕鏈免疫球蛋白可變域序列為如序列辨識編號9所示之CDRL1、序列為RMS之CDRL2以及如序列辨識編號10所示之CDRL3。請參照第1圖，繪示本發明之抗原辨識域之蛋白質結構示意圖，其中灑點的環狀區域表示本發明之抗原辨識域中的可變域。
本發明之單離的核酸係編碼本發明之HLA-G特異性嵌合抗原受體。所述核酸包含依序排列之如序列辨識編號12所示之編碼抗原辨識域片段、如序列辨識編號13所示之編碼跨膜域片段、如序列辨識編號14所示之編碼IL2受體β鏈訊息傳遞域片段以及如序列辨識編號15所示之編碼CD3ζ訊息傳遞域片段。較佳地，其於編碼抗原辨識域片段之5’端可更連接如序列辨識編號16所示之編碼信號肽鏈片段，以及可更包含如序列辨識編號17所示之編碼CD8鉸鏈區域序列連接所述編碼抗原辨識域片段及所述編碼跨膜域片段。如序列辨識編號12所示之編碼抗原辨識域片段係編碼如序列辨識編號1所示之抗原辨識域，序列辨識編號13所 示之編碼跨膜域片段係編碼如序列辨識編號2所示之跨膜域，序列辨識編號14所示之編碼IL2受體β鏈訊息傳遞域片段係編碼如序列辨識編號3所示之IL2受體β鏈訊息傳遞域，序列辨識編號15所示之編碼CD3ζ訊息傳遞域片段係編碼如序列辨識編號4所示之CD3ζ訊息傳遞域，序列辨識編號16所示之編碼信號肽鏈片段係編碼如序列辨識編號5所示之信號肽鏈，序列辨識編號17所示之編碼CD8鉸鏈區域係編碼如序列辨識編號11所示之CD8鉸鏈區域。
請參照第2圖，繪示本發明之HLA-G特異性嵌合抗原受體表達質體之構築示意圖。詳細地說，於本試驗例中所示之一實施例，HLA-G特異性嵌合抗原受體表達質體為Lenti-EF1a-H-28-IL2RB-Z質體，其內插子(insert)片段包含依序排列之起動子、編碼抗原辨識域片段、編碼跨膜域片段、編碼IL2受體β鏈訊息傳遞域片段以及編碼CD3ζ訊息傳遞域片段。起動子為如序列辨識編號18所示的EF-1 alpha起動子，編碼抗原辨識域片段的序列如如序列辨識編號12所示，編碼跨膜域片段的序列如序列辨識編號13所示，編碼IL2受體β鏈訊息傳遞域片段的序列如序列辨識編號14所示，編碼CD3ζ訊息傳遞域片段的序列如序列辨識編號15所示。此外，內插子上還包含如序列辨識編號16所示之編碼信號肽鏈片段和序列辨識編號17所示之編碼CD8鉸鏈區域序列。編碼信號肽鏈片段連接於編碼抗原辨識域片段的5’端，編碼CD8鉸鏈區域序列連接所述編碼抗原辨識域片段及編碼跨膜域片段。再將內插子片段構築於Creative Biolabs載體(Creative Biolabs,NY,USA)上，以得到Lenti-EF1a-H-28-IL2RB-Z質體。所使用的載體為慢病毒(lentivirus)載體系統，因此可將構築完成的HLA-G特異性嵌合抗原受體表達質體轉染至表現細胞中生產慢病毒，後續可利用慢病毒將HLA-G特異性嵌合抗原受體轉導至免疫細胞中。
二、本發明之表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞、其用途以及用於治療癌症之醫藥組合物
本發明之表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞係將本發明之HLA-G特異性嵌合抗原受體利用慢病毒轉導至免疫細胞中而得到。較佳地，所述免疫細胞可為T細胞或自然殺手細胞。更佳地，所述自然殺手細胞可為NK-92細胞株或初代自然殺手細胞。詳細地說，將構築完成的Lenti-EF1a-H-28-IL2RB-Z質體，先利用lipofectamine 3000(Invitrogen)轉染至293T細胞株中以製備帶有本發明之HLA-G特異性嵌合抗原受體的慢病毒，再將含有製備完成的慢病毒的上清液和8μg/ml的聚凝胺(polybrene,Sigma-Aldrich)的Opti-MEM(Invitrogen)培養初代T細胞3天，以將本發明之HLA-G特異性嵌合抗原受體轉導至初代T細胞中。以及將含有製備完成的慢病毒的上清液和50μg/ml的魚精蛋白(Protamine sulfate,Sigma-Aldrich)的Opti-MEM(Invitrogen)培養初代自然殺手細胞7天，以將本發明之嵌合抗原受體轉導至初代自然殺手細胞或NK-92細胞株中，可得本發明之表達HLA-G特異性嵌合抗 原受體細胞。所得到的表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞具有誘導哺乳類動物之腫瘤細胞死亡的效果，是以可用以製備誘導哺乳類動物之腫瘤細胞死亡之藥物。較佳地，腫瘤細胞可為乳癌細胞、多形性膠質母細胞瘤細胞、胰臟癌細胞或卵巢癌細胞。
本發明之用於治療癌症之醫藥組合物包含本發明之表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞以及醫藥上可接受載劑。較佳地，所述用於治療癌症之醫藥組合物可更包含化療藥物。更佳地，所述化療藥物可為阿黴素(doxorubicin)、替莫唑胺(temozolomide)、吉西他濱(gemcitabine)或卡鉑(carboplatin)。
以下的試驗例將以數據證明本發明之表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞以及包含本發明之表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞之用於治療癌症之醫藥組合物對於多種哺乳類動物之腫瘤細胞皆具有良好的誘導其死亡的效果。試驗上所使用的腫瘤細胞分別為人類乳癌細胞株MDA-MB-231、人類惡性腦瘤細胞株DBTRG-05MG(以下簡稱DBTRG)、人類胰臟癌細胞株AsPC1以及人類卵巢癌細胞株SKOV3。所使用的腫瘤細胞株皆購自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。人類乳癌細胞株MDA-MB-231細胞株為三陰性乳腺癌細胞株，即荷爾蒙受體(ER、PR)和HER-2受體為陰性，其培養於含10%胎牛血清(FBS)的RPMI培養液中。人類惡性腦瘤細胞株DBTRG培養於含10%胎牛血清的 DMEM培養液中。人類胰臟癌細胞株AsPC1培養於含10%胎牛血清的RPMI培養液中。人類卵巢癌細胞株SKOV3培養於含10%胎牛血清的McCoy’s 5A培養液中。
2.1. 實施例1
於本試驗例中，將本發明之HLA-G特異性嵌合抗原受體轉導至初代自然殺手細胞可得到本發明之實施例1之表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞(以下簡稱為實施例1)。並進一步測試實施例1以及包含實施例1之用於治療癌症之醫藥組合物誘導乳癌細胞、多形性膠質母細胞瘤細胞、胰臟癌細胞和卵巢癌細胞死亡的效果。
先分別將人類乳癌細胞株MDA-MB-231、人類惡性腦瘤細胞株DBTRG、人類胰臟癌細胞株AsPC1以及人類卵巢癌細胞株SKOV3以1×105cells/well的密度種於12孔盤，再培養48小時後進行試驗。試驗上每種腫瘤細胞分為6個組別，分別為未處理的控制組、處理化療藥物的試驗組1、處理親代初代自然殺手細胞的試驗組2、處理親代初代自然殺手細胞和化療藥物的試驗組3、處理實施例1的試驗組4以及處理實施例1和化療藥物的試驗組5。其中於人類乳癌細胞株MDA-MB-231的組別中，所使用的化療藥物為阿黴素(200nM)；於人類惡性腦瘤細胞株DBTRG的組別中，所使用的化療藥物為替莫唑胺(80μg/ml)；於人類胰臟癌細胞株AsPC1的組別中，所使用的化療藥物為吉西他濱(20μM)；於人類卵巢癌細胞株SKOV3的組別中，所使用的化療藥物為卡鉑(20μM)。而於試驗組4和試驗組5 中，所處理實施例1的細胞數為1×105cells，於試驗組2和試驗組3中所處理的親代初代自然殺手細胞的細胞數亦為1×105cells。再將經處理的各組細胞以Annexin V-FITC和PI進行細胞染色，並計算染上Annexin V-FITC和/或PI的細胞百分比的總和而得到細胞毒殺作用。每個組別皆進行獨立的三重複試驗後，統計細胞毒殺作用結果。
第3A圖、第3B圖、第3C圖、第3D圖、第3E圖、第3F圖、第3G圖和第3H圖，為實施例1誘導腫瘤細胞死亡的分析結果圖。其中第3A圖為實施例1誘導人類乳癌細胞株MDA-MB-231死亡的分析結果圖，第3B圖為第3A圖三重複試驗後的統計圖。第3C圖為實施例1誘導人類惡性腦瘤細胞株DBTRG死亡的分析結果圖，第3D圖為第3C圖三重複試驗後的統計圖。第3E圖為實施例1誘導人類胰臟癌細胞株AsPC1死亡的分析結果圖，第3F圖為第3E圖三重複試驗後的統計圖。第3G圖為實施例1誘導人類卵巢癌細胞株SKOV3死亡的分析結果圖，第3H圖為第3G圖三重複試驗後的統計圖。第3B圖、第3D圖、第3F圖和第3H圖中的P表示親代初代自然殺手細胞。
由第3A圖和第3B圖的結果顯示，在未處理的控制組，僅見約5%的人類乳癌細胞株MDA-MB-231死亡，而處理阿黴素的試驗組1、處理親代初代自然殺手細胞的試驗組2和處理親代初代自然殺手細胞和阿黴素的試驗組3，雖人類乳癌細胞株MDA-MB-231死亡率有增加，但不具有統計意義的差異。而處理實施例1的試驗組4其誘導 的人類乳癌細胞株MDA-MB-231死亡率約可達70%，與試驗組2相比具有統計意義的差異(p<0.001)。此外，處理實施例1和阿黴素的試驗組5其誘導的人類乳癌細胞株MDA-MB-231死亡率更可高達超過80%，與試驗組4相比具有統計意義的差異(p<0.05)，與試驗組3相比亦具有統計意義的差異(p<0.001)。
由第3C圖和第3D圖的結果顯示，在未處理的控制組，僅見不到5%的人類惡性腦瘤細胞株DBTRG死亡，而處理替莫唑胺的試驗組1、處理親代初代自然殺手細胞的試驗組2和處理親代初代自然殺手細胞和替莫唑胺的試驗組3，雖人類惡性腦瘤細胞株DBTRG死亡率有增加，但不具有統計意義的差異。而處理實施例1的試驗組4其誘導的人類惡性腦瘤細胞株DBTRG死亡率可超過60%，與試驗組2相比具有統計意義的差異(p<0.001)。此外，處理實施例1和替莫唑胺的試驗組5所誘導人類惡性腦瘤細胞株DBTRG的死亡率更可接近90%，與試驗組4相比具有統計意義的差異(p<0.01)，與試驗組3相比亦具有統計意義的差異(p<0.001)。
由第3E圖和第3F圖的結果顯示，在未處理的控制組，僅見不到5%的人類胰臟癌細胞株AsPC1死亡，而處理吉西他濱的試驗組1、處理親代初代自然殺手細胞的試驗組2和處理親代初代自然殺手細胞和吉西他濱的試驗組3，雖人類胰臟癌細胞株AsPC1死亡率有增加，但不具有統計意義的差異。而處理實施例1的試驗組4所誘導的人類胰臟 癌細胞株AsPC1死亡率約為50%，與試驗組2相比具有統計意義的差異(p<0.01)。此外，處理實施例1和吉西他濱的試驗組5其誘導的人類胰臟癌細胞株AsPC1的死亡率更達約70%，與試驗組4相比具有統計意義的差異(p<0.05)，與試驗組3相比亦具有統計意義的差異(p<0.001)。
由第3G圖和第3H圖的結果顯示，在未處理的控制組，僅見不到5%的人類卵巢癌細胞株SKOV3死亡，而處理卡鉑的試驗組1和處理親代初代自然殺手細胞的試驗組2，雖人類卵巢癌細胞株SKOV3死亡率有增加，但不具有統計意義的差異。處理親代初代自然殺手細胞和卡鉑的試驗組3，人類卵巢癌細胞株SKOV3死亡率可達接近40%，但仍不具有統計意義的差異。而處理實施例1的試驗組4所誘導的人類卵巢癌細胞株SKOV3死亡率約為50%，與試驗組2相比具有統計意義的差異(p<0.05)。此外，處理實施例1和卡鉑的試驗組5所誘導的人類卵巢癌細胞株SKOV3的死亡率更可達接近70%，與試驗組4相比具有統計意義的差異(p<0.05)，與試驗組3相比亦具有統計意義的差異(p<0.01)。
由第3A圖至第3H圖的結果顯示，處理實施例1對於乳癌細胞、多形性膠質母細胞瘤細胞、胰臟癌細胞或卵巢癌細胞皆具有優異的毒殺作用，是以本發明之表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞可用以製備誘導哺乳類動物之腫瘤細胞死亡之藥物。此外，同時處理實施例1和化療藥物，對於乳癌細胞、多形性膠質母細胞瘤細胞、胰臟癌細 胞或卵巢癌細胞的毒殺作用更為顯著，顯示本發明之用於治療癌症之醫藥組合物，較佳地可包含化療藥物，可以有效地毒殺腫瘤細胞進而治療癌症。
2.2. 實施例2
於本試驗例中，將本發明之HLA-G特異性嵌合抗原受體轉導至初代T細胞可得到本發明之實施例2之表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞(以下簡稱為實施例2)。並進一步測試實施例2以及包含實施例2之用於治療癌症之醫藥組合物誘導乳癌細胞、多形性膠質母細胞瘤細胞、胰臟癌細胞和卵巢癌細胞死亡的效果。
先分別將人類乳癌細胞株MDA-MB-231、人類惡性腦瘤細胞株DBTRG、人類胰臟癌細胞株AsPC1以及人類卵巢癌細胞株SKOV3以1×105cells/well的密度種於12孔盤，再培養48小時後進行試驗。試驗上每種腫瘤細胞分為6個組別，分別為未處理的控制組、處理化療藥物的試驗組1、處理親代初代T細胞的試驗組2、處理親代初代T細胞和化療藥物的試驗組3、處理實施例2的試驗組4以及處理實施例2和化療藥物的試驗組5。其中於人類乳癌細胞株MDA-MB-231的組別中，所使用的化療藥物為阿黴素(200nM)；於人類惡性腦瘤細胞株DBTRG的組別中，所使用的化療藥物為替莫唑胺(80μg/ml)；於人類胰臟癌細胞株AsPC1的組別中，所使用的化療藥物為吉西他濱(20μM)；於人類卵巢癌細胞株SKOV3的組別中，所使用的化療藥物為卡鉑(20μM)。而於試驗組4和試驗組5中，所處理實施例 2的細胞數為1×105cells，於試驗組2和試驗組3中所處理的初代T細胞的細胞數亦為1×105cells。再將經處理的各組細胞以Annexin V-FITC和PI進行細胞染色，並以流式細胞儀檢測細胞凋亡和死亡的狀況，並計算染上Annexin V-FITC和/或PI的細胞百分比的總和而得到細胞毒殺作用。每個組別皆進行獨立的三重複試驗後，統計細胞毒殺作用結果。
請參照第4A圖、第4B圖、第4C圖、第4D圖、第4E圖、第4F圖、第4G圖和第4H圖，為實施例2誘導腫瘤細胞死亡的分析結果圖。其中第4A圖為實施例2誘導人類乳癌細胞株MDA-MB-231死亡的分析結果圖，第4B圖為第4A圖三重複試驗後的統計圖。第4C圖為實施例2誘導人類惡性腦瘤細胞株DBTRG死亡的分析結果圖，第4D圖為第4C圖三重複試驗後的統計圖。第4E圖為實施例2誘導人類胰臟癌細胞株AsPC1死亡的分析結果圖，第4F圖為第4E圖三重複試驗後的統計圖。第4G圖為實施例2誘導人類卵巢癌細胞株SKOV3死亡的分析結果圖，第4H圖為第4G圖的統計圖。第4B圖、第4D圖、第4F圖和第4H圖中的P表示親代初代T細胞。
由第4A圖和第4B圖的結果顯示，在未處理的控制組，僅見約10%的人類乳癌細胞株MDA-MB-231死亡，而處理阿黴素的試驗組1、處理親代初代T細胞的試驗組2和處理親代初代T細胞和阿黴素的試驗組3，雖人類乳癌細胞株MDA-MB-231死亡率有增加，但不具有統計意義的 差異。而處理實施例2的試驗組4所誘導的人類乳癌細胞株MDA-MB-231死亡率接近70%，與試驗組2相比具有統計意義的差異(p<0.01)。此外，處理實施例2和阿黴素的試驗組5所誘導的人類乳癌細胞株MDA-MB-231死亡率更可達接近80%，與試驗組4相比具有統計意義的差異(p<0.05)，與試驗組3相比亦具有統計意義的差異(p<0.01)。
由第4C圖和第4D圖的結果顯示，在未處理的控制組，僅見不到10%的人類惡性腦瘤細胞株DBTRG死亡，而處理替莫唑胺的試驗組1和處理親代初代T細胞的試驗組2，雖人類惡性腦瘤細胞株DBTRG死亡率有增加，但不具有統計意義的差異。而處理親代初代T細胞和替莫唑胺的試驗組3，人類惡性腦瘤細胞株DBTRG死亡率可提高至接近40%，但仍不具有統計意義的差異。而處理實施例2的試驗組4所誘導的人類惡性腦瘤細胞株DBTRG死亡率可超過70%，與試驗組2相比具有統計意義的差異(p<0.001)。此外，處理實施例2和替莫唑胺的試驗組5所誘導的人類惡性腦瘤細胞株DBTRG的死亡率更可接近80%，與試驗組4相比具有統計意義的差異(p<0.05)，與試驗組3相比亦具有統計意義的差異(p<0.001)。
由第4E圖和第4F圖的結果顯示，在未處理的控制組，僅約5%的人類胰臟癌細胞株AsPC1死亡，而處理吉西他濱的試驗組1和處理親代初代T細胞的試驗組2，雖人類胰臟癌細胞株AsPC1死亡率有增加，但不具有統計意義的差異。而處理親代初代T細胞和吉西他濱的試驗組3，人類 胰臟癌細胞株AsPC1死亡率可提高至接近40%。而處理實施例2的試驗組4所誘導的人類胰臟癌細胞株AsPC1死亡率可提高至超過30%，與試驗組2相比具有統計意義的差異(p<0.01)。此外，處理實施例2和吉西他濱的試驗組5所誘導的人類胰臟癌細胞株AsPC1的死亡率更超過50%，與試驗組4相比具有統計意義的差異(p<0.01)，與試驗組3相比亦具有統計意義的差異(p<0.05)。
由第4G圖和第4H圖的結果顯示，在未處理的控制組，僅見不到5%的人類卵巢癌細胞株SKOV3死亡，而處理卡鉑的試驗組1、處理親代初代T細胞的試驗組2和處理親代初代T細胞和卡鉑的試驗組3，雖人類卵巢癌細胞株SKOV3死亡率有增加，但不具有統計意義的差異。而處理實施例2的試驗組4所誘導的人類卵巢癌細胞株SKOV3死亡率可達接近80%，與試驗組2相比具有統計意義的差異(p<0.001)。此外，處理實施例2和卡鉑的試驗組5所誘導的人類卵巢癌細胞株SKOV3的死亡率更可達超過80%，與試驗組4相比具有統計意義的差異(p<0.05)，與試驗組3相比亦具有統計意義的差異(p<0.001)。
由第4A圖至第4H圖的結果顯示，處理實施例2對於乳癌細胞、多形性膠質母細胞瘤細胞、胰臟癌細胞或卵巢癌細胞皆具有優異的毒殺作用，是以本發明之表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞可用以製備誘導哺乳類動物之腫瘤細胞死亡之藥物。此外，同時處理實施例2和化療藥物，對於乳癌細胞、多形性膠質母細胞瘤細胞、胰臟癌細 胞或卵巢癌細胞的毒殺作用更為顯著，顯示本發明之用於治療癌症之醫藥組合物，較佳地可包含化療藥物，可以有效地毒殺腫瘤細胞進而治療癌症。
2.3. 處理化療藥物會增加腫瘤細胞細胞膜上人類白細胞抗原G的表現
本試驗例進一步的探討同時處理本發明之表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞和化療藥物的組別具有更優異的毒殺腫瘤細胞效果的原因。
先分別將人類乳癌細胞株MDA-MB-231、人類惡性腦瘤細胞株DBTRG、人類胰臟癌細胞株AsPC1以及人類卵巢癌細胞株SKOV3以2×105cells/well的密度種於6孔盤，再培養至隔天待細胞貼附後進行試驗。試驗上每種腫瘤細胞分為2個組別，分別為未處理的控制組以及處理化療藥物48小時的化學治療組。其中於人類乳癌細胞株MDA-MB-231的組別中，所使用的化療藥物為阿黴素(200nM)；於人類惡性腦瘤細胞株DBTRG的組別中，所使用的化療藥物為替莫唑胺(80μg/ml)；於人類胰臟癌細胞株AsPC1的組別中，所使用的化療藥物為吉西他濱(20μM)；於人類卵巢癌細胞株SKOV3的組別中，所使用的化療藥物為卡鉑(20μM)。再將經處理的各組腫瘤細胞以流式細胞儀檢測腫瘤細胞於細胞表面的HLA-G的表現。
請參照第5圖，為分析腫瘤細胞接受化學治療後HLA-G表現量的流式細胞術分析結果統計圖。第5圖中同一腫瘤細胞的控制組和化學治療組相比，處理阿黴素可增加人 類乳癌細胞株MDA-MB-231細胞膜上HLA-G的表現(p<0.001)，處理替莫唑胺可增加人類惡性腦瘤細胞株DBTRG細胞膜上HLA-G的表現(p<0.001)，處理吉西他濱可增加人類胰臟癌細胞株AsPC1細胞膜上HLA-G的表現(p<0.001)，處理卡鉑可增加人類卵巢癌細胞株SKOV3細胞膜上HLA-G的表現(p<0.001)。由第5圖的結果顯示，處理化療藥物可增加腫瘤細胞細胞膜上HLA-G的表現，而本發明之表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞所表達的HLA-G特異性嵌合抗原受體可專一性的與HLA-G特異性結合，是以處理過化療藥物後再處理本發明之表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞，或同時處理本發明之表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞和化療藥物，可具有更優異的毒殺腫瘤細胞效果。
綜上所述，本發明之HLA-G特異性嵌合抗原受體具有優異的專一性結合腫瘤細胞能力，特別是與腫瘤細胞之細胞膜上所表現的HLA-G專一性結合，因而可使表現本發明之HLA-G特異性嵌合抗原受體的表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞專一性的靶向腫瘤細胞，避免脫靶效應，進而有效地毒殺腫瘤細胞，是以可用以製備誘導哺乳類動物之腫瘤細胞死亡之藥物。本發明之用於治療癌症之醫藥組合物，包含本發明之表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞，可有效地毒殺腫瘤細胞進而治療癌症。而進一步包含化療藥物的用於治療癌症之醫藥組合物，其可進一步誘導腫瘤細胞的細胞膜大量表現HLA-G，因而可增進表達HLA-G特異性 嵌合抗原受體細胞對於腫瘤細胞的毒殺作用，是以具有更優異的腫瘤細胞毒殺作用。
然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作各種的更動與潤飾，因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。 
				                         序列表
				<![CDATA[<110>　中國醫藥大學附設醫院]]>
				<![CDATA[<120>　HLA-G特異性嵌合抗原受體、核酸、HLA-G特異性嵌合抗原受體表達質體、表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞、其用途以及用於治療癌症之醫藥組合物]]>
				<![CDATA[<160>　18]]>
				<![CDATA[<210>　1]]>
				<![CDATA[<211>　246]]>
				<![CDATA[<212>　PRT]]>
				<![CDATA[<213>　人工序列]]>
				<![CDATA[<220>]]>
				<![CDATA[<223>　抗原辨識域]]>
				<![CDATA[<400>　1]]>
				Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly 
				1               5                   10                  15      
				Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Phe Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 
				            20                  25                  30          
				Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
				        35                  40                  45              
				Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 
				    50                  55                  60                  
				Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met 
				65                  70                  75                  80  
				Leu Ser Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 
				                85                  90                  95      
				Tyr Cys Val Arg Gly Gly Tyr Trp Ser Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly 
				            100                 105                 110         
				Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 
				        115                 120                 125             
				Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Ile Thr Gln Thr Thr Pro Ser 
				    130                 135                 140                 
				Val Pro Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser 
				145                 150                 155                 160 
				Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu 
				                165                 170                 175     
				Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Ser Arg Met Ser Ser 
				            180                 185                 190         
				Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 
				        195                 200                 205             
				Ala Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val 
				    210                 215                 220                 
				Tyr Tyr Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly 
				225                 230                 235                 240 
				Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
				                245     
				<![CDATA[<210>　2]]>
				<![CDATA[<211>  65]]>
				<![CDATA[<212>  PRT]]>
				<![CDATA[<213>  人工序列]]>
				<![CDATA[<220>]]>
				<![CDATA[<223>　跨膜域]]>
				<![CDATA[<400>　2]]>
				Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 
				1               5                   10                  15      
				Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser 
				            20                  25                  30          
				Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly 
				        35                  40                  45              
				Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala 
				    50                  55                  60                  
				Ala Tyr Arg Ser 
				65             
				<![CDATA[<210>　3]]>
				<![CDATA[<211>　94]]>
				<![CDATA[<212>　PRT]]>
				<![CDATA[<213>　人工序列]]>
				<![CDATA[<220>]]>
				<![CDATA[<223>　IL2受體β鏈訊息傳遞域]]>
				<![CDATA[<400>　3]]>
				Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn 
				1               5                   10                  15      
				Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly 
				            20                  25                  30          
				Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe 
				        35                  40                  45              
				Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu 
				    50                  55                  60                  
				Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu 
				65                  70                  75                  80  
				Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val 
				                85                  90                
				<![CDATA[<210>　4]]>
				<![CDATA[<211>　112]]>
				<![CDATA[<212>　PRT]]>
				<![CDATA[<213>　人工序列]]>
				<![CDATA[<220>]]>
				<![CDATA[<223>　CD3ζ訊息傳遞域]]>
				<![CDATA[<400>　4]]>
				Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 
				1               5                   10                  15      
				Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 
				            20                  25                  30          
				Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 
				        35                  40                  45              
				Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 
				    50                  55                  60                  
				Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 
				65                  70                  75                  80  
				Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 
				                85                  90                  95      
				Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Tyr Arg His Gln Ala Leu Pro Pro 
				            100                 105                 110         
				<![CDATA[<210>　5]]>
				<![CDATA[<211>　21]]>
				<![CDATA[<212>　PRT]]>
				<![CDATA[<213>　人工序列]]>
				<![CDATA[<220>]]>
				<![CDATA[<223>　信號肽鏈]]>
				<![CDATA[<400>　5]]>
				Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 
				1               5                   10                  15      
				His Ala Ala Arg Pro 
				            20      
				<![CDATA[<210>　6]]>
				<![CDATA[<211>　8]]>
				<![CDATA[<212>　PRT]]>
				<![CDATA[<213>　人工序列]]>
				<![CDATA[<220>]]>
				<![CDATA[<223>　CDRH1]]>
				<![CDATA[<400>　6]]>
				Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala 
				1               5               
				<![CDATA[<210>　7]]>
				<![CDATA[<211>　10]]>
				<![CDATA[<212>　PRT]]>
				<![CDATA[<213>　人工序列]]>
				<![CDATA[<220>]]>
				<![CDATA[<223>　CDRH2]]>
				<![CDATA[<400>　7]]>
				Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr 
				1               5                   10  
				<![CDATA[<210>　8]]>
				<![CDATA[<211>　10]]>
				<![CDATA[<212>　PRT]]>
				<![CDATA[<213>　人工序列]]>
				<![CDATA[<220>]]>
				<![CDATA[<223>　CDRH3]]>
				<![CDATA[<400>　8]]>
				Val Arg Gly Gly Tyr Trp Ser Phe Asp Val 
				1               5                   10  
				<![CDATA[<210>　9]]>
				<![CDATA[<211>　11]]>
				<![CDATA[<212>　PRT]]>
				<![CDATA[<213>　人工序列]]>
				<![CDATA[<220>]]>
				<![CDATA[<223>　CDRL1]]>
				<![CDATA[<400>　9]]>
				Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 
				1               5                   10      
				<![CDATA[<210>　10]]>
				<![CDATA[<211>　9]]>
				<![CDATA[<212>　PRT]]>
				<![CDATA[<213>　人工序列]]>
				<![CDATA[<220>]]>
				<![CDATA[<223>　CDRL3]]>
				<![CDATA[<400>　10]]>
				Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr 
				1               5                   
				<![CDATA[<210>　11]]>
				<![CDATA[<211>　45]]>
				<![CDATA[<212>　PRT]]>
				<![CDATA[<213>　人工序列]]>
				<![CDATA[<220>]]>
				<![CDATA[<223>　CD8鉸鏈區域]]>
				<![CDATA[<400>　11]]>
				Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 
				1               5                   10                  15      
				Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 
				            20                  25                  30          
				Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 
				        35                  40                  45  
				<![CDATA[<210>　12]]>
				<![CDATA[<211>　738]]>
				<![CDATA[<212>　DNA]]>
				<![CDATA[<213>　人工序列]]>
				<![CDATA[<220>]]>
				<![CDATA[<223>　編碼抗原辨識域片段]]>
				<![CDATA[<400>　12]]>
				gaggttcagc tgcaagagtc tggcggagga ctggtgcagc ctaagggaag cctgaagctg        60
				agctgtgccg ccttcggctt caccttcaac acctacgcca tgcactgggt ccgacaggcc       120
				cctggaaaag gccttgaatg ggtcgcccgg atcagaagca agagcaacaa ttacgccacc       180
				tactacgccg acagcgtgaa ggacagattc accatcagcc gggacgacag ccagagcatg       240
				ctgagcctgc agatgaacaa cctgaaaacc gaggacaccg ccatctacta ctgcgtcaga       300
				ggcggctact ggtccttcga tgtttgggga gccggcacca ccgtgacagt ttctagcgga       360
				ggcggtggat ctggcggcgg aggaagtggt ggcggaggtt ctgatatcgt gatcacccag       420
				accacaccta gcgtgccagt gacacctggc gagagcgtgt ccatcagctg cagaagcagc       480
				aagagcctgc tgcacagcaa cggcaatacc tacctgtact ggttcctgca gaggcccgga       540
				cagtctcctc agctgctgat ctccagaatg agcagcctgg ctagcggcgt gcccgataga       600
				ttttctggca gcggctctgg caccgccttc acactgagaa tcagcagagt ggaagccgag       660
				gacgtgggcg tgtactactg tatgcagcac ctggaatacc cctacacctt cggcggaggc       720
				accaagctgg aaatcaag                                                     738
				<![CDATA[<210>　13]]>
				<![CDATA[<211>　204]]>
				<![CDATA[<212>　DNA]]>
				<![CDATA[<213>　人工序列]]>
				<![CDATA[<220>]]>
				<![CDATA[<223>　編碼跨膜域片段]]>
				<![CDATA[<400>　13]]>
				ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg        60
				gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg       120
				aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca       180
				cgcgacttcg cagcctatcg ctcc                                              204
				<![CDATA[<210>　14]]>
				<![CDATA[<211>　282]]>
				<![CDATA[<212>　DNA]]>
				<![CDATA[<213>　人工序列]]>
				<![CDATA[<220>]]>
				<![CDATA[<223>　編碼IL2受體β鏈訊息傳遞域片段]]>
				<![CDATA[<400>　14]]>
				aactgcagga acaccgggcc atggctgaag aaggtcctga agtgtaacac cccagacccc        60
				tcgaagttct tttcccagct gagctcagag catggaggag acgtccagaa gtggctctct       120
				tcgcccttcc cctcatcgtc cttcagccct ggcggcctgg cacctgagat ctcgccacta       180
				gaagtgctgg agagggacaa ggtgacgcag ctgctccccc tgaacactga tgcctacttg       240
				tccctccaag aactccaggg tcaggaccca actcacttgg tg                          282
				<![CDATA[<210>　15]]>
				<![CDATA[<211>　339]]>
				<![CDATA[<212>　DNA]]>
				<![CDATA[<213>　人工序列]]>
				<![CDATA[<220>]]>
				<![CDATA[<223>　編碼CD3ζ訊息傳遞域片段]]>
				<![CDATA[<400>　15]]>
				agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc        60
				tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc       120
				cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga aggcctgtac       180
				aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag       240
				cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac       300
				acctacgacg cctatcgcca ccaggccctg cccccttaa                              339
				<![CDATA[<210>　16]]>
				<![CDATA[<211>　63]]>
				<![CDATA[<212>　DNA]]>
				<![CDATA[<213>　人工序列]]>
				<![CDATA[<220>]]>
				<![CDATA[<223>　編碼信號肽鏈片段]]>
				<![CDATA[<400>　16]]>
				atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg        60
				ccc                                                                      63
				<![CDATA[<210>　17]]>
				<![CDATA[<211>　135]]>
				<![CDATA[<212>　DNA]]>
				<![CDATA[<213>　人工序列]]>
				<![CDATA[<220>]]>
				<![CDATA[<223>　編碼CD8鉸鏈區域序列]]>
				<![CDATA[<400>　17]]>
				accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg        60
				tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg       120
				gacttcgcct gtgat                                                        135
				<![CDATA[<210>　18]]>
				<![CDATA[<211>　1335]]>
				<![CDATA[<212>　DNA]]>
				<![CDATA[<213>　人工序列]]>
				<![CDATA[<220>]]>
				<![CDATA[<223>　起動子]]>
				<![CDATA[<400>　18]]>
				gagtaattca tacaaaagga ctcgcccctg ccttggggaa tcccagggac cgtcgttaaa        60
				ctcccactaa cgtagaaccc agagatcgct gcgttcccgc cccctcaccc gcccgctctc       120
				gtcatcactg aggtggagaa gagcatgcgt gaggctccgg tgcccgtcag tgggcagagc       180
				gcacatcgcc cacagtcccc gagaagttgg ggggaggggt cggcaattga accggtgcct       240
				agagaaggtg gcgcggggta aactgggaaa gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc       300
				ccgagggtgg gggagaaccg tatataagtg cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca       360
				acgggtttgc cgccagaaca caggtaagtg ccgtgtgtgg ttcccgcggg cctggcctct       420
				ttacgggtta tggcccttgc gtgccttgaa ttacttccac gcccctggct gcagtacgtg       480
				attcttgatc ccgagcttcg ggttggaagt gggtgggaga gttcgaggcc ttgcgcttaa       540
				ggagcccctt cgcctcgtgc ttgagttgag gcctggcttg ggcgctgggg ccgccgcgtg       600
				cgaatctggt ggcaccttcg cgcctgtctc gctgctttcg ataagtctct agccatttaa       660
				aatttttgat gacctgctgc gacgcttttt ttctggcaag atagtcttgt aaatgcgggc       720
				caagatctgc acactggtat ttcggttttt ggggccgcgg gcggcgacgg ggcccgtgcg       780
				tcccagcgca catgttcggc gaggcggggc ctgcgagcgc ggccaccgag aatcggacgg       840
				gggtagtctc aagctggccg gcctgctctg gtgcctggcc tcgcgccgcc gtgtatcgcc       900
				ccgccctggg cggcaaggct ggcccggtcg gcaccagttg cgtgagcgga aagatggccg       960
				cttcccggcc ctgctgcagg gagctcaaaa tggaggacgc ggcgctcggg agagcgggcg      1020
				ggtgagtcac ccacacaaag gaaaagggcc tttccgtcct cagccgtcgc ttcatgtgac      1080
				tccacggagt accgggcgcc gtccaggcac ctcgattagt tctcgagctt ttggagtacg      1140
				tcgtctttag gttgggggga ggggttttat gcgatggagt ttccccacac tgagtgggtg      1200
				gagactgaag ttaggccagc ttggcacttg atgtaattct ccttggaatt tgcccttttt      1260
				gagtttggat cttggttcat tctcaagcct cagacagtgg ttcaaagttt ttttcttcca      1320
				tttcaggtgt cgtga                                                       1335

Claims (16)

  1. 一種HLA-G特異性嵌合抗原受體，包含：
    一抗原辨識域，其中該抗原辨識域包含對人類白細胞抗原G(human leukocyte antigen G,HLA-G)具特異性之單株抗體片段，該抗原辨識域之胺基酸序列如序列辨識編號1所示；
    一跨膜域，其中該跨膜域之胺基酸序列如序列辨識編號2所示；
    一IL2受體β鏈訊息傳遞域，其中該IL2受體β鏈訊息傳遞域之胺基酸序列如序列辨識編號3所示；以及
    一CD3ζ訊息傳遞域，其中該CD3ζ訊息傳遞域之胺基酸序列如序列辨識編號4所示。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之HLA-G特異性嵌合抗原受體，更包含如序列辨識編號5所示之一信號肽鏈，其係連接於該抗原辨識域之N端。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之HLA-G特異性嵌合抗原受體，更包含一CD8鉸鏈區域，其中該CD8鉸鏈區域連接該抗原辨識域和該跨膜域。
  4. 一種單離的核酸，其係編碼如申請專利範圍第1項所述之HLA-G特異性嵌合抗原受體，該核酸包含：
    依序排列之如序列辨識編號12所示之一編碼抗原辨識域片段、如序列辨識編號13所示之一編碼跨膜域片段、如序列辨識編號14所示之一編碼IL2受體β鏈訊息傳遞域片段以及如序列辨識編號15所示之一編碼CD3ζ訊息傳遞域片段。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之核酸，更包含如序列辨識編號16所示之一編碼信號肽鏈片段，其係連接於該編碼抗原辨識域片段之5’端。
  6. 如申請專利範圍第4項所述之核酸，更包含一編碼CD8鉸鏈區域序列，該編碼CD8鉸鏈區域序列連接該編碼抗原辨識域片段及該編碼跨膜域片段。
  7. 一種HLA-G特異性嵌合抗原受體表達質體，其包含：
    依序排列之如序列辨識編號18所示之一起動子以及如申請專利範圍第4項所述之核酸。
  8. 一種表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞，包含：
    一免疫細胞；以及
    如申請專利範圍第7項所述之HLA-G特異性嵌合抗原受體表達質體。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞，其中該免疫細胞為一T細胞。
  10. 如申請專利範圍第8項所述之表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞，其中該免疫細胞為一自然殺手細胞。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞，其中該自然殺手細胞為NK-92細胞株或初代自然殺手細胞。
  12. 一種用於治療癌症之醫藥組合物，包含：如申請專利範圍第8項所述之表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞；以及
    一醫藥上可接受載劑。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之用於治療癌症之醫藥組合物，更包含一化療藥物。
  14. 如申請專利範圍第12項所述之用於治療癌症之醫藥組合物，其中該化療藥物為阿黴素(doxorubicin)、替莫唑胺(temozolomide)、吉西他濱(gemcitabine)或卡鉑(carboplatin)。
  15. 一種如申請專利範圍第8項所述之表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞之用途，其係用於製備誘導哺乳類動物之一腫瘤細胞死亡之藥物。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之表達HLA-G特異性嵌合抗原受體細胞之用途，其中該腫瘤細胞為一乳癌細胞、一多形性膠質母細胞瘤細胞、一胰臟癌細胞或一卵巢癌細胞。
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TWI823402B (zh) * 2021-07-21 2023-11-21 長聖國際生技股份有限公司 多特異性單域抗體嵌合抗原受體及t細胞銜接體、核酸、其表達細胞、其用途以及治療癌症之醫藥組合物

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