CN114605543B - 一种抗hla-g异构体分子hla-g5及hla-g6的单克隆抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗HLA‑G异构体分子HLA‑G5及HLA‑G6的单克隆抗体及用途，所述单克隆抗体(YWHG‑5)由保藏编号为CCTCC NO:202122的杂交瘤产生，采用HLA‑G分子重链位于α3结构域及HLA‑G5/6分子特有的跨膜区氨基酸序列抗原肽(EGLPEPLMLRWSKEGDGGIMS)为免疫原。本发明提供了编码本发明所述YWHG‑5抗体的核苷酸及其编码氨基酸序列,本发明还提供了所述YWHG‑5抗体用于HLA‑G异构体分子HLA‑G5及HLA‑G6免疫组化、免疫印迹及流式细胞术等检测的用途。

Description

一种抗HLA-G异构体分子HLA-G5及HLA-G6的单克隆抗体及其 用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及抗HLA-G异构体抗体(YWHG-5)的以下方面：采用HLA-G分子重链α3结构域及HLA-G5/6分子特有的跨膜区氨基酸序列的抗原肽(EGLPEPLMLRWSKEGDGGIMS)为免疫原，制备抗HLA-G异构体HLA-G5及HLA-G6 的抗体(YWHG-5)；编码本发明所述YWHG-5抗体的核酸分子及氨基酸序列，以及所述抗体(YWHG-5)用于HLA-G5及HLA-G6免疫组化、免疫印迹及流式细胞术检测等用途。
背景技术
人类白细胞抗原-G(human leukocyte antigen-G,HLA-G)基因，全长6.0kb，位于人类第6号染色体短臂远侧6p21.3。在蛋白质翻译过程中，HLA-G mRNA第 1外显子编码信号肽，第2、3和第4外显子分别编码细胞外区的α1、α2和α3 结构域，第5位外显子编码跨膜区；第6外显子编码仅含6个氨基酸残基的HLA-G 分子胞内段；由于外显子6内含有终止密码子，第7外显子不被转录；第8外显子对应于HLA-G基因的3′UTR。HLA-G初始转录产物经选择性剪接，可产生7 种成熟mRNA，分别编码7种不同分子量的异构体分子(HLA-G1、-G2、-G3、-G4、 -G5、-G6及HLA-G7)。其中HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3及HLA-G4含有跨细胞膜区，为膜结合型异构体；HLA-G5、HLA-G6及HLA-G7缺乏跨细胞膜结构，为可溶性异构体。HLA-G1～-G7异构体分子的分子量分别为39kD,31kD,22kD,30kD, 34kD,23kD及16kD。
HLA-G1是由全长HLA-G mRNA编码，由胞外区α1、α2及α3结构域，跨膜区及胞内结构域组成。HLA-G2缺乏α2结构域，由胞外区α1及α3结构域，跨膜区及胞内结构域组成；HLA-G3缺乏α2和α3结构域，由胞外区α1结构域，跨膜区及胞内结构域组成；HLA-G4缺乏α3结构域，由胞外区α1及α2结构域，跨膜区及胞内结构域组成；HLA-G5及HLA-G6胞外区结构域分别与HLA-G1及 HLA-G2相同，但它们由含有内含子4的HLA-G mRNA编码，因内含子4中含有终止密码子，所编码的蛋白分子缺乏由外显子5所编码的跨膜区，形成可溶性HLA-G 分子。编码HLA-G7的mRNA由于内含子2中含有终止密码子，胞外区仅含α1结构域及由内含子2所编码的2个氨基酸残基相连(图1)。
在正常生理情况下，HLA-G分子仅表达在母胎界面的绒毛外滋养层细胞，维持妊娠过程中的母胎免疫耐受。病理情况下，HLA-G分子能在肿瘤细胞及病毒感染等病理组织细胞中诱导性表达，与疾病的发生及进展密切相关。HLA-G分子是体内一个重要的免疫致耐分子，也是一种重要的免疫检查点分子，其免疫抑制功能主要通过结合免疫抑制性受体免疫球蛋白样转录物-2(immunoglobulin-like transcript-2,ILT2/LILRB1/CD85j)、免疫球蛋白样转录物-4 (ILT4/LILRB2/CD85d),传递抑制信号，诱导免疫耐受。具体作用机制有：①与表达在T细胞、NK细胞和B细胞上的ILT2结合，抑制T细胞和NK细胞免疫杀伤活性，及B细胞增殖和抗体分泌等功能。②与树突状细胞(DC)上的ILT2、 ILT4结合，抑制DC细胞的成熟和分化，诱导产生耐受性DC细胞。③与骨髓来源抑制性细胞(MDSC)和巨噬细胞(Mф)上的ILT2、ILT4结合，诱导促炎抗肿瘤的M1向免疫致耐性M2细胞分化等。因此，HLA-G在肿瘤等疾病的发生发展中起到重要作用。基于HLA-G为靶点的肿瘤免疫治疗已在美国进入I期临床试验。
HLA-G与受体ILT2、ILT4结合，具有分子结构特异性。受体ILT2、ILT4与 HLA-G结合的位点HLA-G胞外区α3结构域。ILT2仅结合HLA-G/β2m复合物，而 ILT4不仅可以与HLA-G/β2m结合，同时可以与不含β2m的游离HLA-G分子结合。由于HLA-G1、-G2、-G3、-G4、-G5、-G6及HLA-G7在表达机制及分子结构上存在差异，如HLA-G3、-G4、及HLA-G7异构体胞外区不含α3结构域，不能与ILT2 和ILT4结合。不同HLA-G异构体分子可在病理生理过程中发挥特定的免疫学效应。在不同病理状态下，尤其在肿瘤组织细胞中，HLA-G异构体表达存在广泛的异质性，不同HLA-G分子异构体的表达具有特定的临床意义。因此，分析特定 HLA-G异构体分子表达及不同HLA-G异构体分子表达谱，对于阐述特定HLA-G异构体分子的生物学功能及其临床意义具有重要意义。
目前国内外用于HLA-G免疫组化和免疫印迹的抗体主要有4H84，MEM-G1， MEM-G2，2A12及5A6G7。其中抗体4H84，其识别位点位于7种HLA-G异构体分子均具有的胞外区α1结构域，特异性上能够检测目前已知的含有α1结构域的7 种HLA-G异构体分子(HLA-G1，HLA-G2，HLA-G3，HLA-G4，HLA-G5，HLA-G6及HLA-G7)，但在免疫组化中不能区分具体特定HLA-G异构体分子的表达。抗体 MEM-G1及MEM-G2由全长HLA-G重链免疫小鼠得到，具体识别位点无法预测，这两种抗体理论上，与抗体4H84相似，能够识别7种HLA-G异构体分子(HLA-G1， HLA-G2，HLA-G3，HLA-G4，HLA-G5，HLA-G6及HLA-G7)，但同样不能区分具体特定HLA-G异构体分子的表达。抗体2A12及5A6G7，由位于HLA-G5和HLA-G6 分子羧基端22个氨基酸残基免疫小鼠获得，能够识别HLA-G5和HLA-G6分子。但抗体2A12及5A6G7同时还可以识别其他分子量在36-175kDa范围内的未知的其他非HLA-G5和HLA-G6分子，在免疫组化的应用上可能存在交叉反应，出现假阳性，不能正确HLA-G5和HLA-G6分子表达。用于流式细胞术检测HLA-G分子的单抗有87G及MEM-G/9，但只能检测HLA-G1及HLA-G5分子。
因此，在靶向精准医疗的背景下，现有的检测HLA-G分子的抗体不都是尽如人意，迫切需要开发更多针对不同HLA-G异构体分子的单克隆抗体。
发明内容
鉴于现有HLA-G抗体存在上述不足，本发明的目的是提供一种抗HLA-G5及 HLA-G6异构体分子的特异性单克隆抗体(YWHG-5)、编码本发明所述抗体(YWHG-5) 的核酸分子及氨基酸序列；以及所述YWHG-5抗体用于HLA-G5及HLA-G6免疫组化、免疫印迹及流式检测等用途。
本发明采用HLA-G分子重链α3结构域及HLA-G5/6分子特有的跨膜区氨基酸序列的抗原肽第为免疫原，其氨基酸序列为SEQ ID No.17所示氨基酸序列(EGLPEPLMLRWSKEGDGGIMS)。EGLPEPLMLRWSKEGDGGIMS肽段位于HLA-G分子重链α3结构域及HLA-G5/6分子特有的跨膜区(图1虚框内所示区域)，并基于此制备抗HLA-G5及HLA-G6异构体分子的特异性单克隆抗体(YWHG-5)。
根据发明人的研究成果，本发明提供了一种抗HLA-G异构体分子HLA-G5及 HLA-G6的单克隆抗体(YWHG-5)，至少包括重链高变区CDR1、CDR2和CDR3中的一种或多种，或/和轻链高变区CDR1、CDR2和CDR3中的一种或多种；
所述单克隆抗体(YWHG-5)抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示或经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与SEQ ID No.1所示序列具有同等功能的氨基酸序列；所述抗体轻链高变区CDR1的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的序列QSLLHSNGDTY或经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与SEQ ID No.2 所示的序列具有同等功能的氨基酸序列；所述轻链高变区CDR2的氨基酸序列为SEQ ID No.3所示的序列NIS或经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与 SEQ ID No.3所示的序列具有同等功能的氨基酸序列，和所述轻链高变区CDR3 的氨基酸序列为SEQ ID No.4所示的序列FQGSYVPYT或经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与SEQ ID No.4所示的序列具有同等功能的氨基酸序列；
所述单克隆抗体(YWHG-5)抗体重链的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示或经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与SEQ ID No.5所示序列具有同等功能的氨基酸序列；所述抗体重链高变区CDR1的氨基酸序列为SEQ ID No.6所示的序列GFSLTSYG或经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与SEQ ID No.6所示的序列具有同等功能的氨基酸序列，所述重链高变区CDR2的氨基酸序列为SEQ ID No.7所示的序列IWAGGNT或经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与 SEQ ID No.7所示序列具有同等功能的氨基酸序列，和所述重链高变区CDR3的氨基酸序列为SEQ ID No.8所示的序列ARDRAGTARFYYYALDN或经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与SEQ ID No.8所示的序列具有同等功能的氨基酸序列。
进一步地，所述单克隆抗体(YWHG-5)还包括轻链框架区(Framework region， FR)和重链框架区；其中，所述轻链框架区包括轻链FR1、FR2和FR3中的一种或多种，所述轻链FR1的氨基酸序列为SEQ ID No.9所示的序列 DIVMTQDELSLPVSLGDQASIPCGSS或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与SEQ ID No.9所示序列具有同等功能的氨基酸序列；所述轻链FR2的氨基酸序列为SEQ ID No.10所示的序列LHWFLQTPGQSPKLLRY或经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与SEQ ID No.10所示序列具有同等功能的氨基酸序列；所述轻链FR3的氨基酸序列为SEQ ID No.11所示的序列NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEGEDLGVYYC或经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与SEQ ID No.11所示序列具有同等功能的氨基酸序列；所述重链框架区包括重链FR1、FR2和FR3中的一种或多种，其中：所述重链FR1的氨基酸序列为 SEQ ID No.12所示的序列EVKLQESGPSLVAPSQSLSIACTVS或经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与SEQ ID No.12所示序列具有同等功能的氨基酸序列；所述重链FR2的氨基酸序列为SEQ ID No.13所示的序列VHRIRQPPGKGLEWLGI或经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有与SEQ ID No.13所示序列同等功能的氨基酸序列；所述重链FR3的氨基酸序列为SEQ ID No.14所示的序列KYNSALMSRLCISKDNSKSQAFLKMNSLQTDDTAMYYC或经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与SEQ ID No.14所示序列具有同等功能的氨基酸序列。
进一步地，所述单克隆抗体(YWHG-5)中编码轻链可变区的核苷酸序列为SEQ IDNo.15所示的序列或该序列经替换、缺失或添加一个或多个核苷酸形成的与 SEQ ID No.15所示序列具有同等功能的核苷酸序列，所述单克隆抗体(YWHG-5) 中编码重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID No.16所示的序列或该序列经替换、缺失或添加一个或多个核苷酸形成的与SEQ ID No.16所示序列具有同等功能的核苷酸序列。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种优选的抗HLA-G异构体HLA-G5及 HLA-G6分子的单克隆抗体(YWHG-5)，所述单克隆抗体(YWHG-5)由保藏编号为 CCTCC NO:202122的杂交瘤产生，保藏机构为：中国典型培养物保藏中心，保藏机构地址为：中国湖北省武汉市武汉大学内，邮编：430072，保藏时间为2021 年8月11日。
本发明还提供了所述抗HLA-G5及HLA-G6异构体分子抗体(YWHG-5)用于HLA-G 异构体HLA-G5及HLA-G6分子免疫组化、免疫印迹及流式细胞术等检测的用途，具有特异性高，亲和力强等特点。
为更清楚了解本申请的发明构思和技术方案，下文将通过具体实施例和附图进一步解释本申请，其中关于实施方式中的技术方案仅是优选的实施方式，不应被解释为限制本申请的范围。对于本领域技术人员来说，在不脱离本申请的技术原理的前提下，还可以做出若干改进和调整，这些改进和调整也应视为落入本申请的保护范围之中。
除非另有定义，本文使用的所有科技术语应视为具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用氨基酸的标准3字母和/或1字母代码。
本发明中提及的轻链高变区或重链高变区，其中“高变区”又被称之为互补决定区(complementarity determining region，CDR)。
本发明中提及的“序列”可以指包含某些生物学功能等同的氨基酸序列或“保守性替代”，“其它序列”可以包含功能非等同的氨基酸或“非保守性替代”，其经基因工程改造以改进CDR或含CDR抗体的特性。在不实质性地影响抗体活性的前提下，本领域技术人员可以对本申请中的序列进行操作，即替换、添加和/或缺失一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或多个)氨基酸，以获得所述抗体或其功能性片段序列的变体。它们应被视为包括在本申请保护的范围内。例如，在可变区将具有类似性质的氨基酸进行替换。本发明中提及的变体的序列可以与其来源序列有至少有95％、96％、97％、98％或99％的一致性。序列一致性可以使用序列分析软件测量。例如使用缺省参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。本文所述的多种氨基酸序列详见序列表。
附图说明
图1是7种不同HLA-G异构体分子结构模式图及免疫肽段位置。
图2是所述抗体(YWHG-5)重链和轻链亚类鉴定。
图3是所述抗体(YWHG-5)SDS-PAGE检测抗体纯度检测。
图4是所述抗体(YWHG-5)ELISA法抗体亲和常数测定。
图5是所述抗体(YWHG-5)免疫印迹检测HLA-G5及HLA-G6分子检测。
图6是所述抗体(YWHG-5)ELISA法HLA-G5分子浓度检测。
图7是所述抗体(YWHG-5)流式细胞术HLA-G5及HLA-G6分子检测。
图8是所述抗体(YWHG-5)应用于免疫组化检测组织中HLA-G5及HLA-G6分子表达。
具体实施方式
1.抗HLA-G单克隆抗体(YWHG-5)制备
①抗原肽合成
合成HLA-G分子重链α3结构域及HLA-G5/6分子特有的跨膜区氨基酸序列的抗原肽，SEQ No.17EGLPEPLMLRWSKEGDGGIMS。
②小鼠免疫
初次免疫4只SPF级BALB/c雌性小鼠，60ug/只。第一次加强免疫小鼠，30ug/ 只。第二次加强免疫小鼠，30ug/只。第三次加强免疫小鼠，30ug/只。眼眶取血，测血清效价。用“SEQ No.17EGLPEPLMLRWSKEGDGGIMS”包板，ELISA测定免疫小鼠效价。用“SEQNo.17EGLPEPLMLRWSKEGDGGIMS”，2ug/ml，4℃包被过夜；2％牛奶，37℃封闭2h；血清从200倍开始2倍梯度稀释，空白对照(blank)为 PBS，阴性对照(negative)为阴性血清200倍稀释。融合前，用“SEQ No.17 EGLPEPLMLRWSKEGDGGIMS”免疫原50ug，冲击免疫小鼠。融合实验，取小鼠脾细胞与SP2/0细胞，采用PEG法进行融合，融合完细胞用半固体培养基(含HAT)进行筛选培养。
③单克隆细胞筛选
挑10板×93个细胞单克隆，培养于96孔细胞培养板(事先用胸腺细胞铺板，100ul/孔)。用“SEQ No.17EGLPEPLMLRWSKEGDGGIMS”包板，用包被液稀释“SEQNo.17EGLPEPLMLRWSKEGDGGIMS”，终浓度为2ug/ml，100ul/孔，4℃，过夜；后用洗液洗涤3次。2％牛奶封闭液封闭，200ul/孔，37℃孵箱，2h；后用洗液洗涤3 次。加入一抗(细胞培养上清)、阴性对照(SP2/0培养上清)、空白对照(PBS)、阳性对照(阳性血清PBS 1000倍稀释)，均为100ul/孔，37℃孵箱，1h；后用洗液洗涤3次。加入PBS稀释20000倍的二抗，100ul/孔，37℃孵箱，1h；取出后用洗液洗涤3次。显色，显色液100ul/孔，显色时间为5min左右。每孔加入50ul终止液终止。双波长(450，630)测吸光值。对挑选的克隆采用ELISA方法，做第一次筛选，得到阳性杂交瘤细胞株。将阳性的细胞株，用“SEQ No.17 EGLPEPLMLRWSKEGDGGIMS”再次包板，采用ELISA方法，做第二次筛选，得到阳性杂交瘤细胞株。经多次筛选后得到一株抗SEQ No.17EGLPEPLMLRWSKEGDGGIMS片段的单克隆抗体，命名为YWHG-5(保藏编号为CCTCCNO:202122)。
④抗HLA-G单克隆抗体(YWHG-5)亚类鉴定
将筛选出来的10株阳性细胞株进行亚类鉴定，用100mM PBS(pH7.4)稀释包被抗体至0.5ug/ml,每孔加0.1ml,4℃，过夜。PBS-T洗2次,每孔加入200ul封闭液，37℃孵育2h。PBS-T洗3次；每孔加入100ul杂交瘤上清，37℃孵育1h。PBS-T 洗3次；用封闭液1：10000(κ,λ)或1：20000(其它的)稀释的HRP标记的抗体0.1ml 每孔，分别加入适当的孔中，370C孵育1h。PBS-T洗3次；每孔加50ul底物溶液， 10-20min内于双波长(450，630)测吸光值。抗体亚型再次用Thermo公司的小鼠抗体亚型快速鉴定法(Pierce Rapid Isotyping Kits–Mouse，Catalog”#26178)确定该细胞株产生的单抗亚型为重链为IgG1型，轻链为kappa (κ)型(图2)。
⑤抗体纯化
样本预处理：用相应的偶联缓冲液以1:3稀释，12000rpm4℃离心10min，0.22 μm滤膜过滤，除去脂肪、细胞残渣及小颗粒物质。平衡：用10倍柱体积的相应偶联缓冲液平衡柱子，保持流速为1ml/min。上样：把样品注入柱子上端接口，收集流出液，保持流速为1ml/min。洗杂：用5倍柱体积的偶联缓冲液过柱，保持流速为1ml/min。洗脱：用5倍柱体积洗脱缓冲液洗脱抗体，收集于上述EP管中，保持流速为1ml/min。立即用1M pH9.0的Tris-Hcl缓冲液调整p H值至7.0。平衡：用10柱体积的偶联缓冲液平衡柱子回pH7.0，保持流速为1ml/min。透析：使用0.01M PBS缓冲液将抗体透析过夜，换液3次。
⑥SDS-PAGE检测抗体纯度
配置SDS-PAGE胶，分离胶的浓度为12％。样品制备：样品加上样缓冲液后沸水煮浴10min。上样：每孔10ul。跑胶：浓缩胶80V，30min；分离胶120V，60min。溴酚蓝前沿到达玻璃板底部时停止电泳，取出凝胶。染色与脱色：将凝胶浸入考马斯亮蓝染色液中，置摇床上缓慢震荡30min以上(染色时间需根据凝胶厚度适当调整)。取出凝胶在水中漂洗数次，再加入考马斯亮蓝脱色液、震荡。凝胶脱色至大致看清条带1h，完全脱色则需更换脱色液2～3次，震荡达24h以上。凝胶脱色后可通过ECL凝胶成像系统扫描记录。纯化后得到的抗体YWHG-5纯度>90％ (图3)。
⑦ELISA检测抗体的亲和常数测定
用包被液稀释抗原，SEQ No.17EGLPEPLMLRWSKEGDGGIMS，终浓度为2ug/ml，100ul/孔，4℃，过夜；后用洗液洗涤2次。封闭液封闭，200ul/孔，37℃孵箱， 2h；后用洗液洗涤1次。纯化抗体从200倍开始2倍梯度稀释(PBS)，空白对照 (blank)为PBS，均为100ul/孔，37℃孵箱，1h；后用洗液洗涤3次。加入PBS 稀释20000倍的二抗，100ul/孔，37℃孵箱，1h；取出后用洗液洗涤3次。显色，显色液100ul/孔，显色时间为5-15min。每孔加入50ul终止液终止。双波长(450， 630)测吸光值，作图分析。根据Logistic拟合方程，亲和常数≈150000×A/抗体浓度(A为1/2OD值所对应的抗体稀释倍数；稀释倍数＝12800；YWHG-5抗体浓度＝1.9mg/mL)，抗体YWHG-5的亲和常数为1.01×109L/mol(图4)。
⑧免疫印迹检测抗体的HLA-G异构体识别特异性。
将HLA-G异构体标准蛋白HLA-G1，HLA-G2，HLA-G3，HLA-G4，HLA-G5，HLA-G6、 HLA-G7及α1结构域缺乏的HLA-G分子标准蛋白电转膜后，用5％去脂奶粉室温封闭 4h，0.2％TBS(Teween-20PBS)洗涤。加入所述抗体(YWHG-5，1.0ug/ml)，检测其识别特异性，4℃孵育过夜，洗涤；加入HRP标记兔抗鼠IgG抗体,室温孵育 30min，洗涤后，用Dako REALTMEnVisionTM检测系统(DAKO)孵育1-3min。结果显示：结果说明所述抗体(YWHG-5)能特异性识别HLA-G5及HLA-G6标准蛋白，与其他HLA-G异构体分子不存在交叉反应(图5)。
二、应用实施例
实施例2.1.所述抗体(YWHG-5)免疫印迹检测HLA-G5及HLA-G6分子检测
将HLA-G异构体标准蛋白HLA-G1，HLA-G2，HLA-G3，HLA-G4，HLA-G5，HLA-G6 和HLA-G7分子标准蛋白，变性PAGE电泳。半干电转膜后，用5％去脂奶粉室温封闭4h，0.2％TBS(Teween-20 PBS)洗涤。加入所述抗体(YWHG-5)，检测其识别特异性，4℃孵育过夜，洗涤；加入HRP标记兔抗鼠IgG抗体,室温孵育30min，洗涤后，用Dako REALTMEnVisionTM检测系统(DAKO)孵育1-3min。结果显示：结果说明所述抗体(YWHG-5)能特异性识别HLA-G5及HLA-G6标准蛋白，与其他HLA-G 异构体分子不存在交叉反应(图5)。
实施例2.2.所述抗体(YWHG-5)ELISA法HLA-G5分子浓度检测
用包被液(0.1M,pH＝9.6NaHCO3)2倍梯度稀释HLA-G5蛋白，配置终浓度为分别为4ug/ml，2ug/ml，1ug/ml，0.5ug/ml,0.25ug/ml，0.125ug/ml及 0.0625ug/ml，以包被液为空白对照。100ul/孔包板，4℃，过夜；后用洗液洗涤 2次。200ul/孔1％BSA封闭，37℃孵箱，2h；后用洗液洗涤3次。
洗涤后，加终浓度为1.0ug/ml的生物素标记抗体(YWHG-5)，100ul/孔， 37℃孵箱，1h；后用洗液洗涤3次。加入PBS稀释1.0ug/ml的过氧化物酶标记链酶亲和素(Peroxidase-conjugated Streptavidin)，100ul/孔，37℃孵箱，1h；取出后用洗液洗涤3次。显色，TMB显色液100ul/孔，显色时间为5-15min。每孔加入50ul终止液终止。波长(450)测吸光值，作图分析。4ug/ml，2ug/ml，1ug/ml， 0.5ug/ml,0.25ug/ml，0.125ug/ml，0.0625ug/ml及包被液空白对照的OD450分别为0.449,0.396，0.247，0.165,0.11，0.076,0.069及0.055。结果显示，抗体 (YWHG-5)特异性识别HLA-G5，且与HLA-G5浓度具有显著相关性[Y(浓度)＝0.034 x(OD)2+0.1747x(OD)；R2＝0.9988](图6)。
实施例2.3.所述抗体(YWHG-5)流式细胞术HLA-G5及HLA-G6分子检测
分别取对数生长期表达HLA-G5，HLA-G6分子标准蛋白K562-HLA-G5及 K562-HLA-G6细胞培养物。HLA-G5/6为可溶性HLA-G分子，通过细胞内流式检测。
细胞内HLA-G5及HLA-G6分子表达流式检测：流式管收集K562-HLA-G5及 K562-HLA-G6细胞培养物，2％BSA/PBS离心洗涤2次(250g)，加入250ul细胞破膜剂(BD Cytofix/CytopermTM)，充分混匀，4℃冰箱放置20分钟。加入1ml BD Perm/WashTM离心洗涤两遍(250g)。洗涤后，100ul BD Perm/WashTM重悬 K562-HLA-G5及K562-HLA-G6细胞，加入含有加入1ul(1.0mg/ml)的FITC标记的纯化抗体(YWHG-5),4℃孵育30分钟，用1ml 1×BD Perm/WashTM离心洗涤3 遍(250g)；将细胞用1×BD Perm/WashTM重悬成300ul细胞悬液，流式细胞检测(图7)。
实施例2.4.所述抗体(YWHG-5)应用于免疫组化检测胃癌组织中HLA-G5/6 分子表达。
所取胃癌组织于10％-12％中性福尔马林固定，石蜡包埋。组织切片经烤片，脱蜡，水化及抗原修复等常规制片流程。组织上滴加适量1％BSA，其覆盖组织及组织边缘2mm，室温孵育10min进行封闭。滴加抗HLA-G5/6异构体分子抗体 (YWHG-5)(1mg/mL，1:500稀释)，4℃冰箱湿盒过夜(16-20h)。TBS缓冲液冲洗，滴加二抗(TBS稀释抗体羊抗鼠比例1：300)，37℃恒温箱孵育30min。TBS 缓冲液冲洗，滴加显色剂DAB工作液，待组织显色完全后，将玻片置于流水中冲洗5min，蒸馏水浸泡5min。HE复染、脱水、透明、封片后，光学显微镜观察组织切片各视野情况，计数各视野中总细胞数和棕褐色着色的细胞数。棕褐色着色的细胞为胃癌组织细胞HLA-G5/6分子阳性表达，根据细胞棕褐色着色深浅，判别 HLA-G5/6分子阳性强度。其中图8(A)，(B)为胃癌组织HLA-G5/6分子阳性；图8(C)，(D)为胃癌组织HLA-G5/6分子阴性(图8)。
序列表
<110> 台州恩泽医疗中心（集团）
<120> 一种抗HLA-G异构体分子HLA-G5及HLA-G6的单克隆抗体及其用途
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 113
<212> PRT
<213> 杂交瘤(YWHG-5Hybridoma)
<400> 1
Asp Ile Val Met Thr Gln Asp Glu Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Pro Cys Gly Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Thr Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Arg Tyr Asn Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Gly Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser Tyr Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 杂交瘤(YWHG-5Hybridoma)
<400> 2
Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asp Thr Tyr
1 5 10
<210> 3
<211> 3
<212> PRT
<213> 杂交瘤(YWHG-5Hybridoma)
<400> 3
Asn Ile Ser
1
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 杂交瘤(YWHG-5Hybridoma)
<400> 4
Phe Gln Gly Ser Tyr Val Pro Tyr Thr
1 5
<210> 5
<211> 123
<212> PRT
<213> 杂交瘤(YWHG-5Hybridoma)
<400> 5
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Ala Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val His Arg Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Gly Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Leu Cys Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Ala Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Arg Ala Gly Thr Ala Arg Phe Tyr Tyr Tyr Ala Leu Asp Asn
100 105 110
Trp Gly His Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 杂交瘤(YWHG-5Hybridoma)
<400> 6
Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly
1 5
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 杂交瘤(YWHG-5Hybridoma)
<400> 7
Ile Trp Ala Gly Gly Asn Thr
1 5
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 杂交瘤(YWHG-5Hybridoma)
<400> 8
Ala Arg Asp Arg Ala Gly Thr Ala Arg Phe Tyr Tyr Tyr Ala Leu Asp
1 5 10 15
Asn
<210> 9
<211> 26
<212> PRT
<213> 杂交瘤(YWHG-5Hybridoma)
<400> 9
Asp Ile Val Met Thr Gln Asp Glu Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Pro Cys Gly Ser Ser
20 25
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 杂交瘤(YWHG-5Hybridoma)
<400> 10
Leu His Trp Phe Leu Gln Thr Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Arg
1 5 10 15
Tyr
<210> 11
<211> 36
<212> PRT
<213> 杂交瘤(YWHG-5Hybridoma)
<400> 11
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Gly Glu Asp Leu Gly
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 12
<211> 25
<212> PRT
<213> 杂交瘤(YWHG-5Hybridoma)
<400> 12
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Ala Cys Thr Val Ser
20 25
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 杂交瘤(YWHG-5Hybridoma)
<400> 13
Val His Arg Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
1 5 10 15
Ile
<210> 14
<211> 38
<212> PRT
<213> 杂交瘤(YWHG-5Hybridoma)
<400> 14
Lys Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser Arg Leu Cys Ile Ser Lys Asp Asn
1 5 10 15
Ser Lys Ser Gln Ala Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 15
<211> 337
<212> DNA
<213> 杂交瘤(YWHG-5Hybridoma)
<400> 15
gatatcgtga tgacccaaga tgaactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atcccttgcg gatctagtca gagccttcta cacagtaatg gagacaccta tttacattgg 120
ttcctgcgac accaggccag tctccaaagc tcctgagata caatatttcc aaccgatttt 180
ctggggtccc agacaggttc agtggcagtg gatcagggac agatttcaca ctcaagatca 240
gcagagtgga gggtaggatc tgggagttta ttactgcttt caaggttcat atgttccgta 300
cacgttcgga ggggggacca agctggaaat aaaacgg 337
<210> 16
<211> 367
<212> DNA
<213> 杂交瘤(YWHG-5Hybridoma)
<400> 16
gaggtgaagc tgcaggagtc aggacctagc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60
gcttgcactg tttctgggtt ttcattaacc agctatggtg tacaccggat tcgccagcct 120
ccaggaaggg tctggagtgg ctgggaataa tatgggctgg tggaaacacg aaatataatt 180
cggctctcat gtccagactg tgcatcagca aagacaactc caagagccaa gctttcttaa 240
aaatgaacag tctgaaactg atgacacagc catgtactac tgtgccagag atagggcggg 300
aacggctcgg ttttattact atgctctgga caactggggt catggaacct cagtcaccgt 360
ctcctca 367
<210> 17
<211> 21
<212> PRT
<213> 杂交瘤(YWHG-4Hybridoma)
<400> 17
Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu Arg Trp Ser Lys Glu Gly Asp
1 5 10 15
Gly Gly Ile Met Ser
20

Claims (5)

1.一种抗HLA-G异构体分子HLA-G5及HLA-G6的单克隆抗体YWHG-5，所述单克隆抗体YWHG-5由保藏编号为CCTCC NO: C202122的杂交瘤细胞株产生。
2.一种抗HLA-G异构体分子HLA-G5及HLA-G6单克隆抗体YWHG-5，其特征在于，
所述单克隆抗体YWHG-5抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.1 所示；所述抗体轻链高变区CDR1的氨基酸序列为SEQ ID No.2 所示的序列QSLLHSNGDTY;所述轻链高变区CDR2的氨基酸序列为SEQ ID No.3 所示的序列NIS，和所述轻链高变区CDR3的氨基酸序列为SEQID No.4 所示的序列FQGSYVPYT；
所述单克隆抗体YWHG-5抗体重链的核苷酸序列如SEQ ID No.5 所示；所述抗体重链高变区CDR1的氨基酸序列为SEQ ID No.6 所示的序列GFSLTSYG，所述重链高变区CDR2的氨基酸序列为SEQ ID No.7 所示的序列IWAGGNT，和所述重链高变区CDR3的氨基酸序列为SEQID No.8 所示的序列ARDRAGTARFYYYALDN。
3.根据权利要求2所述的一种抗HLA-G异构体分子HLA-G5及HLA-G6的单克隆抗体YWHG-5，其特征在于，所述单克隆抗体YWHG-5还包括轻链框架区和重链框架区；其中，所述轻链框架区包括轻链FR1、FR2和FR3，所述轻链FR1的氨基酸序列为SEQ ID No.9 所示的序列DIVMTQDELSLPVSLGDQASIPCGSS；所述轻链FR2的氨基酸序列为SEQ ID No.10 所示的序列LHWFLQTPGQSPKLLRY；所述轻链FR3的氨基酸序列为SEQ ID No.11 所示的序列NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEGEDLGVYYC；所述重链框架区包括重链FR1、FR2和FR3，其中：所述重链FR1的氨基酸序列为SEQ ID No.12 所示的序列EVKLQESGPSLVAPSQSLSIACTVS；所述重链FR2的氨基酸序列为SEQ ID No.13 所示的序列VHRIRQPPGKGLEWLGI；所述重链FR3的氨基酸序列为SEQ ID No.14的序列KYNSALMSRLCISKDNSKSQAFLKMNSLQTDDTAMYYC。
4. 根据权利要求2所述的一种抗HLA-G异构体分子HLA-G5及HLA-G6的单克隆抗体YWHG-5，其特征在于，所述单克隆抗体YWHG-5中编码轻链可变区的核苷酸序列为SEQ IDNo.15所示的序列，所述单克隆抗体YWHG-5中编码重链可变区的核苷酸序列为SEQ IDNo.16 所示的序列。
5.权利要求1-4中任一项所述的抗HLA-G异构体分子HLA-G5及HLA-G6的单克隆抗体YWHG-5用于制备HLA-G5及HLA-G6免疫组化、免疫印迹及流式细胞术检测试剂的用途。
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