CN111363042B

CN111363042B - 一种高特异性抗小鼠cd226单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN111363042B
Application number: CN202010238237.9A
Authority: CN
Inventors: 庄然; 张圆; 李琦; 李娜; 马菁昌; 金伯泉
Original assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Current assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Priority date: 2020-03-30
Filing date: 2020-03-30
Publication date: 2022-02-11
Anticipated expiration: 2040-03-30
Also published as: CN111363042A

Abstract

本发明公开了一种高特异性抗小鼠CD226单克隆抗体及其应用，提供了具有生物学活性的抗小鼠CD226单克隆抗体FMU‑mCD226.1的轻链和重链可变区，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1，重链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。通过常规杂交瘤技术和CD226基因敲除小鼠制备了一株小鼠抗小鼠CD226单克隆抗体，筛选出能稳定分泌高特异性的抗小鼠CD226 mAb的杂交瘤细胞株FMU‑mCD226.1，制备腹水获得高特异性、高亲和力的抗小鼠CD226 mAb，可以应用于免疫印迹、免疫荧光染色和流式细胞术检测。确认该基因序列和相应蛋白序列的惟一性及其CDR序列；为研制和开发抗小鼠CD226分子诊断和治疗试剂提供技术支持。

Description

一种高特异性抗小鼠CD226单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种单克隆抗体，尤其是一种高特异性抗小鼠CD226单克隆抗体及其应用。

背景技术

免疫球蛋白超家族成员CD226分子是一种广泛表达于多种免疫细胞膜表面的I型跨膜糖蛋白，分子量约67KD，其胞膜外区含有2个免疫球蛋白V样结构域。CD226分子又称血小板与T细胞活化抗原1(platelet and T cell activation antigen 1,PTA1)，最早是澳大利亚Burns教授等于1985年发现并命名，1996年美国DNAX研究所克隆出该分子基因，将其命名为DNAX辅助分子1(DNAM-1)。

CD226分子是一个在进化上保守的分子，不同种属间CD226分子在核苷酸水平和氨基酸水平高度同源，在组织和细胞类型的表达分布也极为相似，提示该分子在机体免疫应答过程和其他生物学功能中可能扮演了重要的角色。小鼠CD226分子胞膜外区形成二硫键的2对半胱氨酸高度保守，与人类CD226分子同样具有Ig V样结构域的特征性结构(Asp-Xaa-Gly-Ala-Xaa-Try-Xaa-Cys)，胞浆区同样具有结合含有SH2结构域分子的EDIYVNY序列。另一方面，这种高度的保守性也为我们建立相关的实验动物模型，深入研究分子作用机制提供了便利条件。2008年，美国华盛顿大学Marco Colonna教授建立了CD226基因敲除小鼠(CD226KO)，为进一步阐明CD226在体内的作用机制提供了极大的便利。

既往的研究发现，在造血细胞中，CD226主要表达于活化T细胞、NK细胞、单核细胞、巨核及血小板谱系。通过与其配体PRR-2/nectin-2/CD112和PVR/necl-5/CD155的相互作用，CD226主要参与造血调控、血小板活化、免疫突触形成、细胞间黏附、T细胞和NK细胞的分化与杀伤等生物学过程，是一种重要的细胞膜活化型受体。

CD226可以同T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域分子(TIGIT)竞争性结合CD155/CD112，不同的是CD226胞质区含有磷酸化位点，可以传递活化型信号，而TIGIT胞质区含有ITIM基序，传递抑制型信号。CD226同其配受体CD155之间的连接主要通过其胞膜外区的第一个免疫球蛋白V样结构域，但两个结构域的完整性对于分子间有效结合及信号转导具有重要作用。

CD226分子广泛参与体内多种生理和病理过程，其基因多态性同1型糖尿病(T1DM)、系统性硬化症、类风湿关节炎和系统性红斑狼疮(SLE)等自身免疫性疾病的发生发展密切相关。CD226参与NK细胞抗肿瘤免疫过程，调控CD226和TIGIT的平衡，即促进CD226而抑制TIGIT可以产生抗肿瘤效果。外周血NK细胞CD226表达水平降低同胃癌等实体肿瘤预后不良密切相关，其同抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(iKIR)的比值可以作用预测肿瘤患者生存和预后的指标。NK细胞CD226同肿瘤细胞表达的CD155结合后可以促进叉头盒蛋白O1(Foxo1)磷酸化，进而参与NK细胞抗肿瘤免疫过程，CD226缺失或者使用抗体阻断CD226均可抑制NK细胞对肿瘤细胞的杀伤，抑制Foxo1磷酸化也可以减弱CD226介导的NK细胞杀伤作用。

除了NK细胞，CD226还参与CD8⁺CTL细胞的免疫监视和肿瘤杀伤作用。在衰老和肿瘤发生过程中，TIGIT在CD8⁺T中的表达均明显增加，且TIGIT⁺CD8⁺T细胞高表达PD-1，而低表达CD226，该群细胞产生细胞因子的能力明显降低且更易凋亡，可能是衰老过程中CD8⁺T免疫功能低下和免疫监视功能弱化的重要原因。使用PD-1抗体可以通过抑制SRC同源序列2(SHP2)的去磷酸化恢复CD226的功能活性，且联合糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白(GITR)抗体可以进一步降低TIGIT表达，最终抑制CD8⁺T衰竭，促进对肿瘤细胞的杀伤。

新近研究进一步阐明了CD226参与免疫功能调节的具体分子机制。CD226同CD155结合后可以促进蛋白激酶B(AKT)-Foxo1信号通路磷酸化，Foxo1是一种重要的转录因子，可以参与肿瘤的发生发展过程，其磷酸化促使其从胞核向胞浆转位，进而被蛋白酶体降解，CD226活化后最终抑制了Foxo1的活性。CD226是一个重要的活化型受体，应该还有其它直接的作用机制尚需阐明。另一项研究表明，CD226可以诱导VAV1酪氨酸磷酸化，同T细胞抗原识别受体(TCR)信号通路一同促进CD4⁺T细胞白细胞介素(IL-)17的产生。

抗体单体分子是由两条相同的重链(H链)和两条相同的轻链(L链)，通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。H链和L链包括氨基(N)端和羧基(C)端，靠近N端的可变区(V区)由高变区/互补决定区(HVR/CDR)和骨架区(FR)组成；靠近C端为恒定区(C区)。重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)形成的蛋白质折叠是抗原结合部位，其中的CDR/HVR是抗体与抗原决定基互补结合的部位，C区引发抗原抗体识别后的反应。抗体根据FR/C区不同可分为人源、鼠源等，不同种属来源的抗体在实验动物或者人体内使用时具有免疫原性，易引起机体的免疫反应，可引起对异种来源抗体的清除以及免疫复合物介导的超敏反应。

小鼠是一种重要的模式实验动物，在发病机制研究和药物研发过程中具有不可替代的重要作用。配合小鼠这一模式动物的应用，为深入研究CD226分子的重要作用，需要开发相应的高亲和力和高特异性的单克隆抗体。

因此，筛选出高特异性、高亲和力的鼠源性抗小鼠CD226 mAb，从中克隆出轻、重链可变区基因，对进一步研制具有完全自主知识产权的小鼠CD226基因工程抗体试剂，可以应用于小鼠CD226分子功能机制的研究，以及作为诊断和免疫治疗的重要技术手段，也具有十分重要的实际应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高特异性抗小鼠CD226单克隆抗体及其应用。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开的高特异性抗小鼠CD226单克隆抗体，包括轻链和重链，所述轻链的可变区的3个互补决定区序列分别为：

CDR1：Gln-Ser-Leu-Leu-Tyr-Ser-Ile-Asn-Gln-Lys-Asn-Tyr；

CDR2：Tyr-Trp-Ala-Ser-Thr；

CDR3：Gln-Gln-Tyr-Tyr-Ser-Tyr-Pro；

所述重链的可变区的3个互补决定区序列分别为：

CDR1：Gly-Tyr-Thr-Phe-Thr-Asp-Tyr-Thr；

CDR2：Phe-Tyr-Pro-Arg-Asp-Gly-Ser-Ser；

CDR3：Cys-Ala-Arg-Tyr。

优选地，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1，重链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

优选地，编码轻链可变区的基因序列如SEQ.ID.NO.3所示，编码重链可变区的基因序列如SEQ.ID.NO.4所示。

本发明还公开了上述的高特异性抗小鼠CD226单克隆抗体在构建针对小鼠CD226的基因工程抗体中的应用。

本发明还公开了上述的高特异性抗小鼠CD226单克隆抗体作为干预CD226分子表达和信号转导的生物制剂的应用。

本发明还公开了上述的高特异性抗小鼠CD226单克隆抗体作为细胞膜表面分子表达检测试剂的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供的抗小鼠CD226单克隆抗体，是一种高特异性抗小鼠CD226单克隆抗体：与小鼠血小板、T细胞等CD226阳性表达细胞特异性结合，表现出高亲和力、高特异性；与正常血小板特异性结合、不与CD226KO小鼠血小板结合的抗体。可进一步用于小鼠体内实验方面的研究。

2、本发明克隆抗小鼠CD226单克隆抗体的轻链、重链可变区基因和氨基酸序列，序列分析证实了该抗体序列的惟一性。

3、分析获得轻链、重链可变区的CDR区，在此基础上为构建高特异性、高亲和力的抗小鼠CD226嵌合或人源化基因工程抗体提供支持。

附图说明

图1是FMU-mCD226.1 mAb的流式细胞术鉴定结果；其中，(a)为野生型小鼠血小板FMU-mCD226.1染色结果图；(b)为CD226KO小鼠血小板染色结果图；

图2是FMU-mCD226.1 mAb的促血小板聚集检测结果；其中，(a)为空白对照组的血小板聚集检测结果；(b)为加入诱导剂后的血小板聚集检测结果；(c)为加入单克隆抗体FMU-mCD226.1的血小板聚集检测结果；图3是FMU-mCD226.1 mAb的Western blot鉴定结果；

图4是FMU-mCD226.1 mAb轻链可变区基因同源性序列检测结果；

图5是FMU-mCD226.1 mAb重链可变区基因同源性序列检测结果；

图6为轻链氨基酸序列同源性比对结果图；

图7为重链氨基酸序列同源性比对结果图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书中术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

本发明用重组表达的小鼠CD226分子免疫CD226KO基因修饰的C57/B6小鼠，筛选出能稳定分泌高特异性抗小鼠CD226单抗FMU-mCD226.1 mAb杂交瘤细胞株，制备腹水获得高特异性抗小鼠CD226 mAb；并确认该基因序列和相应蛋白序列的惟一性及其CDR序列。下面结合具体单克隆抗体的制备方法、抗体特异性和活性检测，以及序列的检测和唯一性的确定对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

1、抗小鼠CD226单抗FMU-mCD226.1 mAb的制备及其特异性鉴定

1.1小鼠CD226-Fc蛋白的表达与抗原制备

从美国国立卫生院(NCBI)网站上查询获取小鼠CD226基因序列，将胞膜外区基因插入pSectag2B-Fc真核表达载体，经测序鉴定正确后，转染CHO细胞，收获细胞培养上清，利用抗Fc亲和层析法获得纯化的CD226-Fc重组融合蛋白作为免疫原。

1.2单克隆抗体的制备、纯化

因为普通的野生型小鼠对于同种的CD226分子具有免疫耐受性，所以选择CD226KO小鼠作为免疫动物。按单克隆抗体制备方法(《细胞和分子免疫学实验技术(第一版)》，P9-P17)，用小鼠CD226-Fc抗原免疫CD226KO小鼠(每只小鼠50μg/次，共免疫3只小鼠)。初次免疫使用弗氏完全佐剂，后续免疫使用弗氏不完全佐剂，每次间隔3周，均为皮下多点注射，共免疫4次。末次免疫7～10天后尾尖采血，测定血清抗体效价，检测免疫效果。取血清效价最高的一只小鼠经腹腔注射抗原再次进行加强免疫，3天后处死小鼠，分离脾脏细胞进行细胞融合。

细胞融合操作如下：取对数生长的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0计数，同时制备免疫小鼠脾细胞悬液。将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10比例混合，加入PEG进行细胞融合。融合后细胞悬液加入含有饲养细胞(正常Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞)的96孔板，37℃、5％CO₂孵箱培养。待克隆出现后，将CD226-Fc抗原包被聚苯乙烯酶标板，行间接ELISA检测细胞上清，挑选阳性反应克隆。对含有阳性克隆孔的细胞采用有限稀释法进行克隆化，经4次克隆化后，获得能够稳定分泌阳性反应抗体的单克隆杂交瘤细胞系，命名其克隆号为FMU-mCD226.1。

诱导产生腹水及抗体纯化：在获得能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株后，按常规技术制备腹水(《细胞和分子免疫学实验技术(第一版)》，P9-P17)。宿主小鼠为C57和Babl/c小鼠杂交的F1代小鼠。腹水采用Protein A/G亲和层析法纯化抗体，纯化的FMU-mCD226.1mAb纯度达95％。抗体的IgG亚型的鉴定按Sigma检测试剂盒说明书操作。对其分泌的抗体进行Ig亚类测定，鉴定结果为IgG1亚类，轻链κ型。

1.3抗小鼠CD226单克隆抗体FMU-mCD226.1的效价测定

用间接ELISA方法测定纯化前腹水以及纯化后mAb的相对亲和力。其中包被抗原为重组表达小鼠CD226-Fc免疫原，待测样品为系列稀释的腹水以及纯化后mAb，检测抗体为羊抗鼠-HRP酶标记抗体，底物使用ABTS。所筛选出的高亲和力FMU-mCD226.1 mAb，腹水效价为1×10^-7。

1.4抗小鼠CD226单克隆抗体FMU-mCD226.1的流式细胞术鉴定

剪除小鼠尾尖收集抗凝全血，低速离心分离富血小板血浆，稀释后制成血小板单细胞悬液，计数1×10⁶个血小板，3000rpm离心5min，弃去上清液，然后加入单克隆抗体FMU-mCD226.1(2μg/mL)孵育45min，使用同型单抗IgG做阴性对照。用PBS洗涤2次，再加入PE标记羊抗小鼠二抗避光孵育30min。PBS洗涤2次，加入多聚甲醛固定液400μL，上机检测与分析，使用仪器为流式细胞仪。

流式细胞检测结果如图1所示，从图1中(a)可以看出，野生型小鼠血小板FMU-mCD226.1染色显示阳性反应，而图1中(b)可以看出，CD226KO小鼠血小板染色显示为阴性；该实验结果表明，抗小鼠CD226单克隆抗体FMU-mCD226.1可以与小鼠CD226阳性的血小板高特异性结合。

1.5抗小鼠CD226单克隆抗体FMU-mCD226.1的促血小板聚集功能检测

取小鼠全血，枸橼酸钠抗凝(10⁹mmol/L)，采血量：抗凝剂＝9：1。制备富含血小板血浆(PRP)，低速水平离心机160g离心10min，吸取PRP 300μl，加入装有一粒搅拌子的专用测试杯中，37℃孵育30min，实验组中加入终浓度5μg/ml单克隆抗体FMU-mCD226.1。同时制备乏血小板血浆(PPP)，将上述样本2000g离心10min，吸取PPP 300μl，加入另一个无搅拌子的专用测试杯中。将装有PPP和PRP标本的测试杯放置在半自动血小板聚集仪(LBY-NJ4)恒温孔中预热1min后，用PPP测试杯调整阈值，然后加入不同待测PRP测试杯，根据需求加入0.2U/test凝血酶。检测包括空白对照组(blank)、诱导剂组以及抗体组(诱导剂+抗体处理)，测试完毕后仪器自动记录打印60s、100s、300s时的聚集率、最大聚集率(时间)，以及300s内的聚集曲线。实验过程注意室温保持在20℃-30℃，样本需在3小时内处理完成实验，每次离心后的血浆样本无红细胞、溶血、乳糜现象。

血小板聚集仪检测结果如图2所示，从(a)中可以看出，空白对照组血小板不发生聚集，从(b)中可以看出，加入诱导剂后血小板在160sec左右发生聚集，而从(c)可以看出，单克隆抗体FMU-mCD226.1可以促进血小板发生聚集，聚集峰提早出现在90sec左右；该实验结果表明，抗小鼠CD226单克隆抗体FMU-mCD226.1具有促进血小板聚集的功能。

1.6抗小鼠CD226单克隆抗体FMU-mCD226.1的Western blot鉴定

收集高表达小鼠CD226分子的血小板，裂解细胞，SDS-PAGE后按Western blot步骤用FMU-mCD226.1 mAb检测血小板中小鼠CD226的表达情况。

Western blot步骤：收集细胞，将细胞裂解后制样，SDS-PAGE电泳后转膜。50g/L的脱脂奶粉37℃封闭2h，TBST洗膜3次；按照5g/L的工作浓度加入纯化的mAb FMU-mCD226.1，4℃孵育过夜，TBST洗膜。加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗孵育1h；TBST洗膜后加入ECL底物，显影。

结果显示如图3所示，可以看出，FMU-mCD226.1能够识别野生型小鼠血小板裂解后特定的蛋白，结果表明：抗小鼠CD226单克隆抗体可以特异性识别天然的小鼠CD226蛋白，相对分子量为67kDa。

2、抗小鼠CD226单抗FMU-mCD226.1 mAb轻链和重链可变区基因的克隆

2.1 FMU-mCD226.1 mAb杂交瘤细胞的培养

常规方法培养FMU-mCD226.1杂交瘤细胞株，用含15％小牛血清的RPMI1640培养基于37℃，5％CO₂孵箱中培养至对数生长期。

2.2总RNA的提取和cDNA第一链的合成

采用TRIZOL Reagent(购自美国GIBCO公司)提取总RNA，具体操作步骤按说明书进行；cDNA第一链合成试剂盒购自美国GIBCO公司，在得到总RNA后按说明书进行反转录合成cDNA第一链。

2.3 RT-PCR法扩增FMU-mCD226.1 mAb的VL和VH基因

一步法RT-PCR扩增试剂盒购自TakaRa公司，按试剂盒说明书扩增FMU-mCD226.1mAb的VL和VH基因；

引物如下：

扩增抗体Fd片段及轻链全长基因的引物(括号内为简并碱基)

小鼠重链V区5’端引物：

VH1:5’-GGG GAT ATC CAC CAT GG(AG)ATG(CG)AG CTG(TG)GT(CA)AT(CG)CT CTT-3’

VH2:5’-GGG GAT ATC CAC CAT G(AG)A CTT CGG G(TC)T GAG CT(TG)GGT TTT-3’

VH3:5’-GGG GAT ATC CAC CAT GGC TGT CTT GGG GCT GCT CTT CT-3’

VH4:5’-GGG GAT ATC CAC CAT GAT(AG)GT GTT(AG)AG TCT T(CT)T GT(AG)CCT G3’

Fd 3':5'-AGG CTT ACT AGT ACA ATC CCT GGG CAC AAT-3'；

小鼠轻链V区5’端引物

VL1:5’-GGG GAT ATC CAC CAT GGA GAC AGA CAC ACT CCT GCT AT-3’

VL2:5’-GGG GAT ATC CAC CAT GGA TTT TCA AGT GCA GAT TTT CAG-3’

VL3:5’-GGG GAT ATC CAC CAT GGA G(AT)C ACA(GT)(AT)C TCG GGTCTT T(GA)TA-3’

VL4:5’-GGG GAT ATC CAC CAT G(GT)C CCC(AT)(AG)C TCA G(CT)T C(CT)C T(TG)G T-3’

VL5:5’-GGG GAT ATC CAC CAT GAA GTT GCC TGT TAG GCT GTT G-3’

轻链3'端引物：

MLC-3’:5'-GCG CCG TCT AGA ATT AAC ACT CAT TCC TGT TGA A-3'；

反应体积50μl，反应条件为：94℃5min；95℃30s，58℃1min，72℃1min，循环35次；72℃7min。

2.4PCR扩增产物的克隆和筛选

PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，回收PCR扩增片段，用DNA连接试剂盒(购自TakaRa公司)将该片段按说明书，利用加A尾插入pMD-18T载体(购自TakaRa公司)中，连接物转化大肠杆菌E.coli，接种在Amp抗性LB琼脂培养平皿中37℃培养过夜。

挑取LB琼脂培养平皿中克隆，在Amp抗性LB培养基中37℃摇菌过夜，以lμl菌液为模板，通过上述针对轻链、重链可变区设计的引物，用PCR法筛选重组阳性E.coli克隆。

将所获得重组阳性E.coli克隆摇菌并进行基因序列测定，轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.3所示，重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

3、FMU-mCD226.1 mAb轻链和重链可变区的核苷酸序列及同源性分析

3.1确定测序无误后，在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库中，进行核苷酸序列同源性分析(Blastn)。

如图4所示，FMU-mCD226.1 mAb轻链可变区基因与小鼠基因组同源性最高对比序列最高者为289/299(92％)；

如图5所示，FMU-mCD226.1 mAb重链可变区基因与同源性最高对比序列可达283/286(97％)。

同源性分析表明，编码FMU-mCD226.1 mAb的轻、重链可变区的核苷酸序列，尽管与其它基因序列有一定同源性，但未发现与本发明完全相同的基因序列，表明本发明在基因序列上具有惟一性。

3.2将可变区基因翻译成氨基酸序列，进行氨基酸序列分析

单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在non-redundant Genbank CDS translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF蛋白质数据库中，进行氨基酸序列同源性分析(Blastp)。

分析结果表明：

如图6所示，FMU-mCD226.1 mAb轻链氨基酸序列与同源性最高对比序列可达126/133(95％)；

如图7所示，FMU-mCD226.1 mAb重链氨基酸序列与同源性最高对比序列可达110/141(78％)。

同源性分析表明，FMU-mCD226.1 mAb轻、重链可变区的氨基酸序列，尽管与其它蛋白氨基酸序列有一定同源性，但未发现与本发明完全相同的氨基酸序列，表明本发明在氨基酸序列上也具有惟一性。

3.3利用IMGT/V-QUEST分析可变区结构，确定CDR区

将测序所得FMU-mCD226.1 mAb轻链和重链可变区序列，分析得出其CDR区。

轻链可变区的3个互补决定区(CDR)序列，具体为：

CDR1：Gln-Ser-Leu-Leu-Tyr-Ser-Ile-Asn-Gln-Lys-Asn-Tyr；

CDR2：Tyr-Trp-Ala-Ser-Thr；

CDR3：Gln-Gln-Tyr-Tyr-Ser-Tyr-Pro；

重链可变区的3个互补决定区(CDR)序列，具体为：

CDR1：Gly-Tyr-Thr-Phe-Thr-Asp-Tyr-Thr；

CDR2：Phe-Tyr-Pro-Arg-Asp-Gly-Ser-Ser；

CDR3：Cys-Ala-Arg-Tyr。

综上所述，本发明提供了具有生物学活性的抗小鼠CD226单克隆抗体FMU-mCD226.1的轻链和重链可变区，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1，重链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。通过常规杂交瘤技术和CD226基因敲除小鼠制备了一株小鼠抗小鼠CD226单克隆抗体，筛选出能稳定分泌高特异性的抗小鼠CD226 mAb的杂交瘤细胞株FMU-mCD226.1，制备腹水获得高特异性、高亲和力的抗小鼠CD226 mAb，可以应用于免疫印迹、免疫荧光染色和流式细胞术检测。确认该基因序列和相应蛋白序列的惟一性及其CDR序列；为研制和开发抗小鼠CD226分子诊断和治疗试剂提供技术支持。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

序列表

<110> 中国人民解放军第四军医大学

<120> 一种高特异性抗小鼠CD226单克隆抗体及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser

1 5 10 15

Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser

35 40 45

Leu Leu Tyr Ser Ile Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln

50 55 60

Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg

65 70 75 80

Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

85 90 95

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr

100 105 110

Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr

115 120 125

Lys Leu Glu Ile Lys

130

<210> 2

<211> 141

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Glu Trp Ser Trp Val Ser Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Ser Val Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Met Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asp Tyr Thr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Phe Phe Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Ser Gln Tyr Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Trp Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Trp Asp Gly Tyr Tyr Leu Pro Ser Trp Phe

115 120 125

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

130 135 140

<210> 3

<211> 424

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggaatgga gctgggtttc tctcttcttc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag 60

gttcagctgc aacagtctga cgctgagtcg gtgaaacctg gagcttcagt gatgatatcc 120

tgcaagggtt ctggctacac cttcactgac tatactattc actgggtgaa gcagaggcct 180

gaacagggcc tggaatggat tggatttttt tatcctagag atggtagtag tcagtacaat 240

gagaagttca agggcaaggc cacatggact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg 300

cagctcaaca gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt tctgtgcaag atattgggat 360

ggttactacc taccctcctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct 420

gcag 424

<210> 4

<211> 400

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggattcac aggcccaggt tcttatgtta ctgctgctat gggtatctgg tacctgtggg 60

gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 120

atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtatca atcaaaagaa ctacttggcc 180

tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 240

gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 300

atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatagctat 360

ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaac 400

Claims

1.一种高特异性抗小鼠CD226单克隆抗体，包括轻链和重链，其特征在于，所述轻链的可变区的3个互补决定区序列分别为：

CDR1：Gln-Ser-Leu-Leu-Tyr-Ser-Ile-Asn-Gln-Lys-Asn-Tyr；

CDR2：Tyr-Trp-Ala-Ser-Thr；

CDR3：Gln-Gln-Tyr-Tyr-Ser-Tyr-Pro；

所述重链的可变区的3个互补决定区序列分别为：

CDR1：Gly-Tyr-Thr-Phe-Thr-Asp-Tyr-Thr；

CDR2：Phe-Tyr-Pro-Arg-Asp-Gly-Ser-Ser；

CDR3：Cys-Ala-Arg-Tyr。

2.如权利要求1所述的高特异性抗小鼠CD226单克隆抗体，其特征在于，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，重链可变区的氨基酸序列如 SEQ.ID.NO.2所示。

3.如权利要求1所述的高特异性抗小鼠CD226单克隆抗体，其特征在于，编码轻链可变区的基因序列如SEQ.ID.NO.3所示，编码重链可变区的基因序列如SEQ.ID.NO.4所示。

4.权利要求1~3中任意一项所述的高特异性抗小鼠CD226单克隆抗体在构建针对小鼠CD226的基因工程抗体中的应用。

5.权利要求1~3中任意一项所述的高特异性抗小鼠CD226单克隆抗体在制备干预CD226分子表达和信号转导的生物制剂中的应用。

6.权利要求1~3中任意一项所述的高特异性抗小鼠CD226单克隆抗体在制备细胞膜表面CD226分子表达检测试剂中的应用。