CN112940122B - 靶向dnam-1的鼠单链抗体、表达所述鼠单链抗体的重组质粒、重组细胞及应用 - Google Patents

靶向dnam-1的鼠单链抗体、表达所述鼠单链抗体的重组质粒、重组细胞及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112940122B
CN112940122B CN202110197740.9A CN202110197740A CN112940122B CN 112940122 B CN112940122 B CN 112940122B CN 202110197740 A CN202110197740 A CN 202110197740A CN 112940122 B CN112940122 B CN 112940122B
Authority
CN
China
Prior art keywords
chain antibody
ser
variable region
dnam
chain variable
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110197740.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112940122A (zh
Inventor
焦顺昌
张嵘
胡坤
袁翰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Dingcheng Taiyuan Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Beijing Dingcheng Taiyuan Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Dingcheng Taiyuan Biotechnology Co ltd filed Critical Beijing Dingcheng Taiyuan Biotechnology Co ltd
Priority to CN202110197740.9A priority Critical patent/CN112940122B/zh
Publication of CN112940122A publication Critical patent/CN112940122A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112940122B publication Critical patent/CN112940122B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了靶向DNAM‑1的鼠单链抗体、表达所述鼠单链抗体的重组质粒、重组细胞及应用，属于抗体制备技术领域，所述靶向DNAM‑1的鼠单链抗体包括鼠单链抗体DN9或鼠单链抗体DN12；所述鼠单链抗体DN9的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述鼠单链抗体DN9的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述鼠单链抗体DN12的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，所述鼠单链抗体DN12的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。所述靶向DNAM‑1的鼠单链抗体能够与DNAM‑1抗原特异性结合，能够快速高效的检测DNAM‑1抗原。

Description

靶向DNAM-1的鼠单链抗体、表达所述鼠单链抗体的重组质粒、 重组细胞及应用
技术领域
本发明属于抗体制备技术领域，尤其涉及靶向DNAM-1的鼠单链抗体、表达所述鼠单链抗体的重组质粒、重组细胞及应用。
背景技术
DNAM-1，也称为CD226，是一种65kDa跨膜糖蛋白，在细胞外部分含有两个免疫球蛋白样结构域，并在大多数人和小鼠的NK细胞，CD8+T细胞，CD4+T细胞，单核细胞和血小板中表达。CD155(脊髓灰质炎病毒受体；PVR/NECL-5/Tage4)及其家族成员CD112(PRR-2/型Nectin-2)是人和小鼠DNAM-1配体。CD8+T细胞或NK细胞上DNAM-1与靶细胞上的配体CD155或CD112之间的相互作用诱导了CD8+介导的细胞介导的细胞毒性T细胞和NK细胞在体外和体内。此外，DNAM-1在CD4+辅助性T细胞分化中起着重要作用。
鼠DNAM-1的单克隆抗体(MAb)，可有效抑制CD8+T细胞和NK细胞对表达CD155的肿瘤细胞的细胞毒性，这表明MAb干扰了DNAM-1与CD155。MAb同种异体骨髓移植的小鼠显着改善了急性移植物抗宿主病(GVHD)的发展，表明MAb在体内也可能抑制DNAM-1与配体的结合。这些结果表明抗DNAM-1MAb可用于预防或治疗GVHD。但是目前抗DNAM-1MAb种类较少。
发明内容
有鉴于此，为了筛选更有效的抗DNAM-1MAb阻断体内DNAM-1与配体的相互作用，本发明提供了新的靶向DNAM-1的鼠单链抗体、表达所述鼠单链抗体的重组质粒、重组细胞及应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了靶向DNAM-1的鼠单链抗体，包括鼠单链抗体DN9或鼠单链抗体DN12；所述鼠单链抗体DN9的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述鼠单链抗体DN9的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述鼠单链抗体DN12的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，所述鼠单链抗体DN12的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示。
优选的，所述鼠单链抗体DN9的重链可变区和轻链可变区通过第一链接肽连接；所述鼠单链抗体DN12的重链可变区和轻链可变区通过第二链接肽连接；所述第一链接肽的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，所述第二链接肽的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
本发明提供了编码所述的靶向DNAM-1的鼠单链抗体的基因，编码所述鼠单链抗体DN9的基因包括顺次连接的编码DN9重链可变区的核苷酸、第一连接序列和编码DN9轻链可变区的核苷酸；所述编码DN9重链可变区的核苷酸如SEQ ID No.7所示，编码DN9轻链可变区的核苷酸如SEQ ID No.8所示；第一连接序列如SEQ ID No.9所示；
编码所述鼠单链抗体DN12的基因包括顺次连接的编码DN12重链可变区的核苷酸、第二连接序列和编码DN12轻链可变区的核苷酸；所述编码DN12重链可变区的核苷酸如SEQID No.10所示，编码DN12轻链可变区的核苷酸如SEQ IDNo.11所示；第二连接序列如SEQ IDNo.12所示。
本发明提供了一种表达所述鼠单链抗体的重组质粒，包括初始质粒和所述的编码靶向DNAM-1的鼠单链抗体的基因。
优选的，所述初始质粒为pFUSE-hIgG1e3-Fc质粒。
优选的，所述的编码靶向DNAM-1的鼠单链抗体的基因克隆至所述初始质粒的NcoI酶切位点和BglII酶切位之间。
本发明提供了一种表达所述鼠单链抗体的重组细胞，通过将所述重组质粒转染初始细胞获得。
优选的，所述初始细胞为expiCHO细胞。
本发明提供了所述的鼠单链抗体、所述重组质粒、所述的重组细胞在检测DNAM-1抗原中的应用。
本发明提供了所述的鼠单链抗体、所述重组质粒、所述的重组细胞在检测含有表达DNAM-1的质粒的Jurkat细胞中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供了靶向DNAM-1的鼠单链抗体、表达所述鼠单链抗体的重组质粒、重组细胞及应用；所述靶向DNAM-1的鼠单链抗体能够与DNAM-1抗原特异性结合，能够快速高效的检测DNAM-1抗原以及含有表达DNAM-1的质粒的Jurkat细胞。
附图说明
图1为通过ELISA方法对来自各杂交瘤细胞(DNM1-DNM18)培养上清的抗体滴度的定结果；
图2为质粒PB-Luc-DNAM-1的质粒图谱；
图3为荧光素酶检测试验，blank control表示空白对照组，negative control表示野生型jurkat细胞组，sample表示DNM-1-Jurkat细胞组；
图4为Jurkat细胞群体以及Jurkat-DNAM-1细胞群体中PE偶联抗人CD226标记的平均荧光强度值(MFI)；
图5为与杂交瘤细胞(DNM1-DNM18)分泌的单克隆抗体结合的Jurkat-DNAM-1细胞群体中PE偶联抗鼠IgG抗体标记的平均荧光强度(MFI)；
图6为以lgM为保守区特异性引物扩增DN9、DN12单抗的重链可变区扩增产物电泳图，其中M为Trans 2k marker，1为9-lgM(DN9扩增产物)，2为12-lgM(DN12扩增产物)，3为15-lgM(实施例1中DNM15细胞上清)，4为15-lgM(实施例1中DNM15细胞上清)；
图7为抗DNAM-1的单链抗体重组表达上清结合靶细胞Jurkat-DNAM-1的强度比较。
具体实施方式
本发明提供了靶向DNAM-1的鼠单链抗体，包括鼠单链抗体DN9或鼠单链抗体DN12；所述鼠单链抗体DN9的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述鼠单链抗体DN9的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述鼠单链抗体DN12的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，所述鼠单链抗体DN12的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示。
在本发明中，鼠单链抗体DN9的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：
EVQLQESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPGNKLEYMGYISYSGSTYYNPSLKSRISITRDTSKNQYYLQLNSVTTEDTATYYCARYWRYDGYAMDYWGQGTSVTVSS；
所述鼠单链抗体DN9的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：
IVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYSSPYTFGGGTKLEIKR；
所述鼠单链抗体DN12的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，具体如下：
DVKLVESGGGLVKLGGSLKLSCAASGFTFSSYYMSWVRQTPEKRLELVAAINSNGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTALYYCARHNYGSSYAWFAYWGQGTLVTVSA；
所述鼠单链抗体DN12的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，具体如下：
DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISNNLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPRTFGGGTKLEIKR。
在本发明中，所述鼠单链抗体DN9的重链可变区和轻链可变区优选的通过第一链接肽连接；所述鼠单链抗体DN12的重链可变区和轻链可变区优选的通过第二链接肽连接；所述第一链接肽的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，具体如下：GGGGSGGGGSGGGGS；所述第二链接肽的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，具体如下GGGGSGGGGSGGGGS。
本发明还提供了编码所述的靶向DNAM-1的鼠单链抗体的基因，编码所述鼠单链抗体DN9的基因包括顺次连接的编码DN9重链可变区的核苷酸和编码DN9轻链可变区的核苷酸；在本发明中，所述基因优选的为根据中国仓鼠卵巢细胞(CHO)的密码子偏好性优化后的基因包括顺次连接的编码DN9重链可变区的核苷酸、第一连接序列和编码DN9轻链可变区的核苷酸。在本发明中，所述编码DN9重链可变区的核苷酸如SEQ ID No.7所示，具体如下：
gaggtgcagctgcaagagagcggccctagcctggtgaagccttctcagaccctgagcctgacctgcagcgtgaccggcgactccatcacgagcggttactggaactggatcagaaagttccctggcaacaagctggagtacatgggctacatcagctacagcggcagcacctactacaaccctagcctgaagagcagaatctctatcacaagagacacaagcaagaatcagtactacctgcagctgaacagcgtgaccaccgaggacaccgccacctactactgcgctagatactggagatacgacggctacgctatggactactggggccaaggcacaagcgtgaccgtgagcagc；
编码DN9轻链可变区的核苷酸如SEQ IDNo.8所示，具体如下：
atcgtgatgacacagacccctaagttcctgctggtgagcgccggcgacagagtgaccatcacctgcaaggcttctcagagcgtgagcaacgacgtggcctggtatcagcagaagcctggacagagccctaagctgctgatctactacgctagcaacagatacaccggcgtgcctgacagattcaccggcagcggctacggcaccgacttcaccttcaccatcagcaccgtgcaagccgaggacctggccgtgtacttctgtcagcaagactacagcagcccttacacctttggtggcggcaccaaactggaaataaagaga；
第一连接序列如SEQ IDNo.9所示，具体如下：ggtggcggcggcagcgggggtggcggttcgggcggaggcggaagt。
在本发明中，编码所述鼠单链抗体DN12的基因包括顺次连接的编码DN12重链可变区的核苷酸和编码DN12轻链可变区的核苷酸；在本发明中，所述基因优选的为根据中国仓鼠卵巢细胞(CHO)的密码子偏好性优化后的基因包括顺次连接的编码DN12重链可变区的核苷酸、第二连接序列和编码DN12轻链可变区的核苷酸。
所述编码DN12重链可变区的核苷酸如SEQ ID No.10所示，具体如下：
gatgtaaagctggttgaaagcggcggtggcctcgtgaagctaggcgggagcctgaagctgagctgcgccgctagcggcttcaccttcagcagctactacatgagctgggtgagacagacccctgagaagagactggagctggtggccgccatcaacagcaacggcggcagcacctactaccctgacaccgtgaagggcagattcaccatcagcagagacaacgccaagaacaccctgtacctgcagatgagcagcctgaagagcgaggacaccgccctgtactactgcgctagacacaactacggcagcagctacgcctggttcgcctactggggccaaggcaccctggtgaccgtgagcgcc；
编码DN12轻链可变区的核苷酸如SEQ ID No.11所示，具体如下：
gacatcgtgctgacacagagccctgccaccctgagcgtgacccctggcgacagcgtgagcctgagctgcagagcaagccaaagcatatctaacaacctgcactggtatcagcagaagagccacgagagccctagactgctgatcaagtacgctagccaaagtatcagcggcatacctagcagattcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgagcatcaacagcgtggagaccgaggacttcggcatgtacttctgtcagcagagcaacagctggcctagaacctttggaggcggtactaagctggagataaaaaga；
第二连接序列如SEQ IDNo.12所示：
ggtggcggcggcagtggtggaggcgggagcggcggcggcgggagc。
本发明还提供了一种表达所述鼠单链抗体的重组质粒，包括初始质粒和所述的编码靶向DNAM-1的鼠单链抗体的基因。在本发明中，所述初始质粒优选为pFUSE-hIgG1e3-Fc质粒；所述初始质粒优选的购自美国InvivoGen公司。在本发明中，所述的编码靶向DNAM-1的鼠单链抗体的基因优选的克隆至所述初始质粒的NcoI酶切位点和BglII酶切位之间。在本发明具体实施过程中，优选的委托生物公司进行基因的合成以及重组质粒的构建。在本发明中，表达所述鼠单链抗体DN9的重组质粒重组载体命名为MHy9 inpFUSE；表达所述鼠单链抗体DN12的重组质粒重组载体命名为MHy12 inpFUSE。
本发明还提供了一种表达所述鼠单链抗体的重组细胞，通过将所述重组质粒转染初始细胞获得。在本发明中，所述初始细胞优选为expiCHO细胞。本发明对所述转染的方法没有特殊限定，采用本领域常规的转染方法即可。
本发明还提供了所述的鼠单链抗体、所述重组质粒、所述的重组细胞在检测DNAM-1抗原中的应用。
本发明还提供了所述的鼠单链抗体、所述重组质粒、所述的重组细胞在检测含有表达DNAM-1的质粒的Jurkat细胞中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
靶向DNAM-1的抗体杂交瘤细胞株的建立
抗原：KACTΜS品牌商品化抗原human DNAM-1Protein
动物免疫
选自SPF级BALB/C小鼠(雌性6～8周龄)，采购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
免疫方案
取商品化抗原human DNAM-1Protein，加等体积弗氏完全佐剂(FCA)，制成乳化剂，免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠4只，详细免疫方案见表1。
表1小鼠免疫方案
Figure BDA0002946386620000031
注：1.每次免疫间隔2周；2.弗氏不完全佐剂(IFCA)；3.小鼠血清效价测定，小鼠尾静脉采血，分离出血清，ELISA(酶联免疫吸附法)检测血清抗体效价，取血清效价大于1:10000的小鼠，融合前1天进行加强免疫。
细胞融合
1.sp2/0细胞(骨髓瘤细胞，ATCC购买)准备
融合前一周，复苏sp2/0细胞，融合前一天，取细胞上清行支原体检测。
2.小鼠脾脏细胞准备
无菌摘除加强免疫后小鼠脾脏置于冷的PBS中，70μm滤网上研磨，300g，10min离心，弃上清，用含有2mM EDTA的磷酸盐缓冲溶液(PBS)以1×108cells/mL重悬细胞，待用。
3.免疫磁珠分选CD138细胞
采用STEMCELL试剂盒EasySepTMMoμse CD 138Positive Selection Kit。向2中待用脾脏细胞中加入终浓度为50μL/mL的FcR blocker，50μL/mL的Selection Cocktail，混合，冰上孵育5min。加入终浓度为50μL/mL的RapidSpheresTM，混合，冰上孵育5min。补加含有2mM EDTA的PBS至2.5mL,轻柔混匀，将细胞管子放入磁力架上，室温静置3min。弃掉上清，加入含有2mM EDTA的PBS至2.5mL，重复3次，共计4次分离，用ClonaCellTM-HY MediumB重悬。
4.细胞融合
细胞：sp2/0细胞(支原体检测阴性，活率大于95％)，MOΜSE CD 138细胞
融合方法：传统PEG法
细胞融合数量比：sp2/0:MOΜSE CD 138＝1:5；
融合所用试剂：ClonaCellTM-HYHybridomaKit；
融合过程按照ClonaCellTM-HYHybridoma Kit技术手册执行。
融合后细胞的选择性培养及杂交瘤细胞的克隆化
融合后细胞使用ClonaCellTM-HY Medium C培养基培养1天，获取细胞，400g，10min，弃去上清，使用ClonaCellTM-HYLiqμidHAT Selection Medium培养基培养，培养第7天时，第一次换液，培养第12天时，第二次换液，在培养第14天时，获取细胞，应用流式分选仪通过每孔1个细胞的方法分选至96孔板中，之后使用ClonaCellTM-HY Liqμid HATSelection Medium培养基筛选一周。显微镜镜下挑选细胞单克隆孔，标记，并改用ClonaCellTM-HYMediumE培养基继续培养。
杂交瘤细胞单克隆抗体特异性鉴定ELISA
(1)DNAM-1protein抗原包被
用包被液稀释DNAM-1protein抗原至浓度1μg/mL，100μL/孔，4℃过夜。
(2)洗板
弃去孔内溶液，拍干，加洗涤液PBST，每孔300μL，每次洗板间隔静置30s，重复三次。
(3)封闭
加封闭液BSA200μL/孔，室温，静置2h。
(4)洗板
重复步骤(2)。
(5)加样
每孔加入100μL的杂交瘤细胞上清液作为样本，并添加100μL稀释1000倍阳性血清作为阳性对照，添加100μL PBS作为空白对照。
(6)洗板
重复步骤(2)。
(7)加酶标抗抗体
加入稀释5000倍的羊抗鼠lgG(辣根过氧化物酶标记)抗体，100μL/孔，室温，静置2h。
(8)洗板
重复步骤(2)，洗板次数增加至5次。
(9)加底物显色
加TMB底物溶液50μL/孔，室温避光，静置5min。
(10)终止反应
加入1mol/LH2SO4，50μL/孔，震荡数秒混匀。
用酶标仪进行双波长(LM1:450nm，LM2:570nm)比色测定，根据测定结果绘制图1，参考阳性对照(Positive control)及空白对照(Blank control),可见DNM9和DNM12杂交瘤细胞上清抗体滴度较高。
表2 ELISA对来自各杂交瘤细胞(DNM1-DNM18)培养上清的抗体滴度数据的定量数据表
Figure BDA0002946386620000041
杂交瘤细胞单克隆抗体结合靶细胞检测
Jurkat-DNAM-1靶细胞的构建
本发明涉及的原始Jurkat细胞(Clone E6-1),细胞使用的细胞活率95％以上。培养基：RPMI1640完全培养基；每2天传代一次，传代密度为3×105cells/mL
质粒由金唯智生物科技有限公司进行构建(PB-Luc-DNAM-1，项目号为80-492124717)，质粒谱图如图2所示，并进行无内毒素大题制备，用于Jurkat细胞的转染。
1×107数量的Jurkat细胞(ATCC购买，Clone E6-1，细胞使用的细胞活率95％以上)用RPMI1640培养基洗涤离心，转移至电转仪Celetrix，CTX-1500A配套的电击杯(120μlCeletric Cat.NO.1204)内，添加10μg PB-Luc-DNAM-1质粒轻柔混匀后冰上放置5min，690V30ms电击，电击完毕后再次将电击杯(120μl Celetric Cat.NO.1204)放置冰上降温5min。然后将所有细胞悬液转移至洁净的75CM2细胞瓶(CORNING FLASK，430641)内的25mL体积的RPMI1640完全培养基中，37℃培养箱(ESCD，CCL-240B-8)内静置培养48h。此时，称转染后的细胞为Jurkat-DNAM-1。
加入0.5μg/mL的嘌呤霉素(Invivogen品牌)筛选一周。以3×105cells/mL密度传代于细胞瓶(75cm2 CELL CORNING，FLAK，430641)中，于37℃培(ESCD，CCL-240B-8)内静置培养，每48h完全更换培养基，并调节细胞密度为3×105cells/mL。若换液时细胞活率大于70％，则逐步少量地提高药筛浓度，一周后使嘌呤霉素药筛浓度达3.0μg/mL
Jurkat-DNAM-1细胞报告活性功能的鉴定
细胞计数后分别取1×105的Jurkat-DNAM-1和Jurkat-WT细胞细胞用500μL体积RPMI1640培养基(10％FBS)于6孔板内进行抗体孵育，加入anti-human CD314(DNAM-1)Clone：TX 25抗体2μL，37°孵育4小时，孵育结束后将细胞悬液收集，离心并去上清，将细胞沉淀转入96孔板，加100μL ONE-Lite底物加酶的1：1混合液，另外设置只加ONE-Lite底物加酶的1：1混合液试剂作为对照。上酶标仪(MD SpectraMax i3X)(吸光度、LM1：450，LM2：630，板式：96孔标准孔板，读取高度：14.6毫米)检测被抗体激活后的发光信号强度，根据荧光强度值绘制图3，纵坐标为luc值，横坐标blank control表示空白对照组，negative control表示野生型jurkat细胞组，sample表示DNM-1-Jurkat细胞组。
表3荧光素酶检测试验luc数值表
Blankcontrol Negativecontrol sample
luc 5.2 10.7 95.6
Jurkat-DNAM-1细胞的筛选
Jurkat-DNAM-1细胞在用嘌呤霉素药筛一周后(细胞电击48小时后，用完全培养基稀释活细胞，细胞活率＞90％以上)，应用流式细胞术和抗体激活DNAM-1蛋白，鉴定DNAM-1蛋白在Jurkat-DNAM-1细胞中的持续表达情况(分别取1×106的Jurkat-DNAM-1和Jurkat-WT细胞用含0.5％BSA的PBS(Hyclone，SH30256.01)(下同)洗去培养基后，加入直标抗体(PEanti-human CD226(DNAM-1)Clone：11A8)，室温避光孵育20min，PBS洗去荧光抗体后，用400μLPBS重悬，流式细胞仪(BD LSRFORTESSA)检测PE荧光表达DNAM-1阳性的细胞比例)。设置PE通道信号门限，使Jurkat组阳性细胞平均荧光强度(MFI)小于“1000”，计算Jurkat-DNAM-1细胞组阳性细胞的MFI值，绘制图4。
表4 Jurkat细胞群体以及Jurkat-DNAM-1细胞群体中PE偶联抗人CD226标记的平均荧光强度值(MFI)数值表
细胞名称 Jurkat Jurkat-DNAM-1
MFI 274.8 23472.7
Jurkat-DNAM-1细胞杂交瘤细胞单克隆抗体孵育
每流式管取Jurkat-DNAM-1细胞1×106，600g，3min，弃去上清。取各杂交瘤细胞上清，400g，5min，吸取上清，对应加入到Jurkat-DNAM-1细胞中，重悬混匀，室温下孵育40min。
PE抗鼠IgG抗体孵育
取各杂交瘤细胞上清孵育后的细胞，加入1mL PBS，混匀，600g，3min，弃上清，加入100μL浓度为10μg/mL PE抗鼠IgG抗体室温下孵育30min。
流式检测
取PE抗鼠IgG抗体孵育后细胞，加入1mL PBS，600g，30min，弃上清，加入300μL PBS重悬，使用流式仪检测分析，设置PE通道的信号门限，使空白对照组(Blank control)阳性细胞平均荧光强度(MFI)小于“1000”，计算杂交瘤各克隆上清结合Jurkat-DNAM-1细胞的荧光强度，绘制图5，可见DNM 12杂交瘤细胞分泌的DN 12MFI值最高，因此，认为其结合能力最强。比较各杂交瘤细胞抗体结合靶细胞FMI(平均荧光强度)值，选择结合较高的DNM9，DNM12杂交瘤细胞进行抗体序列测序。
表5杂交瘤细胞(DNM1-DNM18)分泌的单克隆抗体结合的Jurkat-DNAM-1细胞群体中PE偶联抗鼠IgG抗体标记的平均荧光强度(MFI)
Figure BDA0002946386620000051
实施例2
5'RACE方法确定DN9、DN12单抗的重链和轻链可变区序列
实验材料
DNM9，DNM12杂交瘤细胞(实施例1中制备获得)
试剂：RNA提取试剂(thermoFisher品牌)、SMARTer RACE 5'/3'kit(Takara品牌)以及pLB零背景快速连接试剂盒(天根品牌)
实验方法
1.参考RNA提取试剂说明书，提取DNM9，DNM12杂交瘤细胞RNA，方法简述如下：
1)1×107个细胞中加0.5mL TRIZOL，重悬细胞，冰上放置5min；
2)加五分之一体积的氯仿混匀，4℃14000rpm，离心15min；
3)吸取上清转入新的EP管中，加等体积的异丙醇，混匀4℃14000rpm，离心15min；
4)弃上清加入500μl的75％乙醇，4℃14000rpm离心5min；
5)弃上清，RNA干燥5min，加30μl H2O，测浓度和纯度，-70℃冰箱保存。
2.RNA反转录成cDNA
反转录cDNA体系：
Figure BDA0002946386620000052
反转录程序：
72℃3min，42℃2min。
42℃90min，70℃10min。
PCR扩增DN9、DN12单抗的轻链和重链可变区序列
表6轻链和重链可变区扩增所用的引物信息
Figure BDA0002946386620000053
Figure BDA0002946386620000061
PCR扩引增物体系：
Figure BDA0002946386620000062
PCR扩增程序：
Figure BDA0002946386620000063
3)电泳检PCR结果并将目的片段进行切胶回收；
4)将目的片段和pLB(pLB零背景快速连接试剂盒提供)载体片段进行连接
连接体系：
Figure BDA0002946386620000064
室温连接5min获得连接产物；
1)连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；
2)挑选平板上单克隆菌落，摇菌提质粒并测序得到单抗的重链和轻链可变区序列。
实验结果
结果如图6所示，以lgM为保守区，特异性引物扩增DN9、DN12单抗的重链可变区序列的扩增产物电泳图。
将目的片段切胶回收连接pLB载体并测序，获得以下结果：DN9轻链可变区的氨基酸序列和DNA序列(此处序列为鼠脾脏B细胞天然抗体序列，与我们密码子优化后的expiCHO细胞表达载体序列不同)：
IVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYSSPYTFGGGTKLEIKR(SEQ ID No.2)。
DNA序列如SEQ IDNo.21所示。
表7 DN9轻链可变区的氨基酸序列区域
Figure BDA0002946386620000065
DN9轻链可变区的氨基酸序列：
EVQLQESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPGNKLEYMGYISYSGSTYYNPSLKSRISITRDTSKNQYYLQLNSVTTEDTATYYCARYWRYDGYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID No.1)。
DNA序列如SEQ ID No.28所示。
表8 DN9轻链可变区的氨基酸序列区域
Figure BDA0002946386620000066
Figure BDA0002946386620000071
DN12轻链可变区的氨基酸序列：
DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISNNLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPRTFGGGTKLEIKR(SEQ ID No.4)
DNA序列如SEQ ID No.36所示。
表9 DN12轻链可变区的氨基酸序列区域
Figure BDA0002946386620000072
DN12重链可变区的氨基酸序列：
DVKLVESGGGLVKLGGSLKLSCAASGFTFSSYYMSWVRQTPEKRLELVAAINSNGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTALYYCARHNYGSSYAWFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID No.3)
DNA序列如SEQ ID No.43所示。
表10 DN9轻链可变区的氨基酸序列区域
Figure BDA0002946386620000073
实施例3
单链抗体的重组表达载体的构建
使用两个靶向DNAM-1的抗体DN9，DN12轻重链氨基酸序列，加入氨链接肽，密码子优化后构建单链抗体的重组表达载体。
DN9单链抗体的重组后氨基酸序列如SEQ ID No.51所示。
根据中国仓鼠卵巢细胞(CHO)的密码子偏好性，优化核苷酸序列如SEQ ID No.52所示。：
DN12单链抗体的重组后氨基酸序列如SEQ ID No.53.所示。：
根据中国仓鼠卵巢细胞(CHO)的密码子偏好性，优化核酸序列如SEQ ID No.54所示。
上述序列交由金唯智进行全序列合成，克隆至pFUSE-hIgG1e3-Fc质粒(购自美国InvivoGen)，委托金唯智公司通过上游NcoI酶切位点和下游BglII酶切位点构建，获得重组载体分别称为MHy9 in pFUSE和MHy12 in pFUSE。
实施例4
DN9、DN12单链抗体的瞬时表达验证
材料
expiCHO细胞(购自thermofisher)；
MHy9 inpFUSE和MHy12 inpFUSE重组表达质粒(pFUSE载体金唯智合成)；
CHO CD04 Medium(QUACELL，A11004)
电转仪(celetrix，CTX-150A)
120μl电击管(celetrix)
电转缓冲液(celetrix)
抗DNAM-1对照抗体(克隆TX25，Biolegend)
Jurkat-DNAM-1细胞
PE标记的抗人Fc抗体(410708，Biolegend)
步骤
1.expiCHO细胞染色计数，取1×107个300g离心5min，加入200μg表达质粒和100μl电转缓冲液，混匀后转移至120μl电击管中，700V电击30ms，将电转后的细胞置于含3ml CHOCD04 Medium培养基的六孔板中，于5％CO2，105rpm培养5天。
2.将培养液8000rpm离心5min，取1ml上清加入1000000个Jurkat-DNAM-1细胞室温亲和1h，另取抗DNAM-1对照抗体(克隆TX25，Biolegend)5μg加入1000000个Jurkat-DNAM-1室温亲和1h作为对照品。将上述各试样和对照品500g离心，弃上清，PBS清洗2次，分别向各管中加入5μl抗人Fc二抗进行孵育1h。
3.同时取1000000个Jurkat-DNAM-1细胞只加入单染PE标记的抗人Fc抗体孵育1h做阴性对照(HUMAN-control)。
4.PBS洗2次，调节体积后通过Fortessa流式细胞仪检测。
结果
设置PE通道的信号门限，绘制图7，比较阴阳性对照得出MHy9 in pFUSE表达上清可较强结合靶细胞Jurkat-DNAM-1。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京鼎成肽源生物技术有限公司
<120> 靶向DNAM-1的鼠单链抗体、表达所述鼠单链抗体的重组质粒、重组细胞及应用
<160> 54
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Trp Arg Tyr Asp Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser
50 55 60
Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 3
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Leu Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Asn Tyr Gly Ser Ser Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 4
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 7
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gaggtgcagc tgcaagagag cggccctagc ctggtgaagc cttctcagac cctgagcctg 60
acctgcagcg tgaccggcga ctccatcacg agcggttact ggaactggat cagaaagttc 120
cctggcaaca agctggagta catgggctac atcagctaca gcggcagcac ctactacaac 180
cctagcctga agagcagaat ctctatcaca agagacacaa gcaagaatca gtactacctg 240
cagctgaaca gcgtgaccac cgaggacacc gccacctact actgcgctag atactggaga 300
tacgacggct acgctatgga ctactggggc caaggcacaa gcgtgaccgt gagcagc 357
<210> 8
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
atcgtgatga cacagacccc taagttcctg ctggtgagcg ccggcgacag agtgaccatc 60
acctgcaagg cttctcagag cgtgagcaac gacgtggcct ggtatcagca gaagcctgga 120
cagagcccta agctgctgat ctactacgct agcaacagat acaccggcgt gcctgacaga 180
ttcaccggca gcggctacgg caccgacttc accttcacca tcagcaccgt gcaagccgag 240
gacctggccg tgtacttctg tcagcaagac tacagcagcc cttacacctt tggtggcggc 300
accaaactgg aaataaagag a 321
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
ggtggcggcg gcagcggggg tggcggttcg ggcggaggcg gaagt 45
<210> 10
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
gatgtaaagc tggttgaaag cggcggtggc ctcgtgaagc taggcgggag cctgaagctg 60
agctgcgccg ctagcggctt caccttcagc agctactaca tgagctgggt gagacagacc 120
cctgagaaga gactggagct ggtggccgcc atcaacagca acggcggcag cacctactac 180
cctgacaccg tgaagggcag attcaccatc agcagagaca acgccaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga gcagcctgaa gagcgaggac accgccctgt actactgcgc tagacacaac 300
tacggcagca gctacgcctg gttcgcctac tggggccaag gcaccctggt gaccgtgagc 360
gcc 363
<210> 11
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
gacatcgtgc tgacacagag ccctgccacc ctgagcgtga cccctggcga cagcgtgagc 60
ctgagctgca gagcaagcca aagcatatct aacaacctgc actggtatca gcagaagagc 120
cacgagagcc ctagactgct gatcaagtac gctagccaaa gtatcagcgg catacctagc 180
agattcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga gcatcaacag cgtggagacc 240
gaggacttcg gcatgtactt ctgtcagcag agcaacagct ggcctagaac ctttggaggc 300
ggtactaagc tggagataaa aaga 324
<210> 12
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
ggtggcggcg gcagtggtgg aggcgggagc ggcggcggcg ggagc 45
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
ggaagatctg atggtgggat ttctcgcaga ctc 33
<210> 14
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
ggaagatctt aaggggtaga gctgagggtt cctg 34
<210> 15
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
ggaagatctg acatttggga aggactgact ctc 33
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
ggaagatcta tagacagatg ggggtgtcgt tttggc 36
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
ggaagatctc ttgaccaggc atcctagagt ca 32
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
ggaagatcta ggggccagtg gatagactga tgg 33
<210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
ggaagatcta gggaccaagg gatagacaga tgg 33
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
tgttaactgc tcactggatg gtgg 24
<210> 21
<211> 1058
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
caattaaggg ggttagctcc ctcattggca cccccaggtt ttccctttta tgtttccggc 60
ttgtataagg ggggaattag gagcggataa taatttcaca caggaggttt aaactttaac 120
catgtcaaaa gagacgtctt ttgttaagaa tgctgaggaa cttgcaaagc aaaaaatgga 180
tgctattaac cctgaacttt cttcaaaatt taaattttta ataaaattcc tgtctcagtt 240
tcctgaagct tgctctaaac ctcgttcaaa aaaaatgcag aataaagttg gtcaagagga 300
acatattgaa tatttagctc gtagttttca tgagagtcga ttgccaagaa aacccacgcc 360
acctacaacg gttcctgatg aggtggttag catagttctt aatataagtt ttaatataca 420
gcctgaaaat cttgagagaa taaaagaaga acatcgattt tccatggcag ctgagaatat 480
tgtaggagac ctgctagaga gatctaatac gactcactat agggcaagca gtggtatcaa 540
tgcagagtac atgggggaaa tacatcaggc aggcaagggc atcaagatga agtcacagac 600
ccaggtcttc gtatttctac tgctctgtgt gtctggtgct catgggagta ttgtgatgac 660
ccagactccc aaattcctgc ttgtatcagc aggagacagg gttaccataa cctgcaaggc 720
cagtcagagt gtgagtaatg atgtagcttg gtaccaacag aagccagggc agtctcctaa 780
actgctgata tactatgcat ccaatcgcta cactggagtc cctgatcgct tcactggcag 840
tggatatggg acggatttca ctttcaccat cagcactgtg caggctgaag acctggcagt 900
ttatttctgt cagcaggatt atagctctcc gtacacgttc ggagggggga ccaagctgga 960
aataaaacgg gctgatgctg caccaactgt atccatcttc ccaccatcca gtgagcagtt 1020
aacaatcttg ctgaaaaact cgaacctccg gtcccggg 1058
<210> 22
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 22
Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 23
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 23
Gln Ser Val Ser Asn Asp
1 5
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 24
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 25
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 25
Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Tyr
1 5 10 15
Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu
20 25 30
Ala Val Tyr Phe Cys
35
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 26
Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr
1 5
<210> 27
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 27
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
1 5 10
<210> 28
<211> 1055
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
attaggcttt acactttatg cttccggctc gtataatgtg tggaattatg agcggataat 60
aattcacaca ggaggttaaa ctttaaacat gtcaaaagag acgtcttttg ttaagaatgc 120
tgaggaactt gcaaagcaaa aaatggatgc tattaaccct gaactttctt caaaatttaa 180
atttttaata aaattcctgt ctcagtttcc tgaagcttgc tctaaacctc gttcaaaaaa 240
aatgcagaat aaagttggtc aagaggaaca tattgaatat ttagctcgta gtttcatgag 300
agtcgattgc caagaaaacc cacgccacct acaacggttc ctgatgaggt ggttagcata 360
gttcttaata taagttttaa tatacagcct gaaaatcttg agagaataaa agaagaacat 420
cgattttcca tggcagctga gaatattgta ggagacctgc tagagagatc taatacgact 480
cactataggg caagcagtgg tatcaacgca gagtacatgg ggcctatctc tctcactgga 540
ggctgatttt tgaagaaagg ggttgtagcc taaaagatga tggtgttaag tcttctgtac 600
ctgttgacag cccttccggg tatcctgtca gaggtgcagc ttcaggagtc aggacctagc 660
ctcgtgaaac cttctcagac tctgtccctc acctgttctg tcactggcga ctccatcacc 720
agtggttact ggaactggat ccggaaattc ccagggaata aacttgagta catggggtac 780
ataagctaca gtggtagcac ttactacaat ccatctctca aaagtcgaat ctccatcact 840
cgagacacat ccaagaacca gtactacctg cagttgaatt ctgtgactac tgaggacaca 900
gccacatatt actgtgcaag atattggagg tacgacgggt atgctatgga ctactggggt 960
caaggaacct cagtcaccgt ctcctcagag agtcagtcct tcccaaatgt cagatcttcc 1020
atcttgctga aaaactcgaa cctcccgaat agggc 1055
<210> 29
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 29
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr
20 25
<210> 30
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 30
Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly Tyr
1 5
<210> 31
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 31
Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met Gly
1 5 10 15
Tyr
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 32
Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 33
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 33
Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 34
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 34
Ala Arg Tyr Trp Arg Tyr Asp Gly Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 35
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 36
<211> 1052
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 36
ccccgggacc ggaaggttcg agtttttcag caagatctaa tacgactcac tatagggcaa 60
gcagtggtat caacgcagag tacatggggg agccacacaa actcagggaa agctcgaaga 120
tggttttcac acctcagata cttggactta tgcttttttg gatttcagcc tccagaggtg 180
atattgtgct aactcagtct ccagccaccc tgtctgtgac tccaggagat agcgtcagtc 240
tttcctgcag ggccagccaa agtattagca acaacctaca ctggtatcaa caaaaatcac 300
atgagtctcc aaggcttctc atcaagtatg cttcccagtc catctctggg atcccctcca 360
ggttcagtgg cagtggatca gggacagatt tcactctcag tatcaacagt gtggagactg 420
aagattttgg aatgtatttc tgtcaacaga gtaacagctg gcctcggacg ttcggtggag 480
gcaccaagct ggaaatcaaa cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc ttcccaccat 540
ccagtgagca gttaacaatc tctctagcag gtctcctaca atattctcag ctgccatgga 600
aaatcgatgt tcttctttta ttctctcaag attttcaggc tgtatattaa aacttatatt 660
aagaactatg ctaaccacct catcaggaac cgttgtaggt ggcgtgggtt ttcttggcaa 720
tcgactctca tgaaaactac gagctaaata ttcaatatgt tcctcttgac caactttatt 780
ctgcattttt tttgaacgag gtttagagca agcttcagga aactgagaca ggaattttat 840
taaaaattta aattttgaag aaagttcagg gttaatagca tccatttttt gctttgcaag 900
ttcctcagca ttcttaacaa aagacgtctc ttttgacatg gttaaagttt aaacctcctg 960
tgtgaaatat tatccgctca taattccccc cttatacaag ccggaaacat aaaagggaaa 1020
acctgggggg ccaatgagtg agctaccccc tt 1052
<210> 37
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 37
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser
20 25
<210> 38
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 38
Gln Ser Ile Ser Asn Asn
1 5
<210> 39
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 39
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
1 5 10 15
Lys
<210> 40
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 40
Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10 15
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr Glu Asp Phe
20 25 30
Gly Met Tyr Phe Cys
35
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 41
Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Arg Thr
1 5
<210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 42
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
1 5 10
<210> 43
<211> 1040
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 43
ataataattt cacacaggag gtttaaactt taaacatgtc aaaagagacg tctttgttaa 60
gaatgctgag gaacttgcaa agcaaaaaat ggatgctatt aaccctgaac tttcttcaaa 120
atttaaattt ttaataaaat tcctgtctca gtttcctgaa gcttgctcta aacctcgttc 180
aaaaaaaatg cagaataaag ttggtcaaga ggaacatatt gaatatttag ctcgtagttt 240
tcatgagagt cgattgccaa gaaaacccac gccacctaca acggttcctg atgaggtggt 300
tagcatagtt cttaatataa gttttaatat acagcctgaa aatcttgaga gtataaaaga 360
agaacatcgc ttttcgatgg cagctgagaa tattgtagga gacctgctag agagatctaa 420
tacgactcac tatagggcaa gcagtggtat caacgcagag tacatgggga gctctgacag 480
aggaggcctg tcctggattc gattcccagt tcctcacatt cagtgatcag cactgaacac 540
agacccctca ccatgaactt cgggctcaga ttgattttcc ttgtccttgt tttaaaaggt 600
gtcctgtgtg acgtgaagct cgtggagtct gggggaggct tagtgaagct tggagggtcc 660
ctgaaactct cctgtgcagc ctctggattc actttcagta gctattacat gtcttgggtt 720
cgccagactc cagagaagag gctggagttg gtcgcagcca ttaatagtaa tggtggtagc 780
acctactatc cagacactgt gaagggccga ttcaccatct ccagagacaa tgccaagaac 840
accctgtacc tgcaaatgag cagtctgaag tctgaggaca cagccttgta ttactgtgca 900
agacataact acggtagtag ctacgcctgg tttgcttact ggggccaagg gactctggtc 960
actgtctctg cagagagtca gtccttccca aatgtcagat cttccatctg ctgaaaaact 1020
cgaacctccg aataatgggt 1040
<210> 44
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 44
Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Leu Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 45
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 46
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 46
Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val Ala
1 5 10 15
Ala
<210> 47
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 47
Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 48
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 48
Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
35
<210> 49
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 49
Ala Arg His Asn Tyr Gly Ser Ser Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 50
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 50
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
1 5 10
<210> 51
<211> 241
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 51
Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser
50 55 60
Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys
130 135 140
Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Trp Asn Trp Ile Arg
145 150 155 160
Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser
165 170 175
Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr
180 185 190
Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr
195 200 205
Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Trp Arg Tyr Asp
210 215 220
Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser
<210> 52
<211> 723
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 52
atcgtgatga cacagacccc taagttcctg ctggtgagcg ccggcgacag agtgaccatc 60
acctgcaagg cttctcagag cgtgagcaac gacgtggcct ggtatcagca gaagcctgga 120
cagagcccta agctgctgat ctactacgct agcaacagat acaccggcgt gcctgacaga 180
ttcaccggca gcggctacgg caccgacttc accttcacca tcagcaccgt gcaagccgag 240
gacctggccg tgtacttctg tcagcaagac tacagcagcc cttacacctt tggtggcggc 300
accaaactgg aaataaagag aggtggcggc ggcagcgggg gtggcggttc gggcggaggc 360
ggaagtgagg tgcagctgca agagagcggc cctagcctgg tgaagccttc tcagaccctg 420
agcctgacct gcagcgtgac cggcgactcc atcacgagcg gttactggaa ctggatcaga 480
aagttccctg gcaacaagct ggagtacatg ggctacatca gctacagcgg cagcacctac 540
tacaacccta gcctgaagag cagaatctct atcacaagag acacaagcaa gaatcagtac 600
tacctgcagc tgaacagcgt gaccaccgag gacaccgcca cctactactg cgctagatac 660
tggagatacg acggctacgc tatggactac tggggccaag gcacaagcgt gaccgtgagc 720
agc 723
<210> 53
<211> 244
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 53
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Lys Leu Val
115 120 125
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Leu Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser
130 135 140
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Tyr Met Ser Trp Val
145 150 155 160
Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val Ala Ala Ile Asn Ser
165 170 175
Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr
180 185 190
Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser
195 200 205
Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg His Asn Tyr
210 215 220
Gly Ser Ser Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ala
<210> 54
<211> 732
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 54
gacatcgtgc tgacacagag ccctgccacc ctgagcgtga cccctggcga cagcgtgagc 60
ctgagctgca gagcaagcca aagcatatct aacaacctgc actggtatca gcagaagagc 120
cacgagagcc ctagactgct gatcaagtac gctagccaaa gtatcagcgg catacctagc 180
agattcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga gcatcaacag cgtggagacc 240
gaggacttcg gcatgtactt ctgtcagcag agcaacagct ggcctagaac ctttggaggc 300
ggtactaagc tggagataaa aagaggtggc ggcggcagtg gtggaggcgg gagcggcggc 360
ggcgggagcg atgtaaagct ggttgaaagc ggcggtggcc tcgtgaagct aggcgggagc 420
ctgaagctga gctgcgccgc tagcggcttc accttcagca gctactacat gagctgggtg 480
agacagaccc ctgagaagag actggagctg gtggccgcca tcaacagcaa cggcggcagc 540
acctactacc ctgacaccgt gaagggcaga ttcaccatca gcagagacaa cgccaagaac 600
accctgtacc tgcagatgag cagcctgaag agcgaggaca ccgccctgta ctactgcgct 660
agacacaact acggcagcag ctacgcctgg ttcgcctact ggggccaagg caccctggtg 720
accgtgagcg cc 732

Claims (10)

1.靶向DNAM-1的鼠单链抗体，其特征在于，包括鼠单链抗体DN9或鼠单链抗体DN12；所述鼠单链抗体DN9的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述鼠单链抗体DN9的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述鼠单链抗体DN12的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，所述鼠单链抗体DN12的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示。
2.根据权利要求1所述的鼠单链抗体，其特征在于，所述鼠单链抗体DN9的重链可变区和轻链可变区通过第一链接肽连接；所述鼠单链抗体DN12的重链可变区和轻链可变区通过第二链接肽连接；所述第一链接肽的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，所述第二链接肽的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
3.编码权利要求2所述的靶向DNAM-1的鼠单链抗体的基因，其特征在于，编码所述鼠单链抗体DN9的基因包括顺次连接的编码DN9重链可变区的核苷酸、第一连接序列和编码DN9轻链可变区的核苷酸；所述编码DN9重链可变区的核苷酸如SEQ ID No.7所示，编码DN9轻链可变区的核苷酸如SEQ ID No.8所示；第一连接序列如SEQ ID No.9所示；
编码所述鼠单链抗体DN12的基因包括顺次连接的编码DN12重链可变区的核苷酸、第二连接序列和编码DN12轻链可变区的核苷酸；所述编码DN12重链可变区的核苷酸如SEQ IDNo.10所示，编码DN12轻链可变区的核苷酸如SEQ ID No.11所示；第二连接序列如SEQ IDNo.12所示。
4.一种表达权利要求1所述鼠单链抗体的重组质粒，其特征在于，包括初始质粒和权利要求3所述的编码靶向DNAM-1的鼠单链抗体的基因。
5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述初始质粒为pFUSE-hIgG1e3-Fc质粒。
6.根据权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，所述编码靶向DNAM-1的鼠单链抗体的基因克隆至所述初始质粒的NcoI酶切位点和BglII酶切位之间。
7.一种表达权利要求1所述鼠单链抗体的重组细胞，其特征在于，通过将所述重组质粒转染初始细胞获得。
8.根据权利要求7所述的重组细胞，其特征在于，所述初始细胞为expiCHO细胞。
9.权利要求1或2所述的鼠单链抗体、权利要求4～6任一项所述的重组质粒、权利要求7或8所述的重组细胞在检测DNAM-1抗原中的应用。
10.权利要求1或2所述的鼠单链抗体、权利要求4～6任一项所述的重组质粒、权利要求7或8所述的重组细胞在检测含有表达DNAM-1的质粒的Jurkat细胞中的应用。
CN202110197740.9A 2021-02-22 2021-02-22 靶向dnam-1的鼠单链抗体、表达所述鼠单链抗体的重组质粒、重组细胞及应用 Active CN112940122B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110197740.9A CN112940122B (zh) 2021-02-22 2021-02-22 靶向dnam-1的鼠单链抗体、表达所述鼠单链抗体的重组质粒、重组细胞及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110197740.9A CN112940122B (zh) 2021-02-22 2021-02-22 靶向dnam-1的鼠单链抗体、表达所述鼠单链抗体的重组质粒、重组细胞及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112940122A CN112940122A (zh) 2021-06-11
CN112940122B true CN112940122B (zh) 2022-04-15

Family

ID=76245223

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110197740.9A Active CN112940122B (zh) 2021-02-22 2021-02-22 靶向dnam-1的鼠单链抗体、表达所述鼠单链抗体的重组质粒、重组细胞及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112940122B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019129177A1 (zh) * 2017-12-28 2019-07-04 上海细胞治疗研究院 抗体修饰的嵌合抗原受体修饰t细胞及其用途
CN111363042A (zh) * 2020-03-30 2020-07-03 中国人民解放军第四军医大学 一种高特异性抗小鼠cd226单克隆抗体及其应用
CN111606996A (zh) * 2020-06-05 2020-09-01 北京鼎成肽源生物技术有限公司 一种靶向4d5的鼠源单克隆抗体及其制备方法和应用
CN111793647A (zh) * 2020-09-08 2020-10-20 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 Cd226基因人源化非人动物的构建方法及应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019129177A1 (zh) * 2017-12-28 2019-07-04 上海细胞治疗研究院 抗体修饰的嵌合抗原受体修饰t细胞及其用途
CN109971725A (zh) * 2017-12-28 2019-07-05 上海细胞治疗研究院 抗体修饰的嵌合抗原受体修饰t细胞及其用途
CN111363042A (zh) * 2020-03-30 2020-07-03 中国人民解放军第四军医大学 一种高特异性抗小鼠cd226单克隆抗体及其应用
CN111606996A (zh) * 2020-06-05 2020-09-01 北京鼎成肽源生物技术有限公司 一种靶向4d5的鼠源单克隆抗体及其制备方法和应用
CN111793647A (zh) * 2020-09-08 2020-10-20 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 Cd226基因人源化非人动物的构建方法及应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
3NZH_L;Teplyakov, A et al.;《PDB》;20201201 *
AGN91284.1;Trad, A. et al.;《Genbank》;20140831 *
ASW22212.1;Degn, S.E.;《Genbank》;20170905 *
BCD92750.1;Matsumura, T. et al.;《Genbank》;20200827 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112940122A (zh) 2021-06-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20190359698A1 (en) Anti-gpc3 antibody
CN109576292B (zh) 一种抗体文库的构建方法及其应用
CN109942709A (zh) 一种抗bcma的单域抗体及其应用
Mettler Izquierdo et al. High-efficiency antibody discovery achieved with multiplexed microscopy
KR20210100624A (ko) 유전적으로 조작된 ｔ 세포를 제조하는 방법
Crépin et al. Nanobodies against surface biomarkers enable the analysis of tumor genetic heterogeneity in uveal melanoma patient‐derived xenografts
CN114163537B (zh) 分泌双特异性抗体的嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN111303286B (zh) 一种anti-CD19的全人源抗体或抗体片段及其嵌合抗原受体和应用
CN113583122A (zh) 抗人sema4d抗体及其制备方法和应用
CN117050195B (zh) 一种靶向baffr嵌合抗原受体、car-t细胞和应用
AU2018234291A1 (en) Method of selecting for antibodies
CN112940122B (zh) 靶向dnam-1的鼠单链抗体、表达所述鼠单链抗体的重组质粒、重组细胞及应用
TWI698643B (zh) 用於檢測米田堡血型抗原的抗體及其片段、試劑盒及方法
CN110981959B (zh) Cd47单域抗体、核苷酸序列、表达载体及试剂盒
CN111484561A (zh) 一种靶向于cd19分子的嵌合抗原受体
CN116640216B (zh) 抗cd19抗体的抗体、抗cd22抗体的抗体及其应用
US20200010810A1 (en) Methods and compositions for inducible extracellular membrane capture of monoclonal immunoglobulins secreted by hybridomas
CN114957469B (zh) 一种抗NKp30抗体及其应用
CN113999320B (zh) 以cd28和4-1bb为共刺激结构域的靶向cd276的嵌合抗原受体及其应用
JP2022521147A (ja) ｍＲＮＡディスプレイ抗体ライブラリー及び方法
CN114085289B (zh) 一种半合成单域抗体库的构建方法及其应用
CN114437232B (zh) 一种细胞表面大分子定量展示系统及其制备方法和用途
CN111647083B (zh) 一种重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体、制备方法和应用
US10796787B2 (en) Method for identifying antigen-specific T cell receptors in primate
US10088471B1 (en) Immunoglobulin G mRNA based plasma cell separation and antibody gene cloning

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant