KR20210100624A - 유전적으로 조작된 ｔ 세포를 제조하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 개시는 CD57 음성 T 세포를 농축시키거나 CD57 양성 세포를 고갈시킨 세포 집단, 및 CD57- T 세포를 농축시키거나 CD57+ T 세포를 고갈시킨 세포 집단을 자극, 배양, 증폭 및/또는 유전자 조작하는 방법을 제공한다. 또한 예를 들어 음성 선택에 의해서 57- T 세포를 생성, 단리, 농축, 또는 선택하거나 또는 CD57+ 세포를 선택하는 방법이 제공된다.
Description
관련 출원의 교차 참조
본원은 "PROCESS FOR PRODUCING GENETICALLY ENGINEERED T CELLS"라는 명칭으로 2018.11.06.자로 출원된 미국 가출원 제62/756,571호 및 "PROCESS FOR PRODUCING GENETICALLY ENGINEERED T CELLS"라는 명칭으로 2019.01.29.자로 출원된 미국 가출원 제62/798,457호의 우선권을 주장하며, 상기 출원들의 내용은 그 전체가 모든 목적으로 참조로 인용된다.
서열 목록의 참조 포함
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 출원된다. 서열 목록은 2019년 11월 5일에 생성된 735042017640SeqList.txt라는 제목의 파일로 제공되며, 이의 크기는 74 킬로바이트이다. 전자 형식의 서열 목록 내 정보는 그 전체가 참조로 포함된다.
분 야
본 개시는 일부 측면에서 CD57 음성 T 세포를 농축시키거나 CD57 양성 세포를 고갈시킨 세포 집단, 및 CD57 음성 T 세포를 농축시키거나 CD57 양성 T 세포를 고갈시킨 세포 집단을 자극, 배양, 증폭 및/또는 유전자 조작하는 방법을 제공한다. 또한 예를 들어 음성 선택에 의해서 57 음성 T 세포를 생성, 단리, 농축, 또는 선택하거나 또는 CD57 양성 세포를 선택하는 방법이 제공된다.
질환 및 병태를 치료하기 위한 다양한 세포 치료 방법이 이용 가능하다. 세포 치료 방법 중에는 재조합 수용체, 예를 들어 키메라 항원 수용체로 유전자 조작된 T 세포와 같은 면역 세포를 포함한 방법이 있다. 그러나 일부 경우에, 존재하는 방법들 중의 일부는 생체 내에서 일관성, 효능 또는 지속성이 낮은 집단을 초래할 수 있다. 생체 내에서 높은 일관성, 효능 및 지속성을 갖는 개선된 세포 요법제를 제공하는 것을 포함하여, 상기 세포 요법제를 제조 및/또는 조작하기 위한 개선된 방법이 필요하다.
본원에서는 T 세포를 농축하는 방법이 제공되되, 상기 방법은, 제 1 선택을 수행하는 단계, 상기 제 1 선택은 1차 인간 T 세포를 함유하는 생물학적 샘플로부터 CD57+ T 세포를 제거함으로써 고갈된 집단을 생성하고, 상기 고갈된 집단은 상기 생물학적 샘플보다 적은 CD57+ T 세포를 함유함; 및 상기 고갈된 집단으로부터의 상기 세포 상에서 제 2 선택을 수행하는 단계, 상기 제 2 선택은 상기 고갈된 집단으로부터 CD3+ T 세포를 농축함으로써, CD57-CD3+ T 세포의 농축된 집단을 생성함;을 포함한다.
또한 본원에서는 T 세포를 농축하는 방법이 제공되되, 상기 방법은, 제 1 선택을 수행하는 단계, 상기 제 1 선택은 1차 인간 T 세포를 함유하는 생물학적 샘플로부터 CD3+ T 세포를 농축함으로써 농축된 T 세포 집단을 생성함; 및 상기 농축된 T 세포 집단으로부터의 상기 세포 상에서 제 2 선택을 수행하는 단계, 상기 제 2 선택은 상기 농축된 샘플 세포 집단으로부터 CD57+ T 세포를 제거함으로써, 고갈된 집단을 생성함;을 포함하되, 상기 고갈된 집단은 상기 생물학적 샘플 및/또는 상기 농축된 T 세포 집단보다 적은 CD57+ T 세포를 함유하고 CD3+ T 세포에 대해 농축된다.
또한 본원에서는 T 세포를 농축하는 방법이 제공되되, 상기 방법은, 1차 인간 T 세포를 함유하는 성분채집술 생성물(apheresis product) 또는 백혈구 성분채집술 생성물(leukapheresis product)을 함유하는 생물학적 샘플로부터 CD57+ T 세포를 제거함으로써, T 세포의 고갈된 집단을 생성하는 단계를 포함하되, 상기 고갈된 집단은 상기 생물학적 샘플보다 적은 CD57+ T 세포를 함유하고 상기 고갈된 집단은, (i) (약) 5% 미만의 CD57+ T 세포; (ii) 상기 생물학적 샘플에 존재하는 CD57+ T 세포의 빈도의 (약) 35% 미만인 빈도의 CD57+ T 세포; 및 (iii) CD3+ T 세포, 상기 CD3+ T 세포의 (약) 95% 이상은 CD57-임;을 함유한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 고갈된 집단은, (i) (약) 5% 미만의 CD57+ T 세포; (ii) 상기 생물학적 샘플에 존재하는 CD57+ T 세포의 빈도의 (약) 35% 미만인 빈도의 CD57+ T 세포; (iii) CD4+ T 세포, 상기 CD4+ T 세포의 (약) 95% 이상은 CD57-임; 및 (iv) CD8+ T 세포, 상기 CD8+ T 세포의 (약) 95% 이상은 CD57-임; 중의 하나 이상을 함유한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 고갈된 집단의 CD3+ T 세포의 (약) 95% 이상은 CD57-CD3+ T 세포를 함유한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 고갈된 집단은 제 1 고갈된 집단이고 상기 방법은 상기 제 1 고갈된 세포로부터의 CD3+ T 세포를 농축함으로써, CD57-CD3+ T 세포의 농축된 집단을 생성하는 것을 더 포함한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 생물학적 샘플은 성분채집술 생성물 또는 백혈구 성분채집술 생성물을 포함한다.
또한 본원에서는 T 세포를 농축하는 방법이 제공되되, 상기 방법은, (a) 제 1 선택을 수행하는 단계, 상기 제 1 선택은 1차 인간 T 세포를 포함하는 성분채집술 생성물 또는 백혈구 성분채집술 생성물을 함유하는 생물학적 샘플로부터 CD57+ 세포를 제거함으로써 제 1 고갈된 집단을 생성하고, 상기 제 1 고갈된 집단은 상기 생물학적 샘플보다 적은 CD57+ 세포를 함유함; 및 (b) 상기 제 1 고갈된 집단으로부터의 상기 세포 상에서 제 2 선택을 수행하는 단계, 상기 제 2 선택은 상기 제 1 고갈된 집단으로부터 CD3+ T 세포를 농축하는 것을 포함하고, 그에 의해서 상기 농축은 CD57-CD3+ T 세포의 농축된 집단을 생성함;을 포함한다.
또한 본원에서는 T 세포를 농축하는 방법이 제공되되, 상기 방법은, (a) 제 1 선택을 수행하는 단계, 상기 제 1 선택은 1차 인간 T 세포를 함유하는 성분채집술 생성물 또는 백혈구 성분채집술 생성물을 함유하는 생물학적 샘플로부터 CD3+ T 세포를 농축함으로써 농축된 생물학적 샘플을 생성하는 것을 포함함; 및 (b) 상기 농축된 생물학적 샘플로부터 상기 세포 상에서 제 2 선택을 수행하는 단계, 상기 제 2 선택은 상기 농축된 생물학적 샘플로부터 CD57+ T 세포를 제거함으로써 CD57-CD3+ T 세포의 농축된 집단인 고갈된 집단을 생성하는 것을 포함함;을 포함한다.
또한 본원에서는 T 세포를 농축하는 방법이 제공되되, 상기 방법은, 상기 방법은, 1차 인간 T 세포를 함유하는 성분채집술 생성물 또는 백혈구 성분채집술 생성물을 함유하는 생물학적 샘플로부터 CD57+ T 세포를 제거함으로써 T 세포의 고갈된 집단을 생성하는 단계를 포함하되, 상기 고갈된 집단은 상기 생물학적 샘플보다 적은 CD57+ T 세포를 함유하고 상기 고갈된 집단은, (i) (약) 5% 미만의 CD57+ T 세포; (ii) 상기 생물학적 샘플에 존재하는 CD57+ T 세포의 빈도의 (약) 35% 미만인 빈도의 CD57+ T 세포; (iii) CD4+ T 세포, 상기 CD4+ T 세포의 (약) 95% 이상은 CD57-임; 및/또는 (iv) CD8+ T 세포, 상기 CD8+ T 세포의 (약) 95% 이상은 CD57-임;을 함유한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 고갈된 집단은 CD57-CD4+ T 세포를 함유한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 고갈된 집단은 CD57-CD8+ T 세포를 함유한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 고갈된 집단은 CD57-CD4+ T 세포 및 CD57-CD8+ T 세포를 함유한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 고갈된 집단은 제 1 고갈된 집단이고 상기 방법은 상기 제 1 고갈된 집단으로부터 CD4+ T 세포를 선택함으로써, CD57-CD4+ T 세포의 농축된 집단 및 비-선택된 집단인 제 2 고갈된 집단을 생성하는 것을 더 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 방법은 상기 비-선택된 집단으로부터 CD8+ T 세포를 선택함으로써, CD57-CD8+ T 세포의 농축된 집단인 제 3 고갈된 집단 및 제 2 비-선택된 집단을 생성하는 것을 더 포함한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 고갈된 집단은 제 1 고갈된 집단이고 상기 방법은 상기 제 1 고갈된 집단으로부터 CD8+ T 세포를 선택함으로써, CD57-CD8+ T 세포의 농축된 집단 및 비-선택된 집단인 제 2 고갈된 집단을 생성하는 것을 더 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 방법은 상기 비-선택된 집단으로부터 CD4+ T 세포를 선택함으로써, CD57-CD4+ T 세포의 농축된 집단 및 제 2 비-선택적 집단인 제 3 고갈된 집단을 생성하는 것을 더 포함한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 고갈된 집단은 제 1 고갈된 집단이고 상기 방법은 상기 제 1 고갈된 집단으로부터 CD83 T 세포를 선택함으로써, CD57-CD3+ T 세포의 농축된 집단 및 비-선택된 집단인 제 2 고갈된 집단을 생성하는 것을 더 포함한다.
또한 본원에서는 T 세포를 농축하는 방법이 제공되되, 상기 방법은, (a) 제 1 선택을 수행하는 단계, 상기 제 1 선택은 1차 인간 T 세포를 함유하는 성분채집술 생성물 또는 백혈구 성분채집술 생성물을 함유하는 생물학적 샘플로부터 CD57+ T 세포를 제거함으로써 제 1 고갈된 집단을 생성하는 것을 포함하고, 상기 제 1 고갈된 집단은 상기 생물학적 샘플보다 적은 CD57+ T 세포를 함유함; (b) 상기 제 1 고갈된 집단으로부터의 상기 세포 상에서 제 2 선택을 수행하는 단계, 상기 제 2 선택은 상기 제 1 고갈된 집단으로부터 (i) CD4+ T 세포 및 (ii) CD8+ T 세포 중의 하나를 농축시키는 것을 포함하고, 그에 의해서 상기 농축은 상기 (i) CD4+ T 세포 및 (ii) CD8+ T 세포 중의 하나를 농축시킨 제 2 고갈된 집단 및 비-선택 집단을 생성함; 및 (c) 제 3 단계를 수행하는 단계, 상기 제 3 선택은 상기 비-선택 집단으로부터 (i) CD4+ 세포 및 (ii) CD8+ 세포 중의 다른 것을 농축시키는 것을 포함하고, 그에 의해서 상기 농축은 (i) CD4+ T 세포 및 (ii) CD8+ T 세포 중의 다른 것을 농축시킨 제 3 고갈된 집단을 생성함;을 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단) 중의 상기 CD57+ T 세포의 빈도는 상기 생물학적 샘플 중의 CD57+ 세포의 빈도의 (약) 35%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단) 중의 상기 CD57+ T 세포의 빈도는 상기 생물학적 샘플 중의 CD57+ T 세포의 빈도의 (약) 35%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단)은 (약) 3% 미만, (약) 2% 미만, (약) 1% 미만, (약) 0.1% 미만 또는 (약) 0.01% 미만의 CD57+ T 세포를 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단)은 CD57+ T 세포가 부재하거나 또는 본질적으로 부재한다. 일부 구현예에서, CD57+ T 세포가 부재하거나 또는 본질적으로 부재하는 고갈된 세포는 (약) 3% 미만, (약) 2% 미만, (약) 1% 미만, (약) 0.1% 미만 또는 (약) 0.01% 미만의 CD57+ T를 포함한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단)의 상기 CD4+ T 세포의 (약) 95% 이상은 CD57-CD4+ T 세포를 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단)의 상기 CD8+ T 세포의 (약) 95% 이상은 CD57-CD8+ T 세포를 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단)의 상기 CD4+ T 세포의 (약) 95% 이상 및 상기 CD8+ T 세포의 (약) 95% 이상은 각각 CD57-CD4+ T 세포 및 CD57-CD8+ T 세포를 포함한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단) 중의 나이브-유사(naive-like) 세포의 빈도는 상기 생물학적 샘플 중의 상기 나이브-유사 세포의 빈도보다 (약) 초과인 적어도 (약) 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50%이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단)에서 CD25+ T 세포, CD27+ T 세포, CD28+ T 세포, CCR7+ T 세포, 또는 CD45RA+ T 세포 중의 하나 이상의 빈도는 상기 생물학적 샘플 중의 각각의 세포의 빈도보다 (약) 초과인 적어도 (약) 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50%이다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단)은 (약) 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 또는 40% 이상의 CD27+ T 세포를 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단)은 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 또는 40% 이상의 CD28+ T 세포를 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단)은 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 또는 40% 이상의 CD27+CD28+ T 세포를 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단)은 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 이상의 CD27+CD28+ T 세포를 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단)은 (약) 70% 또는 80% 이상의 CD27+CD28+ T 세포를 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단)은 (약) 10%, 15%, 20%, 또는 25% 이상의 CCR7+ T 세포를 포함한다.
임의의 상기 제공된 구현예들 중의 일부에서, 상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단)은 T 세포를 유전자 조작하는 공정에서 후속 단계를 위한 입력 조성물로서 사용된다. 일부 구현예에서, 상기 입력 조성물은 CD4+ 세포(CD57-CD4+)에 대해 농축되고 CD8+ 세포(CD57-CD8+)에 대해 농축된 CD57 고갈된 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 입력 조성물은 CD4+ T 세포(CD57-CD4+)에 대해 농축되고 CD8+ T 세포(CD57-CD8+)에 대해 농축된 CD57 고갈된 집단을 포함한다. 임의의 상기 방법들 중의 일부 구현예에서, 상기 방법들은 상기 제 2 고갈된 집단 및 제 3 고갈된 집단의 세포들을 결합함으로써, 입력 조성물을 생성하는 것을 포함한다. 임의의 상기 제공된 구현예들 중의 일부에서, 상기 방법은 상기 제 2 고갈된 집단 및 제 3 고갈된 집단을 결합시키는 것을 더 포함한다. 임의의 상기 제공된 구현예들 중의 일부에서, 상기 제 2 고갈된 집단 및 제 3 고갈된 집단은 (약) 1:3 내지 (약) 3:1의 비율로 결합됨으로써, 상기 제 2 고갈된 집단 및 제 3 고갈된 집단을 포함하는 고갈된 집단을 생성한다. 임의의 상기 제공된 구현예들 중의 일부에서, 상기 제 2 고갈된 집단 및 제 3 고갈된 집단은 (약) 1:1의 비율로 결합됨으로써, 상기 제 2 고갈된 집단 및 제 3 고갈된 집단을 포함하는 고갈된 집단을 생성한다.
임의의 상기 제공된 구현예들 중의 일부에서, 상기 방법은 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 97%, 적어도 (약) 99% 또는 적어도 (약) 99.9%의 CD57-CD4+ T 세포를 함유하는 T 세포 조성물을 생성한다. 임의의 상기 제공된 구현예들 중의 일부에서, 상기 방법은 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 97%, 적어도 (약) 99% 또는 적어도 (약) 99.9%의 CD57-CD8+ T 세포를 함유하는 T 세포 조성물을 생성한다. 임의의 상기 제공된 구현예들 중의 일부에서, 상기 방법은 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 97%, 적어도 (약) 99% 또는 적어도 (약) 99.9%의 CD57-CD3+ T 세포를 함유하는 T 세포 조성물을 생성한다.
임의의 상기 제공된 구현예들 중의 일부에서, 상기 조성물 증의 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비율은 3:1 내지 1:3(각각의 수치를 포함함)이다. 임의의 상기 제공된 구현예들 중의 일부에서, 상기 조성물 증의 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비율은 2:1 내지 1:2(각각의 수치를 포함함)이다. 임의의 상기 제공된 구현예들 중의 일부에서, 상기 조성물 증의 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비율은 1.5:1 내지 1:1.5(각각의 수치를 포함함)이다. 임의의 상기 제공된 구현예들 중의 일부에서, 상기 조성물 증의 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비율은 1.2:1 내지 1:1.2(각각의 수치를 포함함)이다. 임의의 상기 제공된 구현예들 중의 일부에서, 상기 조성물 증의 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 1:1의 CD4+이다. 임의의 상기 제공된 구현예들 중의 일부에서, 상기 1차 T 세포는 인간 대상체로부터 유래된 것이다. 임의의 상기 제공된 구현예들 중의 일부에서, 상기 1차 T 세포는 질환 또는 병태를 갖는 인간 대상체로부터 유래된 것이다. 임의의 상기 제공된 구현예들 중의 일부에서, 상기 질환 또는 병태는 암이다. 임의의 상기 제공된 구현예들 중의 일부에서, 상기 1차 T 페포는 건강한 대상체로부터 유래된 것이다.
임의의 상기 제공된 구현예들 중의 일부에서, 상기 CD57+ T 세포의 제거는 면역 친화도-기반 선택(immunoaffinity-based selection)을 포함한다. 임의의 상기 제공된 구현예들 중의 일부에서, 상기 면역 친화도-기반 선택은 세포를 CD57에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 결합시키고 상기 항체에 결합되지 않은 세포를 회수함으로써, 음성 선택(negative selection)을 수행하는 것을 포함하되, 상기 회수된 세포는 상기 CD57+ 세포에 대해 고갈된다. 임의의 상기 제공된 구현예들 중의 일부에서, 상기 세포의 농축은 면역 친화도-기반 선택을 포함한다. 임의의 상기 제공된 구현예들 중의 일부에서, 상기 제 1, 제 2 및/또는 제 3 선택은 CD4 또는 CD8 T 세포를 농축하고 상기 면역 친화도-기반 선택은 세포를 CD4 또는 CD8 각각에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시키고, 상기 항체에 결합된 세포를 회수함으로써, 양성 선택을 수행하는 것에 의해서 수행되되, 상기 회수된 세포는 상기 CD4+ 세포 또는 상기 CD8+ 세포에 대해 농축된다. 임의의 상기 제공된 구현예들 중의 일부에서, 상기 선택은 CD3 T 세포를 농축하고 상기 면역 친화도-기반 선택은 세포를 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시키고, 상기 항체에 결합된 세포를 회수함으로써, 양성 선택을 수행하는 것에 의해서 수행되되, 상기 회수된 세포는 상기 CD3+ 세포에 대해 농축된다. 임의의 상기 제공된 구현예들 중의 일부에서, 상기 항체는 고체 표면 위에 고정된다. 임의의 상기 제공된 구현예들 중의 일부에서, 상기 고체 표면은 자성 입자이다. 임의의 상기 제공된 구현예들 중의 일부에서, 상기 항체는 친화도 크로마토그래피 매트릭스 위에 고정되거나 또는 거기에 부착된다.
임의의 상기 제공된 구현예들 중의 일부에서, 상기 항체는 상기 매트릭스 상에 고정된 결합 시약과 가역성 결합을 형성할 수 있는 하나 이상의 결합 파트너(binding partner)를 포함하고, 그에 의해서 상기 항체는 상기 접촉 동안 상기 크롭마토그래피 매트릭스에 가역적으로 결합된다. 임의의 상기 제공된 구현예들 중의 일부에서, 상기 결합 시약은 상기 결합 파트너에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘 뮤테인(streptavidin mutein)이다. 임의의 상기 제공된 구현예들 중의 일부에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은, 서열 번호 66에 제시된 아미노산의 서열에서 스트렙타비딘에서의 위치와 관련하여 위치 44 내지 47에 대응하는 서열 위치에서 아미노산 서열 lle44-Gly45-Ala46-Arg47; 또는 서열 번호 66에 제시된 아미노산의 서열에서 스트렙타비딘에서의 위치와 관련하여 위치 44 내지 47에 대응하는 서열 위치에서 아미노산 서열 Va144-Thr45-Ala46-Arg47을 함유한다. 상기 제공된 구현예들 중의 임의의 일부에서, 결합 파트너는 스트렙타비딘 결합-펩티드이다. 상기 제공된 구현예들 중의 임의의 일부에서, 상기 스트렙타비딘 결합-펩티드는 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 69), Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 78), SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK(서열 번호 79), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 70), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 71) 및 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 72)로 구성된 군으로부터 선택된다. 임의의 상기 제공된 구현예들 중의 일부에서, 상기 스트렙타비딘 결합-펩티드는 서열 SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK(서열 번호 79)을 갖는다. 임의의 상기 제공된 구현예들 중의 일부에서, 상기 방법은, 상기 샘플 중의 세포를 상기 친화도 크로마토그래피 매트릭스에 접촉시킨 후, 경쟁 시약을 적용하여 상기 결합 파트너와 결합 시약 사이의 결합을 붕괴시킴으로써, 상기 항체에 결합된 상기 세포를 회수하는 것을 더 포함한다. 임의의 상기 제공된 구현예들 중의 일부에서, 상기 경쟁 시약은 비오틴(biotin) 또는 비오틴 유사체(biotin analog)이다. 임의의 상기 제공된 구현예들 중의 일부에서, 상기 크로마토그래피 매트릭스는 칼럼인 분리 용기 중에 팩킹된다. 임의의 상기 제공된 구현예들 중의 일부에서, 상기 1차 T 세포를 포함하는 상기 생물학적 샘플은 동결 방지제(cyroprectant)로 제형화된 샘플이다. 임의의 상기 제공된 구현예들 중의 일부에서, 상기 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술 샘플은 동결 방지제로 제형화된 샘플이다.
또한 본원에서는, 자극 조건하에 입력 조성물의 T 세포를 인큐베이션함으로써 T 세포의 자극된 집단을 생성하는 것을 포함하는, T 세포를 자극하는 방법이 제공되되, 상기 입력 조성물은 본원에서 기술된 임의의 방법에 의해서 생성된 고갈된 집단(선택적으로 제 1 고갈된 집단, 제 2 고갈된 집단 또는 제 3 고갈된 집단)을 함유한다.
또한 본원에서는 T 세포를 자극하는 방법이 제공되되, 상기 방법은 자극 조건하에 입력 조성물의 T 세포를 인큐베이션하는 것을 포함하고, 상기 입력 조성물 중의 CD57+ T 세포의 백분율은 CD57+ T 세포의 임계 백분율(threshold percentage) 미만이고, 상기 임계 백분율은 (약) 30% 미만의 CD57+ T 세포이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 임계 백분율은 (약) 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 1% 미만의 CD57+ T 세포이다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 입력 조성물은 (i) (약) 5% 미만의 CD57+ T 세포; (ii) 적어도 (약) 95% CD57- T 세포; (iii) 적어도 (약) 90%의 CD57-CD4+ T 세포; (iv) 적어도 (약) 90%의 CD57-CD8+ T 세포; 및 (v) 적어도 (약) 90%의 CD57-CD3+ 세포를 함유한다.
또한 본원에서는, 자극 조건하에 입력 조성물의 T 세포를 인큐베이션함으로써 T 세포의 자극된 집단을 생성하는 것을 포함하는, T 세포를 자극하는 방법이 제공되되, 상기 입력 조성물은, (i) (약) 5% 미만의 CD57+ T 세포; (ii) 적어도 (약) 95% CD57- T 세포; (iii) 적어도 (약) 90%의 CD57-CD4+ T 세포; (iv) 적어도 (약) 90%의 CD57-CD8+ T 세포; 및 (v) 적어도 (약) 90%의 CD57-CD3+ 세포 중의 적어도 하나를 함유한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 입력 조성물은 1차 인간 T 세포를 함유하는 성분채집술 생성물 또는 백혈구 성분채집술 생성물을 함유하는 생물학적 샘플을 포함한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 방법은 상기 생물학적 샘플로부터 CD57+ T 세포를 제거함으로써, T 세포의 고갈된 집단을 함유하는 입력 조성물을 생성하는 것을 더 포함한다.
또한 본원에서는 T 세포를 자극하는 방법이 제공되되, 상기 방법은, (a) 제 1 선택을 수행하는 단계, 상기 제 1 선택은 1차 인간 T 세포를 함유하는 생물학적 샘플로부터 CD57+ T 세포를 제거함으로써 제 1 고갈된 집단을 생성하는 것을 포함하고, 상기 제 1 고갈된 집단은 상기 생물학적 샘플보다 적은 CD57+ T 세포를 함유함; (b) 상기 제 1 고갈된 집단으로부터의 상기 세포 상에서 제 2 선택을 수행하는 단계, 상기 제 2 선택은 상기 제 1 고갈된 집단으로부터 (i) CD4+ T 세포 및 (ii) CD8+ T 세포 중의 하나를 농축시키는 것을 포함하고, 그에 의해서 상기 농축은 (i) CD57-CD4+ T 세포 및 (ii) CD57-CD8+ T 세포 중의 하나를 농축시킨 제 2 고갈된 집단 및 비-선택 집단을 생성함; (c) 상기 비-선택 집단으로부터의 세포 상에서 제 3 단계를 수행하는 단계, 상기 제 3 선택은 상기 비-선택 집단으로부터 (i) CD4+ 세포 및 (ii) CD8+ 세포 중의 다른 것을 농축시키는 것을 포함하고, 그에 의해서 상기 농축은 (i) CD57-CD4+ T 세포 및 (ii) CD57-CD8+ T 세포 중의 다른 것을 농축시킨 제 3 고갈된 집단을 생성함; 및 (d) 자극 조건하에 하나 이상의 입력 조성물을 인큐베이션하는 단계, 상기 하나 이상의 입력 조성물은 상기 제 2 고갈된 집단 또는 상기 제 3 고갈된 집단으로부터의 T 세포를 포함함;을 포함한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 단계 (d)는 상기 제 2 및 제 3 고갈된 집단으로부터의 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함하는 입력 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 단계 (d)는 제 1 입력 조성물 및 제 2 입력 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함하되, 상기 제 1 입력 조성물은 상기 제 2 고갈된 집단으로부터의 T 세포를 함유하고 상기 제 2 입력 조성물은 상기 제 3 고갈된 집단으로부터의 T 세포를 함유한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 제 2 선택은 (i) CD4+ T 세포를 농축함으로써 (i) CD57-CD4+ T 세포를 농축시킨 제 1 농축된 집단을 생성하는 것을 포함하되, 상기 제 1 입력 조성물은 상기 농축된 CD57-CD4+ T 세포를 함유하고; 상기 제 3 선택은 (ii) CD8+ T 세포를 농축함으로써 (ii) CD8+ T 세포를 농축시킨 제 2 농축된 집단을 생성하는 것을 포함하되, 상기 제 2 입력 조성물은 상기 농축된 CD57-CD8+ T 세포를 함유한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 제 2 선택은 (ii) CD8+ T 세포를 농축함으로써 (ii) CD57-CD8+ T 세포를 농축시킨 제 1 농축된 집단을 생성하는 것을 포함하되, 상기 제 1 입력 조성물은 상기 농축된 CD57-CD8+ T 세포를 함유하고; 상기 제 3 선택은 (i) CD4+ T 세포를 농축함으로써 (i) CD57-CD4+ T 세포를 농축시킨 제 2 농축된 집단을 생성하는 것을 포함하되, 상기 제 2 입력 조성물은 상기 농축된 CD57-CD4+ T 세포를 함유한다. 또한 본원에서는 T 세포를 자극하는 방법이 제공되되, 상기 방법은, (a) 제 1 선택을 수행하는 단계, 상기 제 1 선택은 1차 인간 T 세포를 함유하는 생물학적 샘플로부터 CD57+ T 세포를 제거함으로써 제 1 고갈된 집단을 생성하는 것을 포함하고, 상기 고갈된 집단은 상기 생물학적 샘플보다 적은 CD57+ T 세포를 함유함; (b) 상기 제 1 고갈된 집단으로부터의 상기 세포 상에서 제 2 선택을 수행하는 단계, 상기 제 2 선택은 상기 제 1 고갈된 집단으로부터 CD3+ T 세포를 농축시키는 것을 포함하고, 그에 의해서 상기 농축은 상기 CD3+ T 세포를 농축시킨 제 2 고갈된 집단 및 비-선택 집단을 생성함; 및 (c) 자극 조건하에 하나 이상의 입력 조성물을 인큐베이션하는 단계, 상기 하나 이상의 입력 조성물은 상기 제 2 고갈된 집단으로부터의 T 세포를 함유함;을 포함한다.
또한 본원에서는 T 세포를 자극하는 방법이 제공되되, 상기 방법은, (a) 생물학적 샘플로부터의 세포 상에서 제 1 선택을 수행하는 단계, 상기 제 1 선택은 상기 생물학적 샘플로부터의 CD3+ T 세포를 농축하는 것을 포함하고, 그에 의해서 상기 농축은 CD3+ T 세포를 농축시킨 농축된 생물학적 샘플을 생성함; (b) 1차 인간 T 세포를 함유하는 상기 농축된 생물학적 샘플로부터 CD57+ T 세포를 제거함으로써, 고갈된 집단을 생성하는 것을 포함하되, 상기 고갈된 집단은 상기 농축된 생물학적 샘플보다 적은 CD57+ 세포를 함유함; 및 (c) 자극 조건하에 하나 이상의 입력 조성물을 인큐베이션하는 단계, 상기 하나 이상의 입력 조성물은 상기 고갈된 집단으로부터의 T 세포를 함유함;을 포함한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 입력 조성물은 (약) 5% 미만의 CD57+ 세포를 함유한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 입력 조성물은 (약) 3% 미만, (약) 2% 미만, (약) 1% 미만, (약) 0.1% 미만, 또는 (약) 0.01% 미만의 CD57+ 세포를 함유한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 입력 조성물의 CD57+ 세포의 빈도는 상기 생물학적 샘플 중에 존재하는 CD57+ 세포의 빈도의 (약) 35%, 30%, 25%, 20%, 10%, 5%, 1%, 또는 0.1% 미만이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 입력 조성물의 CD57+ T 세포의 빈도는 상기 생물학적 샘플 중에 존재하는 CD57+ T 세포의 빈도의 (약) 35%, 30%, 25%, 20%, 10%, 5%, 1%, 또는 0.1% 미만이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 입력 조성물은 CD57+ T 세포가 부재하거나 본질적으로 부재한다. 일부 구현예에서, CD57+ T 세포가 부재하거나 본질적으로 부재하는 고갈된 집단은 약 또는 약 3% 미만, 약 또는 약 2% 미만, 약 또는 약 1% 미만, 약 또는 약 0.1% 또는 약 또는 약 0.01% 미만의 CD57+ T 세포를 포함한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 입력 조성물은 적어도 (약) 95%의 CD57- T 세포를 함유한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 입력 조성물은 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 97%, 적어도 (약) 99%, 또는 적어도 (약) 99.9%의 CD57-CD4+ T 세포를 함유한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 입력 조성물은 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 97%, 적어도 (약) 99%, 또는 적어도 (약) 99.9%의 CD57-CD8+ T 세포를 함유한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 CD57- T 세포는 CD57-CD4+ T 세포 및 CD57-CD8+ T 세포를 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 입력 조성물은 3:1 내지 1:3, 2:1 내지 1:2, 1.5:1 내지 1:1.5, 또는 1.2:1 내지 1:1.2의 비율(각각의 수치를 포함함)의 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포를 함유한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 입력 조성물은 (약) 1:1의 비율의 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포를 함유한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 입력 조성물 중의 나이브-유사 세포의 빈도는 상기 생물학적 샘플 중의 상기 나이브-유사 세포의 빈도보다 (약) 초과인 적어도 (약) 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50%이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 입력 조성물 중의 CD25+ T 세포, CD27+ T 세포, CD28+ T 세포, CCR7+ T 세포, 또는 CD45RA+ T 세포 중의 하나 이상의 빈도는 상기 생물학적 샘플 중의 각각의 세포의 빈도보다 (약) 초과인 적어도 (약) 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50%이다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 입력 조성물은 적어도 (약) 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 또는 40%의 CD27+ T 세포를 함유한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 입력 조성물은 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 또는 40%의 CD28+ T 세포를 함유한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 입력 조성물은 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%의 CD27+CD28+ T 세포를 함유한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 입력 조성물은 적어도 (약) 70% 또는 80%의 CD27+CD28+ T 세포를 함유한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 입력 조성물은 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 또는 25%의 CCR7+ T 세포를 함유한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 제 1 및/또는 제 2 선택에서 상기 생물학적 샘플 및/또는 상기 농축 세포로부터 상기 CD57+ T 세포의 제거는 면역 친화도-기반 선택을 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 면역 친화도-기반 선택은, 세포를 CD57, CD4 또는 CD8에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 결합시키고 상기 항체에 결합되지 않은 세포를 회수함으로써, 음성 선택을 수행하거나, 또는 상기 항체에 결합된 세포를 회수함으로써, 양성 선택을 수행하는 것에 의해서 수행되되, 상기 회수된 세포는 상기 CD57+ 세포에 대해 고갈되고/되거나, 상기 CD4+ 세포 또는 상기 CD8+ 세포에 대해 농축되고 항체는 자성 입자 위에 고정된다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 면역 친화도-기반 선택은, 세포를 친화도 크로마토그래피 매트릭스 위에 고정되거나 또는 거기에 부착된 항체와 접촉시킴으로서 수행되되, 상기 항체는 CD57, CD4 또는 CD8에 특이적으로 결합하여 CD57+ 세포의 음성 선택 또는 CD4+ 또는 CD8+ 세포의 양성 선택을 수행할 수 있는 것이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 면역 친화도-기반 선택은, 세포를 CD57, CD4 또는 CD8에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 결합시키고 상기 항체에 결합되지 않은 세포를 회수함으로써, 음성 선택을 수행하거나, 또는 상기 항체에 결합된 세포를 회수함으로써, 양성 선택을 수행하는 것에 의해서 수행되되, 상기 회수된 세포는 상기 CD57+ T 세포에 대해 고갈되고/되거나, 상기 CD4+ T 세포 또는 상기 CD8+ T 세포에 대해 농축되고 항체는 자성 입자 위에 고정된다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 면역 친화도-기반 선택은, 세포를 친화도 크로마토그래피 매트릭스 위에 고정되거나 또는 거기에 부착된 항체와 접촉시킴으로서 수행되되, 상기 항체는 CD57, CD4 또는 CD8에 특이적으로 결합하여 CD57+ T 세포의 음성 선택 또는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 양성 선택을 수행할 수 있는 것이다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 자극 조건은 자극 시약의 존재를 포함하고, 상기 자극 시약은 TCR 복합체의 하나 이상의 성분들의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인 및 하나 이상의 공자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 것이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 자극 시약은, (i) TCR 복합체의 멤버에 특이적으로 결합하고, 선택적으로 CD3에 특이적으로 결합하는 1차 제제 및 (ii) T 세포 공자극 분자에 특이적으로 결합하는 2차 제제를 함유하며, 선택적으로 상기 공자극 분자는 CD28, CD137(4-1-BB), OX40 또는 ICOS로부터 선택된다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 1차 및 2차 제제 중의 하나 또는 둘 다는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 1차 및 2차 제제 중의 하나 또는 둘 다는 항체를 포함하되, 선택적으로 상기 자극 시약은 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 사용한 인큐베이션을 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 1차 제제는 항-CD3 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며 상기 2차 제제는 항-CD28 항체, 또는 그의 항원-결합 단편이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 항원 결합 단편은 Fab 단편, Fv 단편, 및 단쇄 Fv 단편(scFv)으로 구성된 군으로부터 선택된 1가 항체 단편이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 1차 제제는 항--CD3 Fab이고 상기 2차 제제는 항-CD28 Fab를 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 1차 제제 및 2차 제제는 고체 지지체의 표면에 존재하거나 또는 부착된다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 고체 지지체는 비드, 선택적으로 상자성 비드이거나 또는 그를 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 고체 지지체는 표면 부착된 항-CD3 및 항-CD28 항체를 갖는 상자성 비드이고, 상기 자극 시약은 약 또는 약 3:1의 비드 대 세포의 비율로 존재한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 자극 조건은 표면 부착된 항-CD3 및 항-CD28 항체를 갖는 상자성 비드를 함유하는 자극 시약의 존재를 포함하고, 상기 자극 시약은 (약) 3:1 미만의 비드 대 세포의 비율로 존재한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 방법은 상기 세포로부터 상기 자극 시약을 분리하는 것을 더 포함하되, 상기 분리는 상기 세포를 자기장에 노출시키는 것을 포함한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 1차 제제 및 2차 제제는 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 포함하는 올리고머 입자 시약의 표면 위에 가역적으로 결합된다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 비오틴, 아비딘, 비오틴 유사체 또는 뮤테인, 아비딘 유사체 또는 뮤테인, 및/또는 그들의 생물학적 활성 단편에 결합하거나 결합할 수 있다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 서열 번호 66에 제시된 아미노산의 서열에서 스트렙타비딘에서의 위치와 관련하여 위치 44 내지 47에 대응하는 서열 위치에서 아미노산 서열 Val44-Thr45-Ala46-Arg47 or Ile44-Gly45-Ala46-Arg47을 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인 분자는, a) 서열 번호 66-68, 73, 80-82, 또는 85-88에 제시된 아미노산의 서열; b) 서열 번호 70-73, 78, 및 85-89 중의 어느 것과 적어도 (약) 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 나타내고, Val44-Thr45-Ala46-Arg47 또는 Ile44-Gly45-Ala46-Arg47에 대응하는 아미노산 서열을 함유하고/하거나, 비오틴, 비오틴 유사체 또는 스트렙타비딘-결합 펩티드에 가역적으로 결합하는 아미노산의 서열; 또는 c) 비오틴, 비오틴 유사체 또는 스트렙타비딘-결합 펩티드에 가역적으로 결합하는 상기 a) 또는 b)의 작용성 단편,을 함유한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 서열 번호 73 또는 78에 제시된 아미노산의 서열을 함유한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 서열 번호 73에 제시된 아미노산의 서열을 함유한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 서열 번호 78에 제시된 아미노산의 서열을 함유한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 1차 제제 및 2차 제제는 각각 스트렙타비딘-결합 펩티드를 함유한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 스트렙타비딘-결합 펩티드는 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 69), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 76), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 77) 및 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 89)로 구성된 군으로부터 선택된다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 스트렙타비딘-결합 펩티드는 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 69), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 70), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 71) 및 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 89)로 구성된 군으로부터 선택된다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 1차 제제 및 2차 제제는 항-CD3 Fab를 포함하되, 상기 2차 제제는 항-CD28 Fab를 함유한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 올리고머 입자 시약은 (약) 60 nm 미만, (약) 70 nm 미만, (약) 80 nm 미만, 또는 (약) 90 nm 미만의 반경을 갖는다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 올리고머 입자 시약은 적어도 (약) 5×107 g/mol, 또는 적어도 (약) 1×108 g/mol; 및/또는 5×107 g/mol 내지 5×108 g/mol, 1×108 g/mol 내지 5×108 g/mol, 또는 1×108 g/mol 내지 2×108 g/mol의 분자량을 갖는다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 올리고머 입자 시약은 적어도 (약) 500개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사량체, 적어도 (약) 1,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사량체, 적어도 (약) 1,500개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사량체, 또는 적어도 (약) 2,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사량체; 및/또는 1,000 내지 20,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사량체, 1,000 내지 10,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사량체, 또는 2,000 내지 5,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사량체를 함유한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 방법은 상기 세포로부터 상기 자극 시약을 분리하는 것을 더 포함하되, 상기 분리는 상기 세포에 물질을 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 물질은 상기 1차 및 2차 제제와 상기 올리고머 입자 시약 사이의 결합을 역전시킬 수 있다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 물질은 자유 결합 파트너이고/이거나 경쟁 제제이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 물질의 존재는 T 세포에서 1차 및 2차 제제에 의해 유도되거나 조절된 신호를 종결시키거나 감소시킨다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 물질은 스트렙타비딘-결합 펩티드, 비오틴 또는 생물학적 활성 단편 또는 비오틴 유사체 또는 생물학적 활성 단편이거나 이를 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 물질은 비오틴 유사체이거나 이를 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 물질은 스트렙타비딘-결합 펩티드이거나 이를 포함하고, 상기 스트렙타비딘-결합 펩티드는 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 69), Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 70), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 77, 예를 들어 서열 번호 71) 및 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 89, 또한 서열 번호 72에도 제시됨)로 구성된 군으로부터 선택된다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 물질은 비오틴 또는 생물학적 활성 단편 또는 비오틴 유사체 또는 생물학적 활성 단편이거나 이를 포함한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 자극 조건은 하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재를 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 자극 조건은 하나 이상의 재조합 IL-2, IL-7, 및 IL-15의 존재를 포함한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 방법은, 상기 고갈된 집단 또는 상기 입력 조성물로부터 얻어진 T 세포의 집단, 또는 상기 자극된 집단으로 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써, T 세포의 조작된 집단을 생성하는 것을 더 포함한다.
또한 T 세포를 유전자 조작하는 방법이 제공되되, 상기 방법은, 상기 입력 조성물 중의 CD57+ T 세포의 백분율이 CD57+ T 세포의 임계 백분율 미만인 경우 자극 조건하에 입력 조성물의 T 세포를 인큐베이션함으로써 생성된 T 세포의 자극된 집단으로 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것을 포함하되, 상기 임계 백분율은 (약) 30% 이하이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 임계 백분율은 (약) 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 1% 이하이다.
또한 T 세포를 유전자 조작하는 방법이 제공되되, 상기 방법은, 본원에서 기술된 방법에 의해서 생산된 상기 T 세포 조성물로부터의 T 세포의 집단으로 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써, T 세포의 조작된 집단을 생성하는 것을 포함한다. 또한 T 세포를 유전자 조작하는 방법이 제공되되, 상기 방법은, 본원에서 제공된 상기 자극된 T 세포 집단 중의 임의의 것으로부터의 T 세포의 집단으로 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써, T 세포의 조작된 집단을 생성하는 것을 포함한다.
또한 T 세포를 유전자 조작하는 방법이 제공되되, 상기 방법은, 입력 조성물로부터의 T 세포로 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것을 포함하되, 상기 입력 조성물은 (i) (약) 5% 미만의 CD57+ T 세포; (ii) 적어도 (약) 95%의 CD57- T 세포; (iii) 적어도 (약) 90%의 CD57-CD4+ T 세포; 또는 (iv) 적어도 (약) 90%의 CD57-CD8+ T 세포 중의 하나 이상을 함유한다.
또한 본원에서는 T 세포를 자극하는 방법이 제공되되, 상기 방법은, (a) 제 1 선택을 수행하는 단계, 상기 제 1 선택은 1차 인간 T 세포를 함유하는 생물학적 샘플로부터 CD57+ T 세포를 제거함으로써 고갈된 집단을 생성하는 것을 포함하고, 상기 고갈된 집단은 상기 생물학적 샘플보다 적은 CD57+ T 세포를 함유함; (b) 상기 고갈된 집단으로부터의 상기 세포 상에서 제 2 선택을 수행하는 단계, 상기 제 2 선택은 1차 인간 T 세포를 함유하는 생물학적 샘플로부터 (i) CD4+ T 세포 및 (ii) CD8+ T 세포 중의 하나를 농축시키는 것을 포함하고, 그에 의해서 상기 농축은 (i) CD57-CD4+ T 세포 및 (ii) CD57-CD8+ T 세포 중의 하나를 농축시킨 제 1 농축된 집단 및 비-선택 집단을 생성함; (c) 상기 비-선택 집단으로부터의 세포 상에서 제 3 단계를 수행하는 단계, 상기 제 3 선택은 상기 비-선택 집단으로부터 (i) CD4+ 세포 및 (ii) CD8+ 세포 중의 다른 것을 농축시키는 것을 포함하고, 그에 의해서 상기 농축은 (i) CD57-CD4+ T 세포 및 (ii) CD57-CD8+ T 세포 중의 다른 것을 농축시킨 제 2 농축된 집단을 생성함; 및 (d) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 상기 제 1 및 제 2 농축된 집단으로부터의 T 세포로 도입함으로써, T 세포의 제 1 및 제 2 조작된 집단을 생성하는 단계;를 포함한다.
또한 본원에서는 T 세포를 자극하는 방법이 제공되되, 상기 방법은, 제 1 선택을 수행하는 단계, 상기 제 1 선택은 1차 인간 T 세포를 함유하는 생물학적 샘플로부터 CD57+ T 세포를 제거함으로써 고갈된 집단을 생성하는 것을 포함하고, 상기 고갈된 집단은 상기 생물학적 샘플보다 적은 CD57+ T 세포를 함유함; 상기 고갈된 집단으로부터의 상기 세포 상에서 제 2 선택을 수행하는 단계, 상기 제 2 선택은 1차 인간 T 세포를 함유하는 생물학적 샘플로부터 CD3+ T 세포를 농축시키는 것을 포함하고, 그에 의해서 상기 농축은 CD57-CD3+ T 세포를 농축시킨 제 1 농축된 집단 및 비-선택 집단을 생성함; 및 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 상기 제 1 농축된 집단으로부터의 T 세포로 도입함으로써, T 세포의 제 1 조작된 집단을 생성하는 단계;를 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 도입 전에, 상기 제 1 농축된 집단은 자극 조건하에 인큐베이션된다.
또한 본원에서는 T 세포를 자극하는 방법이 제공되되, 상기 방법은, 제 1 선택을 수행하는 단계, 상기 제 1 선택은 1차 인간 T 세포를 함유하는 생물학적 샘플로부터 CD3+ T 세포를 농축하는 것을 포함하고, 그에 의해서 상기 농축은 CD3+ T 세포를 농축시킨 농축된 생물학적 샘플을 생성함; 상기 농축된 생물학적 샘플로부터의 상기 세포 상에서 제 2 선택을 수행하는 단계, 상기 제 2 선택은 1차 인간 T 세포를 함유하는 상기 농축된 생물학적 샘플로부터 CD57+ T 세포를 제거함으로써 고갈된 집단을 생성하는 것을 포함하되, 상기 고갈된 집단은 상기 농축된 생물학적 샘플보다 적은 CD57+ T 세포를 함유함; 및 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 상기 고갈된 집단으로부터의 T 세포로 도입함으로써, T 세포의 제 1 조작된 집단을 생성하는 단계;를 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 도입 전에, 상기 입력 조성물은 자극 조건하에 인큐베이션된다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 도입 전에, 상기 입력 조성물 또는 상기 농축된 집단은 자극 조건하에 인큐베이션된다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 단계 (d)는 상기 제 1 및 제 2 농축된 집단으로부터의 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 함유하는 세포의 집단으로 상기 이종 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것을 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 단계 (d)는 상기 이종 폴리뉴클레오티드를 상기 제 1 농축된 집단의 세포 및 상기 제 2 농축된 집단의 세포로 분리하여 도입하는 것을 포함한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 제 2 선택은 (i) CD4+ T 세포를 농축함으로써 (i) CD57-CD4+ T 세포를 농축시킨 제 1 농축된 집단을 생성하는 것을 포함하되, 상기 제 1 조작된 집단은 상기 농축된 CD57-CD4+ T 세포를 함유하고; 상기 제 3 선택은 (ii) CD8+ T 세포를 농축함으로써 (ii) CD8+ T 세포를 농축시킨 제 2 농축된 집단을 생성하는 것을 포함하되, 상기 제 2 조작된 집단은 상기 농축된 CD57-CD8+ T 세포를 함유한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 제 2 선택은 (ii) CD8+ T 세포를 농축함으로써 (ii) CD57-CD8+ T 세포를 농축시킨 제 1 농축된 집단을 생성하는 것을 포함하되, 상기 제 1 조작된 집단은 상기 농축된 CD57-CD8+ T 세포를 함유하고; 상기 제 3 선택은 (i) CD4+ T 세포를 농축함으로써 (i) CD57-CD4+ T 세포를 농축시킨 제 2 조작된 집단을 생성하는 것을 포함하되, 상기 제 2 입력 집단은 상기 농축된 CD57-CD4+ T 세포를 함유한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 도입 전에, 상기 제 1 및 제 2 농축된 집단 중의 하나 또는 둘 다의 세포는 자극 조건하에 인큐베이션된다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 도입은 상기 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 사용한 형질도입을 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 바이러스 벡터는 감마레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 방법은 형질도입된 세포를 함유하는 상기 조성물을 최대 96시간 동안 인큐베이션하는 것을 더 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 인큐베이션은 (약) 37±2℃의 온도에서 수행된다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 인큐베이션은 상기 도입 후 최대 96시간 동안 수행된다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 인큐베이션은 상기 도입 후 최대 48시간 동안 수행된다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 인큐베이션은 상기 도입 후 최대 24시간 동안 수행된다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 인큐베이션은 상기 T 세포의 게놈으로의 상기 바이러스 벡터의 통합을 결과한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 방법은 선택적으로는 상기 조작된 세포의 증식 또는 증폭을 촉진하는 조건하에 상기 변형된 집단의 세포를 배양함으로써, 세포의 증폭된 집단을 생성하는 것을 더 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 배양은 하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재하에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 재조합 사이토카인은 IL-2, IL-7, 및 IL-15 중의 하나 이상이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 증식 또는 증폭은 상기 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 생존가능한 T 세포의 수에서 약, 또는 적어도 (약) 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 또는 (약) 5-배 초과의 증가를 결과한다.
또한 세포를 수확 또는 수집하는 방법이 제공되되, 상기 방법은 본원에서 기술된 임의의 방법에 의해서 생산된 세포의 집단을 수확 또는 수집하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 T 세포를 유전자 조작하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은, (a) 자극 조건하에 본원에서 기술된 임의의 방법에 의해서 생성된 고갈된 집단으로부터의 T 세포를 인큐베이션하는 단계, 상기 자극 조건은, TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인 및 하나 이상의 공자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인을 활성화시킴으로써, 자극된 T 세포를 생성할 수 있는 자극 시약의 존재를 포함함; 및 (b) 이종 폴리뉴클레오티드를 상기 자극된 T 세포로 도입하는 단계, 상기 도입은 상기 자극된 T 세포를 재조합 수용체를 암호화하는 상기 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입함으로써, T 세포의 조작된 집단을 생성하는 것을 포함함;을 포함한다.
본 발명은 또한 T 세포를 유전자 조작하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은, (a) 제 1 선택을 수행하는 단계, 상기 제 1 선택은 1차 인간 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터 CD57+ T 세포를 제거함으로써 고갈된 집단을 생성하는 것을 포함하고, 상기 고갈된 집단은 상기 생물학적 샘플보다 적은 CD57+ T 세포를 함유함; (b) 상기 고갈된 집단으로부터의 상기 세포 상에서 제 2 선택을 수행하는 단계, 상기 제 2 선택은 1차 인간 T 세포를 함유하는 상기 생물학적 샘플로부터 (i) CD4+ T 세포 및 (ii) CD8+ T 세포 중의 하나를 농축시키는 것을 포함하고, 그에 의해서 상기 농축은 (i) CD57-CD4+ T 세포 및 (ii) CD57-CD8+ T 세포 중의 하나를 농축시킨 제 1 농축된 집단 및 비-선택 집단을 생성함; (c) 상기 비-선택 집단으로부터의 상기 세포 위에서 제 3 단계를 수행하는 단계, 상기 제 3 선택은 상기 비-선택 집단으로부터 상기 (i) CD4+ T 세포 및 (ii) CD8+ T 세포 중의 다른 것을 농축시키는 것을 포함하고, 그에 의해서 상기 농축은 상기 (i) CD57-CD4+ T 세포 및 (ii) CD57-CD8+ T 세포 중의 다른 것을 농축시킨 제 2 농축된 집단을 생성함; (d) 자극 조건하에 상기 제 1 농축된 집단 및 상기 제 2 농축된 집단으로부터의 T 세포를 인큐베이션하는 단계, 상기 자극 조건은, TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인 및 하나 이상의 공자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인을 활성화시킴으로써, 상기 제 1 및 제 2 농축된 집단의 자극된 T 세포를 생성할 수 있는 자극 시약의 존재를 포함함; 및 (e) 이종 폴리뉴클레오티드를 상기 제 1 및 제 2 농축된 집단의 상기 자극된 T 세포로 도입하는 단계, 상기 도입은 상기 자극된 T 세포를 상기 이종 폴리뉴클레오티드를 함유하는 바이러스 벡터로 형질도입함으로써, 상기 제 1 및 제 2 농축된 집단으로부터의 T 세포의 조작된 집단을 생성하는 것을 포함함;을 포함한다.
또한 본원에서는 T 세포를 유전자 조작하는 방법이 제공되되, 상기 방법은, 제 1 선택을 수행하는 단계, 상기 제 1 선택은 1차 인간 T 세포를 함유하는 생물학적 샘플로부터 CD57+ T 세포를 제거함으로써 고갈된 집단을 생성하는 것을 포함하고, 상기 고갈된 집단은 상기 생물학적 샘플보다 적은 CD57+ T 세포를 함유함; 상기 고갈된 집단으로부터의 상기 세포 상에서 제 2 선택을 수행하는 단계, 상기 제 2 선택은 1차 인간 T 세포를 함유하는 상기 생물학적 샘플로부터 CD3+ T 세포를 농축시키는 것을 포함하고, 그에 의해서 상기 농축은 CD57-CD3+ T 세포를 농축시킨 제 1 농축된 집단 및 비-선택 집단을 생성함; 자극 조건하에 상기 농축된 집단으로부터의 T 세포를 인큐베이션하는 단계, 상기 자극 조건은, TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인 및 하나 이상의 공자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인을 활성화시킴으로써, 상기 농축된 집단의 자극된 T 세포를 생성할 수 있는 자극 시약의 존재를 포함함; 및 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 상기 농축된 집단의 상기 자극된 T 세포로 도입하는 단계, 상기 도입은 상기 자극된 T 세포를 상기 이종 폴리뉴클레오티드를 함유하는 바이러스 벡터로 형질도입함으로써, 상기 농축된 집단으로부터의 T 세포의 조작된 집단을 생성하는 것을 포함함;을 포함한다.
또한 본원에서는 T 세포를 유전자 조작하는 방법이 제공되되, 상기 방법은, 제 1 선택을 수행하는 단계, 상기 제 1 선택은 1차 인간 T 세포를 함유하는 생물학적 샘플로부터 CD3+ T 세포를 농축하는 것을 포함하고, 그에 의해서 상기 농축은 CD3+ T 세포를 농축시킨 농축된 생물학적 샘플을 생성함; 상기 농축된 집단으로부터의 상기 세포 상에서 제 2 선택을 수행하는 단계, 상기 제 2 선택은 1차 인간 T 세포를 함유하는 상기 생물학적 샘플로부터 CD57+ T 세포를 제거함으로써 고갈된 집단을 생성하는 것을 포함하고, 상기 고갈된 집단은 상기 농축된 생물학적 샘플보다 적은 CD57+ T 세포를 함유함; 자극 조건하에 상기 고갈된 집단으로부터의 T 세포를 인큐베이션하는 단계, 상기 자극 조건은, TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인 및 하나 이상의 공자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인을 활성화시킴으로써, 상기 고갈된 집단의 자극된 T 세포를 생성할 수 있는 자극 시약의 존재를 포함함; 및 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 상기 고갈된 집단의 상기 자극된 T 세포로 도입하는 단계, 상기 도입은 상기 자극된 T 세포를 상기 이종 폴리뉴클레오티드를 함유하는 바이러스 벡터로 형질도입함으로써, 상기 고갈된 집단으로부터의 T 세포의 조작된 집단을 생성하는 것을 포함함;을 포함한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 방법은, (i) 상기 조작된 집단의 증식 또는 증폭을 촉진하는 조건하에서 상기 조작된 T 세포이 집단을 배양함으로써, T 세포의 증폭된 집단을 생성하는 단계; 및 (ii) 상기 증폭된 집단을 수확 또는 수집하는 단계를 더 포함한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 인큐베이션 전에, 상기 제 1 농축된 집단 및 상기 제 2 농축된 집단은, (i) (약) 5% 미만의 CD57+ T 세포; (ii) 상기 생물학적 샘플 중에 존재하는 CD57+ T 세포의 빈도의 (약) 35% 미만인 빈도의 CD57+ T 세포; 또는 (iii) 적어도 (약) 95%의 CD57- T 세포 중의 하나 이상을 함유한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 인큐베이션 전에, 상기 제 1 농축된 집단 및 상기 제 2 농축된 집단은 (약) 5% 미만의 CD57+ T 세포를 함유한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 인큐베이션 전에, 상기 제 1 농축된 집단 및 상기 제 2 농축된 집단은 각각, (약) 3% 미만, (약) 2% 미만, (약) 1% 미만, (약) 0.1% 미만, 또는 (약) 0.01% 미만의 CD57+ T 세포를 함유한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 인큐베이션 전에, 상기 제 1 농축된 집단 및 상기 제 2 농축된 집단 중의 상기 CD57+ 세포의 빈도는 상기 생물학적 샘플 중의 (약) 35%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1%, 또는 0.1% 미만의 빈도의 CD57+ T 세포를 함유한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 도입 전에, 상기 제 1 농축된 집단 및 상기 제 2 농축된 집단은 CD57+ T 세포가 부재하거나 또는 본질적으로 부재한다. 일부 구현예에서, CD57+ T 세포가 본질적으로 부재한 고갈된 집단은 (약) 3% 미만, (약) 2% 미만, (약) 1% 미만, (약) 0.1% 미만 또는 (약) 0.01% 미만의 CD57+ T 세포를 포함한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 제 1 농축된 조성물 및 상기 제 2 조성물의 세포는 인큐베이션되고/되거나, 단일 혼합된 집단에서 함께 배양된다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 도입 전에, 상기 단일 혼합된 집단은 3:1 내지 1:3, 2:1 내지 1:2, 1.5:1 내지 1:1.5, 또는 1.2:1 내지 1:1.2의 비율(각각의 수치를 포함한)의 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포를 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 도입 전에, 상기 단일 혼합된 집단은 (약) 1:1의 비율의 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포를 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 제 1 농축된 집단 및 상기 제 2 농축된 집단의 세포는 별도로 인큐베이션되고/되거나, 배양된다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 자극 시약은 표면 부착된 항-CD3 및 항-CD28 항체를 갖는 상자성 비드를 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 자극 시약은 가역적으로 결합된 항-CD3 및 항-CD28 Fabs을 갖는 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 함유하는 올리고머 입자 시약을 포함한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 제 1 및/또는 제 2 선택에서 상기 생물학적 샘플 및/또는 상기 농축 세포로부터 상기 CD57+ T 세포의 제거는 면역 친화도-기반 선택을 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 면역 친화도-기반 선택은, 세포를 CD57, CD4 또는 CD8에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 결합시키고 상기 항체에 결합되지 않은 세포를 회수함으로써, 음성 선택을 수행하거나, 또는 상기 항체에 결합된 세포를 회수함으로써, 양성 선택을 수행하는 것에 의해서 수행되되, 상기 회수된 세포는 상기 CD57+ 세포에 대해 고갈되고/되거나, 상기 CD4+ 세포 또는 상기 CD8+ 세포에 대해 농축되고 항체는 자성 입자 위에 고정된다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 면역 친화도-기반 선택은, 세포를 친화도 크로마토그래피 매트릭스 위에 고정되거나 또는 거기에 부착된 항체와 접촉시킴으로서 수행되되, 상기 항체는 CD57, CD4 또는 CD8에 특이적으로 결합하여 CD57+ 세포의 음성 선택 또는 CD4+ 또는 CD8+ 세포의 양성 선택을 수행할 수 있는 것이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 면역 친화도-기반 선택은, 세포를 CD57, CD4 또는 CD8에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 결합시키고 상기 항체에 결합되지 않은 세포를 회수함으로써, 음성 선택을 수행하거나, 또는 상기 항체에 결합된 세포를 회수함으로써, 양성 선택을 수행하는 것에 의해서 수행되되, 상기 회수된 세포는 상기 CD57+ T 세포에 대해 고갈되고/되거나, 상기 CD4+ T 세포 또는 상기 CD8+ T 세포에 대해 농축되고 항체는 자성 입자 위에 고정된다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 면역 친화도-기반 선택은, 세포를 친화도 크로마토그래피 매트릭스 위에 고정되거나 또는 거기에 부착된 항체와 접촉시킴으로서 수행되되, 상기 항체는 CD57, CD4 또는 CD8에 특이적으로 결합하여 CD57+ T 세포의 음성 선택 또는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 양성 선택을 수행할 수 있는 것이다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 수확은, T 세포의 상기 증폭된 집단 또는 상기 조작된 집단이 T 세포, 생존가능한 T 세포, 조작된 T 세포 또는 생존가능한 조작된 T 세포, 또는 임계 농도의 T 세포, 생존가능한 T 세포, 조작된 T 세포 또는 생존가능한 조작된 T 세포를 포함하는 시간에 또는 그 후에 수행된다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, T 세포, 생존가능한 T 세포, 조작된 T 세포 또는 생존가능한 조작된 T 세포의 임계 수 또는 농도는 상기 자극의 개시 후 (약) 4, 5, 6 또 7일 이내에 도달된다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 조작된 T 세포의 복수의 집단 또는 증폭된 T 세포의 집단 중에서, T 세포, 생존가능한 T 세포, 조작된 T 세포 또는 생존가능한 조작된 T 세포의 임계 수 또는 농도는 상기 복수의 집단의 적어도 (약) 또는 적어도 (약) 70%, 80%, 90% 또는 95%에서 자극 개시 후 (약) 5일 또는 6일 이내에 도달된다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, T 세포, 생존가능한 T 세포, 조작된 T 세포 또는 생존가능한 조작된 T 세포의 임계 수 또는 농도는 상기 자극 개시 후 (약) 2, 3, 4 또는 5 집단 배가 이내에 도달된다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 조작된 집단 또는 상기 증폭된 집단은 (약) 3% 미만, (약) 2% 미만, (약) 1% 미만, (약) 0.1% 미만, 또는 (약) 0.01% 미만의 CD57+ T 세포를 함유한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 조작된 집단 또는 상기 증폭된 집단은 CD57+ T 세포가 부재하거나 또는 본질적으로 부재한다. 일부 구현예에서, CD57+ T 세포가 본질적으로 부재한 고갈된 집단은 약 또는 약 3% 미만, 약 또는 약 2% 미만, 약 또는 약 1% 미만, 약 또는 약 0.1% 미만 또는 약 또는 약 0.01% 미만의 CD57+ T 세포를 포함한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 조작된 집단 또는 상기 증폭된 집단 중의 나이브-유사 세포의 빈도는 상기 집단 중의 세포의 적어도 (약) 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50%이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 조작된 집단 또는 상기 증폭된 집단 중의 CD25+ T 세포, CD27+ T 세포, CD28+ T 세포, CCR7+ T 세포, 또는 CD45RA+ T 세포 중의 하나 이상의 빈도는 상기 집단 중의 각각의 세포의 빈도보다 (약) 높은 적어도 (약) 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50%이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 조작된 집단 또는 상기 증폭된 집단은 적어도 (약) 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 또는 40%의 CD27+ T 세포를 함유한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 조작된 집단 또는 상기 증폭된 집단은 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 25%, 30%, 35%, 또는 40%의 CD28+ T 세포를 함유한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 조작된 집단 또는 상기 증폭된 집단은 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%의 CD27+CD28+ T 세포를 함유한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 조작된 집단 또는 상기 증폭된 집단은 적어도 (약) 70% 또는 80%의 CD27+CD28+ T 세포를 함유한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 조작된 집단 또는 상기 증폭된 집단은 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 또는 25% CCR7+ T 세포를 함유한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 세포를 수확하는 것은 상기 세포를 세정 또는 세척함으써 세포 파편을 제거하는 것을 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 수확 또는 수집은 동결 보존 또는 대상체에 투여하기 위한 세포를 제형화하는 것을 더 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 수확된 또는 수집된 세포는 약학적으로 허용가능한 부형제의 존재하에 제형화된다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 수확된 또는 수집된 세포는 동결 방지제의 존재하에 동결 보존을 위해 제형화된다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 동결 방지제는 DMSO를 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 수확된 또는 수집된 세포는 용기, 선택적으로는 바이알 또는 백에서 제형화된다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 분리는 상기 수확 전에 일어난다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 분리는 상기 배양 전 또는 도중에 일어난다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 분리는 상기 도입 후에 일어난다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 재조합 수용체는 질환, 장애 또는 병태의 세포 또는 조직과 관련되고, 특이적이고/이거나 발현된 표적 항원과 결합할 수 있다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 질환, 장애 또는 병태는 감염성 질환 또는 장애, 자가면역 질환, 염증성 질환, 또는 종양 또는 암이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 표적 항원은 종양 항원이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 표적 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9, CAIX 또는 G250으로도 공지), 암 고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸 4(chondroitin sulfate proteoglycan 4, CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 타입 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 표피 당단백질 2(EPG-2), 표피 당단백질 40(EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; FC 수용체 상동물 5 또는 FCRH5로도 공지), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 결합 수용체 클래스 5D(GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 2량체, 인간 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나제 삽입 도메인 수용체(kinase insert domain receptor, kdr), 카파 경쇄, L1 세포 부착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 패밀리 8 멤버 A를 함유하는 루신 리치 반복(Leucine Rich Repeat Containing 8 Family Member A, LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종 관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 시토메갈로 바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 2 그룹 D 멤버(NKG2D) 리간드, 멜란 A (MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스트론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나제 유사 고아 수용체 1(ROR1), 서바이빈(survivin), 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지), 종양 관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나제 관련 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75로도 공지), 티로시나제 관련 단백질 2(TRP2, 도파크롬 타우토머라제, 도파크롬 델타 이성화 효소 또는 DCT로도 공지), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체 특이적 또는 병원체 발현 항원 또는 범용 태그 관련 항원 및/또는 비오티닐화 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체(pathogen)로부터 선택된다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 재조합 단백질은 작용성 비-TCR 항원 수용체 또는 TCR 또는 이의 항원 결합 단편이거나 이를 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 재조합 단백질은 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 재조합 수용체는 항-BCMA CAR이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 재조합 단백질은 항-CD19 CAR이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 키메라 항원 수용체는 항원 결합 도메인을 함유하는 세포외 도메인, 스페이서 및/또는 힌지 영역, 막 관통 도메인 및 공자극 신호 전달 영역을 포함하는 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 항원 결합 도메인을 함유하는 세포외 도메인은 scFv를 포함한다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 세포내 신호 전달 도메인은 1차 신호 전달 도메인, T 세포에서 1차 활성화 신호를 유도할 수 있는 신호 전달 도메인, T 세포수용체(T cell receptor, TCR) 성분의 신호 전달 도메인 및/또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)를 포함하는 신호 전달 도메인이거나 이를 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 세포내 신호 전달 도메인은 CD3 사슬, 선택적으로 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 세포내 신호 전달 도메인 또는 이의 신호 전달 부분이거나 이를 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 공자극 신호 전달 영역은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS의 세포내 신호 전달 도메인 또는 이의 신호 전달 부분을 포함한다.
또한, 증폭가능한 세포의 집단을 식별하는 방법이 제공되되, 상기 방법은 상기 집단 중의 CD57+ 세포의 빈도를 측정하는 것을 포함하되, 상기 세포의 집단은, CD57+ 세포의 빈도가 임계 빈도 미만인 경우 증폭가능한 것으로 식별된다. 또한, 증폭가능한 세포의 집단을 식별하는 방법이 제공되되, 상기 방법은 상기 집단 중의 CD57+ T 세포의 빈도를 측정하는 것을 포함하되, 상기 세포의 집단은, CD57+ T 세포의 빈도가 임계 빈도 미만인 경우 증폭가능한 것으로 식별된다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 임계 빈도는 (약) 35%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1%, 또는 0.1% 미만인 백분율이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 증폭가능한 집단은 증식 또는 증폭을 촉진하는 조건하에 4, 5, 6, 7 또는 8일의 배양일 이내에 적어도 (약) 2-배, 4-배, 8-배, 또는 16-배 증폭시킨다.
또한, T 세포의 집단의 증폭 용량을 결정하는 방법이 제공되되, 상기 방법은 T 세포의 집단에서 CD57 발현과 관련된 특성의 값을 측정하는 것을 포함하되, 상기 T 세포의 집단은, 상기 특성의 값이 (약) 상기 특성의 임계값 미만인 경우 증폭가능한 것으로 결정된다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 임계값은, i) CD57 발현과 관련된 특성의 값의 평균값 또는 중앙값 측정치 미만인 (약), 또는 25% 이내, 20%, 15% 이내, 10% 이내, 또는 5% 이내이고/이거나, 복수의 참조 T 세포 집단에서, (약) 상기 평균값 또는 중앙값 측정치 미만인 표준 편차 미만이고; ii) 복수의 참조 T 세포 집단으로부터의 집단 중에서, CD57 발현과 관련된 특성의 최저 측정치 미만, 선택적으로 상기 최저 측정치 미만인, 50% 이내, 25% 이내, 20% 이내, 15% 이내, 10% 이내, 또는 5% 이내이며; iii) 복수의 참조 T 세포 조성물로부터의 샘플의 65%, 75%, 80%, 85% 초과로부터 계산된 CD57 발현과 관련된 특성의 평균값 또는 중앙값 측정치 미만이되, 상기 복수의 참조 T 세포 집단은 T 세포의 증식 또는 증폭을 촉진하는 조건하에 배양될 때 증폭하지 않은 복수의 집단이며, 선택적으로 상기 세포는 4, 5, 6, 7 또는 8일의 배양일 이내에 적어도 (약) 2-배, 4-배, 8-배, 또는 16-배 증폭되지 않는다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 특성은 총 T 세포, CD4+ T 세포, 또는 CD8+ T 세포에서 발현된 CD57 폴리펩티드의 수준 또는 양이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 특성은 상기 세포 집단 중에 존재하는 CD57+ T 세포, CD57+CD4+ T 세포, 또는 CD57+CD8+ T 세포의 빈도, 백분율, 또는 양이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 특성은 상기 세포 집단 중의 상기 T 세포 중에 존재하는 CD57 mRNA의 수준 또는 양이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 특성은 CD57를 암호화하는 유전자(B3GAT1)의 크로마틴 접근성의 수준 또는 양이다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 방법은 T 세포의 집단에서 하나 이상의 제 2 유전자 생성물의 발현과 관련된 제 2 특성의 제 2 값을 측정하는 것을 더 포함하되, 상기 집단은, 상기 특성의 값이 (약) 상기 특성의 임계값 미만인 경우 및 상기 제 2 특성의 제 2 값이 (약) 상기 제 2 특성의 제 2 임계값 미만인 경우 증폭가능할 수 있다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 제 2 유전자 생성물은 나이브-유사 T 세포와 관련된 마커이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 하나 이상의 제 2 유전자 생성물은 CD27, CD28, CCR7, or CD45RA로부터 선택된다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 하나 이상의 제 2 유전자 생성물은 CD27 및 CD28이다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 제 2 임계값은,
i) 상기 제 2 유전자의 발현과 관련된 특성의 값의 평균값 또는 중앙값 측정치 초과인 (약), 또는 25% 이내, 20%, 15% 이내, 10% 이내, 또는 5% 이내이고/이거나, 복수의 제 2 참조 T 세포 조성물에서, (약) 상기 평균값 또는 중앙값 측정치 초과인 표준 편차 초과이고; ii) 상기 복수의 참조 T 세포 조성물로부터의 조성물 중에서, 상기 제 2 유전자의 발현과 관련된 제 2 특성의 최대 측정치 초과, 선택적으로 상기 최대 측정치 초과인, 50% 이내, 25% 이내, 20% 이내, 15% 이내, 10% 이내, 또는 5% 이내이며; iii) 상기 복수의 참조 T 세포 조성물로부터의 샘플의 65%, 75%, 80%, 85% 초과로부터 계산된 상기 제 2 유전자의 발현과 관련된 특성의 평균값 또는 중앙값 측정치 미만이다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 제 2 특성은, (i) 총 T 세포, CD4+ T 세포, 또는 CD8+ T 세포 중에 존재하는 상기 제 2 유전자에 의해서 암호화된 집단의 수준 또는 양이고; (ii) 상기 총 T 세포, CD4+ T 세포, 또는 CD8+ T 세포의 표면 위에 존재하는 상기 제 2 유전자에 의해서 암호화된 폴리펩티드의 수준 또는 양이며; (iii) 상기 제 2 유전자의 발현에 대해 양성으로 존재하는 T 세포, CD4+ T 세포, 또는 CD8+ T 세포의 빈도, 백분율, 또는 양이고; (iv) 상기 T 세포 중에 존재하는 상기 제 2 유전자의 수준 또는 양이며; (v)는 상기 제 2 유전자의 접근성의 수준 또는 양이다.
본 발명은 또한 T 세포를 유전자 조작하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은, (a) 자극 조건하에 본원에서 기술된 임의의 방법에 의해서 식별되거나 또는 결정된 T 세포의 집단으로부터의 T 세포를 인큐베이션하는 단계, 상기 자극 조건은, TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인 및 하나 이상의 공자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인을 활성화시킴으로써, 자극된 T 세포를 생성할 수 있는 자극 시약의 존재를 포함함; 및 (b) 이종 폴리뉴클레오티드를 상기 자극된 T 세포로 도입하는 단계, 상기 도입은 상기 자극된 T 세포를 재조합 수용체를 암호화하는 상기 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입함으로써, T 세포의 조작된 집단을 생성하는 것을 포함함;을 포함한다.
또한 본원에서는 본원에서 기술된 방법에 의해서 생산된 임의의 것을 포함하는 세포의 조성물이 제공된다. 또한 본원에서는 CD57-CD4+ 세포를 포함하는 세포의 조성물이 제공된다. 또한 본원에서는 CD57-CD8+ 세포를 포함하는 세포의 조성물이 제공된다. 또한 본원에서는 CD57-CD3+ 세포를 포함하는 세포의 조성물이 제공된다.
또한 본원에서는 본원에서 기술된 임의의 방법에 의해서 생산된 고갈된 집단의 CD57- T 세포를 포함하는 세포의 조성물이 제공된다.
또한 본원에서 기술된 임의의 방법에 의해서 생산된 CD57-CD4+ T 세포의 농축된 집단의 CD57-CD4+ T 세포를 포함하는, 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 조성물이 제공된다.
또한 본원에서 기술된 임의의 방법에 의해서 생산된 CD57-CD8+ T 세포의 농축된 집단의 CD57-CD8+ T 세포를 포함하는, 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 조성물이 제공된다.
또한 본원에서 기술된 임의의 방법에 의해서 생산된 CD57-CD3+ T 세포의 농축된 집단의 CD57-CD3+ T 세포를 포함하는, 농축된 CD57-CD3+ T 세포의 조성물이 제공된다.
또한 본원에서 기술된 임의의 방법에 의해서 생산된 T 세포의 자극된 집단의 집단을 포함하는, 세포의 조성물이 제공된다.
또한 본원에서 기술된 임의의 방법에 의해서 생산된 T 세포의 조작된 집단의 세포를 포함하는 조성물이 제공된다.
또한 본원에서 기술된 임의의 방법에 의해서 생산된 T 세포의 증폭된 집단의 세포를 포함하는 조성물이 제공된다.
또한 본원에서 기술된 임의의 방법에 의해서 증폭가능한 것으로 식별되거나 또는 결정된 T 세포의 집단을 포함하는 조성물이 제공된다.
또한 질환, 장애, 또는 병태를 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법이 제공되되, 상기 방법은, 본원에서 기술된 임의의 방법에 의해서 생산된 조작된 T 세포의 집단으로부터의 T 세포 또는 본원에서 기술된 임의의 방법에 의해서 생산된 T 세포의 증폭된 집단의 용량을 상기 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
또한 대상체에서 질환, 장애, 또는 병태의 치료를 위한, 본원에서 기술된 임의의 방법에 의해서 생산된 조작된 T 세포의 집단 또는 본원에서 기술된 임의의 방법에 의해서 생산된 T 세포의 증폭된 집단의 용도가 제공된다.
또한 대상체에서 질환, 장애, 또는 병태의 치료용 약제의 제조를 위한, 본원에서 기술된 임의의 방법에 의해서 생산된 조작된 T 세포의 집단 또는 본원에서 기술된 임의의 방법에 의해서 생산된 T 세포의 증폭된 집단의 용도가 제공된다.
또한, (i) CD57, CD4 및/또는 CD8에 특이적인 세포의 면역 친화도-기반 선택을 위한 하나 이상의 시약; 및 (ii) 본원에서 기술된 임의의 방법을 수행하기 위한 상기 하나 이상의 시약의 사용을 위한 지침;을 포함하는 제조 물품이 제공된다.
또한, (i) CD57, CD4 및/또는 CD8에 특이적인 세포의 면역 친화도-기반 선택을 위한 하나 이상의 시약; (ii) TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인 및 하나 이상의 공자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인을 활성화할 수 있는 하나 이상의 자극 시약; 및 (iii) 본원에서 기술된 임의의 방법을 수행하기 위한 상기 하나 이상의 시약의 사용을 위한 지침;을 포함하는 제조 물품이 제공된다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 면역 친화도-기반 선택을 위한 상기 시약은 CD57, CD4 및/또는 CD8에 특이적으로 결합할 수 있는 항체이거나 또는 그를 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 면역 친화도-기반 선택을 위한 상기 시약은 CD57에 특이적으로 결합할 수 있는 항체이거나 또는 그를 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 항체는 자성 입자 위에 고정되거나 또는 친화도 크로마토그래피 매트릭스 위에 고정되거나 또는 거기에 부착된다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 자극 시약은, (i) TCR 복합체의 멤버에 특이적으로 결합하고, 선택적으로 CD3에 특이적으로 결합하는 1차 제제 및 (ii) T 세포 공자극 분자에 특이적으로 결합하는 2차 제제를 함유하며, 선택적으로 상기 공자극 분자는 CD28, CD137(4-1-BB), OX40 또는 ICOS로부터 선택된다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 1차 및 2차 제제 중의 하나 또는 둘 다는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 1차 및 2차 제제 중의 하나 또는 둘 다는 항체를 포함하되, 선택적으로 상기 자극 시약은 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 사용한 인큐베이션을 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 1차 제제 및 2차 제제는 고체 지지체의 표면에 존재하거나 또는 부착된다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 고체 지지체는 비드, 선택적으로 상자성 비드이거나 또는 그를 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 1차 제제 및 2차 제제는 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 포함하는 올리고머 입자 시약의 표면에 가역적으로 결합된다.
또한 (i) 본원에서 기술된 임의의 조성물; 및 (ii) 상기 조성물을 대상체에 투여하기 위한 지침;을 포함하는 제조 물품이 제공된다.
또한 재조합 수용체를 발현하는 CD4+ T 세포 및 재조합 수용체를 발현하는 CD8+ T 세포를 포함하는 치료학적 T 세포 조성물이 제공되되, 상기 조성물에서 총 수용체+/CD8+ 세포의 적어도 80%는 CD57-이고, 총 수용체+/CD4+ 세포의 적어도 80%는 CD57-이다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 조성물 중의 세포의 적어도 또는 적어도 약 80%, 적어도 또는 적어도 약 85%, 적어도 또는 적어도 약 90%, 적어도 또는 적어도 약 95%, 적어도 또는 적어도 약 96%, 적어도 또는 적어도 약 97%, 적어도 또는 적어도 약 98%, 적어도 또는 적어도 약 99%, 약 100%, 또는 100%는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 조성물 중의 총 수용체+/CD3+ 세포의 적어도 80%는 CD57-이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 조성물 중의 세포의 적어도 또는 적어도 약 80%, 적어도 또는 적어도 약 85%, 적어도 또는 적어도 약 90%, 적어도 또는 적어도 약 95%, 적어도 또는 적어도 약 96%, 적어도 또는 적어도 약 97%, 적어도 또는 적어도 약 98%, 적어도 또는 적어도 약 99%, 약 100%, 또는 100%는 CD3+ T 세포이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 조성물에서 수용체+/CD4+ 세포 대 수용체+/CD8+ 세포의 비율은 약 1:3 내지 약 3:1이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 조성물에서 수용체+/CD4+ 세포 대 수용체+/CD8+ 세포의 비율은 약 1:1이다.
임의의 상기 구현예들의 일부에서, 상기 재조합 단백질은, 질환, 장애 또는 병태의 세포 또는 조직과 관련되고/되거나, 그에 특이적이고/이거나 그에서 발현되는 표적 항원에 결합할 수 있는 재조합 수용체이거나 또는 그를 함유한다. 임의의 상기 구현예들의 일부에서, 상기 재조합 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 임의의 상기 구현예들의 일부에서, 상기 조성물 중의 생존가능한 T 세포의 수는 (약) 10×106 세포 내지 (약) 200×106 세포이고, 선택적으로 상기 조성물 중의 생존가능한 T 세포의 수는 (약) 10×106 세포 내지 (약) 100×106 세포, (약) 10×106 세포 내지 (약) 70×106 세포, (약) 10×106 세포 내지 (약) 50×106 세포, (약) 50×106 세포 내지 (약) 200×106 세포, (약) 50×106 세포 내지 (약) 100×106 세포, (약) 50×106 세포 내지 (약) 70×106 세포, (약) 70×106 세포 내지 (약) 200×106 세포, (약) 70×106 세포 내지 (약) 100×106 세포, 또는 (약) 100×106 세포 내지 (약) 200×106 세포(각각의 수치를 포함함)이다. 임의의 상기 구현예들의 일부에서, 상기 조성물의 부피는 1.0 mL 내지 10 mL(수치를 포함함), 선택적으로 (약) 2 mL, (약) 3 mL, (약) 4 mL, (약) 5 mL, (약) 6 mL, (약) 7 mL, (약) 8 mL, (약) 9 mL, 또는 (약) 10 mL, 또는 이들 수치들 중의 임의의 것들 사이의 임의의 값이다.
도 1은, 1차 인간 T 세포에 대한 예시적인 제조 공정에서 자극 시작 후 약 240 시간 이상, 또는 세포의 형질도입이 없는 유사한 공정에 대한, 총 세포수(도 1a), 폴드 증폭(도 1b), % 생존율(도 1c) 및 7명의 상이한 공여자로부터 얻어진 CD8+ T 세포 중에서 % Ki-67+ 세포(세포 주기 항목과 관련된 마커; 도 1d)를 도시한다.
도 2a는 1차 인간 T 세포에 대한 예시적인 공정에서 자극 시작 후 약 216 시간에 걸쳐 다양한 시점에서 CD57 및 Ki-67 발현에 대한 유세포 분석을 보여준다. 도 2b는 3명의 상이한 공여자(공여자 A-C)에서 자극 및 배양 동안 세포 집단에서 CD57+ 세포의 백분율을 보여준다. 도 2c는 자극 및 배양 동안 세포 집단에서 CD57+ 세포 또는 CD57- 세포 중 Ki-67+ 세포의 백분율을 보여준다. 도 2d는 3명의 다른 공여자(공여자 A-C)에서 자극 및 배양 동안 CD4+ 세포 집단에서 CD57+ 세포의 백분율을 보여준다. 도 2e는 자극 후 시간에 따른 공여자 세포 조성물로부터의 세포에 대한 CD57 및 Ki67 발현을 보여준다. 한 공여자 세포 조성물의 세포는 수확 기준(수확까지 8일)에 도달하는데 8일이 필요한데 반해, 다른 공여자 세포 조성물은 수확 기준(수확까지 7일)에 도달하는데 7일만이 필요하였다. 도 2f는 도 2e에 나타낸 공여자 세포 조성물로부터의 세포에 대한 CD45RA 및 CD27 발현을 보여준다.
도 3a는 1차 인간 T 세포에 대한 예시적인 과정에서 자극 및 배양 동안 세포 집단에서 CD57+ 세포 및 CD57- 세포 사이의 CD69 및 CD25 발현(활성화와 관련된 마커)에 대한 유세포 분석을 보여준다. 도 3b 및 3c는 T 세포 분화 표현형(예를 들어 나이브-유사 T 세포, 효과기 T(TEFF) 세포, 기억 T 세포, 중앙 기억 T(TCM), 효과기 기억 T(TEM) 세포, 효과기 기억 RA T(TEMRA) 세포) 및 CD57(도 3b) 또는 Ki-67(도 3c)과 관련된 다양한 표면 마커의 발현에 대한 계층적 클러스터링 분석을 보여준다. 각각의 로우(row)는 개별 공여자의 세포 집단을 나타내고, 칼럼(column)은 T 세포 분화 표현형과 관련된 마커 또는 마커 조합물을 나타낸다.
도 4a는, (1) 100% CD57+ 세포; (2) 75% CD57+ 세포; (3) 25% CD57+ 세포; 및 (4) 0% CD57+ 세포의 빈도의 빈도로 CD57+ 및 CD57- 세포의 혼합물을 함유하는 적정 세포 조성물에 대한 예시적인 제조 공정에서 자극 시작 후 약 240 시간 동안 총 세포의 수 및 생존 세포의 백분율을 보여준다. 예시적인 수확 기준이 표시된다. 도 4b는 자극 시작 후 48 시간에 세포 배양 웰의 이미지를 보여주며, 자극 시약의 존재하에 적정된 세포 조성물의 자극 및 배양에서 세포 클러스터링을 보여준다. 도 4c는 적정 된 세포 조성물의 자극 및 배양에서 자극 시작 후 12 및 48 시간에 배양 배지에 존재하는 IL-2(㎍/mL)의 양을 보여준다.
도 5a 및 5b는 CD57+ T 세포(도 5a), CD27+ CD28+ T 세포(도 5b)의 백분율을 보여준다. 도 5c는 CD57+ 세포가 고갈되지 않았거나(고갈되지 않음) CD57+ 세포가 고갈된(고갈됨) 4명의 공여자 세포 조성물에 대한 CD27의 발현을 보여준다.
도 5d는 고갈된 및 고갈되지 않은 CD3+ 세포 조성물에서의 Ki67 발현을 보여준다. 도 5e는 CD57+ 세포가 고갈되었거나(고갈됨) CD57+ 세포가 고갈되지 않은 (고갈되지 않음) 대상체로부터 얻은 1 차 CD8+ 세포에 대한 수확(자극 시작부터 수확 기준에 도달한 시간까지)까지의 배양 기간을 보여준다. 도 5f는 자극 후 고갈된 및 고갈되지 않은 세포 조성물에서 시간에 따른 총 T 세포수를 보여준다. 도 5g는 고갈된 및 고갈되지 않은 세포 조성물에서 형질도입 후 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포의 백분율을 보여준다.
도 6a는 예시적인 제조 공정을 사용하여 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 세포를 조작하기 위해 비-호지킨 림프종(NHL) 환자로부터 수득된 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 CD57+ T 세포의 백분율을 나타내는 위스커 플롯(whisker plot)을 보여준다. 박스는 사분위수 범위를 나타내고 수염은 데이터 세트의 전체 범위를 나타낸다. 도 6B는 NHL 환자로부터 얻은 다양한 세포 집단에서 CD57+CD8+ 세포의 백분율 및 Ki-67+ 세포의 백분율 간의 관계를 보여준다. 도 6c는 T 세포 분화 표현형(예를 들어 나이브-유사 T 세포, 효과기 T(TEFF) 세포, 기억 T 세포, 중앙 기억 T(TCM), 터미널 효과기 세포)과 관련된 다양한 표면 마커의 발현 및 NHL 환자로부터 얻은 세포 집단에서의 CD57의 발현에 대한 계층적 클러스터링 분석을 보여준다. 각각의 로우(row)는 개별 환자를 나타내고, 칼럼(column)은 T 세포 분화 표현형과 관련된 마커 또는 마커 조합물을 나타낸다. 도 6d는 CD27 및 CD45RA 발현 상태에 의해 그룹핑된 세포 제형화의 서브세트에서 Ki67을 발현하는 생존 CD57+ 세포의 백분율을 보여준다. 도 6e는 CD27 및 CD45RA 발현(상단 패널)에 의해 분류된 세포 집단의 서브 세트에서 생존, CD8+CD57+ 세포의 백분율 및 CD27 및 CD45RA 발현(하단 패널)에 의해 분류된 세포 집단의 서브세트에서 생존, CD4+CD57+ 세포의 백분율을 보여준다.
도 7은 치료적 T 세포 산출 조성물(예를 들어 의약 생성물)에서 중앙 기억/나이브 유사 CD4+ T 세포의 백분율과 수확 척도(Spearman ρ: -0.54; p-값: <0.001)를 달성하기 위한 배가 집단 수 사이의 관계를 나타낸다. 치료적 T 세포 산출 조성물(예를 들어 의약 생성물)에서 CD8+ T 세포에 대해 유사한 결과가 관찰되었다.
도 8a는 생산 과정의 증폭 단계 중 높은(0.35x10^6 세포/mL) 및 낮은(0.05x10^6 세포/mL) 시드 밀도에 대해 수확 척도를 달성하기 위한 배가 집단 수를 나타낸다. 도 8b는 생산 과정의 증폭 단계 중 시드 밀도의 함수로서 치료적 산출 조성물에서 CD27+CAR+CD8+ T 세포의 백분율을 나타낸다. 도 8c는 T 세포 산출 조성물에서 중앙 기억T 세포의 양에 대한 처리 기간의 영향을 나타낸다.
도 9a-9d는 특정 역치 수준 이상 또는 이하인 CD4+ CAR+ T 세포 중(무진행 생존에 대해 도 9a, 반응 기간에 대해 도 9c) 및 CD8+ CAR+ T 세포 중(무진행 생존에 대해 도 9b, 반응 기간에 대해 도 9d) CCR7+CD27+ CAR+ T 세포 비율을 함유한 조성물을 투여받은 군으로 나뉜, CAR+ T 세포 조성물을 투여받은 대상체에 대한 Kaplan-Meier 생존 곡선을 나타낸다.
도 10은 CD8+/CAR+ T 세포에서 “높은(high)” 또는 “낮은(low)” 집단 배가 수(population doubling, PDL)를 갖는 환자에 대한 최적 분할 로그 순위 테스트에 기초한 PFS 곡선을 나타낸다. 낮은 PDL은 <6 PDL을 지칭하고, >6 PDL은 높은 PDL을 지칭한다.
도 11은 비호지킨 림프종 환자에서 유래된 CD4+ 농축(왼쪽 패널) 및 CD8+ 농축(오른쪽 패널) 입력 조성물에서 CD27+CD28+ T 세포의 백분율을 나타낸다.
도 12는 CD4+ 농축 입력 조성물에서 효과기 기억 T 세포의 백분율과 수확 척도(Spearman ρ: 0.43; p-값: <0.001)를 달성하는데 필요한 배가 집단 수 사이의 관계를 나타낸다. CD8+ 농축 입력 조성물에 대해 유사한 결과가 관찰되었다.
도 13a 내지 13d는 다양한 비-증폭 및 증폭된 조작 공정을 포함하여 제조 실행 동안 및 이후의 총 생존 세포(도 13a), 생존율(도 13b) 및 표현형(도 13c 및 13d)을 보여준다.
도 14는 다양한 비-증폭 및 증폭된 조작 공정을 포함하여 제조 수행 동안 및 제조 후 CD4+ 및 CD8+ 세포 집단에서 CD57+ 세포의 백분율을 보여준다.
도 2a는 1차 인간 T 세포에 대한 예시적인 공정에서 자극 시작 후 약 216 시간에 걸쳐 다양한 시점에서 CD57 및 Ki-67 발현에 대한 유세포 분석을 보여준다. 도 2b는 3명의 상이한 공여자(공여자 A-C)에서 자극 및 배양 동안 세포 집단에서 CD57+ 세포의 백분율을 보여준다. 도 2c는 자극 및 배양 동안 세포 집단에서 CD57+ 세포 또는 CD57- 세포 중 Ki-67+ 세포의 백분율을 보여준다. 도 2d는 3명의 다른 공여자(공여자 A-C)에서 자극 및 배양 동안 CD4+ 세포 집단에서 CD57+ 세포의 백분율을 보여준다. 도 2e는 자극 후 시간에 따른 공여자 세포 조성물로부터의 세포에 대한 CD57 및 Ki67 발현을 보여준다. 한 공여자 세포 조성물의 세포는 수확 기준(수확까지 8일)에 도달하는데 8일이 필요한데 반해, 다른 공여자 세포 조성물은 수확 기준(수확까지 7일)에 도달하는데 7일만이 필요하였다. 도 2f는 도 2e에 나타낸 공여자 세포 조성물로부터의 세포에 대한 CD45RA 및 CD27 발현을 보여준다.
도 3a는 1차 인간 T 세포에 대한 예시적인 과정에서 자극 및 배양 동안 세포 집단에서 CD57+ 세포 및 CD57- 세포 사이의 CD69 및 CD25 발현(활성화와 관련된 마커)에 대한 유세포 분석을 보여준다. 도 3b 및 3c는 T 세포 분화 표현형(예를 들어 나이브-유사 T 세포, 효과기 T(TEFF) 세포, 기억 T 세포, 중앙 기억 T(TCM), 효과기 기억 T(TEM) 세포, 효과기 기억 RA T(TEMRA) 세포) 및 CD57(도 3b) 또는 Ki-67(도 3c)과 관련된 다양한 표면 마커의 발현에 대한 계층적 클러스터링 분석을 보여준다. 각각의 로우(row)는 개별 공여자의 세포 집단을 나타내고, 칼럼(column)은 T 세포 분화 표현형과 관련된 마커 또는 마커 조합물을 나타낸다.
도 4a는, (1) 100% CD57+ 세포; (2) 75% CD57+ 세포; (3) 25% CD57+ 세포; 및 (4) 0% CD57+ 세포의 빈도의 빈도로 CD57+ 및 CD57- 세포의 혼합물을 함유하는 적정 세포 조성물에 대한 예시적인 제조 공정에서 자극 시작 후 약 240 시간 동안 총 세포의 수 및 생존 세포의 백분율을 보여준다. 예시적인 수확 기준이 표시된다. 도 4b는 자극 시작 후 48 시간에 세포 배양 웰의 이미지를 보여주며, 자극 시약의 존재하에 적정된 세포 조성물의 자극 및 배양에서 세포 클러스터링을 보여준다. 도 4c는 적정 된 세포 조성물의 자극 및 배양에서 자극 시작 후 12 및 48 시간에 배양 배지에 존재하는 IL-2(㎍/mL)의 양을 보여준다.
도 5a 및 5b는 CD57+ T 세포(도 5a), CD27+ CD28+ T 세포(도 5b)의 백분율을 보여준다. 도 5c는 CD57+ 세포가 고갈되지 않았거나(고갈되지 않음) CD57+ 세포가 고갈된(고갈됨) 4명의 공여자 세포 조성물에 대한 CD27의 발현을 보여준다.
도 5d는 고갈된 및 고갈되지 않은 CD3+ 세포 조성물에서의 Ki67 발현을 보여준다. 도 5e는 CD57+ 세포가 고갈되었거나(고갈됨) CD57+ 세포가 고갈되지 않은 (고갈되지 않음) 대상체로부터 얻은 1 차 CD8+ 세포에 대한 수확(자극 시작부터 수확 기준에 도달한 시간까지)까지의 배양 기간을 보여준다. 도 5f는 자극 후 고갈된 및 고갈되지 않은 세포 조성물에서 시간에 따른 총 T 세포수를 보여준다. 도 5g는 고갈된 및 고갈되지 않은 세포 조성물에서 형질도입 후 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포의 백분율을 보여준다.
도 6a는 예시적인 제조 공정을 사용하여 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 세포를 조작하기 위해 비-호지킨 림프종(NHL) 환자로부터 수득된 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 CD57+ T 세포의 백분율을 나타내는 위스커 플롯(whisker plot)을 보여준다. 박스는 사분위수 범위를 나타내고 수염은 데이터 세트의 전체 범위를 나타낸다. 도 6B는 NHL 환자로부터 얻은 다양한 세포 집단에서 CD57+CD8+ 세포의 백분율 및 Ki-67+ 세포의 백분율 간의 관계를 보여준다. 도 6c는 T 세포 분화 표현형(예를 들어 나이브-유사 T 세포, 효과기 T(TEFF) 세포, 기억 T 세포, 중앙 기억 T(TCM), 터미널 효과기 세포)과 관련된 다양한 표면 마커의 발현 및 NHL 환자로부터 얻은 세포 집단에서의 CD57의 발현에 대한 계층적 클러스터링 분석을 보여준다. 각각의 로우(row)는 개별 환자를 나타내고, 칼럼(column)은 T 세포 분화 표현형과 관련된 마커 또는 마커 조합물을 나타낸다. 도 6d는 CD27 및 CD45RA 발현 상태에 의해 그룹핑된 세포 제형화의 서브세트에서 Ki67을 발현하는 생존 CD57+ 세포의 백분율을 보여준다. 도 6e는 CD27 및 CD45RA 발현(상단 패널)에 의해 분류된 세포 집단의 서브 세트에서 생존, CD8+CD57+ 세포의 백분율 및 CD27 및 CD45RA 발현(하단 패널)에 의해 분류된 세포 집단의 서브세트에서 생존, CD4+CD57+ 세포의 백분율을 보여준다.
도 7은 치료적 T 세포 산출 조성물(예를 들어 의약 생성물)에서 중앙 기억/나이브 유사 CD4+ T 세포의 백분율과 수확 척도(Spearman ρ: -0.54; p-값: <0.001)를 달성하기 위한 배가 집단 수 사이의 관계를 나타낸다. 치료적 T 세포 산출 조성물(예를 들어 의약 생성물)에서 CD8+ T 세포에 대해 유사한 결과가 관찰되었다.
도 8a는 생산 과정의 증폭 단계 중 높은(0.35x10^6 세포/mL) 및 낮은(0.05x10^6 세포/mL) 시드 밀도에 대해 수확 척도를 달성하기 위한 배가 집단 수를 나타낸다. 도 8b는 생산 과정의 증폭 단계 중 시드 밀도의 함수로서 치료적 산출 조성물에서 CD27+CAR+CD8+ T 세포의 백분율을 나타낸다. 도 8c는 T 세포 산출 조성물에서 중앙 기억T 세포의 양에 대한 처리 기간의 영향을 나타낸다.
도 9a-9d는 특정 역치 수준 이상 또는 이하인 CD4+ CAR+ T 세포 중(무진행 생존에 대해 도 9a, 반응 기간에 대해 도 9c) 및 CD8+ CAR+ T 세포 중(무진행 생존에 대해 도 9b, 반응 기간에 대해 도 9d) CCR7+CD27+ CAR+ T 세포 비율을 함유한 조성물을 투여받은 군으로 나뉜, CAR+ T 세포 조성물을 투여받은 대상체에 대한 Kaplan-Meier 생존 곡선을 나타낸다.
도 10은 CD8+/CAR+ T 세포에서 “높은(high)” 또는 “낮은(low)” 집단 배가 수(population doubling, PDL)를 갖는 환자에 대한 최적 분할 로그 순위 테스트에 기초한 PFS 곡선을 나타낸다. 낮은 PDL은 <6 PDL을 지칭하고, >6 PDL은 높은 PDL을 지칭한다.
도 11은 비호지킨 림프종 환자에서 유래된 CD4+ 농축(왼쪽 패널) 및 CD8+ 농축(오른쪽 패널) 입력 조성물에서 CD27+CD28+ T 세포의 백분율을 나타낸다.
도 12는 CD4+ 농축 입력 조성물에서 효과기 기억 T 세포의 백분율과 수확 척도(Spearman ρ: 0.43; p-값: <0.001)를 달성하는데 필요한 배가 집단 수 사이의 관계를 나타낸다. CD8+ 농축 입력 조성물에 대해 유사한 결과가 관찰되었다.
도 13a 내지 13d는 다양한 비-증폭 및 증폭된 조작 공정을 포함하여 제조 실행 동안 및 이후의 총 생존 세포(도 13a), 생존율(도 13b) 및 표현형(도 13c 및 13d)을 보여준다.
도 14는 다양한 비-증폭 및 증폭된 조작 공정을 포함하여 제조 수행 동안 및 제조 후 CD4+ 및 CD8+ 세포 집단에서 CD57+ 세포의 백분율을 보여준다.
본원에서는 예를 들어 출발 세포 물질 또는 생물학적 샘플과 비교하여 감소된 빈도의 CD57+ T 세포를 갖는 세포의 샘플, 집단, 또는 조성물을, 특히 선택, 단리, 농축, 자극, 유전자 조작, 도는 증폭하는데 유용한 방법 및 조성물이 제공된다. 일부 측면에서, 본원에서는 농축된 CD57- T 세포의 집단, 또는 CD57+ 세포에 대해 고갈된 집단을 생성하기 위해서, 생물학적 샘플로부터 CD57+ T 세포를 선택, 단리, 또는 제거하는 것이거나 또는 그를 포함하는 T 세포를 농축하는 방법이 제공된다. 일부 측면에서, 본원에서는 농축된 CD57- T 세포의 집단, 또는 CD57+ T 세포에 대해 고갈된 집단을 생성하기 위해서, 생물학적 샘플로부터 CD57+ T 세포를 선택, 단리, 또는 제거하는 것이거나 또는 그를 포함하는 T 세포를 농축하는 방법이 제공된다.
일부 측면에서, 본원에서는 자극 조건하에 상기 집단의 세포를 인큐베이션함으로써 CD57- T 세포의 집단을 자극하는 방법이 제공된다. 또한 본원에서는 세포, 예를 들어 농축된 CD57-T 세포의 집단의 또는 그로부터 유래하는 세포로 이종 폴리펩티드를 도입함으로써 T 세포를 유전자 조작하는 방법이 제공된다.
특정 구현예는, 조작된 T 세포, 예를 들어 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 조작된 T 세포를 생성하는 기존의 방법이 T 세포의 집단 또는 조성물이 증식 또는 증폭하는 단계들(steps), 단계들(stages), 또는 단계들(phases)을 포함하는 것을 고려한다. 그러나, 일부 경우에, 집단 또는 조성물 중의 일부는 어떠한 증식 또는 증폭을 나타내지 않을 수 있거나, 일부 경우에, 서서히 증폭할 수 있으며 따라서 상기 조작 공정을 완성하기 위해서 추가 일수를 요구한다.
일부 측면에서, 조작된 세포 조성물을 생성하거나 또는 제조하는 기존의 방법 또는 공정은 상기 제조 공정에서 이질성(heterogeneity)을 초래할 수 있다. 일부 측면에서, T 세포와 관련된 표현형은 임상 결과에 영향을 미칠 수 있다[문헌 「Fraietta et al., Nat Med. 2018; 24(5):563-571」; 및 「Larson et al., Cancer Res. 2018; 78(13 Suppl):Abstract nr 960」 참조]. 일부 경우에 조기 기억 T 세포 표현형(early memory T cell phenotypes)을 나타내는 세포에 대한 농축은 조작된 세포 조성물의 제조를 개선시킬 수 있다[문헌 「Singh et al., Sci Trans Med. 2016; 8(320):320ra3」 참조].
상기 제공된 방법 및 조성물은 이들 이슈에 주목한다. 상기 제공된 방법 및 조성물은 적어도 부분적으로는 세포의 집단, 예를 들어 T 세포를 자극 또는 조장하는 공정 동안, 예를 들어 개선된 똔느 보다 신속한 증식 및 증폭을 수행하는 농축된 CD57- T 세포의 집단에 관한 것이다. CD57(이것은 HNK1 및 LEU7으로도 알려짐)은 T 및 NK 림프구의 표면 위에 발현될 수 있는 베타-1,3-글루쿠로닐트란스퍼라제이다. 일부 측면에서, CD57 발현, 예를 들어 표면 발현은 T 및 NK 세포의 성숙, 효과기-분화된 서브-집단과 관련된다. 일부 측면에서, CD57 발현은, 특정 측면에서 지속적인 증식 및 세포 생존에 영향을 미칠 수 있는 공자극 수용체 CD28 및 CD27의 발현이 결여된 T 세포 또는 T 세포 집단에 상응한다. 특정 측면에서, CD57 발현은 또한 낮은 또는 감소된 증식 용량을 갖는 세포를 식별할 수 있다. 일부 측면에서, CD57+CD28- 세포 집단은 CD57- 세포 집단에 비해 짧은 텔로미어 길이(telomere length) 및 감소된 증식 능력을 보여줄 수 있다[문헌 「Reviewed in Strioga, Pasukoniene, & Characiejus, Immunol. (2011)」 참조].
특정 구현예는 유전자 조작 공정에 사용된 출발 세포 물질로부터의 CD57+ T 세포의 빈도의 감소가 보다 높은 증식 용량을 갖는 세포를 농축시킬 것을 고려한다. 일부 측면에서, CD57+ T 세포의 음성 선택은 더 잘 증폭할 수 있는 세포를 사전 농축하여 제조 성공 및 의약품 일관성을 개선시킨다. 추가로, 일부 구현예에서, 증가된 증식 용량을 나타내는 세포를 사용하여 세포의 집단 또는 조성물을 농축시키는 것은 효과기 세포 분화의 정도를 감소시킬 수 있으며, 이것은 자가 설정의 대상 또는 동종이계 설정의 배치 전체에서 개선된 대상 제품 프로필 일관성을 지원해야 한다(CD27+, CCR7+ T 세포).
일부 구현예에서, 상기 방법은, 대안 공정 보다 신속하고 보다 효율적일 수 있는 방식으로 세포 요법에 사용하기 적합한 유전자 조작된 세포를 효율적으로 제조하거나 또는 생성하기 위한 공정과 관련하여 사용된다. 특정 구현예에서, 본원에서 제공된 상기 방법은 대안 공정으로부터 가능할 수 있는 것 보다 광범위한 집단의 대상체들로부터 조작된 세포의 조성물을 생성하거나 또는 제조하기 위한 높은 성공률을 갖는다. 따라서, 일부 측면에서, 세포 요법을 위한 조작된 세포를 생성하기 위한 상기 제공된 방법의 속도 및 효율은 일부 대안 방법에 의해 가능할 수 있는 보다 광범위한 집단의 대상체에 대해 세포 요법 치료, 예를 들어 자가 세포 요법의 보다 용이한 계획 및 조정을 가능하게 한다. 일부 측면에서, 예를 들어 다운스트림 공정에서 세포 집단의 일관성을 개선함으로써 CD57+ 세포(예를 들어 CD57 + T 세포)의 고갈이 유리하다는 것이 고려된다. 예를 들어 CD57+ 세포를 고갈시키면 증식 능력이 더 적거나 감소된 세포가 고갈될 수 있으며, 고갈된 조성물은 세포 증식 속도에서 향상된 일관성을 나타내는 것으로 관측되었다. 이와 관련하여, 세포 증식 속도의 일관성을 개선하면 세포 집단이 수확 기준에 도달하는데 필요한 기간의 일관성이 향상될 수 있다. 추가로, 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 벡터로 세포 집단을 형질도입하기 전에 CD57+ 세포를 고갈시키면 형질도입된 세포의 CAR 발현에서 일관성을 향상시킬 수 있다는 것이 본원에서 관찰된다.
일부 측면에서, CD57+ T 세포를 제거하거나 또는 CD57+ T 세포를 스크리닝함으로써 개선된 증식 용량을 갖는 유입 공여자 세포(incoming donor cell)를 사전-선택하는 것은 세포 요법제를 생성하는 공정에 사용된 세포의 수에 대한 개선된 공정 제어를 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, CD57의 발현은 지연된 또는 빈약한 성장을 나타내는 세포를 표시하는 바이오마커(biomarker)로서 기능할 수 있다. 따라서 상기 제공된 구현예 중의 일부는 세포를 자극, 유전자 조작, 또는 증폭시키는 공정 전에 CD57+ 세포를 선택적으로 제거하는 하나 이상의 선택 시약 또는 공정 단계를 이용하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 상기 시약 및 공정 단계는 CD8+ 및 CD4+ 선택 전략과 함께 사용할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, CD57+ 세포의 선택은 CD8+ 또는 CD4+ 선택을 위한 임의의 단계 전에 세포의 샘플, 조성물, 또는 집단으로부터 CD57+ 세포를 제거 또는 고갈시키는데 사용된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, D57+ T 세포의 선택은 CD8+ 또는 CD4+ 선택을 위한 임의의 단계 전에 세포의 샘플, 조성물, 또는 집단으로부터 CD57+ T 세포를 제거 또는 고갈시키는데 사용된다. 일부 측면에서, 예를 들어 CD8+ 또는 CD4+ 선택을 위한 임의의 단계 전에 음성 선택(양성 선택에 반대되는)에 의해서 CD57+ 세포를 고갈시키는 것이 유리할 수 있다. 일부 측면에서, 예를 들어 CD8+ 또는 CD4+ 선택을 위한 임의의 단계 전에 음성 선택에 의해서 CD57+ 세포를 고갈시키는 것은 상기 CD57-고갈된 집단이 상기 CD57 선택 단계에 사용된 하나 이상의 시약 또는 용액에 의해서 오염될 가능성을 감소시킨다.
일부 구현예에서, CD57+ T 세포의 선택은 CD8+ 또는 CD4+ 선택을 위한 임의의 단계 후에 세포의 샘플, 조성물, 또는 집단으로부터 CD57+ T 세포를 제거 또는 고갈시키는데 사용된다. 일부 측면에서, 상기 시약 및 공정 단계는 CD3+ 선택 전략과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, CD57+ T 세포의 선택은 CD3+ 선택을 위한 임의의 단계 전에 세포의 샘플, 조성물, 또는 집단으로부터 CD57+ T 세포를 제거 또는 고갈시키는데 사용된다. 일부 구현예에서, CD57+ T 세포의 선택은 CD3+ 선택을 위한 임의의 단계 후에 세포의 샘플, 조성물, 또는 집단으로부터 CD57+ T 세포를 제거 또는 고갈시키는데 사용된다. 일부 구현예에서, CD57+ 세포는, 예를 들어 칼럼에서 CD57+ 세포를 결합하는 CD57-지향된 자성 비드를 사용하여 선택되거나 제거되고, 칼럼 플로우-쓰루(결합되지 않은 분획)는 CD57+ 고갈된 세포 소스, 예를 들어 CD57- T 세포에 대해 농축된 세포의 집단을 함유하게 된다. 일부 구현예에서, CD57+ T 세포는 CD57-지향된 자성 비드를 사용하여 선택되거나 제거되고, 칼럼 플로우-쓰루는 CD57+ 고갈된 세포 소스, 예를 들어 CD57- T 세포에 대해 농축된 세포의 집단을 함유하게 된다.
특정 구현예는, CD57 + T 세포가 덜 증식될 것이기 때문에 일부 기존의 생체외 T-세포 활성화 또는 증폭 프로토콜이 일정 시간 후, 예를 들어 상기 공정의 첫번째 48시간 후에 CD57+ T 세포의 존재를 감소시킬 가능성이 높다는 것을 고려한다. 일부 측면에서, CD57+ 세포(예를 들어 CD57+ T 세포)는 그러한 공정에서 죽거나 강력한 증폭이 가능한 세포의 하위 집합에 의해 빈도가 감소한다. 그러나 이러한 공정에서 CD57+ T 세포의 자연적 감소가 발생할 수 있지만 자연적 감소는 높은 증식 능력(예를 들어 CD57- 세포)을 나타내는 공정에 들어가는 세포의 양을 제어하지 않는다. 따라서, 일부 측면에서, CD57+ 세포(예를 들어 CD57+ T 세포)는 생존 가능하지만 증식성이 적은 세포이기 때문에 공정에 입력되는 총괄 출발 세포수에 기여한다. 따라서 일부 구현예에서, CD57+ T 세포를 제거하거나 또는 샘플, 조성물 또는 집단에서 낮은 CD57+ T 세포 함량을 확인하는 이점은 CD57-T 세포, 예를 들어 증식 능력이 있는 세포가 유입 물질에서 소수 집단을 구성하지 않게 한다. 따라서, 일부 구현예에서, 낮은 빈도의 CD57+ T 세포 또는 감소된 증식 세포의 비율을 보장하는 것은 공정 시간 연장, 세포 분화 증가 및/또는 조작 공정 동안 수확 기준을 충족하지 못하는 것과 관련된 발생률을 줄일 수 있다.
일부 측면에서, 상기 제공된 방법은 세포를 조작하는 공정, 예를 들어 세포 요법제용 재조합 수용체-발현 T 세포를 함유하는 조성물을 생성하는 제조공정 동안, 많은 세포가 항-CD3/항-CD8 항체의 존재하에 세포의 인큐베이션과 같이 자극 후 CD25 및 CD69를 포함하는 T 세포의 자극 또는 활성화와 관련된 마커를 발현하거나 상향 조절한다는 발견에 기반한다. 일부 측면에서, Ki-67의 발현에 기초하여 나타낸 바와 같이 세포의 일부만이 세포 주기에 진입하는 것으로 관찰된다. 일부 경우에, Ki-67+ 세포는 CD27 및 CD28을 발현하는 세포를 포함하는 반면, Ki67-집단은 CD57+ 세포에 대해 농축되는 것으로 관측되고 CD27-CD28-표현형을 나타내었다. 일부 측면에서, CD57+ 세포는 본원에서 자극 또는 활성화와 관련된 표현형을 나타내는 것으로 관찰되었으며 제조 공정의 초기 단계에서 지속되었다. 일부 측면에서, CD57+ T 세포의 빈도는 자극 후 약 48 시간 후에 감소하였으며, 이는 일반적으로 T 세포 증폭 및 생존력 증가와 일치하였다. 일부 측면에서, 공정 및 생성물 이질성을 결과하는 성장 요소(growth factor) 및/또는 자극 시약을 지속적으로 사용하는 동안 세포의 특정 유형, 예를 들어 CD57+ 세포(예를 들어 CD57+ T 세포)는 자극 또는 배양 도중 저 증폭 또는 무증폭을 나타냈다.
일부 측면에서, CD57+ 세포(예를 들어 CD57+ T 세포)가 선택되고 자극 전에 다양한 비율로 CD57-세포(예를 들어 CD57+ T 세포)와 결합될 때, 자극 전의 세포 조성물(예를 들어 입력 조성물) 중의 CD57+ T 세포의 빈도는 보다 긴 공정 기간과 관련된다. 일부 측면에서, 또한 세포 조성물, 예를 들어 CAR+ T 세포를 함유하는 조성물은, 상기 조성물 중의 T 세포의 95% 이상, 예를 들어 100%가 CD57+ T 세포이었을 때 증폭 또는 증식되지 않는 것으로 관찰되었다.
일부 측면에서, CD27+ T 세포는 조작된 T 세포, CD57+ 세포, 예를 들어 CD57+ T 세포를 생성하는 제조 공정 동안 세포를 증폭시키는데 기여할 수 있다(예를 들어 일반적으로 증폭되지 않으며 조작된 세포 조성물(예를 들어 투여를 위한 세포 조성물) 중의 세포에 최소로 기여하는 것으로 관측되었다). 따라서 CD57+ T 세포의 존재는 제조 공정에 영향을 줄 수 있으며, 또한 공정의 변동성(예를 들어 증폭을 위한 배양 동안) 및 기타 세포 조성물 속성에 기여하는 것으로 관찰되었다. 일부 측면에서, 본원에서 제공되는 제조 공정의 시작 시점에서, 예를 들어 세포의 자극 전에 CD57+ T 세포의 선택적인 고갈은 상기 조작된 세포 조성물의 일관성, 품질 및 효능을 개선시킬 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 상기 제공된 방법은 세포 요법제를 생성하는 공정 기간을 감소시킬 수 있으며, 따라서 특정 측면에서, 제조 스케쥴의 일관성을 개선시킬 수 있다. 추가로, 일부 측면에서, 세포 요법제를 위한 조작된 세포를 생성하는 상기 제공된 방법의 속도 및 효율성은 일부 대체 방법으로 가능할 수 있는 것보다 더 광범위한 대상체 집단에 대해 자가 요법과 같은 세포 요법 치료의 계획 및 조정을 보다 용이하게 한다.
특정 구현예에서, 상기 제공된 방법은 세포 요법제, 예를 들어 조작된 T 세포의 집단 또는 조성물에 유용한 세포를 생성하는 공정의 개시 시점에 무-증식성 세포의 적어도 일부를 성공적으로 제거한다. 일부 측면에서, 이것은 개시 또는 그러한 공정 전에 CD57+ 세포(예를 들어 CD57+ T 세포)를 선택함으로써, 또는 무 또는 저 CD57+ T 세포 함량을 갖는 세포 조성물 또는 집단만이 상기 공정에 사용되고, 상기 공정의 성공, 예를 들어 세포 요법제에 사용하기 적합한 세포 집단을 성공적으로 생성하는 속도 또는 빈도를 향상시키는 것이 보장되도록 스크리닝함으로써 성취된다. 일부 구현예에서, 상기 제공된 방법은, 예를 들어 증식, 배양 또는 증폭 동안 세포 요법제로서 사용하기 위한 필요한 수의 T 세포를 산출하기 위해 수확까지 필요한 기간 및 세포의 배가 횟수를 감소시킨다. 따라서, 이론에 근거함이 없이, 일부 구현예는 상기 제공된 방법이 개선된 증식 용량을 나타내는 유입 공여자의 충분한 수를 증가 또는 입증하는 것을 고려한다.
일부 구현예에서, 농축된 CD57- T 세포의 집단으로부터 생성된 상기 세포 요법제는 대안 공정에서 생성된 세포 요법제보다 분화도가 낮은 T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 세포 요법제의 감소된 세포 분화는 (예를 들어 대안 공정과 비교하여) 상기 제공된 공정에 의해서 생성된 세포 요법제, 예를 들어 가변 양의 CD57+ T 세포를 함유하는 세포의 집단으로부터 생성되는 세포 요법제 중에서의 일관성을 개선시킨다. 특정 구현예에서, 상기 세포 요법제의 감소된 세포 분화는 상기 세포 요법제의 생성물 품질 프로파일을 개선시킨다.
특정 측면은 CD57이 T 세포에 더하여 NK 및 NKT 세포에 의해 발현되며, 이들 모두는 생물학적 샘플, 예를 들어 백혈구 성분 채집술 물질(leukapheresis material)에 존재할 수 있음을 고려한다. 따라서, 일부 구현예에서, CD57+ 세포(예를 들어 CD57+ T 세포)에 대한 음성 선택은 잔여 비-T 세포를 감소시키고 T 세포 순도를 개선시킨다. 따라서, 상기 제공된 방법은 예를 들어 자극, 형질도입, 또는 증폭에 의해서 가공되는 T 세포의 집단의 순도 뿐만 아니라 세포 요법제를 생성하는 T 세포 순도를 증가시킨다.
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I. 농축된 CD57- T 세포의 집단
특정 구현예에서, 농축된 CD57- T 세포(본원에서 CD57- T 세포 집단, 농축된 CD57- T 세포의 조성물, 또는 CD57- T 세포 세포 조성물이라고도 함)가 제공된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57- T 세포는 T 세포, 예를 들어 농축된 CD57- T 세포의 집단의 T 세포 또는 그로부터 유래하는 T 세포를 자극, 활성화, 조작, 형질도입, 배양, 또는 증폭하는 방법과 관련하여 사용된다. 일부 구현예에서, 농축된 CD57- T 세포의 집단은 예를 들어 생물학적 샘플의, 예를 들어 하나 이상의 면역 세포를 함유하는 생물학적 샘플의 단리, 선택, 또는 농축으로부터 생성되거나 또는 그의 생성물이다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57- T 세포의 집단은 생존가능한 T 세포, CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, 및/또는 CD8+ T 세포이거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57- T 세포의 집단은 생존가능한 T 세포, CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, 및/또는 CD8+ T 세포 또는 그들 중 임의의 것의 조합물이거나 또는 그를 포함한다. 다양한 구현예에서, 농축된 CD57- T 세포의 집단은 생존가능한 CD57- T 세포, CD57-CD3+ T 세포, CD57-CD4+ T 세포, CD57-CD8+ T 세포, 또는 그들 중 임의의 것의 조합물이거나 또는 그를 포함한다.
특정 구현예는, 세포를 함유하는 샘플, 집단, 또는 조성물에서, CD57 발현의 양, 예를 들어 CD57+ T 세포의 양이 임의의 적절한 공지 수단에 의해서 측정될 수 있다는 것을 고려한다. 일부 구현예에서, CD57 발현은 샘플, 집단, 또는 조성물에서 측정하여 상기 샘플, 집단, 또는 조성물 중의 CD57+ 세포, 예를 들어 CD57+ T 세포의 양, 빈도, 또는 백분율을 측정, 평가, 또는 결정한다. 특정 구현예에서, CD57 발현은 샘플, 집단, 또는 조성물에서 측정하여 상기 샘플, 집단, 또는 조성물 중의 CD57+ 세포, 예를 들어 CD57+ T 세포의 양, 빈도, 또는 백분율을 측정, 평가, 또는 결정한다.
일부 구현예에서, 높은 백분율의 CD57+ 세포를 갖는 세포 조성물은 증식성 증폭가능한 낮은 백분율의 세포를 생성할 수 있다. 일부 경우에, 높은 백분율의 CD57+ 세포를 갖는 조작된 세포 조성물은 감소된 증식 용량과 관련되며 연장된 공정 시간, 임계 세포수를 성취하는 높은 배가, 증가된 세포 분화 및/또는 세포 요법용 조작된 T 세포 조성물을 생산하는 제조공정에서 수확 기준에 부합하지 못하는 것을 초래할 수 있다.
또한 일부 측면에서, 증폭가능한 세포의 집단을 식별하는 방법이 제공되되, 상기 방법은 상기 집단 중의 CD57+ 세포의 빈도를 측정하는 것을 포함하되, 상기 세포의 집단은, CD57+ 세포의 빈도가 임계 빈도 미만인 경우 증폭가능한 것으로 식별된다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 임계 빈도는 (약) 35%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1%, 또는 0.1% 미만인 백분율이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 증폭가능한 집단은 증식 또는 증폭을 촉진하는 조건하에 4, 5, 6, 7 또는 8일의 배양일 이내에 적어도 (약) 2-배, 4-배, 8-배, 또는 16-배 증폭시킨다.
또한 일부 측면에서, T 세포의 집단의 증폭 용량을 결정하는 방법이 제공되되, 상기 방법은 T 세포의 집단에서 CD57 발현과 관련된 특성의 값을 측정하는 것을 포함하되, 상기 T 세포의 집단은, 상기 특성의 값이 (약) 상기 특성의 임계값 미만인 경우 증폭가능한 것으로 결정된다.
일부 구현예에서, 상기 임계값은, i) CD57 발현과 관련된 특성의 값의 평균값 또는 중앙값 측정치 미만인 (약), 또는 25% 이내, 20%, 15% 이내, 10% 이내, 또는 5% 이내이고/이거나, 복수의 참조 T 세포 집단에서, (약) 상기 평균값 또는 중앙값 측정치 미만인 표준 편차 미만이고; ii) 복수의 참조 T 세포 집단으로부터의 집단 중에서, CD57 발현과 관련된 특성의 최저 측정치 미만, 선택적으로 상기 최저 측정치 미만인, 50% 이내, 25% 이내, 20% 이내, 15% 이내, 10% 이내, 또는 5% 이내이며; iii) 복수의 참조 T 세포 조성물로부터의 샘플의 65%, 75%, 80%, 85% 초과로부터 계산된 CD57 발현과 관련된 특성의 평균값 또는 중앙값 측정치 미만이되, 상기 복수의 참조 T 세포 집단은 T 세포의 증식 또는 증폭을 촉진하는 조건하에 배양될 때 증폭하지 않은 복수의 집단이며, 선택적으로 상기 세포는 4, 5, 6, 7 또는 8일의 배양일 이내에 적어도 (약) 2-배, 4-배, 8-배, 또는 16-배 증폭되지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 특성은 총 T 세포, CD4+ T 세포, 또는 CD8+ T 세포에서 발현된 CD57 폴리펩티드의 수준 또는 양이다. 일부 구현예에서, 상기 특성은 상기 세포 집단 중에 존재하는 CD57+ T 세포, CD57+CD4+ T 세포, 또는 CD57+CD8+ T 세포의 빈도, 백분율, 또는 양이다. 일부 구현예에서, 상기 CD3+ T 세포에서 발현된 CD57 폴리펩티드의 수준 또는 양이다. 일부 구현예에서, 상기 특성은 상기 세포 집단 중에 존재하는 CD57+CD3+ T 세포의 빈도, 백분율, 또는 양이다. 일부 구현예에서, 상기 특성은 상기 세포 집단 중의 상기 T 세포 중에 존재하는 CD57 mRNA의 수준 또는 양이다. 일부 구현예에서, 상기 특성은 CD57를 암호화하는 유전자(B3GAT1)의 크로마틴 접근성의 수준 또는 양이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 T 세포의 집단에서 하나 이상의 제 2 유전자 생성물의 발현과 관련된 제 2 특성의 제 2 값을 측정하는 것을 더 포함하되, 상기 집단은, 상기 특성의 값이 (약) 상기 특성의 임계값 미만인 경우 및 상기 제 2 특성의 제 2 값이 (약) 상기 제 2 특성의 제 2 임계값 미만인 경우 증폭가능할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 제 2 유전자 생성물은 나이브-유사 T 세포와 관련된 마커이다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 제 2 유전자 생성물은 CD27, CD28, CCR7, or CD45RA로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 제 2 유전자 생성물은 CD27 및 CD28이다.
특정 구현예에서, 음성 발현, 예를 들어 CD57 또는 CD57-의 음성 발현은 예를 들어 표준 기술, 예를 들어 항체-염색을 포함하는 기술을 이용하여 검출되는, 백그라운드 발현의 수준과 동등하거나 그보다 낮은 발현이다. 특정 구현예에서, 음성 발현은 제한되지는 않지만 예를 들어 면역 조직 화학, 면역 형광 또는 유세포 분석 기반 기술과 같은 단백질 또는 유전자 발현을 평가하기 위한 적절한 기술에 의해서 검출되는 백그라운드 발현의 수준과 동등하거나 그보다 낮은 발현이다. 일부 구현예에서, 양성 발현, 예를 들어 특정 단백질의 양성 발현은 백그라운드를 상회하는 양, 수준, 또는 농도에서 상기 단백질의 표면 발현이거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, 음성 발현, 예를 들어 특정 단백질의 음성 발현은 백그라운드 또는 그를 하회하는 양, 수준, 또는 농도에서 상기 단백질의 표면 발현이거나 또는 그를 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에서 제공된 방법은 상기 단백질 또는 유전자(예를 들어 CD57)에 대해 양성 또는 음성 발현으로 샘플, 조성물, 또는 집단 중의 세포를 정량화하도록 샘플, 조성물, 또는 집단에서 하나 이상의 단백질 또는 유전자(예를 들어 CD57)의 발현을 평가, 측정, 결정, 및/또는 정량화하는 하나 이상의 단계를 포함한다. 상기 단계들은 발현과 관련된 임의의 적절한 특성을 평가, 측정, 결정, 및/또는 정량화하는 것, 예를 들어 단백질, 표면 단백질, mRNA, 또는 유전자 접근성, 예를 들어 후생 유전자 접근성(epigenetic gene accessibility)을 측정하는 것을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 단백질(예를 들어 CD57)의 발현은 상기 단백질, 또는 세포의 표면 위에서 발현된, 상기 유전자에 의해서 암호화된 단백질의 수준, 양, 또는 농도를 평가, 측정, 결정, 및/또는 정량화하는 것이거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질(예를 들어 CD57)의 발현은 상기 단백질의 표면 발현, 예를 들어 상기 세포의 표면 상의 상기 단백질의 수준, 양, 또는 농도를 평가, 측정, 결정, 및/또는 정량화함으로써 평가된다. 특정 구현예에서, 상기 단백질의 표면 발현에 양성인 세포의 양, 빈도, 또는 백분율, 상기 표면 단백질을 측정하는데 사용된 기술의 백그라운드 신호보다 높은 상기 표면상의 단백질의 높은 양, 농도, 또는 밀도를 갖는 세포. 특정 구현예에서, 단백질(예를 들어 CD57)의 표면 발현은 면역 조직 화학, 면역 형광 또는 유세포 분석 기반 기술에 의해서 측정된다. 일부 구현예에서, 단백질의 표면 발현에 양성인 세포의 양, 빈도, 또는 백분율은 면역 조직 화학, 면역 형광 또는 유세포 분석 기반 기술에 의해서 결정된다.
특정 구현예에서, 상기 샘플, 조성물, 또는 집단에서 단백질 발현, 예를 들어 표면 발현에 음성 또는 양성인 세포의 양, 빈도, 또는 백분율은 유세포 분석에 의해서 결정된다. 일부 구현예에서, 상기 단백질은 CD3, CD4, CD8, CD25, CD27, CD28, CD57, CCR7, 또는 CD45RA이다. 특정 구현예에서, 상기 단백질은 CD57이다.
특정 구현예에서, 샘플, 집단, 또는 조성물에서 단백질(예를 들어 CD57)의 발현은 단백질의 수준, 양, 또는 농도를 평가, 측정, 결정 및/또는 정량화하는 임의의 적당한 방법이거나 그를 포함한다. 상기 방법은 면역분석, 핵산-기반 또는 단백질-기반 압타머 기술, HPLC(고정밀 액체 크로마토그래피), 펩티드 시퀀싱(예를 들어 Edman 분해 시퀀싱 또는 질량 분석법(예를 들어 MS/MS), 선택적으로, HPLC에 커플링) 및 전술한 것 중의 마이크로어레이 적응(핵산, 항체 또는 단백질-단백질(즉, 비-항체) 어레이 포함)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 면역분석은 면역학적 반응에 기초하여, 예를 들어 유전자 생산물에 대한 항체 또는 항원 결합 항체 단편의 결합을 검출함으로써, 단백질을 검출하는 방법 또는 분석이거나 이를 포함한다. 면역분석은 정량적 면역세포화학 또는 면역 조직화학, ELISA(직접적, 간접적, 샌드위치, 경쟁적, 다중 및 휴대용 ELISA 포함(예를 들어 미국 특허 번호 7,510,687 참조)), 웨스턴 블롯팅(하나, 둘 이상의 차원 블롯팅 또는 다른 크로마토그래피 수단 포함, 선택적으로, 펩티드 시퀀싱 포함 함), 효소 면역 분석(EIA), RIA(방사성 면역 분석) 및 SPR(표면 플라즈몬 공명)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
특정 구현예에서, 단백질 또는 그의 대응하는 유전자의 발현은 단백질(예를 들어 CD57)을 암호화하는 mRNA(또는 상기 mRNA로부터 유래된 cDNA 생성물)을 측정함으로써 측정, 평가, 또는 정량화된다. 특정 구현예에서, 상기 mRNA(또는 대응하는 cDNA)의 양 또는 수준은, 역전사 효소(rt) PCR, 액적 디지털 PCR, 실시간 및 정량화 PCR 방법을 포함하는, 중합 효소 연쇄 반응(PCR)(예를 들어 TAQMAN®, 분자 표지(molecular beacon), LIGHTUP?, SCORPION?, SIMPLEPROBES® 포함; 예를 들어 미국특허 제5,538,848호; 제5,925,517호; 제6,174,670호; 제6,329,144호; 제6,326,145호 및 제6,635,427호 참고); 노던 블롯팅; 서던 블롯팅, 예를 들어 역전사 생성물 및 유도체의; 블롯팅 어레이, 마이크로어레이, 또는 in situ-합성 어레이를 포함한, 어레이 기반 방법; 및 시퀀싱, 예를 들어 합성에 의한 시퀀싱, 파이로시퀀싱, 디데옥시 시퀀싱 또는 리게이션에 의한 시퀀싱, 또는 당 업계에 공지된 임의의 다른 방법에 의해 평가, 측정, 결정,및/또는 정량화되고, 예를 들어 HELICOS®, ROCHE® 454, ILLUMINA®/SOLEXA®, ABI SOLiD®, 및 POLONATOR® 시퀀싱으로서 그러한 특정 플랫폼을 포함하는, Shendure et al., Nat. Rev. Genet. 5:335-44 (2004) 또는 Nowrousian, Euk. Cell 9(9): 1300-1310 (2010)에서 논의되었다. 일부 구현예에서, mRNA의 발현은 차세대 시퀀싱 방법 예를 들어 RNA 시퀀싱(RNA-Seq)에 의해서 결정된다. RNA 시퀀싱 방법은 가장 일반적인 DNA 시퀀싱 플랫폼(HiSeq systems (Illumina), 454 Genome Sequencer FLX System(Roche), Applied Biosystems SOLiD(Life Technologies), IonTorrent(Life Technologies))에 적용되었다. 이들 플랫폼은 RNA의 cDNA로의 초기 역전사를 요구한다. 반대로, 단일 분자 시퀀서(single molecule sequencer) HeliScope(Helicos BioSciences)는 RNA를 시퀀싱용 템플릿으로 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 단백질 또는 그에 상응하는 유전자의 발현은 단백질의 후생 유전학적 분석이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 유전자의 접근성 예를 들어 CD57을 암호화하는 B3GAT1의 접근성에 대해 평가된다. 상기 후생 유전학적 분석은 제한되지는 않지만 시퀀싱(ATAC-seq)을 이용하여 크롭마틴 접근성을 조사하는 트란스포사제-접근가능한 크로마틴에 대한 평가(Assay for Transposase-Accessible Chromatin)를 비롯한 임의의 적절한 공지의 수단에 의해서 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 농축된 CD57- 세포의 집단은 약, 또는 (약) 25%, 20%, 15%, 12%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.01%, 또는 0.001% 미만의 CD57+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57- 세포의 집단은 CD57+ 세포가 본질적으로 부재이다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57- 세포의 집단은 CD57+ 세포가 본질적으로 부재이다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57- 세포의 집단은 (약) 20% 미만의 CD57+ 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57- 세포의 집단은 (약) 10% 미만의 CD57+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 농축된 CD57- 세포의 집단은 (약) 5% 미만의 CD57+ 세포를 함유한다. 다양한 구현예에서, 농축된 CD57- 세포의 집단은 (약) 1%, 0.1%, 또는 0.01% 미만의 CD57+ 세포를 함유한다.
특정 구현예에서, 농축된 CD57- 세포의 집단은 약, 또는 적어도 (약) 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.99%, 또는 100% 또는 약 100%의 CD57- T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57- 세포의 집단은 적어도 (약) 80%의 CD57- T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57- 세포의 집단은 적어도 (약) 95%의 CD57- T 세포를 함유한다. 다양한 구현예에서, 농축된 CD57- 세포의 집단은 적어도 (약) 99%, 99.9%, 또는 99.99%의 CD57- T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- 세포의 집단의 세포의 전부 또는 본질적으로 전부는 CD57- T 세포이다. 일부 구현예에서, 농축된 CD57- 세포의 집단은 적어도 (약) 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.99%, 또는 100% 또는 약 100%의 CD57-CD3+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57- 세포의 집단은 적어도 (약) 80%의 CD57-CD3+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57- 세포의 집단은 적어도 (약) 95%의 CD57-CD3+ T 세포를 함유한다. 다양한 구현예에서, 농축된 CD57- 세포의 집단은 적어도 (약) 99%, 99.9%, 또는 99.99%의 CD57-CD3+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- 세포의 집단의 세포의 전부 또는 본질적으로 전부는 CD57-CD3+ T 세포이다.
특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- 세포의 집단의 세포는 생존가능한 세포이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 생존가능한 세포는 제한되지는 않지만 염료 흡수 분석(예를 들어 칼세인 AM 분석(calcein AM assay)), XTT 세포 생존 분석 및 염료 배제 분석(예를 들어 트립판 블루, 에오신(Eosin) 또는 프로피듐 염료 배제 분석(propidium dye exclusion assay))을 포함할 수 있는 분석으로 평가된다. 특정 구현예에서, 생존가능한 세포는 하나 이상의 세포 사멸 마커(apoptotic marker), 예를 들어 아넥신 V(Annexin V) 또는 활성 카스파제 3(카스파제 3)의 음성 발현을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 생존가능한 세포는 제한되지는 않지만 카스파제 2, 카스파제 3, 카스파제 6, 카스파제 7, 카스파제 8, 카스파제 9, or 카스파제 10, Bcl-2 패밀리 멤버(family member), 예를 들어 Bax, Bad, 및 Bid, Annexin V, 또는 TUNEL 염색(staining)을 포함할 수 있는 하나 이상의 세포 사멸 마커의 발현에 음성이다. 특정 구현예에서, 상기 생존가능한 세포는 활성 카스파제 3 음성이다. 특정 구현예에서, 상기 생존가능한 세포는 Annexin V 음성이다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- 세포의 집단의 세포의 적어도 (약) 60%, 적어도 (약) 65%, 적어도 (약) 70%, 적어도 (약) 75%, 적어도 (약) 80%, 적어도 (약) 85%, 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 97%, 적어도 (약) 99%, 적어도 (약) 99.5%, 적어도 (약) 99.9%, 또는 100% 또는 약 100%는 생존가능한 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 생존가능한 세포는 생존가능한 CD3+, 생존가능한 CD4+, 생존가능한 CD8+, 생존가능한 CD57-, 생존가능한 CD57-CD3+, 생존가능한 CD57-CD4+, 또는 생존가능한 CD57-CD8+ T 세포, 또는 그들의 임의의 조합물이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 생존가능한 세포는 활성 카스파제 3 음성이다. 특정 구현예에서, 상기 생존가능한 세포는 Annexin V 음성이다.
특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- 세포의 집단은 약, 또는 적어도 (약) 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.99%, 또는 100% 또는 약 100%의 CD57-CD4+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 적어도 (약) 80%의 CD57-CD4+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 적어도 (약) 90%의 CD57- T 세포를 함유한다. 다양한 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 적어도 (약) 95%의 CD57-CD4+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단의 전부 또는 본질적으로 전부는 CD57-CD4+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 약, 또는 적어도 (약) 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.99%, 또는 100% 또는 약 100%의 CD57-CD8+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 적어도 (약) 80%의 CD57-CD8+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 적어도 (약) 90%의 CD57-CD8+ T 세포를 함유한다. 다양한 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 적어도 (약) 95%의 CD57-CD8+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단의 전부 또는 본질적으로 전부는 CD57-CD8+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 적어도 (약) 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.99%, 또는 100% 또는 약 100%의 CD57-CD3+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 적어도 (약) 80%의 CD57-CD3+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 적어도 (약) 90%의 CD57-CD3+ T 세포를 함유한다. 다양한 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 적어도 (약) 95%의 CD57-CD3+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단의 전부 또는 본질적으로 전부는 CD57-CD3+ T 세포이다.
특정 구현예에서, 농축된 CD57-세포의 집단 중의 세포 빈도는 나이브-유사 세포이다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 세포가 나이브 및/또는 나이브-유사 세포임을 나타내는 하나 이상의 마커의 발현에 대해 양성인 T 세포이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 T 세포에서 나이브 또는 나이브-유사 상태와 연관이 있는 마커의 발현에 대해 양성인 세포이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 세포가 나이브가 아님 및/또는 나이브-유사 세포가 아님을 나타내는 하나 이상의 마커의 발현에 대해 음성인 T 세포이다. 특정 구현예에서, T 세포내 비-나이브 또는 비-나이브-유사 상태로는, 예를 들어 효과기 T(TEFF) 세포, 기억 T 세포, 중앙 기억T 세포(TCM), 효과기 기억 T(TEM) 세포, 및 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 세포가 나이브 및/또는 나이브-유사 세포이고, 및/또는 T 세포에서 나이브 또는 나이브-유사 상태와 연관이 있음을 나타내는 적어도 하나 이상의 마커의 발현에 대해 양성이다. 일부 구현예에서, 마커는 세포 표면 상에서 발현된다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 세포가 비-나이브 및/또는 비-나이브-유사 세포이고, 및/또는 T 세포에서 비-나이브 또는 비-나이브-유사 상태와 연관이 있음을 나타내는 적어도 하나 이상의 마커의 발현에 대해 음성이다.
T 세포가 나이브 및/또는 나이브-유사 T 세포이고, 및/또는 T 세포에서 나이브 또는 나이브-유사 상태와 연관이 있음을 나타내는 마커로는 CD27, CD28, CD45RA, CD62L, 및/또는 CCR7을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포, 예를 들어 나이브-유사 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 CD27, CD28, CD45RA, 및/또는 CCR7의 발현에 대해 양성이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 CD27, CD28, CD45RA, 및/또는 CCR7 중 하나 이상의 표면 발현에 대해 양성이다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포, 예를 들어 상기 나이브-유사 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 CD62L의 발현에 대해 음성이다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포, 예를 들어 상기 나이브-유사 CD3+ T 세포는 CD62L의 발현에 대해 음성이다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포, 예를 들어 상기 나이브-유사 CD3+, CD4+, 및/또는 CD8+ T 세포는 CD62L의 발현에 대해 음성이다.
세포가 비-나이브 및/또는 비-나이브-유사 T 세포이고, 및/또는 T 세포에서 비-나이브 또는 비-나이브-유사 상태와 연관이 있음을 나타내는 마커로는, CD25, CD45RO, CD56, KLRG1, 및/또는 CD95를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포, 예를 들어 나이브-유사 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 CD25, CD45RO, CD56, 및/또는 KLRG1의 발현에 대해 음성이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포, 예를 들어 나이브-유사 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 비-나이브 또는 비-나이브-유사 세포와 연관된 마커의 낮은 발현을 가진다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포, 예를 들어 나이브-유사 CD3+ T 세포는 CD25, CD45RO, CD56, 및/또는 KLRG1의 발현에 대해 음성이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포, 예를 들어 나이브-유사 CD3+ T 세포는 비-나이브 또는 비-나이브-유사 세포와 연관된 마커의 낮은 발현을 가진다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 CD95의 낮은 발현을 가진다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 CD25, CD45RO, CD56, 및/또는 KLRG1 중 하나 이상의 표면 발현에 대해 음성이다.
일부 구체예에서, 비-나이브 또는 비-나이브-유사 세포와 연관이 있는 마커의 낮은 발현은 비-나이브-유사 세포인 세포내 발현, 및/또는 비-나이브 및/또는 비-나이브-유사 T 세포이고, 및/또는 T 세포에서 비-나이브 또는 비-나이브-유사 상태와 연관이 있음을 나타내는 하나 이상의 마커에 대해 양성인 세포내 발현보다 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 더 적은 발현이거나, 또는 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 비-나이브 또는 비-나이브-유사 세포와 연관이 있는 마커의 낮은 발현은 효과기 T(TEFF) 세포, 기억 T 세포, 중앙 기억T 세포(TCM), 및/또는 효과기 기억 T(TEM) 세포내 마커의 발현보다 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 더 적은 발현이거나, 또는 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포가 비-나이브 및/또는 비-나이브-유사 T 세포이고, 및/또는 T 세포에서 비-나이브 또는 비-나이브-유사 상태와 연관이 있음을 나타내는 마커로는, 하나 이상의 사이토카인을 포함한다. 예를 들어 특정 구현예에서, 비-나이브 또는 비-나이브-유사 T 세포는 IL-2, IFN-γ, IL-4, 및 IL-10 중 하나 이상의 발현 및/또는 제조에 대해 음성이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인이 분비된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은, 예를 들어 분비를 예방, 억제, 또는 감소시키는 시제로 치료하는 동안 또는 이후에 비-나이브-유사 T 세포에 의해 내부적으로 발현된다.
특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포, 예를 들어 나이브-유사 CD57- T 세포는 CD45RA 및 CCR7의 발현, 예를 들어 표면 발현에 대해 양성이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 CD4+ T 세포는 CD45RA 및 CCR7의 발현, 예를 들어 표면 발현에 대해 양성이다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 CD8+ T 세포는 CD45RA 및 CCR7의 발현, 예를 들어 표면 발현에 대해 양성이다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 CD3+ T 세포는 CD45RA 및 CCR7의 발현, 예를 들어 표면 발현에 대해 양성이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 CD45RA, CD27, 및 CCR7의 발현, 예를 들어 표면 발현에 대해 양성이고, CD45RO의 발현, 예를 들어 표면 발현에 대해 음성이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 CD4+ T 세포는 CD45RA, CD27, 및 CCR7의 발현, 예를 들어 표면 발현에 대해 양성이고, CD45RO의 발현, 예를 들어 표면 발현에 대해 음성이다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 CD8+ T 세포는 CD45RA, CD27, 및 CCR7의 발현, 예를 들어 표면 발현에 대해 양성이고, CD45RO의 발현, 예를 들어 표면 발현에 대해 음성이다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 CD3+ T 세포는 CD45RA, CD27, 및 CCR7의 발현, 예를 들어 표면 발현에 대해 양성이고, CD45RO의 발현, 예를 들어 표면 발현에 대해 음성이다.
특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 약, 또는 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50%의 CD25 발현에 양성인 T 세포를 함유한다. 다양한 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 약, 또는 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50%의 CD57-CD25+ T 세포를 함유한다. 다양한 구현예에서, 상기 농축된 CD57- 세포의 집단은 약 10% 내지 60%, 20% 내지 50%, 또는 25% 내지 40%의 CD25+ T 세포(각각의 수치를 포함함)를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 농축된 CD57- 세포의 집단은 약 10% 내지 60%, 20% 내지 50%, 또는 25% 내지 40%의 CD57-CD25+ T 세포(각각의 수치를 포함함)를 함유한다.
특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 약, 또는 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50%의 CD27 발현에 양성인 T 세포를 함유한다. 다양한 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 약, 또는 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50%의 CD57-CD27+ T 세포를 함유한다. 다양한 구현예에서, 상기 농축된 CD57- 세포의 집단은 약 10% 내지 60%, 20% 내지 50%, 또는 25% 내지 40%의 CD27+ T 세포(각각의 수치를 포함함)를 함유한다. 일부 구현예에서, 농축된 CD57- 세포의 집단은 약 10% 내지 60%, 20% 내지 50%, 또는 25% 내지 40%의 CD57-CD27+ T 세포(각각의 수치를 포함함)를 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 적어도 (약) 25%의 CD27+ T 세포를 함유한다.
특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 약, 또는 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50%의 CD28 발현에 양성인 T 세포를 함유한다. 다양한 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 약, 또는 적어도 (약) 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50%의 CD57-CD28+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- 세포의 집단은 약 또는 (약) 5% 내지 (약) 50%, (약) 5% 내지 (약) 35%, 또는 (약) 10% 내지 (약) 25%의 CD27+ T 세포(각각의 수치를 포함함)를 함유한다. 일부 구현예에서, 농축된 CD57- 세포의 집단은 약 또는 (약) 5% 내지 (약) 50%, (약) 5% 내지 (약) 35%, 또는 (약) 10% 내지 (약) 25%의 CD57-CD27+ T 세포(각각의 수치를 포함함)를 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 적어도 (약) 25% CD27+ T 세포를 함유한다.
일부 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 약, 또는 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50%의 CCR7 발현에 양성인 T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 약, 또는 적어도 (약) 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% CD57- CCR7+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 농축된 CD57- 세포의 집단은 약 또는 (약) 5% 내지 (약) 50%, (약) 5% 내지 (약) 35%, 또는 (약) 10% 내지 (약) 25%의 CCR7+T 세포(각각의 수치를 포함함)를 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- 세포의 집단은 약 또는 (약) 5% 내지 (약) 50%, (약) 5% 내지 (약) 35%, 또는 (약) 10% 내지 (약) 25%의 CD57- CCR7+ T 세포(각각의 수치를 포함함)를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 적어도 (약) 25%의 CCR7+ T 세포를 함유한다.
일부 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 약, 또는 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50%의 CD45RA 발현에 양성인 T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 약, 또는 적어도 (약) 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50%의 CD57-CD45RA + T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 농축된 CD57- 세포의 집단은 약 또는 (약) 5% 내지 (약) 50%, (약) 5% 내지 (약) 35%, 또는 (약) 10% 내지 (약) 25%의 CD45RA+ T 세포(각각의 수치를 포함함)를 함유한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57- 세포의 집단은 약 또는 (약) 5% 내지 (약) 50%, (약) 5% 내지 (약) 35%, 또는 (약) 10% 내지 (약) 25%의 CD57-CD45RA + T 세포(각각의 수치를 포함함)를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 적어도 (약) 25%의 CD45RA + T 세포를 함유한다.
일부 구현예에서, 상기 고갈된 집단 중의 나이브-유사 세포의 빈도는 (약) 상기 생물학적 샘플 중의 나이브-유사 세포의 빈도보다 높은 적어도 (약) 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50%이다. 일부 구현예에서, 상기 고갈된 집단 중의 CD25+ T 세포, CD27+ T 세포, CD28+ T 세포, CCR7+ T 세포, 또는 CD45RA+ T 세포 중의 하나 이상의 빈도는 (약) 상기 생물학적 샘플 중의 각각의 세포의 빈도보다 높은 적어도 (약) 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50%이다. 일부 구현예에서, 상기 고갈된 집단은 적어도 (약) 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 또는 40% CD27+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 고갈된 집단은 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 25%, 30%, 35%, 또는 40%의 CD28+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 고갈된 집단은 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%의 CD27+CD28+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 고갈된 집단은 적어도 (약) 70% 또는 80% CD27+CD28+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 고갈된 집단은 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 또는 25% CCR7+ T 세포를 포함한다.
II.
SELECTION OF CD57- T 세포의 선택 및/또는 CD57+ T 세포의 고갈
일부 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 생물학적 샘플로부터 얻어진다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 생물학적 샘플로부터 선택, 단리, 또는 농축된다. 특정 구현예에서, CD57+ T 세포는 생물학적 샘플로부터 제거, 분리, 또는 고갈된다. 특정 구현예에서, 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 99.9%의 CD57+ T 세포는 상기 생물학적 샘플로부터 제거, 분리, 또는 고갈된다.
특정 구현예에서, 세포의 서브세트, 예를 들어 T 세포의 서브세트는 상기 생물학적 샘플로부터 CD57- T 세포를 선택, 단리, 또는 농축하기 전에 상기 생물학적 샘플로부터 선택, 단리, 또는 농축된다. 일부 구현예에서, 세포의 서브세트, 예를 들어 T 세포의 서브세트는 농축된 CD57- T 세포의 집단으로부너 선택, 단리, 또는 농축된다.
일부 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 예를 들어 상기 선택, 단리, 또는 농축 전에, 상기 생물학적 샘플의 CD57+ T 세포의 약, 또는 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0.1%, 0.01%, 또는 0.001% 미만을 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 상기 생물학적 샘플의 CD57+ T 세포의 약, 또는 20% 미만을 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 상기 생물학적 샘플의 CD57+ T 세포의 약, 또는 5% 미만을 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 예를 들어 상기 선택, 단리, 또는 농축 전에, 상기 생물학적 샘플의 CD57+ T 세포의 약, 또는 1% 미만을 함유한다. 다양한 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 상기 생물학적 샘플의 CD57+ T 세포의 약, 또는 0.1% 미만을 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 상기 생물학적 샘플의 CD57+ T 세포의 약, 또는 0.01% 미만을 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 고갈된 집단 중의 상기 CD57+ T 세포의 빈도는 상기 생물학적 샘플의 CD57+ T 세포의 빈도의 (약) 35%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1%, 또는 0.1% 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 고갈된 집단은 (약) 3%, (약) 2%, (약) 1%, (약) 0.1%, 또는 (약) 0.01%의 CD57+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 고갈된 집단은 CD57+ T 세포가 부재하거나 본질적으로 부재한다.
특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단의 세포는 상기 선택, 단리, 또는 농축 전에 상기 생물학적 샘플의 세포보다 덜 분화된다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 상기 생물학적 샘플보다 높은 빈도의 나이브-유사 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57+ T 세포의 집단은 예를 들어 상기 선택, 단리, 또는 농축 전에 상기 생물학적 샘플보다 약, 또는 적어도 (약) 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 또는 10-배 많은 나이브-유사 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 나이브-유사 세포는 나이브 T 세포 또는 중앙 기억 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 세포는 높은 수준의 하나 이상의 표면 마커에 양성이거나 그를 발현하는 세포, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및/또는 CD45RO+ T 세포를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 세포는 CD27+이다. 일부 측면에서, 상기 세포는 CD28+이다. 일부 측면에서, 상기 세포는 CCR7+이다. 특정한 측면에서, CCR7은 나이브 또는 나이브-유사 T 세포(예를 들어 CCR7+CD45RA+ 또는 CCR7+CD27+) 및 중앙 기억 T 세포(CCR7+CD45RA-)에 의해서 발현된다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포 또는 나이브-유사 T 세포 위에 발현된 마커에 대해 표면 양성인 T 세포는 CCR7+CD45RA+이며, 여기서 상기 세포는 CD27+ 또는 CD27-이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포 또는 나이브-유사 T 세포 위에 발현된 마커에 대해 표면 양성인 T 세포는 CD27+CCR7+이며, 여기서 상기 세포는 CD45RA+ 또는 CD45RA-이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포 또는 나이브-유사 T 세포 위에 발현된 마커에 대해 표면 양성인 T 세포는 CD62L-CCR7+이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 세포는 분화의 초기 단계에서 세포(예를 들어 CCR7+CD27+인 세포)를 포함한다.
특정 구현예에서, 중앙 기억 T 세포는 다양한 분화 단계에서 세포를 포함할 수 있으며 특정 세포 마커의 양성 또는 고 발현(예를 들어 표면 발현) 및/또는 다른 세포 마커의 음성 또는 저 발현(예를 들어 표면 발현)에 의해서 특징지워질 수 있다. 일부 측면에서, 덜 분화된 세포, 예를 들어 중앙 기억 세포는 보다 오래 살아남고 덜 신속하게 고갈(exhaust)됨으로써 지속성 및 내구성을 증가시킬 수 있다. 일부 측면에서, 세포 요법제, 예를 들어 CAR-T 세포 요법제에 대한 반응자(responder)는 중앙 기억 유전자의 발현을 증가시켰다[문헌 「Fraietta et al. (2018) Nat Med. 24(5):563-571」 참조]. 일부 측면에서, 중앙 기억 T 세포는 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, 및/또는 CD127의 양성 또는 고 발현에 의해서 특징지워진다. 일부 측면에서, 중앙 기억 T 세포는 CD45RA 및/또는 그란자임 B(granzyme B)의 음성 또는 저 발현에 의해서 특징지워진다. 특정 구현예에서, 중앙 기억 T 세포 또는 중앙 기억 T 세포 위에 발현된 마커에 표면 양성인 T 세포는 CCR7+CD45RA-이다.
특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 예를 들어 상기 선택, 단리, 또는 농축 전에, 상기 생물학적 샘플 보다 약, 또는 적어도 (약) 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 또는 10 배 많은 CD27+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 예를 들어 상기 선택, 단리, 또는 농축 전에, 상기 생물학적 샘플 보다 약, 또는 적어도 (약) 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 또는 10-배 많은 CD28+ T 세포를 포함한다. 다양한 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 예를 들어 상기 선택, 단리, 또는 농축 전에, 상기 생물학적 샘플 보다 약, 또는 적어도 (약) 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 또는 10-배 많은 CD25+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 예를 들어 상기 선택, 단리, 또는 농축 전에, 상기 생물학적 샘플 보다 약, 또는 적어도 (약) 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 또는 10-배 많은 CCR7+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 집단은 예를 들어 상기 선택, 단리, 또는 농축 전에, 상기 생물학적 샘플 보다 약, 또는 적어도 (약) 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 또는 10-배 많은 CD45RA+ 세포를 포함한다.
특정 구현예에서, T 세포, 예를 들어 CD3+ T 세포는 상기 생물학적 샘플로부터 CD57- T 세포를 선택, 단리, 또는 농축하기 전에 상기 생물학적 샘플로우버ㅌ 선택, 단리, 또는 농축된다. 일부 구현예에서, T 세포, 예를 들어 CD3+ T 세포는 농축된 CD57- T 세포의 집단으로부터 선택, 단리, 또는 농축된다. 특정 구현예에서, T 세포, 예를 들어 CD3+ T 세포를 선택, 단리, 또는 농축하는 것은 상기 샘플로부터의 세포의 양성 선택을 포함한다.
일부 구현예에서, CD57+ 세포는 샘플, 세포 조성물, 또는 세포 집단으로부터 선택, 단리, 또는 농축됨으로써, 단리 또는 선택된 CD57+ 세포 및 농축된 CD57- 세포의 집단, 예를 들어 T 세포를 생성한다. 특정 구현예에서, CD57+ 세포는 생물학적 샘플로부터 선택, 단리, 또는 농축됨으로써, 단리 또는 선택된 CD57+ 세포 및 농축된 CD57- 세포의 집단, 예를 들어 T 세포를 생성한다. 특정 구현예에서, CD3+ T 세포는 농축된 CD57- 세포의 집단으로부터 농축, 선택, 또는 단리됨으로써, 농축된 CD57-CD3+ T 세포의 집단 및 농축된 CD57- 세포의 비-선택 집단을 생성한다. 특정 구현예에서, CD3+ T 세포는 농축된 CD57- 세포의 비-선택 집단으로부터 농축, 선택, 또는 단리됨으로써, 농축된 CD57-CD3+ T 세포의 집단을 생성한다. 다양한 구현예에서, CD3+ T 세포는 농축된 CD57- 세포의 집단으로부터 농축, 선택, 또는 단리됨으로써, 농축된 CD57-CD3+ T 세포의 집단 및 농축된 CD57- 세포의 비-선택 집단을 생성하고, 이어서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포는 농축된 CD57- 세포의 비-선택 집단으로부터 농축, 선택, 또는 단리됨으로써, 농축된 CD57-CD4+ T 세포 또는 CD57-CD8+ T 세포의 집단을 생성한다.
특정 구현예에서, T 세포의 서브세트, 예를 들어 CD4+ 또는 CD8+ T 세포는 상기 생물학적 샘플로부터 CD57- T 세포를 선택, 단리, 또는 농축하기 전에 상기 생물학적 샘플로부터 선택, 단리, 또는 농축된다. 일부 구현예에서, T 세포의 서브세트, 예를 들어 CD4+ 또는 CD8+ T 세포는 농축된 CD57- T 세포의 집단으로부터 선택, 단리, 또는 농축된다. 특정 구현예에서, the selecting, isolating or enriching T 세포의 서브세트, 예를 들어 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 선택, 단리 또는 농축은 상기 샘플로부터 세포의 양성 선택을 포함한다.
일부 구현예에서, CD57+ 세포는 샘플, 세포 조성물, 또는 세포 집단으로부터 선택, 단리, 또는 농축됨으로써, 단리 또는 선택된 CD57+ 세포 및 농축된 CD57- 세포의 집단, 예를 들어 T 세포를 생성한다. 특정 구현예에서, CD57+ 세포는 생물학적 샘플로부터 선택, 단리, 또는 농축됨으로써, 단리 또는 선택된 CD57+ 세포 및 농축된 CD57- 세포의 집단, 예를 들어 T 세포를 생성한다. 특정 구현예에서, CD4+ T 세포는 농축된 CD57- 세포의 집단으로부터 농축, 선택, 또는 단리됨으로써, 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단 및 농축된 CD57- 세포의 비-선택 집단을 생성한다. 특정 구현예에서, CD8+ T 세포는 농축된 CD57- 세포의 집단으로부터 농축, 선택, 또는 단리됨으로써, 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 집단 및 농축된 CD57- 세포의 비-선택 집단을 생성한다. 특정 구현예에서, CD8+ T 세포는 농축된 CD57- 세포의 비-선택 집단으로부터 농축, 선택, 또는 단리됨으로써, 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 집단을 생성한다. 특정 구현예에서, CD4+ T 세포는 농축된 CD57- 세포의 비-선택 집단으로부터 농축, 선택, 또는 단리됨으로써, 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단을 생성한다.
특정 구현예에서, CD4+ T 세포는 농축된 CD57- 세포의 집단으로부터 농축, 선택, 또는 단리됨으로써, 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단 및 농축된 CD57- 세포의 비-선택 집단을 생성하고, 이어서 CD8+ T 세포는 농축된 CD57- 세포의 비-선택 집단으로부터 농축, 선택, 또는 단리됨으로써, 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 집단을 생성한다. 다양한 구현예에서, CD4+ T 세포는 농축된 CD57- 세포의 집단으로부터 농축, 선택, 또는 단리됨으로써, 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단 및 CD57- 세포를 농축시킨 비-선택 집단을 생성하고, 이어서 CD8+ T 세포는 농축된 CD57- 세포의 비-선택 집단으로부터 농축, 선택, 또는 단리됨으로써, 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 집단을 생성한다.
특정 구현예에서, (1) CD4+ T 세포는 생물학적 샘플로부터 농축, 선택, 또는 단리됨으로써, 농축된 CD4+ T 세포의 집단 및 CD4- 세포에 대해 농축된 비-선택 집단을 생성하고; (2) CD8+ T 세포는 농축된 CD4- 세포의 비-선택 집단으로부터 농축, 선택, 또는 단리됨으로써, 농축된 CD8+ T 세포의 집단을 생성하며; (3) CD57+ T 세포는 상기 농축된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 집단으로부터 고갈되어, 농축된 CD57-CD4+ 및 CD57-CD8+ T 세포의 집단을 생성한다. 특정 구현예에서, (1) CD8+ T 세포는 생물학적 샘플로부터 농축, 선택, 또는 단리됨으로써, 농축된 CD8+ T 세포의 집단 및 CD8- 세포에 대해 농축된 비-선택 집단을 생성하고; (2) CD4+ T 세포는 농축된 CD4- 세포의 비-선택 집단으로부터 농축, 선택, 또는 단리됨으로써, 농축된 CD4+ T 세포의 집단을 생성하며; (3) CD57+ T 세포는 상기 농축된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 집단으로부터 고갈되어, 농축된 CD57-CD4+ 및 CD57-CD8+ T 세포의 집단을 생성한다.
특정 구현예에서, CD4+ T 세포는 생물학적 샘플로부터 농축, 선택, 또는 단리됨으로써, CD4+ T 세포의 농축된 집단을 생성하고, 이어서 CD57+ 세포는 CD4+ T 세포의 농축된 집단으로부터 제거됨으로써, 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단을 생성한다. 특정 구현예에서, CD8+ T 세포는 생물학적 샘플로부터 농축, 선택, 또는 단리됨으로써, CD8+ T 세포의 농축된 집단을 생성하고, 이어서 CD57+ 세포는 CD8+ T 세포의 농축된 집단으로부터 제거됨으로써, 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 집단을 생성한다.
일부 구현예에서, 농축된 CD57- T 세포의 하나 이상의 집단은 분리, 선택 및/또는 농축 후 동결, 예를 들어 동결 보존(cryopreserved) 및/또는 동결 방지(cryoprotected)된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단은 분리, 선택 및/또는 농축 후 동결, 예를 들어 동결 보존 및/또는 동결 방지된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 집단은 분리, 선택 및/또는 농축 후 동결, 예를 들어 동결 보존 및/또는 동결 방지된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD3+ T 세포의 집단은 분리, 선택 및/또는 농축 후에 동결, 예를 들어 동결 보존 및/또는 동결 방지된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 하나 이상의 집단은 인큐베이션, 활성화, 자극, 조작, 형질도입, 형질감염, 배양, 증폭, 수확, 및/또는 제형화하는 단계 전에 동결, 예를 들어 동결 보존 및/또는 동결 방지된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단은 상기 세포의 조성물을 인큐베이션, 활성화, 자극, 조작, 형질도입, 형질감염, 배양, 증폭, 수확, 및/또는 제형화하는 단계 전에 동결, 예를 들어 동결 보존 및/또는 동결 방지된다. 일부 구현예에서, 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 집단은 상기 세포의 집단을 인큐베이션, 활성화, 자극, 조작, 형질도입, 형질감염, 배양, 증폭, 수확, 및/또는 제형화하는 단계 전에 동결, 예를 들어 동결 보존 및/또는 동결 방지된다. 일부 구현예에서, 농축된 CD57-CD3+ T 세포의 집단은 상기 세포의 집단을 인큐베이션, 활성화, 자극, 조작, 형질도입, 형질감염, 배양, 증폭, 수확, 및/또는 제형화하는 단계 전에 동결, 예를 들어 동결 보존 및/또는 동결 방지된다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 동결 방지된 입력 조성물은 예를 들어 약 -80℃에서 12시간 내지 7일, 24시간 내지 120시간, 또는 2일 내지 5일동안 저장된다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 동결 방지된 입력 조성물은 예를 들어 약 -80℃에서 10일, 9일, 8일, 7일, 6일, 또는 5일, 4일, 3일, 2일, 또는 1일 미만의 시간동안 저장된다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 동결 방지된 입력 조성물은 예를 들어 (약) -70℃ 또는 -80℃에서 3일 미만, 예를 들어 약 2일동안 저장된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 특정한 세포 유형 또는 세포 집단을 언급할때 "고갈" 또는 "제거"는 예를 들어 조성물 중의 세포의 총수 또는 그 부피와 비교하여, 또는 다른 세포 유형과 상대적으로, 예를 들어 그 집단 또는 세포에 의해서 발현된 마커에 기반한 음성 선택에 의해서, 또는 고갈되는 세포 집단 또는 세포 상에 존재하지 않는 마커에 기반한 양성 선택에 의해서 세포 유형 또는 집단의 수 또는 백분율이 감소하는 것을 의미한다. 일반적으로, 상기 용어 "고갈" 또는 "제거"는 상기 조성물로부터 세포, 세포 유형, 또는 집단의 완전한 제거를 요구하지는 않는다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 특정 세포 타입 또는 세포 집단을 언급할 때, "농축"은, 집단 또는 세포에 의해 발현된 마커에 기반한 양성 선택에 의한, 또는 결핍될 세포 집단 또는 세포 상에 존재하지 않는 마커에 기반한 음성 선택에 의한 것과 같은, 예컨대, 조성물 내 총 세포의 수 또는 부피와 비교하여 또는 다른 세포 타입에 대하여, 세포 타입 또는 집단의 수 또는 퍼센트를 증가시키는 것을 가리킨다. 일반적으로, 상기 용어 '농축'은 조성물로부터 다른 세포, 세포 타입, 또는 집단의 완전한 제거를 요구하지 않으며, 그렇게 농축된 세포가 농축된 조성물에서 100% 또는 심지어 100 % 근처에 존재할 것을 요구하지 않는다.
일부 측면에서, 대상체, 예를 들어 인간 대상체로부터 세포 요법제, 예를 들어 입양 세포 요법제용으로 얻어진 세포 집단 또는 세포 조성물은, 치료학적 조성물을 생성하기 위한 세포를 수확하기 위한 임계치(예를 들어 수확 기준)에 도달하지 않도록(예를 들어 성장 없음), 또는 특정 기간 내에 치료학적 조성물을 생성하기 위해(예를 들어 느린 성장) 세포를 수확하기 위한 임계치(예를 들어 수확 기준)에 도달하지 않도록 낮은 성장 또는 느린 성장을 나타낼 수 있다. 일부 측면에서, 상기 세포 집단의 일부는 높은 빈도의 CD57+, 예를 들어 임계치 초과의 빈도의 CD57+을 함유할 수 있다. 다른 측면에서, 대상체, 예를 들어 인간 대상체로부터 세포 요법제, 예를 들어 입양 세포 요법제용으로 얻어진 세포 집단 또는 세포 조성물은 무성장 또는 느린 성장을 나타내는 집단에 비해 개선된 성장을 나타낼 수 있다. 일부 측면에서, 상기 세포 집단 또는 세포 조성물은 낮은 빈도의 CD57+ 세포, 예를 들어 임계값보다 낮은 빈도의 CD57+ 세포를 함유할 수 있다. 일부 측면에서, 개선된 성장을 나타내는 세포 집단 또는 세포 조성물은 나이브-유사 또는 중앙 기억-유사 표현형, 예를 들어 CD27+, CD28+ 및/또는 CCR7+과 관련된 표현형을 나타내거나 또는 마커를 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 제공된 방법은 인간 대상체로부터의 생물학적 샘플(예를 들어 백혈구 성분 채집술 또는 성분 채집술 샘플) 중의 T 세포 중의 CD57+ T 세포 발현에서 가변성 또는 이질성이 존재한다는 관측에 기반하고 있으며, 이것은 일부 측면에서 동일한 제조 공정을 사용하는 경우에도 복수의 상이한 대상체로부터 입양 세포 요법제에 사용하기 위해 생산된 조작된 T 세포 조성물의 표현형 및 기능에 있어서 가변성을 초래할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 제공된 방법은 생물학적 샘플로부터 CD57- T 세포를 선택, 단리, 또는 농축함으로써, 예를 들어 상기 생물학적 샘플로부터 CD57- T 세포를 제거, 분리, 또는 고갈시킴으로써 상기 가변성을 제어하거나 또는 감소시킨다. 이어서 그러한 세포는 제품간의 가변성을 최소화하기 위해서 세포 요법제용 세포를 조작 또는 제조하는 공정에 사용될 수 있으며, 또한 대상체에게 투여시 증폭 및 지속되는 능력과 같은 특정 제품 속성 및 특징을 개선시킨다.
A. 샘플 및 세포 준비
특정 구현예에서, 제공된 방법은 농축된 세포, 예를 들어 CD57- T 세포의 하나 이상의 집단을 생성하기 위해서 생물학적 샘플로부터 세포를 분리, 선택, 또는 농축하는 것과 관련하여 사용된다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 생물학적 샘플로부터의 세포 또는 그의 집단의 분리, 예를 들어 대상체, 예를 들어 특정 질환 또는 병태를 갖거나 또는 세포 요법을 필요로 하거나 또는 세포 요법제가 투여될 대상으로부터 얻어지거나 또는 그로부터 유래된 것을 포함한다. 일부 측면에서, 대상체는 사람, 예를 들어 특정 치료적 개입, 예를 들어 세포가 분리되고, 가공되고/되거나 조작되는 입양 세포 요법을 필요로 하는 환자인 대상체이다. 따라서, 일부 구현예에서, 세포는 1차 세포, 예를 들어 1차 인간 세포이다. 샘플은 조직, 유액 및 대상체로부터 직접 취한 다른 샘플을 포함한다. 생물학적 샘플은 생물학적 공급원으로부터 직접 얻은 샘플 또는 가공된 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은 체액, 예를 들어 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 활액, 소변 및 땀, 조직 및 기관 샘플, 예를 들어 이들로부터 유래한 가공된 샘플을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
일부 측면에서, 샘플은 혈액 또는 혈액-유래 샘플이거나, 또는 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술 산물로부터 유래된 것이다. 예시적인 샘플은 전혈, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 백혈구, 골수, 흉선, 조직 생검, 종양, 백혈병, 림프종, 림프절, 장 관련 림프 조직, 점막 관련 림프 조직, 비장, 기타 림프 조직, 간, 폐, 위장, 소장, 대장, 신장, 췌장, 유방, 뼈, 전립선, 자궁 경부, 고환, 난소, 편도선 또는 기타 기관, 및/또는 이들로부터 유래되는 세포를 포함한다. 샘플은 세포 요법과 관련하여, 예를 들어 입양 세포 요법, 자가 및 동종 원으로부터의 샘플을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 샘플은 전혈 샘플, 버피 코트 샘플, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 샘플, 미분획 T 세포 샘플(unfractionated T cell sample), 림프구 샘플, 백혈구 샘플, 채혈 제품 또는 백혈구 채취 제품이거나 또는 이들을 포함한다.
일부 구체예에서, 대상체의 순환 혈액으로부터의 세포는 예를 들어 성분채집술(apheresis) 또는 백혈구성분채집술(leukapheresis)에 의해 수득된다. 일부 측면에서, 상기 샘플은 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 핵 형성 백혈구, 적혈구 및/또는 혈소판을 비롯한 림프구를 포함하고, 일부 측면에서 적혈구 및 혈소판 이외의 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체로부터 수집된 혈액 세포는, 예를 들어 혈장 분획을 제거하기 위하여, 후속 처리 단계를 위해 적절한 완충제 또는 배지에 세포를 위치시키기 위하여, 세척된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척된다. 일부 구현예에서, 상기 세척 용액은 칼슘 및/또는 마그네슘 및/또는 많은 또는 모든 2가 양이온이 부족하다. 일부 측면에서, 세척 단계는 제조자의 지시에 따라 반자동 "흐름-통과(flow-through)"원심 분리기 (예를 들어 Cobe 2991 세포 처리기, Baxter)에 의해 수행된다. 일부 측면에서, 세척 단계는 제조자의 지시에 따라 접선 유동 여과(TFF)에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 세척 후, 다양한 생체 적합성 완충제, 예를 들어 Ca++/ Mg++ 프리 PBS에서 재현탁된다. 특정 구현예에서, 혈액 세포 샘플의 성분이 제거되고 세포는 배양 배지에 직접 재현탁된다.
일부 구현예에서, 세포를 함유하는 상기 샘플(예를 들어 성분 채집 생성물 또는 백혈구 성분 제품)은 성분채집 또는 백혈구 감소 도중에 부가된 하나 이상의 항-응고제, 예를 들어 헤파린을 제거하기 위해서 세척된다.
일부 구현예에서, 세포를 함유하는 상기 샘플(예를 들어 전혈 샘플, 버피 코트 샘플, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 샘플, 비분획 T 세포 샘플, 림프구 샘플, 백혈구 샘플, 성분 채집 생성물 또는 백혈구 생성 제품)은 동결 보존되고/되거나 동결 방지(예를 들어 동결)된 후, 상기 세포의 집단을 분리, 선택, 활성화, 자극, 조작, 형질도입, 형질감염, 인큐베이션, 배양, 수확, 제형화하고/하거나 상기 제형화된 세포 집단을 대상체에 투여하는 임의의 단계 이전에 해동되고 선택적으로 세척된다.
일부 구현예에서, 대상체의 자가 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 함유한 샘플은 제조에 적절한 품질을 보장하는 적합한 방법으로 수집된다. 한 측면에서, PBMC를 함유한 샘플은 분획화된 전혈에서 유래된다. 일부 구현예에서, 대상체의 전혈은, 자가 단핵 세포(mononuclear cell, MNC)가 우선적으로 농축된 반면, 다른 세포 표현형, 예를 들어 적혈구가 수집된 세포 조성물에서 감소된 경우, 세포 표현형 사이의 밀도 차를 이용하고 원심력을 이용하여 백혈구 성분 채집술에 의해 분획화된다. 일부 구현예에서, 자가 혈장은 MNC 수집 중 동시에 수집되며, 이는 일부 측면에서 연장된 백혈구 성분 채집술 생성물의 안정성을 허용할 수 있다. 한 측면에서, 자가 혈장은 백혈구 성분 채집술 생성물에 첨가되어 백혈구 성분 채집술 생성물 매트릭스의 완충 용량을 개선한다. 일부 측면에서, 백혈구 성분 채집술 생성물을 생성하기 위해 프로세싱된 전혈의 총 부피는 (약) 2L, 4L, 6L, 8L, 10L, 12L, 14L, 16L, 18L 또는 20L이거나 상기 중 임의의 사이의 임의의 값이다. 일부 구현예에서, 수집된 자가 혈장의 부피는 (약) 10mL, 50mL, 100mL, 150mL, 200mL, 250mL 또는 300mL 이상이거나 상기 중 임의의 사이의 부피이다. 일부 구현예에서, 백혈구 성분 채집술 생성물은, 백혈구 성분 채집술 수집 완료 후 약 48 시간 이내에 공정 내 동결 보존을 위한 절차, 예를 들어 세척 및 제형화를 거친다. 일부 구현예에서, 백혈구 성분 채집술 생성물은, 예를 들어 백혈구 성분 채집술 수집 완료 후 약 2 시간, 6 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간 또는 48 시간 이내에 하나 이상의 세척 단계를 거친다. 일부 측면에서, 하나 이상의 세척 단계는 백혈구 성분 채집술 수집 중 항응고제, 백혈구 성분 채집술 생성물에 축적되었을 수 있는 세포 폐기물, 잔여 혈소판 및/또는 세포의 잔해를 제거한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 완충제 교환은 하나 이상의 세척 단계 중 수행된다.
특정 구현예에서, 성분 채집 생성물 또는 백혈구 생성 제품은 동결 보존되고/되거나 동결 방지된(예를 들어 동결된) 후, 하기 기술한 바와 같이 세포 농축, 선택 또는 분리 단계(예를 들어 T 세포 선택 또는 분리 단계)에 적용하기 전에 해동시킨다. 일부 구현예에서, 동결 보존되고/되거나 동결 방지된 성분 채집 생성물 또는 백혈구 생성 제품은 T 세포 선택 또는 분리 단계에 적용한 후에는, 상기 세포의 집단을 분리, 선택, 활성화, 자극, 조작, 형질도입, 형질감염, 인큐베이션, 배양, 수확, 제형화하고/하거나 상기 제형화된 세포 집단을 대상체에 투여하는 단계들과 같은 후속 단계들 도중 또는 그 사이에 추가의 동결 보존 및/또는 동결 방지 단계가 수행되지 않는다. 예를 들어 해동된 동결 보존되고/되거나 동결 방지된 성분 채집 생성물 또는 백혈구 생성 제품은 다운스트림 공정동안, 예를 들어 T 세포 활성화/자극 또는 형질도입 공정동안 해동되고 선택적으로 세척되기 전에 재차 동결 보존되고/되거나 동결 방지되지 않는다. ×
특정 구현예에서, 성분 채집술 생성물 또는 백혈구 성분 채집술 생성물은, 동결 보존 용액 또는 완충제에서 (약) 5×106 세포/mL, 10×106 세포/mL, 20×106 세포/mL, 30×106 세포/mL, 40×106 세포/mL, 50×106 세포/mL, 60×106 세포/mL, 70×106 세포/mL, 80×106 세포/mL, 90×106 세포/mL, 100×106 세포/mL, 110×106 세포/mL, 120×106 세포/mL, 130×106 세포/mL, 140×106 세포/mL 또는 150×106 세포/mL 또는 5×106 세포/mL, 10×106 세포/mL, 20×106 세포/mL, 30×106 세포/mL, 40×106 세포/mL, 50×106 세포/mL, 60×106 세포/mL, 70×106 세포/mL, 80×106 세포/mL, 90×106 세포/mL, 100×106 세포/mL, 110×106 세포/mL, 120×106 세포/mL, 130×106 세포/mL, 140×106 세포/mL 또는 150×106 세포/mL 이상 또는 상기 중 임의의 사이의 임의의 값의 밀도로 동결 보존되고/거나 동결 방지(예를 들어 냉동)된다. 일부 구현예에서, 동결 보존 용액 또는 완충제는, 예를 들어 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA) 또는 기타 적합한 세포 동결 배지를 선택적으로 포함하는 DMSO 용액이거나 상기를 함유한다.
특정 구현예에서, 상기 동결 보존되고/되거나 동결 방지된 성분 채집 생성물 또는 백혈구 생성 제품은 뱅킹(banking)되고(예를 들어 상기 샘플을 동결하기 전에 T 세포 선택 없이), 이것은 일부 측면에서 후속 제조 단계들에 보다 유연성을 허용할 수 있다. 일부 측면에서, 동결 보존되고/거나 동결 방지된 성분 채집술 생성물 또는 백혈구 성분 채집술 생성물은 백(bag)과 같은 다중 동결 보존 컨테이너로 분취되며, 이는 각각 상기 생성물의 프로세싱에 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어 성분 채집술 생성물 또는 백혈구 성분 채집술 생성물의 생존 가능한 총 세포수가 15×109개 미만의 세포인 경우, 상기 동결 보존되고/거나 동결 방지된 성분 채집술 생성물 또는 백혈구 성분 채집술 생성물은 4개의 동결 보존 컨테이너, 예를 들어 백으로 분취된다. 일부 구현예에서, 성분 채집술 생성물 또는 백혈구 성분 채집술 생성물의 생존 가능한 총 세포수가 15-30×109개의 세포인 경우, 상기 동결 보존되고/거나 동결 방지된 성분 채집술 생성물 또는 백혈구 성분 채집술 생성물은 8개의 동결 보존 컨테이너, 예를 들어 백으로 분취된다.
한 측면에서, 선택 전에 세포를 뱅킹하는 것은 다운스트림 공정에 대한 세포수율을 증가시키고, 세포를 조기에 뱅킹하는 것은 그것들이 보다 건강하다는 것을 의미할 수 있으며 제조 성공 기준을 보다 용이하게 충족시킬 수 있다. 또 다른 측면에서, 일단 해동되면, 상기 동결 보존되고/되거나 동결 방지된 성분 채집 생성물 또는 백혈구 생성 제품은 하나 이상의 상이한 선택법에 적용시킬 수 있다. 이러한 접근법의 이점은 다른 것들 중에서 예를 들어 상기 샘플의 공여자 및/또는 또다른 수용자에서와 같은 대상체의 질환 또는 병태에 대한 세포 요법제의 세포의 이용률, 효능, 및/또는 다른 측면을 향상시키는 것이다.
일부 구현예에서, 상기 샘플(예를 들어 성분 채집 또는 백혈구 생성 샘플)은, 상기 공여자가 질환 또는 병태를 갖는 것으로 진단된 후의 시점에서 사전 세포 선택 없이 (예를 들어 크로마토그래피에 의한 선택과 같은 사전 T 세포 선택 없이) 수집되고 동결 보존되고/되거나 동결 방지된다. 일부 측면에서, 동결 보존의 시기는 또한 상기 공여자가 상기 질환 또는 병태에 대한 임의의 초기 치료, 상기 질환 또는 병태에 대한 치료를 위해 표지된 처치, 방사선 및/또는 화학요법 이외의 임의의 치료 중의 하나 이상을 받기 전이다. 일부 구현예에서, 상기 샘플은 질환의 초기 치료 후 질환의 최초 재발 후, 및 상기 공여자 또는 대상체가 상기 질환에 대한 후속 치료를 받기 전에 수집된다. 상기 초기 및/또는 후속 치료는 세포 요법과는 다른 요법일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 수집된 세포는 초기 및/또는 후속 치료 후 세포 요법에 사용될 수 있다. 한 측면에서, 사전 세포 선택이 없는 상기 동결 보존되고/되거나 동결 방지된 샘플은 예를 들어 크로스오버(crossover)할 수 있고 나중에 치료를 요구할 수 있는 무작위 클리닉 시험에서 비-치료 환자들과 관련된 것과 같은 선불 비용(up-front costs)을 줄이는데 도움이 될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 샘플(예를 들어 성분 채집 또는 백혈구 생성 샘플)은, 상기 질환 치료의 제 2 라인 후의 질환의 제 2 재발 후 및 상기 공여자 또는 대상체가 상기 질환에 대한 후속 치료를 받기 전의 시점에서 사전 세포 선택 없이 (예를 들어 크로마토그래피에 의한 선택과 같은 사전 T 세포 선택 없이) 수집되고 동결 보존되고/되거나 동결 방지된다. 일부 구현예에서, 환자들은 예를 들어 특정 위험 인자들을 분석함으로써 제 2 라인의 치료 후에 재발할 가능성이 높은 것으로 식별된다. 일부 구현예에서, 상기 위험 인자들은 질환 유형 및/또는 유전학, 예를 들어 더블-히트 림프종(double-hit lymphoma), 1차 불응성 암 또는 활성화된 B-세포 림프종에 기반한다. 일부 구현예에서, 상기 위험 인자들은 임상적 표현, 예를 들어 제 1 라인 치료 후 조기 재발, 또는 치료후 기타 불량한 예후 지표(예를 들어 IPI(International Prognostic Index) > 2)에 기반한다.
일부 구현예에서, 상기 샘플(예를 들어 성분 채집 또는 백혈구 생성 샘플)은, 상기 공여자 또는 대상체가 질환으로 진단 받기 전의 시점에서 사전 세포 선택 없이 (예를 들어 크로마토그래피에 의한 선택과 같은 사전 T 세포 선택 없이) 수집되고 동결 보존되고/되거나 동결 방지된다. 일부 측면에서, 상기 공여자 또는 대상체는 건강한 대상체일 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 공여자 또는 대상체는 생후 말기 단계에서 세포 요법이 필요한 경우에 질환을 일으키거나 질환으로 진단 받을 위험이 없는 세포를 뱅킹 또는 저장하도록 선택할 수 있다. 일부 경우에, 공여자 또는 대상체는 유전적 변이, 유전적 이상, 유전적 혼란, 가족력, 단백질 이상(예를 들어 단백질 생산 및/또는 가공 결함)과 같은 인자들, 및 질환을 일으킬 수 있는 라이프스타일 선택에 기초하여 질환을 일으킬 위험이 있는 것으로 간주될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 예방적으로 수집된다.
일부 구현예에서, 세포의 상기 동결 보존되고/되거나 동결 방지된 샘플(예를 들어 성분 채집 또는 백혈구 생성 샘플), 예를 들어 사전 세포 선택에 적용되지 않은(예를 들어 크로마토그래피에 의한 선택과 같은 사전 T 세포 선택 없는) 세포의 샘플은 12시간, 24시간, 36시간, 또는 48시간, 또는 그 초과의 기간, 또는 0.5일, 1일, 1.5일, 또는 2일, 또는 그 초과의 기간동안 저장되거나 뱅킹된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플은 1주, 2주, 3주, 또는 4주 또는 그 초과의 기간동안 저장되거나 뱅킹된다. 일부 샘플은 장기간 저장 또는 장기간 뱅킹으로 배치된다. 일부 측면에서, 상기 샘플은 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 11년, 12년, 13년, 14년, 15년, 16년, 17년, 18년, 19년, 20년, 25년, 30년, 35년, 40년, 또는 그 초과의 기간동안 저장된다.
일부 구현예에서, 공여자로부터 채취한 성분 채집 또는 백혈구 생성 샘플은 냉각된 환경에서 저장 또는 처리 시설로 운송되고/되거나, 저장 시설에서 극저온 저장되거나 처리 시설에서 처리된다. 일부 구현예에서, 운송하기 전에, 상기 샘플은 예를 들어 T 세포, 예를 들어 CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, 및/또는 CD8+ T 세포를 선택함으로써 처리된다. 일부 구현예에서, 상기 처리는 운송 후 및 상기 샘플을 극저온 저장 전에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 처리는 극저온 저장 후 상기 샘플을 해동시키기 전에 수행된다.
상기 공여자, 및 따라서 그들의 세포가 질환에 대한 광범위한 치료를 받지 않을 때 및/또는 질환 또는 병태를 발생시키거나 그의 진단을 받기 전의 단계에서 공여자가 그들의 세포를 저장하게 함으로써, 상기 세포는 1회 또는 복수회의 라운드의 치료 후에 수확된 세포와 비교하여 세포 요법에 사용하기 위한 특정 이점을 가질 수 있다. 예를 들어 1회 또는 그 이상의 라운드의 치료 전에 수확된 세포는 보다 높은 수준의 특정 세포 활성을 나타내고, 보다 신속하게 성장하고/하거나 수회의 라운드의 치료를 받은 세포 보다 유전자 조작에 더 수용적일 수 있다. 본원에서 기술된 구현예에 따르는 이점의 또다른 예는 편의성을 포함할 수 있다. 예를 들어 세포 요법에 필요로 하기 전에 공여자의 세포를 수집함으로써, 선택적으로 처리함으로써, 그리고 저장함으로써 상기 세포는 수용자가 나중에 그것들을 필요로 하는 경우 및 필요로 할 때 신속하게 이용할 수 있게 된다. 이것은 성분 채집 실험실 용량을 증가시켜서, 기술자에게 성분 채집 수고 공정을 계획하는데 보다 큰 유연성을 제공한다.
샘플로부터의 세포의 극저온 저장 및 처리를 위한 예시적 방법 및 시스템, 예를 들어 성분 채집 샘플은 국제공개공보 제WO2018/170188호에 기술된 것들을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법 및 시스템은 환자가 세포 요법을 필요로 하기 전에 성분 채집 샘플을 수집한 다음, 재조합 수용체(예를 들어 CAR)로 상기 세포, 예를 들어 T 세포를 조작하는 공정에서 나중에 사용하기 위해 상기 성분 채집 샘플을 동결 보존에 적용시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, 상기 공정은 본원에서 기술된 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 성분 채집 샘플은 대상체로부터 수집되고, 세포들의 집단의 후속 T 세포 선택, 활성화, 자극, 조작, 형질도입, 형질감염, 인큐베이션, 배양, 수확, 제형화, 및/또는 대상체에 제형화된 세포 집단의 투여 이전에 저온 보관된다. 이러한 구체예에서, 동결 보존된 성분 채집 샘플은 상기 샘플을 하나 이상의 선택 단계, 예를 들어 본원에 기술된 임의의 것에 적용시키기 전에 해동된다.
일부 구현예에서, 세포들의 동결 보존되고/되거나 동결 방지된 샘플(예를 들어 성분 채집 또는 백혈구 생성 샘플), 예를 들어 사전 세포 선택에 적용되지 않은(예를 들어 크로마토그래피에 의한 선택과 같은 사전 T 세포 선택 없는) 세포의 샘플은 세포 요법을 위한 세포 집단, 예를 들어 CAR+ T 세포를 함유하는 T 세포 집단의 제조를 위한 다운스트림 공정에 사용하기 전에 해동된다. 일부 구현예에서, 그와 같은 세포들의 동결 보존되고/되거나 동결 방지된 샘플(예를 들어 성분 채집 또는 백혈구 생성 샘플)은, 조작된 T 세포 요법, 예를 들어 CAR+ T 세포 요법을 위해 본원에서 제공된 방법과 관련하여 사용된다. 특정 구체예에서, 상기 수확/제형화 단계들 이전 또는 도중에 추가의 동결 보존 단계는 수행되지 않는다.
일부 구현예에서, 동결 보존되고/거나 동결 방지된 성분 채집술 생성물 또는 백혈구 성분 채집술 생성물이 해동된다. 일부 구현예에서, 해동된 세포 조성물은, 일부 경우에 원치 않거나 바람직하지 않은 성분을 제거 또는 감소시킬 수 있는 희석(예를 들어 무혈청 배지 이용) 및/또는 세척(예를 들어 무혈청 배지 이용)의 대상이 된다. 일부 경우에, 희석 및/또는 세척은, 그렇지 않으면 연장된 실온 노출 시 세포의 생존 능력, 수율, 회수에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 해동 샘플에 함유된 동결 방지제, 예를 들어 DMSO의 존재를 제거하거나 감소시킨다. 일부 구현예에서, 희석 및/또는 세척은, 무혈청 배지, 예를 들어 국제출원 PCT/US2018/064627에 기재된 것으로 해동된 동결 보존 생성물의 배지 교환을 가능하게 하며, 상기 국제출원은 본원에서 참조로 인용된다.
일부 구현예에서, 무혈청 배지는 하나 이상의 보충물로 보충된 기본 배지(예를 들어 OpTmizer™ T-세포 증폭 기본 배지(ThermoFisher))를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 보충물는 무혈청이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는, 예를 들어 추가 보충물(예를 들어 OpTmizer™ T-세포 증폭 보충물(ThermoFisher))에 의해 제공되는 세포의 유지, 증폭 및/또는 활성화를 위한 하나 이상의 추가 성분으로 보충된 기본 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 혈청 대체 보충물, 예를 들어 면역 세포 혈청 대체제, 예를 들어 ThermoFisher, #A2596101, CTS™ 면역 세포 혈청 대체제 또는 문헌[Smith et al. Clin Transl Immunology. 2015 Jan; 4(1): e31]에 기재된 면역 세포 혈청 대체제를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 유리 형태의 아미노산, 예를 들어 L-글루타민을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 디펩티드 형태의 L-글루타민(예를 들어 L-알라닐-L-글루타민), 예를 들어 Glutamax™(ThermoFisher)의 디펩티드를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 하나 이상의 재조합 사이토카인, 예를 들어 재조합 인간 IL-2, 재조합 인간 IL-7 및/또는 재조합 인간 IL-15를 더 포함한다.
B.
T 세포 선택
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 CD57+ 또는 CD57- 세포(예를 들어 CD57+ T 세포)의 선택, 분리, 또는 농축(enrichment)는 하나 이상의 제조 및/또는 비친화성 기반 세포 분리 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 예를 들어 원치 않는 성분을 제거하고, 원하는 성분을 농축하고, 특정 시약에 민감한 세포를 용해 또는 제거하기 위해, 하나 이상의 시약의 존재 하에 세포를 세척, 원심 분리 및/또는 인큐베이션한다. 일부 구현예에서, 세포는 밀도, 부착 특성, 크기, 감도 및/또는 특정 성분에 대한 내성과 같은 하나 이상의 특성에 기초하여 분리된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 밀도 기반 세포 분리 방법, 예를 들어 적혈구를 용해시켜 말초혈로부터 백혈구를 준비하는 것과 퍼콜(Percoll) 또는 피콜(Ficoll) 구배를 통한 원심 분리를 포함한다. 특정 구현예에서, 선택, 단리, 및 농축을 위한 방법, 기술, 및 시약은 예를 들어 국제공개공보 제WO2013/124474호 및 제WO2015/164675호에 기술되어 있으며, 상기 공보는 그 전체가 본원에서 참조로 인용된다.
특정 구현예에서, CD57- 세포는 하나 이상의 선택 단계를 포함하는 공정 또는 과정에서 단리, 농축, 또는 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 단계는 음성 선택이거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, CD57- 세포는 CD57+ 세포의 분리 또는 제거에 의해서 단리, 농축, 또는 선택된다. 특정 구현예에서, CD57- 세포에 대해 농축된 세포 집단은 상기 집단으로부터의 CD57+ 세포의 음성 선택으로부터 결과한다.
특정 구현예에서, CD57+ 세포를 고밀도 세포 또는 비드에 연결하는 2가 항체. 이러한 기술은 적혈 세포(예를 들어 RosetteSepTM STEMCELL Technologies), 또는 표적 세포로, 예를 들어 CD57+ T 세포를 제거를 위한 밀도 구배에 커플링하는 임의의 다른 유사하거나 적합한 기술에서 가장 유망하게 사용되어 왔다.
일부 구현예에서, 선택 단계의 적어도 일부는, 선택 시약과 함께 세포를 인큐베이션하는 것을 포함한다. 예를 들어 선택 방법의 일부로서, 선택 시약 또는 시약과의 인큐베이션은 하나 이상의 특정 분자, 예를 들어 표면 단백질, 세포내 마커 또는 핵산과 같은 표면 마커의 표현 또는 존재에 기초한, 하나 이상의 상이한 세포 유형의 선택을 위해 하나 이상의 선택 시약을 사용하여 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 표면 단백질은 CD57, CD4, 또는 CD8를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 표면 단백질은 CD3를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 선택 시약 또는 시약을 사용하는 임의의 공지된 방법이 이러한 마커에 기초한 분리를 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 선택 시약 또는 시약들은 친화성 또는 면역 친화성-기반 분리인 분리를 초래한다. 예를 들어 상기 선택은 일부 측면에서, 하나 이상의 마커, 전형적으로 세포 표면 마커, 예를 들어 항체 또는 이러한 마커에 특이적으로 결합하는 결합 파트너와의 인큐베이션에 의한 세포의 발현 또는 발현 수준에 기초하여 세포 및 세포 집단의 분리를 위한 시약 또는 시약과의 인큐베이션을 포함하고, 이어서 일반적으로 항체 또는 결합 파트너에 결합하지 않은 세포로부터 항체 또는 결합 파트너에 결합된 세포의 세척 단계 및 분리가 이어진다. 일부 구현예에서, 세포의 분리를 위한 상기 시약(들)은 CD4, CD8, 또는 CD57에 결합하거나 또는 그들을 인식하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 분리를 위한 상기 시약(들)은 CD3에 결합하거나 또는 그들을 인식하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이거나 또는 그를 포함한다.
이러한 공정의 일부 측면에서, 다량의 세포를 원하는 양의 친화성-기반 선택 시약과 혼합한다. 면역 친화성-기반 선택은 분리되는 세포와 세포상의 마커에 특이적으로 결합하는 분자, 예를 들어 항체 또는 고체 표면의 다른 결합 파트너, 예를 들어 입자, 사이에 유리한 에너지 상호 작용을 야기하는 임의의 시스템 또는 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 비드, 예를 들어 세포의 마커에 특이적인 선택 작용제(예를 들어 항체)로 코팅된 자기 비드와 같은 입자를 사용하여 수행된다. 상기 입자(예를 들어 비드)는 에너지가 요구되는 상호작용의 촉진을 돕기 위해 일정한 세포 밀도 대 입자(예를 들어 비드)비로 흔들거나 혼합하면서 튜브 또는 백과 같은 용기에서 세포와 인큐베이션 또는 혼합될 수 있다. 다른 경우에, 상기 방법은 선택의 전부 또는 일부가 원심 챔버의 내부 공동(cavity)에서, 예를 들어 원심 회전 하에, 수행되는 세포의 선택을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 친화성-기반 선택 시약과 같은 선택 시약과 함께하는 세포의 인큐베이션은 원심 챔버에서 수행된다. 특정 구현예에서, 분리(isolation, separation)는 국제공개공보 제WO2009/072003호 또는 미국출원공개공보 제US20110003380 A1호에 기재된 시스템, 장비(device) 또는 장치(apparatus)를 사용하여 수행된다. 일 구현예에서, 상기 시스템은 국제공개공보 제WO2016/073602호에 기술된 시스템이다.
일부 구현예에서, 원심 분리 챔버의 공동에서 이러한 선택 단계 또는 그의 일부(예를 들어 항체-코팅된 입자, 예를 들어 자기 비드와의 인큐베이션)를 수행함으로써, 사용자는 다양한 용액의 부피와 같은 특정 파라미터를 제어할 수 있고, 처리 및 그 타이밍 동안 용액의 첨가는 다른 이용 가능한 방법과 비교하여 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어 인큐베이션 동안 공동 내 액체 부피를 감소시키는 능력은 공동의 총 세포수에 영향을 미치지 않으면서, 선택에 사용된 입자(예를 들어 비드 시약)의 농도 및 용액의 화학적 총 전위를 증가시킬 수 있다. 이는 처리되는 세포와 선택에 사용되는 입자 사이의 쌍별 상호 작용(pairwise interactions)을 향상시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 시스템, 회로 및 제어와 관련될 때 챔버에서 인큐베이션 단계를 수행하는 것은 사용자가 인큐베이션 동안 원하는 시간(들)에 용액의 교반을 수행할 수 있게 하며, 이는 또한 상호 작용을 향상시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 선택 단계의 적어도 일부는 원심 분리 챔버에서 수행되며, 이는 선택 시약과 함께하는 세포의 인큐베이션을 포함한다. 이러한 공정의 일부 측면에서, 제조업체의 지침에 따르면, 일정 부피의 세포는 동일한 수의 세포 및/또는 세포 부피를 선택하기 위해, 튜브 또는 용기에서 유사한 선택을 수행할 때, 일반적으로 사용되는 것보다 훨씬 적은 양의 원하는 친화성-기반 선택 시약과 혼합된다. 일부 구현예에서, 동일한 수의 세포 및/또는 동일한 부피에 대한 튜브 또는 용기-기반 인큐베이션에서 세포의 선택에 사용되는 상기 동일한 선택 시약의 양의 5% 이하, 10% 이하, 15% 이하, 20% 이하, 25% 이하, 50% 이하, 60%이하, 70% 이하 또는 80% 이하인 선택 시약 또는 시약의 양이 제조자의 지시에 따라 사용된다.
일부 구현예에서, 선택, 예를 들어 세포의 면역 친화성-기반 선택을 위해, 세포는 또한 선택 시약, 예를 들어 그 집단의 다른 세포, 예를 들어 항체에는 존재하지 않고 농축 및/또는 고갈시키고자 하는 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합하는 분자를 함유하는 집단에서 챔버의 공동에서 인큐베이션되며, 상기 항체는 스캐폴드 예를 들어 중합체 또는 표면, 예를 들어 비드, 예를 들어 자기 비드, 예를 들어 CD4 및 CD8에 모노클론성(monoclonal) 항체에 커플링된(coupled) 자기 비드에 선택적으로 결합하는 것이다. 일부 구현예에서, 기술된 바와 같이, 상기 선택 시약은, 동요(shaking) 또는 회전(rotation)과 함께 튜브에서 선택을 수행할 때의 동일한 수의 세포 또는 동일한 양의 세포의 선택과 거의 동일하거나 유사한 선택 효율을 달성하기 위해 일반적으로 사용되거나 필요한 선택 시약의 양과 비교하여, 실질적으로 (예를 들어 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 이하의 양) 미만의 양으로 챔버의 공동(cavity) 내의 세포에 첨가된다. 일부 구현예에서, 상기 인큐베이션은 세포 및 선택 시약에 선택 완충제를 첨가하여 수행되며, 예를 들어 10mL 내지 200mL의 시약, 예를 들어 적어도 또는 약 적어도 또는 약 또는 10mL, 20mL, 30mL, 40mL, 50mL, 60mL, 70mL, 80mL, 90mL, 100mL, 150mL 또는 200mL의 시약과 함께 인큐베이션하여 표적 부피를 달성한다. 일부 구현예에서, 선택 완충제 및 선택 시약은 세포에 첨가하기 전에 예비 혼합된다. 일부 구현예에서, 선택 완충제 및 선택 시약은 별도로 세포에 첨가된다. 일부 구현예에서, 선택 인큐베이션은 주기적으로 온화한 혼합 조건으로 수행되며, 이는 에너지적으로 선호되는 상호 작용을 촉진시키고, 이에 의해 높은 선택 효율을 달성하면서도 전체 선택 시약의 사용을 덜 허용할 수 있다.
일부 구현예에서, 선택 시약과의 인큐베이션의 총 지속 시간은 약 5분 내지 6시간, 예를 들어 30분 내지 3시간, 예를 들어 적어도 30분, 60분, 120분 또는 180분 또는 적어도 약 30분, 60분, 120분 또는 180분 이상이다.
일부 구현예에서, 상기 인큐베이션은 일반적으로 혼합 조건, 예를 들어 스피닝(spinning)의 존재 하에, 일반적으로 비교적 낮은 힘 또는 속도, 예를 들어 세포를 펠렛(pellet)화하기 위해 사용된 것보다 낮은 속도와 같은 혼합 조건 하에서 수행되며, 약 600rpm 내지 1700rpm(예를 들어 600rpm, 1000rpm, 또는 1500rpm 또는 1700rpm 또는 약 600rpm, 1000rpm, 또는 1500rpm 또는 1700rpm 또는 적어도 600rpm, 1000rpm, 또는 1500rpm 또는 1700rpm)으로부터, 예를 들어 80g 내지 100g 또는 약 80g 내지 100g(예를 들어 80g, 85g, 90g, 95g 또는 100g 또는 약 80g, 85g, 90g, 95g 또는 100g 또는 적어도 80g, 85g, 90g, 95g 또는 100g)으로부터의 챔버의 샘플 또는 벽(wall) 또는 다른 용기의 RCF에서와 같다. 일부 구현예에서, 상기 스핀은 이러한 저속에서 스핀의 반복된 간격을 사용하여 수행되고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 초 동안의 스핀(spin) 및/또는 휴식, 예를 들어 약 1 또는 2 초에서 스핀(spin) 후 약 5, 6, 7 또는 8 초 동안 휴식 기간이 수행된다.
일부 구현예에서, 이러한 공정는 챔버가 일체화된 완전 폐쇄 시스템 내에서 수행된다. 일부 구현예에서, 이 방법(및 일부 측면에서, 하나 이상의 추가 단계, 예를 들어 혈액성분채집술(apheresis) 샘플과 같은 세포를 포함하는 샘플을 세척하는 이전 세척 단계)은 세포가 다음과 같이 자동화된 방식으로 수행되며, 예를 들어 자동화된 프로그램을 사용하여 단일 폐쇄 시스템에서 세척 및 결합 단계를 완료하기 위해 시약 및 기타 성분을 적절한 시간에 챔버로 끌어당겨 빼내고 원심 분리한다.
일부 구현예에서, 세포 및 선택 시약 및/또는 시약의 인큐베이션 및/또는 혼합 후, 상기 인큐베이션된 세포는 특정 시약 또는 시약의 존재 또는 부재에 기초하여 세포를 선택하기 위해 분리된다. 일부 구현예에서, 상기 분리는 선택 시약과 함께 세포의 인큐베이션이 수행된 동일한 폐쇄 시스템에서 수행된다. 일부 구현예에서, 선택 시약과의 인큐베이션 후, 선택 시약이 결합된 세포를 포함하는 인큐베이션된 세포를, 세포의 면역 친화성-기반 분리를 위한 시스템으로 옮긴다. 일부 구현예에서, 상기 면역 친화성-기반 분리 시스템은 자기(magnetic) 분리 칼럼이거나 이를 포함한다.
이러한 분리 단계는, 세포가 시약에 결합한 세포, 예를 들어 항체 또는 결합 파트너는 추가 사용을 위해 보유되는 양성 선택, 및/또는, 시약에 결합하지 않은 세포, 예를 들어 항체 또는 결합 파트너가 보유되는 음성 선택에 기초할 수 있다. 일부 예에서, 두 분획은 추가 사용을 위해 보유된다. 일부 측면에서, 이종 집단에서 세포 유형을 특이적으로 식별하는 항체가 이용 가능하지 않은 경우, 음성 선택이 특히 유용할 수 있어서, 원하는 집단 이외의 세포에 의해 발현된 마커에 기초하여 분리가 가장 잘 수행된다.
일부 구현예에서, 공정 단계는 친화성 기반 선택을 수행할 수 있는 시스템 또는 장치를 사용하는 것과 같이 인큐베이션된 및 세포의 음성 및/또는 양성 선택을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 분리는, 양성 선택에 의한 특정 세포 집단에 대한 농축 또는 음성 선택에 의한 특정 세포 집단의 고갈에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 양성 또는 음성 선택은 양성 또는 음성적으로 선택된 세포의 상대적으로 더 높은 수준(markerhigh)으로 발현 또는 발현된(marker+) 하나 이상의 표면 마커에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 다른 결합제와 함께 세포를 인큐베이션함으로써 달성된다.
상기 분리는 특정 세포 집단 또는 특정 마커를 발현하는 세포의 100% 농축 또는 제거를 초래할 필요는 없다. 예를 들어 마커를 발현하는 것과 같은 특정 유형의 세포에 대한 양성 선택 또는 농축은 그러한 세포의 수 또는 백분율을 증가시키는 것을 지칭하지만, 마커를 발현하지 않는 세포가 완전히 부재할 필요는 없다. 마찬가지로, 마커를 발현하는 것과 같은 특정 유형의 세포의 음성 선택, 제거 또는 결핍은 그러한 세포의 수 또는 백분율을 감소시키는 것을 말하지만, 그러한 모든 세포를 완전히 제거할 필요는 없다.
일부 구현예에서, 하나의 단계로부터 양성 또는 음성으로 선택된 분획에 후속 양성 또는 음성 선택과 같은 다른 분리 단계가 수행되는, 수 회의 분리 단계가 수행된다. 일부 예에서, 단일 분리 단계는, 예를 들어 각각 음성 선택을 표적으로하는 마커에 특이적인 복수의 항체 또는 결합 파트너와 세포를 인큐베이션함으로써 다수의 마커를 동시에 발현하는 세포를 결핍시킬 수 있다. 마찬가지로, 다수의 세포 유형은 세포를 다양한 세포 유형에서 발현된 복수의 항체 또는 결합 파트너와 인큐베이션함으로써 동시에 양성적으로 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 하나의 단계로부터 양성 또는 음성 선택된 분획이 동일한 분리 단계, 예를 들어 반복된 양성 또는 음성 선택에 적용되는 경우 분리 단계가 반복되고/되거나 1회 이상 수행된다. 일부 구체예에서, 단일 분리 단계는, 예를 들어 선택된 세포의 순도를 증가시키고/시키거나 음성으로 선택된 분획으로부터 음성으로 선택된 세포를 추가로 제거하고/하거나 고갈시키기 위해 1회 이상 반복 및/또는 수행된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 분리 단계가 2 회, 3 회, 4 회, 5 회, 6 회, 7 회, 8 회, 9 회, 10 회 또는 10 회 이상 수행된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 선택 단계는 1 회 내지 10 회, 1 회 내지 5 회, 또는 3 회 내지 5 회 수행 및/또는 반복된다.
예를 들어 일부 측면에서, 예를 들어 CD3+, CD4+, CD8+, 또는 CD57+ T 세포와 같이 높은 수준의 하나 이상의 표면 마커를 양성 또는 발현하는 T 세포의 특이적 하위 집단은 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 분리된다. 일부 구현예에서, 이러한 세포는 이러한 마커에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 결합 파트너와의 인큐베이션에 의해 선택된다. 일부 구현예에서, 항체 또는 결합 파트너는, 자기(magnetic) 비드 또는 상자성(paramagnetic) 비드와 같은 선택을 수행하기 위해 고체 지지체 또는 매트릭스에 직접적으로 또는 간접적으로 컨쥬게이션될 수 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 CD57+ T 세포는 CD4 마이크로비드(Microbeads), CD8 마이크로비드, 또는 CD57 마이크로비드(Miltenyl Biotec)를 사용하여 선택, 예를 들어 양성 선택될 수 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, CD3+ T 세포는 CD3 마이크로비드(Miltenyl Biotec)를 사용하여 선택, 예를 들어 양성 선택될 수 있다.
특정 구현예에서, CD57- 세포는 CD57 발현에 양성인 세포의 음성 선택에 의해서 PBMC로부터 분리된다. 다양한 구현예에서, T 세포는, B 세포, 단핵구 또는 CD14와 같은 다른 백혈구와 같은 비-T 세포에서 발현된 마커의 음성 선택에 의해 PBMC 샘플로부터 분리된다. 일부 측면에서, a CD3+ 선택 단계는 비-T 세포로부터 T 세포를 분리하는데 사용된다. 상기 CD3+ 집단은 하나 이상의 나이브-형(naive-like), 기억, 및/또는 효과기(effector) T 세포 하위집단에서 상대적으로 높은 정도로 발현되는 CD4+ 또는 CD8+, 마커들에 양성 또는 음성 선택에 의해서 하위-집단으로 분류될 수 있다. 일부 측면에서, CD4+ 및 CD8+ 선택 단계는 CD4+ 헬퍼 및 CD8+ 세포 독성 T 세포를 분리하기 위해 사용된다. 이러한 CD4+ 및 CD8+ 집단은, 하나 이상의 나이브, 기억 및/또는 효과기 T 세포 하위 집단에서 상대적으로 높은 정도로 발현되거나 발현된 마커에 대한 양성 또는 음성 선택에 의해 하위 집단으로 추가로 분류될 수 있다.
일부 구현예에서, CD8+ 세포는 CD57의 표면 발현에 기반하여 양성 또는 음성 선택에 의해 CD57-T 세포가 추가로 농축되거나 고갈된다. 특정 구현예에서, CD4+ 세포는 CD57의 표면 발현에 기반하여 양성 또는 음성 선택에 의해 CD57-T 세포가 추가로 농축되거나 고갈된다. 특정 구현예에서, CD3+ 세포는 CD57의 표면 발현에 기반하여 양성 또는 음성 선택에 의해 CD57-T 세포가 추가로 농축되거나 고갈된다.
일부 구현예에서, CD8+ T 세포는, 예를 들어 각각의 하위 집단과 관련된 표면 항원에 기초한 양성 또는 음성 선택에 의해, 나이브(naive), 중앙 기억, 효과기(effector) 기억 및/또는 중심 기억 줄기 세포가 추가로 농축되거나 고갈된다. 일부 구현예에서, 중앙 기억 T(TCM) 세포의 농축은 투여 후 장기 생존, 증폭 및/또는 생착을 개선시키는 것과 같은 효능을 증가시키기 위해 수행되며, 이는 일부 측면에서 이러한 하위 집단에서 특히 강력하다. Terakura et al., (2012) Blood.1:72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701 을 참고한다. 일부 구현예에서, TCM-농축된 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포의 조합은 효능을 추가로 향상시킨다.
일부 측면에서, CD8+ 세포 집단 또는 하위 집단을 제조하는데 사용된 동일한 CD4 발현-기반 선택 단계는, CD4-기반 분리로부터의 양성 및 음성 분획이 선택적으로 하나 이상의 추가 양성 또는 음성 선택 단계 후에 방법의 후속 단계에서 유지되고 사용되는 것과 같이, CD4+ 세포 집단 또는 하위 집단을 생성하는데 또한 사용된다. 일부 구현예에서, CD4+ 세포 집단에 대한 선택 및 CD8+ 세포 집단에 대한 선택은 동시에 수행된다. 일부 구현예에서, CD4+ 세포 집단 및 CD8+ 세포 집단에 대한 선택은 임의의 순서로 순차적으로 수행된다. 일부 구현예에서, 세포를 선택하기 위한 방법은 공개된 미국 출원번호 US20170037369에 기재된 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 선택된 CD4+ 세포 집단 및 선택된 CD8+ 세포 집단은 선택 후에 조합될 수 있다. 일부 양상에서, 선택된 CD4+ 세포 집단 및 선택된 CD8+ 세포 집단은 본원에 기재된 바와 같은 생물반응기 백(bag)에서 조합될 수 있다.
다양한 구현예에서, 생물학적 샘플, 예를 들어 PBMC 또는 기타 백혈 세포의 샘플은 농축된 CD57- 세포를 함유하는 음성 분획이 유지되는 CD57+ T 세포의 선택에 적용된다. 일부 구현예에서, CD57- 세포로 농축된 음성 분획은 양성 분획이 유지되는 CD3+ T 세포의 선택에 적용된다. 특정 구현예에서, CD8+ T 세포는 CD57- 세포로 농축된 음성 분획으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, CD57- 세포로 농축된 음성 분획은 음성 및 양성 분획 둘 다가 유지되는 CD8+ T 세포의 선택에 적용된다. 특정 구현예에서, CD4+ T 세포는 음성 분획으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, CD57- 세포로 농축된 음성 분획으로부터 음성 및 양성 분획이 둘 다 유지되는 CD4+ T 세포의 선택에 적용된다. 특정 구현예에서, CD8+ T 세포는 음성 분획으로부터 선택된다.
일부 측면에서, 분리될 인큐베이션된 샘플 또는 세포의 집단은, 상자기 비드(예를 들어 다인비드(Dynalbead) 또는 MACS® 비드와 같은)와 같은, 자기적 반응 입자 또는 미세입자와 같이, 작은, 자화성(magnetizable) 또는 자기적(magnetically) 반응성 물질을 포함하는 선택 시약과 함께 인큐베이션된다. 상기 자기적(magnetically) 반응성 물질, 예를 들어 입자는, 일반적으로 결합 파트너, 예를 들어 항체에 직접 또는 간접적으로 부착되어 있으며, 이는 분자, 예를 들어 표면 마커에 결합하여 세포, 세포들 또는 세포 집단에 존재하며, 분리, 예를 들어 부정적으로 또는 긍정적으로 선택되는 것이 요구된다. 일부 측면에서, 상기 선택제는 상자기 비드(paramagnetic bead) 및, CD3, CD4, CD8, 또는 CD57에 결합하거나 그들을 인식하는 부착된 항체 또는 그의의 항원 결합 단편이거나 또는 그들을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 선택제는 CD3, CD4, CD8, 또는 CD57 MACS® 마이크로비드(microbead)이다.
일부 구현예에서, 자성 입자 또는 비드는 항체 또는 다른 결합 파트너와 같은 특정 결합 부재에 결합된 자기적으로 반응성 물질을 포함한다. 자기 분리 방법에 사용하기 위한 많은 잘 알려진 자기 반응성 물질은, 예를 들어 Molday, 미국특허 제4,452,773호 및 유럽 특허 명세서 EP 452342 B에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다. Owen 미국특허 제4,795,698 호 및 Liberti et al. 미국특허 제5,200,084호에 기재된 콜로이드 크기의 입자(Colloidal sized particles)도 사용될 수 있다.
상기 인큐베이션은 항체, 또는 결합 파트너, 일반적으로 자성 입자 또는 비드에 부착된 이러한 항체 또는 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 2차 항체 또는 다른 시약과 같은 분자, 구체적으로 샘플 내 세포에 존재하는 경우 세포 표면 분자에 결합하는 조건 하에서 수행된다.
특정 구현예에서, 자기 반응성 입자는 1차 항체 또는 다른 결합 파트너, 2 차 항체, 렉틴(lectins), 효소 또는 스트렙타비딘(streptavidin)으로 코팅된다. 특정 구현예에서, 자성 입자는 하나 이상의 마커에 특이적인 1차 항체의 코팅을 통해 세포에 부착된다. 특정 구현예에서, 상기 비드보다는 상기 세포가 1차 항체 또는 결합 파트너로 표지된 후, 세포 유형 특이적 2 차 항체-또는 다른 결합 파트너(예를 들어 스트렙타비딘(streptavidin))-코팅 된 자성 입자가 첨가된다. 특정 구현예에서, 스트렙타비딘(streptavidin)-코팅된 자성 입자는 비오티닐화된(biotinylated) 1차 또는 2차 항체와 함께 사용된다.
일부 측면에서, 샘플이 자기장에 배치되는 절차에서 분리가 달성되고, 자기 응답성 또는 자화성 입자가 부착된 셀은 자석에 끌려 라벨링되지 않은 세포로부터 분리될 것이다. 양성 선택을 위해, 자석에 끌리는 세포는 유지되며; 음성 선택을 위해, 끌리지 않은 세포(라벨링되지 않은 세포)가 유지된다. 일부 측면에서, 양성 및 음성 선택의 조합은 동일한 선택 단계 동안 수행되며, 여기서 양성 및 음성 분획은 유지되고 추가로 처리되거나 추가 분리 단계를 거친다.
일부 구현예에서, 친화성-기반 선택은 자기 활성화 세포 분류(MACS)(Miltenyi Biotech, Auburn, CA)를 통한 것이다. Magnetic Activated Cell Sorting(MACS), 예를 들어 CliniMACS 시스템은 자화된 입자가 부착된 셀을 고순도로 선택할 수 있다. 특정 구현예에서, MACS는 비-표적 및 표적 종(species)이 외부 자기장의 적용 후에 순차적으로 용리되는(eluted) 모드에서 작동한다. 즉, 자화 입자에 부착된 세포는 부착되지 않은 종(species)이 용리되는 동안 제자리에 유지된다. 이어서, 이 제 1 용리 단계가 완료된 후, 자기장에 포획되고 용리되는 것이 방지된 종(species)은 이들이 용리 및 회수될 수 있도록 어떤 방식으로도 자유롭게된다. 특정 구현예에서, 비-표적-세포는 이종 세포 집단으로부터 표지되고 결핍된다. 다양한 구현예에서, 상기 선택제는 CD3, CD4, CD8, 또는 CD57 MACS® 마이크로비드(microbead)이다.
일부 구현예에서, 친화도 시약의 차선 수율 농도는 시약에 결합된 세포의 회수 또는 분리 및 시약과 세포의 인큐베이션을 수반하는 주어진 선택 또는 농축에서 결합 세포의 최적 또는 최대 수율에 도달하는데 필요하거나 이에 사용되는 농도 이하의 농도이다(“수율(yield)”은 예를 들어 시약에 의해 표적화되거나 시약이 이에 특이적이거나 시약이 특이적이고 결합할 수 있는 마커를 갖는 인큐베이션 중 총 세포수에 비해 그렇게 회수되거나 선택된 세포의 수임). 차선 수율 농도는, 일반적으로 상기 공정 또는 단계에서 시약에 결합된 세포 회수 시, 결합 세포, 예를 들어 CD57+, CD4+ 또는 CD8+ T 세포 중 전부 미만, 예를 들어 70% 이내의 수율을 달성하는 시약의 농도 또는 양이다. 일부 구현예에서, 상기 친화도 시약의 차선 수율 농도는 일반적으로는, 이러한 방법 또는 단계에서 상기 시약에 결합된 세포의 회수시, 결합된 세포, 예를 들어 CD3+ T 세포의, 전부보다 낮은, 예를 들어 70% 이하의 수율을 달성하는 시약의 농도 또는 양이다. 일부 구현예에서, (약) 50%, 45%, 40%, 30% 또는 25% 이내의 수율이 친화도 시약의 차선 농도에 의해 달성된다. 농도는 세포 당 입자 또는 표면의 수 또는 질량 및/또는 세포 당 제제(예를 들어 항체 단편과 같은 항체)의 질량 또는 분자 수의 측면에서 표현될 수 있다.
일부 구현예에서, 예를 들어 CD4+ 및/또는 CD57+, CD4+, 또는 CD8+ T 세포를 갖는 각각 또는 하나 이상의 2개 이상의 선택 시약에 대한 친화도 시약의 차선 수율 농도에 대해 작동하는 경우, 하나 이상의 상기 시약은 다른 것(들)에 의해서 인식된 세포 유형(들)과 비교하여 그 시약에 의해서 인식된 세포 유형의 비를 편향(bias)시키기 위해서 하나 이상의 다른 상기 시약(들) 보다 높은 농도에서 사용된다. 일부 구현예에서, 예를 들어 CD57+, CD3+, CD4+, 또는 CD8+ T 세포를 갖는 각각 또는 하나 이상의 2개 이상의 선택 시약에 대한 친화도 시약의 차선 수율 농도에 대해 작동하는 경우, 하나 이상의 상기 시약은 다른 것(들)에 의해서 인식된 세포 유형(들)과 비교하여 그 시약에 의해서 인식된 세포 유형의 비를 편향시키기 위해서 하나 이상의 다른 상기 시약(들) 보다 높은 농도에서 사용된다. 예를 들어 비율을 편향시키는 것이 바람직한 마커에 특이적으로 결합하는 시약은, 비율을 증가시키는 것이 얼마나 많이 바람직한 가에 따라 다른 것(들)에 비해 절반, 1 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 10 배 또는 그 이상 증가된 농도(예를 들어 세포 당 제제 또는 질량)로 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 시약의 포화를 달성하기에 충분한 세포 및/또는 차선 범위로 운용할 경우, 면역 친화도 시약의 양은 농축된 세포의 대략적인 수율에 비례한다. 특정 구현예에서, 농축되거나 선택된 CD4+ 및 CD8+ T 세포, 예를 들어 CD57-, CD4+, 또는 CD8+ T 세포를 함유하는 생성된 집단의 원하는 비율에 의존하는 면역 친화도 시약의 적절한 양 또는 농도는 일상적으로 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, 농축되거나 선택된 세포, 예를 들어 CD3+ T 세포를 함유하는 생성된 집단의 원하는 비율에 의존하는 면역 친화도 시약의 적절한 양 또는 농도는 일상적으로 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 분리 및/또는 분리 단계는, 면역 친화도 시약이, 예를 들어 전문이 국제공개공보 제WO2015/164675호에 기재된 바와 같은 스트렙타비딘 뮤테인(streptavidin mutein)과의 펩티드 리간드 상호 작용을 통해 가역적으로 결합된 자기 비드를 사용하여 수행된다. 상기 자기 비드의 예는 Streptamers®이다. 일부 구현예에서, 분리 및/또는 단계는 Miltenyi Biotec에서 시판되는 것과 같은 자기 비드를 사용하여 수행된다.
일부 구현예에서, 상기 자기적으로 반응하는 입자는 후속 인큐베이션, 배양 및/또는 조작될 세포에 부착된 채로 남고; 일부 측면에서, 입자는 환자에게 투여하기 위해 세포에 부착된 채로 남는다. 일부 구현예에서, 자화성(magnetizable) 또는 자기 응답성 입자(magnetically responsive particles)는 세포로부터 제거된다. 세포로부터 자화성 입자를 제거하는 방법은 공지되어 있으며, 예를 들어 경쟁 비-표지 항체, 자화성 입자 또는 절단 가능한 링커에 컨쥬게이트된 항체 등의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 자화성 입자는 생분해성(biodegradable)이다.
일부 구현예에서, 분리 및/또는 선택은 농축된 T 세포, 예를 들어 CD57- T 세포, CD3+ T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 하나 이상의 집단을 생성한다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 분리된 농축된 T 세포의 집단은 단 하나의 생물학적 시료로부터 분리, 선택, 농축 또는 수득된다. 일부 구현예에서, 별도의 집단은 동일한 대상체로부터 수집, 채취 및/또는 수득된 별도의 생물학적 샘플로부터 분리, 선택, 농축 및/또는 수득된다.
특정 구현예에서, 상기 분리 및/또는 선택은 하나 이상의 입력 조성물은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100%의 CD57-CD3+ T 세포를 포함하는 농축된 T 세포의 하나 이상의 집단을 생성한다. 특정 구현예에서, 농축된 T 세포의 입력 조성물은 본질적으로 CD3+ T 세포로 구성된다.
특정 구현예에서, 상기 분리 및/또는 농축은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD57-CD4+ T 세포를 포함하는 농축된 CD4+ T 세포의 집단을 생성한다. 특정 구현예에서, CD4+ T 세포의 입력 조성물은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1%, 또는 0.01% 미만의 CD8+ T 세포를 포함하고/하거나, CD8+ T 세포를 함유하지 않고/않거나, CD8+ T 세포가 없거나 또는 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 집단은 필수적으로 CD57-CD4+ T 세포로 구성된다.
C. 크로마토그래피에 의한 세포 선택
본원에서 제공된 상기 방법의 측면에서, 샘플의 세포는, 예를 들어 T 세포는 크로마토그래피 분리, 예를 들어 친화도 크로마토그래피 또는 겔 투과 크로마토그래피를 포함한 칼럼 크로마토그래피에 의한 분리에 의해서 선택된다. 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 T 세포는 친화도 크로마토그래피 또는 겔 투과 크로마토그래피를 포함하는 칼럼 크로마토그래피에 의한 것과 같은 크로마토그래피 분리에 의해 분리, 선택 또는 농축된다. 일부 구현예에서, 방법은 표적 세포, 예를 들어 분리, 선택 또는 농축된 세포(예를 들어 CD57+ 세포)의 표면 상에 위치한 수용체 분자(예를 들어 CD57)에 결합하는 수용체 결합 시약을 이용한다. 상기 방법은 (흔적 없는) 세포 친화도 크로마토그래피 기술(CATCH)로 설명될 수 있고, 전문이 여기에 참조로 포함된 국제공개공보 제WO2013/124474호 및 제WO2015/164675호에 기재된 임의의 방법 또는 기술을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, CD57+ 세포는 크로마토그래피 분리에 의해 음성으로 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 표적 세포(예를 들어 CD57+ 세포)는 세포 표면 상에 수용체 분자를 갖거나 발현하여, 분리, 선택 또는 농축될 세포는 하나 이상의 특이적인 공통 수용체 분자(예를 들어 CD57)의 존재에 의해 정의된다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플은 또한 수용체 분자가 없는 추가 세포를 함유할 수 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, T 세포는 다중 세포 유형, 예를 들어 적혈구 또는 B 세포를 함유하는 샘플에서 분리, 농축 및 선택된다. 특정 구현예에서, CD57+ 세포는 다중 세포, 예를 들어 적혈 세포 또는 B 세포를 함유하는 샘플로부터 분리, 농축, 및/또는 선택됨으로써, 분리된 CD57+ 세포 및 세포의 비-선택된 집단, 예를 들어 농축된 CD57+ 세포의 집단을 제공한다.
일부 구현예에서, 수용체 결합 제제는 예를 들어 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어 고정상)에 직접 또는 간접적으로 결합된 크로마토그래피 칼럼에 포함된다. 일부 구현예에서, 수용체 결합 제제는 샘플이 칼럼에 추가될 때 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어 고정상) 상에 존재한다. 일부 구현예에서, 수용체 결합 제제는 시약, 예를 들어 친화도 시약을 통해 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어 고정상)에 간접적으로 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 친화도 시약은 칼럼의 고정상에 공유적 또는 비공유적으로 결합된다. 일부 구현예에서, 친화도 시약은 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어 고정상)에 가역적으로 고정된다. 일부 경우에, 친화도 시약은 공유 결합을 통해 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어 고정상)에 고정된다. 일부 측면에서, 친화도 시약은 비공유적으로 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어 고정상)에 가역적으로 고정된다.
일부 구현예에서, 수용체 결합 시약은, 샘플이 크로마토그래피 칼럼(예를 들어 고정상)에 추가될 때 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어 고정상) 상에 친화도 시약을 통해 예를 들어 직접적으로(예를 들어 공유적 또는 비공유적) 또는 간접적으로 결합되어 존재할 수 있다. 따라서, 샘플 첨가 시, 표적 세포는 수용체 결합 시약에 의해 결합되고 칼럼의 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어 고정상)에 고정될 수 있다. 대안적으로, 일부 구현예에서, 수용체 결합 시약은 샘플에 첨가될 수 있다. 상기 방식으로, 수용체 결합 시약은 샘플의 표적 세포(예를 들어 T 세포)에 결합하고, 이어서 샘플은 친화도 시약을 포함하는 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어 고정상)에 첨가될 수 있으며, 여기서 표적 세포에 이미 결합된 수용체 결합 시약은 친화도 시약에 결합하고, 이로써 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어 고정상) 상에 표적 세포를 고정한다. 일부 구현예에서, 수용체 결합 시약은, 수용체 결합 시약에 포함된 여기에 기재된 바와 같은 결합 파트너 C를 경유하여 여기에 기재된 바와 같은 친화도 시약에 결합한다.
일부 측면에서, 수용체 결합 시약이 상기 샘플에 부가된다. 특정 구현예에서, 상기 수용체 결합 시약은, 상기 세포, 예를 들어 상기 표적 세포의 표면 위의 상기 수용체 분자에 특이적으로 결합ㅎ사는 결합 부위 B를 갖는다. 일부 측면에서, 상기 수용체 결합 시약은 또한 친화도 시약의 결합 부위 Z에 특이적으로 및 가역적으로 결합할 수 있는 결합 파트너 C를 포함한다. 예를 들어, 특정 측면에서, CD57에 결합하거나 또는 그것을 인식하는 수용체 결합 시약이 상기 샘플에 부가되며, 그는 결합 부위 B에서 CD57 발현에 대해 양성인 세포의 표면 위의 CD57에 결합한다.
특정 측면에서, 친화도 시약은 또한 결합 파트너 C에 의해 결합될 수 있는 2개 이상의 결합 부위 Z를 함유할 수 있고, 이로써 수용체 결합 시약의 다량체화를 제공한다. 따라서 여기에 사용되는 상기 친화도 시약은 또한 다량체화 시약일 수 있다. 친화도 시약은 예를 들어 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인, 아비딘, 아비딘 뮤테인 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 일부 측면에서, 상이한 크로마토그래피 매트릭스가 상이한 친화도 시약에 결합되고, 분리를 위한 다중 성분 시스템을 형성하는 칼럼의 층을 이룰 수 있다.
일부 구현예에서, 2개 이상의 수용체 결합 시약은, 예를 들어 친화도 시약 상에 존재하는 하나 또는 복수의 결합 부위 Z를 통해 친화도 시약과 연관, 예를 들어 가역적 또는 비가역적으로 결합된다. 일부 경우에, 이것은 수용체 결합 시약이 서로 밀접하게 배치되는 결과를 초래하여, 세포 표면 분자(예를 들어 선택 마커)를 갖는 표적 세포가 특정 분자(예를 들어 선택 마커)에 결합할 수 있는 수용체 결합 시약과 접촉을 야기할 경우 열성 효과(avidity effect)가 발생할 수 있다.
일부 구현예에서, 동일한, 즉 동일한 선택 마커 결합 특이성을 갖는 2개 이상의 상이한 수용체 결합 시약이 친화도 시약에 가역적으로 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 상이한 선택 마커에 결합하는 2개 이상의 상이한 수용체 결합 시약 및 일부 경우에 3 또는 4개의 상이한 수용체 결합 시약을 사용하는 것이 가능하다. 일부 측면에서, 2개 이상의 선택 제제 각각은 상이한 분자(예를 들어 선택 마커), 예를 들어 제 1 분자, 제 2 분자 등에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 세포 표면 분자와 같은 상이한 분자(예를 들어 선택 마커)는 동일한 표적 세포 상에 존재할 수 있다. 다른 경우에, 세포 표면 분자와 같은 상이한 분자(예를 들어 선택 마커)는 동일한 세포 집단에 존재하는 상이한 표적 세포 상에 존재할 수 있다. 일부 경우에, 제 3, 제 4 등의 수용체 결합 시약이 동일한 시약과 연합할 수 있고, 각각은 상이한 결합 부위를 더 함유한다.
일부 구현예에서, 2개 이상의 상이한 수용체 결합 시약은 동일한 결합 파트너 C를 함유한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 상이한 수용체 결합 시약은 상이한 결합 파트너를 함유한다. 일부 측면에서, 제 1 수용체 결합 시약은 친화도 시약 상에 존재하는 결합 부위 Z1에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 파트너 C1을 가질 수 있고, 제 2 수용체 결합 시약은 친화도 시약 상에 존재하는 결합 부위 Z1 또는 결합 부위 Z2에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 파트너 C2를 가질 수 있다. 따라서, 일부 경우에, 친화도 시약에 포함된 복수의 결합 부위 Z는 수용체 결합 시약에 포함된 결합 파트너 C1 및 C2에 각각 가역적으로 결합할 수 있는 결합 부위 Z1 및 Z2를 포함한다. 일부 구현예에서, C1 및 C2가 동일하고/거나 Z1 및 Z2가 동일하다. 다른 측면에서, 복수의 결합 부위 Z 중 하나 이상이 상이할 수 있다. 다른 경우에, 복수의 결합 파트너 C 중 하나 이상이 상이할 수 있다. 각각의 결합 파트너 C가 결합 부위 Z 중 하나와 상호 작용, 예를 들어 특이적으로 결합할 수 있는 한, 결합 부위 Z를 함유하는 친화도 시약과 양립 가능한 상이한 결합 파트너 C의 임의의 조합을 선택하는 것은 당업자의 수준 이내이다.
특정 구현예에서, 샘플, 예를 들어 세포 및 수용체 결합 시약(예를 들어 항체)을 함유하는 샘플은, 부착 또는 고정된 친화도 시약(예를 들어 결합 시약)을 함유하는 크로마토그래피 매트릭스에 로딩되거나 상기와 접촉한다. 특정 측면에서, 친화도 시약은 수용체 결합 시약의 결합 파트너 C에 특이적으로 결합하는 복수의 결합 부위 Z를 갖는다. 특정 측면에서, 수용체 결합 시약은 결합 파트너 C와 결합 부위 Z 사이의 상호 작용에 의해 친화도 시약에 결합한다. 따라서, 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 표적 세포는, 크로마토그래피 매트릭스 상의 수용체 결합 시약의 결합 부위 Z와 친화도 시약의 하나 이상의 결합 부위 Z에 의해 형성되는 복합체를 통해 고정된다. 추가 측면에서, 세포, 예를 들어 표적 세포는 크로마토그래피 매트릭스에서 남은 샘플을 예를 들어 세정, 방출 또는 세척함으로써 샘플에서 고갈될 수 있다. 특정 측면에서, 수용체 결합 시약은 세포를 함유하는 샘플에 포함될 수 있거나 또는 예를 들어 샘플이 크로마토그래피 매트릭스에 첨가되기 전에 부착된 친화도 또는 다량체화 시약에 결합하기 위해 크로마토그래피 매트릭스에 적용되거나 접촉될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 크로마토그래피 매트릭스는 예를 들어 음성 선택에 의해서 샘플로부터 표적 세포를 제거하거나 또는 분리하는데 사용된다. 예를 들어 특정 구현예에서, CD57+ 세포 및 CD57- 세포를 함유하는 샘플은 CD57에 결합하고/하거나 그를 인식하는 수용체 결합 시약과 접촉되거나 그를 사용하여 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 상기 샘플 및 수용체 결합 시약은, 일부 측면에서 상기 고정되거나 또는 부착된 친화도 시약, 상기 수용체 결합 시약, 및 CD57+ T 세포에 의해서 복합체가 형성되는 상기 매트릭스 위에 로딩된다. 일부 구현예에서, 미결합 세포는 상기 크로마토그래피 매트릭스로부터 제거되거나 세정됨으로써, 결합된 CD57+ 세포를 제거하고 CD57- 세포에 대해 농축된, 샘플, 예를 들어 집단을 제공한다.
특정 구현예에서, 상기 크로마토그래피 매트릭스는 예를 들어 양성 선택에 의해서 샘플로부터 표적 세포를 단리, 선택, 또는 농축하는데 사용된다. 예를 들어 일부 구현예에서, CD4+ 또는 CD8+ T 세포 및 다른 세포, 예를 들어 비-T 세포 면역 세포를 함유하는 샘플은 CD4 또는 CD8에 결합하거나 또는 그를 인식하는 수용체 결합 시약과 접촉되거나 또는 그를 사용하여 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 상기 샘플 및 상기 수용체 결합 시약은, 일부 측면에서 상기 고정되거나 또는 부착된 친화도 시약, 상기 수용체 결합 시약, 및 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에 의해서 복합체가 형성되는 상기 매트릭스 위에 로딩된다. 특정 구현예에서, 미결합 세포는 상기 크로마토그래피 매트릭스로부터 제거되거나 또는 세정된다. 특정 구현예에서, 상기 고정된 CD4+ 또는 CD8+ 세포는 경쟁 시약의 첨가에 의해서, 예를 들어 상기 복합체를 파괴함으로써 제거되거나 또는 방출된다. 따라서 일부 측면에서, 상기 분리, 방출, 또는 용리된 CD4+ 또는 CD8+ 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에 대해 농축된 세포의 샘플, 조성물, 또는 집단이다.
특정 구현예에서, 상기 크로마토그래피 매트릭스는 예를 들어 양성 선택에 의해서 샘플로부터 표적 세포를 단리, 선택, 또는 농축하는데 사용된다. 예를 들어 일부 구현예에서, CD3+ T 세포 및 다른 세포, 예를 들어 비-T 세포 면역 세포를 함유하는 샘플은 CD3에 결합하거나 또는 그를 인식하는 수용체 결합 시약과 접촉되거나 또는 그를 사용하여 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 상기 샘플 및 상기 수용체 결합 시약은, 일부 측면에서 상기 고정되거나 또는 부착된 친화도 시약, 상기 수용체 결합 시약, 및 CD3+ T 세포에 의해서 복합체가 형성되는 상기 매트릭스 위에 로딩된다. 특정 구현예에서, 미결합 세포는 상기 크로마토그래피 매트릭스로부터 제거되거나 또는 세정된다. 특정 구현예에서, 상기 고정된 CD3+ 세포는 경쟁 시약의 첨가에 의해서, 예를 들어 상기 복합체를 파괴함으로써 제거되거나 또는 방출된다. 따라서 일부 측면에서, 상기 분리, 방출, 또는 용리된 CD3+ 세포는 CD3+ T 세포에 대해 농축된 세포의 샘플, 조성물, 또는 집단이다.
일부 측면에서, 경쟁 시약은 상기 크로마토그래피 칼럼 상에 로딩된다. 일부 구현예에서, 결합 파트너 C와 결합 부위 Z 사이에 형성된 가역적 결합은 경쟁 시약에 의해 파괴될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 경쟁 시약은 친화도 시약의 결합 부위 Z에 결합할 수 있는 결합 부위를 갖는다. 일부 구현예에서, 경쟁 시약은 하나 이상의 결합 부위 Z에 대한 결합 파트너 C와 결합을 두고 경쟁할 수 있는 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체 또는 스트렙타비딘 결합-펩티드일 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 경쟁 시약은 친화도 시약과 복합체를 형성하고, 그에 의해서 크로마토그래피 매트릭스 상에 고정된다. 일부 구현예에서, 결합 파트너 C 및 경쟁 시약은 상이하고, 상기 경쟁 시약은 결합 파트너의 친화도에 비해 하나 이상의 결합 부위 Z에 대해 보다 높은 결합 친화도를 나타낸다. 여기에 제공된 임의의 방법의 특정 측면에서, 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어 고정상)에서 표적 세포(예를 들어 T 세포)를 분리하기 위해 친화도 시약에 대한 선택 제제(예를 들어 수용체 결합 제제)의 결합을 파괴하는 크로마토그래피 칼럼의 고정상에 경쟁 시약의 첨가가 필요하지 않다.
상기 경쟁적 결합의 결과로, 결합 파트너 C 및 결합 부위 Z에서 수용체 결합 시약과 친화도 시약 사이의 결합이 대체된다. 특정 구현예에서, 친화도 시약, 수용체 결합 시약 및 세포, 예를 들어 표적 세포를 함유하는 부착된 복합체를 갖는 크로마토그래피 매트릭스에 경쟁 시약의 첨가 또는 로딩으로 크로마토그래피 매트릭스에서 세포가 방출된다. 일부 측면에서, 수용체 결합 시약은 결합 부위 B에서 세포의 수용체 분자를 향한 낮은 친화도를 가져서, 수용체 결합 시약은 경쟁 시약의 존재하에 세포에서 해리된다. 따라서, 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 표적 세포는, 결합된 수용체 결합 분자가 없거나 본질적으로 없는 크로마토그래피 매트릭스로에서 용출된다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 표적 세포, 경쟁 시약 및 수용체 결합 시약을 포함하는 제 1 크로마토그래피 칼럼의 용출물에서 용출 샘플이 수집된다. 특정 구현예에서, 친화도 크로마토그래피 매트릭스 및 동시에 겔 투과 매트릭스로서도 작용할 수 있는 적절한 고정상을 갖는 제 2 크로마토그래피 칼럼에 용출 샘플이 로딩된다. 특정 구현예에서, 친화도 크로마토그래피 매트릭스는 상기에 고정된 친화도 시약을 갖는다. 일부 측면에서, 수용체 결합 시약 및 경쟁 시약은 친화도 시약 상의 결합 부위 Z에 결합하고, 이로써 크로마토그래피 매트릭스 상에 고정된다. 결과적으로, 특정 측면에서, 단리된 표적 세포를 함유하는 용출 샘플은 수용체 결합 시약 및 경쟁 시약이 고갈된다. 따라서, 일부 측면에서, 임의의 반응물이 없는 표적 세포는, 이제 예를 들어 여기에 기재된 임의의 방법에 의한 프로세싱을 위한 추가 사용을 위한 상태에 있다.
일부 구현예에서, 샘플의 세포, 예를 들어 표적 세포는 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어 고정상)에서 남은 샘플을 예를 들어 세정, 방출 또는 세척함으로써 샘플에서 고갈될 수 있다. 일부 구현예에서, 1회 이상(예를 들어 2, 3, 4, 5, 6)의 세척 단계가 사용되어 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어 고정상)에서 결합되지 않은 세포 및 잔해물이 제거된다. 일부 구현예에서, 적어도 2회의 세척 단계가 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플은 하나 이상의 세척 단계가 수행되기 전에 적어도 (약) 5, 10, 15, 16, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 120 분 동안 매트릭스에 침투하도록 허용된다. 일부 구현예에서, 세척 단계는 상기 샘플이 상기 크로마토그래피 칼럼(예를 들어 고정상)에 첨가된 후 (약) 또는 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 120 분 후에 수행된다. 일부 구현예에서, 세척 단계는 상기 샘플이 상기 크로마토그래피 칼럼(예를 들어 고정상)에 첨가된 후 (약) 또는 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60 분 후에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플이 상기 크로마토그래피 칼럼(예를 들어 고정상)에 첨가된 후 (약) 120, 100, 90, 80, 70, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5 분 이내에 하나 이상의 세척 단계가 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플이 상기 크로마토그래피 칼럼(예를 들어 고정상)에 첨가된 후 (약) 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5 분 이내에 하나 이상의 세척 단계가 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플이 상기 크로마토그래피 칼럼(예를 들어 고정상)에 첨가된 후 (약) 5 내지 60 분 이내에 하나 이상의 세척 단계가 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플이 상기 크로마토그래피 칼럼(예를 들어 고정상)에 첨가된 후 (약) 5 내지 50 분 이내에 하나 이상의 세척 단계가 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플이 상기 크로마토그래피 칼럼(예를 들어 고정상)에 첨가된 후 (약) 5 내지 40 분 이내에 하나 이상의 세척 단계가 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플이 상기 크로마토그래피 칼럼(예를 들어 고정상)에 첨가된 후 (약) 5 내지 30 분 이내에 하나 이상의 세척 단계가 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플이 상기 크로마토그래피 칼럼(예를 들어 고정상)에 첨가된 후 (약) 5 내지 20 분 이내에 하나 이상의 세척 단계가 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플이 상기 크로마토그래피 칼럼(예를 들어 고정상)에 첨가된 후 (약) 5 내지 10 분 이내에 하나 이상의 세척 단계가 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플이 상기 크로마토그래피 칼럼(예를 들어 고정상)에 첨가된 후 (약) 10 내지 60 분 이내에 하나 이상의 세척 단계가 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플이 상기 크로마토그래피 칼럼(예를 들어 고정상)에 첨가된 후 (약) 20 내지 60 분 이내에 하나 이상의 세척 단계가 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플이 상기 크로마토그래피 칼럼(예를 들어 고정상)에 첨가된 후 (약) 30 내지 60 분 이내에 하나 이상의 세척 단계가 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플이 상기 크로마토그래피 칼럼(예를 들어 고정상)에 첨가된 후 (약) 40 내지 60 분 이내에 하나 이상의 세척 단계가 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플이 상기 크로마토그래피 칼럼(예를 들어 고정상)에 첨가된 후 (약) 50 내지 60 분 이내에 하나 이상의 세척 단계가 수행된다.
일부 구현예에서, 여러 라운드의 분리 단계가 수행되고, 여기서 한 단계에서 양성 또는 음성 선택된 분획은 후속 양성 또는 음성 선택과 같은 또 다른 분리 단계를 거친다. 특정 구현예에서, 선택, 단리 및 농축을 위한 방법, 기술 및 시약은 예를 들어 국제공개공보 제WO2015/164675호에 기술되어 있으며, 상기 공보는 그 전체가 본원에서 참조로 인용된다.
일부 구현예에서, 단일 선택 단계를 사용하여 샘플에서 표적 세포(예를 들어 CD57- T 세포)를 분리할 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 선택 단계는 단일 크로마토그래피 칼럼에서 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 단일 선택 단계는 복수의 마커를 동시에 발현하는 세포를 고갈시킬 수 있다. 마찬가지로, 복수의 세포 유형이 동시에 양성 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 선택 단계는 반복되고/거나 1회 이상 수행되며, 여기서 한 단계에서 양성 또는 음성 선택된 분획은 반복적인 양성 또는 음성 선택과 같은 동일한 선택 단계를 거친다. 일부 구현예에서, 단일 선택 단계는 반복되고/거나 1회 이상 수행되어, 예를 들어 선택된 세포의 순도를 증가시키고/거나 음성 선택된 분획에서 음성 선택 세포를 더 제거하고/거나 고갈시킨다. 특정 구현예에서, 1 회 이상의 선택 단계는 2 회, 3 회, 4 회, 5 회, 6 회, 7 회, 8 회, 9 회, 10 회 또는 10 회 이상 수행된다. 특정 구현예에서, 1 회 이상의 선택 단계는 1 내지 10 회, 1 내지 5 회 또는 3 내지 5 회 수행되고/거나 반복된다. 일부 구현예에서 2개의 선택 단계가 수행된다.
세포 선택은 하나 이상의 크로마토그래피 칼럼을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 크로마토그래피 칼럼은 폐쇄 시스템에 포함된다. 일부 구현예에서, 폐쇄 시스템은, 예를 들어 사용자(예를 들어 인간) 입력이 필요없거나 상기가 최소로 필요한 자동화된 폐쇄 시스템이다. 일부 구현예에서, 세포 선택은 순차적(예를 들어 순차적 선택 기술)으로 수행된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 크로마토그래피 칼럼은 순차적으로 배열된다. 예를 들어 제 1 칼럼은 산출 칼럼(예를 들어 용리액)이 제 2 크로마토그래피 칼럼에 예를 들어 연결된 튜브를 통해 공급될 수 있도록 배향될 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 크로마토그래피 칼럼은 순차적으로 배열될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 선택은 순차적인 양성 및 음성 선택 단계를 수행함으로써 달성될 수 있고, 후속 단계는 이전 단계의 음성 및/또는 양성 분획을 추가 선택의 대상으로 하며, 여기서 전체 공정는 동일한 튜브 또는 튜브 세트에서 수행된다.
일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플은, CD4+ 또는 CD8+ 집단 중 하나를 농축하도록 제 1 선택이 달성되고, 제 1 선택에서 비선택 세포가 제 2 선택에 대한 세포의 공급원으로 사용되어 CD4+ 또는 CD8+ 집단 중 나머지 다른 하나를 농축하는 순차적인 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 추가 선택 또는 선택들은, CD4+ 또는 CD8+ 집단 중 하나 또는 둘 다의 하위 집단, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포 및/또는 높은 수준의 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ 발현에 대해 양성인 세포의 농축을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플은, 제 1 선택으로 CD3+ 집단의 농축을 초래하고, 선택된 세포가 제 2 선택을 위한 세포의 공급원으로 사용되어 CD3+ 집단을 농축하는 순차적인 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플은, 제 1 선택으로 제 1 고정상(예를 들어 제 1 크로마토그래피 칼럼)의 CD3+ 집단의 농축이 초래되고, 결합되지 않은 세포를 함유하는 통과액이 제 2 선택을 위한 세포의 공급원으로 사용되어 제 2 고정상(예를 들어 제 2 크로마토그래피 칼럼)의 CD3+ 집단을 농축하는 순차적인 선택의 대상이 되고, 여기에서 제 1 및 제 2 고정상은 순차적으로 배열된다. 일부 구현예에서 추가 선택(들)은, 수행되어 CD3+ 집단, 예를 들어 중앙 기억T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및/또는 CD45RO+ 발현에 양성인 세포의 농축을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플은 순차적 선택의 대상이 될 수 있으며, 여기서 제 1 선택이 CD3+ 집단을 농축시키기 위해서 수행되며, 상기 선택된 세포는 CD4+ 집단을 농축시키는 제 2 선택을 위한 세포의 소스로서 사용된다. 일부 구현예에서, 추가 선택 또는 선택들은, CD4+ 또는 CD8+ 집단 중 하나 또는 둘 다의 하위 집단, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포 및/또는 높은 수준의 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ 발현에 대해 양성인 세포의 농축을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플은, 제 1 선택으로 CD3+ 집단의 농축이 초래되고, 선택된 세포가 제 2 선택을 위한 세포의 공급원으로 사용되어 CD8+ 집단을 농축하는 순차적인 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 추가 선택(들)은, CD3+CD8+ 집단의 하위 집단, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포 및/또는 높은 수준의 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ 발현에 대해 양성인 세포의 농축을 초래할 수 있다. T 세포의 특정 하위 집단(예를 들어 CD3+ 세포), 예를 들어 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ T 세포를 높은 수준으로 발현하거나 이에 대해 양성인 세포가 연속적인 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 선택됨이 고려된다.
일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플은, CD57- 집단을 농축하도록 제 1 선택이 달성되고, 상기 선택된 세포는 CD3+ 집단을 농축하는 순차적인 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플은, 제 1 선택으로 제 1 고정상(예를 들어 제 1 크로마토그래피 칼럼)의 CD57- 집단의 농축이 초래되고, 결합되지 않은 세포를 함유하는 통과액이 제 2 선택을 위한 세포의 공급원으로 사용되어 제 2 고정상(예를 들어 제 2 크로마토그래피 칼럼)의 CD3+ 집단을 농축하는 순차적인 선택의 대상이 되고, 여기에서 제 1 및 제 2 고정상은 순차적으로 배열된다. 일부 구현예에서, 추가 선택 또는 선택들은, CD57- 집단의 하위 집단, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 높은 수준의 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ 발현에 대해 양성인 세포의 농축을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플은, 제 1 선택으로 CD57- 집단의 농축을 초래하고, 선택된 세포가 제 2 선택을 위한 세포의 공급원으로 사용되어 CD3+ 집단을 농축하는 순차적인 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서 추가 선택(들)은, 수행되어 CD57-CD3+ 집단, 예를 들어 중앙 기억T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및/또는 CD45RO+ 발현에 양성인 세포의 농축을 초래할 수 있다. T 세포의 특정 하위 집단(예를 들어 CD57- 세포), 예를 들어 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ T 세포를 높은 수준으로 발현하거나 이에 대해 양성인 세포가 연속적인 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 선택됨이 고려된다.
일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플은, CD3+ 집단을 농축하도록 제 1 선택이 달성되고, 상기 선택된 세포는 CD57- 집단을 농축하는 순차적인 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플은, 제 1 선택으로 제 1 고정상(예를 들어 제 1 크로마토그래피 칼럼)의 CD3+ 집단의 농축이 초래되고, 결합되지 않은 세포를 함유하는 통과액이 제 2 선택을 위한 세포의 공급원으로 사용되어 제 2 고정상(예를 들어 제 2 크로마토그래피 칼럼)의 CD57- 집단을 농축하는 순차적인 선택의 대상이 되고, 여기에서 제 1 및 제 2 고정상은 순차적으로 배열된다. 일부 구현예에서, 추가 선택 또는 선택들은, CD3+ 집단의 하위 집단, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 높은 수준의 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ 발현에 대해 양성인 세포의 농축을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플은, 제 1 선택으로 CD3+ 집단의 농축을 초래하고, 선택된 세포가 제 2 선택을 위한 세포의 공급원으로 사용되어 CD57- 집단을 농축하는 순차적인 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서 추가 선택(들)은, 수행되어 CD3+CD57- 집단, 예를 들어 중앙 기억T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및/또는 CD45RO+ 발현에 양성인 세포의 농축을 초래할 수 있다. T 세포의 특정 하위 집단(예를 들어 CD57- 세포), 예를 들어 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ T 세포를 높은 수준으로 발현하거나 이에 대해 양성인 세포가 연속적인 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 선택됨이 고려된다.
일부 구현예에서, 세포 선택은 병행(예를 들어 병행 선택 기술)하여 수행된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 크로마토그래피 칼럼은 병행 배열된다. 예를 들어 샘플이, 예를 들어 제 1 칼럼을 통과할 필요없이 샘플을 각 칼럼에 부가될 수 있는 튜브를 통해 샘플이 동시에 2 이상의 칼럼에 로딩되도록 2 이상의 칼럼이 배열될 수 있다. 예를 들어 병행 선택 기술을 사용하여, 세포 선택은, 예를 들어 폐쇄 시스템에서 양성 및/또는 음성 선택 단계를 동시에 수행함으로써 달성될 수 있고, 여기서 전체 공정는 동일한 튜브 또는 튜브 세트에서 수행된다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플은, 샘플이 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼에 로딩되는 병행 선택의 대상이 되고, 여기서 각 칼럼은 세포 집단의 선택을 초래한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼은 개별적으로 CD57-, CD3+, CD4+ 또는 CD8+ 집단의 선택을 초래한다. 일부 구현예에서, 친화도 크로마토그래피 또는 겔 투과 크로마토그래피를 포함하는 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼은 독립적으로 동일한 세포 집단의 선택을 초래한다. 예를 들어 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼은 CD57- 세포의 선택을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 친화도 크로마토그래피 또는 겔 투과 크로마토그래피를 포함하는 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼은 독립적으로 상이한 세포 집단의 선택을 초래한다. 예를 들어 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼은 독립적으로 CD57- 세포, CD4+ 세포, CD3+ 및/또는 CD8+ 세포의 선택을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 순차적 선택 기술을 사용하는 추가 선택 또는 선택들은 병행 선택을 통해 선택된 하나 또는 모든 세포 집단의 하위 집단을 농축하는 결과를 초래할 수 있다. 예를 들어 선택된 세포는, 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포 및/또는 높은 수준의 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ 발현에 대해 양성인 세포에 대해 추가 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플은, 병행 선택이 2개 이상의 칼럼 상에서 CD57- 집단의 농축을 초래하는 병행 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 추가 선택 또는 선택들은, CD57- 집단의 하위 집단, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포 및/또는 높은 수준의 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ 발현에 대해 양성인 세포의 농축을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플은, 선택이 2개 이상의 칼럼 상에서 독립적으로 CD57- 집단 및 CD3+ 집단의 농축을 초래하는 병행 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 추가 선택 또는 선택들은, CD57- 및 CD3+ 집단의 하위 집단, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포 및/또는 높은 수준의 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ 발현에 대해 양성인 세포의 농축을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플은, 그 선택이 독립적으로 2개 이상의 칼럼에서 CD57- 집단 및 CD4+ 집단의 농축을 초래하는 병행 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 추가 선택 또는 선택들은, CD57- 및 CD4+ 집단의 하위 집단, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포 및/또는 높은 수준의 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ 발현에 대해 양성인 세포의 농축을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플은, 병행 선택이 CD57- 집단 및 CD8+ 집단의 농축을 초래하는 병행 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 추가 선택 또는 선택들은, CD57- 및 CD8+ 집단의 하위 집단, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포 및/또는 높은 수준의 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ 발현에 대해 양성인 세포의 농축을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플은, 병행 선택이 CD4+ 집단 및 CD8+ 집단의 농축을 초래하는 병행 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 추가 선택 또는 선택들은, CD4+ 및 CD8+ 집단의 하위 집단, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포 및/또는 높은 수준의 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ 발현에 대해 양성인 세포의 농축을 초래할 수 있다. 일부 측면에서, T 세포의 특정 하위 집단(예를 들어 CD3+, CD4+, CD8+ T 세포), 예를 들어 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD3+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ T 세포를 높은 수준으로 발현하거나 이에 대해 양성인 세포가 양성 또는 음성 병행 선택 기술에 의해 선택됨이 고려된다. 일부 구현예에서, 순차적 및 병행 선택 기술이 조합으로 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 병행 선택을 위해 2개의 칼럼이 사용된다. 일부 구현예에서, 상기 2개의 칼럼은 동일한 세포 유형(예를 들어 동일한 선택 마커)을 선택한다. 일부 구현예에서, 상기 2개의 칼럼은 각각 CD57- T 세포를 선택한다.
일반적으로, 고정상(예를 들어 선택 수지)의 결합 용량은 특정 수의 표적 모이어티, 예를 들어 T 세포와 같은 표적 세포를 선택하기 위해 얼마나 많은 고정상이 필요한지에 영향을 미친다. 결합 용량, 예를 들어 고정상(예를 들어 선택 수지)의 mL 당 고정될 수 있는 표적 세포의 수를 사용하여 하나 이상의 컬럼 상에 포획되는 표적 세포의 수를 결정하거나 제어할 수 있다. 하나 이상의 크로마토그래피 컬럼이 여기에 개시된 온-컬럼 세포 선택 및 자극을 위해 사용될 수 있다. 복수의 컬럼이 사용되는 경우, 상기는 순차적으로, 병행하여 또는 이의 적절한 조합으로 배열될 수 있다. 따라서, 고정상(예를 들어 선택 수지)의 결합 용량을 사용하여 단일 컬럼 접근법에서의 시약 양 또는 다중 컬럼 접근법에서 각 컬럼에 대한 시약 양을 표준화할 수 있다.
일부 구현예에서, 여기에 사용된 고정상의 결합 용량은, 과량의 표적 세포가 고정상에 로딩될 경우, 주어진 용매 및 세포 농도 조건에서 고정상에 결합된 표적 세포의 최대 수이다. 일부 구현예에서, 상기 결합 용량은 고정상 mL 당 (약) 100만±25 백만 표적 세포(예를 들어 T 세포) 범위이다. 일부 구현예에서, 여기에 개시된 고정상(예를 들어 선택 수지)의 정적 결합 용량은 고정상 mL 당 약 75 백만 내지 약 125 백만 표적 세포 범위이다. 한 측면에서, 온-컬럼 세포 선택 및 자극을 위해 여기에 사용된 고정상의 결합 용량은 정적 결합 용량이다. 일부 구현예에서, 상기 정적 결합 용량은 고정상, 예를 들어 특정 용매 및 세포 농도 조건에서에서 고정될 수 있는 세포의 최대량이다. 일부 구현예에서, 여기에 개시된 고정상(예를 들어 선택 수지)의 정적 결합 용량은 고정상 mL 당 약 50 백만 내지 약 100 백만 표적 세포 범위이다. 일부 구현예에서, 상기 정적 결합 용량은 고정상 mL 당 (약) 100만±25 백만 표적 세포(예를 들어 T 세포) 범위이다. 일부 구현예에서, 여기에 개시된 고정상(예를 들어 선택 수지)의 정적 결합 용량은 고정상 mL 당 약 75 백만 내지 약 125 백만 표적 세포 범위이다. 일부 구현예에서, 고정상(예를 들어 선택 수지)의 정적 결합 용량은, 고정상 mL 당 약 10 백만 내지 약 20 백만, 약 20 백만 내지 약 30 백만, 약 30 백만 내지 약 40 백만, 약 40 백만 내지 약 50 백만, 약 50 백만 내지 약 60 백만, 약 60 백만 내지 약 70 백만, 약 70 백만 내지 약 80 백만, 약 80 백만 내지 약 90 백만, 약 90 백만 내지 약 100 백만, 약 110 백만 내지 약 120 백만, 약 120 백만 내지 약 130 백만, 약 130 백만 내지 약 140 백만, 약 140 백만 내지 약 150 백만, 약 150 백만 내지 약 160 백만, 약 160 백만 내지 약 170 백만, 약 170 백만 내지 약 180 백만, 약 180 백만 내지 약 190 백만 또는 약 190 백만 내지 약 200 백만 표적 세포이다.
일부 구현예에서, 여기에 사용된 고정상의 결합 용량은, 결합되지 않은 표적 세포의 유의미한 돌파구가 발생하기 전 주어진 흐름 조건 하에서 고정상에 결합한 표적 세포의 수이다. 한 측면에서, 온-컬럼 세포 선택을 위해 여기에 사용된 고정상의 결합 용량은 동적 결합 용량, 즉 샘플 적용 중 패킹된 크로마토그래피 컬럼의 작동 조건 하에서의 결합 용량이다. 일부 구현예에서, 동적 결합 용량은 표적 세포의 공지된 농도를 함유하는 샘플을 로딩하고 통과액을 모니터닝함으로써 결정되고, 결합되지 않은 표적 세포가 컬럼을 통과하기 전에 표적 세포는 특정 중단점까지 고정상에 결합할 것이다. 일부 구현예에서, 상기 동적 결합 용량은 고정상 mL 당 (약) 100만±25 백만 표적 세포(예를 들어 T 세포) 범위이다. 일부 구현예에서, 여기에 개시된 고정상(예를 들어 선택 수지)의 동적 결합 용량은 고정상 mL 당 (약) 75 백만 내지 (약) 125 백만 표적 세포 범위이다. 일부 구현예에서, 여기에 개시된 고정상(예를 들어 선택 수지)의 동적 결합 용량은 고정상 mL 당 약 50 백만 내지 약 100 백만 표적 세포 범위이다. 일부 구현예에서, 고정상(예를 들어 선택 수지)의 동적 결합 용량은, 고정상 mL 당 약 10 백만 내지 약 20 백만, 약 20 백만 내지 약 30 백만, 약 30 백만 내지 약 40 백만, 약 40 백만 내지 약 50 백만, 약 50 백만 내지 약 60 백만, 약 60 백만 내지 약 70 백만, 약 70 백만 내지 약 80 백만, 약 80 백만 내지 약 90 백만, 약 90 백만 내지 약 100 백만, 약 110 백만 내지 약 120 백만, 약 120 백만 내지 약 130 백만, 약 130 백만 내지 약 140 백만, 약 140 백만 내지 약 150 백만, 약 150 백만 내지 약 160 백만, 약 160 백만 내지 약 170 백만, 약 170 백만 내지 약 180 백만, 약 180 백만 내지 약 190 백만 또는 약 190 백만 내지 약 200 백만 세포이다.
일부 구현예에서, 상기 고정상은 20 mL이다. 일부 구현예에서, 상기 고정상은 20 억±5 억 세포의 결합 용량을 갖는다.
일반적으로, 크로마토그래피 방법은 유체 크로마토그래피, 전형적으로 액체 크로마토그래피이다. 일부 측면에서, 크로마토그래피는, 세포, 예를 들어 표적 세포를 함유하는 유체 샘플이, 예를 들어 중력 흐름에 의해 또는 크로마토그래피 매트릭스를 함유하는 컬럼의 한쪽 말단에서 펌프에 의해 적용되고, 상기 유체 샘플이 컬럼의 나머지 다른 말단의 컬럼에 존재하는 통과해 흐르는 방식으로 수행될 수 있다. 또한, 크로마토그래피는, 단리될 세포를 함유하는 유체 샘플이, 예를 들어 피펫 팁 내에 패킹된 크로마토그래피 매트릭스를 함유하는 컬럼의 한쪽 말단에서 피펫에 의해 적용되고, 상기 유체 샘플이 들어가서 컬럼의 나머지 다른 말단에 있는 로마토그래피 매트릭스/피펫 팁에 존재하는 “상하(up and down)” 방식으로 수행될 수 있다. 대안적으로, 크로마토그래피는 또한 크로마토그래피 물질(고정상)이, 예를 들어 흔들기, 회전 또는 예를 들어 피펫에 의해 유체 샘플의 반복적인 접촉 및 제거 하에서 세포를 함유하는 샘플과 인큐베이션되는 배치 모드(batch mode)로 수행될 수 있다.
일부 측면에서, 물질이 세포의 크로마토그래피 단리에 적합한 한, 임의의 물질이 본 발명의 맥락에서 크로마토그래피 매트릭스로 이용될 수 있다. 특정 측면에서, 적합한 크로마토그래피 물질은, 세포 단리 및/또는 세포 분리를 위해 원하는 조건 하에서 패킹된 크로마토그래피 컬럼으로 사용될 경우, 세포 생존 능력에 적어도 무해하거나 본질적으로 무해하거나, 예를 들어 유해하지 않다. 일부 측면에서, 크로마토그래피 매트릭스는 미리 정의된 위치(location), 전형적으로 미리 정의된 적소(position)에 남아있는 반면, 분리될 샘플 및 그 안에 포함된 성분의 위치는 변경된다. 따라서, 일부 측면에서, 크로마토그래피 매트릭스는 "고정상(stationary phase)"이다.
전형적으로, 각각의 크로마토그래피 매트릭스는 고체 또는 반고체 상의 형태를 갖는 반면, 단리/분리될 표적 세포를 함유하는 샘플은 유체상이다. 크로마토그래피 분리를 달성하는 데 사용되는 이동상은 마찬가지로 유체상이다. 크로마토그래피 매트릭스는, 종이 기질 또는 막을 포함(실시예 섹션 참조)하는 미립자 물질(임의의 적절한 크기 및 모양) 또는 단일체 크로마토그래피 물질일 수 있다. 따라서, 크로마토그래피는 컬럼 크로마토그래피 및 평면 크로마토그래피 둘 다일 수 있다. 표준 크로마토그래피 컬럼 외에, 여기에 기재된 바와 같은 컬럼 기반/통과액 방식 기반 세포의 크로마토그래피 분리를 위해 양방향 흐름 또는 피펫 팁을 허용하는 컬럼이 사용될 수 있다. 따라서, 일부 경우에, 양방향 흐름을 허용하는 피펫 팁 또는 칼럼은 본 발명의 방법에 유용한 크로마토그래피 칼럼에 의해서 구성된다. 일부 측면에서, 미립자 매트릭스 물질이 사용되고, 상기 미립자 매트릭스 물질은, 예를 들어 약 5 ㎛ 내지 약 200 ㎛ 또는 약 5 ㎛ 내지 약 400 ㎛ 또는 약 5 ㎛ 내지 약 600 ㎛의 평균 입자 크기를 가질 수 있다. 일부 측면에서, 평면 크로마토그래피가 사용되고, 매트릭스 물질은, 평면 크로마토그래피에 적합한 임의의 물질, 예를 들어 통상적인 셀룰로스 기반 또는 유기 중합체 기반 막(예를 들어 종이 막, 니트로셀룰로스 막 또는 폴리비닐리덴 디플로우라이드(polyvinylidene difluoride, PVDF) 막) 또는 실리카 코팅 유리판일 수 있다. 한 구현예에서, 크로마토그래피 매트릭스/고정상은 비-자성 재료 또는 비-자화가능한 재료이다.
일부 측면에서, 크로마토그래피 매트릭스/고정상은 비자성 물질 또는 비자화 가능 물질이다. 상기 물질은 유도체화 실리카 또는 가교된 겔을 포함할 수 있다. 가교된 겔(전형적으로 비드 형태로 제조됨)은 가교된 다당류와 같은 천연 중합체를 기반으로 할 수 있다. 폴리사카라이드 매트릭스의 예는 제한되지는 않지만 아가로스 겔(agarose gel)(예를 들어 상이한 비드 및 포어 크기로 상업적으로 입수가능한 SuperflowTM 아가로스 또는 Sepharose® 물질 예를 들어 SuperflowTMSepharose®) 또는 가교된 덱스트란(들)의 겔을 포함한다. 추가의 예시적인 구체예는 Sephadex® 또는 Superdex®(둘 다 GE Healthcare로부터 구입가능함)로서 (다양한 비드 크기로 그리고 다양한 포어 크기를 갖는 것으로) 상업적으로 입수가능한, 덱스트란이 공유결합되는 미립자 가교된 아가로스 매트릭스이다. 상기 크로마토그래피 물질의 또다른 예시적 구체예는 또한 GE Healthcare로부터 구입가능한 상이한 비드 및 포어 크기로 입수가능한 Sephacryl®이다.
일부 구현예에서, 가교된 겔은 또한 합성 중합체, 예를 들어 자연에서 일어나지 않는 중합체 클래스에 기반할 수 있다. 적합한 예는 아가로스 겔 또는 가교된 덱스트란(들) 겔을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 가교된 겔은 또한 합성 중합체, 즉 자연에서 발생하지 않는 중합체 부류에 기초할 수 있다. 일반적으로, 세포 분리를 위한 크로마토그래피 고정상이 기초하는 상기 합성 중합체는 극성 단량체 단위를 갖고, 따라서 그 자체가 극성인 중합체이다. 따라서, 일부 경우에, 상기 극성 중합체는 친수성이다. 친수성 분자(지방성이라고도 함)는 일부 측면에서 물 분자와 쌍극자-쌍극자 상호 작용을 형성할 수 있는 모이어티를 함유한다. 일반적으로, 소수성 분자(친유성이라고도 함)는 물과 분리되는 경향을 갖는다.
적합한 합성 중합체의 예시적인 예는 폴리아크릴아미드(들), 스티렌-디비닐벤젠 겔 및 아크릴레이트 및 디올의 공중 합체 또는 아크릴아미드 및 디올의 공중합체이다. 예시적인 예는 Fractogel®로 시판되는 폴리메타크릴레이트 겔이다. 추가 예는 Toyopearl®로 시판되는 에틸렌 글리콜 및 메타크릴레이트의 공중합체이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 고정상은 또한 천연 및 합성 중합체 성분, 예를 들어 복합 매트릭스 또는 복합물 또는 다당류 및 아가로스의 공중합체, 예를 들어 폴리아크릴아미드/아가로스 복합물 또는 다당류 및 N, N'-메틸렌비스아크릴아미드의 공중합체를 포함할 수 있다. 덱스트란 및 N, N'-메틸렌비스아크릴아미드의 공중합체의 예시적인 예는 상기 언급된 Sephacryl® 계열 물질이다. 유도체화 실리카는 합성 또는 천연 중합체에 결합된 실리카 입자를 포함할 수 있다. 상기 구현예의 예는 다당류 접목 실리카, 폴리비닐-피롤리돈 접목 실리카, 폴리에틸렌 옥사이드 접목 실리카, 폴리(2-히드록시에틸아스파트아미드) 실리카 및 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 접목 실리카를 포함하나 이에 국한되지 않는다.
본 발명에 이용되는 크로마토그래피 매트릭스는, 일부 구현예에서, 예를 들어 여기에 기재된 바와 같은 제거 카트리지에 사용될 경우 겔 여과(크기 배제로도 공지) 매트릭스이다. 겔 여과는 적어도 본질적으로 분리될 세포와 상호 작용을 하지 않도록 설계된 속성으로 특성화될 수 있다. 따라서, 겔 여과 매트릭스는 주로 크기를 기준으로 여기에 정의된 바와 같은 세포 또는 기타 생물학적 독립체의 분리를 가능하게 한다. 각각의 크로마토그래피 매트릭스는 상기 언급된 바와 같은 전형적으로 미립자 다공성 물질이다. 크로마토그래피 매트릭스는 특정 배제 한계를 가질 수 있으며, 이는 전형적으로 분자가 세공에 들어가는 것에서 완전히 배제되는 상기 분자량의 관점에서 정의된다. 크기 배제 한계를 정의하는 각각의 분자량은, 분리될 표적 세포(또는 생물학적 독립체)의 무게에 해당하는 무게 이하로 선택될 수 있다. 상기 구현예에서, 표적 세포는 크기 배제 크로마토그래피 매트릭스의 세공으로 들어가는 것이 방지된다. 마찬가지로, 친화도 크로마토그래피 매트릭스인 고정상은 선택된 표적 세포의 크기보다 더 작은 크기의 세공을 가질 수 있다. 예시적인 구현예에서, 친화도 크로마토그래피 매트릭스 및/또는 겔 여과 매트릭스는 0 내지 약 500 nm의 평균 세공 크기를 갖는다.
수용체 결합 분자 또는 경쟁 시약과 같은 샘플에 존재하는 다른 성분은 세공의 배제 한계 이하의 크기를 가질 수 있고, 상기는 크기 배제 크로마토그래피 매트릭스의 세공에 들어갈 수 있다. 세공 부피에 부분적으로 또는 완전히 들어갈 수 있는 상기 성분 중, 세공 부피에 덜 접근하는 보다 큰 분자는 일반적으로 먼저 용출되는 반면, 가장 작은 분자는 마지막에 용출된다. 일부 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피 매트릭스의 배제 한계는 표적 세포의 최대 폭 미만이 되도록 선택된다. 따라서, 세공 부피에 접근하는 성분은, 일반적으로 표적 세포보다 크기 배제 크로마토그래피 매트릭스 안/상에서 더 오래 머무를 것이다. 따라서, 표적 세포는 샘플의 다른 물질/성분과 별개로 크로마토그래피 컬럼의 용출액에서 수집될 수 있다. 따라서, 수용체 결합 시약 또는 적용 가능한 경우 경쟁 시약과 같은 성분은 표적 세포보다 겔 여과 매트릭스에서 보다 나중 시점에 용출된다. 겔 투과 매트릭스가, 샘플에 존재하는 수용체 결합 시약 및/또는 경쟁 시약과 같은 시약에 결합할 수 있는 결합 부위, 예를 들어 결합 부위 Z를 포함하는 친화도 시약(일반적으로 상기에 공유 결합)을 포함하는 경우, 상기 분리 효과는 더 증가될 것이다. 수용체 결합 시약 및/또는 경쟁 시약은 친화도 시약의 결합 부위 Z에 의해 결합될 것이고, 이로써 겔 투과 매트릭스 상에 고정될 것이다. 상기 방법은 일반적으로 본 발명에 사용된 바와 같은 제거 카트리지에서 수행되고, 일부 구현예에서 본 발명에 따른 방법, 조합 및 키트는 상기 겔 여과 매트릭스를 포함하고/거나 이용한다. 그러므로 각 방법에서, 세포는 크기를 기준으로 분리된다.
본 발명에 이용되는 크로마토그래피 매트릭스는 또한 하나 이상의 자기적 유인 가능 입자 또는 자성 유체와 같은 자기적 유인 가능 물질을 포함할 수 있다. 각각의 자기적 유인 가능 입자는 표적 세포에 결합할 수 있는 결합 부위를 갖는 다량체화 시약 또는 친화도 시약을 포함할 수 있다. 자기적 유인 가능 입자는 반자성, 강자성, 상자성 또는 초상자성 물질을 함유할 수 있다. 초상자성 물질은 영구 자화를 초래하지 않으면서 유도 자기장이 있는 자기장에 반응한다. 산화철을 기반으로 한 자성 입자는, 예를 들어 Dynal Biotech의 Dynabeads®로서, Miltenyi Biotec의 자성 MicroBeads로서, CPG Inc.의 자성 다공성 유리 비드로서 및 몇 가지만 예로 들자면 Roche Applied Science, BIOCLON, BioSource International Inc., micromod, AMBION, Merck, Bangs Laboratories, Polysciences 또는 Novagen Inc.와 같은 다양한 다른 출처에서 상업적으로 이용 가능하다. 초상자성 Co 및 FeCo에 기초한 자성 나노 입자 및 강자성 Co 나노 결정이, 예를 들어 문헌 「Hutten, A. et al. (J. Biotech. (2004), 112, 47-63)」에 기재되어 있다. 그러나, 일부 구현예에서, 본 발명에 이용된 크로마토그래피 매트릭스는 임의의 자기적 유인 가능 물질이 없다.
수용체 결합 시약
위에서 기술한 바와 같이, 특정 측면에서, 본원에서 제공된 상기 방법은 수용체 결합 시약을 사용한다. 일부 구현예에서, 이 섹션에서 기술된 상기 시약은 수용체 결합 시약이다. 일부 구현예에서, 상기 수용체 결합 시약은 세포의 표면 상의 분자, 예를 들어 세포 표면 분자에 결합한다. 일부 경우에, 상기 세포 표면 분자는 선택 마커이다. 일부 구현예에서, 상기 수용체 결합 시약은 샘플 중의 하나 이상의 세포에 의해서 발현된 선택 마커에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시 내용 전체에 걸쳐 분자, 예를 들어 세포 표면 분자 또는 세포 표면 수용체에 대한 특이적 결합에 대한 언급은 제제가 이러한 분자에만 결합한다는 것을 반드시 의미하지는 않는다. 예를 들어 분자에 특이적으로 결합하는 시약은 일반적으로는 예를 들어 면역 분석, BIAcore® KinExA 3000 인스트루먼트(Sapidyne Instruments, Boise, ID) 또는 다른 분석에 의해서 결정된 훨씬 낮은 친화도를 갖는 다른 분자에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 특정 자극 조건하에 그의 친화도 또는 결합력이 충분한 통계학적 크기의 랜덤 펩티드 또는 폴리펩티드의 수집에 대해 동일한 제제의 평균 친화도 또는 결합력에 비해 적어도 5 배 많이, 예를 들어 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 100, 250 또는 500 배 많이, 또는 심지어는 적어도 1000 배 많이 되도록 표적 분자에 결합하는 시약의 능력을 갖는다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, 표적 세포(예를 들어, T 세포)는 세포 표면 상에 분자, 예를 들어 선택 마커를 갖거나 발현하여, 선택될 세포가 하나 이상의 특이적인 공통 분자(예를 들어 선택 마커)의 존재에 의해 정의된다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플은 또한 분자(예를 들어, 선택 마커)가 없는 추가 세포를 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, T 세포는 다중 세포 유형, 예를 들어 적혈구 또는 B 세포를 함유하는 샘플에서 선택될 수 있다. 선택 마커 및 수용체 분자는 본원에서는 호환가능하게 세포 표면 분자를 지칭하는 것으로 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 표면, 예를 들어 표적 세포 표면에 위치한 수용체 분자는 본 발명에 따른 방법에서 크로마토그래피 분리 과정 중 세포 표면에 공유 또는 비공유 결합된 상태로 유지되는 한 임의의 분자일 수 있다. 수용체 분자는 수용체 결합 시약이 유도될 수 있는 분자이다. 일부 구현예에서, 수용체는 막 수용체 단백질과 같은 펩티드 또는 단백질이다. 일부 구현예에서, 수용체는 지질, 다당류 또는 핵산이다. 단백질인 수용체는 주변 막 단백질 또는 통합된 막 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 막에 걸쳐 하나 이상의 도메인이 있을 수 있다. 특정 구현예에서, 수용체 분자는 면역 세포의 표면 단백질, 예를 들어 CD4, CD8, 또는 CD57이다. 일부 경우에, T 세포에 있어서 상기 수용체 분자는 CD3이다. 일부 경우에, T 세포에 있어서 상기 수용체 분자는 CD4 또는 CD8이다. 일부 구현예에서, 수용체 분자는 원하는 세포 집단 또는 하위 집단, 예를 들어 혈액 세포의 집단 또는 하위 집단, 예를 들어 림프구(예를 들어 T 세포, CD57+ T 세포, CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포)를 정의하는 항원일 수 있다.
일부 측면에서, 세포 표면 분자, 예를 들어 선택 마커는, 바람직한 세포 집단 또는 하위 집단, 예를 들어 혈액 세포 집단 또는 하위 집단, 예를 들어 림프구(예를 들어 T 세포, T 헬퍼 세포, 예를 들어 CD57- T 세포, CD3+ T 세포, CD8+ T세포, CD4+ T 헬퍼 세포, B 세포 또는 자연 살해 세포), 단핵구 또는 줄기 세포, 예를 들어 CD34 양성 말초 줄기 세포 또는 Nanog 또는 Oct-4 발현 줄기 세포를 정의하는 항원일 수 있다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 T 세포 또는 T 세포의 하위 세트의 표면 상에 발현된 마커, 예를 들어 CD57, CD25, CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD3, CD4, CD8, CD45RA 및/또는 CD45RO일 수 있다. T 세포의 예로는 CMV 특이적 CD8+ T 림프구, 세포 독성 T 세포, 기억 T 세포 및 조절 T 세포(Treg)와 같은 세포가 포함된다. Treg의 예시적인 예는 CD4 CD25 CD45RA Treg 세포를 포함하고, 기억 T 세포의 예시적인 예는 CD62L CD8+ 특이적 중앙 기억 T 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 수용체 결합 시약은 결합 부위 B를 갖거나 함유한다. 특정 구현예에서, 결합 부위 B는 1가이다. 일부 측면에서, 1가 결합 부위 B는 면역글로불린 유사 기능, 압타머 또는 MHC 분자를 가진 1가 항체 단편 또는 단백질성 결합 분자이거나 상기를 함유한다. 1가 항체 단편의 예는 Fab 단편, FV 단편 및 2가 단일 사슬 Fv 단편을 포함한 단일 사슬 Fv 단편(scFv)을 포함하나 이에 국한되지 않는다. (재조합) 항체 단편의 예는 Fab 단편, FV 단편, 단일 사슬 Fv 단편(scFv), 2가 항체 단편, 예를 들어 (Fab)2'-단편, 디아바디, 트리아바디(Iliades, P., et al., FEBS Lett (1997) 409, 437-441), 데카바디(Stone, E., et al., Journal of Immunological Methods (2007) 318, 88–94) 및 기타 도메인 항체(Holt, L.J., et al., Trends Biotechnol. (2003), 21, 11, 484-490)이다. 일부 구현예에서, 수용체 분자 결합 시약의 하나 이상의 결합 부위는 "듀오칼린(duocalin)"으로도 공지된 2량체 리포칼린 뮤테인과 같은 2가 단백질성 인공 결합 분자일 수 있다. 일부 구현예에서, 수용체 결합 시약은 단일 제2 결합 부위를 가질 수 있으며, 즉 1가일 수 있다. 1가 수용체 결합 시약의 예는, 1가 항체 단편, 항체 유사 결합 특성을 갖는 단백질성 결합 분자 또는 MHC 분자를 포함하나 이에 국한되지 않는다.
적합한 단백질성 결합 분자의 추가 예는 EGF 유사 도메인, 크링글 도메인(Kringle-domain), 피브로넥틴 유형 I 도메인, 피브로넥틴 유형 Ⅱ 도메인, 피브로넥틴 유형 Ⅲ 도메인, PAN 도메인, G1a 도메인, SRCR 도메인, Kunitz/Bovine 췌장 트립신 억제제 도메인, 텐다미스타트(tendamistat), Kazal-유형 세린 프로테아제 억제제 도메인, Trefoil(P-유형) 도메인, von Willebrand 인자 유형 C 도메인, 아나필라톡신 유사 도메인, CUB 도메인, 다이로글로블린(thyroglobulin) 유형 I 반복, LDL-수용체 클래스 A 도메인, Sushi 도메인, 결합 도메인, 트롬보스폰딘(Thrombospondin) 유형 I 도메인, 면역 글로불린 도메인 또는 면역 글로불린 유사 도메인 (예를 들어 도메인 항체 또는 낙타 중쇄 항체), C-유형 렉틴 도메인, MAM 도메인, von Willebrand 인자 유형 A 도메인, 소마토메딘(Somatomedin) B 도메인, WAP-유형 4개의 이황화물 코어 도메인, F5/8 유형 C 도메인, 헤모펙신(Hemopexin) 도메인, SH2 도메인, SH3 도메인, 라미닌-유형 EGF 유사 도메인, C2 도메인, "카파바디(Kappabodies)"(Ill. et al., Protein Eng (1997) 10, 949-57 참조, 소위 "미니바디(minibody)"(Martin et al., EMBO J (1994) 13, 5303-5309), 디아바디(Holliger et al., PNAS USA (1993)90, 6444-6448. 참조), 소위 “야누시스(Janusis)”(Traunecker et al., EMBO J (1991) 10, 3655-3659 또는 Traunecker et al., Int J Cancer (1992) Suppl 7, 51-52. 참조), 나노바디, 마이크로바디, 아필린(affilin), 아피바디(affibody), 크노틴(knottin), 유비퀴틴, 아연-핑거 단백질, 자가 형광 단백질 또는 류신-리치 반복 단백질이다. 항체 유사 기능을 갖는 핵산 분자의 예는 압타머이다. 압타머는 정의된 3 차원 모티프로 접히고, 주어진 표적 구조에 대해 높은 친화도를 나타낸다.
특정 측면에서, 수용체 결합 단백질은 결합 파트너 C를 함유한다. 일부 측면에서, 수용체 결합 시약에 포함된 결합 파트너 C는, 예를 들어 탄화수소 기반(중합체 포함)일 수 있고, 질소-, 인-, 황-, 카르벤-, 할로겐- 또는 슈도할로겐 기를 포함할 수 있다. 상기는 알코올, 유기산, 무기산, 아민, 포스핀, 티올, 이황화물, 알칸, 아미노산, 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 지질, 당류, 올리고당류 또는 다당류일 수 있다. 추가 예로서, 상기는 또한 양이온, 음이온, 다중 양이온, 다중 음이온, 다중 양이온, 전해질, 고분자 전해질, 탄소 나노튜브 또는 탄소 나노폼(nanofoam)일 수 있다. 일반적으로, 상기 결합 파트너는 다른 물질에 대해서보다 다량체화 시약의 결합 부위에 대해 보다 높은 친화도를 갖는다. 각각의 결합 파트너의 예는 크라운 에테르, 면역 글로불린, 이의 단편 및 항체 유사 기능을 갖는 단백질성 결합 분자를 포함하나 이에 국한되지 않는다.
일부 구현예에서, 수용체 결합 시약에 포함된 결합 파트너 C는 비오틴을 포함하고, 친화도 시약은 비오틴에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘 유사체 또는 아비딘 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체 결합 시약에 포함된 결합 파트너 C는 스트렙타비딘 또는 아비딘에 가역적으로 결합하는 비오틴 유사체를 포함하고, 친화도 시약은 각각의 비오틴 유사체에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘, 아비딘, 스트렙타비딘 유사체 또는 아비딘 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체 결합 시약에 포함된 결합 파트너 C는 스트렙타비딘 또는 아비딘 결합 펩티드를 포함하고, 친화도 시약은 각각의 스트렙타비딘 또는 아비딘 결합 펩티드에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘, 아비딘, 스트렙타비딘 유사체 또는 아비딘 유사체를 포함한다.
일부 구현예에서, 수용체 결합 시약에 포함된 결합 파트너는 스트렙타비딘 결합-펩티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 서열은 일반적인 화학식 His-Pro-Xaa(여기서 Xaa는 글루타민, 아스파라긴 또는 메티오닌)를 갖는 서열을 함유하고, 예를 들어 서열 번호 78에 제시된 서열에 함유된 것이다. 일부 구현예에서, 펩티드 서열은 서열 번호 69에 제시에 제시된 일반식, 예를 들어 서열 번호 79에 제시된 것을 갖는다. 한 구체예에서, 펩티드 서열은 Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(Strep-tag®로도 명명, 서열 번호 75에 제시됨)이다. 한 구체예에서, 상기 펩티드 서열은 Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (Strep-tag®로도 명명, 서열 번호 90에 제시됨)이다. 한 구체예에서, 펩티드 서열은 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(Strep-tag® Ⅱ로도 명명, 서열 번호 69에 제시됨)이고, 이는 미국특허 제6,103,493호에 기재되어 있고, 예를 들어 Strep-Tactin® 상표로 시판된다. 스트렙타비딘 결합-펩티드는, 예를 들어 미국특허 제5,506,121호에 기재된 "Strep-tag®"와 같은 단일 펩티드 또는 예를 들어 국제공개공보 제WO 02/077018호 또는 미국특허 제7,981,632호에 기재된 바와 같은 2개 이상의 개별 결합 분자의 순차적 배열을 갖는 스트렙타비딘 결합-펩티드일 수 있다.
일부 구현예에서, 수용체 결합 시약의 결합 파트너 C는 친화도 태그로서 당업자에게 공지된 모이어티를 포함한다. 상기 구현예에서, 친화도 시약은 상응하는 결합 파트너, 예를 들어 친화도 태그에 결합하는 것으로 공지된 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 공지된 친화도 태그의 몇 가지 예시적인 예로서, 수용체 결합 시약에 포함된 결합 파트너는 디니트로페놀 또는 디곡 시게닌, 올리고히스티딘, 폴리히스티딘, 면역 글로불린 도메인, 말토스 결합 단백질, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(glutathione-S-transferase, GST), 키틴 결합 단백질(chitin binding protein, CBP) 또는 티오레독신, 칼모둘린 결합 펩티드(calmodulin binding peptide, CBP), FLAG'-펩티드, HA-태그, VSV-G- 태그, HSV-태그, T7 에피토프, 말토오스 결합 단백질(maltose binding protein, MBP), 단순 포진 바이러스 당 단백질 D 서열의 HSV 에피토프, 전사 인자 c-myc 서열의 "myc" 에피토프, V5-태그 또는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)를 포함할 수 있다. 상기 구현예에서, 친화도 시약의 하나 이상의 결합 부위 사이에 형성된 복합체, 이 경우 항체 또는 항체 단편 및 항원은 자유 항원, 즉 자유 펩티드(에피토프 태그) 또는 자유 단백질(예를 들어 MBP 또는 CBP)을 첨가함으로써 경쟁적으로 파괴될 수 있다. 친화도 태그는 올리고뉴클레오티드 태그일 수도 있다. 상기 올리고뉴클레오티드 태그는, 예를 들어 친화도 시약에 연결되거나 포함된 상보적 서열을 가진 올리고뉴클레오티드와 혼성화하는 데 사용될 수 있다.
국제출원 제PCT/EP2012/063969호(국제공개공보 제WO 2013/011011호)에 따라(모든 목적을 위해 이의 전문이 여기에 참조로 포함됨), 수용체 결합 시약과 표적 세포 상의 수용체 분자 사이의 결합 강도는, 수용체 결합 시약을 통해 친화도 시약에 대한 표적 세포의 결합 가역성에 필수적이지 않을 수 없다. 오히려, 결합의 강도와 관계없이, 결합 부위 B를 통한 수용체 결합 시약과 수용체 분자 사이의 결합에 대한 평형 해리 상수(KD)가, 예를 들어 약 10-3 내지 약 10-7 M 의 KD 범위로 낮은 친화도이거나 예를 들어 약 10-7 내지 약 1×10-10 M의 KD 범위로 높은 친화도인지가 중요하고, 표적 세포는 결합 부위 B를 통한 수용체 결합 시약과 수용체 분자의 결합의 해리가 충분히 빠르게 발생하는 한 가역적으로 염색될 수 있다. 이와 관련하여 결합 부위 B를 통한 수용체 결합 시약과 수용체 분자 사이의 결합에 대한 해리 속도 상수(koff)는 약 3×10-5 sec-1 이상의 값을 가질 수 있다(상기 해리 속도 상수는 수용체 결합 시약의 결합 부위 B와 표적 세포 표면 상의 수용체 분자 사이에 형성된 복합체의 해리 반응을 특징짓는 상수이다). 수용체 결합 시약의 결합 부위 B와 표적 세포 표면 상의 수용체 분자 사이의 결합 반응에 대한 결합 속도 상수(kon)는 임의의 값을 가질 수 있다. 수용체 분자와 수용체 결합 시약 사이의 충분히 가역적인 결합을 보장하기 위해, 약 3×10-5 sec-1 이상, 약 5×10-5 sec-1 이상, 예를 들어 (약) 1×10-4 sec-1 이상, 5×10-4 sec-1 이상, 1×10-3 sec-1 이상, 5×10-3 sec-1 이상, 1×10-2 sec-1 이상, 1×10-1 sec-1 이상 또는 5×10-1 sec-1 이상의 값을 갖는 결합 평형의 koff 값을 선택하는 것이 유리하다. 여기에 사용된 바와 같은 동역학 및 열역학 상수의 값은 대기압, 즉 1.013 bar 및 실온, 즉 25℃의 조건을 참조함에 유의한다.
일부 구현예에서, 수용체 결합 시약은 수용체 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 단일(1가) 결합 부위 B를 갖는다. 일부 구현예에서, 수용체 결합 시약은 수용체 분자에 결합할 수 있는 2개 이상(즉, 3, 4 또는 또한 5개의 동일한 결합 부위 B를 포함하는 복수의 결합 부위 B)을 갖는다. 상기 임의의 구현예에서, 결합 부위(들) B (각각)을 통한 수용체 분자의 결합은 약 3×10-5 sec-1 이상의 koff 값을 가질 수 있다. 따라서, 수용체 결합 시약은 1가, 예를 들어 1가 항체 단편 또는 1가 인공 결합 분자(단백질 또는 기타), 예를 들어 리포칼린 패밀리의 폴리펩티드("Anticalin®"으로도 공지)에 기초한 뮤테인 또는 두 결합 부위가 유지되는 항체 또는 단편과 같은 2가 분자, 예를 들어 F(ab')2 단편일 수 있다. 일부 구현예에서, 수용체 분자는 3×10-5 sec-1 이상의 koff 속도를 제공하는 펜타머 IgE 분자와 같은 다가 분자일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 Fab는 항-CD57 Fab이다. 특정 구현예에서, 상기 Fab 항-CD4 Fab이다. 일부 구현예에서, 상기 Fab는 항-CD8 Fab이다.
본 발명의 일부 구현예에서, 여기에 기재된 가역적인 세포 친화도 크로마토그래피 기술을 통한 생물학적 물질의 (흔적이 없는) 단리를 제공하는 것은 표적 세포 상의 수용체 분자와 적어도 결합 부위 B를 통한 수용체 결합 시약의 결합의 koff 속도(3×10-5 sec-1 이상)가 아닌 분자 수준 상에서이다. 오히려, 예를 들어 미국특허 제7,776,562호 또는 국제공개공보 제WO02/054065호에 기재된 바와 같이, 고정된 친화도 시약을 통해 매개된 열성 효과와 함께 결합 수용체 결합 시약의 결합 부위 B와 수용체 분자 사이의 낮은 친화도 결합은 표적 세포의 가역적이고 흔적 없는 단리를 허용한다. 상기 구현예에서, 친화도 시약의 2개 이상의 결합 부위 Z와 2개 이상의 수용체 결합 시약의 결합 파트너 C 사이에 복합체가 형성될 수 있고, 이는 (표적 세포에서 수용체 결합 시약의 해리를 교대로 초래하는 결합 부위 Z와 결합 파트너 C 사이에 형성된 결합 (복합체)를 파괴할 경쟁 시약의 첨가를 통해) 친화도 크로마토그래피 매트릭스에서 표적 세포의 가역적인 고정 및 후속적인 용출을 가능하게 한다. 상기 언급된 바와 같이, 상기 낮은 결합 친화도는, 결합 부위 B를 통한 수용체 결합 시약과 표적 세포 표면 상의 수용체 분자의 결합에 대해 약 1.0×10-3 M 내지 약 1.0×10-7 M 범위의 해리 상수(KD)로 특징지워질 수 있다.
일부 구현예에서, 선택 마커는 CD57일 수 있고, 수용체-결합 제제는 특이적으로 CD57에 결합한다. 일부 측면에서, CD3에 특이적으로 결합하는 수용체-결합 제제는, 항-CD57 항체, 항-CD57 항체의 2가 항체 단편, 항-CD57 항체의 1가 항체 단편 및 항체-유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD57 결합 분자로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 선택 제제는 항-CD57 Fab 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 선택 마커는 CD4일 수 있고, 선택 제제는 특이적으로 CD4에 결합한다. 일부 측면에서, CD4에 특이적으로 결합하는 선택 제제는, 항-CD4 항체, 항-CD4 항체의 2가 항체 단편, 항-CD4 항체의 1가 항체 단편 및 항체 유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD4 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD4 항체, 예를 들어 2가 항체 단편 또는 1가 항체 단편(예를 들어 CD4 Fab 단편)은 13B8.2 항체 또는 CD4에 대한 특이적 결합을 유지하는 13B8.2의 기능적 활성 돌연변이체에서 유래될 수 있다. 예를 들어 13B8.2 항체 또는 m13B8.2의 예시적인 돌연변이체는 미국특허 제7,482,000호, 미국특허출원 제US2014/0295458호 또는 국제공개공보 제WO2013/124474호; 및 문헌 「Bes, C, et al. J Biol Chem 278, 14265-14273 (2003)」에 기재되어 있다. "ml3B8.2"로 명명된 돌연변이체 Fab 단편은, 미국특허 제7,482,000호에 기재된 바와 같이, CD4 결합 뮤린 항체 13B8.2의 가변 도메인 및 중쇄에 대해 감마 유형의 인간 불변 CH1 도메인 및 카파 유형의 인간 불변 경쇄 도메인을 함유하는 불변 도메인을 갖는다. 일부 구현예에서, 항-CD4 항체, 예를 들어 13B8.2 항체의 돌연변이체는, 카바트(Kabat) 넘버링에 의해 각각, 가변 경쇄에서 H91A 아미노산 대체, 가변 경쇄에서 Y92A 아미노산 대체, 가변 중쇄에서 H35A 아미노산 대체 및/또는 가변 중쇄에서 R53A 아미노산 대체를 함유한다. 일부 측면에서, ml3B8.2에서 13B8.2 Fab 단편의 가변 도메인에 비해, 경쇄의 91번 위치(서열 번호 96의 93번 위치)에서 His 잔기는 Ala으로 돌연변이되고, 중쇄의 53번 위치(서열 번호 95의 55번 위치)에서 Arg 잔기는 Ala으로 돌연변이된다. 일부 구현예에서, 항-CD4 또는 이의 단편에 가역적으로 결합하는 시약은 상업적으로 이용 가능하거나 상업적으로 이용 가능한 시약(예를 들어 카탈로그 번호 6-8000-206 또는 6-8000-205 또는 6-8002-100; IBA GmbH, Gottingen, Germany)에서 유래된다. 일부 구현예에서, 수용체-결합 제제는 항-CD4 Fab 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD4 Fab 단편은 서열 번호 95에 제시된 서열을 갖는 가변 중쇄 및 서열 번호 96에 제시된 서열을 갖는 가변 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD4 Fab 단편은 서열 번호 95에 제시된 서열을 갖는 가변 중쇄의 CDR 및 서열 번호 96에 제시된 서열을 갖는 가변 경쇄의 CDR을 포함한다.
일부 구현예에서, 선택 마커는 CD8일 수 있고, 수용체-결합 제제는 특이적으로 CD8에 결합한다. 일부 측면에서, CD8에 특이적으로 결합하는 수용체-결합 제제는, 항-CD8 항체, 항-CD8 항체의 2가 항체 단편, 항-CD8 항체의 1가 항체 단편 및 항체 유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD8 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD8 항체, 예를 들어 2가 항체 단편 또는 1가 항체 단편(예를 들어 CD8 Fab 단편)은 OKT8 항체(예를 들어 ATCC CRL-8014) 또는 CD8에 대한 특이적 결합을 유지하는 이의 기능적 활성 돌연변이체에서 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD8 또는 이의 단편에 가역적으로 결합하는 시약은 상업적으로 이용 가능하거나 상업적으로 이용 가능한 시약(예를 들어 카탈로그 번호 6-8003 또는 6-8000-201; IBA GmbH, Gottingen, Germany)에서 유래된다. 일부 구현예에서, 수용체-결합 제제는 항-CD8 Fab 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD8 Fab 단편은 서열 번호 97에 제시된 서열을 갖는 가변 중쇄 및 서열 번호 98에 제시된 서열을 갖는 가변 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD8 Fab 단편은 서열 번호 97에 제시된 서열을 갖는 가변 중쇄의 CDR 및 서열 번호 98에 제시된 서열을 갖는 가변 경쇄의 CDR을 포함한다.
일부 구현예에서, 선택 마커는 CD3일 수 있고, 수용체-결합 제제는 특이적으로 CD3에 결합한다. 일부 측면에서, CD3에 특이적으로 결합하는 수용체-결합 제제는, 항-CD3 항체, 항-CD3 항체의 2가 항체 단편, 항-CD3 항체의 1가 항체 단편 및 항체 유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD3 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체, 예를 들어 2가 항체 단편 또는 1가 항체 단편(예를 들어 CD3 Fab 단편)은 OKT3 항체(예를 들어 ATCC CRL-8001; 예를 들어 문헌 「Stemberger et al. PLoS One. 2012; 7(4): e35798」 참조) 또는 CD3에 대한 특이적 결합을 유지하는 이의 기능적 활성 돌연변이체에서 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD3 또는 이의 단편에 가역적으로 결합하는 시약은 상업적으로 이용 가능하거나 상업적으로 이용 가능한 시약(예를 들어 카탈로그 번호 6-8000-201, 6-8001-100; IBA GmbH, Gottingen, Germany)에서 유래된다. 일부 구현예에서, 수용체-결합 제제는 항-CD3 Fab 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 Fab 단편은 서열 번호 93에 제시된 서열을 갖는 가변 중쇄 및 서열 번호 94에 제시된 서열을 갖는 가변 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 Fab 단편은 서열 번호 93에 제시된 서열을 갖는 가변 중쇄의 CDR 및 서열 번호 94에 제시된 서열을 갖는 가변 경쇄의 CDR을 포함한다.
임의의 상기 예에서, 2가 항체 단편은 (Fab)2'-단편 또는 2가 단일 사슬 Fv 단편일 수 있는 반면, 1가 항체 단편은 Fab 단편, FV 단편 및 단일 사슬 Fv 단편(scFv)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 임의의 상기 예에서, 항체 유사 결합 특성을 가진 단백질성 결합 분자는 압타머(aptamer), 리포칼린(lipocalin) 패밀리의 폴리펩티드에 기초한 뮤테인(mutein), 글루바디(glubody), 안키린(ankyrin) 스캐폴드에 기초한 단백질, 결정성 스캐폴드에 기초한 단백질, 아드넥틴(adnectin) 및 아비머(avimer)일 수 있다.
특정 구현예에서, 크로마토그래피 단리에 의한 상기 단리 및/또는 선택은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD57-CD3+ T 세포를 포함하는 농축된 T 세포의 하나 이상의 집단을 생성한다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 T 세포의 집단은 본질적으로 CD57-CD3+ T 세포로 구성된다.
특정 구현예에서, 크로마토그래픽 분리에 의한 상기 분리 및/또는 농축은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD57-CD4+ T 세포를 포함하는 농축된 CD4+ T 세포의 집단을 생성한다. 특정 구현예에서, CD4+ T 세포의 입력 조성물은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1%, 또는 0.01% 미만의 CD8+ T 세포를 포함하고/하거나, CD8+ T 세포를 함유하지 않고/않거나 CD8+ T 세포가 존재하지 않거나 실질적으로 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 집단은 필수적으로 CD57-CD4+ T 세포로 구성된다.
특정 구현예에서, 크로마토그래픽 분리에 의한 상기 분리 및/또는 농축은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD57-CD8+ T 세포를 포함하는 농축된 CD57-CD8+ T의 집단을 생성한다. 특정 구현예에서, CD8+ T 세포의 집단은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1%, 또는 0.01% 미만의 CD4+ T 세포를 함유하지 않고/않거나 CD4+ T 세포가 존재하지 않거나 실질적으로 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 집단은 필수적으로 CD57-CD8+ T 세포로 구성된다.
D. 입력 조성물
특정 구현예에서, 제공된 방법은 세포의 입력 집단 또는 조성물(입력 조성물 또는 입력 집단은 본원에서 호환적으로 사용된다)의 생산 또는 제조와 관련하여 사용된다. 일부 구현예에서, 상기 입력 조성물은 생물학적 샘플(예를 들어 1차 T 세포(primary T cell), 예를 들어 백혈구 성분 채집술 또는 성분 채집술 샘플)로부터 T 세포를 선택하기 위해, 기술된 바와 같이 제공된 임의의 방법에 따라, 예를 들어 그 범위 내에서 발생되는 세포이다. 특정 구현예에서, 입력 세포 조성물은 유전자 조작에 사용하기 위한 세포 집단, 예를 들어 유전자 조작될 세포 또는 유전자 조작된 세포를 생성하는 공정를 거치게 될 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포는 재조합 수용체를 암호화하는 핵산으로 치료, 상기와 접촉 또는 인큐베이션될 것이다. 특정 구현예에서, 입력 조성물은 T 세포, 생존 가능한 T 세포, CD57- T 세포, CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 및/또는 이의 하위 집단을 함유한다.
일부 구현예에서, 세포 생존 능력은 염료 흡수 분석(예를 들어 칼세인 AM 분석), XTT 세포 생존 능력 분석 및 염료 배제 분석(예를 들어 트리판 블루, 에오신 또는 프로피듐 염료 배제 분석)을 포함하나 이에 국한되지 않을 수 있는 분석으로 평가된다. 특정 구현예에서, 생존 가능한 세포는 하나 이상의 세포 자멸사 마커, 예를 들어 아넥신 V 또는 활성 카스파제 3의 음성 발현을 갖는다. 일부 구현예에서, 생존 가능한 세포는 카스파제 또는 활성 카스파제, 예를 들어 카스파제 2, 카스파제 3, 카스파제 6, 카스파제 7, 카스파제 8, 카스파제 9 또는 카스파제 10, Bcl-2 패밀리 멤버, 예를 들어 Bax, Bad 및 Bid, 아넥신 V 또는 TUNEL 염색을 포함하나 이에 국한되지 않을 수 있는 하나 이상의 세포 자멸사 마커 발현에 대해 음성이다. 특정 구현예에서, 생존 가능한 세포는 활성 카스파제 3 음성이다. 특정 구현예에서, 생존 가능한 세포는 아넥신 V 음성이다.
일부 구현예에서, 입력 조성물은 농축된 CD57- T 세포, 예를 들어 생존 가능한 CD57- T 세포 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 입력 조성물 중 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 99.9% 이상 또는 (약) 100%의 세포가 CD57- T 세포, 예를 들어 생존 가능한 CD57- T 세포이다. 일부 구현예에서, 입력 집단은 본질적으로 CD57- T 세포, 예를 들어 생존 가능한 CD57- T 세포로 구성된다.
특정 구현예에서, 입력 집단은 농축된 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포, 예를 들어 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포로 농축된 세포 집단이다. 특정 구현예에서, 입력 집단은, CD3+ 세포인 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 99.9% 이상 또는 (약) 100%의 세포이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 입력 집단은, CD4+ 또는 CD8+ T 세포인 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 99.9% 이상 또는 (약) 100%의 세포이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 입력 집단은 본질적으로 CD4+ 및 CD8+ T 세포로 구성된다. 특정 구현예에서, 입력 집단은, CD57-, 예를 들어 생존가능한 CD57- T 세포인 CD3+ T 세포(CD4+ 및 CD8+T 세포)인 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 99.9% 이상 또는 (약) 100%의 세포이거나 이를 포함한다.
특정 구현예에서, 입력 집단은 농축된 CD4+ T 세포 집단이다. 특정 구현예에서, 입력 집단의 세포 중 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 99.9% 이상 또는 (약) 100%의 세포가 CD4+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 입력 집단은 본질적으로 CD4+ T 세포로 구성된다. 특정 구현예에서, 입력 집단은 CD57-, 예를 들어 생존가능한 CD57- T 세포인 CD4+T 세포인 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 99.9% 이상 또는 (약) 100%의 세포이거나 이를 포함한다.
특정 구현예에서, 입력 집단은 농축된 CD8+ T 세포 집단이다. 특정 구현예에서, 입력 집단의 세포 중 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 99.9% 이상 또는 (약) 100%의 세포가 CD8+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 입력 집단은 본질적으로 CD8+ T 세포로 구성된다. 특정 구현예에서, 입력 집단은 CD57-, 예를 들어 생존가능한 CD57- T 세포인 CD8+T 세포인 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 99.9% 이상 또는 (약) 100%의 세포이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ T 세포 집단으로부터의 세포 및 농축된 CD57-CD8+ T 세포 집단으로부터의 세포는 혼합, 조합 및/또는 풀링되어 CD57-CD4+ T 세포 및 CD57-CD8+ T 세포를 함유하는 입력 집단을 생성한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ T 세포 및 CD57-CD8+ T 세포의 집단은 자극 세포, 예를 들어 자극 조건 하에서 세포를 배양하기 전에 풀링(pooled), 혼합 및/또는 조합된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ 및 CD57-CD8+ T 세포의 집단은 동결, 예를 들어 동결 보존 및 농축된 CD57-CD4+ 및 CD57-CD8+ T 세포 집단의 해동 후에 풀링(pooled), 혼합 및/또는 조합된다.
특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ 세포 집단으로부터의 세포를 농축된 CD57-CD8+ 세포 집단으로부터의 세포와 혼합, 풀링 및/또는 조합하여 입력 집단을 생성, 생산 또는 제조한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단은 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 99.9%의 CD57-CD4+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단은 100% CD57-CD4+ T 세포를 함유하거나 약 100% CD57-CD4+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 농축된 T 세포의 집단은 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.01% 미만의 CD57-CD57-CD8+ T 세포를 포함 또는 함유하고/거나 CD57-CD8+ T 세포를 포함하지 않으며/거나 CD57-CD8+ T 세포가 없거나 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 본질적으로 CD57-CD4+ T 세포로 구성된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 집단은 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 99.9% CD8+ T 세포를 함유하거나, 또는 약 100% CD57-CD8+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 집단은 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만 또는 0.01% 미만의 CD57-CD4+ T 세포를 포함하거나 함유하고/거나 또는 CD57-CD4+ T 세포를 함유하지 않고/거나 CD57-CD4+ T 세포가 없거나 또는 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 본질적으로 CD57-CD8+ T 세포로 구성된다.
특정 구현예에서, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포는 1:10 내지 10 : 1, 1:5 내지 5:1, 4:1 내지 1:4, 1:3 내지 3:1, 2:1 내지 1:2, 1.5:1 내지 1:1.5, 1.25:1 내지 1:1.25, 1.2:1 내지 1:1.2, 1.1:1 내지1:1.1, 또는 약 1:1 또는 1:1의 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포의 비로 풀링, 혼합 및/또는 조합된다. 특정 구현예에서, 생존가능한 CD4+ T 세포 및 생존가능한 CD8+ T 세포는 1:10 내지 10 : 1, 1:5 내지 5:1, 4:1 내지 1:4, 1:3 내지 3:1, 2:1 내지 1:2, 1.5:1 내지 1:1.5, 1.25:1 내지 1:1.25, 1.2:1 내지 1:1.2, 1.1:1 내지1:1.1, 또는 약 1:1 또는 1:1의 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포의 비로 풀링, 혼합 및/또는 조합된다.
특정 구현예에서, 입력 조성물은 (약) 50×106, 100×106, 150×106, 200×106, 250×106, 300×106, 350×106, 400×106, 450×106, 500×106, 550×106, 600×106, 700×106, 800×106, 900×106, 1,000×106, 1,100×106 또는 1,200×106개 또는 50×106, 100×106, 150×106, 200×106, 250×106, 300×106, 350×106, 400×106, 450×106, 500×106, 550×106, 600×106, 700×106, 800×106, 900×106, 1,000×106, 1,100×106 또는 1,200×106개 이상의 T 세포, 예를 들어 생존 가능한 T 세포, 생존 가능한 CD3+ T 세포 또는 생존 가능한 혼합 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 양을 갖는다. 특정 구현예에서, 입력 조성물은 (약) 50×106, 100×106, 150×106, 200×106, 250×106, 300×106, 350×106, 400×106, 450×106, 500×106, 550×106, 600×106개 또는 50×106, 100×106, 150×106, 200×106, 250×106, 300×106, 350×106, 400×106, 450×106, 500×106, 550×106, 600×106개 이상의 CD4+ T 세포, 예를 들어 생존 가능한 CD4+ T 세포의 양을 갖는다. 특정 구현예에서, 입력 조성물은 (약) 50×106, 100×106, 150×106, 200×106, 250×106, 300×106, 350×106, 400×106, 450×106, 500×106, 550×106, 600×106개 또는 50×106, 100×106, 150×106, 200×106, 250×106, 300×106, 350×106, 400×106, 450×106, 500×106, 550×106, 600×106개 이상의 CD8+ T 세포, 예를 들어 생존 가능한 CD8+ T 세포의 양을 갖는다. 일부 구현예에서, 세포의 양은, 동일한 조성물에서 함께 풀링, 혼합 및/또는 결합된 생존 가능한 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 양이다. 상기 구현예에서, CD4+ 및 CD8+ T 세포는 1:3 내지 3:1, 2:1 내지 1:2, 1.5:1 내지 1:1.5, 1.25:1 내지 1:1.25, 1.2:1 내지 1:1.2, 1.1:1 내지 1:1.1 또는 약 1:1 또는 1:1의 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포의 비율로 존재한다. 일부 구현예에서, 세포의 양은, (약) 1:1의 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포의 비율로 함께 풀링, 혼합 및/또는 결합된 생존 가능한 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 양이다.
특정 구현예에서, 입력 조성물은 (약) 300×106 내지 600×106 T 세포, 예를 들어 생존 가능한 CD3+ 세포 또는 혼합된 생존 가능한 CD4+ 및 생존 가능한 CD8+ 세포(예를 들어 (약) 1:1의 비율로 혼합됨)의 양을 갖는다. 일부 구현예에서, 입력 조성물은 (약) 300×106, 예를 들어 생존 가능한 CD3+ 세포 또는 혼합된 생존 가능한 CD4+ 및 생존 가능한 CD8+ 세포(예를 들어 (약) 1:1의 비율로 혼합됨)의 양을 갖는다. 일부 구현예에서, 입력 조성물은 (약) 400×106, 예를 들어 생존 가능한 CD3+ 세포 또는 혼합된 생존 가능한 CD4+ 및 생존 가능한 CD8+ 세포(예를 들어 (약) 1:1의 비율로 혼합됨)의 양을 갖는다. 일부 구현예에서, 입력 조성물은 (약) 500×106, 예를 들어 생존 가능한 CD3+ 세포 또는 혼합된 생존 가능한 CD4+ 및 생존 가능한 CD8+ 세포(예를 들어 (약) 1:1의 비율로 혼합됨)의 양을 갖는다. 일부 구현예에서, 입력 조성물은 (약) 600×106, 예를 들어 생존 가능한 CD3+ 세포 또는 혼합된 생존 가능한 CD4+ 및 생존 가능한 CD8+ 세포(예를 들어 (약) 1:1의 비율로 혼합됨)의 양을 갖는다. 일부 구현예에서, 입력 조성물은 (약) 700×106, 예를 들어 생존 가능한 CD3+ 세포 또는 혼합된 생존 가능한 CD4+ 및 생존 가능한 CD8+ 세포(예를 들어 (약) 1:1의 비율로 혼합됨)의 양을 갖는다. 일부 구현예에서, 입력 조성물은 (약) 800×106, 예를 들어 생존 가능한 CD3+ 세포 또는 혼합된 생존 가능한 CD4+ 및 생존 가능한 CD8+ 세포(예를 들어 (약) 1:1의 비율로 혼합됨)의 양을 갖는다. 일부 구현예에서, 입력 조성물은 (약) 900×106, 예를 들어 생존 가능한 CD3+ 세포 또는 혼합된 생존 가능한 CD4+ 및 생존 가능한 CD8+ 세포(예를 들어 (약) 1:1의 비율로 혼합됨)의 양을 갖는다. 일부 구현예에서, 입력 조성물은 (약) 100×107, 예를 들어 생존 가능한 CD3+ 세포 또는 혼합된 생존 가능한 CD4+ 및 생존 가능한 CD8+ 세포(예를 들어 (약) 1:1의 비율로 혼합됨)의 양을 갖는다. 일부 구현예에서, 입력 조성물은 (약) 110×107, 예를 들어 생존 가능한 CD3+ 세포 또는 혼합된 생존 가능한 CD4+ 및 생존 가능한 CD8+ 세포(예를 들어 (약) 1:1의 비율로 혼합됨)의 양을 갖는다. 일부 구현예에서, 입력 조성물은 (약) 120×107, 예를 들어 생존 가능한 CD3+ 세포 또는 혼합된 생존 가능한 CD4+ 및 생존 가능한 CD8+ 세포(예를 들어 (약) 1:1의 비율로 혼합됨)의 양을 갖는다.
특정 구현예에서, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포가 풀링, 혼합 및/또는 결합되어 입력 조성물은 T 세포, 예를 들어 생존 가능한 T 세포, 생존 가능한 CD3+ T 세포 또는 생존 가능한 혼합 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 (약) 최대 표적 수(2n)를 갖는다. 특정 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물이 n개 이상의 CD4+ T 세포를 함유하고, 농축된 CD8+ T 세포(예를 들어 CD4+ T 세포 조성물과 동일한 공여자 유래, 예를 들어 공여자의 동일한 성분 채집술 또는 백혈구 성분 채집술 샘플 유래)를 포함하는 조성물이 n개 이상의 CD8+ T 세포를 함유하는 경우, CD4+ T 세포 조성물 유래 n개의 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 조성물 유래 n개의 CD8+ T 세포가 풀링, 혼합 및/또는 결합(즉, 1:1의 CD4+ 대 CD8+ 비율)되어 표적 수(2n)의 T 세포를 함유하는 입력 조성물을 생성한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물이 n개 이내(예를 들어 미만)의 CD4+ T 세포를 함유하고, 농축된 CD8+ T 세포(예를 들어 CD4+ T 세포 조성물과 동일한 공여자 유래, 예를 들어 공여자의 동일한 성분 채집술 또는 백혈구 성분 채집술 샘플 유래)를 포함하는 조성물이 n개 이내(예를 들어 미만)의 CD8+ T 세포를 함유하는 경우, CD4+ T 세포 조성물 세포 중 모두 및 CD8+ T 세포 조성물 세포 중 모두가 풀링, 혼합 및/또는 결합되어 입력 조성물을 생성한다. 상기 구현예에서, 입력 조성물은 표적 수(2n) 미만의 T 세포를 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물이 n개 미만의 CD4+ T 세포를 함유하고, 농축된 CD8+ T 세포(예를 들어 CD4+ T 세포 조성물과 동일한 공여자 유래, 예를 들어 공여자의 동일한 성분 채집술 또는 백혈구 성분 채집술 샘플 유래)를 포함하는 조성물이 n개 이상의 CD8+ T 세포를 함유하는 (또는 반대의 경우도 마찬가지) 경우, CD4+ 또는 CD8+ T 세포 조성물의 세포가 대안적인 세포 유형을 보충하도록 사용되어 입력 조성물은 최대 표적 수(2n)의 T 세포를 함유한다. 상기 임의의 구현예에서, 표적 수 2n은 300×106, 350×106, 400×106, 450×106, 500×106, 550×106, 600×106, 700×106, 800×106, 900×106, 1,000×106, 1,100×106 또는 1,200×106개 일 수 있다.
특정 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물 유래 450×106 CD4+ T 세포 및 농축된 CD8+ T 세포(예를 들어 CD4+ T 세포 조성물과 동일한 공여자 유래, 예를 들어 공여자의 동일한 성분 채집술 또는 백혈구 성분 채집술 샘플 유래)를 포함하는 조성물 유래 450×106 CD8+ T 세포가 풀링, 혼합 및/또는 결합되어 900×106 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 함유하는 입력 조성물을 생성한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물이 450×106개 미만의 CD4+ T 세포를 함유하고, 농축된 CD8+ T 세포(예를 들어 CD4+ T 세포 조성물과 동일한 공여자 유래, 예를 들어 공여자의 동일한 성분 채집술 또는 백혈구 성분 채집술 샘플 유래)를 포함하는 조성물이 450×106개 미만의 CD8+ T 세포를 함유하는 경우, CD4+ T 세포 조성물 세포 중 모두 및 CD8+ T 세포 조성물 세포 중 모두가 풀링, 혼합 및/또는 결합되어 입력 조성물을 생성한다. 특정 구현예에서, 조성물 중 하나가 450×106개 미만의 CD4+ 또는 CD8+ 세포를 함유하는 반면, 나머지 다른 하나의 조성물이 450×106개 이상의 CD8+ 세포 또는 CD4+ 세포를 함유하는 경우, 이어서 최대 900×106개의 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포가 결합되어 입력 조성물을 생성한다. 입력 조성물 중 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 총 수는 900×106개보다 더 작을 수 있다. 즉, 농축된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물의 세포는, 자극의 대상이 될 최대 표적 수(2n)의 T 세포, 예를 들어 최대 900×106개의 T 세포를 포함하는 입력 조성물을 생성하기 위해 농축된 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물을 보충(또는 반대의 경우도 마찬가지)하도록 사용될 수 있다.
상기 구현예에서, 세포 선택, 단리, 분리, 농축 및/또는 정제 공정가 입력 조성물 제조의 상황에서 논의되었으나, 여기 개시된 세포 선택, 단리, 분리, 농축 및/또는 정제 공정는 임의의 후속 단계(예를 들어 활성화, 자극, 조작, 형질도입, 형질감염, 인큐베이션, 배양, 수확, 제형화 및/또는 대상체에 제형화된 세포 집단의 투여) 중, 전 또는 사이에 임의의 적합한 조합 및/또는 순서로 사용될 수 있음이 이해되어야 한다. 예를 들어 T 세포 선택, 단리, 분리, 농축 및/또는 정제 단계는 T 세포 활성화/자극과 T 세포 형질도입 사이에 수행될 수 있다. 다른 예에서, T 세포 선택, 단리, 분리, 농축 및/또는 정제 단계는 T 세포 형질도입 후이나 세포의 수확 전, 수집 전 및/또는 제형화 전에 수행될 수 있다. 특정 예에서, T 세포 선택, 단리, 분리, 농축 및/또는 정제 단계는 정제 또는 정화 단계로서 세포를 수집하기 직전에 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피에 의한 T 세포 선택 단계는 T 세포 활성화/자극과 T 세포 형질도입 사이에 수행된다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피에 의한 T 세포 선택 단계는 T 세포 형질도입 후이나 세포의 수확 전, 수집 전 및/또는 제형화 전에 수행된다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피에 의한 T 세포 선택 단계는 세포의 수확 직전에 수행된다.
일부 구현예에서, 입력 조성물은, 세포를 자극하기 전에, 예를 들어 자극 조건하에 세포를 배양하기 전에 예를 들어 무혈청 배지로 1회 이상의 희석 및/또는 세척 단계의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 희석 및/또는 세척 단계는, 무혈청 배지, 예를 들어 국제출원 제PCT/US2018/064627호에 기재된 것으로 배지 교환을 가능하게 하며, 상기 국제출원은 본원에서 참조로 인용된다.
일부 구현예에서, 무혈청 배지는 하나 이상의 보충물로 보충된 기본 배지(예를 들어 OpTmizer™ T-세포 증폭 기본 배지(ThermoFisher))를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 보충물는 무혈청이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는, 예를 들어 추가 보충물(예를 들어 OpTmizer™ T-세포 증폭 보충물(ThermoFisher))에 의해 제공되는 세포의 유지, 증폭 및/또는 활성화를 위한 하나 이상의 추가 성분으로 보충된 기본 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 혈청 대체 보충물, 예를 들어 면역 세포 혈청 대체제, 예를 들어 ThermoFisher, #A2596101, CTS™ 면역 세포 혈청 대체제 또는 문헌 「Smith et al. Clin Transl Immunology. 2015 Jan; 4(1): e31」에 기재된 면역 세포 혈청 대체제를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 유리 형태의 아미노산, 예를 들어 L-글루타민을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 디펩티드 형태의 L-글루타민(예를 들어 L-알라닐-L-글루타민), 예를 들어 Glutamax™(ThermoFisher)의 디펩티드를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 하나 이상의 재조합 사이토카인, 예를 들어 재조합 인간 IL-2, 재조합 인간 IL-7 및/또는 재조합 인간 IL-15를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 입력 집단은 PBMC 또는 백혈구 성분 채집술 샘플과 같은 출발 샘플에서 생성된 CD57-CD8+ T 세포로 농축된 집단과 출발 샘플에서 생성된 CD57-CD4+ T 세포로 농축된 집단을 혼합, 결합 및/또는 풀링함으로써 생성된다. 일부 구현예에서, CD57-CD4+ T 세포로 농축된 집단은 출발 샘플에서 CD8+ T 세포로 농축된 집단을 생성하는 과정 중에 생성된 CD8 음성 분획에서 생성된다. 특정 구현예에서, 입력 조성물은 (약) 1:1의 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포의 비율을 갖고, 세포를 자극하기 전에, 예를 들어 자극 조건 하에서 세포를 배양하기 전에, 예를 들어 국제출원 제PCT/US2018/064627호에 기재된 무혈청 배지로 1회 이상의 세척 단계의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 1회 이상의 세척 단계는 PBS/EDTA 완충제 함유 알부민에서 세포 자극에서도 사용되는 무혈청 배지로 배지 교환을 가능하게 한다.
III. 농축된 CD57- 세포의 집단을 유전자 조작하는 방법
제공된 방법 중에는 재조합 수용체, 예를 들어 키메라 항원 수용체(CAR)을 사용하여 T 세포를 유전자 조작하는 방법이 있다. 일부 측면에서, 상기 제공된 방법은 농축된 CD57- T 세포의 하나 이상의 집단을 자극, 활성화, 조작, 배양, 및/또는 증폭하는 하나 이상의 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 집단은 본원에서, 예를 들어 섹션 I.에서 기술된 CD57- T 세포의 임의의 집단이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 집단은 본원에서, 예를 들어 섹션 II.에서 기술된 임의의 방법 또는 공정에 의해서 생물학적 샘플로부터 단리, 선택, 또는 농축된다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 집단은 자극 조건하에, 본원에서, 예를 들어 섹션 III.A.에서 기술된 임의의 자극 조건하에 예를 들어 상기 집단의 세포를 인큐베이션함으로써 자극 또는 활성화된다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 하나 이상의 집단은 예를 들어 상기 하나 이상의 집단에 이종 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 유전자 조작된다. 일부 구현예에서, 상기 도입은 본원에서, 예를 들어 섹션 III.B.에서 제공된 임의의 유전자 조작 방법에 의해서 수행된다. 일부 측면에서, 상기 제공된 방법은 상기 세포이 게놈으로의 상기 바이러스 벡터의 통합을 허용하는 조건하에서 형질도입된 T 세포를 인큐베이션하는 것을 포함한다.
상기 제공된 방법은 상기 조작된 세포가 세포의 집단을 증폭시킬 목적으로 추가로 배양되지는 않는다. 예를 들어, 일부 측면에서, 수확된 세포는, 인큐베이션 또는 배양 초기의 생존 가능한 총 세포수에 비해 인큐베이션 또는 배양 말기에 생존 가능한 총 세포의 양이 증가되는 임의의 인큐베이션 또는 배양을 거치지 않았다. 일부 구현예에서, 수확된 세포는, 상기 인큐베이션 또는 배양 공정의 시작에 비해 인큐베이션 또는 배양 공정의 말기에 생존 가능한 총 세포수를 명백하게 증가시킬(예를 들어 증폭시킬) 목적을 위한 임의의 인큐베이션 또는 배양 단계를 거치지 않았다. 일부 구현예에서, 세포는 증폭을 초래할 수 있는 조건 하에서 인큐베이션 또는 배양되나, 인큐베이션 또는 배양 조건이 세포 집단을 증폭시킬 목적으로 수행되지 않는다. 일부 구현예에서, 수확된 세포는 증폭 단계를 포함하지 않는 공정로 제조되었으나 증폭을 거쳤을 수 있다. 일부 구현예에서, 증폭 단계를 포함하지 않는 제조 공정는 비증폭 또는 최소한으로 증폭된 공정로 지칭된다. “비증폭(non-expanded)” 공정는 “최소한으로 증폭된(minimally expanded)” 공정로도 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, 비증폭 또는 최소한으로 증폭된 공정는 증폭 단계를 포함하지 않는 공정임에도 증폭을 거친 세포를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 수확된 세포는 전체적으로 세포 집단의 증폭을 감소, 억제, 최소화 또는 제거하도록 설계된 배지 조성을 포함하는 인큐베이션 또는 배양 단계를 거쳤을 수 있다. 일부 구현예에서, 수집, 수확 또는 제형화된 세포는, 세포가 인큐베이션 또는 배양의 전부 또는 일부 동안 흔들림, 회전, 떨림 또는 관류되는 조건 하에서 또는 생물 반응기에서 수행된 인큐베이션 또는 배양을 이전에 겪지 않았다.
특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- T 세포의 하나 이상의 집단은 배양되고, 예를 들어 고정된 시간 동안 또는 증폭에 대한 임계 한계에 도달할 때까지 T 세포 분열, 성장 또는 증폭을 촉진하거나 허용하는 조건하에서 배양된다. 일부 측면에서 상기 배양은 본원에서, 예를 들어 섹션 III.C에서 기술된 임의의 방법에 의해서 수행된다.
특정 구현예에서, 본원에서 하나 이상의 초기, 예를 들어 입력, T 세포의 집단으로부터의 유전자 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 농축된 CD57- T 세포의 집단은 자극 조건하에 인큐베이션됨으로써, 자극된 집단을 생성한다. 특정 구현예에서, 상기 자극, 예를 들어 자극 조건하에 상기 세포를 배양하는 것은 설정 또는 고정된 양의 시간, 예를 들어 2일 미만의 양의 시간 또는 18시간 내지 30시간의 양의 시간동안 수행된다. 일부 측면에서, 상기 자극 시약을 사용한 자극은 (약) 20±4시간 동안 수행된다.
특정 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 자극된 집단의 세포로 도입됨으로써 형질전환된 집단을 발생시킨다. 특정 구현예에서, 세포는, 세포를 유전자 조작하는 동안 또는 후에, 예를 들어 재조합 단백질을 암호화하는 이종 또는 재조합 폴리뉴클레오티드의 통합을 허용하거나 또는 재조합 단백질의 발현을 허용하기에 충분한 시간량 동안 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포는 세트 또는 고정된 시간량, 예를 들어 18 시간 초과 또는 4 일 미만, 예를 들어 72 시간±6 시간의 시간량 동안 인큐베이션된다. 임의의 제공된 구현예에서, 도입은 자극 시약으로 자극된 후에 세포 상에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 조작 단계는, 자극 시약이 세포에 첨가되거나 배양되거나 또는 접촉된 때부터 30 시간 이내와 같이 자극이 시작 또는 개시된 때부터 설정된 시간량 내에 시작되거나 개시된다. 특정 구현예에서, 조작 단계는, 자극 시약이 세포에 첨가되거나 배양되거나 또는 접촉된 후 18 시간 내지 30 시간, 예를 들어 20 시간±4 시간에 시작되거나 개시된다.
특정 구현예에서, 이어서 형질전환된 집단이, 예를 들어 고정된 시간량 동안 또는 임계 증폭이 달성될 때까지 증폭되고, 이로써 증폭 집단이 초래된다. 특정 구현예에서, 형질전환된 집단 또는 증폭 집단이 수확 또는 수집되고, 선택적으로 예를 들어 대상체에 투여하기 위해 또는 동결 보존을 위해 제형화된다. 일부 구현예에서, 집단은 CD57-CD4+ T 세포 및 CD57-CD8+ T 세포이거나 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 집단은 CD57-CD3+ T 세포이거나 이를 함유한다.
특정 구현예에서, 농축된 T 세포 집단은 동결 방지 냉동(예를 들어 동결 보호)을 위해 수집, 제형화될 수 있고/거나 재조합 수용체를 발현하는 농축된 T 세포 조작된 집단을 생성하기 위한 공정 중 임의의 시기 또는 단계 전, 중 또는 후에 0℃ 미만, -20℃ 미만 또는 -70℃ 또는 -80℃ 또는 -70℃ 또는 -80℃ 미만에서 보관된다. 일부 구현예에서, 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 일 이하의 시간량 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 주 이하의 시간량 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 주 이상의 시간량 동안 또는 8 주 이상 동안 보관될 수 있다. 보관 후, 농축된 T 세포 집단은 해동될 수 있고, 프로세싱은 공정의 동일한 지점에서 재개될 수 있다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포 입력 집단은 동결 보호되고, 추가 프로세싱, 예를 들어 자극 조건 하에서 인큐베이션 전에 보관된다. 특정 구현예에서, 농축된 T 세포의 배양 및/또는 제형화된 집단은 동결 방지되고, 예를 들어 자가 세포 요법으로서 대상체에 투여되기 전에 보관된다.
특정 구현예에서, 여기에 제공된 방법은, 조작된 세포가 세포를 자극하는 단계 및 이어서 재조합 수용체, 예를 들어 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 세포로 도입하는 단계를 포함하는 공정에 의해 생성되는 공정와 관련하여 사용된다. 특정 구현예에서, 자극은 18 내지 30 시간 동안, 예를 들어 약 24시간 동안 수행되고, 폴리뉴클레오티드의 도입은 이후에 수행된다. 특정 구현예에서, 세포는 수확 또는 수집되어, 예를 들어 폴리뉴클레오티드의 도입이 개시된 후 3 일 이내에 대상체에 투여되거나 동결 보존을 위해 제형화된다. 다양한 구현예에서, 세포는 수확 또는 수집되어, 예를 들어 자극 조건 하에서 인큐베이션이 개시된 후 4 일 이내에 대상체에 투여되거나 동결 보존을 위해 제형화된다.
특정 구현예에서, 2개의 초기, 예를 들어 입력, CD57- T 세포 집단에서 유전자 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, 2개의 농축된 CD57- T 세포 집단이 자극 조건 하에서 별개로 인큐베이션되고, 이로써 2개의 별개의 자극 집단이 생성된다. 특정 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오티드가 2개의 별개의 자극 집단의 세포로 도입되고, 이로써 2개의 별개의 형질전환된 집단이 생성된다. 특정 구현예에서, 이어서 2개의 별개의 형질전환된 집단이, 예를 들어 고정된 시간량 동안 또는 임계 증폭이 달성될 때까지 증폭되고, 이로써 2개의 별개의 증폭 집단이 초래된다. 특정 구현예에서, 2개의 별개의 형질전환된 집단 또는 2개의 별개의 증폭 집단이 수확 또는 수집되고, 선택적으로 예를 들어 대상체에 투여하기 위해 또는 동결 보존을 위해 제형화된다 . 특정 구현예에서, 2개의 별개의 집단은 동일한 개별 대상체로부터의 동일한 생물학적 샘플 또는 상이한 생물학적 샘플에서 기원하거나 유래된다. 일부 구현예에서, 2개의 별개의 집단은 농축된 CD57-CD4+ T 세포 집단 및 별개의 CD57-CD8+ T 세포 집단이거나 이를 함유한다.
또한 예를 들어 T 세포 증식 또는 증폭을 촉진하는 조건하에, 예를 들어 본원에서, 예를 들어 섹션 III.C.에서 기술된 임의의 조건하에 인큐베이션 또는 배양 동안 증폭 또는 증식할 수 있는 세포의 집단을 식별하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 집단에서 CD57+ 의 빈도를 측정하는 것이거나 또는 그를 포함하되, CD57+ 세포의 빈도가 임계 빈도 미만인 경우 상기 세포는 증폭할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 임계 빈도는 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 1% 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 임계값은 (약) 20%이다. 일부 구현예에서, 증폭될 수 있는 집단은 증식 또는 증폭을 촉진하는 조건하의 배양 동안 10, 11, 12, 13, 또는 14 일 이내에 적어도 2-배, 3-배, 4-배, 또는 5-배 증폭한다. 특정 구현예에서, 증폭될 수 있는 집단은 배양 동안, 예를 들어 본원에서 예를 들어 섹션 III.C.에서 제공된 배양 동안 11일 이내에 적어도 4-배 증폭한다.
일부 구현예에서, T 세포 집단의 CD57 발현과 관련된 특성(train)의 값을 측정하거나 또는 그를 포함하되, 상기 특성의 값이 상기 특성의 임계값 미만인 경우 T 세포의 집단은 세포 요법제를 증폭시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 특성은 상기 용량의 총 T 세포, CD4+ T 세포, 또는 CD8+ T 세포 중에 존재하는 CD57에 의해 암호화된 폴리펩티드의 수준 또는 양이다. 특정 구현예에서, 상기 특성은 상기 용량의 총 T 세포, CD4+ T 세포, 또는 CD8+ T 세포의 표면 상에 존재하는 CD57에 의해서 암호화된 폴리펩티드의 수준 또는 양이다. 특정 구현예에서, 상기 특성은 T 세포, CD4+ T 세포, 또는 CD8+ T 세포의 빈도, 백분율, 또는 양이다. 일부 구현예에서, 상기 특성은 상기 T 세포 중에 존재하는 제 2 유전자의 mRNA의 수준 또는 양이다. 특정 구현예에서, 상기 CD57의 수준 또는 양.
특정 구현예에서, 상기 임계값은 CD57 발현과 관련된 상기 특성의 평균값 또는 중앙값 측정치 미만인 (약), 또는 25% 이내, 20% 이내, 15% 이내, 10% 이내, 또는 5% 이내이고/이거나 복수의 참조 T 세포 집단에서, 상기 평균값 또는 중앙값 측정치 미만인 하나의 표준 편차 미만이다. 특정 구현예에서, 상기 임계값은 복수의 참조 T 세포 집단으로부터의 집단에서, CD57 발현과 관련된 상기 특성의 최저 측정이 미만, 선택적으로 50% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10%, 또는 5% 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 임계값은 복수의 참조 T 세포 집단으로부터의 샘플의 65%, 75%, 80%, 85% 초과로부터 계산된 CD57 발현과 관련된 상기 특성의 평균값 또는 중앙값 측정치 미만이다. 특정 구현예에서, 상기 복수의 참조 T 세포 집단은 T 세포의 증식 또는 증폭을 촉진하는 조건하에 배양될 때 증폭하지 않는 복수의 집단이며, 선택적으로 상기 세포는 배양, 예를 들어 본원에서, 예를 들어 섹션 III.C.에서 기술된 배양 10, 11, 12, 13, 또는 14일 이내에 적어도 3-배, 4-배, 또는 5-배까지 종폭되지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 참조 T 세포 집단은 배양 11일 이내에 적어도 4-배까지 증폭하지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 수확은 상기 조작된 집단 또는 T 세포의 조작된 집단이 임계 수의 T 세포, 생존가능한 T 세포, 조작된 T 세포 또는 생존가능한 조작된 T 세포, 또는 임계 농도의 T 세포, 생존가능한 T 세포, 조작된 T 세포 또는 생존가능한 조작된 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 T 세포, 생존가능한 T 세포, 조작된 T 세포 또는 생존가능한 조작된 T 세포의 임계수 또는 농도는 자극 개시 후 (약) 4, 5, 6 또는 7일 이내에 도달한다.
일부 구현예에서, 조작된 T 세포의 복수의 집단 또는 증폭된 T 세포의 집단, T 세포, 생존가능한 T 세포, 조작된 T 세포 또는 생존가능한 조작된 T 세포의 임계수 또는 농도는 상기 복수의 집단의 적어도 (약) 또는 적어도 (약) 70%, 80%, 90% 또는 95%에서 자극 개시 후 (약) 5 또는 6일 이내에 도달한다. 일부 구현예에서, T 세포, 생존가능한 T 세포, 조작된 T 세포 또는 생존가능한 조작된 T 세포의 임계수 또는 농도는 자극 개시 후 (약) 2, 3, 4 또는 5 집단 배가 이내에 도달한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 또한, CD57과 관련된 특성의 값이 임계값 미만인 경우 및 제 2 유전자의 발현과 관련된 특성이 제 2 임계값 미만인 경우 집단이 증폭될 수 있도록 제 2 유전자의 발현과 관련된 특성의 값을 측정하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제 2 유전자는 나이브-유사 세포의 마커이며, 예를 들어 제한되지는 않지만 CD25, CD27, CD28, CCR7, 또는 CD45RA이다. 일부 구현예에서, 상기 제 2 유전자는 CD27를 암호화한다.
A.
자극
일부 구현예에서, 상기 제공된 방법은 자극 조건 하에서 세포, 예를 들어 CD57- T 세포를 인큐베이션하는 것과 관련하여 사용된다. 일부 구현예에서, 상기 자극 조건은, TCR 및/또는 공동 수용체(coreceptor)로부터 발생된 신호와 같은, 세포, 예를 들어 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 신호를 활성화 또는 자극하고/거나 신호를 활성화 또는 자극할 수 있는 조건을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 자극 조건은 자극 시약, 예를 들어 세포의 신호를 활성화 또는 자극하는 시약, 및/또는 활성화 또는 자극할 수 있는 시약과 함께 및/또는 존재 하에 세포를 배양(culturing, cultivating), 인큐베이션, 활성화, 번식시키는 하나 이상의 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 자극 시약은 TCR 및/또는 공동 수용체(coreceptor)를 자극 및/또는 활성화시킨다. 특정 구현예에서, 자극 시약은 섹션 III.A.1에 기재된 시약이다.
특정 구현예에서, 세포를 유전자 조작하기 전에, 예를 들어 섹션 III.B에 제공된 기술에 의해 세포를 형질감염 및/또는 형질도입하기 전에, 자극된 조건하에 농축된 CD57- T 세포의 하나 이상의 집단을 인큐베이션한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 농축된 CD57- T 세포의 집단은 하나 이상의 조성물이 분리, 선택, 농축 또는 생물학적 샘플로부터 수득된 후 자극 조건 하에서 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57- T 세포의 하나 이상의 집단은 상기 인큐베이션 이전에 동결건조(cryofrozen)되고 저장되고, 인큐베이션 전에 해동된다.
특정 구현예에서, 농축된 CD57- T 세포의 하나 이상의 집단은, 농축된 CD57- T 세포의 2개의 별개의 집단이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 T 세포, 예를 들어 동일한 생물학적 샘플로부터 선택, 분리 및/또는 농축된 2개의 별개의 농축된 T 세포의 조성물은 자극 조건 하에서 별도로 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 2개의 별개의 조성물은 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 조성물을 포함한다. 특정 구현예에서, 2개의 별개의 조성물은 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 조성물을 포함한다. 특정 구현예에서, 2개의 별개의 조성물은 CD57-CD3+ T 세포의 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ T 세포 및 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 2개의 별개의 조성물은 자극 조건 하에서 별도로 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 단일 조성물은 자극 조건 하에서 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 단일 조성물은 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 조성물이다. 특정 구현예에서, 단일 조성물은 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 조성물이다. 특정 구현예에서, 단일 조성물은 농축된 CD57-CD3+ T 세포의 조성물이다. 일부 구현예에서, 상기 단일 조성물은 인큐베이션 전에 별개의 조성물로부터 조합된 농축된 CD57-CD4+ 및 CD57-CD8+ T 세포의 조성물이다.
일부 구현예에서, 자극 조건 하에서 인큐베이션되는 CD57-CD4+ T 세포의 집단은 적어도 (약) 60%, 적어도 (약) 65%, 적어도 (약) 70%, 적어도 (약) 75%, 적어도 (약) 80%, 적어도 (약) 85%, 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 98%, 적어도 (약) 99%, 적어도 (약) 99.5%, 적어도 (약) 99.9%, 또는 적어도 (약) 100%의 CD57-CD4+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 조건 하에서 인큐베이션되는 CD57-CD4+ T 세포의 조성물은 CD57 발현에 양성이거나 또는 CD4 발현에 음성인 (약) 40% 미만, (약) 35% 미만, (약) 30% 미만, (약) 25% 미만, (약) 20% 미만, (약) 15% 미만, (약) 10% 미만, (약) 5% 미만, (약) 1% 미만, (약) 0.1%, 또는 (약) 0.01% 미만의 T 세포를 포함한다.
특정 구현예에서, 자극 조건하에서 배양되는 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 집단은 적어도 (약) 60%, 적어도 (약) 65%, 적어도 (약) 70%, 적어도 (약) 75%, 적어도 (약) 80%, 적어도 (약) 85%, 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 98%, 적어도 (약) 99%, 적어도 (약) 99.5%, 적어도 (약) 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD57-CD8+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 조건하에서 배양되는 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 조성물은 (약) 40% 미만, (약) 35% 미만, (약) 30% 미만, (약) 25% 미만, (약) 20% 미만, (약) 15% 미만, (약) 10% 미만, (약) 5% 미만, (약) 1% 미만, (약) 0.1% 미만, 또는 (약) 0.01% 미만의 CD57 발현에 양성 또는 CD8 발현에 음성인 T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 조건하에서 배양되는 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 조성물은 (약) 40% 미만, (약) 35% 미만, (약) 30% 미만, (약) 25% 미만, (약) 20% 미만, (약) 15% 미만, (약) 10% 미만, (약) 5% 미만, (약) 1% 미만, (약) 0.1% 미만, 또는 (약) 0.01% 미만의 CD57 발현에 양성 또는 CD8 발현에 음성인 T 세포를 포함한다.
특정 구현예에서, 자극 조건하에서 배양되는 농축된 CD57-CD3+ T 세포의 집단은 적어도 (약) 60%, 적어도 (약) 65%, 적어도 (약) 70%, 적어도 (약) 75%, 적어도 (약) 80%, 적어도 (약) 85%, 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 98%, 적어도 (약) 99%, 적어도 (약) 99.5%, 적어도 (약) 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD57-CD3+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 조건하에서 배양되는 농축된 CD57-CD3+ T 세포의 조성물은 (약) 40% 미만, (약) 35% 미만, (약) 30% 미만, (약) 25% 미만, (약) 20% 미만, (약) 15% 미만, (약) 10% 미만, (약) 5% 미만, (약) 1% 미만, (약) 0.1% 미만, 또는 (약) 0.01% 미만의 CD57 발현에 양성 또는 CD3 발현에 음성인 T 세포를 포함한다.
특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ 및 CD57-CD8+ T 세포의 별도 조성물은 단일 조성물로 조합되고 자극 조건 하에서 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 인큐베이션이 수행되고/되거나 완료된 후 농축된 CD57-CD4+ 및 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 개별 자극된 조성물이 단일 조성물로 조합된다.
일부 구현예에서, 자극 조건 하의 인큐베이션은, 배양(culture, cultivation), 자극, 활성화, 번식, 예를 들어 자극 조건의 존재 하에 인큐베이션, 예를 들어 증식, 증폭, 활성화 및/또는 집단에서 세포의 생존, 항원 노출 모방(mimic) 및/또는 유전자 조작, 예를 들어 재조합 항원 수용체의 도입을 위한 세포의 프라이밍(prime)을 유도하도록 설계된 조건을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 자극 조건에는 하나 이상의 특정 매체, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 작용제, 예를 들어 영양, 아미노산, 항생제(antibiotics), 이온 및/또는 자극 요인(stimulatory factors) 예를 들어 사이토카인, 케모카인(chemokines), 항원, 결합 파트너, 융합 단백질(fusion proteins), 재조합 수용체 및 세포들을 활성화시키기 위해 설계된 기타 모든 작용제가 포함될 수 있다.
일부 측면에서, 자극 조건 하에서의 자극 및/또는 인큐베이션은 US Patent No. 6,040,1 77 to Riddell et al., Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakuraet al. (2012) Blood.1:72-82, and/or Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701에 기재된 것과 같은 기술에 따라 수행된다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 CD57- T 세포는 비분할 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)와 같은 배양-개시 조성물 공급(feeder) 세포에 첨가(예를 들어 생성된 세포 집단이 증폭될 초기 집단의 각각의 T 림프구에 대해 적어도 약 5, 10, 20 또는 40 개 이상의 PBMC 공급(feeder) 세포를 포함하도록); 및 배양물을 인큐베이션(예를 들어 T 세포의 수를 증폭시키기에 충분한 시간 동안)함으로써 증폭된다. 일부 측면에서, 비분할 공급(feeder) 세포는 감마 조사된 PBMC 공급(feeder) 세포를 포함 할 수 있다. 일부 구현예에서, PBMC에는 세포 분열을 방지하기 위해 약 3000 내지 3600 rad 범위의 감마선이 조사된다. 일부 측면에서, 공급(feeder) 세포는 T 세포 집단의 첨가 전에 배양 배지에 첨가된다.
일부 구현예에서, 자극 조건은 인간 T 림프구의 성장에 적합한 온도, 예를 들어 약 25℃ 이상, 일반적으로 약 30℃ 이상, 및 일반적으로 약 37℃ 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 온도 변화는 배양 동안, 예를 들어 37℃ 내지 35℃에서 수행된다. 임의로, 인큐베이션은 비-분할 EBV-변형 림프모(lymphoblastoid)세포(LCL)를 공급(feeder) 세포로서 첨가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. LCL은 약 6000 내지 10,000rad 범위의 감마선으로 조사될 수 있다. 일부 측면에서 LCL 공급(feeder) 세포는 임의의 적합한 양, 예를 들어 LCL 공급(feeder) 세포 대 초기 T 림프구 적어도 약 10:1의 비와 같은 형태로 제공된다.
특정 구현예에서, 자극 조건은 자극 시약으로 세포를 인큐베이션, 배양(culturing 및/또는 cultivating)하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 시약은 섹션 III.A.1에 기재된 시약이다. 특정 구현예에서, 자극제는 비드를 함유하거나 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 자극제는 올리고머성 시약, 예를 들어 올리고머성 스트렙타비딘 뮤테인 시약을 함유하거나 또는 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 조건 하에서 세포의 인큐베이션, 배양(culturing 및/또는 cultivating) 시작 및/또는 개시는 세포가 자극제와 접촉 및/또는 인큐베이션될 때 발생한다. 특정 구현예에서, 세포는, 세포를 유전자 조작, 예를 들어 형질도입 또는 형질감염하는 것과 같이 재조합 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)를 세포내로 도입하기 전, 동안 및/또는 후에 인큐베이션한다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 조성물은 (약) 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.5:1, 1.25:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.75:1, 0.67:1, 0.5:1, 0.3:1, 또는 0.2:1의 자극제 시약 및/또는 비드 대 세포의 비로 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 상기 자극제 시약 및/또는 비드 대 세포의 비는 2.5:1 내지 0.2:1, 2:1 내지 0.5:1, 1.5:1 내지 0.75:1, 1.25:1 내지 0.8:1, 1.1:1 내지 0.9:1이다. 특정 구현예에서, 상기 자극제 시약 및/또는 비드 대 세포의 비는 약 1:1 또는 1:1이다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 (약), 또는 적어도 0.01 ㎍, 0.02 ㎍, 0.03 ㎍, 0.04 ㎍, 0.05 ㎍, 0.1 ㎍, 0.2 ㎍, 0.3 ㎍, 0.4 ㎍, 0.5 ㎍, 0.75 ㎍, 1 ㎍, 2 ㎍, 3 ㎍, 4 ㎍, 5 ㎍, 6 ㎍, 7 ㎍, 8 ㎍, 9 ㎍, 또는 10 ㎍의 자극 시약/106 세포의 존재하에 자극된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 (약) 4 ㎍의 자극 시약/106 세포의 존재하에 자극된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 (약) 0.8 ㎍의 자극 시약/106 세포의 존재하에 자극된다.
특정 구현예에서, 세포, 예를 들어 입력 집단의 세포는, (약) 0.01×106 세포/mL, 0.1×106 세포/mL, 0.5×106 세포/mL, 1.0×106 세포/mL, 1.5×106 세포/mL, 2.0×106 세포/mL, 2.5×106 세포/mL, 3.0×106 세포/mL, 4.0×106 세포/mL, 5.0×106 세포/mL, 10×106 세포/mL 또는 50×106 세포/mL 또는 0.01×106 세포/mL, 0.1×106 세포/mL, 0.5×106 세포/mL, 1.0×106 세포/mL, 1.5×106 세포/mL, 2.0×106 세포/mL, 2.5×106 세포/mL, 3.0×106 세포/mL, 4.0×106 세포/mL, 5.0×106 세포/mL, 10×106 세포/mL 또는 50×106 세포/mL 이상의 농도로 자극 조건 하에서, 예를 들어 자극 시약의 존재 하에서 자극되거나 자극의 대상, 예를 들어 배양된다. 특정 구현예에서, 세포, 예를 들어 입력 집단의 세포는, (약) 3.0×106 세포/mL 또는 3.0×106 세포/mL 이상의 농도로 자극 조건 하에서, 예를 들어 자극 시약의 존재 하에서 자극되거나 자극의 대상, 예를 들어 배양된다. 특정 구현예에서, 입력 세포는 생존 가능한 세포이다.
일부 구현예에서, 자극 및/또는 활성화 조건은, 특정 배지(media), 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 작용제, 예를 들어 영양소, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예를 들어 사이토카인, 케모카인(chemokines), 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체 및 세포를 활성화시키도록 설계된 임의의 다른 작용제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 자극 조건 또는 자극 시약이 존재하는 경우의 인큐베이션의 적어도 일부는, 예를 들어 국제공개번호 제WO2016/073602호에 기술된 것과 같은 원심 회전 하에 원심 챔버의 내부 공동(cavity)에서 수행된다. 일부 구현예에서, 원심 챔버에서 수행되는 인큐베이션의 적어도 일부는 자극 및/또는 활성화를 유도하기 위해 시약 또는 시약들과 혼합하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 선택된 세포와 같은 세포는 원심 챔버에서 자극 조건 또는 자극 시약과 혼합된다. 이러한 과정의 일부 측면에서, 다량의 세포는, 세포 배양 플레이트(plate) 또는 다른 시스템에서 유사한 자극을 수행될 때 일반적으로 사용되는 것보다 훨씬 적은 양의 하나 이상의 자극 조건 또는 작용제와 혼합된다.
일부 구현예에서, 원심 챔버에서 혼합하지 않고 선택하는 경우 자극제는 실질적으로, 동일한 수 또는 동일한 부피의 세포의 선택의 대략 동일하거나 유사한 선택 효율을 달성하는데 필요한 자극제의 양과 비교하여 더 적은 양(예를 들어 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 이하의 양)으로 챔버의 공동 내의 세포에 첨가되며, 예를 들어 주기적으로 흔들거나 회전하는 튜브 또는 백에 넣는다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은, 예를 들어 10 mL 내지 200 mL, 적어도 또는 적어도 약 또는 약 또는 10 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL, 100 mL, 150 mL 또는 200 mL의 시약의 인큐베이션으로 표적 부피를 달성하기 위해, 세포 및 자극 시약에 인큐베이션 완충제를 첨가하여 수행된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 완충제 및 자극 시약은 세포에 첨가하기 전에 예비 혼합된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 완충제 및 자극 시약은 세포에 별도로 첨가된다. 일부 구현예에서, 자극 인큐베이션은 주기적으로 온화한 혼합 조건으로 수행되며, 이는 에너지적으로 선호되는 상호 작용을 촉진시켜 세포의 자극 및 활성화를 달성하면서, 전반적으로 자극 시약을 덜 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 인큐베이션은 혼합 조건, 예를 들어 일반적으로 비교적 낮은 힘 또는 속도에서의 스피닝(spinning)의 존재 하에서, 예를 들어 세포를 펠렛(pellet)화하기 위해 사용된 것보다 낮은 속도에서, 예를 들어 약 600rpm 내지 1700rpm(예를 들어 600rpm 또는 1000rpm 또는 1500rpm 또는 1700rpm 또는 약 또는 적어도 600rpm 또는 1000rpm 또는 1500rpm 또는 1700rpm)에서, 약 80g 내지 100g(예를 들어 80g, 85g, 90g, 95g 또는 100g 또는 약 또는 적어도 80g, 85g, 90g, 95g 또는 100g)의 챔버의 샘플 또는 벽(wall) 또는 다른 용기의 RCF에서, 일반적으로 수행된다. 일부 구현예에서, 스핀(spin)은, 이러한 저속에서 스핀의 반복된 간격에 이어서, 1초, 2초, 3초, 4초, 5초, 6초, 7초, 8초, 9초 또는 10초에 대한 스핀 및/또는 휴식과 같은 휴식 기간을 사용하여 수행되며, 예를 들어 약 1초 또는 2초 회전 후 약 5초, 6초, 7초 또는 8초 동안 휴식하는 것과 같다.
일부 구현예에서, 예를 들어 자극제와 함께하는, 인큐베이션의 총 지속 시간은, 1시간 내지 96시간, 1시간 내지 72시간, 1시간 내지 48시간, 4시간 내지 36시간, 8시간 내지 30시간, 또는 12시간 내지 24시간 사이 또는 약 1시간 내지 96시간, 1시간 내지 72시간, 1시간 내지 48시간, 4시간 내지 36시간, 8시간 내지 30시간, 또는 12시간 내지 24시간 사이, 예를 들어 적어도 또는 적어도 약 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간 또는 72시간이다. 일부 구현예에서, 추가 인큐베이션은 1시간 내지 48시간, 4시간 내지 36시간, 8시간 내지 30시간 또는 12시간 내지 24시간 사이 또는 약 1시간 내지 48시간, 4시간 내지 36시간, 8시간 내지 30시간 또는 12시간 내지 24시간 사이 시간 동안이다.
일부 구현예에서, 자극, 예를 들어 자극 조건 하에서 세포를 배양하는 것은 (약) 48 시간, 42 시간, 36 시간, 30 시간, 24 시간, 22 시간, 20 시간, 18 시간, 16 시간 또는 12 시간 또는 48 시간, 42 시간, 36 시간, 30 시간, 24 시간, 22 시간, 20 시간, 18 시간, 16 시간 또는 12 시간 미만 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 자극, 예를 들어 자극 조건 하에서 세포를 배양하는 것은 20±4 시간 또는 (약) 16 시간 내지 24 시간 동안 수행된다. 특정 구현예에서, 자극, 예를 들어 자극 조건 하에서 세포를 배양하는 것은 (약) 36 시간 내지 12 시간, 30 시간 내지 18 시간 또는 (약) 24 시간 또는 22 시간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 자극, 예를 들어 자극 조건 하에서 세포를 배양하는 것은 (약) 2 일 또는 1 일 또는 2 일 또는 1 일 미만 동안 수행된다.
특정 구현예에서, 입력 집단 중 (약) 50×106, 100×106, 150×106, 200×106, 250×106, 300×106, 350×106, 400×106, 450×106, 500×106, 550×106, 600×106, 700×106, 800×106, 900×106 또는 1,000×106개 또는 50×106, 100×106, 150×106, 200×106, 250×106, 300×106, 350×106, 400×106, 450×106, 500×106, 550×106, 600×106, 700×106, 800×106, 900×106 또는 1,000×106개 이상의 세포 양이 자극되거나 자극의 대상, 예를 들어 자극 조건 하에서 배양된다. 특정 구현예에서, 자극, 예를 들어 자극 조건 하에서 배양되는 입력 집단의 양은 (약) 50×106 세포, (약) 100×106 세포, (약) 150×106 세포, (약) 200×106 세포, (약) 250×106 세포, (약) 300×106 세포, (약) 350×106 세포, (약) 400×106 세포, (약) 450×106 세포, (약) 500×106 세포, (약) 550×106 세포, (약) 600×106 세포, (약) 700×106 세포, (약) 800×106 세포, (약) 900×106 세포 또는 (약) 1,000×106 세포 또는 상기 중 임의의 사이 임의의 값이다. 특정 구현예에서, 입력 집단 중 (약) 900×106개의 세포 양이 자극, 예를 들어 자극 조건 하에서 배양된다.
특정 구현예에서, 입력 조성물은 1:10 내지 10:1, 1:5 내지 5:1, 4:1 내지1:4, 1:3 내지 3:1, 2:1 내지 1:2, 1.5:1 내지 1:1.5, 1.25:1 내지 1:1.25, 1.2:1 내지 1:1.2, 1.1:1 내지 1:1.1 또는 약 1:1 또는 1:1의 생존 가능한 CD4+ T 세포 대 생존 가능한 CD8+ T 세포의 비율로 생존 가능한 CD4+ T 세포 및 생존 가능한 CD8+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 입력 조성물은 약 1:1 또는 1:1의 생존 가능한 CD4+ T 세포 대 생존 가능한 CD8+ T 세포의 비율로 생존 가능한 CD4+ T 세포 및 생존 가능한 CD8+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 입력 집단 중 (약) 450×106개의 CD4+ 세포 양이 자극, 예를 들어 자극 조건 하에서 배양된다. 특정 구현예에서, 입력 집단 중 (약) 450×106개의 CD8+ 세포 양이 자극, 예를 들어 자극 조건 하에서 배양된다. 특정 구현예에서, 입력 집단 중 (약) 450×106개의 CD4+ T 세포 양 및 (약) 450×106개의 CD8+ T 세포 양이 자극, 예를 들어 자극 조건 하에서 배양된다.
특정 구현예에서, 자극 조건은 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에 및/또는 농축된 T세포의 조성물을 인큐베이션, 배양(culturing 및/또는 cultivating)하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 재조합 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 인간 재조합 사이토카인이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 T세포에 의해 발현되고/되거나 내인성(endogenous) 수용체에 결합하고/하거나 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 사이토카인의 4-알파-헬릭스(4-alpha-helix bundle) 다발 패밀리의 구성원이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인의 4- 알파-헬릭스4-알파-헬릭스(4-alpha-helix bundle) 다발 패밀리의 구성원은 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨-9(IL-9), 인터루킨 12(IL-12), 인터루킨 15(IL-15), 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF) 및 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF)을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 IL-15이거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 IL-7이거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 IL-2이거나 또는 그를 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인의 양 또는 농도는 국제단위(International Unit; IU)로 측정되고/되거나 정량화된다. 국제단위는 비타민, 호르몬, 사이토카인, 백신, 혈액 생성물, 및 유사한 생물학적으로 활성 물질을 정량화하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, IU는 비중 및 강도의 국제 참조 표준, 예를 들어 Human IL-2, 86/504에 대한 WHO 국제 표준(WHO 1st International Standard for Human IL-2, 86/504)과 비교하여 생물학적 제제의 효능의 측정 단위이거나 그를 포함한다. 국제단위는 국제적 공동 연구 노력으로 발간된 생물학적 활동 단위를 보고하는 유일하게 인식되고 표준화된 방법이다. 특정 구현예에서, 집단, 샘플, 또는 사이토카인의 소스에 대한 상기 IU는 유사한 WHO 표준 제품과의 제품 비교 테스트를 통해 얻을 수 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, 집단, 샘플, 또는 인간 재조합 IL-2, IL-7, 또는 IL-15의 소스의 IU/mg은 각각 WHO 표준 IL-2 제품(NIBSC 코드: 86/500), WHO 표준 IL-17 제품(NIBSC 코드: 90/530) 및 WHO 표준 IL-15 제품(NIBSC 코드: 95/554)와 비교된다.
일부 구현예에서, IU/mg로 나타낸 생물학적 활성은 (ng/ml로 나타낸 ED50)-1×106에 해당한다. 특정 구현예에서, 재조합 인간 IL-2 또는 IL-15의 ED50은 CTLL-2 세포를 사용한 세포 증식(XTT 절단)의 절반-최대 자극(half-maximal stimulation)에 필요한 농도에 해당한다. 특정 구현예에서, 재조합 인간 IL-7의 ED50은 PHA_활성화된 인간 말초 혈액 림프구의 증식을 위한 절반-최대 자극에 필요한 농도에 해당한다. IL-2에 대한 IU의 분석 및 계산에 관한 세부 사항은 문헌 「Wadhwa et al., Journal of Immunological Methods (2013), 379 (1-2): 1-7」; 및 「Gearing and Thorpe, Journal of Immunological Methods (1988), 114 (1-2): 3-9」에 논의되어 있으며, IL-15에 대한 IU의 분석 및 계산에 관한 세부 사항은 문헌 「Soman et al. Journal of Immunological Methods (2009) 348 (1-2): 83-94」에 논의되어 있다.
일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 상기 입력 세포는, 1 IU/mL 내지 1,000 IU/mL, 10 IU/mL 내지 50 IU/mL, 50 IU/mL 내지 100 IU/mL, 100 IU/mL 내지 200 IU/mL, 100 IU/mL 내지 500 IU/mL, 250 IU/mL 내지 500 IU/mL, 또는 500 IU/mL 내지 1,000 IU/mL의 농도의 사이토카인, 예를 들어 인간 재조합 사이토카인의 존재하에 자극되거나 자극에 적용된다.
일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 상기 입력 세포는, 1 IU/mL 내지 500 IU/mL, 10 IU/mL 내지 250 IU/mL, 50 IU/mL 내지 200 IU/mL, 50 IU/mL 내지 150 IU/mL, 75 IU/mL 내지 125 IU/mL, 100 IU/mL 내지 200 IU/mL, 또는 10 IU/mL 내지 100 IU/mL의 농도의 재조합 IL-2, 예를 들어 인간 재조합 IL-2의 존재하에 자극되거나 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 상기 입력 집단의 세포는, 50 IU/mL, 60 IU/mL, 70 IU/mL, 80 IU/mL, 90 IU/mL, 100 IU/mL, 110 IU/mL, 120 IU/mL, 130 IU/mL, 140 IU/mL, 150 IU/mL, 160 IU/mL, 170 IU/mL, 180 IU/mL, 190 IU/mL, 또는 100 IU/mL의 농도의 재조합 IL-2의 존재하에 자극되거나 자극에 적용된다. 일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 상기 입력 조성물의 세포는, 100 IU/mL의 IL-2, 예를 들어 인간 재조합 IL-2의 존재하에 자극되거나 자극에 적용된다.
일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 상기 입력 세포는, 100 IU/mL 내지 2,000 IU/mL, 500 IU/mL 내지 1,000 IU/mL, 100 IU/mL 내지 500 IU/mL, 500 IU/mL 내지 750 IU/mL, 750 IU/mL 내지 1,000 IU/mL, 또는 550 IU/mL 내지 650 IU/mL의 농도의 재조합 IL-7, 예를 들어 인간 재조합 IL-7의 존재하에 자극되거나 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 상기 입력 세포는, 50 IU/mL,100 IU/mL, 150 IU/mL, 200 IU/mL, 250 IU/mL, 300 IU/mL, 350 IU/mL, 400 IU/mL, 450 IU/mL, 500 IU/mL, 550 IU/mL, 600 IU/mL, 650 IU/mL, 700 IU/mL, 750 IU/mL, 800 IU/mL, 750 IU/mL, 750 IU/mL, 750 IU/mL, 또는 1,000 IU/mL의 농도의 IL-7의 존재하에 자극되거나 자극에 적용된다. 일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 상기 입력 세포는, 600 IU/mL의 재조합 IL-7, 예를 들어 인간 재조합 IL-7의 존재하에 자극되거나 자극에 적용된다.
일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 상기 입력 세포는, 1 IU/mL 내지 500 IU/mL, 10 IU/mL 내지 250 IU/mL, 50 IU/mL 내지 200 IU/mL, 50 IU/mL 내지 150 IU/mL, 75 IU/mL 내지 125 IU/mL, 100 IU/mL 내지 200 IU/mL, 또는 10 IU/mL 내지 100 IU/mL의 농도의 재조합 IL-15, 예를 들어 인간 재조합 IL-15의 존재하에 자극되거나 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 상기 입력 집단의 세포는, 50 IU/mL, 60 IU/mL, 70 IU/mL, 80 IU/mL, 90 IU/mL, 100 IU/mL, 110 IU/mL, 120 IU/mL, 130 IU/mL, 140 IU/mL, 150 IU/mL, 160 IU/mL, 170 IU/mL, 180 IU/mL, 190 IU/mL, 또는 200 IU/mL의 농도의 재조합 IL-15의 존재하에 자극되거나 자극에 적용된다. 일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 상기 입력 세포는, 100 IU/mL의 IL-15, 예를 들어 인간 재조합 IL-15의 존재하에 자극되거나 자극에 적용된다.
특정 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 상기 입력 집단으로부터의 세포는, IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15의 존재하에서 자극 조건하에 자극되거나 자극에 적용된다. 일부 구현예에서, 상기 IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15는 재조합이다. 특정 구현예에서, 상기 IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15는 인간이다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 인간 재조합 IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15이거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 재조합 IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15의 존재하에서 자극 조건하에 자극되거나 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 재조합 IL-2의 존재하에 또는 약 100 IU/m의 재조합 IL-2의 존재하에, 재조합 IL-7의 존재하에 또는 약 600 IU/m의 재조합 IL-7의 존재하에, 및 재조합 IL-15의 존재하에 또는 약 100 IU/m의 재조합 IL-2의 존재하에, 자극 조건하에 자극되거나 자극에 적용된다.
상기 조건은 하나 이상의 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 제제, 예를 들어 영양물질, 아미노산, 항생제, 이온, 및/또는 자극 요소, 예를 들어 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체, 및 상기 세포를 활성화하도록 설계된 임의의 다른 제제를 포함할 수 있다.
몇몇 측면에서, 자극은 Riddell 등의 미국특허 제6,040,177호, 문헌 「Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660」, 「Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660」, 「Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82」 및/또는 「Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701」에 설명된 기술에 따라 수행된다.
일부 구현예에서, 상기 자극은 무혈청 배지 중에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 무혈청 배지는 정의된 및/또는 잘 정의된 세포 배양 배지이다. 특정 구현예에서, 상기 무혈청 배지는 처리된, 예를 들어 억제제 및/또는 성장 인자(growth factor)를 제거하도록 여과된 제어된 배양 배지이다. 일부 구현예에서, 상기 무혈청 배지는 단백질을 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 무혈청 배지는 혈청 알부민, 가수 분해물, 성장 인자, 호르몬, 담체 단백질 및/또는 부착 인자를 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 자극은 본원 또는 국제출원 제PCT/US2018/064627호에 기재된 무혈청 배지로 수행된다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 하나 이상의 보충물로 보충된 기본 배지(예를 들어 OpTmizer™ T-세포 증폭 기본 배지(ThermoFisher))를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 보충물는 무혈청이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는, 예를 들어 추가 보충물(예를 들어 OpTmizer™ T-세포 증폭 보충물(ThermoFisher))에 의해 제공되는 세포의 유지, 증폭 및/또는 활성화를 위한 하나 이상의 추가 성분으로 보충된 기본 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 혈청 대체 보충물, 예를 들어 면역 세포 혈청 대체제, 예를 들어 ThermoFisher, #A2596101, CTS™ 면역 세포 혈청 대체제 또는 문헌[Smith et al. Clin Transl Immunology. 2015 Jan; 4(1): e31]에 기재된 면역 세포 혈청 대체제를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 유리 형태의 아미노산, 예를 들어 L-글루타민을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 디펩티드 형태의 L-글루타민(예를 들어 L-알라닐-L-글루타민), 예를 들어 Glutamax™(ThermoFisher)의 디펩티드를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 하나 이상의 재조합 사이토카인, 예를 들어 재조합 인간 IL-2, 재조합 인간 IL-7 및/또는 재조합 인간 IL-15를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 자극 조건 또는 자극 시약의 존재하에 상기 자극의 적어도 일부는 예를 들어 참조로 인용되는 국제공개공보 제WO2016/073602호에 기술된 바와 같이 원심 챔버의 내부 공동에서, 예를 들어 원심 회전하에 수행된다. 일부 구현예에서, 원심 챔버에서 수행된 상기 자극의 적어도 일부는 자극 및/또는 활성화를 유도하는 시약(들)과 혼합하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 선택된 세포는 상기 원심 챔버 중에서 자극 조건 또는 자극제와 혼합된다. 이러한 공정의 일부 측면에서, 일정 부피의 세포는, 세포 배양판 또는 다른 시스템에서 유사한 자극을 수행할 때 정상적으로 사용되는 것 보다 훨씬 적은 양의 하나 이상의 자극 조건 또는 제제와 혼합된다.
일부 구현예에서, 상기 자극은, 예를 들어 스피닝(spinning)의 존재하에서, 일반적으로는 비교적 적은 힘 또는 속도에서, 예를 들어 세포를 펠릿화하는 데 사용되는 속도보다 낮은 속도에서, 예를 들어 (약) 600 rpm 내지 1700 rpm (예를 들어 (약) 또는 적어도 600 rpm, 1000 rpm, 또는 1500 rpm 또는 1700 rpm), 예를 들어 약 80g 내지 100g(예를 들어 (약) 또는 적어도 80g, 85g, 90g, 95g, 또는 100g)의 챔버 또는 다른 용기의 샘플 또는 벽의 RCF에서, 혼합 조건하에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 스핀은 그러한 저속에서 스핀의 반복된 간격을 이용하여 수행된 후, 휴지 기간(rest period)을 가지며, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10초의 스핀 및/또는 휴지, 예를 들어 대략 1초 또는 2초의 스핀에 대략 5, 6, 7, 또는 8초의 휴지기를 갖는다.
특정 구현예에서, 자극은 원심 분리, 떨림, 회전, 흔들림 또는 관류, 예를 들어 배지의 연속 또는 반 연속 관류를 수반하지 않는 조건과 같은 정적 조건 하에서 수행된다. 일부 구현예에서, 개시 전 또는 직후, 예를 들어 5 분, 15 분 또는 30 분 이내에, 세포는 백 또는 바이알과 같은 컨테이너로 전달(예를 들어 멸균 조건 하에서 전달)되고, 인큐베이터에 배치된다. 특정 구현예에서, 인큐베이터는 (약) 16℃, 24℃ 또는 35℃ 또는 16℃, 24℃ 또는 35℃ 이상으로 설정된다. 일부 구현예에서, 인큐베이터는 (약) 37℃ 또는 37℃ ±2℃, ±1℃, ±0.5℃ 또는 ±0.1℃로 설정된다. 특정 구현예에서, 정적 조건 하의 자극은 인큐베이터에 배치된 세포 배양 백에서 수행된다. 일부 구현예에서, 배양 백은, 단핵구가 존재하는 경우 백 표면에 부착할 수 있는 단일 웹 폴리올레핀 기체 투과성 필름으로 구성된다.
특정한 측면에서, 상기 방법은 세포의 표면 상의 분자(세포 표면 분자)에 결합할 수 있는 적어도 하나의 시약(예를 들어 친화도 시약 또는 자극 시약)이 시약(예를 들어 친화도 시약 또는 자극 시약)과 가역적으로 결합되는 가역성 시스템을 사용한다. 일부 경우에, 상기 시약은 가역적으로 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 갖는 시약(예를 들어 친화도 시약 또는 자극 시약)을 함유한다. 일부 경우에, 상기 시약(예를 들어 친화도 시약 또는 자극 시약)은 다량체화 시약( multimerization reagent)이다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 시약(예를 들어 친화도 시약 또는 자극 시약)은 상기 분자의 에피토프 또는 영역을 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 결합부위 B를 함유하고 상기 시약(예를 들어 친화도 시약 또는 자극 시약)의 적어도 하나의 결합 부위 Z에 특이적으로 결합하는 결합 파트너 C를 함유한다. 일부 경우에, 상기 결합 파트너 C와 상기 적어도 하나의 결합 부위 Z 사이의 결합 상호작용은 비-공유 상호작용이다. 일부 구현예에서, 상기 결합 파트너 C와 상기 적어도 하나의 결합 부위 Z 사이의 결합 상호작용, 예를 들어 비-공유 상호작용은 가역적이다.
일부 구현예에서, 가역적 결합은 경쟁 시약과 같은 물질, 즉 적어도 하나의 결합 부위 Z에 결합할 수 있는 결합 부위이거나 이를 함유하는 물질의 존재하에 매개될 수 있다. 일반적으로, 상기 물질(예를 들어 경쟁 시약)은 상기 시약 중에 존재하는 결합 부위 Z에 대한 보다 높은 결합 친화도에 기인하여 및/또는 상기 결합 파트너 C보다 높은 농도로 존재하는 것에 기인하여 경쟁자(competitor)로서 작용함으로서, 상기 시약으로부터 상기 결합 파트너를 탈착 및/또는 해리할 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 결합 부위 Z에 대한 상기 물질(예를 들어 경쟁 시약)의 친화도는 상기 적어도 하나의 결합 부위 Z에 대한 제제(예를 들어 친화도 시약 또는 자극 시약)의 결합 파트너의 친화도보다 높다. 따라서, 일부 경우에, 상기 시약의 결합 부위 Z와 상기 시약(예를 들어 친화도 시약 또는 자극 시약)의 결합 파트너 C 사이의 결합은 상기 물질(경쟁 시약)의 첨가에 의해서 파괴됨으로써 상기 시약(예를 들어 친화도 시약 또는 자극 시약)과 시약(예를 들어 친화도 시약 또는 자극 시약)의 연합(association)을 가능하게 한다.
상기 가역적 시스템에서 사용될 수 있는 시약은 공지되어 있다[미국특허 제5,168,049호; 제5,506,121호; 제6,103,493호; 제7,776,562호; 제7,981,632호; 제8,298,782호; 제8,735,540호; 제9,023,604호; 및 국제공개공보 제WO2013/124474호 및 제WO2014/076277호 참조]. 가역적 상호작용을 형성할 수 있는 시약 및 결합 파트너, 및 그러한 결합을 되돌릴 수 있는 물질(예를 들어 경쟁 시약)은 하기 기술된다.
일부 구현예에서, 상기 자극은 예를 들어 형질도입(transduction) 전에 세포의 활성화 및/또는 증식을 초래한다.
1. 자극 시약
특정 구현예에서, 상기 자극 조건은 자극 시약으로 상기 세포를 인큐베이션, 컬처링, 및/또는 배양하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 자극 시약은 비드를 함유하거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 자극의 개시는 상기 세포가 자극 시약으로 인큐베이션되거나 또는 접촉될 때 일어난다. 특정 구현예에서, 상기 자극 시약은 올리고머 시약, 예를 들어 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머를 함유하거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 시약은, TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인 및/또는 하나 이상의 공자극(costimulatory) 분자의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인을 활성화 및/또는 활성화시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 자극 조건 또는 자극 시약은 하나 이상의 제제, 예를 들어 TCR 복합체의 세포내 신호 전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 리간드를 포함한다. 비드는 1종 이상의 제제, 이를테면 비드 표면에 커플링, 컨쥬게이트 또는 연결(직간접적으로)된 제제를 함유한다. 일부 구현예에서, 본원에서 상정된 제제는 RNA, DNA, 단백질(예를 들어 효소), 항원, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 항체 단편, 탄수화물, 지질 렉틴, 또는 원하는 표적에 대해 친화성을 갖는 기타 바이오분자를 포함할 수 있으며 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 원하는 표적은 T 세포수용체 및/또는 T 세포수용체의 성분이다. 특정 구현예에서, 원하는 표적은 CD3이다. 특정 구현예에서, 원하는 표적은 T 세포 공자극분자, 예를 들어 CD28, CD137 (4-1-BB), OX40, 또는 ICOS이다. 1종 이상의 제제는 공지의 다양한 방법에 의해 비드에 직간접적으로 부착될 수 있다. 이러한 부착은 공유, 비공유, 정전기 또는 소수성 부착일 수 있고 예를 들어 화학적 수단, 기계적 수단 또는 효소적 수단을 비롯한 다양한 부착 수단에 의해 달성가능하다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 예를 들어 Fab이다. 일부 구현예에서, 바이오분자(예를 들어 바이오티닐화된 항-CD3 항체)는 비드에 직접 부착된 또 다른 바이오분자(예를 들어 항-비오틴 항체)를 통해 간접적으로 부착될 수도 있다.
일부 구현예에서, 상기 자극 시약은 비드(예를 들어 상자기 비드)에 부착되고 세포(예를 들어 T 세포) 상의 하나 이상의 하기 거대분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 제제(예를 들어 항체)를 함유한다: CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD25, CD27, CD28, CD29, CD31, CD44, CD45RA, CD45RO, CD54 (ICAM-1), CD127, MHCI, MHCII, CTLA-4, ICOS, PD-1, OX40, CD27L (CD70), 4-1BB (CD137), 4-1BBL, CD30L, LIGHT, IL-2R, IL-12R, IL-1R, IL-15R; IFN-감마R, TNF-알파R, IL-4R, IL-10R, CD18/CD1 1a(LFA-1), CD62L(L-selectin), CD29/CD49d (VLA-4), 노치 리간드(Notch ligand)(예를 들어 델타-유사 1/4, Jagged 1/2, 등), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, 및 CXCR3 또는 그들의 단편(이들 거대분자 또는 그들의 단편에 대응하는 리간드를 포함함). 일부 구현예에서, 상기 비드에 부착된 제제는 세포(예를 들어 T 세포) 상의 하나 이상의 하기 거대분자에 특이적으로 결합한다: CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD3, CD4, CD8, CD45RA, 및/또는 CD45RO.
일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 제제는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 예를 들어 Fab를 포함한다. 항체로는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체(면역글로불린 Fc 영역을 갖는 전장 항체를 포함한다), 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물, 다중 특이적 항체(예를 들어 이중특이 항체, 다이아바디 및 단쇄 분자, 및 항체 단편(예를 들어 Fab, F(ab')2, 및 Fv)을 들 수 있다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 항체 단편(항원-결합 단편을 포함), 예를 들어 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, 또는 (Fab')2 단편이다. IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 비롯한 본원에 상정된 항체용으로 임의의 이소타입의 불변 영역이 이용될 수 있고 이러한 불변 영역은 인간 또는 동물 종(예를 들어 뮤린 종)으로부터 수득가능한 것으로 이해될 수 있을 것이다.
일부 구현예에서, 제제는 T 세포수용체의 하나 이상의 성분에 결합 및/또는 상기를 인식하는 항체이다. 특정 구현예에서, 제제는 항-CD3 항체이다. 특정 구현예에서, 제제는 공수용체에 결합 및/또는 상기를 인식하는 항체이다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 항-CD28 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 자극 시약은 항-CD28 항체 및 항-CD3 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 자극 시약은 하나 이상의 자극제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 자극제는 1차 및 2차 자극제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제 1 자극제는 예를 들어 본원에서 기술된 항-CD3 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며, 상기 제 2 자극제는 항-CD28 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서, 상기 제 1 자극제는 예를 들어 본원에서 기술된 항-CD3 Fab이며, 상기 제 2 자극제는 예를 들어 본원에서 기술된 항-CD28 Fab이다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 입력 조성물의 세포는, (약) 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.5:1, 1.25:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.75:1, 0.67:1, 0.5:1, 0.3:1 또는 0.2:1 비율의 자극 시약 대 세포의 존재 하에 자극된다. 특정 구현예에서, 자극 시약 대 세포의 비율은 2.5:1 내지 0.2:1, 2:1 내지 0.5:1, 1.5:1 내지 0.75:1, 1.25:1 내지 0.8:1, 1.1:1 내지 0.9:1이다. 특정 구현예에서, 자극 시약 대 세포의 비율은 (약) 1:1이다. 특정 구현예에서, 자극 시약 대 세포의 비율은 (약) 0.3:1이다. 특정 구현예에서, 자극 시약 대 세포의 비율은 (약) 0.2:1이다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 (약), 또는 적어도 0.01 ㎍, 0.02 ㎍, 0.03 ㎍, 0.04 ㎍, 0.05 ㎍, 0.1 ㎍, 0.2 ㎍, 0.3 ㎍, 0.4 ㎍, 0.5 ㎍, 0.75 ㎍, 1 ㎍, 2 ㎍, 3 ㎍, 4 ㎍, 5 ㎍, 6 ㎍, 7 ㎍, 8 ㎍, 9 ㎍, or 10 ㎍의 자극 시약/106 세포의 존재하에 자극된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 (약) 4 ㎍/106 세포의 존재하에 자극된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 (약) 3 ㎍/106 세포의 존재하에 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 (약) 2.5 ㎍/106 세포의 존재하에 자극된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 (약) 2 ㎍/106 세포의 존재하에 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 (약) 1.8 ㎍/106 세포의 존재하에 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 (약) 1.6 ㎍/106 세포의 존재하에 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 (약) 1.4 ㎍/106 세포의 존재하에 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 (약) 1.2 ㎍/106 세포의 존재하에 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 (약) 1 ㎍/106 세포의 존재하에 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 (약) 0.8 ㎍/106 세포의 존재하에 자극된다. 다양한 구현예에서, 상기 세포는 (약) 0.8 ㎍/106 세포의 존재하에 자극된다.
일부 구현예에서, 상기 자극 시약은 세포의 표면에서 분자와 결합하며, 상기 자극 시약과 상기 분자 사이의 결합은 상기 세포에서 자극 신호 전달을 유도, 전달(delivering), 또는 조절(modulating)할 수 있다. 일부 경우에, 상기 세포 표면 분자(예를 들어 수용체)는 신호 전달 분자이다. 일부 상기 경우에, 상기 자극 시약은 하나 이상의 표적 세포(예를 들어 T 세포)에 의해서 발현된 신호 전달 분자를 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 경우에, 상기 자극 시약은 세포 표면 분자, 예를 들어 수용체와 결합할 때 세포(예를 들어 T 세포)에서 자극 신호를 유도 또는 전달할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 자극 신호는 면역 자극(immunostimulatory)일 수 있으며, 이 경우 상기 자극제는 관련되거나 또는 세포(예를 들어 T 세포)에 의해서 면역 반응을 자극하는 신호를 유도, 전달, 또는 조절할 수 있으며, 예를 들어 면역 세포 증식 또는 증폭, 면역 세포 활성화, 면역 세포 분화, 사이토카인 분비, 세포 독성 활성 또는 면역 세포의 하나 이상의 다른 작용 활동을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 상기 자극 신호는 억제일 수 있으며, 이 경우 상기 자극 시약은 관련되거나 또는 세포(예를 들어 T 세포)에 의해서 면역 반응을 억제하는 신호를 유도, 전달, 또는 조절할 수 있으며, 예를 들어 면역 세포 증식 또는 증폭, 면역 세포 활성화, 면역 세포 분화, 사이토카인 분비, 세포 독성 활성 또는 면역 세포의 하나 이상의 다른 작용 활동을 억제한다.
일부 구현예에서, 상기 자극 시약은 1차 자극제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 1차 자극제는 상기 샘플의 선택된 세포의 표면에서 수용체 분자와 결합한다. 따라서 일부 경우에, 상기 1차 자극제는 자극 신호를 전달, 유도, 또는 조절한다. 일부 측면에서, 상기 1차 자극제에 의한 자극 신호의 전달, 유도, 또는 조절은 상기 세포의 자극을 수행한다. 따라서 일부 경우에, 상기 1차 자극제는 상기 세포에 자극 신호를 전달하거나 1차 활성화 신호를 제공함으로써 상기 세포를 자극하고/하거나 활성화시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 1차 자극제는 선택 마커의 하향 조절을 추가로 유도한다. 본원에서 사용되는 용어 '하향 조절'은 발현 감소, 예를 들어 이른 시점과 비교하여 선택 마커의 세포 표면 발현을 포괄할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 표적 세포(예를 들어 T 세포)는 TCR/CD3 복합체 ㅁ미및 공자극 분자, 예를 들어 CD28를 포함한다. 이러한 경우에, 상기 1차 자극제는 TCR/CD3 복합체와 결합함으로써, T 세포에서의 자극 신호(예를 들어 1차 신호, 예를 들어 1차 활성화 신호)를 전달하고, 상기 2차 자극제는 공자극 CD28 분자와 결합한다. 특정한 측면에서, 상기 1차 자극제 및/또는 상기 2차 자극제는 선택 마커(예를 들어 상기 표적 세포(예를 들어 T 세포)를 고정하는데 사용된 선택 마커)의 하향 조절을 더 유도한다.
일부 구현예에서, 상기 1차 자극제는 상기 세포, 예를 들어 T 세포에서 TCR/CD3 복합체-관련된 자극 신호(예를 들어 1차 신호)를 전달한다. 일부 구현예에서, 상기 1차 자극제는 자극수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM을 함유하는 분자에 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, CD3를 특이적으로 결합하는 상기 1차 자극제는 항-CD3-항체, 항-CD3-항체의 2가 항체 단편, 항-CD3-항체의 1가 항체 단편 및 항체-유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD3 결합 분자로 구성된 제제로부터 선택될 수 있다. 상기 2가 항체 단편은 (Fab)2'-단편 또는 2가 단일 사슬 Fv 단편일 수 있는 반면, 1가 항체 단편은 Fab 단편, FV 단편 및 단일 사슬 Fv 단편(scFv)으로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 항체 유사 결합 특성을 가진 단백질성 CD28 결합 분자는 압타머(aptamer), 리포칼린(lipocalin) 패밀리의 폴리펩티드에 기초한 뮤테인(mutein), 글루바디(glubody), 안키린(ankyrin) 스캐폴드에 기초한 단백질, 결정성 스캐폴드에 기초한 단백질, 아드넥틴(adnectin) 및 아비머(avimer)일 수 있다.
일부 구현예에서, 항-CD3 단편은 하이브리도마 세포주 OKT3에 의해 생성된 CD3 결합 모노클론 항체(ATCC® CRL-8001TM; 미국특허 제4,361,549호 참조)로부터 유래될 수 있다. 상기 항-CD3 항체 OKT3의 중쇄의 가변 도메인 및 경쇄의 가변 도메인은 문헌 「Arakawa et al J. Biochem. 120, 657-662 (1996)」에 기술되어 있으며 각각 서열 번호 93 및 94에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항-CD3 Fab는 각각 서열 번호 93 및 94에 제시된 가변 중쇄 및 경쇄의 CDR을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 자극제는 2차 자극제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 2차 자극제는 상기 세포의 표면 상의 분자, 예를 들어 세포 표면 분자, 예를 들어 수용체 분자에 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 2차 자극제는 상기 1차 자극제에 의해서 결합된 분자를 통해 전달된 자극 신호를 강화, 감쇠 또는 변형시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 2차 자극제는 자극 신호, 예를 들어 2차 또는 추가의 자극 신호를 전달, 유도, 또는 조절한다. 일부 측면에서, 상기 2차 자극제는 상기 1차 자극제에 의해서 유도된 자극 신호를 강화 또는 증강시킨다. 일부 구현예에서, 상기 2차 자극제는 보조 분자에 결합하고/하거나 세포에서 보조 또는 2차 자극 신호를 자극하거나 유도할 수 있다. 일부 측면에서, 상기 2차 자극제는 공자극 분자에 결합하고/하거나 공자극 신호를 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 2차 자극제를 포함할 수 있는 상기 자극제는, 공자극 분자, 보조 분자(accessory molecule), 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체(chemokine receptor), 면역 체크포인트 분자(immune checkpoint molecule), TNF 패밀리 또는 TNF 수용체 패밀리의 구성원일 수 있는 제 2 분자에 결합, 예를 들어 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 T 세포 상의 분자는 CD28일 수 있으며 상기 2차 자극제는 CD28을 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, CD28을 특이적으로 결합하는 상기 2차 자극제는 항-CD28-항체, 항-CD28-항체의 2가 항체 단편, 항-CD28-항체의 1가 항체 단편, 항체-유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD28 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 2가 항체 단편은 (Fab)2'-단편 또는 2가 단일 사슬 Fv 단편일 수 있는 반면, 1가 항체 단편은 Fab 단편, FV 단편 및 단일 사슬 Fv 단편(scFv)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 경우에, 항체 유사 CD3 결합 특성을 가진 단백질성 결합 분자는 압타머(aptamer), 리포칼린(lipocalin) 패밀리의 폴리펩티드에 기초한 뮤테인(mutein), 글루바디(glubody), 안키린(ankyrin) 스캐폴드에 기초한 단백질, 결정성 스캐폴드에 기초한 단백질, 아드넥틴(adnectin) 또는 아비머(avimer)일 수 있다.
일부 구현예에서, 항-CD28 Fab 단편은 항체(GenBank Accession No. AF451974.1하의 합성 단일 사슬 Fv 구성체(synthetic single chain Fv construct)로서 증착됨; 또한 문헌 「Vanhove et al, BLOOD, 15 July 2003, Vol. 102, No. 2, pages 564-570」 참조)로부터 유래될 수 있으며, 그의 가변 중쇄 및 경쇄는 각각 서열 번호 91 및 92를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항-CD28 Fab는 각각 서열 번호 91 및 92에 제시된 가변 중쇄 및 경쇄의 CDR을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 T 세포 상의 분자는 CD90이고 상기 2차 자극제는 CD90를 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, CD90를 특이적으로 결합하는 상기 2차 자극제는 항-CD90-항체, 항-CD90-항체의 2가 항체 단편, 항-CD90-항체의 1가 항체 단편, 및 항체-유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD90 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 당해 분야 공지의 것으로부터 선택될 수 있다[문헌 「nti-CD90 antibody G7 ( 105201)」 참조].
일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 T 세포 상의 분자는 CD95이고 상기 2차 자극제는 CD95를 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, CD95를 특이적으로 결합하는 상기 2차 자극제는 항-CD95-항체, 항-CD95-항체의 2가 항체 단편, 항-CD95-항체의 1가 항체 단편, 및 항체-유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD95 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 당해 분야 공지의 것으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어 일부 측면에서, 상기 항-CD90 항체는 예를 들어 문헌 「Paulsen et al. Cell Death & Differentiation 18.4 (2011): 619-631」에 기술된 바와 같은 모노클론성 마우스 항-인간 CD95 CH11(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY)이거나 또는 항-CD95 mAb 7C11 또는 항-APO-1일 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 T 세포 또는 B 세포 상의 분자는 CD137이고 상기 2차 자극제는 CD137을 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, CD137을 특이적으로 결합하는 상기 2차 자극제는 항-CD137-항체, 항-CD137-항체의 2가 항체 단편, 항-CD137-항체의 1가 항체 단편, 및 항체-유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD137 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 당해 분야 공지의 것으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 항-CD137 항체는 문헌 「Taraban et al. Eur J Immunol. 2002 Dec;32(12):3617-27」에 기술된 바와 같은 LOB12, IgG2a 또는 LOB12.3, IgG1일 수 있다. [예를 들어 US6569997, US6303121, 문헌 「Mittler et al. Immunol Res. 2004;29(1-3):197-208」 참조].
일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 B 세포 상의 분자는 CD40일 수 있으며 상기 2차 자극제는 CD40을 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, CD40을 특이적으로 결합하는 상기 2차 자극제는 항-CD40-항체, 항-CD40-항체의 2가 항체 단편, 항-CD40-항체의 1가 항체 단편, 및 항체-유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD40 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 T 세포 상의 분자는 CD40L(CD154)일 수 있으며 상기 2차 자극제는 CD40L을 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, CD40L을 특이적으로 결합하는 상기 2차 자극제는 항-CD40L-항체, 항-CD40L-항체의 2가 항체 단편, 항-CD40L-항체의 1가 항체 단편, 및 항체-유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD40L 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 당해 분야 공지의 것으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 일부 측면에서 상기 항-CD40L 항체는 문헌 「Blair et al. JEM vol. 191 no. 4 651-660」에 기술된 바와 같은 Hu5C8일 수 있다. [예를 들어 국제공개공보 제WO1999/061065호, 미국출원공개공보 제US20010026932호, 제US7547438호, 국제공개공보 제WO2001056603호 참조].
일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 T 세포 상의 분자는 유도가능한 T 세포 공자극제(inducible T cell Costimulator; ICOS)일 수 있으며 상기 2차 자극제는 ICOS를 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, ICOS를 특이적으로 결합하는 상기 2차 자극제는 항-ICOS-항체, 항-ICOS-항체의 2가 항체 단편, 항-ICOS-항체의 1가 항체 단편, 및 항체-유사 결합 특성을 갖는 단백질성 ICOS 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 당해 분야 공지의 것으로부터 선택될 수 있다. [예를 들어 미국출원공개공보 제US20080279851호 및 문헌 「Deng et al. Hybrid Hybridomics. 2004 Jun;23(3):176-82」 참조].
일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 T 세포 상의 분자는 T 세포의 활성화를 위한 링커(Linker for Activation of T cells; LAT)일 수 있으며 상기 2차 자극제는 LAT를 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, LAT를 특이적으로 결합하는 상기 2차 자극제는 항-LAT-항체, 항-LAT-항체의 2가 항체 단편, 항-LAT-항체의 1가 항체 단편, 및 항체-유사 결합 특성을 갖는 단백질성 LAT 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 당해 분야 공지의 것으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 T 세포 상의 분자는 CD27일 수 있으며 상기 2차 자극제는 CD27을 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, CD27을 특이적으로 결합하는 상기 2차 자극제는 항-CD27-항체, 항-CD27-항체의 2가 항체 단편, 항-CD27-항체의 1가 항체 단편, 및 항체-유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD27 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 당해 분야 공지의 것으로부터 선택될 수 있다. [예를 들어 국제공개공보 제WO2008/051424호 참조].
일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 T 세포 상의 분자는 OX40일 수 있으며 상기 2차 자극제는 OX40을 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, OX40을 특이적으로 결합하는 상기 2차 자극제는 항-OX40-항체, 항-OX40-항체의 2가 항체 단편, 항-OX40-항체의 1가 항체 단편, 및 항체-유사 결합 특성을 갖는 단백질성 OX40 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 당해 분야 공지의 것으로부터 선택될 수 있다. [예를 들어 국제공개공보 제WO2013/038191호, 문헌 「Melero et al. Clin Cancer Res. 2013 Mar 1;19(5):1044-53」 참조].
일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 T 세포 상의 분자는 HVEM일 수 있으며 상기 2차 자극제는 HVEM을 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, HVEM을 특이적으로 결합하는 상기 2차 자극제는 항-HVEM-항체, 항-HVEM-항체의 2가 항체 단편, 항-HVEM-항체의 1가 항체 단편, 및 항체-유사 결합 특성을 갖는 단백질성 HVEM 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 당해 분야 공지의 것으로부터 선택될 수 있다. [예를 들어 국제공개공보 제WO2006/054961호, 제WO2007001459호, 문헌 「Park et al. Cancer Immunol Immunother. 2012 Feb;61(2):203-14」 참조].
임의의 상기 구체예에서, 2가 항체 단편은 (Fab)2'-단편 또는 2가 단일 사슬 Fv 단편일 수 있는 반면, 1가 항체 단편은 Fab 단편, FV 단편 및 단일 사슬 Fv 단편(scFv)으로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 임의의 상기 구체예에서, 항체 유사 결합 특성을 가진 단백질성 결합 분자는 압타머(aptamer), 리포칼린(lipocalin) 패밀리의 폴리펩티드에 기초한 뮤테인(mutein), 글루바디(glubody), 안키린(ankyrin) 스캐폴드에 기초한 단백질, 결정성 스캐폴드에 기초한 단백질, 아드넥틴(adnectin) 및 아비머(avimer)일 수 있다.
일부 측면에서, 상기 자극제는, 분자가 TCR, 키메라 항원 수용체, 또는 면역 수용체 티로신-기반 활성화 모티프 도는 ITAM인 표적 세포의 표변 위에 발현된 분자를 특이적을 표적화한다. 예를 들어 상기 표적 세포의 표면 위에 발현된 분자는 T 세포 또는 B 세포 항원 수용체 복합체, CD3 쇄, CD3 제타, T 세포수용체 또는 B 세포수용체의 항원-결합 부분, 또는 키메라 항원 수용체로부터 선택된다. 일부 경우에, 상기 자극제는 펩티드:MHC 클래스 I 복합체를 표적화한다.
일부 구현예에서, 상기 자극제는 상기 표적 세포의 표면 위에 발현된 분자의 His-태그된 세포외 도메인(His-tagged extracellular domain)에 결합한다. 일부 경우에, 상기 자극제는 니켈 하전된 trisNTA(His-STREPPER 또는 His/Strep-tag®II Adapter라고도 함)과 콘쥬게이트된 펜티드 서열 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 69에 제시된 Strep-tag®II라고도 함)을 함유한다. 일부 구현예에서, His-태그된 표적 세포의 표면 위에 발현된 상기 분자는 CD19이다.
일부 구현예에서, 상기 자극제는 상기 재조합 수용체, 예를 들어 CAR의 항체 부분에 특이적으로 결합한다. 일부 경우에, 상기 재조합 수용체의 항체 부분은 면역글로불린 콘스턴트 영역, 예를 들어 IgG4 힌지 영역, 및/또는 CH1/CL 및/또는 Fc 영역의 적어도 일부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 콘스턴트 영역은 인간 IgG, 예를 들어 IgG4 또는 IgG1 중의 것이다. 일부 경우에, 상기 시약은 상기 IgG4 스페이서를 인식하는 αIgG로 로딩된다.
일부 구현예에서, 원하는 표적은 T 세포수용체 및/또는 T 세포수용체의 성분이다. 특정 구현예에서, 원하는 표적은 CD3이다. 특정 구현예에서, 원하는 표적은 T 세포 공자극 분자, 예를 들어 CD28, CD137(4-1-BB), OX40 또는 ICOS이다.
일부 구현예에서, 예를 들어 상기 자극제가 자극 시약 또는 수용체-결합 제제 시약과 결합되지 않을 때, 상기 자극제는 항체, 2가 항체 단편, F(ab)2, 또는 2가 단일-사슬 Fv 단편이다. 일부 구현예에서, 상기 자극제가 상기 시약과 결합되지 않을 때, 상기 자극제는 결합 파트너 C를 포함하지 않는다.
a. 비드 시약
특정 구현예에서, 자극 시약은 세포, 예를 들어 T 세포를 활성화 및/또는 증폭시킬 수 있는 하나 이상의 작용제와 컨쥬게이트 또는 연결된 입자, 예를 들어 생체 분자, 예를 들어 비드를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 작용제는 비드에 결합된다. 일부 구현예에서, 비드는 생체 적합성(biocompatible), 즉 생물학적 용도에 적합한 물질로 구성된다. 일부 구현예에서, 비드는 배양된 세포, 예를 들어 배양된 T 세포에 비독성이다. 일부 구현예에서, 비드는 작용제와 세포 사이의 상호 작용을 허용하는 방식으로 작용제를 부착할 수 있는 임의의 입자일 수 있다.
일부 구현예에서, 자극 시약은, 비드 및 세포 표면의 거대 분자와 직접 상호 작용하는 하나 이상의 작용제를 포함한다. 특정 구현예에서, 비드(예를 들어 상자기 비드)는 세포상의 하나 이상의 거대 분자(예를 들어 하나 이상의 세포 표면 단백질)에 특이적인 하나 이상의 작용제(예를 들어 항체)를 통해 세포와 상호 작용한다. 특정 구현예에서, 비드(예를 들어 상자기 비드)는 본원에 기재된 제 1 작용제, 예를 들어 1차 항체(예를 들어 항-비오틴 항체) 또는 다른 생체 분자로 표지된 다음, 제 2 작용제, 예를 들어 2차 항체(예를 들어 비오티닐화된(biotinylated) 항-CD3 항체) 또는 다른 제 2 생체 분자(예를 들어 스트렙타비딘(streptavidin))가 첨가됨으로써, 2차 항체 또는 다른 제 2 생체 분자는 입자의 1차 항체 또는 다른 생체 분자와 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 비드는 약 0.001㎛ 초과, 약 0.01㎛ 초과, 약 0.1㎛ 초과, 약 1.0㎛ 초과, 약 10㎛ 초과, 약 50㎛ 초과, 약 100 ㎛ 초과, 또는 약 1000㎛ 초과 및 약 1500㎛ 이하의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 비드는 약 1.0㎛ 내지 약 500㎛, 약 1.0㎛ 내지 약 150㎛, 약 1.0㎛ 내지 약 30㎛, 약 1.0㎛ 내지 약 10㎛, 약 1.0㎛ 내지 약 5.0㎛, 약 2.0㎛ 내지 약 5.0㎛, 또는 약 3.0㎛ 내지 약 5.0㎛의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 비드는 약 3㎛ 내지 약 5㎛의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 비드는 적어도 또는 적어도 약 또는 약 0.001㎛, 0.01㎛, 0.1㎛, 0.5 ㎛, 1.0㎛, 1.5㎛, 2.0㎛, 2.5㎛, 3.0㎛, 3.5㎛, 4.0㎛, 4.5 ㎛, 5.0㎛, 5.5㎛, 6.0㎛, 6.5㎛, 7.0㎛, 7.5㎛, 8.0㎛, 8.5㎛, 9.0㎛, 9.5㎛, 10㎛, 12㎛, 14㎛, 16㎛, 18㎛ 또는 20㎛의 직경을 갖는다. 특정 구현예에서, 비드는 직경이 4.5㎛ 또는 약 4.5㎛이다. 특정 구현예에서, 비드는 직경이 2.8㎛ 또는 약 2.8㎛이다.
일부 구현예에서, 비드는 0.001 g/㎤ 초과, 0.01 g/㎤ 초과, 0.05 g/㎤ 초과, 0.1 g/㎤ 초과, 0.5 g/㎤ 초과, 0.6 g/㎤ 초과, 0.7 g/㎤ 초과, 0.8 g/㎤ 초과, 0.9 g/㎤ 초과, 1 g/㎤ 초과, 1.1 g/㎤ 초과, 1.2 g/㎤ 초과, 1.3 초과 g/㎤, 1.4 g/㎤ 초과, 1.5 g/㎤ 초과, 2 g/㎤ 초과, 3 g/㎤ 초과, 4 g/㎤ 초과, 또는 5g/㎤ 초과의 밀도를 갖는다. 일부 구현예에서, 비드는 약 0.001g/㎤ 내지 약 100g/㎤, 약 0.01g/㎤ 내지 약 50g/㎤, 약 0.1g/㎤ 내지 약 10 g/㎤, 약 0.1g/㎤ 내지 약 .5 g/㎤, 약 0.5 g/㎤ 내지 약 1 g/㎤, 약 0.5 g/㎤ 내지 약1.5 g/㎤, 약 1g/㎤ 내지 약 1.5g/㎤, 약 1g/㎤ 내지 약 2g/㎤, 또는 약 1g/㎤ 내지 약 5g/㎤의 밀도를 갖는다. 일부 구현예에서, 비드는 약 0.5g/㎤, 약 0.6g/㎤, 약 0.7g/㎤, 약 0.8g/㎤, 약 0.9g/㎤, 약 1.0g/㎤, 약 1.1g/㎤, 약 1.2g/㎤, 약 1.3g/㎤, 약 1.4g/㎤, 약 1.5g/㎤, 약 1.6g/㎤, 약 1.7g/㎤, 약 1.8g/㎤, 약 1.9g/㎤, 또는 약 2.0 g/㎤의 밀도를 갖는다. 특정 구현예에서, 비드는 약 1.6 g/㎤의 밀도를 갖는다. 특정 구현예에서, 비드 또는 입자는 약 1.5 g/㎤의 밀도를 갖는다. 특정 구현예에서, 입자는 약 1.3 g/㎤의 밀도를 갖는다.
특정 구현예에서, 복수의 비드는 균일한 밀도를 갖는다. 특정 구현예에서, 균일한 밀도는 평균 비드 밀도의 10% 미만, 5% 미만 또는 1% 미만의 밀도 표준 편차를 포함한다.
일부 구현예에서, 비드는 작용제에 결합, 연결 또는 컨쥬게이트될 수 있는 비드 표면에 또는 근처에 하나 이상의 물질을 함유한다. 일부 구현예에서, 비드는 표면 작용성화된(functionalized), 즉 결합 분자, 예를 들어 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 공유 결합을 형성할 수 있는 작용기를 포함한다. 특정 구현예에서, 비드는 표면-노출된 카르복실, 아미노, 히드록실, 토실, 에폭시 및/또는 클로로메틸 기를 포함한다. 특정 구현예에서, 비드는 표면 노출된 아가로오스(agarose) 및/또는 세파로오스(sepharose)를 포함한다. 특정 구현예에서, 비드 표면은 결합 분자에 결합하거나 부착할 수 있는 부착된 자극 시약을 포함한다. 특정 구현예에서, 생체 분자는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 비드는 표면 노출 단백질 A, 단백질 G 또는 비오틴(biotin)을 포함한다.
일부 구현예에서, 비드는 자기장에서 반응한다. 일부 구현예에서, 비드는 자기(magnetic) 비드이다. 일부 구현예에서, 자기(magnetic) 비드는 상자성이다. 특정 구현예에서, 자기(magnetic) 비드는 초상자성(superparamagnetic)이다. 특정 구현예에서, 비드는 이들이 자기장에 노출되지 않는 한 어떠한 자기 특성도 나타내지 않는다.
특정 구현예에서, 비드는 자기(magnetic) 코어, 상자성 코어 또는 초상 자성(superparamagnetic) 코어를 포함한다. 일부 구현예에서, 자기 코어는 금속을 함유한다. 일부 구현예에서, 금속은 철, 니켈, 구리, 코발트, 가돌리늄(gadolinium), 망간, 탄탈륨 tantalum), 아연, 지르코늄 또는 이들의 임의의 조합일 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 특정 구현예에서, 자기 코어는 금속 산화물 (예를 들어 산화철), 페라이트(ferrites) (예를 들어 망간 페라이트(manganese ferrites), 코발트 페라이트(cobalt ferrites), 니켈 페라이트(nickel ferrites) 등), 적철광(hematite) 및 금속 합금 (예를 들어 CoTaZn)을 포함한다. 일부 구현예에서, 자기 코어는 페라이트, 금속, 금속 합금, 산화철 또는 이산화 크롬(chromium dioxide) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 자기 코어는 철 원소(elemental iron) 또는 이의 화합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 자기 코어는 마그네타이트(magnetite)(Fe3O4), 마그헤마이트(maghemite)(γFe2O3) 또는 그레이그라이트(greigite) (Fe3S4) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 내부 코어는 산화철(예를 들어 Fe3O4)을 포함한다.
특정 구현예에서, 비드는 표면 기능화된 코트 또는 코팅으로 덮인 자기, 상자성 및/또는 초상 자성 코어를 포함한다. 일부 구현예에서, 코트는 중합체(polymer), 다당류(polysaccharide), 실리카, 지방산, 단백질, 탄소, 아가로스(agarose), 세파로오스(sepharose) 또는 이들의 조합을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는 물질을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 중합체(polymer)는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 폴리(락트-코-글리콜산(lactic-co-glycolic acid)), 폴리 글루타르알데히드(polyglutaraldehyde), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리스티렌(polystyrene) 또는 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol) 일 수 있다. 특정 구현예에서, 외부 코트 또는 코팅은 폴리스티렌(polystyrene)을 포함한다. 특정 구현예에서, 외부 코팅은 표면 기능화(functionalized)된다.
일부 구현예에서, 자극 시약은 금속 산화물 코어(예를 들어 산화철 코어) 및 코트를 포함하는 비드를 포함하고, 여기서 금속 산화물 코어는 하나 이상의 다당류(예를 들어 덱스 트란)를 포함하고, 여기서 코트는 하나 이상의 다당류(예를 들어 아미노 덱스트란), 하나 이상의 중합체(예를 들어 폴리 우레탄) 및 실리카를 포함한다. 일부 구현예에서, 금속 산화물 코어는 콜로이드성(colloidal) 산화철 코어이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 작용제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 작용제는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 항-CD3 항체, 항-CD28 항체 및 항-비오틴 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 항-비오틴(anti-biotin) 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 비드는 약 3㎛ 내지 약 10㎛의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 비드는 약 3㎛ 내지 약 5㎛의 직경을 갖는다. 특정 구현예에서, 비드는 약 3.5㎛의 직경을 갖는다.
일부 구현예에서, 자극 시약은 금속 산화물 코어(예를 들어 산화철 내부 코어) 및 코트(예를 들어 보호 코트)를 포함하는 비드에 부착된 하나 이상의 시약을 포함하고, 여기서 코트는 폴리스티렌을 포함한다. 특정 구현예에서, 비드는 상자성(예를 들어 초상자성(superparamagnetic)) 철 코어, 예를 들어 마그네타이트 (Fe3O4) 및/또는 마그헤마이트(maghemite)(γFe2O3)c를 포함하는 코어 및 폴리스티렌(polystyrene) 코트 또는 코팅을 포함하는 단분산성(monodisperse), 상자성(paramagnetic) (예를 들어 초상 자성(superparamagnetic)) 비드이다. 일부 구현예에서, 비드는 비-다공성(non-porous)이다. 일부 구현예에서, 비드는 하나 이상의 작용제가 부착된 작용화된(functionalized) 표면을 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 작용제는 표면에서 비드에 공유 결합된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 작용제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 작용제는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 작용제는 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체, 및 표지된 항체 (예를 들어 비오티닐화(biotinylated) 항체), 예를 들어 표지된 항-CD3 또는 항-CD28 항체에 결합할 수 있는 항체 또는 그의 항원 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 비드는 약 1.5g/㎤의 밀도 및 약 1 ㎡/g 내지 약 4 ㎡/g 의 표면적을 갖는다. 특정 구현예에서; 비드는 직경이 약 4.5㎛이고 밀도가 약 1.5g/㎤인 단분산성(monodisperse) 초상자성(superparamagnetic) 비드이다. 일부 구현예에서, 비드 비드는 평균 직경이 약 2.8㎛이고 밀도가 약 1.3g/㎤인 단분산성(monodisperse) 초상자성(superparamagnetic) 비드이다.
일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 조성물은 (약) 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.5:1, 1.25:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.75:1, 0.67:1, 0.5:1, 0.3:1, 또는 0.2:1의 비드 대 세포의 비율로 자극 시약과 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 상기 비드 대 세포의 비율은 2.5:1 내지 0.2:1, 2:1 내지 0.5:1, 1.5:1 내지 0.75:1, 1.25:1 내지 0.8:1, 1.1:1 내지 0.9:1이다. 특정 구현예에서, 상기 비드 대 세포의 비율은 약 1:1 또는 1:1이다.
b. 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약
특정 구현예에서, 상기 자극 시약은 올리고머 시약, 예를 들어 스트렙타비딘 뮤테인 시약(streptavidin mutein reagent)을 함유하고, 그것은 하나 이상의 제제, 예를 들어 TCR 복합체의 세포내 신호 전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 리간드에 콘쥬게이트되거나, 연결되거나, 또는 부착되는 것이다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 제제는 특정 결합 부위(예를 들어 결합 부위 Z)에서 올리고머 시약과 결합할 수 있는 부착된 결합 도메인 또는 결합 파트너(예를 들어 결합 파트너 C)를 갖는다. 일부 구현예에서, 복수의 제제가 상기 올리고머 시약에 가역적으로 결합된다. 다양한 구현예에서, 상기 올리고머 시약은 특정 구현예에서 결합 도메인(예를 들어 결합 파트너 C)에서 복수의 제제에 가역적으로 결합되는 복수의 특정 결합 부위를 갖는다. 일부 구현예에서, 결합된 제제의 양은 경쟁 시약, 예를 들어 특정 결합 부위(예를 들어 결합 부위 Z)에 결합할 수도 있는 시약의 존재하에 감소된다.
일부 구현예에서, 상기 올리고머 자극 시약은, 적어도 하나의 제제(예를 들어 세포 예를 들어 T 세포에서 신호를 생성할 수 있는 제제)가 상기 올리고머 시약과 관련되는, 예를 들어 가역적으로 관련되는 가역적 시스템이거나 또는 포함한다. 상기 올리고머 자극 시약의 비제한적 예는 예를 들어 국제공개공보 제WO 2018/197949호에서 찾을 수 있으며, 상기 국제공개공보는 그 전체가 본원에서 참조로 인용된다. 일부 구현예에서, 상기 시약은 상기 제제에 결합할 수 있는, 예를 들어 가역적으로 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 함유한다. 일부 경우에, 상기 시약은 세포 예를 들어 T 세포에서 신호를 생성할 수 있는 적어도 하나의 부착된 제제를 갖는 올리고머 입자 시약이다. 일부 구현예에서, 상기 제제는, 상기 분자의 에피토프 또는 영역에 특이적으로 결합할 수 있고 또한 상기 시약의 적어도 하나의 결합 부위, 예를 들어 상기 시약의 결합 부위 Z에 특이적으로 결합하는, 결합 파트너 C로도 지칭되는 결합 파트너를 함유하는, 적어도 하나의 결합 부위, 예를 들어 결합 부위 B를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 결합 파트너 C와 상기 적어도 하나의 결합 부위 Z 사이의 결합 상호작용은 비-공유 상호작용이다. 일부 경우, 상기 결합 파트너 C와 상기 적어도 하나의 결합 부위 Z 사이의 결합 상호작용은 공유 상호작용이다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 결합 부위 Z 사이의 결합 상호작용, 예를 들어 비-공유 상호작용은 가역적이다.
상기 가역적 시스템에서 올리고머 시약으로서 사용될 수 있는 물질은 공지되어 있다[미국특허 제5,168,049호; 제5,506,121호; 제6,103,493호; 제7,776,562호; 제7,981,632호; 제8,298,782호; 제8,735,540호; 제9,023,604호; 및 국제공개공보 제WO2013/124474호 및 제WO2014/076277호 참조]. 가역적 상호작용을 형성할 수 있는 시약 및 결합 파트너, 및 그러한 결합을 되돌릴 수 있는 물질(예를 들어 경쟁 시약)은 하기 기술된다.
일부 구현예에서, 상기 올리고머 시약은 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인 또는 유사체(예를 들어 뉴트라비딘) 또는 그들의 혼합물의 올리고머이며, 여기서 상기 올리고머 시약은 상기 제제의 결합 도메인(예를 들어 결합 파트너 C)와 가역적으로 관련시키기 위한 하나 이상의 결합 부위를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 제제의 결합 도메인은 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체, 또는 스트렙타비딘-결합 펩티드 또는, 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인 또는 유사체, 아비딘 또는 아미딘 뮤테인 또는 유사체에 특이적으로 결합할 수 있는 다른 분자일 수 있다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 제제(예를 들어 세포 예를 들어 T 세포에서 신호를 생성할 수 있는 제제)는, 상기 올리고머 시약, 예를 들어 상기 올리고머 시약 상에 존재하는 상기 복수의 특정 결합 부위(예를 들어 결합 부위 Z)와 관련되거나, 예를 들어 거기에 가역적으로 결합된다. 일부 경우에, 이것은, 상기 제제에 의해 결합되거나 인식되는 세포 표면 분자를 (그의 적어도 2개의 복제물에서) 각는 표적 세포가 상기 제제와 접촉하는 경우 결합활성 효과가 발생할 수 있도록 서로 근접하게 배열되는 제제를 생성한다.
일부 구현예에서, 상기 올리고머 제제는 스트렙타비딘 올리고머, 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머, 스트렙타비딘 유사체 올리고머, 아미딘 올리고머, 아비딘 뮤테인 또는 아비딘 유사체(예를 들어 뉴트라비딘) 또는 그들의 혼합물로 구성된 올리고머이다. 특정 구현예에서, 상기 올리고머 시약은 제제의 결합 도메인(예를 들어 결합 파트너 C)에 결합할 수 있는 특정 결합 부위를 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 결합 도메인은 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체, 또는 스트렙타비딘-결합 펩티드 또는, 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인 또는 유사체, 아비딘 또는 아비딘 뮤테인 또는 유사체에 특이적으로 결합할 수 있는 다른 분자일 수 있다.
본원에 제공된 방법은, 상기 올리고머 시약이 올리고히스티딘 친화성 태그(oligohistidine affinity tag), 칼모듈린(calmodulin) 또는 그의 유사체, 칼모듈린 결합 펩티드(CBP), FLAG-펩티드, HA-태그, 말토스 결합 단백질(MBP), HSV 에피토프, myc 에피토프, 및/또는 비오티닐화된 담체 단백질에 결합할 수 있는 분자을 포함한다.
일부 구현예에서, 스트렙타비딘은 야생형 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인 또는 유사체, 예를 들어 스트렙타비딘-유사 폴리펩티드일 수 있다. 유사하게, 일부 측면에서, 아비딘은 야생형 아비딘 또는 아비딘의 뮤테인 또는 유사체 예를 들어 뉴트라비딘, 천연 아비딘의 대안으로 이용 가능하고 보다 중성 pi를 전형적으로 나타내는 개질 아르기닌을 갖는 탈당화된 아비딘을 포함한다. 일반적으로, 아비딘의 탈당화된, 중성 형태는 상업적으로 이용 가능한 형태 예를 들어 "Extravidin"(Sigma Aldrich를 통해 이용 가능) 또는 "NeutrAvidin"(예를 들어 Thermo Scientific 또는 Invitrogen을 통해 이용 가능)을 포함한다.
일부 구현예에서, 시약은 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 또는 유사체이다. 일부 구현예에서, 야생형 스트렙타비딘(wt-스트렙타비딘)은 문헌[Argarana 외, Nucleic Acids Res 14(1986) 1871-1882(서열 번호 66)]에 개시된 아미노산 서열을 갖는다. 일반적으로, 스트렙타비딘은 자연에서 4 개의 같은 서브 유닛의 사량체로 존재한다, 즉 동종-사량체이고, 각각의 서브 유닛은 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체 또는 비오틴 모방체에 대한 단일 결합 위치를 함유한다. 스트렙타비딘 서브 유닛의 예시적인 서열은 서열 번호 66에 제시된 아미노산 서열이나, 상기 서열은 다른 Streptomyces 종으로부터 이의 상동물에 존재하는 서열을 또한 포함할 수 있다. 특히, 스트렙타비딘의 각각의 서브 유닛은 약 10-14M 정도의 평형 해리 상수(KD)로 비오틴에 대한 강력한 결합 친화도를 나타낼 수 있다. 일부 경우에, 스트렙타비딘은 4 개의 결합 위치 중 하나만이 작용성인 1가 사량체[문헌 「Howarth et al. (2006) Nat. Methods, 3:267-73」; 「Zhang et al. (2015) Biochem. Biophys. Res. Commun., 463:1059-63」 참조], 4 개의 결합 위치 중 2 개가 작용성인 2 가 사량체[문헌 「Fairhead et al. (2013) J. Mol. Biol., 426:199-214」 참조]로 존재할 수 있고 또는 단량체 또는 이량체 형태[문헌 「Wu et al. (2005) J. Biol. Chem., 280:23225-31」; 「Lim et al. (2010) Biochemistry, 50:8682-91」 참조]로 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 스트렙타비딘은 임의의 형태, 야생형 또는 미변형 스트렙타비딘, 예를 들어 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체 또는 비오틴 모방체에 대한 결합 부위를 함유하는 하나 이상의 작용성 서브 유닛을 포함하는 스트렙토마이세스 종(Streptomyces species)으로부터의 스트렙타비딘 또는 그의 기능적으로 활성인 단편일 수 있으며, 예를 들어 서열 번호 66에 제시된 스트렙토마이세스 아비디니 세트(Streptomyces avidinii set)로부터의 야생형 스트렙타비딘 또는 그의 기능적으로 활성인 단편의 적어도 하나의 작용성 서브 유닛 또는 그의 기능적으로 활성인 단편을 함유한다. 예를 들어 일부 구현예에서, 스트렙타비딘은 야생형 스트렙타비딘의 단편을 포함할 수 있으며, 이는 N-말단 및/또는 C-말단에서 단축된다. 이러한 최소 스트렙타비딘은 서열 번호 66의 10번 내지 16번의 아미노산 위치의 영역에서 N-말단으로 시작하고 서열 번호 66의 133번 내지 142번의 아미노산 위치의 영역에서 C-말단으로 종지하는 임의의 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘의 기능적 활성 단편은 서열 번호 67에 제시된 아미노산의 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 예를 들어 서열 번호 67에 제시된 것과 같은 스트렙타비딘은 추가로 서열 번호 66에 제시된 넘버링 세트를 갖는 Ala13에 대응하는 위치에서 N-발단 메티오닌을 추가로 함유할 수 있다. 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인에서 잔기들의 위치에 관한 언급은 서열 번호 66에서 잔기들의 넘버링과 관련이 있다.
스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인의 예는 예를 들어 국제공개공보 제WO 86/02077호, 독일특허출원 제 19641876 Al호, 미국특허 제6,022,951호, 국제공개공보 제WO 98/40396호 또는 제WO 96/24606호에 언급되어 있다. 스트렙타비딘 뮤테인의 예는 공지되어 있다[미국특허 제5,168,049호; 제5,506,121호; 제6,022,951호; 제6,156,493호; 제6,165,750호; 제6,103,493호; 또는 제6,368,813호; 국제공개공보 제WO2014/076277호 참조].
일부 구현예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 미변형 또는 야생형 스트렙타비딘의 일부가 아니거나 또는 미변형 또는 야생형 스트렙타비딘의 일부만을 포함할 수 있는 아미노산을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 미변형 또는 야생형 스트렙타비딘의 서브유닛과 비교하여, 예를 들어 서열 번호 66에 제시된, 예를 들어 서열 번호 67에 제시된 미변형 또는 야생형 스트렙타비딘 또는 그의 기능적 활성 단편과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환(대체)를 가질 수 있는 적어도 하나의 서브 유닛을 함유한다.
일부 구현예에서, 결합 도메인에 대한 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인(streptavidin mutein)의 평형 해리 상수(KD)는 1×10-4 M, 5×10-4 M, 1×10-5 M, 5x 10-5 M, 1×10-6 M, 5×10-6 M 또는 1×10-7 M 미만이지만, 일반적으로는 1×10-13 M, 1×10-12 M 또는 1×10-11 M 초과이다. 예를 들어 미국특허 제5,506,121호에 개시된 것과 같은 펩티드 서열(스트렙-태그(Strep-tags))은 비오틴 모방체(biotin mimics)로서 작용하고 대략 10-4 and 10-5 M의 KD로 스트렙타비딘에 대한 결합 친화도를 입증한다[미국특허 제6,103,493호 또는 국제공개공보 제WO2014/076277호 참조]. 일부 구현예에서, 결합 친화도는 공지의 방법, 예를 들어 본원에서 기술된 임의의 방법에 의해서 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 시약, 예를 들어 시약, 예를 들어 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인은 펩티드 리간드 결합 파트너에 대한 결합 친화도를 나타내고, 상기 펩티드 리간드 결합 파트너는 제제(예를 들어 수용체-결합제 또는 선택제) 중에 존재하는 결합 파트너 C일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 펩티드 서열은 일반식 His-Pro-Xaa을 갖는 서열을 함유하며, 여기서 Xaa는 글루타민, 아스파라긴, 또는 메티오닌이며, 예를 들어 서열 번호 83에 제시된 서열에 함유된다. 일부 구현예에서, 상기 펩티드 서열은 서열 번호 83, 예를 들어 서열 번호 74에 제시된 일반적인 방식을 갖는다. 한 구체예에서, 상기 펩티드 서열은 Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly('Strep-tag®'이라고도 함; 서열 번호 75에 제시됨)이다. 한 구체예에서, 상기 펩티드 서열은 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys('Strep-tag® II'라고도 함; 서열 번호 69에 제시됨)이다. 일부 구현예에서, 펩티드 리간드는 2 개 이상의 스트렙타비딘-결합 모듈의 순차적인 배열을 함유하고, 여기서 2 개의 모듈 사이 거리는 0 이상 및 50 개 이하의 아미노산이고, 여기서 1 개의 결합 모듈은 3 내지 8 개의 아미노산을 갖고 적어도 His-Pro-XaA 서열을 함유하고, 여기서 Xaa는 글루타민, 아스파라긴 또는 메티오닌이고, 다른 결합 모듈은 예를 들어 서열 번호 84에 제시된 동일하거나 상이한 스트렙타비딘 펩티드 리간드를 갖는다[예를 들어 국제공개공보 제WO02/077018호; 미국특허 제7,981,632호 참조]. 일부 구현예에서, 펩티드 리간드는 임의의 서열 번호 76 또는 77에 제시된 방식을 갖는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 펩티드 리간드는 임의의 서열 번호 70-73, 78-79에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 대부분의 경우, 이들 모두의 스트렙타비딘 결합-펩티드는 동일한 결합 부위, 즉 스트렙타비딘의 비오틴 결합 부위에 결합한다. 하나 이상의 스트렙타비딘 결합-펩티드가 결합 파트너 C, 예를 들어 C1 및 C2로서 사용되는 경우, 결합 파트너 C를 통해서 상기 하나 이상의 제제에 결합된 다량체화 시약 및/또는 올리고머성 입자 시약은 전형적으로는 하나 이상의 스트렙타비딘 뮤테인로 구성된다.
일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은 미국특허 제6,103,493호에 기술된 바와 같이 돌연변이체이다. 일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은 서열 번호 66에 제시된 바와 같이 야생형 스트렙타비딘의 아미노산 서열에 기초한 아미노산 위치 44번 내지 53번의 영역 내에 적어도 하나의 돌연변이를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은 하나 이상의 잔기 44, 45, 46 및/또는 47번에서 돌연변이를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은, 소수성 지방족 아미노산, 예를 들어 Val, Ala, Ile 또는 Leu, 45번 위치의 임의의 아미노산, 지방족 아미노산, 예를 들어 46번 위치의 소수성 지방족 아미노산으로 야생형 스트렙타비딘의 44번 위치의 Glu의 치환 및/또는 염기성 아미노산, 예를 들어 Arg 또는 Lys, 예를 들어 일반적으로는 Arg으로 47번 위치의 Val의 치환을 함유한다. 일부 구현예에서, Ala는 46번 위치에 있고/있거나 Arg는 47번 위치에 있고/있거나 Val 또는 Ile는 44번 위치에 있다. 일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은, 예를 들어 서열 번호 80 또는 서열 번호 81 또는 82에 제시된 아미노산의 서열을 함유하는 예시적인 스트렙타비딘 뮤테인(스트렙타비딘 뮤테인 1, SAM1로도 알려짐)에 제시된 것과 같은 잔기 Val44-Thr45-Ala46-Arg47을 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은, 예를 들어 서열 번호 85, 68, 또는 73에 제시된 아미노산의 서열을 함유하는 예시적인 스트렙타비딘 뮤테인(SAM2로도 알려짐)에 제시된 것과 같은 잔기 Ile44-Gly45-Ala46-Arg47을 함유한다. 일부 경우에, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은 예를 들어 미국특허 제6,103,493호에 기술되어 있으며, 상표명 Strep-Tactin®으로 상업적으로 판매되고 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은 서열 번호 86 또는 서열 번호 87에 제시된 아미노산의 서열을 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 분자는 서열 번호 67, 81, 68, 86, 88, 82 또는 73 중의 임의의 것에 제시된 서열을 포함하는 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인의 사량체(tetramer)이며, 이것은 사량체로서, 단량체당 1개의 N-말단 아민 및 4개의 리신(lysine)을 포함한, 20개의 1차 아민을 함유하는 분자이다.
일부 구현예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 펩티드 리간드(Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly; Strep-tag®로도 불리워짐; 서열 번호 75에 제시됨)에 대해 3.7×10-5 M 이거나 그 미만이고/이거나 펩티드 리간드(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys; Strep-tag® II로도 불리워짐; 서열 번호 69에 제시됨)에 대해 7.1×10-5 M이거나 그 미만이고/이거나 서열 번호 69, 76-78, 70-72, 74, 75, 83, 84 중의 임의의 것에 제시된 펩티드 리간드 중의 임의의 것에 대해 7.0×10-5 M, 5.0×10-5 M, 1.0×10-5 M, 5.0×10-6 M, 1.0×10-6 M, 5.0×10-7 M, 또는 1.0×10-7 M 이거나 그 미만이지만, 일반적으로는 1×10-13 M, 1×10-12 M 또는 1×10-11 M 초과인 평형 해리 상수(KD)에 의해서 특징지워지는 결합 친화도를 나타낸다.
일부 구현예에서, 생성되는 스트렙타비딘 뮤테인은 펩티드 리간드(Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly; Strep-tag®로도 불리워짐; 서열 번호 75에 제시됨)에 대해 2.7×104 M-1이거나 그 초과이고/이거나 펩티드 리간드(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys; Strep-tag® II로도 불리워짐; 서열 번호 69에 제시됨)에 대해 1.4×104 M-1이거나 그 초과이고/이거나 서열 번호 69, 76-78, 70-72, 74, 75, 83, 84 중의 임의의 것에 제시된 펩티드 리간드 중의 임의의 것에 대해 1.43×104 M-1, 1.67×104 M-1, 2×104 M-1, 3.33×104 M-1, 5×104 M-1, 1×105 M-1, 1.11×105 M-1, 1.25×105 M-1, 1.43×105 M-1, 1.67×105 M-1, 2×105 M-1, 3.33×105 M-1, 5×105 M-1, 1×106 M-1, 1.11×106 M-1, 1.25×106 M-1, 1.43×106 M-1, 1.67×106 M-1, 2×106 M-1, 3.33×106 M-1, 5×106 M-1, 1×107 M-1 이거나 그 초과이지만, 일반적으로는 (약) 1×1013 M-1, 1×1012 M-1 또는 1×1011 M-1 초과인 평형 결합 상수(KA)에 의해서 특징지워지는 결합 친화도를 나타낸다.
특정 구현예에서, 본원에서는 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사량체로 구성되고/되거나 그를 함유하는 올리고머 입자 시약이 제공된다. 특정 구현예에서, 본원에서 제공된 상기 올리고머 입자 시약은, 하나 이상의 제제, 예를 들어 자극제 및/또는 선택제에 가역적으로 결합하고/하거나 가역적으로 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 올리고머 입자 시약은 70 nm 내지 125 nm의 반경, 예를 들어 평균 반경; 1×107 g/mol 내지 1×109 g/mol의 분자량; 및/또는 1,000개 내지 5,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사량체를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 올리고머 입자 시약은 하나 이상의 제제 예를 들어 세포의 표면에서 분자에, 예를 들어 수용체에 결합하는 제제에 결합, 예를 들어 가역적으로 결합된다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 제제는 본원에서, 예를 들어 섹션 II.C.3에서 기술된 시약이다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 예를 들어 결합 파트너, 예를 들어 스트렙타비딘 결합-펩티드, 예를 들어 Strep-tag® II를 함유하는 항체 또는 그의 항원 단편이거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 제제는 결합 파트너, 예를 들어 스트렙타비딘 결합-펩티드, 예를 들어 Strep-tag® II를 함유하는 항-CD3 및/또는 항-CD28 Fab이다.
일부 구현예에서, 본원에서는 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사량체로 구성되고/되거나 그를 함유하는 올리고머 입자 시약이 제공된다. 특정 구현예에서, 본원에서 제공된 상기 올리고머 입자 시약은, 하나 이상의 제제, 예를 들어 자극제 및/또는 선택제에 가역적으로 결합하고/하거나 가역적으로 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 올리고머 입자 시약은 80 nm 내지 120 nm의 반경, 예를 들어 평균 반경; 7.5×106 g/mol 내지 2×108 g/mol의 분자량; 및/또는 500개 내지 10,000개의 양, 예를 들어 평균 양을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 올리고머 입자 시약은 하나 이상의 제제 예를 들어 세포의 표면에서 분자에, 예를 들어 수용체에 결합하는 제제에 결합, 예를 들어 가역적으로 결합된다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 제제는 섹션 II.C.3에 기술된 제제이다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 결합 파트너, 예를 들어 스트렙타비딘 결합-펩티드, 예를 들어 Strep-tag® II를 함유하는 항-CD3 및/또는 항-CD28 Fab, 예를 들어 Fab이다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 제제는 결합 파트너, 예를 들어 스트렙타비딘 결합-펩티드, 예를 들어 Strep-tag® II를 함유하는 항-CD3 및/또는 항-CD28 Fab이다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 106개의 세포 당 (약) 또는 적어도 (약) 0.01 ㎍, 0.02 ㎍, 0.03 ㎍, 0.04 ㎍, 0.05 ㎍, 0.1 ㎍, 0.2 ㎍, 0.3 ㎍, 0.4 ㎍, 0.5 ㎍, 0.75 ㎍, 1 ㎍, 2 ㎍, 3 ㎍, 4 ㎍, 5 ㎍, 6 ㎍, 7 ㎍, 8 ㎍, 9 ㎍, 또는 10 ㎍의 올리고머 자극 시약의 존재하에서 자극된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 106개의 세포 당 (약) 4 ㎍의 존재하에서 자극된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 106개의 세포 당 (약) 3 ㎍의 존재하에서 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 106개의 세포 당 (약) 2.75 ㎍의 존재하에서 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 106개의 세포 당 (약) 2.5 ㎍의 존재하에서 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 106개의 세포 당 (약) 2.25 ㎍의 존재하에서 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 106개의 세포 당 (약) 2 ㎍의 존재하에서 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 106개의 세포 당 (약) 1.8 ㎍의 존재하에서 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 106개의 세포 당 (약) 1.6 ㎍의 존재하에서 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 106개의 세포 당 (약) 1.4 ㎍의 존재하에서 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 106개의 세포 당 (약) 1.2 ㎍의 존재하에서 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 106개의 세포 당 (약) 1 ㎍의 존재하에서 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 106개의 세포 당 (약) 0.8 ㎍의 존재하에서 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 특정 측면에서, 상기 올리고머 자극 시약의 4 ㎍는 3 ㎍의 올리고머 입자 및 1 ㎍의 부착된 제제, 예를 들어 0.5 ㎍ 의 항-CD3 Fabs 및 0.5 ㎍ 의 항-CD28 Fabs이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 (약) 10×108, 9×108, 8×108, 7×108 , 6×108 , 5×108 , 4×108, 3×108, 2×108, 1×108의 올리고머 시약의 존재하에 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 (약) 7×108 , 6×108 , 5×108 , 4×108, 3×108의 올리고머 시약의 존재하에 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 (약) 7×108 내지 3×108의 올리고머 시약의 존재하에 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 (약) 6×108 내지 4×108의 올리고머 시약의 존재하에 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 (약) 6×108 내지 5×108의 올리고머 시약의 존재하에 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 (약) 5×108의 올리고머 시약의 존재하에 자극되거나 또는 자극에 적용된다.
일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 샘플의 선택된 세포는 (약) 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.5:1, 1.25:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.75:1, 0.67:1, 0.5:1, 0.3:1, 또는 0.2:1의 올리고머 시약 대 세포의 비율의 백분율로 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 올리고머 시약 대 세포의 비율은 2.5:1 내지 0.2:1, 2:1 내지 0.5:1, 1.5:1 내지 0.75:1, 1.25:1 내지 0.8:1, 1.1:1 내지 0.9:1이다. 특정 구현예에서, 상기 올리고머 시약 대 세포의 비율은 약 1:1 또는 1:1이다. 특정 구현예에서, 상기 올리고머 시약 대 세포의 비율은 약 0.3:1이거나 또는 0.3:1이다. 특정 구현예에서, 상기 올리고머 시약 대 세포의 비율은 약 0.2:1이거나 또는 0.2:1이다.
특정 측면에서, 올리고머 시약 내에서, 올리고머 입자와 부착된 제제 사이의 질량 비율은 약 3:1이다. 특정 측면에서, 올리고머 시약 내에서, 올리고머 입자, 부착된 항-CD3 Fab 및 부착된 항-CD28 Fab 사이의 질량 비율은 약 3:0.5:0.5이다. 특정 측면에서, 4 ㎍의 올리고머 시약은 3 ㎍의 올리고머 입자 및 1 ㎍의 부착된 제제, 예를 들어 0.5 ㎍의 항-CD3 Fab 및 0.5 ㎍의 항-CD28 Fab이거나 이를 포함한다. 다른 구체예에서, 106 세포 당 1.2 ㎍의 올리고머 시약은, 106 세포 당 0.9 ㎍의 올리고머 입자 및 0.3 ㎍의 부착된 제제, 예를 들어 0.15 ㎍의 항-CD3 Fab 및 0.15 ㎍의 항-CD28 Fab이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고머 시약은 무혈청 배지에 첨가되고, 자극은 예를 들어 문헌 국제출원 제PCT/US2018/064627호에 기재된 바와 같이 무혈청 배지에서 수행된다.
일부 구현예에서, 무혈청 배지는 하나 이상의 보충물로 보충된 기본 배지(예를 들어 OpTmizer™ T-세포 증폭 기본 배지(ThermoFisher))를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 보충물는 무혈청이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는, 예를 들어 추가 보충물(예를 들어 OpTmizer™ T-세포 증폭 보충물(ThermoFisher))에 의해 제공되는 세포의 유지, 증폭 및/또는 활성화를 위한 하나 이상의 추가 성분으로 보충된 기본 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 혈청 대체 보충물, 예를 들어 면역 세포 혈청 대체제, 예를 들어 ThermoFisher, #A2596101, CTS™ 면역 세포 혈청 대체제 또는 문헌[Smith et al. Clin Transl Immunology. 2015 Jan; 4(1): e31]에 기재된 면역 세포 혈청 대체제를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 유리 형태의 아미노산, 예를 들어 L-글루타민을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 디펩티드 형태의 L-글루타민(예를 들어 L-알라닐-L-글루타민), 예를 들어 Glutamax™(ThermoFisher)의 디펩티드를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 하나 이상의 재조합 사이토카인, 예를 들어 재조합 인간 IL-2, 재조합 인간 IL-7 및/또는 재조합 인간 IL-15를 더 포함한다.
2. 자극 시약의 제거
일부 구현예에서, 자극 시작은 세포를 수집, 수확, 또는 제형화하기 전에 세포 또는 세포 집단으로부터 제거된다. 일부 구현예에서, 상기 자극 시약은 인큐베이션, 예를 들어 섹션 I-D에서와 같이 본원에서 기술된 인큐베이션 후 또는 도중에 세포 또는 세포 집단으로부터 분리 또는 제거된다. 특정 구현예에서, 상기 세포 또는 세포 집단은 상기 인큐베이션 후에 그러나 상기 세포를 수집, 수확, 또는 제형화하기 전에 상기 자극 시약을 제거하는 공정, 과정, 단계, 또는 기법을 수행한다. 특정 구현예에서, 상기 세포 또는 세포 집단은 상기 인큐베이션 후에 상기 자극 시약을 제거하는 공정, 과정, 단계, 또는 기법(technique)을 수행한다. 특정 구현예에서, 상기 세포 또는 세포 집단은 인큐베이션 후에 자극 시약을 제거하는 공정, 과정, 단계, 또는 기법을 거친다. 일부 측면에서, 인큐베이션도중 세포로부터 자극 시약이 분리될 때, 상기 세포는 인큐베이션의 잔여 기간동안 분리 또는 제거 이전과 동일한 인큐베이션 조건으로 복귀된다.
특정 구현예에서, 상기 자극 시약은 세포로부터 제거 및/또는 분리된다. 이론에 구애됨이 없이, 특정 구현예에서, 자극 시약과 세포 사이의 결합 및/또는 연합(association)은 일부 경우 인큐베이션도중에 시간에 따라 감소될 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 제제를 부가하여 자극 시약과 세포 사이의 결합 및/또는 연합을 감소시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 세포 배양 조건에서의 변화, 예를 들어 제제의 첨가는 자극 시약과 세포 사이의 결합 및/또는 연합을 감소시킬 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 자극 시약은 예를 들어 배양, 세포 배양 시스템 및/또는 용액으로부터 세포를 제거하지 않고 배양, 세포 배양 시스템 및/또는 세포와 별도로 용액으로부터 제거될 수 있다.
특정 구현예에서, 자극 시약은 일정 시간 경과 후 세포로부터 분리 및/또는 제거될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 일정 시간은 자극의 개시로부터의 일정 시간이다. 특정 구현예에서, 상기 인큐베이션의 시작은 세포가 자극 시약 및/또는 상기 자극 시약을 함유하는 배지 또는 용액과 접촉하는 시점 또는 대략 그 시점인 것으로 고려된다. 특정 구현예에서, 상기 자극 시약은 상기 자극의 개시 후 (약) 120시간, 108시간, 96시간, 84시간, 72시간, 60시간, 48시간, 36시간, 24시간, 또는 12시간 이내에 세포로부터 제거 또는 분리된다. 특정 구현예에서, 상기 자극 시약은 상기 자극이 개시된 후 (약) 48시간에 세포로부터 제거 또는 분리된다. 특정 구현예에서, 상기 자극 시약은 상기 자극이 개시된 후 (약) 72시간에 세포로부터 제거 또는 분리된다. 특정 구현예에서, 상기 자극 시약은 상기 자극이 개시된 후 (약) 96시간에 세포로부터 제거 또는 분리된다.
a. 비드 시약의 제거
특정 구현예에서, 상기 비드 자극 시약, 예를 들어 항-CD3/항-CD28 항체 콘쥬게이트된 상자기 비드는 상기 세포들 또는 상기 세포 집단으로부터 분리되거나 제거된다. 자극 시약(예를 들어 입자 예를 들어 비드 입자 또는 자화가능한 입자이거나 또는 그를 함유하는 자극 시약)을 제거하는 방법은 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 상기 자극 시약의 1차 항체에 결합하고 상기 세포 상의 그의 항원에 대한 친화성을 변경시켜서 온화한 분리(gentle detachment)를 허용하는 경쟁 항체, 예를 들어 비-표지된 항체가 사용될 수 있다. 일부 경우에, 분리 후에 상기 경쟁 항체는 입자(예를 들어 비드 입자)와 결합된 상태를 유지할 수 있으나 미반응 항체는 세척되거나 될 수 있고 세포는 분리, 선택, 농축 및/또는 활성화하는 항체가 없다. 상기 시약의 예로는 DETACaBEAD(Friedl 외 1995; Entschladen 외 1997)가 있다. 일부 구현예에서, 입자(예를 들어 비드 입자)는 절단 가능한 링커(예를 들어 DNA 링커)의 존재하에 제거될 수 있고, 입자-결합된 항체는 링커(예를 들어 CELLection, Dynal)에 접합된다. 일부 경우에, 링커 영역은 분리, 예를 들어 DNA 분해효소 또는 기타 방출 완충액의 추가로 세포로부터 입자(예를 들어 비드 입자)를 제거하기 위한 절단 가능한 위치를 제공한다. 일부 구현예에서, 기타 효소적 방법이 세포로부터 입자(예를 들어 비드 입자)를 방출시키기 위해 이용될 수도 있다. 일부 구현예에서, 입자(예를 들어 비드 입자 또는 자화성 입자)는 생분해성이다.
일부 구현예에서, 상기 자극 시약은 자성, 상자성, 및/또는 초상자성(superparamagnetic)이고/이거나, 자성, 상자성, 및/또는 초상자성인 비드를 함유하며, 상기 자극 시약은 세포를 자기장에 노출시킴으로써 세포로부터 제거될 수 있다. 자기장을 발생시키는 자석을 함유하는 적당한 장치의 예로는 DynaMag CTS(제조원: Thermo Fisher), Magnetic Separator(제조원: Takara) 및 EasySep Magnet(제조원: Stem Cell Technologies)를 들 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 자극 시약은 상기 제공된 방법의 완료 전에, 예를 들어 본원에서 제공된 방법에 의해서 생산된 조작된 세포를 수확, 수집, 및/또는 제형화하기 전에 상기 세포로부터 제거 또는 분리된다. 일부 구현예에서, 상기 자극 시약은 세포를 조작한 후, 예를 들어 형질도입 또는 형질감염 후에 상기 세포로부터 세포로부터 제거 또는 분리된다.
일부 구현예에서, 상기 자극 비드 시약, 예를 들어 상기 자극 자기 비드 시약은, 상기 세포를 수집, 수확, 또는 제형화하기 전에 상기 세포 또는 세포 집단으로부터 분리 또는 제거된다. 일부 구현예에서, 상기 자극 비드 시약, 예를 들어 상기 자극 자기 비드 시약은, 상기 인큐베이션, 예를 들어 섹션 I-D에서와 같이 본원에서 기술된 인큐베이션 도중 또는 그 후에 자기장에 노출함으로써 상기 세포 또는 세포 집단으로부터 분리 또는 제거된다. 특정 구현예에서, 상기 세포 또는 세포 집단은, 상기 인큐베이션 후 그러나 상기 세포를 수집, 수확, 또는 제형화하는 단계 전에 상기 자기장에 노출되어 상기 자극 비드 시약, 예를 들어 상기 자극 자기 비드 시약을 제거된다. 특정 구현예에서, 상기 세포 또는 세포 집단은, 상기 인큐베이션 후에 상기 자기장에 노출되어 상기 자극 비드 시약, 예를 들어 상기 자극 자기 비드 시약을 제거된다. 일부 측면에서, 상기 자극 비드 시약이 상기 인큐베이션도중에 상기 세포 또는 세포 집단으로부터 분리 또는 제거되는 경우, 상기 세포 또는 세포 집단은, 상기 인큐베이션의 잔여 기간동안 상기 자기장에 노출되기 전과 동일한 인큐베이션 조건으로 복귀된다.
특정 구현예에서, 상기 자극 비드 시약, 예를 들어 상기 자극 자기 비드 시약은, 예를 들어 자기장에 노출됨으로써 상기 인큐베이션의 (약) 120시간, 108시간, 96시간, 84시간, 72시간, 60시간, 48시간, 36시간, 24시간, 또는 12시간 이내에 상기 세포로부터 분리 또는 제거된다. 특정 구현예에서, 상기 자극 비드 시약, 예를 들어 상기 자극 자기 비드 시약은, 예를 들어 자기장에 노출됨으로써 상기 인큐베이션의 (약) 72시간 후에 상기 세포로부터 분리 또는 제거된다. 일부 구현예에서, 상기 자극 비드 시약, 예를 들어 상기 자극 자기 비드 시약은, 예를 들어 자기장에 노출됨으로써 상기 인큐베이션의 (약) 96시간 후에 상기 세포로부터 분리 또는 제거된다.
b. 올리고머 시약의 제거
일부 구현예에서, 인큐베이션된 T 세포의 집단은, 물질, 예를 들어 경쟁 제제(competition agent)를 첨가하는 것, 예를 들어 상기 자극제의 신호 전달을 방해, 예를 들어 단축 및/또는 종지하도록 T 세포에 첨가하는, 본원에 제공된 임의의 방법에 따라 생성 또는 발생된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션된 T 세포의 집단은 물질, 예를 들어 경쟁 제제, 예를 들어 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예를 들어 D-비오틴의 존재를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 물질, 예를 들어 경쟁 제제, 예를 들어 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예를 들어 D-비오틴은, 상기 물질이 배양도중에 외인적으로 첨가되지 않은 배양된 T 세포의 기준 집단 또는 제제 중의 물질의 양 보다 적어도 1.5-배, 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 100-배, 적어도 1000-배 또는 그 보다 많은 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 배양된 T 세포의 집단 중의, 상기 물질, 예를 들어 경쟁 제제, 예를 들어 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예를 들어 D-비오틴의 양은, 10 μM 내지 100 μM, 100 μM 내지 1 mM, 100 μM 내지 500 μM 또는 10 μM 내지 100 μM이다. 일부 구현예에서, 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예를 들어 D-비오틴의 10 μM 또는 약 10 μM이 상기 세포 또는 세포 집단에 첨가되어 상기 세포 또는 세포 집단으로부터 상기 올리고머 자극 시약을 분리 또는 제거한다.
특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 제제(예를 들어 TCR 및/또는 공수용체를 자극하거나 활성화하는 제제)는, 예를 들어 상기 올리고머 시약 상에 존재하는 복수의 특정 결합 부위(예를 들어 결합 부위 Z)를 통해서 상기 올리고머 시약과 결합하고, 예를 들어 그에 가역적으로 결합된다. 일부 경우에, 이것은, 제제에 의해서 결합되거나 인식되는 세포 표면 분자를 갖는 표적 세포(그의 적어도 2개의 복제물)가 상기 제제와 접촉하는 경우 결합활성 효과(avidity effect)가 발생할 수 있도록 제제들이 서로 근접하게 배열되게 한다. 일부 측면에서, 상기 수용체 결합 시약은 결합 부위 B에서 세포의 수용체 분자에 대해 낮은 친화도를 가지므로, 상기 수용체 결합 시약은 경쟁 시약의 존재하에서 상기 세포로부터 해리된다. 따라서, 일부 구현예에서, 상기 제제는 경쟁 시약의 존재하에서 세포로부터 제거된다.
일부 구현예에서, 상기 올리고머 자극 시약은 가역적으로 부착된 항-CD3 및 항-CD28 Fab를 갖는 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머이다. 일부 구현예에서, 상기 Fab는 예를 들어 상기 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머에 대한 가역성 부착을 허용하는 스트렙타비딘 결합 도메인을 함유한다. 일부 경우에, 항-CD3 및 항-CD28 Fab는, T 세포 발현 CD3 및/또는 CD28이 가역적으로 부착된 Fab를 갖는 올리고머 자극 시약과 접촉하는 경우 결합활성 효과를 발생하도록 서로 근접하게 배열된다. 일부 측면에서, 상기 Fab는 CD3 및 CD28에 대한 낮은 친화도를 가지므로, 상기 fab는 경쟁 시약, 예를 들어 비오틴 또는 비오틴 변이체 또는 유사체의 존재하에 세포로부터 해리된다. 따라서, 일부 구현예에서, 상기 Fab는 경쟁 시약 예를 들어 D-비오틴의 존재하에서 세포로부터 제거 또는 해리된다.
일부 구현예에서, 상기 올리고머 자극 시약, 예를 들어 상기 자극 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약은 세포를 수집, 수확 또는 제형화하기 전에 세포(들) 집단으로부터 제거 또는 분리된다. 일부 구현예에서, 자극 올리고머 시약, 예를 들어 상기 자극 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약은, 인큐베이션, 본원에서 예를 들어 섹션 I-D에서 기술된 인큐베이션 후 또는 도중에 경쟁 시약, 예를 들어 비오틴, 또는 비오틴 유사체와 접촉 또는 그에 대한 노출에 의해서 세포들 또는 세포 집단으로부터 제거 또는 분리된다. 특정 구현예에서, 상기 세포들 또는 세포 집단은 경쟁 시약, 예를 들어 비오틴, 또는 비오틴 유사체와 접촉 또는 노출되어 상기 인큐베이션 후 그러나 상기 세포를 수집, 수확 또는 제형화하기 전에 자극 올리고머 시약, 예를 들어 상기 자극 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약을 제거한다. 특정 구현예에서, 상기 세포들 또는 세포 집단은 경쟁 시약, 예를 들어 비오틴, 또는 비오틴 유사체와 접촉 또는 노출되어 상기 인큐베이션 후에 자극 올리고머 시약, 예를 들어 상기 자극 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약을 제거한다. 일부 측면에서, 자극 올리고머 시약, 예를 들어 상기 자극 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약이 상기 인큐베이션 도중에, 예를 들어 경쟁 시약, 예를 들어 비오틴 또는 비오틴 유사체 예를 들어 D-비오틴과의 접촉 또는 노출에 의해서 분리 또는 제거될 때, 상기 세포는 상기 인큐베이션의 잔여 기간동안 상기 분리 또는 제거 이전과 동일한 인큐베이션 조건으로 복귀된다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 (약) 또는 적어도 0.01 μM, 0.05 μM, 0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5 μM, 10 μM, 100 μM, 500 μM, 0.01 μM, 1 mM, 또는 10 mM의 경쟁 시약과 접촉하여 세포로부터 올리고머 자극 시약을 분리 또는 제거한다. 다양한 구현예에서, 상기 세포는 (약) 또는 적어도 0.01 μM, 0.05 μM, 0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5 μM, 10 μM, 100 μM, 500 μM, 0.01 μM, 1 mM, 또는 10 mM의 비오틴 또는 비오틴 유사체 예를 들어 D-비오틴과 접촉하여 세포로부터 항-CD3 및 항-CD28 Fab를 분리 또는 제거한다.
특정 구현예에서, 상기 자극 올리고머 시약, 예를 들어 상기 자극 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약은 인큐베이션의 (약) 120시간, 108시간, 96시간, 84시간, 72시간, 60시간, 48시간, 36시간, 24시간, 또는 12시간 이내에, 예를 들어 상기 자극 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약의 존재하에 상기 세포로부터 제거 또는 분리된다. 특정 구현예에서, 상기 자극 올리고머 시약, 예를 들어 상기 자극 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약은 인큐베이션의 (약) 48시간 후에, 예를 들어 상기 자극 올리고머 시약의 존재하에 상기 세포로부터 제거 또는 분리된다. 특정 구현예에서, 상기 자극 시약은 인큐베이션의 (약) 72시간 후에 상기 세포로부터 제거 또는 분리된다. 특정 구현예에서, 상기 자극 올리고머 시약, 예를 들어 상기 자극 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약은 인큐베이션의 (약) 96시간에 상기 세포로부터 제거 또는 분리된다.
B. 유전자 조작
일부 구현예에서, 제공된 방법은 세포, 예를 들어 재조합 단백질을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것에 의해서 농축된 CD57- T 세포의 집단의 세포 또는 그로부터 유래된 세포를 포함한다. 상기 재조합 단백질은 섹션 IV에 기재된 임의의 것과 같은 재조합 수용체를 포함할 수 있다. 세포로 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 이종 또는 재조합 폴리뉴클레오티드의 도입은, 공지된 다수의 임의의 벡터를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 벡터는 렌티바이러스 및 감마레트로바이러스 시스템을 포함한 바이러스 시스템을 포함한다. 예시적인 방법은 바이러스, 예를 들어 레트로바이러스 또는 렌티바이러스를 통한, 형질도입을 포함하여 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드의 전달을 위한 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 자극된 세포 집단은, 재조합 수용체를 암호화하는 이종 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것과 같이 유전자 조작되고, 이로써 형질전환된 세포 집단(여기서 형질전환된 집단의 세포로도 지칭)을 생성한다.
특정 구현예에서, 세포가 예를 들어 본원에서, 예를 들어 섹션 III.A에 제공된 임의의 방법에 의해 자극 조건 하에서 자극, 활성화 및/또는 인큐베이션된 후, 세포는 유전자 조작, 형질전환 또는 형질도입된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 자극 집단은 이전에 고갈되거나 CD57+ T 세포로부터 분리되었다.
특정 구현예에서, 유전자 조작 방법은 재조합 단백질, 예를 들어 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 집단의 하나 이상의 세포를 접촉시키거나 상기를 도입시킴으로써 수행된다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 세포에 대해 이종이다. 특정 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오티이드는 그것이 전달되는 임의의 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터에 고유하지 않다. 특정 구현예에서, 이종 핵산 분자 또는 이종 폴리뉴클레오티드는 세포에 고유하지 않다. 특정 구현예에서, 이종 핵산 분자 또는 이종 폴리 뉴클레오티드는 세포에 의해 고유하게 발현되지 않는 단백질, 예를 들어 재조합 단백질을 암호화한다. 특정 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 도입 전에 세포에서 발견되지 않는 핵산 서열이거나 상기를 함유한다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 자극된 세포는, 형질도입 보조제의 존재 하에 조작, 예를 들어 형질도입된다. 예시적인 형질도입 보조제는 다가양이온, 피브로넥틴 또는 피브로넥틴-유래 단편 또는 변이체 및 레트로넥틴(RetroNectin)을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 특정 구현예에서, 세포는 다가양이온, 피브로넥틴 또는 피브로넥틴-유래 단편 또는 변이체 및/또는 레트로넥틴의 존재 하에 조작된다. 특정 구현예에서, 세포는 폴리브렌, DEAE-덱스트란, 프로타민 설페이트, 폴리-L-리신 또는 양이온성 리포솜인 다가양이온의 존재 하에 조작된다. 특정 구현예에서, 세포는 프로타민 설페이트의 존재 하에 조작된다.
일부 구현예에서, 유전자 조작, 예를 들어 형질도입은 무혈청 배지에서 수행된다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 정의된 또는 잘 정의된 세포 배양 배지이다. 특정 구현예에서, 무혈청 배지는 공정된, 예를 들어 여과되어 억제제 및/또는 성장인자가 제거된 제어 배양 배지이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 단백질을 함유한다. 특정 구현예에서, 무혈청 배지는 혈청 알부민, 가수분해물, 성장 인자, 호르몬, 담체 단백질 및/또는 부착 인자를 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 사이토카인의 존재하에 조작된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 재조합 사이토카인이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 인간 재조합 사이토카인이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 T 세포에 의해 발현되고/되거나 내인성인 수용체에 결합하고 /하거나 수용체에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 사이토카인의 4- 알파-헬릭스 다발 패밀리의 구성원이거나이를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인의 4- 알파-헬릭스 다발 패밀리의 구성원은 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨-9(IL-9), 인터루킨-12(IL-12), 인터루킨-15(IL-15), 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF) 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 IL-15 이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 IL-7이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 재조합 IL-2이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 상기 자극 동안 존재하는 것과 동일하거나 유사한 배지의 존재하에 유전자 조작, 형질전환, 또는 형질도입된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 상기 배지가 자극 동안 존재하는 것과 동일한 사이토카인을 갖는 배지 중에서 유전자 조작, 형질전환, 또는 형질도입된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 상기 배지가 자극 동안 존재하는 것과 동일한 농도에서 동일한 사이토카인을 갖는 배지 중에서 유전자 조작, 형질전환, 또는 형질도입된다.
일부 구현예에서, 세포는 자극 동안 존재했던 것과 동일하거나 유사한 배지의 존재 하에 유전자 조작, 형질전환 또는 형질도입된다. 일부 구현예에서, 세포는 자극 중 존재하는 배지와 동일한 사이토카인을 갖는 배지에서 유전자 조작, 형질전환 또는 형질도입된다. 일부 구현예에서, 세포는 자극 중 존재하는 배지와 동일한 농도로 동일한 사이토카인을 갖는 배지에서 유전자 조작, 형질전환 또는 형질도입된다.
1. 형질도입
일부 구현예에서, 세포를 유전자 조작하는 것은 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 이종 폴리뉴클레오티드를 형질도입에 의해 세포 내로 도입하는 것이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 바이러스 벡터로 형질도입된다. 일부 구현예에서, 바이러스는 레트로바이러스 벡터, 예를 들어 감마레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터이다. 렌티바이러스 형질도입 방법이 공지되어 있다. 예시적인 방법이, 예를 들어 문헌 「Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; 및 Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505」에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 형질도입(transduction)은, 집단의 하나 이상의 세포를, 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 예를 들어 재조합 수용체와 접촉함으로써 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 접촉은 원심 분리, 예를 들어 스피노큘레이션(pinoculation)(예를 들어 원심 접종(centrifugal inoculation))으로 수행될 수 있다. 이러한 방법은 국제공개공보 제WO2016/073602호에 기재된 바와 같은 방법을 포함한다. 예시적인 원심 챔버는, A-200/F 및 A-200 원심 챔버 및 그러한 시스템과 함께 사용하기위한 다양한 키트를 포함하여 Sepax® 및 Sepax®2 시스템과 함께 사용하기위한 것을 포함하여 Biosafe SA에 의해 생산되고 판매되는 것들을 포함한다. 예시적인 챔버, 시스템 및 처리기구 및 캐비닛은 예를 들어 미국특허 제6,123,655호, 미국특허 번호 6,733,433 및 공개된 미국특허출원공개공보 US 2008/0171951 및 국제공개보 제WO 00/38762호에 기재되어있으며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 이러한 시스템과 함께 사용하기위한 예시적인 키트는 BioSafe SA에 의해 판매되는 일회용 키트인 제품명 CS-430.1, CS-490.1, CS-600.1 또는 CS-900.2를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 바이러스 벡터를 자극된 세포 집단 중 (약) 300×106개 또는 300×106개 미만의 세포, 예를 들어 생존 가능한 T 세포로 형질도입하는 것과 관련하여 사용된다. 특정 구현예에서, 자극된 세포 집단 중 (약) 100×106개의 세포, 예를 들어 생존 가능한 T 세포가 형질도입된다.
일부 구현예에서, 상기 형질도입은 무혈청 배지 중에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 형질도입은 IL-2, IL-7, 및 IL-15의 존재하에서 수행된다. 특정 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 자극된 세포 집단의 세포는 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포인, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 형질도입은 24시간 내지 48시간, 36시간 내지 12시간, 18시간 내지 30시간동안, 또는 (약) 24시간동안 수행된다. 특정 구현예에서, 상기 형질도입 단계는 인큐베이션, 예를 들어 자극 조건하의 인큐베이션의 시작 또는 개시후 2일 이내, 36시간 이내, 또는 30시간 이내에 개시된다.
일부 구현예에서, 시스템은, 형질도입 단계의 측면을 조작, 자동화, 제어 및/또는 모니터링하기위한 기구 및 시스템에서 수행되는 하나 이상의 다양한 다른 처리 단계, 예를 들어. 본원 또는 국제공개공보 제WO 2016/073602호에 기재된 원심 챔버 시스템과 함께 또는 이와 관련하여 수행될 수 있는 하나 이상의 처리 단계를 포함하는 다른 기구에 포함되고/되거나 다른기구와 관련되어있다. 일부 구현예에서 상기 기구는 캐비닛 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 상기 기구는 제어 회로를 포함하는 하우징(housing), 원심 분리기, 커버, 모터, 펌프, 센서, 디스플레이 및 사용자 인터페이스를 포함하는 캐비닛을 포함한다. 예시적인 장치는 미국특허 제6,123,655호, 제6,733,433호 및 미국특허출원공개공보 제2008/0171951호에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 시스템은 일련의 용기, 예를 들어 백(bags), 튜빙(tubing), 스톱콕(stopcocks), 클램프(clamps), 커넥터 및 원심 분리 챔버를 포함한다. 일부 구현예에서, 백과 같은 용기는 동일한 백 또는 별도의 백과 같은 동일한 용기 또는 별도의 용기에 형질도입될 세포 및 바이러스 벡터 입자를 함유하는 백과 같은 하나 이상의 용기를 포함한다. 일부 구현예에서, 시스템은 상기 방법 동안 희석제 및/또는 세척 용액과 같은 매체를 함유하는 백과 같은 하나 이상의 용기를 추가로 포함하며, 이는 챔버 및/또는 다른 성분으로 당겨져 성분 및/또는 집단을 희석, 재현탁(resuspend) 및/또는 세척한다. 상기 용기는 입력 라인, 희석 라인, 세척 라인, 폐기물 라인 및/또는 산출 라인에 대응하는 위치와 같이 시스템에서 하나 이상의 위치에 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 챔버는 원심력과 관련되어 있으며, 이는 회전축 주변과 같은 챔버의 회전에 영향을 줄 수 있다. 세포의 형질도입과 관련하여 및/또는 하나 이상의 다른 처리 단계에서 인큐베이션 전, 동안 및/또는 후에 회전이 일어날 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 다양한 처리 단계 중 하나 이상이, 예를 들어 특정 힘에서 회전 하에 수행된다. 상기 챔버는 전형적으로, 수직 또는 일반적으로 수직 회전할 수 있어서, 원심 분리 동안 챔버가 수직으로 앉아 있고, 측벽 및 축은 수직 또는 일반적으로 수직이고, 단부 벽(들)은 수평 또는 일반적으로 수평이다.
일부 구현예에서, 세포를 함유하는 집단 및, 바이러스 벡터 입자, 및 선택적으로 공기를 함유하는 집단은 상기 공동에 상기 집단들을 제공하기 전에 조합 또는 혼합될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포를 함유하는 상기 집단 및, 바이러스 벡터 입자, 및 선택적으로 공기를 함유하는 집단은 별도로 제공되어 상기 공동에서 조합 및 혼합된다. 일부 구현예에서, 세포를 함유하는 상기 집단, 바이러스 벡터 입자, 및 선택적으로 공기를 함유하는 집단은 상기 내부 공동에 임의의 순서로 제공될 수 있다. 이러한 일부 구현예 중의 임의의 것에서, 세포 및 바이러스 벡터 입자를 함유하는 상기 집단은, 원심 챔버의 내부 또는 외부에서 조합 또는 혼합되는지 및/또는 세포 및 바이러스 벡터 입자들이 상기 원심 챔버에 함께 또는 별도로, 예를 들어 동시에 또는 순차적으로 제공되는지에 관계없이 일단 조합 또는 혼합되면 상기 입력 조성물이다.
일부 구현예에서, 상기 형질도입 방법에서 상기 세포 및 바이러스 벡터 입자의 인큐베이션, 예를 들어 회전 이전에 가스, 예를 들어 공기의 부피 흡수가 일어난다. 일부 구현예에서, 상기 형질도입 방법에서 상기 세포 및 바이러스 벡터 입자의 인큐베이션, 예를 들어 회전 도중에 가스, 예를 들어 공기의 부피 흡수가 일어난다.
일부 구현예에서, 상기 형질도입 집단, 및 가스, 선택적으로는 공기의 부피를 보충하는 상기 세포 또는 바이러스 벡터 입자의 액체 부피는 예비 결정된 부피일 수 있다. 상기 부피는 상기 시스템과 관련된 회로로 프로그래밍되고/되거나 그에 의해서 제어되는 부피일 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 형질도입 집단, 및 선택적으로는 가스, 예를 들어 공기의 흡수는, 원하는 또는 예비 결정된 부피가 상기 챔버의 내부 공동으로 흡수될 때까지 수동으로, 반자동으로 및/또는 자동으로 제어된다. 일부 구현예에서, 상기 시스템과 관련된 센서는 예를 들어 칼러, 유속 및/또는 밀도를 통해서 상기 원심 챔버로 및 그로부터의 액체 및/또는 가스 유동을 탐지할 수 있으며, 상기 원하는 또는 예비 결정된 부피의 흡수가 달성될 때까지 필요에 따라 그 흡수가 중단 또는 계속될 수 있도록 관련된 회로와 커뮤니케이션할 수 있다. 일부 측면에서, 상기 시스템에서 가스(공기)가 아닌 액체만을 탐지하도록 프로그래밍되거나 프로그래밍될 수 있는 센서는 흡수의 중단 없이 상기 시스템으로의 가스, 예를 들어 공기의 통과를 허용할 수 있다. 일부 이러한 구현예에서, 가스, 예를 들어 공기의 흡수가 필요한 경우 상기 센서의 근처에 불투명한 조각의 배관이 배치될 수 있다. 일부 구현예에서, 가스, 예를 들어 공기의 흡수는 수동으로 제어될 수 있다.
상기 제공된 방법의 일부 측면에서, 상기 원심 챔버의 내부 동공은 고속 회전에 적용된다. 일부 구현예에서, 회전은 상기 액체 입력 조성물, 및 선택적으로는 공기의 흡수 이전에, 그와 동시에, 그 후에 또는 간헐적으로 수행된다. 일부 구현예에서, 회전은 상기 액체 입력 조성물, 및 선택적으로는 공기의 흡수 후에 수행된다. 일부 구현예에서, 회전은 (약) 또는 적어도 (약) 200g, 300g, 400g, 500g, 600g, 700g, 800g, 1000g, 1100g, 1500g, 1600g, 1800g, 2000g, 2200g, 2500g, 3000g, 3200g, 3500g 또는 4000g의, 내부 공동의 측벽의 내부 표면 및/또는 세포의 표면층에서의 상대 원심력에서의 상기 원심 챔버의 원심 분리에 의한 것이다. 일부 구현예에서, 회전은 (약) 1100g 초과, 예를 들어 (약) 1200g 초과, 또는 (약) 1400g 초과, (약) 1600g 초과, (약) 1800g 초과, (약) 2000g 초과, (약) 2400g 초과, (약) 2800g 초과, (약) 3000g 초과 또는 (약) 3200g 초과인 원심력에서의 원심 분리에 의한 것이다. 특정 구현예에서, 원심분리에 의한 회전은 600g 내지 800g의 힘에서이다. 특정 구현예에서, 원심분리에 의한 회전은 693g의 힘에서이다. 일부 구현예에서, 회전은 (약) 1600g의 원심력에서의 원심 분리에 의한 것이다.
일부 구현예에서, 상기 챔버의 공동에서의 상기 가스, 예를 들어 공기는 상기 챔버로부터 배출된다. 일부 구현예에서, 상기 가스, 예를 들어 공기는 상기 원심 챔버를 갖는 폐쇄된 시스템의 일부로서 작동가능하게 연결된 용기로 배출된다. 일부 구현예에서, 상기 챔버의 공동에서의 상기 공기, 예를 들어 가스는 멸균 배관 라인을 통해서 상기 챔버의 내부 공동에 작동가능하게 연결된 필터를 통해서 배출된다. 일부 구현예에서, 상기 공기는 수동, 반자동 또는 자동 공정을 이용하여 배출된다. 일부 구현예에서, 상기 공기는, 인큐베이션된 세포 및 바이러스 벡터 입자를 함유하는 산출 집단, 예를 들어 형질도입이 개시되었거나 세포가 바이러스 벡터에 형질도입된 세포를 발현하기 전에, 그와 동시에, 간헐적으로 또는 그 후에 상기 챔버의 공동으로부터 배출된다.
일부 구현예에서, 상기 형질도입 및/또는 다른 인큐베이션은 연속식 또는 반-연속식(semi-continuous) 공정으로서 또는 그의 일부로서 수행된다. 일부 구현예에서, 연속식 공정은, 적어도 일부의 인큐베이션동안, 예를 들어 원심분리하는 동안 상기 용기로부터 상기 세포 및 바이러스 벡터 입자, 예를 들어 형질도입 조성물(단일 사전-존재(pre-existing) 조성물로서 또는 동일한 용기(vessel), 예를 들어 공동(cavity)으로 그의 부분들을 연속 풀링하고, 그에 의해서 혼합함으로써)의 연속적 흡수, 및/또는 액체의 연속적 발현 또는 축출(continuous expression or expulsion), 및 선택적으로는 가스(예를 들어 공기)의 배출을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 연속적 흡수 및 연속적 발현은 적어도 부분적으로 동시에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 연속적 흡수는 상기 인큐베이션의 일부동안, 예를 들어 상기 원심 분리의 일부동안 일어나며, 상기 연속적 발현은 상기 인큐베이션의 별도의 부분동안 일어난다. 상기 두가지는 교번될 수 있다. 다라서, 상기 인큐베이션을 수행하는 동안 상기 연속적 흡수 및 발현은 처리되는, 예를 들어 형질도입되는 샘플의 보다 큰 총 부피를 허용할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 인큐베이션은, 상기 방법이 상기 챔버의 회전동안 및 상기 인큐베이션의 일부동안 상기 공동으로의 상기 형질도입 조성물의 연속적 흡수를 수행하고, 액체의 연속적 발현을 수행하며, 선택적으로는 상기 챔버의 회전동안 적어도 하나의 개구를 통해서 상기 공동으로부터 가스(예를 들어 공기)의 배출을 수행하는 것을 상기 인큐베이션의 적어도 일부동안 포함하는 연속식 공정의 일부이다.
일부 구현예에서, 상기 반-연속식 인큐베이션은, 상기 공동으로의 상기 조성물의 흡수, 인큐베이션, 상기 공동으로부터의 액체의 발현 및, 선택적으로 상기 공동으로부터 예를 들어 산출 용기로의 가스(예를 들어 공기)의 배출, 이어서 보다 많은 세포 및 예를 들어 바이러스 벡터 입자를 처리하고 그 공정을 반복하기 위한 다른 시약을 함유하는 후속(예를 들어 제 2, 제 3 등) 조성물의 흡수를 교번하여 실시함으로써 수행된다. 예를 들어 일부 구현예에서, 상기 인큐베이션은 반-연속식 공정의 일부이며, 상기 방법은 상기 인큐베이션 전에 상기 적어도 하나의 개구를 통해서 상기 공동으로의 상기 형질도입 조성물의 흡수를 실시하고, 상기 공동으로부터의 유체의 발현을 실시하며; 상기 내부 공동으로의 세포 및 상기 바이러스 벡터 입자들을 포함하는 또다른 형질도입 조성물의 흡수; 및 상기 또다른 형질도입 조성물 중의 상기 세포가 상기 벡터에 형질도입되는 조건하에 상기 내부 동공에서 상기 또다른 형질도입 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함한다. 상기 공정은 다수의 부가 라운드동안 반복적인 방식으로 계속될 수 있다. 이와 관련하여, 상기 반-연속식 또는 연속식 방법은 훨씬 많은 부피 및/또는 수의 세포를 허용할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 형질도입 인큐베이션의 일부는 원심 챔버에서 수행되며, 이것은 회전 또는 원심 분리를 포함하는 조건하에서 수행된다.
특정 구현예에서, 바이러스 벡터를 사용한 세포의 형질도입은 스피노큘레이션(spinoculation), 예를 들어 상기 세포 및 바이러스 입자들을 함유하는 혼합물의 원심분리이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포, 벡터, 예를 들어 바이러스 입자 및 시약을 함유하는 조성물은 세포를 펠렛화하기 위해 사용된 것보다 낮은 속도, 예를 들어 또는 (약) 600 rpm 내지 1700 rpm(예를 들어 적어도 (약) 600 rpm, 1000 rpm, 또는 1500 rpm 또는 1700 rpm)와 같이 비교적 낮은 힘 또는 속도로 회전될 수 있다. 일부 구현예에서, 회전은 챔버 또는 공동의 내부 또는 외부 벽에서 측정될 때, (약) 100g 내지 4000g(예를 들어 (약) 또는 적어도 (약) 100g, 200g, 300g, 400g, 500g, 600g, 700g, 800g, 900g, 1000g, 1500g, 2000g, 2500g, 3000g 또는 3500g)의 힘, 예를 들어 상대 원심력으로 수행된다.
일부 구현예에서, 세포는 (약) 100 g 내지 4000 g, 200 g 내지 1,000 g, 500 g 내지 1200 g, 1000 g 내지 2000 g, 600 g 내지 800 g, 1200 g 내지 1800 g 또는 1500 g 내지 1800 g의 힘, 예를 들어 상대적인 원심력에서 바이러스 벡터로 회전 접종된다. 특정 구현예에서, 세포는 (약) 100 g, 200 g, 300 g, 400 g, 500 g, 600 g, 700 g, 800 g, 900 g, 1000 g, 1200g, 1500 g, 1600g, 2000 g, 2500 g, 3000 g, 3200 g 또는 3500 g 또는 100 g, 200 g, 300 g, 400 g, 500 g, 600 g, 700 g, 800 g, 900 g, 1000 g, 1200g, 1500 g, 1600g, 2000 g, 2500 g, 3000 g, 3200 g 또는 3500 g 이상 동안 바이러스 벡터 입자로 회전 접종된다. 일부 구현예에서, 세포는 (약) 692 g의 힘에서 바이러스 벡터로 형질도입된다. 특정 구현예에서, 세포는 (약) 1600 g의 힘에서 바이러스 벡터로 형질도입된다. 일부 구현예에서, 힘은 내부 공동의 측면 벽의 내부 표면 및/또는 세포의 표면 층에서의 힘이다.
특정 구현예에서, 세포는 회전 접종, 예를 들어 세포 및 바이러스 벡터를 함유하는 세포 조성물이 약 5 분 또는 초과, 예를 들어 약 10 분 또는 초과, 약 15 분 또는 초과, 약 20 분 또는 초과, 약 30 분 또는 초과, 약 45 분 또는 초과, 약 60 분 또는 초과, 약 90 분 또는 초과 또는 약 120 분 또는 초과; 또는 (약) 5 분 내지 120 분, 30 분 내지 90 분, 15 분 내지 60 분, 15 분 내지 45 분, 30 분 내지 60 분 또는 45 분 내지 60 분(각각의 수치 포함) 동안 회전된다. 일부 구현예에서, 세포는 바이러스 벡터로 (약) 30분 동안 회전 접종된다. 특정 구현예에서, 세포는 바이러스 벡터로 (약) 60분 동안 회전 접종된다.
일부 구현예에서, 형질도입 방법은, 약 5 분 또는 초과, 예를 들어 약 10 분 또는 초과, 약 15 분 또는 초과, 약 20 분 또는 초과, 약 30 분 또는 초과, 약 45 분 또는 초과, 약 60 분 또는 초과, 약 90 분 또는 초과 또는 약 120 분 또는 초과 동안 회전 접종, 예를 들어 원심분리기 챔버에서 형질도입 조성물 및 선택적으로 공기의 회전 또는 원심분리를 포함한다. 일부 구현예에서, 형질도입 조성물 및 및 선택적으로 공기는 5 분 초과이나 60 분 이내, 45 분 이내, 30 분 이내 또는 15 분 이내 동안 원심분리기 챔버에서 회전되거나 원심분리된다. 특정 구현예에서, 형질도입은 (약) 60 분 동안 회전 또는 원심분리를 포함한다.
일부 구현예에서, 형질도입 방법은 (약) 10 분 내지 60 분, 15 분 내지 60 분, 15 분 내지 45 분, 30 분 내지 60 분 또는 45 분 내지 60 분(각 수치 포함) 동안 내부 공동의 측면 벽의 내부 표면 및/또는 세포의 표면 층에서 (약) 1000 g, 1100 g, 1200 g, 1400 g, 1500 g, 1600 g, 1800 g, 2000 g, 2200 g, 2400 g, 2800 g, 3200 g 또는 3600 g의 힘으로 원심분리기 챔버에서 형질도입 조성물 및 선택적으로 공기의 회전 또는 원심분리를 포함한다. 특정 구현예에서, 형질도입 방법은, (약) 1600 g에서 (약) 60 분 동안 형질도입 조성물, 예를 들어 세포 및 바이러스 벡터 입자의 회전 또는 원심분리를 포함한다.
2. 바이러스 벡터 입자
일부 구현예에서, 재조합 핵산은 재조합 감염성 바이러스 입자, 예를 들어 시미안 바이러스40(simian virus 40)(SV40), 아데노 바이러스, 아데노-관련 바이러스 (AAV)로부터 유래된 벡터를 사용하여 세포내로 전달된다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예를 들어 감마-레트로바이러스 벡터를 사용하여 T 세포 내로 전달된다(예를 들어 Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557 참조).
일부 구현예에서, 상기 레트로바이러스 벡터는 긴 말단 반복 서열(LTR)를 가지며, 예를 들어 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus) (MoMLV), 골수 증식 육종 바이러스(myeloproliferative sarcoma virus)(MPSV), 뮤린 배아 줄기 세포 바이러스(murine embryonic stem cell virus)(MESV), 쥐 줄기 세포 바이러스(MSCV), 또는 비장 초점 형성 바이러스(spleen focus forming virus)(SFFV)로부터 유래된 레트로바이러스 벡터이다. 대부분의 레트로바이러스 벡터는 쥐 레트로바이러스(murine retroviruses)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 임의의 조류 또는 포유동물 세포 공급원으로부터 유래된 것들을 포함한다. 상기 레트로바이러스는 전형적으로 양쪽성(amphotropic)이며, 이는 인간을 포함하여 여러 종의 숙주 세포를 감염시킬 수 있음을 의미한다. 한 구현예에서, 발현될 유전자는 레트로바이러스 개그(retroviral gag), 폴(pol) 및/또는 env 서열을 대체한다. 다수의 예시적인 레트로바이러스 시스템이 기술되어 있다[예를 들어 미국특허 제5,219,740호; 제6,207,453호; 제5,219,740호; 문헌 「Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990」; 「Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14」; 「Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852」; 「Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037」; 및 「Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109」 참조].
바이러스 벡터 게놈은 전형적으로 패키징 또는 생산자 세포주에 형질주입될 수 있는 플라스미드 형태로 구축된다. 이들 구체예 중의 어느 것에서, 재조합 단백질, 예를 들어 재조합 수용체를 암호화하는 핵산은 바이러스 벡터의 영역, 예를 들어 바이러스 게놈의 비필수 영역에 삽입되거나 위치된다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 특정 바이러스 서열 대신 바이러스 게놈에 삽입되어 복제 결함이 있는 바이러스를 생성한다.
게놈이 바이러스 벡터 게놈의 RNA 카피를 포함하는 레트로바이러스 입자를 생성하기 위해 임의의 공지된 다양한 방법을 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스-기반 유전자 전달 시스템을 만드는데 적어도 두 가지 성분이 관여한다: 첫째, 바이러스 벡터 입자를 생성하는데 필요한 효소뿐만 아니라 구조 단백질을 포괄(encompassing)하는 패키징 플라스미드(packaging plasmids), 둘째, 바이러스 벡터 자체, 즉, 전달될 유전 물질. 이러한 구성 요소 중 하나 또는 둘 다를 설계할 때 생물 안전 보호 장치를 도입할 수 있다.
일부 구현예에서, 패키징 플라스미드는, 외피 단백질(envelope proteins) 이외의 단백질인 HIV-1과 같은, 모든 레트로바이러스를 포함할 수 있다(Naldini et al., 1998). 다른 구현예에서, 바이러스 벡터는, 독성과 관련된 추가적인 바이러스 유전자, 예를 들어 vpr, vif, vpu 및 nef, 및/또는 HIV의 1 차 트랜스활성제(transactivator)인 Tat가 결여될 수 있다. 일부 구현예에서, HIV-기반 렌티바이러스 벡터와 같은, 렌티바이러스 벡터는, 모 바이러스의 3 가지 유전자로 구성된다: 이는 재조합을 통한 야생형 바이러스의 재구성 가능성을 감소시키거나 제거하는 gag, pol 및 rev.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 게놈은, 바이러스 벡터 게놈으로부터 전사된 바이러스 게놈 RNA를 바이러스 입자로 패키징하는데 필요한 모든 성분을 포함하는, 패키징(packaging) 세포주 내로 도입된다. 대안적으로, 바이러스 벡터 게놈은, 관심있는 하나 이상의 서열, 예를 들어 재조합 핵산 이외에 바이러스 성분을 암호화하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 그러나 일부 측면에서, 표적 세포에서 게놈의 복제를 방지하기 위해, 복제에 필요한 내인성 바이러스 유전자가 제거되고, 패키징(packaging) 세포주에서 별도로 제공된다.
일부 구현예에서, 패키징(packaging) 세포주는 입자를 생성하는데 필요한 성분을 포함하는 하나 이상의 플라스미드 벡터로 형질감염된다. 일부 구현예에서, 패키징(packaging) LTR, 시스-작용(cis-acting) 패키징(packaging) 서열 및 관심 서열을 포함하는, 바이러스 벡터 게놈을 포함하는, 플라스미드, 즉 CAR과 같은 항원 수용체를 암호화하는 핵산; 및 바이러스 효소 및/또는 구조적 성분, 예를 들어 Gag, pol 및/또는 rev를 암호화하는 하나 이상의 헬퍼(helper) 플라스미드로 형질감염된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 입자를 생성하는 다양한 유전자 성분을 분리하기 위해 다수의 벡터가 이용된다. 이러한 일부 구현예에서, 패키징(packaging) 세포에 별도의 벡터를 제공하는 것은 달리 복제 능력있는(competent) 바이러스를 생성할 수 있는 재조합 사건의 가능성을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 모든 레트로바이러스 성분을 갖는 단일 플라스미드 벡터가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 렌티바이러스(lentiviral) 벡터 입자와 같은 레트로바이러스(retroviral) 벡터 입자는 슈도타입화되어(pseudotyped) 숙주 세포의 형질도입 효율을 증가시킨다. 예를 들어 일부 구현예에서 렌티바이러스(lentiviral) 벡터 입자와 같은 레트로바이러스(retroviral) 벡터 입자는, VSV-G 당단백질로 슈도타입화되어(pseudotyped), 형질도입 될 수 있는 세포 유형을 증폭시키는 넓은 세포 숙주 범위를 제공한다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는, 비-천연(non-native) 외피(envelope) 당단백질을 암호화하는 플라스미드 또는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 신드비스(Sindbis) 바이러스 외피(envelope), GALV 또는 VSV-G와 같은 제노트로픽(xenotropic), 다방성(polytropic) 또는 양쪽성(amphotropic) 외피(envelope)를 포함하도록 형질감염된다.
일부 구현예에서, 패키징 세포주는, 바이러스 게놈 RNA를 렌티바이러스(lentiviral) 벡터 입자로 패키징(packaging)을 위해 운송(trans)에 필요한 바이러스 조절 및 구조 단백질을 포함하는 성분을 제공한다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 렌티바이러스(lentiviral) 단백질을 발현하고 작용성 렌티바이러스(lentiviral) 벡터 입자를 생성할 수 있는 임의의 세포주일 수 있다. 일부 측면에서, 적합한 패키징 세포주는 293 (ATCC CCL X), 293T, HeLA (ATCC CCL 2), D17 (ATCC CCL 183), MDCK (ATCC CCL 34), BHK (ATCC CCL-10) 및 Cf2Th (ATCC CRL 1430) 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 패키징 세포주는 바이러스 단백질(들)을 안정적으로 발현한다. 예를 들어 일부 측면에서, gag, pol, rev 및/또는 다른 구조적 유전자를 포함하지만 LTR 및 패키징 성분이 없는 패키징 세포주가 구축될 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는, 이종(heterologous) 단백질을 암호화하는 핵산 분자 및/또는 외피(envelope) 당단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스 벡터 게놈과 함께 하나 이상의 바이러스 단백질을 암호화하는 핵산 분자로 일시적으로 형질감염될 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 및 패키징(packaging) 및/또는 헬퍼(helper) 플라스미드는 형질감염 또는 감염을 통해 패키징(packaging) 세포주 내로 도입된다. 패키징(packaging) 세포주는 바이러스 벡터 게놈을 포함하는 바이러스 벡터 입자를 생성한다. 형질감염 또는 감염 방법은 잘 알려져 있다. 비제한적인 예에는 인산 칼슘(calcium phosphate), DEAE- 덱스트란(DEAE-dextran) 및 리포펙션(lipofection) 방법, 전기 천공법(electroporation) 및 미세주입법(microinjection)이 포함된다.
재조합 플라스미드 및 레트로바이러스 LTR 및 패키징(packaging) 서열이 특별한 세포주 (예를 들어 인산 칼슘 침전에 의해)에 도입될 때, 패키징(packaging) 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체가 바이러스 입자로 패키징(packaging)될 수 있게 하고, 이어서 배양 배지 내로 분비될 수 있다. 이어서 일부 구현예에서, 재조합 레트로바이러스를 포함하는 배지를 수집하고, 임의로 농축시키고, 유전자 전이에 사용한다. 예를 들어 일부 측면에서, 패키징(packaging) 플라스미드 및 전달(transfer) 벡터를 패키징(packaging) 세포주에 공동 형질감염(cotransfection)시킨 후, 바이러스 벡터 입자는 배양 배지로부터 회수되고, 당업자에 의해 사용되는 표준 방법에 의해 적정된다.
일부 구현예에서, 렌티바이러스(lentiviral) 벡터와 같은 레트로(retroviral) 바이러스 벡터는 렌티바이러스(lentiviral) 입자의 생성을 허용하는 플라스미드의 도입에 의해 예시적인 HEK 293T 세포주와 같은 패키징(packaging) 세포주에서 생산될 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징(packaging) 세포는 형질감염되고/되거나, gag 및 pol을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 재조합 수용체, 예를 들어 항원 수용체, 예를 들어 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 일부 구현예에서, 패키징(packaging) 세포주는 선택적으로 및/또는 추가로 rev 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염되고/되거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 패키징(packaging) 세포주는 선택적으로 및/또는 추가로 VSV-G와 같은 비-천연(non-native) 외피(envelope) 당단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염되고/되거나 이를 포함한다. 이러한 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 HEK 293T 세포의 형질감염 대략 2일 후, 세포 상청액(supernatant)은 재조합 렌티바이러스(lentiviral) 벡터를 포함하고, 이는 회수되고 적정될 수 있다.
회수 및/또는 생성된 레트로바이러스 벡터 입자는 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 표적 세포를 형질도입(transduce)하는데 사용될 수 있다. 일단 표적 세포에서, 바이러스 RNA는 역전사되고, 핵으로 유입(imported)되고, 숙주 게놈에 안정적으로 통합된다. 바이러스 RNA의 통합(integration) 후 1 일 또는 2 일 후에, 재조합 단백질, 예를 들어 CAR과 같은 항원 수용체의 발현이 검출될 수 있다.
3. 바이러스 벡터를 사용한 인큐베이션
특정 구현예에서, 상기 세포를 형질전환 도는 형질도입하는 것은 예를 들어 상기 바이러스 벡터의 존재하에 상기 세포를 인큐베이션하는 하나 이상의 단계이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 형질전환된 세포 집단의 세포는 상기 세포를 유전자 조작, 형질전환, 형질도입, 또는 형질감염 후에 인큐베이션된다.
특정 구현예에서, 인큐베이션은, 원심 분리, 떨림, 회전, 흔들림 또는 관류, 예를 들어 배지의 연속 또는 반 연속 관류를 수반하지 않는 조건과 같은 정적 조건 하에서 수행된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 개시 전 또는 직후, 예를 들어 5 분, 15 분 또는 30 분 이내에, 세포는 백 또는 바이알과 같은 컨테이너로 전달(예를 들어 멸균 조건 하에서 전달)되고, 인큐베이터에 배치된다.
일부 구현예에서, 상기 인큐베이션은 무혈청 배지 중에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 무혈청 배지는 정의된 및/또는 잘 정의된 세포 배양 배지이다. 특정 구현예에서, 상기 무혈청 배지는 처리된, 예를 들어 억제제 및/또는 성장 인자(growth factor)를 제거하도록 여과된 제어된 배양 배지이다. 일부 구현예에서, 상기 무혈청 배지는 단백질을 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 무혈청 배지는 혈청 알부민, 가수 분해물, 성장 인자, 호르몬, 담체 단백질 및/또는 부착 인자를 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 배양 조건은 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 물질, 예를 들어 영양물질, 아미노산, 항생제, 이온, 및/또는 자극 인자, 예를 들어 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체, 및 세포 활성화를 위해 설계된 기타 물질 중 1가지 이상을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 인큐베이션의 적어도 일부는 예를 들어 원심 회전하에, 국제공개공보 제WO2016/073602호에 기재된 바와 같은 원심분리기 챔버의 내부 공동에서 수행된다.
일부 구현예에서, 세포 및 선택적으로 이종 또는 재조합 폴리펩티드, 예를 들어 바이러스 벡터는 인큐베이션을 위한 컨테이너로 전달된다. 일부 구현예에서, 컨테이너는 바이알(vial)이다. 특정 구현예에서, 컨테이너는 백(bag)이다. 일부 구현예에서, 세포 및 선택적으로 이종 또는 재조합 폴리펩티드는 폐쇄되거나 또는 멸균 조건 하에서 컨테이너로 전달된다. 일부 구현예에서, 이어서 컨테이너, 예를 들어 바이알 또는 백은 인큐베이션의 전부 또는 일부를 위해 인큐베이터에 배치된다. 특정 구현예에서, 인큐베이터는 (약) 16℃, 24℃ 또는 35℃ 또는 16℃, 24℃ 또는 35℃ 이상으로 설정된다. 일부 구현예에서, 인큐베이터는 (약) 37℃ 또는 37℃ ±2℃, ±1℃, ±0.5℃ 또는 ±0.1℃로 설정된다.
특정 구현예에서, 농축된 T 세포의 조성물은 하나 이상의 사이토카인의 존재하에서 배양된다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 재조합 사이토카인이다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 인간 재조합 사이토카인이다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 T 세포에 의해서 발현되고/되거나 T 세포에 대해 내인성인 수용체에 결합하고/하거나 결합할 수 있는 것이다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 사이토카인의 4-알파-헬릭스 다발 패밀리의 멤버이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 4-알파-헬릭스 다발 패밀리의 멤버는 제한되지는 않지만, 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨-9(IL-9), 인터루킨-12(IL-12), 인터루킨-15(IL-15), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 IL-15이거나 그것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 IL-7이거나 그것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 재조합 IL-2이거나 그것을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 세포는 재조합 사이토카인의 존재하에서 인큐베이션된다.
일부 구현예에서, 기본 배지는 균형 잡힌 염용액(예를 들어 PBS, DPBS, HBSS, EBSS)이다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), F-10, F-12, RPMI 1640, GMEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), 알파 MEM(alpha Minimal Essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 및 M199에서 선택된다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 복합 배지(예를 들어 RPMI-1640, IMDM)이다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 OpTmizer™ CTS™ T 세포 증폭 기본 배지(ThermoFisher)이다.
일부 구현예에서, 상기 기본 배지는 무기 염, 설탕, 아미노산, 선택적으로는 비타민, 유기산, 항산화제, 및/또는 완충액 또는 기타 공지의 세포 배양 영양물질의 혼합물을 함유한다. 영양물질에 더하여, 상기 배지는 또한 pH 및 삼투압을 유지하는 도움이 된다. 일부 측면에서, 상기 기본 배지의 시약은 세포 성장, 증식 및/또는 증폭을 지원한다. 다양한 상업적으로 이용가능한 기본 배지가 당해 분야의 숙련가에게 익히 알려져 있으며, 덜코스 변형된 이글스 배지(DMEM), 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트 배지(Roswell Park Memorial Institute Medium; RPMI), 아이소코브스 변형된 덜코스 배지 및 한스 배지(Hams medium)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 기본 배지는 아이소코브스 변형된 덜코스 배지, RPMI-1640, 또는 α-MEM이다.
특정 구현예에서, 기본 배지는 추가 첨가제로 보충된다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 임의의 추가 첨가제로 보충되지 않는다. 세포 배양 배지에 대한 첨가제는 영양소, 설탕, 예를 들어 포도당, 아미노산, 비타민 또는 ATP 및 NADH와 같은 첨가제를 포함할 수 있으나 이에 국한되지 않는다.
특정 구현예에서, 세포는 이종 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 바이러스 벡터로 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포는 이종 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 바이러스 벡터로, (약) 또는 적어도 18 시간, 24 시간, 30 시간, 36 시간, 40 시간, 48 시간, 54 시간, 60 시간, 72 시간, 84 시간, 96 시간 또는 96 시간 이상 이상 동안 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 인큐베이션의 총 지속 기간은 (약) 또는 적어도 12 시간, 18 시간, 24 시간, 30 시간, 36 시간, 42 시간, 48 시간, 54 시간, 60 시간, 72 시간, 84 시간, 96 시간, 108 시간, 또는 120 시간이다. 특정 구현예에서, 인큐베이션은 (약) 120 시간, 108 시간, 96 시간, 84 시간, 72 시간, 60 시간, 54 시간, 48 시간, 42 시간, 36 시간, 30 시간, 24 시간, 18 시간 또는 12 시간, 또는 그 이내에 완료된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션의 총 지속 기간은 (약) 12 시간 내지 120 시간, 18 시간 내지 96 시간, 24 시간 내지 72 시간, 또는 24 시간 내지 48 시간(수치 포함)이다. 일부 구현예에서, 인큐베이션의 총 지속 기간은 (약) 1 시간 내지 48 시간, 4 시간 내지 36 시간, 8 시간 내지 30 시간 또는 12 시간 내지 24 시간(수치 포함)이다.
C. 배양
특정 구현예에서, 본원에서 제공된 조작된 T 세포의 조성물을 생성하는 방법은 예를 들어 상기 세포에 이종 폴리뉴클레오티드의 도입 후에, 선택적인 배양 단계 또는 세포가 생체외에서 증폭 또는 증식을 수행하는 단계와 관련하여 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 제공된 방법은 세포를 배양하기 위한, 예를 들어 증식 또는 증폭을 촉진하는 조건하에 세포를 배양하기 위한 하나 이상의 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작하는 단계, 예를 들어 형질도입 또는 형질감염에 의해 세포에 재조합 폴리펩티드를 도입하는 단계 후에 증식 또는 증폭을 촉진하는 조건하에 배양된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 세포가 자극 조건하에 배양되고 재조합 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질도입 또는 형질감염된 후에 배양된다. 따라서 일부 측면에서, 농축된 T 세포의 형질전환된 집단의 세포가 배양된다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 형질전환된 집단은 미리 고갈되거나 또는 CD57+ T 세포로부터 분리된다.
일부 구현예에서, 본원에서 제공된 조작된 T 세포의 조성물을 생성하는 방법은 예를 들어 상기 세포에 이종 폴리뉴클레오티드의 도입 후에, 선택적인 배양 단계 또는 세포가 생체외에서 증폭 또는 증식을 수행하는 배양 단계를 요구하지 않는다. 일부 구현예에서, 조작된 세포 조성물을 생성 또는 제조하는 공정 또는 방법은 예를 들어 치료학적 조성물 중의 조작된 세포의 수를 증폭시키는 배양 단계를 포함하지 않는다.
특정 구현예에서, 상기 조작된 T 세포의 하나 이상의 집단은 농축된 T 세포의 2개의 개별적인 집단이거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, 농축된 T 세포의 2개의 개별 집단, 예를 들어 상기 생물학적 샘플로부터 선택, 단리, 및/또는 농축된 농축된 T 세포의 2개의 개별 집단은 자극 조건하에서 개별적으로 배양된다. 특정 구현예에서, 상기 2개의 개별 집단은 농축된 CD4+ T 세포, 예를 들어 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 2개의 개별 집단은 농축된 CD8+ T 세포, 예를 들어 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포 및 농축된 CD8+ T 세포의 2개의 개별 집단, 예를 들어 농축된 CD57-CD4+ T 세포 및 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 2개의 개별 집단은 예를 들어 증식 및/또는 증폭을 촉진하는 조건하에 개별적으로 배양된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 단일 집단, 예를 들어 CD57-CD4+ T 세포 및 CD57-CD8+ T 세포를 포함하거나 또는 함유하는 단일 집단이 배양된다. 특정 구현예에서, 상기 단일 집단은 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단이다. 일부 구현예에서, 상기 단일 집단은 상기 배양 전에 개별 집단으로부터 결합된 농축된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 집단이다.
일부 구현예에서, 예를 들어 증식 및/또는 증폭을 촉진하는 조건하에서, 배양되는 농축된 CD4+ T 세포(예를 들어 CD57-CD4+ T 세포)는 적어도 (약) 60%, 적어도 (약) 65%, 적어도 (약) 70%, 적어도 (약) 75%, 적어도 (약) 80%, 적어도 (약) 85%, 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 98%, 적어도 (약) 99%, 적어도 (약) 99.5%, 적어도 (약) 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD4+ T 세포(예를 들어 CD57-CD4+ T 세포)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 집단은 적어도 (약) 30%, 적어도 (약) 40%, 적어도 (약) 50%, 적어도 (약) 60%, 적어도 (약) 70%, 적어도 (약) 80%, 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 98%, 적어도 (약) 99%, 적어도 (약) 99.5%, 적어도 (약) 99.9%, 또는 (약) 100%의, 상기 재조합 수용체를 발현하고/하거나 상기 재조합 폴리뉴클레오티드로 형질도입 또는 형질감염된 CD4+ T 세포(예를 들어 CD57-CD4+ T 세포)를 포함한다. 특정 구현예에서, 배양되는 농축된 CD4+ T 세포(예를 들어 CD57-CD4+ T 세포)는 (약) 40% 미만, (약) 35% 미만, (약) 30% 미만, (약) 25% 미만, (약) 20% 미만, (약) 15% 미만, (약) 10% 미만, (약) 5% 미만, (약) 1% 미만, (약) 0.1% 미만, 또는 (약) 0.01% 미만의 CD8+ T 세포를 포함하고/하거나 CD8+ T 세포르 함유하지 않고/않거나 CD8+ T 세포가 부재하거나 실질적으로 부재하다.
일부 구현예에서, 예를 들어 증식 및/또는 증폭을 촉진하는 조건하에서, 배양되는 농축된 CD8+ T 세포는 적어도 (약) 60%, 적어도 (약) 65%, 적어도 (약) 70%, 적어도 (약) 75%, 적어도 (약) 80%, 적어도 (약) 85%, 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 98%, 적어도 (약) 99%, 적어도 (약) 99.5%, 적어도 (약) 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD8+ T 세포(예를 들어 CD57-CD8+ T 세포)를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 집단은 적어도 (약) 30%, 적어도 (약) 40%, 적어도 (약) 50%, 적어도 (약) 60%, 적어도 (약) 70%, 적어도 (약) 80%, 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 98%, 적어도 (약) 99%, 적어도 (약) 99.5%, 적어도 (약) 99.9%, 또는 (약) 100%의, 상기 재조합 수용체를 발현하고/하거나 상기 재조합 폴리뉴클레오티드로 형질도입 또는 형질감염된 CD8+ T 세포(예를 들어 CD57-CD8+ T 세포)를 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 조건하에서 배양되는 농축된 CD8+ T 세포는 (약) 40% 미만, (약) 35% 미만, (약) 30% 미만, (약) 25% 미만, (약) 20% 미만, (약) 15% 미만, (약) 10% 미만, (약) 5% 미만, (약) 1% 미만, (약) 0.1% 미만, 또는 (약) 0.01% 미만의 CD4+ T 세포를 포함하고/하거나 CD4+ T 세포르 함유하지 않고/않거나 CD4+ T 세포가 부재하거나 실질적으로 부재하다.
일부 구현예에서, 배양은 일반적으로 인간 T 림프구와 같은 1차 면역 세포의 성장에 적합한 온도, 예를 들어 (약) 25℃이상, 일반적으로 (약) 30℃ 이상, 및 일반적으로 (약) 37℃ 이상을 포함하는 조건하에서 수행된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 집단은 25 내지 38℃, 예를 들어 30 내지 37℃, 예를 들어 (약) 37℃±2℃의 온도에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 배양, 예를 들어 양성 또는 증폭이 원하는 또는 임계 밀도로 세포수 또는 세포의 용량을 초래할 때까지의 기간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 배양은 (약) 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일 이상을 초과하거나 또는 (약) 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일 이상 동안이다.
일부 구현예에서, 상기 세포는, 상기 배양의 시작시의 세포의 양, 농도, 또는 밀도와 비교하여 적어도 (약) 50%, 적어도 (약) 60%, 적어도 (약) 70%, 적어도 (약) 80%, 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 100%, 적어도 (약) 150%, 적어도 (약) 1-배, 적어도 (약) 2-배, 적어도 (약) 3-배, 적어도 (약) 4-배, 적어도 (약) 5-배, 적어도 (약) 10-배, 적어도 (약) 20-배, 적어도 (약) 50-배 많은 세포의 양, 농도, 또는 밀도인 임계 증폭을 성취하도록 배양된다.
상기 구체예에서 기술된 바와 같이, 집단 배가의 수는 치료학적 T 세포 조성물(예를 들어 산출 조성물)로 치료 받은 대상체에서 무진행 생존 확률과 역의 상관 관계가 있다. 따라서 일부 구현예에서, 상기 집단 배가의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 또는 10 이하의 집단 배가이다. 일부 구현예에서, 상기 집단 배가의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 이하의 집단 배가이다. 일부 구현예에서, 집단 배가의 감소된 수(예를 들어 6 이하)는 적어도 또는 적어도 약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 나이브-유사 및/또는 중앙 기억 T 세포를 포함하는 T 세포 조성물(예를 들어 조작된 CD4+, CD8+ T 세포)를 증폭시킴으로써 성취된다. 일부 구현예에서, 집단 배가의 감소된 수(예를 들어 6 이하)는 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만의 T 세포 조성물(예를 들어 조작된 CD4+, CD8+ T 세포)를 증폭시킴으로써 성취된다. 일부 구현예에서, 집단 배가의 감소된 수(예를 들어 6 이하)는 0.05×106 cells/mL, 0.1×106 cells/mL, 0.15×106 cells/mL, 0.2×106 cells/mL, 0.25×106 cells/mL, 0.3×106 cells/mL, 0.35×106 cells/mL, 0.4×106 cells/mL, 0.45×106 cells/mL, 또는 그 이상보다 높은 시드 밀도를 사용함으로써 성취된다.
자극 조건은, 하나 이상의 특정 매질, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 작용제, 예를 들어 영양소, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예를 들어 사이토카인, 케모카인(chemokines), 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체, 및 세포를 활성화시키도록 설계된 임의의 다른 작용제를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 세포는 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에 배양된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 재조합 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 인간 재조합 사이토카인이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 T 세포에 의해 발현되고/되거나 내인성(endogenous) 수용체에 결합하고/하거나 수용체에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 사이토카인의 4-알파-헬릭스 다발 패밀리(4-alpha-helix bundle family)의 구성원이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인의 4-알파-헬릭스 다발 패밀리(4-alpha-helix bundle family)의 구성원은 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨-9(IL-9), 인터루킨 12(IL-12), 인터루킨 15(IL-15), 과립구 집락(granulocyte colony)-자극 인자 (G-CSF) 및 과립구-대식세포 집락(granulocyte-macrophage colony) 자극 인자(GM-CSF)를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 IL-15이거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 IL-7이거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 IL-2이거나 또는 그를 포함한다.
일부 측면에서, 인큐베이션은 리델(Riddell) 등의 미국특허 제6,040,177호, 문헌 「Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82, and/or Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701」에 기술된 기법에 따라 수행된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 자극 조건 또는 자극 시약의 존재하에 상기 인큐베이션의 적어도 일부는 예를 들어 국제공개공보 제WO2016/073602호에 기술된 바와 같이 원심 챔버의 내부 공동에서, 예를 들어 원심 회전하에 수행된다. 일부 구현예에서, 원심 챔버에서 수행된 상기 인큐베이션의 적어도 일부는 자극 및/또는 활성화를 유도하는 시약(들)과 혼합하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 선택된 세포는 상기 원심 챔버 중에서 자극 조건 또는 자극제와 혼합된다. 이러한 공정의 일부 측면에서, 일정 부피의 세포는, 세포 배양판 또는 다른 시스템에서 유사한 자극을 수행할 때 정상적으로 사용되는 것 보다 훨씬 적은 양의 하나 이상의 자극 조건 또는 제제와 혼합된다.
일부 구현예에서, 상기 배양은 상기 세포 및 자극제에 배양 완충액의 첨가로 수행하여 예를 들어 10 mL 내지 2,000 mL, 예를 들어 적어도 또는 약 적어도 또는 (약) 10 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL, 100 mL, 150 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL, 500 mL, 600 mL, 700 mL, 800 mL, 900 mL, 1,000 mL, 1,200 mL, 1,400 mL, 1,600 mL, 1,800 mL, 2,000 mL, 2,200 mL 또는 2,400 mL의 표적 용적을 성취한다. I일부 구현예에서, 상기 인큐베이션 완충액 및 자극제는 상기 세포에 분리하여 첨가된다. 일부 구현예에서, 상기 자극 인큐베이션은 주기적인 온화한 혼합 조건으로 수행되고, 이것은 에너지적으로 바람직한 상호작용을 촉진하는데 도움을 줄 수 있으며 그에 의해서 세포의 자극 및 활성화를 성취하면서 보다 적은 총괄 자극제의 사용을 허용한다.
일부 구현예에서, 상기 인큐베이션은, 예를 들어 스피닝(spinning)의 존재하에서, 일반적으로는 비교적 적은 힘 또는 속도에서, 예를 들어 세포를 펠릿화하는 데 사용되는 속도보다 낮은 속도에서, 예를 들어 (약) 600 rpm 내지 (약) 1700 rpm (예를 들어 (약) 또는 적어도 600 rpm, 1000 rpm, 또는 1500 rpm 또는 1700 rpm), 예를 들어 약 80g 내지 100g(예를 들어 (약) 또는 적어도 80g, 85g, 90g, 95g, 또는 100g)의 챔버 또는 다른 용기의 샘플 또는 벽의 RCF에서, 혼합 조건하에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 스핀은 그러한 저속에서 스핀의 반복된 간격을 이용하여 수행된 후, 휴지 기간(rest period)을 가지며, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10초의 스핀 및/또는 휴지, 예를 들어 대략 1초 또는 2초의 스핀에 대략 5, 6, 7, 또는 8초의 휴지기를 갖는다.
특정 구현예에서, 배양은 폐쇄 시스템에서 수행된다. 특정 구현예에서, 배양은 멸균 조건 하에 폐쇄 시스템에서 수행된다. 특정 구현예에서, 배양은 제공된 시스템의 하나 이상의 단계와 동일한 폐쇄 시스템에서 수행된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 조성물은 폐쇄 시스템으로부터 제거되고 배양을 위한 생물 반응기(bioreactor)에 배치 및/또는 연결된다. 배양에 적합한 생물 반응기의 예시로 GE Xuri W25, GE Xuri W5, Sartorius BioSTAT RM 20 | 50, Finesse SmartRocker Bioreactor Systems, 및 Pall XRS Bioreactor Systems를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 생물 반응기는 배양 단계의 적어도 일부 동안 세포를 관류(perfuse) 및/또는 혼합하는데 사용된다.
일부 구현예에서, 혼합은 요동(rocking) 및/또는 움직임(motioning)이거나 이를 포함한다. 일부 경우에, 생물 반응기는 움직임(motioning) 또는 요동(rocking)의 영향을 받을 수 있으며, 이는 일부 측면에서 산소 전달을 증가시킬 수 있다. 생물 반응기의 움직임(motioning)은, 수평축을 따라 회전하는 것, 수직축을 따라 회전하는 것, 생물 반응기의 기울어지거나 경사진 수평 축에 따른 요동(rocking) 움직임, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 인큐베이션의 적어도 일부는 요동(rocking)으로 수행된다. 요동(rocking) 속도 및 요동(rocking) 각도는 원하는 교반(agitation)을 달성하도록 조정될 수 있다. 일부 구현예에서, 요동(rocking) 각도는 20˚, 19˚, 18˚, 17˚, 16˚, 15˚, 14˚, 13˚, 12˚, 11˚, 10˚, 9˚, 8˚, 7˚, 6˚, 5˚, 4˚, 3˚, 2˚ 또는 1˚이다. 특정 구현예에서, 요동 각도는 6 내지 16˚이다. 다른 구현예에서, 요동 각도는 7 내지 16˚이다. 다른 구현예에서, 요동 각도는 8 내지 12˚이다. 일부 구현예에서, 요동 속도는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 rpm 이다. 일부 구현예에서, 요동 속도는 4 내지 12 rpm, 예를 들어 4 내지 6 rpm이다.
일부 구현예에서, 생물 반응기는 0.01 L/min, 0.05 L/min, 0.1 L/min, 0.2 L/min, 0.3 L/min, 0.4 L/min, 0.5 L/min, 1.0 L/min, 1.5 L/min, 또는 2.0 L/min 또는 2.0 L/min이상, 약 또는 적어도 0.01 L/min, 0.05 L/min, 0.1 L/min, 0.2 L/min, 0.3 L/min, 0.4 L/min, 0.5 L/min, 1.0 L/min, 1.5 L/min, 또는 2.0 L/min 또는 2.0 L/min이상에서 일정한 공기 흐름으로, 37℃ 또는 그 근처의 온도 및 5% 또는 그 근처의 CO2 수준을 유지한다. 특정 구현예에서, 배양의 적어도 일부는, 예를 들어 290 ml/day, 580 ml/day, 및/또는 1160 ml/day 의 속도로, 관류(perfusion)로 수행되며, 예를 들어 배양의 시작 및/또는 배양된 세포의 밀도와 관련된 타이밍에 의존한다. 일부 구현예에서, 세포 배양 증폭의 적어도 일부는 예를 들어 6 RMP 또는 10 RPM과 같은 5 내지 15 RPM의 일정한 요동 속도로, 6˚와 같이, 5˚ 내지 10˚의 각도의 요동(rocking) 움직임(motion)으로 수행된다.
일부 구현예에서, 상기 배양 단계의 적어도 일부는 일정한 관류하에서, 예를 들어 느린 정상 속도(slow steady rate)의 관류하에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 관류는 액체, 예를 들어 사용된 배지의 유출(outflow), 및 신선한 배지의 유입이거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 관류는 사용된 배지를 신선한 배지로 대체한다. 일부 구현예에서, 상기 배양의 적어도 일부는 (약) 또는 적어도 (약) 100 mL/day, 200 mL/day, 250 mL/day, 275 mL/day, 290 mL/day, 300 mL/day, 350 mL/day, 400 mL/day, 450 mL/day, 500 mL/day, 550 mL/day, 575 mL/day, 580 mL/day, 600 mL/day, 650 mL/day, 700 mL/day, 750 mL/day, 800 mL/day, 850 mL/day, 900 mL/day, 950 mL/day, 1000 mL/day, 1100 mL/day, 1160 mL/day, 1200 mL/day, 1400 mL/day, 1500 mL day, 1600 mL/day, 1800 mL/day, 2000 mL/day, 2200 mL/day, 또는 2400 mL/day의 정상 속도의 관류하에서 수행된다.
D.
수확, 수집, 및 제형화
일부 구현예에서, 세포 요법제 및/또는 조작된 세포를 제조, 생성 또는 생산하기 위한 하나 이상의 공정 단계(예를 들어 원심 챔버 및/또는 폐쇄된 시스템에서 수행됨)은 세포의 제형화, 예를 들어 컬처링, 예를 들어 배양 및 증폭 전 또는 후에 상기 제공된 형질도입 처리 단계, 및/또는 기술된 하나 이상의 다른 처리 단계로부터 생성된 유전자 조작된 세포의 제형화를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포의 제형화와 관련된 상기 제공된 방법은 처리중인 형질도입된 세포, 예를 들어 폐쇄된 시스템에서 위에서 기술한 처리 단계를 이용하여 형질도입되고/되거나 증폭된 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 자극 시약은 상기 제형화 이전에 상기 세포로부터 제거되고/되거나 분리된다. 특정 구현예에서, 상기 자극 시약은 상기 배양 후에 상기 세포로부터 제거되고/되거나 분리된다. 특정 구현예에서, 상기 자극 시약은, 예를 들어 증식 및/또는 증폭을 촉진시키는 조건하에, 상기 배양 후에 그리고 상기 배양된 세포를 제형화하기 전에 상기 세포로부터 제거되고/되거나 분리된다. 특정 구현예에서, 상기 자극 시약은 본원에서, 예를 들어 섹션 III.A.1에서 기술되는 자극 시약이다. 특정 구현예에서, 상기 자극 시약은 본원에서, 예를 들어 섹션 III.A.2에서 기술된 세포로부터 제거되고/되거나 분리된다.
특정 구현예에서, 세포의 배양된 집단의 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 세포는, 상기 배양도중에 임계치의 세포수, 밀도, 및/또는 증폭이 달성된 후 0일 내지 10일, 0일 내지 5일, 2일 내지 7일, 0.5일 내지 4일, 또는 1일 내지 3일에 제형화된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는, 상기 배양도중에 임계치의 세포수, 밀도, 및/또는 증폭이 달성된 후 (약) 12시간, 18시간, 24시간, 1일, 2일, 또는 3일 이내에 제형화된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는, 상기 배양도중에 임계치의 세포수, 밀도, 및/또는 증폭이 달성된 후 (약) 1일 이내에 제형화된다.
특정 구현예에서, 자극의 개시에서 세포의 수집, 수확 또는 제형화까지의 시간량은 (약) 36 시간, 42 시간, 48 시간, 54 시간, 60 시간, 72 시간, 84 시간, 96 시간, 108 시간 또는 120 시간 또는 36 시간, 42 시간, 48 시간, 54 시간, 60 시간, 72 시간, 84 시간, 96 시간, 108 시간 또는 120 시간 미만이다. 특정 구현예에서, 자극의 개시에서 세포의 수집, 수확 또는 제형화까지의 시간량은 (약) 1.5 일, 2 일, 3 일, 4 일 또는 5 일 또는 1.5 일, 2 일, 3 일, 4 일 또는 5 일 미만이다. 일부 구현예에서, 자극의 개시에서 세포의 수집, 수확 또는 제형화까지 조작된 세포를 생성하기 위해 자극의 개시에서 세포의 수집, 수확 또는 제형화까지의 시간량은 (약) 36 시간 내지 120 시간, 48 시간 내지 96 시간 또는 48 시간 내지 72 시간(수치 포함) 또는 (약) 1.5 일 내지 5 일, 2 일 내지 4 일 또는 2 일 내지 3 일(수치 포함)이다. 특정 구현예에서, 인큐베이션의 개시에서 세포의 수확, 수집 또는 제형화까지의 시간량은 (약) 48 시간, 72 시간 또는 96 시간 또는 48 시간, 72 시간 또는 96 시간 미만이다. 특정 구현예에서, 인큐베이션의 개시에서 세포의 수확, 수집 또는 제형화까지의 시간량은 (약) 2 일, 3 일 또는 4 일 또는 2 일, 3 일 또는 4 일 미만이다. 특정 구현예에서, 인큐베이션의 개시에서 세포의 수확, 수집 또는 제형화까지의 시간량은 48 시간±6 시간, 72 시간±6 시간 또는 96 시간±6 시간이다. 특정 구현예에서, 인큐베이션의 개시에서 세포의 수확, 수집 또는 제형화까지의 시간량은 (약) 96 시간 또는 4 일이다.
특정 구현예에서, 세포는, 적어도 통합된 벡터가 게놈에서 검출된 경우 수확 또는 수집된다. 일부 구현예에서, 세포는 2배수체 게놈 당 안정적인 통합 벡터 카피 수(iVCN) 전에 수확 또는 수집된다. 특정 구현예에서, 세포는 통합된 벡터가 게놈에서 검출된 후이나 2배수체 게놈 당 안정적인 iVCN을 얻기 전에 수확 또는 수집된다.
일부 구현예에서, 세포는 2배수체 게놈 당 iVCN이 (약) 5.0, 4.0, 3.0, 2.5, 2.0, 1.75, 1.5, 1.25, 1.2, 1.1, 1.0, 0.9, 0.8, 0.75, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3 또는 0.25 카피 또는 5.0, 4.0, 3.0, 2.5, 2.0, 1.75, 1.5, 1.25, 1.2, 1.1, 1.0, 0.9, 0.8, 0.75, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3 또는 0.25 카피 이상을 얻기 전에 수확 또는 수집된다. 특정 구현예에서, 세포는 2배수체 게놈 당 iVCN이 (약) 1.0 카피를 얻기 전에 수확 또는 수집된다. 일부 구현예에서, 세포는 2배수체 게놈 당 iVCN이 (약) 0.5 카피를 얻기 전에 수확 또는 수집된다.
특정 구현예에서, 세포는, (약) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 20 이상 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 20 이상의 세포 집단의 세포 배가, 예를 들어 인큐베이션 중 발생하는 배가 전에 수확된다.
특정 구현예에서, 세포는, 총 세포수, 예를 들어 인큐베이션된 세포 또는 인큐베이션을 경험하는 세포의 총 수가, 입력 집단의 세포수, 예를 들어 자극 시약과 접촉되었던 총 세포수의 (약) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 20 또는 20 배 이상을 초과하기 전의 시기에 수확 또는 수집된다. 일부 구현예에서, 세포는, 인큐베이션된 총 세포수가 형질전환, 형질도입 또는 회전 접종되었던 총 세포수, 예를 들어 바이러스 벡터와 접촉되었던 총 세포수의 (약) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 20 또는 20 배 이상을 초과하기 전의 시기에 수확 또는 수집된다. 특정 구현예에서, 세포는 T 세포, 생존 가능한 T 세포, CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CAR 발현 T 세포 또는 상기 중 임의의 조합물이다. 특정 구현예에서, 세포는 총 세포수가 입력 집단의 총 세포수를 초과하기 전의 시기에 수확 또는 수집된다. 다양한 구현예에서, 세포는 생존 가능한 CD3+ T 세포의 총 수가 입력 집단의 생존 가능한 CD3+ 세포의 총 수를 초과하기 전의 시기에 수확 또는 수집된다. 특정 구현예에서, 세포는, 총 세포수가 형질전환, 형질도입 또는 회전 접종된 세포의 총 수를 초과하기 전의 시기에 수확 또는 수집된다. 다양한 구현예에서, 세포는, 생존 가능한 CD3+ T 세포의 총 수가 형질전환, 형질도입 또는 회전 접종된 세포의 생존 가능한 CD3+ 세포의 총 수를 초과하기 전의 시기에 수확 또는 수집된다. 다양한 구현예에서, 세포는, 생존 가능한 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포의 총 수가 입력 집단의 생존 가능한 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포의 총 수를 초과하기 전의 시기에 수확 또는 수집된다. 특정 구현예에서, 세포는, 총 세포수가 형질전환, 형질도입 또는 회전 접종된 세포의 총 수를 초과하기 전의 시기에 수확 또는 수집된다. 다양한 구현예에서, 세포는, 생존 가능한 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포의 총 수가 형질전환, 형질도입 또는 회전 접종된 세포의 생존 가능한 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포의 총 수를 초과하기 전의 시기에 수확 또는 수집된다.
일부 구현예에서, 세포 치료 및/또는 조작된 세포를 제조, 생성 또는 생산하기 위한 제공된 방법은 세포의 제형화, 예를 들어 인큐베이션, 배양 및 조작 전 또는 후에 제공된 처리 단계 및/또는 기술된 바와 같은 하나 이상의 다른 처리 단계로부터 생성된 유전자 조작된 세포의 제형화를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포의 제형화와 관련된 제공된 방법은 폐쇄된 시스템에서 상기 처리 단계를 이용하여 형질도입 및/또는 증폭된 세포와 같은, 형질도입된 세포를 처리하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 항원 수용체로 조작된 세포, 예를 들어 CAR 또는 TCR를 포함하는 세포의 용량은, 약학적 조성물 또는 제형과 같은, 조성물 또는 제형으로서 제공된다. 이러한 조성물은, 제공된 방법, 예를 들어 질환, 병태 및 장애의 예방 또는 치료, 또는 검출, 진단 및 예후 방법에 따라 사용될 수 있다.
일부 경우에, 세포는, 세포 치료 및/또는 조작된 세포를 제조, 생성 또는 생산하기 위한 하나 이상의 단계 (예를 들어 원심 챔버 및/또는 폐쇄 시스템에서 수행)로 처리되며, 예를 들어 세포의 제형화, 예를 들어 배양 전 또는 후에 제공된 형질도입 처리 단계로부터 생성된 유전자 조작된 세포의 제형화, 예를 들어 배양 및 증폭, 및/또는 기술된 바와 같은 하나 이상의 다른 처리 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 세포는 단일 단위 용량 투여(dosage administration) 또는 다중 용량 투여(dosage administration)와 같은 용량 투여량로 제형화 될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포의 제형화와 관련된 제공된 방법은, 형질전환된 세포, 예를 들어 상기 기재된 처리 단계를 사용하여 형질도입 및/또는 증폭된 세포를 폐쇄 시스템에서 처리하는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, 농축된 T 세포의 하나 이상의 조성물이 제형화된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 농축된 T 세포의 조성물은 하나 이상의 조성물이 조작 및/또는 배양된 후에 제형화된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 조성물은 입력 조성물이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 입력 조성물은 이전에 동결 보존(cryopreserved)되고 저장되고, 인큐베이션 전에 해동된다.
특정 구현예에서, 상기 제형화된 세포는 산출 세포이다. 특정 구현예에서, 농축된 T 세포의 제형화된 조성물은 농축된 T 세포의 입력 조성물이다. 특정 구현예에서, 상기 제형화된 CD4+ T 세포 및 제형화된 CD8+ T 세포는 산출 CD4+ T 및 CD8+ T 세포이다. 특정 구현예에서, 제형화된 세포 조성물, 예를 들어 농축된 CD4+ 및 CD8+ 세포의 제형화된 조성물은 산출 세포 조성물, 예를 들어 CD4+ 및 CD8+ 세포의 산출 조성물이다.
일부 구현예에서, 세포는 용기, 예를 들어 백 또는 바이알로 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 세포는, 상기 배양도중에 임계치의 세포수, 밀도, 및/또는 증폭이 달성된 후 0일 내지 10일, 0일 내지 5일, 2일 내지 7일, 0.5일 내지 4일, 또는 1일 내지 3일에 제형화된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는, 상기 배양도중에 임계치의 세포수, 밀도, 및/또는 증폭이 달성된 후 (약) 12시간, 18시간, 24시간, 1일, 2일, 또는 3일 이내에 제형화된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는, 상기 배양도중에 임계치의 세포수, 밀도, 및/또는 증폭이 달성된 후 (약) 1일 이내에 제형화된다.
특정 구현예에서, 상기 세포는, 상기 임계치가 달성되는 때와 무관하게 세포가 상기 배양도중에 보다 빠른 시점에서 제형화되는 경우 보다 덜 활성화된 상태에서 수집되도록 최소 기간 또는 시간동안 배양된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는, 상기 배양도중에 임계치의 세포수, 밀도, 및/또는 증폭이 달성된 후 0일 내지 3일, 예를 들어 0일 내지 3일, 1일 내지 2일, (약) 1일, (약) 2일, 또는 (약) 3일에 제형화된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 상기 임계치의 세포수, 밀도, 및/또는 증폭을 활성화하고 상기 제형화 전의 최소 시간 또는 기간동안 배양된 상태를 유지한다. 일부 구현예에서, 상기 임계치를 달성한 세포는 그것들이 최소 시간 또는 기간, 예를 들어 1일 내지 14일, 2일 내지 7일, 또는 3일 내지 6일의 최소 시간 또는 기간, 또는 (약) 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 또는 7일 초과의 최소 시간 또는 기간동안 배양될 때까지 제형화되지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 배양의 최소 시간 또는 기간은 3일 내지 6일이다.
일부 구현예에서, 세포는 약학적으로 허용가능한 완충제로 제형화되는데, 이는 일부 측면에서 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 처리(processing)는 배지를 대상체에게 투여하기 위해 약학적으로 허용가능하거나 바람직한 배지 또는 제형 완충제로 배지를 교환하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 처리 단계는 하나 이상의 임의의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함할 수 있는, 약학적으로 허용가능한 완충액에서 세포를 대체하기 위해 형질도입 및/또는 증폭된 세포를 세척하는 것을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 이러한 약학적 형태의 예는 세포 및 조성물을 대상체에게 투여하기에 적합한 형태와 관련하여 하기에 기술될 수 있다. 일부 구현예에서 약학 조성물은 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는데 효과적인 양, 예를 들어 치료적 유효 또는 예방적 유효량으로 세포를 포함한다.
"약학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분 이외의 약학적 제형의 성분을 나타내며, 이는 대상체에게 무독성이다. 약학적으로 허용가능한 담체는 완충제, 부형제, 안정제 또는 보존제를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
일부 측면에서, 담체의 선택은 특정 세포 및/또는 투여 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 다양한 적합한 제형이 존재한다. 예를 들어 약학 조성물은 보존제를 포함할 수 있다. 적합한 보존제는 예를 들어 메틸파라벤(methylparaben), 프로필파라벤(propylparaben), 벤조산나트륨 (sodium benzoate) 및 염화벤잘코늄(benzalkonium chloride)을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 둘 이상의 방부제의 혼합물이 사용된다. 보존제 또는 이들의 혼합물은 일반적으로 총 조성물의 중량을 기준으로 약 0.0001% 내지 약 2%의 양으로 존재한다. 담체는 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에 기재되어 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 일반적으로 사용된 용량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며 다음을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다: 포스페이트, 시트르산염(citrate) 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (옥타데실 디메틸벤질 암모늄 클로라이드(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride); 헥사메토늄 클로라이드(hexamethonium chloride);염화벤잘코늄(benzalkonium chloride); 벤제토늄 클로라이드(benzethonium chloride); 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀(resorcinol); 사이클로헥사놀(cyclohexanol); 3-펜탄올(3-pentanol); 및 m-크레졸); 저 분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 글로불린과 같은 단백질; 폴리 비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류 및 글루코스, 마노스(mannose) 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스(sucrose), 만니톨, 트레할로스(trehalose) 또는 소르비톨(sorbitol)과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 카운터-이온(salt-forming counter-ions); 금속 착물 (예 : Zn- 단백질 착물); 및 / 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 비이온성 계면 활성제.
일부 측면에서 완충제가 조성물에 포함된다. 적합한 완충제는 예를 들어 시트르산, 시트르산 나트륨, 인산, 인산 칼륨 및 다양한 다른 산 및 염을 포함한다. 일부 측면에서, 2 종 이상의 완충제의 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 이의 혼합물은 일반적으로 총 조성물의 약 0.001 중량% 내지 약 4 중량%의 양으로 존재한다. 투여 가능한 약학 조성물의 제조 방법은 공지되어있다. 자세한 예시적인 방법은 예를 들어 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)에 기재되어 있다.
제형은 수용액을 포함할 수 있다. 제형 또는 조성물은 또한, 세포로 치료되는 특정 징후(particular indication), 질환 또는 병태에 유용한 하나 이상의 활성 성분, 바람직하게는 세포에 상보적인 활성을 갖는 활성 성분을 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 활성은 서로 악영향을 미치지 않는다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합하여 적합하게 존재한다. 따라서, 일부 구현예에서, 약학 조성물은, 화학치료제, 예를 들어 아스파라기나제(asparaginase), 부설판(busulfan), 카보플라틴(carboplatin), 시스플라틴(cisplatin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 플로우로유라실(fluorouracil), 젬시타빈(gemcitabine), 히드록시우레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트(methotrexate), 파클리탁셀(paclitaxel), 리툭시맙(rituximab), 빈블라스틴(vinblastine) 및/또는 빈크리스틴(vincristine)과 같은 다른 약학적 활성제 또는 약물을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서 조성물은 멸균 액체 제제, 예를 들어 등장성 수용액, 현탁액, 유제, 분산액 또는 점성 조성물로서 제공되며, 이는 일부 측면에서 선택된 pH로 완충될 수 있다. 액체 조성물은, 예를 들어 물, 식염수(saline), 포스페이트 완충 식염수, 폴리올(polyol)(예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 이들의 적합한 혼합물을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있는 담체를 포함할 수 있다. 멸균 주사용 용액은 적절한 담체, 희석제 또는 부형제, 예를 들어 멸균수, 생리 식염수, 포도당, 덱스트로오스(dextrose) 등과의 혼합물과 같은 용매에 세포를 혼입시킴으로써 제조될 수 있다. 조성물은 투여 경로 및 원하는 제형에 따라, 습윤제, 분산제 또는 유화제(예를 들어 메틸셀룰로오스), pH 완충제, 겔화 또는 점도 향상 첨가제, 보존제, 향미제 및/또는 색소와 같은 보조 물질을 포함할 수 있다. 적절한 준비를 준비하기 위해 일부 측면에서 표준 텍스트를 참조할 수 있다.
항균 방부제, 항산화제, 킬레이트제 및 완충제를 포함하여 조성물의 안정성 및 무균 성을 향상시키는 다양한 첨가제가 첨가될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로 부탄올, 페놀 및 소르브산에 의해 보장될 수 있다. 주사 가능한 약학 형태의 흡수를 지속시키는 것은 흡수 지연제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트(aluminum monostearate) 및 젤라틴을 사용함으로써 야기될 수 있다.
일부 구현예에서, 제형 완충제는 동결 보존제(cryopreservative)를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 1.0% 내지 30% DMSO 용액, 예를 들어 5% 내지 20% DMSO 용액 또는 5% 내지 10% DMSO 용액을 포함하는 동결 보존 용액(cyropreservative solution)로 제형화된다. 일부 구현예에서, 동결 보존 용액은, 예를 들어 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민 (HSA)을 함유하는 PBS, 또는 다른 적합한 세포 동결 배지이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 동결 보존 용액은 예를 들어 적어도 7.5% DMSO이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 처리 단계(processing steps)는 동결 보존 용액(cryopreservative solution)에서 세포를 대체하기 위해 형질도입된 및/또는 증폭된 세포를 세척하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 최종 농도가 12.5%, 12.0%, 11.5%, 11.0%, 10.5%, 10.0%, 9.5%, 9.0%, 8.5%, 8.0%, 7.5%, 7.0%, 6.5%, 6.0%, 5.5% 또는 5.0% 또는 약 12.5%, 12.0%, 11.5%, 11.0%, 10.5%, 10.0%, 9.5%, 9.0%, 8.5%, 8.0%, 7.5%, 7.0%, 6.5%, 6.0%, 5.5% 또는 5.0%인 DMSO 또는 1% 내지 15%, 6% 내지 12%, 5% 내지 10% 또는 6% 내지 8%인 DMSO 배지 및/또는 용액에서 동결, 예를 들어 동결, 예를 들어 동결 보존(cryopreserved) 또는 동결 방지(cryoprotected)된다. 특정 구현예에서, 최종 농도가 5.0%, 4.5%, 4.0%, 3.5%, 3.0%, 2.5%, 2.0%, 1.5%, 1.25%, 1.0%, 0.75%, 0.5% 또는 0.25% 또는 약 5.0%, 4.5%, 4.0%, 3.5%, 3.0%, 2.5%, 2.0%, 1.5%, 1.25%, 1.0%, 0.75%, 0.5% 또는 0.25%인 HSA, 또는 0.1% 내지 5%, 0.25% 내지 4%, 0.5% 내지 2%, 또는 1% 내지 2%인 HAS 배지 및/또는 용액으로 동결, 예를 들어 동결 보존 또는 동결 방지된다.
특정 구현예에서, 자극되고, 조작되고/되거나, 배양된 농축된 T 세포, 예를 들어 T 세포의 조성물은 제형화되고, 동결 보존된 다음, 일정 시간동안 저장된다. 특정 구현예에서, 상기 제형화되고, 동결 보존된 세포는, 상기 세포가 주입을 위해 방출될 때까지 저장된다. 특정 구현예에서, 상기 제형화되고 동결 보존된 세포는, 1일 내지 6개월, 1개월 내지 3개월, 1일 내지 14일, 1일 내지 7일, 3일 내지 6일, 6개월 내지 12개월, 또는 12개월 초과동안 저장된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 동결 보존되고 (약) 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일, 또는 그 기간 미만동안 저장된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 상기 저장 후 해동되고 투여된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 (약) 5일동안 저장된다.
일부 구현예에서, 제형화는, 배양된 또는 증폭된 세포와 같은 세포의 세척, 희석 또는 농축을 포함하는 하나 이상의 처리 단계를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 처리(processing)는, 주어진 복용량 또는 이의 분획으로 투여하기위한 세포수를 포함하는 단위 용량 형태 조성물과 같은, 원하는 농도 또는 수로 세포의 희석 또는 농도를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 처리 단계는 부피 감소를 포함하여 원하는 바에 따라 세포의 농도를 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 처리 단계는 부피-부가를 포함하여 원하는 바에 따라 세포의 농도를 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 처리는 형질도입 및/또는 증폭된 세포에 다량의 제형 완충제를 첨가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 제형 완충제의 부피는 10mL 내지 1000mL 또는 약 10mL 내지 1000mL, 예를 들어 적어도 또는 적어도 약 또는 약 또는 50mL, 100mL, 200mL, 300mL, 400mL, 500mL, 600 mL, 700 mL, 800 mL, 900 mL 또는 1000 mL이다.
일부 구현예에서, 세포 조성물을 제형화하기 위한 이러한 처리 단계는 폐쇄 시스템에서 수행된다. 이러한 처리 단계의 예시는, 세포 처리 시스템과 관련된 하나 이상의 시스템 또는 키트와 연계되어 원심 챔버를 사용하여 수행될 수 있으며, 예를 들어 Sepax® 또는 Sepax 2® 세포 처리 시스템과 함께 사용하기위한 것을 포함하는, Biosafe SA에 의해 생산 및 판매되는 원심 챔버와 같다. 예시적인 시스템 및 공정는 국제공개공보 제WO2016/073602호에 기재되어있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 원심 챔버의 내부 공동으로부터 제형화된 조성물을 발현시키는 단계를 포함하며, 이는 전술한 바와 같은 상기 구현예들 중 어느 하나에서, 약학적으로 허용되는 완충제와 같은, 제형화 완충제로 제형화된 세포의 결과 조성물이다. 일부 구현예에서, 제형화된 조성물의 발현은, 용기, 예를 들어 폐쇄 시스템의 일부로서 원심 챔버와 작동 가능하게 연결되어 있는 백(bag)에 대한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 용기, 예를 들어 백은 산출 라인 또는 산출 위치에서 시스템에 연결된다.
일부 구현예에서, 원심 챔버 또는 세포 처리 시스템과 관련된 폐쇄 시스템은, 튜빙 라인의 각 단부에, 제형화된 조성물의 발현을 위해 하나 또는 복수의 용기가 연결될 수 있는 포트로 연결된, 다방향 튜빙 매니폴드(multi-way tubing manifold)를 포함하는 다중 포트 산출 키트(multi-port output kit)를 포함한다. 일부 측면에서, 원하는 수 또는 복수의 산출 용기, 예를 들어 백은 멀티-포트 산출(multi-port output)의 하나 이상, 일반적으로 2 개 이상, 예를 들어 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8 개 이상의 포트(ports)에 멸균 연결될 수 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, 하나 이상의 용기, 예를 들어 백은 포트 또는 모든 포트보다 적은 포트에 부착될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 시스템은 산출 조성물의 생체 의학 용기의 복수의 백으로의 발현에 영향을 줄 수 있다.
일부 측면에서, 세포는 단일 단위 용량 투여(single unit dosage administration) 또는 다중 용량 투여(multiple dosage administration)와 같은, 용량 투여량으로 복수의 산출 백(output bag) 중 하나 이상, 예를 들어 산출 백에 발현될 수 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, 백은 각각 주어진 용량 또는 이의 분획으로 투여하기위한 세포의 수를 포함할 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, 각각의 백은 투여를 위한 단일 단위 용량을 포함할 수 있고 또는 2 개 이상의 산출 백과 같은 복수의 산출 백 중 하나 이상, 또는 산출 백의 3 개 이상이 되도록 원하는 용량의 분획을 포함할 수 있고, 함께 투여를 위한 용량을 구성한다.
따라서, 용기, 예를 들어 산출 백은 일반적으로 투여될 세포, 예를 들어 이의 하나 이상의 단위 용량을 포함한다. 단위 용량은 대상체에게 투여될 세포의 양 또는 수, 또는 투여될 세포수의 2 배(또는 그 이상)일 수 있다. 이것은 대상에게 투여될 세포의 최저 용량 또는 최저 가능 용량일 수 있다.
일부 구현예에서, 각각의 용기, 예를 들어 백은 별도로 단위 용량의 세포를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 용기 각각은 동일하거나 대략 또는 실질적으로 동일한 수의 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 단위 용량은 적어도 또는 적어도 약 1×106, 2×106, 5×106, 1×107, 5×107 또는 1×108 개의 조작된 세포, 총 세포, T 세포 또는 PBMCs를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 백에서 제형화된 세포 조성물의 부피는 10mL 내지 100mL, 예를 들어 적어도 또는 적어도 약 20mL, 30mL, 40mL, 50mL, 60mL, 70mL, 80mL, 90mL 또는 100mL이다.
일부 구현예에서, 상기 방법에 의해 생성된 이러한 세포 또는 이러한 세포를 포함하는 조성물은 질환 또는 병태를 치료하기 위해 대상체에게 투여된다.
E. 순차적 선택 및 병행 선택
본원에 제공된 방법은 표적 세포 집단(예를 들어 T 세포, CD3+, CD4+, CD8+, CD57- T 세포)을 단리 및/또는 농축하기 위해 예를 들어 컬럼 크로마토그래피에 의한 다중 선택 단계를 허용한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 선택 단계는 하나 이상의 시점에 또는 치료 세포 산출 조성물을 생성하기 위한 공정 후에 수행된다. 일부 구현예에서, 선택 단계는, 예를 들어 세포 조성물의 추가 정제, 특정 세포 하위 유형의 선택, 생존 가능한 세포의 선택, 조작된 세포의 선택 및/또는 세포의 비율, 총 수 또는 농도를 조정하기 위한 다중 선택 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 선택 단계는 인큐베이션 전에 수행된다. 일부 구현예에서, 선택 단계는 수확 및 수집 전에 수행된다.
일부 측면에서, 상기 방법(예를 들어 선택 단계(예를 들어 선택 단계))은, 본원에 제공된 바와 같은 샘플(예를 들어 자극 및/또는 조작된 세포의 산출 조성물)에서 복수의 상이한 세포 집단이 농축 및/또는 단리되는 순차적 선택을 이용함으로써 폐쇄 시스템에서와 같은 단일 공정 흐름으로 달성된다. 일부 측면에서, 동일한 용기 또는 용기 세트, 예를 들어 튜브 세트에서 선택 또는 단리의 수행은 순차적인 양성 및 음성 선택 단계, 이전 단계의 음성 및/또는 양성 분획를 추가 선택의 대상으로 하는 후속 단계를 수행함으로써 달성되고, 여기서 전체 공정는 동일한 튜브 또는 튜브 세트에서 수행된다. 일 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 자극 및/또는 조작된 세포의 산출 조성물)은, CD4+ 또는 CD8+ 집단 중 하나를 농축하도록 제1 선택이 수행되고, 제1 선택에서 비선택 세포가 제2 선택을 위한 세포의 공급원으로 사용되어 CD4+ 또는 CD8+ 집단 중 나머지 다른 하나를 농축하는 순차적인 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 추가 선택 또는 선택들을 수행하여 CD4+ 또는 CD8+ 집단 중 하나 또는 둘 다의 하위 집단, 예를 들어 CD57- 세포를 농축할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 세포 집단(예를 들어 자극 및/또는 조작된 세포의 산출 조성물)은, 생존 가능한 세포를 위한 후속 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 세포 집단(예를 들어 자극된 및/또는 조작된 세포의 산출 조성물)에서 세포의 비율 또는 총 수가 제어 또는 조정된다.
일부 측면에서, 상기 방법(예를 들어 선택 단계(예를 들어 선택 단계))은, 본원에 제공된 바와 같은 샘플(예를 들어 자극 및/또는 조작된 세포의 산출 조성물)에서 복수의 상이한 세포 집단이 농축 및/또는 단리되는 순차적 선택을 이용함으로써 폐쇄 시스템에서와 같은 단일 공정 흐름으로 달성된다. 일부 측면에서, 동일한 용기 또는 용기 세트, 예를 들어 튜브 세트에서 선택 또는 단리의 수행은 순차적인 음성 및 양성 선택 단계, 이전 단계의 음성 및/또는 양성 분획를 추가 선택의 대상으로 하는 후속 단계를 수행함으로써 달성되고, 여기서 전체 공정는 동일한 튜브 또는 튜브 세트에서 수행된다. 일 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 자극 및/또는 조작된 세포의 산출 조성물)은, CD57+ 집단을 제거하도록 제1 선택이 수행되는 순차적인 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 추가 선택 또는 선택들을 수행하여 CD4+ 또는 CD8+ 집단 중 하나 또는 둘 다, 예를 들어 CD57-CD4+ 또는 CD57-CD8+ 세포를 농축할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 세포 집단(예를 들어 자극 및/또는 조작된 세포의 산출 조성물)은, 생존 가능한 세포를 위한 후속 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 세포 집단(예를 들어 자극된 및/또는 조작된 세포의 산출 조성물)에서 세포의 비율 또는 총 수가 제어 또는 조정된다.
일 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 자극 및/또는 조작된 세포의 산출 조성물)은, CD3+ 집단을 농축하도록 제1 선택이 초래되는 후속 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 추가 선택 또는 선택들은 CD3+ 집단의 하위 집단, 예를 들어 CD57- 세포를 농축하는 결과를 가져올 수 있다. 일부 구현예에서, 추가 선택 또는 선택들은 생존 가능한 세포를 농축하는 결과를 가져올 수 있다. 일부 구현예에서, 추가 선택 또는 선택들은 생존 가능한 CD57-CD3+ 세포의 하위 집단, 예를 들어 CD3+CD57-CD4+ 또는 CD57-CD3+CD8+ 세포를 농축하는 결과를 가져올 수 있다. 일부 구현예에서, 생존 가능한 세포의 선택은 세포 집단(예를 들어 자극 및/또는 조작된 세포의 산출 조성물 또는 이의 하위 집단)에서 죽은 세포를 제거하는 것을 포함하거나 상기로 구성된다.
일 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 자극 및/또는 조작된 세포의 산출 조성물)은, CD57+ 세포를 제거하도록 제1 선택이 수행되는 후속 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 추가 선택 또는 선택들은 CD57- 집단의 하위 집단, 예를 들어 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포를 농축하는 결과를 가져올 수 있다. 일부 구현예에서, 추가 선택 또는 선택들은 생존 가능한 세포를 농축하는 결과를 가져올 수 있다. 일부 구현예에서, 생존 가능한 세포의 선택은 세포 집단(예를 들어 자극 및/또는 조작된 세포의 산출 조성물 또는 이의 하위 집단)에서 죽은 세포를 제거하는 것을 포함하거나 상기로 구성된다.
일부 구현예에서, 본 섹션에 개시된 방법(예를 들어 선택 단계)은 순차적인 선택 기술을 사용하여 수행될 필요가 없다. 일부 구현예에서, 본 섹션에 개시된 방법(예를 들어 선택 단계)은 병행 선택 기술과 조합하여 순차적인 선택 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 선택 단계는 순차적인 선택을 적용하지 않을 수 있거나 또는 폐쇄 시스템 또는 동일한 튜브를 사용하는 용기 세트에서 발생하지 않는 순차적인 선택을 적용할 수 있다. 일부 구현예에서, 선택 단계는 예를 들어 단일 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 단일 단계에서 완료된다. 일부 구현예에서, 선택 단계는 병행 선택 기술을 사용하여 완수된다. 예를 들어 선택 단계는, 예를 들어 폐쇄 시스템에서 양성 및/또는 음성 선택 단계를 동시에 수행함으로써 달성되고, 여기서 전체 공정는 동일한 튜브 또는 튜브 세트에서 수행된다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 자극 및/또는 조작된 세포의 산출 조성물)은, 샘플(예를 들어 자극 및/또는 조작된 세포의 산출 조성물)이 2개 이상의 크로마토그래피 컬럼에 로딩되는 병행 선택의 대상이 되고, 여기서 각 컬럼은 세포 집단의 선택을 초래한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 크로마토그래피 컬럼은 개별적으로 CD57-, CD3+, CD4+ 또는 CD8+ 집단의 선택을 초래한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 크로마토그래피 컬럼은 동일한 세포 집단의 선택을 초래한다. 예를 들어 2개 이상의 크로마토그래피 컬럼은 CD57- 세포의 선택을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 친화도 크로마토그래피 또는 겔 투과 크로마토그래피를 포함하는 2개 이상의 크로마토그래피 컬럼은 독립적으로 동일한 세포 집단의 선택을 초래한다. 일부 구현예에서, 친화도 크로마토그래피 또는 겔 투과 크로마토그래피를 포함하는 2개 이상의 크로마토그래피 컬럼은 독립적으로 상이한 세포 집단의 선택을 초래한다. 일부 구현예에서, 추가 선택 또는 선택들은 병행 선택을 통해 선택된 하나 또는 모든 세포 집단의 하위 집단을 농축하는 결과를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포(예를 들어 CD57- 세포)를 함유하는 샘플(예를 들어 자극 및/또는 조작된 세포의 산출 조성물)은, 병행 선택이 CD4+ 집단 및 CD8+ 집단 E또는 CD3+ 집단의 농축을 초래하는 병행 선택의 대상이 된다.
일부 구현예에서, 선택 단계는 여기 기재된 바와 같은 선택 제제로 표지된 비드를 사용하여 수행될 수 있고, 예를 들어 제2 선택 제제로 표지된 비드를 사용하거나 또는 상기 기재된 바와 같은 컬럼 크로마토그래피에 양성 분획을 노출시킴으로써 제2 선택 마커를 농축하도록 양성 분획의 추가 양성 선택 후에 제1 선택 단계의 양성 및 음성 분획이 유지될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 선택 단계는 본원에 기재된 바와 같은 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 선택 단계는 비드 분리 및 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 하나 이상의 방법을 사용하여 달성된다. 일부 구현예에서, 선택 단계는 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 달성된다.
일부 측면에서, 단일 또는 동일한 단리 또는 분리 용기 또는 용기 세트, 예를 들어 단일 컬럼 또는 컬럼 세트 및/또는 동일한 튜브 또는 튜브 세트에서 또는 동일한 분리 매트릭스 또는 배지 또는 시약, 예를 들어 동일한 자성 매트릭스, 친화도 표지된 고체 지지체 또는 항체 또는 기타 결합 파트너를 사용하여 복수의 집단을 단리하는 것은, 예를 들어 비용, 시간, 복잡성, 샘플 처리의 필요성, 자원, 시약 또는 장비 사용의 감소를 초래하는 단리를 간소화하는 특성을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 특징은 방법과 관련된 비용, 효율, 시간 및/또는 복잡성을 최소화하고/거나 감염, 오염 및/또는 온도 변화로 인한 피해와 같은 세포 생성물에 대한 잠재적인 피해를 피한다는 점에서 유리하다. 여기에 제공된 방법은 온-컬럼 자극과 조합된 세포 선택 전 또는 후 둘 다에 다중 선택 단계로 표적 집단의 농축을 가능하게 한다.
여기에 제공된 방법은 성공적으로 자극 및 조작된 세포의 선택 및 농축을 더 가능하게 한다. 예를 들어 일부 구현예에서, 상기 기재된 순차 선택, 병행 선택 또는 단일 선택 절차가 사용되어 재조합 수용체(예를 들어 CAR, TCR)를 발현하는 자극 세포를 확인할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체(예를 들어 CAR)를 발현하는 세포는, 하위 집단 세포, 예를 들어 CD4+ CAR+ T 세포, CD8+ CAR+ T 세포, 및/또는 생존 가능한 세포에 대해 더 농축될 수 있다. 일부 구현예에서, 선택 단계는 재조합 수용체(예를 들어 CAR, TCR)를 발현하는 세포 및/또는 이의 하위 집단의 비율, 농도 또는 총 수의 제어 또는 조정을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 농축된 집단은 세포 요법을 위한 사용(예를 들어 투여)을 위해 제형화될 수 있다.
F. 공정의 예시적 특징
일부 측면에서, 상기 제공된 방법 및 조성물은 CD57- T 세포에 대해 농축된 T 세포의 집단에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 예를 들어 CD57+ 세포의 음성 선택에 의해서, 및 일부 측면에서는 T 세포, 예를 들어 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 양성 선택에 의해서 농축된 CD57- T 세포의 집단을 생성하는 방법이 기술된다. 특정 구현예에서, 예를 들어 CD57+ 세포의 음성 선택에 의해서, 및 일부 측면에서는 T 세포, 예를 들어 CD3+ T 세포의 양성 선택에 의해서 농축된 CD57- T 세포의 집단을 생성하는 방법이 기술된다. 특정 구현예는 농축된 CD57- T 세포의 집단을 인큐베이션, 자극, 활성화, 조작, 형질도입, 배양, 및/또는 증폭시키는 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57- T 세포의 집단을 인큐베이션, 자극, 활성화, 조작, 형질도입, 배양, 및/또는 증폭시키는 것은 또다른 T 세포의 집단, 예를 들어 CD57+ 세포의 양 또는 높은 양을 함유하는 집단에 상기 단계 또는 공정들에 관한 이점을 제공한다. 이러한 이점은 제한되지는 않지만 개선된 증식 또는 증폭 및 낮은 분화, 예를 들어 터미널 분화(terminal differentiation)를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제공된 방법은 예를 들어 CD57+ T 세포의 고갈된 T 세포의 집단, 예를 들어 농축된 CD57- T 세포의 집단을 생성하는 1차 인간 T 세포를 함유하는 생물학적 샘플로부터 CD57+ T 세포를 선택함으로써 T 세포를 농축하는 단계이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 집단은 (약) 10%, 5%, 1%, 또는 0.1% 미만의 CD57+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 집단은 상기 생물학적 샘플 중에 존재하는 (약) 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 미만의 빈도의 CD57+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 집단의 CD4+ T 세포의 적어도 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 CD57-CD4+ T 세포이다. 특정 구현예에서, 상기 집단의 CD8+ T 세포의 적어도 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 CD57-CD8+ T 세포이다. 특정 구현예에서, 상기 집단의 CD3+ T 세포의 적어도 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 CD57-CD3+ T 세포이다.
특정 구현예에서, T 세포를 농축하는 것은 생물학적 샘플로부터 CD57+ 세포를 선택하거나 또는 제거하고, 이어서 CD57에 대해 음성 선택된 집단으로부터 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 개별적으로 선택하여, 예를 들어 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단 및 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 집단을 생성하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 이들 집단은 개별 상태를 유지하며, 예를 들어 개별적으로 동결 방지되고 저장되고/되거나 개별적으로 조작되어 재조합 수용체를 발현한다.
일부 구현예에서, 상기 제공된 방법은 농축된 CD57- T 세포의 집단을 자극하는 것이거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 제공된 방법은 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단을 자극하는 것이거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 제공된 방법은 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 집단을 자극하는 것이거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단 및 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 집단은 예를 들어 자극 조건, 예를 들어 본원의 섹션 III.A에서 기술된 임의의 자극 조건하에서 인큐베이션함으로써 자극된다. 특정 구현예에서, 상기 자극 조건은 자극 시약의 존재이거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ T 세포 및 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 개별 집단은 개별적으로 자극된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ T 세포 및 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 개별 집단은, 농축된 CD57-CD4+ T 세포 및 농축된 CD57-CD8+ T 세포가 자극되도록 자극 전에 결합 또는 혼합된다.
특정 구현예에서, T 세포를 자극하는 방법 또는 공정은 생물학적 샘플로부터 CD57+ 세포를 선택 또는 제거하고, 이어서 CD57에 대해 음성 선택된 상기 집단으로부터 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 개별적으로 선택하여 예를 들어 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단 및 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 집단을 생성하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ T 세포 및 농축된 CD57-CD8+ T 세포는 자극 조건하에 개별적으로 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ T 세포 및 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 개별 집단은 결합되고, 예를 들어 자극 조건하에 개별적으로 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 상기 자극은 자극 시약의 존재를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 자극 시약은 항-CD3 및 항-CD28 항체 콘쥬게이트된 상자성 비드이거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 자극 시약은 가역적으로 결합된 항-CD3 및 항-CD28 Fab를 갖는 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머 입자이거나 또는 그를 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 제공된 방법은 예를 들어 본원에서. 예를 들어 섹션 III.B에서, 제공된 방법에 의해서 농축된 CD57- T 세포의 집단을 유전자 조작하는 것이거나 또는 그를 포함한다. 일부 측면에서, 이종 폴리뉴클레오티드가 예를 들어 형질도입에 의해서 상기 집단의 세포에 도입된다. 특정 구현예에서, 상기 제공된 방법은 상기 세포로부터 유래하거나 또는 그로부터 유도되는 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단 또는 세포의 집단을 조작하는 하나 이상의 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 제공된 방법은 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 집단을 유전자 조작하는 하나 이상의 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단 및 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 집단은 예를 들어 바이러스 벡터를 사용한 형질도입에 의해서 유전자 조작된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ T 세포 및 농축된 CD57-CD8+ T 세포, 예를 들어 자극된 농축된 CD57-CD4+ T 세포 및 자극된 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 개별 집단은 유전자 조작된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57- T 세포, 예를 들어 CD57-CD4+ T 세포 및 CD57-CD8+ T 세포 둘 다를 포함하는 자극된 CD57- T 세포, 예를 들어 자극된 농축된 CD57-CD4+ T 세포 및 자극된 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 단일 집단이 유전자 조작된다.
특정 구현예에서, T 세포를 유전자 조작하는 방법은 생물학적 샘플로부터 CD57+ 세포를 선택 또는 제거하고, 이어서 CD57에 대해 음성 선택된 상기 집단으로부터 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 개별적으로 선택하여 예를 들어 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단 및 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 집단을 생성하는 단계이거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ T 세포 및 농축된 CD57-CD8+ T 세포는 개별적으로 유전자 조작된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ T 세포 및 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 개별 집단은 상기 세포를 유전자 조작하는 단계 전에 결합된다. 일부 측면에서, 상기 유전자 조작은 예를 들어 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것이거나 또는 그를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 도입은 예를 들어 스피노큘레이션(spinoculation) 및 바이러스 벡터의 존재하의 후속 인큐베이션과 같은 형질도입 단계이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 이종 폴리뉴클레오티드는 본원에서, 예를 들어 섹션 III.B에서 제공된 임의의 방법에 의해서 도입된다. 특정 구현예에서, 상기 CD57-CD4+ T 세포 및 CD57-CD8+ T 세포는 유전자 조작되기 전에 본원에서, 예를 들어 섹션 III.A에서 기술된 임의의 방법에 의해서 자극된다.
일부 구현예에서, (a) 하나 이상의 TCR 복합체의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인 및 하나 이상의 공자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 자극 시약의 존재하에 농축된 CD57- T 세포의 집단을 인큐베이션함으로써 자극된 T 세포를 생성하는 단계; (b) 이종 폴리뉴클레오티드를 함유하는 바이러스 벡터를 사용하여 자극된 T 세포를 형질도입하여 형질전환된 T 세포를 생성함으로써 제 1 및 제 2 농축된 집단의 자극된 T 세포에 이종 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계; (c) 상기 형질전환된 T 세포의 증식 또는 증폭을 촉진하는 조건하에 상기 형질전환된 T 세포를 배양하는 단계; 및 (d) 상기 증폭된 T 세포를 수확 또는 수집하는 단계;에 의해서 수행된다.
일부 구현예에서, T 세포를 유전자 조작하는 방법은 생물학적 샘플로부터 CD57+ 세포를 선택 또는 제거하고, 이어서 CD57에 대해 음성 선택된 상기 집단으로부터 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 개별적으로 선택하여 예를 들어 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단 및 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 집단을 생성하는 단계이거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ T 세포 및 농축된 CD57-CD8+ T 세포는 개별적으로 유전자 조작되거나 또는 하나 이상의 유전자 조작 단계 전에 결합된다. 특정 구현예에서, 상기 CD57-CD4+ T 세포 및 CD57-CD8+ T 세포는 자극 시약, 예를 들어 항-CD3 및 항-CD28 항체 콘쥬게이트된 상자성 비으의 존재하에 배양된다. 특정 구현예에서, 상기 자극 시약은 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계 전에 상기 T 세포를 자극하는 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머 입자이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 자극된 CD57-CD4+ T 세포 및 CD57-CD8+ T 세포는 상기 이종 폴리뉴클레오티드를 운반하는 바이러스, 예를 들어 상기 바이러스의 존재하에 스피노큘레이션 및/또는 인큐베이션을 포함하는 단게에 의해서, 형질전환되어 예를 들어 형질전환된 CD57-CD4+ T 세포 및 CD57-CD8+ T 세포를 생성한다.
일부 구현예에서, T 세포를 유전자 조작하는 방법은 생물학적 샘플로부터 CD57+ 세포를 선택 또는 제거하고, 이어서 CD57에 대해 음성 선택된 상기 집단으로부터 CD3+ T 세포를 개별적으로 선택하여 예를 들어 농축된 CD57-CD3+ T 세포의 집단을 생성하는 단계이거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD3+ T 세포는 개별적으로 유전자 조작되거나 또는 하나 이상의 유전자 조작 단계 전에 결합된다. 특정 구현예에서, 상기 CD57-CD4+ T 세포 및 CD57-CD8+ T 세포는 자극 시약, 예를 들어 항-CD3 및 항-CD28 항체 콘쥬게이트된 상자성 비으의 존재하에 배양된다. 특정 구현예에서, 상기 자극 시약은 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계 전에 상기 T 세포를 자극하는 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머 입자이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 자극된 CD57-CD3+ T 세포는 상기 이종 폴리뉴클레오티드를 운반하는 바이러스, 예를 들어 상기 바이러스의 존재하에 스피노큘레이션 및/또는 인큐베이션을 포함하는 단게에 의해서, 형질전환되어 예를 들어 형질전환된 CD57-CD3+ T 세포를 생성한다.
일부 구현예에서, 상기 형질전환된 T 세포는 사이토카인 예를 들어 IL-2, IL-7, 또는 IL-15의 존재하에서 형질전환된 T 세포의 증식 또는 증폭을 촉진하는 조건하에서 배양된다. 일부 측면에서, 상기 세포는 세포가 적어도 3-배, 4-배, 또는 5-배의 발현을 성취할 때까지 배양된다.
특정 구현예에서, 상기 증폭된 세포는 예를 들어 동결 방지 및 저장을 위해, 또는 세포 요법제로서 대상체에 투여하기 위해 제형화되도록 수집된다. 특정 구현예에서, 상기 형질전환된 세포는 수집 또는 수확된다.
특정 구현예에서, 상기 제공된 방법은 세포 요법제에 사용하기 적합한 조작된 T 세포의 산출 조성물을 성공적으로 생성 또는 생산하는 것과 관련하여 사용된다. 일부 구현예에서, 산출 조성물은 상기 조성물의 세포가 배양동안 상기 임계 세포수, 밀도, 및/또는 증폭을 성취하는 경우 성공적으로 생성된다. 특정 구현예에서, 상기 제공된 방법은 예를 들어 농축된 T 세포의 초기 집단 또는 생물학적 샘플로부터 세포 요법제에 적합한 T 세포의 집단을 성공적으로 생성 또는 생산할 수 있는, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 확률 또는 가능성을 갖는다.
특정 구현예에서, 세포 요법제에 사용하기 위한 상기 제공된 방법으로부터 생성된 농축된 T 세포의 집단은 활성이고 증폭하고/하거나, 대상체에 투여될 때 생체내에서 활성화 및 증폭될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 생체내 효능, 활성, 및/또는 증폭을 나타내거나 또는 그와 관련된 특징 및/또는 특성을 나타낸다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 특징 또는 특성은 생체내에서 대상체에 투여후 활성화, 증식, 및/또는 증폭과 관련되는 단백질, 예를 들어 표면 단백질의 발현을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 예를 들어 세포 요법제에 사용하기 위해서 상기 제공된 방법에 의해서 생성 또는 생산되는 농축된 T 세포의 집단은 대안의 및/또는 예시적 방법(예를 들어 높은 빈도의 CD57+ T 세포를 함유하는 T 세포의 집단을 자극, 조작 및/또는 배양하는 방법)에 의해서 생성 또는 생산되는 세포보다 높은 CD25의 발현을 갖는다. 일부 구현예에서, 대안의 및/또는 예시적 방법에 의해서 생성 또는 생산되는 T 세포보다 높은 CD25의 발현을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 제공된 방법에 의해서 생성된 집단의 T 세포의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 100%는 CD25 염색에 대해 양성이고, 예를 들어 검출가능한 양의 CD25를 발현한다. 특정 구현예에서, 상기 산출 조성물은 상기 대안의 및/또는 예시적 방법에 의해서 생성 또는 생산되는 세포의 조성물보다 높은 빈도의 CD25에 대해 양성인 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 집단의 세포는 예를 들어 상기 대안의 및/또는 예시적 방법에 의해서 생성 또는 생산되는 세포와 비교하여 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 1-배, 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 또는 적어도 5-배 많은 CD25를 발현한다.
특정 구현예에서, 예를 들어 세포 요법제에 사용하기 위해서 상기 제공된 방법에 의해서 생성 또는 생산되는 농축된 T 세포의 집단은 대안의 및/또는 예시적 방법(예를 들어 높은 빈도의 CD57+ T 세포를 함유하는 T 세포의 집단을 자극, 조작 및/또는 배양하는 방법)에 의해서 생성 또는 생산되는 세포보다 높은 CD27의 발현을 갖는다. 특정 구현예에서, 대안의 및/또는 예시적 방법에 의해서 생성 또는 생산되는 T 세포보다 높은 CD27의 발현을 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 제공된 방법에 의해서 생성된 집단의 T 세포의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 100%는 CD27 염색에 대해 양성이고, 예를 들어 검출가능한 양의 CD27을 발현한다. 특정 구현예에서, 상기 산출 조성물은 상기 대안의 및/또는 예시적 방법에 의해서 생성 또는 생산되는 세포의 조성물보다 높은 빈도의 CD27에 대해 양성인 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 집단의 세포는 예를 들어 상기 대안의 및/또는 예시적 방법에 의해서 생성 또는 생산되는 세포와 비교하여 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 1-배, 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 또는 적어도 5-배 많은 CD27을 발현한다.
특정 구현예에서, 예를 들어 세포 요법제에 사용하기 위해서 상기 제공된 방법에 의해서 생성 또는 생산되는 농축된 T 세포의 집단은 대안의 및/또는 예시적 방법(예를 들어 높은 빈도의 CD57+ T 세포를 함유하는 T 세포의 집단을 자극, 조작 및/또는 배양하는 방법)에 의해서 생성 또는 생산되는 세포보다 높은 CD28의 발현을 갖는다. 일부 구현예에서, 대안의 및/또는 예시적 방법에 의해서 생성 또는 생산되는 T 세포보다 높은 CD28의 발현을 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 제공된 방법에 의해서 생성된 집단의 T 세포의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 100%는 CD28 염색에 대해 양성이고, 예를 들어 검출가능한 양의 CD28을 발현한다. 특정 구현예에서, 상기 산출 조성물은 상기 대안의 및/또는 예시적 방법에 의해서 생성 또는 생산되는 세포의 조성물보다 높은 빈도의 CD28에 대해 양성인 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 집단의 세포는 예를 들어 상기 대안의 및/또는 예시적 방법에 의해서 생성 또는 생산되는 세포와 비교하여 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 1-배, 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 또는 적어도 5-배 많은 CD28을 발현한다.
특정 구현예에서, 상기 제공된 방법은 세포 요법제에 사용하기 적합한 조작된 T 세포의 조성물을 성공적으로 생성 또는 생산하는 것과 관련하여 사용된다. 일부 구현예에서, 조성물은 상기 조성물의 세포가 배양동안 표적 세포수, 밀도, 및/또는 증폭을 성취하는 경우 성공적으로 생성된다.
특정 구현예에서, 상기 제공된 방법은 세포 요법제에 적합한 농축된 T 세포의 집단을 성공적으로 생성 또는 생산할 수 있는, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 확률 또는 가능성을 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 확률 또는 가능성은 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 또는 92% 내지 94%이다. 특정 구현예에서, 상기 제공된 방법은 농축된 CD57- T 세포의 샘플 또는 집단의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%로부터 세포 요법제에 적합한 농축된 T 세포의 집단을 성공적으로 생성 또는 생산한다.
특정 구현예에서, 자극의 개시에서 세포의 수집, 수확 또는 제형화까지 조작된 세포를 생성하기 위한 제공된 공정의 전체 지속 기간은 (약) 36 시간, 42 시간, 48 시간, 54 시간, 60 시간, 72 시간, 84 시간, 96 시간, 108 시간 또는 120 시간 또는 36 시간, 42 시간, 48 시간, 54 시간, 60 시간, 72 시간, 84 시간, 96 시간, 108 시간 또는 120 시간 미만이다. 특정 구현예에서, 자극의 개시에서 세포의 수집, 수확 또는 제형화까지 조작된 세포를 생성하기 위한 제공된 공정의 전체 지속 기간은 (약) 1.5 일, 2 일, 3 일, 4 일 또는 5 일 또는 1.5 일, 2 일, 3 일, 4 일 또는 5 일 미만이다. 일부 구현예에서, 자극의 개시에서 세포의 수집, 수확 또는 제형화까지 조작된 세포를 생성하기 위한 제공된 공정의 전체 지속 기간은 (약) 36 시간 내지 120 시간, 48 시간 내지 96 시간 또는 48 시간 내지 72 시간(수치 포함) 또는 (약) 1.5 일 내지 5 일, 2 일 내지 4 일 또는 2 일 내지 3 일(수치 포함)이다. 특정 구현예에서, 인큐베이션의 개시에서 세포의 수확, 수집 또는 제형화까지 측정된 바와 같이 제공된 공정를 완료하기까지의 시간량은 (약) 48 시간, 72 시간 또는 96 시간 또는 48 시간, 72 시간 또는 96 시간 미만 또는 (약) 2 일, 3 일 또는 4 일 또는 2 일, 3 일 또는 4 일 미만이다. 특정 구현예에서, 인큐베이션의 개시에서 세포의 수확, 수집 또는 제형화까지 측정된 바와 같이 제공된 공정를 완료하기까지의 시간량은 48 시간±6 시간, 72 시간±6 시간 또는 96 시간±6 시간이다.
일부 구현예에서, 인큐베이션은, 자극의 개시 후 (약) 24 시간 내지 120 시간, 36 시간 내지 108 시간, 48 시간 내지 96 시간 또는 48 시간 내지 72 시간(수치 포함)에 완료된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 자극의 개시로부터 (약) 120 시간, 108 시간, 96 시간, 72 시간, 48 시간 또는 36 시간 또는 120 시간, 108 시간, 96 시간, 72 시간, 48 시간 또는 36 시간 이내에 완료된다. 특정 구현예에서, 인큐베이션은 24 시간±6 시간, 48 시간±6 시간 또는 72 시간±6 시간 후에 완료된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은, 자극의 개시 후 (약) 1 일 내지 5 일, 1.5 일 내지 4.5 일, 2 일 내지 4 일 또는 2 일 내지 3 일(수치 포함)에 완료된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 자극의 개시로부터 (약) 5 일, 4 일, 3 일, 2 일 또는 1.5 일 또는 5 일, 4 일, 3 일, 2 일 또는 1.5 일 이내에 완료된다.
일부 구현예에서, 전체 공정는 농축된 T 세포, 예를 들어 CD4+ 및 CD8+ T 세포 또는 CD3+ 세포의 단일 집단으로 수행된다. 특정 구현예에서, 공정는 농축된 T 세포의 단일 산출 집단을 생성 또는 생산하기 위한 공정 전 및/또는 중에 결합된 2개 이상의 농축된 T 세포(예를 들어 CD4 및 CD8 세포)의 입력 집단으로 수행된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포는, 조작된 T 세포, 예를 들어 재조합 수용체를 발현하도록 형질도입된 T 세포이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 산출 집단, 예를 들어 조작된 T 세포 집단은, (i) (약) 18 내지 30 시간(수치 포함) 동안 자극 조건 하에서 T 세포 함유 또는 T 세포 입력 집단을 인큐베이션하고, (ii) 자극 집단의 T 세포로 재조합 수용체를 암호화하는 이종 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 도입시키고, (iii) 세포를 인큐베이션하고, 이어서 (iv) 인큐베이션된 세포를 수집 또는 수확함으로써 생성된다.
일부 구현예에서, 세포는, 자극 조건 하에서 인큐베이션이 개시된 후 36 내지 108 시간 또는 1.5 일 내지 4.5 일 이내에 수확 또는 수집된다. 특정 구현예에서, 세포는, 형질전환(예를 들어 유전자 조작, 형질도입 또는 형질감염)된 T 세포가 24-48 시간 또는 1 일 내지 2 일의 시간 내에 20% 이상 증가 또는 감소하지 않는 게놈 당 안정적인 통합 벡터 카피 수(iVCN)를 달성한 후 48 시간 또는 2 일 내에 수집 또는 수확된다. 일부 구현예에서, 세포 집단의 측정된 iVCN이 집단에서 측정된 총 벡터 카피 수(VCN)의 (약) 20%, 15%, 10% 또는 5% 이내인 경우 통합이 안정적인 것으로 간주된다. 특정 구현예는, 안정적인 통합을 달성하기 위해 바이러스 벡터가 세포와 접촉 또는 도입된 후, 세포가 (약) 48 시간, 60 시간 또는 72 시간 또는 1 일, 2 일 또는 3 일 또는 48 시간, 60 시간 또는 72 시간 또는 1 일, 2 일 또는 3 일 이상 동안 인큐베이션되어야 함을 고려한다. 일부 구현예에서, 안정적인 통합은 인큐베이션의 (약) 72 시간 내에 발생한다. 일부 구현예에서, 형질전환된 T 세포의 총 수가 입력 집단 세포의 총 수이거나 또는 미만인 경우 세포는 수집 또는 수확된다. 다양한 구현예에서, 세포는, 입력 집단의 세포가 3, 2 또는 1 배 이상 배가되기 전의 시기에 수집 또는 수확된다.
특정 구현예에서, 산출 집단, 예를 들어 조작된 T 세포 집단은, (i) 자극 시약, 예를 들어 본원에 기재된 자극 시약의 존재 하에 18 내지 30 시간(수치 포함) 동안 자극 조건 하에서 T 세포를 포함하는 입력 집단을 인큐베이션하고, (ii) 예를 들어 바이러스 벡터의 존재 하에 자극된 T 세포를 회전 접종함으로써 재조합 수용체를 암호화하는 바이러스 벡터로 자극된 T 세포를 형질도입시키고, (iii) 18 시간 내지 96 시간(수치 포함) 동안 정적 조건 하에서 형질도입된 T 세포를 인큐베이션하고, (iv) 자극 조건 하에서 인큐베이션이 개시된 후 (약) 36 시간 내지 108 시간 내에 형질전환된 집단의 T 세포를 수확함으로써 생성된다.
일부 구현예에서, 제공된 방법과 관련된 공정는 대안적인 공정와 비교된다. 예를 들어 일부 구현예에서, 여기 제공된 방법은 세포를 증폭하는 단계를 함유하는 대안적인 공정와 비교된다. 특정 구현예에서, 대안적인 공정는 하나 이상의 특정 측면에서 상이할 수 있으나, 그렇지 않으면 제공된 방법과 관련된 공정와 동일한 특징, 측면, 단계, 시기, 시약 또는 조건을 함유한다. 일부 구현예에서, 대안적인 공정는 제공된 방법과 관련된 공정와 유사, 예를 들어 증폭을 포함하지 않거나 결여되나, 상이한 시약 및/또는 배지 제형; 인큐베이션, 형질도입, 형질감염 및/또는 배양 중 혈청의 존재; 입력 집단의 상이한 세포 조성, 예를 들어 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비율; 상이한 자극 조건 및/또는 상이한 자극 시약; 자극 시약 대 세포의 상이한 비율; 상이한 벡터 및/또는 형질도입 방법; 세포의 인큐베이션, 형질도입 및/또는 형질감염을 위한 상이한 시기 또는 순서; 형질도입 또는 인큐베이션 중 존재하는 하나 이상의 재조합 사이토카인의 부재 또는 차이(예를 들어 상이한 사이토카인 또는 상이한 농도) 또는 세포의 수확 또는 수집을 위한 상이한 시기; 중 하나 이상을 포함하나 이에 국한되지 않는 방식으로 상이하다.
일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서 입력 세포(예를 들어 CD4+ 또는 CD8+ T 세포)의 단리, 농축 및/또는 선택에서 산출 세포가 수집, 제형화 및/또는 동결 방지되는 시기까지 측정된 바와 같은 제공된 공정를 완료하기까지 필요한 시간의 양 또는 지속 기간은 (약) 48 시간, 72 시간, 96 시간, 120 시간, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 7 일 또는 10 일 또는 48 시간, 72 시간, 96 시간, 120 시간, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 7 일 또는 10 일 미만이다. 일부 구현예에서, 단리, 선택 또는 농축된 세포는 자극 전에 동결 방지되지 않고, 입력 세포의 단리, 농축 및/또는 선택에서 산출 세포가 수집, 제형화 및/또는 동결 방지되는 시기까지 측정된 바와 같은 제공된 공정를 완료하기까지 필요한 시간의 양 또는 지속 기간은 (약) 48 시간, 72 시간, 96 시간 또는 120 시간 또는 2 일, 3 일, 4 일 또는 5 일 또는 48 시간, 72 시간, 96 시간 또는 120 시간 또는 2 일, 3 일, 4 일 또는 5 일 미만이다.
특정 구현예에서, 제공된 공정는 생물학적 샘플에서 단리, 농축 또는 선택된 세포, 예를 들어 CD4+ 및 CD8+ T 세포 또는 CD3+ 세포의 집단에서 수행된다. 일부 측면에서, 제공된 방법은, 생물학적 샘플이 다른 방법 또는 공정에 비해 짧은 시간량 내에 대상체에서 수집된 경우 조작된 T 세포 조성물을 생산하거나 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은, 조작된 T 세포가 수집, 수확 또는 제형화(예를 들어 동결 보존 또는 투여를 위해)된 경우에 대해 생물학적 샘플이 대상체에서 수집된 때로부터 생물학적 샘플 또는 농축, 단리 또는 선택된 세포가, (약) 10 일, 9 일, 8 일, 7 일, 6 일, 5 일, 4 일, 3 일 또는 2 일 이내 또는 (약) 120 시간, 96 시간, 72 시간 또는 48 시간 이내에 자극 또는 형질도입을 위한 단계 전에 동결 보존 및 보관된 임의의 또는 모든 시간을 포함하여 조작된 T 세포를 생산하거나 생성할 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 방법은, 조작된 T 세포가 수집, 수확 또는 제형화된 경우에 대해 생물학적 샘플이 대상체에서 수집된 때로부터 생물학적 샘플 또는 농축, 단리 또는 선택된 세포가, (약) 6 일 내지 8 일(수치 포함) 이내에 자극 또는 형질도입을 위한 단계 전에 동결 보존 및 보관된 임의의 또는 모든 시간을 포함하여 조작된 T 세포를 생산하거나 생성할 수 있다.
IV. 재조합 단백질을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드
일부 구현예에서, 제공된 방법은 CD-57 세포에 대해 농축된 집단의 세포로 이종 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 이종 폴리뉴클레오티드는 재조합 단백질을 암호화한다. 상기 재조합 단백질은 재조합 수용체, 예를 들어 섹션 III.A에 기술된 것을 포함할 수 있다. 세포로 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 이종 또는 재조합 폴리뉴클레오티드의 도입은, 공지된 다수의 임의의 벡터를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 벡터는 렌티바이러스 및 감마레트로바이러스 시스템을 포함한 바이러스 시스템을 포함한다. 예시적인 방법은 바이러스, 예를 들어 레트로바이러스 또는 렌티바이러스를 통한, 형질도입을 포함하여 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드의 전달을 위한 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 자극된 세포 집단은, 재조합 수용체를 암호화하는 이종 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것과 같이 유전자 조작되고, 이로써 형질전환된 세포 집단(여기서 형질전환된 집단의 세포로도 지칭)을 생성한다.
특정 구현예에서, 재조합 단백질, 예를 들어 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 세포에 도입된다. 특정 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 상기 세포에 이종이다. 특정 구현예에서, 상기 이종 폴리뉴클레오티드는 세포에 네이티브하지 않다. 특정 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 단백질, 예를 들어 상기 세포에 의해서 네이티브하게 발현되지 않는 재조합 단백질을 암호화한다. 특정 구현예에서, 상기 이종 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드는 상기 접촉 또는 도입 전에 상기 세포에서 발견되지 않는 핵산 서열이거나 또는 그를 함유한다.
특정 구현예에서, 상기 이종 폴리뉴클레오티드는 재조합 단백질을 암호화한다. 특정 구현예에서, 상기 재조합 단백질은 재조합 수용체이다. 일부 구현예에서, 상기 재조합 단백질은 재조합 항원 수용체, 예를 들어 재조합 TCR 또는 키메라 항원 수용체(CAR)이다.
A. 재조합 수용체
일부 구현예에서, 조작된 세포, 예를 들어 하나 이상의 재조합 수용체(들)을 발현하거나 또는 발현하도록 조작된 CD57- T 세포가 제공된다. 수용체 중에는 항원 수용체 및 이의 하나 이상의 성분을 함유하는 수용체가 있다. 재조합 수용체는 키메라 수용체, 예를 들어 리간드-결합 도메인 또는 이의 결합 단편 및 세포 내 신호 전달 도메인 또는 영역, 작용성 비-TCR 항원 수용체, 키메라 항원 수용체(CAR), T 세포수용체(TCRs), 예를 들어 재조합 또는 트랜스제닉 TCRs , 키메라 자가항체 수용체(CAAR) 및 상기의 임의의 성분를 포함할 수 있다. CAR과 같은 재조합 수용체는 일반적으로 일부 측면에서 링커 및/또는 트랜스멤브레인 도메인(들)을 통해 하나 이상의 세포 내 신호 전달 성분에 연결된 세포 외 항원(또는 리간드) 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 세포는 상이한 성분들, 도메인들 또는 영역들을 함유하는 둘 이상의 수용체를 발현시킨다. 일부 측면에서, 둘 이상의 수용체들은 재조합 수용체들의 특이성, 활성, 항원(또는 리간드) 결합, 기능 및/또는 발현의 공간적 또는 시간적 규제(regulation) 또는 제어를 허용한다.
1. 키메라 항원 수용체
제공된 방법 및 용도의 일부 구현예에서, 키메라 수용체, 예를 들어 키메라 항원 수용체는 상기 조작된 세포, 예를 들어 T 세포는, 세포내 신호 도메인으로 원하는 항원(예를 들어 종양 항원)에 대한 특이성을 제공하는 리간드-결합 도메인(예를 들어 항체 또는 항체 단편)을 조합하는 하나 이상의 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 도메인은 1차 활성화 신호 또는 1차 신호를 제공하는 T 세포 자극 또는 활성화 도메인과 같은 자극 또는 활성화 세포내 도메인 부분이다. 일부 구현예에서, 상기 세포내 신호 도메인은 효과기 기능을 용이하게 하기 위해 공자극 신호 도메인을 함유하거나 추가로 함유한다. 일부 구현예에서, 면역 세포 내로 유전자 조작될 때 키메라 수용체는 T 세포 활성을 조절할 수 있고, 일부 경우에, T 세포 분화 또는 항상성을 조절할 수 있어, 입양 세포 치료 방법에 사용하기 위한 것과 같은, in vivo 향상된 장수, 생존 및/또는 지속성을 가진 유전자 조작된 세포를 초래한다.
CAR를 포함하는 예시적인 항원 수용체 및 그러한 수용체를 세포 내로 조작 및 도입하기 위한 방법은 예를 들어 국제공개공보 제WO2000/14257호, 제WO2013/126726호, 제WO2012/129514호, 제WO2014/031687호, 제WO2013/166321호, 제WO2013/071154호, 제WO2013/123061호, 미국출원공개공보 US2002/131960, US2013/287748, US2013/0149337, 미국특허 번호 US6,451,995, US7,446,190, US8,252,592, US8,339,645, US8,398,282, US7,446,179, US6,410,319, US7,070,995, US7,265,209, US7,354,762, US7,446,191, US8,324,353, US8,479,118, 및 유럽 특허 출원 번호 EP2537416에서 서술된 것 및/또는 Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75에서 서술된 것을 포함한다. 일부 측면에서, 항원 수용체는 미국특허 번호 7,446,19에서 서술된 바와 같은 CAR, 및 국제공개공보 제WO2014055668 A1호에서 서술된 것을 포함한다. CAR의 예시는 상기 언급된 출판물, 제WO2014/031687호, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, 미국특허 번호 US7,446,190, 미국특허 번호 US78,389,282, Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; 및 Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177)와 같은, 하나에서 서술된 바와 같은 CAR를 포함한다. WO2014/031687, US8,339,645, US 7,446,179, US2013/0149337, 미국특허 번호 US7,446,190, 및 미국특허 번호 US8,389,282, WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US2013/0149337, 미국특허 번호 US7,446,190, 및 미국특허 번호 US8,389,282을 역시 참고한다.
상기 키메라 수용체, 예를 들어 CAR은, 일반적으로 세포외 항원 결합 도메인, 예를 들어 항체 분자의 일부, 일반적으로는 상기 항체의 가변 중쇄 (VH) 영역 및/또는 가변 경쇄 (VL) 영역, 예를 들어 scFv 항체 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화된 항원은 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 탄수화물 또는 다른 분자이다. 일부 구현예에서, 항원은 정상 또는 비-표적화 세포 또는 조직과 비교하여 질환 또는 병태의 세포, 예를 들어 종양 또는 병원성 세포에서 선택적으로 발현되거나 과발현된다. 다른 구현예에서, 항원은 정상 세포에서 발현되고 및/또는 조작된 세포에서 발현된다.
일부 구현예에서, 상기 수용체에 의해서 표적화된 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 인테그린), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산탈수효소 9(CA9, 또한 CAIX 또는 G250로 공지됨), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, 또한 NY-ESO-1 및 LAGE-2로 공지됨), 암태아성 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4(CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), III형 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백 2 (EPG-2), 상피 당단백 40(EPG-40), 에프린 B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5, 또한 Fc 수용체 유사 5 또는 FCRH5로 공지됨), 태아성 아세틸콜린 수용체(태아성 AchR), 폴레이트 결합 단백질(FBP), 폴레이트 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화된 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 결합 수용체 5D(GPRC5D), Her2/neu (수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량-멜라노마-연관 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나아제 삽입 도메인 수용체 (kdr), 카파 경쇄, L1 세포 접착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 리치 반복 함유 8 패밀리 멤버 A(LRRC8A), 루이스 Y, 멜라노마-연관 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 그룹 2 구성원 D(NKG2D) 리간드, 멜란 A (MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 온코페탈 항원, 멜라노마의 우선 발현된 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 서바이빈, 세포영양막 당단백(TPBG, 또한 5T4로 공지됨), 종양-연관 당단백 72(TAG72), 티로시나아제 연관 단백질 1(TRP1, 또한 TYRP1또는 gp75로 공지됨), 티로시나아제 연관 단백질 2(TRP2, 또한 도파크롬 토토머라아제, 도파크롬 델타-이소머라아제 또는 DCT로 공지됨), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2), 윌름스 종양 1(WT- 1), 병원체-특이적 또는 병원체-발현 항원, 또는 유니버설 태그로 연관된 항원, 및/또는 비오틴화 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현되는 분자이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서 수용체에 의해 표적화된 항원은 다수의 공지된 B 세포 마커의 하나와 같은 B 세포 악성 종양과 연관된 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b 또는 CD30이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 항원은 병원체-특이적 또는 병원체-발현된 항원이거나 또는 그를 포함한다. 상기 항원은 바이러스성 항원(예를 들어 HIV, HCV, HBV 등으로부터의 바이러스성 항원), 박테리아성 항원, 및/또는 기생성 항원이다.
일부 구현예에서, 항원 또는 항원 결합 도메인은 CD19이다. 일부 구현예에서, scFv는 CD19에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유래된 VH 및 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, CD19에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 FMC63 및 SJ25C1과 같은 마우스 유래 항체이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 예를 들어 미국특허 공개 번호 US2016/0152723에 서술된 바와 같은, 인간 항체이다.
일부 구현예에서, scFv는 FMC63으로부터 유래된다. FMC63은 일반적으로 인간 기원의 CD19를 발현하는 Nalm-1 및 -16 세포에 대해 생성된 마우스 단일클론 IgG1 항체를 가리킨다(Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typeing III. 302). 일부 구현예에서, FMC63 항체는 각각 서열 번호 38 및 39에 제시된 CDR H1 및 H2, 및 서열 번호 40 또는 54에 제시된 CDR H3 및 서열 번호 35에 제시된 CDR L1 및 서열 번호 36 또는 55에 제시된 CDR L2 및 서열 번호 37 또는 56에 제시된 CDR L3를 포함한다. 일부 구현예에서, FMC63 항체는 서열 번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, scFv는 서열 번호 35의 CDRL1 서열, 서열 번호 36의 CDRL2 서열, 및 서열 번호 37의 CDRL3 서열을 함유하는 가변 경쇄 및/또는 서열 번호 38의 CDRH1 서열, 서열 번호 39의 CDRH2 서열 및 서열 번호 40의 CDRH3 서열을 함유하는 가변 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호 41에 제시된 가변 중쇄 영역 및 서열 번호 42에 제시된 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 링커에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 서열 번호 58에 제시되어 있다. 일부 구현예에서, scFv는 VH, 링커 및 VL을 순서대로 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 VL, 링커 및 VH를 순서대로 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호 43에 제시된 뉴클레오티드의 서열 또는 서열 번호 43과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호 43에 제시된 아미노산의 서열 또는 서열 번호 43과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, scFv는 SJ25C1로부터 유래된다. SJ25C1은 인간 기원의 CD19를 발현하는 Nalm-1 및 -16 세포에 대해 생성된 마우스 단일 클론 IgG1 항체이다 (Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typeing III. 302). 일부 구현예에서, SJ25C1 항체는 CDRH1, 각각 서열 번호 47-49에 제시된 H2 및 H3, 및 CDRL1, 각각 서열 번호 44-46에 제시된 L2 및 L3를 포함한다. 일부 구현예에서, SJ25C1 항체는 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, scFv는 서열 번호 44의 CDRL1 서열, 서열 번호 45의 CDRL2 서열, 및 서열 번호 46의 CDRL3 서열을 함유하는 가변 경쇄 및/또는 서열 번호 47의 CDRH1 서열, 서열 번호 48의 CDRH2 서열, 및 서열 번호 49의 CDRH3 서열을 함유하는 가변 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호 50에 제시된 가변 중쇄 영역 및 서열 번호 51에 제시된 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 링커에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 서열 번호 52에 제시되어 있다. 일부 구현예에서, scFv는 VH, 링커 및 VL을 순서대로 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 VL, 링커 및 VH를 순서대로 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호 53에 제시된 아미노산의 서열 또는 서열 번호 53과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 키메릭 항원 수용체는 항체 또는 항체 단편을 함유하는 세포외 부분을 포함한다. 일부 측면에서, 키메라 항원 수용체는 항체 또는 단편을 함유하는 세포외 부분 및 세포내 신호 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 단편은 scFv를 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체, 예를 들어 CAR의 항체 부분은 힌지 영역, 예를 들어 IgG4 힌지 영역, 및/또는 CH1/CL 및/또는 Fc 영역과 같은 면역글로불린 불변 영역의 적어도 부분을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 불변 영역 또는 부분은 IgG4 또는 IgG1와 같은, 인간 IgG의 것이다. 일부 측면에서, 불변 영역의 일부는 항원-인식 성분, 예를 들어 scFv, 및 막 관통 도메인 사이의 스페이서 영역으로서 작용한다. 스페이서는 스페이서가 없을 때와 비교하여, 항원 결합 후 세포의 반응성을 증가시키는 길이를 가질 수 있다. 예시적인 스페이서는 Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153, 국제 특허 출원 공개 WO2014031687, U.S. 특허 번호 8,822,647 또는 공개된 출원 번호 US2014/0271635에 서술된 것들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 불변 영역 또는 부분은 IgG4 또는 IgG1와 같은, 인간 IgG의 것이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 ESKYGPPCPPCP(서열 번호 1에 제시됨)를 가지고, 서열 번호 2에 제시된 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호 3에 제시된 서열을 가진다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호 4에 제시된 서열을 가진다. 일부 구현예에서, 불변 영역 또는 부분은 IgD의 것이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호 5에 제시된 서열을 가진다. 일부 구현예에서, 스페이서는 임의의 서열 번호 1, 3, 4 또는 5와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 가진다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호 27-34에 제시된 서열을 가진다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호 27-34와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 가진다.
일부 구현예에서, 항원 수용체는 세포외 도메인에 직접 또는 간접적으로 연결된 세포내 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메릭 항원 수용체는 세포외 도메인 및 세포내 신호 도메인을 연결하는 막 관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 도메인은 ITAM을 포함한다. 예를 들어 일부 측면에서, 항원 인식 도메인(예를 들어 세포외 도메인)은 CAR, 및/또는 다른 세포 표면 수용체를 통한 신호의 경우에, TCR 복합체와 같은, 항원 수용체 복합체를 통해 활성화를 모방하는 신호 성분과 같은, 하나 이상의 세포내 신호 성분에 일반적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 키메릭 수용체는 세포외 도메인 (예를 들어 scFv)과 세포내 신호 도메인 사이에 연결되거나 융합된 막 관통 도메인을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 항원-결합 성분(예를 들어 항체)은 하나 이상의 막 관통 및 세포내 신호 도메인에 연결된다.
일 구현예에서, 수용체, 예를 들어 CAR에서 도메인 중 하나와 자연적으로 연관되는 막 관통 도메인이 사용된다. 일부 경우에, 막 관통 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호 작용을 최소화하기 위해 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막 관통 도메인에 그러한 도메인의 결합을 피하기 위해 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형된다.
일부 구현예에서 막 관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 각각 유래된다. 공급원이 천연인 경우, 일부 측면에서 도메인은 임의의 막-결합 또는 막 관통 단백질로부터 유래된다. 막 관통 영역은 T-세포수용체, CD28, CD3 입실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22의 알파, 베타 또는 제타 사슬(즉, 적어도 이의 막 관통 영역을 포함함)로부터 유래된 것들을 포함한다. 일부 측면에서, 합성 막 관통 도메인은 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함한다. 일부 측면에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플렛은 합성 막 관통 도메인의 각각의 말단에서 발견될 것이다. 일부 구현예에서, 연결은 링커, 스페이서 및/또는 막 관통 도메인(들)에 의한 것이다. 일부 측면에서, 막 관통 도메인은 CD28의 막 관통 부분을 함유한다.
일부 구현예에서, 세포외 도메인 및 막 관통 도메인은 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포외 도메인 및 막 관통은 본원에 서술된 바와 같은, 스페이서에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 수용체는 CD28 세포외 부분과 같은, 막 관통 도메인이 유래하는 분자의 세포외 부분을 함유한다.
세포내 신호 도메인 중에는 천연 항원 수용체를 통한 신호, 공자극 수용체와 조합된 그러한 수용체를 통한 신호, 및/또는 공자극 수용체 단독을 통한 신호가 모방되거나 근사되는 것들이 있다. 일부 구현예에서, 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커, 예를 들어 예를 들어 글라이신-세린 이중선, 글라이신 및 세린을 포함하는 것과 같은, 2개 및 10개 사이 아미노산 길이의 링커는 CAR의 막 관통 도메인 및 세포질 신호 도메인 사이 연결을 존재하고 형성한다.
T 세포 활성화는 2개 클래스의 세포질 신호 서열: TCR를 통해 항원-의존적 1차 활성화를 개시하는 것(1차 세포질 신호 서열), 및 항원-비의존적 방식으로 작용하여 2차 또는 공동-자극 신호를 제공하는 것(2차 세포질 신호 서열)에 의해 매개되는 바와 같이 서술되는 일부 측면에 있다. 일부 측면에서, CAR은 그러한 신호 성분의 하나 또는 둘 모두를 포함한다.
수용체, 예를 들어 CAR은 적어도 하나의 세포내 신호 성분 또는 성분들을 일반적으로 포함한다. 일부 측면에서, CAR은 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절하는 1차 세포질 신호 서열을 포함한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호 서열은 면역 수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 신호 모티프를 함유할 수 있다. 1차 세포질 신호 서열을 함유하는 ITAM의 예시는 CD3 제타 사슬, FcR 감마, CD3 감마, CD3 델타 및 CD3 입실론으로부터 유도된 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 내 세포질 신호 전달 분자(들)은 세포질 신호 도메인, 그의 부분, 또는 CD3 제타로부터 유래된 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, 수용체는 T- 세포 활성화 및 세포독성, 예를 들어 CD3 제타 사슬을 매개하는 TCR CD3 사슬과 같은, TCR 복합체의 세포내 성분을 포함한다. 따라서, 일부 측면에서, 항원-결합 부분은 하나 이상의 세포 신호 모듈에 연결된다. 일부 구현예에서, 세포 신호 모듈은 CD 막 관통 도메인, CD3 세포내 신호 도메인, 및/또는 다른 CD3 막 관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체, 예를 들어 CAR은 Fc 수용체 γ, CD8, CD4, CD25, 또는 CD16과 같은 하나 이상의 추가 분자의 일부를 추가로 포함한다. 예를 들어 일부 측면에서, CAR 또는 다른 키메릭 수용체는 CD3-제타(CD3-ζ) 또는 Fc 수용체 γ 및 CD8, CD4, CD25 또는 CD16 사이의 키메릭 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR 또는 다른 키메릭 수용체의 결찰시, 수용체의 세포질 도메인 또는 세포내 신호 도메인은 면역 세포, 예를 들어 CAR을 발현하도록 조작된 T 세포의 정상 효과기 기능 또는 반응 중 적어도 하나를 활성화시킨다. 예를 들어 일부 상황에서, CAR은 사이토카인 또는 다른 인자의 분비와 같은, 세포분해 활성 또는 T-헬퍼 활성과 같은 T 세포의 기능을 유도한다. 일부 구현예에서, 항원 수용체 성분 또는 공자극 분자의 세포내 신호 전달 도메인의 절단된 부분은, 예를 들어 그것이 효과기 기능 신호를 형질도입하는 경우, 온전한 면역자극 사슬 대신에 사용된다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 도메인 또는 도메인들은 T 세포수용체(TCR)의 세포질 서열을 포함하고, 일부 측면에서, 또한 자연 상황에서 항원 수용체 결합 후 신호 전달을 개시하기 위해 이러한 수용체와 협력하여 작용하는 공동- 수용체의 것들을 포함한다.
자연 TCR의 상황에서, 완전한 활성화는 일반적으로 TCR을 통한 신호뿐만 아니라 공자극 신호를 필요로 한다. 따라서, 일부 구현예에서, 또한, 완전한 활성화를 촉진하기 위해, 2차 또는 공동-자극 신호를 생성하기 위한 성분은 CAR에 포함된다. 다른 구현예에서, CAR은 공자극 신호를 생성하기 위한 성분을 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 추가 CAR은 동일한 세포에서 발현되고 2차 또는 공자극 신호를 생성하기 위한 성분을 제공한다.
일부 구현예에서, 키메릭 항원 수용체는 T 세포 공자극 분자의 세포내 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, CAR은 CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 및 ICOS와 같은, 공자극 수용체의 신호 도메인 및/또는 막 관통 부분을 포함한다. 일부 측면에서, 동일한 CAR은 활성화 및 보조자극 성분 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, 키메릭 항원 수용체는 막 관통 도메인 및 세포내 신호 도메인 사이와 같은, T 세포 공자극 분자 또는 그의 기능적 변이체로부터 유래된 세포내 도메인을 함유한다. 일부 측면에서, T 세포 공자극 분자는 CD28 또는 41BB이다.
일부 구현예에서, 활성화 도메인은 1개 CAR 내 포함되는 반면, 보조자극 성분은 다른 항원을 인식하는 다른 CAR에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, CAR은 동일한 세포상에서 모두 발현된 활성화 또는 자극 CAR, 동시자극 CAR을 포함한다(WO 2014/055668 참고). 일부 측면에서, 세포는 하나 이상의 자극 또는 활성화 CAR 및/또는 공자극 CAR을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 질환 또는 병태에와 관련 있는 및/또는 특이적인 것 이외의 항원을 인식하는 CAR과 같은, 억제성 CAR(iCARs, Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (December, 2013) 참고)을 추가로 포함하고, 이로 인해, 질환-표적 CAR를 통해 전달되는 활성화 신호는 억제성 CAR이 그의 리간드에 결합함으로써, 예를 들어 오프-표적 효과를 감소시키기 위해, 감소되거나 억제된다.
특정 구현예에서, 세포내 신호 도메인은 CD3(예를 들어 CD3-제타) 세포내 도메인에 연결된 CD28 막 관통 및 신호 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 도메인은 CD3 제타 세포내 도메인에 연결된, 키메릭 CD28 및 CD137(4-1BB, TNFRSF9) 공동-자극 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 세포질 부분에서 1개 이상, 예를 들어 2개 이상, 공자극 도메인 및 활성화 도메인, 예를 들어 1차 활성화 도메인을 포함한다. 예시적인 CAR은 CD3-제타, CD28, 및 4-1BB의 세포내 성분을 포함한다
일부 구현예에서, 항원 수용체는 마커를 추가로 포함하고 및/또는 CAR 또는 다른 항원 수용체를 발현하는 세포는 세포 표면 마커와 같은, 대용 마커를 추가로 포함하며, 이는 수용체를 발현하기 위해 세포의 형질도입 또는 조작을 확인하는데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 마커는 그러한 세포 표면 수용체(예를 들어 tEGFR)의 절단된 버전과 같은, CD34, NGFR, 또는 표피 성장 인자 수용체의 전부 또는 일부(예를 들어 절단된 형태)를 포함한다. 일부 구현예에서, 마커를 암호화하는 핵산은 절단가능한 링커 서열, 예를 들어 T2A와 같은 링커 서열을 암호화하는 폴리 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 예를 들어 마커 및 선택적인 링커 서열은 공개된 특허 출원 WO 2014031687에 개시된 바와 같은 것일 수 있다. 예를 들어 마커는 T2A 절단가능한 링커 서열과 같은, 링커 서열에 선택적으로 연결된, 절단된 EGFR(tEGFR)일 수 있다.
절단된 EGFR(예를 들어 tEGFR)에 대한 예시적인 폴리펩티드는 서열 번호 7 또는 16에 제시된 아미노산의 서열 또는 서열 번호 7 또는 16과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 포함한다. 예시적인 T2A 링커 서열은 서열 번호 6 또는 17에 제시된 아미노산의 서열 또는 서열 번호 6 또는 17과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 마커는 T 세포에서 자연적으로 발견되지 않거나 T 세포의 표면에서 자연적으로 발견되지 않는 분자, 예를 들어 세포 표면 단백질, 또는 그의 일부이다. 일부 구현예에서, 분자는 비-자기 분자, 예를 들어 비-자기 단백질, 즉, 세포가 입양될 숙주의 면역계에 의해 "자기"로 인식되지 않는 것이다.
일부 구현예에서, 마커는 치료 기능을 제공하지 않고 및/또는 유전적 조작을 위한, 예를 들어 성공적으로 조작된 세포를 선택하기 위한 마커로서 사용되는 것 외에 다른 효과를 생산하지 않는다. 다른 구현예에서, 마커는 치료적 분자 또는 입양 전달 및 리간드와의 접촉시 세포의 반응을 향상시키고 및/또는 약화시키기 위해 공자극 또는 면역 체크포인트 분자와 같은, 인비보에서 세포가 마주치는 리간드와 같은, 일부 원하는 효과를 달리 나타내는 분자일 수 있다.
일부 경우에, CAR은 1세대, 2세대 및/또는 3세대 CAR을 가리킨다. 일부 측면에서, 1세대 CAR은 항원 결합시 CD3-사슬 유도된 신호만을 제공하는 것이고; 일부 측면에서, 2세대 CAR은 CD28 또는 CD137과 같은 공자극 수용체로부터의 세포내 신호 도메인을 포함하는 것과 같은, 신호 및 공자극 신호를 제공하는 것이며; 일부 측면에서, 3세대 CAR은 상이한 공자극 수용체의 다중 공자극 도메인을 포함하는 것이다.
예를 들어 일부 구현예에서, CAR은 항체, 예를 들어 항체 단편, CD28 또는 그의 기능적 변이체의 막 관통 부분이거나 이를 함유하는 막 관통 도메인, 및 CD28 또는 그의 기능적 변이체의 신호 부분 및 CD3 제타 또는 그의 기능적 변이체의 신호 부분을 포함하는 세포내 신호 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, CAR은 항체, 예를 들어 항체 단편, CD28 또는 그의 기능적 변이체의 막 관통 부분이거나 이를 함유하는 막 관통 도메인, 및 4-1BB 또는 그의 기능적 변이체의 신호 부분 및 CD3 제타 또는 그의 기능적 변이체의 신호 부분을 포함하는 세포내 신호 도메인을 함유한다. 일부 그러한 구현예에서, 수용체는 힌지-전용 스페이서와 같은, Ig 힌지, 예를 들어 IgG4 힌지와 같은, 인간 Ig 분자와 같은, Ig 분자의 일부를 함유하는 스페이서를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체, 예를 들어 CAR의 막 관통 도메인은 서열 번호 8로 제시되는 아미노산 서열의 서열 또는 서열 번호 8과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 포함하는 막 관통 도메인과 같은, 인간 CD28(예를 들어 수탁번호 P01747.1) 또는 그의 변이체의 막 관통 도메인이거나 이를 포함하고; 일부 구현예에서, 재조합 수용체의 부분을 함유하는 막 관통-도메인은 서열 번호 9로 제시되는 아미노산 서열의 서열 또는 그와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체, 예를 들어 CAR의 세포내 신호 성분(들)은 네이티브 CD28 단백질의 위치 186-187에서 LL이 GG로 치환된 도메인과 같은, 인간 CD28의 세포내 공자극 신호 도메인 또는 또는 그의 기능적 변이체 또는 부분을 함유한다. 예를 들어 세포내 신호 도메인은 서열 번호 10 또는 11로 제시되는 아미노산의 서열 또는 서열 번호 10 또는 11과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포내 도메인은 서열 번호 12로 제시되는 아미노산의 서열 또는 서열 번호 12와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열과 같은, 4-1BB(예를 들어 수탁번호 Q07011.1) 또는 그의 변이체의 세포내 공자극 신호 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체, 예를 들어 CAR의 세포내 신호 도메인은 미국특허 번호 7,446,190 또는 미국특허 번호 8,911,993에 서술된 바와 같은 인간 CD3 ζ의 이소형 3의 112 AA 세포질 도메인(수탁 번호 P20963.2) 또는 CD3 제타 신호 도메인과 같은, 인간 CD 제타 자극 신호 도메인 또는 그의 기능적 변이체를 포함한다. 예를 들어 일부 구현예에서, 세포내 신호 도메인은 서열 번호 13, 14 또는 15로 제시되는 아미노산의 서열 또는 서열 번호 13, 14 또는 15와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 스페이서는 서열 번호 1에 제시된 힌지 전용 스페이서와 같은, IgG4 또는 IgG1의 힌지 전용과 같은, IgG의 힌지 영역만을 함유한다. 다른 구현예에서, 스페이서는 선택적으로 CH2 및/또는 CH3 도메인에 연결된, Ig 힌지, 예를 들어 IgG4- 유래 힌지이거나 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호 4에 제시된 바와 같은, CH2 및 CH3 도메인에 연결된, Ig 힌지, 예를 들어 IgG4 힌지이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호 3에 제시된 바와 같은, 오직 CH3 도메인에 연결된, Ig 힌지, 예를 들어 IgG4 힌지이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 글라이신-세린 리치 서열 또는 공지된 플렉서블 링커와 같은 다른 다른 플렉서블 링커이거나 이를 포함한다.
예를 들어 일부 구현예에서, CAR은 scFvs, 스페이서, 예를 들어 면역글로불린 분자의 일부를 함유하는 스페이서, 예를 들어 힌지 영역 및/또는 하나 이상의 중쇄 분자의 불변 영역, 예를 들어 Ig-힌지 함유 스페이서, CD28-유래 막 관통 도메인의 전부 또는 일부를 함유하는 막 관통 도메인, CD-28-유래 세포내 신호 도메인, 및 CD3 제타 신호도메인을 포함하는 항체 단편과 같은 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 scFv와 같은 항체 또는 단편, 임의의 Ig- 힌지 함유 스페이서와 같은 스페이서, CD28-유래 막 관통 도메인, 4-1BB-유래 세포내 신호 도메인, 및 CD3 제타-유래 신호 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 그러한 CAR 구조물을 암호화하는 핵산 분자는 T2A 리보솜 스킵 요소를 암호화하는 서열 및/또는 tEGFR 서열, 예를 들어 CAR을 암호화하는 서열의 다운스트림을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 서열은 서열 번호 6 또는 17에 제시된 T2A 리보솜 스킵 요소, 또는 서열 번호 6 또는 17과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 항원 수용체(예를 들어 CAR)를 발현하는 T 세포는 비-면역원성 선택 에피토프로서 (예를 들어 동일한 구조물로부터 2개 단백질을 발현하기 위한 T2A 리보솜 스위치에 의해 분리된 CAR 및 EGFRt을 암호화하는 구조의 도입에 의해) 절단된 EGFR(EGFRt)을 발현하기 위해 생성될 수 있고, 그런 다음 그러한 세포를 검출하기 위한 마커로서 사용될 수 있다(미국특허 번호 8,802,374 참고). 일부 구현예에서, 서열은 서열 번호 7 또는 16에 제시된 tEGFR 서열, 또는 서열 번호 7 또는 16과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 암호화한다. 일부 경우에, T2A와 같은 펩티드는 2A 요소의 C-말단에서 펩티드 결합의 스킵(리보솜 스킵) 합성을 위한 리보솜을 야기할 수 있고, 2A 서열의 말단 및 다음 펩티드 다운스트림 사이의 분리를 초래한다(예를 들어 de Felipe. Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004) 및 deFelipe et al. Traffic 5:616-626 (2004) 참고). 많은 2A 요소가 공지되어 있다. 본원에 개시된 방법 및 핵산에 사용될 수 있는 2A 서열의 예시는 미국특허 공개번호 20070116690에 서술된 바와 같이, 수족구 바이러스(F2A, 예를 들어 서열 번호 21), 말 비염 A 바이러스(E2A, 예를 들어 서열 번호 20), 토시 아시그나 바이러스(Thosea asigna virus)(T2A, 예를 들어 서열 번호 6 또는 17), 및 돼지 테스코바이러스-1(P2A, 예를 들어 서열 번호 18 또는 19)로부터 2A 서열이나, 이에 한정되지 않는다.
대상체에 투여된 세포에 의해 발현되는, CAR과 같은, 재조합 수용체는 치료되는 질환 또는 병태 또는 그의 세포에 발현된, 연관된 및/또는 특이적인 분자를 일반적으로 인식하거나 특이적으로 결합한다. 분자, 예를 들어 항원에 특이적으로 결합할 때, 수용체는 ITAM-형질도입된 신호와 같은, 면역자극 신호를 세포 내로 전달하여 질환 또는 병태를 표적하는 면역 반응을 촉진시킨다. 예를 들어 일부 구현예에서, 세포는 질환 또는 병태의 세포 또는 조직에 의해 발현되거나 질환 또는 병태와 관련된 항원에 특이적으로 결합하는 CAR을 발현한다.
2. T 세포수용체(TCR)
일부 구현예에서, 상기 제공된 방법, 용도, 제조 물품 또는 조성물과 관련하여 사용된 조작된 세포, 예를 들어 T 세포는 종양, 바이러스 또는 자가면역 단백질의 항원과 같은, 표적 폴리펩티드의 펩티드 에피토프 또는 T 세포 에피토프를 인식하는 T 세포수용체(TCR) 또는 그의 항원-결합 부분을 발현하는 T 세포와 같은, 조작된 세포이다.
일부 구현예에서, "T 세포수용체" 또는 "TCR"은 가변 α 및 β 사슬(각각, TCRα 및 TCRβ로 공지됨) 또는 가변 γ 및 δ 사슬(각각, TCRα 및 TCRβ로 공지됨), 또는 그의 항원-결합 부분을 함유하고, MHC 분자에 결합된 펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 분자이다. 일부 구현예에서, TCR은 αβ 형태로 있다. 전형적으로, αβ 및 γδ 형태로 존재하는 TCR은 일반적으로 구조적으로 유사하지만, 그들을 발현하는 T 세포는 별개 해부학적 위치 또는 기능을 가질 수 있다. TCR은 세포 표면 상에서 또는 가용성 형태로 발견될 수 있다. 일반적으로, TCR은 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 분자에 결합된 항원을 인식하는 것이 일반적인 T 세포(또는 T 림프구)의 표면에서 발견된다.
달리 언급되지 않는 한, 용어 "TCR"은 전체 TCR 뿐만 아니라 그의 항원-결합 부분 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, TCR은 αβ 형태 또는 γδ 형태에 있는 TCR을 포함하는, 온전한 또는 전장 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 전장 TCR 미만이지만 MHC-펩티드 복합체에 결합된 것과 같은, MHC 분자에 결합된 특정 펩티드에 결합된 항원-결합 부분이다. 일부 경우에, TCR의 항원-결합 부분 또는 단편은 전장 또는 온전한 TCR의 구조적 도메인의 일부만을 함유할 수 있지만, MHC-펩티드 복합체와 같은, 펩티드 에피토프에 결합하여 전체 TCR이 결합한다. 일부 경우에, 항원-결합 부분은 특정 MHC-펩티드 복합체에 결합하기 위한 결합 부위를 형성하기에 충분한, TCR의 가변 α 사슬 및 가변 β 사슬과 같은, TCR의 가변 도메인을 함유한다. 일반적으로, TCR의 가변 사슬은 펩티드, MHC 및/또는 MHC-펩티드 복합체의 인식에 관여하는 상보성 결정 영역을 함유한다.
일부 구현예에서, TCR의 가변 도메인은 초가변 루프, 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 함유하고, 이는 일반적으로 항원 인식 및 결합 능력 및 특이성에 대한 주요 기여자이다. 일부 구현예에서, TCR의 CDR 또는 그의 조합은 주어진 TCR 분자의 항원-결합 부위의 모두 또는 실질적으로 모두를 형성한다. TCR 사슬의 가변 영역 내에 다양한 CDR은 일반적으로 프레임 워크 영역(FR)에 의해 분리되고, 이는 일반적으로 CDR과 비교하여 TCR 분자 사이에서 덜 가변성을 나타낸다(예를 들어 Jores et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990; Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988; see also Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003 참고). 일부 구현예에서, CDR3은 항원 결합 또는 특이성을 담당하는 주요 CDR이거나, 항원 인식, 및/또는 펩티드-MHC 복합체의 가공된 펩티드 부분과의 상호 작용을 위해 주어진 TCR 가변 영역 상에 3개 CDR 중에서 가장 중요하다. 일부 상황에서, 알파 사슬의 CDR1은 특정 항원성 펩티드의 N-말단 부분과 상호 작용할 수 있다. 일부 상황에서, 베타 사슬의 CDR1은 펩티드의 C-말단 부분과 상호 작용할 수 있다. 일부 상황에서, CDR2는 MHC-펩티드 복합체의 MHC 부분과의 상호 작용 또는 인식에 가장 크게 기여하거나 이를 담당하는 1차 CDR이다. 일부 구현예에서, β-사슬의 가변 영역은 추가적인 초가변 영역(CDR4 또는 HVR4)을 함유할 수 있고, 이는 일반적으로 항원 인식이 아닌 초항원 결합에 관여한다(Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8:411-426).
일부 구현예에서, 또한, TCR은 불변 도메인, 막 관통 도메인 및/또는 짧은 세포질 테일을 함유할 수 있다(예를 들어 Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997 참고). 일부 측면에서, TCR의 각 사슬은 1개 N-말단 면역글로불린 가변 도메인, 1개 면역글로불린 불변 도메인, 막 관통 영역, 및 C-말단에서 짧은 세포질 테일을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 신호 전달의 매개에 관여하는 CD3 복합체의 불변 단백질과 관련된다.
일부 구현예에서, TCR 사슬은 하나 이상의 불변 도메인을 포함한다. 예를 들어 주어진 TCR 사슬의 세포외 부분(예를 들어 α-사슬 또는 β-사슬)은 세포 막에 인접한 가변 영역(예를 들어 Vα or Vβ; typically amino acids 1 to 116 based on Kabat numbering Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.) 및 불변 영역(예를 들어 α-chain constant domain or Cα, typically positions 117 to 259 of the chain based on Kabat numbering or β chain constant domain or Cβ, typically positions 117 to 295 of the chain based on Kabat)과 같은, 2개 면역글로불린-유사 도메인을 함유할 수 있다. 예를 들어 일부 경우에, 2개 사슬에 의해 형성된 TCR의 세포외 부분은 2개 막-근위 불변 도메인, 및 2개 막-원위 가변 도메인을 함유하고, 가변 도메인은 CDR을 각각 함유한다. TCR의 불변 도메인은 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하는 데에서 짧은 연결 서열을 함유할 수 있고, 이에 따라 TCR의 2개 사슬을 연결한다. 일부 구현예에서, TCR은 각각의 α 및 β 사슬에서 추가 시스테인 잔기를 가질 수 있어, TCR은 불변 도메인에서 2 개 이황화 결합을 함유한다.
일부 구현예에서, TCR 사슬은 막 관통 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 막 관통 도메인은 양으로 하전된다. 일부 경우에, TCR 사슬은 세포질 테일을 함유한다. 일부 경우에, 구조는 TCR이 CD3 및 그의 서브유닛과 같은 다른 분자와 결합되도록 한다. 예를 들어 막 관통 영역을 갖는 불변 도메인을 함유하는 TCR은 세포 막에서 단백질을 고정시키고 CD3 신호 장치 또는 복합체의 불변 서브유닛과 결합될 수 있다. CD3 신호 서브유닛(예를 들어 CD3γ, CD3δ, CD3ε 및 CD3ζ 사슬)의 세포내 테일은 TCR 복합체의 신호 능력을 수반하는 하나 이상의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM을 함유한다.
일부 구현예에서, TCR은 2개 사슬 α 및 β(또는 선택적으로 γ 및 δ)의 헤테로다이머일 수 있거나 단일 사슬 TCR 구조일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 이황화 결합 또는 이황화 결합들에 의한 것과 같이, 연결된 2개 별도 사슬(α 및 β 사슬 또는 γ 및 δ 사슬)을 함유하는 헤테로다이머이다.
일부 구현예에서, TCR은 Vα,β 사슬의 서열과 같은, 공지된 TCR 서열(들)로부터 생성될 수 있고, 이는 실질적으로 전장 코딩 서열이 쉽게 이용가능하다. 세포 공급원으로부터, V 사슬 서열을 포함하는, 전장 TCR 서열을 획득하기 위한 방법은 잘 알려져 있다. 일부 구현예에서, TCR을 암호화하는 핵산은 주어진 세포 내 또는 이로부터 분리된 TCR-코딩 핵산의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭, 또는 공개적으로 이용가능한 TCR DNA 서열의 합성과 같은, 다양한 공급원으로부터 획득될 수 있다.
일부 구현예에서, TCR은 예를 들어 T 세포(예를 들어 세포독성 T 세포), T-세포 하이 브리도마 또는 다른 공개적으로 이용가능한 공급원과 같은, 생물학적 공급원으로부터 획득된다. 일부 구현예에서, T-세포는 인비보(in vivo) 분리된 세포로부터 획득될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 티미칼리(thymically) 선택된 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 네오에피토프-제한 TCR이다. 일부 구현예에서, T-세포는 배양된 T-세포 하이브리도마 또는 클론일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 또는 그의 항원-결합 부분 또는 이의 항원-결합 단편은 TCR의 서열에 대한 지식으로부터 합성적으로 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, TCR은 표적 폴리펩티드 항원, 또는 그의 표적 T 세포 에피토프에 대한 후보 TCR의 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인되거나 선택된 TCR로부터 생성된다. TCR 라이브러리는 PBMC, 비장 또는 다른 림프 기관에 존재하는 세포를 포함하여, 대상체로부터 분리된 T 세포로부터 Vα 및 Vβ의 레퍼토리의 증폭에 의해 생성될 수 있다. 일부 경우에, T 세포는 종양-침윤 림프구 (TIL)로부터 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 라이브러리는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포로부터 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 건강한 대상체의 정상, 즉, 정상 TCR 라이브러리의 T 세포 공급원으로부터 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, 일부 구현예에서, TCR은 질환에 걸린 대상체, 즉, 질환에 걸린 TCR 라이브러리의 T 세포 공급원으로부터 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, 변성 프라이머는 인간으로부터 획득된, T 세포와 같은, 샘플 내 RT-PCR에 의한 것과 같은, Vα 및 Vβ의 유전자 레퍼토리를 증폭시키는데 사용된다. 일부 구현예에서, scTv 라이브러리는 증폭된 생성물이 링커에 의해 분리되도록 클로닝되거나 조립되는 나이브 Vα 및 Vβ 라이브러리로부터 조립될 수 있다. 대상체 및 세포의 공급원에 따라, 라이브러리는 HLA 대립유전자-특이적일 수있다. 대안적으로, 일부 구현예에서, TCR 라이브러리는 모(parent) 또는 스캐 폴드 TCR 분자의 돌연변이유발 또는 다양화에 의해 생성될 수 있다. 일부 측면에서, TCR은 예를 들어 α 또는 β 사슬의 돌연변이유발에 의한 것과 같은, 지시된 진화에 적용된다. 일부 측면에서, TCR의 CDR 내의 특정 잔기는 변경된다. 일부 구현예에서, 선택된 TCR은 친화성 성숙에 의해 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원-특이적 T 세포는 펩티드에 대한 CTL 활성을 평가하기 위해 스크리닝함으로써와 같이, 선택될 수 있다. 일부 측면에서, TCR, 예를 들어 항원-특이적 T 세포 상에 존재하는 것은 결합 활성, 예를 들어 항원에 대한 특정 친화성 및 결합활성에 의한 것과 같이, 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, TCR 또는 그의 항원-결합 부분은 변형 또는 조작된 것이다. 일부 구현예에서, 유도 진화 방법은 특정 MHC-펩티드 복합체에 대한 보다 높은 친화성을 가진 것과 같은, 변경된 특성을 가진 TCR을 생성하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 유도 진화는 효모 디스플레이(Holler et al. (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5387-92), 파지 디스플레이(Li et al. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54), 또는 T 세포 디스플레이(Chervin et al. (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84)를 포함하는 디스플레이 방법에 의해 획득되나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 디스플레이 접근은 공지된, 모(parent) 또는 기준 TCR을 엔지니어링 또는 변형하는 것을 포함한다. 예를 들어 일부 경우에, 야생형 TCR은 CDR의 하나 이상의 잔기가 돌연변이되는 돌연변이유도된 TCR을 생성하기 위한 템플릿으로서 사용될 수 있고, 원하는 표적 항원에 대한 보다 높은 친화성을 가지는 것과 같은, 원하는 변경된 물성을 가진 돌연변이체는 선택된다.
일부 구현예에서, 관심있는 TCR을 생산 또는 생성하는데 사용하기 위한 표적 폴리펩티드의 펩티드는 공지되어 있거나 쉽게 확인될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 또는 항원-결합 부분을 생성하는데 사용하기에 적합한 펩티드는 하기 서술된 표적 폴리펩티드와 같은, 관심있는 표적 폴리펩티드에서 HLA- 제한 모티프의 존재에 기초하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드는 이용가능한 컴퓨터 예측 모델을 사용하여 확인된다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 I 결합 부위를 예측하기 위해, 그러한 모델은 ProPred1(Singh and Raghava(2001) Bioinformatics 17(12):1236-1237), 및 SYFPEITHI(Schuler et al. (2007) Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, 409(1): 75-93 2007 참고)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, MHC-제한 에피토프는 HLA-A0201이고, 이는 모든 백인의 약 39-46%로 표현되므로, 적합한 TCR 또는 다른 MHC- 펩티드 결합 분자를 제조하는데 사용하기 위한 MHC 항원의 적절한 선택을 나타낸다.
컴퓨터 예측 모델을 사용하여 프로테아좀 및 면역-프로테아좀에 대한 HLA-A0201- 결합 모티프 및 절단 부위가 공지되어 있다. MHC 클래스 I 결합 부위를 예측하기 위해, 그러한 모델은 ProPred1(Singh and Raghava, ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. BIOINFORMATICS 17(12):1236-1237 2001에 보다 상세하게 서술됨), 및 SYFPEITHI(Schuler et al. SYFPEITHI, Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction. in Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, vol 409(1): 75-93 2007 참고)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, TCR 또는 그의 항원 결합 부분은 결합 특성과 같은, 하나 이상의 특성이 변경된 재조합으로 생성된 천연 단백질 또는 그의 돌연변이된 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 인간, 마우스, 래트, 또는 다른 포유동물과 같은, 다양한 동물 종으로부터 유래될 수 있다. TCR은 세포-결합 또는 가용성 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 방법의 목적을 위해, TCR은 세포의 표면 상에 발현된 세포-결합 형태이다.
일부 구현예에서, TCR은 전장 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 항원-결합 부분이다. 일부 구현예에서, TCR은 다이머 TCR(dTCR)이다. 일부 구현예에서, TCR은 단일-사슬 TCR(sc-TCR)이다. 일부 구현예에서, dTCR 또는 scTCR은 WO 03/020763, WO 04/033685, WO2011/044186에 서술된 바와 같은 바와 같은 구조를 가진다.
일부 구현예에서, TCR은 막 관통 서열에 상응하는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, TCR은 세포질 서열에 상응하는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, TCR은 CD3과 함께 TCR 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, dTCR 또는 scTCR을 포함하는, 임의의 TCR은 T 세포의 표면 상에 활성 TCR을 산출하는 신호 도메인에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 세포의 표면 상에 발현된다.
일부 구현예에서, dTCR은 TCR α 사슬 가변 영역 서열에 상응하는 서열이 TCR α 사슬 불변 영역 세포외 서열에 상응하는 서열의 N 말단에 융합된 제 1 폴리펩티드, 및 TCR β 사슬 가변 영역 서열에 상응하는 서열이 TCR β 사슬 불변 영역 세포외 서열에 상응하는 서열의 융합된 제 2 폴리펩티드를 함유하고, 제 1 및 제 2 폴리펩티드는 이황화 결합에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 결합은 자연 다이머 αβ TCR에 존재하는 자연 사슬간 이황화 결합에 상응할 수 있다. 일부 구현예에서, 사슬간 이황화 결합은 천연 TCR에 존재하지 않는다. 예를 들어 일부 구현예에서, 하나 이상의 시스테인은 dTCR 폴리펩티드 쌍의 불변 영역 세포외 서열 내로 혼입될 수 있다. 일부 경우에, 천연 및 비-천연 이황화 결합 모두 바람직할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 막에 고정하기 위한 막 관통 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, dTCR은 가변 α 도메인, 불변 α 도메인 및 불변 α 도메인의 C- 말단에 부착된 제 1 다이머화 모티프를 함유하는 TCR α 사슬, 및 가변 β 도메인, 불변 β 도메인 및 불변 β 도메인의 C- 말단에 부착된 제 1 다이머화 모티프를 포함하는 TCR β 사슬을 함유하고, 상기 제 1 및 제 2 다이머화 모티프는 쉽게 상호 작용하여 TCR α 사슬 및 TCR β 사슬을 함께 연결하는 제 1 다이머화 모티프에서 아미노산 및 제 2 다이머화 모티프에서 아미노산 사이 공유 결합을 형성한다.
일부 구현에서, TCR은 scTCR이다. 전형적으로, scTCR은 공지된 방법을 사용하여 생성된다(예를 들어 Soo Hoo, W. F. et al. PNAS (USA) 89, 4759 (1992); Wulfing, C. and Pluckthun, A., J. Mol. Biol. 242, 655 (1994); Kurucz, I. et al. PNAS (USA) 90 3830 (1993); International published PCT Nos. WO 96/13593, WO 96/18105, WO99/60120, WO99/18129, WO 03/020763, WO2011/044186; 및 Schlueter, C. J. et al. J. Mol. Biol. 256, 859 (1996) 참고). 일부 구현예에서, scTCR은 TCR 사슬의 결합을 용이하게 하기 위해 도입된 비-천연 이황화 사슬간 결합을 함유한다(예를 들어 국제공개 PCT 번호 WO 03/020763 참고). 일부 구현예에서, scTCR은 그의 C-말단에 융합된 이종 류신 지퍼가 사슬 결합을 용이하게 하는 비-이황화 연결된 절단 TCR이다(예를 들어 국제공개 PCT 번호 WO 99/60120 참고). 일부 구현예에서, scTCR은 펩티드 링커를 통해 TCRβ 가변 도메인에 공유 결합된 TCRα 가변 도메인을 함유한다(예를 들어 국제공개 PCT 번호 WO 99/18129 참고).
일부 구현예에서, scTCR은 TCR α 사슬 가변 영역에 상응하는 아미노산 서열로 구성된 제 1 세그먼트, TCR β 사슬 불변 영역 세포외 서열에 상응하는 아미노산 서열의 N 말단에 융합된 TCR β 사슬 가변 영역 서열에 상응하는 아미노산 서열로 구성된 제 2 세그먼트, 및 제 1 세그먼트의 C 말단을 제 2 세그먼트의 N 말단에 연결하는 링커 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, scTCR은 α 사슬 세포외 불변 도메인 서열의 N 말단에 융합된 α 사슬 변이 영역 서열로 구성된 제 1 세그먼트, 및 서열 β 사슬 세포외 불변 및 막 관통 서열에 융합된 β 사슬 가변 영역 서열로 구성된 제 2 세그먼트, 및, 선택적으로, 제 1 세그먼트의 C 말단을 제 2 세그먼트의 N 말단에 연결하는 링커 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, scTCR은 β 사슬 세포외 불변 도메인 서열의 N 말단에 융합된 TCR β 사슬 변이 영역 서열로 구성된 제 1 세그먼트, 및 서열 α 사슬 세포외 불변 및 막 관통 서열에 융합된 α 사슬 가변 영역 서열로 구성된 제 2 세그먼트, 및, 선택적으로, 제 1 세그먼트의 C 말단을 제 2 세그먼트의 N 말단에 연결하는 링커 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, 제 1 및 제 2 TCR 세그먼트를 연결하는 scTCR의 링커는 TCR 결합 특이성을 유지하면서 단일 폴리펩티드 가닥을 형성할 수 있는 임의의 링커일 수있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 링커 서열은 식 -P-AA-P-를 가질 수 있고, P는 프롤린이고 AA는 아미노산이 글라이신 및 세린인 아미노산 서열을 나타낸다. 일부 구현예에서, 제 1 및 제 2 세그먼트는 그의 가변 영역 서열이 그러한 결합을 위해 배향되도록 쌍을 이룬다. 따라서, 일부 경우에, 링커는 제 1 세그먼트의 C 말단 및 제 2 세그먼트의 N 말단 사이 거리에 걸쳐서 충분한 길이를 갖거나, 반대로, 표적 리간드에 대한 scTCR의 결합을 차단하거나 감소시키기에는 너무 길지 않다. 일부 구현예에서, 링커는 10 내지 45개의 아미노산, 예를 들어 10 내지 30개의 아미노산 또는 26 내지 41개의 아미노산 잔기, 예를 들어 29, 30, 31 또는 32개의 아미노산을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 식 -PGGG-(SGGGG)5-P-를 가지고, P는 프롤린이고, G는 글라이신이고, S는 세린이다(서열 번호 22). 일부 구현예에서, 링커는 서열 GSADDAKKDAAKKDGKS를 가진다(서열 번호 23).
일부 구현예에서, scTCR은 α 사슬의 불변 도메인의 면역글로불린 영역의 잔기를 β 사슬의 불변 도메인의 면역글로불린 영역의 잔기에 연결하는 공유 이황화 결합을 함유한다. 일부 구현예에서, 천연 TCR에서 사슬간 이황화 결합은 존재하지 않는다. 예를 들어 일부 구현예에서, 하나 이상의 시스테인은 scTCR 폴리펩티드의 제 1 및 제 2 세그먼트의 불변 영역 세포외 서열에 통합될 수 있다. 일부 경우에, 천연 및 비-천연 이황화 결합 모두는 바람직할 수 있다.
도입된 사슬간 이황화 결합을 함유하는 dTCR 또는 scTCR의 일부 구현예에서, 천연 이황화 결합은 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 천연 사슬간 이황화 결합을 형성하는 하나 이상의 천연 시스테인은 세린 또는 알라닌과 같은 다른 잔기로 치환된다. 일부 구현예에서, 도입된 이황화 결합은 제 1 및 제 2 세그먼트 상에 비- 시스테인 잔기를 시스테인으로 돌연변이시킴으로써 형성될 수 있다. TCR의 예시적인 비-천연 이황화 결합은 공개된 국제 PCT 번호 WO2006/000830에서 서술된다.
일부 구현예에서, TCR 또는 그의 항원-결합 단편은 10-5 및 10-12M 사이 또는 약 10-5 및 10-12M 사이 및 그안에 모든 개별적인 값 및 범위의 표적 항원을 위한 평형 결합 상수를 가진 친화성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 MHC-펩티드 복합체 또는 리간드이다.
일부 구현예에서, α 및 β 사슬과 같은, TCR을 암호화하는 핵산 또는 핵산들은 PCR, 클로닝 또는 다른 적절한 수단에 의해 증폭될 수 있고, 적합한 발현 벡터 또는 벡터들로 클로닝될 수 있다. 발현 벡터는 임의의 적합한 재조합 발현 벡터일 수 있고, 임의의 적합한 숙주를 형질전환 또는 형질감염시키는데 사용될 수 있다. 적합한 벡터는 증식 및 증폭 또는 발현을 위해 설계된 것들 또는 플라스미드 및 바이러스와 같은, 둘다를 포함한다.
일부 구현예에서, 벡터는 pUC series(Fermentas Life Sciences), pBluescript series(Stratagene, LaJolla, Calif.), pET series(Novagen, Madison, Wis.), pGEX series(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), 또는 pEX series(Clontech, Palo Alto, Calif.)의 벡터일 수 있다. 일부 경우에, 또한, λG10, λGT11, λZapII(Stratagene), λEMBL4, 및 λNM1149와 같은, 박테리오파지 벡터는 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 식물 발현 벡터는 pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 및 pBIN19(Clontech)를 사용하고 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 동물 발현 벡터는 pEUK-Cl, pMAM 및 pMAMneo(Clontech)를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터와 같은 것들이 사용된다.
일부 구현예에서, 재조합 발현 벡터는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈과 같은, 조절 서열을 함유할 수 있고, 이는 벡터가 DNA- 또는 RNA- 기반인지를 고려하여 적절한 바와 같이, 벡터가 도입되기 위한 숙주의 유형(예를 들어 박테리아, 곰팡이, 식물, 또는 동물)에 특이적이다. 일부 구현예에서, 벡터는 TCR 또는 항원-결합 부분(또는 다른 MHC- 펩티드 결합 분자)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 비천연 프로모터를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 비-바이러스 프로모터 또는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터, 및 뮤린 줄기 세포 바이러스의 장기 반복에서 발견되는 프로모터와 같은 바이러스 프로모터일 수 있다. 또한, 다른 공지된 프로모터도 고려된다.
일부 구현예에서, TCR을 암호화하는 벡터를 생성하기 위해, α 및 β 사슬은 관심있는 TCR을 발현하는 T 세포 클론으로부터 분리되고 발현 벡터로 클로닝된 총 cDNA로부터 PCR 증폭된다. 일부 구현예에서, α 및 β 사슬은 동일한 벡터 내로 클로닝된다. 일부 구현예에서, α 및 β 사슬은 상이한 벡터 내로 클로닝된다. 일부 구현예에서, 생성된 α 및 β 사슬은 레트로바이러스, 예를 들어 렌티바이러스 벡터 내로 통합된다. 유전자 조작된 세포 및 세포의 제조방법
일부 구현예에서, 상기 제공딘 방법은 재조합 항원 수용체를 발현하는 세포를 질환 또는 병태를 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 유전자 조작된 성분들, 예를 들어 재조합 수용체, 예를 들어 CAR 또는 TCR의 다양한 도입 방법은 익히 공지되어 있으며 상기 제공된 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 예시적인 방법은 바이러스, 예를 들어 레트로바이러스 또는 렌티바이러스, 형질도입, 전이인자(transposon) 및 전기 천공(electroporation)을 통한 수용체를 암호화하는 핵산의 전달 방법을 포함한다.
상기 수용체를 발현하고 상기 제공된 방법에 의해서 투여된 세포 중에는 조작된 세포가 있다. 상기 유전자 조작은 일반적으로 예를 들어 레트로바이러스 형질도입, 형질감염, 또는 형질전환에 의해서 상기 재조합물 또는 조작된 성분을 상기 세포를 함유하는 조성물로 암호화하는 핵산의 도입을 포함한다.
3. 키메라 자가-항체수용체(CAAR)
일부 구현예에서, 상기 제공된 방법, 용도, 제조 제품 및 조성물과 관련하여 사용된 조작된 세포에 의해서 발현된 재조합 수용체 중에는 키메라 자가항체 수용체(CAAR)가 있다. 일부 구현예에서, CAAR은 자가항체에 특이적다. 일부 구현예에서, CAAR를 발현하는 세포, 예를 들어 CARR을 발현하도록 조작된 T 세포는 자가항체-발현 세포에 특이적으로 결합하고 이를 죽이는 데 사용될 수 있지만, 정상 항체 발현 세포에는 그러하지 아니하다. 일부 구현예에서, CAAR-발현 세포는 자가면역 질환과 같은 자기-항원의 발현과 관련된 자가면역 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, CAAR-발현 세포는 궁극적으로 자가항체를 생산하고 그의 세포 표면 상에 자가항체를 표시하는 B 세포를 표적화할 수 있고, 이들 B 세포를 치료적 중재를 위한 질환-특이적 표적으로 표시할 수 있다. 일부 구현예에서, CAAR-발현 세포는 항원-특이적 키메라 자가항체 수용체를 사용하여 질환-유발 B 세포를 표적화함으로써 자가면역 질환에서 병원성 B 세포를 효율적으로 표적화하고 사멸시키는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 CAAR, 예를 들어 미국특허출원공보 제 2017/0051035호에 개시된 임의의 수용체이다.
일부 구현예에서, CAAR은 자가항체 결합 도메인, 막 관통 도메인, 및 세포내 신호 전달 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 영역은 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 영역은 1차 신호 전달 도메인, T 세포에서 1차 활성화 신호를 유도할 수 있는 신호 전달 도메인, T 세포수용체(TCR) 요소의 신호 전달 도메인 및/또는 면역 수용체 티로신-계 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 신호 전달 도메인이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포내 신호 전달 영역은 2차 또는 공자극 신호 전달 영역(2차 세포내 신호 전달 영역)을 포함한다.
일부 구현예에서, 자가항체 결합 도메인은 자가항원 또는 그의 단편을 포함한다. 자가항원의 선택은 표적화 될 자가항체의 유형에 달려 있다. 예를 들어 자가항원은, 그것이 특정 질환 상태, 예를 들어 자기면역 질환, 예를 들어 자가항체-매개 자가면역 질환과 관련된, B 세포와 같은 표적 세포상의 자가항체를 인식하기 때문에 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 자가면역 질환은 심상성 천포창(pemphigus vulgaris, PV)을 포함한다. 예시적인 자가항원은 데스모글레인 1(Dsg1) 및 Dsg3을 포함한다.
4. 다중 표적화
일부 구현예에서, 상기 제공된 방법, 용도, 제조 제품 및 조성물과 관련하여 사용된 세포는 상기 세포 상에 2개 이상의 유전자 조작된 수용체의 발현과 같은 다중 표적화 전략을 포함하며, 각각 상이한 항원의 동일함을 인식하고 전형적으로 각각 상이한 세포내 신호 전달 성분을 포함한다. 그러한 다중 표적화 전략은 예를 들어 국제공개공보 제WO2014/055668 A1호(예를 들어 정상 세포와 같이 표적 상에 개별적으로 존재하지만 치료하고자 하는 질환 또는 병태의 세포에서만 함께 존재하는 두 개의 상이한 항원을 표적으로 하는 활성화 및 공자극 CAR의 조합을 기술함) 및 문헌 「Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (2013)」[활성화 CAR 및 억제 CAR을 발현하는 세포, 예를 들어 활성화 CAR이 정상 또는 비병출성 세포 모두에서 발현되는 하나의 항원 및 치료 대상의 질환 또는 병태의 세포에 결합하고, 억제성 CAR이 정상 세포 또는 치료를 원하지 않는 세포에서만 발현되는 다른 항원에 결합하는 것을 기술함]에 기술되어 있다.
예를 들어 일부 구현예에서, 세포는 일반적으로 제 1 수용체, 예를 들어 제 1 항원에 의해 인식되는 항원에 대한 특이적 결합시 세포에 활성화하거나 또는 자극하는 신호를 유도할 수 있는 제 1 유전자 조작된 항원 수용체(예를 들어 CAR 또는 TCR)을 발현하는 수용체를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 일반적으로 제 2 수용체에 의해 인식되는 제 2 항원에 특이적으로 결합시 면역 세포에 공자극 신호를 유도할 수 있는 제 2 유전자 조작 항원 수용체(예를 들어 CAR 또는 TCR), 예를 들어 키메라 공자극 수용체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 항원 및 제 2 항원은 동일하다. 일부 구현예에서, 제 1항원 및 제 2 항원은 상이하다.
일부 구현예에서, 제 1 및/또는 제 2 유전자 조작된 항원 수용체(예를 들어 CAR 또는 TCR)은 세포에 활성화 신호를 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 수용체는 ITAM 또는 ITAM-유사 모티프를 함유하는 세포내 신호 전달 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 수용체에 의해 유도된 활성화는 신호 전달 또는 ITAM 인 산화 및/또는 ITAM 매개 신호 전달 캐스케이드의 개시와 같은 면역 반응의 개시를 초래하는 세포에서의 단백질 발현의 변화(예 : CD4 또는 CD8 등), NF-κB 및/또는 AP-1과 같은 하나 이상의 전사 인자의 활성화, 및/또는 NF-κB 및/또는 AP-1과 같은 유전자 발현의 유도 사이토카인, 증식 및/또는 생존과 같은 인자를 포함한다.
일부 구현예에서, 제 1 및/또는 제 2 수용체는 CD28, CD137(4-1BB), OX40 및/또는 ICOS와 같은 공자극 수용체의 세포내 신호 전달 도메인 또는 영역을 함유한다. 일부 구현예에서, 제 1 및 제 2 수용체는 상이한 공자극 수용체의 세포내 신호 전달 도메인을 함유한다. 하나의 구현예에서, 제 1 수용체는 CD28 공자극 신호 전달 영역을 포함하고, 제 2 수용체는 4-1BB 보조-자극 신호 전달 영역을 함유하거나 그 역도 마찬가지이다.
일부 구현예에서, 제 1 및/또는 제 2 수용체는 ITAM 또는 ITAM-유사 모티프를 포함하는 세포내 신호 전달 도메인 및 공자극 수용체의 세포내 신호 전달 도메인을 모두 함유한다.
일부 구현예에서, 제 1 수용체는 TAM 또는 ITAM-유사 모티프를 함유하는 세포내 신호 전달 도메인을 함유하고, 제 2 수용체는 공자극 수용체의 세포내 신호 전달 도메인을 함유한다. 동일한 세포에서 유도된 활성화 신호와 조합된 공자극 신호는 증가된 유전자 발현, 사이토카인 및 다른 인자의 분비 및 세포 사멸과 같은 T 세포 매개된 효과기와 같은 견고하고 지속적인 면역 반응과 같은 면역 반응을 유발하는 신호이다.
일부 구현예에서, 제 1 수용체만의 결찰 또는 제 2 수용체만의 결찰은 어느 것도 강력한 면역 반응을 유도하지 않는다. 일부 양상에서, 단지 하나의 수용체가 결찰되다면, 세포는 항원에 대해 내성을 갖거나 비반응성이거나, 또는 억제되고/되거나 인자를 증식시키거나 분비하도록 유도되거나 작용기 기능을 수행하지 않는다. 그러나, 일부 이러한 구현예에서, 제 1 및 제 2 항원을 발현하는 세포의 만남과 같이 다수의 수용체가 결찰되었을 때, 예를 들어 하나 이상의 사이토카인의 분비, 증식, 지속성에 의해 지시되는 바와 같이, 및/또는 표적 세포의 세포 독성 사멸과 같은 면역 효과기 기능을 수행하는 것과 같은, 완전한 면역 활성화 또는 자극과 같은 원하는 반응이 달성된다.
일부 구현예에서, 2개의 수용체는 세포에 대한 활성화 및 억제 신호를 각각 유도하여 수용체 중 하나에 의한 그의 항원에의 결합이 세포를 활성화시키거나 반응을 유도하지만 제 2 억제 수용체에 의한 결합 이 항원에 대한 신호는 그 반응을 억제하거나 약화시키는 신호를 유도한다. 예를 들어 활성화 CAR과 억제 CAR 또는 iCAR의 조합이다. 이러한 전략은 예를 들어 활성화 CAR이 질환 또는 병태에서 발현되는 항원에 결합 하나 정상 세포에서도 발현되며, 억제 수용체는 정상 세포에서 발현되는 별도의 항원에 결합하지만 질환이나 병태가 있는 세포가 아니다.
일부 구현예에서, 다중 표적화 전략은 특정 질환 또는 병태와 관련된 항원이 비 병사성 세포(non-diseased cell)에서 발현되고/되거나 일시적(예를 들어 유전자 조작과 관련된 자극시)으로 또는 영구적으로 조작된 세포 자체에서 발현되는 경우에 사용된다. 이러한 경우, 2개의 분리된 개별적 항원 수용체의 연결을 요구함으로써, 특이성, 선택성 및/또는 효능이 개선될 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 항원, 예를 들어 제 1항원 또는 제 2항원은 암세포에서와 같이 표적화 되는 세포, 조직 또는 질환 또는 병태 상에 발현된다. 한 양상에서, 세포, 조직, 질환 또는 질환 상태는 다발성 골수종 또는 다발성 골수종 세포이다. 일부 구현예에서, 복수의 항원 중 하나 이상은 일반적으로 정상 또는 비병사성 세포 또는 조직 및/또는 조작된 세포 자체와 같은 세포 치료법으로 표적화하는 것이 바람직하지 않은 세포에서 또한 발현된다. 이러한 구현예에서, 세포의 반응을 달성하기 위해 다중 수용체의 연결을 요구함으로써, 특이성 및/또는 효능이 달성된다.
B. 핵산, 백터 및 유전자 조작방법
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 농축된 CD57- T 세포의 집단의 세포는 재조합 수용체를 발현하도록 유전자 조작된다. 일부 구현예에서, 상기 조작은 재조합 수용체를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 수행된다. 또한 재조합 수용체 또는 그의 부분들 또는 성분들을 암호화하는 뉴클레오티드, 및 상기 핵산 및/또는 뉴클레오티드를 함유하는 벡터 또는 컨스트럭트(construct)가 제공된다.
일부 경우에서, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열은 신호 펩티드를 암호화하는 신호 서열을 함유한다. 일부 구체예에서, 신호 서열은 천연 폴리펩티드로부터 유래된 신호 펩티드를 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 조절 서열, 예를 들어 폴리뉴클레오티드가 도입될 숙주 유형(예를 들어 세균, 곰팡이, 식물 또는 동물)에 특이적인 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈을, 폴리뉴클레오티드가 DNA 기반 또는 RNA 기반인지 고려하여 적절한 것으로 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 조절/제어 요소, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 신호, 코작 컨센선스(Kozak consensus) 서열, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 2A 서열 및 스플라이스 수용체 또는 공여자를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는, 재조합 수용체 및/또는 하나 이상의 추가 폴리펩티드(들)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 비천연 프로모터를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 RNA pol I, pol Ⅱ 또는 pol Ⅲ 프로모터 중으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 RNA 폴리머라제 Ⅱ(예를 들어 CMV, SV40 초기 영역 또는 아데노바이러스 주요 후기 프로모터)에 의해 인식된다. 다른 구현예에서, 프로모터는 RNA 폴리머라제 Ⅲ(예를 들어 U6 또는 H1 프로모터)에 의해 인식된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 비바이러스 프로모터 또는 바이러스 프로모터, 예를 들어 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터 및 뮤린 줄기 세포 바이러스의 긴 말단 반복에서 발견되는 프로모터일 수 있다. 다른 공지된 프로모터도 고려된다.
일부 구현예에서, 프로모터는 구성적 프로모터이거나 이를 포함한다. 예시적인 구성적 프로모터는 시미안 바이러스 40 초기 프로모터(SV40), 사이토메갈로바이러스 초기 직후 프로모터(CMV), 인간 유비퀴틴 C 프로모터(UBC), 인간 신장 인자 1α 프로모터(EF1α), 마우스 포스포글리세레이트 키나제 1 프로모터(PGK) 및 CMV 초기 인핸서와 결합된 닭 β-액틴 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 구성적 프로모터는 합성 또는 변경된 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 MND 프로모터, 골수 증식 육종 바이러스 인핸서를 갖는 변형된 MoMuLV LTR의 U3 영역을 함유하는 합성 프로모터이거나 이를 포함한다[문헌 「Challita et al. (1995) J. Virol. 69(2):748-755」 참조]. 일부 구현예에서, 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 바이러스 프로모터이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 비-바이러스 프로모터이다. 일부 구현예에서, 예시적인 프로모터는, 인간 신장 인자 1 알파(EF1α) 프로모터 또는 이의 변형된 형태 또는 MND 프로모터를 포함할 수 있으나 이에 국한되지 않는다.
다른 구현예에서, 프로모터는 조절 프로모터(예를 들어 유도 가능 프로모터)이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 유도 가능 프로모터 또는 억제 가능 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 Lac 오퍼레이터 서열, 테트라사이클린 오퍼레이터 서열, 갈락토오스 오퍼레이터 서열 또는 독시사이클린 오퍼레이터 서열을 포함하거나 또는 이의 유사체이거나 Lac 억제제 또는 테트라사이클린 억제제 또는 이의 유사체를 인식하거나 이와 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 조절 요소, 예를 들어 프로모터를 포함하지 않는다.
일부 경우에서, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열은 신호 펩티드를 암호화하는 신호 서열을 함유한다. 일부 측면에서, 신호 서열은 천연 폴리펩티드로부터 유도된 신호 펩티드를 암호화할 수 있다. 다른 측면에서, 신호 서열은 서열 번호 24에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되고 서열 번호 25에 제시된 GMCSFR 알파 사슬의 예시적인 신호 펩티드와 같은 이종성 또는 비-고유 신호 펩티드를 암호화할 수 있다. 일부 경우에, 재조합 수용체, 예를 들어 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산 서열은 신호 펩티드를 암호화하는 신호 서열을 함유한다. 비제한적 예시적 신호 펩티드는, 예를 들어 서열 번호 25에 제시되고 서열 번호 24에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 GMCSFR 알파 사슬 신호 펩티드, 또는 서열 번호 26에 제시된 CD8 알파 신호 펩티드를 들 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 추가 폴리펩티드, 예를 들어 하나 이상의 마커(들) 및/또는 하나 이상의 효과기 분자를 암호화하는 핵산 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 마커(들)는 형질도입 마커, 대리 마커 및/또는 선택 마커를 포함한다. 예를 들어 하나 이상의 추가 폴리펩티드(들)를 암호화하는 도입된 추가 핵산 서열 중에는, 예를 들어 전달된 세포의 생존 능력 및/또는 기능을 촉진함으로써 요법의 효능을 개선할 수 있는 핵산 서열; 예를 들어 생체 내에서 생존 또는 국소화를 평가하기 위해 세포의 평가 및/또는 선택을 위한 유전자 마커를 제공하는 핵산 서열; 문헌 「Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); 및 Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)」에 기재된 바와 같이 예를 들어 생체 내에서 음성 선택에 세포를 예민하게 만들어 안정성을 개선하기 위한 핵산 서열이 포함되고; 또한 우성 양성 선택 가능 마커의 음성 선택 가능 마커와의 융합에서 유래된 2작용성 선택 가능 융합 유전자의 용도를 기술하는 국제공개공보 제WO1992/008796호 및 및WO1994/028143호 및 미국특허 제6,040,177호를 참조한다.
일부 구현예에서, 마커는 형질도입 마커 또는 대리 마커이다. 형질도입 마커 또는 대리 마커는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포를 검출하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 형질도입 마커는 세포의 변형을 나타낼 수 있거나 또는 세포의 변형을 확인할 수 있다. 일부 구현예에서, 대리 마커는 세포 표면에서 재조합 수용체, 예를 들어 CAR과 세포 표면에서 동시 발현되도록 만들어진 단백질이다. 특정 구현예에서 그러한 대리 마커는 거의 또는 전혀 활성을 갖지 않도록 변형된 표면 단백질이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열은 마커를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결되고, 2A 서열과 같은 리보솜 스킵을 야기하는 펩티드 또는 자가-절단 펩티드를 암호화하는 핵산 또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)에 의해 선택적으로 분리된다. 외래 마커 유전자는 어떤 경우에는 조작된 세포와 관련하여 세포의 검출 또는 선택을 가능하게 하고 경우에 따라 세포 제거 및/또는 세포 자살을 촉진시킬 수 있다.
예시적인 대리 마커는 절단된 형태의 세포 표면 폴리펩티드 예를 들어 비-작용성이고 신호 또는 전장 형태의 세포 표면 폴리펩티드에 의해서 통상적으로 형질도입된 신호를 형질도입하지 않거나 형질도입할 수 없고/없거나 내재화할 수 없는 절단된 형태를 포함할 수 있다. 예시적인 절단된 세포 표피 폴리펩티드는 절단된 형태의 성장 인자 또는 다른 수용체, 예를 들어 절단된 인간 표피 성장 인자 수용체 2(예시적인 절단된 세포 표피 폴리펩티드(tHER2), 절단된 인간 표피 성장 인자 수용체(tEGFR, 서열 번호 7 또는 16에 제시된 예시적인 tEGFR 서열) 또는 전립선 특이적 막 항원(PSMA) 또는 그의 변형된 형태, 예를 절단된 PSMA(tPSMA)를 포함한다. 일부 측면에서, tEGFR는 항체 세툭시맙(Erbitux®) 또는 기타 치료용 항-EGFR 항체 또는 결합 분자에 의해 인식되는 에피토프를 포함할 수 있으며, 이는 tEGFR 구조물에 의해 조작된 세포를 확인 또는 선택하고/하거나 상기 암호화된 외인성 단백질을 발현하는 세포들을 제거 또는 분리하는데 이용될 수 있다[미국특허 제8,802,374호 및 문헌 「Liu et al., Nature Biotech. 2016 April; 34(4): 430-434)」 참조]. 일부 측면에서, 예를 들어 대리 마커와 같은 마커는, CD34, NGFR, CD19 또는 절단된 CD19, 예를 들어 절단된 비-인간 CD19의 전부 또는 일부(예를 들어 절단된 형태)를 포함한다. 절단된 EGFR(예를 들어 tEGFR)에 대한 예시적인 폴리펩티드는 서열 번호 7 또는 16에 제시된 아미노산의 서열 또는 서열 번호 7 또는 16과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 마커는 형광 단백질, 예를 들어 녹색 형광 단백질(GFP), 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP), 예를 들어 슈퍼-폴드 GFP (sfGFP), 적색 형광 단백질(RFP), 예를 들어 tdTomato, mCherry, mStrawberry, AsRed2, DsRed 또는 DsRed2, 시안 형광 단백질(CFP), 청록색 형광 단백질(BFP), 강화 청색 형광 단백질(EBFP), 및 황색 형광 단백질(YFP), 및 형광 단백질의 종 변이체, 단량체 변이체, 코돈-최적화, 안정화된 및/또는 강화된 변이체를 포함하는 그의 변이체이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 마커는 효소, 예를 들어 루시퍼라아제, E. coli로부터 lacZ 유전자, 알칼리성 포스파타아제, 분비된 배아 알칼리성 포스파타아제(SEAP), 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제(CAT)이거나 이를 포함한다. 예시적인 발광 리포터 유전자는 루시퍼라아제(luc), β-갈락토시다아제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), β-글루쿠로니다아제(GUS) 또는 그의 변이체를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 효소의 발현은 상기 효소의 발현 및 작용 활성시 검출될 수 있는 기판의 첨가에 의해서 검출될 수 있다.
일부 구현예에서, 마커는 선택 마커이다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 외인성 제제 또는 약물에 내성을 부여하는 폴리펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 항생제 내성 유전자이다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 항생제 내성 유전자이고, 포유동물 세포에 항생제 내성을 부여한다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 퓨로마이신 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자, 블라스티시딘 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 제네티신 내성 유전자 또는 제오신 내성 유전자 또는 그의 변형된 형태이거나 이를 포함한다.
여기에 기재된 임의의 재조합 수용체 및/또는 추가 폴리펩티드(들)는 재조합 수용체를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 임의의 조합, 배향 또는 배열로 함유하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 예를 들어 1개, 2개, 3개 이상의 폴리뉴클레오티드는 1개, 2개, 3개 이상의 상이한 폴리펩티드, 예를 들어 재조합 수용체 또는 이의 일부 또는 이의 성분 및/또는 하나 이상의 추가 폴리펩티드(들), 예를 들어 마커 및/또는 효과기 분자를 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나의 폴리뉴클레오티드는 재조합 수용체, 예를 들어 CAR 또는 이의 일부 또는 이의 성분을 암호화하는 핵산 서열 및 하나 이상의 추가 폴리펩티드(들)를 암호화하는 핵산 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 하나의 벡터 또는 작제물은 재조합 수용체, 예를 들어 CAR 또는 이의 일부 또는 이의 성분을 암호화하는 핵산 서열을 함유하고, 별도의 벡터 또는 작제물은 하나 이상의 추가 폴리펩티드(들)를 암호화하는 핵산 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열과 하나 이상의 추가 폴리펩티드(들)를 암호화하는 핵산 서열은 2개의 상이한 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산은 하나 이상의 추가 폴리펩티드(들)를 암호화하는 핵산의 상류에 존재한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산은 하나 이상의 추가 폴리펩티드(들)를 암호화하는 핵산의 하류에 존재한다.
특정 경우에, 하나의 폴리뉴클레오티드는 2개 이상의 상이한 폴리펩티드 사슬, 예를 들어 재조합 수용체 및 하나 이상의 추가 폴리펩티드(들), 예를 들어 마커 및/또는 효과기 분자를 암호화하는 핵산 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 상이한 폴리펩티드 사슬, 예를 들어 재조합 수용체 및 하나 이상의 추가 폴리펩티드(들)를 암호화하는 핵산 서열은 2개의 별도의 폴리뉴클레오티드에 존재한다. 예를 들어 2개의 별도의 폴리뉴클레오티드가 제공되고, 각각은 세포 내 발현을 위해 세포로 개별적으로 전달되거나 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열 및 마커를 암호화하는 핵산 서열은 세포의 게놈 내의 상이한 위치에 존재하거나 삽입된다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열 및 마커를 암호화하는 핵산 서열은 2개의 상이한 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
폴리뉴클레오티드가 제 1 및 제 2 핵산 서열을 함유하는 일부 구현예에서, 상이한 폴리펩티드 사슬 각각을 암호화하는 코딩 서열들(coding sequences)은 동일하거나 상이한 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 2 이상의 상이한 폴리펩티드 사슬의 발현을 유도하는 프로모터를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 핵산 분자는 멀티시스트론(바이시스트론 또는 트리시스트론, 예를 들어 미국특허 제6,060,273호 참조)일 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열 및 하나 이상의 추가 폴리펩티드(들)를 암호화하는 핵산 서열은 동일한 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 선택적으로 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 또는 자가 절단 펩티드 또는 리보솜 건너뛰기를 야기하는 펩티드, 예를 들어 2A 요소를 암호화하는 핵산에 의해 분리되어 있다. 예를 들어 예시적인 마커 및 선택적으로 리보솜 건너뛰기 서열은 국제공개공보 제WO2014/031687호에 개시된 바와 같은 임의의 것일 수 있다.
일부 구현예에서, 전사 단위는 단일 프로모터로부터의 메시지에 의해서 유전자 생성물의 공발현(예를 들어 재조합 수용체 및 추가적인 폴리펩티드의 암호화)을 허용하는 IRES를 함유하는 비시스토로닉 유닛(bicistronic unit)으로서 조작될 수 있다. 대안으로는, 일부 경우에서, 단일 프로모터는 자가-절단 펩티드(예를 들어 2A 서열들) 또는 프로테아제 인식 부위(예를 들어 퓨린)을 암호화하는 서열에 의해 서로 분리된 2 또는 3개의 유전자들(예를 들어 마커 암호화 및 재조합 수용체 암호화)을 하나의 오픈 리딩 프레임(ORF)에 함유하는, RNA의 발현을 지시할 수 있다. ORF는 따라서 번역 도중(2A의 경우) 또는 번역 후에 개별적인 단백질로 가공되는, 단일 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에서, T2A와 같은 펩티드는, 리보솜으로 하여금 2A 요소의 C-말단에서 펩티드 결합 합성을 생략하도록(리보좀 스키핑) 할 수 있는데 이에 의해, 2A 서열의 말단과 다음 펩티드의 하류 사이가 분리된다[예를 들어 문헌 「de Felipe, Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004)」 및 「de Felipe et al. Traffic 5:616-626 (2004)」 참조]. 다양한 2A 요소가 알려져 있다. 본원에 개시된 방법 및 시스템에 사용가능한 2A 서열의 비제한적인 예로는, 구제역 바이러스(F2A, 예를 들어 서열 번호 21), 말의 A형 비염 바이러스(E2A, 예를 들어 서열 번호 20), 토세아 아시그나 바이러스(Thosea asigna virus)(T2A, 예를 들어 서열 번호 6 또는 17), 및 돼지의 테스코바이러스-1(P2A, 예를 들어 서열 번호 18 또는 19)을 들 수 있으며 이에 관해서는 미국특허출원공개공보 제US2007/0116690호에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체 및/또는 추가 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 하나의 벡터에 함유되거나 하나 이상의 벡터(들)로 클로닝될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 벡터(들)는 숙주 세포, 예를 들어 조작을 위한 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 데 사용될 수 있다. 예시적인 벡터는 플라스미드 및 바이러스와 같이 도입, 번식 및 증폭 또는 발현 또는 둘 다를 위해 설계된 벡터를 포함한다. 일부 측면에서, 벡터는 발현 벡터, 예를 들어 재조합 발현 벡터이다. 일부 구현예에서, 재조합 발현 벡터는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 pUC 시리즈(Fermentas Life Sciences), pBluescript 시리즈(Stratagene, 미국 캘리포니아주 라호야 소재), pET 시리즈(Novagen, 미국 위스콘신주 매디슨 소재), pGEX 시리즈(Pharmacia Biotech, 스웨덴 웁살라 소재), 또는 pEX 시리즈(Clontech, 미국 캘리포니아주 팔로앨토 소재)의 벡터일 수 있다. 일부 경우에서, 박테리오파지 벡터, 예를 들어 λG10, λGT11, λZapII(Stratagene), λEMBL4, 및 λNM1149가 또한 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 식물 발현 벡터가 사용될 수 있으며, 이는 pBI01, pBI1012, pBI1013, pBI121 및 pBIN19(Clontech)를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물 발현 벡터는 pEUK-Cl, pMAM 및 pMAMneo(Clontech)를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 벡터가 사용된다.
일부 구현예에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체 및/또는 추가 폴리펩티드(들)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터 또는 트랜스포손을 통해 세포로 도입된다[예를 들어 문헌 「Baum et al. (2006) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13:1050-1063; Frecha et al. (2010) Molecular Therapy 18:1748-1757; 및 Hackett et al. (2010) Molecular Therapy 18:674-683」 참조].
일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(들)은 재조합 감염성 바이러스 입자, 예를 들어 유인원 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV)로부터 유래한 벡터를 사용하여 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(들)은 예를 들어 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예를 들어 감마-레트로바이러스 벡터를 사용하여, T 세포내로 도입된다[예를 들어 문헌 「Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25」; 「Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46」; 「Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93」; 「Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557」 참조].
일부 구현예에서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 일부 측면에서, 레트로바이러스 벡터는 긴 말단 반복부 서열(LTR), 예를 들어 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV), 골수 증식성 육종 바이러스(MPSV), 뮤린 배아 줄기세포 바이러스(MESV), 뮤린 줄기세포 바이러스(MSCV), 비장 병원체 형성 바이러스(SFFV), 또는 아데노-관련 바이러스(AAV)로부터 유래한 레트로바이러스 벡터를 가질 수 있다. 대부분의 레트로바이러스 벡터는 뮤린 레트로바이러스로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 임의의 조류 또는 포유류 세포 공급원으로부터 유래한 것을 포함한다. 레트로바이러스는 통상적으로 양쪽성이며, 이는 이들이 인간을 포함하는 여러 종의 숙주 세포를 감염시킬 수 있음을 의미한다. 하나의 구현예에서, 발현될 유전자는 레트로바이러스 gag, pol 및/또는 env 서열을 대체한다. 다수의 예시적 레트로바이러스 시스템이 기재된 바 있다[예를 들어 미국특허 제5,219,740호; 제6,207,453호; 제5,219,740호; 문헌 「Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14」; 「Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852」;「Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037」; 및 「Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109」 참조].
렌티바이러스 형질도입 방법은 공지되어 있다. 예시적 방법은, 예를 들어 문헌 「Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701」; 「Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644」; 「Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114」 및 「Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505」에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 상기 재조합 수용체 및/또는 하나 이상의 추가의 폴리펩티드를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 레트로 바이러스 형질도입, 형질감염 또는 형질전환에 의해서 배양된 세포를 함유하는 집단으로 도입된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(들)은 전기천공을 이용하여 T 세포내로 도입된다[예를 들어 문헌 「Chicaybam et al., (2013) PLoS ONE 8(3): e60298」 및 「Van Tedeloo et al., (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437」 참조]. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 트랜스포지션(transposition)를 통해 T 세포내로 전달된다[예를 들어 문헌 「Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437」; 「Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74」; 및 「Huang et al., (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126」 참조]. 면역 세포에서 유전 물질, 예를 들어 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터를 도입하여, 발현시키는 다른 방법으로는 인산칼륨 형질도입[예를 들어 문헌 「Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.」에 기재된 바와 같음], 원형질체 융합, 양이온성 리포솜 매개 형질도입; 텅스텐 입자 촉진 미립자 충격[문헌 「Johnston, Nature, 346: 776-777(1990)」]; 및 스트론튬 인산염 DNA 공-침전[문헌 「Brash et al., Mol Cell Biol, 7: 2031-2034(1987)」 참조] 및 국제공개공보 제WO 2014055668호 및 미국특허 제7,446,190호를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 T 세포는 증식 도중 또는 증식 후에 예를 들어 T 세포수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)로 형질도입될 수 있다. 원하는 수용체 유전자의 도입을 위한 이러한 형질도입은 예를 들어 임의의 적합한 레트로바이러스 벡터로 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체 및/또는 추가 폴리펩티드(들)을 암호화하는 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(들) 또는 벡터(들)은 발현동안 또는 발현 후 세포, 예를 들어 T 세포에 도입될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드(들) 또는 벡터(들)의 도입은 적절한 임의의 레트로바이러스 벡터를 사용하여 수행될 수 있다. 이어서 생성되는 유전자 조작된 세포들은 초기 자극(예를 들어 항-CD3/항-CD28 자극)으로부터 유리될 수 있고, 이어서, 예를 들어 새로 도입된 재조합 수용체를 통하여 제 2 유형의 자극으로 자극될 수 있다. 이 제 2 유형의 자극은 펩티드/MHC 분자 형태의 항원 자극, 유전적으로 도입된 수용체의 동족(가교성) 리간드(예를 들어 CAR의 천연 항원 및/또는 리간드) 또는(예를 들어 수용체 내 불변 영역을 인식함으로써) 새로운 수용체의 구조 내에 직접 결합하는 기타 리간드(항체 등)를 포함할 수 있다. 예를 들어 문헌 「Cheadle et al, "Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy" Methods Mol Biol. 2012; 907:645-66 」 또는 「Barrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65: 333-347 (2014).」를 참조한다.
일부 경우에, 세포, 예를 들어 T 세포가 활성화되는 것을 요하지 않는 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 일부 경우에서, 세포는 활성화 전에 선택 및/또는 형질도입될 수 있다. 따라서, 세포는, 세포의 배양 전에 또는 후에, 그리고 경우에 따라서는 상기 배양과 동시에 적어도 일부의 상기 배양도중에 조작될 수 있다.
C. 유전자 조작을 위한 세포 및 세포의 준비
일부 구현에에서 조작된 세포, 예를 들어 유전자 조작된 또는 변형된 세포, 및 세포를 조작하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 재조합 수용체 및/또는 부가적인 폴리펩티드, 예를 들어 본원에서 기술된 임의의 것이 조작을 위한 세포가 그 속으로 도입된다. 일부 측면에서, 상기 폴리뉴클레오티드 및/또는 그의 일부는 이종성이며, 즉 예를 들어 조작되는 세포 및/또는 그러한 세포가 유도된 유기체에서 통상적으로 발견되지 않는 것 같은 다른 생물 또는 세포로부터 얻은 것과 같은 세포 또는 세포로부터 수득된 샘플에 통상적으로 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 여러 상이한 세포 유형으로부터의 다양한 도메인을 암호화하는 핵산의 키메라 조합물을 포함하여 자연계에서 발견되지 않거나 또는 자연계에서 발견된 핵산 서열로부터 변형된 핵산 서열과 같이 자연 발생적 핵산 서열은 아니다.
세포는 일반적으로 포유류 세포와 같은 진핵 세포이고, 전형적으로 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 혈액, 골수, 림프 또는 림프 기관으로부터 유래되며, 타고난 면역 또는 적응 면역의 세포, 예를 들어 림프구를 비롯한 골수 또는 림프 세포, 전형적으로 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함한다. 다른 예시적인 세포는 유도된 만능 줄기 세포(pluripotent stem cell; iPSC)를 포함하여 다능성 및 만능 줄기 세포와 같은 줄기 세포를 포함한다. 세포는 전형적으로 대상으로부터 직접 분리된 및/또는 대상으로부터 분리되고 동결된 것과 같은 일차세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 T 세포의 하나 이상의 서브 세트 또는 전체 T 세포 집단, CD4+ 세포, CD8+ 세포 및 이들의 모집단과 같은 다른 세포 유형, 예를 들어 기능, 활성화 상태, 성숙도, 항원 특이성, 항원 수용체의 유형, 특정 기관 또는 구획에서의 존재, 마커 또는 사이토카인 분비 프로파일 및/또는 분화 정도에 의존적일 수 있다. 치료될 대상과 관련하여, 세포는 동종 및/또는 자기 조직일 수 있다. 방법 중에는 상용 방법이 포함된다. 상용 기술과 같은 일부 측면에서, 세포는 만능성 및/또는 다능성, 예를 들어 iPSC와 같은 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 대상체로부터 세포를 분리하고, 이들을 제조, 가공, 배양하고/하거나 조작하고 동결 보존 전후에 동일 대상으로 도입하는 것을 포함한다.
T 세포 및/또 CD4+ 및/또는CD8+ T 세포의 서브 타입 및 하위 집단 중에서, 천연 T(TN) 세포, 효과기 T 세포(TEFF), 메모리 T 세포 및 그의 서브-타입, 예를 들어 줄기 세포 메모리 T(TSCM), 센트럴 메모리 T(TCM), 효과기 메모리 T(TEM), 또는 말단분화 효과기 메모리(terminally differentiated effector memory) T 세포, 종양-침윤 림프구(tumor-infiltrating lymphocytes; TIL), 미성숙 T 세포, 성숙 T 세포, 헬퍼(helper) T 세포, 세포독성 T 세포, 점막 관련 불변 T(mucosa-associated invariant T; TMAIT) 세포, 자연적으로 발생하는 및 적응 조절 T(adaptive regulatory Treg) 세포, 헬퍼 T 세포, 예를 들어 TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포, 폴리큘러 헬퍼(follicular helper) T 세포, 알파/베타 T 세포, 및 델타/감마 T 세포가 있다.
일부 구현예에서, 세포는 천연 킬러 세포(NK cell)이다. 일부 구현예에서, 세포는 단핵 세포 또는 과립구, 예를 들어 골수 세포, 대 식세포, 호중구, 수지상 세포, 비만 세포, 호산구 및/또는 호염기구이다.
일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작을 통해 도입된 하나 이상의 핵산을 포함하고, 이에 의해 그러한 핵산의 재조합 또는 유전자 조작된 생성물을 발현한다. 일부 구현예에서, 핵산은 이종성이며, 즉 예를 들어 조작되는 세포 및/또는 그러한 세포가 유도된 유기체에서 통상적으로 발견되지 않는 세포는 다른 유기체 또는 세포로부터 얻어진 것과 같이 세포 또는 세포로부터 수득된 샘플에 통상적으로 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 핵산은 여러 상이한 세포 유형으로부터 다양한 도메인을 암호화하는 핵산의 키메라 조합물을 포함하여 자연계에서 발견되지 않는 핵산과 같이 자연 발생적 핵산은 아니다.
일부 구현예에서, 조작된 세포의 제조는 하나 이상의 배양 및/또는 제조단계를 포함한다. CAR과 같은 형질전환 수용체를 암호화하는 핵산 도입용 세포는 생물학적 샘플, 예를 들어 대상으로부터 수득되거나 이로부터 유도된 샘플과 같은 샘플로부터 분리 될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포가 분리된 대상은 질환 또는 증상를 가지거나 세포 치료가 필요하거나 세포 치료가 투여될 대상이다. 일부 구현예에서 환자는 세포가 분리, 가공 및/또는 조작되는 적용 세포 치료와 같은 특정 치료적 개입이 필요한 인간이다.
따라서, 한 구현예에서 세포는 일차 세포, 예를 들어 일차 인간 세포이다. 샘프에는 분리, 원심 분리, 유전자 조작(예를 들어 바이러스 벡터를 이용한 형질도입), 세척 및/또는 배양과 같은 하나 이상의 처리 단계에서 생성되는 샘플뿐만 아니라 조직에서 추출한 조직, 유체 및 기타 샘플이 포함된다. 생물학적 샘플은 생물학적 소스 또는 처리된 샘플에서 직접 얻은 샘플일 수 있다. 생물학적 시료로는 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 활액, 소변 및 땀, 조직 및 기관 샘플(이로부터 유도된 가공 샘플 포함)과 같은 체액이 있으나 이에 국한되지 않는다.
한 측면에서, 세포가 유래되거나 분리되는 샘플은 혈액 또는 혈액 유래 샘플이고, 또는 성분 채집술 또는 백혈구 추출물에서 유도된 것이다. 예시적인 샘플은 전혈, 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs), 백혈구, 골수, 흉선, 조직 생검, 종양, 백혈병, 림프종, 림프절, 장 관련 림프 조직, 점막 관련 림프 조직, 비장, 기타 림프 조직, 간, 폐, 전립선, 자궁 경부, 고환, 난소, 편도선 또는 다른 기관에서 유도된 세포, 및/또는 이로부터 유도된 세포를 포함한다. 샘플은 세포 치료와 관련하여, 예를 들어 적용 세포 치료, 자기 및 동종 원천으로부터의 샘플을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 세포주, 예를 들어 T 세포주에서 유래한다. 일부 구현예에서 세포는 이종의 소스, 예를 들어 마우스, 래트, 비인간 영장류 및 돼지로부터 수득된다.
일부 구현예에서, 세포의 분리는 하나 이상의 제조 및/또는 비친화성에 기초한 세포 분리 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 세포를 세척, 원심 분리 및/또는 하나 이상의 시약의 존재하에, 예를 들어 원하지 않는 성분을 제거하고, 원하는 성분을 농축시키고, 특정 시약에 민감한 세포를 용해 시키거나 제거하기 위해 배양한다. 일뷰 구체예에서, 세포는 밀도, 부착 성질, 크기, 민감성 및/또는 특정 성분에 대한 내성과 같은 하나 이상의 특성에 기초하여 분리된다.
일부 구체예에서, 환자의 순환 혈액으로부터의 세포는 예를 들어 성분 채집술 또는 백혈구 제거에 의해 얻어진다. 샘플에는 T 세포, 단핵 세포, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구 및/또는 혈소판을 비롯한 일부 림프구가 포함되어 있으며 일부 측면에서는 적혈구 및 혈소판 이외의 세포가 포함되어 있다.
일부 구현예에서, 환자로부터 수집된 혈액 세포를 세척하여 예를 들어 혈장 분획을 제거하고 후속 공정 단계를 위해 적절한 완충액 또는 배지에 세포를 위치시킨다. 일부 구현예에서, 세포는 인산 환충 식염수(PBS)로 세척한다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 칼슘 및/또는 마그네슘 및/또는 다수 또는 모든 2가 양이온이 부족하다. 일부 측면에서 세척 단계는 반자동 "플로우 스루(flow-through)" 원심 분리기(예를 들어 the Cobe 2991 세포 프로세서, Baxter)를 제조사의 지침에 따라 수행한다. 일부 측면에서, 세척 단계는 제조사의 지시에 따라 접선 유동 여과(TFF)에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 세포는 세척 후 다양한 생체 적합성 완충액, 예를 들어 Ca++/Mg++ 부재 PBS에 재현탁된다. 특정 구현예에서, 혈액 세포 샘플의 성분을 제거하고 세포를 배양 배지에 직접 재현탁한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 적혈구를 용해시켜 퍼콜(Percoll) 또는 피콜(Ficoll) 구배를 통해 원심 분리하여 말초 혈액으로부터 백혈구를 제조하는 것과 같은 밀도-기반 세포 분리방법을 포함한다.
일부 구현예에서, 분리 방법은 표면 마커, 예를 들어 표면 단백질, 세포내 마커 또는 핵산과 같은 하나 이상의 특정 분자의 세포에서의 발현 또는 존재에 기초한 상이한 세포 유형의 분리를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 마커에 기초한 임의의 공지된 분리 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 분리는 친화도 또는 면역 친화성-기재분리이다. 예를 들어 일부 측면에서 분리는 세포의 예를 들어 그러한 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 파트너와의 배양에 의해, 전형적으로 세포 표면 마커의 세포 발현 또는 발현 수준에 기초한 세포 및 세포 집단의 분리를 포함하며, 일반적으로 세척 단계 및 항체 또는 결합 파트너에 결합한 세포를 항체 또는 결합 파트너에 결합하지 않은 세포로부터 분리하는 단계를 포함한다.
이러한 분리 단계는 항체 또는 결합 파트너에 결합하지 않은 세포가 보유되는 시약에 결합된 세포가 추가 사용을 위해 보유된 양성 선택 및/또는 음성 선택에 기초할 수 있다. 한 구체예에서, 두 분획은 추후 사용을 위해 보유된다. 일부 측면에서, 음성 선택은 이종 집단에서 세포 유형을 특이적으로 식별하는 항체가 이용 가능하지 않은 경우에 특히 유용할 수 있어, 원하는 집단 이외의 세포에 의해 발견된 마커에 기초하여 분리가 가장 잘 수행된다.
분리는 특정 세포 집단 또는 특정 마커를 발현하는 세포의 100% 농축 또는 제거를 수반할 필요는 없다. 예를 들어 마커를 발현하는 세포와 같은 특정 유형의 세포에 대한 양성 또는 농축은 그러한 세포의 수 또는 백분율을 증가시키는 것을 말하지만, 마커를 발현하지 않는 세포가 완전히 없게 할 필요는 없다. 마찬가지로, 마커를 발현하는 것과 같은 특정 유형의 세포의 음성 선택, 제거 또는 고갈은 그러한 세포의 수 또는 백분율을 감소시키는 것을 의미하지만 그러한 모든 세포를 완전히 제거할 필요는 없다.
일부 구체예에서, 한 번의 단계로부터 양 또는 음으로 선택된 분획이 후속적인 양성 또는 음성의 선택과 같은 다른 분리 단계를 거치는 다중 단계의 분리 단계가 수행된다. 일부 구체예에서, 단일 분리 단계는 복수의 항체 또는 결합 파트너와 함께 세포를 항온 처리함으로써, 복수의 마커를 동시에 발현하는 세포를 고갈시킬 수 있으며, 각각은 음성 선택을 목표로 하는 마커에 특이적이다. 마찬가지로, 여러 세포 유형은 다양한 세포 유형에서 발현되는 복수의 항체 또는 결합 파트너와 함께 세포를 배양함으로써 동시에 양성으로 선택될 수 있다.
예를 들어 일부 측면에서, 양성이거나 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및/또는 CD45RO+ T 세포의 높은 수준을 발현하는 세포와 같은 T 세포의 하위 집단은 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 분리된다.
예를 들어 CD3+, CD28+ T 세포는 항-CD3/항-CD28 콘쥬게이트된 자기 비드(conjugated magnetic bead)(예를 들어 DYNABEADS®M-450 CD3/CD28 T 세포 증폭기)를 사용하여 적극적으로 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 분리는 음성 선택에 의한 양성 선택 또는 특정 세포군의 고갈에 의해 특정 세포 집단에 대한 농축에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 양성 또는 음성 선택는 양성 또는 음성으로 선택된 세포 상에 상대적으로 높은 수준(마커 하이(high))으로 발현되거나 발현되는 하나 이상의 표면 마커(마커+)에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 다른 결합제와 세포를 인큐베이션시킴으로써 달성된다.
일부 구현예에서, T 세포는 B 세포, 단구 또는 CD14와 같은 다른 백혈구와 같은 비 T 세포에서 발현된 마커의 음성 선택에 의해 PBMC 샘플로부터 분리된다. 일부 측면에서, CD4+ 또는 CD8+ 선택 단계는 CD4+ 헬퍼 및 CD8+ 세포 독성 T 세포를 분리하는데 사용된다. 이러한 CD4+ 및 CD8+ 모집단은 하나 이상의 순진, 메모리 및/또는 효과기 T 세포 하위 집단에서 상대적으로 높은 정도로 발현되거나 표현된 마커에 대한 양성 또는 음성 선택에 의해 하위 집단으로 추가 분류될 수 있다.
일부 구현예에서, CD8+ 세포는 각각의 부분 집단과 관련된 표면 항원에 기초한 양성 또는 음성 선택에 의해서, 네이비(naive), 센트럴 메모리, 효과기 메모리(effector memory) 및/또는 센트럴 메모리 줄기 세포(central memory stem cell)를 추가로 농축하거나 고갈시킨다. 일부 구현예에서, 센트럴 메모리 T(TCM) 세포에 대한 농축은 증폭 및/또는 생체내 투여를 개선하는 것과 같은 효능을 증가시키기 위해 수행되며, 일부 측면에서는 특히 이러한 하위 집단에서 강건하다[문헌 「Terakura et al. (2012) Blood,1:72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701」 참조]. 일부 구현예에서, TCM-농축 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포를 결합시키는 것은 효능을 추가로 강화시킨다.
일부 구현예에서, 기억 T 세포는 CD8+ 말초 혈액 림프구의 CD62L+ 및 CD62L- 서브 세트에 모두 존재한다. PBMC는 항-CD8 및 항-CD62L 항체를 사용하는 것과 같은, CD62L-CD8+ 및/또는 CD62L+CD8+ 분획을 농축하거나 고갈시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 센트럴 메모리(central memory) T(TCM) 세포에 대한 농축은 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, 및/또는 CD127의 양성 또는 고표면 발현에 기초하며; 일부 측면에서 그것은 CD45RA 및/또는 그랜자임 B(granzyme B)를 발현하거나 고도로 발현하는 세포에 대한 음성 선택에 기초한다. 일부 구현예에서, 중앙 기억 T (TCM) 세포에 대한 농축은 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD27, 및/또는 CD127의 양성 또는 높은 표면 발현에 기반한다. 일부 구현예에서, 중앙 기억 T (TCM) 세포에 대한 농축은 CD62L, CCR7, CD28, 및/또는 CD27의 양성 또는 높은 표면 발현에 기반한다. 일부 구현예에서, 중앙 기억 T (TCM) 세포에 대한 농축은 CCR7, CD28, 및/또는 CD27의 양성 또는 높은 표면 발현에 기반한다. 일부 구현예에서, 중앙 기억 T (TCM) 세포에 대한 농축은 CD28 및 CD27의 양성 또는 높은 표면 발현에 기반한다. 일부 구현예에서, TCM 세포에 대해 농축된 CD8+ 집단의 분리는 CD4, CD14, CD45RA를 발현하는 세포의 고갈 및 CD62L을 발현하는 세포에 대한 양성 선택 또는 농축에 의해 수행된다. 일부 측면에서, TCM 세포에 대해 농축된 CD8+ 집단의 분리는 CD4, CD14, CD45RA를 발현하는 세포의 고갈 및 CD27 및 CD28을 발현하는 세포에 대한 양성 선택 또는 농축에 의해 수행된다. 일부 측면에서, 센트럴 메모리 T(TCM) 세포에 대한 농축은 CD14 및 CD45RA의 발현에 기초한 음성 선택 및 CD62L에 기초한 양성 선택을 실시한 CD4 발현에 기초하여 선택된 세포의 음성 분획으로 시작하여 수행한다. 일부 측면에서, 이러한 선택은 동시에 수행되고 다른 양상에서는 어느 순서로 순차적으로 수행된다. 일부 구현예에서, CD8+ 세포 집단 또는 부분 집단을 제조하는데 사용된 동일한 CD4 발현-기반 선택 단계는 또한 CD4+ 세포 집단 또는 하위 집단을 생성하는데 사용되어 CD4-기반 분리로부터의 양성 및 음성 분획을 둘 다 유지시켜서 상기 방법의 후속 단계에서 사용한 후, 선택적으로 하나 이상의 추가의 양성 또는 음성 선택 단계를 수행한다.
CD4+ T 헬퍼 세포는 세포 표면 항원을 가진 세포 집단을 확인함으로써 네이비하고 센트럴 메모리 및 효과 세포로 분류된다. CD4+ 림프구는 표준 방법으로 얻을 수 있다. 일부 구현예에서, 천연의 CD4+ T 림프구는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 센트럴 메모리 CD4+ 세포는 CD62L+ 및 CD45RO+이다. 일부 구현예에서, 효과기 CD4+ 세포는 CD62L- 및 CD45RO-이다.
한 구체예에서, 음성 선택에 의한 CD4+ 세포를 농축하기 위해, 단클론 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 결합 파트너는 양성 및/또는 음성 선택을 위한 세포의 분리를 허용하기 위해 자기 비드 또는 상자기 비드와 같은 고체 지지체 또는 매트릭스에 결합된다. 예를 들어 일부 구현예에서, 세포 및 세포 집단은 면역 자기(또는 친화력 자기) 분리 기술을 사용하여 분리 또는 분리된다[문헌 「Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks and U. Schumacher ⓒ Humana Press Inc., Totowa, NJ」에서 검토됨].
일부 측면에서, 분리될 세포의 샘플 또는 집단은 상자기 비드(예를 들어 Dynalbeads 또는 MACS 비드)와 같은 자기적으로 반응하는 입자 또는 미세 입자와 같은 작고 자화 가능한 또는 자기적으로 반응하는 물질로 배양된다. 자기 반응 물질, 예를 들어 입자는 세포, 세포 또는 분리하고자하는 세포 집단 상에 존재하는 분자, 예를 들어 표면 마커에, 예를 들어 음성 또는 양성으로 선발하는 것이 바람직하다는 것을 의미, 특이적으로 결합하는 항체와 같은 결합 파트너에 직접 또는 간접적으로 부착된다.
일부 구현예에서, 자성 입자 또는 비드는 항체 또는 다른 결합 파트너와 같은 특정 결합 부재에 결합된 자기 반응 물질을 포함한다. 자기 분리법에 많이 사용되는 자기 반응 재료가 있다. 적합한 자성 입자는 몰데이(Molday)의 미국특허 제4,452,773호 및 유럽특허 제452342 B호에 개시되어 있으며, 이는 본원에 참고로 인용된다. 오웬(Owen)의 미국특허 제4,795,698호 및 리버티(Liberti) 등의 미국특허 제5,200,084호에 기재된 것과 같은 콜로이드 상 입자는 다른 예이다.
일반적으로 배양은 샘플 내의 세포에 존재하는 경우, 자성 입자 또는 비드에 결합된 항체 또는 결합 파트너 또는 이 항체 또는 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 이차 항체 또는 다른 시약과 같은 분자가 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하는 조건 하에서 수행된다.
일부 측면에서, 샘플은 자기장에 놓이며, 자기적으로 반응하는 또는 자화 가능한 입자가 부착된 세포는 자석에 끌려가서 표지가 없는(unlabeled) 세포로부터 분리될 것이다. 긍정적인 선택의 경우, 자석에 끌리는 세포는 유지된다; 음성 선택의 경우 끌리지 않는 세포(표지가 없는 세포)은 유지된다. 일부 구현예에서, 양성 및 음성 선택의 조합은 양성 및 음성 분획이 보유되고 추가 처리되거나 추가 분리 단계에 종속되는 동일한 선택 단계에서 수행된다.
특정 구현예에서, 자기적 응답 입자는 1 차 항체 또는 다른 결합 파트너, 2차 항체, 렉틴, 효소 또는 스트렙타비딘에 코팅된다. 특정 구현예에서, 자성 입자는 하나 이상의 마커에 특이적인 1차 항체의 코팅을 통해 세포에 부착된다. 일부 구현예에서, 비드보다는 세포가 1차 항체 또는 결합 파트너로 표지되고, 이어서 세포-유형 특이적인 2차 항체 또는 다른 결합 파트너(예를 들어 스트렙타빈)-코팅 자성 입자가 첨가된다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘-코팅 자성 입자는 바이오티닐화된 1차 또는 2차 항체와 함께 사용된다.
일부 구현예에서, 자기적으로 반응하는 입자는 후속 배양, 배양 및/또는 조작되는 세포에 부착된 채로 남게 된다; 일부 구현예에서 입자는 환자에게 투여하기 위해 세포에 부착된 채로 남는다. 일부 구현예에서, 자화가능하거나 또는 자기적으로 반응하는 입자는 세포로부터 제거된다. 세포로부터 자화 가능한 입자를 제거하는 방법은 공지되어 있으며, 예를 들어 경쟁하는 비 표지된 항쳉 및 자화 가능한 입자 또는 절단 가능한 리어에 접합된 항체를 포함된다. 일부 구현예에서, 자화 가능한 입자는 생분해성이다.
일부 구현예에서, 친화도-기재 선택은 자기-활성화 세포 분류(MACS)(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)를 통해 이루어진다. 자기화성화 세포 분류(MACS) 시스템은 자화된 입자가 부착되 세포를 고순도로 선택할 수 있다. 일부 구현예에서, MACS는 비 표적종 및 표적종을 외부 자기장의 적용 후에 순차적으로 용출시키는 모드로 작동한다. 즉 자화된 입자에 부착된 세포는 부착되지 않은 화학종이 용리되는 동안 제 위치에 유지된다. 이어서, 이 첫 번째 용출 단계가 완료된 후, 자기장에 포획되어 용출되는 것을 방지한 종을 용리 및 회수할 수 있는 방법으로 자유롭게 한다. 일부 구현예에서, 비 표적 세포는 표적화되고 세포의 이종 집단으로부터 고갈된다.
일부 구현예에서, 추출 또는 분리는 세포 준비, 분리, 처리, 항온 배양, 배양 및/또는 방법의 제형 단계 중 하나 이상을 수행하는 시스템, 장치 또는 장치를 사용하여 수행된다. 일부 측면에서, 시스템은 폐쇄, 무균 환경, 예를 들어 에러, 사용자 취급 및/또는 오염을 최소화하기 위해 이들 단계 각각을 수행하는데 사용된다. 한 구체예에서, 시스템은 국제공개공보 제WO2009/072003호 또는 미국특허출원공보 제 20110003380호에 기재된 것과 같은 시스템이다.
일부 구현예에서, 시스템 또는 장치는 자동화된 또는 프로그래밍 가능한 방식으로, 하나 이상의, 예를 들어 모든 분리, 처리, 엔지니어링 및 제형 단계를 수행한다. 일부 측면에서, 시스템 또는 장치는 사용자가 처리, 격리, 엔지니어링 및 제형 단계의 결과를 프로그램, 제어, 평가 및/또는 조정할 수 있게 하는 시스템 및/또는 장치와 통신하는 컴퓨터 및/또는 컴퓨터 프로그램을 포함한다.
일부 측면에서, 분리 및/또는 다른 단계는 ClinMACS 시스템(Miltenyi Biotec)을 사용하여, 예를 들어 밀폐된 및 멸균 시스템에서 임상 규모의 세포의 자동화된 분리를 위해 수행된다. 구성 요소로는 통합 마이크로컴퓨터, 자기 분리 장치, 연동 펌프 및 다양한 핀치 밸브가 포함될 수 있다. 일부 측면에서 통합 컴퓨터는 계측기의 모든 구성요소를 제어하고 표준화된 순서로 반복적인 절차를 수행하도록 시스템에서 지시한다. 일부 측면에서 자기 분리 유닛은 이동 가능한 영구 자석 및 선택 칼럼용 홀더를 포함한다. 연동 펌프는 배관 세트 전체의 유속을 제어하며 핀치 밸브와 함께 시스템을 통한 완충액의 제어된 흐름과 세포의 지속적인 정지를 보장한다.
CliniMACS 시스템은 일부 측면에서 멸균 비 발열성 용액으로 공급되는 항체 결합 자성 입자를 사용한다. 일부 구현예에서, 자성 입자로 세포를 표지한 후, 세포를 세척하여 과량의 입자를 제거한다. 이어서 세포 준비 백을 튜빙 세트에 연결하고, 버퍼 세트 및 세포수집 백을 연결한다. 튜빙 세트는 프리-칼럼과 분리 칼럼을 포함하여 미리 조립된 무균 튜빙으로 구성되어 있으며 일회용으로만 사용된다. 분리 프로그램을 시작한 후, 상기 시스템은 세포 샘플을 자동으로 분리 칼럼에 적용한다. 표지된 세포는 칼럼 내에 보유되는 반면, 표지되지 않는 세포는 일련의 세척 단계에 의해 제거된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 지답은 표지되지 않고 칼럼에 보유되지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 표지되고 칼럼에 보유된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 자기장의 제거 후 칼럼으로부터 용리되어 세포수집 백 내에 수집된다.
특정 구현예에서, 분리 및/또는 다른 단계는 CliniMACS Prodigy 시스템(Miltenyi Biotec)을 사용하여 수행된다. 상기 CliniMACS Prodigy 시스템은 원심 분리에 의한 세포의 자동화된 세척 및 분별을 가능하게 하는 세포 처리 단일체를 갖추고 있다. 상기 CliniMACS Prodigy 시스템에는 소스 세포 생성물의 거시적 층(macroscopic layer)을 식별하여 최적의 세포 분획 종말점을 결정하는 온보드 카메라 및 이미지 인식 소프트웨어가 포함될 수 있다. 예를 들어 말초 혈액은 적혈구, 백혈구 및 혈장 층으로 자동 분리된다. 상기 CliniMACS Prodigy 시스템은 또한 세포 분화 및 증폭, 항원 로딩 및 장기 세포 배양과 같은 세포 배양 프로토콜을 수행하는 일체형 세포 배양 챔버를 포함할 수 있다. 입력 포트는 멸균 제거 및 매체의 보충을 허용할 수 있으며, 통합 현미경을 사용하여 세포를 모니터할 수 있다[문헌 예를 들어 「Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82, and Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701」 참조].
일부 구현예에서, 본원에 기술된 세포 집단은 유세포 계측법을 통해 수집 및 농축(또는 고갈)되며, 여기서 다수의 세포 표면 마커로 염색된 세포는 유체 스트림으로 운반된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 세포 집단은 예비 스케일(FACS)-분류를 통해 수집 및 농축(또는 고갈)된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 세포 집단은 FACS-기반 검출 시스템과 조합된 마이크로 전자 기계 시스템(MEMS) 칩의 사용에 의해 수집 및 농축(또는 고갈)된다[예를 들어 국제공개공보 제WO2010/033140호, 문헌 「Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573」; 및 「Godin et al. (2008) J Biophoton. 1(5):355-376」 참조]. 두 경우 모두 세포를 여러 마커로 분류하여 잘 정의된 T 세포 하위 세트를 고순도로 분리 할 수 있다.
일부 구현예에서, 항체 또는 결합 파트너는 하나 이상의 검출 가능한 카로 표지되어 양성 및/또는 음성 선택을 위한 분리를 용이하게 한다. 예를 들어 분리는 형광 표지된 항체와의 결합에 기초할 수 있다. 예를 들어 하나 이상의 세포 표면 마커에 특이적 항체 또는 다른 결합 파트너의 결합에 기초한 세포의 분리는 형광-활성 세포 분류(FACS)을 포함하는 분취용(FACS) 및/또는 미세 전자 기계 시스템(MEMS) 칩, 예를 들어 유세포 계측 탐지 시스템과 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 방법은 동시에 여러 마커를 기반으로 긍정적이고 부정적인 선택을 허용한다.
일부 구현예에서, 제조 방법은 분리, 항온 처리 및/또는 조작 전 또는 후에 세포를 동결, 예를 들어 냉동 보존하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 동결 및 후속 행동 단계는 과립구 및 어는 정도는 세포 집단 내의 단핵구를 제거한다. 일부 구현예에서, 세포는 예를 들어 혈장 및 혈소판을 제거하기 위한 세척 단계 후에 냉동 용액에 현탁된다. 임의의 다양한 공지된 동결 용액 및 파라미터가 사용될 수 있다. 일예로 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민(HSA) 또는 다른 적합한 세포 동결 배지를 함유하는 PBS를 사용하는 것을 포함한다. 그런 다음 DMSO와 HSA의 최종 농도가 각각 10%와 4%가 되도록 배지로 1 : 1로 희석한다. 이어서, 세포를 일반적으로 분당 1℃의 속도로 -80℃로 동결시키고 액체 질소 저장 탱크의 증기 상에 저장한다.
일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작 전에 또는 유전자 조작과 관련하여 배양 및/또는 배양된다. 배양 단계는 배양(culture), 배양(cultivation), 자극, 활성화 및/또는 증식을 포함 할 수 있다. 배양 및/또는 조작은 배양 용기 또는 세포 배양을 위한 유닛, 챔버, 웰, 칼럼, 튜브, 튜빙 세트, 밸브, 바이알, 배양 접시, 백 또는 기타 용기와 같은 배양 용기에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 집단 또는 세포는 자극 조건 또는 자극제의 존재하에 배양된다. 그러한 조건은 집단 내에서 세포의 증식, 증폭, 활성화 및/또는 생존을 유도하고, 항원 노출을 모방하고, 및/또는 재조합 항원 수용체의 도입과 같은 유전자 조작을 위해 세포를 준비하는 것을 포함한다.
조건은 하나 이상의 특정 매질, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 영양제, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예를 들어 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 용해성 수용체, 및 세포를 활성화 시키도록 고안된 임의의 다른 제제를 포함한다.
일부 구현예에서, 자극 조건 또는 작용제는 TCR 복합체의 세포내 신호 전달 영역을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 약제, 예를 들어 리간드를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 약제는 T 세포에서 TCR/CD3 세포내 신호 전달 계통을 작동시키거나 개시시킨다. 이러한 제제는 항체, 예를 들어 TCR에 특이적인 항체, 예를 들어 항-CD3을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 자극 조건은 하나 이상의 제제, 예를 들어 공자극 수용체를 자극할 수 있는 리간드, 예를 들어 항-CD28을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제제 및/또는 리간드는 고형 지지체 예를 들어 비드, 및/또는 하나 이상의 사이토카인에 결합될 수 있다. 선택적으로 상기 증폭 방법은 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체를 배양 배지에 (예를 들어 적어도 약 0.5ng/ml 농도로) 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극제는 IL-2, IL-15 및/또는 IL-7을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 IL-2 농도는 적어도 약 10 유닛/mL이다.
일부 측면에서, 배양은 미국특허 제6,040,177호, 문헌 「Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82, and/or Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701」에 기재된 기법에 따라 수행된다.
일부 구현예에서, 상기 T 세포는 비분할 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 같은 배양-개시 집단(culture-initiating poupulation)에 피더 세포(feeder cell)를 (예를 들어 결과적인 세포 집단이 확대될 초기 집단에서 각 T 림프구에 대해 적어도 약 5, 10, 20 또는 40 이상의 PBMC 공급 세포를 포함하도록) 첨가하고; 상기 배양물을 (예를 들어 T 세포의 수를 증폭시키기에 충분한 시간동안) 배양함으로써 확대시킨다. 일부 측면에서는, 비분할 피더 세포는 감마-조사 PBMC 피더 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, PBMC는 세포 분열을 방지하기 위해 약 3000 내지 3600 rad 범위의 감마선으로 조사된다. 일부 측면에서, 피더 세포는 T 세포 집단을 첨가하기 전에 배양 배지에 첨가된다.
일부 측면에서, 자극 조건은 인간 T 림프구의 성장에 적합한 온도, 예를 들어 적어도 약 25℃, 일반적으로는 약 30℃, 일반적으로는 약 37℃의 온도를 포함한다. 선택적으로, 배양은 피더 세포로서 비분할 EBV-형질전환 림프구 세포(LCL)를 첨가하는 것을 추가로 포함 할 수 있다. LCL은 약 6000 내지 10,000 rad의 범위의 감마선으로 조사될 수 있다. 일부 측면에서, LCL 피더 세포는 적당한 양으로, 예를 들어 약 10:1의 LCL 피더 세포 대 초기 T 림프구 비율의 양으로 제공된다.
일부 구현예에서, 항원-특이적 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포와 같은 항원 특이적 T 세포는 항원으로 순수 또는 항원 특이적 T 림프구를 자극함으로써 수득된다. 예를 들어 항원 특이적 T 세포주 또는 클론은 감염된 대상체로부터 T 세포를 분리하고 시험관내에서 동일한 항원으로 세포를 자극함으로써 사이토메갈로바이러스 항원(cytomegalovirus antigen)에 생성될 수 있다.
Ⅴ. 조성물 및 제형
일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 제조 공정에 의해 생성된 치료 조성물(예를 들어 치료용 T 세포 조성물), 예를 들어 조작된 (재조합 수용체-발현) T 세포를 함유하는 조성물이 여기서 제공된다. 일부 구현예에서, 여기, 예를 들어 섹션 III-F에 개시된 하나 이상의 임의의 특징을 갖는 치료 조성물(예를 들어 치료용 T 세포 조성물)이 여기서 제공된다. 일부 구현예에서, 재조합 항원 수용체, 예를 들어 CAR 또는 TCR로 조작된 세포를 포함하는 세포의 용량은 약학 조성물 또는 제형와 같은 조성물 또는 제형으로 제공된다. 상기 조성물은, 예를 들어 질환, 병태 및 장애의 예방 또는 치료에서 또는 검출, 진단 및 예후 방법에서 제공된 방법 및/또는 제공된 제조 물품 또는 조성물과 부합되게 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 치료학적 T 세포 조성물은 재조합 수용체를 발현하는 CD4+ T 세포 및 재조합 수용체를 발현하는 CD8+ T 세포를 함유하되, 상기 조성물 중의 총 수용체+/CD8+ 세포의 적어도 80%는 CD57-이고 상기 조성물 중의 총 수용체+/CD4+ 세포의 적어도 80%는 CD57-이다. 일부 구현예에서, 상기 치료학적 T 세포 조성물은 상기 조성물 중의 세포의 적어도 또는 적어도 약 80%, 적어도 또는 적어도 약 85%, 적어도 또는 적어도 약 90%, 적어도 또는 적어도 약 95%, 적어도 또는 적어도 약 96%, 적어도 또는 적어도 약 97%, 적어도 또는 적어도 약 98%, 적어도 또는 적어도 약 99%, 약 100%, 또는 100%가 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포인 것이다.
일부 구현예에서, 상기 치료학적 T 세포 조성물은 재조합 수용체를 발현하는 CD3+ T 세포를 포함하되, 상기 조성물 중의 총 수용체+/CD3+ 세포의 적어도 80%는 CD57-이다. 일부 구현예에서, 상기 치료학적 T 세포 조성물은 상기 조성물 중의 세포의 적어도 또는 적어도 약 80%, 적어도 또는 적어도 약 85%, 적어도 또는 적어도 약 90%, 적어도 또는 적어도 약 95%, 적어도 또는 적어도 약 96%, 적어도 또는 적어도 약 97%, 적어도 또는 적어도 약 98%, 적어도 또는 적어도 약 99%, 약 100%, 또는 100%가 CD3+ T 세포인 것이다.
일부 구현예에서, 상기 치료학적 T 세포 조성물은 상기 조성물 중의 수용체+/CD4+ T 세포 대 수용체+/CD8+ T 세포의 비율은 약 1:3 내지 약 3:1이고, 예를 들어 (약) 1:1이다.
일부 구현예에서, 상기 재조합 수용체는 섹션 IV.A에서 기술된 임의의 것이다. 일부 구현예에서, 상기 재조합 수용체는 질환, 장애 또는 병태의 세포 또는 조직과 관련되고/되거나, 그에 특이적이고/이거나, 그 위에서 발현된 표적 단백질에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다.
일부 구현예에서, 제공된 치료학적 조성물 중의 T 세포의 수는 (약) 10×106 세포 내지 (약) 200×106 세포이다. 일부 구현예에서, 제공된 치료학적 조성물 중의 T 세포의 수는 (약) 10×106 세포 내지 (약) 100×106 세포이다. 일부 구현예에서, 제공된 치료학적 조성물 중의 T 세포의 수는 (약) 10×106 세포 내지 (약) 70×106 세포이다. 일부 구현예에서, 제공된 치료학적 조성물 중의 T 세포의 수는 (약) 10×106 세포 내지 (약) 50×106 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 제공된 치료학적 조성물 중의 T 세포의 수는 (약) 50×106 세포 내지 (약) 200×106 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 제공된 치료학적 조성물 중의 T 세포의 수는 (약) 50×106 세포 내지 (약) 100×106 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 제공된 치료학적 조성물 중의 T 세포의 수는 (약) 50×106 세포 내지 (약) 70×106 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 제공된 치료학적 조성물 중의 T 세포의 수는 (약) 70×106 세포 내지 (약) 200×106 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 제공된 치료학적 조성물 중의 T 세포의 수는 (약) 70×106 세포 내지 (약) 100×106 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 제공된 치료학적 조성물 중의 T 세포의 수는 (약) 100×106 세포 내지 (약) 200×106 세포이다. 일부 측면에서, 상기 조성물의 부피는 1.0 mL 내지 10 mL이다. 일부 구현예에서, 상기 부피는 (약) 2 mL, (약) 3 mL, (약) 4 mL, (약) 5 mL, (약) 6 mL, (약) 7 mL, (약) 8 mL, (약) 9 mL, 또는 (약) 10 mL, 또는 전술한 수치의 임의의 값이다.
상기 용어 "약학적 제형"은 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 허용하는 형태이고, 상기 제형이 투여될 대상체에게 허용되지 않는 독성이 있는 부가 성분을 함유하지 않는 제형을 지칭한다.
"약학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분 이외의 약학적 제형의 성분을 나타내며, 이는 대상체에게 무독성이다. 약학적으로 허용가능한 담체는 완충제, 부형제, 안정제 또는 보존제를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
일부 구현예에서, 조작된 T 세포(예를 들어 CAR T 세포)와 같은 세포 요법은 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제형화된다. 일부 구현예에서, 담체의 선택은 부분적으로는, 특정 세포 또는 물질 및/또는 투여 방법에 의해 결정된다. 따라서, 다양한 적합한 제형이 존재한다. 예를 들어 약학 조성물은 보존제를 함유할 수 있다. 적합한 보존제는, 예를 들어 메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤조산나트륨 및 염화벤잘코늄을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 2종 이상의 보존제의 혼합물이 사용된다. 보존제 또는 그의 혼합물은 통상적으로 총 조성물 중 약 0.0001 중량% 내지 약 2 중량%의 양으로 존재한다. 담체는 예를 들어 문헌 「Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)」에 기술되어 있다. 담체는, 예를 들어 문헌 「Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A Ed (1980)」에 기재되어 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 일반적으로, 사용되는 용량 및 농도에서 수용체에 유독하지 않은 것이며, 인산염, 시트르산염 및 다른 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제(예를 들어 염화옥타데실디메틸벤질 암모늄; 염화헥사메토늄, 염화벤잘코늄; 염화벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기)의 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 소수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당류; 나트륨과 같은 염-형성 카운터-이온; 금속 복합체(예를 들어 Zn-단백질 복합체); 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 측면에서, 조성물 중에 완충제가 포함된다. 적합한 완충제는, 예를 들어 시트르산, 시트르산나트륨, 인산, 인산칼륨 및 다양한 다른 산 및 염을 포함한다. 일부 측면에서, 2종 이상의 완충제의 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 그의 혼합물은 통상적으로 총 조성물 중 약 0.001 중량% 내지 약 4 중량%의 양으로 존재한다. 투여 가능한 약학 조성물의 제조 방법이 공지되어 있다. 예시적인 방법이, 예를 들어 문헌 「Remington: Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed(May 1, 2005)」에 더욱 상세히 기재되어 있다.
제형 또는 조성물은 또한, 각각의 활성이 상호 악영향을 미치지 않는 세포 또는 제제에 의해 예방 또는 치료되는 특정 지표, 질환 또는 병태에 유용한 1종 이상의 활성 성분을 함유할 수 있는데, 예를 들어 그 활성은 세포에 상보성이고 및/또는 각각의 활성은 서로 유해한 영향을 주지 않는 것인 하나 이상의 활성 성분이다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 유효한 양으로 조합물 중에 적절히 존재한다. 따라서, 일부 구현예에서, 약학 조성물은 화학치료제, 예를 들어 아스파라기나제, 부술판, 카르보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플로우로우라실, 겜시타빈, 하이드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴, 빈크리스틴 등과 같은 다른 약학적 활성 제제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제제 또는 세포는 염, 예를 들어 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 투여된다. 적합한 약학적으로 허용 가능한 산 부가 염은 염산, 브롬화 수소산, 인산, 메타인산, 질산 및 황산과 같은 무기산 및 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 말산, 락트산, 푸마르산, 벤조산, 글리콜 산, 글루콘산, 숙신산 및 아릴술폰산, 예를 들어 p-톨루엔술폰산과 같은 유기산으로부터 유도된 것을 포함한다.
약학 조성물은 일부 구현예에서, 질환 또는 병태의 치료 또는 예방에 유효한 양, 예를 들어 치료적 또는 예방적 유효량의 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 치료 대상체의 주기적 평가에 의해, 치료적 또는 예방적 효능을 모니터링한다. 수일 또는 그 이상에 걸친 반복 투여에 대하여, 질환 상태에 따라, 치료는 원하는 질환 예후에 대한 억제가 나타날 때까지 반복된다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있고 결정될 수 있다. 요망되는 용량은 조성물의 단일 볼루스 투여, 조성물의 다회 볼루스 투여 또는 조성물의 연속 주입 투여에 의해 전달될 수 있다.
세포 또는 제제는 볼루스 주입, 주사, 예를 들어 정맥내 또는 피하 주사, 안내 주사, 눈 주위 주사, 망막하 주사, 유리체내 주사, 경 중격 주사, 공막하 주사, 맥락막내 주사, 전방내 주사, 결막하 주사(subconjectval injection), 결막하 주사(subconjuntival injection), 안각건하 주사, 안구후 주사, 안구 주위 주사 또는 후 방 공막 부근 전달에 의한 임의의 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 그것들은 비경구, 폐내 및 비내, 및 국소 치료가 필요한 경우, 병변내 투여에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 주어진 용량은 세포 또는 제제의 단일 일시 투여에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 그것은 예를 들어 3일 이하의 기간에 걸쳐 세포 또는 제제의 다중 일시 투여에 의해, 또는 세포 또는 제제의 연속 주입 투여에 의해 투여된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 적절한 투여량은 치료될 질환의 유형, 세포의 유형, 세포 또는 재조합 수용체의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 상기 제제 또는 세포가 예방적 혹은 치료적 목적으로 투여되는지의 여부, 이전 치료, 대상체의 임상 이력 및 상기 제제 또는 세포에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 의존할 수 있다. 조성물은 일부 구체 예에서 한번의 또는 일련의 치료에 걸쳐 대상체에게 적합하게 투여된다.
세포 또는 제제는 표준 투여 기법, 제형 및/또는 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 상기 조성물의 저장 및 투여를 위하여, 제형 및 시린지 및 바이알과 같은 장치가 제공된다. 세포에 관하여, 투여는 자가 또는 이종의 것일 수 있다. 예를 들어 면역반응 세포 또는 전구세포는 하나의 대상체로부터 얻어질 수 있으며, 동일한 대상체 또는 상용 가능한 상이한 대상체에 투여될 수 있다. 말초혈액 유도 면역반응 세포 또는 그의 전구세포(예를 들어 생체내, 생체외 또는 시험관내 유래)는 카테터 투여, 전신 주사, 국소 주사, 정맥내 주사 또는 비경구 투여를 포함하여, 국소 주사를 통해 투여될 수 있다. 치료 조성물(예를 들어 유전자 변형된 면역반응 세포를 함유하는 약학 조성물 또는 신경 독성 증상을 치료하거나 개선하는 제제)의 투여 시, 이는 일반적으로 단위 용량의 주사 가능한 형태(용액, 현탁액, 유제)로 제형화될 것이다.
제형은 경구, 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근육내, 비강내, 협측, 설하 또는 좌제 투여용의 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 제제 또는 세포 집단은 비경구로 투여된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "비경구"는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질 및 복강내 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 제제 또는 세포 집단은 정맥내, 복강내 또는 피하 주사에 의해, 말초 전신 전달을 사용하여, 대상체에 투여된다.
일부 구현예에서, 조성물은, 일부 측면에서 선택된 pH로 완충될 수 있는 멸균 액체 제조물, 예를 들어 등장성 수용액, 현탁액, 유제, 분산액 또는 점성 조성물로서 제공된다. 액체 제조물은 일반적으로 겔, 다른 점성 조성물 및 고체 조성물보다 제조가 용이하다. 추가로, 액체 조성물은 특히 주사에 의해 투여하기에 다소 편리하다. 한편, 점성 조성물은 특정 조직과의 접촉 시간을 연장하기 위해 적절한 점성 범위 내에서 제형화될 수 있다. 액체 또는 점성 조성물은, 예를 들어 물, 염수, 인산염 완충 염수, 폴리올(예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있는 담체를 포함할 수 있다.
용매, 예를 들어 적절한 담체, 희석제 또는 부형제, 예를 들어 멸균수, 생리 염수, 글루코스, 덱스트로스 등과의 혼합물에 상기 제제 또는 세포를 도입입시킴으로써, 멸균 주사용 용액을 제조할 수 있다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균된 것이다. 멸균은, 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
VI. 치료 방법
예를 들어 임의의 조작된 세포 또는 여기 기재된 조작된 세포를 함유하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 여기에 제공된다. 일부 측면에서, 임의의 조작된 세포 또는 여기에 기재된 조작된 세포를 함유하는 조성물을 대상체, 예를 들어 질환 또는 장애가 있는 대상체에 투여하는 방법이 또한 제공된다. 일부 측면에서, 질환 또는 장애의 치료를 위한 임의의 조작된 세포 또는 여기에 기재된 조작된 세포를 함유하는 조성물의 용도가 또한 제공된다. 일부 측면에서, 질환 또는 장애의 치료를 위해 약제의 제조를 위한 임의의 조작된 세포 또는 여기에 기재된 조작된 세포를 함유하는 조성물의 용도가 또한 제공된다. 일부 측면에서, 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 또는 질환 또는 장애가 있는 대상체에 투여하기 위한 임의의 조작된 세포 또는 여기에 기재된 조작된 세포를 함유하는 조성물이 또한 제공된다.
입양 세포 요법을 위한 세포의 투여 방법은 공지되어 있으며 제공된 방법 및 조성물과 관련하여 사용될 수 있다. 예를 들어 입양 T 세포 요법 방법은 예를 들어 문헌[미국 특허 출원 공개 번호 2003/0170238(Gruenberg et al); 미국특허 4,690,915(Rosenberg); Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85)]에 기재되어 있다. 예를 들어 문헌 「Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338」을 참조한다.
일부 구현예에서, 상기 대상체, 예를 들어 질환 또는 장애를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체는 낮은 또는 감소된 양의 CD57+ T 세포를 갖는 세포 요법제를 투여받는다. 특정 구현예에서, 상기 세포 요법제 중의 CD57+ 세포의 양 또는 빈도는 투여 전에 측정된다. 특정 구현예에서, 상기 세포 요법제는 (약) 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 1% 미만의 CD57+ T 세포를 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 세포 요법제 중의 CD57+ 세포의 양 또는 빈도가 측정되고, 상기 세포 요법제는 상기 세포가 (약) 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 1% 미만의 CD57+ T 세포를 갖는 경우 상기 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 세포 요법제는 (약) 25% 미만의 CD57+ T 세포를 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 세포 요법제는 (약) 10% 미만의 CD57+ T 세포를 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 세포 요법제는 (약) 임계량 미만의 CD57+ T 세포를 갖는다.
특정 구현예에서, 상기 대상체, 예를 들어 질환 또는 장애를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체는 낮은 또는 감소된 양의 CD57 발현에 대해 양성인 T 세포 또는 대상체는 낮은 또는 감소된 양의 CD57 발현과 관련된 특성(trait)을 갖는 세포 요법제를 투여받는다. 일부 구현예에서, 상기 CD57 발현과 관련된 특성은 상기 세포 요법제를 대상체에 투여하기 전에 세포 요법제의 세포에서 측정된다. 특정 구현예에서, 상기 CD57 발현과 관련된 특성은 상기 세포 요법제에서 측정되고, 상기 세포 요법제는 상기 세포가 상기 CD57 발현과 관련된 특성의 임계값 미만인 경우 상기 대상체에 투여된다.
특정 구현예에서, 상기 임계값은 예비결정된 값이다. 일부 구현예에서, 상기 임계값은 실험적으로 유도된다. 일부 구현예에서, 상기 임계값은 복수의 세포 요법제에서 측정된 상기 특성의 평균, 중앙값, 또는 평균값이다. 일부 구현예에서, 상기 임계값은 복수의 세포 요법제, 예를 들어 참조 세포 요법제의 측정으로부터 실험적으로 유도된다. 일부 구현예에서, 상기 참조 세포 요법제는 T 세포의 참조 조성물, 예를 들어 재조합 수용체를 발현하는 T 세포를 포함하는 T 세포 조성물이다. 특정 구현예에서, T 세포, 예를 들어 재조합 수용체를 발현하는 T 세포의 참조 조성물은 대상체에 투여하기 전에 측정된다.
특정 구현예에서, 상기 참조 세포 요법제 또는 참조 T 세포 조성물은 동일한 질환, 장애 또는 병태를 치료하기 위해 세포 요법을 받은 대상체의 군으로부터, T 세포, 예를 들어 재조합 수용체를 발현하는 T 세포를 포함하는 상기 세포 요법제의 조성물이다. 일부 구현예에서, 참조 세포 요법제 또는 참조 T 세포 조성물은 부분 반응 또는 진행성 질환으로 발전하는 대상체에 투여되는 T 세포 조성물이다.
일부 구현예에서, 상기 CD57 발현과 관련된 특성은 총 T 세포, 총 CD4+ T 세포, 또는 총 CD8+ T 세포 중에 존재하는 수준 또는 양이다. 특정 구현예에서, 상기 특성은 상기 용량의 총 T 세포, 총 CD4+ T 세포, 또는 총 CD8+ T 세포 중에 존재하는 CD57 폴리펩티드의 수준 또는 양이다. 일부 구현예에서, 상기 특성은 총 T 세포, 총 CD4+ T 세포, 또는 총 CD8+ T 세포의 표면상에 존재하는 CD57 폴리펩티드의 수준 또는 양이다. 다양한 구현예에서, 상기 특성은 총 CD57+ T 세포, 총 CD57+CD4+ T 세포, 또는 총 CD57+CD8+ T 세포의 빈도, 백분율, 또는 양이다. 특정 구현예에서, 상기 특성은 상기 용량의 상기 T 세포 중에 존재하는 CD57 mRNA의 수준 또는 양이다. 일부 구현예에서, 상기 특성은 CD57을 암호화하는 유전자의 접근성(B3GAT1)의 수준 또는 양이다.
일부 구현예에서, 상기 CD57 발현과 관련된 특성은 총 CD3+ T 세포 중에 존재하는 수준 또는 양이다. 특정 구현예에서, 상기 특성은 상기 용량의 총 CD3+ T 세포 중에 존재하는 CD57 폴리펩티드의 수준 또는 양이다. 일부 구현예에서, 상기 특성은 총 CD3+ T 세포의 표면상에 존재하는 CD57 폴리펩티드의 수준 또는 양이다. 다양한 구현예에서, 상기 특성은 총 CD57+CD3+ T 세포의 빈도, 백분율, 또는 양이다. 특정 구현예에서, 상기 특성은 상기 용량의 상기 T 세포 중에 존재하는 CD57 mRNA의 수준 또는 양이다. 일부 구현예에서, 상기 특성은 CD57을 암호화하는 유전자의 접근성(B3GAT1)의 수준 또는 양이다.
특정 구현예에서, 상기 임계값은 복수의 참조 세포 요법제 도는 참조 T 세포 조성물에서 CD57 발현과 관련된 특성의 평균, 평균값, 또는 중앙값 측정치, 약 그 측정치, 또는 그 측정치의 75%, 60%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% 이내, 또는 그 미만이다. 상기 양은 상기 특성의 평균, 평균값, 또는 중앙값 측정치 미만인 표준 편차의 1, 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, 1/8, 또는 1/10이다. 특정 구현예에서, 상기 임계값은 복수의 참조 T 세포 조성물 또는 참조 세포 요법제로부터의 조성물에서 CD57 발현과 관련된 특성의 최저 측정치 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 임계치는 상기 복수의 참조 T 세포 조성물 또는 참조 세포 요법제 중에서 측정된 특성의 최저 측정치의 (약) 50%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% 이내, 또는 1% 미만이다. 특정 구현예에서, 상기 임계값은 상기 참조 T 세포 조성물 또는 참조 세포 요법제 중의 빈도로부터 계산된 CD57 발현과 관련된 특성의 평균, 중앙값, 또는 평균값 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 임계값은 복수의 참조 T 세포 조성물로부터 취한 측정치들의 (약), 또는 적어도 25%, 33%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 평균, 중앙값, 또는 평균값 측정치이다.
특정 구현예에서, CD57 발현과 관련된 상기 특성은 상기 세포 요법제를 대상체에 투여하기 전에 상기 세포 요법제 중에서 측정된다. 일부 구현예에서, 상기 측정은 대상체가 완전 반응을 경험하지 않을 위험, 확률 또는 가능성을 평가하는데 사용된다. 특정 구현예에서, 상기 측정은 대상체가 세포 요법제 투여 후 부분 반응 또는 진행성 질환 결과를 경험할 위험, 확률 또는 가능성을 평가하는데 사용된다. 특정 구현예에서, 상기 대상체는 상기 특성의 값이 상기 특성의 임계값을 초과하는 경우 상기 세포 요법제의 투여에 따른 완전 반응을 경험하지 못할 위험, 가능성, 또는 확률이 증가된 것으로 결정된다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 상기 특성의 값이 상기 특성의 임계값을 초과하는 경우 상기 세포 요법제의 투여에 따른 부분 반응 또는 진행성 질환을 경험할 증가된 위험, 가능성, 또는 확률을 갖는 것으로 결정된다. 일부 구현예에서, 상기 임계값은 본원에서 기술된 CD57과 관련된 특성의 임의의 임계값이다.
일부 구현예에서, 상기 세포 요법제의 투여 후 완전 반응을 달성하지 못할 위험이 증가된 것으로 간주되는 대상체는 상기 세포 요법제의 용량의 투여 후 (약) 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15% 10% 미만, 또는 10% 미만의 빈도를 갖는 완전 반응을 달성하게 된다. 일부 구현예에서, 완전 반응을 달성하지 못할 위험이 증가된 것으로 간주되는 대상체는 상기 세포 요법제의 용량의 투여 후 (약) 20% 미만의 빈도를 갖는 완전 반응을 달성하게 된다. 다양한 구현예에서, 완전 반응을 달성하지 못할 위험이 증가된 것으로 간주되는 대상체는 상기 세포 요법제의 용량의 투여 후 (약) 0%의 빈도를 갖는 완전 반응을 달성하게 된다.
특정 구현예에서, 상기 세포 요법제의 투여 후 부분 반응 또는 진행성 질환 결과를 달성할 위험이 증가된 것으로 간주되는 대상체는 상기 세포 요법제의 용량의 투여 후 (약) 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 미만, 또는 10% 미만의 빈도를 갖는 완전 반응을 달성하게 된다. 다양한 구현예에서, 상기 세포 요법제의 투여 후 부분 반응 또는 진행성 질환 결과를 달성할 위험이 증가된 것으로 간주되는 대상체는 상기 세포 요법제의 용량의 투여 후 20% 미만의 빈도를 갖는 완전 반응을 달성하게 된다. 다양한 구현예에서, 상기 세포 요법제의 투여 후 부분 반응 또는 진행성 질환 결과 반응을 달성할 위험이 증가된 것으로 간주되는 대상체는 상기 세포 요법제의 용량의 투여 후 (약) 0%의 빈도를 갖는 완전 반응을 달성하게 된다.
특정 구현예에서, 완전 반응을 달성하지 못할 위험이 증가된 것으로 간주되는 대상체는 예를 들어 대상체가 완전 반응을 달성하기 위해 계속할 가능성 또는 확률을 개선하기 위해 증가된 용량의 세포 요법을 받는다. 일부 구현예에서, 부분 반응 또는 진행성 질환 결과를 달성할 위험이 증가된 것으로 간주되는 대상체는 예를 들어 대상체가 완전 반응을 달성하기 위해 계속 진행할 가능성 또는 확률을 개선하기 위해 증가된 용량의 세포 요법을 받는다.
치료되는 질환 또는 병태는 항원의 발현이 질환 상태 또는 장애의 병인과 관련되고 및/또는 이를 수반하고, 예를 들어 그러한 질환, 병태, 또는 장애를 일으키거나, 악화시키거나, 그렇지 않으면 수반한다. 예시적인 질환 및 상태는 세포의 악성종양 또는 형질전환(예를 들어 암), 자가 면역 또는 염증성 질환, 또는 감염성 질환과 연관된 질환 또는 병태를 포함할 수 있고, 예를 들어 박테리아, 바이러스, 또는 다른 병원체에 의해 발생한다. 치료될 수 있는 다양한 질환 및 상태와 관련된 항원을 포함하는 예시적인 항원은 앞서 서술된다. 특정 구현예에서, 키메릭 항원 수용체 또는 트랜스제닉 TCR은 질환 또는 병태와 관련된 항원에 특이적으로 결합한다. 질환 중에, 상태 및 장애는 고형 종양, 혈액 악성 종양 및 흑색종을 포함하는 종양 및 국소 및 전이성 종양을 포함하고, 전이성 종양, 바이러스 또는 다른 병원체, 예를 들어 HIV, HCV, HBV, CMV, HPV, 및 기생충 질환으로 감염된 것과 같은 감염성 질환, 및 자가면역 및 염증성 질환을 포함하는 종양이다.
일부 구현예에서, 질환, 장애 또는 상태는 종양, 암, 악성 종양, 신생물, 또는 다른 증식성 질환 또는 장애이다. 그러한 질환은 백혈병, 림프종, 예를 들어 급성 골수(또는 골수성) 백혈병(AML), 만성 골수(또는 골수성) 백혈병(CML), 급성 림프구(또는 림프구성) 백혈병(ALL), 만성 림프구 백혈병(CLL), 털세포 백혈병(HCL), 작은 림프구 림프종(SLL), 맨틀 세포 림프종(MCL), 한계 영역 림프종, 버킷 림프종, 호지킨 림프종(HL), 비-호지킨 림프종(NHL), 퇴행성 거대세포 림프종(ALCL), 여포성 림프종, 불응성 여포성 림프종, 확산성 거대 B- 세포 림프종(DLBCL) 및 다발성 골수종(MM)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 급성 림프모구 백혈병(ALL), 성인 ALL, 만성 림프모구 백혈병 (CLL), 비-호지킨 림프종(NHL) 및 확산성 거대 B-세포 림프종(DLBCL) 중으로부터 선택된 B 세포 악성 종양이다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 NHL이고, NHL은 공격적인 NHL, 확산성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), NOS(무통으로부터 de novo 및 형질전환된), 1차 종격동 거대 B 세포 림프종(PMBCL), T 세포/조직세포-농축 거대 B 세포 림프종(TCHRBCL), 버킷 림프종, 맨틀 세포 림프종(MCL) 및/또는 여포성 림프종(FL), 선택적으로, 여포성 림프종 3B(FL3B)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 바이러스성, 레트로바이러스성, 박테리아성, 및 원생동물 감염, 면역 결핍, 사이토메갈로바이러스(CMV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 아데노바이러스, BK 폴리오마바이러스와 같은 감염성 질환 또는 병태이다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 자가 면역 또는 염증성 질환 또는 병태, 예를 들어 관절염, 예를 들어 류마티스 관절염(RA), 제 1형 당뇨병, 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 염증성 장 질환, 건선, 경피증, 자가면역 갑상선 질환, 그레이브병, 크론병, 다발성 경화증, 천식 및/또는 이식과 관련된 질환 또는 병태이다.
일부 구현예에서, 질환 또는 장애와 관련된 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 인테그린), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산탈수효소 9(CA9, 또한 CAIX 또는 G250로 공지됨), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, 또한 NY-ESO-1 및 LAGE-2로 공지됨), 암태아성 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 절단된 표피 성장 인자 단백질(tEGFR), III형 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백 2 (EPG-2), 상피 당단백 40(EPG-40), 에프린 B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5, 또한 Fc 수용체 유사 5 또는 FCRH5로 공지됨), 태아성 아세틸콜린 수용체(태아성 AchR), 폴레이트 결합 단백질(FBP), 폴레이트 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화된 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 커플링된 수용체 5D(GPCR5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량-멜라노마-연관 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나아제 삽입 도메인 수용체 (kdr), 카파 경쇄, L1 세포 접착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 리치 반복 함유 8 패밀리 멤버 A(LRRC8A), 루이스 Y, 멜라노마-연관 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 그룹 2 구성원 D(NKG2D) 리간드, 멜란 A(MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 온코페탈 항원, 멜라노마의 우선 발현된 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 서바이빈, 세포영양막 당단백(TPBG, 또한 5T4로 공지됨), 종양-연관 당단백 72(TAG72), 티로시나제 관련된 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75라고도 알려짐), 티로시나제 관련된 단백질 2(TRP2, 도파크롬 타우토머라제(dopachrome tautomerase), 도파크롬 델타-이소머라제(dopachrome delta-isomerase) 또는 DCT라고도 알려짐), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 윌름스 종양 1(WT- 1), 병원체-특이적 또는 병원체-발현된 항원, 또는 유니버설 태그로 연관된 항원, 및/또는 비오틴화 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현되는 분자이거나 또는 그들을 포함한다. 일부 구현예에서 수용체에 의해 표적화된 항원은 다수의 공지된 B 세포 마커의 하나와 같은 B 세포 악성 종양과 연관된 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b 또는 CD30이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항원은 병원체-특이적 또는 병원체-발현된 항원, 예를 들어 바이러스성 항원(예를 들어 HIV, HCV, HBV 등으로부터 바이러스성 항원), 박테리아성 항원, 및/또는 기생충 항원이이거나 또는 그를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어 scFv 또는 VH 도메인)은 CD19와 같은 항원을 특이적으로 인식한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 CD19에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편에서 유래하거나 이의 변이체이다. 일부 구현예에서, 세포 치료, 예를 들어 입양 T 세포 치료는 자가 전달에 의해 수행되고, 여기서 세포는 세포 치료를 받을 대상체, 또는 그러한 대상체로부터 유래된 샘플로부터 분리 및/또는 그렇지 않으면 준비된다. 따라서, 일부 측면에서, 세포는 치료를 필요로 하는 대상체, 예를 들어 환자로부터 유래되고, 분리 및 처리 후 동일한 대상체에 투여된다.
일부 구현예에서, 세포 치료, 예를 들어 입양 T 세포 치료는 동종이계 전달에 의해 수행되고, 여기서 세포는 세포 치료를 받거나 궁극적으로 받을 대상체, 예를 들어 제 1 대상체 이외의 대상체로부터 분리 및/또는 그렇지 않으면 준비된다. 그러한 구현예에서, 그다음, 세포는 동일한 종의 다른 대상체, 예를 들어 제 2 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 제 1 및 제 2 대상체는 유전적으로 유사하다. 일부 구현예에서, 제 2 대상체는 제 2 대상체와 동일한 HLA 클래스 또는 슈퍼타입을 발현한다.
세포는 볼루스 주입, 주사, 예를 들어 정맥내 또는 피하 주사, 안구내 주사, 눈주위(periocular) 주사, 망막하 주사, 유리체내 주사, 트랜스-경막 주사, 공막하 주사, 맥락막내 주사, 전방내 주사, 결막하(subconjectval, subconjuntival) 주사, 서브-테논 주사, 안구후 주사, 안구주위(peribulbar) 주사, 또는 후배엽 전달에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 그들은 비경구, 폐내 및 비강 내, 및 국소 치료를 위해 필요한 경우, 병변내 투여에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 주어진 용량은 세포의 단일 일시 투여에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 그것은 예를 들어 3 일 이하의 기간에 걸쳐 세포의 다중 일시 투여에 의해, 또는 세포의 연속 주입 투여에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 세포 용량의 투여 또는 임의의 추가 치료, 예를 들어 림프구 마비 치료, 중재 치료 및/또는 병용 치료는 외래 환자 전달을 통해 수행된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 적절한 투여량은 치료될 질환의 유형, 세포 또는 재조합 수용체의 타입, 질환의 중증도 및 과정, 세포가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전 치료, 대상체의 임상 이력 및 세포에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 의존할 수 있다. 조성물 및 세포는 일부 구체 예에서 한번의 또는 일련의 치료에 걸쳐 대상체에게 적합하게 투여된다.
일부 구현예에서, 세포는 조합 치료의 일부로서, 예를 들어 동시에 또는 순차적으로, 임의의 순서로, 다른 치료적 개입, 예를 들어 항체 또는 조작된 세포 또는 수용체 또는 작용제, 예를 들어 세포독성 또는 치료제가 투여된다. 일부 구현예에서 세포는 하나 이상의 추가 치료제와 함께 또는 다른 치료적 개입과 관련하여 동시에 또는 임의의 순서로 동시에 투여된다. 일부 상황에서, 세포는 세포 집단이 하나 이상의 추가 치료제의 효과를 향상시키도록 또는 그 반대의 시간에 충분히 근접한 다른 치료와 공동-투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 작용제는 예를 들어 지속성을 향상시키기 위해, IL-2와 같은 사이토카인을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 화학요법 작용제의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 예를 들어 투여 전에 종양 부담을 감소시키기 위해, 화학요법 작용제, 예를 들어 처리 화학요법 작용제의 투여를 포함한다.
일부 측면에서 면역결핍(예를 들어 림프구결핍) 치료를 가진 전처리 대상체는 입양 세포 치료(ACT)의 효과를 개선시킬 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 방법은 세포 치료의 개시 전에 대상체에 전처리 작용제, 예를 들어 림프구 마비 또는 화학요법 작용제, 예를 들어 사이클로포스파마이드, 플루다라빈, 또는 그의 조합을 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어 대상체는 세포 치료의의 개시 적어도 2일 전, 예를 들어 적어도 3, 4, 5, 6 또는 7 일 전 전처리 작용제를 투여받는다. 일부 구현예에서, 대상체는 세포 치료의 개시 7 일 이하 전, 예를 들어 6, 5, 4, 3 또는 2일 이하 이전에 전처리 작용제를 투여받는다.
일부 구현예에서, 대상체는 20 mg/kg 내지 100 mg/kg 또는 약 20 mg/kg 내지 100 mg/kg, 예를 들어 40 mg/kg 내지 80 mg/kg 또는 약 40 mg/kg 내지 80 mg/kg의 용량으로 사이클로포스파마이드로 전처리된다. 일부 측면에서, 대상체는 60 mg/kg 또는 약 60 mg/kg의 사이클로포스파마이드로 전처리된다. 일부 구현예에서, 사이클로포스파마이드는 단일 용량으로 투여될 수 있거나, 매일, 격일로 또는 3 일 마다 주어진 것과 같은 복수의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 사이클로포스파마이드는 1일 또는 2일 동안 1일 1회 투여된다. 일부 구현예에서, 림프구 마비 작용제가 사이클로포스파마이드를 포함하는 경우, 대상체는 사이클로포스파마이드를 100 mg/m2내지 500 mg/m2또는 약 100 mg/m2내지 500 mg/m2, 예를 들어 200 mg/m2 내지 400 mg/m2 또는 250 mg/m2 내지 350 mg/m2 또는 약 200 mg/m2 내지 400 mg/m2 또는 약 250 mg/m2 내지 350 mg/m2의 용량으로 투여된다. 일부 예시에서, 대상체는 약 300 mg/m2 의 사이클로포스파마이드로 투여된다. 일부 구현예에서, 사이클로포스파마이드는 단일 용량으로 투여될 수 있거나, 매일, 격일로 또는 3 일 마다 주어진 것과 같은 복수의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 사이클로포스파마이드는 1일 내지 5 일 동안, 예를 들어 3 일 내지 5 일 동안과 같이, 매일 투여된다. 일부 경우에, 대상체는 세포 치료의 개시 전에 3 일 동안 매일 약 300 mg/m2의 사이클로포스파마이드를 투여받는다.
일부 구현예에서, 림프구 마비 작용제가 플루다라빈을 포함하는 경우, 대상체는 1 mg/m2 내지 100 mg/m2 또는 약 1 mg/m2 and 100 mg/m2, 예를 들어 10 mg/m2 내지 75 mg/m2, 15 mg/m2 내지 50 mg/m2, 20 mg/m2 내지 40 mg/m2, 또는 24 mg/m2 내지 35 mg/m2, 또는 약 10 mg/m2 내지 75 mg/m2, 15 mg/m2 내지 50 mg/m2, 20 mg/m2 내지 40 mg/m2, 또는 24 mg/m2 내지 35 mg/m2의 용량으로 플루다라빈을 투여받는다. 일부 예시에서, 대상체는 약 30 mg/m2의 플루다라빈을 투여받을 수 있다. 일부 구현예에서, 플루다라빈은 단일 용량으로 투여될 수 있거나, 매일, 격일로 또는 3 일 마다 주어진 것과 같은 복수의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 플루다라빈은 1일 내지 5 일 동안, 예를 들어 3 일 내지 5 일 동안과 같이, 매일 투여된다. 일부 경우에, 대상체는 세포 치료의 개시 전에 3 일 동안 매일 약 30 mg/m2의 플루다라빈을 투여받는다.
일부 구현예에서, 림프구 마비 작용제는 작용제의 조합, 예를 들어 사이클로포스파마이드 및 플루다 라빈의 조합을 포함한다. 따라서, 작용제의 조합은 앞서 기재된 바와 같은 임의의 용량 또는 투여 스케쥴에서 사이클로포스파마이드 및 앞서 기재된 바와 같은 임의의 용량 또는 투여 스케쥴에서 플루다라빈을 포함할 수 있다. 예를 들어 일부 측면에서, 대상체는 1차 또는 후속 용량 전에 60 mg/kg (~ 2 g/m2)의 사이클로포스파마이드 및 3회 내지 5 회 용량의 25 mg/m2 플루다라빈을 투여받는다.
세포의 투여 후, 일부 구현예에서 조작된 세포 집단의 생물학적 활성은 예를 들어 임의의 다수의 공지 된 방법에 의해 측정된다. 평가하는 파라미터는 in vivo, 예를 들어 영상화, 또는 ex vivo, 예를 들어 ELISA 또는 유세포 분석에 의해 조작된 또는 천연 T 세포 또는 다른 면역 세포의 항원에 대한 특이 적 결합을 포함한다. 특정 구현예에서, 조작된 세포가 표적 세포를 파괴하는 능력은 예를 들어 Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), 및 Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004) 에서 서술된 세포독성 분석과 같은 적합한 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포의 생물학적 활성은 CD107a, IFNγ, IL-2 및 TNF와 같은 하나 이상의 사이토카인의 발현 및/또는 분비를 분석함으로써 측정된다. 일부 측면에서, 생물학적 활성은 종양 부담 또는 부하 감소와 같은 임상 결과를 평가함으로써 측정된다.
특정 구현예에서, 조작된 세포는 임의의 수의 방식으로 추가로 변형되어, 그의 치료 또는 예방 효능이 증가된다. 예를 들어 집단에 의해 발현된 조작된 CAR 또는 TCR은 링커를 통해 표적 부분에 직접 또는 간접적으로 컨쥬게이션될 수 있다. 표적 부분에 대한 적화합물, 예를 들어 CAR 또는 TCR을 컨쥬게이션시키는 관행은 공지되어 있다. 예를 들어 Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 1 1 1 (1995), 및 미국특허 5,087,616 참고.
일부 구현예에서, 세포는 조합 치료의 일부로서, 예를 들어 항체 또는 조작된 세포 또는 수용체 또는 시약, 예를 들어 세포 독성제 또는 치료제와 같은 다른 치료적 개입과 동시에 또는 순차적으로 임의의 순서로와 같이 조합 치료의 일부로서 투여된다. 일부 구현예에서 세포는 하나 이상의 추가 치료제 또는 다른 치료 개입과 관련하여 어떤 순서로든 동시에 또는 순차적으로 공동-투여된다. 일부 상황에서, 상기 세포들은, 충분히 가까운 시간에 또 다른 요법과 공동-투여되어, 세포 집단은 하나 이상의 추가 치료제의 효과를 향상시키거나 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 제제는 예를 들어 지속성을 향상시키기 위해 IL-2와 같은 사이토카인을 포함한다.
A. 투여량
일부 구현예에서, 세포의 용량은 제공된 방법, 및/또는 제조 또는 조성물의 제공된 물품에 따라 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 용량의 크기 또는 시기는 대상체에서 특정 질환 또는 병태의 함수로서 결정된다. 일부 경우에, 제공된 설명의 관점에서 특정 질환에 대한 용량의 크기 또는 시기는 경험적으로 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포의 용량은 2×105 개의 세포/kg 내지 2×106 개의 세포/kg 또는 약 2×105 개의 세포/kg 내지 2×106 개의 세포/kg, 예를 들어 4×105 개의 세포/kg 내지 1×106 개의 세포/kg 또는 약 4×105 개의 세포/kg 내지 1×106 개의 세포/kg 또는 6×105 개의 세포/kg 내지 8×105 개의 세포/kg 또는 약 6×105 개의 세포/kg 내지 8×105 개의 세포/kg를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 용량은 2×105 대상체의 킬로그램 체중 당 세포(예를 들어 항원-발현, 예를 들어 CAR- 발현 세포)(세포/kg) 이하, 예를 들어 3×105 개의 세포/kg 또는 약 3×105 개의 세포/kg 이하, 4×105 개의 세포/kg 또는 약 4×105 개의 세포/kg 이하, 5×105 개의 세포/kg 또는 약 5×105 개의 세포/kg 이하, 6×105 개의 세포/kg 또는 약 6×105 개의 세포/kg 이하, 7×105 개의 세포/kg 또는 약 7×105 개의 세포/kg 이하, 8×105 개의 세포/kg 또는 약 8×105 개의 세포/kg 이하, 9×105 개의 세포/kg 또는 약 9×105 개의 세포/kg 이하, 1×106 개의 세포/kg 또는 약 1×106 개의 세포/kg 이하, 또는 2×106 개의 세포/kg 또는 약 2×106 개의 세포/kg 이하를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 용량은 적어도 2×105 대상체의 킬로그램 체중 당 세포(예를 들어 항원-발현, 예를 들어 CAR- 발현 세포)(세포/kg) 또는 적어도 약 2×105 개의 세포/kg 또는 2×105 개의 세포/kg 또는 2×105 개의 세포/kg, 예를 들어 적어도 3×105 개의 세포/kg 또는 적어도 약 3×105 개의 세포/kg 또는 3×105 개의 세포/kg 또는 3×105 개의 세포/kg, 적어도 4×105 개의 세포/kg 또는 적어도 약 4×105 개의 세포/kg 또는 4×105 개의 세포/kg 또는 4×105 개의 세포/kg, 적어도 5×105 개의 세포/kg 또는 적어도 약 5×105 개의 세포/kg 또는 5×105 개의 세포/kg 또는 5×105 개의 세포/kg, 적어도 6×105 개의 세포/kg 또는 적어도 약 6×105 개의 세포/kg 또는 6×105 개의 세포/kg 또는 6×105 개의 세포/kg, 적어도 7×105 개의 세포/kg 또는 적어도 약 7×105 개의 세포/kg 또는 7×105 개의 세포/kg 또는 7×105 개의 세포/kg, 적어도 8×105 개의 세포/kg 또는 적어도 약 8×105 개의 세포/kg 또는 8×105 개의 세포/kg 또는 8×105 개의 세포/kg, 적어도 9×105 개의 세포/kg 또는 적어도 약 9×105 개의 세포/kg 또는 9×105 개의 세포/kg 또는 9×105 개의 세포/kg, 적어도 1×106 개의 세포/kg 또는 적어도 약 1×106 개의 세포/kg 또는 1×106 개의 세포/kg 또는 1×106 개의 세포/kg, 또는 적어도 2×106 개의 세포/kg 또는 적어도 약 2×106 개의 세포/kg 또는 2×106 개의 세포/kg 또는 2×106 개의 세포/kg를 포함한다.
특정 구현예에서, 세포, 또는 세포의 서브-타입의 개별 집단은 약 100만 내지 약 1000억개의 세포의 범위 및/또는 체중의 킬로그램 당 세포의 양, 예를 들어 100억 내지 약 500억개의 세포(예를 들어 약 500만개의 세포, 약 1000만개의 세포, 약 1500만개의 세포, 약 2000만개의 세포, 약 2500만개의 세포, 약 5억개의 세포, 약 10억개의 세포, 약 50억개의 세포, 약 200억개의 세포, 약 300억개의 세포, 약 400억개의 세포, 또는 2개의 앞선 값 중 하나에 의해 정의된 범위), 예를 들어 약 1000만 내지 1000억개의 세포(예를 들어 약 2000만개의 세포, 약 3000만개의 세포, 약 4000만개의 세포, 약 6000만개의 세포, 약 7000만개의 세포, 약 8000만개의 세포, 약 9000만개의 세포, 약 100억개의 세포, 약 250억개의 세포, 약 500억개의 세포, 약 750억 개의개의 세포, 약 900억개의 세포, 또는 2개의 앞선 값 중 하나에 의해 정의된 범위), 및 일부 경우에, 약 1억 내지 약 500억개의 세포(예를 들어 약 1억 2000만개의 세포, 약 2억 5000만개의 세포, 약 3억 5000만개의 세포, 약 4억 5000만개의 세포, 약 6억 5000만개의 세포, 약 8억개의 세포, 약 9억개의 세포, 약 30억개의 세포, 약 300억개의 세포, 약 450억개의 세포, 또는 2개의 앞선 값 중 하나에 의해 정의된 범위) 또는 그들 범위 사이 및/또는 체중의 킬로그램 당에서 임의의 값으로 대상체에 투여된다. 투여량은 질환 또는 장애 및/또는 환자 및/또는 다른 치료에 특이적인 속성에 의존하여 다양할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포의 용량은 세포의 용량이 대상체의 신체 표면적 또는 중량에 결속되지 않거나 이를 기반으로 하지 않도록 세포의 일정한 용량 또는 세포의 고정된 용량이다.
일부 구현예에서, 예를 들어 대상체가 인간인 경우, 용량은 약 5×108 개 미만 총 재조합 수용체(예를 들어 CAR)-발현 세포, T 세포, 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMs), 예를 들어 2×106, 5×106, 1×107, 5×107, 또는 1×108 개 또는 총 그러한 세포와 같은, 약 1×106 내지 1×108 개 세포의 범위, 또는 2개 앞선 값 중 임의의 사이 범위에서 포함한다.
일부 구현예에서, 유전자 조작 세포의 투여량은 (약) 1×105 내지 5×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×105 내지 2.5×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×105 내지 1×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×105 내지 5×107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×105 내지 2.5×107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×105 내지 1×107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×105 내지 5×106 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×105 내지 2.5×106 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×105 내지 1×106 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×106 내지 5×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×106 내지 2.5×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×106 내지 1×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×106 내지 5×107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×106 내지 2.5×107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×106 내지 1×107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×106 내지 5×106 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×106 내지 2.5×106 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5×106 내지 5×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5×106 내지 2.5×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5×106 내지 1×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5×106 내지 5×107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5×106 내지 2.5×107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5×106 내지 1×107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5×106 내지 5×106 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5×106 내지 5×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5×106 내지 2.5×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5×106 내지 1×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5×106 내지 5×107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5×106 내지 2.5×107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5×106 내지 1×107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×107 내지 5×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×107 내지 2.5×108개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×107 내지 1×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×107 내지 5×107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×107 내지 2.5×107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5×107 내지 5×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5×107 내지 2.5×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5×107 내지 1×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5×107 내지 5×107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5×107 내지 5×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5×107 내지 2.5×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5×107 내지 1×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×108 내지 5×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×108 내지 2.5×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 또는 2.5×108 내지 5×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전자 조작 세포의 투여량은 적어도 (약) 1×105 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 2.5×105 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 5×105 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 1×106 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 2.5×106 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 5×106 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 1×107 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 2.5×107 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 5×107 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 1×108 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 2.5×108 개의 CAR-발현 세포, 또는 적어도 (약) 5×108 개의 CAR-발현 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 요법은 (약) 1×105 내지 5×108 개의 전체 재조합 수용체-발현 세포, 전체 T 세포, 또는 전체 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC) 수, (약) 5×105 내지 1×107 개의 전체 재조합 수용체-발현 세포, 전체 T 세포, 또는 전체 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC) 수, 또는 (약) 1×106 내지 1×107 개의 전체 재조합 수용체-발현 세포, 전체 T 세포, 또는 전체 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC) 수를 포함하는 투여량의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포 요법은 적어도 (약) 1×105 개의 전체 재조합 수용체-발현 세포, 전체 T 세포, 또는 전체 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC) 수를 포함하는 세포 투여량의 투여를 포함하는데, 예를 들어 적어도 (약) 1×106 개, 적어도 (약) 1×107 개, 적어도 (약) 1×108 개의 그러한 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 수는 CD3+ 또는 CD8+의 전체 수에 관한 것이며, 일부 경우, 재조합 수용체-발현 (예를 들어 CAR+) 세포에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 세포 요법은 (약) 1×105 내지 5×108 개의 CD3+ 또는 CD8+ 전체 T 세포 또는 CD3+ 또는 CD8+ 재조합 수용체-발현 세포, (약) 5×105 내지 1×107 개의 CD3+ 또는 CD8+ 전체 T 세포 또는 CD3+ 또는 CD8+ 재조합 수용체-발현 세포, 또는 (약) 1×106 내지 1×107 개의 CD3+ 또는 CD8+ 전체 T 세포 또는 CD3+ 또는 CD8+ 재조합 수용체-발현 세포수를 포함하는 투여량의 투여를 포함한다. 일 부 구현예에서, 상기 세포 요법은, (약) 1×105 내지 5×108 개의 전체 CD3+/CAR+ 또는 CD8+/CAR+ 세포, (약) 5×105 내지 1×107 개의 전체 CD3+/CAR+ 또는 CD8+/CAR+ 세포, 또는 (약) 1×106 내지 1×107 개의 전체 CD3+/CAR+ 또는 CD8+/CAR+ 세포수를 포함하는 투여량의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 용량의 T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 예를 들어 대상체가 인간인 경우, 용량은 약 1×106 내지 5×108 개의 총 재조합 수용체(예를 들어 CAR)-발현 CD8+ T 세포, 예를 들어 1×107, 2.5×107, 5×107, 7.5×107, 1×108, 또는 5×108 개의 총 그러한 세포와 같은, 약 5×106 내지 1×108 그러한 세포의 범위, 또는 2개 앞선 값 중 임의의 사이 범위에서 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 다중 용량으로 투여되고, 각각의 용량 또는 총 용량은 앞선 값 중 임의의 범위 내에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 세포의 용량은 각각 포함하여, 1×107 내지 0.75×108 또는 약 1×107 내지 0.75×108의 총 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포, 1×107 내지 2.5×107 또는 약 1×107 내지 2.5×107 의 총 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포, 1×107 내지 0.75×108개 또는 약 1×107 내지 0.75×108의 총 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 용량은 1×107, 2.5×107, 5×107 7.5×107 또는 1×108 또는 약 1×107, 2.5×107, 5×107 7.5×107, 1×108, 또는 5×108 개의 총 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 재조합 수용체-발현 T 세포의 용량은 단일 용량으로서 대상체에 투여되거나 2주, 1달, 3달, 6달, 1년 이상의 기간 내에 오직 1회 투여된다.
입양 세포 치료의 경우, 주어진 "용량"의 투여는 단일 조성물로서 세포의 주어진 양 또는 수의 투여 및/또는 단일 중단없는 투여, 예를 들어 단일 주사 또는 연속 주입으로서를 포함하고, 또한, 특정된 기간, 예를 들어 3일 이하에 걸쳐, 다중 개별 조성물 또는 주입으로 제공된, 분할 용량 또는 복수의 조성물로서 세포의 주어진 양 또는 수의 투여를 포함한다. 따라서, 일부 상황에서, 용량은 단일 시점에서 제공되거나 개시되는 세포의 특정 수의 단일 또는 연속 투여이다. 그러나, 일부 상황에서, 용량은 3 일 이하, 예를 들어 3 일 동안 또는 2 일 동안 하루에 한번에 걸쳐 다중 주사 또는 주입으로, 또는 단일 기간에 걸쳐 다중 주입에 의해 투여된다.
따라서, 일부 측면에서, 용량의 세포는 단일 약학적 조성물에서 투여된다. 일부 구현예에서, 용량의 세포는 용량의 세포를 총괄적으로 함유하는, 복수의 조성물에서 투여된다.
일부 구현예에서, 용어 "분할 용량"은 1 일 초과에 걸쳐 투여되도록 분할된 용량을 가리킨다. 용량의 이러한 타입은 본 방법에 포함되고 단일 용량으로 간주된다.
따라서, 세포의 용량은 분할 용량, 예를 들어 시간에 걸쳐 투여되는 분할 용량으로서 투여될 수 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, 용량은 2 일에 걸쳐 또는 3 일에 걸쳐 대상체에 투여될 수있다. 분할 투여를 위한 예시적인 방법은 첫째날에 용량의 25%를 투여하고 둘째날에 용량의 나머지 75%를 투여하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 용량의 33%는 첫째날에 투여될 수 있고 나머지 67%는 둘째날에 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 용량의 10%는 첫째날에 투여되고, 용량의 30%는 둘째 날에 투여되고, 용량의 60%는 셋째날에 투여된다. 일부 구현예에서, 분할 용량은 3 일 초과에 걸쳐 퍼지지 않는다.
일부 구현예에서, 용량의 세포는 용량의 일부 세포를 각각 함유하는, 선택적으로 보다 많은, 제 1 및 제 2와 같은, 복수의 조성물 또는 용액의 투여에 의해 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 상이한 집단 및/또는 세포의 서브-타입을 각각 함유하는, 복수의 조성물은 선택적으로, 특정 기간 내에, 별도로 또는 독립적으로 투여된다. 예를 들어 세포의 집단 또는 서브-타입은 각각 CD8+ 및 CD4+ T 세포, 및/또는 각각 CD8+ 및 CD4+ 농축된 집단, 예를 들어 재조합 수용체를 발현시키기 위해 유전자 조작된 세포를 각각 개별적으로 포함하는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 용량의 투여는 CD8+ T 세포의 용량 또는 CD4+ T 세포의 용량을 포함하는 제 1 조성물의 투여 및 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 다른 용량을 포함하는 제 2 조성물의 투여를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 조성물 또는 용량의 투여, 예를 들어 복수의 세포 조성물의 투여는 별도로 세포 조성물의 투여를 포함한다. 일부 측면에서, 별도 투여는 임의의 순서로, 동시에, 또는 순차적으로 수행된다. 일부 구현예에서, 용량은 제 1 조성물 및 제 2 조성물을 포함하고, 제 1 조성물 및 제 2 조성물은 0 내지 12 시간 간격, 0 내지 6 시간 간격 또는 0 내지 2 시간 간격으로 투여된다. 일부 구현예에서, 제 1 조성물의 투여의 개시 및 제 2 조성물의 투여의 개시는 2 시간 이하, 1 시간 이하, 또는 30 분 이하 간격, 15 분 이하, 10 분 이하 또는 5 분 이하 간격으로 수행된다. 일부 구현예에서, 제 1 조성물의 투여 개시 및/또는 완료 및 제 2 조성물의 투여 완료 및/또는 개시는 2 시간 이하, 1 시간 이하, 또는 30 분 이하 간격, 15 분 이하, 10 분 이하 또는 5 분 이하 간격으로 수행된다.
일부 구현예에서, 제 1 조성물, 예를 들어 용량의 제 1 조성물은 CD4+ T 세포를 포함한다. 일부 조성물에서, 제 1 조성물, 예를 들어 용량의 제 1 조성물은 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 조성물은 제 2 조성물 이전에 투여된다.
일부 구현예에서, 세포의 용량 또는 조성물은 재조합 수용체를 발현하는 CD4+ 세포 대 재조합 수용체를 발현하는 CD8+ 세포 및/또는 CD4+ 세포 대 CD8+ 세포의 정의된 또는 표적 비를 포함하고, 이러한 비는 선택적으로, 약 1:1 또는 약 1:3 내지 약 3:1, 예를 들어 약 1:1이다. 일부 측면에서, 상이한 세포 집단의 표적 또는 원하는 비(예를 들어 CD4+:CD8+ 비 또는 CAR+CD4+:CAR+CD8+ 비, 예를 들어 1:1)로 조성물 또는 용량의 투여는 하나의 집단을 함유하는 세포 조성물의 투여 후 다른 집단을 포함하는 별도 세포 조성물의 투여를 포함하고, 여기서, 투여는 표적 또는 원하는 비로 또는 약 표적 또는 원하는 비로 있다. 일부 측면에서, 한정된 비율로 세포의 용량 또는 조성물의 투여는 T 세포 치료의 증폭, 지속성 및/또는 항종양 활성을 개선시킨다.
일부 구현예에서, 대상체는 세포의 다중 용량, 예를 들어 2 회 이상 용량 또는 다중 연속 용량을 받는다. 일부 구현예에서, 2 가지 용량이 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체는 제 1 용량 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21일 후 투여되는, 연속 용량, 예를 들어 제 2 용량을 받는다. 일부 구현예에서, 다중 연속 용량은 추가 용량 또는 용량이 연속 용량의 투여 후 투여되도록, 제 1 용량 후에 투여된다. 일부 측면에서, 추가 용량으로 대상체에 투여되는 세포의 수는 제 1 용량 및/또는 연속 용량과 동일하거나 유사하다. 일부 구현예에서, 추가 용량 또는 용량들은 이전 용량 보다 더 크다.
일부 측면에서, 제 1 및/또는 연속 용량의 크기는 이전 치료, 예를 들어 화학요법에 대한 대상체의 반응, 종양 부하, 벌크, 크기, 또는 정도, 범위, 또는 전이의 타입, 단계와 같은 대상체에서 질환 부담, 및/또는 독성 결과를 발생시키는 대상체의 가능성 또는 발생률, 예를 들어 CRS, 대식세포 활성화 증후군, 종양 용해 증후군, 신경독성 및/또는 투여되는 세포 및/또는 재조합 수용체에 대한 숙주 면역 반응과 같은, 하나 이상의 기준에 기반하여 결정된다.
일부 측면에서, 제 1 용량의 투여 및 연속 용량의 투여 사이의 시간은 약 9 내지 약 35 일, 약 14 내지 약 28 일, 또는 15 내지 27 일이다. 일부 구현예에서, 연속 용량의 투여는 제 1 용량의 투여 후 약 14 일 초과 및 약 28 일 미만의 시점에 있다. 일부 측면에서, 제 1및 연속 용량 사이의 시간은 약 21일이다. 일부 구현예에서, 추가 용량 또는 용량들, 예를 들어 연속 용량은 연속 용량의 투여 후 투여된다. 일부 측면에서, 추가 연속 용량 또는 용량들은 이전 용량의 투여 후 적어도 약 14 일 및 약 28 일 미만에 투여된다. 일부 구현예에서, 추가 용량은 이전 용량 후 약 14 일 미만, 예를 들어 이전 용량 후 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13 일에 투여된다. 일부 구현예에서, 용량은 이전 용량 후 약 14 일 미만으로 투여되지 않고 및/또는 용량은 이전 용량 후 약 28 일 초과로 투여되지 않는다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 재조합 수용체-발현 세포의 용량은 T 세포의 제 1 용량 및 T 세포의 연속 용량을 포함하는 2 가지 용량(예를 들어 이중 용량)을 포함하고, 여기서 제 1 용량 및 제 2 용량 중 하나 또는 둘다는 T 세포의 분할 용량의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포의 용량은 질환 부담을 감소시키는데 효과적일 정도로 충분히 일반적으로 크다.
일부 구현예에서, 세포는 원하는 용량으로 투여되는데, 이는 일부 측면에서 세포 또는 세포 타입(들)의 원하는 용량 또는 수 세포 타입(들)의 원하는 비를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서 세포의 용량은 세포의 총 수(또는 체중 kg 당 수) 및 개별 집단 또는 서브-타입의 원하는 비, 예를 들어 CD4+ 대 CD8+ 비를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 세포의 용량은 개별 집단 또는 개별 세포 타입에서 세포의 원하는 총 수(또는 체중 kg 당 수)를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 투여 량은 개별 집단에서 총 세포의 원하는 수, 원하는 비, 및 세포의 원하는 총 수와 같은, 그러한 특징의 조합에 기반한다.
일부 구현예에서, CD8+ 및 CD4+ T 세포와 같은 세포의 집단 또는 서브-타입은 T 세포의 원하는 용량과 같은, 총 세포의 원하는 용량의 허용된 차이로 또는 그의 내에 투여된다. 일부 측면에서, 원하는 용량은 세포의 원하는 수 또는 세포가 투여되는 대상체의 체중의 단위 당 세포의 원하는 수, 예를 들어 cells/kg이다. 일부 측면에서, 원하는 용량은 최소 세포수 또는 체중의 단위 당 세포의 최소 수이거나 그 이상이다. 일부 측면에서, 원하는 용량으로 투여된 총 세포 중에서, 개별 집단 또는 서브-타입은 원하는 산출 비(예를 들어 CD4+ 대 CD8+ 비), 예를 들어 그러한 비의 특정 허용된 차이 또는 오차 범위 내에 있거나 그 근처이다.
일부 구현예에서, 세포는 CD4+ 세포의 원하는 용량 및/또는 CD8+ 세포의 원하는 용량과 같은, 세포의 하나 이상의 개별 집단 또는 서브-타입의 원하는 용량의 허용된 차이에서 또는 그 내에서 투여된다. 일부 측면에서, 원하는 용량은 서브-타입 또는 집단의 세포의 원하는 수, 또는 세포가 투여되는 대상체의 체중의 단위당 그러한 세포의 원하는 수, 예를 들어 세포/kg이다. 일부 측면에서, 원하는 용량은 집단 또는 서브-타입의 세포의 최소 수 또는 체중의 단위 당 집단 또는 서브-타입의 세포의 최소 수이거나 그 이상이다.
따라서, 일부 구현예에서, 투여량은 총 세포의 원하는 고정된 용량 및 원하는 비에 기반하고, 및/또는 하나 이상, 예를 들어 개별 서브-타입 또는 서브-집단 각각의 원하는 고정된 용량에 기반한다. 따라서, 일부 구현예에서, 투여량은 T 세포의 원하는 고정된 또는 최소 투여 및 CD4+ 대 CD8+ 세포의 원하는 비에 기반하고, 및/또는 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포의 원하는 고정된 또는 최소 투여에 기반한다.
일부 구현예에서, 세포는 다수의 세포 집단 또는 서브-타입, 예를 들어 CD4+ 및 CD8+ T 세포 또는 서브-타입의 원하는 산출 비의 허용 범위 내에서 또는 그 범위 내에서 투여된다. 일부 측면에서, 원하는 비는 특정 비일 수 있거나 비의 범위일 수 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, 원하는 비(예를 들어 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비)는 5:1 또는 약 5:1 또는 5:1 또는 약 5:1 사이(또는 약 1:5 초과 및 약 5:1 미만)이고, 또는 1:3 또는 약 1:3 또는 3:1 또는 약 3:1 사이(또는 약 1:3 초과 및 약 3:1 미만), 예를 들어 2:1 또는 약 2:1 또는 1:5 또는 약 1:5 사이(또는 약 1:5 초과 및 약 2:1 미만), 예를 들어 5:1, 4.5:1, 4:1, 3.5:1, 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9: 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, 1:4, 1:4.5, 또는 1:5, 또는 약 5:1, 4.5:1, 4:1, 3.5:1, 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9: 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, 1:4, 1:4.5, 또는 1:5이다. 일부 측면에서, 허용되는 차이는 원하는 비의 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50% 이내이고, 이들 범위 사이의 임의의 값을 포함한다.
특정 구현예에서, 세포의 수 및/또는 농도는 재조합 수용체(예를 들어 CAR)-발현 세포의 수를 가리킨다. 다른 구현예에서, 세포의 수 및/또는 농도는 투여되는 모든 세포, T 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 수 또는 농도를 가리킨다.
일부 측면에서, 용량의 크기는 이전 치료, 예를 들어 화학요법에 대한 대상체의 반응, 종양 부하, 벌크, 크기, 또는 정도, 범위, 또는 전이의 타입, 단계와 같은 대상체에서 질환 부담, 및/또는 독성 결과를 발생시키는 대상체의 가능성 또는 발생률, 예를 들어 CRS, 대식세포 활성화 증후군, 종양 용해 증후군, 신경독성 및/또는 투여되는 세포 및/또는 재조합 수용체에 대한 숙주 면역 반응과 같은, 하나 이상의 기준에 기반하여 결정된다.
일부 구현예에서, 또한, 방법은 키메릭 항원 수용체(CAR) 및/또는 림프구 마비 치료를 발현하는 하나 이상의 추가 용량의 세포를 투여하는 단계를 포함하고 /하거나 상기 방법의 하나 이상의 단계가 반복된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 용량은 초기 용량과 동일하다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 용량은 초기 용량과 상이하며, 예를 들어 초기 용량에 비해 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 이상 보다 높은 것과 같이, 보다 높거나, 예를 들어 초기 용량에 비해, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 이하 보다 낮은 것과 같이, 보다 낮다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 용량의 투여는 초기 치료 또는 임의이 이전 치료에 대한 대상체의 반응, 종양 부하, 벌크, 크기, 또는 정도, 범위, 또는 전이의 타입, 단계와 같은 대상체에서 질환 부담, 및/또는 독성 결과를 발생시키는 대상체의 가능성 또는 발생률, 예를 들어 CRS, 대식세포 활성화 증후군, 종양 용해 증후군, 신경독성 및/또는 투여되는 세포 및/또는 재조합 수용체에 대한 숙주 면역 반응에 기반하여 결정된다.
VII. 조성물 및 제형
일부 구현예에서, 재조합 항원 수용체, 예를 들어 CAR 또는 TCR로 조작된 세포를 포함하는 세포의 용량은 약학 조성물 또는 제형와 같은 조성물 또는 제형으로 제공된다. 상기 조성물은, 예를 들어 질환, 병태 및 장애의 예방 또는 치료에서 또는 검출, 진단 및 예후 방법에서 제공된 방법 및/또는 제공된 제조 물품 또는 조성물과 부합되게 사용될 수 있다.
상기 용어 "약학적 제형"은 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 허용하는 형태이고, 상기 제형이 투여될 대상체에게 허용되지 않는 독성이 있는 부가 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"약학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분 이외의 약학적 제형의 성분을 나타내며, 이는 대상체에게 무독성이다. 약학적으로 허용가능한 담체는 완충제, 부형제, 안정제 또는 보존제를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
일부 측면에서, 담체의 선택은 부분적으로는 특정 세포 또는 제제 및/또는 투여 방법에 의해서 결정된다. 예를 들어 약학 조성물은 보존제를 함유할 수 있다. 적합한 보존제는, 예를 들어 메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤조산나트륨 및 벤잘코늄 클로라이드를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 2종 이상의 보존제의 혼합물이 사용된다. 보존제 또는 그의 혼합물은 통상적으로 총 조성물 중 약 0.0001 중량% 내지 약 2 중량%의 양으로 존재한다. 담체는, 예를 들어 문헌 「Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A Ed (1980)」에 기재되어 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 일반적으로, 사용되는 용량 및 농도에서 수용체에 유독하지 않은 것이며, 인산염, 시트르산염 및 다른 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제(예를 들어 염화옥타데실디메틸벤질 암모늄; 염화헥사메토늄, 염화벤잘코늄; 염화벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기)의 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 소수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당류; 나트륨과 같은 염-형성 카운터-이온; 금속 복합체(예를 들어 Zn-단백질 복합체); 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 측면에서, 조성물 중에 완충제가 포함된다. 적합한 완충제는, 예를 들어 시트르산, 시트르산나트륨, 인산, 인산칼륨 및 다양한 다른 산 및 염을 포함한다. 일부 측면에서, 2종 이상의 완충제의 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 그의 혼합물은 통상적으로 총 조성물 중 약 0.001 중량% 내지 약 4 중량%의 양으로 존재한다. 투여 가능한 약학 조성물의 제조 방법이 공지되어 있다. 예시적인 방법이, 예를 들어 문헌 「Remington: Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed(May 1, 2005)」에 더욱 상세히 기재되어 있다.
제형 또는 조성물은 또한, 각각의 활성이 상호 악영향을 미치지 않는 세포 또는 제제에 의해 치료되는 특정 지표, 질환 또는 병태에 유용한 1종 이상의 활성 성분을 함유할 수 있는데, 예를 들어 그 활성은 세포에 상보성이고 및/또는 각각의 활성은 서로 유해한 영향을 주지 않는 것인 하나 이상의 활성 성분이다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 유효한 양으로 조합물 중에 적절히 존재한다. 따라서, 일부 구현예에서, 약학 조성물은 화학치료제, 예를 들어 아스파라기나제, 부술판, 카르보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플로우로우라실, 겜시타빈, 하이드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴, 빈크리스틴 등과 같은 다른 약학적 활성 제제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제제 또는 세포는 염의 형태로, 예를 들어 약제학적으로 허용되는 염으로 투여된다. 제약학적으로 허용되는 적절한 산 부가염에는 염산, 브롬산, 인산, 메타인산, 질산 및 황산과 같은 무기산, 및 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 말산, 락트산, 푸마르산, 벤조산, 글리콜산, 글루콘산, 숙신산 및 아릴설폰산, 예를 들어 p-톨루엔설폰산과 같은 유기산이 포함된다.
상기 제제 또는 세포는 예를 들어 볼루스 주입, 주사, 예를 들어 정맥내 또는 피하 주사, 안내 주사, 눈 주위 주사, 망막하 주사, 유리체내 주사, 경 중격 주사, 공막하 주사, 맥락막내 주사, 전방내 주사, 결막하 주사(subconjectval injection), 결막하 주사(subconjuntival injection), 안각건하 주사, 안구후 주사, 안구 주위 주사 또는 후방 공막 부근 전달에 의한 임의의 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 이들은 비경구, 폐내 및 비내, 및 국소 치료가 요망되는 경우, 병변내 투여에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 소정의 투여량이 세포 또는 제제의 단일 볼루스 투여에 의해, 예를 들어 3일 이하의 기간에 걸쳐, 제제 또는 세포의 다회의 볼루스 투여 또는 세포의 연속 주입 투여에 의해 투여된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 적절한 투여량은 치료될 질환의 유형, 제제 또는 제제들의 유형, 세포 또는 재조합 수용체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 제제 또는 세포가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는 지 여부, 이전의 치료, 대상체의 임상 기록 및 제제 또는 세포에 대한 반응, 주치의의 재량에 따라 달라질 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 조성물 및 세포는 한 번에 또는 일련의 치료를 통해 적절하게 대상체에게 투여된다.
세포 또는 제제는 표준 투여 기법, 제형 및/또는 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 상기 조성물의 저장 및 투여를 위하여, 제형 및 시린지 및 바이알과 같은 장치가 제공된다. 세포에 관하여, 투여는 자가 또는 이종의 것일 수 있다. 예를 들어 면역반응 세포 또는 전구세포는 하나의 대상체로부터 얻어질 수 있으며, 동일한 대상체 또는 상용 가능한 상이한 대상체에 투여될 수 있다. 말초혈액 유도 면역반응 세포 또는 그의 전구세포(예를 들어 생체내, 생체외 또는 시험관내 유래)는 카테터 투여, 전신 주사, 국소 주사, 정맥내 주사 또는 비경구 투여를 포함하여, 국소 주사를 통해 투여될 수 있다. 치료 조성물(예를 들어 유전자 변형된 면역반응 세포를 함유하는 약학 조성물 또는 신경 독성 증상을 치료하거나 개선하는 제제)의 투여 시, 이는 일반적으로 단위 용량의 주사 가능한 형태(용액, 현탁액, 유제)로 제형화될 것이다.
제형은 경구, 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근육내, 비강내, 협측, 설하 또는 좌제 투여용의 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 제제 또는 세포 집단은 비경구로 투여된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "비경구"는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질 및 복강내 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 제제 또는 세포 집단은 정맥내, 복강내 또는 피하 주사에 의해, 말초 전신 전달을 사용하여, 대상체에 투여된다.
일부 구현예에서, 조성물은, 일부 측면에서 선택된 pH로 완충될 수 있는 멸균 액체 제조물, 예를 들어 등장성 수용액, 현탁액, 유제, 분산액 또는 점성 조성물로서 제공된다. 액체 제조물은 일반적으로 겔, 다른 점성 조성물 및 고체 조성물보다 제조가 용이하다. 추가로, 액체 조성물은 특히 주사에 의해 투여하기에 다소 편리하다. 한편, 점성 조성물은 특정 조직과의 접촉 시간을 연장하기 위해 적절한 점성 범위 내에서 제형화될 수 있다. 액체 또는 점성 조성물은, 예를 들어 물, 염수, 인산염 완충 염수, 폴리올(예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있는 담체를 포함할 수 있다.
용매, 예를 들어 적절한 담체, 희석제 또는 부형제, 예를 들어 멸균수, 생리 염수, 글루코스, 덱스트로스 등과의 혼합물에 상기 제제 또는 세포를 혼입시킴으로써, 멸균 주사용 용액을 제조할 수 있다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균된 것이다. 멸균은, 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
VIII. 제조 물품 및 키트
또한 상기 제공된 방법을 수행하는데 유용한 제조 물품, 시스템, 장치, 및 키트가 제공된다. 또한, (i) CD57, CD4 및/또는 CD8에 특이적인 세포의 면역 친화도-기반 선택을 위한 하나 이상의 시약; 및 (ii) 본원에서 기술된 임의의 방법을 수행하기 위한 상기 하나 이상의 시약의 사용을 위한 지침;을 포함하는 제조 물품이 제공된다.
또한, (i) CD57, CD4 및/또는 CD8에 특이적인 세포의 면역 친화도-기반 선택을 위한 하나 이상의 시약; (ii) TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인 및 하나 이상의 공자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인을 활성화할 수 있는 하나 이상의 자극 시약; 및 (iii) 본원에서 기술된 임의의 방법을 수행하기 위한 상기 하나 이상의 시약의 사용을 위한 지침;을 포함하는 제조 물품이 제공된다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 면역 친화도-기반 선택을 위한 상기 시약은 CD57, CD4 및/또는 CD8에 특이적으로 결합할 수 있는 항체이거나 또는 그를 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 면역 친화도-기반 선택을 위한 상기 시약은 CD57에 특이적으로 결합할 수 있는 항체이거나 또는 그를 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 항체는 자성 입자 위에 고정되거나 또는 친화도 크로마토그래피 매트릭스 위에 고정되거나 또는 거기에 부착된다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 자극 시약은, (i) TCR 복합체의 멤버에 특이적으로 결합하고, 선택적으로 CD3에 특이적으로 결합하는 1차 제제 및 (ii) T 세포 공자극 분자에 특이적으로 결합하는 2차 제제를 함유하며, 선택적으로 상기 공자극 분자는 CD28, CD137(4-1-BB), OX40 또는 ICOS로부터 선택된다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 1차 및 2차 제제 중의 하나 또는 둘 다는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 1차 및 2차 제제 중의 하나 또는 둘 다는 항체를 포함하되, 선택적으로 상기 자극 시약은 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 사용한 인큐베이션을 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 1차 제제 및 2차 제제는 고체 지지체의 표면에 존재하거나 또는 부착된다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 고체 지지체는 비드, 선택적으로 상자성 비드이거나 또는 그를 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 1차 제제 및 2차 제제는 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 포함하는 올리고머 입자 시약의 표면에 가역적으로 결합된다.
또한 (i) 본원에서 기술된 임의의 조성물; 및 (ii) 상기 조성물을 대상체에 투여하기 위한 지침;을 포함하는 제조 물품이 제공된다.
일부 구현예에서, 제조 물품 또는 키트는 하나 이상의 용기, 전형적으로 복수의 용기, 패킹 재료(packaging material), 및 상기 용기(들) 및/또는 패키징 상의 또는 그와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함하되, 일반적으로는 사용을 위한 지침, 예를 들어 특정 세포의 면역 친화도-기반 선택, 예를 들어 CD57, CD4 및/또는 CD8을 발현하는 세포의 양성 또는 음성 선택을 위한 지침, 및 본원에서 제공된 임의의 방법을 수행하는, 예를 들어 T 세포를 조작하여 조성물, 예를 들어 세포 요법제용 치료학적 조성물을 생성하기 위한 지침을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 제공된 제조 물품은 예를 들어 제조 공정의 하나 이상의 단계에서 세포의 자극 및/또는 배양을 위한 시약, 예를 들어 섹션 II 및 섹션 III의 임의의 단계에서 기술된 임의의 시약을 함유한다.
또한 재조합 수용체를 발현하는 조작된 세포 또는 그의 조성물, 예를 들어 본원에서 제공된 방법을 사용하여 생성되는 것, 및 선택적으로 사용을 위한 지침, 예를 들어 투여를 위한 지침을 함유하는 제조 물품 및 키트가 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 지침은 세포 요법을 받기 전에 대상체가 반응할 가능성이 있거나 의심되는 경우 및/또는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 재조합 수용체를 발현하는 조작된 세포의 투여 후 반응의 정도 또는 수준을 평가하기 위한 지침을 제공하거나 방법을 특정한다. 일부 측면에서, 상기 제조 물품은 조작된 세포의 용량 똔느 조성물을 함유할 수 있다.
본원에서 제공된 제조 물품은 패키징 물질을 함유한다. 제공된 재료를 패키징하는데 사용되는 패키징 물질은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어 그 내용 전체가 본원에 인용된 미국특허 제5,323,907호, 제5,052,558호 및 제5,033,252호를 참조한다. 패키징 물질의 예에는 블리스터 팩, 병, 튜브, 흡입기, 펌프, 백, 바이알, 컨테이너, 주사기, 일회용 실험실 용품, 예를 들어 피펫 팁 및/또는 플라스틱 플레이트 또는 병이 포함되나 이에 국한되지 않는다. 제조 물품 또는 키트는 재료의 분배를 용이하게 하거나 고처리량 또는 대규모 방식으로 사용을 용이하게 하기 위한, 예를 들어 로봇 장비에서의 사용을 용이하게 하기 위한 장치를 포함할 수 있다. 전형적으로, 패키징은 그 안에 함유된 조성물과 반응하지 않는다.
일부 구현예에서, 세포 조성물은 별도로 포장된다. 일부 구현예에서, 각 컨테이너는 단일 구획을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 제조 물품 또는 키트의 다른 성분은 개별적으로 또는 단일 구획에 함께 포장된다.
IX. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 발명에 사용되는 분야의 모든 용어, 표기 및 다른 기술적 및 과학적 용어 또는 전문용어는 청구 대상이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에서, 일반적으로 이해되는 의미의 용어는 본 명세서에서 명확성 및/또는 용이한 참조를 위해 정의되며, 본 명세서에 이러한 정의가 포함된 경우에는 반드시, 당업계에서 일반적으로 이해되는 것 이상의 실질적인 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명에서 사용되는바, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 분명히 다르게 지시하지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 예를 들어 "a" 또는 "an"은 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미한다. 본 발명에서 기술된 측면 및 변형은 측면들 및 변형들"로 이루어지는" 및/또는 "필수적으로 그로 이루어지는"을 포함하는 것으로 이해된다.
본 명세서에 걸쳐, 청구된 주제의 다양한 측면이 범위 형식으로 제시된다. 범위 형식에서의 설명은 편의상 및 간략화를 위한 것이며 청구된 주제의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안됨을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 설명은 가능한 모든 하위 범위 및 그 범위 내의 개별적인 수치를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어 값의 범위가 제공되는 경우, 그 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 개재된 값 및 언급된 범위 내 임의의 언급된 또는 개재된 값이 청구된 주제 내에 포함되는 것으로 이해된다. 이들과 같은 보다 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로보다 더욱 작은 범위에 포함될 수 있으며, 기술된 범위 내에서 특별히 배제된 한계에 따라 청구된 대상 내에 포함된다. 명시된 범위가 하나의 한계 또는 두 한계를 포함하는 경우, 포함된 한계들 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위는 청구 대상에 포함된다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
본 발명에서 사용되는 "약"이라는 용어는 쉽게 알려진 각각의 값에 대한 통상적인 오차 범위를 나타낸다. 본 발명에서 어떠한 값 또는 파라미터와 관련한 "약"의 언급은 그 값 또는 매개 변수 자체에 대한 구현예를 포함(및 설명)한다. 예를 들어 "약 X"을 언급하는 설명은 "X"에 대한 설명을 포함한다. 특정 구현예에서, "약 X"는 상기 X의 ±25%, ±10%, ±5%, ±2%, ±1%, ±0.1%, 또는 ±0.01%의 값을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는바, 뉴클레오티드 또는 아미노산 위치가, 기재된 서열, 예를 들어 서열 목록에 기재된 서열 내 뉴클레오티드 또는 아미노산 위치"에 대응한다"는 것은, 표준 정렬 알고리즘, 예를 들어 GAP 알고리즘을 사용하여 상기 기재된 서열과 상동성을 최대화하는 정렬시 확인된 뉴클레오티드 또는 아미노산 위치를 말한다. 서열을 정렬시킴으로써, 상응하는 잔기는 예를 들어 보존된 아미노산 잔기 및 동일한 아미노산 잔기를 가이드로서 사용하여 확인될 수 있다. 일반적으로, 대응하는 위치를 확인하기 위해, 가장 높은 정도의 매치가 얻어지도록 아미노산 서열을 정렬한다[예를 들어 문헌 「Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New.Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073」 참조].
본 발명에 사용되는바, 용어 "벡터"는 그것이 연결된 다른 핵산을 전파시킬 수 있는 핵산 분자를 말한다. 상기 용어는 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈에 혼입된 벡터뿐만 아니라 자기 복제 핵산 구조로서의 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그들이 작동적으로 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터를 본 발명에서는 "발현 벡터"라 지칭한다. 벡터 중에는 레트로바이러스, 예를 들어 감마레트로바이러스 및 렌티 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터가 있다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양체"는 상호교환적으로 사용되며, 이러한 세포의 자손을 포함하여 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하는데, 여기에는 최초의 형질전환된 세포 및 계대의 수에 관계없이 그로부터 유도된 자손이 포함된다. 자손은 핵산 함량이 부모 세포와 완전히 동일하지는 않을 수 있고, 돌연변이를 포함할 수 있다. 본래의 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본 발명에 포함된다.
본 발명에서 사용되는 바, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "양성"이라는 설명은 특정 마커, 통상 표면 마커의, 세포 상의 또는 세포내의 검출 가능한 존재를 말한다. 표면 마커를 언급할 때, 이 용어는 유세포 분석에 의하여 검출되는, 예를 들어 상기 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 염색하고 상기 항체를 검출함으로써 검출되는 표면 발현의 존재를 말하는데, 여기서 상기 염색은, 다른 것은 동일한 조건 하에서 이소형-매치된 대조군으로 동일한 절차를 수행하여 검출된 염색을 실질적으로 초과하는 수준에서, 및/또는 상기 마커에 대하여 양성이라고 알려진 세포에 대한 것과 실질적으로 유사한 수준에서, 및/또는 상기 마커에 대하여 음성이라고 알려진 세포에 대한 것보다 실질적으로 더 높은 수준에서 유세포 분석에 의하여 검출 가능하다.
본 발명에서 사용되는 바, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "음성"이라는 설명은 특정 마커, 통상 표면 마커의, 세포 상에 또는 세포내의 실질적인 검출 가능한 존재의 부재를 말한다. 표면 마커를 언급할 때, 이 용어는 유세포 분석에 의하여 검출되는, 예를 들어 상기 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 염색하고 상기 항체를 검출함으로써 검출되는 표면 발현의 부재를 말하는데, 여기서 상기 염색은, 다른 것은 동일한 조건 하에서 이소형-매치된 대조군으로 동일한 절차를 수행하여 검출된 염색을 실질적으로 초과하는 수준에서 유세포 분석에 의하여 검출되지 않고, 및/또는 상기 마커에 대하여 양성이라고 알려진 세포에 대한 것보다 실질적으로 낮은 수준에서, 및/또는 상기 마커에 대하여 음성이라고 알려진 세포에 대한 것과 실질적으로 유사한 수준에서 유세포 분석에 의하여 검출된다.
본 발명에서 사용되는바, 아미노산 서열(레퍼런스 폴리펩티드 서열)에 대해 사용되는 경우, "백분율(%) 아미노산 서열 상동성" 및 "백분율 상동성"은, 서열들과, 최대치의 백분율 서열 상동성을 얻기 위하여 필요하다면 도입되는 갭을 정렬한 후, 상기 기준 폴리펩티드 서열 내 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열(예를 들어 대상 항체 또는 단편) 내 아미노산 잔기의 백분율로서 정의되며, 상기 서열 상동성의 일부로서 어떠한 보존적 치환은 고려하지 않는다. 백분율 아미노산 서열 상동성을 결정하는 목적을 위한 서열정렬은 다양한 방식, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈리안(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공중이 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여 달성될 수 있다. 서열의 전체 길이에 대해 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 적절히 결정할 수 있다.
아미노산 치환은 폴리펩티드에서 하나의 아미노산을 다른 아미노산으로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비보존적 아미노산 치환일 수 있다. 아미노산 치환은 관심있는 결합 분자, 예를 들어 항체에 도입될 수 있고, 생성물은 원하는 활성, 예를 들어 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.
아미노산은 일반적으로 하기의 통상적인 측쇄 특성에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe
일부 구현예에서, 보존적 치환은 상기 클래스 중 하나의 구성원을 같은 클래스의 다른 구성원으로 교환하는 것을 수반할 수 있다. 일부 구현예에서, 비보존적 아미노산 치환은 상기 클래스 중 하나의 구성원을 다른 클래스로 교환하는 것을 수반할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 '조성물'은 세포를 포함한, 둘 이상의 생성물, 물질, 또는 화합물의 임의의 혼합물을 지칭한다. 그것은 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비-수성 또는 그들의 임의의 조합물일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 '대상체'는 포유동물, 인간 또는 기타 동물, 전형적으로는 인간이다.
X. 예시적인 구현예
제공된 구현예 중에는 하기의 것들이 있다:
1. T 세포를 농축하는 방법으로서,
상기 방법은,
(a) 제 1 선택을 수행하는 단계, 상기 제 1 선택은 1차 인간 T 세포를 포함하는 성분 채집술 생성물(apheresis product) 또는 백혈구 성분 채집술 생성물(leukapheresis product)을 포함하는 생물학적 샘플로부터 CD57- 또는 CD3+ T 세포 중의 어느 하나를 농축함으로써 농축된 T 세포 집단(enriched T cell population)을 생성하는 것을 포함함; 및
(b) 상기 농축된 T 세포 집단으로부터의 상기 세포 상에서 제 2 선택을 수행하는 단계;
를 포함하되,
상기 제 1 선택은 CD57- T 세포를 농축하는 것을 포함하고 상기 제 2 선택은 상기 농축된 집단으로부터 CD3+ T 세포를 농축하는 것을 포함하거나; 또는
상기 제 1 선택은 CD3+ T 세포를 농축하는 것을 포함하고 상기 제 2 선택은 상기 농축된 T 세포 집단으로부터 CD57+ T 세포를 제거하는 것을 포함하며,
상기 방법은, 상기 생물학적 샘플보다 적은 CD57+ T 세포를 포함하는 고갈된 집단(depleted population)을 생성하고 CD3+ T 세포에 대해 농축되는,
방법.
2. T 세포를 농축하는 방법으로서,
상기 방법은,
(a) 제 1 선택을 수행하는 단계, 상기 제 1 선택은 1차 인간 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터 CD57+ 세포를 제거함으로써 고갈된 집단을 생성하고, 상기 고갈된 집단은 상기 생물학적 샘플보다 적은 CD57+ 세포를 포함함; 및
(b) 상기 고갈된 집단으로부터의 상기 세포 상에서 제 2 선택을 수행하는 단계, 상기 제 2 선택은 상기 고갈된 집단으로부터 CD3+ T 세포를 농축하는 것을 포함하고, 그에 의해서 상기 농축은 CD57-CD3+ T 세포의 농축된 집단을 생성하는 것을 포함함;
을 포함하는, 방법.
3. T 세포를 농축하는 방법으로서,
상기 방법은,
(a) 제 1 선택을 수행하는 단계, 상기 제 1 선택은 1차 인간 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터 CD3+ 세포를 농축함으로써 농축된 T 세포 집단을 생성하는 것을 포함함; 및
(b) 상기 농축된 집단으로부터의 상기 세포 상에서 제 2 선택을 수행하는 단계, 상기 제 2 선택은 상기 농축된 샘플 세포 집단으로부터 CD57+ T 세포를 제거함으로써 고갈된 집단을 생성하는 것을 포함하고, 상기 고갈된 집단은 상기 생물학적 샘플 및/또는 상기 농축된 T 세포 집단보다 적은 CD57+ T 세포를 포함하고 CD3+ 세포에 대해 농축됨;
을 포함하는, 방법.
4. T 세포를 농축하는 방법으로서,
상기 방법은,
(a) 제 1 선택을 수행하는 단계, 상기 제 1 선택은 1차 인간 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터 CD57+ T 세포를 제거함으로써 제 1 고갈된 집단을 생성하는 것을 포함하고, 상기 제 1 고갈된 집단은 상기 생물학적 샘플보다 적은 CD57+ T 세포를 포함함;
(b) 상기 제 1 고갈된 집단으로부터의 상기 세포 상에서 제 2 선택을 수행하는 단계, 상기 제 2 선택은 상기 제 1 고갈된 집단으로부터 (i) CD4+ T 세포 및 (ii) CD8+ T 세포 중의 하나를 농축시키는 것을 포함하고, 그에 의해서 상기 농축은 상기 (i) CD4+ T 세포 및 (ii) CD8+ T 세포 중의 하나를 농축시킨 제 2 고갈된 집단 및 비-선택 집단을 생성함; 및
(c) 제 3 단계를 수행하는 단계, 상기 제 3 선택은 상기 비-선택 집단으로부터 상기 (i) CD4+ T 세포 및 (ii) CD8+ T 세포 중의 다른 것을 농축시키는 것을 포함하고, 그에 의해서 상기 농축은 상기 (i) CD4+ T 세포 및 (ii) CD8+ T 세포 중의 다른 것을 농축시킨 제 3 고갈된 집단을 생성함;
를 포함하는, 방법.
5. 구현예 1 내지 4 중의 어느 하나에 있어서,
상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단)은,
(i) (약) 5% 미만의 CD57+ T 세포;
(ii) 상기 생물학적 샘플 중에 존재하는 CD57+ T 세포의 빈도(frequency)의 (약) 35% 미만인 빈도의 CD57+ T 세포;
(iii) CD4+ T 세포, 상기 CD4+ T 세포의 (약) 95% 이상은 CD57-임; 및
(iv) CD8+ T 세포, 상기 CD8+ T 세포의 (약) 95% 이상은 CD57-임;
중의 하나 이상을 포함하는, 방법.
6. 구현예 1 내지 5 중의 어느 하나에 있어서,
상기 생물학적 샘플은 성분채집술 생성물(apheresis product) 또는 백혈구 성분채집술 생성물(leukapheresis product)을 포함하는 방법.
7. T 세포를 농축하는 방법으로서,
상기 방법은, 1차 인간 T 세포를 포함하는 성분채집술 생성물 또는 백혈구 성분채집술 생성물을 포함하는 생물학적 샘플로부터 CD57+ T 세포를 제거함으로써 T 세포의 고갈된 집단을 생성하는 단계를 포함하되, 상기 고갈된 집단은 상기 생물학적 샘플보다 적은 CD57+ T 세포를 포함하고 상기 고갈된 집단은,
(i) (약) 5% 미만의 CD57+ T 세포;
(ii) 상기 생물학적 샘플에 존재하는 CD57+ T 세포의 빈도의 (약) 35% 미만인 빈도의 CD57+ T 세포;
(iii) CD4+ T 세포, 상기 CD4+ T 세포의 (약) 95% 이상은 CD57-임; 및/또는
(iv) CD8+ T 세포, 상기 CD8+ T 세포의 (약) 95% 이상은 CD57-임;
을 포함하는, 방법.
8. 구현예 7에 있어서,
상기 고갈된 집단의 상기 CD4+ T 세포의 (약) 95% 이상은 CD57-CD4+ T 세포를 포함하는, 방법.
9. 구현예 7에 있어서,
상기 고갈된 집단의 상기 CD8+ T 세포의 (약) 95% 이상은 CD57-CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
10. 구현예 7 내지 9 중의 어느 하나에 있어서,
상기 고갈된 집단의 상기 CD4+ T 세포 및 상기 CD8+ T 세포의 (약) 95% 이상은 CD57-CD4+ T 세포 및 CD57-CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
11, 구현예 1 내지 10 중의 어느 하나에 있어서,
상기 고갈된 집단의 상기 CD3+ T 세포의 (약) 95% 이상은 CD57-CD3+ T 세포를 포함하는, 방법.
12. 구현예 7 내지 10 중의 어느 하나에 있어서,
상기 고갈된 집단은 제 1 고갈된 집단이고 상기 방법은 상기 제 1 고갈된 집단으로부터 CD4+ T 세포를 농축함으로써 CD57-CD4+ T 세포의 농축된 집단인 제 2 고갈된 집단 및 비-선택 집단을 생성하는 것을 더 포함하는, 방법.
13. 구현예 12에 있어서,
상기 방법은 상기 비-선택 집단으로부터 CD8+ T 세포를 선택함으로써 CD57-CD8+ T 세포의 농축된 집단인 제 3 고갈된 집단 및 제 2 비-선택 집단을 생성하는 것을 더 포함하는, 방법.
14. 구현예 7 내지 10 중의 어느 하나에 있어서,
상기 고갈된 집단은 제 1 고갈된 집단이고 상기 방법은 상기 제 1 고갈된 집단으로부터 CD8+ T 세포를 선택함으로써 CD57-CD8+ T 세포의 농축된 집단인 제 2 고갈된 집단 및 비-선택 집단을 생성하는 것을 더 포함하는, 방법.
15. 구현예 14 에 있어서,
상기 방법은 상기 비-선택 집단으로부터 CD4+ T 세포를 선택함으로써 CD57-CD4+ T 세포의 농축된 집단인 제 3 고갈된 집단 및 제 2 비-선택 집단을 생성하는 것을 더 포함하는, 방법.
16. 구현예 7 내지 11 중의 어느 하나에 있어서,
상기 고갈된 집단은 제 1 고갈된 집단이고 상기 방법은 상기 제 1 고갈된 집단으로부터 CD3+ T 세포를 선택함으로써 CD57-CD3+ T 세포의 농축된 집단인 제 2 고갈된 집단 및 비-선택 집단을 생성하는 것을 더 포함하는, 방법.
17. 구현예 16에 있어서,
상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단)은,
(i) (약) 5% 미만의 CD57+ T 세포;
(ii) 상기 생물학적 샘플 중에 존재하는 CD57+ T 세포의 빈도(frequency)의 (약) 35% 미만인 빈도의 CD57+ T 세포;
(iii) CD4+ T 세포, 상기 CD4+ T 세포의 (약) 95% 이상은 CD57-임; 및
(iv) CD8+ T 세포, 상기 CD8+ T 세포의 (약) 95% 이상은 CD57-임;
중의 하나 이상을 포함하는, 방법.
18. 구현예 17에 있어서,
상기 고갈된 집단의 상기 CD3+ T 세포의 (약) 95% 이상은 CD57-CD3+ T 세포를 포함하는, 방법.
19. 구현예 17 또는 18에 있어서,
상기 CD57+ T 세포를 제거하기 전에 상기 생물학적 샘플로부터 CD3+ T 세포를 농축함으로써, CD57+ T 세포를 제거하기 위한 농축된 CD3+ T 세포 생물학적 샘플을 생성하는 것을 더 포함하는, 방법.
20. 구현예 17 또는 18에 있어서,
상기 고갈된 집단은 제 1 고갈된 집단이고 상기 방법은 상기 제 1 고갈된 집단으로부터 CD3+ T 세포를 농축함으로써 CD57-CD3+ T 세포의 농축된 집단을 생성하는 것을 더 포함하는, 방법.
21. T 세포를 농축하는 방법으로서,
상기 방법은,
(a) 제 1 선택을 수행하는 단계, 상기 제 1 선택은 1차 인간 T 세포를 포함하는 성분채집술 생성물 또는 백혈구 성분채집술 생성물을 포함하는 생물학적 샘플로부터 CD57+ 세포를 제거함으로써 제 1 고갈된 집단을 생성하는 것을 포함하고, 상기 제 1 고갈된 집단은 상기 생물학적 샘플보다 적은 CD57+ T 세포를 포함함; 및
(b) 상기 제 1 고갈된 집단으로부터의 상기 세포 상에서 제 2 선택을 수행하는 단계, 상기 제 2 선택은 상기 제 1 고갈된 집단으로부터 CD3+ T 세포를 농축하는 것을 포함하고, 그에 의해서 상기 농축은 CD57-CD3+ T 세포의 농축된 집단을 생성하는 것을 포함함;
을 포함하는, 방법.
22. T 세포를 농축하는 방법으로서,
상기 방법은,
(a) 제 1 선택을 수행하는 단계, 상기 제 1 선택은 1차 인간 T 세포를 포함하는 성분채집술 생성물 또는 백혈구 성분채집술 생성물을 포함하는 생물학적 샘플로부터 CD3+ T 세포를 농축함으로써 농축된 생물학적 샘플을 생성하는 것을 포함함; 및
(b) 상기 농축된 생물학적 샘플로부터 상기 세포 상에서 제 2 선택을 수행하는 단계, 상기 제 2 선택은 상기 농축된 생물학적 샘플로부터 CD57+ T 세포를 제거함으로써 CD57-CD3+ T 세포의 농축된 집단인 고갈된 집단을 생성하는 것을 포함함;
을 포함하는, 방법.
23. 구현예 1 내지 22 중의 어느 하나에 있어서,
상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단) 중의 상기 CD57+ T 세포의 빈도는 상기 생물학적 샘플 중의 CD57+ T 세포의 빈도의 (약) 35%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만인, 방법.
24. 구현예 1 내지 23 중의 어느 하나에 있어서,
상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단)은 (약) 3% 미만, (약) 2% 미만, (약) 1% 미만, (약) 0.1% 미만 또는 (약) 0.01% 미만의 CD57+ T 세포를 포함하는, 방법.
25. 구현예 1 내지 24 중의 어느 하나에 있어서,
상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단)은 CD57+ T 세포가 부재하거나 또는 본질적으로 부재하는, 방법.
26. 구현예 1 내지 25 중의 어느 하나에 있어서,
상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단) 중의 나이브-유사(naive-like) 세포의 빈도는 상기 생물학적 샘플 중의 상기 나이브-유사 T 세포의 빈도보다 적어도 (약) 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 많은 것인, 방법.
27. 구현예 1 내지 26 중의 어느 하나에 있어서,
상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단) 중의 CD25+ T 세포, CD27+ T 세포, CD28+ T 세포, CCR7+ T 세포 또는 CD45RA+ 세포 중의 하나 이상의 빈도는 상기 생물학적 샘플 중의 세포들 각각의 빈도보다 적어도 (약) 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 많은 것인, 방법.
28. 구현예 1 내지 27 중의 어느 하나에 있어서,
상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단) 중의 CD28+ T 세포의 빈도는 상기 생물학적 샘플 중의 세포들 각각의 빈도보다 적어도 약 또는 약 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 많은 것인, 방법.
29. 구현예 1 내지 27 중의 어느 하나에 있어서,
상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단) 중의 CD27+/CD28+ T 세포의 빈도는 상기 생물학적 샘플 중의 세포들 각각의 빈도보다 적어도 약 또는 약 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 많은 것인, 방법.
30. 구현예 1 내지 27 중의 어느 하나에 있어서,
상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단)은 적어도 (약) 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% CD27+ T 세포를 포함하거나; 또는
상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단)은 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 25%, 30%, 35% 또는 40% CD28+ T 세포를 포함하는, 방법.
31. 구현예 1 내지 30 중의 어느 하나에 있어서,
상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단)은 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% CD27+CD28+ T 세포를 포함하는, 방법.
32. 구현예 1 내지 31 중의 어느 하나에 있어서,
상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단)은 적어도 (약) 70% 또는 80% CD27+CD28+ T 세포를 포함하는, 방법.
33. 구현예 1 내지 32 중의 어느 하나에 있어서,
상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단)은 적어도 (약) 10%, 15%, 20% 또는 25% CCR7+ T 세포를 포함하는, 방법.
34. 구현예 13 또는 15 내지 33 중의 어느 하나에 있어서,
상기 제 2 고갈된 집단 및 상기 제 3 고갈된 집단을, 선택적으로 (약) 1:3 내지 (약) 3:1, 선택적으로 (약) 1:1의 비로 결합시킴으로써, 상기 제 2 고갈된 집단 및 상기 제 3 고갈된 집단을 포함하는 고갈된 집단을 생성하는 것을 더 포함하는, 방법.
35. T 세포를 자극하는 방법으로서,
상기 방법은 자극 조건하에 입력 조성물의 T 세포를 인큐베이션함으로써, T 세로의 자극된 집단을 생성하는 것을 포함하되, 상기 입력 조성물은 구현예 1 내지 34 중의 어느 하나의 방법에 의해서 생성된 상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단)을 포함하는, 방법.
36. 구현예 1 내지 35 중의 어느 하나에 있어서,
상기 방법은, (약) 90% 이상, (약) 95% 이상, (약) 97% 이상, (약) 99% 이상 또는 (약) 99.9% 이상의 CD57-CD4+ T 세포를 포함하는 T 세포 조성물을 생성하는, 방법.
37. 구현예 1 내지 35 중의 어느 하나에 있어서,
상기 방법은, (약) 90% 이상, (약) 95% 이상, (약) 97% 이상, (약) 99% 이상 또는 (약) 99.9% 이상의 CD57-CD8+ T 세포를 포함하는 T 세포 조성물을 생성하는, 방법.
38. 구현예 1 내지 35 중의 어느 하나에 있어서,
상기 방법은, (약) 90% 이상, (약) 95% 이상, (약) 97% 이상, (약) 99% 이상 또는 (약) 99.9% 이상의 CD57-CD3+ T 세포를 포함하는 T 세포 조성물을 생성하는, 방법.
39. 구현예 38에 있어서,
상기 조성물 중의 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 비율은 3:1 내지 1:3, 2:1 내지 1:2, 1.5:1 내지 1:1.5 또는 1.2:1 내지 1:1.2(각각의 수치를 포함)인, 방법.
40. 구현예 38 또는 39에 있어서,,
상기 조성물 중의 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 1:1 CD4+인, 방법.
41. 구현예 1 내지 40 중의 어느 하나에 있어서,
상기 1차 T 세포는 인간 대상체 유래인, 방법.
42. 구현예 1 내지 41 중의 어느 하나에 있어서,
상기 1차 T 세포는 질환 또는 병태를 갖는 대상체 유래인, 방법.
43. 구현예 42에 있어서,
상기 질환 또는 병태는 암인, 방법.
44. 구현예 1 내지 41 중의 어느 하나에 있어서,
상기 1차 T 세포는 건강한 대상체 유래인, 방법.
45. 구현예 1 내지 44 중의 어느 하나에 있어서,
상기 CD57+ T 세포의 제거는 면역 친화도-기반 선택(immunoaffinity-based selection)을 포함하는, 방법.
46. 구현예 45에 있어서,
상기 면역 친화도-기반 선택은 세포를 CD57에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시키고 상기 항체에 결합되지 않은 세포을 제거함으로써, 음성 선택을 수행하는 것을 포함하되, 회수된 세포들은 상기 CD57+ 세포에 대해 고갈되는 것인, 방법.
47. 구현예 45에 있어서,
상기 제 1, 제 2 및/또는 제 3 선택은 CD4 또는 CD8 T 세포를 농축하고 상기 면역 친화도-기반 선택은 세포를 CD4 또는 CD8에 각각 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시킴으로써 수행되고, 상기 항체에 결합되지 않은 세포를 회수함으로써 양성 선택을 수행하되, 상기 회수된 세포는 상기 CD4+ 세포 또는 상기 CD8+ 세포에 대해 농축되고; 상기 선택은 CD3 T 세포를 농축하고 상기 면역 친화도-기반 선택은 세포를 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시킴으로써 수행되고, 상기 항체에 결합되지 않은 세포를 회수함으로써 양성 선택을 수행하되, 상기 회수된 세포는 상기 CD3+ 세포에 대해 농축되는 것인, 방법.
48. 구현예 46 또는 47에 있어서,
상기 항체는 고체 표면 상에서 고정되고, 선택적으로 상기 고체 표면은 자성 입자(magnetic particle)인, 방법.
49. 구현예 48에 있어서,
상기 항체는 친화도 크로마토그래피 매트릭스(affinity chromatography matrix) 상에 고정되거나 또는 거기에 부착되고; 상기 항체는 상기 매트릭스 상에 고정된 결합제와 가역성 결합을 형성할 수 있는 하나 이상의 결합 파트너(binding partner)를 더 포함하고, 그에 의해서 상기 항체는 상기 접촉 동안 크로마토그래피 매트릭스에 가역적으로 결합되는 것인, 방법.
50. 구현예 49에 있어서,
상기 결합제는 상기 결합 파트너와 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘 뮤테인(streptavidin mutein)인, 방법.
51. 구현예 50에 있어서,
상기 스트렙타비딘 뮤테인은, 서열 번호 66에 제시된 아미노산의 서열에서 스트렙타비딘에서의 위치와 관련하여 위치 44 내지 47에 대응하는 서열 위치에서 아미노산 서열 lle44-Gly45-Ala46-Arg47을 포함하거나; 또는
상기 스트렙타비딘 뮤테인은, 서열 번호 66에 제시된 아미노산의 서열에서 스트렙타비딘에서의 위치와 관련하여 위치 44 내지 47에 대응하는 서열 위치에서 아미노산 서열 Va144-Thr45-Ala46-Arg47을 포함하는,
방법.
52. 구현예 49 내지 51 중의 어느 하나에 있어서,
상기 결합 파트너는 스트렙타비딘 결합-펩티드인, 방법.
53. 구현예 52에 있어서,
상기 스트렙타비딘-결합 펩티드는 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 69), Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 78), SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK(서열 번호 79), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 70), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 71) 및 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 72)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
54. 구현예 52 또는 53에 있어서,
상기 스트렙타비딘-결합 펩티드는 상기 서열 SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK(서열 번호 79)을 갖는 것인, 방법.
55. 구현예 49 내지 54 중의 어느 하나에 있어서,
상기 샘플 중의 세포를 상기 친화도 크로마토그래피 매트릭스에 접촉시킨 후, 경쟁 시약(competition reagent)을 적용하여 상기 결합 파트너와 결합 시약 사이의 결합을 파괴함으로서, 상기 항체에 결합된 세포를 회수하는 것을 더 포함하는, 방법.
56. 구현예 55에 있어서,
상기 경쟁 시약은 비오틴(biotin) 또는 비오틴 유사체인, 방법.
57. 구현예 48 내지 55 중의 어느 하나에 있어서,
상기 크로마토그래피 매트릭스는 분리 용기(separation vessel)에 포장되며, 그것은 칼럼인, 방법.
58. 구현예 1 내지 57 중의 어느 하나에 있어서,
상기 1차 T 세포를 포함하는 상기 생물학적 샘플은 동결 방지제(cyroprotectant)로 제형화된 샘플인, 방법.
59. 구현예 13 내지 58 중의 어느 하나에 있어서,
상기 성분채집술 샘플 또는 백혈구 성분채집술 샘플은 동결 방지제로 제형화된 샘플인, 방법.
60. T 세포를 자극하는 방법으로서,
상기 방법은, 자극 조건하에 입력 조성물(input composition)의 T 세포를 인큐베이션(incubation)함으로써, T 세포의 자극된 집단을 생성하되, 상기 입력 조성물은 구현예 1 내지 59 중의 어느 하나의 방법에 의해서 생성되는, 방법.
61. T 세포를 자극하는 방법으로서,
상기 방법은 자극 조건하에 입력 조성물의 T 세포를 인큐베이션하는 것을 포함하되, 상기 입력 조성물 중의 CD57+ T 세포의 백분율은 CD57+ T 세포의 임계 백분율(threshold percentage) 미만이고, 상기 임계 백분율은 (약) 30% CD57+ T 세포 이하인, 방법.
62. 구현예 61에 있어서,
상기 임계 백분율은 (약) 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 또는 1% CD57+ T 세포 이하인, 방법.
63. 구현예 60 내지 62 중의 어느 하나에 있어서,
상기 입력 조성물은,
(i) (약) 5% 미만의 CD57+ T 세포;
(ii) 적어도 (약) 95%의 CD57- T 세포;
(iii) 적어도 (약) 90%의 CD57-CD4+ T 세포; 또는
(iv) 적어도 (약) 90%의 CD57-CD8+ T 세포;
를 포함하는, 방법.
64. T 세포를 자극하는 방법으로서,
자극 조건하에 입력 조성물의 T 세포를 인큐베이션함으로써, T 세포의 자극된 집단을 생성하는 것을 포함하되, 상기 입력 조성물은,
(i) 약 또는 약 5% 미만의 CD57+ T 세포;
(ii) 적어도 약 또는 약 95%의 CD57- T 세포;
(iii) 적어도 약 또는 약 90%의 CD57-CD4+ T 세포; 또는
(iv) 적어도 약 또는 약 90%의 CD57-CD8+ T 세포;
를 포함하는, 방법.
65. 구현예 60 내지 64 중의 어느 하나에 있어서,
상기 입력 조성물은 1차 인간 T 세포를 포함하는 백혈구 성분채집술 생성물 또는 성분채집술 생성물을 포함하는 생물학적 샘플로부터 얻어진 세포를 포함하는, 방법.
66. 구현예 65에 있어서,
상기 생물학적 샘플로부터 CD57+ T 세포를 제거함으로써, T 세포의 고갈된 집단을 포함하는 입력 조성물을 생성하는 것을 더 포함하는, 방법.
67. T 세포를 자극하는 방법으로서,
상기 방법은,
(a) 제 1 선택을 수행하는 단계, 상기 제 1 선택은 1차 인간 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터 CD57+ T 세포를 제거함으로써 제 1 고갈된 집단을 생성하는 것을 포함하고, 상기 고갈된 집단은 상기 생물학적 샘플보다 적은 CD57+ T 세포를 포함함;
(b) 상기 제 1 고갈된 집단으로부터의 상기 세포 상에서 제 2 선택을 수행하는 단계, 상기 제 2 선택은 상기 고갈된 집단으로부터 (i) CD4+ T 세포 및 (ii) CD8+ T 세포 중의 하나를 농축시키는 것을 포함하고, 그에 의해서 상기 농축은 상기 (i) CD57-CD4+ T 세포 및 (ii) CD57-CD8+ T 세포 중의 하나를 농축시킨 제 2 고갈된 집단 및 비-선택 집단을 생성함;
(c) 상기 비-선택 집단으로부터의 상기 세포 위에서 제 3 단계를 수행하는 단계, 상기 제 3 선택은 상기 비-선택 집단으로부터 상기 (i) CD4+ T 세포 및 (ii) CD8+ T 세포 중의 다른 것을 농축시키는 것을 포함하고, 그에 의해서 상기 농축은 상기 (i) CD57-CD4+ T 세포 및 (ii) CD57-CD8+ T 세포 중의 다른 것을 농축시킨 제 3 고갈된 집단을 생성함; 및
(d) 자극 조건하에 하나 이상의 입력 조성물을 인큐베이션하는 단계, 상기 하나 이상의 입력 조성물은 상기 제 2 고갈된 집단 또는 상기 제 3 고갈된 집단으로부터 T 세포를 포함함;
을 포함하는, 방법.
68. 구현예 67에 있어서,
상기 단계 (d) 전에 상기 방법은 상기 제 2 고갈된 집단 또는 상기 제 3 고갈된 집단을 결합함으로써, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함하는 입력 조성물을 생성하는 것을 포함하는, 방법.
69. 구현예 67에 있어서,
상기 단계 (d)는 제 1 입력 조성물 및 제 2 입력 조성물을 개별적으로 인큐베이션하는 것을 포함하고,
상기 제 1 입력 조성물은 상기 제 2 고갈된 집단으로부터의 T 세포를 포함하고 상기 제 2 입력 조성물은 상기 제 3 고갈된 집단으로부터의 T 세포를 포함하는, 방법.
70. 구현예 67 내지 69 중의 어느 하나에 있어서,
상기 제 2 선택은 (i) CD4+ T 세포를 농축시킴으로써, (i) CD57-CD4+ T 세포를 농축시킨 상기 제 2 고갈된 집단을 생성하고, 상기 제 1 입력 조성물은 농축된 CD57-CD4+ T 세포를 포함하며;
상기 제 3 선택은 (ii) CD8+ T 세포를 농축시킴으로써, (ii) CD57-CD8+ T 세포를 농축시킨 상기 제 3 고갈된 집단을 생성하고, 상기 제 2 입력 조성물은 농축된 CD57-CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
71. 구현예 67 내지 69 중의 어느 하나에 있어서,
상기 제 2 선택은 (ii) CD8+ T 세포를 농축시킴으로써, (ii) CD57-CD8+ T 세포를 농축시킨 상기 제 2 고갈된 집단을 생성하고, 상기 제 1 입력 조성물은 농축된 CD57-CD8+ T 세포를 포함하며;
상기 제 3 선택은 (i) CD4+ T 세포를 농축시킴으로써, (i) CD57-CD4+ T 세포를 농축시킨 상기 제 3 고갈된 집단을 생성하고, 상기 제 2 입력 조성물은 농축된 CD57-CD4+ T 세포를 포함하는, 방법.
72. T 세포를 자극하는 방법으로서,
상기 방법은,
(a) 제 1 선택을 수행하는 단계, 상기 제 1 선택은 1차 인간 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터 CD57+ T 세포를 제거함으로써 제 1 고갈된 집단을 생성하는 것을 포함하고, 상기 고갈된 집단은 상기 생물학적 샘플보다 적은 CD57+ T 세포를 포함함;
(b) 상기 제 1 고갈된 집단으로부터의 상기 세포 상에서 제 2 선택을 수행하는 단계, 상기 제 2 선택은 상기 제 1 고갈된 집단으로부터 CD3+ T 세포를 농축시키는 것을 포함하고, 그에 의해서 상기 농축은 상기 CD3+ T 세포를 농축시킨 제 2 고갈된 집단을 생성함; 및
(c) 자극 조건하에 하나 이상의 입력 조성물을 인큐베이션하는 단계, 상기 하나 이상의 입력 조성물은 상기 제 2 고갈된 집단으로부터의 T 세포를 포함함;
을 포함하는, 방법.
73. T 세포를 자극하는 방법으로서,
상기 방법은,
(a) 생물학적 샘플로부터의 세포 상에서 제 1 선택을 수행하는 단계, 상기 제 1 선택은 상기 생물학적 샘플로부터 CD3+ T 세포를 농축하고, 그에 의해서 상기 농축은 CD3+ T 세포를 농축시킨 농축된 생물학적 샘플을 생성함;
(b) 제 2 선택을 수행하는 단계, 1차 인간 T 세포를 포함하는 상기 농축된 생물학적 샘플로부터 CD57+ T 세포를 제거함으로써 고갈된 집단을 생성하고, 상기 고갈된 집단은 상기 농축된 생물학적 샘플보다 적은 CD57+ 세포를 포함함; 및
(c) 자극 조건하에 하나 이상의 입력 조성물을 인큐베이션하는 단계, 상기 하나 이상의 입력 조성물은 상기 고갈된 집단으로부터의 T 세포를 포함함;
을 포함하는 방법.
74. 구현예 60 내지 73 중의 어느 하나에 있어서,
상기 입력 조성물은 (약) 5% 미만의 CD57+ T 세포를 포함하는, 방법.
75. 구현예 60 내지 74 중의 어느 하나에 있어서,
상기 입력 조성물은 (약) 3% 미만, (약) 2% 미만, (약) 1% 미만, (약) 0.1% 미만 또는 (약) 0.01% 미만의 CD57+ T 세포를 포함하는, 방법.
76. 구현예 60 내지 75 중의 어느 하나에 있어서,
상기 CD57+ 세포의 빈도는 상기 생물학적 샘플 중에 존재하는 CD57+ T 세포의 빈도의 (약) 35%, 30%, 25%, 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만인, 방법.
77. 구현예 60 내지 76 중의 어느 하나에 있어서,
상기 입력 조성물은 CD57+ T 세포가 부재하거나 또는 본질적으로 부재인, 방법.
78. 구현예 60 내지 77 중의 어느 하나에 있어서,
상기 입력 조성물은 적어도 (약) 95%의 CD57+ T 세포를 포함하는, 방법.
79. 구현예 60 내지 78 중의 어느 하나에 있어서,
상기 입력 조성물 중의 CD4+ T 세포는 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 97%, 적어도 (약) 99%, 또는 적어도 (약) 99.9%의 CD57-CD4+ T 세포를 포함하는, 방법.
80. 구현예 60 내지 79 중의 어느 하나에 있어서,
상기 입력 조성물 중의 CD8+ T 세포는 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 97%, 적어도 (약) 99%, 또는 적어도 (약) 99.9%의 CD57-CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
81. 구현예 60 내지 80 중의 어느 하나에 있어서,
상기 입력 조성물 중의 CD3+ T 세포는 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 97%, 적어도 (약) 99%, 또는 적어도 (약) 99.9%의 CD57-CD3+ T 세포를 포함하는, 방법.
82. 구현예 60 내지 81 중의 어느 하나에 있어서,
상기 CD57- T 세포는 CD57-CD4+ T 세포 및 CD57-CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
83. 구현예 60 내지 82 중의 어느 하나에 있어서,
상기 입력 조성물은 3:1 내지 1:3, 2:1 내지 1:2, 1.5:1 내지 1:1.5, 또는 1.2:1 내지 1:1.2(각각의 수치를 포함함)의 비율의 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
84. 구현예 60 내지 83 중의 어느 하나에 있어서,
상기 입력 조성물은 (약) 1:1의 비율의 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
85. 구현예 60 내지 84 중의 어느 하나에 있어서,
상기 입력 조성물 중의 나이브-유사 세포의 빈도는 상기 생물학적 샘플 중의 나이브-유사 세포의 빈도 (약) 적어도 (약) 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 높은 것인, 방법.
86. 구현예 60 내지 85 중의 어느 하나에 있어서,
상기 입력 조성물 중의 CD25+ T 세포, CD27+ T 세포, CD28+ T 세포, CCR7+ T 세포 또는 CD45RA+ T 세포 중의 하나 이상의 빈도는 상기 생물학적 샘플 중의 각각의 세포의 빈도보다 적어도 (약) 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 높은 것인, 방법.
87. 구현예 60 내지 86 중의 어느 하나에 있어서,
상기 입력 조성물은 적어도 (약) 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40%의 CD27+ T 세포를 포함하는, 방법.
88. 구현예 60 내지 87 중의 어느 하나에 있어서,
상기 입력 조성물은 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40%의 CD28+ T 세포를 포함하는, 방법.
89. 구현예 60 내지 88 중의 어느 하나에 있어서,
상기 입력 조성물은 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%의 CD27+CD28+ T 세포를 포함하는, 방법.
90. 구현예 60 내지 89 중의 어느 하나에 있어서,
상기 입력 조성물은 적어도 (약) 70% 또는 80%의 CD27+CD28+ T 세포를 포함하는, 방법.
91. 구현예 20 내지 47 중의 어느 하나에 있어서,
상기 입력 조성물은 적어도 (약) 10%, 15%, 20% 또는 25%의 CCR7+ T 세포를 포함하는, 방법.
92. 구현예 1 내지 91 중의 어느 하나에 있어서,
상기 생물학적 샘플로부터의 CD57+ T 세포 및/또는 상기 제 1 및/또는 제 2 선택에서의 농축 세포의 제거는 면역 친화도-기반 선택을 포함하는, 방법.
93. 구현예 92에 있어서,
상기 친화도-기반 선택은, 세포를 CD57, CD4 또는 CD8에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시키고 상기 항체에 결합되지 않은 세포를 회수함으로서, 음성 선택을 수행하거나, 또는 상기 항체에 결합된 세포를 회수함으로써 양성 선택을 수행하는 것에 의해서 수행되고, 상기 회수된 세포는 상기 CD57+ 세포에 대해 고갈되고/되거나 CD4+ 세포 또는 CD8+ 세포에 대해 농축되고 상기 항체는 자성 입자 상에서 고정되는 것인, 방법.
94. 구현예 92에 있어서,
상기 친화도-기반 선택은, 세포를 친화도 크로마토그래피 매트릭스 위에 고정되거나 또는 부착된 항체와 접촉시킴으로써 수행되고, 상기 항체는 CD57, CD4 또는 CD8에 특이적으로 결합하여 CD57+ 세포의 음성 선택 또는 CD4+ 또는 CD8+ 세포의 양성 선택을 수행하는 것인, 방법.
95. 구현예 60 내지 94 중의 어느 하나에 있어서,
상기 자극 조건은 자극 시약의 존재를 포함하고, 상기 자극 시약은 TCR 복합체의 하나 이상의 성분들의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인 및 하나 이상의 공자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 것인, 방법.
96. 구현예 95에 있어서,
상기 자극 시약은, (i) TCR 복합체의 멤버에 특이적으로 결합하고, 선택적으로 CD3에 특이적으로 결합하는 1차 제제 및 (ii) T 세포 공자극 분자에 특이적으로 결합하는 2차 제제를 포함하며, 선택적으로 상기 공자극 분자는 CD28, CD137(4-1-BB), OX40 또는 ICOS로부터 선택되는, 방법.
97. 구현예 96에 있어서,
상기 1차 및 2차 제제 중의 하나 또는 둘 다는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는, 방법.
96. 구현예 96 또는 97에 있어서,
상기 1차 제제 및 상기 2차 제제는 항체를 포함하고, 선택적으로 상기 자극 조건은 항-CD3 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 항-CD28 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는, 방법.
99. 구현예 97 또는 98에 있어서,
상기 항원 결합 단편은 Fab 단편, Fv 단편, 및 단쇄 Fv 단편(scFv)으로 구성된 군으로부터 선택된 1가 항체 단편인, 방법.
100. 구현예 96 내지 99 중의 어느 하나에 있어서,
상기 1차 제제는 항-CD3 Fab이고 상기 2차 제제는 항-CD28 Fab를 포함하는, 방법.
101. 구현예 96 내지 100 중의 어느 하나에 있어서,
상기 1차 제제는 고체 지지체의 표면에 각각 존재하거나 또는 그 위에 부착되는, 방법.
102. 구현예 101에 있어서,
상기 고체 지지체는 비드(bead), 선택적으로는 상자성 비드(paramagnetic bead)이거나 또는 그를 포함하는, 방법.
103. 구현예 102에 있어서,
상기 자극 조건은, 항-CD3 및 항-CD28 항체에 부착된 표면을 갖는, 상자성 비드를 포함하는 자극 시약의 존재를 포함하고, 상기 자극 시약은 약 3:1 이하의 비드 대 세포의 비율로 존재하는, 방법.
104. 구현예 103에 있어서,
상기 자극 시약은 (약) 1:1의 비드 대 세포의 비율로 존재하는, 방법.
105. 구현예 102 내지 104 중의 어느 하나에 있어서,
상기 세포로부터 상기 자극 시약을 분리시키는 것을 더 포함하되, 상기 분리는 상기 세포를 자기장에 노출시키는 것을 포함하는, 방법.
106. 구현예 96 내지 104 중의 어느 하나에 있어서,
상기 1차 제제 및 상기 2차 제제는 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 포함하는 올리고머 입자 시약의 표면 위에 가역적으로 결합되는, 방법.
107. 구현예 106에 있어서,
상기 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는, 비오틴, 아비딘(avidin), 비오틴 유사체 또는 비오틴 뮤테인, 아비딘 유사체 또는 뮤테인 및/또는 그들의 생물학적 활성 단편에 결합하거나 또는 그에 결합할 수 있는 것인, 방법.
108. 구현예 106 또는 107에 있어서,
상기 스트렙타비딘 분자는, 서열 번호 66에 제시된 아미노산의 서열과 관련하여 위치 44 내지 47에 상응하는 서열 위치에서 아미노산 서열 Val44-Thr45-Ala46-Arg47 또는 Ile44-Gly45-Ala46-Arg47을 포함하는, 방법.
109. 구현예 106 내지 108 중의 어느 하나에 있어서,
상기 스트렙타비딘 뮤테인 분자는,
a) 서열 번호 70-73, 78, 85-89 중의 임의의 것에 제시된 아미노산의 서열;
b) 서열 번호 70-73, 78, 85-89 중의 임의의 것과 적어도 (약) 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내고 Val44-Thr45-Ala46-Arg47 또는 Ile44-Gly45-Ala46-Arg47에 상응하는 아미노산 서열을 함유하고 비오틴, 비오틴 유사체 또는 스트렙타비딘-결합 펩티드와 가역적으로 결합하는 아미노산 서열; 또는
c) 비오틴, 비오틴 유사체 또는 스트렙타비딘-결합 펩티드와 가역적으로 결합하는 상기 a) 또는 b)의 작용성 단편;
을 포함하는, 방법.
110. 구현예 106 내지 109 중의 어느 하나에 있어서,
상기 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 서열 번호 73 또는 78에 제시된 아미노산의 서열을 포함하는, 방법.
111. 구현예 106 내지 110 중의 어느 하나에 있어서,
상기 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 서열 번호 73에 제시된 아미노산의 서열을 포함하는, 방법.
112. 구현예 106 내지 110 중의 어느 하나에 있어서,
상기 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 서열 번호 78에 제시된 아미노산의 서열을 포함하는, 방법.
113. 구현예 106 내지 112 중의 어느 하나에 있어서,
상기 1차 제제 및 상기 2차 제제는 각각 스트렙타비딘-결합 펩티드를 포함하는, 방법.
114. 구현예 113에 있어서,
상기 스트렙타비딘-결합 펩티드는 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 69), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 70), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 71) 및 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 89)으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
115. 구현예 106 내지 114 중의 어느 하나에 있어서,
상기 1차 제제는 항-CD3 Fab를 포함하고 상기 2차 제제는 항-CD28 Fab을 포함하는, 방법.
116. 구현예 106 내지 115 중의 어느 하나에 있어서,
상기 올리고머 입자 시약은 (약) 60 nm 초과, (약) 70 nm 초과, (약) 80 nm 초과, 또는 (약) 90 nm 초과의 반경을 포함하는, 방법.
117. 구현예 106 내지 116 중의 어느 하나에 있어서,
상기 올리고머 입자 시약은 적어도 (약) 5×107 g/mol 또는 적어도 (약) 1×108 g/mol; 또는 5×107 g/mol 내지 5×108 g/mol, 1×108 g/mol 내지 5×108 g/mol 또는 1×108 g/mol 내지 2×108 g/mol(각각의 수치를 포함함)의 분자량을 포함하는, 방법.
118. 구현예 106 내지 117 중의 어느 하나에 있어서,
상기 올리고머 입자 시약은 적어도 (약) 500 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사량체(streptavidin mutein tetramer), 적어도 (약) 1,000 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사량체, 적어도 (약) 1,500 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사량체 또는 적어도 (약) 2,000 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사량체; 또는 1,000 내지 20,000 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사량체, 1,000 내지 10,000 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사량체 또는 2,000 내지 5,000 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사량체를 포함하는, 방법.
119. 구현예 106 내지 118 중의 어느 하나에 있어서,
상기 세포로부터 상기 자극 시약을 분리하는 것을 더 포함하되, 상기 분리는 상기 세포를 물질(substance)과 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 물질은 상기 1차 및 2차 시약과 상기 올리고머 입자 시약 사이의 결합을 역전(reversing)시킬 수 있는 것인, 방법.
120. 구현예 119에 있어서,
상기 물질은 자유 결합 파트너(free binding partner)이고/이거나 경쟁 제제(competition agent)인, 방법.
121. 구현예 119 또는 120에 있어서,
상기 물질의 존재는 상기 T 세포 중의 상기 1차 및 2차 제제에 의해서 유도되거나 또는 조절된 신호를 종경시키거나 또는 감소시키는, 방법.
122. 구현예 119 내지 121 중의 어느 하나에 있어서,
상기 물질은 스트렙타비딘-결합 펩티드, 비오틴, 또는 그의 생물학적 활성 단편(biologically active fragment), 또는 비오틴 유사체(biotin analog) 또는 그의 생물학적 활성 단편이거나 또는 그를 포함하는, 방법.
123. 구현예 119 내지 122 중의 어느 하나에 있어서,
상기 물질은 오틴 유사체이거나 또는 그를 포함하는, 방법.
124.
구현예 122에 있어서,
상기 물질은 스트렙타비딘-결합 펩티드이거나 또는 이를 포함하고, 상기 스트렙타비딘-결합 펩티드는 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 69), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 70), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 71) 및 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 89)으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
125. 구현예 122에 있어서,
상기 물질은 비오틴 또는 생물학적 활성 단편, 또는 비오틴 유사체 또는 생물학적 활성 단편이거나 또는 이를 포함하는, 방법.
126. 구현예 60 내지 126 중의 어느 하나에 있어서,
상기 자극 조건은 하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재를 포함하는, 방법.
127. 구현예 60 내지 126 중의 어느 하나에 있어서,
상기 자극 조건은 하나 이상의 재조합 IL-2, IL-7 및 IL-15의 존재를 포함하는, 방법.
128. T 세포를 유전자 조작하는 방법으로서,
상기 방법은, 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드(heterologous polynucleotide)를 구현예 1 내지 59 중의 어느 하나의 방법에 의해서 생산된 T 세포 조성물로부터의 T 세포의 집단으로 도입시킴으로써, T 세포의 조작된 집단을 생성하는 것을 포함하는, 방법.
129. T 세포를 유전자 조작하는 방법으로서,
상기 방법은, 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 구현예 73 내지 127 중의 어느 하나의 자극된 T 세포 집단으로부터의 T 세포의 집단으로 도입시킴으로써, T 세포의 조작된 집단을 생성하는 것을 포함하는, 방법.
130. 구현예 1 내지 127 중의 어느 하나에 있어서,
재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 상기 고갈된 집단으로부터 얻어진 T 세포의 집단 또는, 상기 입력 조성물, 또는 상기 자극된 집단으로 도입함으로써, T 세포의 조작된 집단을 생성하는 것을 더 포함하는, 방법.
131. T 세포를 유전자 조작하는 방법으로서,
상기 방법은, 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를, 상기 입력 조성물 중의 CD57+ T 세포의 백분율이 CD57+ T 세포의 임계 백분율 미만인 경우 자극 조건하에 입력 조성물의 T 세포를 인큐베이션함으로써 생성된 T 세포의 자극된 집단으로 도입하는 것을 포함하고, 상기 임계 백분율은 (약) 30% 이하이고, 그에 의해서 T 세포의 조작된 집단을 생성하는 것인, 방법.
132. 구현예 131에 있어서,
상기 임계 백분율은 (약) 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 또는 1% 이하인, 방법.
133. T 세포를 유전자 조작하는 방법으로서,
재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 입력 조성물로부터의 T 세포로 도입함으로써, T 세포의 조작된 집단을 생성하는 것을 포함하되, 상기 입력 조성물은,
(i) (약) 5% 미만의 CD57+ T 세포;
(ii) 적어도 (약) 95%의 CD57- T 세포;
(iii) 적어도 (약) 90%의 CD57-CD4+ T 세포; 또는
(iv) 적어도 (약) 90%의 CD57-CD8+ T 세포;
를 포함하는, 방법.
134. T 세포를 유전자 조작하는 방법으로서,
상기 방법은,
(a) 제 1 선택을 수행하는 단계, 상기 제 1 선택은 1차 인간 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터 CD57+ T 세포를 제거함으로써 고갈된 집단을 생성하는 것을 포함하고, 상기 고갈된 집단은 상기 생물학적 샘플보다 적은 CD57+ T 세포를 포함함;
(b) 상기 고갈된 집단으로부터의 상기 세포 상에서 제 2 선택을 수행하는 단계, 상기 제 2 선택은 1차 인간 T 세포를 포함하는 상기 생물학적 샘플로부터 (i) CD4+ T 세포 및 (ii) CD8+ T 세포 중의 하나를 농축시키는 것을 포함하고, 그에 의해서 상기 농축은 상기 (i) CD57-CD4+ T 세포 및 (ii) CD57-CD8+ T 세포 중의 하나를 농축시킨 제 1 농축된 집단 및 비-선택 집단을 생성함;
(c) 상기 비-선택 집단으로부터의 상기 세포 위에서 제 3 단계를 수행하는 단계, 상기 제 3 선택은 상기 비-선택 집단으로부터 상기 (i) CD4+ T 세포 및 (ii) CD8+ T 세포 중의 다른 것을 농축시키는 것을 포함하고, 그에 의해서 상기 농축은 상기 (i) CD57-CD4+ T 세포 및 (ii) CD57-CD8+ T 세포 중의 다른 것을 농축시킨 제 2 농축된 집단을 생성함; 및
(d) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 상기 제 1 및 제 2 농축된 집단 중의 하나 또는 둘 다로부터의 T 세포로 도입함으로써, T 세포의 제 1 및 제 2 조작된 집단을 생성하는 단계;
를 포함하는, 방법.
135. 구현예 130 내지 134 중의 어느 하나에 있어서,
상기 도입 전에, 상기 입력 조성물 또는 상기 농축된 집단은 자극 조건하에 인큐베이션되는, 방법.
136. 구현예 134 또는 135에 있어서,
상기 단계 (d)는 상기 이종 폴리뉴클로오티드를 상기 제 1 및 제 2 농축된 집단으로부터의 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함하는 세포의 집단으로 도입하는 것을 포함하는, 방법.
137. 구현예 134 또는 135에 있어서,
상기 단계 (d)는 상기 이종 폴리뉴클로오티드를 상기 제 1 농축된 집단의 세포 및 제 2 농축된 집단의 세포로 개별적으로 도입하는 것을 포함하는, 방법.
138. 구현예 134 내지 137 중의 어느 하나에 있어서,
상기 제 2 선택은 (i) CD4+ T 세포를 농축함으로써 (i) CD57-CD4+ T 세포를 농축시킨 제 1 농축된 집단을 생성하는 것을 포함하고 상기 제 1 조작된 집단은 CD57-CD4+ T 세포를 포함하고,
상기 제 3 선택은 (ii) CD8+ T 세포를 농축함으로써 (ii) CD57-CD8+ T 세포를 농축시킨 제 2 농축된 집단을 생성하는 것을 포함하고 상기 제 2 조작된 집단은 CD57-CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
139. 구현예 134 내지 137 중의 어느 하나에 있어서,
상기 제 2 선택은 (ii) CD8+ T 세포를 농축함으로써 (ii) CD57-CD8+ T 세포를 농축시킨 제 1 농축된 집단을 생성하는 것을 포함하고 상기 제 1 조작된 집단은 CD57-CD8+ T 세포를 포함하고,
상기 제 3 선택은 (i) CD4+ T 세포를 농축함으로써 (i) CD57-CD4+ T 세포를 농축시킨 제 2 조작된 집단을 생성하는 것을 포함하고 상기 제 2 입력 집단은 CD57-CD4+ T 세포를 포함하는, 방법.
140. T 세포를 유전자 조작하는 방법으로서,
상기 방법은,
(a) 제 1 선택을 수행하는 단계, 상기 제 1 선택은 1차 인간 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터 CD57+ T 세포를 제거함으로써 고갈된 집단을 생성하는 것을 포함하고, 상기 고갈된 집단은 상기 생물학적 샘플보다 적은 CD57+ T 세포를 포함함;
(b) 상기 고갈된 집단으로부터의 상기 세포 상에서 제 2 선택을 수행하는 단계, 상기 제 2 선택은 1차 인간 T 세포를 포함하는 상기 생물학적 샘플로부터 CD3+ T 세포를 농축시키는 것을 포함하고, 그에 의해서 상기 농축은 상기 CD57-CD3+ T 세포를 농축시킨 제 1 농축된 집단 및 비-선택 집단을 생성함; 및
(c) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 상기 제 1 농축된 집단으로부터의 T 세포로 도입함으로써, T 세포의 제 1 조작된 집단을 생성하는 단계;
를 포함하는, 방법.
141. 구현예 140에 있어서,
상기 도입 전에, 상기 제 1 농축된 집단은 자극 조건하에서 인큐베이션되는, 방법.
142. T 세포를 유전자 조작하는 방법으로서,
상기 방법은,
(a) 제 1 선택을 수행하는 단계, 상기 제 1 선택은 1차 인간 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터 CD3+ T 세포를 농축하는 것을 포함하고, 그에 의해서 상기 농축은 CD3+ T 세포를 농축시킨 농축된 생물학적 샘플을 생성하는 것을 포함함;
(b) 상기 농축된 생물학적 샘플로부터 상기 세포 상에서 제 2 선택을 수행하는 단계, 상기 제 2 선택은 1차 인간 T 세포를 포함하는 상기 농축된 생물학적 샘플로부터 CD57+ T 세포를 제거함으로써, 고갈된 집단을 생성하고, 상기 고갈된 집단은 상기 농축된 생물학적 샘플보다 적은 CD57- T 세포를 포함함; 및
(c) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 상기 고갈된 집단으로부터의 T 세포로 도입함으로써, T 세포의 제 1 조작된 집단을 생성하는 단계;
를 포함하는, 방법.
143. 구현예 142에 있어서,
상기 도입 전에, 상기 고갈된 집단은 자극 조건하에서 인큐베이션되는, 방법.
144. 구현예 134 내지 143 중의 어느 하나에 있어서,
상기 도입 전에, 상기 제 1 및 제 2 농축된 집단 중의 하나 또는 둘 다의 상기 세포는 자극 조건하에서 인큐베이션되는, 방법.
145. 구현예 128 내지 144 중의 어느 하나에 있어서,
상기 도입은 형질도입을 포함하는, 방법.
146. 구현예 145에 있어서,
상기 바이러스 벡터는 감마레트로바이러스 벡터(gammaretroviral vector) 또는 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)인, 방법.
147. 구현예 145 또는 146에 있어서,
상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인, 방법.
148. 구현예 128 내지 147 중의 어느 하나에 있어서,
상기 도입 후 최대 96 시간 동안, 선택적으로 (약) 37℃±2℃의 온도에서 형질도입된 세포를 포함하는 상기 조성물을 인큐베이션하는 것을 더 포함하는, 방법.
149. 구현예 148에 있어서,
상기 인큐베이션은 상기 도입 후 최대 72 시간 동안 수행되는, 방법.
150. 구현예 148에 있어서,
상기 인큐베이션은 상기 도입 후 최대 48 시간 동안 수행되는, 방법.
151. 구현예 148에 있어서,
상기 인큐베이션은 상기 도입 후 최대 24 시간 동안 수행되는, 방법.
152. 구현예 148 내지 151 중의 어느 하나에 있어서,
상기 인큐베이션은 상기 T 세포의 게놈(genome)으로 상기 바이러스 벡터를 통합(integration)시키는, 방법.
153. 구현예 128 내지 147 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조작된 세포의 증식 또는 증폭을 촉진시키는 조건하에서 상기 조작된 집단의 세포를 배양함으로써, 세포의 증폭된 집단을 생성하는, 방법.
154. 구현예 153에 있어서,
상기 배양은 하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재하에 수행되는, 방법.
155. 구현예 153에 있어서,
상기 배양은, 선택적으로 하나 이상의 IL-2, IL-7 및 IL-15를 포함하는, 하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재하에서 수행되는, 방법.
156. 구현예 153에 있어서,
상기 증식 또는 증폭은, 상기 배양의 개시(initiation)시에서와 비교하여, 상기 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 생존가능한 T 세포의 수에서 약 또는 적어도 (약) 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 또는 (약) 5-배 초과의 증가를 결과하는, 방법.
157. 세포를 수확 또는 수집하는 방법으로서,
상기 방법은 구현예 1 내지 156 중의 어느 하나의 방법에 의해서 생산된 세포의 집단을 수확 또는 수집하는 것을 포함하는, 방법.
158. T 세포를 유전자 조작하는 방법으로서,
상기 방법은,
(a) 자극 조건하에 구현예 1 내지 19 중의 어느 하나의 방법에 의해서 생성된 고갈된 집단(선택적으로 제 1 고갈된 집단, 제 2 고갈된 집단, 또는 제 3 고갈된 집단)으로부터의 T 세포를 인큐베이션하는 단계, 상기 자극 조건은, TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인 및 하나 이상의 공자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인을 활성화시킴으로써, 자극된 T 세포를 생성할 수 있는 자극 시약의 존재를 포함함; 및
(b) 이종 폴리뉴클레오티드를 상기 자극된 T 세포로 도입하는 단계, 상기 도입은 상기 자극된 T 세포를 재조합 수용체를 암호화하는 상기 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입함으로써, T 세포의 조작된 집단을 생성하는 것을 포함함;
을 포함하는, 방법.
159. T 세포를 유전자 조작하는 방법으로서,
상기 방법은,
(a) 제 1 선택을 수행하는 단계, 상기 제 1 선택은 1차 인간 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터 CD57+ T 세포를 제거함으로써 고갈된 집단을 생성하는 것을 포함하고, 상기 고갈된 집단은 상기 생물학적 샘플보다 적은 CD57+ T 세포를 포함함;
(b) 상기 고갈된 집단으로부터의 상기 세포 상에서 제 2 선택을 수행하는 단계, 상기 제 2 선택은 1차 인간 T 세포를 포함하는 상기 생물학적 샘플로부터 (i) CD4+ T 세포 및 (ii) CD8+ T 세포 중의 하나를 농축시키는 것을 포함하고, 그에 의해서 상기 농축은 (i) CD57-CD4+ T 세포 및 (ii) CD57-CD8+ T 세포 중의 하나를 농축시킨 제 1 농축된 집단 및 비-선택 집단을 생성함;
(c) 상기 비-선택 집단으로부터의 상기 세포 위에서 제 3 단계를 수행하는 단계, 상기 제 3 선택은 상기 비-선택 집단으로부터 상기 (i) CD4+ T 세포 및 (ii) CD8+ T 세포 중의 다른 것을 농축시키는 것을 포함하고, 그에 의해서 상기 농축은 상기 (i) CD57-CD4+ T 세포 및 (ii) CD57-CD8+ T 세포 중의 다른 것을 농축시킨 제 2 농축된 집단을 생성함;
(d) 자극 조건하에 상기 제 1 농축된 집단 및 상기 제 2 농축된 집단으로부터의 T 세포를 인큐베이션하는 단계, 상기 자극 조건은, TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인 및 하나 이상의 공자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인을 활성화시킴으로써, 상기 제 1 및 제 2 농축된 집단의 자극된 T 세포를 생성할 수 있는 자극 시약의 존재를 포함함; 및
(e) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 상기 제 1 및 제 2 농축된 집단의 상기 자극된 T 세포로 도입하는 단계, 상기 도입은 상기 자극된 T 세포를 상기 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입함으로써, 상기 제 1 및 제 2 농축된 집단으로부터의 T 세포의 조작된 집단을 생성하는 것을 포함함;
을 포함하는, 방법.
160. 구현예 158 또는 159에 있어서,
(i) 상기 조작된 집단의 증식 또는 증폭을 촉진시키는 조건하에 조작된 T 세포의 상기 집단을 배양함으로써, T 세포의 증폭된 집단을 생성하는 단계; 및
(ii) 상기 증폭된 집단을 수확 또는 수집하는 단계;
를 포함하는, 방법.
161. 구현예 159 또는 160에 있어서,
상기 인큐베이션 전에, 상기 제 1 농축된 집단 및 상기 제 2 농축된 집단은,
(i) (약) 5% 미만의 CD57+ T 세포;
(ii) 상기 생물학적 샘플 중에 존재하는 (약) 35% 미만의 CD57+ T 세포의 빈도인 CD57+ T 세포의 빈도; 또는
(iii) 적어도 (약) 95%의 CD57- T 세포;
중의 하나 이상을 포함하는, 방법.
162. 구현예 159에 있어서,
상기 인큐베이션 전에, 상기 제 1 농축된 집단 및 상기 제 2 농축된 집단은 (약) 5% 미만의 CD57+ T 세포를 포함하는, 방법.
163. 구현예 159 내지 162 중의 어느 하나에 있어서,
상기 인큐베이션 전에, 상기 제 1 농축된 집단 및 상기 제 2 농축된 집단은 각각 (약) 3% 미만, (약) 2% 미만, (약) 1% 미만, (약) 0.1% 또는 (약) 0.01% 미만의 CD57+ T 세포를 포함하는, 방법.
164. 구현예 159 내지 163 중의 어느 하나에 있어서,
상기 인큐베이션 전에, 상기 제 1 농축된 집단 및 상기 제 2 농축된 집단 중의 CD57+ T 세포의 빈도는 상기 생물학적 샘플 중의 CD57+ T 세포의 빈도의 (약) 35%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만을 포함하는, 방법.
165. 구현예 159 내지 164 중의 어느 하나에 있어서,
상기 도입 전에, 상기 제 1 농축된 집단 및 상기 제 2 농축된 집단은 CD57+ T 세포가 부재하거나 또는 본질적으로 부재하는, 방법.
166. 구현예 159 내지 165 중의 어느 하나에 있어서,
상기 제 1 농축된 조성물 및 상기 제 2 농축된 조성물의 세포는 인큐베이션되고/되거나, 단일 혼합된 집단에서 함께 배양되는, 방법.
167. 구현예 166에 있어서,
상기 도입 전에, 상기 단일 혼합된 집단은 3:1 내지 1:3, 2:1 내지 1:2, 1.5:1 내지 1:1.5 또는 1.2:1 내지 1:1.2의 비율(각각의 수치를 포함함)의 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
168. 구현예 166 또는 167에 있어서,
상기 도입 전에, 상기 단일 혼합된 집단은 (약) 1:1의 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
169. 구현예 159 내지 168 중의 어느 하나에 있어서,
상기 제 1 농축된 집단 및 상기 제 2 농축된 집단의 세포는 개별적으로 인큐베이션되고/되거나, 배양되는, 방법.
170. T 세포를 유전자 조작하는 방법으로서,
상기 방법은,
(a) 제 1 선택을 수행하는 단계, 상기 제 1 선택은 1차 인간 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터 CD57+ T 세포를 제거함으로써 고갈된 집단을 생성하는 것을 포함하고, 상기 고갈된 집단은 상기 생물학적 샘플보다 적은 CD57+ T 세포를 포함함;
(b) 상기 고갈된 집단으로부터의 상기 세포 상에서 제 2 선택을 수행하는 단계, 상기 제 2 선택은 1차 인간 T 세포를 포함하는 상기 생물학적 샘플로부터 CD3+ T 세포를 농축시키는 것을 포함하고, 그에 의해서 상기 농축은 상기 CD57-CD3+ T 세포를 농축시킨 농축된 집단을 생성함;
(c) 자극 조건하에 상기 농축된 집단으로부터의 T 세포를 인큐베이션하는 단계, 상기 자극 조건은, TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인 및 하나 이상의 공자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인을 활성화시킴으로써, 상기 농축된 집단의 자극된 T 세포를 생성할 수 있는 자극 시약의 존재를 포함함; 및
(d) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 상기 농축된 집단의 상기 자극된 T 세포로 도입하는 단계, 상기 도입은 상기 자극된 T 세포를 재조합 수용체를 암호화하는 상기 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입함으로써, 상기 농축된 집단으로부터의 T 세포의 조작된 집단을 생성하는 것을 포함함;
을 포함하는, 방법.
171. T 세포를 유전자 조작하는 방법으로서,
상기 방법은,
(a) 제 1 선택을 수행하는 단계, 상기 제 1 선택은 1차 인간 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터 CD3+ T 세포를 농축하는 것을 포함하고, 그에 의해서 상기 농축은 CD3+ T 세포를 농축시킨 생물학적 샘플을 생성함;
(b) 상기 농축된 생물학적 샘플로부터의 세포 상에서 제 2 선택을 수행하는 단계, 상기 제 2 선택은 1차 인간 T 세포를 포함하는 상기 생물학적 샘플로부터 CD57+ T 세포를 제거함으로써 고갈된 집단을 생성하는 것을 포함하고, 상기 고갈된 집단은 상기 농축된 생물학적 샘플보다 적은 CD57+ T 세포를 포함함;
(c) 자극 조건하에 상기 고갈된 집단으로부터의 T 세포를 인큐베이션하는 단계, 상기 자극 조건은, TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인 및 하나 이상의 공자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인을 활성화시킴으로써, 상기 고갈된 집단의 자극된 T 세포를 생성할 수 있는 자극 시약의 존재를 포함함; 및
(d) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 상기 고갈된 집단의 상기 자극된 T 세포로 도입하는 단계, 상기 도입은 상기 자극된 T 세포를 재조합 수용체를 암호화하는 상기 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입함으로써, 상기 농축된 집단으로부터의 T 세포의 조작된 집단을 생성하는 것을 포함함;
을 포함하는, 방법.
172. 구현예 170 또는 171에 있어서,
(i) 상기 조작된 집단의 증식 또는 증폭을 촉진시키는 조건하에 조작된 T 세포의 상기 집단을 배양함으로써, T 세포의 증폭된 집단을 생성하는 단계; 및
(ii) 상기 증폭된 집단을 수확 또는 수집하는 단계;
를 포함하는, 방법.
173. 구현예 158 내지 172 중의 어느 하나에 있어서,
상기 자극 시약은 항-CD3 및 항-CD28 항체에 부착된 표면을 갖는 상자성 비드를 포함하는, 방법.
174. 구현예 158 내지 172 중의 어느 하나에 있어서,
상기 자극 시약은 가역역으로 결합된 항-CD3 및 항-CD28 Fabs를 갖는 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 포함하는, 방법.
175. 구현예 158 내지 172 중의 어느 하나에 있어서,
상기 생물학적 샘플로부터의 상기 CD57+ T 세포의 제거 및/또는 상기 제 1 및/또는 제 2 선택에서의 세포 농축은 면역 친화도-기반 선택을 포함하는, 방법.
176. 구현예 175에 있어서,
상기 친화도-기반 선택은, 세포를 CD57, CD4 또는 CD8에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시키고 상기 항체에 결합되지 않은 세포를 회수함으로서, 음성 선택을 수행하거나, 또는 상기 항체에 결합된 세포를 회수함으로써 양성 선택을 수행하는 것에 의해서 수행되고, 상기 회수된 세포는 상기 CD57+ 세포에 대해 고갈되고/되거나 CD4+ 세포 또는 CD8+ 세포에 대해 농축되고 항체는 자성 입자 상에서 고정되는 것인, 방법.
177. 구현예 175에 있어서,
상기 친화도-기반 선택은, 세포를 CD57, CD3, CD4 또는 CD8에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시키고 상기 항체에 결합되지 않은 세포를 회수함으로서, 음성 선택을 수행하거나, 또는 상기 항체에 결합된 세포를 회수함으로써 양성 선택을 수행하는 것에 의해서 수행되고, 상기 회수된 세포는 상기 CD57+ 세포에 대해 고갈되고/되거나 CD3+ 세포, CD4+ 세포 또는 CD8+ 세포에 대해 농축되고 상기 항체는 자성 입자 상에서 고정되는 것인, 방법.
178. 구현예 175에 있어서,
상기 친화도-기반 선택은, 세포를 친화도 크로마토그래피 매트릭스 위에 고정되거나 또는 부착된 항체와 접촉시킴으로써 수행되고, 상기 항체는 CD57, CD4 또는 CD8에 특이적으로 결합하여 CD57+ 세포의 음성 선택 또는 CD4+ 또는 CD8+ 세포의 양성 선택을 수행하는 것인, 방법.
179. 구현예 175에 있어서,
상기 친화도-기반 선택은, 세포를 친화도 크로마토그래피 매트릭스 위에 고정되거나 또는 부착된 항체와 접촉시킴으로써 수행되고, 상기 항체는 CD57, CD3, CD4 또는 CD8에 특이적으로 결합하여 CD57+ 세포의 음성 선택 또는 CD3+, CD4+, CD8+ 세포의 양성 선택을 수행하는 것인, 방법.
180. 구현예 157, 160, 또는 161 내지 179 중의 어느 하나에 있어서,
상기 수확은, T 세포의 상기 조작된 집단 또는 상기 증폭된 집단은 T 세포, 생존가능한 T 세포, 조작된 T 세포 또는 생존가능한 T 세포의 임계 수(threshold number) 또는 T 세포, 생존가능한 T 세포, 조작된 T 세포 또는 생존가능한 T 세포의 임계 농도(threshold concentration)를 포함하는 시점에서 또는 그 후에 수행되는, 방법.
181. 구현예 180에 있어서,
상기 T 세포, 생존가능한 T 세포, 조작된 T 세포 또는 생존가능한 T 세포의 임계 수 또는 농도는 자극 개시 후 (약) 4, 5, 6 또는 7일 이내에 도달하는, 방법.
182. 구현예 181에 있어서,
복수의 조작된 T 세포의 집단 또는 증폭된 T 세포의 집단 중에서, 상기 T 세포, 생존가능한 T 세포, 조작된 T 세포 또는 생존가능한 T 세포의 임계 수 또는 농도는 상기 복수의 집단의 적어도 (약) 70%, 80%, 90% 또는 95%에서 자극 개시 후 (약) 5일 또는 6일 이내에 도달하는, 방법.
183. 구현예 180 내지 182 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포, 생존가능한 T 세포, 조작된 T 세포 또는 생존가능한 T 세포의 임계 수 또는 농도는 자극의 개시 후 (약) 2, 3, 4 또는 5 집단 배가(population doublings) 이내에 도달하는, 방법.
184. 구현예 80 내지 118 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조작된 집단 또는 상기 증폭된 집단은 (약) 3% 미만, (약) 2% 미만, (약) 1% 미만, (약) 0.1% 미만 또는 (약) 0.01% 미만의 CD57+ T 세포를 포함하는, 방법.
185. 구현예 128 내지 184 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조작된 집단 또는 상기 증폭된 집단은 CD57+ T 세포가 부재하거나 또는 본질적으로 부재하는, 방법.
186. 구현예 128 내지 185 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조작된 집단 또는 상기 증폭된 집단에서 상기 나이브-유사 세포의 빈도는 상기 집단 중의 상기 세포의 적어도 (약) 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50%인, 방법.
187. 구현예 128 내지 186 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조작된 집단 또는 상기 증폭된 집단에서 CD25+ T 세포, CD27+ T 세포, CD28+ T 세포, CCR7+ T 세포 또는 CD45RA+ T 세포 중의 하나 이상의 빈도는 상기 집단 중의 각각의 세포의 빈도보다 (약) 높은 적어도 (약) 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50%인, 방법.
188. 구현예 128 내지 187 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조작된 집단 또는 상기 증폭된 집단은 적어도 (약) 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40%의 CD27+ T 세포를 포함하는, 방법.
189. 구현예 128 내지 188 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조작된 집단 또는 상기 증폭된 집단은 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 25%, 30%, 35% 또는 40%의 CD28+ T 세포를 포함하는, 방법.
190. 구현예 128 내지 189 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조작된 집단 또는 상기 증폭된 집단은 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%의 CD27+CD28+ T 세포를 포함하는, 방법.
191. 구현예 128 내지 190 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조작된 집단 또는 상기 증폭된 집단은 적어도 (약) 70% 또는 80%의 CD27+CD28+ T 세포를 포함하는, 방법.
192. 구현예 128 내지 191 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조작된 집단 또는 상기 증폭된 집단은 적어도 (약) 10%, 15%, 20% 또는 25%의 CCR7+ T 세포를 포함하는, 방법.
193. 구현예 157, 160, 또는 161 내지 192 중의 어느 하나에 있어서,
상기 세포를 수확하는 것은 상기 세포를 세정(rinsing) 또는 세척(washing)함으로써 세포 파편(cellular debris)을 제거하는 것을 포함하는, 방법.
194. 구현예 157, 160, 또는 161 내지 193 중의 어느 하나에 있어서,
상기 수확 또는 수집은 동결 보존 또는 투여를 위해 상기 세포를 대상체에 투여하는 것을 더 포함하는, 방법.
195. 구현예 194에 있어서,
상기 수확 또는 수집된 세포는 약학적으로 허용가능한 부형제의 존재하에 제형화되는, 방법.
196. 구현예 194 또는 195에 있어서,
상기 수확 또는 수집된 세포는 동결 보존제의 존재하에서 제형화되는, 방법.
197. 구현예 196에 있어서,
상기 동결 방지제는 DMSO를 포함하는, 방법.
198. 구현예 129 또는 194 내지 197 중의 어느 하나에 있어서,
상기 수확 또는 수집된 세포는 용기, 선택적으로 바이알(vial) 또는 백(bag)에서 제형화되는, 방법.
199. 구현예 105 또는 119 내지 131 중의 어느 하나에 있어서,
상기 분리는 상기 수집 전에 일어나는, 방법.
200. 구현예 105, 119 내지 131 또는 199 중의 어느 하나에 있어서,
상기 분리는 상기 배양 전 또는 도중에 일어나는, 방법.
201. 구현예 105, 119 내지 131, 199 또는 200 중의 어느 하나에 있어서,
상기 분리는 상기 도입 후에 일어나는, 방법.0
202. 구현예 128 내지 201 중의 어느 하나에 있어서,
상기 재조합 수용체는, 질환, 장애 또는 병태의 세포 또는 조직과 관련되고/되거나, 그에 특이적이고/이거나 그에서 발현되는 표적 항원에 결합할 수 있는 것인, 방법.
203. 구현예 202에 있어서,
상기 질환, 장애 또는 병태는 감염성 질환 또는 장애, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 종양 또는 암인, 방법.
204. 구현예 202 또는 203에 있어서,
상기 표적 항원은 종양 항원인, 방법.
205. 구현예 202 내지 204 중의 어느 하나에 있어서, 상기 표적 항원은, αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9, CAIX 또는 G250으로도 공지), 암 고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸 4(chondroitin sulfate proteoglycan 4, CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 타입 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 표피 당단백질 2(EPG-2), 표피 당단백질 40(EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; FC 수용체 상동물 5 또는 FCRH5로도 공지), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 결합 수용체 클래스 5D(GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 2량체, 인간 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나제 삽입 도메인 수용체(kinase insert domain receptor, kdr), 카파 경쇄, L1 세포 부착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 패밀리 8 멤버 A를 함유하는 루신 리치 반복(Leucine Rich Repeat Containing 8 Family Member A, LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종 관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 시토메갈로 바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 2 그룹 D 멤버(NKG2D) 리간드, 멜란 A (MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스트론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나제 유사 고아 수용체 1(ROR1), 서바이빈(survivin), 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지), 종양 관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나제 관련 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75로도 공지), 티로시나제 관련 단백질 2(TRP2, 도파크롬 타우토머라제, 도파크롬 델타 이성화 효소 또는 DCT로도 공지), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체 특이적 또는 병원체 발현 항원 또는 범용 태그 관련 항원 및/또는 비오티닐화 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체(pathogen)로부터 선택되는, 방법.
206. 구현예 202 내지 204 중의 어느 하나에 있어서,
상기 재조합 수용체는 작용성 비-TCR 항원 수용체(functional non-TCR antigen receptor) 또는 TCR 또는 그의 항원-결합 단편이거나 또는 그를 포함하는, 방법.
207. 구현예 202 내지 205 중의 어느 하나에 있어서,
상기 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor; CAR)인, 방법.
208. 구현예 202 내지 205 또는 207 중의 어느 하나에 있어서,
상기 재조합 수용체는 항-BCMA CAR인, 방법.
209. 구현예 202 내지 205 또는 207 중의 어느 하나에 있어서,
상기 재조합 수용체는 항-CD19 CAR인, 방법.
210. 구현예 202 내지 209 중의 어느 하나에 있어서,
상기 재조합 수용체는, 항원-결합 도메인, 스페이서 및/또는 힌지 영역(hinge region)을 포함하는 세포외 도메인(extracellular domain), 막 관통 도메인(transmembrane domain), 및 공자극 신호 전달 영역(costimulatory signaling region)을 포함하는 세포내 신호 전달 도메인(intracellular signaling domain)을 포함하는, 방법.
211. 구현예 210에 있어서,
상기 세포외 도메인은 scFv를 포함하는 항원-결합 도메인을 포함하는, 방법.
212. 구현예 210 또는 211에 있어서,
상기 세포내 신호 전달 도메인은, 1차 신호 전달 도메인, T 세포에서 1차 활성화 신호를 유도할 수 있는 신호 전달 도메인, T 세포수용체(TCR) 성분의 신호 전달 도메인 및/또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif; ITAM)를 포함하는 신호 전달 도메인이거나 또는 그를 포함하는, 방법.
213. 구현예 210 내지 212 중의 어느 하나에 있어서,
상기 세포내 신호 전달 도메인은, CD3 쇄, 선택적으로 CD3-제타(CD3ζ) 쇄 또는 그의 신호 전달 부분의 세포내 신호 전달 도메인이거나 또는 그를 포함하는, 방법.
214. 구현예 210 내지 213 중의 어느 하나에 있어서,
상기 공자극 신호 전달 영역은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS 또는 그의 신호 전달 부분의 세포내 신호 전달 도메인을 포함하는, 방법.
215. 증폭가능한 T 세포의 집단을 식별하는 방법으로서,
상기 방법은 상기 집단에서 CD57+ 세포의 빈도를 측정하는 것을 포함하되, 상기 세포의 집단은 상기 CD57+ 세포의 집단이 임계 빈도 미만인 경우 증폭가능한 것으로 식별되는, 방법.
216. 구현예 215에 있어서,
상기 임계 빈도는 (약) 35%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만인 백분율인, 방법.
217. 구현예 216에 있어서,
증폭가능한 세포의 집단은 증식 또는 증폭을 촉진하는 조건하에 적어도 (약) 4, 5, 6, 7 또는 8일의 배양일 이내에 적어도 (약) 2-배, 4-배, 8-배 또는 16-배 증폭하는, 방법.
218. T 세포의 집단의 증폭 용량을 결정하는 방법으로서,
상기 방법은 T 세포의 집단에서 CD57 발현과 관련된 특성(trait)의 값을 측정하는 것을 포함하되, 상기 T 세포의 집단은, 상기 특성의 값은 상기 특성의 임계값 (약) 미만인 경우 증폭가능한 것으로 결정되는, 방법.
219. 구현에 218에 있어서,
상기 임계값은,
(i) 복수의 참조 T 세포 집단에서, CD57 발현과 관련된 상기 특성의 평균값 또는 중앙값 측정치 미만인 약 또는 약 25% 또는 약 또는 약 25% 이내, 약 또는 약 20% 또는 약 또는 약 20% 이내, 약 또는 약 15% 또는 약 또는 약 15% 이내, 약 또는 약 10% 또는 약 또는 약 10% 이내 또는 약 또는 약 5% 또는 약 또는 약 5% 이내이고/이거나 약 또는 약 상기 평균값 또는 중앙값 측정치보다 낮은 하나의 표준편차 미만이고;
(ii) 복수의 참조 T 세포 집단 중에서의 집단에서, CD57 발현과 관련된 특성의 최저 측정치 미만, 선택적으로 최저 측정치 미만인 약 또는 약 50% 이내, 약 또는 약 25% 이내, 약 또는 약 20% 이내, 약 또는 약 15% 이내, 약 또는 약 10% 이내 또는 약 또는 약 5% 이내이며;
(iii) 복수의 참조 T 세포 집단으로부터의 샘플의 65%, 75%, 80%, 85% 초과로부터 계산된 CD57 발현과 관련된 특성의 평균값 또는 중앙값 측정치 미만이고;
상기 복수의 참조 T 세포 집단은 T 세포의 증식 또는 증폭을 촉진하는 조건하에 배양될 때 증폭하지 않는 복수의 집단이고, 선택적으로 상기 세포는 적어도 (약) 4, 5, 6, 7 or 8일의 배양일 이내에 적어도 약 또는 약 2-배, 3-배, 4-배 또는 5-배 증폭하지 않는 것인, 방법.
220. 구현예 217 내지 219 중의 어느 하나에 있어서,
상기 특성은 총 T 세포, CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포에서 발현된 CD57 단백질의 수준 또는 양인, 방법.
221. 구현예 217 내지 220 중의 어느 하나에 있어서,
상기 특성은 상기 세포 집단 중에 존재하는 CD57+ T 세포, CD57+CD4+ T 세포 또는 CD57+CD8+ T 세포의 빈도, 백분율 또는 양인, 방법.
222. 구현예 217 내지 221 중의 어느 하나에 있어서,
상기 특성은 상기 세포 집단 중의 총 T 세포 중에 존재하는 CD57+ T 세포의 수준 또는 양인, 방법.
223. 구현예 217 내지 221 중의 어느 하나에 있어서,
상기 특성은, 상기 세포 집단 중의, 상기 총 T 세포, CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포 중에 존재하는 CD57 단백질의 수준 또는 양인, 방법.
224. 구현예 217 내지 221 중의 어느 하나에 있어서,
상기 특성은, CD57을 암호화하는 상기 유전자(B3GAT1)의 염색질 접근성(chromatin accessibility)의 수준 또는 양인, 방법.
225. 구현예 215 내지 224 중의 어느 하나에 있어서,
상기 방법은,
T 세포의 집단에서 하나 이상의 제 2 유전자 생성물의 발현과 관련된 제 2 특성의 제 2 값을 측징하는 것을 포함하되,
상기 집단은, 상기 특성의 값이 상기 특성의 임계값이거나 또는 약 그 미만인 경우 및 상기 제 2 특성의 제 2 값이 상기 제 2 특성의 제 2 임계값이거나 또는 약 그 미만인 경우 증폭가능한 것인, 방법.
226. 구현예 225에 있어서,
상기 제 2 유전자 생성물은 나이브-유사 T 세포와 관련된 마커(marker)인, 방법.
227. 구현예 225 또는 226에 있어서,
상기 하나 이상의 제 2 유전자 생성물은 CD27, CD28, CCR7 또는 CD45RA로부터 선택되는, 방법.
228. 구현예 225 내지 227 중의 어느 하나에 있어서,
상기 하나 이상의 제 2 유전자 생성물은 CD27 및 CD28인, 방법.
229. 구현에 225 내지 228 중의 어느 하나에 있어서,
제 2 임계값은,
(i) 상기 복수의 제 2 참조 T 세포 조성물에서, 상기 제 2 유전자의 발현과 관련된 상기 특성의 평균값 또는 중앙값 측정치 초과인 (약) 25% 또는 약 25% 이내, 약 또는 약 20% 이내, 약 또는 약 15% 이내, 약 또는 약 10% 이내 또는 약 또는 약 5% 이내이고/이거나 (약) 상기 평균값 또는 중앙값 측정치보다 높은 하나의 표준편차 초과이고;
(ii) 상기 복수의 참조 T 세포 조성물 중에서의 조성물에서, 상기 제 2 유전자의 발현과 관련된 상기 제 2 특성의 최고 측정치 초과, 선택적으로 상기 최고 측정치 초과인 약 또는 약 50% 이내, 약 또는 약 25% 이내, 약 또는 약 20% 이내, 약 또는 약 15% 이내, 약 또는 약 10% 이내 또는 약 또는 약 5% 이내이며;
(iii) 상기 복수의 참조 T 세포 조성물로부터의 샘플의 65%, 75%, 80%, 85% 초과로부터 계산된 상기 제 2 유전자의 발현과 관련된 특성의 평균값 또는 중앙값 측정치 미만이인, 방법.
230. 구현예 225 내지 229 중의 어느 하나에 있어서,
상기 제 2 특성은,
(i) 상기 총 T 세포, CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포 중에 존재하는 상기 제 2 유전자에 의해서 암호화된 폴리펩티드의 수준 또는 양이거나;
(ii) 상기 총 T 세포, CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 표면 위에 존재하는 상기 제 2 유전자에 의해서 암호화된 폴리펩티드의 수준 또는 양이거나;
(iii) 상기 제 2 유전자의 발현을 위해 양성으로 존재하는 T 세포, CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 빈도, 백분율 또는 양인 특성이거나;
(iv) 상기 T 세로 중에 존재하는 상기 제 2 유전자의 mRNA의 수준 또는 양이거나; 또는
(v) 상기 제 2 유전자의 접근성의 수준 또는 양인, 방법.
231. T 세포를 유전자 조작하는 방법으로서,
상기 방법은,
(a) 자극 조건하에 구현예 215 내지 230 중의 어느 하나의 방법에 의해서 식별되거나 또는 결정된 T 세포의 집단으로부터의 T 세포를 인큐베이션하는 단계, 상기 자극 조건은, TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인 및 하나 이상의 공자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인을 활성화시킴으로써, 자극된 T 세포를 생성할 수 있는 자극 시약의 존재를 포함함; 및
(b) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 상기 자극된 T 세포로 도입하는 단계, 상기 도입은 상기 자극된 T 세포를 상기 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입함으로써, T 세포의 조작된 집단을 생성하는 것을 포함함;
을 포함하는, 방법.
232.
구현예 1 내지 34 중의 어느 하나의 방법에 의해서 생산된 고갈된 집단의 CD57- T 세포를 포함하는, 세포의 조성물.
233.
구현예 1 내지 59 중의 어느 하나의 방법에 의해서 생산된 고갈된 집단의 CD57- T 세포를 포함하는, 세포의 조성물.
234. 구현예 233에 있어서,
상기 세포는 CD57-CD4+ T 세포를 포함하는, 조성물.
235. 구현예 233에 있어서,
상기 세포는 CD57-CD8+ T 세포를 포함하는, 조성물.
236. 구현예 233에 있어서,
상기 세포는 CD57-CD3+ T 세포를 포함하는, 조성물.
237. 구현예 12, 13 또는 15 내지 34 중의 어느 하나의 방법에 의해서 생산된 CD57-CD4+ T 세포의 집단의 CD57-CD4+ T 세포를 포함하는, 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 조성물.
238. 구현예 13 내지 34 중의 어느 하나의 방법에 의해서 생산된 CD57-CD8+ T 세포의 집단의 CD57-CD8+ T 세포를 포함하는, 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 조성물.
239. 구현예 20 내지 33 중의 어느 하나의 방법에 의해서 생산된 CD57-CD3+ T 세포의 집단의 CD57-CD3+ T 세포를 포함하는, 농축된 CD57-CD3+ T 세포의 조성물.
240. 구현예 35 내지 127 중의 어느 하나의 방법에 의해서 생산된 자극된 T 세포의 집단을 포함하는, 세포의 조성물.
241. 구현예 128 내지 152 중의 어느 하나의 방법에 의해서 생산된 T 세포의 조작된 집단의 세포를 포함하는, 조성물.
242. 구현예 153 내지 157, 160, 161 ,163 내지 198 및 202 내지 214 중의 어느 하나의 방법에 의해서 생산된 T 세포의 증폭된 집단의 세포를 포함하는, 조성물.
243. 구현예 215 내지 230 중의 어느 하나의 방법에 의해서 증폭가능한 것으로 식별되거나 결정된 T 세포의 집단을 포함하는, 조성물.
244. 질환, 장애 또는 병태를 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법으로서,
상기 방법은 상기 대상체에 구현예 130 내지 151 중의 어느 하나의 방법에 의해서 생산된 조작된 T 세포의 집단 또는 구현예 154 내지 157, 160, 161 ,163 내지 198 및 202 내지 214 중의 어느 하나의 방법에 의해서 생산된 T 세포의 증폭된 집단으로부터의 T 세포의 용량을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
245. 질환, 장애 또는 병태를 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법으로서,
상기 방법은 상기 대상체에 구현예 128 내지 214 중의 어느 하나의 방법에 의해서 생산된 조작된 T 세포의 집단으로부터의 T 세포의 용량을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
246. 대상체에서 질환, 장애 또는 병태의 치료를 위한, 구현예 128 내지 152 중의 어느 하나의 방법에 의해서 생산된 조작된 T 세포의 집단 또는 구현예 153 내지 157, 160, 161 ,163 내지 198 및 202 내지 214 중의 어느 하나의 방법에 의해서 생산된 T 세포의 증폭된 집단의 용도.
247. 대상체의 질환, 장애 또는 병태의 치료용 약제의 제조를 위한, 구현예 128 내지 152 중의 어느 하나의 방법에 의해서 생산된 조작된 T 세포의 집단 또는 구현예 153 내지 157, 160, 161 ,163 내지 198 및 202 내지 214 중의 어느 하나의 방법에 의해서 생산된 T 세포의 증폭된 집단의 용도.
248. 대상체에서 질환, 장애 또는 병태의 치료를 위한, 구현예 135 내지 174 중의 어느 하나의 방법에 의해서 생산된 조작된 T 세포의 집단 또는 구현예 232 내지 244 중의 어느 하나의 조성물의 용도.
249. 대상체의 질환, 장애 또는 병태의 치료용 약제의 제조를 위한, 구현예 135 내지 174 중의 어느 하나의 방법에 의해서 생산된 조작된 T 세포의 집단의 용도.
250. 대상체에서 질환, 장애 또는 병태를 치료하는데 사용하기 위한 구현예 232 내지 254 중의 어느 하나의 조성물.
251. 구현예 248 내지 250 중의 어느 하나에 있어서,
상기 재조합 수용체, 선택적으로 상기 CAR은, 상기 질환 또는 병태의 세포와 관련되거나, 또는 그 위에 발현되거나 또는 존재하는 항원을 특이적으로 인식하거나 또는 거기에 특이적으로 결합하는 것인, 용도 또는 조성물.
252. 구현예 248 내지 251 중의 어느 하나에 있어서,
상기 질환 또는 병태는 암인, 용도 또는 조성물.
253. 구현예 248 내지 252 중의 어느 하나에 있어서,
상기 대상체에 자가인인,, 용도 또는 조성물.
254. 구현예 248 내지 253 중의 어느 하나에 있어서,
상기 대상체에 동종이계인,, 용도 또는 조성물.
255. 제조 물품으로서,
(i) CD57, CD3, CD4 및/또는 CD8에 특이적인 세포의 면역 친화도-기반 선택을 위한 하나 이상의 시약; 및
(ii) 구현예 1 내지 245 중의 어느 하나의 방법을 수행하기 위한 하나 이상의 시약의 사용을 위한 지침;
을 포함하는, 제조 물품.
256. 제조 물품으로서,
(i) CD57, CD4 및/또는 CD8에 특이적인 세포의 면역 친화도-기반 선택을 위한 하나 이상의 시약;
(ii) TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인 및 하나 이상의 공자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인을 활성화할 수 있는 하나 이상의 자극 시약; 및
(iii) 구현예 1 내지 245 중의 어느 하나의 방법을 수행하기 위한 상기 하나 이상의 시약의 사용을 위한 지침;
을 포함하는, 제조 물품.
257. 제조 물품으로서,
(i) CD57, 및 하나 이상의 CD3, CD4 및/또는 CD8에 특이적인 세포의 면역친화도-기반 선택을 위한 하나 이상의 시약;
(ii) TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인 및 하나 이상의 공자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 자극 시약; 및
(iii) 구현예 1 내지 245 중의 어느 하나의 방법을 수행하기 위한 상기 하나 이상의 시약의 사용을 위한 지침;
을 포함하는, 제조 물품.
258. 구현예 255 내지 257 중의 어느 하나에 있어서,
면역친화도-기반 선택을 위한 상기 시약은 CD57, CD4 또는 CD8에 특이적으로 결합할 수 있는 항체이거나 또는 그를 포함하는, 제조 물품.
259. 구현예 255 내지 257 중의 어느 하나에 있어서,
면역친화도-기반 선택을 위한 상기 시약은 CD57, CD3, CD4 또는 CD8에 특이적으로 결합할 수 있는 항체이거나 또는 그를 포함하는, 제조 물품.
260. 구현예 255 내지 259 중의 어느 하나에 있어서,
면역친화도-기반 선택을 위한 상기 시약은 CD57에 특이적으로 결합할 수 있는 항체이거나 또는 그를 포함하는, 제조 물품.
261. 구현예 260에 있어서,
상기 항체는 자성 입자(magnetic particle) 위에 고정되는, 제조 물품.
262. 구현예 260에 있어서,
상기 항체는 친화도 크로마토그래피 매트릭스 위에 고정되거나 또는 그에 부착되는, 제조 물품.
263. 구현예 256 내지 262 중의 어느 하나에 있어서,
상기 자극 시약은, (i) TCR 복합체의 멤버에 특이적으로 결합하고, 선택적으로 CD3에 특이적으로 결합하는 1차 제제 및 (ii) T 세포 공자극 분자에 특이적으로 결합하는 2차 제제를 포함하며, 선택적으로 상기 공자극 분자는 CD28, CD137(4-1-BB), OX40 또는 ICOS로부터 선택되는, 제조 물품.
264. 구현예 263에 있어서,
상기 1차 제제 및 2차 제제 중의 하나 또는 둘 다는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는, 제조 물품.
265. 구현예 263 또는 264에 있어서,
상기 1차 제제 및 2차 제제는 항체를 포함하고, 선택적으로 상기 자극 시약은 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 사용한 인큐베이션을 포함하는, 제조 물품.
266. 구현예 263 내지 265 중의 어느 하나에 있어서,
상기 1차 제제 및 2차 제제는 고체 지지체(solid support)의 표면 위에 존재하거나 또는 그 위에 부착되는, 제조 물품.
267. 구현예 266에 있어서,
상기 고체 지지체는 비드, 선택적으로는 상자성 비드(paramagnetic bead)인, 제조 물품.
268. 구현예 263 내지 267 중의 어느 하나에 있어서,
상기 1차 제제 및 2차 제제는, 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 포함하는 올리고머 입자 시약의 표면 위에 가역적으로 결합하는, 제조 물품.
269. 제조 물품으로서,
(i) 구현예 241 또는 242의 조성물; 및
(ii) 대상체에 상기 조성물을 투여하기 위한 지침;
을 포함하는 제조 물품.
270. 재조합 수용체를 발현하는 CD4+ T 세포 및 재조합 수용체를 발현하는 CD8+ T 세포를 포함하는 치료학적 T 세포 조성물로서, 상기 조성물 중의 총 수용체+/CD8+ 세포의 적어도 80%는 CD57-이고 상기 조성물 중의 총 수용체+/CD4+ 세포의 적어도 80%는 CD57-인, 치료학적 T 세포 조성물.
271. 구현예 270에 있어서,
상기 조성물 중의 상기 세포의 적어도 또는 적어도 약 80%, 적어도 또는 적어도 약 85%, 적어도 또는 적어도 약 90%, 적어도 또는 적어도 약 95%, 적어도 또는 적어도 약 96%, 적어도 또는 적어도 약 97%, 적어도 또는 적어도 약 98%, 적어도 또는 적어도 약 99%, 약 100%, 또는 100%는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포인, 치료학적 T 세포 조성물.
272. 재조합 수용체를 발현하는 CD3+ T 세포를 포함하는 치료학적 T 세포 조성물로서, 상기 조성물 중의 총 수용체+/CD3+ 세포의 적어도 80%는 CD57-인, 치료학적 T 세포 조성물.
273. 구현예 272에 있어서,
상기 조성물 중의 상기 세포의 적어도 또는 적어도 약 80%, 적어도 또는 적어도 약 85%, 적어도 또는 적어도 약 90%, 적어도 또는 적어도 약 95%, 적어도 또는 적어도 약 96%, 적어도 또는 적어도 약 97%, 적어도 또는 적어도 약 98%, 적어도 또는 적어도 약 99%, 약 100%, 또는 100%는 CD3+ T 세포인, 치료학적 T 세포 조성물.
274. 구현예 270 내지 273 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물 중의 상기 수용체+/CD4+ 세포 대 수용체+/CD8+ 세포의 비율은 약 1:3 내지 약 3:1인, 치료학적 T 세포 조성물.
275. 구현예 270 내지 274 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물 중의 상기 수용체+/CD4+ 세포 대 수용체+/CD8+ 세포의 비율은 (약) 1:1인, 치료학적 T 세포 조성물.
276. 구현예 270 내지 275 중의 어느 하나에 있어서,
상기 재조합 단백질은, 질환, 장애 또는 병태의 세포 또는 조직과 관련되고/되거나, 그에 특이적이고/이거나 그에서 발현되는 표적 항원에 결합할 수 있는 재조합 수용체이거나 또는 그를 포함하는, 치료학적 T 세포 조성물.
277. 구현예 270 내지 276 중의 어느 하나에 있어서,
상기 재조합 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR)인, 치료학적 조성물.
278. 구현예 270 내지 277 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물 중의 생존가능한 T 세포의 수는 (약) 10×106 세포 내지 (약) 200×106 세포이고, 선택적으로 상기 조성물 중의 생존가능한 T 세포의 수는 (약) 10×106 세포 내지 (약) 100×106 세포, (약) 10×106 세포 내지 (약) 70×106 세포, (약) 10×106 세포 내지 (약) 50×106 세포, (약) 50×106 세포 내지 (약) 200×106 세포, (약) 50×106 세포 내지 (약) 100×106 세포, (약) 50×106 세포 내지 (약) 70×106 세포, (약) 70×106 세포 내지 (약) 200×106 세포, (약) 70×106 세포 내지 (약) 100×106 세포, 또는 (약) 100×106 세포 내지 (약) 200×106 세포(각각의 수치를 포함함)인, 치료학적 조성물.
279. 구현예 270 내지 278 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물의 부피는 1.0 mL 내지 10 mL(수치를 포함함), 선택적으로 (약) 2 mL, (약) 3 mL, (약) 4 mL, (약) 5 mL, (약) 6 mL, (약) 7 mL, (약) 8 mL, (약) 9 mL, 또는 (약) 10 mL, 또는 이들 수치들 중의 임의의 것들 사이의 임의의 값인, 치료학적 조성물.
XI. 실시예
하기 실시예는 설명할 목적으로만 포함된 것으로 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되어서는 아니된다.
실시예 1: T 세포를 조작하는 공정 동안 T 세포 증폭, 세포 생존력 및 세포 주기 항목의 평가
CD8+ T 세포는 7명의 예시적인 공여자(공여자 A-G)로부터 얻어졌으며, 자극, CAR 컨스트럭트(construct)을 암호화하는 렌티바이러스 벡터를 사용한 형질도입 및 증폭을 위한 배양에 의해서 키메라 항원 수용체(CAR)을 조작되었거나, 또는 자극 및 배양을 위한 유사한 공정에 적용되었다. 세포 증폭, 세포 생존력, 및 자극되고 배양된 세포에서 세포 주기 항목이 평가되었다.
상기 조작된 세포 조성물을 생성하기 위해서, 인간 공여자 백혈구 성분채집술 샘플로부터 면역 친화도-기반 농축에 의해서 CD8+ 세포를 단리시키고 동결 보존하였다. 이어서 상기 동결 보존된 조성물을 해동시키고 항-CD3/항-CD28 항체 콘쥬게이트된 상자성 비드 및 재조합 사이토카인(예를 들어 IL-2, IL-7 및 IL-15)의 존재하에 자극 조건하에서 세포를 대략 24시간 동안 인큐베이션함으로써 자극하였다. 이어서 4명의 공여자(공여자 D-G)로부터의 세포에 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산을 함유하는 바이러스 제제를 사용하여 형질도입하였다. 형질도입 후, 37℃에서 인큐베이터에서 재조합 사이토카인(예를 들어 IL-2, IL-7 및 IL-15)의 존재하에 세포를 배양하였고 매일 배지를 보충하였다. 3명의 공여자(공여자 A-C)로부터 세포는 형질도입하지 않았으며 자극 후 재조합 사이토카인의 존재하에 배양되었다.
상기 자극을 시작한 후 최대 대략 240시간 동안 총 세포수에 대해 세포를 모니터하고, 시간에 따른 폴드 증폭(fold expansion)을 결정하였다. 생존력을 평가하고 세포를 세포 분열을 나타내는 마커(Ki-67)에 대해 염색하고 자극 시작 후 72 시간에 유세포 분석으로 분석하였다.
도 1a 내지 도 1d에 나타낸 바와 같이, T 세포 증폭에서의 생존력(도 1a 및 1b), 세포 생존력(도 1c) 및 세포 주기 항목(도 1d)이 상이한 공여자로부터의 CD8+ 세포 중에서 관측되었다.
실시예 2: 세포 제조 동안 공여자-유래된 세포의 자극에 따른 CD57+ 및 CD57- 집단의 특성화
CD57+ 및 CD57- 세포의 표현형은 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 세포를 조작하기 위한 예시적인 세포 제조 공정 동안 특성화되었다.
3명의 예시적인 공여자(공여자 A-C)로부터의 CD8+ 및 CD4+ T 세포를 실시예 1에 기술된 것과 유사하지만 세포의 형질도입없이 예시적인 공정을 거쳤다. 세포 샘플은 자극 시작 직전 및 자극 동안 다양한 시점에서 자극 시작 후 최대 약 216 시간 동안 수집되었다. 세포는, 유세포 분석에 의한 분석을 위해, 활성화(CD25 및 CD69), 증식 능력(CD57), 세포 분열((Ki-67)과 관련된 마커를 포함한 다양한 마커, 및 T 세포 분화 표현형(예를 들어 나이브-유사 T 세포, 효과기 T(TEFF) 세포, 기억 T 세포, 중앙 기억 T(TCM) 세포, 효과기 기억 RA T(TEMRA) 세포)와 관련된 다양한 표면 마커로 염색되었다. CD57 발현, Ki-67 발현 및 T 세포 분화 표현형 간의 연관성을 평가하기 위해 계층적 클러스터링 분석(hierarchical clustering analysis)을 수행하였다.
도 2a 내지 2c에서 나타낸 바와 같이, CD57+ T 세포는 자극 시작시에 상기 집단 중에 존재하였으며, CD57+ T 세포의 백분율은 자극 및 배양 동안 상기 집단 중에서 감소되었다[도 2a 및 2b 참조]. CD57+ T 세포의 빈도는 자극 시작 후 대략 48시간 감소하였으며, 이것은 일반적으로 T 세포 증폭 및 생존력 증가와 일치하였다. 자극 후, Ki-67의 발현에 기반하여 CD8+ T 세포의 서브세트만이 세포 주기에 진입하였다. Ki-67의 발현은 자극 후 CD57+ 세포에서 실질적으로 증가하지 않았다. 대조적으로, Ki-67+ 세포의 백분율은 CD57- 세포 사이에서 실질적으로 증가하였다(도 2a 및 2c 참조). CD8+ 세포 구획(CD8+ cell compartment)과 대조적으로, CD4+ 세포 중 CD57+ 세포는 자극 시작시 낮은 수준으로 존재하였으며, CD57+ 세포의 비율은 자극 및 배양 공정의 종료시에 증가하였다(도 2d). 이 결과는 CD8+ 세포 구획이 CD4+ 세포 구획보다 더 균질할 수 있다는 관찰과 일치한다.
특히, 공여자-유래 조성물은 수확을 위한 예시적인 임계 세포수(수확 기준)에 도달하는 데 필요한 시간에서 가변성을 나타냈으며, 이는 다양한 면역 표현형 마커의 발현에서 생존력에 상응하였다. 하나의 공여자 유래 조성물은 수확 기준에 도달하는데 7일의 배양 시간만 필요하였다. 대조적으로, 또 다른 공여자-유래 조성물은 수확 기준에 도달하기 위해 8일의 배양 시간이 필요하였다. 2명의 공여자 조성물 사이의 CD57, Ki-67, CD45RA 및 CD27 발현(유세포 분석에 의해 결정됨)의 분석은 도 2e 및 도 2f에 도시된다. 발현은 자극 직전 시간을 나타내는 시점 t = 0에서 시작하여 분석되었다. 도 2e에 도시된 바와 같이, 모든 평가 시점에서, 실질적으로 보다 높은 CD57 발현은, 수확 기준(수확까지 7일)에 도달하는데 7일이 필요한 공여자 세포 조성물과 비교하여, 수확 기준(수확까지 8일)에 도달하는데 8일이 필요한 공여자 세포 조성물에서 관찰되었다. 도 2f에 나타낸 바와 같이, 모든 평가 시점에서, 7일이 필요한 조성물의 세포는 8일이 필요한 조성물의 세포에 비해 CD27+ CD45RA+의 더 높은 빈도를 나타냈다. 8일이 필요한 조성물로부터의 세포는 평가된 모든 시점에서 실질적으로 더 낮은 빈도의 CD27+ 세포를 나타냈다. 이러한 관찰은 출발 물질에서 더 높은 빈도의 CD27+ 세포를 나타내는 세포 조성물이 배양 공정 말기에 더 나은 증폭 및 더 높은 빈도의 그러한 세포를 나타낸다는 발견과 일치한다.
도 3a에 나타낸 바와 같이, CD57+ T 세포는 자극 후 활성화를 나타내는 마커(CD69 및 CD25)를 발현하는 것으로 관찰되었다. CD57+ 세포는 활성화와 관련된 표현형을 나타냈으며 초기 공정 단계 내내 지속되었다. 계층적 클러스터링 분석은 CD57+ 및 Ki67- T 세포가 CD57- 및 Ki67+ 세포 (도 3c)와 비교하여 더 분화된 효과기 세포 집단과 관련된 표현형 특징을 나타내는 것을 보여 주었다(도 3b). Ki-67+ 집단은 주로 CD27+CD28+인 세포를 포함하고, Ki67- 집단은 CD57+ 세포에 대해 농축되고 CD27-CD28- 표현형과 일치하였다.
상기 결과는 CD57+ T 세포가 자극을 받을 수 있는 반면, 보다 말기에 분화된 세포와 관련된 표현형 및 감소된 증식 능력을 나타내는 관찰과 일치하였다. 일부 측면에서, CD27+ T 세포는 CAR T 세포 제조 공정 동안 대부분의 증폭된 세포에 기여하는 것으로 관찰되었다. 대조적으로, CD57+ T 세포는 증폭되지 않았으며 최종적으로 제조된 CAR T 세포 조성물의 세포에 최소한으로 기여하였다. 일부 측면에서, 감소된 증식 능력을 나타낼 수 있는 세포 집단에서 CD57+ 세포의 존재는 T 세포 제조 공정을 거치는 세포 집단의 변이 및 이질성에 기여할 수 있다.
실시예 3: 입력 조성물 중의 CD57+ 세포의 빈도 및 세포 증폭, 생존력, 자극 시약 및 사이토카인에 관한 효과
공여자-매칭된 CD57+ 및 CD57- 세포를 함유하는 입력 조성물을 특정 비율로 혼합하고 상기 세포의 생존력을 분석하였다.
면역 친화도-기반 농축에 의해서 CD57+ 세포의 양성 선택에 의해 공여자 대상체로부터 얻어진 CD8+ T 세포의 조성물로부터 CD57+CD8+ T 세포 및 CD57-CD8+ T 세포를 단리시켰다. 단리된 집단의 순도는 유세포 분석에 의해 결정되었다. 다양한 빈도의 CD57+ T 세포가 제조 공정에 미치는 영향을 평가하기 위해, 자극 전에 단리된 CD57+ 및 CD57- 집단을 혼합하여 (1) 100% CD57+ 세포; (2) 75% CD57+ 세포; (3) 25% CD57+ 세포; 및 (4) 0% CD57+ 세포의 빈도의 CD57+ 세포를 함유하는 입력 조성물을 생성하였다. 상이한 적정된 입력 조성물(titrated input composition)을, 항-CD3/항-CD28 콘쥬게이트된 비드 및 재조합 사이토카인을 사용한 인큐베이션에 의한 자극, 및 CAR을 암호화하는 핵산을 함유하는 바이러스 제제를 사용한 형질도입을 포함하는, 실시예 1에 기재된 바와 유사한 CAR-발현 세포에 대한 예시적인 제조 공정에 적용하였다. 자극 시작 후 최대 약 288 시간 동안 시간에 따른 총 세포수 및 생존력에 대해 세포를 모니터링하였다. 자극 시작 후 48 시간에 세포 배양 플레이트의 웰 이미지를 얻었고, 자극 시약의 존재하에 세포 클러스터링에 대해 평가하였다. 자극 시작 24 시간 및 48 시간 후에 배양 배지 내 IL-2의 농도를 평가하였다.
도 4a에 나타낸 바와 같이, 더 높은 빈도의 CD57+ 세포를 함유하는 입력 조성물은 더 느린 세포 증폭을 나타내었고, 수확을 위한 예시적인 임계 세포수(수확 기준)에 도달하기 위해 더 긴 배양 시간을 필요로 하며, 더 낮은 빈도의 CD57+ 세포를 함유하는 입력 조성물에 비해 더 낮은 세포 생존율을 나타냈다. 100% CD57+ 세포를 함유하는 조성물에서 매우 낮거나 증폭이 전혀 관찰되지 않았다. 일반적으로 입력 조성물에서 CD57+ 세포의 빈도는 수확 기준을 달성하는데 필요한 배양 기간과 관련이 있는 것으로 관찰되었다. 도 4b에 나타낸 바와 같이, 더 높은 빈도의 CD57+ 세포를 함유하는 입력 조성물은 또한 48 시간에 자극 시약(항-CD3/항-CD28 항체 콘쥬게이트된 상자성 비드)의 존재하에 세포 클러스터를 형성하여, 세포가 자극에 반응함을 입증하였다. 자극 시작 24 시간 및 48 시간 후, 더 낮은 빈도의 CD57+ 세포를 함유하는 입력 조성물의 배양에 비해 더 높은 빈도의 CD57+ 세포를 함유하는 입력 조성물의 배양에서 배양 배지 내 IL-2의 농도가 더 낮다는 것이 관찰되었다(도 4c).
결과는 입력 조성물에서 CD57+ 세포의 빈도가 전체 세포 증폭 및 세포 생존력에 영향을 미칠 수 있다는 관찰과 일치하였다. CD57+ 세포의 빈도가 더 높은 입력 조성물은 수확 기준에 도달하기 위해 더 긴 배양 시간이 필요하였다. 일부 측면에서, 자극 및 점유 또는 자극 시약을 사용할 수 있는 CD57+ 세포는 배양 조건 중에 존재하는 IL-2를 소비하고 배양 세포 카운트 수에 기여하는 것으로 관찰되었다. 이것은 CD57+ 세포의 존재가 제조 공정에서 집단의 다른 세포에 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다.
실시예 4: 입력 조성물 중의 CD57+ 세포의 고갈 및 배양 기간에 관한 효과
CD57+ 세포가 고갈된 입력 조성물을 예시적인 제조 공정에 적용하고, 수확 기준에 도달하기 전에 세포 표현형 및 배양 기간을 평가하였다.
CD8+ 세포는 4명의 다른 대상체로부터 얻어졌고 각각 두 개의 아암(arm)으로 분리되었다. 하나의 아암에서, CD57+ 세포는 입력 조성물을 생성하기 위해 세포 조성물(고갈됨)에서 고갈되었고, 순도는 유세포 분석에 의해 평가되었다. 다른 쪽에서는 CD57+ 세포(고갈되지 않음)가 고갈되지 않고 CD8+ 세포가 입력 조성물로 사용되었다. 상기 고갈된 및 고갈되지 않은 입력 조성물을, 항-CD3/항-CD28 콘쥬게이트된 비드 및 재조합 사이토카인을 사용한 인큐베이션에 의한 자극, CAR을 암호화하는 핵산을 함유하는 바이러스 제제를 사용한 형질도입, 및 증폭을 위한 조건하의 배양을 포함하는, 실시예 1에 기재된 바와 유사한 바이러스 형질도입에 의한 CAR-발현 세포에 대한 예시적인 제조 공정에 적용하였다. 자극 시작 직전에 세포 조성물의 샘플을 Ki67, CD3, CD57, CD27 및 CD28에 대해 염색하였다. 고갈되고 고갈되지 않은 배양이 예시적인 수확 기준에 도달하는 기간을 평가하였다. 수확 기준은 세포의 약 10배 확장을 나타내었다.
도 5a에 나타낸 바와 같이, 고갈되지 않은 입력 조성물은 다양한 빈도의 CD57 세포를 나타냈다. 도 5b에 나타낸 바와 같이, CD27+ CD28+ 세포의 빈도는 고갈되지 않은 입력 조성물에 비해 고갈된 입력 조성물 중에서 보다 높고 많은 일관성이 있다. 4명개의 공여자의 고갈되지 않은 그리고 고갈된 입력 조성물로부터의 CD27 발현에 대한 플로우 플롯이 도 5c에 도시되어 있다. 도 5c의 상단 패널은 4 명의 공여자로부터의 고갈되지 않은 샘플로부터 CD8+ T 세포가 다양한 정도의 CD27 발현을 나타내는 것을 보여준다. 대조적으로, 도 5c의 하단 패널에서 나타낸 바와 같이, 유사하게 일관된 CD27 발현에 의해 입증된 바와 같이, 입력 조성물로부터 CD8+CD57+ 세포의 고갈은 공여자 전반에 걸쳐 출발 물질 일관성을 개선시켰다. 아울러, 이러한 결과는 CD57+ 세포를 고갈시켜 개선할 수 있는 시작 공여자 백혈구 성분 채집술 샘플에서 공여자자 세포 중에서 나이브-유사 또는 중앙 기억 세포의 가변성(variability)을 입증한다.
T 세포 증식 및 성장의 마커인 Ki67의 발현은 자극 시작 72 시간 후 공여자 입력 조성물에서 총 CD3+ T 세포 중에서 평가되었다. 도 5d에서 나타낸 바와 같이, Ki67 발현은 고갈되지 않은 조성물에 비해 고갈된 입력 조성물에서 더 높았다.
도 5e에서 나타낸 바와 같이, 수확까지의 배양 기간(자극 시작부터 수확 기준에 도달한 시간까지)은 일반적으로 고갈된 입력 조성물과 비교하여 고갈된 입력 조성물 중에서 더 짧고 일관성이 있었다. 자극 후 다양한 날에 총 T 세포에 의해 평가된 하나의 예시적인 공여자로부터의 세포 증폭이 도 5f에 도시되어 있다. 결과는 고갈된 입력 조성물로부터 증폭된 총 세포수가 자극 후 여러 시점에서 고갈되지 않은 입력 조성물로부터 증폭된 총 세포수보다 더 높은 것으로 관찰되었음을 보여준다(도 5f). 이러한 발견은 고갈된 집단이 더 많은 수의 분열 및 총 세포로 인해 수확 기준에 더 짧은 기간을 나타낼 수 있다는 관찰과 일치한다.
예시적인 키메라 항원 수용체(CAR)를 사용하여 고갈된 그리고 고갈되지 않은 세포의 형질도입 후, CAR을 발현하는 세포의 백분율을 평가하였다. 도 5g에 나타낸 바와 같이, 고갈된 공여자 조성물 중 CAR을 발현하는 세포의 백분율은 고갈되지 않은 공여자 조성물 중 항-CD19 CAR을 발현하는 세포의 백분율보다 더 일관성이 있었다. 이 결과는 CD57+ 세포의 고갈이 T 세포에 의한 CAR 발현의 일관성을 향상시킬 수 있다는 관찰과 일치한다.
아울러, 결과는 CD57+ 세포의 선택된 고갈이 증폭을 개선하고 수확 기준에 도달하는데 필요한 배양 기간을 감소시켰다는 관찰과 일치하였다. 또한, 이러한 발견은 CD57+ 세포의 고갈이 다양한 입력 조성물 중 출발 물질(예를 들어 CD27+ 세포)에서 세포 표현형의 가변성을 감소시킬 수 있음을 나타낸다. 일부 측면에서, 다양한 입력 조성물 중 CD57+ T 세포의 존재 및 빈도에서의 가변성은 CAR T 세포 제조 공정에 영향을 미칠 수 있으며, 배양 기간 및 세포 조성 속성의 가변성을 초래할 수 있다. 일부 측면에서, 투입 조성물에서 CD57+ T 세포의 고갈은 제조된 CAR T 세포 조성물의 공정 제어 및 일관성을 개선시킬 수 있다.
실시예 5: 비호지킨 림프종(NHL) 환자의 말초 혈액에서 57+CD8+ T 세포 빈도
비호지킨 림프종(NHL) 환자의 말초 혈액 세포를 CD57+ 발현 및 T 세포 분화 표현형과 관련된 다양한 표면 마커에 대해 평가하였다. 임상 연구에서 NHL 환자의 백혈구 성분 채집술 샘플에서 CD4+ 및 CD8+ 세포의 개별 조성물을 면역 친화도-기반 농축에 의해 분리하고 동결 보존하였다. 각각의 분리된 세포 조성물로부터의 세포를 후속적으로 해동하고 항-CD3/항-CD28 항체-콘쥬게이트된 상자성 비드 및 재조합 사이토카인(예를 들어 IL-2, IL-7 및 IL-15)의 존재하에 자극 조건하에서 48시간 동안 세포를 개별적으로 인큐베이션함으로써 자극하였다. 자극 시작 48 시간 후, 세포 조성물의 샘플은 유세포 분석에 의한 분석을 위해, 리니지(lineage)(CD4 및 CD8), 증식 능력(CD57), 세포 분열(Ki-67) 및 T 세포 분화 표현형(나이브-유사 T 세포, 효과기 T(TEFF) 세포, 기억 T 세포, 중앙 기억 T(TEMRA) 세포)과 관련된 마커를 포함하는 다양한 마커로 염색되었다. CD57+ 발현 및 T 세포 분화 표현형과 관련된 다양한 마커 사이의 연관성을 평가하기 위해 계층적 클러스터링을 수행하였다.
도 6a에 나타낸 바와 같이, 입력 조성물 중의 CD57+ 세포의 빈도는 다른 NHL 환자의 CD8+ 세포 중에서 변화하였다. 도 6b에 나타낸 바와 같이, CD57 + CD8 + 세포의 백분율 및 Ki67+ 세포의 백분율 사이의 일반적인 역관계는 자극 시작 후 48 시간에 관찰되었다. 도 6c에 나타낸 바와 같이, 계층적 클러스터링은 기억 및 효과기 T 세포 분화 표현형으로 구별되는 클러스터를 보여 주며, 이러한 표현형 클러스터는 CD57+ T 세포의 높거나 낮은 빈도로 샘플을 더 클러스터링하였다.
공여자 입력 조성물로부터의 CD57+ 세포의 분석은 Ki67 발현이 상이한 T 세포 분화 면역 표현형을 갖는 세포 중에서 변한다는 것을 밝혀졌다. 도 6d에 도시 된 바와 같이, Ki67을 발현하는 생존 CD57+ 세포의 백분율은 CD27-CD45RA+ 세포에서 가장 낮았고, CD27-CD45RA- 세포, CD27+CD45RA+ 및 CD27+CD45RA- 세포에서 더 높았다.
별도의 CD4+ 및 CD8+ 공여자 세포 조성물을 Ki67, CD27, CD45RA 및 CD57의 발현에 대해 분석하였다. 도 6e에 나타낸 바와 같이, 많은 백분율의 CD8+CD57+ 세포가 CD27-CD45RA+였으며, 이는 이들 T 세포가 말단 분화 효과기 기억 RA(TEMRA) T 세포임을 나타낸다. 이러한 발견은 CD57+ T 세포가 다양한 면역 표현형의 분화된 효과기 T 세포임을 입증한다.
결과는 NHL 대상체의 말초 순환에서 CD57+ T 세포의 가변 주파수 관찰과 일치하였다. 공여자 세포로부터 생성된 세포 조성물을 사용한 발견과 유사하게 (이전 실시예에서 기술된 바와 같이), 높은 CD57 발현은 감소된 증식 능력을 갖는 보다 분화된 세포를 나타내는 표현형과 연관되는 것으로 관찰되었다.
실시예 6: 이배 수(Number of Doublings) 및 세포 분화 내지 환자 반응의 관계
CD19에 특이적인 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 자가 T 세포를 함유하는 예시적인 치료용 T 세포 조성물이 생성되었다. 상기 항-CD19 CAR은 뮤린 항체(FMC63으로부터 유래된 가변 영역)로부터 유래된 항-CD19 scFv, 면역글로불린 유래 스페이서, CD28로부터 유래된 막 관통 도메인, 4-1BB로부터 유래된 공자극 영역 및 CD3-제타 세포 내 신호 전달 도메인을 함유했다.
재발 및 불응성 비호지킨 림프종(NHL)이 있는 대상체에 투여하기 위한 세포 조성물의 생성을 위해, 자가 세포가 백혈구 성분 채집술을 통해 대상체에서 단리되었다. 백혈구 성분 채집술 샘플은 CAR 발현 세포의 생성을 위한 공정를 거쳤다. 공정는 자동 세척 및 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 정제를 위한 면역 친화도 기반 선택을 이용한 세포의 세척을 포함했고, CD8+(세포의 중앙값의 99%, 사분위 간 범위(IQR) 98-100%가 CD8+임) 및 CD4+(중앙값의 99%, IQR 99-100% 세포가 CD4+임) 세포로 각각 농축된 2개의 조성물을 초래했다.
농축된 CD4+ 및 CD8+ 조성물의 세포는 항-CD3/항-CD28 상자기 비드로 별도로 활성화되었고, 이어서 4-1BB 공자극 도메인을 갖는 항-CD19 CAR을 암호화하는 벡터로 렌티바이러스 형질도입에 별개로 노출되었다. 상기 CAR은 뮤린 항체에서 유래된 항-CD19 scFv, 면역 글로불린 스페이서, CD28에서 유래된 막 관통 도메인, 4-1BB에서 유래된 공자극 영역 및 CD3-제타 세포내 신호 전달 도메인을 함유하였다. 이어서 형질도입된 집단을 세포 증폭을 위해 재조합 IL-2 및 IL-15 사이토 카인(및 추가적으로 CD4+ T 세포 조성물을 위한 재조합 IL-7)의 존재하에 개별적으로 인큐베이션하였다. 증폭을 위한 조건하에서의 배양은 약 4 배 증폭의 역치에 도달할 때까지 락킹 모션 바이오리엑터(rocking motion bioreactor)에서 수행되었다. 증폭된 CD8+ 및 CD4+ 세포는 제형화되었고, 투여 전에 별도로 동결 보존 및 보관되었다. 세포의 건강을 나타내는 파라미터에서 상이한 환자 특성을 갖는 것과 같은 상이한 환자 유래 로트 및/또는 세포 조성물 사이의 변이를 최소화하기 위해, 세포를 로트에 걸쳐 일정한 부피로 유지했다. 세포 생성물은 좁은 범위의 생존 가능한 세포 농도(일 군의 대상체에 대한 세포 조성물의 분석에 기초함, CD8+: 중앙값 31×106 세포/mL, IQR 28-40×106 세포/mL, N=38; CD4+: 중앙값 35×106 세포/mL, IQR 31-40×106, N=36)를 나타냈다.
생성된 T 세포 조성물이 하기 기재된 바와 같이 재발 및 불응성 비호지킨 림프종(NHL)이 있는 대상체에 투여하기 위해 사용되었다.
A. 치료용 T 세포 조성물의 예시적인 특성
하기 기재된 재발 및 불응성 비호지킨 림프종(NHL)이 있는 대상체에 투여하기 위해 사용된 생성된 치료용 T 세포 조성물을 유세포 분석을 이용하여 CCR7 및 CD27에 대해 분석하였다. CD4의 표면 발현 수준 및 대리 마커로 사용된 절단형 수용체도 분석되었다.
각각의 생성된 치료 조성물에 대해, 생성된 세포 조성물의 배가 수를 아크리딘 오렌지(AO) 및 프로프리둠 요오드화물(propridum iodide, PI) 또는 DAPI로 이중 형광 염색에 의해 세포의 총 핵수(total nuclear count, TNC)에 기초하여 하기 공식을 이용하여 또한 결정하였다:
1) 세포 배가 = ln(수확시 TNC/활성화 후 3일의 TNC)/ln 2
도 7은 치료 조성물 생성 공정에서 배가 수와 CD4+CAR+ 세포 중의 CD27+ 세포의 백분율 사이 연관성을 도시한다. CD8+ T 세포에 대해 유사한 결과가 관찰되었다. 결과는, 일반적으로, 치료용 T 세포 조성물을 생성하는 과정 중 보다 작은 수의 배가가 CD27+ 세포의 증가된 수준과 연관됨을 나타낸다. 이론에 구속되기를 원하지 않고, 상기 결과는, 상기 실시예에 기재된 바와 같이 조작된 T 세포를 생성하기 위한 공정에서 CD27+ 세포의 증가된 백분율이 상기 공정에서 제한된 배가에 의해 영향을 받을 수 있다는 관찰과 일치한다.
상기 기재된 바와 같이 실질적으로 동일한 공정에서 증폭 단계 중 공정 내 시드 밀도 모델링 연구는, 상대적으로 보다 높은 시드 밀도(예를 들어 0.35 x 106 세포/mL 이상)가 보다 낮은 시드 밀도(예를 들어 0.05 x 106 세포/mL 이하)에 비해 수확 기준을 달성하기 위한 집단 배가 수를 감소시킬 것이란 예상을 실증했다(도 8a). 모델링은 또한 상대적으로 보다 높은 시드 밀도(도 8b) 또는 보다 짧은 공정 지속 기간(도 8c)이, 보다 낮은 시드 밀도 또는 보다 긴 공정 지속 기간에 비해 각각 산출 치료용 T 세포 조성물(예를 들어 약물 제품)에서 CD27에 대해 양성인 CD8+CAR+ T 세포의 백분율 증가를 또한 초래할 것이란 예상을 드러냈다. 상기 데이터는, 증폭 단계 초기에 세포의 보다 높은 시드 밀도 또는 보다 짧은 공정 지속 기간이 조작된 치료용 T 세포 조성물에서 중앙 기억 세포 비율의 증가를 초래할 수 있다는 발견과 일치한다.
B. 항-CD19 CAR
+
T 세포 조성물의 투여
상기 기술된 치료적 CAR+ T 세포 조성물은 임상 연구에서 재발 또는 불응성(relapsed or refractory, R/R) 공격성 비-호지킨 림프종(NHL)을 가진 대상체에게 투여되었다. 구체적으로, 확산성 거대 B 세포 림프종(DLBCL) 데 노보(de novo) 또는 지연성 림프종(NOS), 고-등급(high-grade) B 세포 림프종(더블/트리플 히트(hit) 포함)로부터 형질전환된 DLBCL, 만성 림프구성 백혈병(CLL) 또는 한계 영역 림프종(MZL)으로부터 형질전환된 DLBCL, 원발 종격동 거대 b-세포 림프종(primary mediastinal large b-cell lymphoma, PMBCL), 및 여포성 림프종 3b 등급(FLG3B)을 비롯하여, R/R NHL을 갖는 성인 인간 대상체의 코호트는 항-CD19 CAR-발현 T 세포 조성물로 투여되었다. 전체 코호트 내 대상체의 코어 서브세트에 대하여 결과를 개별적으로 평가하였다(불량한 전신 활동도(ECOG 2)를 갖는 대상체들을 제외한, 한계 영역 림프종(MZL) 및/또는 만성 림프구성 백혈병(CLL, Richter's)으로부터 형질전환된 DLBCL, 및 원발성 종격동 거대 b-세포 림프종(PMBCL)이 있는 대상체들을 제외한 외), 여포성 림프종 등급 3b(FLG3B)(코어 코호트)). 코어 코호트에는 DLBCL, NOS 및 형질전환된 여포성 림프종(tFL) 또는 고등급 B-세포 림프종(더블/트리플 히트) 또는 고-등급 B-세포 림프종이 있는 대상체, MYB 및 BCL2 및/또는 DLBCL 조직학을 사용한 BCL6 재배열(더블/트리플 히트)이 있는 대상체 및 ECOG PS(Eastern Cooperative Oncology Group performance status)가 0 또는 1인 대상체가 포함되었다. 이 실시예에서 제시된 시점에서의 분석은 항-CD19 CAR-발현 세포가 투여된 전체 코호트(88 명(코어 코호트로부터의 65 명)은 반응을 평가했으며 91 명(코어 코호트로부터의 67 명)은 안전성을 평가하였음)에서 총 91 명의 대상체에 대한 평가를 기반으로 한다.
항-CD19 CAR-발현 세포를 함유하는 동결 보존된 세포 조성물을 정맥 내 투여 전에 해동시켰다. 치료적 T 세포 용량은 대략 1 : 1의 목표 비율로 별도로 투여된 제제화된 CD8+ CAR+ 집단 및 제제화된 CD4+ CAR+ 세포 집단을 투여하는 것에 의해 정해진 세포 조성물로서 투여되었다. 대상체에게 다음과 같이 단일 또는 이중 용량의 CAR-발현 T 세포(각 단일 용량은 각각 CD4+ CAR-발현 T 세포 및 CD8+ CAR-발현 T 세포의 개별 주입을 통해)가 투여되었다: 5×107 개의 총 CAR-발현 T 세포를 함유하는 단일 용량의 용량 수준 1(DL1), 또는 1×108 개의 총 CAR-발현 T 세포를 함유하는 단일 용량의 용량 수준 2(DL2). 일부 경우에, 투약 오류(dosing error)로 인하여, 대상체에게 2 회 용량 스케줄을 통해 2 회 DL2 용량을 부주의하게 받은 1 명의 대상체를 포함하여, 각 용량이 대략 14 일 간격으로 1 일 및 14 일에 투여되는 DL1의 이중 용량이 대상체에게 투여되었다. DL1 및 DL2에서 투여된 조성물에 대한 T 세포 서브세트의 용량 수준 및 목표 수(target numbers)는 표 E1에 제시되어 있다. 코어 코호트에서, 34 명의 대상체에게 DL1이 투여되었고, 27 명의 대상체에게 DL2로 투여되었다.
표 E2는 두 용량 수준에서 전체 코호트 및 코어 코호트에 대한 전체 반응 및 안전성 결과를 보여준다. 완전 반응(CR)을 보이는 52%의 대상을 포함하여 객관적 반응률(ORR)은 74%였다. 임의의 등급의 사이토카인 방출 증후군(CRS)의 발생률은 35%였으며 1%는 중증 CRS였고; 및 임의의 등급의 신경 독성(NT)의 발병률은 19%였으며, 1%는 중증 NT였다.
a 유사한 결과를 갖는 DL1D(용량 수준 1, 2회 용량 스케줄)로 치료받은 4 명의 환자.
b PD, 사망 또는 28-일 재병기설정 스캔(restaging scans)의 이벤트를 갖는 환자를 포함한다. 한 환자는 이용 가능한 재병기설정 스캔이 없었다.
c 데이터 스냅 샷 날짜 28 일 이전에 적어도 1 회 용량의 순응(conforming) CAR-발현 세포 생성물을 받았거나 사망한 모든 대상체를 포함한다.
C. 항-CD19 CAR-발현 T 세포의 세포 속성과 반응 사이의 관련성
치료 조성물에서 CAR+ T 세포의 특정 표현적 속성과 임상 반응 결과와 관련된 파라미터와의 관계를 평가하였다. 조성물에서의 기억 표현형과 기능 사이의 상관 관계는 중앙 기억 서브세트와 CAR+ 세포의 피크 생체 내(in vivo) 증폭(ρ=0.42, P=0.002), 및 관찰된 무진행 생존 (PFS) (카플란-마이어 생존 추정치, P=0.0164) 간의 양의 상관 관계로 해석되었다. 도 9a-9d는 특정 임계값 이상 또는 이하인 CD8+ CAR+ 세포 중에서 (무진행 생존에 대한 도 9a, 반응 지속 기간에 대한 도 9c) 또는 CD4+ CAR+ T 세포 중에서(무진행 생존에 대한 도 9e, 반응 지속 기간에 대한 도 9d) CCR7+CD27+ CAR+ T 세포의 빈도를 함유하는 조성물이 투여된 그룹으로 나눈, CAR+ T 세포 조성물이 투여된 대상체에 대한 카플란-마이어 생존 곡선을 보여준다. 조성물 중 더 높은 빈도의 CCR7+CD27+ 기억 세포는 더 긴 무진행 생존과 상관 관계가 있는 것으로 관찰되었다.
단변량 분석으로 치료용 T 세포 조성물을 생성하는 공정 중 T 세포 집단 배가(population doubling, PDL)와 비호지킨 림프종(NHL) 환자의 무 진행 생존 확률(probability of progression free survival, PFS) 사이의 역 상관 관계가 밝혀졌다. 도 10은 CD8+/CAR+ T 세포에서 “높은(high)”(>6 PDL) 또는 “낮은(low)”(<6 PDL) PDL 수를 갖는 환자에 대한 최적 분할 로그 순위 테스트에 기초한 PFS 곡선을 나타낸다. 상기 결과는 치료용 T 세포 조성물을 생성하는 공정에서 T 세포 집단의 배가 수를 제한할 수 있는 요인이 지속적인 무 진행 생존을 나타낼 대상체의 가능성을 개선할 수 있다는 발견과 일치한다.
실시예 7: 치료학적 세포 조성물을 생성하는 공정에서 선택된 (입력) 세포 조성물의 특징들의 평가
실시예 6에 기술된 과정에 의해 항-CD19 CAR로 조작하기 전에 재발 및 불응성 비호 지킨 림프종(NHL)을 앓는 대상체로부터 선택된 T 세포의 표현형 속성을 평가하였다. CD4+ 및 CD8+ T 세포는 다수의 대상체로부터 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 백혈구성분채집술로부터의 면역친화성-기반 강화(immunoaffinity-based enrichment)에 의해 선택되었다. 이러한 선택된 T 세포의 조성물(유전적 조작 전에, "전-조작 조성물"로 지정됨)은 C-C 케모카인 수용체 타입 7 (CCR7), CD27 및 CD45RA를 비롯한 효과기 기억 또는 중앙 기억세포 서브타입과 같은 특정 T 세포 서브타입을 나타내는 세포 표면 마커의 발현을 비롯하여 다양한 속성에 대하여 평가되었다.
농축된 CD4+ 및 CD8+ 조성물(예를 들어 입력 조성물)의 분석은 중앙 기억 T 세포 서브 세트에 존재하는 것과 같은 나이브 유사 마커(예를 들어 CD27+CD28+ T 세포)에 대해 양성인 T 세포의 백분율이 NHL 환자 사이에 매우 가변적임을 나타냈다(도 11). 이들 데이터는 중심 기억 T 세포 서브 세트의 환자 간 T 세포 이질성이 CAR+ T 세포 치료용 T 세포 조성물을 생성하는 데 사용된 선택된 (입력) T 세포 조성물에 존재함을 나타낸다.
선택된 (입력) T 세포 조성물을 사용하여 실질적으로 실시예 6에 기재된 바와 같이 CD4+ 및 CD8+ 치료용 T 세포 조성물을 생성하였다. 생성된 세포 조성물의 배가 수는 또한 실시예 6에 기재된 바와 같이 세포의 총 핵 수(TNC)를 기반으로 결정되었다. 치료 조성물 생성하는 공정에서 배가 수와 선택된 (입력) T 세포 조성물에서 세포의 표현형 특성 사이 연관성이 결정되었다. 도 12에 도시된 바와 같이, 농축된 CD4+ (입력) 조성물에서 CD45RA 및 CCR7에 대해 음성 염색으로 확인된(CD45RA-CCR7-) 효과기 기억 CD4+ T 세포의 보다 높은 비율은, 치료용 T 세포 조성물의 생성 중 집단 배가의 수와 양의 상관 관계가 있었다. CD8+ T 세포에 대해 유사한 결과가 관찰되었다.
상기 결과는, 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 공정에서 사용된 입력 조성물에서 나이브 유사 또는 중앙 기억 세포 서브 세트에 양성인 T 세포를 농축하고/거나 효과기 기억 T 세포의 백분율을 감소시키는 것을 포함하는 접근법을 지지한다. 상기 결과와 일관되게, 상기 접근법은 조작된 치료용 T 세포 조성물의 하나 이상의 특징, 예를 들어 환자 대 환자 가변성의 감소, 조작된 치료용 T 세포 조성물을 생성하는 공정에서 집단 배가 수의 감소 및/또는 대상체가 지속적인 PFS를 나타낼 수 있는 가능성의 증가를 개선할 수 있다.
실시예 8: 비-증폭된 및 증폭된 조작 공장의 키네틱스
인간 T 세포(CD4+ 및 CD8+)는, 증폭을 위한 배양 단계(비-증폭 코호트)를 포함하지 않은 공정 및 확장을위한 재배 단계를 포함하는 공정(증폭 코호트)를 포함하는 다양한 제조 공정을 통해 키메라 항원 수용체(CAR)로 조작되었다. 다양한 공정에 의해 제조 공정 중 및 제조 후에 생산된 세포의 복합 분석이 수행되었다. 조작된 T 세포 조성물을 생산하기 위한 제조 수행은 실시예 8에 기술된 규모의 수행뿐만 아니라하기 기술된 공정을 포함한다. 제조 수행에는 또한 제조 수행과 실질적으로 동일하게 수행되었지만 세포를 조작하는 과정에서 더 적은 수의 T 세포가 사용된 축소 모델(scale-down model; SDM)이 포함되었다. 일반적으로, 축소 제조 수행은 표 E3에 설명된 공정 활동을 공유하였다.
상기 분석된 공정에서, T 세포는 항-CD19 CAR 또는 항-BCMA CAR로 조작되었다. 예시적인 항-CD19 CAR은 뮤린 항체 FMC63, 면역 글로불린 스페이서, CD28로부터 유래된 막 관통 도메인, 4-1BB로부터 유래된 공자극 영역 및 CD3-제타 세포 내 신호 전달 도메인으로부터 유래된 항-CD19 scFv를 함유하였다. 벡터는 또한 T2A 서열에 의해 CAR 컨스트럭트로부터 분리된 CAR 발현에 대한 대리 마커 역할을 하는 절단된 수용체 분자를 암호화하였다. 예시적인 항-BCMA CAR은 BCMA에 특이적인 scFv 항원 결합 도메인, CD28 막 관통 영역, 4-1BB 공자극 신호 전달 영역, 및 CD3-제타 유래 세포 내 신호 전달 도메인을 함유하였다. 벡터는 또한 T2A 서열에 의해 CAR 컨스트럭트로부터 분리된 CAR 발현에 대한 대리 마커 역할을 하는 절단된 수용체 분자를 암호화하였다.
상기 공정은 항-CD3/항-CD28 상자성 비드 또는 항-CD3/항-CD28 Fab 콘쥬게이트된 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약을 사용한 T 세포의 자극을 포함하였다. 올리고머 시약에는 STREP-TACTIN® M2로 지정된 스트렙타비딘 뮤테인 중합체를 함유하였다[서열번호 73에 제시된 아미노산의 뮤테인 서열을 함유하는 스트렙타비딘 호모-테트라머(국제공개공보 제WO2018/197949호)]. 상기 스트렙타비딘 뮤테인은 또한 미국특허 제6,103,493호 및 문헌 「Voss and Skerra (1997) Protein Eng., 1:975-982, and Argarana et al. (1986) Nucleic Acids Research, 1871-1882」에 기술된다. 자극제(항-CD3 및 항-CD28 Fab 단편)는 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약에 가역적인 결합에 의해 다량체화되었다. 항-CD3 및 항-CD28 Fab 단편은 각 Fab 단편에 융합된 스트렙타비딘 펩티드 결합 파트너를 통해 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머에 가역적으로 결합되었다. 항-CD3 Fab 단편은 하이브리도마 세포주 OKT3(ATCC® CRL-8001™; 또한 미국특허 제4,361,549호 참조)에 의해 생성된 CD3 결합 단클론 항체에서 유래되었고, 문헌 「Arakawa et al J. Biochem. 120, 657-662 (1996)」에 기재된 항-CD3 항체 OKT3의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 함유했다. 상기 서열은 서열 번호 89 및 90에 각각 제시된다. 항-CD28 Fab 단편은 항체 CD28.3(GenBank 수탁 번호 AF451974.1 하에 합성 단일 사슬 Fv 작제물로 기탁됨; 또한 문헌 「Vanhove et al., BLOOD, 15 July 2003, Vol. 102, No. 2, 564-570 페이지」에서 유래되었고, 서열 번호 93 및 94에 각각 제시된 항-CD28 항체 CD28.3의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유했다. Fab 단편은 중쇄의 카르복시-말단에 아미노산 서열 SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK(서열 번호 79)을 갖는 2개의 스트렙타비딘 결합 모듈의 순차적 배열을 함유하는 스트렙타비딘 펩티드 결합 서열이 개별적으로 융합되었다. 펩티드 태그 Fab 단편은 재조합으로 생성되었다(국제공개공보 제WO 2013/011011호 및 제WO 2013/124474호 참조). 올리고머 스트레타비딘 뮤테인 시약에 대한 펩티드-태그된 항-CD3 및 항-CD28의 결합은 D-비오틴의 첨가에 의해 파괴되거나 역전될 수 있다. D-비오틴은 스트렙타비딘 뮤테인의 결합 파트너에 대한 결합을 위해 제제의 스트렙-태그와 경쟁하여 결합을 방해한다.
세포는 제조 수행 동안 및 종료 시에 다양한 시간에 수집하고 계수하고 CD4, CD8, CCR7, CD27 및 CD45RA를 포함한 표면 마커를 인식하는 항체로 염색한 후 생존력 및 유세포 분석법에 의해 평가되었다.
A. T 세포 조작 공정
세포의 출발원(동결 보존된 성분 채집술 또는 신선한 성분 채집술), 올리고머 자극 시약의 농도 및 자극에 사용된 세포의 수를 포함한 다양한 특징에서 차이가 나는 상이한 비증폭 공정를 이용하여 생성된 T 세포 조성물을 비교하였다. 또한 세포가 증폭을 위해 배양된 T 세포 조성물이 생성되었다. 공정는 건강한 공여자 또는 환자 공여자에서 수행되었다.
1. 비-증폭된 공정
백혈구 성분 채집술 샘플이 인간 공여자에서 수집되었고 세척되었다. CD4+ 및 CD8+ 세포는 동결 보존되지 않은 백혈구 성분 채집술 샘플에서 면역 친화도 기반 선택에 의해 직접 선택되었다. 선택 후, 별도의 CD4+ 및 CD8+ T 세포 조성물이 동결 보존된 다음 해동되었고, 이어서 선택된 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 생존 가능한 CD4+ T 세포 대 생존 가능한 CD8+ T 세포의 1:1 비율로 혼합되어 입력 조성물이 생성되었다. 혼합된 입력 세포 조성물 유래 약 600×106 세포(약 300×106 CD4+ 및 300×106 CD8+)가 이 실시예에서 위에서 기재된 바와 같이 생성된 1x106 세포 당 0.8 ㎍의 항-CD3/항-CD28 Fab 접합 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약과 함께 인큐베이션하여 자극되었다. 자극은, 기본 배지(예를 들어 CTS™ OpTmizer 기본 배지, Thermo Fisher), T 세포 보충물(예를 들어 2.6% OpTmizer® T-세포 증폭 보충물, Thermo Fisher), 면역 세포 혈청 대체제(예를 들어 2.5% CTS™ 면역 세포 혈청 대체제), 2 mM L-글루타민, 디펩티드 형태의 L-글루타민(예를 들어 1.0% Glutamax™, Thermo Fisher), 100 IU/mL의 재조합 IL-2, 600 IU/mL의 재조합 IL-7 및 100 IU/mL의 재조합 IL-15를 함유하는 무혈청 완전 배지에서 18-30 시간(24±6 시간) 동안 수행되었다. 자극 후, 최대 300×106 세포가 예시적인 항-BCMA CAR 또는 예시적인 항-CD19 CAR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 회전 접종에 의해 형질도입되었다.
회전 접종 후에, 세포를 세척하고, 2 mM 글루타민은 있으나 재조합 사이토카인은 첨가되지 않은 기본 배지(예를 들어 CTS™ OpTmizer 기본 배지, Thermo Fisher)에서 최대 약 0.75×106 세포/mL의 밀도로 재현탁하고, 약 37℃에서 인큐베이터로 인큐베이션했다. 자극 개시 후 약 48 시간±6 시간(인큐베이션 시작 후 약 24시간)후에, 1.0 mM D-비오틴을 첨가하고 세포와 혼합하여 항-CD3 및 항-CD28 Fab 시약을 올리고머 스트렙타비딘 시약에서 해리시켰다. 세포를 추가 약 48 시간(자극 개시 후 96 시간±6 시간 또는 공정의 5 일까지) 동안 더 인큐베이션한 다음, 동결 방지제로 제형화하였다.
또다른 공정 B에서, 백혈구 성분 채집술 샘플이 인간 공여자에서 수집되었고 세척 및 동결 보존되었다. 동결 보존된 백혈구 성분 채집술 샘플이 해동되었고, 별도의 CD4+ 및 CD8+ 세포 조성물이 면역 친화도 기반 선택에 의해 각 샘플에서 선택되었고, 이어서 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 목표와 혼합되어 최대 약 900×106개의 생존 가능한 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 입력 조성물이 생성되었고, 여기서 생존 가능한 CD4+ T 세포 대 생존 가능한 CD8+ T 세포의 비율은 다를 수 있다. 혼합된 입력 세포 조성물을 이 실시예에서 위에서 기재된 바와 같이 생성된 1×106 세포 당 1.2 ㎍의 항-CD3/항-CD28 Fab 접합 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약과 인큐베이션함으로써 자극하였다(여기서 1.2 ㎍의 올리고머 자극 시약은 0.9 ㎍의 올리고머 입자 및 0.15 ㎍의 항-CD3 Fab 및 0.15 ㎍의 항-CD28 Fab를 포함한다). 자극은 위에서 기재된 동일한 무혈청 완전 배지에서 16-24시간(20±4시간) 동안 수행되었다. 자극 후, 최대 약 600×106 세포가, CAR, 위에서 기재된 동일한 예시적인 항-BCMA CAR 또는 예시적인 항-CD19 CAR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 회전 접종에 의해 형질도입되었다. 본 연구에서, 보다 높은 농도의 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약과 함께 인큐베이션된 세포는 형질도입 효율의 개선을 나타냈다(데이터는 도시되지 않음). 이러한 공정에서 회전 접종 후에, 세포를 세척하고, 2 mM 글루타민 및 2.6% T 세포 보충물(예를 들어 2.6% OpTmizer® 보충물, Thermofisher)은 있으나 재조합 사이토카인은 첨가되지 않은 기본 배지(예를 들어 CTS™ OpTmizer 기본 배지, Thermo Fisher)에서 0.75×106 세포/mL의 밀도로 재현탁하고, 약 37℃에서 인큐베이터로 인큐베이션했다. 자극 개시 후 약 48 시간±6 시간(인큐베이션 시작 후 약 24시간)후에, 1.0 mM D-비오틴을 첨가하고 세포와 혼합하여 항-CD3 및 항-CD28 Fab 시약을 올리고머 스트렙타비딘 시약에서 해리시켰다. 세포를 추가 약 48 시간(자극 개시 후 96 시간±6 시간 또는 공정의 5 일까지) 동안 더 인큐베이션한 다음, 동결 방지제로 제형화하였다.
2. 증폭 공정
하나의 프로스세에서, 항-CD19 CAR T 세포는 위에서 기술한 비-증폭 공정에 의해서 조작되었다.
또다른 증폭 공정에서, CD4+ 및 CD8+ 세포의 별도 조성물이 인간 백혈구 성분 채집술 샘플에서 선택되고 동결되었다. 선택된 세포 조성물이 후속적으로 해동되었으며, 생존 가능한 CD4+ T 세포 대 생존 가능한 CD8+ T 세포의 비율, 1:1로 혼합되었다. 혼합 조성물 중 대략 300×106개의 T 세포(150×106 CD4+ 및 150×106 CD8+ T 세포)가, 재조합 IL-2, IL-7 및 IL-15를 함유하는 무혈청 배지에서 18 내지 30 시간 동안 비드 대 세포의 비율, 1:1로 항-CD3 및 항-CD28 항체가 부착된 상자성 폴리스티렌 코팅 비드의 존재 하에 자극되었다. 인큐베이션 후에, 자극 세포 조성물에서 대략 100 x106개의 생존 가능한 세포가 재조합 IL-2, IL-7 및 IL-15를 함유하는 무혈청 배지로 농축되었다. 세포는, 대략 1600 g에서 60 분 동안 회전 접종에 의해 예시적인 CAR, 위에서 기재된 바와 같은 예시적인 항-BCMA CAR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입되었다. 회전 접종 후에, 세포를 재조합 IL-2, IL-7 및 IL-15를 함유하는 무혈청 배지로 재현탁하고, 약 37℃에서 약 18 내지 30 시간 동안 인큐베이션했다. 이어서 세포는, 인큐베이션 및 형질도입 단계 중 사용된 바와 같은 IL-2, IL-7 및 IL-15의 2배 농도를 함유하는 예시적인 무혈청 배지 약 500mL의 생물반응기(예를 들어 흔들리는 동작 생물반응기)로 전달되어 증폭을 위해 배양되었다. 설정된 생존 가능한 세포 농도를 달성한 경우, 관류가 개시되었고, 여기에서 배지는 연속 혼합되는 반연속 관류에 의해 교체되었다. 세포는, 전형적으로 6-7 일의 증폭을 수반하는 공정에서 발생하는 약 3×16 세포/ml의 임계 세포 밀도를 달성할 때까지 생물 반응기에서 다음날까지 배양되었다. 항-CD3 및 항-CD28 항체 접합 상자기 비드가 자기장에 노출됨으로써 세포 조성물에서 제거되었다. 이어서 세포는 수집, 제형화 및 동결 보호되었다.
B. 공정 메트릭스
살아있는 총 세포(도 13a) 및 생존 능력(도 13b)과 같은 공정 메트릭스가 제조 실행 중에 모니터링되었다. 도 13a에 도시된 바와 같이, 최소한의 세포 증폭이 5 일 시점에 관찰되었고, 강력한 증폭이 5 일 후에 시작되었다. 도 13b는 공정의 5 일 후에 세포가 증폭을 시작함에 따라 증가하기 시작한 세조 실행에서 세포 생존 능력의 초기 감소를 나타낸다.
제조 수행의 상이한 시점에서 기억/분화 표현형의 비교 결과가 도 13c(CD5RA 및 CCR7 발현에 의한) 및 도 13d(CD27 및 CCR7 발현에 의한)에 도시되어 있다. 표시된 바와 같이, 제조 수행 중 초기에 세포를 평가하면, 공정의 초기 시간(예를 들어 1일 또는 2일차) 또는 공정의 이후 시간(예를 들어 9일차)에 세포와 비교하여 약 5일차에 세포가 덜 분화된 세포 유형, 예를 들어 CCR7+CD45RA- 또는 CCR7+CD27+ 세포에 대해 실질적으로 더 농축되는 것을 보여준다. CD57+ 세포의 수가 제조 공정 기간 동안 분석되었다. 도 14에 나타낸 바와 같이, CD8+CD57+ 세포의 수는 제조 공정에서 감소한 반면, CD4+CD57+ 세포의 수는 전체적으로 낮게 유지되었다.
본 발명은 예를 들어 본 발명의 다양한 구현예를 예시할 목적으로 제공되는 특정 개시된 실시예로 그 범위가 제한되도록 의도되어서는 안된다. 기재된 조성물 및 방법에 대한 다양한 변형은 본원의 설명 및 교시로부터 명백해질 것이다. 이러한 변형은 본 개시의 진정한 범위 및 사상을 벗어남이 없이 실시될 수 있으며 본 개시의 범위 내에 속하도록 의도된다.
| # | 서열 | 주석 |
| 1 | ESKYGPPCPPCP | 스페이서 (IgG4힌지) (aa) |
| 2 | GAATCTAAGTACGGACCGCCCTGCCCCCCTTGCCCT | 스페이서 (IgG4힌지) (nt) |
| 3 | ESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK | 힌지-CH3 스페이서 |
| 4 | ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK | 힌지-CH2-CH3 스페이서 |
| 5 | RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH | IgD-힌지-Fc |
| 6 | LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR | T2A |
| 7 | MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM | tEGFR |
| 8 | FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV | CD28 (수탁번호 P10747의 아미노산 153-179) |
| 9 | IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV | CD28 (수탁번호 P10747의 아미노산 114-179) |
| 10 | RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS | CD28 (P10747의 아미노산 180-220) |
| 11 | RSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS | CD28 (LL to GG) |
| 12 | KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL | 4-1BB (Q07011.1의 아미노산 214-255) |
| 13 | RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR | CD3 제타 |
| 14 | RVKFSRSAEPPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR | CD3 제타 |
| 15 | RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR | CD3 제타 |
| 16 | RKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM | tEGFR |
| 17 | EGRGSLLTCGDVEENPGP | T2A |
| 18 | GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP | P2A |
| 19 | ATNFSLLKQAGDVEENPGP | P2A |
| 20 | QCTNYALLKLAGDVESNPGP | E2A |
| 21 | VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP | F2A |
| 22 | -PGGG-(SGGGG)5-P- wherein P is proline, G is glycine and S is serine | 링커 |
| 23 | GSADDAKKDAAKKDGKS | 링커 |
| 24 | atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatccca | GMCSFR 알파 사슬 신호 서열 |
| 25 | MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP | GMCSFR 알파 사슬 신호 서열 |
| 26 | MALPVTALLLPLALLLHA | CD8 알파 신호 펩티드 |
| 27 | EPKSCDKTHTCPPCP | 힌지 |
| 28 | ERKCCVECPPCP | 힌지 |
| 29 | ELKTPLGDTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP | 힌지 |
| 30 | ESKYGPPCPSCP | 힌지 |
| 31 | X1PPX2P X1 is glycine, cysteine or arginine X2 is cysteine or threonine |
힌지 |
| 32 | YGPPCPPCP | 힌지 |
| 33 | KYGPPCPPCP | 힌지 |
| 34 | EVVVKYGPPCPPCP | 힌지 |
| 35 | RASQDISKYLN | CDR L1 |
| 36 | SRLHSGV | CDR L2 |
| 37 | GNTLPYTFG | CDR L3 |
| 38 | DYGVS | CDR H1 |
| 39 | VIWGSETTYYNSALKS | CDR H2 |
| 40 | YAMDYWG | CDR H3 |
| 41 | EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS | VH |
| 42 | DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT | VL |
| 43 | DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS | scFv |
| 44 | KASQNVGTNVA | CDR L1 |
| 45 | SATYRNS | CDR L2 |
| 46 | QQYNRYPYT | CDR L3 |
| 47 | SYWMN | CDR H1 |
| 48 | QIYPGDGDTNYNGKFKG | CDR H2 |
| 49 | KTISSVVDFYFDY | CDR H3 |
| 50 | EVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSS | VH |
| 51 | DIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKR | VL |
| 52 | GGGGSGGGGSGGGGS | 링커 |
| 53 | EVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKR | scFv |
| 54 | HYYYGGSYAMDY | HC-CDR3 |
| 55 | HTSRLHS | LC-CDR2 |
| 56 | QQGNTLPYT | LC-CDR3 |
| 57 | gacatccagatgacccagaccacctccagcctgagcgccagcctgggcgaccgggtgaccatcagctgccgggccagccaggacatcagcaagtacctgaactggtatcagcagaagcccgacggcaccgtcaagctgctgatctaccacaccagccggctgcacagcggcgtgcccagccggtttagcggcagcggctccggcaccgactacagcctgaccatctccaacctggaacaggaagatatcgccacctacttttgccagcagggcaacacactgccctacacctttggcggcggaacaaagctggaaatcaccggcagcacctccggcagcggcaagcctggcagcggcgagggcagcaccaagggcgaggtgaagctgcaggaaagcggccctggcctggtggcccccagccagagcctgagcgtgacctgcaccgtgagcggcgtgagcctgcccgactacggcgtgagctggatccggcagccccccaggaagggcctggaatggctgggcgtgatctggggcagcgagaccacctactacaacagcgccctgaagagccggctgaccatcatcaaggacaacagcaagagccaggtgttcctgaagatgaacagcctgcagaccgacgacaccgccatctactactgcgccaagcactactactacggcggcagctacgccatggactactggggccagggcaccagcgtgaccgtgagcagc | scFv를 암호화하는 서열 |
| 58 | GSTSGSGKPGSGEGSTKG | 링커 |
| 59 | ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 인간 IgG2 Fc (유니포트 P01859) |
| 60 | ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK | 인간 IgG4 Fc (유니포트 P01861) |
| 61 | GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKMDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE | FKBP |
| 62 | GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE | FKBP12v36 |
| 63 | MGSNKSKPKDASQRRR | 아실화 모티프 |
| 64 | Met-Gly-Cys-Xaa-Cys | 이중 아실화 영역 |
| 65 | Cys-Ala-Ala-Xaa | CAAX 박스 |
| 66 | DPSKDSKAQVSAAEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASIDAAKKAGVNNGNPLDAVQQ | 스트렙타비딘 종: 스트렙토마이세스 아비디니 유니포트 No. P22629 |
| 67 | EAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAAS | 최소 스트렙타비딘종: 스트렙토마이세스 아비디니 |
| 68 | EAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYIGARGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAAS | 뮤테인 스트렙타비딘 Ile44-Gly45-Ala-46-Arg47종: 스트렙토마이세스 아비디니 |
| 69 | WSHPQFEK | Strep-tag® II |
| 70 | WSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEK | Twin-Strep-tag |
| 71 | WSHPQFEKGGGSGGGSWSHPQFEK | Twin-Strep-tag |
| 72 | WSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK | Twin-Strep-tag |
| 73 | MEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYIGARGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAAS | 뮤테인 스트렙타비딘 Ile44-Gly45-Ala-46-Arg47종: 스트렙토마이세스 아비디니 |
| 74 | -Trp-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa- | 스트렙타비딘-결합 펩티드 Xaa는 임의의 아미노산이고; Yaa는 Gly 또는 Glu이며 Zaa는 Gly, Lys 또는 Arg이다. |
| 75 | Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly | 스트렙타비딘 결합 펩티드, Strep-tag® |
| 76 | Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Xaa)n-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys- | 스트렙타비딘-결합 펩티드의 순차 모듈 Xaa는 임의의 아미노산이고; n은 8 또는 12이다. |
| 77 | Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)n-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys | 스트렙타비딘-결합 펩티드의 순차 모듈; n은 2 또는 3이다. |
| 78 | SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEK | Twin-Strep-tag |
| 79 | SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK | Twin-Strep-tag |
| 80 | DPSKDSKAQVSAAEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYVTARGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASIDAAKKAGVNNGNPLDAVQQ | 뮤테인 스트렙타비딘 Val44-Thr45-Ala46-Arg47 스트렙토마이세스 아비디니 |
| 81 | EAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYVTARGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAAS | 뮤테인 스트렙타비딘 Val44-Thr45-Ala46-Arg47스트렙토마이세스 아비디니 |
| 82 | MEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYVTARGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAAS | 뮤테인 스트렙타비딘 Val44-Thr45-Ala46-Arg47스트렙토마이세스 아비디니 |
| 83 | His-Pro-Gln-Phe | 스트렙타비딘-결합 펩티드 |
| 84 | Oaa-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa | 스트렙타비딘-결합 펩티드 Oaa는 Trp, Lys 또는 Arg이고; Xaa임의의 아미노산이고; Yaa는 Gly 또는 Glu이며 Zaa는 Gly, Lys 또는 Arg이다. |
| 85 | DPSKDSKAQVSAAEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYIGARGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASIDAAKKAGVNNGNPLDAVQQ | 뮤테인 스트렙타비딘 Ile44-Gly45-Ala-46-Arg47 종: 스트렙토마이세스 아비디니 |
| 86 | EAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYVTARGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEENAGYSTLVGHDTFTKVKPSAAS | 뮤테인 스트렙타비딘 Ile44-Gly45-Ala-46-Arg47 and Glu117, Gly120, Try121 (뮤테인 m1-9) 종: 스트렙토마이세스 아비디니 |
| 87 | DPSKDSKAQVSAAEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYVTARGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEENAGYSTLVGHDTFTKVKPSAAS | 뮤테인 스트렙타비딘 Ile44-Gly45-Ala-46-Arg47 및 Glu117, Gly120, Try121 (뮤테인 m1-9) 종: 스트렙토마이세스 아비디니 |
| 88 | MEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAAS | 최소 스트렙타비딘종: 스트렙토마이세스 아비디니 |
| 89 | Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys | 뮤테인 스트렙타비딘 |
| 90 | Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly | Strep-tag® |
| 91 | LQQSGAELVKPGASVRLSCKASGYTFTEYIIHWIKLRSGQGLEWIGWFYPGSNDIQYNAKFKGKATLTADKSSSTVYMELTGLTSEDSAVYFCARRDDFSGYDALPYWGQGTMVTV | VH 항-CD28 항체 CD28.3 |
| 92 | DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRTNENIYSNLAWYQQKQGKSPQLLIYAATHLVEGVPSRFSGSGSGTQYSLKITSLQSEDFGNYYCQHFWGTPCTFGGGTKLEIKR | VL 항-CD28 항체 CD28.3 |
| 93 | QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS | VH 항-CD3 항체 OKT3 |
| 94 | QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIN | VL 항-CD3 항체 OKT3 |
| 95 | AMQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTTFGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWASGITDYNVPFMSRLSITKDNSKSQVFFKLNSLQPDDTAIYYCAKNDPGTGFAYWQGTLVTVSSTKGPSVFPAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGSAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK | Fab 단편 t m13B8.2의 가변 중쇄 |
| 96 | AMDIQMTQSPASLSASVGETVTFTCRASEMIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVHDAKTLAEGVPSRFSGGGSGTQFSLKINTLQPEDFGTYYCQAHYGNPPTFGGGTKLEIKRGIAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGS | Fab 단편 m13B8.2의 가변 경쇄 |
| 97 | QVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNIKDTYIHWVQQAPGKGLEWMGRIDPANDNTLYASKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYGYYVFDHWGQGTLVTVSS | huOKT8의 가변 중쇄 |
| 98 | DVQITQSPSSLSASVGDRVTITCRTSRSISQYLAWYQQKPGKVPKLLIYSGSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQHNENPLTFGGGTKVEIK | huOKT8의 가변 경쇄 |
SEQUENCE LISTING
<110> JUNO THERAPEUTICS, INC.
Teoh, Jeffrey
Cossette, Daniel
Larson, Ryan
Cooper, Sara
<120> PROCESS FOR PRODUCING GENETICALLY ENGINEERED CELLS
<130> 735042017640
<140> Not Yet Assigned
<141> Concurrently Herewith
<150> 62/756,571
<151> 2018-11-06
<150> 62/798,457
<151> 2019-01-29
<160> 98
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Spacer(IgG4 hinge)
<400> 1
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<223> Spacer (IgG4hinge)
<400> 2
gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36
<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Hinge-CH3 spacer
<400> 3
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg
1 5 10 15
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
20 25 30
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
35 40 45
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
50 55 60
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
65 70 75 80
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
85 90 95
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
100 105 110
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
115
<210> 4
<211> 229
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Hinge-CH2-CH3-spacer
<400> 4
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 5
<211> 282
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> IgD-hinge-Fc
<400> 5
Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala
1 5 10 15
Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala
20 25 30
Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
35 40 45
Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln
65 70 75 80
Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly
85 90 95
Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
100 105 110
Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly
115 120 125
Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn
130 135 140
Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro
145 150 155 160
Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys
165 170 175
Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser
180 185 190
Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu
195 200 205
Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro
210 215 220
Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser
225 230 235 240
Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr
245 250 255
Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg
260 265 270
Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His
275 280
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> T2A
<400> 6
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20
<210> 7
<211> 357
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> tEGFR
<400> 7
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195 200 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210 215 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225 230 235 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275 280 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290 295 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305 310 315 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala
325 330 335
Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly
340 345 350
Ile Gly Leu Phe Met
355
<210> 8
<211> 27
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> cd28
<300>
<308> P10747
<309> 1989-07-01
<313> (153)..(179)
<400> 8
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 9
<211> 66
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CD28
<300>
<308> P10747
<309> 1989-07-01
<313> (114)..(179)
<400> 9
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val
65
<210> 10
<211> 41
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CD28
<300>
<308> P10747
<309> 1989-07-01
<313> (180)..(220)
<400> 10
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 11
<211> 41
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CD28 (LL to GG)
<400> 11
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 12
<211> 42
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 4-1BB
<300>
<308> Q07011.1
<309> 1995-02-01
<313> (214)..(255)
<400> 12
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CD3 zeta
<400> 13
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CD3 zeta
<400> 14
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 15
<211> 112
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CD3 zeta
<400> 15
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 16
<211> 335
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> tEGFR
<400> 16
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330 335
<210> 17
<211> 18
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> T2A
<400> 17
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 18
<211> 22
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> P2A
<400> 18
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 19
<211> 19
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> P2A
<400> 19
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 20
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> E2A
<400> 20
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 21
<211> 22
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> F2A
<400> 21
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Linker
<220>
<221> REPEAT
<222> (5)..(9)
<223> SGGGG is repeated 5 times
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(9)
<223> wherein P is proline, G is glycine and S is serine
<400> 22
Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro
1 5 10
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Linker
<400> 23
Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Gly Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 24
<211> 66
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> GMCSFR alpha chain signal sequence
<400> 24
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atccca 66
<210> 25
<211> 22
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> GMCSFR alpha chain signal sequence
<400> 25
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 26
<211> 18
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> CD8 alpha signal peptide
<400> 26
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 27
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 28
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 29
<211> 61
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 29
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro
1 5 10 15
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
20 25 30
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro
35 40 45
Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
50 55 60
<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 30
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210> 31
<211> 5
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Hinge
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> Xaa is Glycine, Cysteine or Arginine
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> Xaa is Cysteine or Threonine
<400> 31
Xaa Pro Pro Xaa Pro
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 32
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 33
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 34
<211> 14
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 34
Glu Val Val Val Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> CDR L1
<400> 35
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> CDR L2
<400> 36
Ser Arg Leu His Ser Gly Val
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> CDR L3
<400> 37
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly
1 5
<210> 38
<211> 5
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> CDR H1
<400> 38
Asp Tyr Gly Val Ser
1 5
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<211> 16
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> CDR H2
<400> 39
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 40
<211> 7
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> CDR H3
<400> 40
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
1 5
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<211> 120
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> VH
<400> 41
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> VL
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
100 105
<210> 43
<211> 245
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> scFv
<400> 43
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> CDR L1
<400> 44
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
1 5 10
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> CDR L2
<400> 45
Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> CDR L3
<400> 46
Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 47
<211> 5
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> CDR H1
<400> 47
Ser Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> CDR H2
<400> 48
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 49
<211> 13
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> CDR H3
<400> 49
Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 50
<211> 122
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> VH
<400> 50
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 51
<211> 108
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> VL
<400> 51
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Linker
<400> 52
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 53
<211> 245
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> scFv
<400> 53
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys
145 150 155 160
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe
210 215 220
Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 54
<211> 12
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> HC-CDR3
<400> 54
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> LC-CDR2
<400> 55
His Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> LC-CDR3
<400> 56
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 57
<211> 735
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Sequence encoding scFv
<400> 57
gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60
atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240
gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300
ggaacaaagc tggaaatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360
ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gaaagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420
cagagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta cggcgtgagc 480
tggatccggc agccccccag gaagggcctg gaatggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540
accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600
agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660
gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720
gtgaccgtga gcagc 735
<210> 58
<211> 18
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Linker
<400> 58
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 59
<211> 326
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<223> Human IgG2 Fc (Uniprot P01859)
<400> 59
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 60
<211> 327
<212> PRT
<213> homo sapiens
<220>
<223> Human IgG4 Fc (Uniprot P01861)
<400> 60
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 61
<211> 107
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> FKBP
<400> 61
Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro
1 5 10 15
Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp
20 25 30
Gly Lys Lys Met Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe
35 40 45
Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala
50 55 60
Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr
65 70 75 80
Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr
85 90 95
Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu
100 105
<210> 62
<211> 107
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> FKBP12v36
<400> 62
Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro
1 5 10 15
Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp
20 25 30
Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe
35 40 45
Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala
50 55 60
Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr
65 70 75 80
Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr
85 90 95
Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu
100 105
<210> 63
<211> 16
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> acylation motif
<400> 63
Met Gly Ser Asn Lys Ser Lys Pro Lys Asp Ala Ser Gln Arg Arg Arg
1 5 10 15
<210> 64
<211> 5
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> dual acylation region
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> Xaa is any amino acid
<400> 64
Met Gly Cys Xaa Cys
1 5
<210> 65
<211> 4
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> CAAX box
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> Xaa is any amino acid
<400> 65
Cys Ala Ala Xaa
1
<210> 66
<211> 159
<212> PRT
<213> Streptomyces avidinii
<400> 66
Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly
1 5 10 15
Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr
20 25 30
Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly
35 40 45
Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro
50 55 60
Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys
65 70 75 80
Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr
85 90 95
Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser
100 105 110
Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp
115 120 125
Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys
130 135 140
Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln
145 150 155
<210> 67
<211> 126
<212> PRT
<213> Streptomyces avidinii
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> minimal streptavidin
<400> 67
Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe
1 5 10 15
Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser
20 25 30
Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp
35 40 45
Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val
50 55 60
Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser
65 70 75 80
Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu
85 90 95
Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val
100 105 110
Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser
115 120 125
<210> 68
<211> 126
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Mutein Streptavidin Ile44-Gly45-Ala-46-Arg47
<400> 68
Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe
1 5 10 15
Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Ile Gly
20 25 30
Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp
35 40 45
Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val
50 55 60
Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser
65 70 75 80
Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu
85 90 95
Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val
100 105 110
Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser
115 120 125
<210> 69
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Strep-tag II
<400> 69
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 70
<211> 28
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Twin-Strep-tag
<400> 70
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
20 25
<210> 71
<211> 24
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Twin-Strep-tag
<400> 71
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
20
<210> 72
<211> 28
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Twin-Strep-tag
<400> 72
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
20 25
<210> 73
<211> 127
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Mutein Streptavidin Ile44-Gly45-Ala-46-Arg47
<400> 73
Met Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Ile
20 25 30
Gly Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr
35 40 45
Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr
50 55 60
Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp
65 70 75 80
Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp
85 90 95
Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu
100 105 110
Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser
115 120 125
<210> 74
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Streptavidin-binding peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is any amino acid
<220>
<221> VARIANT
<222> (7)..(7)
<223> Xaa is Gly or Glu
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> Xaa is Gly, Lys or Arg
<400> 74
Trp Xaa His Pro Gln Phe Xaa Xaa
1 5
<210> 75
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Streptavidin binding peptide, Strep-tag
<400> 75
Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly
1 5
<210> 76
<211> 17
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Sequential modules of streptavidin-binding peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> (9)..(9)
<223> Xaa is any amino acid
<220>
<221> REPEAT
<222> (9)..(9)
<223> Xaa is repeated 8 or 12 times
<400> 76
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Xaa Trp Ser His Pro Gln Phe Glu
1 5 10 15
Lys
<210> 77
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Sequential modules of streptavidin-binding peptide
<220>
<221> REPEAT
<222> (9)..(12)
<223> GGGS is repeated 2 or 3 times
<400> 77
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Trp Ser His Pro
1 5 10 15
Gln Phe Glu Lys
20
<210> 78
<211> 30
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Twin-Strep-tag
<400> 78
Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
20 25 30
<210> 79
<211> 30
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Twin-Strep-tag
<400> 79
Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
20 25 30
<210> 80
<211> 159
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Mutein Streptavidin Val44-Thr45-Ala46-Arg47
<400> 80
Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly
1 5 10 15
Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr
20 25 30
Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Thr Ala Arg Gly
35 40 45
Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro
50 55 60
Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys
65 70 75 80
Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr
85 90 95
Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser
100 105 110
Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp
115 120 125
Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys
130 135 140
Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln
145 150 155
<210> 81
<211> 126
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Mutein Streptavidin Val44-Thr45-Ala46-Arg47
<400> 81
Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe
1 5 10 15
Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Thr
20 25 30
Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp
35 40 45
Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val
50 55 60
Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser
65 70 75 80
Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu
85 90 95
Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val
100 105 110
Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser
115 120 125
<210> 82
<211> 127
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Mutein Streptavidin Val44-Thr45-Ala46-Arg47
<400> 82
Met Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val
20 25 30
Thr Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr
35 40 45
Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr
50 55 60
Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp
65 70 75 80
Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp
85 90 95
Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu
100 105 110
Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser
115 120 125
<210> 83
<211> 4
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Streptavidin-binding peptide
<400> 83
His Pro Gln Phe
1
<210> 84
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Streptavidin-binding peptide
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> Xaa is Trp, Lys or Arg
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is any amino acid
<220>
<221> VARIANT
<222> (7)..(7)
<223> Xaa is Gly or Glu
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> Xaa is Gly, Lys or Arg
<400> 84
Xaa Xaa His Pro Gln Phe Xaa Xaa
1 5
<210> 85
<211> 159
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Mutein Streptavidin Ile44-Gly45-Ala-46-Arg47
<400> 85
Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly
1 5 10 15
Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr
20 25 30
Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Ile Gly Ala Arg Gly
35 40 45
Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro
50 55 60
Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys
65 70 75 80
Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr
85 90 95
Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser
100 105 110
Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp
115 120 125
Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys
130 135 140
Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln
145 150 155
<210> 86
<211> 126
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Mutein Streptavidin Ile44-Gly45-Ala-46-Arg47 and Glu117, Gly120,
Try121 (mutein m1-9)
<400> 86
Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe
1 5 10 15
Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Thr
20 25 30
Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp
35 40 45
Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val
50 55 60
Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser
65 70 75 80
Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu
85 90 95
Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Glu Asn Ala Gly Tyr Ser Thr Leu Val
100 105 110
Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser
115 120 125
<210> 87
<211> 139
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Mutein Streptavidin Ile44-Gly45-Ala-46-Arg47 and Glu117, Gly120,
Try121 (mutein m1-9)
<400> 87
Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly
1 5 10 15
Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr
20 25 30
Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Thr Ala Arg Gly
35 40 45
Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro
50 55 60
Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys
65 70 75 80
Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr
85 90 95
Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser
100 105 110
Gly Thr Thr Glu Glu Asn Ala Gly Tyr Ser Thr Leu Val Gly His Asp
115 120 125
Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser
130 135
<210> 88
<211> 127
<212> PRT
<213> Streptomyces avidinii
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Minimal streptavidin
<400> 88
Met Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu
20 25 30
Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr
35 40 45
Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr
50 55 60
Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp
65 70 75 80
Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp
85 90 95
Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu
100 105 110
Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser
115 120 125
<210> 89
<211> 24
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Mutein Streptavidin
<220>
<221> REPEAT
<222> (9)..(12)
<223> GGGS is repeted 2 times
<400> 89
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala
1 5 10 15
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
20
<210> 90
<211> 9
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Strep-tag
<400> 90
Ala Trp Ala His Pro Gln Phe Gly Gly
1 5
<210> 91
<211> 116
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> VH anti-CD28 antibody CD28.3
<400> 91
Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Arg
1 5 10 15
Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Ile His
20 25 30
Trp Ile Lys Leu Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Phe
35 40 45
Tyr Pro Gly Ser Asn Asp Ile Gln Tyr Asn Ala Lys Phe Lys Gly Lys
50 55 60
Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu
65 70 75 80
Thr Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg
85 90 95
Asp Asp Phe Ser Gly Tyr Asp Ala Leu Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val
115
<210> 92
<211> 108
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> VL anti-CD28 antibody CD28.3
<400> 92
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Asn Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr His Leu Val Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Thr Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Cys
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 93
<211> 119
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> VH anti-CD3 antibody OKT3
<400> 93
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 94
<211> 106
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> VL anti-CD3 antibody OKT3
<400> 94
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn
100 105
<210> 95
<211> 248
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Variable Heavy chain of Fab fragment m13B8.2
<400> 95
Ala Met Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr
20 25 30
Thr Phe Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Val Ile Trp Ala Ser Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Val Pro
50 55 60
Phe Met Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val
65 70 75 80
Phe Phe Lys Leu Asn Ser Leu Gln Pro Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Lys Asn Asp Pro Gly Thr Gly Phe Ala Tyr Trp Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
180 185 190
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
195 200 205
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Ser Ala Trp Ser His Pro
210 215 220
Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala
225 230 235 240
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
245
<210> 96
<211> 218
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Variable Light chain of Fab Fragment m13B8.2
<400> 96
Ala Met Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Gly Glu Thr Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Glu Met Ile Tyr
20 25 30
Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu
35 40 45
Leu Val His Asp Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Thr Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Ala His Tyr Gly Asn
85 90 95
Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Ile
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Ser
210 215
<210> 97
<211> 118
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Variable Heavy chain of huOKT8
<400> 97
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Leu Tyr Ala Ser Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Tyr Tyr Val Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 98
<211> 107
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Variable Light chain of huOKT8
<400> 98
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Arg Ser Ile Ser Gln Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
Claims (154)
- T 세포를 농축하는 방법으로서,
상기 방법은,
(a) 제 1 선택을 수행하는 단계, 상기 제 1 선택은 1차 인간 T 세포(primary human T cell)를 포함하는 생물학적 샘플로부터 CD57- 또는 CD3+ T 세포 중의 어느 하나를 농축함으로써 농축된 T 세포 집단(enriched T cell population)을 생성함; 및
(b) 상기 농축된 T 세포 집단으로부터 상기 세포에 대해 제 2 선택을 수행하는 단계;
를 포함하되,
상기 제 1 선택은 CD57- T 세포를 농축하는 것을 포함하고 상기 제 2 선택은 상기 농축된 집단으로부터 CD3+ T 세포를 농축하는 것을 포함하거나; 또는
상기 제 1 선택은 CD3+ T 세포를 농축하는 것을 포함하고 상기 제 2 선택은 상기 농축된 T 세포 집단으로부터 CD57+ T 세포를 제거하는 것을 포함하며,
상기 방법은, 상기 생물학적 샘플보다 더 적은 CD57+ T 세포를 포함하며 CD3+ T 세포에 대해 농축된 고갈된 집단(depleted population)을 생성하는,
방법. - T 세포를 농축하는 방법으로서,
상기 방법은,
(a) 제 1 선택을 수행하는 단계, 상기 제 1 선택은 1차 인간 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터 CD57+ 세포를 제거함으로써 고갈된 집단을 생성하고, 상기 고갈된 집단은 상기 생물학적 샘플보다 더 적은 CD57+ 세포를 포함함; 및
(b) 상기 고갈된 집단으로부터 상기 세포에 대해 제 2 선택을 수행하는 단계, 상기 제 2 선택은 상기 고갈된 집단으로부터 CD3+ T 세포를 농축하는 것을 포함하고, 그에 의해서 상기 농축은 CD57-CD3+ T 세포의 농축된 집단을 생성함;
을 포함하는, 방법. - T 세포를 농축하는 방법으로서,
상기 방법은,
(a) 제 1 선택을 수행하는 단계, 상기 제 1 선택은 1차 인간 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터 CD3+ 세포를 농축함으로써 농축된 T 세포 집단을 생성하는 것을 포함함; 및
(b) 상기 농축된 집단으로부터 상기 세포에 대해 제 2 선택을 수행하는 단계, 상기 제 2 선택은 상기 농축된 샘플 세포 집단으로부터 CD57+ T 세포를 제거함으로써 고갈된 집단을 생성하며, 상기 고갈된 집단은 상기 생물학적 샘플 및/또는 상기 농축된 T 세포 집단보다 더 적은 CD57+ T 세포를 포함하고 CD3+ 세포에 대해 농축됨;
을 포함하는, 방법. - T 세포를 농축하는 방법으로서,
상기 방법은,
(a) 제 1 선택을 수행하는 단계, 상기 제 1 선택은 1차 인간 T 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터 CD57+ T 세포를 제거함으로써 제 1 고갈된 집단을 생성하는 것을 포함하고, 상기 제 1 고갈된 집단은 상기 생물학적 샘플보다 더 적은 CD57+ T 세포를 포함함;
(b) 상기 제1 고갈된 집단으로부터 상기 세포에 대해 제 2 선택을 수행하는 단계, 상기 제 2 선택은 상기 제1 고갈된 집단으로부터 (i) CD4+ T 세포 및 (ii) CD8+ T 세포 중의 하나를 농축시키는 것을 포함하고, 그에 의해서 상기 농축은 (i) CD4+ T 세포 및 (ii) CD8+ T 세포 중의 하나를 농축시킨 제 2 고갈된 집단 및 비-선택 집단을 생성함; 및
(c) 제 3 선택을 수행하는 단계, 상기 제 3 선택은 상기 비-선택 집단으로부터 상기 (i) CD4+ T 세포 및 (ii) CD8+ T 세포 중의 다른 하나를 농축시키는 것을 포함하고, 그에 의해서 상기 농축은 상기 (i) CD4+ T 세포 및 (ii) CD8+ T 세포 중의 다른 하나를 농축시킨 제 3 고갈된 집단을 생성함;
를 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단)은,
(i) (약) 5% 미만의 CD57+ T 세포;
(ii) 상기 생물학적 샘플 중에 존재하는 CD57+ T 세포의 빈도(frequency)의 (약) 35% 미만인 빈도의 CD57+ T 세포;
(iii) CD4+ T 세포, 여기서 상기 CD4+ T 세포의 (약) 95% 이상은 CD57-임; 및
(iv) CD8+ T 세포, 여기서 상기 CD8+ T 세포의 (약) 95% 이상은 CD57-임;
중의 하나 이상을 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 5 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 생물학적 샘플은 성분채집술 생성물(apheresis product) 또는 백혈구 성분채집술 생성물(leukapheresis product)을 포함하는 방법. - T 세포를 농축하는 방법으로서,
상기 방법은, 1차 인간 T 세포를 포함하는 성분채집술 생성물 또는 백혈구 성분채집술 생성물을 포함하는 생물학적 샘플로부터 CD57+ T 세포를 제거함으로써 T 세포의 고갈된 집단을 생성하는 단계를 포함하되,
상기 고갈된 집단은 상기 생물학적 샘플보다 더 적은 CD57+ T 세포를 포함하고 상기 고갈된 집단은,
(i) (약) 5% 미만의 CD57+ T 세포;
(ii) 상기 생물학적 샘플에 존재하는 CD57+ T 세포의 빈도의 (약) 35% 미만인 빈도의 CD57+ T 세포;
(iii) CD4+ T 세포, 여기서 상기 CD4+ T 세포의 (약) 95% 이상은 CD57-임; 및
(iv) CD8+ T 세포, 여기서 상기 CD8+ T 세포의 (약) 95% 이상은 CD57-임;
중의 하나 이상을 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 7 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 고갈된 집단의 상기 CD4+ T 세포의 (약) 95% 이상은 CD57-CD4+ T 세포를 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 7 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 고갈된 집단의 상기 CD8+ T 세포의 (약) 95% 이상은 CD57-CD8+ T 세포를 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 9 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 고갈된 집단의 상기 CD4+ T 세포의 (약) 95% 이상 및 상기 CD8+ T 세포의 (약) 95% 이상은 각각 CD57-CD4+ T 세포 및 CD57-CD8+ T 세포를 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 10 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 고갈된 집단의 상기 CD3+ T 세포의 (약) 95% 이상은 CD57-CD3+ T 세포를 포함하는, 방법. - 제 7 항 내지 제 11 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 고갈된 집단은 제 1 고갈된 집단이고 상기 방법은 상기 제 1 고갈된 집단으로부터 CD4+ T 세포를 선택함으로써 CD57-CD4+ T 세포의 농축된 집단인 제 2 고갈된 집단 및 비-선택 집단을 생성하는 것을 더 포함하는, 방법. - 제 12 항에 있어서,
상기 방법은 상기 비-선택 집단으로부터 CD8+ T 세포를 선택함으로써 CD57-CD8+ T 세포의 농축된 집단인 제 3 고갈된 집단 및 제 2 비-선택 집단을 생성하는 것을 더 포함하는, 방법. - 제 7 항 내지 제 11 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 고갈된 집단은 제 1 고갈된 집단이고, 상기 방법은 상기 제 1 고갈된 집단으로부터 CD8+ T 세포를 선택함으로써 CD57-CD8+ T 세포의 농축된 집단인 제 2 고갈된 집단 및 비-선택 집단을 생성하는 것을 더 포함하는, 방법. - 제 14 항에 있어서,
상기 방법은 상기 비-선택 집단으로부터 CD4+ T 세포를 선택함으로써 CD57-CD4+ T 세포의 농축된 집단인 제 3 고갈된 집단 및 제 2 비-선택 집단을 생성하는 것을 더 포함하는, 방법. - 제 7 항 내지 제 11 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 고갈된 집단은 제 1 고갈된 집단이고, 상기 방법은 상기 제 1 고갈된 집단으로부터 CD3+ T 세포를 선택함으로써 CD57-CD3+ T 세포의 농축된 집단인 제 2 고갈된 집단 및 비-선택 집단을 생성하는 것을 더 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 16 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단) 중의 상기 CD57+ T 세포의 빈도는 상기 생물학적 샘플 중의 CD57+ T 세포의 빈도의 약 35%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 이하인, 방법. - 제 1 항 내지 제 17 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단)은 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1% 이하, 약 0.1% 이하 또는 약 0.01% 이하의 CD57+ T 세포를 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 18 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단)은 CD57+ T 세포가 부재하거나 또는 본질적으로 부재하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 19 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단) 중의 나이브-유사(naive-like) T 세포의 빈도는 상기 생물학적 샘플 중의 상기 나이브-유사 T 세포의 빈도보다 적어도 약 또는 약 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 많은 것인, 방법. - 제 20 항에 있어서,
상기 나이브-유사 T 세포는 CD45RA, CD27, CD28, 및 CCR7로부터 선택된 마커(marker) 중의 하나 이상에 대해 표면 양성인, 방법. - 제 1 항 내지 제 21 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단) 중의 CD27+ T 세포의 빈도는 상기 생물학적 샘플 중의 각 세포의 빈도보다 적어도 약 또는 약 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 많은 것인, 방법. - 제 1 항 내지 제 22 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단) 중의 CD28+ T 세포의 빈도는 상기 생물학적 샘플 중의 각 세포의 빈도보다 적어도 약 또는 약 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 많은 것인, 방법. - 제 1 항 내지 제 23 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 고갈된 집단(선택적으로 상기 제 1 고갈된 집단, 상기 제 2 고갈된 집단, 또는 상기 제 3 고갈된 집단) 중의 CD27+/CD28+ T 세포의 빈도는 상기 생물학적 샘플 중의 각 세포의 빈도보다 적어도 약 또는 약 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 많은 것인, 방법. - 제 4 항 내지 제 6 항, 제 13 항, 제 15 항 및 제 17 항 내지 제 24 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 제 2 고갈된 집단 및 상기 제 3 고갈된 집단을, 선택적으로 (약) 1:3 내지 (약) 3:1, 선택적으로 (약) 1:1의 비로 조합함으로써, 상기 제 2 고갈된 집단 및 상기 제 3 고갈된 집단을 포함하는 고갈된 집단을 생성하는 것을 더 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 25 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은, (약) 90% 이상, (약) 95% 이상, (약) 97% 이상, (약) 99% 이상 또는 (약) 99.9% 이상의 CD57-CD4+ T 세포를 포함하는 T 세포 조성물을 생성하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 25 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은, (약) 90% 이상, (약) 95% 이상, (약) 97% 이상, (약) 99% 이상 또는 (약) 99.9% 이상의 CD57-CD8+ T 세포를 포함하는 T 세포 조성물을 생성하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 25 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은, (약) 90% 이상, (약) 95% 이상, (약) 97% 이상, (약) 99% 이상 또는 (약) 99.9% 이상의 CD57-CD3+ T 세포를 포함하는 T 세포 조성물을 생성하는, 방법. - 제 28 항에 있어서,
상기 조성물 중의 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 비율은 3:1 내지 1:3, 2:1 내지 1:2, 1.5:1 내지 1:1.5 또는 1.2:1 내지 1:1.2(각각의 수치를 포함)인, 방법. - 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서,
상기 조성물 중의 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 1:1인, 방법. - 제 1 항 내지 제 30 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 1차 T 세포는 인간 대상체 유래인, 방법. - 제 1 항 내지 제 31 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 1차 T 세포는 질환 또는 병태를 갖는 대상체 유래인, 방법. - 제 32 항에 있어서,
상기 질환 또는 병태는 암인, 방법. - 제 1 항 내지 제 30 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 1차 T 세포는 건강한 대상체 유래인, 방법. - 제 1 항 내지 제 34 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 생물학적 샘플은 CD4+ 및 CD8+ 세포를 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 35 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 CD57+ T 세포의 제거는 면역 친화도-기반 선택(immunoaffinity-based selection)을 포함하는, 방법. - 제 36 항에 있어서,
상기 면역 친화도-기반 선택은 세포를 CD57에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시키고 상기 항체에 결합되지 않은 세포을 회수함으로써, 음성 선택을 수행하는 것을 포함하되, 상기 회수된 세포들은 상기 CD57+ 세포에 대해 고갈되는 것인, 방법. - 제 1 항 내지 제 37 항 중의 어느 한 항에 있어서,
선택적으로 상기 제 1, 제 2 및/또는 제 3 선택에서, 상기 세포의 농축은 면역 친화도-기반 선택을 포함하는, 방법. - 제 38 항에 있어서,
상기 제 1, 제 2 및/또는 제 3 선택은 CD4 또는 CD8 T 세포를 농축하고, 상기 면역 친화도-기반 선택은 세포를 CD4 또는 CD8에 각각 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시킴으로써 수행되고, 상기 항체에 결합한 세포를 회수함으로써 양성 선택을 수행하되, 상기 회수된 세포는 상기 CD4+ 세포 또는 상기 CD8+ 세포에 대해 농축되는 것인, 방법. - 제 39 항에 있어서,
상기 선택은 CD3 T 세포를 농축하고, 상기 면역 친화도-기반 선택은 세포를 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시킴으로써 수행되고, 상기 항체에 결합한 세포를 회수함으로써 양성 선택을 수행하되, 상기 회수된 세포는 상기 CD3+ 세포에 대해 농축되는 것인, 방법. - 제 37 항 내지 제 40 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 항체는 고체 표면 상에서 고정되고, 선택적으로 상기 고체 표면은 자성 입자(magnetic particle)인, 방법. - 제 37 항 내지 제 40 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 항체는 친화도 크로마토그래피 매트릭스(affinity chromatography matrix) 상에 고정되거나 또는 거기에 부착되는 것인, 방법. - 제 42 항에 있어서,
상기 항체는 상기 매트릭스 상에 고정된 결합제와 가역성 결합을 형성할 수 있는 하나 이상의 결합 파트너(binding partner)를 더 포함하고, 그에 의해서 상기 항체는 상기 접촉 동안 상기 크로마토그래피 매트릭스에 가역적으로 결합되는 것인, 방법. - 제 43 항에 있어서,
상기 결합제는 상기 결합 파트너와 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘 뮤테인(streptavidin mutein)인, 방법. - 제 44 항에 있어서,
상기 스트렙타비딘 뮤테인은, 서열 번호 66에 제시된 아미노산의 서열에서 스트렙타비딘에서의 위치와 관련하여 위치 44 내지 47에 대응하는 서열 위치에서 아미노산 서열 lle44-Gly45-Ala46-Arg47을 포함하거나; 또는
상기 스트렙타비딘 뮤테인은, 서열 번호 66에 제시된 아미노산의 서열에서 스트렙타비딘에서의 위치와 관련하여 위치 44 내지 47에 대응하는 서열 위치에서 아미노산 서열 Va144-Thr45-Ala46-Arg47을 포함하는,
방법. - 제 43 항 내지 제 45 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 결합 파트너는 스트렙타비딘 결합-펩티드인, 방법. - 제 46 항에 있어서,
상기 스트렙타비딘-결합 펩티드는 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 69), Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 78), SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK(서열 번호 79), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 70), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 71) 및 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 72)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 방법. - 제 46 항 또는 제 47 항에 있어서,
상기 스트렙타비딘-결합 펩티드는 상기 서열 SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK(서열 번호 79)을 갖는 것인, 방법. - 제 43 항 내지 제 48 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플 중의 세포를 상기 친화도 크로마토그래피 매트릭스에 접촉시킨 후, 경쟁 시약(competition reagent)을 적용하여 상기 결합 파트너와 결합 시약 사이의 결합을 파괴함으로서, 상기 항체에 결합된 세포를 회수하는 것을 더 포함하는, 방법. - 제 49 항에 있어서,
상기 경쟁 시약은 비오틴(biotin) 또는 비오틴 유사체인, 방법. - 제 42 항 내지 제 50 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 크로마토그래피 매트릭스는, 칼럼인 분리 용기(separation vessel)에 포장되는, 방법. - 제 1 항 내지 제 51 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 1차 T 세포를 포함하는 상기 생물학적 샘플은 동결 방지제(cyroprotectant)로 제형화된 샘플인, 방법. - 제 6 항 내지 제 52 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 성분채집술 샘플 또는 백혈구 성분채집술 샘플은 동결 방지제로 제형화된 샘플인, 방법. - T 세포를 자극하는 방법으로서,
상기 방법은, 자극 조건하에 입력 조성물(input composition)의 T 세포를 인큐베이션(incubation)함으로써, T 세포의 자극된 집단을 생성하되, 상기 입력 조성물은 제 1 항 내지 제 53 항 중의 어느 한 항의 방법에 의해서 생성되는, 방법. - 제 54 항에 있어서,
상기 입력 조성물은,
(i) (약) 5% 미만의 CD57+ T 세포;
(ii) (약) 95% 이상의 CD57- T 세포;
(iii) (약) 90% 이상의 CD57-CD4+ T 세포;
(iv) (약) 90% 이상의 CD57-CD8+ T 세포; 및
(v) 약 90% 이상의 CD57-CD3+ T 세포;
중의 하나 이상을 포함하는, 방법. - T 세포를 자극하는 방법으로서,
자극 조건하에 입력 조성물의 T 세포를 인큐베이션함으로써, T 세포의 자극된 집단을 생성하는 것을 포함하되,
상기 입력 조성물은,
(i) (약) 5% 미만의 CD57+ T 세포;
(ii) (약) 95% 이상의 CD57- T 세포;
(iii) (약) 90% 이상의 CD57-CD4+ T 세포;
(iv) (약) 90% 이상의 CD57-CD8+ T 세포; 및
(v) (약) 90% 이상의 CD57-CD3+ T 세포;
중의 하나 이상을 포함하는, 방법. - 제 56 항에 있어서,
상기 자극 조건은 자극 시약의 존재를 포함하고, 상기 자극 시약은 TCR 복합체의 하나 이상의 성분들의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인 및 하나 이상의 공자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 것인, 방법. - 제 57 항에 있어서,
상기 자극 시약은, (i) TCR 복합체의 멤버에 특이적으로 결합하고, 선택적으로 CD3에 특이적으로 결합하는 1차 제제 및 (ii) T 세포 공자극 분자에 특이적으로 결합하는 2차 제제를 포함하며, 선택적으로 상기 공자극 분자는 CD28, CD137(4-1-BB), OX40 또는 ICOS로부터 선택되는, 방법. - 제 58 항에 있어서,
상기 1차 및 2차 제제 중의 하나 이상은 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는, 방법. - 제 58 항 또는 제 59 항에 있어서,
상기 1차 제제는 항-CD3 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고 상기 2차 제제는 항-CD28 항체 또는 그의 항원-결합 단편인, 방법. - 제 59 항 또는 제 60 항에 있어서,
상기 항원 결합 단편은 Fab 단편, Fv 단편, 및 단쇄 Fv 단편(scFv)으로 구성된 군으로부터 선택된 1가 항체 단편인, 방법. - 제 58 항 내지 제 61 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 1차 제제는 항-CD3 Fab이고 상기 2차 제제는 항-CD28 Fab를 포함하는, 방법. - 제 58 항 내지 제 62 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 1차 제제 및 2차 제제는 각각 고체 지지체의 표면에 존재하거나 또는 그 위에 부착되는, 방법. - 제 63 항에 있어서,
상기 고체 지지체는 비드(bead), 선택적으로는 상자성 비드(paramagnetic bead)이거나 또는 그를 포함하는, 방법. - 제 64 항에 있어서,
상기 고체 지지체는 표면 부착된 항-CD3 및 항-CD28 항체를 갖는 상자성 비드이고, 상기 자극 시약은 약 3:1 이하의 비드 대 세포의 비율로 존재하는, 방법. - 제 65 항에 있어서,
상기 자극 시약은 (약) 1:1의 비드 대 세포의 비율로 존재하는, 방법. - 제 58 항 내지 제 62 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 1차 제제 및 상기 2차 제제는 복수의 스트렙타비딘 분자 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 포함하는 올리고머 입자 시약의 표면 위에 가역적으로 결합되는, 방법. - 제 67 항에 있어서,
상기 스트렙타비딘 분자 또는 상기 스트렙타비딘 뮤테인 분자는, 비오틴, 아비딘(avidin), 비오틴 유사체 또는 비오틴 뮤테인, 아비딘 유사체 또는 아비딘 뮤테인 및/또는 그들의 생물학적 활성 단편에 결합하거나 또는 그에 결합할 수 있는 것인, 방법. - 제 67 항 또는 제 68 항에 있어서,
상기 스트렙타비딘 분자는, 서열 번호 66에 제시된 아미노산의 서열과 관련하여 잔기 44 내지 47에 상응하는 아미노산 잔기에 아미노산 서열 Val44-Thr45-Ala46-Arg47 또는 Ile44-Gly45-Ala46-Arg47을 포함하는, 방법. - 제 67 항 내지 제 69 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 스트렙타비딘 뮤테인 분자는,
a) 서열 번호 70-73, 78, 85-89 중의 임의의 것에 제시된 아미노산의 서열;
b) 서열 번호 70-73, 78, 85-89 중의 임의의 것과 적어도 약 또는 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내고, Val44-Thr45-Ala46-Arg47 또는 Ile44-Gly45-Ala46-Arg47에 상응하는 아미노산 서열을 함유하고, 비오틴, 비오틴 유사체 또는 스트렙타비딘-결합 펩티드와 가역적으로 결합하는 아미노산 서열; 또는
c) 비오틴, 비오틴 유사체 또는 스트렙타비딘-결합 펩티드와 가역적으로 결합하는 상기 a) 또는 b)의 작용성 단편;
을 포함하는, 방법. - 제 67 항 내지 제 70 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 서열 번호 73에 제시된 아미노산의 서열을 포함하는, 방법. - 제 67 항 내지 제 70 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 서열 번호 78에 제시된 아미노산의 서열을 포함하는, 방법. - 제 67 항 내지 제 72 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 1차 제제 및 상기 2차 제제는 각각 스트렙타비딘-결합 펩티드를 포함하는, 방법. - 제 73 항에 있어서,
상기 스트렙타비딘-결합 펩티드는 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 69), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 70), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 71) 및 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호 89)으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법. - 제 67 항 내지 제 74 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 1차 제제는 항-CD3 Fab를 포함하고, 상기 2차 제제는 항-CD28 Fab을 포함하는, 방법. - 제 67 항 내지 제 75 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 올리고머 입자 시약은 (약) 60 nm 이상, (약) 70 nm 이상, (약) 80 nm 이상, 또는 (약) 90 nm 이상의 반경을 포함하는, 방법. - 제 67 항 내지 제 76 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 올리고머 입자 시약은 적어도 약 또는 약 5×107 g/mol 또는 적어도 약 또는 약 1×108 g/mol; 또는 5×107 g/mol 내지 5×108 g/mol, 1×108 g/mol 내지 5×108 g/mol 또는 1×108 g/mol 내지 2×108 g/mol(각각의 수치를 포함함)의 분자량을 포함하는, 방법. - 제 67 항 내지 제 77 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 올리고머 입자 시약은 적어도 약 또는 약 500 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사량체(streptavidin mutein tetramer), 적어도 약 또는 약 1,000 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사량체, 적어도 약 또는 약 1,500 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사량체 또는 적어도 약 또는 약 2,000 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사량체; 또는 1,000 내지 20,000 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사량체, 1,000 내지 10,000 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사량체 또는 2,000 내지 5,000 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사량체를 포함하는, 방법. - 제 61 항 내지 제 78 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 세포로부터 상기 자극 시약을 분리하는 것을 더 포함하되, 상기 분리는 상기 세포를 물질(substance)과 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 물질은 상기 1차 및 2차 시약과 상기 올리고머 입자 시약 사이의 결합을 역전(reversing)시킬 수 있는 것인, 방법. - 제 79 항에 있어서,
상기 물질은 자유 결합 파트너(free binding partner)이고/이거나 경쟁 제제(competition agent)인, 방법. - 제 79 항 또는 제 80 항에 있어서,
상기 물질은 스트렙타비딘-결합 펩티드, 비오틴, 또는 그의 생물학적 활성 단편(biologically active fragment), 또는 비오틴 유사체(biotin analog) 또는 그의 생물학적 활성 단편이거나 또는 그를 포함하는, 방법. - 제 81 항에 있어서,
상기 물질은 비오틴 또는 비오틴 유사체이거나 또는 그를 포함하는, 방법. - 제 56 항 내지 제 82 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 자극 조건은 하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재를 포함하는, 방법. - 제 56 항 내지 제 83 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 자극 조건은 재조합 IL-2, IL-7 및 IL-15 중의 하나 이상의 존재를 포함하는, 방법. - T 세포를 유전자 조작하는 방법으로서,
상기 방법은, 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드(heterologous polynucleotide)를 제 1 항 내지 제 53 항 중의 어느 한 항의 방법에 의해서 생산된 T 세포 조성물 유래의 T 세포의 집단으로 도입시킴으로써, T 세포의 조작된 집단을 생성하는 것을 포함하는, 방법. - T 세포를 유전자 조작하는 방법으로서,
상기 방법은, 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 제 54 항 내지 제 84 항 중의 어느 하나의 자극된 T 세포 집단 유래의 T 세포의 집단으로 도입시킴으로써, T 세포의 조작된 집단을 생성하는 것을 포함하는, 방법. - 제 85 항 또는 제 86 항에 있어서,
상기 도입은 상기 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 사용한 형질도입(transduction)을 포함하는, 방법. - 제 87 항에 있어서,
상기 바이러스 벡터는 감마레트로바이러스 벡터(gammaretroviral vector) 또는 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)인, 방법. - 제 87 항 또는 제 88 항에 있어서,
상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인, 방법. - 제 85 항 내지 제 89 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 도입 후 최대 96 시간 동안, 선택적으로 (약) 37℃±2℃의 온도에서 형질도입된 세포를 포함하는 상기 조성물을 인큐베이션하는 것을 더 포함하는, 방법. - 제 90 항에 있어서,
상기 인큐베이션은 상기 도입 후 최대 72 시간 동안 수행되는, 방법. - 제 90 항에 있어서,
상기 인큐베이션은 상기 도입 후 최대 48 시간 동안 수행되는, 방법. - 제 90 항에 있어서,
상기 인큐베이션은 상기 도입 후 최대 24 시간 동안 수행되는, 방법. - 제 90 항 내지 제 93 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 인큐베이션은 상기 T 세포의 게놈(genome)으로 상기 바이러스 벡터를 통합(integration)시키는, 방법. - 제 85 항 내지 제 94 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포의 증식 또는 증폭을 촉진시키는 조건하에서, 상기 조작된 집단의 세포를 배양함으로써, 세포의 증폭된 집단을 생성하는, 방법. - 제 95 항에 있어서,
상기 배양은, 선택적으로 IL-2, IL-7 및 IL-15 중 하나 이상을 포함하는, 하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재하에서 수행되는, 방법. - 제 95 항 또는 제 96 항에 있어서,
상기 증식 또는 증폭은, 상기 배양의 개시(initiation)시에서와 비교하여, 상기 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 생존가능한 T 세포의 수에서 약 또는 적어도 (약) 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 또는 (약) 5-배 초과의 증가를 초래하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 97 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 방법에 의해서 생산된 세포의 집단을 수확(harvesting) 또는 수집(collecting)하는 것을 더 포함하는, 방법. - 제 98 항에 있어서,
상기 수확 또는 수집은 동결 방지제(cryoprotectant)의 존재하에 동결 보존(cryopreservation)을 위해 상기 세포를 제형화하는 것을 더 포함하는, 방법. - 제 98 항 또는 제 99 항에 있어서,
상기 수확 또는 수집된 세포는 약학적으로 허용가능한 부형제의 존재하에 제형화되는, 방법. - 제 85 항 내지 제 100 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 수용체는, 질환, 장애 또는 병태의 세포 또는 조직과 관련되고/되거나, 그에 특이적이고/이거나 그에서 발현되는 표적 항원에 결합할 수 있는 것인, 방법. - 제 101 항에 있어서,
상기 질환, 장애 또는 병태는 감염성 질환 또는 장애, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 종양 또는 암인, 방법. - 제 101 항 또는 제 102 항에 있어서,
상기 표적 항원은 종양 항원인, 방법. - 제 101 항 내지 제 103 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 표적 항원은, αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9, CAIX 또는 G250으로도 공지), 암 고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸 4(chondroitin sulfate proteoglycan 4, CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 타입 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 표피 당단백질 2(EPG-2), 표피 당단백질 40(EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; FC 수용체 상동물 5 또는 FCRH5로도 공지), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 결합 수용체 클래스 5D(GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 2량체, 인간 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나제 삽입 도메인 수용체(kinase insert domain receptor, kdr), 카파 경쇄, L1 세포 부착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 패밀리 8 멤버 A를 함유하는 루신 리치 반복(Leucine Rich Repeat Containing 8 Family Member A, LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종 관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 시토메갈로 바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 2 그룹 D 멤버(NKG2D) 리간드, 멜란 A (MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스트론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나제 유사 고아 수용체 1(ROR1), 서바이빈(survivin), 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지), 종양 관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나제 관련 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75로도 공지), 티로시나제 관련 단백질 2(TRP2, 도파크롬 타우토머라제, 도파크롬 델타 이성화 효소 또는 DCT로도 공지), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체 특이적 또는 병원체 발현 항원 또는 범용 태그 관련 항원 및/또는 비오티닐화 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체(pathogen)로부터 선택되는, 방법. - 제 101 항 내지 제 103 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 수용체는 작용성 비-TCR 항원 수용체(functional non-TCR antigen receptor) 또는 TCR 또는 그의 항원-결합 단편이거나 또는 그를 포함하는, 방법. - 제 101 항 내지 제 104 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor; CAR)인, 방법. - 제 101 항 내지 제 106 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 수용체는, 항원-결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인(extracellular domain), 스페이서 및/또는 힌지 영역(hinge region), 막 관통 도메인(transmembrane domain), 및 공자극 신호 전달 영역(costimulatory signaling region)을 포함하는 세포내 신호 전달 도메인(intracellular signaling domain)을 포함하는, 방법. - 제 107 항에 있어서,
상기 세포외 도메인은 scFv를 포함하는 항원-결합 도메인을 포함하는, 방법. - 제 107 항 또는 제 108 항에 있어서,
상기 세포내 신호 전달 도메인은, 1차 신호 전달 도메인, T 세포에서 1차 활성화 신호를 유도할 수 있는 신호 전달 도메인, T 세포수용체(TCR) 성분의 신호 전달 도메인 및/또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif; ITAM)를 포함하는 신호 전달 도메인이거나 또는 그를 포함하는, 방법. - 제 107 항 내지 제 109 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 세포내 신호 전달 도메인은, CD3 쇄(chain), 선택적으로 CD3-제타(CD3ζ) 쇄 또는 그의 신호 전달 부분의 세포내 신호 전달 도메인이거나 또는 그를 포함하는, 방법. - 제 107 항 내지 제 110 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 공자극 신호 전달 영역은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS 또는 그의 신호 전달 부분의 세포내 신호 전달 도메인을 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 53 항 중의 어느 한 항의 방법에 의해서 생산된, 세포의 조성물.
- 제 112 항에 있어서,
상기 세포는 CD57-CD4+ T 세포를 포함하는, 조성물. - 제 112 항에 있어서,
상기 세포는 CD57-CD8+ T 세포를 포함하는, 조성물. - 제 112 항에 있어서,
상기 세포는 CD57-CD3+ T 세포를 포함하는, 조성물. - 제 85 항 내지 제 111 항 중의 어느 한 항의 방법에 의해서 생산된 T 세포의 조작된 집단을 포함하는 조성물.
- 재조합 수용체를 발현하는 CD4+ T 세포 및 재조합 수용체를 발현하는 CD8+ T 세포를 포함하는 치료학적 T 세포 조성물로서,
상기 조성물 중의 총 수용체+/CD8+ 세포의 적어도 80%는 CD57-이고 상기 조성물 중의 총 수용체+/CD4+ 세포의 적어도 80%는 CD57-인, 치료학적 T 세포 조성물. - 제 117 항에 있어서,
상기 조성물 중의 상기 세포의 적어도 또는 적어도 약 80%, 적어도 또는 적어도 약 85%, 적어도 또는 적어도 약 90%, 적어도 또는 적어도 약 95%, 적어도 또는 적어도 약 96%, 적어도 또는 적어도 약 97%, 적어도 또는 적어도 약 98%, 적어도 또는 적어도 약 99%, 약 100%, 또는 100%는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포인, 치료학적 T 세포 조성물. - 재조합 수용체를 발현하는 CD3+ T 세포를 포함하는 치료학적 T 세포 조성물로서,
상기 조성물 중의 총 수용체+/CD3+ 세포의 적어도 80%는 CD57-인, 치료학적 T 세포 조성물. - 제 119 항에 있어서,
상기 조성물 중의 상기 세포의 적어도 또는 적어도 약 80%, 적어도 또는 적어도 약 85%, 적어도 또는 적어도 약 90%, 적어도 또는 적어도 약 95%, 적어도 또는 적어도 약 96%, 적어도 또는 적어도 약 97%, 적어도 또는 적어도 약 98%, 적어도 또는 적어도 약 99%, 약 100%, 또는 100%는 CD3+ T 세포인, 치료학적 T 세포 조성물. - 제 117 항 내지 제 120 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물 중의 상기 수용체+/CD4+ 세포 대 수용체+/CD8+ 세포의 비율은 약 1:3 내지 약 3:1인, 치료학적 T 세포 조성물. - 제 117 항 내지 제 121 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물 중의 상기 수용체+/CD4+ 세포 대 수용체+/CD8+ 세포의 비율은 (약) 1:1인, 치료학적 T 세포 조성물. - 제 117 항 내지 제 122 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 단백질은, 질환, 장애 또는 병태의 세포 또는 조직과 관련되고/되거나, 그에 특이적이고/이거나 그에서 발현되는 표적 항원에 결합할 수 있는 재조합 수용체이거나 또는 그를 포함하는, 치료학적 T 세포 조성물. - 제 117 항 내지 제 123 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 단백질은 키메라 항원 수용체(CAR)인, 치료학적 T 세포 조성물. - 제 117 항 내지 제 124 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물 중의 생존가능한 T 세포의 수는 (약) 10×106 세포 내지 (약) 200×106 세포이고, 선택적으로 상기 조성물 중의 생존가능한 T 세포의 수는 (약) 10×106 세포 내지 (약) 100×106 세포, (약) 10×106 세포 내지 (약) 70×106 세포, (약) 10×106 세포 내지 (약) 50×106 세포, (약) 50×106 세포 내지 (약) 200×106 세포, (약) 50×106 세포 내지 (약) 100×106 세포, (약) 50×106 세포 내지 (약) 70×106 세포, (약) 70×106 세포 내지 (약) 200×106 세포, (약) 70×106 세포 내지 (약) 100×106 세포, 또는 (약) 100×106 세포 내지 (약) 200×106 세포(각각의 수치를 포함함)인, 치료학적 T 세포 조성물. - 제 117 항 내지 제 125 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물의 부피는 1.0 mL 내지 10 mL(수치를 포함함), 선택적으로 (약) 2 mL, (약) 3 mL, (약) 4 mL, (약) 5 mL, (약) 6 mL, (약) 7 mL, (약) 8 mL, (약) 9 mL, 또는 (약) 10 mL, 또는 상기 수치들의 임의의 것들 사이의 임의의 값인, 치료학적 T 세포 조성물. - 질환, 장애 또는 병태를 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법으로서,
상기 방법은 상기 대상체에 제 85 항 내지 제 111 항 중의 어느 한 항의 방법에 의해서 생산된 T 세포의 조작된 집단 유래의 T 세포의 용량을 투여하는 것을 포함하는, 방법. - 질환, 장애 또는 병태를 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법으로서,
상기 방법은 상기 대상체에 제 112 항 내지 제 126 항 중의 어느 한 항의 조성물 유래의 T 세포의 용량을 투여하는 것을 포함하는, 방법. - 제 127 항 또는 제 128 항에 있어서,
상기 재조합 수용체, 선택적으로 상기 CAR은, 상기 질환 또는 병태의 세포와 관련되거나, 또는 그 위에 발현되거나 또는 존재하는 항원을 특이적으로 인식하거나 또는 항원에 특이적으로 결합하는 것인, 방법. - 제 127 항 내지 제 129 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포의 용량은, (약) 5×106 내지 (약) 1.5×108 재조합 수용체-발현 T 세포, (약) 5×106 내지 (약) 1×108 재조합 수용체-발현 T 세포, (약) 5×106 내지 (약) 50×106 재조합 수용체-발현 T 세포, (약) 5×106 내지 (약) 25×106 재조합 수용체-발현 T 세포, (약) 5×106 내지 (약) 10×106 재조합 수용체-발현 T 세포, (약) 10×106 내지 (약) 1.5×108 재조합 수용체-발현 T 세포, (약) 10×106 내지 (약) 1×108 재조합 수용체-발현 T 세포, (약) 10×106 내지 (약) 50×106 재조합 수용체-발현 T 세포, (약) 10×106 내지 (약) 25×106 재조합 수용체-발현 T 세포, (약) 25×106 내지 (약) 1.5×108 재조합 수용체-발현 T 세포, (약) 25×106 내지 (약) 1×108 재조합 수용체-발현 T 세포, (약) 25×106 내지 (약) 50×106 재조합 수용체-발현 T 세포, (약) 50×106 내지 (약) 1.5×108 재조합 수용체-발현 T 세포, (약) 50×106 내지 (약) 1×108 재조합 수용체-발현 T 세포, (약) 1×108 내지 (약) 1.5×108 재조합 수용체-발현 T 세포(각각의 수치를 포함함)를 포함하는, 방법. - 제 127 항 내지 제 130 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포의 용량의 T 세포는 총 T 세포, 총 생존가능한 T 세포, 총 생존가능한 재조합 수용체 발현 T 세포, 총 생존가능한 재조합 수용체 발현 CD4+ T 세포, 또는 총 생존가능한 재조합 수용체 발현 CD8+ T 세포인, 방법. - 제 127 항 내지 제 131 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포의 용량은 치료되는 대상체에게 동종이계(allogeneic)인, 방법. - 제 127 항 내지 제 131 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포의 용량은 치료되는 대상체에게 자가인(autologous)인, 방법. - 제 127 항 내지 제 133 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 질환 또는 병태는 암인, 방법. - 대상체에서 질환, 장애 또는 병태를 치료하기 위한 제 85 항 내지 제 111 항 중의 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 조작된 T 세포의 집단 또는 제 112 항 내지 제 126 항 중의 어느 한 항의 조성물의 용도.
- 대상체에서 질환, 장애 또는 병태 치료용 약제의 제조를 위한 제 85 항 내지 제 111 항 중의 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 조작된 T 세포의 집단의 용도.
- 대상체에서 질환, 장애 또는 병태를 치료하기 위한 제 112 항 내지 제 126 항 중의 어느 한 항의 조성물.
- 제 135 항 내지 제 137 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 수용체, 선택적으로 상기 CAR는, 상기 질환 또는 병태와 관련되거나, 또는 그의 세포 위에 발현되거나 또는 그 위에 존재하는 항원을 특이적으로 인식하거나 또는 그에 특이적으로 결합하는 것인, 용도 또는 조성물. - 제 135 항 내지 제 138 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 질환 또는 병태는 암인, 용도 또는 조성물. - 제 135 항 내지 제 139 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 대상체에 자가인인, 용도 또는 조성물. - 제 135 항 내지 제 140 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 대상체에 동종이계인, 용도 또는 조성물. - 제조 물품으로서,
(i) CD57, 및 CD3, CD4 및/또는 CD8 중 하나 이상에 특이적인 세포의 면역친화도-기반 선택을 위한 하나 이상의 시약; 및
(ii) 제 1 항 내지 제 141 항 중의 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 상기 하나 이상의 시약의 사용을 위한 지침;
을 포함하는, 제조 물품. - (i) CD57, 및 CD3, CD4 및/또는 CD8 중 하나 이상에 특이적인 세포의 면역친화도-기반 선택을 위한 하나 이상의 시약;
(ii) TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인 및 하나 이상의 공자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 자극 시약; 및
(iii) 제 1 항 내지 제 141 항 중의 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 상기 하나 이상의 시약의 사용을 위한 지침;
을 포함하는, 제조 물품. - 제 142 항 또는 제 143 항에 있어서,
면역친화도-기반 선택을 위한 상기 시약은 CD57, CD3, CD4 또는 CD8에 특이적으로 결합할 수 있는 항체이거나 또는 그를 포함하는, 제조 물품. - 제 142 항 내지 제 144 항 중의 어느 한 항에 있어서,
면역친화도-기반 선택을 위한 상기 시약은 CD57에 특이적으로 결합할 수 있는 항체이거나 또는 그를 포함하는, 제조 물품. - 제 145 항에 있어서,
상기 항체는 자성 입자(magnetic particle) 위에 고정되는, 제조 물품. - 제 145 항에 있어서,
상기 항체는 친화도 크로마토그래피 매트릭스 위에 고정되거나 또는 그에 부착되는, 제조 물품. - 제 143 항 내지 제 147 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 자극 시약은, (i) TCR 복합체의 멤버에 특이적으로 결합하고, 선택적으로 CD3에 특이적으로 결합하는 1차 제제 및 (ii) T 세포 공자극 분자에 특이적으로 결합하는 2차 제제를 포함하며, 선택적으로 상기 공자극 분자는 CD28, CD137(4-1-BB), OX40 또는 ICOS로부터 선택되는, 제조 물품. - 제 148 항에 있어서,
상기 1차 제제 및 2차 제제 중의 하나 또는 둘 다는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는, 제조 물품. - 제 148 항 또는 제 149 항에 있어서,
상기 1차 제제 및 2차 제제는 항체를 포함하고, 선택적으로 상기 자극 시약은 항-CD3 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 항-CD28 항체 또는 그의 항원 결합 단편과의 인큐베이션을 포함하는, 제조 물품. - 제 148 항 내지 제 150 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 1차 제제 및 2차 제제는 고체 지지체(solid support)의 표면 위에 존재하거나 또는 그 위에 부착되는, 제조 물품. - 제 151 항에 있어서,
상기 고체 지지체는 비드, 선택적으로는 상자성 비드(paramagnetic bead)인, 제조 물품. - 제 148항 내지 제 152 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 1차 제제 및 2차 제제는, 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 포함하는 올리고머 입자 시약의 표면 위에 가역적으로 결합하는, 제조 물품. - 제조 물품으로서,
(i) 제 112 항 내지 제 126 항 중의 어느 한 항의 조성물; 및
(ii) 대상체에 상기 조성물을 투여하기 위한 지침;
을 포함하는 제조 물품.
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