JPH11501008A

JPH11501008A - 改変−アフィニティーストレプトアビジン

Info

Publication number: JPH11501008A
Application number: JP8524423A
Authority: JP
Inventors: エス．ステイトン，パトリック
Original assignee: University of Washington
Current assignee: University of Washington
Priority date: 1995-02-09
Filing date: 1996-02-02
Publication date: 1999-01-26
Also published as: AU708375B2; CA2211951A1; EP0815121A1; US6165750A; US6156493A; AU4918596A; WO1996024606A1; EP0815121A4

Abstract

(57)【要約】ストレプトアビジン四量体は、ビオチンに対する結合アフィニティーの減少、改変されたオフレート、改変されたオンレート、または改変された結合エンタルピーを生じるアミノ酸改変を含む少なくとも１つの単量体を有する。改変された単量体をコードするポリヌクレオチドがまた提供される。改変されたストレプトアビジンおよびキメラストレプトアビジンは、バイオセパレーションおよび細胞選別、イメージング、薬物送達、および診断の方法において有用である。

Description

【発明の詳細な説明】改変−アフィニティーストレプトアビジン政府援助本明細書中に記載の本発明の特定の実施態様は、国立科学基金(National Scie nce Foundation)により援助された研究の過程で行われた。従って、米国政府は本発明において所定の権利を有する。発明の背景 Streptomyces avidiniiにより産生されるタンパク質、ストレプトアビジンは、水溶性ビタミンのビオチンと非常に強力かつ特異的な非共有結合の複合体を形成する。ストレプトアビジンは、リガンドとタンパク質との間の非共有結合的相互作用に関して最も高いことが示されたアフィニティーで、10¹³M^-1〜10¹⁵M^-1の範囲であることが見積もられた会合定数(Ka)で、ビオチンに結合する四量体のタンパク質である。この結合アフィニティーは、通常の生理学的溶液条件下で、本質的に不可逆的であるのに十分強力であり、そして広範の様々な臨床的および産業的応用において、ストレプトアビジンおよびビオチンの有用性の基礎を提供する。Green、Adv ．Prot．Chem. 29:85-143(1975)を参照のこと。ストレプトアビジンおよびその相同性タンパク質のアビジンの両方(ビオチンに対する高いアフィニティーを共有する)は、強力なリガンド-タンパク質相互作用の範例として研究されてきた。ストレプトアビジンおよびアビジンのＸ線結晶構造(それらのアポおよびホロ形態の両方において)が記載された。また、いくつかのストレプトアビジン融合タンパク質の構築が報告されているように、その両方の配列が報告されている(SanoおよびCantor、Biochem ．Biophys．Res．Commun . 176:571-577(1991)；米国特許第4,839,293号)。しかし、通常高アフィニティーの構造-機能の起源はまだ解明されていない。ストレプトアビジン分子は、タンパク質-リガンド結合相互作用のために同定されたいくつかの共通認識モチーフを示す。これらは、トリプトファン残基の芳香族側鎖により大部分が媒介されるファンデルワールス力、ドナー/アクセプター側鎖により媒介される水素結合ネットワーク、そしてリガンド結合に際して表面のポリペプチドループの整列により媒介される無秩序-秩序転移を含む。 MiyamotoおよびKollmanは、リガンドとタンパク質との間の疎水力/ファンデルワールス力の重要性を強調するコンピューターによる研究を報告した。Miyamoto およびKollman，Proteins 16:226-245(1993)およびProc ．Natl．Acad．Sci．USA 90:8402-8406(1993)。これらの研究は、疎水性相互作用/ファンデルワールス相互作用が、結合の絶対自由エネルギーに^〜18 kcal/mol寄与し、一方静電エネルギー項(水素結合相互作用を含む)はわずか^〜３ kcal/mol寄与するに過ぎないことを示唆する。極端に高い結合アフィニティーに加えて、ストレプトアビジンの有用性はまたそのタンパク質の独特な構造的特性から生じる。ストレプトアビジンは、４つの同一サブユニットの四量体であり、各サブユニットはビオチンに対する結合部位に寄与する。その四量体は、近似の２回対称(two-fold symmetry)を有しているため、その結合部位はその分子の反対側に対になって配置されており、それはタンパク質を効率的な分子アダプターにしている。この構造的特徴は、ビオチンに対するストレプトアビジンの高アフィニティーとともに、このタンパク質を多くの技術において重要な成分にしている。ストレプトアビジン四量体は、ほとんど理想的な222点群対称を示す一方、その四量体内には２つの明確なタンパク質-タンパク質接触面がある。Hendrickson ら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 86:2190-2194(1989)；Weberら、Science 243: 85-88(1989)。第１の接触面は、２回対称軸により結び付けられる２つの単量体との間に位置し、そしてそれは相補的屈曲とともにβ-バレル表面の広範囲にわたる重なりにより限定される。この接触面は、いくらかのファンデルワールス力、水素結合、および塩橋相互作用により特徴付けられる。この接触面でのサブユニットの近接会合は、２回対称軸により関係付けられるビオチン結合部位を有するストレプトアビジン２量体を規定する。第２の四量体接触面は、これらの近接に会合した２量体の対の間の表面を規定する(ストレプトアビジンは「二量体の二量体」としてうまく記載される)。二量体/二量体接触面は、単量体のＣ-末端β- ストランド８により主として媒介される最小結合相互作用を有する非常に緩い「ウエストライン」により特徴付けられる。従って、その二量体接触面は構造的に広範囲にわたる一方、その二量体/二量体接触面は構造的には最小である。二量体/二量体接触面における強力な結合相互作用の明らかな欠如にもかかわらず、ストレプトアビジン四量体は、ビオチン-フリーおよびビオチン-結合状態において非常に安定である。その四量体は、６Ｍ尿素または６Ｍ塩酸グアニジンのいずれにおいても、より小さいサブユニットに解離しない。Kurzbanら、J ．Biol．Ch em. 266:14470-14477(1991)。ストレプトアビジンおよびアビジンは、４つの技術領域において、大きな意義のある鍵となる構成要素である：１)バイオセパレーション/細胞選別；２)イメージング；３)薬物送達；および４)診断(WilchekおよびBayer、Meths ．Enzymol. 184:5-45(1990))。分離領域においては、これらのタンパク質は重要な細胞選別応用において幅広く用いられてきており、ここで例えば、それらは骨髄移植に先立ち造血幹細胞から混入している細胞を除去するために用いられる。Berensonら、Prog ．Clin．Biol．Res. 377:449-459(1992)。彼らはガンの診断において同様な幅広い用途を見出し、ここでそれらは、種々の腫瘍の特異的なバイオマーカーの存在を試験するために研究および臨床の両方の場で広く用いられる。ストレプトアビジン/アビジンおよびビオチンのイメージングおよび薬物送達応用は、イメージング剤または治療薬の腫瘍細胞への同時の標的化および送達に対する能力から生じる。インビボにおけるイメージング剤および治療薬の標的化送達に対するストレプトアビジン/アビジンの使用において特に重要な関心が現れる。ストレプトアビジン/アビジンは、インビトロおよびインビボの両方において、標的化細胞への薬物、毒素、およびイメージング剤の送達に用いられている。例えば、Meyerら、Exp. Hematol. 19:710-713(1991)を参照のこと。これらの系において、ストレプトアビジンは、標的化成分として働く抗体、およびビオチニル化治療薬剤またはイメージング剤との間で分子アダプターの重要な役割を果たす。いくつかのストラテジーに関して、細胞は抗体-ストレプトアビジンコンジュゲートで予め標的化され、その後ビオチニル化薬剤が送律される。他の応用においては、初めにビオチニル化抗体が細胞を予め標的化するために用いられ、その後ストレプトアビジン/ビオチニル化薬剤コンジュゲートが送達される。ビオチニル化抗体、続くストレプトアビジン、次いでビオチニル化薬剤を用いる３段階送達がまた可能である。ストレプトアビジンおよびアビジンは非常に有用な分子である一方、それらは重要な制限(例えば、極めて高アフィニティーの結合部位を有する４つの同一サブユニットの非可変性)を有する。さらに、もしサブユニットの縮重が取り除かれてもその四量体内のサブユニットの分布を制御することは、不可能であった( 例えば、異なるアフィニティーを有するサブユニット、異なるイメージング剤で標識されたサブユニット、異なる薬物で標識されたサブユニット)。当該分野で必要とされることは、個々のサブユニットの機能的特性、および四量体内の幾何学的配置を仕立てる能力である。これは、重要なストレプトアビジンの構造-機能相関を操作することにより達成され得る。ビオチンおよびその誘導体に対するアフィニティーならびにオフおよびオンレートの範囲にわたるストレプトアビジン変異体のライブラリーは、既に幅広く用いられている系に関して現在の生物工学的応用を改善し、そしてその重要な新しい用途を開く。同様に、サブユニット成分およびジオメトリーを正確に規定する技能は、現在の用途を顕著に改善し、そして細胞分離、イメージング、治療薬、および様々な他の技術に関する新しい手段を提供する。大変驚いたことに、本発明はこれらのおよび他の関連した要求を満たす。発明の要旨本発明は、四量体の少なくとも１つの単量体が、ビオチンに対する結合アフィニティーの減少、オフレート(off-rate)の改変、オンレート(on-rate)の改変、および/または結合エンタルピーの改変を生じるアミノ酸改変を有する、ストレプトアビジン四量体を提供する。ビオチンに対する四量体の得られた結合アフィニティーは、約１×10¹³Ｍ^-1未満である。代表的には、ストレプトアビジン四量体の少なくとも１つの単量体は、ビオチンに対する結合アフィニティーの減少をもたらすアミノ酸改変を有し(ときには少なくとも２つまたは３つの単量体)、そしていくつかの実施態様においては、その４量体を含む４つの単量体の全てが、ビオチンに対する結合アフィニティーの減少をもたらすアミノ酸改変を有する。好ましい実施態様において、アミノ酸改変は、アミノ酸79位、92位、108位、または120位におけるトリプトファン残基のような、ビオチン結合部位におけるトリプトファン残基の置換である。前記のアミノ酸位の少なくとも２つのトリプトファン残基が、置換または欠失され得る。便利なことに、トリプトファン以外のあらゆるアミノ酸が結合アフィニティーを低下させ、そしてより速いオフレートをもたらし；トリプトファン残基に対する置換は、本明細書中に記載の例示の実施例に記載したビオチン結合部位においては、フェニルアラニンまたはアラニンが好ましい。本発明はまた、ビオチンに対するストレプトアビジンの結合アフィニティーの減少をもたらすアミノ酸改変を有するストレプトアビジンをコードする単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。代表的な実施態様において、ポリヌクレオチド分子は、アミノ酸79位、92位、108位、または120位のトリプトファン残基のようなビオチン結合部位におけるトリプトファン残基のアミノ酸置換または欠失を、例えば、フェニルアラニンもしくはアラニンまたは他のアミノ酸残基に置換することによりコードする。単離されたポリヌクレオチド分子は、少なくとも１つ、ときには２つまたはそれ以上の前記アミノ酸位の置換をコードし得る。他の局面において、本発明は、その特徴がアフィニティーには影響を与えるがビオチンに対する特異性には影響を与えない、天然のストレプトアビジン単量体サブユニット中には見出されない特徴を有する少なくとも１つのその単量体を有するストレプトアビジン四量体を生産するための方法を提供する。本方法は、その特徴を有する改変したストレプトアビジン四量体を生産する工程、改変したストレプトアビジンを単量体および/または二量体サブユニットに、例えばグアニジウムチオシアネートにより分離する工程、リフォールディングする工程；およびストレプトアビジンの単量体および/または二量体サブユニットを、その特徴を有しないストレプトアビジンの単量体または二量体と混合する工程、それにより前記特徴を有するその少なくとも１つの単量体を有するストレプトアビジン四量体を生産する工程を包含する。この方法はまた、全てではないが少なくとも１つの単量体が、標識、薬物、毒素、標的化分子、金属、またはビオチンへのストレプトアビジンの結合アフィニティーの減少をもたらすアミノ酸改変を含む場合キメラ四量体を組み立てるために用いられ得る。例えば、ストレプトアビジン単量体は、二量体/二量体接触面に位置するそのアミノ酸配列に少なくとも１つの変異を含み得、例えば、ジスルフィド結合が、特異のサブユニットを接続させるため、および解離した種の化学量論を規定するために操作され得る。図面の簡単な説明図１は、グアニジンチオシアネートで誘導した解離後に、CPI-およびFITC-標識WTストレプトアビジンの蛍光共鳴エネルギー移動を用いることにより、キメラ四量体を形成するために、サブユニットと異なる標識との混合を示す。実線は、 pH8.6におけるCPI-およびFITC-標識したWTストレプトアビジン四量体を混合した後の発光スペクトル(ex=385nm)である。点線は、蛍光エネルギーアクセプターの発光スペクトルにおける対応する増加(FITC)とともに、ドナーの発光スペクトル (CPI)における減少を示す。充填された線（変性/再生を受けていない、同様に混合したCPI-およびFITC-標識WTストレプトアビジンの発光スペクトル)は、その２成分の個々のスペクトルの合計である。トリプトファン発光強度およびマスのスペクトル中心がグアニジン変性の後回復された。蛍光スペクトルは、混合四量体の透析から生じる希釈効果を校正するため、そのトリプトファン発光の組み込まれた強度に対して標準化される。図2Aおよび2Bは、WTストレプトアビジン、W79A、およびW79Fの、pH10.0でのビオチン/BSA(図2A)、pH10.0での2-イミノビオチン/ビオチン(図2B)へのELISAの濃度依存的な結合を示す。μg/mlでのタンパク質濃度(四量体)は、横座標にプロットし、一方405nmにおける吸収により示したアルカリホスファターゼ活性は縦座標にプロットした。図3Aは、pH 8.0およびpH10.0におけるWTストレプトアビジン結合およびTrp変異体のイミノビオチンへの平均EC₅₀値を示す。各変異体およびそのアッセイpHは横座標に示され、そしてμg ml^-1での平均EC₅₀は、対数ｙ-スケールにプロットされる。WxA上のアスタリスク(*)は、報告されたEC₅₀がより結合がより低いことを示す(Trp-＞Ala変異体のフラットな結合等温式から見積もられた(本質的に)) 。図3Bは、絶対EC₅₀の特性値に対する4-パラメーターフィッティング関数から計算されたELISA結合等温式を示す。各EC₅₀に対応するイミノビオチン-タンパク質の見積りKaがまた示される。図4Aおよび図4Bは、298Ｋでのストレプトアビジン-ビオチン解離速度を示す。ここで図4Aは、WTストレプトアビジン(黒丸)、W79F(白三角)、およびW108F(白四角)であり；そして図4Bは、W120F(白丸)である。図5AはW120Aの、図5BはWTストレプトアビジンの、ビオチンカラムへの結合および2mMビオチンでのその後の溶出を示す。図6Aおよび図6Bは、キメラストレプトアビジン四量体の精製を示す：図6Aは２ -イミノビオチンアフィニティークロマトグラフィーである；タンパク質はpH11 の結合緩衝液で平衡化されたイミノビオチンカラムに結合され、結合緩衝液で洗浄され、pH４の緩衝液で溶出された；図6Bはビオチンアフィニティークロマトグラフィーである：図6A由来の結合したタンパク質がビオチンとインキュベートされ、そして特異的にビオチンとともにWTサブユニットでブロックするために完全に限外濾過されそしてビオチンカラムに通された；PBS内のビオチンカラムに結合されたタンパク質がPBS内の2mMビオチンで溶出された。図7Aは、二量体/二量体接触面を横切る解離、それに続く異種二量体の四量体再会合の概略図である。クロスハッチングは、非同一組成(例えば、変異結合部位、異なる蛍光標識、結合した薬物など)を有する四量体を示す。図7Bは、二量体および単量体の中間体種が存在するように、二量体/二量体および単量体/単量体接触面の両方を横切る解離の概略図を示す。引き続く会合は、キメラ四量体種の集合をもたらす。特定の実施態様の説明本発明は、ストレプトアビジン四量体が、異種であるが限定されたサブユニット組成および機能を有する点でキメラである、ストレプトアビジンおよびアビジン分子アダプターを提供する。本発明の他の局面では、ストレプトアビジン四量体内のその異種サブユニットの位置が制御され得る。キメラストレプトアビジン四量体は、遺伝子工学技術および生物物理学的四量体の解離/会合手順を行うことにより提供される。キメラストレプトアビジンおよびアビジン分子アダプターは、治療関連の薬物送達への新しいアプローチ、イメージング剤のインビボ送達、細胞の分別および分離、ならびに診断的応用を包含する、広範な種々の用途を提供する。キメラストレプトアビジン四量体は、サブユニットの制御された混合により産生され、ここで１つ以上のサブユニットは、特定の効用に対して所望される特性を有する。例えば、野生型のストレプトアビジンと比較した場合、ビオチンに対するアフィニティーが減少したサブユニットは、野生型のストレプトアビジンのサブユニットへ結合したときよりも容易に結合される、抗新生物薬剤を放出し得る。当然、個々のサブユニットまたはその二量体は、ビオチンに対する改変された結合アフィニティー以外の特性またはさらなる特性を有し得る。改変された特徴を有するストレプトアビジンサブユニットの生産は、意図した用途および改変されるサブユニットの特徴に依存して、いくつかの手段により達成され得る。例えば、いくつかの例において、解離したまたは解離していないサブユニットは、蛍光または放射性核種標識などで直接または間接的に標識され得、あるいは別の化合物などに結合され得、次いで解離され得(もしまだ解離されていないならば)、そしてキメラ四量体を形成するために本明細書中に記載されているように他のサブユニットと混合され得る。本明細書中に記載される特定の実施態様において、ストレプトアビジンサブユニットは、例えば、ビオチン結合ドメインの残基内のアミノ酸置換または欠失により、特に79位、92位、108位、および/または120位におけるTrp残基を置換することにより、ビオチン(またはイミノビオチン)に対して減少した結合アフィニティーを有する。結合アフィニティーの減少をもたらすそのような特徴は、組み換えDNA技術により達成される。ここで、ストレプトアビジンポリペプチドの特定のアミノ酸残基は、例えば、部位特異的変異生成により改変される。ビオチンに対するストレプトアビジンポリペプチドのアフィニティーの減少をもたらす変異の例が以下に実施例の節で記載されるが(ここで、Trp79、Trp92、Trp108、およびTrp120の改変は結合の減少をもたらす)、この教示に基づくさらなる改変が用いられ得る。例えば、Trp以外のあらゆるアミノ酸が選択された部位において置換され得る。改変されたストレプトアビジンのビオチン（および/またはイミノビオチン)に対する結合アフィニティーの減少は、代表的には、約１×10¹³Ｍ^-1 未満、ときに約１×10¹²Ｍ^-1未満、ときに約１×10¹¹Ｍ^-1以下であり、そして約１×10¹⁰Ｍ^-1またはそれより低い(例えば１×10⁷Ｍ^-1)場合もある。結合アフィニティー、オンレート、またはオフレートを減少させるために、ビオチンに対するストレプトアビジンのビオチン結合部位における変化を操作することに加えて、ストレプトアビジンのサブユニットまたは二量体に対する他の変異が作製され得る。これらは、例えば、二量体/二量体接触面における側鎖の部位特異的変異生成による二量体/二量体接触面を不安定化するために増強した解離平衡を操作することを含む。例えば、ストレプトアビジン単量体は二量体/二量体接触面に位置するアミノ酸残基中に少なくとも１つの変異を含み得る。この場合、ジスルフィド結合は特定のサブユニットを結びつけるために、そして解離した種の化学量論を規定するために操作され得る。あるいは、静水圧に対して増大された感受性は、溶液安定性を変化させることなしに、二量体/二量体接触面で操作され得る。他の変異がサブユニットになされ、薬物、リンカー、酵素、標識などの接着を可能にし得る。一度ストレプトアビジンサブユニットが所望の特徴を有するように改変され、異なるサブユニット、例えば、改変型および野生型が、１つ、２つ、または３つの改変されたサブユニットを有する異種またはキメラストレプトアビジン四量体を再形成するために混合される。各々の位置に改変されたサブユニットを有する同種四量体は、改変されたサブユニットをリフォールディングすることにより形成され、そして混合は必要としない。そのサブユニットは、二量体を形成するために架橋され得、そして、同じまたは異なる二量体が異種四量体を形成するために再会合され得るか、またはそのサブユニットは単に、単量体レベルで、1:3、2 :2、および3:1の改変された四量体を形成するために混合され得る。このように、幅広く様々な組み合わせが本発明により可能となる。ストレプトアビジン四量体内でのサブユニットの混合は、種々の異なる技術によりモニターされ得る。１つの技術において、蛍光アッセイが、高圧による解離後のオリゴマータンパク質サブユニットの混合を追跡するために用いられる(一般的に、ErijmanおよびWeber、Biochemistry 30:1595-1599(1991)(本明細書中に参考として援用される)に記載されたように)。このアッセイにおいて、オリゴマータンパク質の１つの集団が、蛍光エネルギー転移ドナー(例えば、7-ジエチルアミノ-3-(4'-イソチオシアナトフェニル)-4-メチルクマリン)で標識され、そして第２の集団は、相補的なエネルギー転移アクセプター(例えば、フルオレセインイソチオシアネート)で標識される。これらのフルオロホアのスルフヒドリル選択的誘導体は、サブユニット当たり１つのフルオロホアのドナーまたはアクセプターを提供する、チオール特異的低分子用の化学量論的な標識部位を提供するために構築された部位特異的変異体(例えば、Asn49Cys変異体)を標識するために用いられ得る。２つの集団が周囲の条件下で混合される場合、蛍光発光スペクトルは、単に個々のドナーおよびアクセプタースペクトルの付加に過ぎない。これは、オリゴマータンパク質の解離率が一般にごく僅かなので、その２集団の混合がないためである。混合したタンパク質を解離状態にする変性剤に曝露し、次いで周囲の条件に戻すと、蛍光発光がエネルギー転移により改変される。このドナー/アクセプター対を用いるエネルギー転移研究のための励起波長は385nmでありそして発光スペクトルは400nm〜600nmより集められる。このエネルギー転移スペクトルは、ドナー標識化サブユニットとアクセプター標識化サブユニットとの間の混合の特徴であり、ここで再会合したオリゴマーのいくつかは、同じ分子上に存在するドナーおよびアクセプター標識を有する。このように、このモニターする技術は、変性剤により誘導された四量体解離後のサブユニット混合を実証するために用いられ得る。１つの実施例において、組み換えストレプトアビジン集団はクマリンフルオロホアで標識され、そして第２の集団はフルオレセイン誘導体で標識された。これらの集団が混合され、そして図１に実線により示された蛍光発光スペクトルが得られた。次いでこのサンプルを6Mグアニジニウムチオシアネートに１時間移し、次いで透析して開始時の条件に戻した。このリフォールディングは、開始条件下で測定したトリプトファン蛍光強度および発光最大への復帰により証明されるように、ほとんど定量的であった。色素の発光スペクトルは、クマリンとフルオレセイン色素との間のエネルギー転移の出現と一致した様式で改変された(点線、図１)。この実験は、四量体解離後のサブユニット混合の証拠を提供する。そのタンパク質集団のキメラ四量体をモニターすることはまた、エレクトロスプレーマススペクトロメトリー(ESMS)により実施され得る。ESMSにおける最近の進歩は、保存されるべきマルチサブユニットタンパク質における非共有結合による会合の検出を可能にし、これは、その全体のマルチサブユニット複合体の検出を可能にした。Light-Wahlら、J ．Amer．Chem．Soc. 115:5869(1993)；Light Wa hlら、J ．Amer．Chem．Soc. 116:5271(1994)；およびSchwartzら、J ．Amer．Soc ．Mass Spectrom. 5:201-204(1994)(これら各々が本明細書中に参考として援用される)を参照のこと。そのキメラストレプトアビジン四量体は、非共有結合的会合の保存を促進する条件下でESMSにより分析される。四量体組成の確証は、その四量体の単量体への解離を促進する条件下でそのタンパク質を分析することにより得られ得る。選択的圧力解離はまた、ストレプトアビジン四量体に対して、特に二量体/二量体接触面が、このような解離を受けやすいように遺伝的に操作された場合に用いられ得る。高圧技術は、異種サブユニット集団の効率的な混合を許容する平衡条件下で、その四量体をサブユニットに解離するために用いられる。圧力解離は、圧力により誘導される解離に対する物理的駆動力が、四量体と分離したサブユニットとの間の体積の差であるので、一般的に非常に穏やか且つ可逆的である。圧力の適用は、最も低いネット体積を有する平衡の側を好み、そしてほとんどの場合、個々のサブユニット(単量体または二量体)は、オリゴマーの状態(四量体) よりも、低いネット体積を有する。従って、静水圧の適用は、一般に、会合平衡を解離状態にシフトさせる。従って、解離およびサブユニットの混合は、周囲の条件下で四量体の安定性を顕著に改変することなしに制御され得る。さらに、部位特異的変異生成を介して特定の接触面における荷電対を導入することにより、圧力で誘導された単量体または二量体状熊のいずれかへの解離が実現され得る。これは、二量体-二量体接触面(これは最小かつ構造的に十分規定される)で示され、そして単量体-単量体接触面の圧力感受性を操作することに応用され得る。異なる圧力感受性を有するように２つの接触面(二量体-二量体および単量体-単量体)を操作することにより、このアプローチは、混合するために利用可能な種(単量体または二量体)を制御する手段を提供し、それにより混合された四量体内のキメラの結合部位の構築を制御する。四量体のサブユニットを混合するために必要な圧力は、蛍光エネルギー転移およびマススペクトロメトリーアプローチを用いて測定される。四量体を単量体ではなく二量体に解離する圧力範囲、および四量体を単量体に解離する圧力範囲が確立される。別の局面において、四量体サブユニットの接触性は、部位特異的変異生成によりジスルフィド結合を形成し得る残基を導入し、そしてそれによりジスルフィド結合を介した四量体の再アセンブリを制御するように改変される。例えば、ストレプトアビジンのタンパク質-タンパク質接触面の空間的に近接したβ-炭素位は、距離および二平面の外面的形態が、ジスルフィド結合を操作するのに適切な場合(例えば、単量体/単量体接触面および二量体/二量体接触面を横切る位置)、決定される。共有結合は二量体内の単量体間、例えばH127位で操作されることが好ましい。次いで、二量体への解離が生じる場合、タグされたジスルフィド結合した二量体から生じる標識された四量体が戻ることが示される。本発明に従い構築される規定されたサブユニット組成を有する混合されたストレプトアビジン四量体は、幅広く様々な薬物送達およびイメージング、細胞選別および分離技術において用途を見出す。ストレプトアビジンは多数の重要な分離 /細胞選別技術において用いられる。本発明により提供されるように規定されたサブユニット配置を有する混合されたストレプトアビジン四量体を再構築する能力は大いに、これらの分子的道具を改善する。例えば、２つのサブユニットは、残る２つの部位のアフィニティーを撹乱することなく蛍光色素マーカーで標識され得、それにより、標識が、他の２つの結合部位から離れた四量体の一方の側面上にあり、そのため結合アフィニティーに立体的に干渉しないことを保証する。本発明の部位特異的変異体は、マーカーまたはプローブ(例えば、発光剤、放射標識、酵素、クロモホア、フェリチン、ヘモシアニン、巨大分子キャリアなど) に対する標識部位を提供する。そしてこれらはキメラ四量体を形成するために同様に野生型サブユニットと混合され得る。また部位特異的変異体は、磁気ビーズまたはクロマトグラフィー支持体などの表面にストレプトアビジンを固定化するための部位を提供するために用いられ得、そしてこれらは立体的に最適化された細胞分離成分を生じるように、野生型サブユニットと混合され得る。さらに、表面においてストレプトアビジンを配列させるために設計された部位特異的変異体が、結合アフィニティーを低下させる部位特異的変異体と結合され得、それにより立体的に最適化され、そして結合した細胞のより穏やかな溶出を可能とするアフィニティーを有する成分を提供する。従って本発明の改変された分子の応用として、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、アフィニティー細胞化学、組織化学、診断、シグナル増幅、ブロッティング技術、バイオアフィニティーセンサー、遺伝子プローブ、薬物送達、架橋剤、アフィニティー標的化、アフィニティー撹乱、融合剤、固定化剤、選択的修復、および選択的除去などが含まれる。例えば、本発明のより低いアフィニティー変異体が特に有用である、アビジンおよびビオチンを用いる細胞の免疫選択に関する方法は、Berensonら、米国特許第5,215,927号(本明細書中に参考として援用されている)に詳細に記載されている。造血幹細胞のような標的物をその標的物を含む異種懸濁物から分離するための１つの方法において、細胞培養物、骨髄、末梢血、または臍帯血のような懸濁物が、標的物に結合するビオチニル化結合成分と反応され、それによりビオチニル化標的物複合体を形成する。ビオチニル化された結合成分は、CD34⁺造血幹細胞に特異的に結合する抗体、ポリクローナル、モノクローナル、またはその結合フラグメントであり得る。ビオチニル化された標的物複合体を含む懸濁物が、本発明の改変されたストレプトアビジン分子、例えば、少なくとも１つの改変された単量体(しかし改変された単量体は４つ未満である)に曝露される。便利なことに、この曝露工程は、本発明のストレプトアビジン四量体が固相に吸着されたカラム中で実施され得る。ビオチニル化された標的物複合体が、富化された形態で標的物を回収するために、改変されたストレプトアビジン単量体ユニットのより低いアフィニティー(または解離速度定数の増加)により懸濁物から分離される。薬物送達、イメージング、および他のそのような用途について、例えば、２つのより高いアフィニティーおよび２つのより低いアフィニティーに改変された単量体を含むキメラストレプトアビジン四量体が、ビオチニル化分子(例えば、ビオチニル化抗体)と共にロードされ、その結果そのビオチニル化分子が選択的に、より低いアフィニティーのサブユニットの急速なオフレートにより高いアフィニティーのサブユニットに分けられる。そのビオチニル化標的/キメラ複合体は、インビボまたはエクソビボのいずれかにおいて、抗体を介して、所望の部位に標的化される。ビオチニル化イメージング剤または薬物は、投与され、そしてより低いアフィニティーのサブユニットにより捕獲され、それにより標的化細胞または組織は、所望の部位特異的な治療的または診断的活性のために薬物または標識に曝露される。別の局面においては、ビオチニル化標的薬剤が投与され、続いて高いおよびより低いアフィニティー結合部位を有する本発明のストレプトアビジンキメラが投与される。その高アフィニティー部位は標的化部位においてビオチンに結合する。次いで、利用可能なより低いアフィニティーのストレプトアビジン部位で結合する、ビオチニル化イメージング剤または治療剤が投与される。これは、標的化部位における、治療またはイメージング剤のストレプトアビジン分子からの即時放出をもたらす。なお別の実施態様においては、例えば、２つのより高いアフィニティーおよび２つのより低いアフィニティーの改変単量体の、キメラストレプトアビジン四量体が、より高いアフィニティーのサブユニットで、抗体(またはレセプター、リガンドなど)のようなビオチニル化分子とともにロードされ、そしてより低いアフィニティー部位はビオチニル化薬物、治療タンパク質、またはイメージング標識とともにロードされる。キメラ複合体は、インビボまたはエクソビボにおいて、標的化する成分を介して、所望の部位または細胞に標的化され、ここでより低いアフィニティー成分が所望の治療的または診断的活性を授けるために放出される。なお別の例において、プロドラッグ(例えば、エトポシドホスフェート)の転換に適する酵素(例えば、アルカリホスファターゼ )に結合したより低いアフィニティーのサブユニットが、患者または細胞コレクションに投与したとき、その抗体がキメラ複合体を所望の部位に送達し、そしてその酵素が患者または細胞に投与されるプロドラッグを活性化するように、抗体または他の標的化成分に結合したより高いアフィニティーのサブユニットと混合され得る。適切なプロドラッグ、酵素、そして投与方法は、Senterら、米国特許第 4,975,278号(本明細書中に参考として援用されている)に記載される。以下の実施例は、例示として提供され、本発明を限定するものではない。実施例Ｉ本実施例は、ビオチン結合部位のアミノ酸改変を有するストレプトアビジンの構造を記載する。その改変は、イミノビオチンおよびビオチンに対する結合アフィニティーの減少をもたらすことが示される。コアストレプトアビジンについての合成遺伝子の設計および構築。プログラム GCG(Genetics System Group Inc.、Madison、WI、1991)を使用し、天然に発生するタンパク質の残基13〜139として規定されるコストレプトアビジンのアミノ酸配列由来のヌクレオチド配列を産生した(ストレプトアビジンの配列については、Argaranaら、Nucl ．Acids Res. 14: 1871-1882(1986)、および米国特許第4,83 9,923号（これらの各々は、本明細書中で、参考として援用される）を参照のこと）。コアストレプトアビジンの合成遺伝子は、好適なE．coli使用頻度（deBoe rら、Maximizing Gene Expression、Renznikoffら編、(Butterworth、Stoneham、 MA、USA)225〜285頁(1986)）、共通リボソーム結合部位（Shineら、Nature 254: 34-38(1975)）、メチオニン開始コドン、翻訳停止コドン、および遺伝子の全長にわたって等間隔に並べられた多数の唯一の制限エンドヌクレアーゼ認識部位と組み合わせる。これらの特徴を、遺伝子デザイン内に組み込み、カセット変異誘発による部位特異的変異体の便利な生成ならびにそれら自身のリボソーム結合部位を欠くプラスミド由来の発現を容易にした。１本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドを、商業的に合成し(Oligos Etc.)、そしてゲル濾過で精製した。コアストレプトアビジン遺伝子を、以下の制限エンドヌクレアーゼ認識部位に隣接する３つのセグメントで構築した：それぞれEcoR I/XbaI、XbaI/HincII、およびHincII/HindIII。各セグメントについて、個々のオリゴデオキシリボヌクレオチドを、5'リン酸化し、アニーリングし、そして適切ペアーの制限エンドヌクレアーゼで線状化した分離pUC18プラスミド内に連結した。(他に明確な記載がなければ、標準的な手順のプロトコル（例えば、プラスミドの単離、連結、形質転換、および制限酵素を用いる消化）は、Sambrookら (Molecular Clonlng: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、 NY、第２版、(1989))または試薬およびキットの市販の供給者により提供された説明書に従うことに注意のこと）。引き続いて、そのプラスミドを、DH5a、またはNovablue(Novagen Inc.、Madison，WI)E．coli細胞中に形質転換した。適切な大きさにした挿入物を含むクローンをコロニーPCRにより選択後、プラスミド構築物を配列決定産物の蛍光検出を用いる色素ターミネーター化学(dye terminato r chemistry)を用いて配列決定した（Applied Blosystems、Foster City、CA）。コアストレプトアビジン遺伝子を含む３つのDNAセグメントを、単離し、そしてNovablue細胞内に形質転換した単一のpUC18プラスミド内に連結した。この時点で、全遺伝子を配列決定し、ヌクレオチド配列を確認した。次いで、コアストレプトアビジン遺伝子を、NdeI/HindIIIセグメントとしてE．coli発現べクター内(pET-21a(Novagen Inc.))にサブクローニングし、そしてNovablue細胞中で維持した。コアストレプトアビジンの部位特異的変異生成。 WTストレプトアビジンのW79A，W79F、W108A、およびW108F部位特異的変異体を、所望のコドン変化を組込む変異型プライマーを用いて、PCR変異誘発によって作製した（Sligarら、Meth ．Enzymol.、206: 31-49（1990）。PCR変異誘発プライマーは以下のとおりである： W120AおよびW120Fを、以下の配列を用いるカセット変異誘発によって作製した： Trp->Ala/Phe変異を組み込んだ残基120での縮重コドンを有するMluI/HindIII エンドヌクレアーゼ制限部位におよぶ、合成の間に化学的に5'リン酸化した(IDT Inc.)オリゴデオキシリボヌクレオチドを、アニーリングし、コアストレプトアビジン遺伝子を含むMluI/HindII線状化pUC18に連結し、そしてコンピタントなNo vablue細胞に形質転換した。変異プラスミドを含むクローンを、コアストレプトアジビン遺伝子内に変異原性挿入物の好結果な連結の際のPstI制限酵素部位の導入により同定した。PstI制限酵素部位を含むプラスミドのDNA配決定を用いて、P heまたはAla変異のいずれかを含むクローンを同定した。変異体ストレプトアビジン遺伝子(W120AまたはW120F)を、NdeI/HindIIIセグメントとしてpET21a内にサブクローニングし、そしてNovablue細胞中に維持した。 E. coliにおけるストレプトアビジンおよび変異体の発現。発現宿主(BL21(DE3)(Novagen，Inc.))内に形質転換した、ストレプトアビジン遺伝子を含む発現プラスミドpET-21aを、100μg/mlのアンピシリンを補充した10ml LB培地中で37℃で一晩振盪培養した。次いで培養物を4500×gで５分間遠心分離し、細胞ペレットを新鮮な10mlのLB培地中で再懸濁し、そして振盪フラスコ中の 100μg/mlのアンピシリンを補充した6.5Lの２×YT培地に接種するのに使用した。培養物を600nmにおける吸光度が1.0に到達するまで37℃で振盪しながらインキュベートし、この時点でイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシドを添加し(1m M)、タンパク質発現を誘導した。細胞をさらに３時間培養し、その後それらを4500× gで10分間、遠心分離により回収した。細胞ペレットをさらに使用するまで-70℃ に保存した。誘導されたBL21(DE3)細胞溶解物のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)におけるタンパク質バンドのレーザーデンシトメトリーによる定量は、ストレプトアビジンが、総細胞タンパク質の15〜20％を構成することを示した。発現したストレプトアビジンおよび変異体の単離および精製。凍結した細胞ペレットを解凍し、200mlの50mM Tris HCl(pH 8.0)/0.75Mスクロース／１mM フェニルメチルスルフォニルフルオリド(PMSF)に再懸濁し、そして超音波で破壊した。溶解した細胞を、DNAseI(10μg/ml)/RNAseA(10μg/ml)/MgCl₂(10mM)とともに室温で15分間インキュベートし、そして22000×gで30分間遠心分離した。不溶性画分を50mM Tris(pH 8.0)/10mM EDTA/1.5M NaCl/１mM PMSF/0.5％(v/v)Trit on-X-100で繰り返し洗浄し、膜タンパク質を可溶化した。ストレプトアビジンの封入体を多く含む最終的な白いペレットを、SDS-PAGEで定量すると純度約70％であった。封入体を６ＭグアニジンHCl(pH 1.5)(500ml)中に溶解し、≦50μM（ストレプトアビジンモノマー）の濃度まで濃縮し、そして20Lの50mM Tris HCl(pH 8.0)/150mM NaCl/10mM EDTA/0.1mM PMSF/0.5mMベンザミジンHClに対して、１回2 0Lの透析緩衝液を交換して24時間以上透析した。透析物を遠心分離し、0.45μM のフィルターを通して吸引濾過し、そして撹拌限外濾過セル(Amicon Inc.、Danv ers、MA)で濃縮した。数mlまでの最終濃縮には、Centriprep-30遠心分離濃縮器( Amicon Inc.)を利用した。透析後に残った不溶性の凝集したタンパク質は、上記のプロトコル後、数回リフォールドし得る。 WTストレプトアビジンおよびTrp->Phe変異体を、イミノビオチン−アガロース (Pierce．Naperville、IL)(46,47)を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。アフィニティー精製WTストレプトアビジンの収率は、２×YT培養物１リットルあたり^〜10〜20mgであった。イミノビオチンのTRP->Ala変異体の最も低いアフィニティーは、その精製のための使用を除外する。代わりに、サンプルを20mM Tris HCl(pH 7.0)で平衡化したDEAE-SepharoseFFカラム(1.5×5cm) (Pharmacia、Piscataway、NJ)にアプライした。E. coli由来のDNAおよび大部分の汚染タンパク質の結合のために合理的な精製法が提供されるが、これらの条件下では、ストレプトアビジンはカラムに結合せずに空隙容量中に溶出される。ストレプトアビジン含有画分をプールし、濃縮し、そして20mM Tris(ph 8.5)で平衡化し、そして同じ緩衝液で平衡化したDEAE-SepharoseFFカラム(1.5×5cm)を通過させた。ストレプトアビジンはこれらの条件下で結合し、そして０〜0.3M NaC lの直線的なグラジエントにアプライすることにより溶出した。ストレプトアビジン含有画分をプールし、濃縮し、そしてさらなる使用のために４℃で保存した。これらの２つのクロマトグラフィー工程は、同種のタンパク質を生ずる(SDS-P AGEにより証明したように)。リフォールディングし、アフィニティー精製したWTストレプトアビジンを、アミノ酸組成分析およびＮ末端配列決定によって特徴付けした。実験的に決定した組換えタンパタ質の組成およびＮ末端配列は、それぞれ、コアストレプトアビジンの算出した組成および配列と一致した。熱変性タンパク質のSDS-PAGEは、各Tr p変異体位の単量体が、WTストレプトアビジン単量体と同じサイズであること、そしてWTストレプトアビジンおよびそのTrp変異体に対して用いた精製法が、WT クマシー染色の検出限界以下の汚染タンパク質しか有しない、均質なタンパク質を生じることを示した。WTストレプトアビジンおよびTrp変異体のESMSは、実験的に測定したWTストレプトアビジンおよびTrp変異体の質量が正しいことを示した。ネイティブPAGEにおけるWTストレプトアビジンおよびTrp変異体の移動度の類似は、リフォールディングした変異体が自己会合して、溶液中で、WTストレプトアビジンに類似の四量体を形成することを示した。WTストレプトアビジンおよびTrp変異体へのフルオレセイン−ビオチンの結合は、飽和の際、(サブユニットベースで)0.85〜1.1の範囲であり、これはストレプトアビジンサブユニット当たり１つのビオチンの結合について予測された1.0の化学量論比に近似している。ストレプトアビジンおよび変異体の特徴付け。SDS-PAGE分析を、不連続緩衝液系(Laemmli，Nature 227: 680-685(1971))で既成のMiniprotean 10〜20％グラジエントゲル(BioRad Inc.、Richmond、CA)を用いて実施した。サンプルを、電気泳動の前に、SDSの存在下で15分間ボイルし、ストレプトアビジン四量体を分離させた。ネイティブPAGEは、サンプルアプリケーション緩衝液およびゲルランニング緩衝液、ならびに電気泳動前のタンパク質の熱変性におけるSDSを省略することにより、上記の系を用いて実施した。ゲルを45％メタノール、10％酢酸(v /v)中に溶解した、0.25％(w/v)のクマシーR-250で染色した。WTストレプトアビジンの濃度を、サブユニットについての吸光係数(e₂₈₀)34000M^-1cm^-1を用い、28 0nmでの吸収によって決定した(Sanoら、Proc ．Natl．Acad．Scl．USA 87: 142-1 46(1990))。変異体の濃度を、参考としてWTストレプトアビジンのe₂₈₀を用い、G illら、Anal ．Blochem. 182:319-326(1989)の方法によって決定した。タンパク質エレクトロスプレーマススペクトロメトリー(ESMS)を、ARI IIIエレクトロスプレーマススペクトロメーター(PE/Sciex、Thronhill、Ontario)において実施した。WTストレプトアビジンおよび変異体のビオチン結合化学量論を、タンパク質でのタートレーションに際して、5-((N-(5-(N-(6-(ビオチニル)アミノ)ヘキサノイル)アミノ)ペンチル)チオウレイジル)フルオレセイン(Fluorescein-biotin、M olecular Probes，Eugene、OR)の蛍光における定量的なクエンチングによって溶液中で決定した。 ELISAアッセイ。Bayerら、Anal ．Blochem. 154: 367-370(1986)によって報告された酵素アッセイの改変バージョンを用いて、WTストレプトアビジンおよび変異体のビオチンおよび2-イミノビオチンとの濃度依存性結合を試験した。ウシ血清アルブミンにコンジュゲートした2-イミノビオチン(イミノビオチン／BSA)を、 100mM NaHCO₃(pH 8.3)中に100mgのBSAを含む、2-イミノビオチンN-ヒドロキシスクシニミドエステル(Sigma)の20倍モル過剰量と、４℃で12時間回転撹拌しながら反応させることにより合成し、その後、透析およびゲル濾過(G-25、Pharmacia )し、イミノビオチン／BSAを未反応の2-イミノビオチンから分離した。10mg/ml の濃度でのビオチン／BSA(Pierce)またはイミノビオチン／BSAを、マイクロウェルプレート(１ウェルにつき100μl)中で、15mM Na₂CO₃(pH 9.6)中、４℃で１晩吸着させた。翌日、マイクロウェルプレートを、１ウェル当たり200μlのpH 8.0 またはpH 10.0のブロッキング緩衝液(50mMリン酸ナトリウム(pH 8.0)または50mM Na₂CO₃(PH 10.0)/100mM NaCl/0.5％(w/v)BSA/0.05％(v/v)Tween-20)とともに少なくとも２時間室温でインキュベートし、次いで100μg/mlのWTストレプトアビジンまたは変異体の10倍連続希釈物(100μl/ウェル)を室温で２時間インキュベートし、pH 8.0またはpH 10.0のブロッキング緩衝液(200μl/ウェル)でリンスし、そしてpH 8.0またはpH 10.0のブロッキング緩衝液(100μl/ウェル)中で一次抗ストレプトアビジン抗体(Sigma)の２×10⁴希釈において室温で１時間インキュベートした。プレートを、ウェルにつきアッセイpHで200μlのブロッキング緩衝液で３回リンスし、二次抗IgG/アルカリホスファターゼコンジュゲート(Sigma)と共に室温で１時間インキュベートし、ブロッキング緩衝液で３回リンスし、pH 1 0.0におけるアルカリホスファターゼ活性をアッセイした。各プレートアッセイは、した各タンパク質濃度につき３連で行った。データを、Mathcad(Mathworks) で処理し、以下に示す公開された4-パラメーター非線形フィッティングアルゴリズム(4-parameter nonlinear fitting algorithm)(Jinら、J.Mol.Biol. 226:851 -865(1992))を用いて、結合の50％結合飽和値(EC₅₀)における等価のバルク濃度を決定した：ここで、a，b，c、およびdは、調節可能なフィッティングパラメーターである；x＝ストレプトアビジン濃度(μg/ml)；y＝405nmにおける吸光度。μg ml^-1における絶対値EC₅₀は、結合等温式(binding isotherm)に対するフィッティング関数の最適フィットのためのパラメーターcの値で与えられる。表Ｉに報告した相対的EC₅₀値は、EC₅₀(変異体)／EC₅₀(WTストレプトアビジン)である。ビオチンの平衡結合。２nM(WT、W79A、W120A)または0.2nM(WT、W120F)の濃度の³H-ビオチンを、連続的に希釈したタンパク質のアリコート中で２時間インキュベートした。次いで、遊離のリガンドを、Microcon-30またはCentriprep-30遠心限外濾過デバイス(Amicon、Inc.)のいずれかでタンパク質結合リガンドから分離した。代表的には、0.1〜１mlの遊離リガンド溶液またはタンパク質リガンド混合物を、18mlの液体シンチレーションカクテル(Ecolume、ICN Biomedicals、I nc.、Costa Mesa、CA)に添加し、そして液体シンチレーションカウンター(Beckm an Instruments、Inc.、Fullerton、CA)でアッセイした。遊離のタンパク質濃度に対するタンパク質結合リガンドの画分の非線形カーブフィット(nonlinear cur ve fit)からK_aを決定した。リガンドとしてビオチンを用いる、WTストレプトアビジンおよび全てのTrp変異体の濃度依存的結合等温式は、pH 8.0およびpH 10.0の両方でのELISAアッセイにおいて大部分一致する(図2Aは、WTストレプトアビジンおよびW79A/F変異体の結合等温式を示す)。しかし、リガンドとしてイミノビオチン／BSA(図2BのWTストレプトアビジンおよびW79A/F変異体)を用いる結合等温式は、WTストレプトアビジンおよび変異体のアフィニティーにおいて、EC₅₀についてWT＜Phe＜Alaの順で顕著な相違を示す。pH 8.0およびpH 10.0におけるイミノビオチンに対するWT ストレプトアビジンおよびTrp変異体の結合についての絶対的EC₅₀および相対的E C₅₀を、表Ｉおよび図２にまとめる。絶対的EC₅₀値(μg/ml^-1)を、結合等温式の少なくとも３つの独立した測定の非線形最小二乗フィッティング(nonlinear least squares fit)から導いた。相対的E C₅₀値をpH 8.0またはpH 10.0においてそれぞれ、WTストレプトアビジンの平均（絶対的）EC₅₀に対して標準化する。 *ビオチンがリガンドである。ビオチン／BSAに対するWT結合の６つの独立した等温式を、EC₅₀を決定するためにフィッティングした。 **それらのEC₅₀のより低い結合を導く、Trp->Ala変異体を含まない完全結合等温式は決定され得なかった。これらの実験結果は、Ala変異体が平衡ビオチン結合アッセイに利用可能であることを示している。分子量カット30,000の濾過膜を用いるスピンカラムアッセイを用い、遊離状態と結合状態との間の³H-ビオチンの分配を定量した。このアッセイは、アフィニティーが10⁵〜10⁹との間である場合、K_aの有用な見積もりを提供する。W120Fについての濃度依存的結合等温式は、最も低い実験的に利用可能な全ビオチン濃度(0.2nM)で密着結合限界(K_a＞10⁹)であり、そして野生型ストレプトアビジンと同一である。W108A変異体タンパク質が、必要な濃度でのこのアッセイにおいて不安定であることを証明される一方、W79AおよびW120A変異体は、Kaがそれぞれ4.3×10⁷M^-1および8.6×10⁶M^-1であると決定される完全な濃度依存性結合等温式を与えた。これらの実験的に決定したK_aの評価は、以下でさらに議論されるELISAアッセイから見積もられるΔK_aの独立した確証を提供する。変異体のΔK_aのマグニチュード測定(magnitude determination)のオーダーを、EC₅₀で評価し、いくつかのこれらのリガンドタンパク質のパートナーの公知の K_aを与える。その後の分析は、ビオチン-WTストレプトアビジンの2.5×10¹³M^-1 の実験的に決定したKa、および10⁸M^-1のイミノビオチン／WTストレプトアビジンのpH10.0における10⁸M^-1のKa(イミノビオチン／アビジンの実験的に決定した値から見積もった)を基礎とする。これらの数字は、別に決定したW79AおよびW120A 変異体のビオチン結合アフィニティーによりさらに支持され、これは、ELISAの見積もりと良く一致する。 Kaが10⁷M^-1より高い場合、ELISAアッセイは、リガンドータンパク質結合におけるΔK_aの影響を受けない(すなわち、K_aが10⁷〜10¹³M^-1の範囲にある場合、リガンドタンパク質のパートナーについてのELISA結合等温式は区別がつかない)。この仮定は、以下の観察により支持される：実験的に測定したWTストレプトアビジン／ビオチンについてのEC₅₀は、WTストレプトアビジン／ビオチンのK_a(2.5×10¹³ M^-1)、およびpH 10.0におけるイミノビオチン／WTストレプトアビジンのK_a(-1 0⁸M^-1)における顕著な差にもかかわらず、pH 10.0でのWTストレプトアビジン／イミノビオチンのEC₅₀と同一である。これらの２つのリガンドについての類似の EC₅₀は、ELISAが、10⁸〜10¹³M^-1の範囲では一般にΔK_aの影響を受けないことを示す。さらに、イミノビオチンによるWTストレプトアビジンの結合はpH感受性であり、そしてWTストレプトアビジン／イミノビオチンのK_aは、密接に関連したイミノビオチン-アビジン系についての実験的に決定したΔK_aであるように、pH 10 .0におけるよりpH 8.0において大きさの次数はより低いようである。従って、リガンドK_aに対するELISAの感度については、10⁷M^-1の上限を確立し得る。WTストレプトアビジンおよび全てのTrp変異体について測定された類似するビオチンEC5 0値は、ビオチンに対するTrp変異体のKaが、10¹⁷〜10¹³M^-1の範囲であることを近似的に示す。しかし、リガンドアフィニティーをリガンドとしてイミノビオチンを用いることによるこのELISAアッセイの利用可能な範囲内に低くした場合、EC₅₀における顕著な変化が、Trp変異体において観察された。Trp変異体についての相対的EC₅₀ の結果を図３にまとめ、そしてそれらの増加したイミノビオチンのEC₅₀を図示する。W79FおよびW108Fは、WTストレプトアビジンと比較してpH 10.0で約２〜３倍大きいEC₅₀を示す；アッセイpHを8.0に下げるとき、それらのEC₅₀は、２オーダーの大きさで劇的に増加し、これはストレプトアビジンについてのイミノビオチンのアフィニティーにおけるpH依存性増加と一致する。これらの結果は、イミノビオチンに対するW79FおよびW108F変異体のアフィニティーが、pH 10.0でのWTストレプトアビジン(K_a-107 _{〜108 M-1})より１オーダーの大きさ未満であることを示す。アッセイpHを8.0に低めることは、W79FおよびW108Fと比較して、さらにK_a を〜10⁶M^-1に減少させ（pH 10.0での100倍高い相対的EC₅₀により示される)、そしてより弱いpH依存性が、pH 8.0での相対的EC₅₀においてより小さい増加によって示される(pH ８で相対的EC₅₀〜200)。 Trp＞Ala変異は、2-イミノビオチン結合アフィニティーにおいてより大きな変化をもたらし、それゆえより低い結合のEC₅₀のみが見積もられ得る(相対的EC₅₀ ≧2000)。イミノビオチンに結合したTrp->Ala変異体に対するEC₅₀は、ELISAにおける何回もの洗浄工程の間の結合タンパク質の不均衡な損失によって幾分過大に評価され得る。Ala変異体は、WTストレプトアビジンのビオチン結合等温式(最大 ΔK_aをセットする)と区別がつかないビオチン結合等温式を示すため、Ala変異体のΔK_aを10⁴〜10⁶の間に下げて評価する。この結果は、W79AおよびW120A変異体( これらのアフィニティーを10⁷M^-1に位置させる)についてのKaの直接的な見積もりにより支持される。本分析は、イミノビオチンに対するEC₅₀の差が、ビオチンに対する類似した差を反映することを想定し、これはMiyamotoおよびKollmanの計算によって支持され、ここでは２つのリガンドに対する結合の絶対自由エネルギーにおける差は、リガンド-タンパク質相互作用自由エネルギーにおける大きな差というよりもむしろ２つのリガンドの溶媒和エネルギーにおける差による(MiyamotoおよびKollm an、Proteins 16: 226-245(1993)、およびMiyamotoおよびKollman、Proc.Natl.A cad.Sci ．USA 90: 8402-8406(1993))。2-イミノビオチンELISA結合等温式から見積もるΔK_aは、W79A、W120A、およびW120F変異体に対するビオチンのK_aの直接的な見積もりによりきっちり確証される。従って、イミノビオチンは、固有のストレプトアビジン−ビオチン相互作用についての良好なレポーターであり、これは、トリプトファンが、構造的に変化したウレイド部分と直接相互作用しないという事実と一致する。これらの結果、および特に側鎖Trp(WT)＞Phe＞Alaの芳香族性の順序におけるアフィニティーの順位ならびに関連するイミノビオチンへの結合に対するEC₅₀の変化の大きさは、接触する残基の芳香族成分の変化が、結合の絶対自由エネルギーに非常に強い影響を与えることを示している。従って、TrpをPheに変化させることにより側鎖の芳香族性の部分的な保持が、イミノビオチンEC₅₀の10¹〜10²の増加をもたらし、これは、ビオチンに対するそれらのKaの類似する増加を示す。従って、TrpをAlaに変異させることによる芳香族側鎖の完全な撤廃は、顕著により大きなEC₅₀をもたらし、これはWTストレプトアビジンより低いΔKa(ビオチン) 10³を示す。これらの結果は、ビオチン結合の絶対自由エネルギーに対するTrp側鎖の寄与が、^〜４kcal/molほどの大きさであり得ることを示す；４つのTrp残基がビオチンと接触するので、結合ビオチンの絶対自由エネルギーに対するそれらの全体の寄与は実質的である。平衡結合エンタルピー(ΔH_゜)および熱容量(ΔCp_゜)をまた、ストレプトアビジン変異体を用いて操作した(表II)。熱容量を、Murphyら、proteins: structure, Function and Genetics 15: 113-120(1993)(本明細書中で参考として援用される)に一般的に記載されるように決定した。観察され得るように、増加したΔH_゜および減少したΔH_゜ならびに増加したΔCp_゜および減少したΔCp_゜の両方の例が存在する。熱容量は、結合エンタルピーの温度依存性に関与し、これは、結合アフィニティーに対して顕著に寄与する。従って、熱容量の変化は、温度をビオチンアフィニティーを調節する変数として使用する応用において重要である。実施例II この実施例は、結合部位トリプトファン残基のビオチンオフレートおよび活性化熱力学の関与を示す。ストレプトアビジン変異体W79F、W108F、およびW120Fの解離速度定数は、これらのTrp接触(Trp contact)が解離速度の調節において重要であるということを示す。ストレプトアビジン−ビオチン解離速度を、WTストレプトアビジン、W79F，W1 08F、およびW120Fについて、以下のように決定した。8,9-³Hビオチン(4.8μl、2 1μM、NEN/Dupont)を、WTストレプトアビジン、またはW79F、W108F、もしくはW1 20F変異体の１つを0.5μMの濃度で含む10mlのPBS(pH7.4)、1mM EDTAに添加し、そして10分間インキュベートし、その後非放射活性ビオチン(20mM)を、最終濃度 50μMになるように加えた。この混合物のアリコート(0.5ml)を分子量カット30,0 00のフイルター(Microcon-30、Amicon Inc.、Beverly、MA)で遠心で限外濾過し、タンパク質リガンド複合体から非結合ビオチンを分離した。濾液50μlを、３連で10mlのシンチレーションカクテルと混合し、そして液体シンチレーションカウンター(LS-7000、Beckman Instruments，Fullerton、CA)で放射活性をアッセイした。各時点でのcpmでの濾液の平均放射活性、およびコールドのビオチンを添加する前のタンパク質リガンド複合体の放射活性（ａ）は、タンパク質リガンド複合体の解離の一次速度定数(k_off)をln(a-x/a)[ln(フラクションバウンド)] のプロットから決定するのを可能にした。標準偏差を３つの独立した測定に基づき決定した。コールドのビオチンを添加しなかった対照実験は、限外濾液内に全放射活性の＜２％を生じ、これは全ての³Ｈビオチンが初めに結合したことを示す。図４に示した結果は、ビオチン結合野生型(WT)コアストレプトアビジンおよび部位特異的変異体W79F、W108F、および120Fは、モノイクスポネンシャルな、一次解離キネティックスを示す。一次解離速度定数(ｋ_off)を表IIIにまとめた。組み換えコアWTストレプトアビジン（ｋ_off＝5.6×10^-6ｓ^-1）のｋ_offは先に報告された市販用に調製された全長ストレプトアビジン(PiranおよびRiordan、J.Imm unol.Meths. 133:141-143(1990))の約２倍である。しかし、市販用に調製されたストレプトアビジンについては多相のキネティックスが観察されたのに対して、組換えコアWTストレプトアビジンについては単相の解離キネティックスが得られた。ビオチンとの接触におけるTrp残基のPheでの置換の影響は重要であり、そして位置依存的である。Trp120のPheでの置換におけるｋ_offに劇的な効果があった：保存的なW120F変異は、WTストレプトアビジンと比較して、ｔ_1/2が35時間(WT)から0.5時間(W120F)の減少に対応して、解離速度定数の70倍の増大をもたらした。部位79および108におけるTrpのPheでの置換の影響はまた重要であるが、その重要度はより小さい。W79Fのｋ_offは、WTストレプトアビジンより５倍大きく、W10 8Fのｋ_offは、WTストレプトアビジンより17倍大きい。WTストレプトアビジンと比較したW79FおよびW120Fの△ｋ_offは(表Ｉにまとめた)、それらの△k_dと大きさにおいて類似しており、このことは、W79FおよびW20Fの平衡アフィニティーの減少が、ｋ_offの増加により主に説明され得ることを示す。他方、W108Fは、△k_dよりも大きいビオチン△ｋ_offを示し、このことは対応するオンレート変化も存在することを示唆する。これらの結果は、W79FおよびW120Fについてのオフレートキネティックスにおける変化が、WTストレプトアビジンに対するリガンド結合基底状態の自由エネルギーの不安化により主に説明され、一方WTに対するW108Fの遷移状態の安定化は、この変異体の△ｋo_ffを主に説明する。 W79F、W108F、およびW120Fについてのｋ_offにおける著しい差異のエネルギー的な原因を、解離速度の温度依存性を測定することによりさらに調べ、活性化バリアに対するエンタルピー的およびエントロピー的寄与を決定するために遷移状態理論を適用する。活性化熱力学的パラメーターを、単一遷移状態であると仮定して計算し、表IVにまとめた。例外的に遅いビオチンのオフレートは、ビオチンの解離に対する、大きな活性化バリア(△G_r ^≠＝24.4kcal mol^-1)のためである。活性化バリアは、298ｋで7.6kcal mol^-1の正の活性化エントロピーとともに、もともとエンタルピー的(△H_r ^≠＝＋32kcal mol^-1)である。予期しなかった発見は、 W79FおよびW108F両方が、WTストレプトアビジンと比較してより大きな解離の活性化エンタルピー(＋３、＋4.5 kcal mol^-1)を示すことである。しかし、このTr p-＞Phe置換は、W79FおよびW108FについてのＴ△Ｓ_r≠項が298ｋで４〜６ kcal mol^-1で解離を与えるように、活性エントロピーの寄与において均等のより大きな正の増大をもたらす。直接的対比において、より70倍早いW120のオフレート（ WTストレプトアビジンに対して-2.1kcal mol^-1の△△Ｇ_r≠に対応する）は、WT ストレプトアビジンと非常に類似する活性化エントロピーとともに、主に減少した活性化エンタルピーバリア（△H_r≠＋28.5kcal mol^-1）から生じる。遷移状態の分析による△G_r≠の決定、およびアフィニティー測定からの△Ｇ⁰ の別個の見積もりは、WTストレプトアビジンおよびTrpからPheへの変異体について自由エネルギープロフィールの描写を可能にする。同様に、エンタルピーエネルギープロフィールは、平衡ビオチン−結合エンタルピー(△Ｈ^O)(等温滴定熱量測定により別個に決定した)から、および温度依存性タンパク質−リガンド解離キネティックスの遷移状態分析から得られる△H_r≠から描写し得る。この分析の長所は、異なる変異体のオフレートを担う自由エネルギーバリアを、遷移状態および/またはビオチン−結合基底状態における変化の点から描写されることを可能にしたこと、そしてさらにこれらの自由エネルギー変化をエンタルピー的およびエントロピー的成分への分割を可能にしたことである。WTストレプトアビジンについての結果と比較して、特異的残基の変異の熱力学的影響が、次に位置づけられ得、それは遷移状態の構造およびエネルギー論についての多くの洞察を提供する。 WTストレプトアビジンおよびTrpからPheへの変異体の自由エネルギープロフィールに目をむけると、W120Fのｋ_offの70倍の減少は、WTストレプトアビジンに対するビオチン−結合基底状態の不安定化(△△Ｇ⁰＝＋2.7kcal mol^-1対DDG_rπ＝ −2.5kcal mol^-1)のためと考えられる。Trp120のPheへの変異におけるリガンド −結合状態の自由エネルギーにおけるこの変化は、熱力学的に調節される(△△H⁰ ＝＋5.1kcal mol^-1、好ましいエントロピー項で、TDDS∞＝＋2.4kcal mol^-1)。 W79Fはｋ_offの減少が最も小さく、それはまたビオチン−結合基底状態の不安定化に帰し得る。この＋0.9kcal mol^-1△△Ｇ⁰項の起源は、W120Fとは異なる。平衡結合エンタルピーにおける変化は、△△H⁰＝−1.5kcal molのために実際には会合を好み、このことは、Trp70のPheへの変異により生じるビオチン−結合状態の自由エネルギー不安定化が、均等なより大きなに好ましくないエントロピー変化(T△△S⁰＝−2.4kcal mol^-1)により生じることを示す。実施例III この実施例は、部位特異的変異により操作されたストレプトアビジン-ビオチン平衡アフィニティーおよび解離キネティックスが、ビオチニル化標的分子の効率的な捕獲を可能にする一方、引き続き非変性条件下で遊離のビオチンの競合的な解離を利用することにより、ストレプトアビジン-ビオチニル化標的複合体の解離を町能にすることを示す。ビオチン結合アフィニティーおよび解離キネティックスを調節する能力を、幅広く異なるアフィニティーおよびビオチンオフレートを有するサブユニットから成るキメラストレプトアビジン四量体を作製するのに用いる。 Trp120-＞Ala(W120A)変異体(実施例Ｉ)(10⁷Ｍ^-1のＫ_aおよび10^-2s^-1以下のｋ_o _ff を有する)を、ビオチニル化分子の可逆的分離を証明するために用いた。W120A は、緩衝液の流れる下でビオチニル化クロマトグラフィー支持体に結合し、そしてその後2mMのビオチンで溶出し得る(図5A)。実験は、以下のように実施した：p H7.4のPBS中の0.4mgのW120Aを、１mlのビオチン−官能基化カラム(Sigma Chemic als, St Louis，MO)に添加した。カラムを５mlのPBSで洗浄して非特異的吸着タンパクを除去し、その後PBS中の２mMビオチンで溶出した。添加したW120Aの全てを、280nmで吸光度を測定したように、ビオチン溶出物中に回収した。WTストレプトアビジンについての同じ実験は、ビオチン結合ストレプトアビジンの例外的な安定性と一致して、強い変性におけるカラムのインキュベートの後でさえビオチンにより溶出し得ない、カラムへのそのタンパク質の不可逆的な結合をもたらした(図5B)。W120AおよびWTストレプトアビジンの固定化ビオチンカラムへの最初の結合は、それらの高いアフィニティーの結果である。次のビオチンの緩衝液フローへの添加において、W120A-ビオチン複合体の速いオフレートは、固定化（カラムに結合した)ビオチンに対する遊離ビオチンの効果的な競合を可能にし、これは結合W120Aの置換を誘導する。WTストレプトアビジンの場合、極めて遅いビオチンのオフレート(ｔ_1/2＝35h)は、固定化ビオチン−WTストレプトアビジンの解離を妨げ、それは必然的にそのタンパク質のカラムへ不可逆的な結合をもたらす。 W120Aの速いオフレートキネティックスはまた、限外濾過および透析によるリガンド-遊離タンパク質の再生を可能にした。逆の実験、ビオチニル化標的の固定化W120Aへの結合、および引き続く遊離ビオチンでの溶出は、本実験と等価である。W120Aの固定化ビオチンへの結合、および遊離ビオチンでのその溶出、ならびにWTストレプトアビジンの不可逆的結合は、アフィニティー分離の最適化におけるアフィニティーとオフレートキネティックスの両方を調節することの重要性を際立たせる。 WTストレプトアビジンおよびW120Aサブユニットの混合を有するキメラ四量体を、等モル量のWTストレプトアビジンおよび120Aを混合することにより作製し、グアニジンチオシアネート中で変性し、引き続き以下のように、透析により変性タンパクをゆっ〈り再生した：WTストレプトアビジンおよびW120A（タンパク容量＝1.13ml)のそれぞれ2.4mgを、7.6mlの６Ｍのグアニジンチオシアネート中で室温で一時間インキュベートし、そして４Ｌの25mM Tris.Cl、80mMグリシン中で４℃にて一晩透析した。次いで透析物をさらなる精製のために回収した。再生の際に、いくつかの異なるタンパク集団が生じる：1:3、2:2、および3:1(WT:W120A )のサブユニット化学量論を有するキメラ四量体、親WTおよびW120A、および凝集 /ミスフォールディングにより生じた変性タンパク質サブユニット。親W120A四量体由来のキメラ四量体およびミスフォールド/凝集タンパクの分離には、2-イミノビオチンアフィニティークロマトグラフィーを利用した。W120Aは2-イミノビオチンに対し10³Ｍ^-1未満の親和性を示した。イミノビオチンカラムへの透析物の通過、およびpH ４での結合タンパクの溶出は、キメラ四量体および親WTストレプトアビジンからなる、最初のタンパク質の^〜20％の回収をもたらした(図6A) 。透析物を結合緩衝液(50mM炭酸ナトリウム、0.5M NaCl pH11)中で平衡化し、そして10mlのイミノビオチンカラム(Pierce，Rockford，IL)に通した。非結合タンパク(^〜4mg)を結合緩衝液中で溶出し、そして特異的結合タンパク(0.8mg)を50mM の酢酸ナトリウム、0.5mM NaCl(pH 4)で溶出した。回収したタンパクを濃縮し、そしてダイアフィルトレーションによりPBS(pH 7.4)中に交換した。キメラ四量体の親WTストレプトアビジンからの分離は、WTストレプトアビジンおよびW120A の非常に異なるビオチンオフレートを用いた。そのタンパク質を^〜２倍過剰のビオチンとインキュベートし、そして過剰のビオチンを除去するために完全に限外濾過した。WT-ビオチン複合体のｔ_1/2は35時間であり、一方W120Aのｔ_1/2が10² 秒未満であるため、これはW120Aビオチン結合部位の実質的な分画からのビオチンの除去をもたらす。次いで、そのタンパク質をビオチンカラムに通し、緩衝液で洗浄し、そして次に２mMビオチンで溶出した(図6B)。ビオチン飽和の親WTストレプトアビジン四量体はカラムと結合せず、一方でフリーのビオチン結合部位を有するWTストレプトアビジン四量体は、ビオチンカラムと不可逆的に結合する（図 5Bを参照のこと)。この工程は、親WTストレプトアビジン四量体からキメラ四量体を効果的に分離する。ビオチンで溶出したタンパク質含有画分は、ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動において、ビオチン結合ストレプトアビジン四量体と類似して移動しこのことは、類似の四次構造であることを示す(μM濃度で混合四量体の20μlを８％アクリルアミドゲルにおいて、SDS非存在下でMiniproteanゲル電気泳動装置 (BioRad Inc.、Hercules、CA)で分析した)。そのタンパク質集団がキメラ四量体から構成されているという直接的な確証は、エレクトロスプレーマススペクトロメトリー(ESMS)から得られた。キメラストレプトアビジン四量体を、非共有結合的会合の保存に有利な条件下でESMSにより分析した。タンパク質濃度(WT+ビオチン、W120A、および混合四量体)は、10mM酢酸アンモニウム中(pH8.6)で10〜50μM 四量体であった。四量体の荷電状態を検出する実験を、低頻度のマス領域で単一の４重極マススペクトロメーター(Extrel Corp.)で行った。機器の詳細および一般の操作条件は、Light-Wahlら、J ．Amer Chem．Soc. 115:5869(1993); Light-W ahlら、J ．Amer Chem．Soc.116:5271(1994); Schwartzら、J ．Amer Soc．Mass S pectrom. 5:201-204(1994); およびSchwartzら、J ．Amer Soc．Mass Spectrom.( 1995)印刷中(本明細書中に参考として援用される)に見出し得る。結果を表Ｖに示す。推定のキメラ四量体の＋14と＋15両方の荷電状態のシフトしたピークの位置（４量体ストレプトアビジンを示唆する）、および親WT＋ビオチンまたはW120A４量体の位置およびFWHMとの比較において、最大値の半分でのより広い全幅(FWHM)( 表VI)は、ビオチン結合WTおよびビオチンフリーW120Aサブユニットを含むキメラ４量体の存在と一致する。＋14の荷電状態およびより広いFWHMの位置のシフトが、ビオチン結合WTおよびW120A四量体の混合集団より生じ得た、という別の説明は、用いたアフィニティー精製により除外される。 WTサブユニットとW120Aサブユニットの両方がこのタンパク質中に存在するというさらなる確証は、４量体の単量体への解離に好ましい条件下でタンパク質を分析することで得られた。単量体イオンを検出するためのESMSの実験を、Finnig anMAT triple quadrupoleマススペクトロメーターで、４量体の＋６および＋７単量体イオンへの解離を誘導するキャピラリー加熱条件下で行った(キャピラリー電圧＝＋2..7kV、キャピラリー温度＝180℃)；サンプルの調製は上記に従った。これらのESMSの結果は＋７および＋６電荷状態にかかわるピークがWTおよびW1 20Aサブユニットの両方から生じるということを示した。マルチサブユニットタンパク質の２つの異なる集団のサブユニット混合を、共鳴エネルギートランスファー実験により証明した。この実験では、１つの集団を蛍光エネルギードナーで標識し、そしてもう一方を相補的な蛍光エネルギーアクセプターで標識した。この方法は一般的に、ErijmanおよびWeber、Biochemistry 30:1595-1599(1991)、およびErijmanおよびWeber、Photochem ．Photobiol. 57: 411-415(1993)(本明細書中に参考として援用される)に記載される。当モル量のフルオレセインイソチオシアネート標識したWTストレプトアビジン(FITC-WTストレプトアビジン)および7-ジエチルアミノ-3-(4’-イソチオシアネートフェニル) -4-メチルクマリン標識したWTストレプトアビジン(CPI-WTストレプトアビジン) を混合し、６Ｍのグアニジンイソチオシアネート中で変性し、そして以下のように、緩衝液中で透析して再生させた：WTストレプトアビジンを、50mM Na₂CO₃、1 50mM NaCl(pH9.0)中で、室温で２時間、10倍モル過剰量のFITCまたCPI(Molecula r Probes，Eugene，OR)中でタンパク質をインキュベートして、FITCまたはCPIで標識した。次いで、標識したタンパク質をゲル濾過(PD-10，Pharmacia，Piscata way，NJ)により非結合フルオロホアから分離した。フルオロホア標識率は、吸光度の測定で決定したように、代表的には４量体当たり３〜４であった。FITC標識 WTストレプトアビジンおよびCPI標識WTストレプトアビジンの当モル量混合物を1 .5mlの６Ｍグアニジンチオシアネート中で１時間、室温でインキュベートし、次いで、25mM Tris．Cl、80mMグリシン(pH8.6)で透析した。蛍光測定は、Hitachi F-5000スペクトロフルオリメーターで行った：励起＝385nm、発光＝400〜500nm 。再生タンパク質４量体およびコントロールの同一濃度を確実に等しくするように注意を払う一方で、透析から生じる希釈の効果を、各サンプルのトリプトファン蛍光を標準化して補正した。従って、これらの２つの異なる４量体集団の物理的混合に際して(カオトロープにより誘導された変性およびタンパタ質リフォールディングが続く)、共鳴エネルギートランスファーの発生は、２つの異なるサブユニットタイプからなる、キメラ４量体の生成を明らかに証明した。WTストレプトアビジンでの結果を図１に示す：再生混合物の発光スペクトルは、変性／再生を受けていないこれらの２つの標識タンパク質混合物と比較して、FITC標識WTストレプトアビジン(蛍光エネルギーアクセプター)の強度における顕著な増強を示し、これは蛍光エネルギートランスファーの発生を示す。蛍光共鳴エネルギートランスファーの観察は、同一(四量体の)分子におけるドナーおよびアクセプター標識の存在の診断になる (FITC標識WTストレプトアビジンおよびCPI標識WTストレプトアビジン両方のサブユニットからなるキメラストレプトアビジン四量体の創出の結果)。これらの結果は、標的化成分(WTサブユニットに結合したビオチン)およびイメージング成分(キメラストレプトアビジン四量体のW120Aサブユニットによるビオチンカラムへの結合)は、異なるサブユニットアフィニティーおよびビオチン解離キネティックスで、キメラストレプトアビジン四量体を用いることにより分離され得るということを証明する。従って、薬物送達、イメージング、および他のそのような使用に関して、キメラ四量体が、より低いアフィニティーサブユニットの速いオフレートにより、高いアフィニティーサブユニットに選択的に分割されるように、ビオチニル化分子(例えば、ビオチニル化抗体)とともにロードされる。ビオチニル化標的／キメラ複合体は、抗体を介して所望の部位に標的化する。イメージング剤および薬物は循環し、より低いアフィニティーサブユニットにより捕獲される。前述の発明を、理解を明確にする目的で、例示および実施例により、いくらか詳細に記載したが、ある種の変化および改変が、添付の請求の範囲の範囲内で実施され得ることは明白である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．野生型のストレプトアビジンに比べて、ビオチンに対する四量体の結合アフィニティーの減少または解離速度定数の増加をもたらす、アミノ酸79位、92位、 108位、または120位のトリプトファン残基のアミノ酸置換を有する少なくとも１つの単量体を含む、ストレプトアビジン四量体。２．ビオチンに対する前記四量体の結合アフィニティーが約１×10¹³Ｍ^-1未満である、請求項１に記載のストレプトアビジン四量体。３．少なくとも２つの単量体が、ビオチンに対する前記四量体の結合アフィニティーの減少をもたらすアミノ酸改変を有する、請求項１に記載のストレプトアビジン四量体。４．少なくとも３つの単量体が、ビオチンに対する前記四量体の結合アフィニティーの減少をもたらすアミノ酸改変を有する、請求項３に記載のストレプトアビジン四量体。５．前記四量体を含む４つの単量体全てが、ビオチンに対する前記四量体の結合アフィニティーの減少をもたらすアミノ酸改変を有する、請求項４に記載のストレプトアビジン四量体。６．前記アミノ酸置換がアミノ酸残基79位である、請求項１に記載のストレプトアビジン四量体。７．前記トリプトファン残基がアミノ酸残基120位である、請求項１に記載のストレプトアビジン四量体。８．前記トリプトファン残基がアミノ酸残基108位である、請求項１に記載のストレプトアビジン四量体。９．さらに野生型のストレプトアビジンに比較して、平衡エンタルピーの減少、平衡自由エネルギーの減少、活性化自由エネルギーの減少、または活性化エンタルピーの減少を有する、請求項１に記載のストレプトアビジン単量体。１０．さらに野生型ストレプトアビジンに比較して、平衡エンタルピーの増加または活性化エンタルピーの増加を有する、請求項１に記載のストレプトアビジン単量体。１１．野生型のストレプトアビジンに比べて、ビオチンに対するストレプトアビジン四量体の結合アフィニティーの減少または解離速度定数の増加をもたらす、アミノ酸79位、92位、108位、または120位のトリプトファン残基のアミノ酸置換を有するストレプトアビジン単量体をコードする、単離されたポリヌクレオチド分子。１２．前記アミノ酸位の少なくとも２つのアミノ酸置換をコードする、請求項１１に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。１３．アミノ酸79位、92位、108位、または120位におけるトリプトファン残基に対するアミノ酸置換を有する改変された単量体が４つ未満であるが少なくとも１つの改変された単量体を有するキメラストレプトアビジン四量体を生産する方法であって、ここで該置換が、野生型のストレプトアビジンに比較して、ビオチンに対する結合アフィニティーの減少または解離速度定数の増加をもたらし：アミノ酸置換の少なくとも１つを有するストレプトアビジンの同種四量体を生産する工程；該同種ストレプトアビジン四量体を単量体および/または二量体サブユニットに分離する工程；および該アミノ酸置換を有するストレプトアビジン単量体および/または二量体を、該回じ置換を有しないストレプトアビジン単量体または二量体サブユニットと、ストレプトアビジン四量体のリフォールディングを可能にする条件下で混合し、それによりキメラストレプトアビジン四量体を生産する工程、を包含する方法。１４．分離する工程がグアニジンイソチオシアネート中での変性による、請求項１３に記載の方法。１５．前記の特徴が、ビオチンに対するストレプトアビジンの結合アフィニティーの減少をもたらすアミノ酸改変である、請求項１３に記載の方法。１６．前記アミノ酸置換を有するストレプトアビジン単量体および/または二量体がさらに標識、薬物、毒素、標的化分子、金属、または酵素を有する、請求項１３に記載の方法。１７．アミノ酸79位、92位、108位、または120位のトリプトファン残基に対するアミノ酸置換を有する前記ストレプトアビジン改変単量体が、さらに該四量体の単量体/単量体または二量体/二量体接触面に共有結合するアミノ酸配列中に少なくとも１つのシステイン残基を含む、請求項１３に記載の方法。１８．前記システインがH127位に位置している、請求項１７に記載の方法。１９．前記標的物を含む異種の懸濁物から標的物を分離する方法であって： a)該懸濁物を、該標的物に結合するビオチニル化された結合成分と、ビオチニル化された標的物複合体を形成するために反応させる工程； b)該ビオチニル化された標的物複合体を含む懸濁物を、改変がアミノ酸79位、 92位、108位、または120位におけるトリプトファン残基に対するアミノ酸置換であり、そして該置換が、野生型ストレプトアビジンに比較して、ビオチンに対する結合アフィニティーの減少または解離速度定数の増加をもたらす、改変された単量体が４つ未満であるが少なくとも１つの改変された単量体を含むキメラストレプトアビジン四量体に、曝露する工程；および該ビオチニル化標的物複合体を、該キメラストレプトアビジン四量体から富化された形態で該標的物を回収するために、該懸濁物から分離する工程、を包含する、方法。２０．前記標的物が造血幹細胞である、請求項１９に記載の方法。２１．前記ビオチニル化結合成分が、CD34+造血幹細胞に特異的に結合する抗体である、請求項２０に記載の方法。２２．前記異種懸濁物が骨髄、末梢血、または臍帯血であり、そして前記ビオチニル化抗体標的物複合体が、前記キメラストレプトアビジン四量体が、固体相に吸着されたカラム内で、該キメラストレプトアビジン四量体に曝露される、請求項２１に記載の方法。