KR20230165919A - 루프 또는 말단에서 펩티드 태그와 상호작용하는 폴리펩티드 및 그의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 폴리펩티드가 펩티드 태그와 자발적으로 이소펩티드 결합을 형성하는 2-파트 링커의 한 부분, 상기 2-파트 링커의 제 2 부분을 형성하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 및 상기 벡터 및 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다. 상기 2-파트 링커(즉, 펩티드 태그 및 폴리펩티드 결합 파트너), 및/또는 핵산 분자/벡터를 포함하는 키트가 또한 제공된다. 폴리펩티드의 제조 방법 및 본 발명의 폴리펩티드의 용도가 또한 제공된다.
Description
본 발명은 한 측면에서 폴리펩티드(단백질)가 펩티드 태그와 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성하는 2-파트 링커(two-part linker)의 한 부분, 상기 2-파트 링커의 제 2 부분을 형성하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 특히, 상기 2-파트 링커는 본 발명의 폴리펩티드와 펩티드 태그 사이의 이소펩티드 결합의 자발적 형성을 허용하는 조건 하에 접촉될 때 공유 결합을 통해 접합될 수 있는 펩티드 태그 및 폴리펩티드 결합 파트너 동족 쌍(peptide tag and polypeptide binding partner cognate pair)으로서 간주될 수 있다. 제 2 측면에서, 본 발명은 또한 그의 동족 펩티드 태그(리간드)에 선택적으로 (예를 들어 특이적으로) 및 가역적으로 결합하는, 즉 펩티드 태그와 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성하지 않는 변형된 폴리펩티드(단백질)를 포함하는 친화성 정제 시스템(affinity purification system)을 제공한다. 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 및 상기 벡터 및 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다. 상기 폴리펩티드(예를 들어 펩티드 태그 및 폴리펩티드 결합 파트너), 및/또는 핵산 분자/벡터를 포함하는 키트가 또한 제공된다. 상기 폴리펩티드를 포함하는 추가의 생성물 및 본 발명의 폴리펩티드의 용도가 또한 제공된다.
세포 기능은 막대한 수의 가역적인 비공유 단백질-단백질 상호작용에 의존하고 복합체 내 단백질의 정확한 배열이 그 기능에 영향을 미치고 그 기능을 결정한다. 따라서, 공유 단백질-단백질 상호작용을 조작하는 능력은 기초 연구, 합성 생물학 및 생명공학에 다양한 새로운 기회를 가져오게 할 수 있다. 특히, 소위 "융합 단백질"을 형성하기 위한 2 이상의 단백질의 접합은 유용한 특성을 갖는 분자를 생성할 수 있다. 예를 들어 백신의 반복 항원 구조와 같은 단일 종류의 단백질 클러스터링(clustering)은 종종 생물학적 신호를 크게 향상시킨다. 상이한 활성을 갖는 단백질의 클러스터링도 역시 효소에 의한 기질 채널링(channelling)과 같은 향상된 활성을 가진 복합체를 생성할 수 있다.
전형적으로, 공유 단백질 상호작용은 이황화 결합을 통해 매개되지만, 이황화물은 가역적이고, 환원성 세포 구획에 적용할 수 없으며, 단백질 폴딩(folding)을 방해할 수 있다. 펩티드 태그는 작은 크기가 단백질 기능에 대한 혼란을 최소화하기 때문에 단백질 분석 및 변형에 편리한 도구이다. 펩티드 태그는 유전자 암호화가 간단하고 크기가 작기 때문에 (i) 다른 상호작용 방해(interfering with other interactions), (ii) 생합성 비용 및 (iii) 면역원성 도입(introduction of immunogenicity)으로부터 붕괴(disruption)를 감소시킨다. 그러나, 펩티드 태그와 이들의 펩티드 또는 폴리펩티드 결합 파트너 사이의 상호작용은 높은 친화성이 거의 없으며, 이는 안정한 복합체의 형성에 있어서 유용성을 제한한다.
자발적 이소펩티드 결합 형성이 가능한 단백질(소위 "이소펩티드 단백질")은 서로 공유적으로 결합하여 돌이킬 수 없는 상호작용을 제공하는 펩티드 태그/폴리펩티드 결합 파트너 쌍(즉, 2-파트 링커)을 개발하는데 유리하게 사용되어왔다(참조: 예를 들어 WO2011/098772, WO 2016/193746, WO 2018/197854 및 WO2020/183198 모두 본원에 참조로 포함됨). 이와 관련하여, 자발적인 이소펩티드 결합 형성이 가능한 단백질은 별도의 단편으로 발현되어 펩티드 태그 및 이 펩티드 태그에 대한 폴리펩티드 결합 파트너를 제공할 수 있으며, 여기서 두 단편은 이소펩티드 결합 형성에 의해 공유적으로 재구성될 수 있어, 펩티드 태그 및 이의 폴리펩티드 결합 파트너에 융합된 분자 또는 성분을 연결시킨다.
이소펩티드 결합은 카복실/카르복스 아미드와 아미노기 사이에 형성된 아미드 결합이며, 여기서 카복실 또는 아미노기 중의 적어도 하나는 단백질 주쇄(단백질의 골격)의 외측에 있다. 이러한 결합은 전형적인 생물학적 조건 하에서 화학적으로 비가역적이고 대부분의 프로테아제에 내성이 있다. 이소펩티드 결합은 본질적으로 공유성이므로, 몇몇 측정된 최강의 단백질 상호작용을 초래한다. 펩티드 태그 및 이의 폴리펩티드 결합 파트너에 의해 형성된 이소펩티드 결합은 비공유 상호작용이 빠르게 해리되는 조건, 예를 들어 장시간(예를 들어 몇 주), 고온(최소 95℃), 강한 힘 또는 가혹한 화학 처리(예를 들어 pH 2-11, 유기 용매, 계면활성제 또는 변성제) 하에 안정적이다.
간단히 말하면, 2-파트 링커, 즉 펩티드 태그 및 이의 폴리펩티드 결합 파트너(소위 펩티드 태그/결합 파트너 쌍)는 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성할 수 있는 단백질(이소펩티드 단백질)로부터 유래될 수 있고, 단백질의 도메인은 별도로 발현되어 이소펩티드 결합에 관여하는 잔기 중의 하나(예 : 아스파 테이트 또는 아스파라긴)를 포함하는 펩티드 태그 및 이소펩티드 결합에 관여하는 다른 잔기(예를 들어 리신) 및 이소펩티드 결합을 형성하는데 필요한 하나 이상의 다른 잔기(예를 들어 글루타메이트)를 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드 결합 파트너(또는 "캐처")를 생성한다. 펩티드 태그와 결합 파트너를 혼합하면 태그와 결합 파트너 사이에 이소펩티드 결합이 자발적으로 형성된다. 따라서, 펩티드 태그 및 결합 파트너를 다른 분자 또는 성분(예를 들어 단백질)에 별도로 융합시킴으로써, 펩티드 태그와 결합 파트너 사이에 형성된 이소펩티드 결합을 통해 상기 분자 또는 성분을 함께 공유적으로 연결하는 것, 즉 펩티드 태그및 결합 파트너에 융합된 분자 또는 성분 사이에 링커를 형성하는 것이 가능하다.
고전적인 유전적 융합으로부터 진행된 효소적 결찰(enzymatic ligations) 및 2-파트 펩티드 태그/폴리펩티드 결합 파트너 쌍(즉, 2-파트 링커), 예를 들어 본원에 개시되고 상기 언급된 것에 이르기까지 그의 말단에서 단백질을 연결하는 많은 효율적인 방법이 있다. 천연 화학적 결찰(native chemical ligation), 분할 인테인(split inteins), 소르타제(sortase) 및 부티라제(butelase)를 포함한 단백질 단위의 번역후 연결을 확립하기 위해 광범위한 작업이 수행되었다. 그러나, 이들 연결 방법 중 몇몇은 내부 부위에서 단백질을 결찰하는데 부적절하다. 예를 들어 분할 인테인은 단백질의 말단에 있어야 한다. 유사하게, 소르타제 효소는 단백질의 말단에서 거의 항상 사용되고, 매우 높은 농도의 올리고글리신 반응물을 필요로 한다. 내부 부위에서 단백질-단백질 결찰에 대한 관심이 훨씬 덜 많았고, 여기서 말단에서보다 더 많은 입체 장애 및 더 적은 접근가능한 화학이 존재한다. 천연 단백질의 N- 및 C-말단은 종종 고도로 가요성이고 더 노출되어 반응을 용이하게 하는 반면, 내부 루프는 다양한 구조를 채택할 수 있고, 단백질 폴딩 또는 기능을 방해하는 루프에서 펩티드 태그의 삽입의 무수한 예가 존재한다. 따라서, 더 낮은 가요성 및 더 가변적인 환경으로 인해 내부 부위, 예를 들어 단백질 루프에서 단백질을 함께 연결하는 것이 훨씬 더 어렵다.
그러나, 일부 적용에서, 내부 부위에서 단백질을 함께 연결하는 것이 필요하거나 바람직하다. 다수의 단백질은 그의 말단에서 융합에 적합하지 않고, 예를 들어 단백질의 기능에 중요한 말단을 갖는 것(예를 들어 프로테아솜), 또는 원형질막의 세포내 측면 상에 위치된 말단을 갖는 것(예를 들어 테트라스판닌 및 많은 이온 채널), 또는 단백질간 계면에 매립된 것(예를 들어 Qβ 바이러스-유사 입자)을 포함한다. 말단이 가능한 융합 부위인 경우에도, 내부 융합, 예를 들어 루프 융합은 여전히 단백질 배향을 제어하는데 바람직할 수 있고, 예를 들어 진단제의 표면에서, 다중-효소 복합체에서, 또는 백신 접합체에서 제어할 수 있다.
본 발명자들은 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes ) FbaB 단백질의 CnaB2 도메인을 기반으로 하여, SpyTag/SpyCatcher로 알려진, 또 다른 2-파트 펩티드 태그/폴리펩티드 결합 파트너 시스템을 미리 개발하였다(문헌 [Zakeri et al., 2012, Proc Natl Acad Sci U S A 109, E690-E697]). 이 시스템의 가장 최근 버전(iteration)인 SpyTag003/SpyCatcher003은 말단에서 단백질-단백질 반응에 대해 가장 빠른 반응성을 갖도록 이전에 확립된 쌍이다(WO2020/183198 참조, 본원에 참조로 포함됨). 그러나, 실시예에 나타낸 바와 같이, SpyTag003이 특정 단백질의 특정 루프 영역 내로 내부적으로 삽입될 수 있고 그의 동족 파트너 SpyCatcher003과 반응할 수 있지만, SpyTag003이 동일한 단백질의 말단에서 융합되었을 때와 비교하여 반응 속도가 상당히 감소되었다. 더욱이, 특정 경우에, SpyTag003이 주어진 단백질의 루프 영역 내로 삽입되었을 때, 단백질의 발현은 전혀 가능하지 않았다.
내부 부위에서 단백질을 함께 연결하기 위한 대안적인 시스템은 이소펩티드 결합 형성에 관여하는 잔기를 별도로 포함하는, 즉 3개의 별개의 단편으로서, 즉 2개의 펩티드 및 폴리펩티드로서 포함하는 이소펩티드 단백질의 도메인을 발현시킴으로써 제공될 수 있다(예를 들어 문헌 [Fierer et al. 2014, PNAS E1176-E1181] 참조). 하나의 이러한 시스템은 RrgA를 기반으로 하여 본 발명자들에 의해 개발되었다(WO2018/189517 참조, 본원에 참조로 포함됨). RrgA 단백질은 3개의 별개의 성분, 즉 이소펩티드 결합에 관여하는 잔기 중의 하나(예를 들어 리신)를 포함하는 제 1 펩티드 태그(SnoopTagJr로 지칭됨), 이소펩티드 결합에 관여하는 다른 잔기(예를 들어 아스파라긴)를 포함하는 제 2 펩티드 태그(DogTag로 지칭됨) 및 이소펩티드 결합 형성을 매개하는데 관여하는 잔기(예를 들어 글루타메이트)를 포함하는 폴리펩티드(SnoopLigase로 지칭됨);으로 분할되었다. 모든 3개의 단편, 즉 펩티드 및 폴리펩티드 둘 다를 혼합하는 것은 반응하여 이소펩티드 결합을 형성하는 잔기를 포함하는 2개의 펩티드 사이의, 즉 SnoopTagJr과 DogTag 사이의 이소펩티드 결합의 형성을 초래한다. 그러나, SnoopLigase의 반응 속도는 상대적으로 느려서(완료에 도달하기까지 약 48시간), 이는 특히 세포 시스템에서 그의 적용을 제한한다. 또한, SnoopLigase 시스템은 특정 완충액과 양립할 수 없고, 예를 들어 특히 포유동물 발현 시스템과 함께 실제로 항상 가능한 것은 아닌, 상대적으로 높은 농도의 구성 성분을 필요로 한다.
따라서, 내부 부위에서 단백질을 연결할 수 있는 개선된 링커 시스템이 필요하다.
RrgATag/RrgACatcher로 지칭되는 펩티드 태그/결합 파트너 쌍(2-파트 링커)은 인간에서 패혈증, 폐렴 및 수막염을 유발할 수 있는 그람-양성 박테리아(Gram-positive bacterium)인 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)로부터의 어드헤신 단백질(adhesin protein) RrgA로부터 유래되었다. 잔기 Lys742와 Asn854 사이의 RrgA의 D4 이뮤노글로불린-유사 도메인에서 자발적인 이소펩티드 결합이 형성된다. 이러한 D4 도메인은 RrgATag(서열번호 4) 및 RrgACatcher(서열번호 6)로 지칭되는 링커 쌍으로 이전에 분할되었다(WO2016/19374 참조, 본원에 참조로 포함됨). RrgATag는 RrgA 단백질의 잔기 838-856으로부터 유래되고, 따라서 Asn854 잔기를 포함하는 반면, RrgACatcher(R2Catcher로도 알려짐)는 RrgA 단백질의 잔기 734-837에 상응하고, 따라서 Lys742 잔기를 포함한다. 따라서, RrgATag(서열번호 4) 및 RrgACatcher(서열번호 6)는 자발적으로 이소펩티드 결합을 형성할 수 있다.
정제된 RrgATag 및 RrgACatcher는 혼합 시 성공적으로 재구성되고 반응할 수 있지만, 이소펩티드 결합 형성 속도는 특히 링커가 세포 발현 수준과 동등한 농도로 존재하는 경우에 비교적 느렸다. RrgATag의 조작된 버전(DogTag, 서열번호 3)은 더 빠른 재구성, 즉 RrgACatcher와의 이소펩티드 결합의 더 빠른 형성 속도를 갖는 것으로 나타났다. RrgATag는 RrgA의 위치 842에 상응하는 위치에서 Gly 잔기 대신에 Thr 잔기를 함유한다. 이러한 서열을 RrgA의 잔기 857-860에 상응하는 잔기를 함유하도록 펩티드를 연장하도록 추가로 변형시키고, RrgATag 내의 위치 848에 상응하는 Asp 잔기를 Gly로 치환시켰다. 이들 2개의 변형을 갖는 RrgATag(C-말단 연장 및 D848G)를 RrgATag2(서열번호 5)로 지칭하였다. 또한, RrgATag 및 RrgATag2 내의 RrgA의 위치 847에 상응하는 Asn 잔기를 Asp로 치환시켰다. 이들 변형 모두 3개를 갖는 RrgATag(C-말단 연장, N847D, 및 D848G)를 DogTag(서열번호 3)으로 지칭하였다.
DogTag는 실시예에서 나타낸 바와 같이 RrgATag 및 태그의 다른 버전, 예를 들어 R2Tag(서열번호 17)에 비해 RrgACatcher와의 개선된 반응 속도를 갖지만, 낮은 농도에서 반응 속도는 여전히 느렸다. 또한, RrgACatcher 폴리펩티드는 특정 조건에서 제한된 용해도를 갖는 것으로 관찰되었다.
발명의 요약
본 발명자들은, 놀랍게도, RrgACatcher 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변형(즉, 돌연변이)시킴으로써 RrgACatcher 폴리펩티드의 반응 속도를 적어도 10배(an order of magnitude) 증가시킬 수 있으며, 통상의 완충액 및 조건에서 폴리펩티드의 용해도를 크게 개선시킬 수 있음을 확인하였다. 현저하게 그리고 예상외로, 반응 속도 및 용해도를 증가시키는 변형은 폴리펩티드의 다른 바람직한 특성에 악영향을 미치지 않는다. 따라서, 본 발명의 변형된 RrgACatcher 폴리펩티드(DogCatcher, 서열번호 1로 지칭됨)는 원래의 RrgACatcher 폴리펩티드보다 DogTag와 10배 초과의 반응 속도를 가지며, 이의 증가된 용해도 때문에 광범위한 조건 하에서 다양한 응용에 사용될 수 있다.
이론에 구애됨이 없이, DogCatcher 폴리펩티드를 생성하는 RrgACatcher 폴리펩티드에 대한 10개의 변형 중에서, 7개("용해도 변형"으로 지칭됨)가 폴리펩티드의 용해도를 증가시키도록 독립적으로 기능할 수 있다는 것이 전제된다. 용해도 변형 중 7개 모두를 함유하는 RrgACatcher의 서열은 RrgACatcherB 또는 R2CatcherB(서열번호 8)로 지칭된다. DogCatcher를 RrgACatcher와 구별하는 나머지 3개의 변형("반응성 변형"으로 지칭됨)은 DogTag 펩티드와의 반응 속도를 증가시키도록 독립적으로 기능할 수 있는 것으로 고려된다. 반응성 변형 중 3개 모두를 함유하는 RrgACatcher의 서열은 서열번호 9에 제공된다. 따라서, RrgACatcher의 아미노산 서열에 비해 본 발명의 폴리펩티드(DogCatcher(서열번호 1) 또는 DogCatcher 변이체(예를 들어 서열번호 8 또는 9))에서 용해도 및 반응성 변형 각각이 폴리펩티드의 용해도 및 반응성을 각각 개별적으로 개선시킬 수 있는 것으로 고려된다.
추가로, 본원에 예시된 폴리펩티드(즉, DogCatcher, 서열번호 1)는 폴리펩티드의 활성을 현저히 감소시키지 않으면서 N-말단 및/또는 C-말단에서 절단될 수 있는 것으로 고려된다. 특히, 서열번호 1은 N-말단에서 4개 이하의 아미노산(예를 들어 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산) 및/또는 C-말단에서 5개 이하의 아미노산(예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산)에 의해 절단될 수 있다.
유리하게는, 본 발명의 폴리펩티드(돌연변이체 "캐처(catcher)" 또는 펩티드 태그 결합 파트너)(DogCatcher, 서열번호 1)는 따라서 펩티드 태그 및 폴리펩티드 결합 파트너의 단지 낮은 농도가 이용가능한, 예를 들어 생체내에서 이의 동족 펩티드 태그, 예를 들어 DogTag(서열번호 3)와 함께(즉, 2-파트 링커로서) 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)는 또한 높은 민감성 및/또는 속도를 필요로 하는 분석 검정, 예를 들어 펩티드 태그(예를 들어 DogTag, 서열번호 3)가 에피토프 태그로서 사용되는 웨스턴 블롯에서 특히 유용할 수 있다. 본 발명의 돌연변이체 캐처(폴리펩티드)의 개선된 속도 상수는 또한 태그 및/또는 캐처가 반응을 느리게 할 수 있는 분자 또는 성분(예를 들어 대형 단백질(large proteins))에 융합되는 반응에서, 및 태그 및/또는 캐처에 융합된 분자 또는 성분이 예를 들어 백신 조립을 위한 바이러스-유사 입자의 형성에서 입체 장애를 야기하는 반응에서 유리하다.
이와 관련하여, 본 발명자들은 DogTag가 유래되는 RrgA의 도메인 4의 서열(잔기 838 내지 860)이 반응성 Asn854 잔기를 포함하는 β-헤어핀을 형성하고, 따라서 이것이 루프-친화적 태그/캐처 쌍(즉, 내부 부위, 예를 들어 단백질 루프에서 단백질을 연결할 수 있는 태그/캐처 쌍)의 기초를 형성할 수 있다는 가설을 주목하였다. 놀랍게도 그리고 유리하게, DogTag가 상기 단백질의 발현 또는 기능을 방해하지 않으면서 상이한 단백질에서 다양한 루프 부위 내로 삽입될 수 있고, 본 발명의 폴리펩티드(DogCatcher, 서열번호 1)와 이의 결합 파트너(DogTag, 서열번호 3) 사이의 반응 속도는 DogTag가 말단 부위에서 단백질 내로 삽입되는지 또는 내부, 예를 들어 루프 부위에서 단백질 내로 삽입되는지에 관계없이 필적할만한 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 폴리펩티드를 수반하는 DogTag/DogCatcher 2-파트 링커는 펩티드 태그가 특정 단백질 루프 부위 내로 삽입될 때 SpyTag003/SpyCatcher003의 반응 속도보다 대략 10배 더 빠른 반응 속도를 나타냈다. 하기 실시예에서 더 상세히 설명되는 바와 같이, DogTag/DogCatcher 2-파트 링커는 DogTag가 주로 α-나선, 주로 β-시트, 또는 α+β 폴드(folds)인 단백질 내로 내부적으로 삽입될 때 기능적임이 입증되었다. 더욱이, 상기 언급된 돌연변이의 결과로서, DogCatcher 폴리펩티드는 다양한 완충액에서 가용성이고, 따라서 DogTag/DogCatcher 2-파트 링커는 다양한 조건에서 더 낮은 농도에서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 폴리펩티드(DogCatcher, 서열번호 1)는 펩티드 태그가 당해의 분자 또는 성분 내에 내부적으로 삽입되는 높은 반응 속도, 예를 들어 이것이 내부 단백질, 예를 들어 루프, 부위에 삽입되는 높은 반응 속도에서 자발적으로 이소펩티드 결합을 형성할 수 있는 2-파트 링커 시스템의 한 부분을 형성한다. 그러므로 이러한 2-파트 링커는 특정 단백질, 특히 단백질 중의 적어도 하나의 말단이 융합을 위한 최적 부위가 아닌 특정 단백질 사이에 공유 단백질 결찰을 도입하는 개선된 방법을 제공한다.
대안적으로 보면, 본 발명의 폴리펩티드(DogCatcher, 서열번호 1)는 이의 동족 펩티드 태그(DogTag, 서열번호 3)와 조합하여 단백질을 내부 부위, 예를 들어 단백질 루프에서 함께 연결하는데 특히 유용한 2-파트 링커 시스템을 제공한다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은,
i) 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열; 또는
ii) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 (i)의 부분;
iii) 서열번호 1에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어 서열번호 1에 제시된 서열에 대해 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일함)을 갖는 아미노산 서열, 상기 아미노산 서열은 위치 9의 리신, 위치 70의 글루탐산 및 다음:
1) 위치 4의 글루탐산;
2) 위치 11의 아스파르트산;
3) 위치 13의 트레오닌;
4) 위치 47의 아스파르트산;
5) 위치 59의 트레오닌;
6) 위치 69의 이소류신;
7) 위치 75의 프롤린;
8) 위치 87의 세린;
9) 위치 89의 아르기닌; 및
10) 위치 92의 아스파르트산;
중의 하나 이상을 포함하되;
상기 아미노산 서열이 위치 75의 프롤린을 포함하는 경우, 이는 또한 상기 1) 내지 6) 및 8) 내지 10)으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 1에서의 위치와 동등한 위치에 있음; 또는
iv) 서열번호 2에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어 서열번호 2에 제시된 서열에 대해 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일함)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 (iii)의 부분, 상기 아미노산 서열은 위치 5의 리신, 위치 66의 글루탐산 및 다음:
1) 위치 7의 아스파르트산;
2) 위치 9의 트레오닌;
3) 위치 43의 아스파르트산;
4) 위치 55의 트레오닌;
5) 위치 65의 이소류신;
6) 위치 71의 프롤린;
7) 위치 83의 세린;
8) 위치 85의 아르기닌; 및
9) 위치 88의 아스파르트산;
중의 하나 이상을 포함하되;
상기 아미노산 서열이 위치 71의 프롤린을 포함하는 경우, 이는 또한 상기 1) 내지 5) 및 7) 내지 9)로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 2에서의 위치와 동등한 위치에 있음;
을 포함하는 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)를 제공하되,
상기 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드와 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성할 수 있고, 상기 이소펩티드 결합은 서열번호 3의 위치 17의 아스파라긴 잔기와 서열번호 1의 위치 9 또는 서열번호 2의 위치 5의 리신 잔기 사이에 형성된다.
대안적인 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는,
i) 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열; 또는
ii) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 (i)의 부분;
iii) 서열번호 1에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어 서열번호 1에 제시된 서열에 대해 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일함)을 갖는 아미노산 서열, 상기 아미노산 서열은 위치 9의 리신, 위치 70의 글루탐산, 다음:
1) 위치 4의 글루탐산;
2) 위치 11의 아스파르트산;
3) 위치 13의 트레오닌;
4) 위치 47의 아스파르트산;
5) 위치 59의 트레오닌;
6) 위치 75의 프롤린; 및
7) 위치 92의 아스파르트산;
중의 하나 이상 및 다음:
1) 위치 69의 이소류신;
2) 위치 87의 세린; 및
3) 위치 89의 아르기닌;
중의 하나 이상을 포함하되;
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 1에서의 위치와 동등한 위치에 있음; 또는
iv) 서열번호 2에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어 서열번호 2에 제시된 서열에 대해 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일함)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 (iii)의 부분, 상기 아미노산 서열은 위치 5의 리신, 위치 66의 글루탐산, 다음:
1) 위치 7의 아스파르트산;
2) 위치 9의 트레오닌;
3) 위치 43의 아스파르트산;
4) 위치 55의 트레오닌;
5) 위치 71의 프롤린; 및
6) 위치 88의 아스파르트산;
중의 하나 이상 및 다음:
1) 위치 65의 이소류신;
2) 위치 83의 세린; 및
3) 위치 85의 아르기닌;
중의 하나 이상을 포함하되;
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 2에서의 위치와 동등한 위치에 있음;
을 포함할 수 있고,
상기 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드와 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성할 수 있고, 상기 이소펩티드 결합은 서열번호 3의 위치 17의 아스파라긴 잔기와 서열번호 1의 위치 9 또는 서열번호 2의 위치 5의 리신 잔기 사이에 형성된다.
대안적으로 보면, 본 발명은,
i) 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열; 또는
ii) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 (i)의 부분;
iii) 서열번호 1에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어 서열번호 1에 제시된 서열에 대해 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일함)을 갖는 아미노산 서열, 상기 아미노산 서열은 위치 9의 리신, 위치 70의 글루탐산 및 다음:
1) 위치 4의 글루탐산;
2) 위치 11의 아스파르트산;
3) 위치 13의 트레오닌;
4) 위치 47의 아스파르트산;
5) 위치 59의 트레오닌;
6) 위치 69의 이소류신;
7) 위치 75의 프롤린;
8) 위치 87의 세린;
9) 위치 89의 아르기닌; 및
10) 위치 92의 아스파르트산;
중의 하나 이상을 포함하되;
(A) 상기 아미노산 서열이 위치 75의 프롤린을 포함하는 경우, 이는 또한 상기 1) 내지 6) 및 8) 내지 10)으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하거나; 또는 (B) 상기 아미노산 서열은 상기 1) 내지 5), 7) 및 10)으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 잔기 및 상기 6), 8) 및 9)로부터 선택된 하나의 아미노산 잔기를 포함하며,
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 1에서의 위치와 동등한 위치에 있음; 또는
iv) 서열번호 2에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어 서열번호 2에 제시된 서열에 대해 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일함)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 (iii)의 부분, 상기 아미노산 서열은 위치 5의 리신, 위치 66의 글루탐산 및 다음:
1) 위치 7의 아스파르트산;
2) 위치 9의 트레오닌;
3) 위치 43의 아스파르트산;
4) 위치 55의 트레오닌;
5) 위치 65의 이소류신;
6) 위치 71의 프롤린;
7) 위치 83의 세린;
8) 위치 85의 아르기닌; 및
9) 위치 88의 아스파르트산;
중의 하나 이상을 포함하고;
(A) 상기 아미노산 서열이 위치 71의 프롤린을 포함하는 경우, 이는 또한 상기 1) 내지 5) 및 7) 내지 9)로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하거나; 또는 (B) 상기 아미노산 서열은 상기 1) 내지 4), 6) 및 9)로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 잔기 및 상기 5), 7) 및 8)로부터 선택된 하나의 아미노산 잔기를 포함하되,
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 2에서의 위치와 동등한 위치에 있음;
을 포함하는 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)를 제공하되,
상기 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드와 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성할 수 있고, 상기 이소펩티드 결합은 서열번호 3의 위치 17의 아스파라긴 잔기와 서열번호 1의 위치 9 또는 서열번호 2의 위치 5의 리신 잔기 사이에 형성된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드에 연결된 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 재조합 또는 합성 폴리펩티드를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 이소펩티드 결합을 통해 2개의 분자 또는 성분을 접합시키기 위한 본 발명의 폴리펩티드의 용도를 제공하되,
이소펩티드 결합을 통해 접합된 상기 분자 또는 성분은:
a) 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 제 1 분자 또는 성분; 및
b) (i) 서열번호 3-5 또는 17 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드; 및 (ii) 서열번호 3-5 또는 17 중의 어느 하나에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열(예를 들어 서열번호 3-5 또는 17 중의 어느 하나에 제시된 서열에 대해 적어도 85, 90 또는 95% 동일함)을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열은 위치 17의 아스파라긴 잔기를 포함하고, 선택적으로 위치 5의 트레오닌 잔기, 위치 10의 아스파르트산 잔기 및 위치 11의 글리신 잔기를 포함함;으로부터 선택된 펩티드를 포함하는 제 2 분자 또는 성분;
을 포함하되,
상기 펩티드는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성할 수 있고, 상기 이소펩티드 결합은 서열번호 3, 4, 5 또는 17의 위치 17의 아스파라긴 잔기와 서열번호 1의 위치 9의 리신 잔기 사이에 형성된다.
대안적으로 보면, 본 발명은 이소펩티드 결합을 통해 2개의 분자 또는 성분을 접합시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은:
a) 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 제 1 분자 또는 성분을 제공하는 단계; 및
b) (i) 서열번호 3-5 또는 17 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드; 및 (ii) 서열번호 3-5 또는 17 중의 어느 하나에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열(예를 들어 서열번호 3-5 또는 17 중의 어느 하나에 제시된 서열에 대해 적어도 85, 90 또는 95% 동일함)을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열은 위치 17의 아스파라긴 잔기를 포함하고, 선택적으로 위치 5의 트레오닌 잔기, 위치 10의 아스파르트산 잔기 및 위치 11의 글리신 잔기를 포함함;으로부터 선택된 펩티드를 포함하는 제 2 분자 또는 성분을 제공하는 단계, 상기 펩티드는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성할 수 있고, 상기 이소펩티드 결합은 서열번호 3, 4, 5 또는 17의 위치 17의 아스파라긴 잔기와 서열번호 1의 위치 9의 리신 잔기 사이에 형성됨; 및
c) 상기 폴리펩티드와 펩티드 사이의 이소펩티드 결합의 자발적 형성을 가능하게 하는 조건 하에 상기 제 1 및 제 2 분자 또는 성분을 접촉시킴으로써, 상기 제 1 분자 또는 성분을 상기 제 2 분자 또는 성분에 이소펩티드 결합을 통해 접합시켜서 복합체를 형성하는 단계;
를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 바람직하게는 본 발명의 용도 또는 방법에서 사용하기 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는:
(a) 선택적으로 분자 또는 성분에 접합되거나 융합된 본 발명의 폴리펩티드; 및
(b) 선택적으로 분자 또는 성분에 접합되거나 융합된 펩티드, 상기 펩티드는: (i) 서열번호 3-5 또는 17 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드; 및 (ii) 서열번호 3-5 또는 17 중의 어느 하나에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열(예를 들어 서열번호 3-5 또는 17 중의 어느 하나에 제시된 서열에 대해 적어도 85, 90 또는 95% 동일함)을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열은 위치 17의 아스파라긴 잔기를 포함하고, 선택적으로 위치 5의 트레오닌 잔기, 위치 10의 아스파르트산 잔기 및 위치 11의 글리신 잔기를 포함함;으로부터 선택되고, 상기 펩티드는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성할 수 있고, 상기 이소펩티드 결합은 서열번호 3, 4, 5 또는 17의 위치 17의 아스파라긴 잔기와 서열번호 1의 위치 9의 리신 잔기 사이에 형성됨; 및/또는
(c) (a)에 정의된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자, 특히 벡터; 및/또는
(d) (b)에 정의된 펩티드를 암호화하는 핵산 분자, 특히 벡터;
를 포함한다.
본 발명자들은 이전에 "캐처(Catcher)" 폴리펩티드가 그의 동족 펩티드 태그에 대한 친화성 정제 시스템(affinity purification system)을 확립하도록 변형될 수 있는 것으로 결정하였다(예를 들어 본원에 참조로 포함되는 WO 2020/115252 참조). 따라서, 상기 시스템은 상기 펩티드 태그에 접합되거나 융합된 분자 또는 성분(융합 파트너)의 단리 및/또는 정제를 용이하게 하기 위해 적절한 조건 하에 해리될 수 있는 안정한 가역적 비-공유 복합체(즉, 폴리펩티드:리간드 복합체)를 형성할 수 있는 폴리펩티드(친화성 정제 폴리펩티드) 및 그의 동족 펩티드 태그(친화성 태그)를 포함하는 2-파트 시스템으로서 간주될 수 있다.
RrgACatcher 폴리펩티드의 특성이 DogCatcher에서 발견된 돌연변이를 도입함으로써 개선될 수 있는 것을 결정할 때, 본 발명자들은 DogTag 친화성 정제 시스템을 확립하기 위해 상기 정의된 폴리펩티드를 변형시킬 가능성을 확인하였다. 이론에 구애됨이 없이, RrgA의 D4 도메인에서의 활성화 글루탐산 잔기의 위치에서의 DogCatcher 폴리펩티드의 돌연변이(803E)는 DogTag와의 선택적, 안정한 및 가역적 비-공유 상호작용을 유지하면서, DogCatcher와 DogTag 사이의 이소펩티드 결합의 형성을 폐기하기에 충분할 것으로 여겨진다.
따라서, 추가 측면에서, 본 발명은,
i) 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열, 여기서 위치 70의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산이 아니고(즉, 위치 70의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산 이외의 임의의 아미노산일 수 있음), 선택적으로 상기 위치 70의 X는 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택됨;
ii) 서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 (i)의 일부, 여기서 위치 66의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산이 아니고, 선택적으로 상기 위치 66의 X는 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택됨;
iii) 서열번호 18에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 여기서 위치 70의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산이 아니고, 선택적으로 상기 위치 70의 X는 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택되고 상기 아미노산 서열은 다음:
1) 위치 4의 글루탐산;
2) 위치 11의 아스파르트산;
3) 위치 13의 트레오닌;
4) 위치 47의 아스파르트산;
5) 위치 59의 트레오닌;
6) 위치 69의 이소류신;
7) 위치 75의 프롤린;
8) 위치 87의 세린;
9) 위치 89의 아르기닌; 및
10) 위치 92의 아스파르트산;
중의 하나 이상을 포함하되;
상기 아미노산 서열이 위치 75의 프롤린을 포함하는 경우, 이는 또한 상기 1) 내지 6) 및 8) 내지 10)으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 18에서의 위치와 동등한 위치에 있음; 또는
iv) 서열번호 19에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 (iii)의 부분, 여기서 위치 66의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산이 아니고, 선택적으로 상기 위치 66의 X는 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택되고 상기 아미노산 서열은 다음:
1) 위치 7의 아스파르트산;
2) 위치 9의 트레오닌;
3) 위치 43의 아스파르트산;
4) 위치 55의 트레오닌;
5) 위치 65의 이소류신;
6) 위치 71의 프롤린;
7) 위치 83의 세린;
8) 위치 85의 아르기닌; 및
9) 위치 88의 아스파르트산;
중의 하나 이상을 포함하되;
상기 아미노산 서열이 위치 71의 프롤린을 포함하는 경우, 이는 또한 상기 1) 내지 5) 및 7) 내지 9)로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 19에서의 위치와 동등한 위치에 있음,
을 포함하는 폴리펩티드(친화성 정제 폴리펩티드)를 제공하되,
상기 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 선택적으로 및 가역적으로 결합한다.
대안적인 측면에서, 본 발명은,
i) 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열, 여기서 위치 70의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산이 아니고, 선택적으로 상기 위치 70의 X는 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택됨;
ii) 서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 (i)의 일부, 여기서 위치 66의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산이 아니고, 선택적으로 상기 위치 66의 X는 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택됨;
iii) 서열번호 18에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 여기서 위치 70의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산이 아니고, 선택적으로 상기 위치 70의 X는 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택되고 상기 아미노산 서열은 다음:
1) 위치 4의 글루탐산;
2) 위치 11의 아스파르트산;
3) 위치 13의 트레오닌;
4) 위치 47의 아스파르트산;
5) 위치 59의 트레오닌;
6) 위치 75의 프롤린; 및
7) 위치 92의 아스파르트산;
중의 하나 이상 및 다음:
1) 위치 69의 이소류신;
2) 위치 87의 세린; 및
3) 위치 89의 아르기닌;
중의 하나 이상을 포함하되;
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 1에서의 위치와 동등한 위치에 있음; 또는
iv) 서열번호 19에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 (iii)의 부분, 여기서 위치 66의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산이 아니고, 선택적으로 상기 위치 66의 X는 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택되고 상기 아미노산 서열은 다음:
1) 위치 7의 아스파르트산;
2) 위치 9의 트레오닌;
3) 위치 43의 아스파르트산;
4) 위치 55의 트레오닌;
5) 위치 71의 프롤린; 및
6) 위치 88의 아스파르트산;
중의 하나 이상 및 다음:
1) 위치 65의 이소류신;
2) 위치 83의 세린; 및
3) 위치 85의 아르기닌;
중의 하나 이상을 포함하되;
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 19에서의 위치와 동등한 위치에 있음,
을 포함하는 폴리펩티드(친화성 정제 폴리펩티드)를 제공하되,
상기 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 선택적으로 및 가역적으로 결합한다.
대안적으로 보면, 본 발명은,
i) 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열, 여기서 위치 70의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산이 아니고(즉, 위치 70의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산 이외의 임의의 아미노산일 수 있음), 선택적으로 상기 위치 70의 X는 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택됨;
ii) 서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 (i)의 일부, 여기서 위치 66의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산이 아니고, 선택적으로 상기 위치 66의 X는 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택됨;
iii) 서열번호 18에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 여기서 위치 70의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산이 아니고, 선택적으로 상기 위치 70의 X는 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택되고 상기 아미노산 서열은 다음:
1) 위치 4의 글루탐산;
2) 위치 11의 아스파르트산;
3) 위치 13의 트레오닌;
4) 위치 47의 아스파르트산;
5) 위치 59의 트레오닌;
6) 위치 69의 이소류신;
7) 위치 75의 프롤린;
8) 위치 87의 세린;
9) 위치 89의 아르기닌; 및
10) 위치 92의 아스파르트산;
중의 하나 이상을 포함하되;
(A) 상기 아미노산 서열이 위치 75의 프롤린을 포함하는 경우, 이는 또한 상기 1) 내지 6) 및 8) 내지 10)으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하거나; 또는 (B) 상기 아미노산 서열은 상기 1) 내지 5), 7) 및 10)으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 잔기 및 상기 6), 8) 및 9)로부터 선택된 하나의 아미노산 잔기를 포함하며,
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 18에서의 위치와 동등한 위치에 있음; 또는
iv) 서열번호 19에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 (iii)의 부분, 여기서 위치 66의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산이 아니고, 선택적으로 상기 위치 66의 X는 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택되고 상기 아미노산 서열은 다음:
1) 위치 7의 아스파르트산;
2) 위치 9의 트레오닌;
3) 위치 43의 아스파르트산;
4) 위치 55의 트레오닌;
5) 위치 65의 이소류신;
6) 위치 71의 프롤린;
7) 위치 83의 세린;
8) 위치 85의 아르기닌; 및
9) 위치 88의 아스파르트산;
중의 하나 이상을 포함하되;
(A) 상기 아미노산 서열이 위치 71의 프롤린을 포함하는 경우, 이는 또한 상기 1) 내지 5) 및 7) 내지 9)로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하거나; 또는 (B) 상기 아미노산 서열은 상기 1) 내지 4), 6) 및 9)로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 잔기 및 상기 5), 7) 및 8)로부터 선택된 하나의 아미노산 잔기를 포함하되,
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 19에서의 위치와 동등한 위치에 있음,
을 포함하는 폴리펩티드(친화성 정제 폴리펩티드)를 제공하되,
상기 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 선택적으로 및 가역적으로 결합한다.
추가 측면에서, 본 발명은 서열번호 3-5 또는 17 중의 하나에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 분자 또는 성분을 정제 또는 단리하는 방법을 제공하되, 상기 아미노산 서열은 위치 17의 아스파라긴 잔기를 포함하고, 선택적으로 위치 5의 트레오닌 잔기, 위치 10의 아스파르트산 잔기 및 위치 11의 글리신 잔기를 포함하고, 상기 방법은:
a) 위에서 정의된 폴리펩티드(친화성 정제 폴리펩티드)가 고정화되는 고체 기질을 제공하는 단계;
b) 상기 분자 또는 성분을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
c) 상기 펩티드가 상기 폴리펩티드에 선택적으로 결합할 수 있게 하는 조건 하에, 상기 a)의 고체 기질을 상기 b)의 샘플과 접촉시켜서, 상기 고체 기질 상에 고정화된 상기 폴리펩티드와, 상기 펩티드를 포함하는 분자 또는 성분 사이에 비-공유 복합체를 형성하는 단계;
d) 상기 고체 기질을 완충액으로 세척하는 단계;
e) 상기 고체 기질 상에 고정화된 상기 폴리펩티드로부터 상기 펩티드를 포함하는 분자 또는 성분을 분리하는 단계;
를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은, 서열번호 3-5 또는 17 중의 하나에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 분자 또는 성분을 정제 또는 단리하기 위한 위에서 정의된 폴리펩티드(친화성 정제 폴리펩티드)의 용도를 제공하되, 상기 아미노산 서열은 위치 17의 아스파라긴 잔기를 포함하고, 선택적으로 위치 5의 트레오닌 잔기, 위치 10의 아스파르트산 잔기 및 위치 11의 글리신 잔기를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 위에서 정의된 폴리펩티드(친화성 정제 폴리펩티드)가 고정화되는 고체 기질을 포함하는 위에서 정의된 방법 또는 용도에서 사용하기 위한 장치를 제공한다.
추가 측면에서, 본 발명은 위에서 정의된 폴리펩티드(친화성 정제 폴리펩티드)가 고정화되는 고체 기질을 제조하는데 사용하기 위한 키트를 제공하는 것으로, 상기 키트는:
a) 위에서 정의된 폴리펩티드(친화성 정제 폴리펩티드); 및
b) 고체 기질 상에 상기 a)의 폴리펩티드를 고정화하는 수단;
을 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 또는 위에서 정의된 본 발명의 재조합 또는 합성 폴리펩티드를 암호화(encoding)하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드를 생산 또는 발현시키는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
a) 숙주 세포를 본 발명의 벡터로 형질전환(transforming) 또는 형질감염(transfecting)시키는 단계;
b) 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 선택적으로,
c) 폴리펩티드를 단리하는 단계;
를 포함한다.
상세한 설명
위에서 논의한 바와 같이, RrgACatcher에 비해 DogCatcher에서 용해도 및 반응성 돌연변이 각각은 각각 폴리펩티드의 용해도 및 반응성을 개별적으로 및 독립적으로 개선시킬 수 있는 것으로 고려된다. 따라서, 일부 구현예에서, 폴리펩티드는,
i) 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열; 또는
ii) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 (i)의 부분;
iii) 서열번호 1에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어 서열번호 1에 제시된 서열에 대해 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일함)을 갖는 아미노산 서열, 상기 아미노산 서열은 위치 9의 리신, 위치 70의 글루탐산 및 다음:
1) 위치 4의 글루탐산;
2) 위치 11의 아스파르트산;
3) 위치 13의 트레오닌;
4) 위치 47의 아스파르트산;
5) 위치 59의 트레오닌;
6) 위치 69의 이소류신;
7) 위치 75의 프롤린;
8) 위치 87의 세린;
9) 위치 89의 아르기닌; 및
10) 위치 92의 아스파르트산;
중의 2개 이상을 포함하되;
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 1에서의 위치와 동등한 위치에 있음; 또는
iv) 서열번호 2에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어 서열번호 2에 제시된 서열에 대해 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일함)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 (iii)의 부분, 상기 아미노산 서열은 위치 5의 리신, 위치 66의 글루탐산 및 다음:
1) 위치 7의 아스파르트산;
2) 위치 9의 트레오닌;
3) 위치 43의 아스파르트산;
4) 위치 55의 트레오닌;
5) 위치 65의 이소류신;
6) 위치 71의 프롤린;
7) 위치 83의 세린;
8) 위치 85의 아르기닌; 및
9) 위치 88의 아스파르트산;
중의 2개 이상을 포함하되;
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 2에서의 위치와 동등한 위치에 있음,
을 포함하되,
상기 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드와 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성할 수 있고, 상기 이소펩티드 결합은 서열번호 3의 위치 17의 아스파라긴 잔기와 서열번호 1의 위치 9 또는 서열번호 2의 위치 5의 리신 잔기 사이에 형성된다.
상기 폴리펩티드가 상기 1) 내지 10)으로부터 선택된 2개 이상의 잔기를 포함하는 일부 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 용해도 변형(solubility modifications) 중의 적어도 하나(즉, 1) 내지 5), 7) 또는 10 중의 적어도 하나) 및 반응성 변형 중의 적어도 하나(즉, 6), 8) 또는 9) 중의 적어도 하나)를 포함한다.
표 1의 데이터에 기초하여, 및 이론에 의해 구애됨이 없이, 서열번호 1의 위치 75와 동등한 위치(서열번호 2의 위치 71과 동등함)의 프롤린 잔기의 존재가 본 발명의 폴리펩티드의 용해도에 대해 특히 유리한 효과를 갖는다는 가설이 세워진다. 일부 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1의 위치 75와 동등한 위치(서열번호 2의 위치 71과 동등함)의 프롤린 잔기를 포함한다. 따라서, 2개 이상의 아미노산은 서열번호 1의 위치 75에 있는 프롤린 및 1)-6) 및 8)-10) 중의 임의의 하나 이상, 또는 서열번호 2의 위치 71에 있는 프롤린 및 (상기 파트 (iv)에서의 넘버링을 사용하는) 2)-6) 및 8)-10)(또는 1)-5) 및 7)-9)) 중의 임의의 하나 이상일 수 있다. 그러나, 상기 열거된 것들로부터의 2개 이상의 아미노산의 임의의 조합이 본원에서 고려된다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 아미노산은 서열번호 1의 위치 75에 있는 프롤린 및 (상기 파트 (iv)에서의 넘버링을 사용하는) 1), 4) 및 10) 중의 임의의 하나 이상, 또는 서열번호 2의 위치 71에 있는 프롤린 및 4) 또는 10)(또는 3) 또는 9)) 중의 하나 또는 둘 다일 수 있다.
본 발명의 일부 추가 구현예에서, 폴리펩티드는,
i) 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열; 또는
ii) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 (i)의 부분;
iii) 서열번호 1에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어 서열번호 1에 제시된 서열에 대해 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일함)을 갖는 아미노산 서열, 상기 아미노산 서열은 위치 9의 리신, 위치 70의 글루탐산 및 다음:
1) 위치 4의 글루탐산;
2) 위치 11의 아스파르트산;
3) 위치 13의 트레오닌;
4) 위치 47의 아스파르트산;
5) 위치 59의 트레오닌;
6) 위치 69의 이소류신;
7) 위치 75의 프롤린;
8) 위치 87의 세린;
9) 위치 89의 아르기닌; 및
10) 위치 92의 아스파르트산;
중의 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 또는 9개 이상을 포함하되;
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 1에서의 위치와 동등한 위치에 있음; 또는
iv) 서열번호 2에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어 서열번호 2에 제시된 서열에 대해 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일함)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 (iii)의 부분, 상기 아미노산 서열은 위치 5의 리신, 위치 66의 글루탐산 및 다음:
1) 위치 7의 아스파르트산;
2) 위치 9의 트레오닌;
3) 위치 43의 아스파르트산;
4) 위치 55의 트레오닌;
5) 위치 65의 이소류신;
6) 위치 71의 프롤린;
7) 위치 83의 세린;
8) 위치 85의 아르기닌; 및
9) 위치 88의 아스파르트산;
중의 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 또는 8개 이상을 포함하되;
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 2에서의 위치와 동등한 위치에 있음,
을 포함하되,
상기 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드와 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성할 수 있고, 상기 이소펩티드 결합은 서열번호 3의 위치 17의 아스파라긴 잔기와 서열번호 1의 위치 9 또는 서열번호 2의 위치 5의 리신 잔기 사이에 형성된다.
일부 구현예에서, 4개 이상의 잔기는 (상기 파트 (iii)에서의 넘버링을 사용하는) 잔기 1), 4), 7) 및 10) 및 선택적으로 6), 8) 및 9) 중의 1개, 2개 또는 3개를 포함한다.
위에서 언급된 바와 같이, DogCatcher 폴리펩티드(서열번호 1)를 생성하는 RrgACatcher 폴리펩티드(서열번호 6)에 대해 이루어진 10개의 변형 중에서, 이들 중 7개("용해도 변형"으로 지칭됨)는 폴리펩티드의 용해도를 증가시키는 기능을 하는 것으로 제안되고, 이들 중 3개("반응성 변형"으로 지칭됨)는 DogTag 펩티드와의 반응 속도를 증가시키는 기능을 하는 것으로 제안된다.
7개의 용해도 변형은 원래의 RrgA 단백질에서의 잔기의 측면에서: D737E, N774D, N746T, N780D, K792T, A808P, 및 N825D이다. 서열번호 1에서의 잔기의 측면에서, 이들 용해도 변형은:
1) 위치 4의 글루탐산;
2) 위치 11의 아스파르트산;
3) 위치 13의 트레오닌;
4) 위치 47의 아스파르트산;
5) 위치 59의 트레오닌;
6) 위치 75의 프롤린; 및
7) 위치 92의 아스파르트산;
에 대응한다.
위에서 언급된 바와 같이, 용해도 변형의 7개 모두를 함유하는 RrgACatcher의 서열은 RrgACatcherB 또는 R2CatcherB(서열번호 8)로 지칭된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 모든 용해도 변형을 포함할 수 있고, 즉 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열 또는 본원에서 정의된 기능성 폴리펩티드를 생성하는, 예를 들어 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드와 자발적으로 이소펩티드 결합을 형성할 수 있는 그의 변이체 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 폴리펩티드는,
i) 서열번호 1에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어 서열번호 1에 제시된 서열에 대해 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일함)을 갖는 아미노산 서열, 상기 아미노산 서열은 위치 9의 리신, 위치 70의 글루탐산 및
1) 위치 4의 글루탐산;
2) 위치 11의 아스파르트산;
3) 위치 13의 트레오닌;
4) 위치 47의 아스파르트산;
5) 위치 59의 트레오닌;
6) 위치 75의 프롤린; 및
7) 위치 92의 아스파르트산;
을 모두 포함하되;
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 1에서의 위치와 동등한 위치에 있음; 또는
ii) 서열번호 2에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어 서열번호 2에 제시된 서열에 대해 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일함)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 (i)의 부분, 상기 아미노산 서열은 위치 5의 리신, 위치 66의 글루탐산 및
1) 위치 7의 아스파르트산;
2) 위치 9의 트레오닌;
3) 위치 43의 아스파르트산;
4) 위치 55의 트레오닌;
5) 위치 71의 프롤린; 및
6) 위치 88의 아스파르트산;
을 모두 포함하되;
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 2에서의 위치와 동등한 위치에 있음,
을 포함할 수 있고,
상기 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드와 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성할 수 있고, 상기 이소펩티드 결합은 서열번호 3의 위치 17의 아스파라긴 잔기와 서열번호 1의 위치 9 또는 서열번호 2의 위치 5의 리신 잔기 사이에 형성된다.
3개의 반응성 변형은 원래의 RrgA 단백질에서의 잔기의 측면에서: F802I, A820S, 및 Q822R이다. 서열번호 1의 잔기에 관하여, 이들 용해도 변형은:
1) 위치 69의 이소류신;
2) 위치 87의 세린; 및
3) 위치 89의 아르기닌;
에 대응한다.
위에서 언급된 바와 같이, 반응성 변형의 3개 모두를 함유하는 RrgACatcher의 서열은 서열번호 9에 제공된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 모든 반응성 변형을 포함할 수 있으며, 즉, 예를 들어 적합한 조건 하에서 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드와 자발적으로 이소펩티드 결합을 형성할 수 있는, 본원에서 정의된 기능성 폴리펩티드를 초래하는 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 변이체 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 폴리펩티드는,
i) 서열번호 1에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어 서열번호 1에 제시된 서열에 대해 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일함)을 갖는 아미노산 서열, 상기 아미노산 서열은 위치 9의 리신, 위치 70의 글루탐산 및
1) 위치 69의 이소류신;
2) 위치 87의 세린; 및
3) 위치 89의 아르기닌;
을 모두 포함하되;
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 1에서의 위치와 동등한 위치에 있음; 또는
ii) 서열번호 2에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어 서열번호 2에 제시된 서열에 대해 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일함)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 (i)의 부분, 상기 아미노산 서열은 위치 5의 리신, 위치 66의 글루탐산 및
1) 위치 65의 이소류신;
2) 위치 83의 세린; 및
3) 위치 85의 아르기닌;
을 모두 포함하되;
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 2에서의 위치와 동등한 위치에 있음,
을 포함할 수 있고,
상기 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드와 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성할 수 있고, 상기 이소펩티드 결합은 서열번호 3의 위치 17의 아스파라긴 잔기와 서열번호 1의 위치 9 또는 서열번호 2의 위치 5의 리신 잔기 사이에 형성된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 1의 위치 75과 동등한 위치에 프롤린 잔기(서열번호 2의 위치 71과 동등함)를 포함한다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 상기 위치에 있는 프롤린 잔기, 및 반응성 변형 중의 하나 이상을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 폴리펩티드는,
i) 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열; 또는
ii) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 (i)의 부분;
iii) 서열번호 1에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어 서열번호 1에 제시된 서열에 대해 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일함)을 갖는 아미노산 서열, 상기 아미노산 서열은 위치 9의 리신, 위치 70의 글루탐산, 위치 75의 프롤린 및 다음:
1) 위치 69의 이소류신;
2) 위치 87의 세린; 및
3) 위치 89의 아르기닌;
중의 하나 이상을 포함하되;
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 1에서의 위치와 동등한 위치에 있음; 또는
iv) 서열번호 2에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어 서열번호 2에 제시된 서열에 대해 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일함)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 (iii)의 부분, 상기 아미노산 서열은 위치 5의 리신, 위치 66의 글루탐산, 위치 71의 프롤린 및 다음:
1) 위치 65의 이소류신;
2) 위치 83의 세린; 및
3) 위치 85의 아르기닌;
중의 하나 이상을 포함하되;
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 2에서의 위치와 동등한 위치에 있음,
을 포함할 수 있고,
상기 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드와 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성할 수 있고, 상기 이소펩티드 결합은 서열번호 3의 위치 17의 아스파라긴 잔기와 서열번호 1의 위치 9 또는 서열번호 2의 위치 5의 리신 잔기 사이에 형성된다.
추가 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 1에서의 위치 75와 동등한 위치의 프롤린 잔기, 하나 이상의 추가의 용해도 변형, 및 하나 이상의 반응성 변형을 포함한다. 즉, 본 발명의 폴리펩티드는,
i) 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열; 또는
ii) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 (i)의 부분;
iii) 서열번호 1에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어 서열번호 1에 제시된 서열에 대해 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일함)을 갖는 아미노산 서열, 상기 아미노산 서열은 위치 9의 리신, 위치 70의 글루탐산, 위치 75의 프롤린, 다음:
1) 위치 4의 글루탐산;
2) 위치 11의 아스파르트산;
3) 위치 13의 트레오닌;
4) 위치 47의 아스파르트산;
5) 위치 59의 트레오닌; 및
6) 위치 92의 아스파르트산;
중의 하나 이상 및 다음:
1) 위치 69의 이소류신;
2) 위치 87의 세린; 및
3) 위치 89의 아르기닌;
중의 하나 이상을 포함하되;
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 1에서의 위치와 동등한 위치에 있음; 또는
iv) 서열번호 2에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어 서열번호 2에 제시된 서열에 대해 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일함)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 (iii)의 부분, 상기 아미노산 서열은 위치 5의 리신, 위치 66의 글루탐산, 위치 71의 프롤린, 다음:
1) 위치 7의 아스파르트산;
2) 위치 9의 트레오닌;
3) 위치 43의 아스파르트산;
4) 위치 55의 트레오닌; 및
5) 위치 88의 아스파르트산;
중의 하나 이상 및 다음:
1) 위치 65의 이소류신;
2) 위치 83의 세린; 및
3) 위치 85의 아르기닌; 및
중의 하나 이상을 포함하되;
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 2에서의 위치와 동등한 위치에 있음,
을 포함할 수 있고,
상기 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드와 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성할 수 있고, 상기 이소펩티드 결합은 서열번호 3의 위치 17의 아스파라긴 잔기와 서열번호 1의 위치 9 또는 서열번호 2의 위치 5의 리신 잔기 사이에 형성된다.
추가 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는,
i) 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열; 또는
ii) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 (i)의 부분;
iii) 서열번호 1에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어 서열번호 1에 제시된 서열에 대해 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일함)을 갖는 아미노산 서열, 상기 아미노산 서열은 위치 9의 리신, 위치 70의 글루탐산 및 다음:
1) 위치 4의 글루탐산;
2) 위치 11의 아스파르트산;
3) 위치 13의 트레오닌;
4) 위치 47의 아스파르트산;
5) 위치 59의 트레오닌;
6) 위치 75의 프롤린; 및
7) 위치 92의 아스파르트산;
중의 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상 및 다음:
1) 위치 69의 이소류신;
2) 위치 87의 세린; 및
3) 위치 89의 아르기닌;
중의 하나 이상(예를 들어 2개 또는 3개 이상)을 포함하되;
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 1에서의 위치와 동등한 위치에 있음; 또는
iv) 서열번호 2에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어 서열번호 2에 제시된 서열에 대해 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일함)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 (iii)의 부분, 상기 아미노산 서열은 위치 5의 리신, 위치 66의 글루탐산 및 다음:
1) 위치 7의 아스파르트산;
2) 위치 9의 트레오닌;
3) 위치 43의 아스파르트산;
4) 위치 55의 트레오닌; 및
5) 위치 71의 프롤린; 및
6) 위치 88의 아스파르트산;
중의 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상 및 다음:
1) 위치 65의 이소류신;
2) 위치 83의 세린; 및
3) 위치 85의 아르기닌; 및
중의 하나 이상(예를 들어 2개 또는 3개 이상)을 포함하되;
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 2에서의 위치와 동등한 위치에 있음,
을 포함하되,
상기 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드와 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성할 수 있고, 상기 이소펩티드 결합은 서열번호 3의 위치 17의 아스파라긴 잔기와 서열번호 1의 위치 9 또는 서열번호 2의 위치 5의 리신 잔기 사이에 형성된다.
일부 구현예에서, 용해도 변형의 목록으로부터 선택된 2개 이상의 아미노산은 서열번호 1의 위치 75의 프롤린 및 (상기 넘버링 파트 (iii)을 사용하는) 1) 내지 5) 및 7) 중의 임의의 하나 이상 또는 서열번호 2의 위치 71의 프롤린 및 (상기 넘버링 파트 (iii)을 사용하는) 1) 내지 4) 및 6) 중의 임의의 하나 이상일 수 있다. 그러나, 상기 열거된 것들로부터의 2개 이상의 아미노산의 임의의 조합이 본원에서 고려된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 적어도 위치 4의 글루탐산; 위치 47의 아스파르트산; 위치 75의 프롤린; 및 위치 92의 아스파르트산을 포함한다. 일부 구현예에서, 절단된 폴리펩티드(폴리펩티드 부분)는 적어도 위치 43의 아스파르트산; 위치 71의 프롤린; 및 위치 88의 아스파르트산을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 용해도 변형 모두 및 하나 이상, 예를 들어 반응성 변형 모두를 포함한다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는,
i) 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열; 또는
ii) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 (i)의 부분;
iii) 서열번호 1에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어 서열번호 1에 제시된 서열에 대해 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일함)을 갖는 아미노산 서열, 상기 아미노산 서열은 위치 9의 리신, 위치 70의 글루탐산 및
1) 위치 4의 글루탐산;
2) 위치 11의 아스파르트산;
3) 위치 13의 트레오닌;
4) 위치 47의 아스파르트산;
5) 위치 59의 트레오닌;
6) 위치 69의 이소류신;
7) 위치 75의 프롤린;
8) 위치 87의 세린;
9) 위치 89의 아르기닌; 및
10) 위치 92의 아스파르트산;
을 모두 포함하되;
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 1에서의 위치와 동등한 위치에 있음; 또는
iv) 서열번호 2에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어 서열번호 2에 제시된 서열에 대해 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일함)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 (iii)의 부분, 상기 아미노산 서열은 위치 5의 리신, 위치 66의 글루탐산 및
1) 위치 7의 아스파르트산;
2) 위치 9의 트레오닌;
3) 위치 43의 아스파르트산;
4) 위치 55의 트레오닌;
5) 위치 65의 이소류신;
6) 위치 71의 프롤린;
7) 위치 83의 세린;
8) 위치 85의 아르기닌; 및
9) 위치 88의 아스파르트산;
을 모두 포함하되;
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 2에서의 위치와 동등한 위치에 있음,
을 포함할 수 있고,
상기 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드와 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성할 수 있고, 상기 이소펩티드 결합은 서열번호 3의 위치 17의 아스파라긴 잔기와 서열번호 1의 위치 9 또는 서열번호 2의 위치 5의 리신 잔기 사이에 형성된다.
특히 바람직한 실시예에서, DogCatcher를 RrgACatcher와 구별하는 서열번호 1과 관련하여 상기 언급된 10개의 아미노산 모두(서열번호 2와 관련하여 9개)가 본 발명의 변이체 폴리펩티드에 존재한다. 본 발명의 폴리펩티드 변이체(즉, 서열 동일성 관련 폴리펩티드 및 그의 일부)가 상기 명시된 잔기 모두를 함유하지 않는 구현예에서, 명시된 위치에서 변이체는 RrgACatcher 폴리펩티드(서열번호 6) 또는 그의 보존적 치환에서 동등한 위치에 아미노산 잔기를 함유하는 것이 전형적으로 바람직하다. 동등한 위치는 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열을 서열번호 6과 비교함으로써, 예를 들어 BLASTP 알고리즘을 사용함으로써 용이하게 결정될 수 있다.
따라서, 예로서, 본 발명의 폴리펩티드가 본원에 정의된 서열(예를 들어 서열번호 1 또는 18에 기재된 바와 같음)에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 구현예에서, 위치 4(또는 동등한 위치)의 잔기가 글루탐산이 아닌 경우에, 잔기는 아스파르트산인 것이 바람직하다. 유사하게, 위치 11(또는 동등한 위치)의 잔기가 아스파르트산이 아닌 경우에, 잔기는 아스파라긴인 것이 바람직하다. 위치 13(또는 동등한 위치)의 잔기가 트레오닌이 아닌 경우에, 잔기는 아스파라긴인 것이 바람직하다. 위치 47(또는 동등한 위치)의 잔기가 아스파르트산이 아닌 경우, 잔기는 아스파라긴인 것이 바람직하다. 위치 59(또는 동등한 위치)의 잔기가 트레오닌이 아닌 경우, 잔기는 리신인 것이 바람직하다. 위치 69(또는 동등한 위치)에서의 잔기가 이소류신이 아닌 경우, 잔기는 페닐알라닌인 것이 바람직하다. 위치 75(또는 동등한 위치)에서의 잔기가 프롤린이 아닌 경우, 잔기는 알라닌인 것이 바람직하다. 위치 87(또는 동등한 위치)의 잔기가 세린이 아닌 경우, 잔기는 알라닌인 것이 바람직하다. 위치 89(또는 동등한 위치)의 잔기가 아르기닌이 아닌 경우, 잔기는 글루타민인 것이 바람직하다. 위치 92(또는 동등한 위치)의 잔기가 아스파르트산이 아닌 경우, 잔기는 아스파라긴인 것이 바람직하다. 이는 하기 명시된 다른 잔기에 적용된다.
그러나, 일부 구현예에서, 위치 87(또는 동등한 위치)의 잔기가 세린이 아닌 경우, 잔기는 글루탐산인 것이 바람직하다. 하기 도 9에 제시된 바와 같이, 이 위치에서의 글루탐산 잔기는 폴리펩티드의 용해도를 추가로 개선시킬 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 "반응성" 변형, 위치 69(또는 동등한 위치)의 이소류신 및 위치 89(또는 동등한 위치)의 아르기닌 중 단지 2개만을 포함하고, 위치 87(또는 동등한 위치)의 글루탐산을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드 변이체는 서열번호 1 또는 18과는, 예를 들어 1 내지 30, 1 내지 25, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실, 바람직하게는 1 내지 21, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 예를 들어 1, 2 내지 3개의 아미노산 치환 및/또는 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 예를 들어 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실에 의해 상이할 수 있다. 하기 논의된 바와 같이, 일부 구현예에서, 결실은 N- 및/또는 C-말단, 즉 절단에 있고, 이에 의해 위에서 정의된 서열번호 1, 예를 들어 서열번호 2 또는 19의 폴리펩티드 부분을 생성하는 것이 바람직하다.
일부 구현예에서, 예시된 폴리펩티드(예를 들어 서열번호 1 또는 18)에 비해 본 발명의 폴리펩티드에 존재하는 임의의 돌연변이는 보존적 아미노산 치환일 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 폴리펩티드의 물리화학적 특성을 보존하는 또 다른 것에 의한 아미노산의 대체를 지칭한다(예를 들어 D는 E에 의해 또는 그 반대로 대체될 수 있고, N은 Q에 의해 대체될 수 있거나, 또는 L 또는 I는 V에 의해 대체될 수 있거나, 또는 그 반대로 대체될 수 있음). 따라서, 일반적으로, 치환 아미노산은 대체되는 아미노산과 유사한 특성, 예를 들어 소수성, 친수성, 전자음성, 벌키한 측쇄 등을 갖는다. 천연 L-아미노산, 예를 들어 D-아미노산의 이성질체가 혼입될 수 있다.
따라서, 본 발명의 폴리펩티드 변이체가 상기 및 하기에서 특정된 모든 잔기(즉, 서열번호 6에 대한 서열번호 1 또는 18에서의 모든 돌연변이)를 함유하지 않는 일부 구현예에서, 본원에서 특정된 위치, 특히 하기에서 특정된 위치에서, 변이체는 RrgACatcher 펩티드(서열번호 6)에서 동등한 위치의 아미노산 잔기의 보존적 치환을 함유할 수 있다. 따라서, 예를 들어 위치 69(또는 동등한 위치)의 잔기가 이소류신 또는 페닐알라닌이 아닌 경우, 잔기는 서열번호 1, 6 또는 18, 예를 들어 류신에서 동등한 위치에서의 잔기의 보존적 치환을 나타내는 것이 바람직하다.
본원에 사용된 용어 "링커(linker)"는 2개의 분자 또는 성분을, 바람직하게는 공유 결합, 예를 들어 이소펩티드 결합에 의해 함께 연결, 즉 접합 또는 결합시키는 작용을 하는 분자를 지칭한다. 이소펩티드 결합. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너) 및 그의 펩티드 태그는 2-파트 링커로 볼 수 있는데, 여기서 제 1 부분, 즉 폴리펩티드와 제 2 부분, 즉 펩티드 태그 사이에 이소펩티드 결합의 형성은 링커를 재구성함으로써 링커의 상기 제 1 및 제 2 부분에 융합되거나 접합된 분자 또는 성분을 결합시킨다. 대안적으로, 본 발명의 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너) 및 그의 펩티드 태그는 링커로서 기능하는 동족 쌍, 즉 펩티드 태그 및 폴리펩티드 동족 쌍 또는 펩티드 태그 및 결합 파트너 동족 쌍으로 볼 수 있다. 이들 용어는 본 명세서 전체에서 상호교환적으로 사용된다.
"동족(cognate)"이라는 용어는 함께 기능하거나 특이적으로 상호작용하는 구성 우레아를 지칭한다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 동족 쌍은 자발적으로 함께 반응하여 이소펩티드 결합을 형성하는 본 발명의 펩티드 태그 및 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)를 지칭할 수 있다. 따라서, 이소펩티드 결합의 자발적 형성을 가능하게 하는 조건 하에서 효율적으로 함께 반응하여 이소펩티드 결합을 형성하는 펩티드 태그 및 폴리펩티드를 포함하는 2-파트 링커는 또한 "상보성 쌍", 즉 펩티드 태그 및 폴리펩티드 상보성 쌍이라고 지칭될 수 있다.
일부 구현예에서, 동족 쌍은 비-공유적으로 결합하여 복합체(즉, 폴리펩티드:펩티드 태그 복합체)를 형성하는 본 발명의 펩티드 태그(즉, DogTag 또는 그의 변이체) 및 폴리펩티드(친화성 정제 폴리펩티드)를 지칭한다.
따라서, 일부 구현예에서, 동족 펩티드 태그는 본 발명의 폴리펩티드가 자발적으로 반응하여 이소펩티드 결합을 형성하는 DogTag 펩티드 또는 그의 변이체, 예를 들어 RrgATag 또는 RrgATag2(예를 들어 서열번호 3-5 또는 17 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드)를 지칭한다. 일부 구현예에서, 동족 펩티드 태그는 예를 들어 동족 펩티드 태그 내의 아스파라긴(즉, 서열번호 3-5 또는 17 중의 어느 하나에서 위치 17에 대응하는 위치의 아스파라긴)과 서열번호 1의 위치 9의 리신 잔기 사이에 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 자발적으로 이소펩티드 결합을 형성할 수 있는 서열번호 3-5 또는 17 중의 하나에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%(예를 들어 적어도 85, 90 또는 95%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드일 수 있다.
일부 구현예에서, 동족 펩티드 태그는 본 발명의 폴리펩티드(친화성 정제 폴리펩티드)가 선택적으로 (예를 들어 특이적으로) 및 가역적으로 결합할 수 있는 본원에 정의된 펩티드 태그(예를 들어 서열번호 3-5 또는 17 중의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드)를 지칭한다.
따라서, 일부 바람직한 구현예에서, 펩티드 태그는 서열번호 3, 4, 5 또는 17에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 3-5 또는 17 중의 어느 하나에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어 서열번호 3-5 또는 17 중의 어느 하나에 제시된 서열에 대해 적어도 85, 90 또는 95% 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 구성되되, 상기 아미노산 서열은 위치 17의 아스파라긴 잔기를 포함하고, 선택적으로 위치 5의 트레오닌 잔기, 위치 10의 아스파르트산 잔기 및 위치 11의 글리신 잔기를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서 펩티드 태그는 서열번호 3에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어 서열번호 3에 제시된 서열에 대해 적어도 85, 90 또는 95% 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 구성되되, 상기 아미노산 서열은 위치 5의 트레오닌 잔기, 위치 10의 아스파르트산 잔기, 위치 11의 글리신 잔기 및 위치 17의 아스파라긴 잔기를 포함한다.
따라서, 본 발명은 펩티드(펩티드 태그) 및 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)를 포함하는 2-파트 링커를 추가로 제공하는 것으로,
a) 상기 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)는 위에서 정의된 아미노산 서열(즉, 서열번호 1 또는 그의 변이체)을 포함하고;
b) 상기 펩티드(펩티드 태그)는 위에서 정의된 아미노산 서열(예를 들어 서열번호 3, 4 또는 5에 제시된 아미노산 서열 또는 그의 변이체)을 포함하되,
상기 펩티드(펩티드 태그) 및 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)는 펩티드 태그 내의 아스파라긴 잔기(예를 들어 서열번호 3, 4 또는 5의 위치 17에서)와 서열번호 1의 위치 9의 리신 잔기 사이에 자발적으로 이소펩티드 결합을 형성할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)의 위치 9의 리신 잔기(예를 들어 서열번호 1)는 서열번호 3, 4, 5 또는 17에서 위치 17의 아스파라긴 잔기와 자발적으로 이소펩티드 결합을 형성하고, 상기 펩티드 태그와 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너) 사이에 이소펩티드 결합의 형성에 적합한 하기의 것들을 포함한 다양한 조건 하에 있다. 하기 실시예로부터, 본 발명의 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)는 다양한 조건 하에 활성이고, 다양한 펩티드 태그(특히 서열번호 3-5)와 반응할 수 있는 것임이 명백하다.
예를 들어 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)는 포스페이트 완충 식염수(PBS), 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES), HEPES 완충 식염수(HBS), 트리스(트리스(하이드록시메틸)아미노메탄) 및 트리스 완충 식염수(TBS)를 포함하는 다양한 완충액에서 활성(즉, 본원에 기재된 바와 같은 펩티드 태그와 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성할 수 있음)이고, 이들은 둘 다 EDTA와 함께 및 EDTA 없이 활성이다. 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)는 광범위한 온도, 예를 들어 0 내지 40℃, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 10, 12, 15, 18, 20, 22, 25, 28, 30, 35 또는 37℃, 바람직하게는 약 25 내지 35℃, 예를 들어 약 25℃에 걸쳐 약 5.5 내지 11.0, 예를 들어 5.5 내지 10.0, 6.0 내지 9.5, 예를 들어 약 6.0 내지 8.5 또는 6.5 내지 9.0의 pH에서 활성이다. 본 발명의 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)는 또한 통상적으로 사용되는 세제, 예를 들어 트윈 20 및 트리톤 X-100의 존재 하에, 예를 들어 약 1%(v/v) 이하의 농도로, 및 환원제, 예를 들어 디티오트레이톨(DTT)의 존재 하에 활성이다. 당업자는 다른 적합한 조건을 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)와 동족 펩티드 태그(예를 들어 서열번호 3 내지 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된 펩티드) 사이의 이소펩티드 결합의 형성에 적합한 조건은 본 발명의 펩티드 태그와 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)를 접촉시키는 것이 상기 펩티드 태그와 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너) 사이, 특히 서열번호 3, 4 또는 5의 위치 17의 아스파라긴 잔기와 서열번호 1의 위치 9(또는 동등한 위치)의 라이신 잔기 사이의 이소펩티드 결합의 자발적 형성을 초래하는 임의의 조건을 포함한다. 예를 들어 상기 펩티드 태그와 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)를 완충된 조건, 예를 들어 완충 용액 중에서 또는 완충액, 예를 들어 PBS로 평형화된 고체상(예를 들어 컬럼) 상에서 접촉시킨다. 접촉 단계는 임의의 적합한 pH, 예를 들어 약 pH 5.5 내지 11.0, 예를 들어 5.5 내지 10.0, 예를 들어 약 pH 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0, 8.2, 8.4, 8.6, 8.8, 9.0, 9.2, 9.4 또는 9.6일 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 접촉 단계는 임의의 적합한 온도, 예를 들어 약 0 내지 40℃, 예를 들어 약 1 내지 39, 2 내지 38, 3 내지 37, 4 내지 36, 5 내지 35, 6 내지 34, 7 내지 33, 8 내지 32, 9 내지 31 또는 10 내지 30℃, 예를 들어 약 10, 12, 15, 18, 20, 22, 25, 28, 30, 33, 35 또는 37℃, 바람직하게는 약 25 내지 35℃, 예를 들어 약 25℃일 수 있다.
위에서 언급한 바와 같이, 본원에서 기술된 본 발명의 펩티드 태그와 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너) 사이의 이소펩티드 결합의 형성은 자발적이다. 이와 관련하여, 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)는 위치 70(또는 동등 위치, 서열번호 1의 넘버링을 기준으로 함)에 글루탐산을 포함하고, 이는 예를 들어 펩티드 태그 및 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너) 내에 있는 각 아스파라진 및 리신 잔기 사이에 이소펩티드 결합의 형성을 용이하게 하고, 예를 들어 유도, 촉진 또는 촉매한다.
본원에 사용된 용어 "자발적"은 단백질에서 또는 펩티드 또는 단백질 간에(예를 들어 2 개의 펩티드 간에 또는 펩티드와 단백질 사이, 즉 펩티드 태그와 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너) 간에) 임의의 다른 작용제(agent)(예를 들어 효소 촉매)의 존재 없이 및/또는 단백질 또는 펩티드의 화학적 변형 없이, 예를 들어 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC)를 사용한 천연 화학적 결찰 또는 화학적 커플링 없이 형성될 수 있는 이소펩티드 결합을 지칭한다. 따라서, C-말단 티오에스테르를 갖는 펩티드 또는 단백질을 변형시키기 위한 천연 화학적 결찰은 수행되지 않는다.
따라서, 자발적인 이소펩티드 결합은 본원에서 기술된 본 발명의 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드의 화학적 변형없이 분리될 때 본 발명의 펩티드 태그와 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너) 사이에 형성될 수 있다. 따라서, 자발적 이소펩티드 결합은 효소 또는 다른 외인성 물질의 부재 및 본 발명의 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드의 화학적 변형없이 저절로 형성될 수 있다.
자발적 이소펩티드 결합은 본 발명의 펩티드 태그 및 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)의 거의 접촉 직후에, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25 또는 30 분 내에 또는 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 또는 24 시간 내에 형성될 수 있다.
이소펩티드 형성의 속도는 펩티드 태그 및 폴리펩티드 반응물의 농도 및 반응 조건, 예를 들어 온도에 의존할 것이다. 일부 구현예에서, 자발적 이소펩티드 결합 형성은 약 20분 이내에 반응물의 약 80% 이상 동안 완료될 수 있으며, 예를 들어 여기서 반응물은 각각 약 25℃의 반응 온도에서 약 5 μM의 농도로 존재한다.
대안적으로 보면, 일부 구현예에서, 자발적 이소펩티드 결합 형성은 약 20분 이내에 반응물의 약 80% 이상 동안 완료될 수 있으며, 예를 들어 여기서 반응물은 각각 약 25℃의 반응 온도에서 약 μM의 농도로 존재한다.
상기 정의된 반응 속도를 결정하기 위해 사용되는 다른 반응 조건, 예를 들어 완충액, pH 등은 본원에 정의된 임의의 조건일 수 있다. 일부 구현예에서, 반응 조건은 실시예에서 사용되는 것이다. 예를 들어 일부 구현예에서, 자발적 이소펩티드 결합 형성은 약 7.5의 pH에서 PBS 완충액 중 상기 명시된 양으로 완료된다.
본 발명의 폴리펩티드는 폴리펩티드(즉, 펩티드 태그 결합 파트너 또는 친화성 정제 폴리펩티드)의 돌연변이체 형태(즉, 본원에서 상동체, 변이체 또는 유도체로서 지칭됨)를 포함하며, 이는 서열번호 1 및 18에 제시된 예시된 폴리펩티드와 구조적으로 유사하다. 본 발명의 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너) 변이체는 펩티드 태그 결합 파트너(캐처)로서 기능할 수 있으며, 즉, 위에서 정의된 적합한 조건 하에 본원에 정의된 펩티드 태그의 위치 17(또는 동등한 위치)의 아스파라긴과 폴리펩티드 (펩티드 태그 결합 파트너) 변이체의 위치 9(또는 등등한 위치)의 리신 사이에 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성할 수 있다. 본 발명의 친화성 정제 폴리펩티드 변이체는 본원에 정의된 적합한 조건 하에 동족 펩티드 태그에 선택적으로 및 가역적으로 결합할 수 있다.
폴리펩티드 변이체가 서열번호 1 또는 18에 대해 돌연변이, 예를 들어 결실 또는 삽입을 포함하는 경우, 상기 명시된 잔기는 변이체 폴리펩티드 서열에서 동등한 아미노산 위치에 존재한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드 변이체에서 결실은 N-말단 및/또는 C-말단 절두형이 아니다.
그러나, 상기 언급된 바와 같이, 본원에 예시된 폴리펩티드(예를 들어 서열번호 1 또는 18)는 폴리펩티드의 활성 또는 기능을 현저하게 감소시키지 않으면서 N-말단 및/또는 C-말단에서 절단될 수 있는 것으로 고려된다. 특히, 서열번호 1 또는 18은 N-말단에서 최대 4 개의 아미노산(예를 들어 1, 2, 3 또는 4 개의 아미노산) 및/또는 C-말단에서 최대 5 개의 아미노산(예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5 개 아미노산)까지 절단될 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 용어 변이체는 예시된 폴리펩티드의 절단 변이체를 포함한다. 대안적으로, 본 발명은 예시된 폴리펩티드의 부분을 제공하는 것으로 보여질 수 있으며, 상기 부분은 상기 논의된 바와 같이 서열번호 2 또는 19에 제시된 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 포함한다.
본원에서 언급된 "부분"은 적어도 예를 들어 서열번호 2 또는 19에 제시된 아미노산 서열, 즉 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 서열번호 1 또는 18(이로부터 유래되는 서열)의 적어도 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 또는 103 개의 아미노산을 포함한다. 따라서 상기 부분은 서열의 중심 또는 N-말단 또는 C-말단 부분으로부터 수득될 수 있다. 바람직하게는 상기 부분은 중심 부분으로부터 얻어지며, 즉 상기 정의된 바와 같이 N-말단 및/또는 C-말단 절두형을 포함한다. 특히, 본원에 기술된 "부분"은 본 발명의 폴리펩티드이므로 본원에 언급된 동일성(비교 영역에 대비하여) 조건 및 기능적 동등 조건을 만족시킨다.
일부 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드와 함께 사용하기 위한 펩티드 태그는 본원에서 기술된 서열의 변이체일 수 있으며, 예를 들어 서열번호 3-5와 예를 들어 위에서 정의된 1 내지 5, 1 내지 4, 예를 들어 1, 2 내지 3 개의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실, 바람직하게는 치환에 의해 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드 변이체는 상기 정의된 바와 같이 서열번호 1 또는 18과 상이할 수 있다. 그러나, 펩티드 및 폴리펩티드 변이체는 이들의 기능적 활성, 예를 들어 이들의 동족 결합 파트너 및 펩티드와 각각 자발적으로 이소펩티드 결합을 형성하는 이들의 능력, 또는 복합체(즉, 폴리펩티드:펩티드 태그 복합체)를 형성하는 이들의 능력을 보유해야 한다.
서열 동일성은 당업계에 공지된 임의의 적합한 수단, 예를 들어 가변 pamfactor를 갖는 FASTA pep-cmp 및 12.0으로 설정된 갭 생성 페널티 및 4.0으로 설정된 갭 확장 페널티 및 2 개의 아미노산 윈도우를 사용하는 SWISS-PROT 단백질 서열 데이터뱅크를 사용하여 확인할 수 있다. 아미노산 서열 동일성을 확인하기 위한 다른 프로그램은 University of Wisconsin의 Genetics Computer Group(GCG) 버전 10 소프트웨어 패키지의 BestFit 프로그램을 포함한다. 이 프로그램은 기본 값, 즉 갭 생성 페널티 -8, 갭 확장 페널티 = 2, 평균 일치 = 2.912, 평균 불일치 = -2.003을 가지고 Smith와 Waterman의 국소 상동성 알고리즘을 사용한다.
바람직하게는 상기 비교는 전체 길이의 서열에 걸쳐 이루어지지만, 보다 작은 비교 윈도우, 예를 들어 100, 80 또는 50개 미만의 연속 아미노산에 걸쳐 이루어질 수 있다.
바람직하게는 펩티드 태그 및 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너) 변이체(예를 들어 서열 동일성 관련 변이체)는 서열번호 3-5 또는 서열번호 1 또는 2에 각각 제시된 서열을 갖는 펩티드 태그 및 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)와 기능적으로 동등하다. 본원에서 언급된 "기능적 동등성"은 본원에서 정의된 펩티드 태그 및 상기 논의된 본 발명의 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)의 변이체를 지칭하며, 이는 각각의 파트너와 모 분자(즉, 서열 상동성을 나타내는 분자)에 대비하여 이소펩티드 결합의 자발적인 형성이 일부 감소된 효능(예를 들어 더 낮은 발현 수율, 더 낮은 반응 속도, 또는 제한된 범위의 반응 조건(예를 들어 10-30℃ 등의 더 좁은 온도 범위)에서의 활성을 나타낼 수 있지만, 효율적이거나 더 효율적인 것이 바람직하다.
서열번호 3-5 중의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 펩티드 태그의 활성과 "동등한" 활성을 갖는 돌연변이체 또는 변이체 펩티드 태그는 서열번호 3-5 중의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 펩티드 태그의 활성과 유사한(즉, 비슷한) 활성, 즉 펩티드 태그의 실제 적용이 크게 영향을 미치지 않는, 예를 들어 실험 오류의 한계 이내일 정도의 유사한 활성을 가질 수 있다. 따라서, 동등한 펩티드 태그 활성은 돌연변이체 또는 변이체 펩티드 태그가 폴리펩티드(예를 들어 서열번호 1 또는 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 펩티드 태그 결합 파트너)와 동일한 조건하에서 서열번호 3-5 중의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 펩티드 태그와 유사한 반응 속도(즉, 하기 논의된 속도 상수 및/또는 수율로 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성할 수 있음)를 의미한다.
유사하게, 서열번호 1, 2, 18 또는 19(바람직하게는 서열번호 1 또는 18)에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 폴리펩티드의 활성과 "동등한" 활성을 갖는 본 발명의 돌연변이체 또는 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1, 2, 18 또는 19(바람직하게는 서열번호 1 또는 18)에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 구성된 폴리펩티드의 특성과 유사한(즉, 비교가능한) 기능적 특성(예를 들어 용해도 및/또는 활성(예를 들어 반응성 또는 친화성))을 가질 수 있고, 즉 폴리펩티드의 실제 적용이 예를 들어 실험 오차의 한계 내에서 크게 영향을 미치지 않도록 한다.
따라서, 일부 구현예에서, 동등한 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너) 활성 또는 기능은 본 발명의 돌연변이체 또는 변이체 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)가 펩티드 태그(예를 들어 서열번호 3-5 중의 하나에서 설정된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성됨)와 동일한 조건 하에서 서열번호 1 또는 2(바람직하게는 서열번호 1)에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)와 유사한 반응 속도(즉, 이하에 논의되는 바와 같은 속도 상수) 및/또는 수율로 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성할 수 있다는 것을 의미한다.
일부 구현예에서, 동등한 폴리펩티드 기능은 본 발명의 돌연변이체 또는 변이체 폴리펩티드(예를 들어 펩티드 태그 결합 파트너)가 동일한 조건 하에 서열번호 1, 2, 18 또는 19(바람직하게는 서열번호 1 또는 18)에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 구성된 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)와 유사한 용해도 특성을 갖는다는 것을 의미한다. 특히, 일부 구현예에서, 서열번호 1 또는 2(바람직하게는 서열번호 1)에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 구성된 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)와 유사한 용해도 특성을 갖는 동등한 폴리펩티드는 또한 본원에 정의된 펩티드 태그(예를 들어 서열번호 3-5 중의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 구성됨)와 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성할 수 있어야 한다. 바람직하게는, 동등한 폴리펩티드는 동일한 조건 하에 서열번호 1 또는 2(바람직하게는 서열번호 1)에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 구성된 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)와 유사한 용해도, 반응 속도 및/또는 수율을 갖는다.
일부 구현예에서, 서열번호 18 또는 19 (바람직하게는 서열번호 18)에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 구성된 폴리펩티드(친화성 정제 폴리펩티드)와 유사한 용해도 특성을 갖는 동등한 폴리펩티드는 또한 본원에서 정의된 적합한 조건 하에 동족 펩티드 태그에 선택적으로 및 가역적으로 결합할 수 있어야 한다. 바람직하게는, 동등한 폴리펩티드는 동일한 조건 하에 서열번호 18 또는 19(바람직하게는 서열번호 18)에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 구성되는 폴리펩티드(친화성 정제 폴리펩티드)와 유사한 용해도, 결합 친화성 및/또는 수율을 갖는다.
따라서, 본 발명의 돌연변이체 또는 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1, 2, 18 또는 19(바람직하게는 서열번호 1 또는 18)에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 구성된 폴리펩티드의 용해도와 유사한(즉, 비슷한) 용해도를 가질 수 있고, 즉, 폴리펩티드의 실제 적용이 예를 들어 실험 오차의 한계 내에서 유의하게 영향을 받지 않도록 할 수 있음을 알 수 있다.
동일한 반응 조건, 예를 들어 상기 예시된 온도, 기질(즉, 펩티드 태그 또는 폴리펩티드 서열) 및 이들의 농도, 완충액, 염 등 하에서 측정된 상이한 펩티드 태그 및 폴리펩티드(예를 들어 각각 서열번호 3 대 돌연변이체 및 서열번호 1 대 돌연변이체)의 활성은 쉽게 비교되어 각각의 펩티드 태그 및 폴리펩티드에 대한 활성이 더 높거나 낮거나 동등한 지 여부를 확인할 수 있다.
특히, 본원에서 정의된 펩티드 태그 변이체 및 본 발명의 폴리펩티드 변이체는 각각 서열번호 3-5 또는 서열번호 1 또는 2에 제시된 서열을 갖는 펩티드 태그 및 폴리펩티드와 동등한 속도 상수를 가질 수 있다. 속도 상수는 반응물 농도의 곱(즉, 본 발명의 펩티드 태그 및 폴리펩티드의 농도의 곱)에 주어진 온도에서의 반응 속도(이소펩티드 결합의 형성)를 관련짓는 비례 계수를 지칭한다.
따라서, 본원에 개시된 변이체(예를 들어 돌연변이체) 펩티드 태그의 활성, 예를 들어 속도 상수는 서열번호 3-5 중의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성된 펩티드 태그의 활성, 예를 들어 속도 상수의 60% 이상, 예를 들어 70, 75, 80, 85 또는 90% 이상, 예를 들어 서열번호 3-5 중의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 펩티드 태그의 활성의 적어도 91, 92, 93, 94 또는 95%일 수 있다. 대안적으로 보면, 돌연변이체 펩티드 태그의 활성, 예를 들어 속도 상수는 서열번호 3-5 중의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성된 펩티드 태그의 활성, 예를 들어 속도 상수보다 40% 이하로 낮을 수 있고, 예를 들어 서열번호 3-5 중의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성된 펩티드 태그의 활성, 예를 들어 속도 상수보다 35, 30, 25 또는 20% 이하로 낮을 수 있으며, 예를 들어 서열번호 3-5 중의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성된 펩티드 태그의 활성, 예를 들어 속도 상수보다 10, 9, 8, 7, 6 또는 5% 이하로 낮을 수 있다.
마찬가지로, 본 발명의 변이체 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)의 활성, 예를 들어 속도 상수는 서열번호 1 또는 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성된 폴리펩티드의 활성, 예를 들어 속도 상수의 적어도 60%, 예를 들어 적어도 70, 75, 80, 85 또는 90%, 예를 들어 서열번호 1 또는 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성된 폴리펩티드의 활성, 예를 들어 속도 상수의 적어도 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%일 수 있다. 대안적으로 보면, 돌연변이체 폴리펩티드의 활성은 서열번호 1 또는 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성된 폴리펩티드의 활성, 예를 들어 속도 상수보다 40% 이하 낮고, 예를 들어 서열번호 1 또는 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성된 폴리펩티드의 활성, 예를 들어 속도 상수보다 35, 30, 25 또는 20% 이하 낮고, 예를 들어 서열번호 1 또는 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성된 폴리펩티드의 활성, 예를 들어 속도 상수보다 0, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 이하 낮을 수 있다.
또한, 본 발명의 변이체 폴리펩티드의 용해도는 동일한 조건, 예를 들어 완충액, 온도, pH 등 하에 측정될 때, 서열번호 1, 2, 18 또는 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된 폴리펩티드의 용해도의 적어도 60%, 예를 들어 적어도 70, 75, 80, 85 또는 90%, 예를 들어 서열번호 1 또는 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된 폴리펩티드의 용해도의 적어도 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%일 수 있다. 대안적으로 보면, 변이체 폴리펩티드의 용해도는 서열번호 1, 2, 18 또는 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된 폴리펩티드의 용해도보다 40% 이하로 낮을 수 있고, 예를 들어 동일한 조건, 예를 들어 완충액, 온도, pH 등 하에 측정될 때, 서열번호 1, 2, 18 또는 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된 폴리펩티드의 용해도보다 35, 30, 25 또는 20% 이하로 낮을 수 있고, 예를 들어 서열번호 1, 2, 18 또는 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된 폴리펩티드의 용해도보다 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 이하로 낮을 수 있다. 폴리펩티드의 용해도는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 수단을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어 실시예에 제시된 바와 같이, 용해도는 명시된 조건 하에 적합한 숙주 세포, 예를 들어 이. 콜라이에서의 발현으로부터 수득된 가용성 단백질의 수율을 결정함으로써 측정될 수 있다. 추가의 대표적인 실시예에서, 단백질의 상대 용해도는 단백질 용액이 단백질 응집이 일어날 때까지 농축되는 스핀 농축기를 사용하여 측정될 수 있고, 응집 지점은 단백질의 상대 용해도를 결정하는데 사용될 수 있다.
특히, 본원에 개시된 펩티드 태그 및 본 발명의 폴리펩티드의 반응 속도 상수는 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드가 단리된 펩티드 태그 및 폴리펩티드보다 느리게 확산하는 큰 분자 또는 성분(예를 들어 단백질)로 융합되는 경우에는 실시예에 기재된 값보다 낮을 수 있다. 또한, 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드가 융합되는 분자 또는 성분이 반응에 입체 장애를 유발하는 경우 상기 속도 상수는 감소될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 펩티드 태그 및 본 발명의 폴리펩티드 변이체의 반응 속도 상수를 측정할 때, 이 측정은 단리된 펩티드 태그 및 폴리펩티드, 즉 다른 분자 또는 성분에 융합되거나 접합되지 않은 펩티드 태그 및 폴리펩티드를 사용하여 수행하는 것이 바람직하다.
그러나, 실시예에 나타낸 바와 같이, 폴리펩티드에 융합된 펩티드 태그를 사용하여 본 발명의 폴리펩티드 변이체의 반응 속도 상수를 측정하는 것이 종종 편리하다. 따라서, 폴리펩티드에 융합된 펩티드 태그를 사용하여 서로 다른 폴리펩티드 변이체의 반응 속도 상수를 측정하고 비교하는 경우, 펩티드 태그에 융합된 폴리펩티드는 모든 반응에서 동일한 크기, 바람직하게는 동일한 서열을 갖는 것이 바람직하다.
큰 분자 또는 성분에 대한 융합 및/또는 입체 장애가 또한 다른 펩티드 태그 및 폴리펩티드, 예를 들어 RrgATag, RrgATag2 및 RrgACatcher의 속도 상수에 영향을 미칠 것임은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드의 속도 상수의 향상은 본 발명의 폴리펩티드 및 그의 동족 펩티드 태그가 저농도로 사용될 때는 물론 고농도, 예를 들어 약 적어도 10 μM로 사용될 때(예를 들어 큰 분자 또는 성분에 융합될 때)에도 여전히 유리할 수 있다.
반응 속도 및 속도 상수는 당업계에 공지되고 실시예, 및 WO 2018/197854(본원에서 참조로 포함됨)에 기재된 임의의 적당한 수단에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어 반응 속도는 (i) SDS에서의 비등처리 또는 모든 비공유 상호작용을 방해할 수 있는 다른 강한 변성 처리 후 SDS-PAGE 상에서 반응 생성물의 이동성을 평가하거나 또는 (ii) 질량 분광분석법으로 모니터할 수 있다.
따라서, 변이체 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)가 서열번호 1의 위치 9와 동등한 위치에 리신 잔기 및 서열번호 1의 위치 70과 동등한 위치에 글루탐산 잔기 및 위에서 정의된 서열번호 1의 위치 4, 11, 13, 47, 59, 69, 75, 87, 89 및 92와 동등한 위치에 적어도 하나(바람직하게는, 2개 이상)의 다른 아미노산 잔기(들)를 포함하고(상기 적어도 하나의 아미노산은 위치 75에 프롤린인 것을 포함하고, 상기 아미노산 서열은 상기 정의된 바와 같이 서열번호 1의 위치 4, 11, 13, 47, 59, 69, 87, 89 및 92에 대응하는 위치에 적어도 하나의 다른 아미노산 잔기를 포함함) 상기 정의된 기능적 특징들을 보유하는 한, 즉 서열번호 3 내지 5 중의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성된 펩티드 태그와 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성할 수 있는 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)를 생성하고, 선택적으로 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)와 대비하여 동등하거나 더 높은 수율, 반응 속도, 예를 들어 속도 상수, 용해도, 온도 변화에 대한 내성 및/또는 완충액(buffer)을 갖는 한, 서열번호 1에 임의의 변형 또는 변형의 조합이 이루어져 본 발명의 변이체 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)를 생성할 수 있다.
일부 추가 구현예에서, 본 발명의 변이체 폴리펩티드는 위에서 명시된 잔기를 포함하고 상기 정의된 기능적 특징들을 보유하며, 즉 서열번호 3 내지 5 중의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성된 펩티드 태그와 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성할 수 있는 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)를 생성하고, 선택적으로 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)와 대비하여 동등하거나 더 높은 수율, 반응 속도, 예를 들어 속도 상수, 용해도, 온도 변화에 대한 내성 및/또는 완충액 범위(buffer range)를 갖는다.
대안적으로 보면, 변이체 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)가 서열번호 2의 위치 5와 동등한 위치에 리신 잔기 및 서열번호 2의 위치 66과 동등한 위치에 글루탐산 잔기 및 위에서 정의된 서열번호 2의 위치 7, 9, 43, 55, 65, 71, 83, 85 및 88과 동등한 위치에 적어도 하나(바람직하게는, 2개 이상)의 다른 아미노산 잔기(들)를 포함하고(상기 적어도 하나의 아미노산은 위치 71에 프롤린인 것을 포함하고, 상기 아미노산 서열은 상기 정의된 바와 같이 서열번호 2의 위치 7, 9, 43, 55, 65, 71, 83, 85 및 88에 대응하는 위치에 적어도 하나의 다른 아미노산 잔기를 포함함) 상기 정의된 기능적 특징들을 보유하는 한, 즉 서열번호 3 내지 5 중의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성된 펩티드 태그와 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성할 수 있는 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)를 생성하고, 선택적으로 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)와 대비하여 동등하거나 더 높은 수율, 반응 속도, 예를 들어 속도 상수, 용해도, 온도 변화에 대한 내성 및/또는 완충액 범위를 갖는 한, 서열번호 2에 임의의 변형(바람직하게는 치환) 또는 변형의 조합이 이루어져 본 발명의 변이체 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)를 생성할 수 있다.
일부 추가 구현예에서, 본 발명의 절단된 변이체 폴리펩티드(truncated variant polypeptide)는 위에서 명시된 잔기를 포함하고 상기 정의된 기능적 특징들을 보유하며, 즉 서열번호 3 내지 5 중의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성된 펩티드 태그와 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성할 수 있는 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)를 생성하고, 선택적으로 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)와 대비하여 동등하거나 더 높은 수율, 반응 속도, 예를 들어 속도 상수, 용해도, 온도 변화에 대한 내성 및/또는 완충액 범위(buffer range)를 갖는다.
본원에 개시된 펩티드 태그에서 동등한 위치는 바람직하게는 서열번호 3의 아미노산 서열을 참조하여 결정한다. 본 발명의 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)에서 동등 위치는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 참조하여 결정한다. 상동성 또는 상응하는 위치는 상동체(돌연변이체, 변이체 또는 유도체) 펩티드 태그의 서열과 서열번호 3의 서열을, 또는 상동체(돌연변이체, 변이체 또는 유도체) 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)의 서열과 서열번호 1 또는 2의 서열을 서열 간에 상동성 또는 동일성에 기초하여, 예를 들어 BLAST 알고리즘을 사용하여 정렬시킴으로써 쉽게 추론할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "태그" 및 "펩티드 태그"는 일반적으로 펩티드 또는 올리고펩티드를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "펩티드 태그 결합 파트너", "결합 파트너" 또는 "캐처"는 일반적으로 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다.
이와 관련하여, 펩티드가 의미하는 것과 폴리고펩티드가 의미하는 것 사이에 크기 경계에 관한 기준 정의는 없다. 전형적으로, 펩티드는 2 내지 39개의 아미노산을 포함하는 것으로 볼 수 있다. 따라서, 폴리펩티드는 적어도 40개의 아미노산, 바람직하게는 적어도 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 아미노산을 포함하는 것으로 볼 수 있다.
따라서, 바람직한 구현예에서, 본원에 정의된 펩티드 태그는 12개 이상의 아미노산, 예를 들어 12-39 아미노산, 예를 들어 13-35, 14-34, 15-33, 16-31, 17-30개의 아미노산 길이를 포함하는 것으로 볼 수 있고, 예를 들어 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개의 아미노산을 포함하거나, 그로 구성될 수 있다.
본원에 정의된 본 발명의 폴리펩티드(예를 들어 펩티드 태그 결합 파트너, 결합 파트너 또는 "캐처" 또는 친화성 정제 폴리펩티드)는 95개 이상의 아미노산, 예를 들어 95-150개의 아미노산, 예를 들어 95-140, 95-130, 95-120개의 아미노산 길이를 포함하는 것으로 볼 수 있고, 예를 들어 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103 또는 104개의 아미노산을 포함하거나, 그로 구성될 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 2-파트 링커(예를 들어 태그 및 캐처 시스템 또는 쌍, 즉 동족 쌍)는 많은 유용성이 있으며, 본 발명의 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너) 및 그의 동족 펩티드 태그(예를 들어 서열번호 3-5)는 이소펩티드 결합을 통해 두 분자 또는 성분을 접합(즉, 결합 또는 연결) 시에 특히 유용성이 있다. 예를 들어 펩티드 태그 및 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)는 당해의 분자 또는 성분에 개별적으로 접합 또는 융합된 후 펩티드 태그와 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너) 사이에 이소펩티드 결합의 자발적인 형성을 허용하기에 적합한 조건 하에서 함께 접촉되어, 이소펩티드 결합을 통해 분자 또는 성분을 결합(즉, 연결 또는 접합)시킬 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 이소펩티드 결합을 통해 2개의 분자 또는 성분을 접합시키는, 본원에서 정의된 펩티드(펩티드 태그) 및 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너) 쌍의 사용을 제공하는 것으로 볼 수 있으며,
여기서, 이소펩티드 결합을 통해 접합된 상기 분자 또는 성분은 다음을 포함한다:
a) 본원에서 정의된 본 발명의 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)를 포함하는(예를 들어 접합 또는 융합되는) 제 1 분자 또는 성분; 및
b) 본원에서 정의된 펩티드(펩티드 태그)를 포함하는(예를 들어 접합 또는 융합되는) 제 2 분자 또는 성분.
전술한 펩티드 태그 및 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너) 쌍(즉, 2-파트 링커)의 사용이 상기 기재된 바와 같이 상기 펩티드 태그와 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너) 사이에 이소펩티드 결합의 자발적인 형성을 가능하게 하는(촉진하거나 용이하게 하는) 적합한 조건 하에서 상기 제 1 분자 및 제 2 분자를 접촉시키는 것을 포함하는 것은 명백할 것이다.
상기 펩티드 태그 및 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너) 쌍(즉, 2-파트 링커)의 사용은 상기 펩티드 태그와 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너) 사이의 이소 펩티드 결합의 자발적 형성을 가능하게 하는(예를 들어 촉진하거나 용이하게 하는) 조건 하에서 상기 제 1 및 제 2 분자를 접촉시키는 것을 포함하는 것이 명백할 것이다.
위에서 언급한 바와 같이, 전술한 펩티드 태그 및 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너) 쌍(즉, 2-파트 링커)은 펩티드 태그가 내부 부위(internal site)에서, 즉 상기 분자 또는 성분의 말단 중의 하나가 아닌 분자 또는 성분 내로 혼입될 때 특히 효과적이다. 따라서, 일부 구현예에서, 제 2 분자 또는 성분은 내부 부위에서, 예를 들어 루프 내에서 본원에서 정의된 펩티드(펩티드 태그)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 본원에서 정의된 펩티드 태그는 제 2 분자 또는 성분의 내부 부위에 존재할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "내부 부위"는 본 발명의 펩티드 태그 또는 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)가 혼입될 분자 또는 성분 내의 부위를 의미하며, 이는 상기 분자 또는 성분의 말단에 있지 않은, 즉 상기 분자 또는 성분 내에 내부가 된다. 분자 또는 성분이 단백질인 경우, 내부 부위는 단백질의 말단으로부터 적어도 1개 이상의 잔기, 예를 들어 단백질의 말단으로부터 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 또는 25개 이상의 잔기가 떨어져 있는 부위일 수 있다. 내부 부위는 분자 또는 성분 내의 임의의 지점에 내부적으로 존재할 수 있다. 분자 또는 성분이 단백질인 경우, 내부 부위가 단백질 루프 영역 내, 즉 단백질 내에서 규정된 규칙적인 2차 구조의 2개 영역을 연결하는 영역 내에 있는 것이 바람직하다.
따라서, 일부 구현예에서, 제 2 분자 또는 성분은 단백질일 수 있고, 내부 부위에 본원에서 정의된 펩티드(펩티드 태그)를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 제 2 분자 또는 성분은 단백질일 수 있으며, 루프 영역 또는 도메인에서 본원에서 정의된 펩티드(펩티드 태그)를 포함할 수 있다.
대안적으로 보면, 본 발명은 이소펩티드 결합을 통해 2개의 분자 또는 성분을 접합하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
a) 본원에서 정의된 본 발명의 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)를 포함하는(예를 들어 접합 또는 융합되는) 제 1 분자 또는 성분을 제공하는 단계;
b) 본원에서 정의된 펩티드(펩티드 태그)를 포함하는(예를 들어 접합 또는 융합되는) 제 2 분자 또는 성분을 제공하는 단계;
c) 상기 기재된 바와 같이 펩티드와 폴리펩티드 사이에 이소펩티드 결합의 자발적인 형성을 가능하게 하는(예를 들어 촉진시키거나 용이하게 하는) 조건 하에서 상기 제1 및 제2 분자 또는 성분을 접촉시킴으로써, 상기 제1 분자 또는 성분을 상기 제2 분자 또는 성분에 이소펩티드 결합을 통해 접합시켜 복합체를 형성하는 단계;
를 포함한다.
또한, 일부 구현예에서, 제 2 분자 또는 성분은 내부 부위에서 본원에서 정의된 펩티드(펩티드 태그)를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 제 2 분자 또는 성분은 단백질이고, 본원에서 정의된 펩티드 태그는 상기 단백질의 내부 부위, 바람직하게는 루프 영역 또는 도메인에 존재한다.
복합체를 형성하기 위해 2개 이상의 분자 또는 성분을 연결하는 것에 관한 본 발명의 문맥에서 용어 "접합" 또는 "연결"은 상기 분자 또는 성분, 예를 들어 단백질을 공유 결합을 통해, 특히 상기 분자 또는 성분, 예를 들어 단백질에 포함되거나, 또는 융합되는 폴리펩티드와 펩티드 태그 사이에 형성되는 이소펩티드 결합을 통해 결합 또는 접합시키는 것을 의미한다(예를 들어 펩티드 태그와 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)는 함께 접합되거나 연결되는 단백질의 도메인을 형성할 수 있다).
위에서 언급한 바와 같이, 일부 구현예에서, 본원에 개시된 펩티드 태그 및/또는 본 발명의 폴리펩티드는 다른 분자 또는 다른 성분 또는 실체(entities)에 융합되거나 접합된다. 이러한 분자 또는 성분(즉, 실체)은 핵산 분자, 단백질(항체 또는 그의 항원-결합 단편), 펩티드, 소분자 유기 화합물, 형광단, 금속-리간드 착물, 다당류, 나노입자, 2D 단층(예를 들어 그래핀), 지질, 나노튜브, 중합체, 세포, 바이러스, 바이러스 유사 입자, 바이러스 벡터 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드가 융합되거나 접합된 성분 또는 실체는 하기에 정의된 고체 지지체, 즉 고체 기질 또는 고체상이다.
따라서, 대안적으로 보면, 본 발명은 핵산 분자, 단백질(항체 또는 그의 항원-결합 단편), 펩티드, 소분자 유기 화합물, 형광단, 금속-리간드 착물, 다당류, 나노 입자, 2D 단층(예를 들어 그래핀), 지질, 나노 튜브, 중합체, 세포, 바이러스, 바이러스 유사 입자, 바이러스 벡터 또는 이의 임의의 조합 또는 고체 지지체가 본 발명의 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드에 융합 또는 접합된 것을 제공한다.
세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 원핵 세포, 예를 들어 박테리아 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 진핵 세포, 예를 들어 동물 세포, 예를 들어 인간 세포이다.
일부 구현예에서, 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드(예를 들어 펩티드 태그 결합 파트너)는 치료 또는 예방 효과를 갖는 화합물 또는 분자, 예를 들어 항생제, 항 바이러스제, 백신, 항종양제, 예를 들어 방사성 화합물 또는 동위원소, 사이토카인, 독소, 유전자를 암호화하는 올리고뉴클레오티드 및 핵산, 또는 핵산 백신에 접합 또는 융합될 수 있다.
일부 구현예에서, 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드(예를 들어 펩티드 태그 결합 파트너)는 표지(label), 예를 들어 방사성 표지, 형광 표지, 발광 표지, 발색단 표지 및 양고추냉이 퍼옥시다제, 루시퍼라제 또는 알칼리성 포스파타제와 같은 검출 가능한 신호를 생성하는 물질 및 효소에 접합 또는 융합될 수 있다. 이 검출은 웨스턴 블롯팅/면역블롯팅, 조직 화학, 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA) 또는 유세포 분석(FACS) 형식을 포함하여 항체가 통상적으로 사용되는 수많은 분석에 적용될 수 있다. 또한, 자기 공명 영상술을 위한 표지, 양전자 방출 단층촬영 프로브 및 중성자 포획 요법을 위한 붕소 10도 본 발명의 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)에 접합될 수 있다. 특히, 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드(예를 들어 펩티드 태그 결합 파트너)는 다른 펩티드, 예를 들어 His 태그와 융합되거나, 함께 생산될 수 있고/있거나 예를 들어 말토오스 결합 단백질(Maltose Binding Protein)에 융합하여 재조합 단백질의 발현을 향상시킬 목적으로 다른 단백질에 융합되거나 또는 함께 생산될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 예를 들어 링커 또는 스페이서 서열, 예를 들어 서열번호 16을 통해 그의 C-말단에 융합된 펩티드(예를 들어 c-myc 태그)를 포함할 수 있고, 이는 예를 들어 C-말단 펩티드가 없는 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 용해도를 추가로 개선시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드를 또 다른 분자 또는 성분, 예를 들어 표지, 예를 들어 형광 표지, 또는 고체 기질에 커플링시키기 위해 시스테인 잔기를 본 발명의 폴리펩티드 내로 도입하는 것이 유용할 수 있다. 예를 들어 시스테인 잔기의 도입은 폴리펩티드가 또 다른 분자 또는 성분, 예를 들어 말레이미드 관능기를 함유하는 표지, 예를 들어 형광 표지에 커플링되게 할 것이다.
위에서 언급된 바와 같이, 상기 정의된 펩티드 태그 결합 파트너 폴리펩티드("캐처")는 폴리펩티드와 그의 동족 펩티드 태그 사이의 이소펩티드 결합의 자발적 형성을 폐기하도록 변형될 수 있다. 유리하게는, 변형된 폴리펩티드는 고체 기질(상) 상에 고정화되어, 본원에서 정의된 펩티드 태그를 포함하는 분자 또는 성분의 단리 및/또는 정제를 위한 친화성 정제 시스템을 제공할 수 있다. 따라서, 상기 정의된 폴리펩티드 중의 임의의 것은 서열번호 1의 위치 70 또는 서열번호 2의 위치 66(또는 동등한 위치)의 글루탐산을 치환함으로써 친화성 정제 시스템에서 유용성을 갖는 폴리펩티드를 제공하도록 변형될 수 있어서, 변형된 폴리펩티드는 본원에서 정의된 펩티드 태그와 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성할 수 없다. 따라서, 변형된 폴리펩티드(즉, 친화성 정제 폴리펩티드)는 서열번호 1의 위치 70 또는 서열번호 2의 위치 66(또는 동등한 위치)에 글루탐산의 비-보존적 치환을 포함할 수 있다. 대안적으로 보면, 변형된 폴리펩티드는 서열번호 1의 위치 70 또는 서열번호 2의 위치 66(또는 동등한 위치)에 글루탐산 또는 아스파르트산을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 서열번호 1의 위치 70 또는 서열번호 2의 위치 66(또는 동등한 위치)의 글루탐산은 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로 치환될 수 있다.
따라서, 한 구현예에서, 본 발명은,
i) 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열, 여기서 위치 70의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산이 아니고(즉, 글루탐산 또는 아스파르트산 이외의 임의의 아미노산), 선택적으로 상기 위치 70의 X는 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택됨;
ii) 서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 (i)의 일부, 여기서 위치 66의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산이 아니고, 선택적으로 상기 위치 66의 X는 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택됨;
iii) 서열번호 18에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 여기서 위치 70의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산이 아니고, 선택적으로 상기 위치 70의 X는 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택되고 상기 아미노산 서열은 다음:
1) 위치 4의 글루탐산;
2) 위치 11의 아스파르트산;
3) 위치 13의 트레오닌;
4) 위치 47의 아스파르트산;
5) 위치 59의 트레오닌;
6) 위치 69의 이소류신;
7) 위치 75의 프롤린;
8) 위치 87의 세린;
9) 위치 89의 아르기닌; 및
10) 위치 92의 아스파르트산;
중의 하나 이상을 포함하되;
상기 아미노산 서열이 위치 75의 프롤린을 포함하는 경우, 이는 또한 상기 1) 내지 6) 및 8) 내지 10)으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 18에서의 위치와 동등한 위치에 있음; 또는
iv) 서열번호 19에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 (iii)의 부분, 여기서 위치 66의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산이 아니고, 선택적으로 상기 위치 66의 X는 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택되고 상기 아미노산 서열은 다음:
1) 위치 7의 아스파르트산;
2) 위치 9의 트레오닌;
3) 위치 43의 아스파르트산;
4) 위치 55의 트레오닌;
5) 위치 65의 이소류신;
6) 위치 71의 프롤린;
7) 위치 83의 세린;
8) 위치 85의 아르기닌; 및
9) 위치 88의 아스파르트산;
중의 하나 이상을 포함하되;
상기 아미노산 서열이 위치 71의 프롤린을 포함하는 경우, 이는 또한 상기 1) 내지 5) 및 7) 내지 9)로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 19에서의 위치와 동등한 위치에 있음,
을 포함하는 폴리펩티드(친화성 정제 폴리펩티드)를 제공하되,
상기 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 선택적으로 및 가역적으로 결합한다.
추가 구현예에서, 본 발명은,
i) 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열, 여기서 위치 70의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산이 아니고(즉, 글루탐산 또는 아스파르트산 이외의 임의의 아미노산), 선택적으로 상기 위치 70의 X는 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택됨;
ii) 서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 (i)의 일부, 여기서 위치 66의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산이 아니고, 선택적으로 상기 위치 66의 X는 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택됨;
iii) 서열번호 18에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 여기서 위치 70의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산이 아니고, 선택적으로 상기 위치 70의 X는 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택되고 상기 아미노산 서열은 다음:
1) 위치 4의 글루탐산;
2) 위치 11의 아스파르트산;
3) 위치 13의 트레오닌;
4) 위치 47의 아스파르트산;
5) 위치 59의 트레오닌;
6) 위치 75의 프롤린; 및
7) 위치 92의 아스파르트산;
중의 하나 이상 및 다음:
1) 위치 69의 이소류신;
2) 위치 87의 세린; 및
3) 위치 89의 아르기닌;
중의 하나 이상을 포함하되;
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 1에서의 위치와 동등한 위치에 있음; 또는
iv) 서열번호 19에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 (iii)의 부분, 여기서 위치 66의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산이 아니고, 선택적으로 상기 위치 66의 X는 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택되고 상기 아미노산 서열은 다음:
1) 위치 7의 아스파르트산;
2) 위치 9의 트레오닌;
3) 위치 43의 아스파르트산;
4) 위치 55의 트레오닌;
5) 위치 71의 프롤린; 및
6) 위치 88의 아스파르트산;
중의 하나 이상 및 다음:
1) 위치 65의 이소류신;
2) 위치 83의 세린; 및
3) 위치 85의 아르기닌;
중의 하나 이상을 포함하되;
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 19에서의 위치와 동등한 위치에 있음,
을 포함하는 폴리펩티드(친화성 정제 폴리펩티드)를 제공하되,
상기 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 선택적으로 및 가역적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 서열번호 18의 위치 70(또는 동등한 위치)의 X는 산성 아미노산 이외의 통상적인 (표준) 아미노산이고, 즉 X는 D 또는 E가 아니다.
일부 구현예에서, 서열번호 18의 위치 70(또는 동등한 위치)의 X는 염기성 아미노산(예를 들어 R, K 또는 H), 방향족 아미노산(예를 들어 F, Y 또는 W), 시스테인(C) 및/또는 프롤린(P)이 아니다.
따라서, 일부 구현예에서, 서열번호 18의 위치 70(또는 동등한 위치)의 X는 A, G, I, L, M, N, Q, S, T 및 V로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 위치 70(또는 동등한 위치)의 X는 A, G, S, N 및 T로부터 선택된다.
"통상적인 또는 표준 아미노산"은 폴리펩티드 또는 단백질 분자, 즉 단백질생성 아미노산을 생성하기 위해 생체내에서 사용되는 아미노산이다. 다시 말해서, 표준 또는 통상적인 R-기를 갖는 아미노산 또는 표준 유전자 코드에 의해 암호화되는 측쇄를 갖는 아미노산, 즉 "암호화된 아미노산"이다.
본 발명의 펩티드 태그 결합 파트너 폴리펩티드(즉, 본원에서 정의된 펩티드 태그와 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성할 수 있는 폴리펩티드, 예를 들어 DogCatcher 및 이의 기능성 변이체)에 관하여 상기 명시된 "용해도 변형" 및/또는 "활성 변형"의 조합은 상기 정의된 변형된(친화성 정제) 폴리펩티드에 동일하게 적용된다. 예를 들어 친화성 정제 폴리펩티드는 모든 "용해도 변형" 및/또는 모든 "활성 변형", 또는 위에서 정의된 임의의 선택 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
폴리펩티드가 본원에서 정의된 펩티드 태그와 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성하지 않기 때문에, 서열번호 1의 위치 9의 리신 잔기는 본 발명의 친화성 정제 폴리펩티드에서 요구되지 않을 수 있다. 그러나, 이러한 잔기가 펩티드 태그와 비-공유적으로 상호작용하여 폴리펩티드의 펩티드 태그에 대한 선택적 결합을 용이하게 할 수 있기 때문에, 본 발명의 친화성 정제 폴리펩티드에 이를 보유하는 것이 유리할 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 상기 정의된 (친화성 정제) 폴리펩티드는 서열번호 18 또는 19에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 서열은 서열번호 18의 위치 9 또는 서열번호 19의 위치 5와 동등한 위치에 리신을 포함한다.
상기 언급된 바와 같이, 예를 들어 본원에 정의된 친화성 정제 시스템 또는 장치에 사용하기 위해 폴리펩티드를 또 다른 분자 또는 성분, 특히 고체 기질에 커플링시키기 위해 시스테인 잔기를 본 발명의 폴리펩티드 내로 도입하는 것이 유용할 수 있다. 일부 구현예에서, 시스테인 잔기는 서열번호 20에 제시된 바와 같이, 시스테인 잔기를 포함하는 N-말단 또는 C-말단 아미노산 서열(예를 들어 태그)의 첨가에 의해 폴리펩티드 내로 혼입될 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 상기 정의된 폴리펩티드(예를 들어 친화성 정제 폴리펩티드)는 시스테인 잔기를 포함하는 추가의 N-말단 또는 C-말단 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 시스테인 잔기는 아미노산을 시스테인 잔기로 치환함으로써 폴리펩티드 내로 도입될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 시스테인 잔기는 상기 정의된 임의의 용해성 또는 활성 변형 잔기의 위치에 도입되지 않는다. 일부 구현예에서, 서열번호 18의 위치 13과 동등한 위치 또는 서열번호 19의 위치 27과 동등한 위치의 아스파르트산은 시스테인 잔기로 치환된다. 일부 구현예에서, 서열번호 18의 위치 41과 동등한 위치 또는 서열번호 19의 위치 37과 동등한 위치의 글루타민은 시스테인 잔기로 치환된다.
따라서, 일부 구현예에서, (친화성 정제) 폴리펩티드는,
i) 서열번호 21 또는 22에 제시된 아미노산 서열, 여기서 위치 70의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산이 아니고, 선택적으로 상기 위치 70의 X는 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택됨;
ii) 서열번호 23 또는 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 (i)의 일부, 여기서 위치 66의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산이 아니고, 선택적으로 상기 위치 66의 X는 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택됨;
iii) 서열번호 21 또는 22에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 여기서 위치 70의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산이 아니고, 선택적으로 상기 위치 70의 X는 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택되고 상기 아미노산 서열은 위치 31 또는 41의 시스테인 및 다음:
1) 위치 4의 글루탐산;
2) 위치 11의 아스파르트산;
3) 위치 13의 트레오닌;
4) 위치 47의 아스파르트산;
5) 위치 59의 트레오닌;
6) 위치 69의 이소류신;
7) 위치 75의 프롤린;
8) 위치 87의 세린;
9) 위치 89의 아르기닌; 및
10) 위치 92의 아스파르트산;
중의 하나 이상을 포함하되;
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 21 또는 22에서의 위치와 동등한 위치에 있으며 선택적으로 (A) 상기 아미노산 서열이 위치 75의 프롤린을 포함하는 경우, 이는 또한 상기 1) 내지 6) 및 8) 내지 10)으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하거나; 또는 (B) 상기 아미노산 서열은 상기 1)-5), 7) 및 10)으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 잔기 및 상기 6), 8) 및 9)로부터 선택된 하나의 아미노산 잔기를 포함함; 또는
iv) 서열번호 23 또는 24에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 (iii)의 부분, 여기서 위치 66의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산이 아니고, 선택적으로 상기 위치 66의 X는 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택되고 상기 아미노산 서열은 위치 27 또는 37의 시스테인 및 다음:
1) 위치 7의 아스파르트산;
2) 위치 9의 트레오닌;
3) 위치 43의 아스파르트산;
4) 위치 55의 트레오닌;
5) 위치 65의 이소류신;
6) 위치 71의 프롤린;
7) 위치 83의 세린;
8) 위치 85의 아르기닌; 및
9) 위치 88의 아스파르트산;
중의 하나 이상을 포함하되;
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 23 또는 24에서의 위치와 동등한 위치에 있으며 선택적으로 (A) 상기 아미노산 서열이 위치 71의 프롤린을 포함하는 경우, 이는 또한 상기 1) 내지 5) 및 7) 내지 9)로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하거나; 또는 (B) 상기 아미노산 서열은 상기 1)-4), 6) 및 9)로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 잔기 및 상기 5), 7) 및 8)로부터 선택된 1개의 아미노산 잔기를 포함함;
을 포함하는 폴리펩티드를 포함하되,
상기 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 선택적으로 및 가역적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 상기 정의된 (친화성 정제) 폴리펩티드는 서열번호 21 내지 24 중의 어느 하나에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 아미노산 서열은 서열번호 21 또는 22에서의 위치 9 또는 서열번호 23 또는 24에서의 위치 5와 동등한 위치에 리신을 포함한다.
용어 "선택적으로 결합한다"는 펩티드 태그가 존재하는 샘플(예를 들어 펩티드 태그(및 펩티드 태그가 융합 또는 접합된 관련 분자 또는 성분, 즉 융합 파트너)가 단리 또는 정제되는 샘플) 내의 다른 성분에 비해 더 큰 친화성 및/또는 특이성으로 (예를 들어 반데르 발스 힘 및/또는 수소 결합에 의해) 비공유적으로 이의 동족 펩티드 태그에 결합하는 (친화성 정제) 폴리펩티드의 능력을 지칭한다. 따라서, 본 발명의 (친화성 정제) 폴리펩티드는 대안적으로 적합한 조건 하에서 이의 동족 펩티드 태그(즉, DogTag 펩티드 또는 이의 변이체), 예를 들어 서열번호 3, 4, 5 또는 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 특이적으로 및 가역적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다.
동족 펩티드 태그에 대한 결합은 샘플 내에 존재하는 다른 분자(예를 들어 펩티드 또는 폴리펩티드), 즉 비-동족 분자에 대한 결합과 구별될 수 있다. 본 발명의 (친화성 정제) 폴리펩티드는 샘플 내에 존재하는 다른 분자(예를 들어 펩티드 또는 폴리펩티드)에 결합하지 않거나, 임의의 이러한 비-특이적 결합이 발생하는 경우, 용이하게 동족 펩티드 태그에 대한 결합과 구별될 수 있도록 무시할만하게 또는 검출 불가능하게 한다.
특히, 본 발명의 (친화성 정제) 폴리펩티드가 동족 펩티드 태그 이외의 분자에 결합하는 경우, 이러한 결합은 일시적이어야 하고, 결합 친화성은 동족 펩티드 태그에 대한 (친화성 정제) 폴리펩티드의 결합 친화성보다 낮아야 한다. 따라서, 펩티드 태그에 대한 (친화성 정제) 폴리펩티드의 결합 친화성은 샘플 내에 존재하는 다른 분자(즉, 비-동족 분자)보다 적어도 10배 이상(an order of magnitude) 더 높아야 한다. 바람직하게는, 동족 펩티드 태그에 대한 (친화성 정제) 폴리펩티드의 결합 친화성은 비-동족 분자(예를 들어 펩티드 또는 폴리펩티드)에 대한 결합 친화성보다 적어도 2, 3, 4, 5 또는 6 자릿수 이상(2, 3, 4, 5, or 6 orders of magnitude) 더 높아야 한다.
따라서, 선택적 또는 특이적 결합은 동족 펩티드 태그에 대한 본 발명의 (친화성 정제) 폴리펩티드의 해리 상수가 약 10-3M 미만인 이의 동족 펩티드 태그에 대한 본 발명의 (친화성 정제) 폴리펩티드의 친화성을 지칭한다. 바람직한 구현예에서, 이의 동족 펩티드 태그에 대한 폴리펩티드의 해리 상수는 약 10-4M, 10-5M, 10-6M, 10-7M, 10-8M 또는 10-9M 미만이다.
본 발명의 (친화성 정제) 폴리펩티드의 결합 선택성(예를 들어 특이성)은 또한 하기 정의된 단리 또는 정제 방법에서 수득된 생성물, 즉 동족 펩티드 태그 및 펩티드 태그가 융합 또는 접합된 관련 분자 또는 성분(융합 파트너, 예를 들어 폴리펩티드)의 수율 및/또는 순도에 기초하여 정의될 수 있다. 일부 구현예에서, 하기 정의된 방법에서 본 발명의 (친화성 정제) 폴리펩티드는 적어도 약 75%, 예를 들어 적어도 약 80%, 85% 또는 90%의 순도를 갖는 생성물을 생성한다. 본 발명의 방법 및 (친화성 정제) 폴리펩티드를 사용하여 수득된 생성물의 순도는 임의의 적합한 수단, 예를 들어 WO 2020/115252(본원에 참조로 포함됨)에 기재된 SDS-PAGE 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 하기 정의된 방법에서 본 발명의 (친화성 정제) 폴리펩티드는 적어도 약 50%, 예를 들어 약 60%, 70%, 75%, 80% 85% 또는 90%의 수율로 생성물을 생성한다. 본 발명의 방법 및 (친화성 정제) 폴리펩티드를 사용하여 수득된 생성물의 수율은 임의의 적합한 수단을 사용하여 결정될 수 있다.
따라서, 본 발명의 (친화성 정제) 폴리펩티드는 서열번호 3-5 및 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된 적어도 하나의 펩티드에 선택적으로 및 가역적으로 결합해야 한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 (친화성 정제) 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 아미노산을 포함하거나 그로 구성된 펩티드에 선택적으로 및 가역적으로 결합해야 한다. 따라서, 본 발명의 (친화성 정제) 폴리펩티드는 서열번호 3-5 또는 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된 적어도 하나의 펩티드에 결합하며, 펩티드 태그가 존재하는 샘플 내의 다른 성분(즉, 비-동족 분자)에 비해 더 큰 친화성 및/또는 특이성을 갖는다. 샘플은 펩티드 태그(및 펩티드 태그가 융합되거나 접합된 연관된 분자 또는 성분, 즉 융합 파트너)가 단리되거나 정제되는 임의의 샘플(예를 들어 하기 기재된 바와 같은 세포 용해물 등)일 수 있다. 그러나, 본 발명의 폴리펩티드는 또한 본원에 정의된 다른 동족 펩티드 태그에 결합할 수 있다.
비-동족 분자, 특히 비-동족 펩티드 또는 폴리펩티드는 본원에 정의된 펩티드 태그에 대해 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된 아미노산 서열을 함유하지 않는 펩티드 또는 폴리펩티드, 즉 서열번호 3, 4, 5 또는 17로서 정의될 수 있다. 바람직하게는, 비-동족 분자는 본원에서 정의된 펩티드 태그에 대해 약 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25% 또는 20% 초과의 서열 동일성을 갖는 19-23개의 아미노산의 연속 서열, 즉 서열번호 3, 4, 5 또는 17을 함유하지 않는다. 다른 비-동족 분자는 탄수화물, 당, 지질, 이온 및 소분자를 포함한다.
(친화성 정제) 폴리펩티드의 그의 동족 펩티드 태그에 대한 선택적 또는 특이적 결합을 위한 적합한 조건은 일상적인 실험을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어 적합한 조건은 본 발명의 펩티드 태그 결합 파트너 폴리펩티드에 대해 상기 제시된 조건 및 본원에서 정의된 펩티드 태그와 이소펩티드 결합의 형성을 위한 조건을 포함할 수 있다.
용어 "가역적" 또는 "가역적으로 결합하다"는 파괴될 (친화성 정제) 폴리펩티드와 그의 동족 펩티드 태그 사이의 상호작용의 능력을 지칭하며, 이는 적합한 조건 하에서 복합체의 분리(해리)를 초래한다. 다시 말해서, 친화성 정제 폴리펩티드:동족 펩티드 태그 복합체에 의해 형성된 비-공유 상호작용은 구성 부분의 분리를 가능하게 하는 적합한 조건 하에서 파괴될 수 있다. 복합체를 해리시키기 위한 적합한 조건은 복합체를 형성하는데 요구되는 비-공유 결합을 파괴 또는 파괴할 수 있는 임의의 조건을 포함할 수 있으며, 일상적인 실험을 사용하여 결정될 수 있다.
친화성 정제 폴리펩티드:동족 펩티드 태그 복합체를 해리시키기 위한 조건은 바람직하게는 DogTag 펩티드 및/또는 융합 파트너의 활성의 비가역적 손실을 초래하지 않아야 함이 명백할 것이다. 예를 들어 DogTag가 본 발명의 펩티드 태그 결합 파트너 폴리펩티드(예를 들어 DogCatcher)와 자발적으로 반응하여 이소펩티드 결합을 형성하는 것을 방지하는 조건은 피해야 한다. 유사하게, DogTag 펩티드(즉, 융합 파트너, 예를 들어 폴리펩티드)에 융합된 분자 또는 성분을 변경 또는 억제(예를 들어 변성)시키는 조건은 친화성 정제 폴리펩티드:동족 펩티드 태그 복합체를 해리시키는데 적합하지 않은데, 이러한 조건은 하류 적용에서 DogTag 융합의 유용성을 제한할 것이기 때문이다. 이러한 조건은 융합 파트너의 성질에 따라 달라질 것이고, 숙련자는 어떤 조건이 관련 기술분야에 공지된 방법에 기초하여 적합한지(또는 적합하지 않은지)를 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 예로서, 친화성 정제 폴리펩티드:동족 펩티드 태그 복합체를 끓이거나 및/또는 1% 나트륨 도데실 설페이트(SDS)로 처리하면 친화성 정제 폴리펩티드:동족 펩티드 태그 복합체를 해리시키지만, 융합 파트너를 비가역적으로 변경(예를 들어 변성)시킬 수 있다.
본원에서 언급된 바와 같이, "기능적 등가물"은 모 분자(즉, 그것이 서열 상동성을 나타내는 분자)에 비해 그의 각각의 파트너와의 결합(예를 들어 본 발명의 방법에서의 더 낮은 순도 또는 수율, 또는 제한된 범위의 반응 조건(예를 들어 더 좁은 온도 범위, 예를 들어 10 내지 30℃ 등)에서의 활성)에서 일부 감소된 선택성(예를 들어 특이성) 또는 친화성을 나타낼 수 있지만, 바람직하게는 효율적이거나 또는 더 효율적인 본원에 기재된 동족 펩티드 태그 및 상기 논의된 본 발명의 친화성 정제 폴리펩티드의 변이체를 지칭한다.
서열번호 3-5 또는 17 중의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 구성된 동족 펩티드 태그의 활성과 "동등한" 활성을 갖는 본원에 기재된 돌연변이체 또는 변이체 동족 펩티드 태그는 서열번호 3-5 또는 17 중의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 구성된 펩티드 태그의 활성과 유사한(즉, 비슷한), 즉 펩티드 태그의 실제 적용이 예를 들어 실험 오차의 한계 내에서 유의하게 영향을 받지 않는 활성을 가질 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 동등한 펩티드 태그 활성은 기재된 돌연변이체 또는 변이체 동족 펩티드 태그가 본 발명의 친화성 정제 폴리펩티드에 선택적으로 및 가역적으로 결합할 수 있음을 의미한다. 일부 바람직한 구현예에서, 돌연변이체 또는 변이체 동족 펩티드 태그는 동일한 조건 하에 서열번호 3-5 또는 17 중의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 구성된 펩티드 태그에 대해 유사한 반응 속도(즉, 상기 논의된 바와 같은 속도 상수)로 본원에서 정의된 펩티드 태그 결합 파트너 폴리펩티드와 자발적으로 이소펩티드 결합을 형성하고/하거나 수율을 가질 수 있다.
유사하게, 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된 폴리펩티드의 활성과 "동등한" 활성을 갖는 본 발명의 돌연변이체 또는 변이체 친화성 정제 폴리펩티드(바람직하게는 위치 70의 X가 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택됨)는 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된 폴리펩티드의 활성과 유사한(즉, 비슷한) 활성을 가질 수 있으며, 즉 폴리펩티드의 실제 적용이 예를 들어 실험 오차의 한계 내에서 유의하게 영향을 받지 않게 한다. 따라서, 동등한 폴리펩티드 활성은 본 발명의 돌연변이체 또는 변이체 친화성 정제 폴리펩티드가 동일한 조건 하에 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된 폴리펩티드(바람직하게는 위치 70의 X가 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택됨)와 유사한 친화성 및/또는 수율로 본원에 기재된 동족 펩티드 태그(예를 들어 서열번호 3-5 또는 17 중의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성됨)에 선택적으로 및 가역적으로 결합할 수 있음을 의미한다.
서열번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된 폴리펩티드의 활성과 "동등한" 활성을 갖는 본 발명의 돌연변이체 또는 변이체 폴리펩티드(바람직하게는 위치 70의 X가 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택됨)는 본원에서 정의된 동족 펩티드 태그, 예를 들어 서열번호 3-5 또는 17 중의 하나 또는 모두와의 결합을 위해 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된 폴리펩티드(바람직하게는 위치 70의 X가 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택됨)와 경쟁할 수 있다.
동일한 반응 조건 하에 측정된 상이한 폴리펩티드(예를 들어 서열번호 18 대 돌연변이체)의 활성, 예를 들어 상기 예시된 바와 같은 온도, 리간드(즉, 동족 펩티드 태그 서열) 및 그의 농도, 완충액, 염 등을 각각의 폴리펩티드에 대한 친화성 및/또는 수율이 보다 높거나, 보다 낮거나 동등한지 여부를 결정하기 위해 용이하게 비교할 수 있다.
특히 유용한 구체예에서, 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드(예를 들어 펩티드 태그 결합 파트너)는 다른 펩티드 또는 폴리펩티드와 융합되거나 접합된다. 예를 들어 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드(예를 들어 펩티드 태그 결합 파트너)는 하기 논의된 바와 같은 재조합 기술에 의해 다른 펩티드 또는 폴리펩티드의 파트로서, 즉 재조합 또는 합성 단백질 또는 폴리펩티드로서 생산될 수 있다.
본원에 개시된 펩티드 태그 및/또는 본 발명의 폴리펩티드(예를 들어 펩티드 태그 결합 파트너)가 임의의 단백질 또는 폴리펩티드에 융합될 수 있음은 명백할 것이다. 단백질은 임의의 적합한 공급원으로부터 유래되거나 수득될 수 있다. 예를 들어 단백질은 생물학적 샘플 및 임상 샘플, 예를 들어 유기체(진핵 생물, 원핵 생물)의 임의의 세포 또는 조직 샘플, 또는 이로부터 유래된 임의의 체액 또는 제조물, 및 세포 배양물, 세포 제조물, 세포 용해물 등과 같은 샘플로부터 시험관내 해독되거나 정제될 수 있다. 단백질은 환경 샘플로부터 유래되거나 수득, 예를 들어 정제될 수 있고, 예를 들어 토양 및 물 샘플 또는 식품 샘플도 포함된다. 샘플은 새로 제조될 수 있거나 또는 예를 들어 저장을 위해, 임의의 편리한 방식으로 전처리될 수 있다.
위에서 언급한 바와 같이, 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 펩티드 태그 및/또는 본 발명의 폴리펩티드에 융합된 펩티드 또는 단백질은 재조합으로 생산될 수 있으며, 따라서 상기 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 임의의 적합한 공급원, 예를 들어 모든 원핵 또는 진핵 세포, 바이러스, 박테리오파지, 마이코 플라스마, 원형질체 및 소기관을 포함한 임의의 바이러스 또는 세포 물질로부터 유래되거나 수득될 수 있다. 따라서, 이러한 생물학적 물질은 모든 종류의 포유동물 및 비포유동물 세포, 식물 세포, 남조류를 포함한 조류, 진균, 박테리아, 원생 동물, 바이러스 등을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질은 합성 단백질일 수 있다. 예를 들어 본원에 개시된 펩티드 및 폴리펩티드(단백질)는 고체상 펩티드 합성과 같은 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다.
펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드(예를 들어 펩티드 태그 결합 파트너)는 재조합 또는 합성 단백질 내의 임의의 편리한 위치에 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)는 재조합 또는 합성 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드(예를 들어 펩티드 태그 결합 파트너)는 재조합 또는 합성 폴리펩티드 내에 내부적으로 위치할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드(예를 들어 펩티드 태그 결합 파트너)는 재조합 또는 합성 폴리펩티드의 N-말단, C-말단 또는 내부 도메인으로 간주될 수 있다.
위에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 펩티드 태그 및 펩티드 태그 결합 파트너 폴리펩티드는 적어도 하나의 루프 영역을 통해 단백질을 함께 결합시킬 필요가 있는 상황에서 특히 효과적이다. 따라서, 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 바람직하게는 재조합 또는 합성 폴리펩티드 내에 내부적으로 위치한다. 바람직한 구현예에서, 펩티드 태그는 재조합 또는 합성 폴리펩티드의 루프 영역 또는 도메인 내에 위치한다. 따라서, 일부 구현예에서, 펩티드 태그는 재조합 또는 합성 폴리펩티드의 내부 도메인으로서 간주될 수 있다.
일부 구현예에서, 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드(예를 들어 펩티드 태그 결합 파트너)와 결합 또는 접합되는 펩티드 또는 폴리펩티드 사이에는 하나 이상의 스페이서, 예를 들어 펩티드 스페이서를 포함하는 것이 유용할 수 있다. 따라서, 펩티드 또는 폴리펩티드와 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드(예를 들어 펩티드 태그 결합 파트너)는 서로 직접 연결될 수 있거나 하나 이상의 스페이서 서열에 의해 간접적으로 연결될 수 있다. 따라서, 스페이서 서열은 재조합 또는 합성 폴리펩티드의 2 이상의 개별 부분을 이격 또는 분리시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 스페이서는 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)에 대해 N-말단 또는 C-말단일 수 있다. 일부 구현예에서, 스페이서는 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)의 양쪽에 있을 수 있으며, 예를 들어 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드(예를 들어 펩티드 태그 결합 파트너)가 접합 또는 접합될 펩티드 또는 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에 위치할 수 있다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 펩티드 태그 및 폴리펩티드(예를 들어 펩티드 태그 결합 파트너)는 펩티드 태그가 접합 또는 접합(또는 단리 또는 정제)될 펩티드 또는 폴리펩티드 내의 내부 부위에 위치하는 경우에 특히 적합하다. 예를 들어 펩티드 태그는 루프 영역 내로 삽입될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 스페이서는 펩티드 태그의 양쪽에 있을 수 있다.
스페이서 서열의 정확한 성질은 가변 길이 및/또는 서열일 수 있으며, 예를 들어 1-40, 보다 특히 2-20, 1-15, 1-12, 1-10, 1-8 또는 1-6 잔기, 예를 들어 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 잔기를 가질 수 있다. 대표적인 예로서, 스페이서 서열은 존재하는 경우 1-15, 1-12, 1-10, 1-8 또는 1-6 잔기 등을 가질 수 있다. 잔기의 성질은 중요하지 않으며, 예를 들어 임의의 아미노산, 예를 들어 중성 아미노산, 또는 지방족 아미노산, 또는 대안적으로 이들은 소수성이거나, 극성이거나 하전형 또는 구조 형성성, 예를 들어 프롤린일 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 링커는 세린 및/또는 글리신이 풍부한 서열이다. 예시적인 링커/스페이서 서열은 서열번호 16에 제시되어 있다.
따라서, 예시적인 스페이서 서열은 임의의 단일 아미노산 잔기, 예를 들어 S, G, L, V, P, R, H, M, A 또는 E 또는 이러한 하나 이상의 잔기로 구성된 디-, 트리-, 테트라-, 펜타- 또는 헥사-펩티드를 포함한다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 위에서 정의된 본 발명의 폴리펩티드(예를 들어 펩티드 태그 결합 파트너)를 포함하는 재조합 또는 합성 폴리펩티드, 즉 본 발명의 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)에 융합된 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어 이종 펩티드 또는 폴리펩티드, 즉 본 발명의 폴리펩티드와 정상적으로 관련이 없는, 즉 다른 유기체 기원의 펩티드, 올리고펩티드 또는 폴리펩티드)를 제공한다. 재조합 또는 합성 폴리펩티드는 선택적으로 위에서 정의된 스페이서를 포함한다.
본 발명의 재조합 또는 합성 폴리펩티드는 또한 이의 정제를 용이하게 하기 위한 정제 모이어티 또는 태그를 포함할 수 있다(예를 들어 이하에 논하는 본 발명의 방법 및 용도에 사용하기 전에). 임의의 적합한 정제 모이어티 또는 태그가 폴리펩티드에 혼입될 수 있고 이러한 모이어티는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, 재조합 또는 합성 폴리펩티드는 펩티드 정제 태그 또는 모이어티, 예를 들어 His-태그 또는 C-태그 서열을 포함할 수 있다. 이러한 정제 모이어티 또는 태그는 폴리펩티드 내 임의의 위치에 포함될 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 정제 모이어티는 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에 위치하거나, 또는 N- 또는 C-말단쪽(즉, N- 또는 C-말단의 5, 10, 15, 20개 아미노산 이내에)에 위치한다. 일부 구현예에서, 태그는 다른 분자 또는 성분, 예를 들어 고체 기질에 대한 재조합 또는 합성 폴리펩티드의 접합을 용이하게 하기 위해 시스테인 잔기를 포함할 수 있다.
위에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 이점은 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어 본 발명의 재조합 또는 합성 폴리펩티드)에 포함된 본 발명의 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드가 완전히 유전자 암호화될 수 있다는 사실에서 기인한다. 따라서, 추가의 측면에서, 본 발명은 위에서 정의된 폴리펩티드(예를 들어 펩티드 태그 결합 파트너) 또는 재조합 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 따라서, 일부 구현예에서, 핵산 분자는 박테리아 세포, 예를 들어 이. 콜라이 (E. coli ), 예를 들어 서열번호 7에 제시된 뉴클레오티드 서열에서 발현에 최적화된 코돈이다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 포유동물 세포, 예를 들어 인간 세포, 예를 들어 HEK 세포에서의 발현에 최적화된 코돈이다.
일부 구현예에서, 위에서 정의된 결합 파트너를 암호화하는 폴리펩티드는 서열번호 7에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 7에 제시된 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
바람직하게는, 상기 핵산 분자는 서열번호 7과 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 이상 동일하다.
핵산 서열 동일성은 예를 들어 GCG 패키지를 사용하는 FASTA Search에 의해 기본 값 및 가변 pamfactor, 12.0으로 설정된 갭 생성 페널티, 4.0으로 설정된 갭 확장 페널티, 6개 뉴클레오티드의 윈도우 하에 측정할 수 있다. 바람직하게는 상기 비교는 전체 길이의 서열에 걸쳐 이루어지지만, 보다 작은 비교 윈도우, 예를 들어 300, 200, 100 또는 50개 미만의 인접 뉴클레오티드에 걸쳐 이루어질 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 리보뉴클레오티드 및/또는 데옥시리보뉴클레오티드뿐만 아니라 Watson-Crick형 또는 유사한 염기쌍 상호작용에 참여할 수 있는 합성 잔기, 예를 들어 합성 뉴클레오타이드로 구성될 수 있다. 바람직하게는, 핵산 분자는 DNA 또는 RNA이다.
상기 기재된 핵산 분자는 발현 제어 서열, 또는 이러한 재조합 DNA 분자를 함유하는 재조합 DNA 클로닝 매개체 또는 벡터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이로써 유전자 산물로서 본 발명의 펩티드 및 폴리펩티드의 세포 발현을 가능해지며, 이의 발현은 당해의 세포 내로 도입된 유전자(들)에 의해 지시된다. 유전자 발현은 당해의 세포에서 활성인 프로모터(promoter)로부터 유도되고 게놈에 포함시키거나 독립적인 복제 또는 일시적 형질감염/발현을 위해 선형 또는 원형 핵산(예를 들어 DNA) 벡터 중 임의의 형태에 삽입될 수 있다. 적합한 형질전환 또는 형질감염 기술은 문헌에 잘 기재되어 있다. 대안적으로, 노출된 핵산(예를 들어 하나 이상의 합성 잔기, 예를 들어 염기 및/또는 당 유사체를 포함할 수 있는 DNA 또는 RNA) 분자가 본 발명의 폴리펩티드의 생성을 위해 세포 내로 직접 도입될 수 있다. 대안적으로, 핵산은 시험관내 전사에 의해 mRNA로 변환될 수 있고 관련 단백질은 시험관내 해독에 의해 생성될 수 있다.
적절한 발현 벡터는 적절한 제어 서열, 예를 들어 해독(예를 들어 시작 및 정지 코돈, 리보솜 결합 부위) 및 전사 제어 우레아(예를 들어 프로모터-오퍼레이터(operator) 영역, 종결 정지 서열)를 본 발명의 핵산 분자와 정합성 리딩 프레임으로 연결하여 포함한다. 적절한 벡터는 플라스미드 및 바이러스(박테리오파지 및 진핵 바이러스 모두 포함)를 포함할 수 있다. 적합한 바이러스 벡터는 바큘로바이러스 및 또한 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 렌티 바이러스, 헤르페스 및 백시니아/폭스 바이러스를 포함한다. 많은 다른 바이러스 벡터가 당업계에 기술되어 있다. 적합한 벡터의 예는 박테리아 및 포유동물 발현 벡터 pGEX-KG, pEF-neo 및 pEF-HA를 포함한다.
위에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 재조합 또는 합성 폴리펩티드는 추가 서열(예를 들어 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하는 펩티드/폴리펩티드 태그)을 포함할 수 있고, 따라서 핵산 분자는 편리하게는 추가 펩티드 또는 폴리펩티드, 예를 들어 His-태그, 말토오스-결합 단백질 등을 암호화하는 DNA와 융합되어 발현 시에 융합 단백질을 생성한다.
따라서, 추가 측면에서 볼 때, 본 발명은 위에서 정의된 핵산 분자를 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)를 암호화하는 본 발명의 핵산 분자를 벡터 핵산에 삽입하는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 재조합 핵산 분자의 제조 방법을 포함한다.
바람직하게는 벡터에 함유된, 본 발명의 핵산 분자는 임의의 적절한 수단에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 적합한 형질전환 또는 형질감염 기술은 문헌에 잘 기재되어 있다. 다수의 기술이 공지되어 있고, 상기 벡터를 발현을 위해 원핵 또는 진핵 세포 내로 도입하는데 사용될 수 있다. 이러한 목적에 바람직한 숙주 세포는 곤충 세포주, 효모, 포유동물 세포주 또는 이. 콜라이, 예를 들어 균주 BL21(DE3)을 포함한다. 본 발명은 또한 핵산 분자, 특히 상기 정의된 벡터를 함유하는 형질전환된 또는 형질감염된 원핵 또는 진핵 숙주 세포에까지 확대된다.
따라서, 다른 측면으로, 상기 기재된 바와 같은 핵산 분자 및/또는 벡터를 함유하는 재조합 숙주 세포가 제공된다.
"재조합"은 핵산 분자 및/또는 벡터가 숙주 세포 내로 도입되었음을 의미한다. 숙주 세포는 당연히 핵산 분자의 내인성 카피를 함유하거나 함유하지 않을 수 있지만, 핵산 분자 및/또는 벡터의 외인성 또는 추가 내인성 카피가 도입되었다는 점에서 재조합체이다.
본 발명의 추가 측면은 위에서 정의된 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포를, 폴리펩티드를 암호화하는 상기 핵산 분자가 발현되는 조건하에 배양하고, 이와 같이 생산된 상기 분자(폴리펩티드)를 회수하는 것을 포함하여, 위에서 정의된 본 발명의 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다. 발현된 폴리펩티드는 본 발명의 추가 측면을 형성한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 펩티드 태그 및/또는 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 방법 및 용도에 사용하기 위한 상기 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)는 예를 들어 아미노산 또는 작은 합성적으로 생성된 펩티드의 결찰에 의해, 또는 더 편리하게는 상기 기재된 바와 같은 상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자의 재조합 발현에 의해 합성적으로 생성될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 당업계에 공지된 임의의 적합한 수단에 의해 합성적으로 생성될 수 있다.
따라서, 본원에 개시된 펩티드 태그 및/또는 본 발명의 폴리펩티드는 단리, 정제, 재조합 또는 합성된 펩티드 태그 또는 폴리펩티드일 수 있다.
용어 "폴리펩티드"는 본원에서 용어 "단백질"과 상호교환적으로 사용된다. 상기 언급된 바와 같이, 용어 폴리펩티드 또는 단백질은 전형적으로 40개 이상의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 아미노산, 예를 들어 40-1000, 50-900, 60-800, 70-700, 80-600, 90-500, 100-400 아미노산을 포함하는 임의의 아미노산 서열을 포함한다.
유사하게, 본 발명의 핵산 분자는 단리, 정제, 재조합 또는 합성된 핵산 분자일 수 있다.
따라서, 대안적으로 보면, 본 발명의 폴리펩티드 및 핵산 분자는 바람직하게는 비 천연, 즉 비 천연 발생의 분자이다.
표준 아미노산 명명법이 본원에 사용된다. 따라서, 아미노산 잔기의 전체 명칭은 1 문자 코드 또는 3 문자 약어와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 예를 들어 리신은 K 또는 Lys로 치환될 수 있고, 이소류신은 I 또는 Ile로 치환될 수 있으며, 기타 등등이다. 더욱이, 용어 아스파테이트와 아스파르트산, 및 글루타메이트와 글루탐산은 본원에서 상호교환적으로 사용되고 각각 Asp 또는 D, 또는 Glu 또는 E로 교체될 수 있다.
본원에 개시된 펩티드 태그 및 본 발명의, 본 발명에 사용하기 위한 폴리펩티드는 재조합적으로 생산될 수 있고 이것이 본 발명의 바람직한 구체예인 것으로 예상되지만, 본원에 개시된 펩티드 태그 및 본 발명의 폴리펩티드가 다른 수단에 의해 위에서 정의된 단백질 또는 다른 실체, 예를 들어 분자 또는 성분에 접합될 수 있음은 분명할 것이다. 환언하면, 펩티드 태그 또는 폴리펩티드 및 다른 분자, 성분 또는 실체, 예를 들어 단백질 또는 고체 기질은 임의의 적합한 수단에 의해, 예를 들어 재조합적으로 별도로 생산되고, 이어서 접합되어(결합되어) 본 발명의 방법 및 용도에 사용될 수 있는 펩티드 태그-다른 성분 접합체 또는 폴리펩티드-다른 성분 접합체를 형성할 수 있다. 예를 들어 본원에 개시된 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드는 상기 기재된 바와 같이 합성적으로 생산되거나 재조합적으로 생산될 수 있고, 다른 성분, 예를 들어 단백질에 비-펩티드 링커 또는 스페이서, 예를 들어 화학적 링커 또는 스페이서를 통해 접합될 수 있다.
위에서 논의된 다른 구현예에서와 같이, 펩티드 태그는 내부 부위에서, 즉 다른 성분의 말단 중의 하나에서가 아닌 다른 성분에 접합(결합)될 수 있다. 다른 성분이 단백질인 경우, 펩티드 태그는 바람직하게는 상기 단백질 내의 루프 영역에 접합(결합)될 수 있다.
위에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 친화성 정제 폴리펩티드는 2-파트 친화성 정제 시스템의 한 부분을 형성하고, 본원에 정의된 동족 펩티드 태그를 포함하는(예를 들어 이에 결합 또는 접합된) 분자 또는 성분(융합 파트너)을 정제(즉, 단리 또는 분리)하는데 있어서 특정 유용성을 발견한다.
따라서, 추가의 측면에서, 본 발명은 본원에 정의된 동족 펩티드 태그를 포함하는 분자 또는 성분, 예를 들어 서열번호 3-5 또는 17 중의 하나에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 태그를 정제 또는 단리하기 위한 위에서 정의된 본 발명의 친화성 정제 폴리펩티드(예를 들어 서열번호 18)의 용도를 제공하는 것으로 보일 수 있고, 여기서 아미노산 서열은 위치 17의 아스파라긴 잔기를 포함하고, 선택적으로 위치 5에 트레오닌 잔기, 위치 10에 아스파르트산 잔기 및 위치 11에 글리신 잔기를 포함한다.
친화성 정제 시스템은 전형적으로 표적 리간드의 포획, 세척 및 용리를 용이하게 하기 위해 고체 기질 상에 고정화된 포획 분자(예를 들어 수용체)를 이용한다. 따라서, 본 발명의 친화성 정제 폴리펩티드는 고체 기질(즉, 고체 상 또는 고체 지지체)에 고정(예를 들어 융합, 접합 또는 연결)될 수 있다. 이는 임의의 편리한 방식으로 달성될 수 있음이 명백할 것이다. 대안적으로 보면, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드가 고정되는 고체 지지체를 제공한다.
고정 방식 또는 수단 및 고체 지지체는 선택에 따라 당업계에 널리 공지되고 문헌에 기재된 바와 같은 임의의 수의 고정 수단 및 고체 지지체로부터 선택될 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 예를 들어 폴리펩티드의 도메인 또는 모이어티를 통해(예를 들어 화학적으로 가교됨) 지지체에 직접 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 링커 기에 의해 간접적으로, 또는 중간 결합 기(들)에 의해(예를 들어 비오틴-스트렙타비딘 상호작용에 의해) 결합될 수 있다. 따라서, 폴리펩티드는 고체 지지체에 공유적으로 또는 비공유적으로 연결될 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드는 공유 결합을 통해 고체 기질 상에 고정화된다.
연결(linkage)은 가역적(예를 들어 절단 가능) 또는 비가역적 연결일 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 연결은 효소적으로, 화학적으로, 또는 예를 들어 빛에 의해 절단될 수 있고, 예를 들어 연결은 감광성 연결일 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드 및 다른 성분, 예를 들어 단백질 또는 고체 기질은 결합을 통해 직접 또는 연결 기를 통해 간접으로 함께 결합될 수 있다. 연결 기가 이용되는 경우, 이러한 기는 이 연결 기를 통해 펩티드 태그 또는 폴리펩티드와 다른 실체, 예를 들어 단백질 또는 고체 기질이 공유 부착하게 하는 것으로 선택할 수 있다. 당해의 연결 기는 다른 실체, 예를 들어 단백질의 본질에 따라 매우 달라질 수 있다. 연결 기는 존재하는 경우, 많은 구체예들에서 생물학적으로 불활성이다.
많은 연결 기는 당업자에게 공지되어 있으며 본 발명에 사용된다. 대표적인 구체예에서, 연결 기는 일반적으로 약 50 달톤(Daltons) 이상, 보통 약 100 달톤 이상이고, 연결 기가 스페이서를 포함하는 경우 1000 달톤 이상, 예를 들어 최대 1000000 달톤일 수 있지만, 일반적으로 약 500 달톤을 초과하지 않을 것이고 보통 약 300 달톤을 초과하지 않을 것이다. 일반적으로, 이러한 링커는 어느 한쪽 말단이 펩티드 태그 또는 폴리펩티드 및 다른 분자 또는 성분, 예를 들어 단백질 또는 고체 기질과 공유 결합할 수 있는 반응성 작용기로 종결된 스페이서 기를 포함할 것이다.
당해 스페이서 기는 지방족 및 불포화 탄화수소 쇄, 산소(폴리에틸렌글리콜과 같은 에테르) 또는 질소(폴리아민)과 같은 헤테로 원자를 함유하는 스페이서, 펩티드, 탄수화물, 가능하게는 이종원자를 함유할 수 있는 환형 또는 비환형 시스템을 포함할 수 있다. 스페이서 기는 또한 금속 이온의 존재가 둘 이상의 리간드를 배위하여 착물을 형성하도록 금속에 결합하는 리간드로 구성될 수도 있다. 특정 스페이서 우레아는 1,4-디아미노 헥산, 자일릴렌디아민, 테레프탈산, 3,6-디옥사옥탄디산, 에틸렌디아민-N,N-디아세트산, 1,1'-에틸렌비스(5-옥소-3-피롤리딘카복실산), 4,4'-에틸렌디피페리딘, 올리고에틸렌글리콜 및 폴리에틸렌글리콜을 포함한다. 잠재적 반응성 작용기는 친핵성 작용기(아민, 알코올, 티올, 하이드라지드), 친전자성 작용기(알데히드, 에스테르, 비닐 케톤, 에폭사이드, 이소시아네이트, 말레이미드), 고리첨가 반응을 할 수 있거나, 이황화 결합을 형성할 수 있거나 또는 금속에 결합할 수 있는 작용기를 포함한다. 구체적인 예는 1차 및 2차 아민, 하이드록삼산, N-하이드록시석신이미딜 에스테르, N-하이드록시석신이미딜 카보네이트, 옥시카보닐이미다졸, 니트로페닐에스테르, 트리플루오로에틸 에스테르, 글리시딜 에테르, 비닐설폰 및 말레이미드를 포함한다. 본 발명의 펩티드 태그/폴리펩티드 결합 파트너 접합체(gentpeptide tag/polypeptide binding partner conjugates)에 사용될 수 있는 특정 링커 기는 이종작용기성 화합물, 예를 들어 아지도벤조일하이드라지드, N-[4-(p-아지도살리실아미노)부틸]-3'-[2'-피리딜디티오]프로피온아미드, 비스-설포석신이미딜수버레이트, 디메틸아디피미데이트, 디석신이미딜타르트레이트, N-말레이미도부티릴옥시석신이미드 에스테르, N-하이드록시 설포석신이미딜-4-아지도벤조에이트, N-석신이미딜[4-아지도페닐]-1,3'-디티오프로피오네이트, N-석신이미딜[4-요오도아세틸]아미노벤조에이트, 글루타르알데히드 및 석신이미딜-4-[N-말레이미도메틸]사이클로헥산-1-카복실레이트, 3-(2-피리딜디티오)프로피온산 N-하이드록시석신이미드 에스테르(SPDP), 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실산 N-하이드록시석신이미드 에스테르(SMCC) 등을 포함한다. 예를 들어 스페이서는 알킨과 반응하는 아지드로 형성되거나 트랜스-사이클로옥텐 또는 노르보르넨과 반응하는 테트라진으로 형성될 수 있다.
일부 구현예에서, 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드는 그 중의 하나 이상의 잔기를 변형시켜 이 분자들의 접합을 용이하게 하고(하거나) 펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드의 안정성을 향상시키는 것이 유용할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 개시된 펩티드 태그 또는 본 발명의, 또는 본 발명에 사용하기 위한 폴리펩티드는 비천연 또는 비-표준 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 펩티드 태그 또는 본 발명의, 또는 본 발명에 사용하기 위한 폴리펩티드는 하나 이상, 예를 들어 적어도 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 비-통상적 아미노산, 즉 본원에서 "비-암호화된 아미노산"이라 지칭되는, 표준 유전자 코드에 의해 암호화되지 않는 측쇄를 갖는 아미노산을 포함할 수 있다. 이러한 아미노산은 당해 분야에서 익히 알려져 있으며 오르니틴 또는 타우린과 같은 대사 과정을 통해 형성되는 아미노산 및/또는 9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐(Fmoc), (tert)-부틸옥시카보닐(Boc), 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐(Pmc) 보호된 아미노산, 또는 벤질옥시-카보닐(Z) 기를 가진 아미노산과 같은 인공적으로 변형된 아미노산으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 및 본 발명에 사용하기 위한 펩티드 태그 또는 폴리펩티드에 사용될 수 있는 비표준 또는 구조 유사체 아미노산의 예는 D 아미노산, 아미드 이소스테레(예를 들어 N-메틸 아미드, 레트로-인버스 아미드, 티오아미드, 티오에스테르, 포스포네이트, 케토메틸렌, 하이드록시메틸렌, 플루오로비닐, (E)-비닐, 메틸렌아미노, 메틸렌티오 또는 알칸), L-N 메틸아미노산, D-α메틸아미노산, D-N-메틸 아미노산이다. 본 발명의 및 본 발명에 사용하기 위한 펩티드 태그 또는 폴리펩티드에 사용될 수 있는 추가의 비-표준 아미노산 및 이의 사용은 모두 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Willis and Chin, Nat Chem. 2018; 10(8):831-837], WO2018/189517 및 WO2018/197854의 표 1에 개시되어 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 펩티드 태그 또는 폴리펩티드에는 지지체 상에 제공된 고정화 수단(예를 들어 결합 파트너, 즉 동족 결합 파트너, 예를 들어 스트렙타비딘 또는 항체에 결합할 수 있는 친화성 결합 파트너, 예를 들어 바이오틴 또는 합텐)이 구비될 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 태그 또는 폴리펩티드와 고체 지지체 사이의 상호작용은 세척 단계를 허용하기에 충분하게 견고해야 하며, 즉 펩티드 태그 또는 폴리펩티드와 고체 지지체 사이의 상호작용은 세척 단계에 의해 붕괴(유의적으로 붕괴)되지 않는다. 예를 들어 각각의 세척 단계에서, 펩티드 태그 또는 폴리펩티드의 5% 미만, 바람직하게는 4, 3, 2, 1, 0.5 또는 0.1% 미만이 고체상으로부터 제거되거나 용리되는 것이 바람직하다.
고체 지지체(상 또는 기질)는 고정화, 분리 등을 위해 현재 널리 사용되거나 제안된 잘 알려진 임의의 지지체 또는 매트릭스일 수 있다. 이들은 입자(예를 들어 자성, 상자성, 또는 비자성일 수 있는 비드), 시트, 겔, 필터, 막, 섬유, 모세관, 슬라이드, 어레이 또는 마이크로타이터 스트립, 튜브, 플레이트 또는 웰 등의 형태를 취할 수 있다.
지지체는 유리, 실리카, 라텍스 또는 중합체 물질, 예를 들어 다당류 중합체 물질, 예를 들어 아가로스(예를 들어 세파로스)로 제조될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 결합을 위해 높은 표면적을 나타내는 물질이 적합하다. 이러한 지지체는 불규칙한 표면을 가질 수 있고 예를 들어 다공성 또는 미립자, 예를 들어 입자, 섬유, 웹, 소결물 또는 체(sieve)일 수 있다. 미립자 물질, 예를 들어 비드는 이들의 큰 결합 능력으로 인해 유용하고, 특히 중합체 비드가 유용하다.
편리하게는, 본 발명에 따라 사용되는 미립자 고체 지지체는 구형 비드를 포함할 것이다. 비드의 크기는 중요하지 않지만, 예를 들어 직경이 적어도 약 1 ㎛, 바람직하게는 적어도 약 2 ㎛, 5 ㎛, 10 ㎛ 또는 20 ㎛ 정도일 수 있고, 최대 직경은 바람직하게는 약 500 ㎛ 이하, 예를 들어 약 100 ㎛ 이하인 것이다.
단분산 입자, 즉 크기가 실질적으로 균일한 입자(예를 들어 직경 표준 편차가 5% 미만인 크기)는 반응의 매우 균일한 재현성을 제공한다는 이점을 갖는다. 대표적인 단분산 중합체 입자는 US-A-4336173에 기재된 기술에 의해 제조될 수 있다.
그러나, 조작 및 분리를 돕기 위해, 자성 비드가 유리하다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "자성"은 지지체가 자기장에 배치될 때 지지체에 부여된 자기 모멘트를 가질 수 있고, 따라서 자기장의 작용에 의해 변위될 수 있음을 의미한다. 다시 말해, 자성 입자를 포함하는 지지체는 자성 응집에 의해 쉽게 제거될 수 있으며, 이는 이소펩티드 결합 형성 단계 후에 입자를 빠르고 간단하고 효율적으로 분리하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 고체 지지체는 수지, 예를 들어 아밀로오스 수지이다. 일부 구현예에서, 고체 지지체는 티올-반응성 수지이다. 따라서, 일부 구현예에서, 고체 기질은 요오도아세틸기를 포함할 수 있고, 예를 들어 고체 기질은 요오도아세틸-활성화 기질일 수 있다.
추가 구체예에서, 본 발명은 키트, 특히 본 발명의 방법 및 용도에 사용하기위한, 즉 이소펩티드 결합을 통해 2개의 분자 또는 성분을 접합시키기위한 키트를 제공하며, 여기서 복합체 내의 2개의 분자 또는 성분은 이소펩티드 결합을 통해 접합되고, 상기 키트는:
(a) 단백질과 같은 분자 또는 성분에 선택적으로 접합되거나 융합된, 위에서 정의된 펩티드 태그 결합 파트너 폴리펩티드, 예를 들어 위에서 정의된 펩티드 태그 결합 파트너 폴리펩티드를 포함하는 재조합 또는 합성 폴리펩티드; 및
(b) 단백질과 같은 분자 또는 성분에 선택적으로 접합되거나 융합된, 위에서 정의된 펩티드(펩티드 태그); 및/또는
(c) 상기 (a)에 정의된 펩티드 태그 파트터 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자, 특히 벡터; 및/또는
(d) 상기 (b)에 정의된 펩티드 태그를 암호화하는 핵산 분자, 특히 벡터;
를 포함한다.
본원에 개시된 펩티드 태그(들) 및 본 발명의 펩티드 태그 결합 파트너 폴리펩티드는 광범위한 유용성을 가짐이 명백할 것이다. 대안적으로 보면, 본원에 개시된 펩티드 태그 및 본 발명의 펩티드 태그 결합 파트너 폴리펩티드는 다양한 산업에서 사용될 수 있다.
예를 들어 일부 구현예에서, 본원에 개시된 펩티드 태그 및 본 발명의 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)는 형광 또는 다른 생체물리학적 프로브 또는 표지를 특정 단백질에 대해 표적화하는데 유용성이 있을 수 있다. 이와 관련하여, 당해의 단백질은 상기 논의된 바와 같이 펩티드 태그(예를 들어 서열번호 3-5 중의 하나)를 포함하도록 변형될 수 있고, 형광 또는 다른 생체물리학적 프로브 또는 표지는 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너, 예를 들어 서열번호 1 또는 2)에 융합되거나 접합될 수 있다. 변형된 단백질 및 프로브 또는 표지는 펩티드 태그와 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너) 사이에 이소펩티드 결합의 자발적인 형성을 허용하기에 적합한 조건하에 함께 접촉될 수 있으며, 이에 의해 단백질은 이소펩티드 결합을 통해 표지 또는 프로브로 표지될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 표지된 폴리펩티드는 무항체 웨스턴 블롯(antibody-free Western blot)에서 유용성을 발견할 수 있고, 즉 표지된 폴리펩티드는 별도의 표지된 항체에 대한 필요 없이 DogTag 또는 RrgATag/RrgATag2 펩티드(예를 들어 서열번호 3-5 중의 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 펩티드)를 함유하는 폴리펩티드를 검출하는데 사용된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 펩티드 태그 및 본 발명의 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)는 프로테오믹스(proteomics)에서 단백질 고정화에 유용성이 있을 수 있다. 이와 관련하여, 당해의 단백질은 펩티드 태그(예를 들어 서열번호 3-5 중의 하나)를 포함하도록 변형될 수 있고, 고체 기질은 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너, 예를 들어 서열번호 1 또는 2)에 융합되거나 접합될 수 있다. 변형된 단백질 및 고체 기질은 펩티드 태그와 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너) 사이에 이소펩티드 결합의 자발적인 형성을 허용하기에 적합한 조건하에 함께 접촉될 수 있으며, 이에 의해 이소펩티드 결합을 통해 고체 기질 상에 단백질을 고정화시킬 수 있다. 본원에 개시된 펩티드 태그 및 본 발명의 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)는 다수의 단백질을 고상/기질 상에, 즉 다중 반응으로 동시에 고정시키는데 사용될 수 있음은 명백할 것이다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 펩티드 태그(들) 및 본 발명의 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)는 백신 접종을 위해 바이러스-유사 입자, 바이러스, 바이러스 벡터, 박테리아 또는 다량체화 스캐폴드에 항원을 접합시키는 데 유용성이 있을 수 있다. 예를 들어 표면에 본 발명의 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)(서열번호 1 또는 2)를 표시하는(display) 바이러스-유사 입자, 바이러스, 바이러스 벡터 또는 박테리아의 생성은 이소펩티드 결합을 통해 그 표면에 펩티드 태그(서열번호 3-5)를 포함하는 항원의 접합을 용이하게 할 것이다. 이와 관련하여, 항원 다량체화는 면역 반응을 크게 향상시킨다. 따라서, 일부 구현예에서, 폴리펩티드에 융합된 분자 또는 성분은 바이러스 캡시드 단백질이고/이거나 본 발명의 펩티드 태그에 융합된 분자 또는 성분은 항원, 예를 들어 감염, 자가면역 질환, 알레르기 또는 암과 연관된 항원이다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 펩티드 태그 및 본 발명의 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)는 예를 들어 펩티드 태그 및 결합 파트너를 단백질, 예를 들어 효소의 각 말단에 융합시키고, 이어서 펩티드 태그와 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너) 사이에 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성시킴으로써 단백질, 예를 들어 효소를 고리화하는데 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 효소의 고리화는 효소 유연성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다.
특히, 효소 또는 효소 중합체(융합 단백질)의 고리화는 효소 중합체에서 단백질 또는 단백질 단위의 열안정성을 향상시킬 수 있다. 이와 관련하여, 효소는 많은 공정에서 유용한 도구이지만 불안정하고 회수하기가 어렵다. 효소 중합체는 온도, pH 및 유기 용매에 대해 더 큰 안정성을 지녀, 산업 공정에서 효소 중합체를 사용하려는 요구가 증가하고 있다. 그러나, 효소 중합체 생성은 일반적으로 글루 타르알데히드 비특이적 반응을 사용하며, 이는 잠재적으로 유용한 많은 효소를 손상시키거나 변성(즉, 활성 감소)시킬 것이다. 본원에 개시된 펩티드 태그 및 본 발명의 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)를 이용하여 이소펩티드 결합을 통한 단백질의 사슬(중합체)로의 부위-특이적 결합은 동물 사료에 첨가된 효소 또는 진단학에서와 같이 효소 유연성을 향상시킬 것으로 예상된다. 특히 바람직한 구체예에서, 효소는 상기 논의된 바와 같이 고리화에 의해 안정화될 수 있다.
본원에 개시된 펩티드 태그 및 본 발명의 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)는 WO 2016/193746에 기술된 바와 같이, 대사 효율을 증진시키기 위한 경로에 다수의 효소를 연결하는 데에도 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 효소는 종종 세포 내의 경로에서 함께 기능하고, 전통적으로 다수의 효소를 세포 외부(시험관 내)에서 함께 연결하는 것은 어려웠다. 따라서, 본원에 개시된 펩티드 태그 및 본 발명의 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)는 융합 단백질을 생성하도록 효소를 커플링 또는 접합시켜 다단계 효소 경로의 활성을 향상시키는 데 사용될 수 있으며, 이는 다양한 산업적 변환 및 진단학에 유용할 수 있다.
본원에 개시된 펩티드 태그 및 본 발명의 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)는 또한 항체 중합체의 생산에도 유용성이 있을 것이다. 이와 관련하여, 항체는 가장 중요한 의약품 부류 중의 하나이며 종종 표면에 부착되어 사용된다. 그러나, 샘플에서의 항원 혼합 및 이에 따라 상기 샘플에서 상기 항원의 포획은 표면 부근이어서 비효율적이다. 항체 사슬을 연장시킴으로써 포획 효율이 향상될 것으로 예상된다. 이것은 혈행 종양 세포 분리에 특히 중요할 것이며, 이는 현재 조기 암 진단을 가능하게 하는 가장 유망한 방법 중의 하나이다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 펩티드 태그 및 본 발명의 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)는 세포 신호전달(signalling)을 활성화시키기 위한 약물의 생산에 유용성이 있을 수 있다. 이와 관련하여, 세포 기능을 활성화시키는 가장 효과적인 많은 방법은 단백질 리간드를 통한 것이다. 그러나, 본질적으로 단백질 리간드는 일반적으로 단독으로 작동하지 않고 다른 신호전달 분자의 특정 조합에 의해 작동 할 것이다. 따라서, 본원에 개시된 펩티드 태그 및 본 발명의 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)는 세포 신호전달의 최적 활성화를 제공할 수 있는 맞춤형 융합 단백질(즉, 단백질 팀)의 생성을 가능하게 한다. 이들 융합 단백질(단백질 팀)은 세포 생존, 분열 또는 분화를 제어하는데 적용될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본원에 개시된 펩티드 태그 및 본 발명의 폴리펩티드(펩티드 태그 결합 파트너)는 진핵 세포, 예를 들어 뉴런, 줄기 세포의 성장을 위한 하이드로겔의 생성, 생체재료의 제조, 염료 또는 효소에 의한 항체 작용기화 및 고리화에 의한 효소 안정화에 유용성이 있을 수 있다.
본 발명의 친화성 정제 폴리펩티드의 1차 유용성은 본원에 정의된 펩티드 태그를 포함하는 분자 또는 성분의 단리 및/또는 정제에 있다. 따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 서열번호 3-5 또는 17 중의 하나에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 펩티드(즉, 동족 펩티드 태그)를 포함하는 분자 또는 성분을 정제 또는 단리하는 방법을 제공하며, 상기 아미노산 서열은 위치 17의 아스파라긴 잔기를 포함하고, 선택적으로 위치 5의 트레오닌 잔기, 위치 10의 아스파르트산 잔기 및 위치 11의 글리신 잔기를 포함하고, 상기 방법은:
a) 본 발명의 친화성 정제 폴리펩티드(예를 들어 서열번호 18)가 고정화되는 고체 기질을 제공하는 단계;
b) 상기 분자 또는 성분을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
c) 상기 펩티드가 상기 폴리펩티드에 선택적으로 결합할 수 있게 하는 조건 하에, a)의 고체 기질을 b)의 샘플과 접촉시켜서, 상기 고체 기질 상에 고정화된 상기 폴리펩티드와, 상기 펩티드를 포함하는 분자 또는 성분 사이에 비-공유 복합체를 형성하는 단계;
d) 상기 고체 기질을 완충액으로 세척하는 단계;
e) 상기 고체 기질 상에 고정화된 상기 폴리펩티드로부터 상기 펩티드를 포함하는 분자 또는 성분을 분리하는 단계;
를 포함한다.
본원에 기재된 친화성 정제 시스템의 동족 펩티드 태그는 다른 다운스트림 적용(downstream applications) 전에 그의 정제를 용이하게 하기 위해, 예를 들어 동족 펩티드 태그를 펩티드 태그 결합 파트너 폴리펩티드(예를 들어 DogCatcher, 즉 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드)와 반응시키기 위해 다른 분자 또는 다른 성분 또는 실체(즉, 융합 파트너)에 융합 또는 접합될 수 있다. 이러한 분자 또는 성분(즉, 실체)은 핵산 분자, 단백질(예를 들어 항체), 펩티드, 지질, 소분자 유기 화합물, 형광단, 금속-리간드 복합체, 폴리사카라이드, 나노입자, 나노튜브, 중합체, 세포, 소기관, 소포, 바이러스, 바이러스-유사 입자, 바이러스 벡터 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법 또는 용도는 핵산 분자, 단백질(예를 들어 항체), 펩티드, 지질, 소분자 유기 화합물, 형광단, 금속-리간드 복합체, 폴리사카라이드, 나노입자, 나노튜브, 중합체, 세포, 소기관, 소포, 바이러스, 바이러스-유사 입자, 바이러스 벡터 또는 동족 펩티드 태그가 융합 또는 접합되는 이들의 임의의 조합의 정제 또는 단리에 사용될 수 있다. 펩티드 태그가 융합 또는 접합될 수 있는 분자 또는 성분의 추가의 예는 상기에 제공된다.
본 발명의 방법 또는 용도에서 정제 또는 단리를 위해 동족 펩티드 태그를 분자 또는 성분에 연결하는 것과 관련하여 본 발명의 맥락에서 용어 "접합" 또는 "연결"은 공유 결합, 특히 펩티드 태그와 폴리펩티드 사이의 펩티드 결합을 통해 상기 펩티드 태그를 상기 분자 또는 성분, 예를 들어 단백질에 연결하는 것을 지칭한다. 본 발명의 친화성 정제 폴리펩티드를 고체 기질에 연결하는 것과 관련하여, "접합" 또는 "연결"은 공유 결합, 특히 폴리펩티드(예를 들어 폴리펩티드 내의 시스테인 잔기)와 고체 기질 사이의 티오에테르 결합을 통해 상기 폴리펩티드를 상기 고체 기질, 예를 들어 비드에 연결하는 것을 지칭한다.
본 발명의 방법에서 사용된 샘플(즉, 동족 펩티드 태그를 포함하는 분자 또는 성분, 예를 들어 재조합 단백질을 포함함)은 임의의 생물학적 또는 임상 샘플, 예를 들어 유기체의 임의의 세포 또는 조직 샘플(진핵, 원핵), 또는 그로부터 유래된 임의의 체액 또는 제제, 뿐만 아니라 샘플, 예를 들어 세포 배양물, 세포 제제, 세포 용해물 등으로부터 유래될 수 있다. 샘플은 새로 제조될 수 있거나, 또는 이들은 임의의 편리한 방식으로, 예를 들어 저장을 위해 사전 처리될 수 있다.
일부 구현예에서, 고체 기질 상에 고정화된 폴리펩티드로부터 펩티드를 포함하는 분자 또는 성분을 분리하는 단계는 고체 기질을 (친화성 정제) 폴리펩티드:동족 펩티드 태그 복합체를 파괴하기에, 즉 폴리펩티드와 동족 펩티드 태그 사이의 비-공유 상호작용을 파괴하기에 적합한 조건에 적용하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 조건은 폴리펩티드에 연결 또는 접합된 분자 또는 성분에 의존할 수 있고, 통상적인 실험을 사용하여 결정될 수 있다.
대표적인 구현예에서, 폴리펩티드:동족 펩티드 태그 복합체를 파괴하기에 적합한 조건은 상기 복합체를 이미다졸을 포함하는 용액(예를 들어 적어도 1.0 M, 예를 들어 1.0-4.0 M, 1.0-3.0 M 또는 2.0-3.0 M, 바람직하게는 약 2.5 M 이미다졸)과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 복합체를 파괴하기에 적합할 수 있는 다른 조건은 고체 기질을 낮은 pH 용액 또는 완충액(예를 들어 4℃에서 0.1 M 글리신 pH 2.0)과 접촉시키는 단계, 상기 복합체를 승온, 예를 들어 적어도 30, 35, 40 또는 45℃, 예를 들어 30-65, 35-60, 40-55℃에 적용하는 단계, 및/또는 상기 복합체를 경쟁자(예를 들어 위에서 정의된 동족 펩티드 태그, 예를 들어 서열번호 3)를 포함하는 용액과 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 고체 기질은 정제될 분자 또는 성분의 수율을 최대화하기 위해, 이들 조건을 반복적으로, 예를 들어 2, 3, 4, 5회 이상 적용할 수 있다. 일부 구현예에서, 정제될 분자 또는 성분의 수율을 최대화하기 위한 조건의 조합, 예를 들어 이미다졸을 포함하는 용액을 사용하는 제 1 단계, 및 낮은 pH 용액 또는 완충액을 사용하는 제 2 단계를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 조건의 임의의 적합한 조합이 사용될 수 있고, 이는 당업자의 의도 내에 있다. 경쟁적 펩티드 용리가 사용되는 구현예에서, 즉, 복합체가 경쟁자, 예를 들어 동족 펩티드 태그와 인큐베이션되는 구현예에서, 용리 단계는 다수회, 예를 들어 2, 3, 4, 5회 이상 반복될 수 있다.
"낮은 pH 용액 또는 완충액"은 본 발명의 (친화성 정제) 폴리펩티드와 그의 동족 펩티드 태그 파트너 사이의 비-공유 상호작용을 파괴하기에 적합한 임의의 용액 또는 완충액으로서 간주될 수 있다. 일부 구현예에서, 낮은 pH 용액 또는 완충액은 항체 용리 완충액이다. 이와 관련하여, 본 발명의 (친화성 정제) 폴리펩티드와 그의 동족 펩티드 태그 파트너 사이의 상호작용을 파괴하는데 필요한 용액의 pH는 용액 중의 성분에 의존할 수 있음이 명백하다. 예로서, 항체 용리 완충액은 50 mM 글리신 pH 2.2-2.8 또는 100 mM 시트르산 완충액 pH 3.5-4.0을 포함하거나 그로 구성될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 낮은 pH 용액 또는 완충액은 4.0 이하, 예를 들어 3.9, 3.8, 3.7, 3.6, 3.5, 3.4, 3.3, 3.2, 3.1, 3.0 이하, 예를 들어 약 1.5-3.5, 1.6-3.4, 1.7-3.3, 1.8-3.2, 1.9-3.1 또는 2.0-3.0, 예를 들어 약 2.2-2.8 또는 2.5-2.7의 pH를 갖는다.
바람직하게는, (친화성 정제) 폴리펩티드:동족 펩티드 태그 복합체를 파괴하는데 사용되는 조건은 동족 펩티드 태그가 여전히 하류 적용에 사용될 수 있도록 하는 것으로, 상기 조건은 동족 펩티드 태그의 활성의 비가역적 손실을 초래하지 않는다.
친화성 정제를 위한 본원에 정의된 펩티드 태그의 사용은 하류 관능기(즉, 본 발명의 펩티드 태그 결합 파트너 폴리펩티드를 통해 다른 분자에 접합되는 능력)를 갖는 정제된 분자 또는 성분을 제공하기 때문에 특히 유리하지만, 본 발명의 방법은 표적 분자 또는 성분만의, 즉 펩티드 태그 없이의 정제 또는 단리에서 유용성을 발견할 수 있다. 이는 표적 분자 또는 성분으로부터 펩티드 태그를 절단하는 절단 반응을 통해 고체 기질 상에 고정화된 폴리펩티드로부터 표적 분자 또는 성분을 분리함으로써 달성될 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 고체 기질 상에 고정화된 폴리펩티드로부터 펩티드를 포함하는 분자 또는 성분을 분리하는 단계는 고체 기질을 펩티드 태그를 포함하는 분자 또는 성분으로부터 펩티드 태그를 절단하기에 적합한 조건, 예를 들어 온-수지 태그 절단에 적용하는 것을 포함할 수 있다. 이는 펩티드 태그와 표적 분자 또는 성분 사이의 부위에 특이적인 하나 이상의 프로테아제에 의해 인식될 수 있는 절단 부위를 혼입하는 것(예를 들어 유전적으로 암호화하는 것)에 의해 달성될 수 있다. 특이적 프로테아제(들)에 의한 절단 부위에서의 표적 분자:펩티드 태그 융합의 절단은 폴리펩티드:동족 펩티드 태그 복합체로부터 표적 분자 또는 성분을 방출하여, 펩티드 태그가 여전히 폴리펩티드에 결합되어 있는 상태로 남게 한다. 적합한 프로테아제 및 그들의 각각의 인식 부위는 당업계에 잘 알려져 있으며, 임의의 적절한 설정이 본 방법에 이용될 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 펩티드 태그를 포함하는 분자 또는 성분은 펩티드 태그와 분자 또는 성분 사이의 절단 부위, 예를 들어 펩티드 태그와 분자 또는 성분을 연결하는 절단 부위를 함유한다. 대안적으로 보면, 펩티드 태그는 절단가능한 링커를 통해 간접적으로 분자 또는 성분에 융합되거나 접합된다. 일부 구현예에서, 절단 부위 또는 절단가능한 링커는 프로테아제 절단 부위, 예를 들어 TEV 인식 부위이다. 따라서, 일부 구현예에서, 고체 기질 상에 고정화된 폴리펩티드로부터 펩티드를 포함하는 분자 또는 성분을 분리하는 단계는 고체 기질을 절단 부위 또는 절단가능한 링커를 절단하기에 적합한 조건 하에 실체(예를 들어 프로테아제, 예를 들어 SuperTEV)와 접촉시켜 펩티드 태그 및 고체 기질 상에 고정화된 폴리펩티드로부터 분자 또는 성분을 방출하는 것을 포함할 수 있다.
고체 기질을 상기 복합체를 고체 기질로부터 분리하기 전에 완충액으로 세척하는 단계는 임의의 적합한 완충액, 예를 들어 TBS를 이용할 수 있다. 완충액은 펩티드 태그에 접합되거나 연결된 분자 또는 성분을 기반으로 선택될 수 있다. 또한, 고체 기질을 세척하는 단계는 여러 번, 예를 들어 2, 3, 4, 5회 이상 반복될 수 있다. 대안적으로 보면, 일부 구현예에서, 방법은 다수의 세척 단계를 포함하며, 여기서 동일한 또는 상이한 세척 조건이 각각의 단계에서 사용될 수 있다.
고체 기질이 비드(예를 들어 아가로스-기반 비드)를 포함하는 경우, 세척 단계에서 사용되는 완충액의 부피는 비드의 부피의 적어도 약 2배, 예를 들어 비드의 부피의 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10배일 수 있다.
일부 구현예에서, 고체 기질은 엄격한 세척 조건에 적용된다. 엄격한 세척 조건의 성질은 펩티드 태그 및/또는 고체 기질의 조성물에 접합되거나 연결된 분자 또는 성분에 의존할 것이다. 당업자는 일상적인 문제로서 이러한 조건을 선택할 수 있다.
세척 및 분리(용리) 단계의 온도는 일상적인 실험을 기반으로 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 단리되거나 정제되는 분자 또는 성분의 성질에 의존할 수 있다. 일부 구현예에서, 세척 및/또는 분리 단계는 10℃ 이하, 예를 들어 9, 8, 7, 6, 5 또는 4℃ 이하에서 수행된다.
동족 펩티드 태그를 포함하는 분자 또는 성분을 포함하는 샘플과 접촉하기 전에 고체 지지체 상에 본 발명의 친화성 정제 폴리펩티드를 고정화하는 것이 유용할 수 있지만, 이것이 필수적이지 않다는 것이 명백할 것이다. 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드 및 동족 펩티드 태그를 포함하는 성분의 결합은 용액에서 일어날 수 있고, 이는 후속 세척 및 분리(예를 들어 용리) 단계를 위해 고체 지지체 또는 고체 상, 예를 들어 칼럼에 후속 적용된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드:동족 펩티드 태그 복합체는 폴리펩티드(예를 들어 폴리펩티드 상의 고정화 도메인)를 통해 고체 상 상에 복합체를 고정화하고, 적합한 조건 하에 세척하고, 후속적으로 상기 언급된 조건 중의 하나 이상에 적용하고, 예를 들어 이미다졸을 포함하는 용액과 접촉시켜 복합체를 파괴함으로써 폴리펩티드 및 동족 펩티드 태그를 포함하는 성분을 분리하기에 적합한 조건 하에 고체 상에 적용될 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 본 발명의 (친화성 정제) 폴리펩티드가 고정화되는 고체 기질을 포함하는 상기 정의된 방법 또는 용도에서 사용하기 위한 장치를 제공한다.
일부 구현예에서, 장치는 본 발명의 (친화성 정제) 폴리펩티드가 고정화되는 고체 기질을 포함하는 크로마토그래피 칼럼을 포함할 수 있다. 상기 장치는 고체 기질을 샘플, 세척 및 용리 완충액과 접촉시키기 위한 수단 및/또는 고체 기질로부터 액체(예를 들어 세척-통과, 용리된 분획)를 제거(예를 들어 흡입) 또는 수집하기 위한 수단을 더 포함할 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은, 키트, 특히 본 발명의 (친화성 정제) 폴리펩티드가 고정화되는 고체 기질을 제조하는데 사용하기 위한 키트를 제공하는 것으로, 상기 키트는,
a) 본 발명의 (친화성 정제) 폴리펩티드; 및
b) 상기 폴리펩티드를 고체 기질 상에 고정화하기 위한 수단;
을 포함한다.
추가 구현예에서, 상기 키트는 위에서 정의된 고체 기질을 더 포함한다.
고체 기질 상에 본 발명의 폴리펩티드를 고정화하기 위한 수단은 고체 기질(예를 들어 수지) 및/또는 폴리펩티드(예를 들어 트리스(2-카복시에틸)포스핀)를 활성화시키기 위한 시약, 폴리펩티드를 고체 기질에 커플링시키기 위한 시약(예를 들어 커플링 완충액, 예를 들어 50 mM 트리스-HCl, 5 mM EDTA, pH 8.5) 및/또는 고체 기질을 차단하기 위한 시약(예를 들어 커플링 완충액 중 L-시스테인-HCl)을 포함할 수 있다.
본 발명은 이제 하기 도면을 참조하여 하기 비제한적 실시예에서 보다 상세하게 기재될 것이다:
도 1은 DogTag(DogTag/R2Catcher 곡선)의 사용 시 및 DogCatcher(DogTag/DogCatcher 곡선)의 사용 시 증가와 함께, R2Tag/R2Catcher에 대한 아미드 결합 형성 속도를 25℃에서 pH 7.5 PBS 중에서 각각의 단백질 5 μM로 측정하였다. 평균 ± 1 s.d., SDS-PAGE 밀도측정법(densitometry)을 기준으로 하여 n=3. 일부 오차 막대(error bars)는 너무 작아서 가시적이지 못하다.
도 2는 DogTag/DogCatcher 및 R2Tag/R2Catcher에 대한 2차 속도 상수 결정을 도시한다. (A) DogTag/DogCatcher 또는 R2Tag/R2Catcher에 대한 반응 시간 경과. 5 μM AviTag-DogTag-MBP 및 5 μM DogCatcher 또는 5 μM AviTag-R2Tag-MBP 및 5 μM R2Catcher를 25℃에서 pH 7.5 PBS에서 인큐베이션하고, SDS-PAGE/쿠마시 및 밀도측정법에 의해 정량화하였다(평균 ± 1 s.d, n=3). 일부 오차 막대는 너무 작아서 가시적이지 못하다. 생성된 2차 속도 상수는 표시된다(평균 ± 1 s.d, n=3). (B) R2Tag/R2Catcher에 대한 데이터를 더욱 명확하게 하기 위해 (A)로부터의 y-축의 줌.
도 3은 R2Catcher(서열번호 6)와 DogCatcher(서열번호 1)의 서열 정렬을 나타낸다. DogCatcher를 생성하기 위한 돌연변이는 밑줄 및 굵은 글씨로 표시된다.
도 4는 DogTag/DogCatcher 반응성의 조건-의존성이다. (A) pH-의존성. 2 μM AviTag-DogTag-MBP 및 2 μM DogCatcher를 표시된 pH에서 SPG 완충액 중에서 25℃에서 30분 동안 반응시켰다. (B) 온도-의존성. 2 μM AviTag-DogTag-MBP 및 2 μM DogCatcher를 표시된 온도에서 pH 7.0 SPG 중에서 25℃에서 30분 동안 반응시켰다. (C) 완충액-의존성. 5 μM AviTag-DogTag-MBP 및 5 μM DogCatcher를 표시된 완충액(HBS는 HEPES-완충 염수이고; TBS는 트리스-완충 염수임) 중에서 25℃에서 5분 동안 반응시켰다. 데이터는 평균 ± 1 s.d, n=3을 나타내고; 일부 오차 막대는 너무 작아서 가시적이지 못하다.
도 5는 DogTag가 내부였을 때 DogTag/DogCatcher 반응이 완료되었음을 나타낸다. (A) HaloTag7SS 중 내부 DogTag를 사용한 DogCatcher 반응 속도는 AviTag-DogTag-MBP 중 비구속 DogTag에 대한 것과 유사하였다. 데이터는 평균 ± 1 s.d, n=3을 나타내고; 일부 오차 막대는 너무 작아서 가시적이지 못하다. (B) DogTag/DogCatcher 반응이 완료되었음을 시험하였다. DogCatcher를 쿠마시 염색을 사용한 SDS-PAGE 전에 pH 7.5 PBS 중 HaloTag7SS-DogTag와 함께 200분 동안 인큐베이션하였다. [M+1] = 10 μM, [M+1]+ = 20 μM. M = 분자량 마커. 밀도측정법에 기초하여 과량의 DogCatcher의 존재 하에 HaloTag7SS-DogTag에 대해 98% 손실이 나타났다. 과량의 HaloTag7SS-DogTag의 존재 하에 DogCatcher에 대해 98% 손실이 나타났다.
도 6은 DogTag가 sfGFP의 β-배럴 도메인 내에서 잘 기능하였고 SpyTag003보다 더 빠르게 반응하였음을 나타낸다. 2차 반응 플롯은 SpyTag003과 SpyCatcher003 반응에 비해 sfGFP 루프 A에서 DogTag와 DogCatcher의 반응 속도를 비교한다. 평균 ± 1 s.d, n=3. 일부 오차 막대는 너무 작아서 가시적이지 못하다.
도 7 이소발러알데히드 리덕타제의 루프에서 태그 삽입 후 태그 반응성 및 효소 활성. 2차 반응 플롯. DogTag/DogCatcher는 Gre2p의 루프 B에서 SpyTag003/SpyCatcher003보다 더 빠르게 반응하였다.
도 8은 DogTag/DogCatcher 직교성(orthogonality). (A) DogTag는 DogCatcher와 반응하였지만 SnoopCatcher 또는 SpyCatcher003은 그렇지 않다. 15 μM DogCatcher, Affi-SnoopCatcher 또는 SpyCatcher003을 25℃에서 pH 7.5 PBS 중 10 μM HaloTag7SS-DogTag와 24시간 동안 인큐베이션한 후, 쿠마시 염색을 이용한 SDS-PAGE를 수행하였다. (B) DogCatcher를 DogTag 및 SnoopCatcher와 반응시켰다. 15 μM DogCatcher를 25℃에서 pH 7.5 PBS 중 10 μM HaloTag7SS-DogTag, SpyTag003-MBP, SnoopTagJr-Affi, Affi-SnoopCatcher 또는 SpyCatcher003과 24시간 동안 인큐베이션한 후, 쿠마시 염색을 이용한 SDS-PAGE를 수행하였다. M = 분자량 마커.
도 9 막대 차트는 이.콜라이(E. coli) Ni-NTA 정제 후 이. 콜라이의 1 L 배양액으로부터의 가용성 단백질의 수율을 기준으로 한, R2Catcher에 대한 다양한 변형이 그의 용해도에 미치는 영향을 보여준다.
도 10은 DogTag/DogCatcher를 사용한 포유동물 세포-표면에서의 이온 채널의 특이적 표적화의 결과를 보여준다. (A) DogTag 삽입은 이온 채널 개방에 최소한의 영향을 미쳤다. 하나의 96-웰 플레이트(평균 ± 1 SE, n = 4)로부터의 대표적인 세포내 칼슘 측정(Ca2 +i)은 30 nM (-)-엔글레린(englerin) A(수평선으로 표시된 기간 동안 존재함)에 의한 HEK 293 세포에서 TRPC5-SYFP2(회색 흔적(grey trace)) 또는 TRPC5-DogTag-SYFP2(중간 흔적(middle trace))의 활성화를 보여준다. 칼슘 반응은 빈 벡터-형질감염된 세포에서 (-)-엔글레린 A에 의해 유도되지 않았다(하부 흔적(lower trace)). (B) 세포 표면에서 DogCatcher에 의한 신속한 표지화. TRPC5-DogTag-SYFP2 또는 TRPC5-SYFP2 대조군을 발현하는 COS-7 세포를 25℃에서 표시된 시간 동안 5 μM 비오틴-DogCatcher-MBP와 인큐베이션하였다. 세포 용해물을 GFP-Trap로 면역침전시킨 후, 비오틴(상부 패널) 또는 형광 단백질(하부 패널)에 대해 블롯팅하였다. (C) DogCatcher 반응은 이온 채널 개방에 최소한의 영향을 미쳤다. 하나의 96-웰 플레이트(평균 ± 1 SE, n = 6)로부터의 대표적인 세포내 칼슘 측정(Ca2+i)은 5 μM 비오틴-DogCatcher-MBP로의 30분 전처리(회색 흔적) 또는 무처리(흑색 흔적)에 의한 HEK293 세포에서 10 nM (-)-엔글레린 A(수평선으로 표시된 기간 동안 존재함)에 의한 TRPC5-DogTag-SYFP2의 활성화를 보여준다.
도 1은 DogTag(DogTag/R2Catcher 곡선)의 사용 시 및 DogCatcher(DogTag/DogCatcher 곡선)의 사용 시 증가와 함께, R2Tag/R2Catcher에 대한 아미드 결합 형성 속도를 25℃에서 pH 7.5 PBS 중에서 각각의 단백질 5 μM로 측정하였다. 평균 ± 1 s.d., SDS-PAGE 밀도측정법(densitometry)을 기준으로 하여 n=3. 일부 오차 막대(error bars)는 너무 작아서 가시적이지 못하다.
도 2는 DogTag/DogCatcher 및 R2Tag/R2Catcher에 대한 2차 속도 상수 결정을 도시한다. (A) DogTag/DogCatcher 또는 R2Tag/R2Catcher에 대한 반응 시간 경과. 5 μM AviTag-DogTag-MBP 및 5 μM DogCatcher 또는 5 μM AviTag-R2Tag-MBP 및 5 μM R2Catcher를 25℃에서 pH 7.5 PBS에서 인큐베이션하고, SDS-PAGE/쿠마시 및 밀도측정법에 의해 정량화하였다(평균 ± 1 s.d, n=3). 일부 오차 막대는 너무 작아서 가시적이지 못하다. 생성된 2차 속도 상수는 표시된다(평균 ± 1 s.d, n=3). (B) R2Tag/R2Catcher에 대한 데이터를 더욱 명확하게 하기 위해 (A)로부터의 y-축의 줌.
도 3은 R2Catcher(서열번호 6)와 DogCatcher(서열번호 1)의 서열 정렬을 나타낸다. DogCatcher를 생성하기 위한 돌연변이는 밑줄 및 굵은 글씨로 표시된다.
도 4는 DogTag/DogCatcher 반응성의 조건-의존성이다. (A) pH-의존성. 2 μM AviTag-DogTag-MBP 및 2 μM DogCatcher를 표시된 pH에서 SPG 완충액 중에서 25℃에서 30분 동안 반응시켰다. (B) 온도-의존성. 2 μM AviTag-DogTag-MBP 및 2 μM DogCatcher를 표시된 온도에서 pH 7.0 SPG 중에서 25℃에서 30분 동안 반응시켰다. (C) 완충액-의존성. 5 μM AviTag-DogTag-MBP 및 5 μM DogCatcher를 표시된 완충액(HBS는 HEPES-완충 염수이고; TBS는 트리스-완충 염수임) 중에서 25℃에서 5분 동안 반응시켰다. 데이터는 평균 ± 1 s.d, n=3을 나타내고; 일부 오차 막대는 너무 작아서 가시적이지 못하다.
도 5는 DogTag가 내부였을 때 DogTag/DogCatcher 반응이 완료되었음을 나타낸다. (A) HaloTag7SS 중 내부 DogTag를 사용한 DogCatcher 반응 속도는 AviTag-DogTag-MBP 중 비구속 DogTag에 대한 것과 유사하였다. 데이터는 평균 ± 1 s.d, n=3을 나타내고; 일부 오차 막대는 너무 작아서 가시적이지 못하다. (B) DogTag/DogCatcher 반응이 완료되었음을 시험하였다. DogCatcher를 쿠마시 염색을 사용한 SDS-PAGE 전에 pH 7.5 PBS 중 HaloTag7SS-DogTag와 함께 200분 동안 인큐베이션하였다. [M+1] = 10 μM, [M+1]+ = 20 μM. M = 분자량 마커. 밀도측정법에 기초하여 과량의 DogCatcher의 존재 하에 HaloTag7SS-DogTag에 대해 98% 손실이 나타났다. 과량의 HaloTag7SS-DogTag의 존재 하에 DogCatcher에 대해 98% 손실이 나타났다.
도 6은 DogTag가 sfGFP의 β-배럴 도메인 내에서 잘 기능하였고 SpyTag003보다 더 빠르게 반응하였음을 나타낸다. 2차 반응 플롯은 SpyTag003과 SpyCatcher003 반응에 비해 sfGFP 루프 A에서 DogTag와 DogCatcher의 반응 속도를 비교한다. 평균 ± 1 s.d, n=3. 일부 오차 막대는 너무 작아서 가시적이지 못하다.
도 7 이소발러알데히드 리덕타제의 루프에서 태그 삽입 후 태그 반응성 및 효소 활성. 2차 반응 플롯. DogTag/DogCatcher는 Gre2p의 루프 B에서 SpyTag003/SpyCatcher003보다 더 빠르게 반응하였다.
도 8은 DogTag/DogCatcher 직교성(orthogonality). (A) DogTag는 DogCatcher와 반응하였지만 SnoopCatcher 또는 SpyCatcher003은 그렇지 않다. 15 μM DogCatcher, Affi-SnoopCatcher 또는 SpyCatcher003을 25℃에서 pH 7.5 PBS 중 10 μM HaloTag7SS-DogTag와 24시간 동안 인큐베이션한 후, 쿠마시 염색을 이용한 SDS-PAGE를 수행하였다. (B) DogCatcher를 DogTag 및 SnoopCatcher와 반응시켰다. 15 μM DogCatcher를 25℃에서 pH 7.5 PBS 중 10 μM HaloTag7SS-DogTag, SpyTag003-MBP, SnoopTagJr-Affi, Affi-SnoopCatcher 또는 SpyCatcher003과 24시간 동안 인큐베이션한 후, 쿠마시 염색을 이용한 SDS-PAGE를 수행하였다. M = 분자량 마커.
도 9 막대 차트는 이.콜라이(E. coli) Ni-NTA 정제 후 이. 콜라이의 1 L 배양액으로부터의 가용성 단백질의 수율을 기준으로 한, R2Catcher에 대한 다양한 변형이 그의 용해도에 미치는 영향을 보여준다.
도 10은 DogTag/DogCatcher를 사용한 포유동물 세포-표면에서의 이온 채널의 특이적 표적화의 결과를 보여준다. (A) DogTag 삽입은 이온 채널 개방에 최소한의 영향을 미쳤다. 하나의 96-웰 플레이트(평균 ± 1 SE, n = 4)로부터의 대표적인 세포내 칼슘 측정(Ca2 +i)은 30 nM (-)-엔글레린(englerin) A(수평선으로 표시된 기간 동안 존재함)에 의한 HEK 293 세포에서 TRPC5-SYFP2(회색 흔적(grey trace)) 또는 TRPC5-DogTag-SYFP2(중간 흔적(middle trace))의 활성화를 보여준다. 칼슘 반응은 빈 벡터-형질감염된 세포에서 (-)-엔글레린 A에 의해 유도되지 않았다(하부 흔적(lower trace)). (B) 세포 표면에서 DogCatcher에 의한 신속한 표지화. TRPC5-DogTag-SYFP2 또는 TRPC5-SYFP2 대조군을 발현하는 COS-7 세포를 25℃에서 표시된 시간 동안 5 μM 비오틴-DogCatcher-MBP와 인큐베이션하였다. 세포 용해물을 GFP-Trap로 면역침전시킨 후, 비오틴(상부 패널) 또는 형광 단백질(하부 패널)에 대해 블롯팅하였다. (C) DogCatcher 반응은 이온 채널 개방에 최소한의 영향을 미쳤다. 하나의 96-웰 플레이트(평균 ± 1 SE, n = 6)로부터의 대표적인 세포내 칼슘 측정(Ca2+i)은 5 μM 비오틴-DogCatcher-MBP로의 30분 전처리(회색 흔적) 또는 무처리(흑색 흔적)에 의한 HEK293 세포에서 10 nM (-)-엔글레린 A(수평선으로 표시된 기간 동안 존재함)에 의한 TRPC5-DogTag-SYFP2의 활성화를 보여준다.
실시예
실시예
1:
RrgA
도메인 4로부터
유래된
태그-캐처 쌍의 개선
RrgA는 4개의 도메인으로 구성된 에스 . 뉴모니애(S. pneumoniae)로부터의 어드헤신(adhesin)이다. 도메인 4(잔기 734-861)는 Glu803에 의해 지시된, Lys742와 Asn854 사이의 트랜스아미데이션 반응에 의해 자발적인 분자내 이소펩티드 결합을 형성한다. 이 도메인을 미리 분할하고, 조작하여 RrgA의 잔기 734-838에 대응하고 반응성 Lys 및 촉매적 Glu를 함유하는 단백질 커플링 시약 R2Catcher(RrgACatcher(서열번호 6)으로도 공지됨) 및 R2Tag(RrgA의 잔기 838-860에 상응하는 서열번호 17)를 생성하였다.
R2Tag 및 R2Catcher가 혼합 시 성공적으로 재구성되고 반응하였지만, 속도는 느렸다는 것이 밝혀졌다(도 1). 2차 속도 상수를 25℃에서 pH 7.4 PBS 중에서 3 ± 0.1 M-1s-1(평균 ± 1s, n=3)로 결정하였다(도 2). R2Tag를 보다 빠른 재구성을 위해 조작하였다. β-가닥 내의 842에서 가요성 Gly를 Thr로 치환하여, 친수성을 유지하고 β-시트 내에서 선호하였다. Asp848을 Gly로 치환하여 타이트한 회전 형성을 선호하였다. Asn847을 Asp로 치환하여 Lys 849와의 정전기적 상호작용을 개선하였다. 돌연변이 G842T, N847D, 및 D848G(DogTag, 서열번호 3으로 명명됨)를 갖는 R2Tag는 R2Catcher와의 반응을 10배 개선하였다. R2Catcher를 갖는 DogTag에 대한 2차 속도 상수는 30 ± 2 M-1s-1(평균 ± 1s.d., n=3)이었다.
R2Catcher에 대한 주요 문제는 PBS pH 7.4(~140 μM)에서의 제한된 용해도였으며, 이는 SpyCatcher(1 mM)와 비교할 때 낮다. RrgA의 D4 도메인으로부터 유래된 폴리펩티드인 SnoopLigase는 이전에 PROSS 및 Rosetta를 통해 계산적으로 최적화되었으며, 돌연변이 D737S, D838G, 및 I839V를 유도하였다. 그러나, R2Catcher 변이체에서 산성 잔기의 돌연변이는 중성 pH에서 고도로 불용성인 단백질을 유도하였다. 본 발명자들은 R2Catcher의 예측된 pI가 중성에 가까운 것으로 관찰되었고(6.6), R2Catcher의 표면 음성 변화를 증가시키기 위한 돌연변이의 도입이 단백질의 용해도를 개선할 수 있다는 가설을 세웠다. 본 발명자들은 폴리펩티드의 표면 음성 변화를 증가시킬 수 있는 다수의 돌연변이를 확인하였다. 선택된 돌연변이를 Rosetta에 의해 평가하여, 돌연변이가 폴리펩티드의 예측된 안정성을 크게 감소시키지 않았음을 확인하였다(표 1 참조).
표 1: R2Catcher에서의 돌연변이에 대한 예측된 안정성 변화. 단백질 안정성은 R2Catcher에 대한 이소펩티드 결합-형성된 버전에 대한 상대 에너지 단위( DREU )의 차이로서 Rosetta에 의해 계산된다.
R2Catcher에서의 β-회전의 입체형태적 유연성을 감소시키기 위해 도입된 A808P에 더하여, 돌연변이 D737E, N744D, N746T, N780D, K792T, 및 N825D의 조합은 pH 7.4 PBS에서 용해도를 316 μM로 증가시켰다. 생성된 돌연변이체는 R2CatcherB(서열번호 8)로서 명명되었다.
실시예
2:
R2Catcher
반응성의 개선
새로운 단백질 스캐폴드의 파지 디스플레이는 종종 미스폴딩, 주변세포질에서의 분해, 파지 감염성의 손실, 및 프레임-이동된 또는 절단된 변이체의 축적을 포함하는 장애물로 운용된다. 따라서, 지향성 진화를 시도하기 전에 R2Catcher를 합리적으로 최적화하는 것이 필요하였다. 한편, 고도로 가용성인 R2CatcherB를 사용하여, 본 발명자들은 반응 속도를 향상시키기 위해 지향성 진화를 적용하였다. R2CatcherB에서의 돌연변이의 라이브러리를 오류-유발 PCR에 의해 생성하였다. 통상적인 파지 디스플레이 패닝 동안, 비공유적으로 결합된 파지를 글리신 pH 2.5와 같은 조건에 의해 베이트 단백질로부터 용리시킨다. 현재의 접근법에서, 이러한 동일한 세척을 사용하여 임의의 비공유적으로 결합된 파지를 제거하여, 이소펩티드 결합 형성이 일어나게 하는 변이체만을 선택하였다. 이어서, 파지를 TEV 프로테아제를 사용하여 특이적으로 용리시켰다. 여러 라운드의 파지 디스플레이 및 상이한 파지 라이브러리의 평가 후, 가장 잘 수행되는 변이체인 DogCatcher(서열번호 1)를 R2Catcher(760 ± 20 M-1s-1, 평균 ± 1s.d., n=3)보다 25배 더 빠르게 AviTag-DogTag-MBP와 반응시켰다(도 1 및 도 2). DogCatcher는 R2CatcherB(F802I, A820S, 및 Q822R)에 비해 3개의 추가의 돌연변이를 함유하였다(도 3). 도메인 안정성에 대한 이들 돌연변이의 효과를 Rosetta를 사용하여 개별적으로 평가하였고, 단지 약간의 예측된 변화만을 발견하였다(상기 표 1). 전체적으로, DogTag/DogCatcher는 초기 분할 쌍(R2Tag 및 R2Catcher)에 비해 반응 속도의 250배 개선을 나타낸다(도 1 및 도 2).
실시예
3:
DogTag
/
DogCatcher의
특성
DogTag/DogCatcher 쌍은 반응 조건에 대한 이의 의존성을 결정하는 것을 특징으로 하였다(도 4).
DogTag/DogCatcher는 pH 4 및 5에서 불량하게 반응하였고, 이때 반응성이 pH 7로 급격하게 상승하였고, 높은 반응성이 pH 8 및 9에서 유지되었다(도 4의 A). DogTag/DogCatcher는 25℃ 내지 37℃의 높은 반응성과 함께 4℃에서 실질적인 활성을 갖는 것으로 나타났다(도 4의 B). DogTag/DogCatcher는 다양한 완충액(HEPES, PBS, Tris)에서 높은 반응성을 나타내었고, 킬레이터(EDTA) 또는 세제에 대해 내성이 있었다(도 4의 C).
실시예
4: 루프 내에 삽입된
DogTag는
양호한
DogCatcher
반응성을 보유하였다.
Tag/Catcher 접근법은 수백개의 단백질에 대해 사용되었고, 이때 대부분의 태그가 당해의 단백질의 가요성 말단에 삽입되었다. DogTag가 도메인 4 구조를 재구성하기 위해 β-헤어핀을 형성할 것으로 예상되는 것을 고려하여, 본 발명자들은 단백질의 구조화된 내부 부위에서 DogTag를 구속하는 것이 효율적인 이소펩티드 결합 형성을 가능하게 할 것이라고 가정하였다. 따라서, 본 발명자들은 잔기 139와 140 사이에서 42 kDa HaloTag7 단백질(HaloTag7SS로 명명된 버전) 내의 α-헬릭스에 삽입된 DogTag를 검정하였다. 비-구속된 DogTag(MBP 도메인에 N-말단으로 융합됨)의 반응과의 비교는 DogTag가 이들 상이한 환경에서 유사한 반응성을 입증하였음을 밝혀내었다(도 5의 A).
DogTag/DogCatcher 반응이 완료될 수 있는 능력을 또한 시험하였다. 2배 과량의 DogCatcher를 사용하여, 98%의 HaloTag7SS-DogTag가 반응하였다(도 5의 B). 반대로, 2배 과량의 HaloTag7SS-DogTag를 사용하여, 98%의 DogCatcher가 반응하였다(도 5의 B).
실시예
5:
DogTag는
슈퍼폴더
(
superfolder
)
GFP
내 Catcher 반응성에 대해 SpyTag003보다 우수하였다.
SpyTag003 또는 DogTag와 같은 태그의 단백질 내의 루프 내로의 삽입은 이상적으로는 Catcher 단백질과의 높은 반응성 둘 다를 가능하게 할 뿐만 아니라 숙주 단백질의 기능을 보유해야 한다. 첫번째 경우에, G5S 링커에 의해 각각의 측면에 플랭킹된 DogTag 또는 SpyTag003을 루프 삽입을 위해 허용가능한 것으로 이전에 나타낸 β-배럴 단백질인 수퍼폴더 GFP(sfGFP) 내의 루프 내로 클로닝하였다. sfGFP의 모든 변이체를 (DogTag 또는 SpyTag003 및 루프 A, B 또는 C를 사용하여) 성공적으로 발현시켰다.
캐처 사이의 반응성의 주요 차이가 관찰되었다. 루프 A 내의 DogTag와 DogCatcher의 반응에 대해(도 6), 2차 속도 상수는 1.0 ± 0.08 x 103 M-1s-1(평균 ± 1 s.d., n=3)이었고, 이는 말단 DogTag 융합에 대한 속도와 비슷하다(도 2). 대조적으로, sfGFP의 동일한 루프에서 SpyTag003과 SpyCatcher003 반응에 대한 2차 속도 상수는 87 ± 8 M-1s-1(평균 ± 1 s.d., n=3)이었고, 말단 융합으로서 SpyTag003에 대한 것보다 6,000배 더 느렸다 (5.5 ± 0.6 x 105 M-1s-1).
sfGFP의 모든 루프-삽입 변이체는 비융합된 WT sfGFP에 대해 비슷한 흡수 강도 및 스펙트럼을 나타내었다. 유사하게, 임의의 변이체에 대한 형광 방출의 강도 또는 스펙트럼에 대한 최소 변화가 있었다. 따라서, DogTag 또는 SpyTag003의 삽입은 형광 단백질 기능의 보유에 대해 잘 용인되었다.
실시예
6:
DogTag는
촉매 활성을 유지하면서 효소 내의 루프 내로 삽입될 수 있었다.
Tag/Catcher 반응은 다중-효소 복합체의 스캐폴딩 및 촉매 하이드로겔의 생성을 위해 사용되었다.
본원에서는 이소발러알데히드 리덕타제 Gre2p를 SpyTag/SpyCatcher와 함께 사용하였고, 혼합된 β-α-β 로스만(Rossmann) 배수를 가졌다. 이 단백질을 효율적인 기능에 대한 유연성을 유지해야 하는 효소에서 DogTag/DogCatcher가 사용될 수 있는지 여부를 시험하기 위해 선택하였다. 활성 부위로부터 떨어진 Gre2p 내의 3개의 루프를 선택하여 G5S 링커에 의해 플랭킹된 DogTag 또는 SpyTag003을 삽입하였다. SpyTag003 또는 DogTag의 모든 삽입은 가용성 효소 발현을 허용하였다. Gre2p에 의한 이소발러알데히드의 이소아밀 알코올로의 환원은 NADPH-의존성이다. NADPH의 NADP+로의 산화 시의 흡광도 변화를 사용하여 야생형(WT) 및 루프-삽입된 Gre2p 변이체의 반응을 따랐다. 각 루프에서 SpyTag003 또는 DogTag와 함께, 이소발러알데히드 리덕타제 활성은 WT Gre2p의 2배 내에서 성공적으로 유지되었다(표 2).
표 2: Gre2p 변이체에 대한 특이적 효소 활성. 각 Gre2p 변이체를 25℃에서 포스페이트 완충액 중 이소발러알데히드 및 NADPH와 함께 인큐베이션하고 , 반응을 분광광도측정법으로 모니터링하였다 (평균 ± 1 s .d., n=3 생물학적 복제물).
Gre2p 루프 B에 대해, DogTag와 DogCatcher의 반응에 대한 2차 속도 상수는 527 ± 80 M-1s-1이었고, 반면에 SpyTag003과 SpyCatcher003의 반응은 훨씬 더 느렸다(93 ± 13 M-1s-1; 평균 ± 1 s.d., n=3, 도 7).
실시예
7:
DogTag
/
DogCatcher
직교성
시험
SnoopTagJr/SnoopCatcher는 RrgA의 D4 도메인으로부터 유래되고, SpyTag/SpyCatcher 패밀리의 Tag/Catcher에 대해 직교한다. SnoopTagJr/SnoopCatcher 또는 SpyTag003/SpyCatcher003과 DogTag/DogCatcher의 교차-반응성을 시험하였다. DogTag는 높은 단백질 농도에서 24시간 후에도 DogCatcher와만 반응하였다(도 8의 A). DogCatcher는 DogTag-함유 Tag/Catcher 구조체(constructs)와만 반응하였다(도 8의 B). 결과적으로, DogCatcher는 SpyTag003, SpyCatcher003 또는 SnoopTagJr과 반응하지 않았다. 대조적으로, DogCatcher는 HaloTag7SS-DogTag 또는 SnoopCatcher와 반응하여 완료되었다(도 8의 B). SnoopCatcher는 그것의 C-말단에 DogTag와 같은 서열을 함유하기 때문에(DogCatcher는 마찬가지로 그것의 N-말단에 SnoopTag와 같은 서열을 함유함), DogCatcher는 SnoopCatcher와 반응한다.
실시예 8: DogCatcher는 포유동물 세포 표면에서 이온 채널과 특이적으로 반응한다.
다양한 세포-표면 단백질은 원형질막에서 접근가능한 N 또는 C 말단이 결여되어 있다. 따라서, 외인성 프로브와의 공유 표지화는 루프-매개 결찰에 의해 촉진될 수 있다.
일시적 수용체 전위 정규 5(TRPC5)는 Na+ 및 Ca2 +에 투과성이고 불안, 신장 질환, 및 심혈관 및 대사 질환을 포함하는 다양한 병태에 관여하는 이온 채널이다. TRPC5의 양쪽 말단은 막의 세포질 측에 있다.
DogTag는 기공으로부터 먼 부위에서 잔기 460과 461 사이의 TRPC5의 제 2 세포외 루프에 유전적으로 삽입되었다. 밝고 빠르게 성숙한 황색 형광 단백질 SYFP2를 C-말단에 융합시켰으며, 이는 총 TRPC5의 분포의 영상화를 허용하지만 활성 표면 풀을 강조(highlight)하지는 않는다.
일시적으로 형질감염된 HEK293 세포에서 세포내 칼슘 측정을 수행하여 세스퀴테르피노이드 활성제 (-)-엔글레린 A로 TRPC5 개방을 자극함으로써 DogTag 삽입의 기능성을 시험하였다. DogTag 융합은 효율적인 작용제 반응을 갖는 기능적 채널을 형성하였다(도 10의 A).
세포 표면에서 DogCatcher 인식의 효능을 TRPC5-DogTag-SYFP2를 발현하는 COS-7 세포에 비오틴-DogCatcher-MBP를 첨가함으로써 시험하였다. SYFP2 융합의 GFP-Trap 풀-다운 후, 전체-세포 용해물을 스트렙타비딘-HRP로 블롯팅하였다. 단지 1분 인큐베이션 후 검출가능한, DogTag 융합이 결여된 음성 대조군 세포에 대한 최소 신호와 함께, TRPC5-DogTag-SYFP2와 DogCatcher의 신속한 반응이 있었다(도 10의 B).
비오틴-DogCatcher-MBP로 표지한 후 HEK293 세포에서 TRPC5의 기능성을 또한 시험하였다. DogCatcher 표지화는 (-)-엔글레린 A에 의해 자극된 이들 세포로의 TRPC5-매개 칼슘 유입에 대해 효과를 갖지 않았다(도 10의 C).
표면 노출된 TRPC5 풀을 시각화하기 위해, 독특한 시스테인을 DogCatcher의 N-말단에 도입하고 말레이미드-알렉사 플루오르 647에 커플링시켜 DogCatcher-647을 제공하였다. DogCatcher-647은 공초점 형광 현미경에 의한 수용체 시각화를 이용하여, DogTag가 결여된 대조군과 비교하여, COS-7 세포에서 TRPC5-DogTag-SYFP2의 선택적 염색을 허용하였다.
DogCatcher 염색은 첨가 후 1분만큼 일찍 관찰되었고, 10분에서 최적 염색을 이용하였다. 전반적으로, DogTag/DogCatcher는 상이한 포유동물 세포 유형의 표면에서 이온 채널의 신속하고 선택적인 공유 표지화를 허용하였다.
결 론
DogTag/DogCatcher 쌍은 다양한 단백질 루프에서 공유 단백질-단백질 반응에 효율적이다. DogTag/DogCatcher는 시스템이 적용하기 쉽게 만드는 다수의 특징을 나타낸다. 양쪽 파트너는 일정 범위의 조건(4-37℃, pH 6-8, 세제, 및 상이한 완충액)에 대해 반응 내성을 갖는, 정규 20개의 아미노산으로부터 유전적으로 암호화가능하다. 반응은 검출가능한 부산물 없이 ~98% 전환으로 진행될 수 있고, 높은 안정성을 갖는 것으로 예상되는 아미드 결합을 남긴다. DogTag 또는 DogCatcher 중 어느 것도 임의의 시스테인 잔기를 함유하지 않으므로, 환원 또는 산화 조건을 필요로 하는 단백질에 대해 커플링을 수행할 수 있다.
DogTag는 단백질의 말단에서 DogCatcher와 효율적으로 반응하거나, 주로 α-나선, 주로 β-시트, 또는 α+β 폴드인 단백질에 내부적으로 삽입된다. sfGFP의 상이한 루프에 삽입될 때 양호한 형광 특성의 유지, 및 Gre2p의 상이한 루프에서 양호한 촉매 활성이 관찰되었다. 막 단백질의 루프 내의 DogTag의 삽입 (TRCP5) 또한 포유동물 세포의 표지를 가능하게 하였다. HaloTag의 경우에, DogTag는 2차 구조 요소 내에 삽입되었다.
신속하고 높은 수율 반응을 갖는 Tag/Catcher 쌍을 수득하는 것은 상당한 도전이다. 문헌에서의 대부분의 Tag/Catcher 쌍은 실질적인 커플링을 위해 높은 마이크로몰 농도 및 일을 필요로 한다. 일부 경우에, 분할 단백질은 전혀 반응성을 나타내지 않는다. 따라서, 본원에 입증된 효율적인 자발적 분자간 이소펩티드 결합 형성을 달성하기 위해 실질적인 단백질 조작 노력이 요구되었다. DogTag/DogCatcher 반응의 속도는 말단 부위 또는 루프 부위에서 필적하였으며, 따라서 DogTag/DogCatcher 쌍은 다양한 루프와의 반응을 위한 바람직한 쌍형성을 나타낸다.
재료 및 방법
플라스미드 및 구조체의
클로닝
PCR-기반 클로닝 및 부위-지정 돌연변이 유발은 Q5 고충실도 폴리머라제(NEB) 또는 KOD 폴리머라제(EMD 밀리포어) 및 깁슨 어셈블리를 사용하여 표준 방법에 의해 수행하였다. pDEST14-R2Catcher는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 TIGR4로부터의 RrgA 어드헤신의 잔기 734-838을 클로닝함으로써 유도되었고(GenBank AAK74622), PDB ID 2WW8을 기반으로 하는 넘버링은 pDEST14-SpyCatcher로부터의 골격 내로 유래되었다(GenBank JQ478411, Addgene plasmid ID 35044). 돌연변이 D737E, N744D, N746T, N780D, K792T, A808P 및 N825D는 R2Catcher 상에 오버레이하여 깁슨 어셈블리(Gibson assembly)에 의해 pDEST14-R2CatcherB를 형성하였다. 파지미드 벡터 pFab5cHis-R2CatcherB는 pFab5cHis-SpyCatcher-gIII으로부터 유래되었다. pDEST14-DogCatcher(도 3)는 깁슨 어셈블리에 의한 F802I, A820S 및 Q822R 돌연변이의 포함에 의해 pDEST14-R2CatcherB로부터 유래되었다. pDEST14-SpyCatcher003이 기재되었다(GenBank 수탁 번호 MN433887, 애드진 플라스미드 ID 133447). pET28-AviTag-R2Tag-MBP는 pET28a-SpyTag003-MBP로부터 유래되었다(GenBank 수탁 번호 MN433888, 애드진 플라스미드 ID 133450). pET28-AviTag-DogTag-MBP는 pET28a-SpyTag003-MBP로부터 유래되었다(GenBank 수탁 번호 MN433888, 애드진 플라스미드 ID 133450). pET28-AviTag-DogTag NA-MBP는 pET28-AviTag-DogTag-MBP로부터 깁슨 어셈블리에 의해 유래되었다. pET28a-HaloTag7SS - DogTag는 이황화 결합 형성을 차단하기 위해 HaloTag7에서 잔기 D139와 E140 사이에 삽입된 DogTag 및 HaloTag7에서 C61S 및 C261S 돌연변이를 암호화한다. pET28-Gre2p는 깁슨 어셈블리에 의해 sfGFP 대신에 사카로마이세스 세레비지애로부터의 Gre2p 이소발러알데히드 리덕타제(이.콜라이 B 균주에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 갖는 합성 유전자 블록으로서)를 삽입함으로써 pET28-SpyTag003-sfGFP(애드진 플라스미드 ID 133454)로부터 유래되었다. pET28-Gre2p-SpyTag003 루프 삽입은 깁슨 어셈블리에 의해 잔기 Lys140과 Ser141(pET28-Gre2p-SpyTag003 루프 A), Glu229 및 Asp230(pET28-Gre2p-SpyTag003 루프 B), 또는 Ser297 및 Thr303(pET28-Gre2p-SpyTag003 루프 C) 사이에 스페이서-SpyTag003-스페이서(서열 GGGGSRGVPHIVMVDAYKRYKGGGGS, 서열번호 10)를 삽입함으로써 pET28-Gre2p로부터 유래되었다. pET28-Gre2p-DogTag 루프 삽입은 깁슨 어셈블리에 의해 잔기 Lys140과 Ser141(pET28-Gre2p-DogTag 루프 A), Glu229 및 Asp230(pET28-Gre2p-DogTag 루프 B), 또는 Ser297 및 Thr303(pET28-Gre2p-DogTag 루프 C) 사이에 스페이서-DogTag-스페이서(서열 GGGGSDIPATYEFTDGKHYITNEPIPPKGGGGS, 서열번호 11)의 삽입에 의해 pET28-Gre2p로부터 유래되었다. pET28-sfGFP는 깁슨 어셈블리에 의한 N-말단 SpyTag003의 결실에 의해 pET28-SpyTag003-sfGFP(Addgene 플라스미드 ID 133454)로부터 유래되었다. pET28-sfGFP-SpyTag003 루프 삽입은 잔기 Val22와 Asn23(pET28-sfGFP-SpyTag003 루프 A), Asp102와 Asp103(pET28-sfGFP-SpyTag003 루프 B), 또는 Asp173과 Gly174(pET28-sfGFP-SpyTag003 루프 B) 사이에 스페이서-SpyTag003-스페이서(서열번호 10)를 삽입함으로써 pET28-sfGFP로부터 유래되었다. pET28-sfGFP-DogTag 루프 삽입은 깁슨 어셈블리에 의한 루프 C). 깁슨 어셈블리에 의해 잔기 Val22와 Asn23(pET28-sfGFP-DogTag 루프 A), Asp102와 Asp103(pET28-sfGFP-DogTag 루프 B), 또는 Asp173과 Gly174(pET28-sfGFP-DogTag 루프 C) 사이에 스페이서-DogTag-스페이서(서열번호 11)를 삽입함으로써 pET28-sfGFP로부터 유래되었다. pGEX-2T-GST-BirA는 Chris O'Callaghan, University of Oxford로부터 제공받았다. pET28-MBP-sTEV는 도메인 배열 MBP-His6-TEV 프로테아제-Arg6을 갖지만, MBP와 TEV 프로테아제 사이에 내부 TEV 절단 부위를 갖지 않는 변형된 TEV 프로테아제 구조체이다. TEV 프로테아제 도메인은 하기 용해도/안정성 돌연변이를 함유한다(숫자는 표준 TEV 프로테아제 넘버링 체계를 지칭함): C19V L56V C110V C130S S135G 및 S219D. pET28 SnoopCatcher의 N-말단에 항-HER2 애피바디를 클로닝함으로써 pET28 Affi-SnoopCatcher를 생성하였다(GenBank 수탁 번호 KU500646, 애드진 플라스미드 ID 72322). pDEST14-Cys-DogCatcher는 TEV 절단 부위와 DogCatcher 부분 사이에 시스테인의 삽입에 의해 pDEST14-DogCatcher로부터 Gibson 어셈블리에 의해 유래되었다.
단백질 발현 및 정제
R2Catcher, DogCatcher 변이체, AviTag-R2Tag-MBP, DogTag-MBP 융합체, SpyTag003-MBP, SpyCatcher003-sfGFP 및 His6-MBP를 이. 콜라이 BL21 DE3 RIPL(Agilent)에서 발현시켰다. SpyCatcher003은 이. 콜라이 C41 DE3(Anthony Watts, University of Oxford로부터 선물)에서 발현시켰다. 단일 콜로니를 100 μg/mL 암피실린(SpyCatcher003, SpyCatcher003-sfGFP, R2Catcher 또는 DogCatcher 변이체) 또는 50 μg/mL 카나마이신(His6-MBP, SpyTag003-MBP, AviTag-R2Tag-MBP 및 DogTag 융합체)을 함유하는 10 mL LB에 접종하고 200 rpm에서 진탕하면서 37℃에서 16시간 동안 성장시켰다. 2차 배양을 위해, 포화 밤샘 배양물의 1/100 희석액을 적절한 항생제와 함께 1 L 자가-유도 LB 브로쓰 + 0.8% (v/v) 글루코스에 접종하고 200 rpm 초-수율 배플 플라스크(Thomson Instrument Company)에서 진탕하면서 OD600이 0.5가 될 때까지 37℃에서 성장시킨 후, 200 rpm에서 진탕하면서 30℃에서 4시간 동안 0.42 mM IPTG로 과발현을 유도하였다. 세포를 수확하고 300 mM NaCl 및 혼합 프로테아제 억제제를 함유하는 10 mM 이미다졸을 함유하는 50 mM Tris-HCl pH 8.0(콤플릿 미니 EDTA-무함유 프로테아제 억제제 칵테일, Roche) 및 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF) 중의 얼음 상에서 초음파처리에 의해 용해시키고 Ni-NTA(Qiagen)에 의해 정제하였다. 단백질을 3.5 kDa 분자량 컷-오프 투석 튜빙(Spectrum Labs)을 사용하여 PBS(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4) pH 7.5에 투석하였다. MBP-sTEV를 발현시키고 프로테아제 억제제 칵테일 정제가 없는 것을 제외하고는 상기 기재된 바와 같이 정제하였다. 단백질 농도를 ExPASy ProtParam으로부터의 흡광 계수를 사용하여 OD280으로부터 결정하였다.
GST-BirA를 이. 콜라이 BL21 DE3 RIPL(Agilent)에서 발현시켰다. 단일 콜로니를 100 μg/mL 암피실린을 함유하는 10 mL LB에 접종하고 200 rpm에서 진탕하면서 37℃에서 16시간 동안 성장시켰다. 2차 배양을 위해, 포화 밤샘 배양물의 1/100 희석액을 적절한 항생제와 함께 1 L 자가-유도 LB 브로쓰 + 0.8% (v/v) 글루코스에 접종하고 200 rpm 초-수율 배플 플라스크(Thomson Instrument Company)에서 진탕하면서 OD600이 0.5가 될 때까지 37℃에서 성장시켰다. 세포를 0.42 mM IPTG로 30℃에서 진탕하면서 200 rpm에서 4시간 동안 유도하였다. 단백질을 기재된 바와 같이 글루타티온-세파로스 정제를 사용하여 정제하였다(Fairhead and Howarth, 2015).
GST-BirA로의 AviTag 비오티닐화를 수행하고 기재된 바와 같이 SDS-PAGE에서 조사하였다(Fairhead and Howarth, 2015). 간략하게, 952 μL PBS, 5 μL 1M MgCl2, 20 μL 100 mM ATP, 20 μL 50 μM GST-BirA 및 1.5 mM 비오틴 중의 100 μM 베이트 단백질로 마스터 믹스를 제조하였다. 이를 800 rpm에서 진탕하면서 30℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 추가의 20 μL 50 μM GST-BirA를 첨가한 후 추가로 1시간 인큐베이션하였다. 마지막으로, 베이트를 4℃에서 PBS 완충액 pH 7.5에 투석하였다. 단백질 비오티닐화의 정도를 스트렙타비딘 겔-이동 검정에 의해 시험하였다.
슈퍼폴더 GFP(sfGFP) 변이체를 이. 콜라이 BL21 DE3 RIPL에서 발현시켰다. 단일 콜로니를 LB + 50 μg/mL 카나마이신에 접종하고, 200 rpm에서 진탕하면서 37℃에서 16시간 동안 성장시켰다. 2차 배양을 위해, 포화 밤샘 배양물의 1/100 희석물을 LB + 50 μg/mL 카나마이신에 접종하고, OD600이 0.5에 도달할 때까지 200 rpm에서 진탕하면서 37℃에서 성장시키고, 이때 0.42 mM IPTG를 첨가하고, 배양물을 22℃에서 18시간 동안 성장시켰다. 세포를 수거하고, 300 mM NaCl 및 10 mM 이미다졸을 함유하는 50 mM 트리스-HCl pH 8.0 중의 얼음 상에서 초음파처리에 의해 용해시키고, 표준 절차를 사용하여 Ni-NTA(퀴아젠)에 의해 정제하였다. 단백질을 3.5 kDa 분자량 컷-오프 투석 튜빙(스펙트럼 랩스(Spectrum Labs))을 사용하여 PBS pH 7.5에 투석하였다. 단백질을 제조사의 지침에 따라 피어스 bicinchoninic acid(BCA) 단백질 검정 키트(Thermo Fisher)를 사용하여 정량화하고, 단백질을 검정 용액에서 60℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 흡광도를 판독하는 변형을 가하였다.
Gre2p 변이체를 이. 콜라이 BL21 DE3 RIPL에서 발현시켰다. 단일 콜로니를 LB + 50 μg/mL 카나마이신에 접종하고, 200 rpm에서 진탕하면서 37℃에서 16시간 동안 성장시켰다. 2차 배양을 위해, 포화 밤샘 배양물의 1/100 희석물을 LB + 50 μg/mL 카나마이신에 접종하고, OD600이 0.5에 도달할 때까지 200 rpm에서 진탕하면서 37℃에서 성장시키고, 이때 0.42 mM IPTG를 첨가하고, 배양물을 25℃에서 18시간 동안 성장시켰다. 세포를 수거하고, 300 mM NaCl 및 10 mM 이미다졸을 함유하는 50 mM 트리스 pH 8.0 중의 얼음 상에서 초음파처리에 의해 용해시키고, 혼합된 프로테아제 억제제(콤플릿 미니 EDTA-무함유 프로테아제 억제제 칵테일, 로슈) 및 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)를 사용하여 표준 절차를 사용하여 Ni-NTA(퀴아젠)에 의해 정제하였다. 단백질을 3.5 kDa 분자량 컷-오프 투석 튜빙(스펙트럼 랩스)을 사용하여 100 mM 인산칼륨 용액의 일염기성(KH2PO4) 및 이염기성(K2HPO4) 용액을 혼합함으로써 형성된 100 mM 인산칼륨 pH 7.4에 투석하였다. 단백질을 제조사의 지침에 따라 피어스 BCA 단백질 검정 키트(써모 피셔)를 사용하여 정량화하였다.
R2Catcher
돌연변이의
모델링
Rosetta3을 사용하여 R2Catcher에 대한 돌연변이의 효과를 모델링하였다(Lever-Fay et al., 2011). A808P 돌연변이를 갖는 RrgA(PDB 코드 2WW8) 잔기 734 내지 838의 결정 구조를 완화시키고, pmut_scan 프로토콜을 사용하여 각각의 돌연변이체에 대한 Rosetta 에너지 단위(Rosetta Energy Units)를 계산하였다.
R2CatcherB
WT 파지 생성
R2CatcherB가 파지 표면 상에 불량하게 초기에 디스플레이되기 때문에, R2CatcherB 파지 생성에 대한 더 나은 조건을 확인하기 위해 2개의 상이한 세포주를 선택하였다. R2CatcherB 파지미드를 이. 콜라이 XL1-블루(애질런트) 또는 이. 콜라이 K12 ER2738(루시젠)에 형질전환시키고, 파지 생성을 위해 18, 25 또는 30℃에서 16시간 동안 성장시켰다. 형질전환된 세포를 100 μg/mL 암피실린 및 10 μg/mL 테트라사이클린 및 0.2% (v/v) 글리세롤을 함유하는 50 mL 2YT에서 37℃, 200 rpm에서 OD600 = 0.5(~2-3 h)가 될 때까지 성장시켰다. 세포를 1012 R408 헬퍼 파지(Agilent)로 로그 상으로 감염시키고, 80 rpm에서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. R2CatcherB-pIII의 발현을 0.1 mM IPTG로 유도하고, 세포를 18, 25 또는 30℃에서 200 rpm에서 18-20 h 동안 인큐베이션하였다. 4 부피의 상청액 당 1 부피의 침전 완충액 멸균, 20% (w/v) PEG8000, 2.5 M NaCl을 사용하여 파지를 수확하였다(Keeble et al., 2017). 간략하게, 상청액을 침전 완충액과 혼합하고, 4℃에서 3-4 h 동안 인큐베이션하였다. 4℃에서 15,000 g에서 30분 동안 원심분리하여 파지를 펠렛화하고, 상청액을 제거하였다. 파지 펠렛을 PBS(100 mL 배양물 당 2 mL)에 재현탁시키고, 4℃에서 15,000 g에서 10분 동안 원심분리하여 임의의 잔류 세포를 투명하게 한 후, 상청액을 새로운 튜브로 옮겼다. 혼합물을 이전과 같이 다시 침전시켰지만, 이 때 100 mL 배양물 당 0.25 mL PBS에 재현탁시켰다. 샘플을 4℃에서 15,000 g에서 10분 동안 원심분리하고, 파지를 3회 침전시키고, 100 mL 배양물 당 0.25 mL PBS의 최종 부피에 재현탁시켰다. 샘플을 저온보호제로서 20% 글리세롤(v/v)과 함께 4℃에서 단기간(1-2 주) 또는 -80℃에서 장기간 저장하였다. 파지를 재감염 후 연속 희석물을 플레이팅함으로써 정량화하였다.
파지 라이브러리 생성
무작위 돌연변이유발 라이브러리를 생성하기 위해, pFab5cHis R2CatcherB 파지미드 구조체를 PCR 반응에서 주형으로서 사용하였다. 벡터를 올리고뉴클레오티드 프라이머(정방향 프라이머: 5'-GGATCCAGTGGTAGCGAAAACCTCTAC(서열번호 12); 역방향 프라이머: 5'-CATGGCGCCCTGATCTCGAGG(서열번호 13))를 갖는 KOD 폴리머라제(EMD 밀리포어)를 사용하여 증폭시켰다. 삽입물을 정방향 프라이머 5'-GACCTCGAGATCAGGGCGCCATG(서열번호 14) 및 역방향 프라이머 5'-GAAGTAGAGGTTTTCGCTACCACTGGATC로 증폭시켰다. GeneMorph II 랜덤 돌연변이유발 키트(Agilent)를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하였다. 열 사이클링(thermal cycling) 후 DpnI를 첨가하고, 37℃에서 1 h 동안 인큐베이션하고, 80℃에서 20분 동안 열-불활성화시켰다. 증폭된 단편을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리하고, 벡터에 대한 DNA 밴드 및 삽입물을 겔 추출(Thermo Scientific)에 의해 정제하였다. 20 μL의 총 부피 중 ~500 ng의 DNA를 사용하여 최적화된 벡터:삽입물 몰비 1:3에서 라이게이션을 수행하였다. 동일한 부피의 2X 마스터 믹스 깁슨(New England Biotech)을 삽입물-벡터 혼합물에 첨가하고, 50℃에서 16 h 동안 인큐베이션하였다. DNA를 스핀-필터(Wizard PCR 클린업 키트; Promega) 상에서 농축시키고, 2.5 kV 전압 설정을 갖는 GenePulserXcell(Bio-Rad)에서 Bio-Rad 2 mm 전기천공 큐벳에서 전기천공에 의해 3 μL(~700 ng)의 DNA를 50 μL 전기적격 ER2738 앰버 정지 코돈 억제자 세포(루시젠)로 형질전환시켰다. 형질전환체를 37℃에서 1시간 동안 950 μL SOC 배지를 첨가하여 회수한 다음, 100 μg/mL 암피실린 및 10 μg/mL 테트라사이클린을 함유하는 50 mL 2YT 배지에서 37℃에서 16시간 동안 추가로 성장시켰다. 형질전환 효율은 100 μg/mL 암피실린 및 10 μg/mL 테트라사이클린을 갖는 한천 플레이트 상에 1 mL 구제 배양물의 연속 희석물을 플레이팅하여 결정하였다. 분취량을 플래시-동결시키고 -80℃에서 저장하였다. 라이브러리를 수확하기 위해, 1 mL의 밤샘 배양물을 100 μg/mL 암피실린 및 10 μg/mL 테트라사이클린 및 0.2%(v/v) 글리세롤을 갖는 250 mL 2YT 배지에 첨가하고, 37℃에서 200 rpm에서 OD600 0.5(~2-3 h)까지 성장시켰다. 세포를 1012 R408 헬퍼 파지(Agilent)로 감염시키고, 37℃에서 80 rpm에서 30분 동안 인큐베이션하였다. R2CatcherB-pIII 라이브러리의 발현을 0.1 mM IPTG로 유도하고, 18℃에서 200 rpm에서 18-20시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 4℃에서 10분 동안 15,000 g에서 원심분리하여 제거하고, 파지를 상기 기재된 바와 같이 정제하였다.
파지 선택
비오티닐화 AviTag-DogTag-MBP를 베이트로서 사용하여 R2CatcherB 파지 라이브러리와 반응시켰다. 패닝의 효율을 평가하기 위해 비-반응성 베이트 변이체(비오티닐화 AviTag-DogTag NA-MBP)를 병렬 선택에 포함시켰다. 반응을 25℃에서 pH 7.5PBS에서 3%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA; 시그마 A9418)을 사용하여 수행하고, 25 μM His6-MBP(MBP에 결합하는 임의의 DogCatcher 변이체에 대해 역-선택)를 보충하였다. 첫 번째 라운드의 선택에서, 1012 파지를 0.5 μM 베이트와 혼합하고 18시간 동안 반응시켰다. 3회의 후속 선택 라운드를 증가하는 엄격도(stringency)(0.2 μM 베이트 및 라운드 2에서의 60분 반응; 0.1 μM 베이트 및 라운드 3에서의 15분 반응; 0.05 μM 베이트 및 라운드 4에서의 10분 반응)로 수행하였다. 아비태그 없이 100-배 과량의 베이트(DogTag-MBP)를 첨가하여 반응을 중단시켰다.
파지를 PEG-NaCl 침전에 의해 미반응 비오티닐화 베이트로부터 정제하였다. 파지-비오티닐화 베이트 부가물을 함유하는 펠릿을 0.1%(v/v) 트윈-20을 갖는 pH 7.5 PBS에 재현탁시켰다. 200 μL 파지를 PBS pH 7.5 + 0.1%(v/v) 트윈-20 중 3%(w/v) BSA로 25℃에서 2시간 동안 예비 차단된 96-웰 저 결합 눈크 플레이트에서 20 μL 비오틴-바인더 디나비즈(Thermo Fisher Scientific)와 혼합하였다. 비드를 200 μL/웰의 PBS pH 7.5 + 0.1%(v/v) 트윈-20으로 4회 예비 세척하였다. 파지-비오티닐화 베이트 부가물을 마이크로타이터 플레이트에서 비드와 함께 에펜도르프 써모믹서에서 800 rpm으로 진탕하면서 25℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 약하게 결합된 파지를 제거하기 위해, 비드를 25℃에서 150 μL 글리신-HCl pH 2.2로 1회 세척한 다음, 25℃에서 0.5%(v/v) 트윈-20을 갖는 150 μL TBS(50 mM 트리스-HCl + 150 mM NaCl, pH 7.5)로 4회 세척하였다. 파지를 0.5 mM EDTA를 갖는 50 mM 트리스-HCl pH 8.0에서 34℃에서 2시간 동안 TEV 프로테아제 소화에 의해 비드로부터 용리시켰다. 용리된 파지를 ER2738 세포의 10 mL 중간-로그상(OD600 = 0.5) 배양물의 감염에 의해 구제하였다. 세포를 37℃에서 80 rpm으로 30분 동안 성장시킨 다음, 암피실린(100 μg/mL), 테트라시클린(10 μg/mL), 0.2%(v/v) 글리세롤이 보충된 200 mL 2YT로 옮기고, 37℃에서 200 rpm으로 ~2시간 동안(OD600 = 0.5가 될 때까지) 성장시켰다. 배양물을 1012 R408 헬퍼 파지로 감염시키고, 37℃에서 80 rpm으로 30분 동안 인큐베이션하였다. R2CatcherB-pIII의 발현을 0.1 mM IPTG로 유도하고, 세포를 18℃에서 200 rpm으로 18-20시간 동안 인큐베이션하였다. 용리된 파지의 수를 10 mL 구제 배양물로부터의 일련의 희석물을 플레이팅함으로써 정량화하였다.
이소펩티드
결합 형성 검정
반응은 일반적으로 pH 7.5 PBS 중에서 25℃에서 수행하였다. 반응을 XCell SureLock 시스템(Thermo Fisher)을 사용하여 16%(w/v) 폴리아크릴아미드 겔 상에서 180V에서 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 반응을 Bio-Rad C1000 열 사이클러에서 6× SDS-로딩 완충액 0.23 M Tris-HCl, pH 6.8, 24%(v/v) 글리세롤, 120 μM 브로모페놀 블루, 0.23 M SDS의 첨가 후에 95℃에서 5분 동안 켄칭하였다. 단백질을 InstantBlue(Expedeon) 쿠마시를 사용하여 염색하였다. 밴드 강도를 겔 Doc XR 영상화기 및 Image Lab 5.0 소프트웨어 (Bio-Rad)를 사용하여 정량화하였다. 공유 복합체에 대한 밴드의 강도를 레인 내의 모든 밴드의 강도로 나누고, 100을 곱함으로써 퍼센트 이소펩티드 결합 형성을 계산하였다.
5 μM AviTag-DogTag-MBP 및 5 μM Catcher 단백질을 반응시킬 때의 공유 복합체 형성에 대한 2차 속도 상수를 R2Catcher 또는 DogCatcher에 대한 밴드의 상대 강도의 감소를 모니터링함으로써 결정하여, 미반응 Catcher 변이체의 농도의 변화를 제공하였다. 반응 곡선의 선형 부분 동안 시간 지점을 분석하였다. 1/캐처 변이체를 시간에 대해 플롯팅하고, 최선의 적합도에 대한 s.d의 계산을 포함한, Excel(Microsoft) 및 Origin 2015(OriginLab Corporation)를 사용하여 선형 회귀에 의해 분석하였다. 데이터는 3회 측정으로부터의 평균 ± 1s.d를 나타낸다.
DogTag:DogCatcher 이소펩티드 결합 형성의 온도-의존성을 숙시네이트-포스페이트-글리신(SPG) 완충액(12.5 mM 석신산, 43.75 mM NaH2PO4, 43.75 mM 글리신; NaOH를 사용하여 pH 7.0으로 조정됨) 중 2 μM의 AviTag-DogTag-MBP 및 DogCatcher 중에서 수행하였으며, 15분 시점을 4, 25 또는 37℃에서 3회 평가하였다.
DogTag:DogCatcher 이소펩티드 결합 형성의 pH-의존성을 SPG 완충액 중에서 AviTag-DogTag-MBP 및 DogCatcher 각각에 대해 2 μM로 수행하였으며, 30분 시점을 pH 4, 5, 6, 7, 8 또는 9에서 3회 평가하였다.
DogTag:DogCatcher 이소펩티드 결합 형성의 완충액-의존성을 모두 완충액의 범위 중에서 5 μM AviTag-DogTag-MBP 및 5 μM DogCatcher를 사용하여 pH 7.5에서 수행하였으며, 5분 시점을 평가하였다. 사용된 완충액은 PBS, PBS + 1 mM DTT, PBS + 1 mM EDTA, PBS + 1%(v/v) Triton X-100, PBS + 1%(v/v) Tween-20, HBS(50 mM HEPES + 150 mM NaCl), TBS(50 mM Tris-HCl + 150 mM NaCl), 또는 트리스(50 mM Tris-HCl)였다.
SpyTag003/SpyCatcher003의 조건-의존성을 하기와 같이 결정하였다. 온도-의존성 검정을 위해, 100 nM SpyCatcher003-sfGFP 및 SpyTag003-MBP를 0.2%(w/v) BSA로 보충된 PBS pH 7.4 중에서 4, 25, 30 또는 37℃에서 2분 동안 반응시켰다. 완충액-의존성 검정을 위해, 100 nM SpyCatcher003-sfGFP 및 SpyTag003-MBP를 완충액의 범위 내에서 25℃에서 2분 동안 반응시켰다: PBS pH 7.4, PBS pH 7.4 + 1 mM EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산), PBS pH 7.4 + 1%(v/v) 트리톤 X-100, PBS pH 7.4 + 1%(v/v) 트윈-20, HBS (20 mM HEPES pH 7.4 + 150 mM NaCl), 또는 TBS(20 mM 트리스-HCl pH 7.4 + 150 mM NaCl). 각각의 완충액을 0.2%(w/v) BSA로 보충하였다. pH-의존성 검정을 위해, 1 μM SpyCatcher003 및 SpyTag003-MBP를 25℃에서 SPG 완충액 중에서 반응시켰다.
완료하기 위한 DogCatcher 및 DogTag 반응을 pH 7.5 PBS 중에서 200분 동안 10 또는 20 μM HaloTag7SS-DogTag와 반응시킨 10 또는 20 μM DogCatcher로 시험하였다. 5 μM DogCatcher를 PBS pH 7.5 중에서 5 μM HaloTag7SS-DogTag 또는 AviTag-DogTag-MBP와 반응시켜 루프에 구속되거나(HaloTag7SS-DogTag) 또는 이러한 구속이 없는 DogTag의 반응 (AviTag-DogTag-MBP)을 비교하였다.
sfGFP 또는 Gre2p에 대한 루프 변이체의 반응을 25℃에서 PBS pH 7.5 중에서 5 μM DogCatcher 또는 SpyCatcher003과 반응시킨 5 μM 루프 변이체와 함께 수행하였다.
DogCatcher(15 μM) 및 HaloTag7SS-DogTag(10 μM)의 교차-반응성을 25℃에서 24시간 동안 PBS pH 7.5 중에서 Affi-SnoopCatcher, SnoopTagJr-AffiHer2, SpyCatcher003, SpyTag003-MBP(모두 DogCatcher 반응성 시험을 위해 10 μM에서; HaloTag7SS-DogTag와의 반응을 위해 15 μM에서 Affi-SnoopCatcher 및 SpyCatcher003과 함께)로 시험하였다.
분광 측정(Spectroscopic measurements)
0.5 μM sfGFP 변이체의 스펙트럼을 25℃에서 PBS pH 7.5 중에서 488 nm의 여기 파장을 갖는 Horiba-Yvon Fluoromax 4를 사용하여 수집하고, 500 내지 660 nm에서 수집된 형광 방출을 매직각(54.7o)으로 설정된 편광기를 갖는 단색화기를 사용하여 수집하였다. 10 μM sfGFP 변이체의 흡광도 스펙트럼을 25℃에서 PBS pH 7.5 중에서 Jasco V-550 UV/VIS 분광광도계를 사용하여 수집하였다. 데이터를 200 nm/분의 스캐닝 속도, 빠른 반응, 및 2.0 nm의 대역폭으로 250 nm 내지 600 nm의 매 nm마다 수집하였다. 데이터는 생물학적 3중선의 평균을 나타낸다.
Gre2p
활성 검정
50 nM Gre2p 변이체를 25℃에서 pH 7.4 100 mM 인산칼륨[인산칼륨 용액의 일염기성(KH2PO4) 및 이염기성(K2HPO4) 인산칼륨 용액의 100 mM 용액을 혼합함으로써 형성됨] + 0.1%(w/v) BSA + 1 mM 디티오트레이톨(DTT) 중에서 1.5 mM 이소발러알데히드(Merck) 및 0.25 mM 환원된 니코틴아미드 디뉴클레오티드 포스페이트(NADPH)(ChemCruz)와 함께 인큐베이션하였다. 상기 반응 혼합물에 pH 7.4 100 mM 인산칼륨 중의 15 mM 스톡의 100 μL 중에서 피펫팅함으로써 반응을 개시하고, 중간 반응 및 5.0 nm 밴드 폭을 갖는 Jasco V-550 UV/VIS 분광광도계를 사용하여 측정된 A340의 감소에 의해 진행을 측정하였다. 데이터를 200초 동안 매초 수집하였다.
DogCatcher
염료 표지(dye labelling)
광 노출을 최소화하기 위해 호일로 감싸진 튜브로 염료 표지화를 수행하였다. 알렉사 플루오르 647-말레이미드(Thermo Fisher)를 DMSO에 10 mg/mL로 용해시켰다. Cys-DogCatcher를 pH 7.4 TBS로 투석하고, 1 mM TCEP 트리스(2-카복시에틸)포스핀으로 25℃에서 30분 동안 환원시켰다. 100 μM Cys-DogCatcher를 3배 몰 과량의 염료:단백질과 함께 인큐베이션하고, 25℃에서 4시간 동안 종단간 회전(end-over-end rotation) 회전으로 반응시켰다. 미반응 말레이미드를 1 mM DTT로 25℃에서 30분 동안 켄칭한 후, 샘플을 4℃에서 5분 동안 16,000 g에서 원심분리하여 임의의 응집체를 제거하였다. 자유 염료(free dye)를 세파덱스 G-25 수지(Merck)를 사용하여 제거하고, 4℃에서 PBS pH 7.4에서 적어도 3시간 동안 매회 투석하였다.
세포내
칼슘 측정
HEK 293 세포를 형질감염 전에 24시간 동안 0.8 x 106 세포/웰로 6-웰 플레이트 상에 플레이팅하였다. 세포를 제트프라임 형질감염 시약(VWR)을 사용하여 pcDNA4/TO(빈 벡터(empty vector)), TRPC5-SYFP2, 또는 TRPC5-DogTag-SYFP2에 대해 2 μg DNA로 형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후, 세포를 흑색의 투명-바닥 96 웰 플레이트(Greiner)에 웰당 60,000 세포로 플레이팅하고, 16 내지 18시간 동안 부착되도록 방치하였다. 세포내 칼슘 기록을 위해, 배지를 제거하고, 2 μM Fura-2 AM(Thermo Fisher) 및 0.01%(v/v) 플루론산을 함유하는 SBS로 대체하였다. SBS는 NaCl 130, KCl 5, 글루코스 8, HEPES 10, MgCl2 1.2, CaCl2 1.5(mM 단위)를 함유하고, NaOH로 pH 7.4로 적정하였다. 이어서, 세포를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, Fura-2 AM을 제거하고, 신선한 SBS로 대체하였다. 세포를 25℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, SBS를 기록 완충액(recording buffer)[화합물 완충액을 매칭하는 0.01%(v/v) 플루론산 및 0.1%(v/v) DMSO를 갖는 SBS]으로 대체하였다. TRPC5 기능에 대한 DogCatcher 표지화의 효과를 결정하기 위한 실험을 위해, Fura-2 AM 인큐베이션 후 세포를 SBS로 2회 세척하였다. 5 μM 비오틴-DogCatcher-MBP를 갖거나 갖지 않는 SBS를 첨가하고, 세포를 25℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 완충액을 기록 완충액으로 대체하였다. 세포내 칼슘을 340 nm 및 380 nm의 여기(excitation)를 사용하여 510 nm의 방출로 플렉스스테이션3(FlexStation3)(Molecular Devices)을 사용하여 측정하였다. 기록을 5분 간격으로 수행하였다. 60초에, 효능제(agonist) (-)-엔글레린 A(피토랩(PhytoLab))를 0.01%(v/v) 플루론산 및 (-)-엔글레린 A를 함유하는 화합물 완충액 SBS를 함유하는 화합물 플레이트로부터 30 nM(도 10의 A) 또는 10 nM(도 10의 C)의 최종 농도로 첨가하였다.
SEQUENCE LISTING
<110> Oxford University Innovation Limited
<120> Polypeptides that interact with peptide tags at loops or termini
and uses thereof
<130> 20.153906/01
<150> GB2104999.4
<151> 2021-04-08
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 104
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DogCatcher
<400> 1
Lys Leu Gly Glu Ile Glu Phe Ile Lys Val Asp Lys Thr Asp Lys Lys
1 5 10 15
Pro Leu Arg Gly Ala Val Phe Ser Leu Gln Lys Gln His Pro Asp Tyr
20 25 30
Pro Asp Ile Tyr Gly Ala Ile Asp Gln Asn Gly Thr Tyr Gln Asp Val
35 40 45
Arg Thr Gly Glu Asp Gly Lys Leu Thr Phe Thr Asn Leu Ser Asp Gly
50 55 60
Lys Tyr Arg Leu Ile Glu Asn Ser Glu Pro Pro Gly Tyr Lys Pro Val
65 70 75 80
Gln Asn Lys Pro Ile Val Ser Phe Arg Ile Val Asp Gly Glu Val Arg
85 90 95
Asp Val Thr Ser Ile Val Pro Gln
100
<210> 2
<211> 95
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DogCatcher Truncation
<400> 2
Ile Glu Phe Ile Lys Val Asp Lys Thr Asp Lys Lys Pro Leu Arg Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Ser Leu Gln Lys Gln His Pro Asp Tyr Pro Asp Ile Tyr
20 25 30
Gly Ala Ile Asp Gln Asn Gly Thr Tyr Gln Asp Val Arg Thr Gly Glu
35 40 45
Asp Gly Lys Leu Thr Phe Thr Asn Leu Ser Asp Gly Lys Tyr Arg Leu
50 55 60
Ile Glu Asn Ser Glu Pro Pro Gly Tyr Lys Pro Val Gln Asn Lys Pro
65 70 75 80
Ile Val Ser Phe Arg Ile Val Asp Gly Glu Val Arg Asp Val Thr
85 90 95
<210> 3
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DogTag
<400> 3
Asp Ile Pro Ala Thr Tyr Glu Phe Thr Asp Gly Lys His Tyr Ile Thr
1 5 10 15
Asn Glu Pro Ile Pro Pro Lys
20
<210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RrgATag
<400> 4
Asp Ile Pro Ala Thr Tyr Glu Phe Thr Asn Asp Lys His Tyr Ile Thr
1 5 10 15
Asn Glu Pro
<210> 5
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RrgATag2
<400> 5
Asp Ile Pro Ala Thr Tyr Glu Phe Thr Asn Gly Lys His Tyr Ile Thr
1 5 10 15
Asn Glu Pro Ile Pro Pro Lys
20
<210> 6
<211> 104
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RrgACatcher
<400> 6
Lys Leu Gly Asp Ile Glu Phe Ile Lys Val Asn Lys Asn Asp Lys Lys
1 5 10 15
Pro Leu Arg Gly Ala Val Phe Ser Leu Gln Lys Gln His Pro Asp Tyr
20 25 30
Pro Asp Ile Tyr Gly Ala Ile Asp Gln Asn Gly Thr Tyr Gln Asn Val
35 40 45
Arg Thr Gly Glu Asp Gly Lys Leu Thr Phe Lys Asn Leu Ser Asp Gly
50 55 60
Lys Tyr Arg Leu Phe Glu Asn Ser Glu Pro Ala Gly Tyr Lys Pro Val
65 70 75 80
Gln Asn Lys Pro Ile Val Ala Phe Gln Ile Val Asn Gly Glu Val Arg
85 90 95
Asp Val Thr Ser Ile Val Pro Gln
100
<210> 7
<211> 312
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DogCatcher DNA
<400> 7
aaactgggcg agattgaatt tattaaagtg gacaaaaccg ataaaaagcc gctgcgtggt 60
gccgtgttta gcctgcagaa acagcatccc gactatcccg atatctatgg cgcgattgat 120
cagaatggga cctatcaaga tgtgcgtacc ggcgaagatg gtaaactgac ctttacgaat 180
ctgagcgatg gcaaatatcg cctgattgaa aatagcgaac ccccgggcta taaaccggtg 240
cagaataagc cgattgtgag ctttcgtatt gtggatggcg aagtgcgtga tgtgaccagt 300
attgtgccgc ag 312
<210> 8
<211> 104
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RrgACatcherB
<400> 8
Lys Leu Gly Glu Ile Glu Phe Ile Lys Val Asp Lys Thr Asp Lys Lys
1 5 10 15
Pro Leu Arg Gly Ala Val Phe Ser Leu Gln Lys Gln His Pro Asp Tyr
20 25 30
Pro Asp Ile Tyr Gly Ala Ile Asp Gln Asn Gly Thr Tyr Gln Asp Val
35 40 45
Arg Thr Gly Glu Asp Gly Lys Leu Thr Phe Thr Asn Leu Ser Asp Gly
50 55 60
Lys Tyr Arg Leu Phe Glu Asn Ser Glu Pro Pro Gly Tyr Lys Pro Val
65 70 75 80
Gln Asn Lys Pro Ile Val Ala Phe Gln Ile Val Asp Gly Glu Val Arg
85 90 95
Asp Val Thr Ser Ile Val Pro Gln
100
<210> 9
<211> 104
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RrgACatcher with reactivity modifications
<400> 9
Lys Leu Gly Asp Ile Glu Phe Ile Lys Val Asn Lys Asn Asp Lys Lys
1 5 10 15
Pro Leu Arg Gly Ala Val Phe Ser Leu Gln Lys Gln His Pro Asp Tyr
20 25 30
Pro Asp Ile Tyr Gly Ala Ile Asp Gln Asn Gly Thr Tyr Gln Asn Val
35 40 45
Arg Thr Gly Glu Asp Gly Lys Leu Thr Phe Lys Asn Leu Ser Asp Gly
50 55 60
Lys Tyr Arg Leu Ile Glu Asn Ser Glu Pro Ala Gly Tyr Lys Pro Val
65 70 75 80
Gln Asn Lys Pro Ile Val Ser Phe Arg Ile Val Asn Gly Glu Val Arg
85 90 95
Asp Val Thr Ser Ile Val Pro Gln
100
<210> 10
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Spacer-SpyTag003-Spacer
<400> 10
Gly Gly Gly Gly Ser Arg Gly Val Pro His Ile Val Met Val Asp Ala
1 5 10 15
Tyr Lys Arg Tyr Lys Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 11
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Spacer-DogTag-Spacer
<400> 11
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Pro Ala Thr Tyr Glu Phe Thr Asp Gly
1 5 10 15
Lys His Tyr Ile Thr Asn Glu Pro Ile Pro Pro Lys Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 12
ggatccagtg gtagcgaaaa cctctac 27
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 13
catggcgccc tgatctcgag g 21
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 14
gacctcgaga tcagggcgcc atg 23
<210> 15
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 15
gaagtagagg ttttcgctac cactggatc 29
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 16
Gly Thr Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 17
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> R2Tag
<400> 17
Asp Ile Pro Ala Gly Tyr Glu Phe Thr Asn Asp Lys His Tyr Ile Thr
1 5 10 15
Asn Glu Pro Ile Pro Pro Lys
20
<210> 18
<211> 104
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Affinity purification polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (70)..(70)
<223> Xaa is not glutamic acid or aspartic acid
<400> 18
Lys Leu Gly Glu Ile Glu Phe Ile Lys Val Asp Lys Thr Asp Lys Lys
1 5 10 15
Pro Leu Arg Gly Ala Val Phe Ser Leu Gln Lys Gln His Pro Asp Tyr
20 25 30
Pro Asp Ile Tyr Gly Ala Ile Asp Gln Asn Gly Thr Tyr Gln Asp Val
35 40 45
Arg Thr Gly Glu Asp Gly Lys Leu Thr Phe Thr Asn Leu Ser Asp Gly
50 55 60
Lys Tyr Arg Leu Ile Xaa Asn Ser Glu Pro Pro Gly Tyr Lys Pro Val
65 70 75 80
Gln Asn Lys Pro Ile Val Ser Phe Arg Ile Val Asp Gly Glu Val Arg
85 90 95
Asp Val Thr Ser Ile Val Pro Gln
100
<210> 19
<211> 95
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Truncated Affinity purification polypeptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (66)..(66)
<223> Xaa is not glutamic acid or aspartic acid
<400> 19
Ile Glu Phe Ile Lys Val Asp Lys Thr Asp Lys Lys Pro Leu Arg Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Ser Leu Gln Lys Gln His Pro Asp Tyr Pro Asp Ile Tyr
20 25 30
Gly Ala Ile Asp Gln Asn Gly Thr Tyr Gln Asp Val Arg Thr Gly Glu
35 40 45
Asp Gly Lys Leu Thr Phe Thr Asn Leu Ser Asp Gly Lys Tyr Arg Leu
50 55 60
Ile Xaa Asn Ser Glu Pro Pro Gly Tyr Lys Pro Val Gln Asn Lys Pro
65 70 75 80
Ile Val Ser Phe Arg Ile Val Asp Gly Glu Val Arg Asp Val Thr
85 90 95
<210> 20
<211> 131
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Affinity purification polypeptide extension
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (97)..(97)
<223> Xaa is not glutamic acid or aspartic acid
<400> 20
Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr
1 5 10 15
Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Cys Gly Lys Leu Gly Glu Ile
20 25 30
Glu Phe Ile Lys Val Asp Lys Thr Asp Lys Lys Pro Leu Arg Gly Ala
35 40 45
Val Phe Ser Leu Gln Lys Gln His Pro Asp Tyr Pro Asp Ile Tyr Gly
50 55 60
Ala Ile Asp Gln Asn Gly Thr Tyr Gln Asp Val Arg Thr Gly Glu Asp
65 70 75 80
Gly Lys Leu Thr Phe Thr Asn Leu Ser Asp Gly Lys Tyr Arg Leu Ile
85 90 95
Xaa Asn Ser Glu Pro Pro Gly Tyr Lys Pro Val Gln Asn Lys Pro Ile
100 105 110
Val Ser Phe Arg Ile Val Asp Gly Glu Val Arg Asp Val Thr Ser Ile
115 120 125
Val Pro Gln
130
<210> 21
<211> 104
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Affinity purification polypeptide D31C
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (70)..(70)
<223> Xaa is not glutamic acid or aspartic acid
<400> 21
Lys Leu Gly Glu Ile Glu Phe Ile Lys Val Asp Lys Thr Asp Lys Lys
1 5 10 15
Pro Leu Arg Gly Ala Val Phe Ser Leu Gln Lys Gln His Pro Cys Tyr
20 25 30
Pro Asp Ile Tyr Gly Ala Ile Asp Gln Asn Gly Thr Tyr Gln Asp Val
35 40 45
Arg Thr Gly Glu Asp Gly Lys Leu Thr Phe Thr Asn Leu Ser Asp Gly
50 55 60
Lys Tyr Arg Leu Ile Xaa Asn Ser Glu Pro Pro Gly Tyr Lys Pro Val
65 70 75 80
Gln Asn Lys Pro Ile Val Ser Phe Arg Ile Val Asp Gly Glu Val Arg
85 90 95
Asp Val Thr Ser Ile Val Pro Gln
100
<210> 22
<211> 104
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Affinity purification polypeptide Q41C
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (70)..(70)
<223> Xaa is not glutamic acid or aspartic acid
<400> 22
Lys Leu Gly Glu Ile Glu Phe Ile Lys Val Asp Lys Thr Asp Lys Lys
1 5 10 15
Pro Leu Arg Gly Ala Val Phe Ser Leu Gln Lys Gln His Pro Asp Tyr
20 25 30
Pro Asp Ile Tyr Gly Ala Ile Asp Cys Asn Gly Thr Tyr Gln Asp Val
35 40 45
Arg Thr Gly Glu Asp Gly Lys Leu Thr Phe Thr Asn Leu Ser Asp Gly
50 55 60
Lys Tyr Arg Leu Ile Xaa Asn Ser Glu Pro Pro Gly Tyr Lys Pro Val
65 70 75 80
Gln Asn Lys Pro Ile Val Ser Phe Arg Ile Val Asp Gly Glu Val Arg
85 90 95
Asp Val Thr Ser Ile Val Pro Gln
100
<210> 23
<211> 95
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Truncated Affinity purification polypeptide D27C
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (66)..(66)
<223> Xaa is not glutamic acid or aspartic acid
<400> 23
Ile Glu Phe Ile Lys Val Asp Lys Thr Asp Lys Lys Pro Leu Arg Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Ser Leu Gln Lys Gln His Pro Cys Tyr Pro Asp Ile Tyr
20 25 30
Gly Ala Ile Asp Gln Asn Gly Thr Tyr Gln Asp Val Arg Thr Gly Glu
35 40 45
Asp Gly Lys Leu Thr Phe Thr Asn Leu Ser Asp Gly Lys Tyr Arg Leu
50 55 60
Ile Xaa Asn Ser Glu Pro Pro Gly Tyr Lys Pro Val Gln Asn Lys Pro
65 70 75 80
Ile Val Ser Phe Arg Ile Val Asp Gly Glu Val Arg Asp Val Thr
85 90 95
<210> 24
<211> 95
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Truncated Affinity purification polypeptide Q37C
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (66)..(66)
<223> Xaa is not glutamic acid or aspartic acid
<400> 24
Ile Glu Phe Ile Lys Val Asp Lys Thr Asp Lys Lys Pro Leu Arg Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Ser Leu Gln Lys Gln His Pro Asp Tyr Pro Asp Ile Tyr
20 25 30
Gly Ala Ile Asp Cys Asn Gly Thr Tyr Gln Asp Val Arg Thr Gly Glu
35 40 45
Asp Gly Lys Leu Thr Phe Thr Asn Leu Ser Asp Gly Lys Tyr Arg Leu
50 55 60
Ile Xaa Asn Ser Glu Pro Pro Gly Tyr Lys Pro Val Gln Asn Lys Pro
65 70 75 80
Ile Val Ser Phe Arg Ile Val Asp Gly Glu Val Arg Asp Val Thr
85 90 95
Claims (36)
- 폴리펩티드로서,
i) 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열;
ii) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 (i)의 부분;
iii) 서열번호 1에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 상기 아미노산 서열은 위치 9의 리신, 위치 70의 글루탐산 및 다음:
1) 위치 4의 글루탐산;
2) 위치 11의 아스파르트산;
3) 위치 13의 트레오닌;
4) 위치 47의 아스파르트산;
5) 위치 59의 트레오닌;
6) 위치 69의 이소류신;
7) 위치 75의 프롤린;
8) 위치 87의 세린;
9) 위치 89의 아르기닌; 및
10) 위치 92의 아스파르트산;
중의 2개 이상을 포함하되;
상기 아미노산 서열이 위치 75의 프롤린을 포함하는 경우, 이는 또한 상기 1) 내지 6) 및 8) 내지 10)으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 1에서의 위치와 동등한 위치에 있음; 또는
iv) 서열번호 2에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 (iii)의 부분, 상기 아미노산 서열은 위치 5의 리신, 위치 66의 글루탐산 및 다음:
1) 위치 7의 아스파르트산;
2) 위치 9의 트레오닌;
3) 위치 43의 아스파르트산;
4) 위치 55의 트레오닌;
5) 위치 65의 이소류신;
6) 위치 71의 프롤린;
7) 위치 83의 세린;
8) 위치 85의 아르기닌; 및
9) 위치 88의 아스파르트산;
중의 하나 이상을 포함하되;
상기 아미노산 서열이 위치 71의 프롤린을 포함하는 경우, 이는 또한 상기 1) 내지 5) 및 7) 내지 9)로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 2에서의 위치와 동등한 위치에 있음;
을 포함하되,
상기 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드와 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성할 수 있고, 상기 이소펩티드 결합은 서열번호 3의 위치 17의 아스파라긴 잔기와 서열번호 1의 위치 9 또는 서열번호 2의 위치 5의 리신 잔기 사이에 형성되는, 폴리펩티드. - 제 1 항에 있어서,
상기 폴리펩티드는, 서열번호 1에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하되, 상기 아미노산 서열은 위치 9의 리신, 위치 70의 글루탐산 및 다음:
1) 위치 4의 글루탐산;
2) 위치 11의 아스파르트산;
3) 위치 13의 트레오닌;
4) 위치 47의 아스파르트산;
5) 위치 59의 트레오닌;
6) 위치 69의 이소류신;
7) 위치 75의 프롤린;
8) 위치 87의 세린;
9) 위치 89의 아르기닌; 및
10) 위치 92의 아스파르트산;
중의 3개 이상을 포함하고;
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 1에서의 위치와 동등한 위치에 있는 것인, 폴리펩티드. - 제 1 항에 있어서,
상기 폴리펩티드는 서열번호 1에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하되, 상기 아미노산 서열은 위치 9의 리신, 위치 70의 글루탐산, 위치 75의 프롤린, 및 다음:
1) 위치 69의 이소류신;
2) 위치 87의 세린; 및
3) 위치 89의 아르기닌;
중의 하나 이상을 포함하고;
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 1에서의 위치와 동등한 위치에 있는 것인, 폴리펩티드. - 제 3 항에 있어서,
상기 폴리펩티드는,
1) 위치 4의 글루탐산;
2) 위치 11의 아스파르트산;
3) 위치 13의 트레오닌;
4) 위치 47의 아스파르트산;
5) 위치 59의 트레오닌; 및
6) 위치 92의 아스파르트산;
중의 하나 이상을 더 포함하되,
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 1에서의 위치와 동등한 위치에 있는 것인, 폴리펩티드. - 폴리펩티드로서,
i) 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열;
ii) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 (i)의 부분;
iii) 서열번호 1에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 상기 아미노산 서열은 위치 9의 리신, 위치 70의 글루탐산, 다음:
1) 위치 4의 글루탐산;
2) 위치 11의 아스파르트산;
3) 위치 13의 트레오닌;
4) 위치 47의 아스파르트산;
5) 위치 59의 트레오닌;
6) 위치 75의 프롤린; 및
7) 위치 92의 아스파르트산;
중의 하나 이상 및 다음:
1) 위치 69의 이소류신;
2) 위치 87의 세린; 및
3) 위치 89의 아르기닌;
중의 하나 이상을 포함하되;
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 1에서의 위치와 동등한 위치에 있음; 또는
iv) 서열번호 2에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 (iii)의 부분, 상기 아미노산 서열은 위치 5의 리신, 위치 66의 글루탐산, 다음:
1) 위치 7의 아스파르트산;
2) 위치 9의 트레오닌;
3) 위치 43의 아스파르트산;
4) 위치 55의 트레오닌;
5) 위치 71의 프롤린; 및
6) 위치 88의 아스파르트산;
중의 하나 이상 및 다음:
1) 위치 65의 이소류신;
2) 위치 83의 세린; 및
3) 위치 85의 아르기닌;
중의 하나 이상을 포함하되;
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 2에서의 위치와 동등한 위치에 있음,
을 포함하고,
상기 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드와 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성할 수 있고, 상기 이소펩티드 결합은 서열번호 3의 위치 17의 아스파라긴 잔기와 서열번호 1의 위치 9 또는 서열번호 2의 위치 5의 리신 잔기 사이에 형성되는, 폴리펩티드. - 제 5 항에 있어서,
상기 폴리펩티드는 서열번호 1에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하되, 상기 아미노산 서열은 위치 9의 리신, 위치 70의 글루탐산, 다음:
1) 위치 4의 글루탐산;
2) 위치 11의 아스파르트산;
3) 위치 13의 트레오닌;
4) 위치 47의 아스파르트산;
5) 위치 59의 트레오닌;
6) 위치 75의 프롤린; 및
7) 위치 92의 아스파르트산;
중의 2개 이상 및 다음:
1) 위치 69의 이소류신;
2) 위치 87의 세린; 및
3) 위치 89의 아르기닌;
중의 하나 이상을 포함하고;
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 1에서의 위치와 동등한 위치에 있는 것인, 폴리펩티드. - 제 1 항 내지 제 6 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩티드는 서열번호 1에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하되, 상기 아미노산 서열은 위치 9의 리신, 위치 70의 글루탐산, 위치 75의 프롤린, 다음:
1) 위치 4의 글루탐산;
2) 위치 11의 아스파르트산;
3) 위치 13의 트레오닌;
4) 위치 47의 아스파르트산;
5) 위치 59의 트레오닌; 및
6) 위치 92의 아스파르트산;
중의 하나 이상 및 다음:
1) 위치 69의 이소류신;
2) 위치 87의 세린; 및
3) 위치 89의 아르기닌;
중의 하나 이상을 포함하며;
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 1에서의 위치와 동등한 위치에 있고,
상기 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드와 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성할 수 있고, 상기 이소펩티드 결합은 서열번호 3의 위치 17의 아스파라긴 잔기와 서열번호 1의 위치 9 또는 서열번호 2의 위치 5의 리신 잔기 사이에 형성되는, 폴리펩티드. - 제 1 항 내지 제 7 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩티드는 서열번호 1에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하되, 상기 아미노산 서열은 위치 9의 리신, 위치 70의 글루탐산 및
1) 위치 4의 글루탐산;
2) 위치 11의 아스파르트산;
3) 위치 13의 트레오닌;
4) 위치 47의 아스파르트산;
5) 위치 59의 트레오닌;
6) 위치 69의 이소류신;
7) 위치 75의 프롤린;
8) 위치 87의 세린;
9) 위치 89의 아르기닌; 및
10) 위치 92의 아스파르트산;
을 모두 포함하고;
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 1에서의 위치와 동등한 위치에 있는 것인, 폴리펩티드. - 제 1 항 내지 제 8 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩티드는 핵산 분자, 단백질, 펩티드, 소분자 유기 화합물(small-molecule organic compound), 형광단, 금속-리간드 복합체, 다당류, 나노입자, 2D 단층(예를 들어 그래핀), 지질, 나노튜브, 중합체, 세포, 바이러스, 바이러스-유사 입자, 바이러스 벡터 또는 이들의 조합물에 접합되는, 폴리펩티드. - 폴리펩티드로서,
i) 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열, 여기서 위치 70의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산이 아니고, 선택적으로 상기 위치 70의 X는 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택됨;
ii) 서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 (i)의 일부, 여기서 위치 66의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산이 아니고, 선택적으로 상기 위치 66의 X는 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택됨;
iii) 서열번호 18에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 여기서 위치 70의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산이 아니고, 선택적으로 상기 위치 70의 X는 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택되고 상기 아미노산 서열은 다음:
1) 위치 4의 글루탐산;
2) 위치 11의 아스파르트산;
3) 위치 13의 트레오닌;
4) 위치 47의 아스파르트산;
5) 위치 59의 트레오닌;
6) 위치 69의 이소류신;
7) 위치 75의 프롤린;
8) 위치 87의 세린;
9) 위치 89의 아르기닌; 및
10) 위치 92의 아스파르트산;
중의 하나 이상을 포함하되;
상기 아미노산 서열이 위치 75의 프롤린을 포함하는 경우, 이는 또한 상기 1) 내지 6) 및 8) 내지 10)으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 18에서의 위치와 동등한 위치에 있음; 또는
iv) 서열번호 19에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 (iii)의 부분, 여기서 위치 66의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산이 아니고, 선택적으로 상기 위치 66의 X는 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택되고 상기 아미노산 서열은 다음:
1) 위치 7의 아스파르트산;
2) 위치 9의 트레오닌;
3) 위치 43의 아스파르트산;
4) 위치 55의 트레오닌;
5) 위치 65의 이소류신;
6) 위치 71의 프롤린;
7) 위치 83의 세린;
8) 위치 85의 아르기닌; 및
9) 위치 88의 아스파르트산;
중의 하나 이상을 포함하되;
상기 아미노산 서열이 위치 71의 프롤린을 포함하는 경우, 이는 또한 상기 1) 내지 5) 및 7) 내지 9)로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 19에서의 위치와 동등한 위치에 있음,
을 포함하되,
상기 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 선택적으로 및 가역적으로 결합하는, 폴리펩티드. - 폴리펩티드로서,
i) 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열, 여기서 위치 70의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산이 아니고, 선택적으로 위치 70의 X는 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택됨;
ii) 서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 (i)의 일부, 여기서 위치 66의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산이 아니고, 선택적으로 상기 위치 66의 X는 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택됨;
iii) 서열번호 18에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 여기서 위치 70의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산이 아니고, 선택적으로 위치 70의 X는 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택되고 상기 아미노산 서열은 다음:
1) 위치 4의 글루탐산;
2) 위치 11의 아스파르트산;
3) 위치 13의 트레오닌;
4) 위치 47의 아스파르트산;
5) 위치 59의 트레오닌;
6) 위치 75의 프롤린; 및
7) 위치 92의 아스파르트산;
중의 하나 이상 및 다음:
1) 위치 69의 이소류신;
2) 위치 87의 세린; 및
3) 위치 89의 아르기닌;
중의 하나 이상을 포함하되;
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 1에서의 위치와 동등한 위치에 있음; 또는
iv) 서열번호 19에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 (iii)의 부분, 여기서 위치 66의 X는 글루탐산 또는 아스파르트산이 아니고, 선택적으로 상기 위치 66의 X는 알라닌, 글리신, 세린, 아스파라긴, 또는 트레오닌으로부터 선택되고 상기 아미노산 서열은 다음:
1) 위치 7의 아스파르트산;
2) 위치 9의 트레오닌;
3) 위치 43의 아스파르트산;
4) 위치 55의 트레오닌;
5) 위치 71의 프롤린; 및
6) 위치 88의 아스파르트산;
중의 하나 이상 및 다음:
1) 위치 65의 이소류신;
2) 위치 83의 세린; 및
3) 위치 85의 아르기닌;
중의 하나 이상을 포함하되;
상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 19에서의 위치와 동등한 위치에 있음,
을 포함하되,
상기 폴리펩티드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 선택적으로 및 가역적으로 결합하는, 폴리펩티드. - 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,
상기 폴리펩티드는 서열번호 18 또는 19에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 아미노산 서열은 서열번호 18에서의 위치 9 또는 서열번호 19에서의 위치 5와 동등한 위치에 리신을 포함하는, 폴리펩티드. - 제 10 항 내지 제 12 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩티드는 시스테인 잔기를 포함하는 추가의 N-말단 또는 C-말단 서열을 포함하는, 폴리펩티드. - 제 10 항 내지 제 12 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩티드는 서열번호 18 또는 19에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 폴리펩티드는 시스테인 잔기를 포함하는, 폴리펩티드. - 제 14 항에 있어서,
상기 시스테인 잔기는 서열번호 18에서의 위치 31 또는 41과 동등한 위치, 또는 서열번호 19에서의 위치 27 또는 37과 동등한 위치에 있는 것인, 폴리펩티드. - 제 1 항 내지 제 15 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩티드는 고체 기질(solid substrate) 상에 고정화되는 것인, 폴리펩티드. - 제 1 항 내지 제 16 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩티드는 공유 결합을 통해 고체 기질 상에 고정화되는 것인, 폴리펩티드. - 제 10 항 내지 제 15 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩티드는 시스테인 잔기와 상기 고체 기질 사이의 공유 결합을 통해 고체 기질 상에 고정화되는 것인, 폴리펩티드. - 재조합 또는 합성 폴리펩티드로서,
제 1 항 내지 제 18 항 중의 어느 한 항에 정의된 폴리펩티드에 연결된 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는, 재조합 또는 합성 폴리펩티드. - 핵산 분자로서,
제 1 항 내지 제 8 항 및 제 10 항 내지 제 18 항 중의 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 제 19 항의 재조합 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산 분자. - 벡터로서,
제 20 항의 핵산 분자를 포함하는, 벡터. - 세포로서,
제 20 항의 핵산 분자 또는 제 21 항의 벡터를 포함하는, 세포. - 제 1 항 내지 제 8 항 및 제 10 항 내지 제 18 항 중의 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 제 19 항의 재조합 폴리펩티드를 생산 또는 발현시키는 방법으로서,
a) 숙주 세포를 제 21 항에 정의된 벡터로 형질전환(transforming) 또는 형질감염(transfecting)시키는 단계;
b) 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 선택적으로,
c) 상기 폴리펩티드를 단리하는 단계;
를 포함하는, 방법. - 이소펩티드 결합을 통해 2개의 분자 또는 성분을 접합시키기 위한 제 1 항 내지 제 9 항 및 제 16 항 중의 어느 한 항에 정의된 폴리펩티드의 용도로서,
이소펩티드 결합을 통해 접합된 상기 분자 또는 성분은:
a) 제 1 항 내지 제 9 항 및 제 16 항 중의 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 제 1 분자 또는 성분; 및
b) (i) 서열번호 3-5 또는 17 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드; 및
(ii) 서열번호 3-5 또는 17 중의 어느 하나에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열은 위치 17의 아스파라긴 잔기를 포함하고, 선택적으로 위치 5의 트레오닌 잔기, 위치 10의 아스파르트산 잔기 및 위치 11의 글리신 잔기를 포함함;
로부터 선택된 펩티드를 포함하는 제 2 분자 또는 성분;
을 포함하되,
상기 펩티드는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성할 수 있고, 상기 이소펩티드 결합은 서열번호 3, 4, 5 또는 17의 위치 17의 아스파라긴 잔기와 서열번호 1의 위치 9의 리신 잔기 사이에 형성되는 것인, 용도. - 제 24 항에 있어서,
상기 제 2 분자 또는 성분이 내부 부위에 펩티드를 포함하는 것인, 용도. - 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서,
상기 제 2 분자 또는 성분은 단백질이고, 상기 단백질은 루프 내에 펩티드를 포함하는 것인, 용도. - 이소펩티드 결합을 통해 2개의 분자 또는 성분을 접합시키는 방법으로서,
a) 제 1 항 내지 제 9 항 및 제 16 항 중의 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 제 1 분자 또는 성분을 제공하는 단계;
b) (i) 서열번호 3-5 또는 17 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드; 및
(ii) 서열번호 3-5 또는 17 중의 어느 하나에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열은 위치 17의 아스파라긴 잔기를 포함하고, 선택적으로 위치 5의 트레오닌 잔기, 위치 10의 아스파르트산 잔기 및 위치 11의 글리신 잔기를 포함함;
로부터 선택된 펩티드를 포함하는 제 2 분자 또는 성분을 제공하는 단계,
상기 펩티드는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성할 수 있고, 상기 이소펩티드 결합은 서열번호 3, 4, 5 또는 17의 위치 17의 아스파라긴 잔기와 서열번호 1의 위치 9의 리신 잔기 사이에 형성됨; 및
c) 상기 폴리펩티드와 펩티드 사이의 이소펩티드 결합의 자발적 형성을 가능하게 하는 조건 하에 상기 제 1 및 제 2 분자 또는 성분을 접촉시킴으로써, 상기 제 1 분자 또는 성분을 상기 제 2 분자 또는 성분에 이소펩티드 결합을 통해 접합시켜서 복합체를 형성하는 단계;
를 포함하는, 방법. - 제 27 항에 있어서,
상기 제 2 분자 또는 성분은 내부 부위에 펩티드를 포함하는, 방법. - 제 27 항 또는 제 28 항에 있어서,
상기 제 2 분자 또는 성분은 단백질이고, 상기 단백질은 루프 내에 펩티드를 포함하는, 방법. - 키트로서,
바람직하게는 제 24 항 내지 제 26 항 중의 어느 한 항의 용도 또는 제 27 항 내지 제 29 항 중의 어느 한 항의 방법에서 사용하기 위한 것이고, 상기 키트는:
(a) 선택적으로 분자 또는 성분에 접합되거나 융합된 제 1 항 내지 제 9 항 및 제 16 항 중의 어느 한 항의 폴리펩티드; 및
(b) 선택적으로 분자 또는 성분에 접합되거나 융합된 펩티드, 상기 펩티드는:
(i) 서열번호 3-5 또는 17 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드; 및
(ii) 서열번호 3-5 또는 17 중의 어느 하나에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열은 위치 17의 아스파라긴 잔기를 포함하고, 선택적으로 위치 5의 트레오닌 잔기, 위치 10의 아스파르트산 잔기 및 위치 11의 글리신 잔기를 포함함;
로부터 선택되고,
상기 펩티드는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 이소펩티드 결합을 자발적으로 형성할 수 있고, 상기 이소펩티드 결합은 서열번호 3, 4, 5 또는 17의 위치 17의 아스파라긴 잔기와 서열번호 1의 위치 9의 리신 잔기 사이에 형성되고, 선택적으로 분자 또는 성분에 접합되거나 융합됨; 및/또는
(c) (a)에 정의된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자, 특히 벡터; 및/또는
(d) (b)에 정의된 펩티드를 암호화하는 핵산 분자, 특히 벡터;
를 포함하는, 키트. - 제 24 항 내지 제 30 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 펩티드는:
(i) 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드; 및
(ii) 서열번호 3에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열은 위치 5의 트레오닌 잔기, 위치 10의 아스파르트산 잔기 및 위치 11의 글리신 잔기 및 위치 17의 아스파라긴 잔기를 포함하고, 상기 특정된 아미노산 잔기는 서열번호 3에서의 위치와 동등한 위치에 있음;
로부터 선택되는 것인, 용도, 방법 또는 키트. - 서열번호 3-5 또는 17 중의 하나에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 분자 또는 성분을 정제 또는 단리하는 방법으로서,
상기 아미노산 서열은 위치 17의 아스파라긴 잔기를 포함하고, 선택적으로 위치 5의 트레오닌 잔기, 위치 10의 아스파르트산 잔기 및 위치 11의 글리신 잔기를 포함하고, 상기 방법은:
a) 제 10 항 내지 제 15 항 중의 어느 한 항의 폴리펩티드가 고정화되는 고체 기질을 제공하는 단계;
b) 상기 분자 또는 성분을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
c) 상기 펩티드가 상기 폴리펩티드에 선택적으로 결합할 수 있게 하는 조건 하에, 상기 a)의 고체 기질을 상기 b)의 샘플과 접촉시켜서, 상기 고체 기질 상에 고정화된 상기 폴리펩티드와, 상기 펩티드를 포함하는 분자 또는 성분 사이에 비-공유 복합체를 형성하는 단계;
d) 상기 고체 기질을 완충액으로 세척하는 단계;
e) 상기 고체 기질 상에 고정화된 상기 폴리펩티드로부터 상기 펩티드를 포함하는 분자 또는 성분을 분리하는 단계;
를 포함하는, 방법. - 서열번호 3-5 또는 17 중의 하나에 제시된 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 분자 또는 성분을 정제 또는 단리하기 위한 제 10 항 내지 제 18 항 중의 어느 한 항의 폴리펩티드의 용도로서,
상기 아미노산 서열은 위치 17의 아스파라긴 잔기를 포함하고, 선택적으로 위치 5의 트레오닌 잔기, 위치 10의 아스파르트산 잔기 및 위치 11의 글리신 잔기를 포함하는, 용도. - 제 32 항의 방법 또는 제 33 항의 용도에서 사용하기 위한 장치로서,
제 10 항 내지 제 15 항 중의 어느 한 항의 폴리펩티드가 고정화되는 고체 기질을 포함하는, 장치. - 제 10 항 내지 제 15 항 중의 어느 한 항의 폴리펩티드가 고정화되는 고체 기질을 제조하는 데 사용하기 위한 키트로서,
a) 제 10 항 내지 제 15 항 중의 어느 한 항의 폴리펩티드; 및
b) 고체 기질 상에 상기 a)의 폴리펩티드를 고정화하기 위한 수단;
을 포함하는, 키트. - 제 23 항 내지 제 35 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 펩티드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 용도, 방법 또는 키트.
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