CN106977590B

CN106977590B - 突变的菜豆根瘤菌亲和素蛋白及其应用

Info

Publication number: CN106977590B
Application number: CN201710258398.2A
Authority: CN
Inventors: 张毅奕
Original assignee: Xi'an Yabo Biotechnology Co ltd
Current assignee: Xi'an Yabo Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-04-19
Filing date: 2017-04-19
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2037-04-19
Also published as: CN106977590A

Abstract

本发明公开了一种突变的菜豆根瘤菌亲和素蛋白(rhizavidin)及其应用。根据野生型rhizavidin蛋白与生物素结合的分子机理，设计并筛选了能够与生物素可逆结合的突变rhizavidin蛋白，包括Tyr41Phe/Asn43Gln双突变rhizavidin以及Tyr41Phe/Asn43Gln/Ser69Cys三突变rhizavidin。所述突变rhizavidin蛋白可以与生物素或生物素化的生物分子可逆结合，偶联有这种突变rhizavidin蛋白的亲和层析树脂可捕获生物素化的生物分子，而被捕获的生物素化的生物分子可在温和的生理条件下用游离生物素竞争洗脱下来，从而达到纯化目的。

Description

突变的菜豆根瘤菌亲和素蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物分离纯化技术领域，具体涉及一种能够与生物素可逆结合的突变菜豆根瘤菌亲和素蛋白(rhizavidin)、偶联有这种突变蛋白的亲和层析树脂，以及利用这种亲和层析树脂从复杂生物样本中纯化生物素化的生物分子的方法。

背景技术

亲和素蛋白家族(avidin family)是一类在结构和功能上高度相似的蛋白的统称，其中发现最早且最广为人知的是源于鸡蛋清的亲和素(avidin)以及源于阿维丁菌(Streptomyces avidinii)的链霉亲和素(streptavidin)。近十余年来，归功于生物信息学的发展，一些具有不同来源的蛋白也被鉴定为亲和素蛋白家族的成员，包括源于慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)的bradavidin(Nordland H.R.et al.,J.Biol.Chem.2005,280:13250-13255)、源于热带爪蟾(Xenopus tropicalis)的xenavidin(

J.et al.,BMC Struct.Biol.,2009,9:63)、源于伯克霍尔德菌(Burkholderiapseudomallei)的burkavidin(Sardo A.et al.,Protein Expression and Purification,2011,77:131-139)、源于Tamogitake蘑菇的tamavidin(Takakura Y.et al.,FEBS J.,2009,276:1383-1397)、源于菜豆根瘤菌(Rhizobium etli CFN42)共生质粒p42d的rhizavidin(Helppolainen S.H.et al.,Biochem.J.,2007,405:394-405)、源于脱硝希瓦氏菌(Shewanella denitrificans)的shwanavidin(Meir A.et al.,J.Biol.Chem.,2012,287:17951-17962)以及源于光养赫夫勒氏菌(Hoeflea phototrophica)的hoefavidin(Avraham O.et al.,J.Struct.Biol.,2015,191:139-148)。其中，最后三种亲和素类蛋白是由两个相同的亚基构成，而其他的亲和素类蛋白则由四个相同的亚基构成。虽然来源迥异，氨基酸序列也各有不同，但所有的亲和素家族蛋白，其亚基的三级结构都具有由8条反平行β-折叠形成的特征性的β-桶状结构(β-barrel)。

亲和素家族蛋白在结构上的相似性决定了其功能的相似性。此处所谓功能相似性，意指所有已知的亲和素家族蛋白，其每个亚基的β-桶状结构内部都可结合一个生物素分子。相应的，含两个亚基或四个亚基的亲和素家族蛋白分别可结合两个或四个生物素分子。生物素，又名辅酶R、维生素H和维生素B7，是一个含戊酸侧链的分子量为244.3Dalton的有机小分子。通过对戊酸侧链羧基的化学修饰，生物素可被制作成具有不同反应活性的各种衍生物，如生物素-马来酰亚胺酯和生物素-琥珀酰亚胺酯等，这些衍生物统称为生物素化试剂。具有不同反应活性的生物素化试剂可以和生物分子(蛋白、脂肪、核酸、多糖等)上不同的基团如氨基、巯基、羟基、羧基等反应，从而可以给几乎所有的生物分子标记上生物素，而标记到生物分子上的生物素依然能够与亲和素家族蛋白结合。在生物分子上标记生物素的过程称作生物素化(biotinylation)，相应的，标记有生物素的生物分子称作生物素化的生物分子(biotinylated biomolecules)。生物素化的生物分子常作为探针或报告分子用于对样品中特定靶分子的分析，在生物医药研究中具有广泛的应用。

亲和素家族蛋白与生物素的结合极为牢固，是已知的最为牢固的非共价键结合之一。例如，亲和素或链霉亲和素与生物素之间形成的复合物，其解离常数K_d为10^-14～10^-15M，因此在温和的生理条件下被看作是几乎不可逆的结合(温和的生理条件意指不会导致生物分子结构和功能受到破坏的条件，如适宜的温度、接近中性的pH值、不含或只含很低浓度的表面活性剂和变性剂等)。这一特质，以及生物素化试剂的广泛商业来源，使得亲和素/链霉亲和素-生物素系统在各种涉及生物分子分析及检测的技术平台得以广泛应用，如流式细胞分析、荧光显微镜术、酶联免疫吸附、蛋白印迹杂交、基因芯片、蛋白芯片以及纳米生物技术等。

另一方面，亲和素家族蛋白与生物素之间结合的不可逆性也限制了其在某些生物医学研究中的应用，尤其是在利用(链霉)亲和素-生物素系统对生物分子进行分离纯化方面。虽然市场上有很多偶联有亲和素或链霉亲和素的亲和层析树脂产品，可用来有效捕获生物素化的生物分子，然而为了进一步将被捕获的生物素化的生物分子从这些亲和层析树脂上洗脱或释放下来，通常需要高温加热(Tong X.&Smith L.M.,Anal.Chem.1992,64:2672-2677)，或联合使用高浓度变性剂和极端酸性条件如6～8M盐酸胍和pH 1.5(Bodanszky A.&Bodanszky M.,Experientia,1970,26:327)。在这些苛刻的条件下，被捕获的生物分子(尤其是像抗体和酶等蛋白质类生物分子)的高级结构和功能基本上被破坏殆尽。如何在温和的生理条件下实现亲和素家族蛋白与生物素的可逆结合，从而在不影响被捕获的生物素化生物分子结构和功能的前提下将其释放，成了一个受到广泛关注的问题。

已有若干方法被尝试用来解决这个问题。第一种方法是使用生物素的结构类似物来代替生物素对生物分子进行标记，如脱硫生物素(desthiobiotin)和2-亚氨基生物素(2-iminobiotin)等。脱硫生物素或脱硫生物素标记的生物分子可以与(链霉)亲和素结合，但与(链霉)亲和素的亲和力显著低于生物素与(链霉)亲和素的亲和力(Green N.M.,Adv.Protein Chem.,1975,29:85-133；Florin E.L.et al.,Science,1994,264:415-417)。因此，在与(链霉)亲和素结合后，它们能够被游离的生物素竞争取代，从而得以释放。然而，与生物素化试剂相比，脱硫生物素化试剂的种类及商品化产品来源极为有限且价格非常昂贵，限制了这种方法的普遍应用。2-亚氨基生物素或2-亚氨基生物素标记的生物分子同样可与(链霉)亲和素可逆结合，但结合-解离过程依赖于pH的变化，即结合需在pH＝11的强碱性条件下进行，而解离需在pH＝4的酸性条件下进行(Fudem-Goldin B.&Orr G.A.,MethodsEnzymol.,1990,184:167-173)。相对极端的pH条件对许多生物分子的结构和功能也会造成程度不等的破坏。第二种方法是使用可切割的生物素化试剂，如含有二硫键的生物素化试剂，使用这种生物素化试剂标记的生物分子在与(链霉)亲和素结合后，可以用还原剂破坏二硫键，从而将结合的生物分子释放下来(Shimkus M.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,pp.2593-2597,1985)(专利US4772691)。然而，对于很多本身就含有二硫键的蛋白质如抗体而言，还原剂的使用会破坏这些生物分子的结构和功能。可切割的生物素化试剂还有如含肽键可被多肽酶切割、含二糖可被二糖酶切割、或含其他化学键可被酸、碱、氧化剂、还原剂等切割的多种形式(专利US5215927)，这些方法同样会对欲分离的生物分子造成程度不等的破坏。第三种方法是采用能够结合链霉亲和素的多肽来代替生物素，如Strep-tag和Strep-Tag II等(Schmidt T.G.&Skerra A.,Protein Engineering,1993,6:109-122)。这些多肽可结合在链霉亲和素蛋白上的生物素结合位点，但二者间的亲和力远小于生物素与链霉亲和素间的亲和力，故此多肽-链霉亲和素复合物可被游离的生物素竞争取代拆分开来。这种方法的优点在于多肽的遗传可操作性，其编码DNA可方便地整合至基因工程常用的载体如质粒中用于表达融合有这些多肽的重组蛋白。此类重组蛋白可被偶联有链霉亲和素的亲和层析树脂捕获，并可在温和的生理条件下用生物素竞争洗脱下来。然而，由于天然生物样本中的生物分子不含这些多肽序列，因而无法利用该技术进行纯化。第四种方法是对(链霉)亲和素蛋白进行化学修饰，尤其是对(链霉)亲和素蛋白中的酪氨酸残基进行硝基化修饰，由于酪氨酸残基参与(链霉)亲和素与生物素间的相互作用，其硝基化可有效降低蛋白与生物素的亲和力(Gitlin G.et al.,Biochem.J.1990,269:527-530)，使不可逆的结合转变为可逆结合。该方法已被用来制备商品化的亲和层析树脂，如美国ThermoFisherScientific公司的CaptAvidin Agarose就是将硝基化的亲和素共价偶联到琼脂糖树脂上制得。但使用这种树脂纯化生物素化的生物分子同样依赖于相对极端的酸碱条件，其结合过程需要pH＝4的酸性环境，而解离过程需要pH＝10的碱性环境(Morag E.et al.,Biochem.J.,1996,316:193-199)，对某些pH敏感的生物分子依然会造成损害。第五种方法采用偶联有单亚基亲和素(monomeric avidin)的琼脂糖亲和层析树脂(Green N.M.&TomsE.J.,Biochem.J.,1973,133:687-700)。其原理是，完整的四亚基亲和素拆分成单亚基后依然能结合生物素，但二者间的亲和力显著低于完整的四亚基亲和素与生物素之间的亲和力，故此表现为可逆的结合过程。然而，由于其具体制作工艺无法完全去除多亚基亲和素蛋白，所谓的单亚基亲和素树脂表面实际上仍残留有很多完整的亲和素蛋白，需要使用游离的生物素预先封闭，为实际操作增加了额外的步骤。第六种方法是对(链霉)亲和素进行基因突变(综述见Laitinen O.H.et al.,Cell.Mol.Life Sci.,2006,63:2992-3017)，通过改变(链霉)亲和素蛋白中与生物素相互作用的氨基酸残基，从而降低突变蛋白与生物素的亲和力。此方法散见于大量的科技文献报道中，商品化的偶联有突变链霉亲和素的亲和层析树脂有Strep-Tactin树脂，主要用于纯化含有Strep Tag II的重组蛋白。

上述这些实现亲和素类蛋白与生物素可逆结合的方法，普遍使用了亲和素以及链霉亲和素这两个最早发现的亲和素家族的蛋白成员，而近十余年来新发现的亲和素家族蛋白如rhizavidin等在实现与生物素可逆结合方面的潜在应用尚未涉及。另外，商品化的用于生物素化生物分子纯化的亲和层析树脂仅见单亚基亲和素琼脂糖树脂和硝基化亲和素琼脂糖树脂两种，例如美国ThermoFisher Scientific公司的Monomeric Avidin Agarose和CaptAvidin Agarose。如上述，单亚基亲和素琼脂糖树脂上残留有不可逆结合位点，使用前必须先封闭这些位点，而硝基化亲和素琼脂糖树脂必须使用较为极端的pH值以实现可逆结合。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种突变的菜豆根瘤菌亲和素蛋白(rhizavidin)；本发明的目的之二是提供一种偶联有上述突变的rhizavidin的亲和层析树脂；本发明的目的之三是提供一种利用上述亲和层析树脂从复杂生物样本中纯化生物素化生物分子的方法。所述突变的rhizavidin可以与生物素或生物素化生物分子可逆结合，偶联有这种突变的rhizavidin的亲和层析树脂可捕获生物素化的生物分子，而被捕获的生物素化生物分子可在温和的生理条件下用游离生物素竞争洗脱下来，从而达到纯化目的。全部纯化过程无需Monomeric Avidin Agarose所必需的预封闭步骤，也无需CaptAvidin Agarose所必需的较为极端的pH条件。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

根据rhizavidin与生物素结合的分子机理，设计并筛选能够与生物素可逆结合的rhizavidin突变蛋白，这种突变蛋白偶联到层析树脂上后，即可在温和的生理条件下纯化生物素化的生物分子。

如前述，rhizavidin源自于菜豆根瘤菌Rhizobium etli CFN42的共生质粒p42d，是新近发现的亲和素蛋白家族成员之一(Helppolainen S.H.et al.,Biochem.J.,2007,405:394-405)。与在其之前发现的所有的亲和素蛋白家族成员不同，rhizavidin含有两个而非四个相同的亚基。虽然在四级结构上存在巨大差异，rhizavidin的亚基具有亲和素家族蛋白特征性的由8条反平行β-折叠形成的β-桶状结构，并像其他亲和素家族蛋白一样，也可与生物素结合，且这种结合在生理条件下几乎是不可逆的(Meir A.et al.,J.Mol.Biol.,2009,386:379-390)。

Rhizavidin与生物素形成牢固结合的分子机理涉及广泛的氢键和疏水相互作用。根据rhizavidin-生物素复合物的晶体结构(PDB ID：3EW2；Meir A.et al.,J.Mol.Biol.,2009,386:379-390)，rhizavidin蛋白每个亚基中其侧链直接与生物素形成氢键的氨基酸残基包括Asn21、Ser25、Tyr41、Asn43、Ser81、Thr83、Asp119(参见图1，相应氨基酸后缀的编号是SEQ.ID.NO.1所给出)。其中，Asn21、Ser25和Tyr41的侧链基团与生物素咪唑酮环上的羰基氧形成氢键，Asn43和Asp119的侧链基团分别与生物素咪唑酮环上两个仲氨基中的一个形成氢键，Ser81的侧链基团与生物素戊酸侧链的羧基氧形成氢键，Thr83的侧链基团与生物素噻吩环的硫原子形成氢键(图1)。所有这些氨基酸均位于rhizavidin亚基的β-桶状结构的内壁上，围成一个中空的生物素结合位点。本发明所公开的突变rhizavidin，其设计思路是对这些和生物素形成氢键的氨基酸残基进行突变，以减少蛋白与生物素之间氢键的数量，从而降低其与生物素的亲和力，使二者的结合可在温和的生理条件下逆转。

在对野生型rhizavidin中与生物素形成氢键的氨基酸残基进行突变研究之前，首先对该蛋白(即野生型rhizavidin)进行了结构优化。如前述，rhizavidin蛋白包含两个相同的亚基，亚基的编码基因对应的前体蛋白质产物全长为179个氨基酸，其中，N-端44个氨基酸为信号肽，故成熟的rhizavidin蛋白的每个亚基均是由上述前体蛋白的第45到第179共135个氨基酸(SEQ.ID.NO.1)构成(Helppolainen S.H.et al.,Biochem.J.,2007,405:394-405)。专利US9499593B2描述了一种复合疫苗和免疫原性复合物，其核心组分之一就是含上述135个氨基酸的成熟rhizavidin。根据成熟rhizavidin蛋白的晶体结构(PDB ID:3EW1)，该蛋白两个亚基的C-端的10个氨基酸残基均构成一段游离于β-桶状结构主体之外且远离生物素结合位点的卷曲(coil)(图2)，一个合理的预期是，移除C-端这10个氨基酸残基的全部或一部分不会影响生物素的结合。在本发明中，移除了C-端最后5个氨基酸残基，所得到的蛋白依然与生物素不可逆结合(图3，泳道1、2)，且具有更好的溶解度(移除的5个氨基酸残基中包括两个连续的、暴露于溶剂中的疏水的亮氨酸残基)。故此，本发明中所述的野生型rhizavidin其每个亚基仅含所述成熟的rhizavidin蛋白的第1到第130个氨基酸残基(SEQ.ID.NO.2)，而突变的rhizavidin(或称突变蛋白)是在此基础上进行突变得来。

对上述与生物素形成氢键的氨基酸残基进行了不同的突变组合，构建了分别含有野生型、双突变(Asn21Ala/Asn43Ala、Asn21Ala/Asn43Gln、Ser25Ala/Asn43Ala、Ser25Ala/Asn43Gln、Tyr41Phe/Asn43Ala、Tyr41Phe/Asn43Gln)、三突变(Asn21Ala/Tyr41Phe/Asn43Ala、Asn21Ala/Ser25Ala/Asn43Gln、Asn21Ala/Tyr41Phe/Asn43Gln、Ser25Ala/Tyr41Phe/Asn43Ala、Ser25Ala/Tyr41Phe/Asp119Ala、Ser25Ala/Tyr41Phe/Asn43Gln)以及四突变(Asn21Ala/Ser25Ala/Tyr41Phe/Thr83Ala、Asn21Ala/Ser25Ala/Tyr41Phe/Asn43Asp、Asn21Ala/Ser25Ala/Tyr41Phe/Asn43Gln、)rhizavidin基因的表达质粒。所有这些表达质粒均以pET-26b(+)质粒为载体，并在BL21(DE3)大肠杆菌进行蛋白表达。所有的蛋白表达产物均以包涵体的形式存在。包涵体经含表面活性剂Triton X-100的缓冲液洗涤除去大部分杂质后，以8M尿素溶液溶解变性，然后快速稀释到适宜的缓冲液中进行复性以得到天然状态的突变蛋白(含有两个亚基的四级结构)。复性后的蛋白进一步以70％饱和度硫酸铵沉淀，然后以适宜缓冲液或水溶解。Asn21Ala/Ser25Ala/Tyr41Phe/Thr83Ala四突变蛋白在硫酸铵沉淀后不溶，其余的突变蛋白和野生型蛋白在硫酸铵沉淀后均可重新溶解。

对可重新溶解的突变蛋白，采用改良的荧光-聚丙烯酰胺电泳(荧光-PAGE)进行了功能筛选(详见实施例，以及Humbert N.et al.,Electrophoresis,2004,26:47-52)。荧光-PAGE的特点是使用可发射荧光的生物素-4-荧光素(B4F)与蛋白一起孵育，然后进行PAGE电泳。电泳结束后在365nm紫外灯或其他适宜波长光源下观察凝胶。如果样品中含有能够结合生物素的蛋白，凝胶上生物素结合蛋白的位置会呈现明亮的B4F荧光条带；如果样品中没有能够结合生物素的蛋白存在，则在凝胶电泳前沿(示踪染料溴酚蓝处)呈现游离B4F荧光条带。如欲进一步判断蛋白与生物素的结合是否可逆，可在样品进入凝胶后在同一上样孔中追加游离生物素。由于游离生物素的电泳迁移率大于蛋白与B4F的复合物，游离生物素会逐渐追上并超越蛋白-B4F复合物，在此过程中，如果蛋白-生物素之间的结合是不可逆的，则B4F荧光条带的位置不会因为追加生物素而发生变化；如果蛋白-生物素之间的结合是可逆的，游离生物素会将与蛋白结合的B4F竞争取代下来，这种情况下，B4F荧光条带的位置将位于游离的B4F和结合的B4F之间。采用这种荧光-PAGE分析法，证实了亚基C-端去除5个氨基酸后的rhizavidin(即本发明中所称的野生型rhizavidin)依然结合生物素且这种结合不可逆，另外，从上述可重新溶解的突变rhizavidin中筛选到了一个能够可逆结合生物素的突变蛋白，即Tyr41Phe/Asn43Gln双突变rhizavidin(图3)，而其他突变蛋白均不能结合B4F，也就是不能结合生物素。Tyr41Phe/Asn43Gln双突变rhizavidin中(序列参见SEQ.ID.NO.3)，Tyr41Phe突变直接消除了Tyr41与生物素咪唑酮环上氧原子之间的氢键，而Asn43Gln突变虽然没有改变氨基酸侧链上的酰胺基团受氢体，但由于Gln的侧链比Asn的侧链多出一个亚甲基，因而至少会改变生物素结合位点的局部构象，干扰蛋白与生物素咪唑酮环仲氨基之间氢键的形成。另外一个为了同时消除这两个氢键而构建的Tyr41Phe/Asn43Ala双突变蛋白并不结合B4F，可能是因为Asn43Ala突变对生物素结合位点的空间构象造成了过大的影响。

迄今为止所有已发现的野生型的亲和素家族蛋白都具有良好的热稳定性。例如，亲和素在没有和有生物素存在时其T_m值分别为83.5和117℃，链霉亲和素在没有和有生物素存在时其T_m值分别为75.0和112℃。野生型rhizavidin同样具有良好的热稳定性，没有和有生物素存在时，其T_m值分别为74.8和100.5℃(Helppolainen S.H.et al.,Biochem.J.,2007,405:394-405)。蛋白质的热稳定性可为其纯化、贮存、运输和使用等各环节带来极大的便利性。在得到能够可逆结合生物素的Tyr41Phe/Asn43Gln双突变rhizavidin之后，本发明检查了该蛋白是否像野生型rhizavidin一样具有热稳定性。结果表明，Tyr41Phe/Asn43Gln双突变rhizavidin的溶液经60℃加热1小时后絮凝析出，因而不具热稳定性，而野生型rhizavidin溶液60℃加热1小时后依然保持清亮，具有良好的热稳定性(图4)。

曾有报导对亲和素Tyr33(相当于rhizavidin的Tyr41)进行突变(Tyr33Ala,Tyr33His,Tyr33Gln)也会导致亲和素热稳定性的降低(Marttila A.T.et al.,Biochem.J.,2003,369:249-254)。另一方面，也有报导通过在亲和素的亚基间引入二硫键(Nordlund H.R.et al.,J.Biol.Chem.,2003,278:2479-2483)，或是在链霉亲和素的亚基间引入二硫键(Reznik G.O.et al.,Nat.Biotechnol.,1996,14:1007-1011)，可有效地提高亲和素或链霉亲和素蛋白的热稳定性。在非亲和素家族蛋白中，通过二硫键的引入来提高蛋白稳定性也是一种较常用的策略(Takagi H.et al.,J.Biol.Chem.,1990,265:6874-6878；Zavodszky M.et al.,Protein Science,2001,10:149-160)。

为了提高Tyr41Phe/Asn43Gln双突变rhizavidin的热稳定性，进一步尝试了在该突变蛋白的两个亚基的界面上引入二硫键。根据其氨基酸序列(SEQ.ID.NO.1)和晶体结构(PDB ID：3EW2)，成熟rhizavidin的每个亚基都含有两个半胱氨酸(Cys50和Cys79)，但这两个半胱氨酸并非位于亚基间界面上，而是紧邻生物素结合位点，彼此间形成亚基内二硫键并起到稳定生物素结合位点的作用(Meir A.et al.,J.Mol.Biol.,2009,386:379-390)。换言之，成熟rhizavidin或野生型rhizavidin中不存在亚基间二硫键。为了在亚基间引入二硫键，本发明选择了位于亚基间界面上的Ser69作为突变对象。就分子结构而言，Ser69Cys突变仅仅是将羟基(-OH)变成了巯基(-SH)，氨基酸残基主链和侧链的其余部分均没有变化，从rhizavidin晶体结构(PDB ID：3EW1、3EW2)可知，两个亚基的Ser69彼此紧邻(图5)，其侧链羟基上氧原子的间距为

将Ser69突变为Cys，假定蛋白主链空间构象维持不变，则两个亚基上的Cys69侧链硫原子间距为

(氧原子半径

硫原子半径

)，足够接近二硫键的键长

事实上，某些蛋白质中二硫键键长可达

以上，如乙酸钙不动杆菌的葡萄糖脱氢酶(PDB ID:1CRU)(Oubrie A.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1999,96:11787-11791)。一个合理的预期是，Ser69Cys突变将在rhizavidin的两个亚基间引入二硫键。

构建了含Tyr41Phe/Asn43Gln/Ser69Cys三突变rhizavidin基因的表达质粒并进行了蛋白表达，该蛋白的氨基酸序列参见SEQ.ID.NO.4。包涵体经变性、复性并以DEAE离子交换色谱纯化后得到的三突变蛋白，在非还原和还原条件下进行SDS-PAGE电泳分析(图6)，还原条件下，三突变rhizavidin亚基间二硫键被打开，其表观分子量(～15kD)近似于单个亚基的分子量(14kD)，非还原条件下，亚基间二硫键保存完整，表观分子量(～24kD)接近两个亚基分子量之和(28kD)，表明三突变rhizavidin两个亚基上的Ser69Cys确实形成了亚基间二硫键。非还原条件下表观分子量小于理论值是因为链内及链间二硫键的存在使蛋白不能完全变性所致。此外，二硫键的引入显著提升了蛋白的热稳定性，Tyr41Phe/Asn43Gln/Ser69Cys三突变蛋白经60℃加热1小时不见絮凝析出(图4，样品3)，即Tyr41Phe/Asn43Gln/Ser69Cys三突变rhizavidin可耐受热处理，具有良好的热稳定性。

本发明进一步制作了偶联有Tyr41Phe/Asn43Gln/Ser69Cys三突变rhizavidin的亲和层析树脂。所谓的亲和层析树脂，是指表面偶联有特定配体或受体、能够特异结合待分离混合样品中特定的受体或配体的树脂。一种常见的亲和层析树脂是表面偶联有特定抗原或抗体的树脂，可用来纯化特定的抗体或抗原。另一种常见的亲和层析树脂是表面偶联有镍离子的树脂，可用来纯化带有组氨酸标签的蛋白。与传统的离子交换、疏水作用和凝胶过滤等树脂相比，亲和层析树脂通常可提供更好的纯化效果和更快速的纯化过程。前述的Monomeric Avidin琼脂糖、CaptAvidin琼脂糖和Strep-Tactin树脂，都属于亲和层析树脂。

根据树脂化学性质和表面功能集团的差别，可以采用多种技术线路将蛋白质偶联到树脂表面。简单的方法可以是通过非特异性的物理吸附将蛋白质以非共价键的形式偶联在树脂表面，而更为精细的方法可通过化学反应将蛋白质以共价键连接的方式偶联到活化的树脂表面。常见的活化树脂包括但不限于溴化氰(CNBr)活化的树脂以及N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)活化的树脂等。通过活化树脂表面的功能基团与蛋白质上的功能基团(如氨基)之间的化学反应，即可将蛋白质共价偶联到树脂表面。本发明中，使用NHS活化的琼脂糖树脂偶联Tyr41Phe/Asn43Gln/Ser69Cys三突变rhizavidin蛋白，Tyr41Phe/Asn43Gln双突变rhizavidin也可采用此方法偶联到琼脂糖树脂表面。偶联反应发生在NHS基团与突变蛋白上的氨基之间，可供偶联的氨基包括蛋白N-端的游离α-氨基以及Lys130侧链的ε-氨基，如欲进一步提供更多的偶联位点，还可通过突变引入更多的赖氨酸残基，包括但不限于Glu128Lys等。(所述Glu128Lys突变是验证过的突变，不影响蛋白与生物素的结合，但可增加偶联效率。虽然含有Glu128Lys突变的蛋白偶联效率更高，但在纯化生物素化的生物分子时，效果没有明显改进。C-端进一步去除若干个氨基酸从理论上讲是可行的，也不会显著影响生物素的结合。但是，从另外一个角度看，Lys130是C-端10个氨基酸的第5个，如果进一步缩短C-端的话，会把Lys130也去除掉。由于rhizavidin的氨基酸组成比较特殊，除了N-端有一个氨基外，主体筒状结构里不含任何赖氨酸残基，即不含可供偶联用的氨基，而N-端是半掩埋在蛋白中的，在N-端处发生偶联的效率不会太高，如果去除Lys130的话，整体的偶联效率会非常低。这也是在截短C-端时选择截止在Lys130的原因)。其他可与氨基反应的活化树脂，包括但不限于醛基活化的、环氧基活化的或溴化氰活化的琼脂糖树脂、葡聚糖树脂、聚丙烯酰胺树脂等，也可用于偶联上述突变蛋白或在其基础上进一步突变的蛋白。此外，除了利用突变rhizavidin蛋白上的氨基将其偶联到树脂上，还可以利用该蛋白的羧基将其偶联到含有氨基的树脂上，还可以利用含有双功能基团的交联剂(包括但不限于戊二醛、辛二酸二琥珀酰亚胺酯等)达到同一偶联目的。

在制得偶联有Tyr41Phe/Asn43Gln/Ser69Cys三突变rhizavidin的亲和层析树脂后，以B4F为模型分子，验证了该亲和层析树脂能够可逆结合生物素分子(而根据前文利用荧光-聚丙烯酰胺电泳进行的功能筛选，Tyr41Phe/Asn43Gln二突变rhizavidin同样具有可逆结合生物素分子的能力。同时偶联有Tyr41Phe/Asn43Gln二突变rhizavidin的亲和树脂，也用B4F进行了验证，发现能够可逆结合B4F。但是偶联二突变蛋白的亲和树脂其保质期很短，大约一周后就失效了)。其过程为，首先以亲和层析树脂装柱制备重力流亲和层析柱，柱子经缓冲液平衡后加载过量B4F直至柱子上所有的生物素结合位点被饱和，再以缓冲液冲洗至流出液无荧光，然后每次加入1/4柱床体积的5mM游离生物素溶液进行洗脱。洗脱前和每次洗脱1/4柱床体积的生物素溶液后都在365nm紫外灯下观察。结果显示，洗脱前层析柱内的填料呈现均匀的B4F荧光，表明亲和层析树脂上所有的生物素结合位点均已结合了B4F，而随着游离生物素溶液的添加，结合的B4F从层析柱上段逐渐被游离生物素竞争取代下来，荧光下移，直至层析柱上的B4F完全被洗脱，荧光消失。全部洗脱过程约需2个柱床体积的生物素溶液(图7)。对上述层析过程中每一滴流出液进行分别收集并检测其488nm光吸收值(B4F中的荧光素的光吸收峰涵盖此波长)，以光吸收值对相应的滴数作图，B4F的洗脱峰呈现良好的对称性(图8)。这些结果表明偶联了Tyr41Phe/Asn43Gln/Ser69Cys三突变rhizavidin蛋白的亲和层析树脂确实可以有效地实现生物素化分子的可逆结合。

以生物素化的牛血清白蛋白和生物素化的麦芽糖结合蛋白为模型生物分子，进一步给出了利用上述亲和层析树脂对复杂混合样品中生物素化生物分子进行纯化的方法。牛血清白蛋白为商业来源，麦芽糖结合蛋白为本公司自制，二者分别用N-琥珀酰亚氨基-6-生物素氨己酸和生物素-PEG2-马来酰亚胺进行生物素化。另取对数生长后期的BL21(DE3)大肠杆菌，经溶菌酶裂解后离心，离心上清即为大肠杆菌总可溶蛋白。生物素化的牛血清白蛋白或生物素化的麦芽糖结合蛋白分别按照1:20的质量比与大肠杆菌总可溶蛋白混合，如此制得分别含有生物素化牛血清白蛋白和生物素化麦芽糖结合蛋白的两种混合样品。对这两种混合样品中生物素化的生物分子进行纯化的步骤包括：1)以5-10倍柱床体积的适宜缓冲液(包括但不限于磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液等)平衡偶联有三突变rhizavidin的亲和层析柱；2)将复杂混合样品上样到层析柱上；3)以适宜缓冲液冲洗直至流出液280nm光吸收值降到与所用缓冲液相同(即所有不结合的杂质已被冲洗干净)；4)以含5-10mM生物素的适宜缓冲液洗脱生物素化的生物分子。所谓适宜缓冲液，包括但不限于磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液等常用的缓冲液，其pH值接近中性如6-8。按照该方法对含有生物素化牛血清白蛋白或生物素化麦芽糖结合蛋白的混合样品进行纯化，洗脱的蛋白分别进行SDS-PAGE分析和蛋白印迹杂交分析，均呈现单一蛋白条带(图9、图10)。这些结果表明，偶联有Tyr41Phe/Asn43Gln/Ser69Cys三突变rhizavidin的亲和层析树脂可有效地捕获复杂混合样品中生物素化的生物分子，更重要的是，被捕获的生物素化的生物分子可以在温和的生理条件下用游离生物素竞争洗脱下来，从而达到纯化的目的。

综上述，本发明提供了一种基于突变rhizavidin蛋白的亲和层析树脂以用于从复杂混合样品中纯化生物素化的生物分子。与现有技术相比，其有益效果是：所述亲和层析树脂不像Monomeric Avidin Agarose那样需要用游离生物素预先封闭树脂上的不可逆结合位点，因而使用更简单；也不像CaptAvidin Agarose那样需要较为极端的pH条件来实现生物素化生物分子的结合和解离，因而所需条件更温和，更有利于生物素化生物分子结构和功能的稳定。

附图说明

图1为野生型rhizavidin与生物素之间所形成的氢键以及参与氢键形成的氨基酸残基。

图2为rhizavidin蛋白的晶体结构图，图中包括两个亚基的主体β-桶状结构的C-末端的10个氨基酸残基，白框圈出的部分为C-末端的10个氨基酸。

图3为Tyr41Phe/Asn43Gln双突变rhizavidin蛋白的荧光-PAGE分析，1～5为样品编号；样品1和2为10μg野生型rhizavidin与1μL、15μM B4F的混合物，样品3和4为10μgTyr41Phe/Asn43Gln双突变rhizavidin与1μL、15μM B4F的混合物，样品5为游离B4F，其中，样品2和4在样品进胶以后又追加了15μL的5mM游离生物素。

图4为野生型rhizavidin(样品1)、Tyr41Phe/Asn43Gln双突变rhizavidin(样品2)、以及Tyr41Phe/Asn43Gln/Ser69Cys三突变rhizavidin(样品3)热稳定性比较；三种蛋白浓度均为2mg/mL，经60℃加热1小时。Tyr41Phe/Asn43Gln双突变rhizavidin在加热处理后变性絮凝析出，而野生型rhizavidin和Tyr41Phe/Asn43Gln/Ser69Cys三突变rhizavidin不变性絮凝析出。

图5为野生型rhizavidin亚基界面上的Ser69(a)以及Ser69Cys突变后亚基界面上的Cys69(b)的示意图。

图6为Tyr41Phe/Asn43Gln/Ser69Cys三突变rhizavidin的SDS-PAGE分析。从左至右依次为预染的蛋白质分子量标准、20μg三突变rhizavidin加还原型上样缓冲液(含50mMDTT)、20μg三突变rhizavidin加非还原型上样缓冲液(不含还原剂DTT)，样品经煮沸5分钟后上样。

图7为偶联有Tyr41Phe/Asn43Gln/Ser69Cys三突变rhizavidin蛋白的亲和层析柱(层析柱的柱床体积为0.5mL)上结合的B4F以游离生物素竞争洗脱的荧光照片；图中CV为柱床体积(Column Volume)。

图8为偶联有Tyr41Phe/Asn43Gln/Ser69Cys三突变rhizaividin蛋白的亲和层析柱上结合的B4F以5mM游离生物素竞争洗脱的色谱图，箭头所示为加入游离生物素溶液开始洗脱的时间。

图9为含生物素化牛血清白蛋白的混合样品经偶联有Tyr41Phe/Asn43Gln/Ser69Cys三突变rhizaividin蛋白的亲和层析柱纯化之前和纯化之后的SDS-PAGE(a)及Western Blot(b)分析，1～4为泳道编号；泳道1为预染蛋白分子量标准，泳道2为生物素化牛血清白蛋白与大肠杆菌总可溶蛋白混合物，泳道3为上样到层析柱时的流穿部分(不结合层析树脂)，泳道4为洗脱样品。

图10为含生物素化麦芽糖结合蛋白的混合样品经偶联有Tyr41Phe/Asn43Gln/Ser69Cys三突变rhizaividin蛋白的亲和层析柱纯化之前和纯化之后的SDS-PAGE(a)及Western Blot(b)分析，1～4为泳道编号；泳道1为预染蛋白分子量标准，泳道2为生物素化麦芽糖结合蛋白与大肠杆菌总可溶蛋白混合样品，泳道3为上样到层析柱时的流穿部分(不结合层析树脂)，泳道4为洗脱样品。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行进一步详细说明，所述实施例是对本发明的解释而不是限定。

(一)野生型及突变型rhizavidin蛋白表达及纯化

野生型及突变性rhizavidin基因系按照大肠杆菌密码子使用频率优化，并采用全基因合成的方法由南京金斯瑞生物科技有限公司制备。其中，野生型、Tyr41Phe/Asn43Gln双突变、以及Tyr41Phe/Asn43Gln/Ser69Cys三突变rhizavidin的基因序列分别参见SEQ.ID.NO.5、SEQ.ID.NO.6及SEQ.ID.NO.7。合成基因插入到pET-26b(+)质粒(深圳伟通生物科技有限公司)上Nde I和Xho I酶切位点之间构成表达质粒。

野生型及突变型rhizavidin蛋白表达以BL21(DE3)大肠杆菌(西安东澳生物科技有限公司)为宿主。首先在含32μg/mL卡那霉素的LB培养基中于37℃下振荡培养携带表达质粒的BL21(DE3)至600nm光吸收值达到0.8–1.0，然后加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.2mM，并继续震荡培养3～4小时。经10000g离心30分钟，弃上清，-80℃冻存菌体直至蛋白纯化步骤。

上述培养条件下，野生型和突变型rhizavidin表达产物均以包涵体存在，其纯化涉及包涵体的变性和蛋白复性，复性后的蛋白再进一步采用DEAE色谱柱纯化。具体步骤如下：首先将冻存菌体解冻后悬浮于裂解液(50mM Tris，，200mM NaCl，5mM EDTA，1％TritonX-100，pH8.0)中，冰浴条件下100瓦超声破碎，12000g离心30分钟后得到包涵体，包涵体再以裂解液悬浮，超声/离心清洗，共四次。清洗后的包涵体以含8M尿素的缓冲液(50mMNa₂HPO₄，，8M尿素，200mM NaCl，5mM EDTA，pH8.0)在室温下溶解5个小时，12000g离心去除不溶物后，以7倍体积复性缓冲液(50mM Na₂HPO₄，200mM NaCl,5mM EDTA，pH8.5)迅速稀释，稀释后的上清在4℃放置48-72小时以允许蛋白充分复性。

复性后的蛋白以70％饱和度硫酸铵沉淀，10000g离心1小时得到蛋白沉淀。沉淀以pH 8.0的25mM磷酸盐缓冲液溶解后对同一缓冲液透析然后上样到DEAE色谱柱上，并以0–500mM NaCl线性梯度洗脱，收集目的组分。

采用上述方法纯化的蛋白，在SDS-PAGE胶上表现为单一的条带(参见图6)。

(二)野生型、Tyr41Phe/Asn43Gln双突变以及Tyr41Phe/Asn43Gln/Ser69Cys三突变rhizavidin蛋白的稳定性比较

三种蛋白均配制成2mg/mL浓度(溶于20mM Na₂HPO₄,pH 7.2)，各取1mL分别加到1.5mL离心管中，于60℃水浴加热1小时。野生型及Tyr41Phe/Asn43Gln/Ser69Cys三突变rhizavidin蛋白具有热稳定性，60℃加热1小时后蛋白溶液透明清亮(图4，样品1和3)，而Tyr41Phe/Asn43Gln双突变rhizavidin蛋白不具有热稳定性，60℃加热1小时后蛋白变性析出(图4，样品2)。

(三)Ser69Cys可介导突变rhizavidin形成链间二硫键

各取20μg Tyr41Phe/Asn43Gln/Ser69Cys三突变rhizavidin蛋白，分别用还原型上样缓冲液(含50mM还原剂DTT)和非还原型上样缓冲液(不含还原剂)制成SDS-PAGE样品，样品煮沸5分钟后进行SDS-PAGE分析，考马斯亮蓝染色。还原样品中蛋白条带的表观分子量接近单个亚基的分子量(14kD)，非还原样品中蛋白条带的表观分子量接近二个亚基分子量之和(28kD)(图6)。

(四)荧光-聚丙烯酰胺电泳

此电泳方法结合使用生物素-4-荧光素(biotin-4-fluorescein，B4F)和游离生物素，可检测突变的rhizavidin蛋白是否与生物素结合以及结合是否可逆。B4F是在生物素的戊酸侧链上连接一个荧光素基团，其生物素基团可与亲和素家族蛋白结合，其荧光素基团可在被紫外线激发时发射明亮的绿色荧光，故此能够方便地指示SDS-PAGE凝胶上亲和素家族蛋白条带所在的位置。B4F与亲和素家族蛋白的结合等同于生物素与亲和素家族蛋白的结合。

荧光-聚丙烯酰胺电泳的具体步骤是：首先混合11μL野生型或突变型rhizavidin样品(含10μg蛋白)与1μL 15μM B4F，室温孵育10分钟以允许蛋白与B4F结合，然后与3μL 5×SDS-PAGE上样缓冲液混合并上样(样品不煮)。电泳10分钟后当样品全部进入PAGE胶后，在同一上样孔中再追加15μL 5mM的游离生物素并继续电泳30分钟。由于生物素是分子量很小的有机分子，其电泳迁移率较高，在电泳过程中会追上并超过同一泳道中的蛋白成分。如果样品中不含能够结合生物素的蛋白，则B4F保持游离状态，在电泳过程中始终处于电泳前沿；如果样品中含有能够与生物素结合的蛋白，则B4F会结合到该蛋白上并与该蛋白一起在胶上迁移(明显落后于电泳前沿)，其在紫外线照射下的绿色荧光条带就指示了能够结合生物素的蛋白的位置。如果B4F与蛋白的结合是不可逆的(例如野生型的rhizavidin)，追加的生物素不会对B4F的荧光条带产生任何影响，如果B4F与蛋白的结合是可逆的(如本发明所公开的突变rhizavidin)，追加的生物素会将B4F从所结合的蛋白上竞争取代下来，恢复到游离状态的B4F电泳迁移率快于结合了蛋白的B4F，因而荧光条带会快速迁移。

取野生型和突变rhizavidin，按上述方法进行荧光-聚丙烯酰胺电泳。野生型与Tyr41Phe/Asn43Gln双突变rhizavidin各制作两个样品(每个样品中含5μg蛋白)，其中一个样品不追加游离生物素，另一个样品追加生物素。另做一个单独的B4F样品，不加蛋白，用以指示游离B4F的位置。电泳结束后，在365nm紫外灯下拍照。如图3所示，与野生型rhizavidin结合的B4F不被游离生物素取代，即野生型rhizavidin与生物素的结合是不可逆的。与之相反，与Tyr41Phe/Asn43Gln双突变rhizavidin结合的B4F可被游离生物素取代，说明该突变rhizavidin与生物素的结合是可逆的。

(五)偶联有Tyr41Phe/Asn43Gln/Ser69Cys三突变rhizavidin的亲和层析树脂的制备

取2mL N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化的琼脂糖悬浮液(博格隆(上海)生物技术有限公司)，100g离心1分钟后去上清，以100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)重悬树脂，再次离心去上清。重复离心洗涤三次后，以1mL溶于相同缓冲液的突变rhizavidin(10mg/mL)重新悬浮树脂，4℃震荡孵育过夜。次日离心洗涤树脂，合并各次离心上清，测量蛋白浓度及体积，得出离心上清中蛋白总量。以最初投放的蛋白量减去离心上清中蛋白总量，即得偶联到树脂上的蛋白总量。蛋白偶联量为4.5mg/mL树脂。

(六)亲和层析柱可逆结合B4F的荧光分析

取0.5mL偶联有Tyr41Phe/Asn43Gln/Ser69Cys三突变rhizavidin的亲和层析树脂手工灌装层析柱，层析柱内径10mm，柱子上下端各置入一个直径10mm的多孔隔片。柱子以5mL缓冲液(20mM Na₂HPO₄，500mM NaCl，pH7.4)平衡后，以10μM B4F(溶于上述缓冲液)上样到层析柱上，并在365nm紫外线下监测荧光，直到亲和层析树脂全部呈现荧光为止，此时，亲和层析树脂上所有的生物素结合位点均已结合了B4F(即层析柱首先以B4F饱和)。以10倍柱床体积上述缓冲液冲洗柱子(即以5mL缓冲液冲洗去除多余B4F)，然后每次在层析柱上端添加0.125mL即1/4柱床体积的游离生物素(5mM，溶于相同缓冲液)，每次待游离生物素溶液完全进入层析柱后，将层析柱移至365nm紫外灯下拍照，记录B4F被游离生物素洗脱的过程。如图7所示，B4F被两个柱床体积的游离生物素完全洗脱下来。

(七)亲和层析柱可逆结合B4F的色谱图分析

按照(六)灌装层析柱，并以B4F饱和层析柱，然后以上述缓冲液冲洗至流出液无荧光。以5mM游离生物素(溶于相同缓冲液)洗脱B4F。从在层析柱上端加入B4F样品开始一直到洗脱结束，逐滴收集层析柱下端每一滴流出液至一个1.5mL离心管中(实测每滴流出液体积为27μL)。每一滴样品中加入53μL水后测定488nm处光吸收值(A488)，并对相应的滴数作图(图8)。B4F的洗脱峰呈现良好的对称性。

(八)大肠杆菌总可溶蛋白制备

在200mL不含抗生素的LB液体培养基中接种BL21(DE3)大肠杆菌，37℃振荡培养8小时后，8000g离心20分钟收集菌体，-20℃冻存。次日以裂解缓冲液(20mM Na₂HPO₄，500mMNaCl，1mM EDTA，pH8.0)重悬，加入溶菌酶至1mg/mL，4℃振荡1小时。裂解液经100瓦超声处理后，12000g离心30分钟，弃沉淀。测定上清蛋白浓度，调整为10mg/mL后冻存于-20℃备用。

(九)生物素化牛血清白蛋白的制备

取20mg牛血清白蛋白(BSA，美国Amresco公司产品)，以100mM NaHCO₃溶液(pH8.5)配制成10mg/mL浓度。另称取N-琥珀酰亚氨基-6-生物素氨己酸(上海阿拉丁生物科技股份有限公司)溶于N,N-二甲基甲酰胺(4mg/mL)，取0.1mL加入上述2mL BSA溶液，冰浴反应4小时。反应物对缓冲液(20mM NaH₂PO₄，500mM NaCl，pH6.5)透析除去多余的生物素化试剂。

(十)生物素化麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein，MBP)的制备

MBP是大肠杆菌麦芽糖转运蛋白的一个亚基。麦芽糖结合蛋白不含半胱氨酸因而不含巯基，可通过基因工程的方法在其N-端或C-端引入一个半胱氨酸，从而提供一个特异性的反应位点(单一巯基)。本发明中，麦芽糖结合蛋白的基因系采用PCR方法从pMAL-c4x质粒(美国New England Biolabs Inc.)扩增而来。

5’-端引物为：

5’-GGAGAATTGCATATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGG-3’(SEQ.ID.NO.8)；

3’-端引物为：

5’-GTAGATCTGCTCGAGGCAGCCGCCAGTCTGCGCGTCTTTCAGG-3’(SEQ.ID.NO.9)。

5’-端引物和3’-端引物中分别引入了Nde I和Xho I酶切位点，3’-端引物还含有一个半胱氨酸密码子(引物中下划线标识的GCA密码子)。PCR产物经Nde I和Xho I切割后，克隆入经同样酶切处理的pET-26b(+)质粒载体中，最终的重组MBP蛋白在C-端上除了含有一个半胱氨酸外，还含有来自pET-26b(+)的His6纯化标签。重组MBP蛋白的表达流程与上述rhizavidin蛋白的表达流程一致，唯一不同的是，重组MBP蛋白是以可溶形式存在于大肠杆菌宿主菌的细胞质中。重组MBP的纯化采用Ni-NTA填料(德国Qiagen公司)，并按照厂家建议的流程进行操作。

纯化后的麦芽糖结合蛋白(即重组MBP)以100mM Na₂HPO₄(pH 7.4)配制成2mg/mL浓度，加入生物素-PEG2-马来酰亚胺(biotin-PEG2-maleimide，美国AAT Bioquest公司)至终浓度为500μM，室温反应2小时后，对缓冲液(20mM Tris，500mM NaCl，pH7.5)透析除去多余的生物素化试剂。

(十一)复杂混合样品中生物素化BSA的纯化

取0.5mg制备的生物素化的牛血清白蛋白与10mg制备的大肠杆菌总可溶蛋白混合并对缓冲液(20mM NaH₂PO₄，500mM NaCl，pH6.5)透析。按(五)中方法制备0.5mL亲和层析柱，以10倍柱床体积的缓冲液(20mM NaH₂PO₄，pH 6.5，500mM NaCl)平衡层析柱。将生物素化牛血清白蛋白和大肠杆菌总可溶蛋白混合样品上样到层析柱上，以10倍柱床体积的缓冲液冲洗，再以5倍柱床体积的溶于相同缓冲液中的5mM生物素竞争洗脱。洗脱液以离心超滤的方法浓缩，然后分别进行SDS-PAGE电泳分析分析及蛋白印迹杂交(Western Blot)分析。蛋白印迹杂交具体步骤为：SDS-PAGE电泳结束后，200V电压将蛋白转到PVDF膜上。PVDF膜以5％脱脂奶粉(20mM Tris,150mM NaCl，pH7.5)封闭后，与链霉亲和素-辣根过氧化物酶复合物在37℃孵育0.5小时后，经3次漂洗后，与显色液(0.03％DAB，0.03％H₂O₂，20mM Tris,150mMNaCl,pH 7.5)一起孵育显色。SDS-PAGE电泳分析和蛋白印迹杂交(Western Blot)分析结果见图9。

(十二)复杂混合样品中生物素化麦芽糖结合蛋白的纯化

除了将生物素化的牛血清白蛋白换成了生物素化的麦芽糖结合蛋白，以及将上述缓冲液(20mM NaH₂PO₄，500mM NaCl，pH6.5)用另一种缓冲液(20mM Tris，500mM NaCl，pH6.5)替换以外，其余操作与(十一)中完全相同，SDS-PAGE分析和蛋白印迹杂交(WesternBlot)分析结果见图10。

本发明以上实施例是基于成熟rhizavidin去除C-端5个氨基酸后的仅含130个氨基酸的rhizavidin突变蛋白，但从成熟rhizavidin的晶体结构来看，其C-端的10个氨基酸是一段游离于蛋白主体β-桶状结构之外的卷曲(coil)，且远离生物素结合位点(PDB ID3EW1和3EW2，Meir A.et al.,J.Mol.Biol.,2009,386:379-390)。一个合理的预期是，将本发明所移除的C-端5个氨基酸添加回来，或进一步移除C-端若干个氨基酸，都不会影响本发明所述突变rhizavidin与生物素的结合。此外，任何对生物科学和技术有一定了解的人都知道，可以通过基因工程的方法在本发明所述的突变rhizavidin的N-端、C-端或蛋白内部添加一个或多个氨基酸(多肽)形成重组融合蛋白。添加的多肽可以是一个包括但不限于用于细胞内定向运输、分离、纯化、检测、分析等用途的标签(tag)如组氨酸标签或FLAG标签，也可以是另外一个蛋白或另外一个蛋白的一个或几个结构域(domain)。另外，也可以通过基因工程对本发明所述的突变rhizavidin的任何一个或若干个氨基酸位点进行删除突变(deletion)或点突变(point mutation)，从而得到基于上述突变蛋白的新蛋白。再另外，也可以通过化学偶联(conjugation)的方法将另外一个分子(包括但不限于荧光基团、酶、抗体、蛋白、核酸等)以共价或非共价的方式连接到本发明所述的突变rhizavidin上形成复合结构。无论通过哪种方法制作上述的重组融合蛋白、新蛋白或复合结构，只要其中的rhizavidin部分含有本发明所述的突变，且所制备的重组蛋白或复合结构具有与生物素或生物素化分子可逆结合的特性，都应视作本发明的范畴。

<110>西安亚博生物技术有限公司

<120>突变的菜豆根瘤菌亲和素蛋白及其应用

<160>9

<210> 1

<211>135

<212>PRT

<213>Rhizobium etli CFN42

<400> 1

Phe Asp Ala Ser Asn Phe Lys Asp Phe Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ser

1 5 10 15

Ser Ser Trp Gln Asn Gln Ser Gly Ser Thr Met Ile Ile Gln Val Asp

20 25 30

Ser Phe Gly Asn Val Ser Gly Gln Tyr Val Asn Arg Ala Gln Gly Thr

35 40 45

Gly Cys Gln Asn Ser Pro Tyr Pro Leu Thr Gly Arg Val Asn Gly Thr

50 55 60

Phe Ile Ala Phe Ser Val Gly Trp Asn Asn Ser Thr Glu Asn Cys Asn

65 70 75 80

Ser Ala Thr Gly Trp Thr Gly Tyr Ala Gln Val Asn Gly Asn Asn Thr

85 90 95

Glu Ile Val Thr Ser Trp Asn Leu Ala Tyr Glu Gly Gly Ser Gly Pro

100 105 110

Ala Ile Glu Gln Gly Gln Asp Thr Phe Gln Tyr Val Pro Thr Thr Glu

115 120 125

Asn Lys Ser Leu Leu Lys Asp

130 135

<210>2

<211>130

<212>PRT

<213>Rhizobium etli CFN42

<400> 2

Phe Asp Ala Ser Asn Phe Lys Asp Phe Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ser

1 5 10 15

Ser Ser Trp Gln Asn Gln Ser Gly Ser Thr Met Ile Ile Gln Val Asp

20 25 30

Ser Phe Gly Asn Val Ser Gly Gln Tyr Val Asn Arg Ala Gln Gly Thr

35 40 45

Gly Cys Gln Asn Ser Pro Tyr Pro Leu Thr Gly Arg Val Asn Gly Thr

50 55 60

Phe Ile Ala Phe Ser Val Gly Trp Asn Asn Ser Thr Glu Asn Cys Asn

65 70 75 80

Ser Ala Thr Gly Trp Thr Gly Tyr Ala Gln Val Asn Gly Asn Asn Thr

85 90 95

Glu Ile Val Thr Ser Trp Asn Leu Ala Tyr Glu Gly Gly Ser Gly Pro

100 105 110

Ala Ile Glu Gln Gly Gln Asp Thr Phe Gln Tyr Val Pro Thr Thr Glu

115 120 125

Asn Lys

130

<210> 3

<211> 130

<212> PRT

<213>人工序列

<400> 3

Phe Asp Ala Ser Asn Phe Lys Asp Phe Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ser

1 5 10 15

Ser Ser Trp Gln Asn Gln Ser Gly Ser Thr Met Ile Ile Gln Val Asp

20 25 30

Ser Phe Gly Asn Val Ser Gly Gln Phe Val Gln Arg Ala Gln Gly Thr

35 40 45

Gly Cys Gln Asn Ser Pro Tyr Pro Leu Thr Gly Arg Val Asn Gly Thr

50 55 60

Phe Ile Ala Phe Ser Val Gly Trp Asn Asn Ser Thr Glu Asn Cys Asn

65 70 75 80

Ser Ala Thr Gly Trp Thr Gly Tyr Ala Gln Val Asn Gly Asn Asn Thr

85 90 95

Glu Ile Val Thr Ser Trp Asn Leu Ala Tyr Glu Gly Gly Ser Gly Pro

100 105 110

Ala Ile Glu Gln Gly Gln Asp Thr Phe Gln Tyr Val Pro Thr Thr Glu

115 120 125

Asn Lys

130

<210> 4

<211> 130

<212> PRT

<213>人工序列

<400> 4

Phe Asp Ala Ser Asn Phe Lys Asp Phe Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ser

1 5 10 15

Ser Ser Trp Gln Asn Gln Ser Gly Ser Thr Met Ile Ile Gln Val Asp

20 25 30

Ser Phe Gly Asn Val Ser Gly Gln Phe Val Gln Arg Ala Gln Gly Thr

35 40 45

Gly Cys Gln Asn Ser Pro Tyr Pro Leu Thr Gly Arg Val Asn Gly Thr

50 55 60

Phe Ile Ala Phe Cys Val Gly Trp Asn Asn Ser Thr Glu Asn Cys Asn

65 70 75 80

Ser Ala Thr Gly Trp Thr Gly Tyr Ala Gln Val Asn Gly Asn Asn Thr

85 90 95

Glu Ile Val Thr Ser Trp Asn Leu Ala Tyr Glu Gly Gly Ser Gly Pro

100 105 110

Ala Ile Glu Gln Gly Gln Asp Thr Phe Gln Tyr Val Pro Thr Thr Glu

115 120 125

Asn Lys

130

<210> 5

<211> 393

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 5

tttgatgcga gcaactttaa agattttagc agcattgcga gcgcgagcag cagctggcag 60

aaccagagcg gcagcaccat gattattcag gtggatagct ttggcaacgt gagcggccag 120

tatgtgaacc gcgcgcaggg caccggctgc cagaacagcc cgtatccgct gaccggccgc 180

gtgaacggca cctttattgc gtttagcgtg ggctggaaca acagcaccga aaactgcaac 240

agcgcgaccg gctggaccgg ctatgcgcag gtgaacggca acaacaccga aattgtgacc 300

agctggaacc tggcgtatga aggcggcagc ggcccggcga ttgaacaggg ccaggatacc 360

tttcagtatg tgccgaccac cgaaaacaaa taa 393

<210> 6

<211> 393

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 6

tttgatgcga gcaactttaa agattttagc agcattgcga gcgcgagcag cagctggcag 60

aaccagagcg gcagcaccat gattattcag gtggatagct ttggcaacgt gagcggccag 120

tttgtgcagc gcgcgcaggg caccggctgc cagaacagcc cgtatccgct gaccggccgc 180

gtgaacggca cctttattgc gtttagcgtg ggctggaaca acagcaccga aaactgcaac 240

agcgcgaccg gctggaccgg ctatgcgcag gtgaacggca acaacaccga aattgtgacc 300

agctggaacc tggcgtatga aggcggcagc ggcccggcga ttgaacaggg ccaggatacc 360

tttcagtatg tgccgaccac cgaaaacaaa taa 393

<210> 7

<211> 393

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 7

tttgatgcga gcaactttaa agattttagc agcattgcga gcgcgagcag cagctggcag 60

aaccagagcg gcagcaccat gattattcag gtggatagct ttggcaacgt gagcggccag 120

tttgtgcagc gcgcgcaggg caccggctgc cagaacagcc cgtatccgct gaccggccgc 180

gtgaacggca cctttattgc gttttgcgtg ggctggaaca acagcaccga aaactgcaac 240

agcgcgaccg gctggaccgg ctatgcgcag gtgaacggca acaacaccga aattgtgacc 300

agctggaacc tggcgtatga aggcggcagc ggcccggcga ttgaacaggg ccaggatacc 360

tttcagtatg tgccgaccac cgaaaacaaa taa 393

<210>8

<211>45

<212> DNA

<213>人工序列

<400>8

ggagaattgc atatgaaaat cgaagaaggt aaactggtaa tctgg 45

<210>9

<211>43

<212> DNA

<213>人工序列

<400>9

gtagatctgc tcgaggcagc cgccagtctg cgcgtctttc agg 43

Claims

1.突变的菜豆根瘤菌亲和素蛋白，其特征在于：该亲和素蛋白的亚基是将野生型菜豆根瘤菌亲和素蛋白亚基中与生物素咪唑酮环上的羰基氧形成氢键的Tyr41突变为Phe以及将与生物素咪唑酮环上仲氨基氢原子形成氢键的Asn43突变为Gln而得到的，野生型菜豆根瘤菌亲和素蛋白亚基中其他氨基酸残基不突变；

或者，

所述突变的菜豆根瘤菌亲和素蛋白是将野生型菜豆根瘤菌亲和素蛋白亚基中与生物素咪唑酮环上的羰基氧形成氢键的Tyr41突变为Phe以及将与生物素咪唑酮环上仲氨基氢原子形成氢键的Asn43突变为Gln，并且在所述突变的菜豆根瘤菌亲和素蛋白的亚基间引入一个二硫键而得到的，所述二硫键形成于两亚基间界面上的Cys之间，该Cys由Ser69突变得到，野生型菜豆根瘤菌亲和素蛋白亚基中其他氨基酸残基不突变；

所述野生型菜豆根瘤菌亲和素蛋白亚基的氨基酸序列选自SEQ.ID.NO.1，或者，所述野生型菜豆根瘤菌亲和素蛋白亚基的氨基酸序列选自对SEQ.ID.NO.1羧基端构成游离于b-桶状结构之外的卷曲的氨基酸序列进行截短后剩余的部分，截短后的卷曲剩余的氨基酸序列至少包括一个Lys。

2.根据权利要求1所述突变的菜豆根瘤菌亲和素蛋白，其特征在于：该亲和素蛋白的亚基为SEQ.ID.NO.3或SEQ.ID.NO.4所示的氨基酸序列。

3.一种包含权利要求1所述的突变的菜豆根瘤菌亲和素蛋白的亲和层析树脂，其特征在于：该亲和层析树脂包括固相载体以及偶联在固相载体表面的结合剂，所述结合剂选自所述突变的菜豆根瘤菌亲和素蛋白。

4.一种利用权利要求3所述的亲和层析树脂从混合样品中纯化生物素化的生物分子的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）以所述亲和层析树脂装填层析柱；

2）经过步骤1）后，以缓冲液平衡层析柱；

3）经过步骤2）后，将含有生物素化的生物分子的混合样品上样到层析柱上；

4）以所述缓冲液冲洗层析柱以去除混合样品中不与所述亲和层析树脂结合的杂质；

5）以游离生物素在温和的生理条件下洗脱层析柱结合的生物素化的生物分子。

5.一种如权利要求1所述的突变的菜豆根瘤菌亲和素蛋白在生物分子分离纯化中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述突变的菜豆根瘤菌亲和素蛋白能够与生物素或生物素化的生物分子结合且结合后的生物素或生物素化的生物分子可在温和的生理条件下被游离生物素竞争取代。