JP3097905B2 - 組換え不活性コア・ストレプトアビジン変異体 - Google Patents
組換え不活性コア・ストレプトアビジン変異体Info
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ビオチンへの結合
親和力が低下したアビジンおよびストレプトアビジンの
ミュテイン（突然変異タンパク質）、ならびに被検体の
測定方法、例えばイムノアッセイや核酸ハイブリダイゼ
ーションアッセイなどの診断試験における干渉除去試薬
としてのその使用に関する。さらに、本発明は、例えば
ビオチン化分子の分析用の、受容体−リガンド相互作用
の研究用の、またはビオチン化分子のアフィニティー精
製用の、ビオチンとの結合に関して再生可能なシステム
としてのアビジンおよびストレプトアビジンのミュテイ
ンの使用に関する。
親和力が低下したアビジンおよびストレプトアビジンの
ミュテイン（突然変異タンパク質）、ならびに被検体の
測定方法、例えばイムノアッセイや核酸ハイブリダイゼ
ーションアッセイなどの診断試験における干渉除去試薬
としてのその使用に関する。さらに、本発明は、例えば
ビオチン化分子の分析用の、受容体−リガンド相互作用
の研究用の、またはビオチン化分子のアフィニティー精
製用の、ビオチンとの結合に関して再生可能なシステム
としてのアビジンおよびストレプトアビジンのミュテイ
ンの使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】イムノアッセイや核酸ハイブリダイゼー
ションアッセイなどの被検体を測定するための検出法で
は、しばしば、被検体が特異的結合対の結合相手間の高
親和力相互作用によって測定されている。特異的結合対
の代表的な例はアビジンおよび／またはストレプトアビ
ジン−ビオチン複合体である。アビジン／ストレプトア
ビジン−ビオチン結合対を用いる場合は、その高い結合
親和力が利用される。この方法では、例えばアビジン／
ストレプトアビジンをコーティングした固相が使用さ
れ、この固相に被検体と特異的受容体とのビオチン化複
合体が結合され得る。他の試験フォーマットでは、アビ
ジン／ストレプトアビジンを可溶性形態で使用すること
もできる。
ションアッセイなどの被検体を測定するための検出法で
は、しばしば、被検体が特異的結合対の結合相手間の高
親和力相互作用によって測定されている。特異的結合対
の代表的な例はアビジンおよび／またはストレプトアビ
ジン−ビオチン複合体である。アビジン／ストレプトア
ビジン−ビオチン結合対を用いる場合は、その高い結合
親和力が利用される。この方法では、例えばアビジン／
ストレプトアビジンをコーティングした固相が使用さ
れ、この固相に被検体と特異的受容体とのビオチン化複
合体が結合され得る。他の試験フォーマットでは、アビ
ジン／ストレプトアビジンを可溶性形態で使用すること
もできる。
【０００３】しかしながら、特異的な相互作用のほかに
も、例えば試験成分とサンプル中のまたは固相上の他の
成分との望ましくない相互作用や非特異的結合反応とい
った副反応も起こり得る。特に、サンプル中に存在する
他の物質が、固定化されたまたは可溶性のアビジンやス
トレプトアビジンに結合して偽陽性または偽陰性の試験
結果をもたらすことがある。その上、こうした相互作用
はバックグラウンドシグナルの増加とシグナル散乱の増
加をまねき、それぞれの試験の感度と特異性を低減させ
る結果となり得る。
も、例えば試験成分とサンプル中のまたは固相上の他の
成分との望ましくない相互作用や非特異的結合反応とい
った副反応も起こり得る。特に、サンプル中に存在する
他の物質が、固定化されたまたは可溶性のアビジンやス
トレプトアビジンに結合して偽陽性または偽陰性の試験
結果をもたらすことがある。その上、こうした相互作用
はバックグラウンドシグナルの増加とシグナル散乱の増
加をまねき、それぞれの試験の感度と特異性を低減させ
る結果となり得る。
【０００４】これらの非特異的相互作用を低減させるた
めにさまざまな試みがなされてきた。こうして、例え
ば、種々の炭水化物成分および種々のタンパク質、タン
パク質混合物またはタンパク質画分、ならびにそれらの
加水分解産物はイムノアッセイにおいて試験成分と被検
体との非特異的相互作用を低下させ得ることが知られて
いる (Robertson ら, J. of Immun. Med. 26 (1985) 19
5; EP-A-260 903; US-A-4,931,385)。ところが、このよ
うな炭水化物およびタンパク質成分の使用は、そこに含
まれる成分が試験の際に更なる干渉を引き起こすという
欠点を抱えている。さらに、酵素的に調製された加水分
解産物はその調製の際に使用したプロテアーゼによって
汚染されていることがあり、しかも一般的に加水分解切
断の制御が難しいことから均一な品質のものが得られな
い。この種のプロテアーゼ不純物は試験成分を攻撃する
ことがあり、少量でも試験機能と貯蔵安定性の減損にむ
すびつく。
めにさまざまな試みがなされてきた。こうして、例え
ば、種々の炭水化物成分および種々のタンパク質、タン
パク質混合物またはタンパク質画分、ならびにそれらの
加水分解産物はイムノアッセイにおいて試験成分と被検
体との非特異的相互作用を低下させ得ることが知られて
いる (Robertson ら, J. of Immun. Med. 26 (1985) 19
5; EP-A-260 903; US-A-4,931,385)。ところが、このよ
うな炭水化物およびタンパク質成分の使用は、そこに含
まれる成分が試験の際に更なる干渉を引き起こすという
欠点を抱えている。さらに、酵素的に調製された加水分
解産物はその調製の際に使用したプロテアーゼによって
汚染されていることがあり、しかも一般的に加水分解切
断の制御が難しいことから均一な品質のものが得られな
い。この種のプロテアーゼ不純物は試験成分を攻撃する
ことがあり、少量でも試験機能と貯蔵安定性の減損にむ
すびつく。
【０００５】さらに、化学的に修飾されたタンパク質、
特にスクシニル化またはアセチル化タンパク質を使用す
ると非特異的相互作用が減少するとも記載されている
(US-A-5,051,356; EP-A-0 525 916) 。しかし、これら
の物質を用いても血清からの抗体の試験では偽陽性また
は偽陰性の結果の多くを回避できない。
特にスクシニル化またはアセチル化タンパク質を使用す
ると非特異的相互作用が減少するとも記載されている
(US-A-5,051,356; EP-A-0 525 916) 。しかし、これら
の物質を用いても血清からの抗体の試験では偽陽性また
は偽陰性の結果の多くを回避できない。
【０００６】非特異的相互作用を防止するために、最大
平均サイズ０．２μｍの超微細粒子を試験試薬に添加し
て、それらを干渉成分に結合させ、その成分を捕獲させ
る方法も提案された (EP 0 163 312) 。しかし、こうし
た方法は超微細粒子の特別な調製を必要とし、その上、
サンプル中に存在する非特異的因子のタイプが既知でな
ければならない。
平均サイズ０．２μｍの超微細粒子を試験試薬に添加し
て、それらを干渉成分に結合させ、その成分を捕獲させ
る方法も提案された (EP 0 163 312) 。しかし、こうし
た方法は超微細粒子の特別な調製を必要とし、その上、
サンプル中に存在する非特異的因子のタイプが既知でな
ければならない。
【０００７】DE-A-44 07 423およびDE-A-44 34 093に
は、サンプル成分とストレプトアビジン被覆固相との間
の非特異的相互作用により起こる干渉を前反応を用いて
除くことが提案されている。この前反応は、活性なスト
レプトアビジン被覆固相に可能なかぎり類似している
が、サンプル分子が特異的に結合し得ない固相上で有利
に行われる。対照的に、非特異的成分はその不活性固相
に結合するため、除去することができる。
は、サンプル成分とストレプトアビジン被覆固相との間
の非特異的相互作用により起こる干渉を前反応を用いて
除くことが提案されている。この前反応は、活性なスト
レプトアビジン被覆固相に可能なかぎり類似している
が、サンプル分子が特異的に結合し得ない固相上で有利
に行われる。対照的に、非特異的成分はその不活性固相
に結合するため、除去することができる。
【０００８】DE-A-44 07 423によれば、ストレプトアビ
ジンは共有結合による誘導体化または修飾により不活性
化され得る。しかし、これは時間のかかる化学的修飾を
その後に必要とするという欠点がある。さらに、化学的
誘導体化は干渉除去効果を減ずるようなやり方で天然の
ストレプトアビジンの活性中心付近の領域を変化させる
ことがあり、更なる干渉相互作用をまねくことさえあり
うる。ビオチン結合ポケットで起こる非特異的相互作用
による干渉は共有結合修飾によって排除し得ない。
ジンは共有結合による誘導体化または修飾により不活性
化され得る。しかし、これは時間のかかる化学的修飾を
その後に必要とするという欠点がある。さらに、化学的
誘導体化は干渉除去効果を減ずるようなやり方で天然の
ストレプトアビジンの活性中心付近の領域を変化させる
ことがあり、更なる干渉相互作用をまねくことさえあり
うる。ビオチン結合ポケットで起こる非特異的相互作用
による干渉は共有結合修飾によって排除し得ない。
【０００９】アビジン／ストレプトアビジン−ビオチン
系は結合相手間の強い非共有結合親和力(KA 約1015 l/m
ol) のためにいくつかの研究の課題となっている。この
高い結合親和力は主にストレプトアビジンとビオチンの
トリプトファン残基間の相互作用のためであると考えら
れてきた。しかし、ストレプトアビジン変異体のイミノ
ビオチンへの結合親和力の有意な低下はトリプトファン
残基の修飾によって達成できた (Chilkotiら, Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 1754-1758; Sanoおよび
Cantor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 3180-
3184) 。ところが、ビオチンへの結合親和力の低下をは
っきりと実証することはできなかった（Chilkotiら, 同
上, 図１ＡおよびＢ参照）。したがって、このような変
異体は、まだ非常に高い結合親和力が残っていてビオチ
ン化試験成分と特異的に反応し得るので、干渉除去試薬
として使用するのに適していない。
系は結合相手間の強い非共有結合親和力(KA 約1015 l/m
ol) のためにいくつかの研究の課題となっている。この
高い結合親和力は主にストレプトアビジンとビオチンの
トリプトファン残基間の相互作用のためであると考えら
れてきた。しかし、ストレプトアビジン変異体のイミノ
ビオチンへの結合親和力の有意な低下はトリプトファン
残基の修飾によって達成できた (Chilkotiら, Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 1754-1758; Sanoおよび
Cantor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 3180-
3184) 。ところが、ビオチンへの結合親和力の低下をは
っきりと実証することはできなかった（Chilkotiら, 同
上, 図１ＡおよびＢ参照）。したがって、このような変
異体は、まだ非常に高い結合親和力が残っていてビオチ
ン化試験成分と特異的に反応し得るので、干渉除去試薬
として使用するのに適していない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】それゆえ、本発明の課
題は、被検体を測定するための検出法、例えばイムノア
ッセイや核酸ハイブリダイゼーションアッセイでの干渉
の影響を減少させることができる試薬を提供することで
ある。
題は、被検体を測定するための検出法、例えばイムノア
ッセイや核酸ハイブリダイゼーションアッセイでの干渉
の影響を減少させることができる試薬を提供することで
ある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】この課題は、本発明によ
れば、（ａ）天然のポリペプチドと少なくとも１個のア
ミノ酸において異なり、かつ（ｂ）ビオチンへの結合親
和力が1010 l/molより低いことを特徴とする、アビジン
およびストレプトアビジンのミュテインから選ばれるビ
オチンに結合可能なポリペプチドにより達成される。次
の反応：
れば、（ａ）天然のポリペプチドと少なくとも１個のア
ミノ酸において異なり、かつ（ｂ）ビオチンへの結合親
和力が1010 l/molより低いことを特徴とする、アビジン
およびストレプトアビジンのミュテインから選ばれるビ
オチンに結合可能なポリペプチドにより達成される。次
の反応：
【００１２】
【化１】
【００１３】の結合親和力は約1015 l/molである。した
がって、捕捉系として用いられるストレプトアビジン／
ビオチン系はタンパク質とリガンドとの最強の既知の非
共有結合相互作用の一つを提供する。驚いたことに、ス
トレプトアビジンまたはアビジンの１個または数個のア
ミノ酸の置換により、一方では組換え的に生産したとき
復元可能であり、他方ではビオチンへの結合親和力を＜
1010 l/molに低下できるポリペプチドが得られることが
わかった。さらに、本発明によるミュテインは活性ポリ
ペプチドの構造に対応する構造をもつことが好ましい。
本発明のミュテインはその天然ポリペプチドとの免疫学
的交差反応性が高いことが好ましい。さらに、それらは
二量体化または四量体化することができることが望まし
い。意外にも、天然のストレプトアビジンまたはアビジ
ンに似ているミュテインは、ビオチンへの結合親和力が
低下しているにもかかわらず、生物学的サンプル、例え
ば血清、血漿、全血などの体液中に存在しうる干渉性の
サンプル成分と結合することができる。
がって、捕捉系として用いられるストレプトアビジン／
ビオチン系はタンパク質とリガンドとの最強の既知の非
共有結合相互作用の一つを提供する。驚いたことに、ス
トレプトアビジンまたはアビジンの１個または数個のア
ミノ酸の置換により、一方では組換え的に生産したとき
復元可能であり、他方ではビオチンへの結合親和力を＜
1010 l/molに低下できるポリペプチドが得られることが
わかった。さらに、本発明によるミュテインは活性ポリ
ペプチドの構造に対応する構造をもつことが好ましい。
本発明のミュテインはその天然ポリペプチドとの免疫学
的交差反応性が高いことが好ましい。さらに、それらは
二量体化または四量体化することができることが望まし
い。意外にも、天然のストレプトアビジンまたはアビジ
ンに似ているミュテインは、ビオチンへの結合親和力が
低下しているにもかかわらず、生物学的サンプル、例え
ば血清、血漿、全血などの体液中に存在しうる干渉性の
サンプル成分と結合することができる。
【００１４】本発明のミュテインは、その特殊な性質ゆ
えに、さまざまな用途に使用することができる。結合親
和力の低下はビオチンとミュテインとの相互作用を低下
させることと同義である。本発明のミュテインは、それ
がいかなる状況下でもビオチンに結合しないか、または
比較的ゆるい可逆的結合が存在するようにデザインされ
る。ミュテインの空間構造は好ましくは天然のポリペプ
チドと比べて著しく変化するものではないので、他の物
質との相互作用に影響を与えない。このようにして、ビ
オチンへの結合能が改変されたことを除いて、その空間
構造とその結合特性の点で天然のストレプトアビジンま
たはアビジンに対応する試薬が得られる。
えに、さまざまな用途に使用することができる。結合親
和力の低下はビオチンとミュテインとの相互作用を低下
させることと同義である。本発明のミュテインは、それ
がいかなる状況下でもビオチンに結合しないか、または
比較的ゆるい可逆的結合が存在するようにデザインされ
る。ミュテインの空間構造は好ましくは天然のポリペプ
チドと比べて著しく変化するものではないので、他の物
質との相互作用に影響を与えない。このようにして、ビ
オチンへの結合能が改変されたことを除いて、その空間
構造とその結合特性の点で天然のストレプトアビジンま
たはアビジンに対応する試薬が得られる。
【００１５】一般には試験サンプルとして水性サンプル
が用いられる。特に、生物学的サンプル、例えば全血、
血漿、血清、唾液、組織液、髄液または尿のような体液
が用いられる。
が用いられる。特に、生物学的サンプル、例えば全血、
血漿、血清、唾液、組織液、髄液または尿のような体液
が用いられる。
【００１６】突然変異誘発による各種アミノ酸の置換は
明確に規定されたミュテイン生産を可能にする。例えば
化学的誘導体化のようなストレプトアビジンの他の修飾
とは対照的に、本発明によるミュテインの構造は保持さ
れる。こうして、追加的に導入される誘導体化試薬と試
験すべきサンプルの諸成分との間の干渉相互作用は全く
起こり得ない。
明確に規定されたミュテイン生産を可能にする。例えば
化学的誘導体化のようなストレプトアビジンの他の修飾
とは対照的に、本発明によるミュテインの構造は保持さ
れる。こうして、追加的に導入される誘導体化試薬と試
験すべきサンプルの諸成分との間の干渉相互作用は全く
起こり得ない。
【００１７】本発明のミュテインのビオチンへの結合親
和力は好ましくは＜109 l/mol 、より好ましくは＜108
l/mol 、さらに好ましくは＜107 l/mol 、特に好ましく
は＜106 l/mol 、最も好ましくは＜105 l/mol である。
和力は好ましくは＜109 l/mol 、より好ましくは＜108
l/mol 、さらに好ましくは＜107 l/mol 、特に好ましく
は＜106 l/mol 、最も好ましくは＜105 l/mol である。
【００１８】本発明によるストレプトアビジンまたはア
ビジンのミュテインは、BIAcore 表面のようなセンサー
チップ表面の上に固定されるとき再生され得ることが好
ましい。
ビジンのミュテインは、BIAcore 表面のようなセンサー
チップ表面の上に固定されるとき再生され得ることが好
ましい。
【００１９】ストレプトアビジンのミュテインの場合
は、位置 Leu25、Ser27 、Tyr43 、Ser45 、Val47 、Gl
y48 、Ser88 、Thr90 、Leu110および／またはAsp128の
１個または数個のアミノ酸を別のアミノ酸で置換するこ
とが好ましい。ビオチンへの結合能は、小さな残基をも
つアミノ酸をより大きな残基をもつアミノ酸で置換する
ことにより、例えばLeu またはSer をTrp 、Arg 、Tyr
、Phe またはHis で置換することにより低下させるこ
とができる。さらに、ビオチン結合能は、ビオチン結合
ポケットの接近可能性を少なくするジスルフィド橋を追
加的に導入することによっても低下させたり、ブロック
したりできる。追加のジスルフィド橋は例えば２個のア
ミノ酸を正確な空間的間隔の２個のシステインで置換す
ることにより形成できる。また、追加のイオン相互作用
によってもビオチン結合能を低下させることが可能であ
る。そのために、例えばAsp128とのイオン相互作用を形
成するArg またはLys のような陽電荷をもつアミノ酸を
導入することができる。一方、互いと塩橋を形成してビ
オチン結合ポケットをブロックし得る陽電荷および陰電
荷をもつアミノ酸を導入することも可能である。小型の
アミノ酸および表面にあるアミノ酸、例えばLeu25 、Se
r27 、Ser45 および／またはLeu110をArg 、Trp、Tyr
、Phe 、His などの比較的嵩高なアミノ酸で置換する
ことが好ましい。
は、位置 Leu25、Ser27 、Tyr43 、Ser45 、Val47 、Gl
y48 、Ser88 、Thr90 、Leu110および／またはAsp128の
１個または数個のアミノ酸を別のアミノ酸で置換するこ
とが好ましい。ビオチンへの結合能は、小さな残基をも
つアミノ酸をより大きな残基をもつアミノ酸で置換する
ことにより、例えばLeu またはSer をTrp 、Arg 、Tyr
、Phe またはHis で置換することにより低下させるこ
とができる。さらに、ビオチン結合能は、ビオチン結合
ポケットの接近可能性を少なくするジスルフィド橋を追
加的に導入することによっても低下させたり、ブロック
したりできる。追加のジスルフィド橋は例えば２個のア
ミノ酸を正確な空間的間隔の２個のシステインで置換す
ることにより形成できる。また、追加のイオン相互作用
によってもビオチン結合能を低下させることが可能であ
る。そのために、例えばAsp128とのイオン相互作用を形
成するArg またはLys のような陽電荷をもつアミノ酸を
導入することができる。一方、互いと塩橋を形成してビ
オチン結合ポケットをブロックし得る陽電荷および陰電
荷をもつアミノ酸を導入することも可能である。小型の
アミノ酸および表面にあるアミノ酸、例えばLeu25 、Se
r27 、Ser45 および／またはLeu110をArg 、Trp、Tyr
、Phe 、His などの比較的嵩高なアミノ酸で置換する
ことが好ましい。
【００２０】所望の結合親和力を得るためには、少なく
とも２つのアミノ酸が置換されたストレプトアビジンま
たはアビジンのミュテインを形成することも考えられ
る。ストレプトアビジンの場合には、アミノ酸 Leu25、
Ser27 、Ser45 およびLeu110のうちの少なくとも２つ、
例えばアミノ酸対 Leu25とSer45 、Ser27 とSer45 、ま
たはSer45 とLeu110を、適当なアミノ酸、特にArg 、Tr
p 、Tyr 、Phe 、His などの比較的嵩高なアミノ酸で置
換することが好ましい。とりわけ、Leu25 をTrpで、Ser
45 をArg でそれぞれ置換するか、Ser27 をArg で、Ser
45 をArg でそれぞれ置換するか、Ser45 をTrp で、Leu
110をTrp でそれぞれ置換するか、あるいはSer45 をTyr
で、Leu110をTrp でそれぞれ置換することが好適であ
る。
とも２つのアミノ酸が置換されたストレプトアビジンま
たはアビジンのミュテインを形成することも考えられ
る。ストレプトアビジンの場合には、アミノ酸 Leu25、
Ser27 、Ser45 およびLeu110のうちの少なくとも２つ、
例えばアミノ酸対 Leu25とSer45 、Ser27 とSer45 、ま
たはSer45 とLeu110を、適当なアミノ酸、特にArg 、Tr
p 、Tyr 、Phe 、His などの比較的嵩高なアミノ酸で置
換することが好ましい。とりわけ、Leu25 をTrpで、Ser
45 をArg でそれぞれ置換するか、Ser27 をArg で、Ser
45 をArg でそれぞれ置換するか、Ser45 をTrp で、Leu
110をTrp でそれぞれ置換するか、あるいはSer45 をTyr
で、Leu110をTrp でそれぞれ置換することが好適であ
る。
【００２１】ストレプトアビジンまたはアビジンの場合
には２個より多いアミノ酸の置換も本発明によるミュテ
インをもたらす。このようなストレプトアビジンの多重
変異体においては、好ましくはアミノ酸 Leu25、Ser27
、Ser45 およびLeu110のうちの少なくとも３つが上記
のような比較的嵩高なアミノ酸で置換されることが有利
である。３重組合せ変異体の特定例では、Leu25 がTrp
で、Ser45 がTrp で、Leu110がTrp でそれぞれ置換され
るか、またはLeu25 がTrp で、Ser45 がTyr で、Leu110
がTrp でそれぞれ置換された。
には２個より多いアミノ酸の置換も本発明によるミュテ
インをもたらす。このようなストレプトアビジンの多重
変異体においては、好ましくはアミノ酸 Leu25、Ser27
、Ser45 およびLeu110のうちの少なくとも３つが上記
のような比較的嵩高なアミノ酸で置換されることが有利
である。３重組合せ変異体の特定例では、Leu25 がTrp
で、Ser45 がTrp で、Leu110がTrp でそれぞれ置換され
るか、またはLeu25 がTrp で、Ser45 がTyr で、Leu110
がTrp でそれぞれ置換された。
【００２２】別の好適な多重組合せ変異体においては、
アミノ酸 Leu25、Ser27 、Ser45 およびLeu110のうちの
少なくとも２つと、さらにTrp120に突然変異を起こさせ
る。このような３重組合せ変異体の特定例は、Ser27 の
Arg による置換、Ser45 のArg による置換、Trp120のAl
a による置換を含む。
アミノ酸 Leu25、Ser27 、Ser45 およびLeu110のうちの
少なくとも２つと、さらにTrp120に突然変異を起こさせ
る。このような３重組合せ変異体の特定例は、Ser27 の
Arg による置換、Ser45 のArg による置換、Trp120のAl
a による置換を含む。
【００２３】アビジンのミュテインの場合には、好まし
くは位置 Leu14、Ser16 、Tyr33 、Thr35 、Val37 、Th
r38 、Ser75 、Thr77 、Leu99 およびIle117のうちの１
個または数個のアミノ酸が置換される。アミノ酸の置換
は位置 Leu14、Ser16 、Thr35 および／またはLeu99 で
行うのが特に好適である。これらのアミノ酸はArg 、Tr
p 、Tyr 、Phe 、His などの比較的嵩高なアミノ酸で置
換することが好ましい。ストレプトアビジンについて記
述した他の置換可能性がアビジンについてもあてはま
る。
くは位置 Leu14、Ser16 、Tyr33 、Thr35 、Val37 、Th
r38 、Ser75 、Thr77 、Leu99 およびIle117のうちの１
個または数個のアミノ酸が置換される。アミノ酸の置換
は位置 Leu14、Ser16 、Thr35 および／またはLeu99 で
行うのが特に好適である。これらのアミノ酸はArg 、Tr
p 、Tyr 、Phe 、His などの比較的嵩高なアミノ酸で置
換することが好ましい。ストレプトアビジンについて記
述した他の置換可能性がアビジンについてもあてはま
る。
【００２４】天然のストレプトアビジンをコードするＤ
ＮＡ配列は配列番号１に示してある。そのタンパク質配
列は配列番号２に示してある。記載したアミノ酸の番号
はこの配列に関係する。天然のアビジンの核酸配列は配
列番号３に示してある。配列番号４はアビジンのアミノ
酸配列を示す。アミノ酸はこの配列にしたがって番号付
けされる。
ＮＡ配列は配列番号１に示してある。そのタンパク質配
列は配列番号２に示してある。記載したアミノ酸の番号
はこの配列に関係する。天然のアビジンの核酸配列は配
列番号３に示してある。配列番号４はアビジンのアミノ
酸配列を示す。アミノ酸はこの配列にしたがって番号付
けされる。
【００２５】本発明によれば、アビジンおよびストレプ
トアビジン変異体（変異体の形でビオチンに結合可能）
のミュテインをつくることも可能である。本発明によれ
ば、短縮されたストレプトアビジンのミュテイン（組換
えコア・ストレプトアビジン）が好適である。このコア
・ストレプトアビジンは好ましくは配列番号１５に示す
ヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号１６に
示すアミノ酸配列を有する。このコア・ストレプトアビ
ジンの製造はWO 93/09144 に記載されている。コア・ス
トレプトアビジンの好適なミュテインは、天然のストレ
プトアビジンに関して上述したような変異を含むもので
ある。
トアビジン変異体（変異体の形でビオチンに結合可能）
のミュテインをつくることも可能である。本発明によれ
ば、短縮されたストレプトアビジンのミュテイン（組換
えコア・ストレプトアビジン）が好適である。このコア
・ストレプトアビジンは好ましくは配列番号１５に示す
ヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号１６に
示すアミノ酸配列を有する。このコア・ストレプトアビ
ジンの製造はWO 93/09144 に記載されている。コア・ス
トレプトアビジンの好適なミュテインは、天然のストレ
プトアビジンに関して上述したような変異を含むもので
ある。
【００２６】本発明の更なる主題は、ストレプトアビジ
ンまたはアビジンのミュテインをコードする核酸であ
る。この核酸は例えば配列番号１、配列番号３または配
列番号１５に示す核酸の部位特異的in vitro突然変異誘
発によりつくることができる。本発明による核酸は、原
核生物のプラスミド（好ましくは大腸菌内で複製可能な
プラスミド）のようなベクター上に位置づけられる。好
ましくは、この核酸はそれぞれの宿主生物内での発現を
可能にするプロモーターに機能的に連結した状態でベク
ター上に位置づけられる。
ンまたはアビジンのミュテインをコードする核酸であ
る。この核酸は例えば配列番号１、配列番号３または配
列番号１５に示す核酸の部位特異的in vitro突然変異誘
発によりつくることができる。本発明による核酸は、原
核生物のプラスミド（好ましくは大腸菌内で複製可能な
プラスミド）のようなベクター上に位置づけられる。好
ましくは、この核酸はそれぞれの宿主生物内での発現を
可能にするプロモーターに機能的に連結した状態でベク
ター上に位置づけられる。
【００２７】本発明のさらに別の主題は、アビジンまた
はストレプトアビジンミュテインの遺伝子を含むベクタ
ーで形質転換された細胞である。この細胞は原核細胞で
あることが好ましく、特に大腸菌細胞のようなグラム陰
性細菌細胞である。
はストレプトアビジンミュテインの遺伝子を含むベクタ
ーで形質転換された細胞である。この細胞は原核細胞で
あることが好ましく、特に大腸菌細胞のようなグラム陰
性細菌細胞である。
【００２８】ミュテインは適当な宿主細胞、特に大腸菌
のような原核宿主細胞による組換え発現により産生され
ることが好ましい。その場合、ミュテインは通常不活性
な封入体(inclusion body)の形で産生されるが、これは
適当な条件下で復元させることができる。
のような原核宿主細胞による組換え発現により産生され
ることが好ましい。その場合、ミュテインは通常不活性
な封入体(inclusion body)の形で産生されるが、これは
適当な条件下で復元させることができる。
【００２９】ミュテインは復元および精製後にそれ以上
の処理を行うことなく可溶性形態でまたは固相上に固定
化した後で干渉除去試薬として使用する。さらに、ミュ
テインは可溶性のまたは固定化されたポリマーコンジュ
ゲートの形でも用いられる。このようなポリマーコンジ
ュゲートは数個のミュテイン分子の化学的カップリング
により、またはポリペプチド、タンパク質、炭水化物な
どの他の巨大分子とのカップリングにより製造できる。
の処理を行うことなく可溶性形態でまたは固相上に固定
化した後で干渉除去試薬として使用する。さらに、ミュ
テインは可溶性のまたは固定化されたポリマーコンジュ
ゲートの形でも用いられる。このようなポリマーコンジ
ュゲートは数個のミュテイン分子の化学的カップリング
により、またはポリペプチド、タンパク質、炭水化物な
どの他の巨大分子とのカップリングにより製造できる。
【００３０】ミュテインと他のポリペプチドまたはタン
パク質とのコンジュゲートが好適である。特に好ましい
ものはアルブミン、例えばウシ血清アルブミンとのコン
ジュゲートである。ミュテインと場合により他の巨大分
子とのポリマーコンジュゲートの製造は公知の方法にし
たがって行うことができる（例えばEP-A-0 269 092参
照）。
パク質とのコンジュゲートが好適である。特に好ましい
ものはアルブミン、例えばウシ血清アルブミンとのコン
ジュゲートである。ミュテインと場合により他の巨大分
子とのポリマーコンジュゲートの製造は公知の方法にし
たがって行うことができる（例えばEP-A-0 269 092参
照）。
【００３１】さらに、本発明は、試験成分としてストレ
プトアビジン／アビジン−ビオチン結合対を含む被検体
アッセイのための干渉除去試薬としての上記ミュテイン
の使用に関する。この場合、ミュテインは可溶性および
／または固定化形態で用いられる。一実施態様では、イ
ムノアッセイやハイブリダイゼーションアッセイなどの
不均一系アッセイにおいて非修飾ストレプトアビジン／
アビジン固相とともにミュテインを用いる。その場合
は、可溶性および／または固定化形態で、例えば別の固
相形態で、ミュテインを試験混合物に添加することがで
きる。
プトアビジン／アビジン−ビオチン結合対を含む被検体
アッセイのための干渉除去試薬としての上記ミュテイン
の使用に関する。この場合、ミュテインは可溶性および
／または固定化形態で用いられる。一実施態様では、イ
ムノアッセイやハイブリダイゼーションアッセイなどの
不均一系アッセイにおいて非修飾ストレプトアビジン／
アビジン固相とともにミュテインを用いる。その場合
は、可溶性および／または固定化形態で、例えば別の固
相形態で、ミュテインを試験混合物に添加することがで
きる。
【００３２】試験は一段階法または二段階法として行う
ことができ、すなわち、測定すべきサンプルをミュテイ
ンおよび非修飾ストレプトアビジン／アビジンと同時に
または別々の反応段階で接触させることができる。
ことができ、すなわち、測定すべきサンプルをミュテイ
ンおよび非修飾ストレプトアビジン／アビジンと同時に
または別々の反応段階で接触させることができる。
【００３３】さらに、本発明によるミュテインは均一系
アッセイや凝集アッセイなどの他の試験フォーマットに
おいても、ストレプトアビジン／アビジン−ビオチン結
合対が試験成分として存在するという条件で使用するこ
とができる。これに関連して、「ビオチン」なる用語
は、その遊離形態ばかりでなく、ビオチン化された核
酸、炭水化物、脂質、ペプチド、ポリペプチドなどのビ
オチン化物質の形態のビオチンを包含するものである。
さらに、この用語はビオチン類似体およびビオチン誘導
体、例えばイミノビオチン、デスチオビオチン、ストレ
プトアビジン親和性ペプチドなどをも包含する。
アッセイや凝集アッセイなどの他の試験フォーマットに
おいても、ストレプトアビジン／アビジン−ビオチン結
合対が試験成分として存在するという条件で使用するこ
とができる。これに関連して、「ビオチン」なる用語
は、その遊離形態ばかりでなく、ビオチン化された核
酸、炭水化物、脂質、ペプチド、ポリペプチドなどのビ
オチン化物質の形態のビオチンを包含するものである。
さらに、この用語はビオチン類似体およびビオチン誘導
体、例えばイミノビオチン、デスチオビオチン、ストレ
プトアビジン親和性ペプチドなどをも包含する。
【００３４】本発明の更なる主題は、被検体の測定方法
において非特異的相互作用を低下および／または防止す
るための、上記ミュテインの１種または数種を含む干渉
除去試薬である。この干渉除去試薬は可溶性形態で存在
しても、固相上に、好ましくは膜、マイクロタイタープ
レート、微小試薬容器または微小ビーズ上に固定化され
てもよい。アッセイ成分と非特異的に相互作用する物質
は干渉除去試薬によって捕獲されるので、試験の感度が
高まる。この干渉除去試薬は、修飾されていないアビジ
ンまたはストレプトアビジンと比べて、干渉性成分に対
して本質的に変わることのない結合能を有し、その結果
試験サンプルの干渉性成分が効果的に捕獲される。しか
しながら、天然のアビジンまたはストレプトアビジンと
対照的に、干渉除去試薬はビオチンへの親和力が試験に
とって実際上無視できるもので、このことが試験サンプ
ル中の被検体の検出に有意な影響を与えない理由であ
る。
において非特異的相互作用を低下および／または防止す
るための、上記ミュテインの１種または数種を含む干渉
除去試薬である。この干渉除去試薬は可溶性形態で存在
しても、固相上に、好ましくは膜、マイクロタイタープ
レート、微小試薬容器または微小ビーズ上に固定化され
てもよい。アッセイ成分と非特異的に相互作用する物質
は干渉除去試薬によって捕獲されるので、試験の感度が
高まる。この干渉除去試薬は、修飾されていないアビジ
ンまたはストレプトアビジンと比べて、干渉性成分に対
して本質的に変わることのない結合能を有し、その結果
試験サンプルの干渉性成分が効果的に捕獲される。しか
しながら、天然のアビジンまたはストレプトアビジンと
対照的に、干渉除去試薬はビオチンへの親和力が試験に
とって実際上無視できるもので、このことが試験サンプ
ル中の被検体の検出に有意な影響を与えない理由であ
る。
【００３５】本発明の更なる主題は、ビオチンへの結合
親和力が1010 l/molより低いストレプトアビジンまたは
アビジンのミュテインを干渉除去試薬として添加するこ
とを特徴とする、ストレプトアビジン／アビジン−ビオ
チンの特異的結合対の使用を含んでなる試験サンプル中
の被検体の定性および／または定量検出法である。
親和力が1010 l/molより低いストレプトアビジンまたは
アビジンのミュテインを干渉除去試薬として添加するこ
とを特徴とする、ストレプトアビジン／アビジン−ビオ
チンの特異的結合対の使用を含んでなる試験サンプル中
の被検体の定性および／または定量検出法である。
【００３６】本発明の一実施態様において、この方法は
不均一系のアッセイであり、該アッセイでは被検体が固
相への結合によって測定され、ストレプトアビジン／ア
ビジン−ビオチンの結合対がこの固相結合に関与する。
不均一系のアッセイであり、該アッセイでは被検体が固
相への結合によって測定され、ストレプトアビジン／ア
ビジン−ビオチンの結合対がこの固相結合に関与する。
【００３７】この試験フォーマットの好適な実施態様で
は、ストレプトアビジンをコーティングした固相が用い
られ、これにビオチン化試験成分を結合させる。こうし
た試験フォーマットでは、本発明による干渉除去試薬を
可溶性および／または固定化形態で添加することができ
る。固定化される干渉除去試薬は別の不活性固相の形で
添加することが好ましく、その際、試験サンプルを最初
に不活性固相とのみ接触させ、その後に活性固相と接触
させるか、または活性固相と不活性固相に同時に接触さ
せる。可溶性の干渉除去試薬を用いる場合は、干渉除去
試薬を他のすべての試験成分と一緒にサンプル液中に存
在させる一段階法を採用することが好ましい。
は、ストレプトアビジンをコーティングした固相が用い
られ、これにビオチン化試験成分を結合させる。こうし
た試験フォーマットでは、本発明による干渉除去試薬を
可溶性および／または固定化形態で添加することができ
る。固定化される干渉除去試薬は別の不活性固相の形で
添加することが好ましく、その際、試験サンプルを最初
に不活性固相とのみ接触させ、その後に活性固相と接触
させるか、または活性固相と不活性固相に同時に接触さ
せる。可溶性の干渉除去試薬を用いる場合は、干渉除去
試薬を他のすべての試験成分と一緒にサンプル液中に存
在させる一段階法を採用することが好ましい。
【００３８】また、干渉除去試薬は、試験成分としてビ
オチン化固相と可溶性のストレプトアビジン／アビジン
を用いる場合にも、例えば可溶性形態でまたは別の不活
性固相の形でうまく使用することができる。
オチン化固相と可溶性のストレプトアビジン／アビジン
を用いる場合にも、例えば可溶性形態でまたは別の不活
性固相の形でうまく使用することができる。
【００３９】本発明の方法では、被検体を間接または直
接標識によって公知の方法で検出できる。検出を行うに
は直接標識された検出試薬を使用して、この検出試薬が
例えば被検体と結合して標識をもつ検出可能な複合体を
形成するように、または特異的結合部位で被検体と競合
的に結合するようにする。間接標識をもつ検出試薬には
いくつかの成分が含まれ、被検体と結合する成分は標識
されておらず、標識をもつ別の成分に結合可能である。
接標識によって公知の方法で検出できる。検出を行うに
は直接標識された検出試薬を使用して、この検出試薬が
例えば被検体と結合して標識をもつ検出可能な複合体を
形成するように、または特異的結合部位で被検体と競合
的に結合するようにする。間接標識をもつ検出試薬には
いくつかの成分が含まれ、被検体と結合する成分は標識
されておらず、標識をもつ別の成分に結合可能である。
【００４０】適当な標識は当業者に公知である。例え
ば、放射性標識、化学発光、蛍光もしくは電気化学発光
標識、金属ゾル粒子のような着色粒子、着色もしくは未
着色のラテックスを用いることができる。また、標識は
酵素標識のように間接シグナルをもたらすものでもよ
く、かかる酵素としてはペルオキシダーゼ、β−ガラク
トシダーゼ、アルカリホスファターゼなどがある。
ば、放射性標識、化学発光、蛍光もしくは電気化学発光
標識、金属ゾル粒子のような着色粒子、着色もしくは未
着色のラテックスを用いることができる。また、標識は
酵素標識のように間接シグナルをもたらすものでもよ
く、かかる酵素としてはペルオキシダーゼ、β−ガラク
トシダーゼ、アルカリホスファターゼなどがある。
【００４１】本発明の更なる主題は、ビオチンに結合可
能なポリペプチドと各アッセイの他の成分、および本発
明によるミュテインからなる干渉除去試薬を含有するこ
とを特徴とする、試験サンプル中の被検体の定性および
／または定量検出のための試験キットである。干渉除去
試薬は可溶性形態で存在しても、固相上に、特にマイク
ロタイタープレート、微小試薬容器、膜または微小ビー
ズに固定された状態で存在してもよい。
能なポリペプチドと各アッセイの他の成分、および本発
明によるミュテインからなる干渉除去試薬を含有するこ
とを特徴とする、試験サンプル中の被検体の定性および
／または定量検出のための試験キットである。干渉除去
試薬は可溶性形態で存在しても、固相上に、特にマイク
ロタイタープレート、微小試薬容器、膜または微小ビー
ズに固定された状態で存在してもよい。
【００４２】本発明の更なる主題は、天然のポリペプチ
ドの少なくとも１個のアミノ酸が置換されており、かつ
ビオチンへの結合親和力が 105〜1011 l/molの範囲であ
るアビジンおよびストレプトアビジンのミュテインの、
ビオチン化物質との結合に関して再生可能なシステムと
しての使用である。ビオチンへの結合親和力が 105〜10
10 l/molの範囲、特に 105〜108 l/mol であるミュテイ
ンが好適である。
ドの少なくとも１個のアミノ酸が置換されており、かつ
ビオチンへの結合親和力が 105〜1011 l/molの範囲であ
るアビジンおよびストレプトアビジンのミュテインの、
ビオチン化物質との結合に関して再生可能なシステムと
しての使用である。ビオチンへの結合親和力が 105〜10
10 l/molの範囲、特に 105〜108 l/mol であるミュテイ
ンが好適である。
【００４３】ビオチン化物質との結合に関して再生可能
なシステムは、ストレプトアビジンのミュテインが固定
化されている固相を含むことが好ましい。適当な固相の
例としてはセンサーチップ（例えば、Kabi Pharmacia C
o.のBiacore システム）、ポリスチレンチューブやキュ
ベットなどの反応容器、マイクロタイタープレート、微
小ビーズ、ラテックス粒子、アフィニティカラム用の担
体材料がある。「ビオチン化物質」は特にビオチンおよ
びビオチン類似体のコンジュゲートとして理解され、ビ
オチン類似体は（天然の）ストレプトアビジンまたはア
ビジンのビオチン結合ポケットと複合体を形成する物
質、例えばイミノビオチン、デスチオビオチンおよびス
トレプトアビジン親和性ペプチドである。
なシステムは、ストレプトアビジンのミュテインが固定
化されている固相を含むことが好ましい。適当な固相の
例としてはセンサーチップ（例えば、Kabi Pharmacia C
o.のBiacore システム）、ポリスチレンチューブやキュ
ベットなどの反応容器、マイクロタイタープレート、微
小ビーズ、ラテックス粒子、アフィニティカラム用の担
体材料がある。「ビオチン化物質」は特にビオチンおよ
びビオチン類似体のコンジュゲートとして理解され、ビ
オチン類似体は（天然の）ストレプトアビジンまたはア
ビジンのビオチン結合ポケットと複合体を形成する物
質、例えばイミノビオチン、デスチオビオチンおよびス
トレプトアビジン親和性ペプチドである。
【００４４】天然のストレプトアビジン／アビジンをコ
ーティングした固相と比べたときの本発明の再生可能な
固相の利点は、その固相を被検体のアッセイに、受容体
−リガンド相互作用の研究に、またはビオチン化物質の
精製もしくは分析に使用できるように、それらがビオチ
ン（遊離のビオチンまたはビオチン化物質の形）に対し
て十分に高い結合親和力を有する一方で、ビオチンまた
はビオチン化物質への固相の結合親和力が固相の再生を
可能とするに十分なほど低い、すなわちビオチンを脱離
可能であるということである。この脱離を行わせるに
は、ｐＨ値をｐＨ＜４．５に低下させたり、カオトロピ
ック物質、すなわち水素橋の形成を妨げる物質を添加し
たりすることが好ましい。また、ビオチン化物質を単離
するための脱離は、遊離のビオチンおよび／またはビオ
チン類似体を添加することによっても実施できる。勾配
溶離が特に好ましい。
ーティングした固相と比べたときの本発明の再生可能な
固相の利点は、その固相を被検体のアッセイに、受容体
−リガンド相互作用の研究に、またはビオチン化物質の
精製もしくは分析に使用できるように、それらがビオチ
ン（遊離のビオチンまたはビオチン化物質の形）に対し
て十分に高い結合親和力を有する一方で、ビオチンまた
はビオチン化物質への固相の結合親和力が固相の再生を
可能とするに十分なほど低い、すなわちビオチンを脱離
可能であるということである。この脱離を行わせるに
は、ｐＨ値をｐＨ＜４．５に低下させたり、カオトロピ
ック物質、すなわち水素橋の形成を妨げる物質を添加し
たりすることが好ましい。また、ビオチン化物質を単離
するための脱離は、遊離のビオチンおよび／またはビオ
チン類似体を添加することによっても実施できる。勾配
溶離が特に好ましい。
【００４５】好適な実施態様では、再生可能な固相はア
フィニティーマトリックスとして使用される。このアフ
ィニティーマトリックスを用いると、ビオチン化抗体の
ようなビオチン化物質を精製したり、分子あたりに結合
されたビオチン残基の数に基づいてこのような物質を分
離できる。未修飾のストレプトアビジンまたはアビジン
をマトリックスとして用いる場合は、マトリックスと接
触させた物質を放出させることはその高い結合親和力ゆ
えに事実上不可能である。当技術分野では、尿素で処理
してアビジンをそのモノマーに変換するか、または結合
親和力を低下させるためにビオチンの代わりにイミノビ
オチンを使うかによってこの問題を解決しようとしてき
た。しかし、こうした方法は時間がかかり、また別の問
題を生起させる。本発明によるミュテインを用いると、
可逆的な結合が可能なため被検体を回収し得るビオチン
結合親和力を有するアフィニティーマトリックスをつく
ることができる。
フィニティーマトリックスとして使用される。このアフ
ィニティーマトリックスを用いると、ビオチン化抗体の
ようなビオチン化物質を精製したり、分子あたりに結合
されたビオチン残基の数に基づいてこのような物質を分
離できる。未修飾のストレプトアビジンまたはアビジン
をマトリックスとして用いる場合は、マトリックスと接
触させた物質を放出させることはその高い結合親和力ゆ
えに事実上不可能である。当技術分野では、尿素で処理
してアビジンをそのモノマーに変換するか、または結合
親和力を低下させるためにビオチンの代わりにイミノビ
オチンを使うかによってこの問題を解決しようとしてき
た。しかし、こうした方法は時間がかかり、また別の問
題を生起させる。本発明によるミュテインを用いると、
可逆的な結合が可能なため被検体を回収し得るビオチン
結合親和力を有するアフィニティーマトリックスをつく
ることができる。
【００４６】さらに、受容体−リガンド相互作用を測定
するために本発明にしたがって再生し得る固相を、例え
ば被覆センサーチップとして、使用することが好適であ
る。この表面への分子の結合は例えば表面プラズモン共
鳴スペクトロスコピーにより試験することができる。
するために本発明にしたがって再生し得る固相を、例え
ば被覆センサーチップとして、使用することが好適であ
る。この表面への分子の結合は例えば表面プラズモン共
鳴スペクトロスコピーにより試験することができる。
【００４７】本明細書中に記載したプラスミドおよび微
生物は、ブダペスト条約の規定にしたがって Mascherod
erweg 1B, D-30300 Braunschweig所在の "Deutsche Sam
mlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH"
(DSM)に下記の受託番号で寄託された。 大腸菌 K12RM82： DSM 5445 1991年10月２日 pUBS500 ： DSM 6720 1991年９月20日
生物は、ブダペスト条約の規定にしたがって Mascherod
erweg 1B, D-30300 Braunschweig所在の "Deutsche Sam
mlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH"
(DSM)に下記の受託番号で寄託された。 大腸菌 K12RM82： DSM 5445 1991年10月２日 pUBS500 ： DSM 6720 1991年９月20日
【００４８】配列表において、配列番号１は、シグナル
ペプチドをコードする配列を含むストレプトアビジンを
コードするヌクレオチド配列を示す。配列番号２は、シ
グナルペプチドを含むストレプトアビジンのアミノ酸配
列を示す。配列番号３は、シグナルペプチドをコードす
る配列を含むアビジンをコードするヌクレオチド配列を
示す。配列番号４は、シグナルペプチドを含むアビジン
のアミノ酸配列を示す。配列番号５は、プライマーＮ１
のヌクレオチド配列を示す。配列番号６は、プライマー
Ｎ２のヌクレオチド配列を示す。配列番号７は、プライ
マーＮ３のヌクレオチド配列を示す。配列番号８は、プ
ライマーＮ４のヌクレオチド配列を示す。配列番号９
は、プライマーＮ５のヌクレオチド配列を示す。配列番
号１０は、プライマーＮ６のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１１は、プライマーＮ７のヌクレオチド配列を
示す。配列番号１２は、プライマーＮ８のヌクレオチド
配列を示す。配列番号１３は、プライマーＮ９のヌクレ
オチド配列を示す。配列番号１４は、プライマーＮ１０
のヌクレオチド配列を示す。配列番号１５は、WO 93/09
144 によるコア・ストレプトアビジンをコードするヌク
レオチド配列を示す。配列番号１６は、コア・ストレプ
トアビジンのアミノ酸配列を示す。本発明を以下の実施
例により詳細に説明することにする。
ペプチドをコードする配列を含むストレプトアビジンを
コードするヌクレオチド配列を示す。配列番号２は、シ
グナルペプチドを含むストレプトアビジンのアミノ酸配
列を示す。配列番号３は、シグナルペプチドをコードす
る配列を含むアビジンをコードするヌクレオチド配列を
示す。配列番号４は、シグナルペプチドを含むアビジン
のアミノ酸配列を示す。配列番号５は、プライマーＮ１
のヌクレオチド配列を示す。配列番号６は、プライマー
Ｎ２のヌクレオチド配列を示す。配列番号７は、プライ
マーＮ３のヌクレオチド配列を示す。配列番号８は、プ
ライマーＮ４のヌクレオチド配列を示す。配列番号９
は、プライマーＮ５のヌクレオチド配列を示す。配列番
号１０は、プライマーＮ６のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１１は、プライマーＮ７のヌクレオチド配列を
示す。配列番号１２は、プライマーＮ８のヌクレオチド
配列を示す。配列番号１３は、プライマーＮ９のヌクレ
オチド配列を示す。配列番号１４は、プライマーＮ１０
のヌクレオチド配列を示す。配列番号１５は、WO 93/09
144 によるコア・ストレプトアビジンをコードするヌク
レオチド配列を示す。配列番号１６は、コア・ストレプ
トアビジンのアミノ酸配列を示す。本発明を以下の実施
例により詳細に説明することにする。
【００４９】
【実施例】実施例１ コア・ストレプトアビジン変異体遺伝子の構築 プラスミド pSAM-COREをWO 93/09144 にしたがって作製
した。導入すべき変異の上流と下流のＤＮＡ領域を、pS
AM-CORE 発現ベクター中の隣接する単一の制限エンドヌ
クレアーゼ開裂部位まで取り出して、所望の変異をもつ
化学合成した対応ＤＮＡセグメント（ＤＮＡアダプタ
ー）と置き換えた。この場合のＤＮＡの操作は、Sambro
okら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbo
r, New York, 1989 に記載されるような標準方法を用い
て実施した。用いた分子生物学的試薬類は製造業者の説
明書にしたがって使用した。融合タンパク質およびペプ
チドのタンパク質濃度は、アミノ酸配列によって計算さ
れたモル吸光係数（例えば、コア・ストレプトアビジン
についてはε=41820cm2/mol）を用いて280 nmでの光学
濃度（ＯＤ）に基づいて決定した。
した。導入すべき変異の上流と下流のＤＮＡ領域を、pS
AM-CORE 発現ベクター中の隣接する単一の制限エンドヌ
クレアーゼ開裂部位まで取り出して、所望の変異をもつ
化学合成した対応ＤＮＡセグメント（ＤＮＡアダプタ
ー）と置き換えた。この場合のＤＮＡの操作は、Sambro
okら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbo
r, New York, 1989 に記載されるような標準方法を用い
て実施した。用いた分子生物学的試薬類は製造業者の説
明書にしたがって使用した。融合タンパク質およびペプ
チドのタンパク質濃度は、アミノ酸配列によって計算さ
れたモル吸光係数（例えば、コア・ストレプトアビジン
についてはε=41820cm2/mol）を用いて280 nmでの光学
濃度（ＯＤ）に基づいて決定した。
【００５０】ストレプトアビジン変異体の構築 単一変異体： 1.1 pSA-Leu25Trp Leu25Trp CORE-SA変異体遺伝子を構築するために、一個
所だけを開裂する制限エンドヌクレアーゼNcoIとSalIで
プラスミド pSAM-COREを消化し、アガロースゲル電気泳
動で単離した後、約2.9kbp長のNcoI/SalI-pSAM-CORE ベ
クターフラグメントをLeu25Trpアダプターと連結させ
た。Leu25Trpアダプターは相補的オリゴヌクレオチドＮ
１およびＮ２からハイブリダイゼーションにより調製し
た（反応緩衝液：12.5mmol/l Tris-HCl, pH7.0および1
2.5mmol/l MgCl2; Ｎ濃度：それぞれ１pmol/60 μl
）。Ｎ１とＮ２はどちらも、ハイブリダイゼーション
後にクローニングに関係するNcoIおよびSalI突出部分が
形成されるようにデザインされた。新たに作製されたプ
ラスミド pSA-Leu25Trp を制限地図作成（Leu25Trpアダ
プター中のサイレント突然変異によるBanI制限エンドヌ
クレアーゼ開裂部位の欠失）により分析し、さらにアダ
プター領域のＤＮＡ配列をＤＮＡシークエンシングによ
り解析した。 Leu25Trpアダプター：
所だけを開裂する制限エンドヌクレアーゼNcoIとSalIで
プラスミド pSAM-COREを消化し、アガロースゲル電気泳
動で単離した後、約2.9kbp長のNcoI/SalI-pSAM-CORE ベ
クターフラグメントをLeu25Trpアダプターと連結させ
た。Leu25Trpアダプターは相補的オリゴヌクレオチドＮ
１およびＮ２からハイブリダイゼーションにより調製し
た（反応緩衝液：12.5mmol/l Tris-HCl, pH7.0および1
2.5mmol/l MgCl2; Ｎ濃度：それぞれ１pmol/60 μl
）。Ｎ１とＮ２はどちらも、ハイブリダイゼーション
後にクローニングに関係するNcoIおよびSalI突出部分が
形成されるようにデザインされた。新たに作製されたプ
ラスミド pSA-Leu25Trp を制限地図作成（Leu25Trpアダ
プター中のサイレント突然変異によるBanI制限エンドヌ
クレアーゼ開裂部位の欠失）により分析し、さらにアダ
プター領域のＤＮＡ配列をＤＮＡシークエンシングによ
り解析した。 Leu25Trpアダプター：
【００５１】
【化２】
【００５２】1.2 pSA-Ser27Arg Ser27Arg CORE-SA変異体遺伝子を構築するために、一個
所だけを開裂する制限エンドヌクレアーゼNcoIとHindII
I でプラスミド pSAM-COREを消化し、約 400bp長のスト
レプトアビジンフラグメントと約2.5kbpのpSAM-CORE ベ
クターフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し
た。ＰＣＲ技法を用いて、あらかじめデザインしておい
た５’突然変異誘発プライマーＮ３を含む 400bp長フラ
グメントの増幅により所望の変異Ser27Argを導入した。
その後、このようにして単離したＰＣＲ産物をNcoIとHi
ndIII で再開裂し、アガロースゲル電気泳動で精製し、
そして上記のようにして単離した2.5kbpのpSAM-CORE ベ
クターフラグメントと連結させた。新たに作製されたプ
ラスミド pSA-Ser27Arg を制限地図作成（変異Ser27Arg
の導入によるSalI制限エンドヌクレアーゼ開裂部位の欠
失）により分析し、５’領域の変異ＤＮＡ配列をＤＮＡ
シークエンシングにより解析した。 Ser27Arg：ＰＣＲは５’突然変異誘発プライマーＮ３
（所望のSer27Arg変異を有する）と３’ストレプトアビ
ジンプライマーＮ４（pSAM-CORE に対して未変化の配
列）を用いて実施した。
所だけを開裂する制限エンドヌクレアーゼNcoIとHindII
I でプラスミド pSAM-COREを消化し、約 400bp長のスト
レプトアビジンフラグメントと約2.5kbpのpSAM-CORE ベ
クターフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し
た。ＰＣＲ技法を用いて、あらかじめデザインしておい
た５’突然変異誘発プライマーＮ３を含む 400bp長フラ
グメントの増幅により所望の変異Ser27Argを導入した。
その後、このようにして単離したＰＣＲ産物をNcoIとHi
ndIII で再開裂し、アガロースゲル電気泳動で精製し、
そして上記のようにして単離した2.5kbpのpSAM-CORE ベ
クターフラグメントと連結させた。新たに作製されたプ
ラスミド pSA-Ser27Arg を制限地図作成（変異Ser27Arg
の導入によるSalI制限エンドヌクレアーゼ開裂部位の欠
失）により分析し、５’領域の変異ＤＮＡ配列をＤＮＡ
シークエンシングにより解析した。 Ser27Arg：ＰＣＲは５’突然変異誘発プライマーＮ３
（所望のSer27Arg変異を有する）と３’ストレプトアビ
ジンプライマーＮ４（pSAM-CORE に対して未変化の配
列）を用いて実施した。
【００５３】
【化３】
【００５４】1.3 pSA-Ser45Arg Ser45Arg CORE-SA変異体遺伝子を構築するために、一個
所だけを開裂する制限エンドヌクレアーゼSacIとHindII
I でプラスミド pSAM-COREを消化し、約 300bp長のスト
レプトアビジンフラグメントと約2.6kbpのpSAM-CORE ベ
クターフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し
た。ＰＣＲ技法を用いて、あらかじめデザインしておい
た５’突然変異誘発プライマーＮ５を含む約 300bp長フ
ラグメントの増幅により所望の変異Ser45Argを導入し
た。その後、このようにして得られたＰＣＲ産物をSacI
とHindIII で再開裂し、アガロースゲル電気泳動で精製
し、そして上記のようにして単離した2.6kbpのpSAM-COR
E ベクターフラグメントと連結させた。新たに作製され
たプラスミド pSA-Ser45Arg を制限地図作成（Ｎ５突然
変異誘発プライマー中のサイレント突然変異によるAvaI
I 制限エンドヌクレアーゼ開裂部位の追加）により分析
し、５’領域の変異ＤＮＡ配列をＤＮＡシークエンシン
グにより解析した。 Ser45Arg：ＰＣＲは５’突然変異誘発プライマーＮ５
（所望のSer45Arg変異を有する）と３’ストレプトアビ
ジンプライマーＮ４（pSAM-CORE と比べて未変化の配
列）を用いて実施した。
所だけを開裂する制限エンドヌクレアーゼSacIとHindII
I でプラスミド pSAM-COREを消化し、約 300bp長のスト
レプトアビジンフラグメントと約2.6kbpのpSAM-CORE ベ
クターフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離し
た。ＰＣＲ技法を用いて、あらかじめデザインしておい
た５’突然変異誘発プライマーＮ５を含む約 300bp長フ
ラグメントの増幅により所望の変異Ser45Argを導入し
た。その後、このようにして得られたＰＣＲ産物をSacI
とHindIII で再開裂し、アガロースゲル電気泳動で精製
し、そして上記のようにして単離した2.6kbpのpSAM-COR
E ベクターフラグメントと連結させた。新たに作製され
たプラスミド pSA-Ser45Arg を制限地図作成（Ｎ５突然
変異誘発プライマー中のサイレント突然変異によるAvaI
I 制限エンドヌクレアーゼ開裂部位の追加）により分析
し、５’領域の変異ＤＮＡ配列をＤＮＡシークエンシン
グにより解析した。 Ser45Arg：ＰＣＲは５’突然変異誘発プライマーＮ５
（所望のSer45Arg変異を有する）と３’ストレプトアビ
ジンプライマーＮ４（pSAM-CORE と比べて未変化の配
列）を用いて実施した。
【００５５】
【化４】
【００５６】1.4 pSA-Trp120Ala Trp120Ala CORE-SA 変異体遺伝子を構築するために、一
個所だけを開裂する制限エンドヌクレアーゼNsiIとSpeI
でプラスミド pSAM-COREを消化し、アガロースゲル電気
泳動での単離後に約2.9kbpのNsiI/SpeI-pSAM-CORE ベク
ターフラグメントをTrp120Ala アダプターと連結させ
た。Trp120Ala アダプターは相補的オリゴヌクレオチド
Ｎ９およびＮ１０からハイブリダイゼーションにより調
製した（反応緩衝液：12.5mmol/l Tris-HCl, pH7.0およ
び12.5mmol/l MgCl2; Ｎ濃度：それぞれ１pmol/60 μl
）。Ｎ９とＮ１０はどちらも、ハイブリダイゼーショ
ン後にクローニングに関係するNsiIおよびSpeI突出部分
が形成されるようにデザインされた。新たに作製された
プラスミド pSA-Trp120Alaを制限地図作成（Trp120Ala
アダプター中の所望の変異によるNsiI制限エンドヌクレ
アーゼ開裂部位の欠失）により分析し、さらにアダプタ
ー領域のＤＮＡ配列をＤＮＡシークエンシングにより解
析した。 Trp120Ala アダプター：
個所だけを開裂する制限エンドヌクレアーゼNsiIとSpeI
でプラスミド pSAM-COREを消化し、アガロースゲル電気
泳動での単離後に約2.9kbpのNsiI/SpeI-pSAM-CORE ベク
ターフラグメントをTrp120Ala アダプターと連結させ
た。Trp120Ala アダプターは相補的オリゴヌクレオチド
Ｎ９およびＮ１０からハイブリダイゼーションにより調
製した（反応緩衝液：12.5mmol/l Tris-HCl, pH7.0およ
び12.5mmol/l MgCl2; Ｎ濃度：それぞれ１pmol/60 μl
）。Ｎ９とＮ１０はどちらも、ハイブリダイゼーショ
ン後にクローニングに関係するNsiIおよびSpeI突出部分
が形成されるようにデザインされた。新たに作製された
プラスミド pSA-Trp120Alaを制限地図作成（Trp120Ala
アダプター中の所望の変異によるNsiI制限エンドヌクレ
アーゼ開裂部位の欠失）により分析し、さらにアダプタ
ー領域のＤＮＡ配列をＤＮＡシークエンシングにより解
析した。 Trp120Ala アダプター：
【００５７】
【化５】
【００５８】二重組合せ変異体： 1.5 pSA-Leu25Trp/Ser45Arg Leu25Trp/Ser45Arg CORE-SA 変異体遺伝子を構築するた
めに、一個所だけを開裂する制限エンドヌクレアーゼNc
oIとSacIでプラスミドpSA-Leu25TrpとpSA-Ser45Argを消
化し、82bp長のpSA-Leu25Trpフラグメントと約2.8kbp長
のpSA-Ser45Argベクターフラグメントをアガロースゲル
電気泳動で単離した。続いて両フラグメントを一緒に連
結させた。新たに作製されたプラスミド pSA-Leu25Trp/
Ser45Argを制限地図作成（pSA-Leu25TrpからのBanI制限
エンドヌクレアーゼ開裂部位の消失およびpSA-Ser45Arg
からのAvaII 制限エンドヌクレアーゼ開裂部位の追加）
により分析し、さらに５’領域のＤＮＡ配列をＤＮＡシ
ークエンシングにより解析した。
めに、一個所だけを開裂する制限エンドヌクレアーゼNc
oIとSacIでプラスミドpSA-Leu25TrpとpSA-Ser45Argを消
化し、82bp長のpSA-Leu25Trpフラグメントと約2.8kbp長
のpSA-Ser45Argベクターフラグメントをアガロースゲル
電気泳動で単離した。続いて両フラグメントを一緒に連
結させた。新たに作製されたプラスミド pSA-Leu25Trp/
Ser45Argを制限地図作成（pSA-Leu25TrpからのBanI制限
エンドヌクレアーゼ開裂部位の消失およびpSA-Ser45Arg
からのAvaII 制限エンドヌクレアーゼ開裂部位の追加）
により分析し、さらに５’領域のＤＮＡ配列をＤＮＡシ
ークエンシングにより解析した。
【００５９】1.6 pSA-Ser27Arg/Ser45Arg Ser27Arg/Ser45Arg CORE-SA 変異体遺伝子を構築するた
めに、一個所だけを開裂する制限エンドヌクレアーゼNc
oIとSacIでプラスミドpSA-Ser27ArgとpSA-Ser45Argを消
化し、82bp長のpSA-Ser27Argフラグメントと約2.8kbp長
のpSA-Ser45Argベクターフラグメントをアガロースゲル
電気泳動で単離した。続いて両フラグメントを互いと連
結させた。新たに作製されたプラスミド pSA-Ser27Arg/
Ser45Argを制限地図作成（pSA-Ser27ArgからのSalI制限
エンドヌクレアーゼ開裂部位の消失およびpSA-Ser45Arg
からのAvaII 制限エンドヌクレアーゼ開裂部位の追加）
により分析し、さらに５’領域のＤＮＡ配列をＤＮＡシ
ークエンシングにより解析した。
めに、一個所だけを開裂する制限エンドヌクレアーゼNc
oIとSacIでプラスミドpSA-Ser27ArgとpSA-Ser45Argを消
化し、82bp長のpSA-Ser27Argフラグメントと約2.8kbp長
のpSA-Ser45Argベクターフラグメントをアガロースゲル
電気泳動で単離した。続いて両フラグメントを互いと連
結させた。新たに作製されたプラスミド pSA-Ser27Arg/
Ser45Argを制限地図作成（pSA-Ser27ArgからのSalI制限
エンドヌクレアーゼ開裂部位の消失およびpSA-Ser45Arg
からのAvaII 制限エンドヌクレアーゼ開裂部位の追加）
により分析し、さらに５’領域のＤＮＡ配列をＤＮＡシ
ークエンシングにより解析した。
【００６０】1.7 pSA-Ser45Trp/Leu110Trp Ser45Trp/Leu110Trp CORE-SA変異体遺伝子を構築するた
めに、一個所だけを開裂する制限エンドヌクレアーゼSa
cIとNsiIでプラスミドpSA-Ser45Argを消化し、243bp 長
のストレプトアビジンフラグメントと約2.7kbp長のpSA-
Ser45Argベクターフラグメントをアガロースゲル電気泳
動で単離した。続いて、ＰＣＲ技法を用いて、それぞれ
にデザインしておいた５’突然変異誘発プライマーＮ６
および３’突然変異誘発プライマーＮ７を用いる 243bp
長フラグメントの増幅により所望の変異Ser45Trp/Leu11
0Trpを導入した。その後、このようにして得られたＰＣ
Ｒ産物をSacIとNsiIで再開裂し、アガロースゲル電気泳
動で精製し、そして上記のようにして単離した約2.7kbp
のpSA-Ser45Argベクターフラグメントと連結させた。新
たに作製されたプラスミドを制限地図作成（pSA-Ser45A
rgにサイレント突然変異により追加的に導入されたAvaI
I 開裂部位の元の配列への復帰突然変異による欠失およ
びLeu110Trp 突然変異によるHindIII 部位の欠失）によ
り分析し、さらに所望のＤＮＡ突然変異をＤＮＡシーク
エンシングにより解析した。 Ser45Trp/Leu110Trp：ＰＣＲは５’突然変異誘発プライ
マーＮ６（所望の変異Ser45TrpとSacI制限エンドヌクレ
アーゼ開裂部位をもつ）と３’突然変異誘発プライマー
Ｎ７（所望の変異Leu110Trp とNsiI制限エンドヌクレア
ーゼ開裂部位をもつ）を用いて実施した。
めに、一個所だけを開裂する制限エンドヌクレアーゼSa
cIとNsiIでプラスミドpSA-Ser45Argを消化し、243bp 長
のストレプトアビジンフラグメントと約2.7kbp長のpSA-
Ser45Argベクターフラグメントをアガロースゲル電気泳
動で単離した。続いて、ＰＣＲ技法を用いて、それぞれ
にデザインしておいた５’突然変異誘発プライマーＮ６
および３’突然変異誘発プライマーＮ７を用いる 243bp
長フラグメントの増幅により所望の変異Ser45Trp/Leu11
0Trpを導入した。その後、このようにして得られたＰＣ
Ｒ産物をSacIとNsiIで再開裂し、アガロースゲル電気泳
動で精製し、そして上記のようにして単離した約2.7kbp
のpSA-Ser45Argベクターフラグメントと連結させた。新
たに作製されたプラスミドを制限地図作成（pSA-Ser45A
rgにサイレント突然変異により追加的に導入されたAvaI
I 開裂部位の元の配列への復帰突然変異による欠失およ
びLeu110Trp 突然変異によるHindIII 部位の欠失）によ
り分析し、さらに所望のＤＮＡ突然変異をＤＮＡシーク
エンシングにより解析した。 Ser45Trp/Leu110Trp：ＰＣＲは５’突然変異誘発プライ
マーＮ６（所望の変異Ser45TrpとSacI制限エンドヌクレ
アーゼ開裂部位をもつ）と３’突然変異誘発プライマー
Ｎ７（所望の変異Leu110Trp とNsiI制限エンドヌクレア
ーゼ開裂部位をもつ）を用いて実施した。
【００６１】
【化６】
【００６２】1.8 pSA-Ser45Tyr/Leu110Trp Ser45Tyr/Leu110Trp CORE-SA変異体遺伝子を構築するた
めに、一個所だけを開裂する制限エンドヌクレアーゼSa
cIとNsiIでプラスミドpSA-Ser45Argを消化し、243bp 長
のストレプトアビジンフラグメントと約2.7kbp長のpSA-
Ser45Argベクターフラグメントをアガロースゲル電気泳
動で単離した。続いて、ＰＣＲ技法を用いて、それぞれ
にデザインしておいた５’突然変異誘発プライマーＮ８
および３’突然変異誘発プライマーＮ７を用いる 243bp
長フラグメントの増幅により所望の変異Ser45Tyr/Leu11
0Trpを導入した。その後、このようにして得られたＰＣ
Ｒ産物をSacIとNsiIで再開裂し、アガロースゲル電気泳
動で精製し、そして上記のようにして単離した約2.7kbp
のpSA-Ser45Argベクターフラグメントと連結させた。新
たに作製されたプラスミドを制限地図作成（pSA-Ser45A
rgにサイレント突然変異により追加的に導入されたAvaI
I 開裂部位の元の配列への復帰突然変異による欠失およ
びLeu110Trp 突然変異によるHindIII 部位の欠失）によ
り分析し、さらに所望のＤＮＡ突然変異をＤＮＡシーク
エンシングにより解析した。 Ser45Tyr/Leu110Trp：ＰＣＲは５’突然変異誘発プライ
マーＮ８（所望の変異Ser45TyrとSacI制限エンドヌクレ
アーゼ開裂部位をもつ）と３’突然変異誘発プライマー
Ｎ７（所望の変異Leu110Trp とNsiI制限エンドヌクレア
ーゼ開裂部位をもつ）を用いて実施した。
めに、一個所だけを開裂する制限エンドヌクレアーゼSa
cIとNsiIでプラスミドpSA-Ser45Argを消化し、243bp 長
のストレプトアビジンフラグメントと約2.7kbp長のpSA-
Ser45Argベクターフラグメントをアガロースゲル電気泳
動で単離した。続いて、ＰＣＲ技法を用いて、それぞれ
にデザインしておいた５’突然変異誘発プライマーＮ８
および３’突然変異誘発プライマーＮ７を用いる 243bp
長フラグメントの増幅により所望の変異Ser45Tyr/Leu11
0Trpを導入した。その後、このようにして得られたＰＣ
Ｒ産物をSacIとNsiIで再開裂し、アガロースゲル電気泳
動で精製し、そして上記のようにして単離した約2.7kbp
のpSA-Ser45Argベクターフラグメントと連結させた。新
たに作製されたプラスミドを制限地図作成（pSA-Ser45A
rgにサイレント突然変異により追加的に導入されたAvaI
I 開裂部位の元の配列への復帰突然変異による欠失およ
びLeu110Trp 突然変異によるHindIII 部位の欠失）によ
り分析し、さらに所望のＤＮＡ突然変異をＤＮＡシーク
エンシングにより解析した。 Ser45Tyr/Leu110Trp：ＰＣＲは５’突然変異誘発プライ
マーＮ８（所望の変異Ser45TyrとSacI制限エンドヌクレ
アーゼ開裂部位をもつ）と３’突然変異誘発プライマー
Ｎ７（所望の変異Leu110Trp とNsiI制限エンドヌクレア
ーゼ開裂部位をもつ）を用いて実施した。
【００６３】
【化７】
【００６４】三重組合せ変異： 1.9 pSA-Leu25Trp/Ser45Trp/Leu110Trp Leu25Trp/Ser45Trp/Leu110Trp CORE-SA 変異体遺伝子を
構築するために、一個所だけを開裂する制限エンドヌク
レアーゼSalIとHindIII でプラスミドpSA-Leu25Trpおよ
びpSA-Ser45Trp/Leu110Trpを消化し、pSA-Ser45Trp/Leu
110Trpの352bp長フラグメントとpSA-Leu25Trpの約2.6kb
p長ベクターフラグメントをアガロースゲル電気泳動で
単離した。続いて、両フラグメントを互いと連結させ
た。新たに作製されたプラスミドpSA-Leu25Trp/Ser45Tr
p/Leu110Trp を制限地図作成（pSA-Ser45Trp/Leu110Trp
からのHindIII 制限エンドヌクレアーゼ開裂部位の消失
およびpSA-Leu25TrpからのBanI制限エンドヌクレアーゼ
開裂部位の消失）により分析し、ＤＮＡシークエンシン
グにより解析した。
構築するために、一個所だけを開裂する制限エンドヌク
レアーゼSalIとHindIII でプラスミドpSA-Leu25Trpおよ
びpSA-Ser45Trp/Leu110Trpを消化し、pSA-Ser45Trp/Leu
110Trpの352bp長フラグメントとpSA-Leu25Trpの約2.6kb
p長ベクターフラグメントをアガロースゲル電気泳動で
単離した。続いて、両フラグメントを互いと連結させ
た。新たに作製されたプラスミドpSA-Leu25Trp/Ser45Tr
p/Leu110Trp を制限地図作成（pSA-Ser45Trp/Leu110Trp
からのHindIII 制限エンドヌクレアーゼ開裂部位の消失
およびpSA-Leu25TrpからのBanI制限エンドヌクレアーゼ
開裂部位の消失）により分析し、ＤＮＡシークエンシン
グにより解析した。
【００６５】1.10 pSA-Leu25Trp/Ser45Tyr/Leu110Trp Leu25Trp/Ser45Tyr/Leu110Trp CORE-SA 変異体遺伝子を
構築するために、一個所だけを開裂する制限エンドヌク
レアーゼSalIとHindIII でプラスミドpSA-Leu25Trpおよ
びpSA-Ser45Tyr/Leu110Trpを消化し、pSA-Ser45Tyr/Leu
110Trpの352bp長フラグメントとpSA-Leu25Trpの約2.6kb
p長ベクターフラグメントをアガロースゲル電気泳動で
単離した。続いて、両フラグメントを互いと連結させ
た。新たに作製されたプラスミドpSA-Leu25Trp/Ser45Ty
r/Leu110Trp を制限地図作成（pSA-Ser45Tyr/Leu110Trp
からのHindIII 制限エンドヌクレアーゼ開裂部位の消失
およびpSA-Leu25TrpからのBanI制限エンドヌクレアーゼ
開裂部位の消失）により分析し、ＤＮＡ配列をＤＮＡシ
ークエンシングにより解析した。
構築するために、一個所だけを開裂する制限エンドヌク
レアーゼSalIとHindIII でプラスミドpSA-Leu25Trpおよ
びpSA-Ser45Tyr/Leu110Trpを消化し、pSA-Ser45Tyr/Leu
110Trpの352bp長フラグメントとpSA-Leu25Trpの約2.6kb
p長ベクターフラグメントをアガロースゲル電気泳動で
単離した。続いて、両フラグメントを互いと連結させ
た。新たに作製されたプラスミドpSA-Leu25Trp/Ser45Ty
r/Leu110Trp を制限地図作成（pSA-Ser45Tyr/Leu110Trp
からのHindIII 制限エンドヌクレアーゼ開裂部位の消失
およびpSA-Leu25TrpからのBanI制限エンドヌクレアーゼ
開裂部位の消失）により分析し、ＤＮＡ配列をＤＮＡシ
ークエンシングにより解析した。
【００６６】1.11 pSA-Ser27Arg/Ser45Arg/Leu110Trp Ser27Arg/Ser45Arg/Leu110Trp CORE-SA 変異体遺伝子を
構築するために、一個所だけを開裂する制限エンドヌク
レアーゼKpnIとHindIII でプラスミドpSA-Ser27Arg/Ser
45Arg とpSA-Ser45Trp/Leu110Trpを消化し、pSA-Ser45T
rp/Leu110Trpの218bp 長フラグメントとpSA-Ser27Arg/S
er45Arg の約2.7kbp長ベクターフラグメントをアガロー
スゲル電気泳動で単離した。続いて、両フラグメントを
互いと連結させた。新たに作製されたプラスミドpSA-Se
r27Arg/Ser45Arg/Leu110Trp を制限地図作成（pSA-Ser2
7Arg/Ser45Arg およびpSA-Ser45Trp/Leu110TrpからのHi
ndIII 制限エンドヌクレアーゼ開裂部位の消失およびpS
A-Ser27Arg/Ser45Arg からのAvaII制限エンドヌクレア
ーゼ開裂部位の追加）により分析し、ＤＮＡ配列をＤＮ
Ａシークエンシングにより解析した。
構築するために、一個所だけを開裂する制限エンドヌク
レアーゼKpnIとHindIII でプラスミドpSA-Ser27Arg/Ser
45Arg とpSA-Ser45Trp/Leu110Trpを消化し、pSA-Ser45T
rp/Leu110Trpの218bp 長フラグメントとpSA-Ser27Arg/S
er45Arg の約2.7kbp長ベクターフラグメントをアガロー
スゲル電気泳動で単離した。続いて、両フラグメントを
互いと連結させた。新たに作製されたプラスミドpSA-Se
r27Arg/Ser45Arg/Leu110Trp を制限地図作成（pSA-Ser2
7Arg/Ser45Arg およびpSA-Ser45Trp/Leu110TrpからのHi
ndIII 制限エンドヌクレアーゼ開裂部位の消失およびpS
A-Ser27Arg/Ser45Arg からのAvaII制限エンドヌクレア
ーゼ開裂部位の追加）により分析し、ＤＮＡ配列をＤＮ
Ａシークエンシングにより解析した。
【００６７】1.12 pSA-Ser27Arg/Ser45Arg/Trp120Ala Ser27Arg/Ser45Arg/Trp120Ala CORE-SA 変異体遺伝子を
構築するために、一個所だけを開裂する制限エンドヌク
レアーゼNsiIとSpeIでプラスミドpSA-Ser27Arg/Ser45Ar
g を消化し、約2.9kbp長のNsiI/SpeI-pSAM-CORE ベクタ
ーフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離した後
にTrp120Ala アダプターと連結させた。Trp120Ala アダ
プターは相補的オリゴヌクレオチドＮ９およびＮ１０か
らハイブリダイゼーションにより調製した（反応緩衝
液：12.5mmol/l Tris-HCl, pH7.0および12.5mmol/l MgC
l2; Ｎ濃度：それぞれ１pmol/60 μl ）。Ｎ９とＮ１０
はどちらも、ハイブリダイゼーション後にクローニング
に関係するNsiIおよびSpeI突出部分が形成されるように
デザインされた。新たに作製されたプラスミドpSA-Ser2
7Arg/Ser45Arg/Trp120Ala を制限地図作成（Trp120Ala
アダプター中の所望の変異によるNsiI制限エンドヌクレ
アーゼ開裂部位の欠失）により分析し、さらにアダプタ
ー領域のＤＮＡ配列をＤＮＡシークエンシングにより解
析した。
構築するために、一個所だけを開裂する制限エンドヌク
レアーゼNsiIとSpeIでプラスミドpSA-Ser27Arg/Ser45Ar
g を消化し、約2.9kbp長のNsiI/SpeI-pSAM-CORE ベクタ
ーフラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離した後
にTrp120Ala アダプターと連結させた。Trp120Ala アダ
プターは相補的オリゴヌクレオチドＮ９およびＮ１０か
らハイブリダイゼーションにより調製した（反応緩衝
液：12.5mmol/l Tris-HCl, pH7.0および12.5mmol/l MgC
l2; Ｎ濃度：それぞれ１pmol/60 μl ）。Ｎ９とＮ１０
はどちらも、ハイブリダイゼーション後にクローニング
に関係するNsiIおよびSpeI突出部分が形成されるように
デザインされた。新たに作製されたプラスミドpSA-Ser2
7Arg/Ser45Arg/Trp120Ala を制限地図作成（Trp120Ala
アダプター中の所望の変異によるNsiI制限エンドヌクレ
アーゼ開裂部位の欠失）により分析し、さらにアダプタ
ー領域のＤＮＡ配列をＤＮＡシークエンシングにより解
析した。
【００６８】実施例２ 大腸菌から精製された不活性コア・ストレプトアビジン
ミュテインの特性付け 2.1 発現 大腸菌によるコア・ストレプトアビジンミュテインの発
現、発現分析、復元させた不活性コア・ストレプトアビ
ジンミュテインの調製および精製は、組換えコア・スト
レプトアビジンに関してEP-A-0 612 325に記載されると
おりに行った。二重変異体 SA-Ser27Arg/Ser45Arg およ
び三重変異体 SA-Ser27Arg/Ser45Arg/Leu110Trp を精製
する場合は、Q-セファロースの代わりに20 mM 酢酸Na,
pH5.0 で平衡化したS-セファロースを用いた。これらは
350 mM NaCl を含む20 mM 酢酸Na, pH5.0 で溶出した。
SA変異体Trp120Ala は他の変異体と比べて酸に対する安
定性が低下しており、不正確な構造折り畳みとタンパク
質骨格の乱れを示した。
ミュテインの特性付け 2.1 発現 大腸菌によるコア・ストレプトアビジンミュテインの発
現、発現分析、復元させた不活性コア・ストレプトアビ
ジンミュテインの調製および精製は、組換えコア・スト
レプトアビジンに関してEP-A-0 612 325に記載されると
おりに行った。二重変異体 SA-Ser27Arg/Ser45Arg およ
び三重変異体 SA-Ser27Arg/Ser45Arg/Leu110Trp を精製
する場合は、Q-セファロースの代わりに20 mM 酢酸Na,
pH5.0 で平衡化したS-セファロースを用いた。これらは
350 mM NaCl を含む20 mM 酢酸Na, pH5.0 で溶出した。
SA変異体Trp120Ala は他の変異体と比べて酸に対する安
定性が低下しており、不正確な構造折り畳みとタンパク
質骨格の乱れを示した。
【００６９】2.2 SDS-PAGE／等電点電気泳動(IF) 精製して復元させた不活性コア・ストレプトアビジンミ
ュテインの均一性および純度をSDS-PAGE (Laemmli, Nat
ure 227 (1970) 680-685) および等電点電気泳動(Bark
ら, J. Forensic Sci. Soc. 16 (1976) 115-120)により
調べた。精製して復元させた不活性コア・ストレプトア
ビジンミュテインはSDS-PAGEで均一（単一バンド）であ
り（分子量：約13500 Da）、ＩＦゲルで９８％を超える
純度を有していた。
ュテインの均一性および純度をSDS-PAGE (Laemmli, Nat
ure 227 (1970) 680-685) および等電点電気泳動(Bark
ら, J. Forensic Sci. Soc. 16 (1976) 115-120)により
調べた。精製して復元させた不活性コア・ストレプトア
ビジンミュテインはSDS-PAGEで均一（単一バンド）であ
り（分子量：約13500 Da）、ＩＦゲルで９８％を超える
純度を有していた。
【００７０】実施例３ 組換えストレプトアビジンミュテインの親和力の測定 ビオチン誘導体に対するストレプトアビジンミュテイン
の親和力（定数Ｋon、Ｋoff およびＫA ）はPharmacia
社製の BIAcoreシステムを使ってコア・ストレプトアビ
ジン（野生型ストレプトアビジン）との比較において測
定した。そのために、それぞれのストレプトアビジンサ
ンプルをバイオセンサーチップ（CM5 バイオセンサー）
の表面上に固定させた。表面負荷量は 500〜2000共鳴単
位(rU)の測定シグナルが生ずるように選ばれた。会合反
応速度をそれぞれの場合に６種類の濃度 (12.5、25、5
0、100 、200 および400 nmol/l) のモノビオチン化Ｆa
b'抗体フラグメントを用いて25℃で３分間記録した。抗
体の逆結合の影響を調べるために、10μg/mlのコア・ス
トレプトアビジンの不在下と存在下での解離反応速度を
比較した。結合の特異性は非ビオチン化形態の同一抗体
（陰性対照）を用いた実験により明らかにした。精製し
たストレプトアビジンミュテインおよび高分子物質と架
橋させたストレプトアビジンミュテイン（ストレプトア
ビジンミュテインとサーモ- ウシ血清アルブミンのコン
ジュゲート、調製：EP-A-0 269 092）の結合定数を測定
した。実験の結果を表１に示す。
の親和力（定数Ｋon、Ｋoff およびＫA ）はPharmacia
社製の BIAcoreシステムを使ってコア・ストレプトアビ
ジン（野生型ストレプトアビジン）との比較において測
定した。そのために、それぞれのストレプトアビジンサ
ンプルをバイオセンサーチップ（CM5 バイオセンサー）
の表面上に固定させた。表面負荷量は 500〜2000共鳴単
位(rU)の測定シグナルが生ずるように選ばれた。会合反
応速度をそれぞれの場合に６種類の濃度 (12.5、25、5
0、100 、200 および400 nmol/l) のモノビオチン化Ｆa
b'抗体フラグメントを用いて25℃で３分間記録した。抗
体の逆結合の影響を調べるために、10μg/mlのコア・ス
トレプトアビジンの不在下と存在下での解離反応速度を
比較した。結合の特異性は非ビオチン化形態の同一抗体
（陰性対照）を用いた実験により明らかにした。精製し
たストレプトアビジンミュテインおよび高分子物質と架
橋させたストレプトアビジンミュテイン（ストレプトア
ビジンミュテインとサーモ- ウシ血清アルブミンのコン
ジュゲート、調製：EP-A-0 269 092）の結合定数を測定
した。実験の結果を表１に示す。
【００７１】
【表１】
【００７２】実施例４ 干渉除去実験 抗ＨＣＶ抗体のエンザイムイムノアッセイを行い、スト
レプトアビジンミュテイン SA-Ser27Arg/Ser45Arg (1)
、SA-Ser45Trp/Leu110Trp (2) および SA-Ser45Tyr/Le
u110Trp (3)を添加したことによる試験干渉の低減を測
定した。試験はストレプトアビジン固相を用いて２ステ
ップサンドイッチアッセイとして行った。第１ステップ
で、ビオチン化ＨＣＶペプチド (EP-A-0 582 243, EP-A
-0 484 787) またはポリペプチド (EP-A-0 696 640) お
よびサンプルを加えた。第２ステップで、固相結合抗体
と抗ヒトＩｇＧ−ペルオキシダーゼコンジュゲートとの
反応を行わせた。その後、基質としてＡＢＴＳを用いて
指示薬反応を行わせた。
レプトアビジンミュテイン SA-Ser27Arg/Ser45Arg (1)
、SA-Ser45Trp/Leu110Trp (2) および SA-Ser45Tyr/Le
u110Trp (3)を添加したことによる試験干渉の低減を測
定した。試験はストレプトアビジン固相を用いて２ステ
ップサンドイッチアッセイとして行った。第１ステップ
で、ビオチン化ＨＣＶペプチド (EP-A-0 582 243, EP-A
-0 484 787) またはポリペプチド (EP-A-0 696 640) お
よびサンプルを加えた。第２ステップで、固相結合抗体
と抗ヒトＩｇＧ−ペルオキシダーゼコンジュゲートとの
反応を行わせた。その後、基質としてＡＢＴＳを用いて
指示薬反応を行わせた。
【００７３】次のように試験を行った： インキュベーション緩衝液：40 mmol/l リン酸Na, pH7.4 7.1 g/l NaCl 防腐剤（例：クロロアセトアミド） 200 g/l Plasma-Diagnostic Base (Armour Pharmaceuticals 社, USA) + コア、NS4 およびNS3 領域由来のHCV ペプチド および組換えNS3 ポリペプチド（ビオチン化） ±25μg/mlのストレプトアビジンミュテインまたは 75μg/mlのサーモ-BSAとのコンジュゲート ±25μg/mlのコア・ストレプトアビジン(WT)
【００７４】 コンジュゲート緩衝液： 40 mmol/l リン酸Na, pH7.4 7.1 g/l NaCl 防腐剤（例：クロロアセトアミド） １g/l ウシ血清アルブミン ４g/l ウシIgG １g/l トリトン X 100 15U/l 抗ヒトIgG POD
【００７５】 インキュベーション期間： ステップ１：１時間（サンプル＋ インキュベーション緩衝液） ステップ２：１時間（＋コンジュゲート緩衝液） ステップ３：１時間（ＡＢＴＳとの基質反応） 試験をES 600上で25℃で行った。 基質溶液を422 nmで測定した。
【００７６】 サンプル： ５つの偽陽性の抗ＨＣＶ陰性サンプル （干渉サンプル） ６つの陽性抗ＨＣＶサンプル（対照） 容量： 各々サンプル20μl 、他のすべての試薬 500μl
【００７７】ES 600アナライザを使って422 nmで測定し
た吸光度値を以下の表２および３に示す。これらの結果
から、ストレプトアビジンミュテインを添加すると陰性
血清サンプルのシグナルが非常に減少するが、陽性血清
サンプルのシグナルは全く減少しないか、ほんのわずか
しか減少しないことがわかる。したがって、ストレプト
アビジンミュテインは干渉除去試薬として格別優れてい
るといえる。
た吸光度値を以下の表２および３に示す。これらの結果
から、ストレプトアビジンミュテインを添加すると陰性
血清サンプルのシグナルが非常に減少するが、陽性血清
サンプルのシグナルは全く減少しないか、ほんのわずか
しか減少しないことがわかる。したがって、ストレプト
アビジンミュテインは干渉除去試薬として格別優れてい
るといえる。
【００７８】
【表２】
【００７９】
【表３】
【００８０】実施例５ アフィニティー吸着剤としてのストレプトアビジンミュ
テインの使用 5.1 スフェロシル-NH2へのストレプトアビジンミュテイ
ンの固定化 スフェロシル-NH2 (Boehringer Mannheim 社, 注文番
号: 576590) を３倍量の10%(w/v)グルタルジアルデヒド
を用いて活性化し、その後７倍容量の蒸留水で洗った。
ストレプトアビジンミュテインをその遊離アミノ基を介
して遊離アルデヒド基にカップリングさせた。用いたス
トレプトアビジンミュテインの濃度は活性化スフェロシ
ル-NH2ゲル１mlあたり２mgとした。スフェロシルに結合
しなかったミュテインをＰＢＳ緩衝液 (50 mM リン酸
Ｋ, pH7.5, 150 mM NaCl) で洗い流した。続いて、吸着
剤にビオチン化物質を負荷させた。非ビオチン化物質は
結合せず、したがってビオチン化物質から容易に分離で
きた。また、それらのビオチン化の程度（分子あたりの
ビオチン基の数）に応じてビオチン化物質を分離するこ
とも可能であった。カラムに結合したビオチン化物質
は、ｐＨ＜４．５の緩衝液を用いるか、および／または
グアニジニウム塩酸のようなカオトロピック物質を添加
するか、および／またはビオチンまたはビオチン類似体
を添加することによって溶出することができた。ビオチ
ン化物質はそれらのビオチン化の程度に応じてビオチン
またはビオチン類似体の勾配を用いて分離することが好
ましい。
テインの使用 5.1 スフェロシル-NH2へのストレプトアビジンミュテイ
ンの固定化 スフェロシル-NH2 (Boehringer Mannheim 社, 注文番
号: 576590) を３倍量の10%(w/v)グルタルジアルデヒド
を用いて活性化し、その後７倍容量の蒸留水で洗った。
ストレプトアビジンミュテインをその遊離アミノ基を介
して遊離アルデヒド基にカップリングさせた。用いたス
トレプトアビジンミュテインの濃度は活性化スフェロシ
ル-NH2ゲル１mlあたり２mgとした。スフェロシルに結合
しなかったミュテインをＰＢＳ緩衝液 (50 mM リン酸
Ｋ, pH7.5, 150 mM NaCl) で洗い流した。続いて、吸着
剤にビオチン化物質を負荷させた。非ビオチン化物質は
結合せず、したがってビオチン化物質から容易に分離で
きた。また、それらのビオチン化の程度（分子あたりの
ビオチン基の数）に応じてビオチン化物質を分離するこ
とも可能であった。カラムに結合したビオチン化物質
は、ｐＨ＜４．５の緩衝液を用いるか、および／または
グアニジニウム塩酸のようなカオトロピック物質を添加
するか、および／またはビオチンまたはビオチン類似体
を添加することによって溶出することができた。ビオチ
ン化物質はそれらのビオチン化の程度に応じてビオチン
またはビオチン類似体の勾配を用いて分離することが好
ましい。
【００８１】5.2 他の担体へのストレプトアビジンミュ
テインの固定化 他のクロマトグラフィー材料へのストレプトアビジンミ
ュテインの固定化は、天然ストレプトアビジンの公知の
固定化法により行うことができる。
テインの固定化 他のクロマトグラフィー材料へのストレプトアビジンミ
ュテインの固定化は、天然ストレプトアビジンの公知の
固定化法により行うことができる。
【００８２】5.3 ストレプトアビジンミュテイン吸着剤
への ビオチン化ウシ血清アルブミン(Bi-BSA)の負荷 実施例5.1 において製造したスフェロシル-NH2 SA ミュ
テイン吸着剤をＰＢＳ緩衝液 (50 mM リン酸Ｋ, pH7.5,
150 mM NaCl) で平衡化し、クロマトグラフィーカラム
に移した。次に、ストレプトアビジンミュテイン吸着剤
１mlあたり２mgのＰＢＳ中のBi-BSAを加えた。未結合タ
ンパク質を２倍カラム容量のＰＢＳで洗い流した。これ
を50 mM 酢酸アンモニウム, pH3.0 および／または９mM
から10mMのイミノビオチンまたはビオチンの勾配を用い
て溶出した。
への ビオチン化ウシ血清アルブミン(Bi-BSA)の負荷 実施例5.1 において製造したスフェロシル-NH2 SA ミュ
テイン吸着剤をＰＢＳ緩衝液 (50 mM リン酸Ｋ, pH7.5,
150 mM NaCl) で平衡化し、クロマトグラフィーカラム
に移した。次に、ストレプトアビジンミュテイン吸着剤
１mlあたり２mgのＰＢＳ中のBi-BSAを加えた。未結合タ
ンパク質を２倍カラム容量のＰＢＳで洗い流した。これ
を50 mM 酢酸アンモニウム, pH3.0 および／または９mM
から10mMのイミノビオチンまたはビオチンの勾配を用い
て溶出した。
【００８３】5.4 ストレプトアビジンミュテイン吸着剤
への ビオチン化Ｆab抗体フラグメントの負荷 実施例5.1 において製造したストレプトアビジンミュテ
イン吸着剤を500 mM硫酸アンモニウムを含むＰＢＳ緩衝
液 (PBS+AS緩衝液) で平衡化し、クロマトグラフィーカ
ラムに移した。次に、ストレプトアビジンミュテイン吸
着剤１mlあたり２mgのPBS+AS緩衝液中の抗体フラグメン
トを添加した。未結合タンパク質を２倍カラム容量のPB
S+AS緩衝液で洗い流した。これをＰＢＳ緩衝液, pH7.2
および０から10mMのビオチンの勾配を用いて溶出した。
への ビオチン化Ｆab抗体フラグメントの負荷 実施例5.1 において製造したストレプトアビジンミュテ
イン吸着剤を500 mM硫酸アンモニウムを含むＰＢＳ緩衝
液 (PBS+AS緩衝液) で平衡化し、クロマトグラフィーカ
ラムに移した。次に、ストレプトアビジンミュテイン吸
着剤１mlあたり２mgのPBS+AS緩衝液中の抗体フラグメン
トを添加した。未結合タンパク質を２倍カラム容量のPB
S+AS緩衝液で洗い流した。これをＰＢＳ緩衝液, pH7.2
および０から10mMのビオチンの勾配を用いて溶出した。
【００８４】
配列番号：１ 配列の長さ：６３８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：50..598 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：50..121 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：122..598 配列
【００８５】
【化８】
【００８６】配列番号：２ 配列の長さ：１８３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【００８７】
【化９】
【００８８】配列番号：３ 配列の長さ：６０４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：44..499 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：44..115 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：116..499 配列
【００８９】
【化１０】
【００９０】配列番号：４ 配列の長さ：１５２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【００９１】
【化１１】
【００９２】配列番号：５ 配列の長さ：４６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【００９３】
【化１２】
【００９４】配列番号：６ 配列の長さ：４６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【００９５】
【化１３】
【００９６】配列番号：７ 配列の長さ：５９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【００９７】
【化１４】
【００９８】配列番号：８ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【００９９】
【化１５】
【０１００】配列番号：９ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【０１０１】
【化１６】
【０１０２】配列番号：１０ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【０１０３】
【化１７】
【０１０４】配列番号：１１ 配列の長さ：４９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【０１０５】
【化１８】
【０１０６】配列番号：１２ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【０１０７】
【化１９】
【０１０８】配列番号：１３ 配列の長さ：１２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【０１０９】
【化２０】
【０１１０】配列番号：１４ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【０１１１】
【化２１】
【０１１２】配列番号：１５ 配列の長さ：３８４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..384 配列
【０１１３】
【化２２】
【０１１４】配列番号：１６ 配列の長さ：１２８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【０１１５】
【化２３】
【図１】コア・ストレプトアビジン発現プラスミド pSA
M-COREのプラスミド地図を示す模式図である。
M-COREのプラスミド地図を示す模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 リチャード エング ドイツ連邦共和国 ディー−81375 ミ ュンヘン， アイチェンシュトラーセ 40 アー (72)発明者 ウルバン シュミット ドイツ連邦共和国 ディー−82386 オ バーハウ セン， ヴァルドシュトラー セ 36 (72)発明者 アルノ デガー ドイツ連邦共和国 ディー−82377 ペ ンツバー グ， クルフルスト−マック ス−シードルング ７ベー (72)発明者 ハンス ブランドステッター アメリカ合衆国 02150 マサチューセ ッツ州 チェルシー， クラ─ク アヴ ェニュー 246 (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．92，Ｎｏ．８ （1995）ｐ．3180−3184 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．92，Ｎｏ．５ （1995）ｐ．1754−1758 Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏ ｌ．114，Ｎｏ．９（1992）ｐ．3197− 3200 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/465 C12N 15/12 G01N 33/53 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (15)
- 【請求項１】 アビジンおよびストレプトアビジンのミ
ュテインから選ばれるビオチンに結合可能なポリペプチ
ドであって、ストレプトアビジンのミュテインは天然ポ
リペプチドの位置 Leu25、Ser27、Tyr43、Ser45、Val4
7、Gly48、Ser88、Thr90、Leu110およびAsp128のアミノ
酸のうち少なくとも２個が他のアミノ酸によって置換さ
れており、アビジンのミュテインは天然ポリペプチドの
位置 Leu14、Ser16、Tyr33、Thr35、Val37、Thr38、Ser
75、Thr77、Leu99およびIle117のアミノ酸のうち少なく
とも2個が他のアミノ酸によって置換されており、該ミ
ュテインはビオチンへの結合親和力が1010 l/molより低
いことを特徴とする上記ポリペプチド。 - 【請求項２】 ストレプトアビジンのミュテインであ
り、アミノ酸 Leu25、Ser27、Ser45およびLeu110のうち
少なくとも２個がArg、Trp、Tyr、PheおよびHisから選
ばれるアミノ酸によって置換されていることを特徴とす
る、請求項１に記載のポリペプチド。 - 【請求項３】 アビジンのミュテインであり、位置 Leu
14、Ser16、Thr35およびLeu99のうち少なくとも2個がAr
g、Trp、Tyr、PheおよびHisから選ばれるアミノ酸によ
って置換されていることを特徴とする、請求項１に記載
のポリペプチド。 - 【請求項４】 配列番号１６に示すアミノ酸配列を有す
る組換えコア・ストレプトアビジンのミュテインである
ことを特徴とする、請求項１または２に記載のポリペプ
チド。 - 【請求項５】 前記ミュテインがポリマーコンジュゲー
トとして存在することを特徴とする、請求項１〜４のい
ずれか１つに記載のポリペプチド。 - 【請求項６】 前記ミュテインが二量体および／または
四量体を形成する能力を有することを特徴とする、請求
項１〜５のいずれか１つに記載のポリペプチド。 - 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか１つに記載のポ
リペプチドをコードすることを特徴とする核酸。 - 【請求項８】 請求項７に記載の核酸を少なくとも１コ
ピー含むことを特徴とするベクター。 - 【請求項９】 請求項８に記載のベクターで形質転換さ
れていることを特徴とする細胞。 - 【請求項１０】 請求項１〜６のいずれか１つに記載の
ミュテインを含むことを特徴とする、被検体の検出方法
において非特異的相互作用を低下および／または回避す
るための干渉除去試薬。 - 【請求項１１】 請求項１〜６のいずれか１つに記載の
ポリペプチドを試験サンプルに添加することを特徴とす
る、ストレプトアビジン／アビジン−ビオチンの特異的
結合対の使用を含んでなる試験サンプル中の被検体の定
性および／または定量検出法。 - 【請求項１２】 ビオチンに結合可能なポリペプチドと
各アッセイの更なる成分、および請求項１０に記載の干
渉除去試薬を含むことを特徴とする、試験サンプル中の
被検体の定性および／または定量検出のための試験キッ
ト。 - 【請求項１３】 天然ストレプトアビジンポリペプチド
の位置 Leu25、Ser27、Tyr43、Ser45、Val47、Gly48、S
er88、Thr90、Leu110およびAsp128のアミノ酸のうち少
なくとも２個が他のアミノ酸によって置換されている
か、または天然アビジンポリペプチドの位置 Leu14、Se
r16、Tyr33、Thr35、Val37、Thr38、Ser75、Thr77、Leu
99およびIle117のアミノ酸のうち少なくとも2個が他の
アミノ酸によって置換されており、かつビオチンへの結
合親和力が105〜1011 l/molであるアビジンおよびスト
レプトアビジンのミュテインから選ばれるビオチンに結
合可能なポリペプチドの、ビオチンとの結合に関して再
生され得るシステムとしての使用。 - 【請求項１４】 前記システムがｐＨ値を４．５より低
く下げるおよび／またはカオトロピック物質を添加する
ことにより再生されることを特徴とする、請求項１３に
記載の使用。 - 【請求項１５】 天然ストレプトアビジンポリペプチド
の位置 Leu25、Ser27、Tyr43、Ser45、Val47、Gly48、S
er88、Thr90、Leu110およびAsp128のアミノ酸のうち少
なくとも２個が他のアミノ酸によって置換されている
か、天然アビジンポリペプチドの位置 Leu14、Ser16、T
yr33、Thr35、Val37、Thr38、Ser75、Thr77、Leu99およ
びIle117のアミノ酸のうち少なくとも2個が他のアミノ
酸によって置換されており、かつビオチンへの結合親和
力が105〜1011 l/molであるストレプトアビジンまたは
アビジンのミュテインがコーティングされていることを
特徴とする、ビオチンと結合できるように再生され得る
固相。
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