CN117491623A - 使用聚乙二醇化分析物特异性结合剂的基于颗粒的免疫测定法 - Google Patents
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Abstract
本文报道了用于在基于微粒的分析物特异性结合测定中测量分析物的方法，其中所述微粒涂覆有结合对的第一配偶体，所述方法包括混合所述涂覆的微粒、缀合至结合对的第二配偶体的分析物特异性结合剂和怀疑包含分析物或包含分析物的样品，其中结合对的所述第二配偶体经由包含12至30个乙二醇单元(PEG 12至30)的接头结合至所述分析物特异性结合剂，由此将分析物经由缀合的分析物特异性结合剂结合至涂覆的微粒，将包含经由结合对和分析物特异性结合剂结合的分析物的微粒从混合物中分离，和测量结合至微粒的分析物。
Description
本申请是申请日为2016年8月18日，申请号为201680047660.2，发明名称为“使用聚乙二醇化分析物特异性结合剂的基于颗粒的免疫测定法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及用于在基于微粒的分析物特异性结合测定中测量分析物的方法，其中所述微粒涂覆有结合对的第一配偶体，所述方法包括混合所述涂覆的微粒、结合至结合对的第二配偶体的分析物特异性结合剂和怀疑包含分析物或包含分析物的样品，其中所述结合对的第二配偶体经由包含12至30个乙二醇单元(PEG 12至30)的接头结合至所述分析物特异性结合剂，由此将分析物经由分析物特异性结合剂结合至涂覆的微粒，将包含经由结合对和分析物特异性结合剂结合的分析物的微粒从混合物中分离，和测量结合至微粒的分析物。
背景技术
已经开发了许多用于检测和定量生物化学和生物样品中的目标分析物的方法和系统。能够测量痕量的微生物、药物、激素、病毒、抗体、核酸和其他蛋白的方法和系统对于研究人员和临床医生是非常有价值的。
许多测定方法利用分析物特异性结合剂来从样品捕获目标特异性靶分子并允许测定靶分子。
已经基于结合反应，例如抗原-抗体反应、核酸杂交技术和蛋白-配体系统开发了大量技术。许多生物化学和生物结合系统的高度特异性导致了许多在研究和诊断中有价值的检测方法和系统。通常，目标分析物的存在通过连接至一种或多种分析物特异性结合剂的可观察“标记物”的存在或不存在来表示。
测定灵敏度在很大程度上受非特异性结合现象的限制。因此，主要困难在于构想一种非常灵敏、同时本质上不会受到高背景信号(例如，由被探测的样品流体引起)的影响的测定技术。非特异性结合通常导致增加的背景信号、不准确的检测以及更高(更差)的检测限。具体而言，当使用复杂的生物基质诸如人血浆或血清样品作为样品流体时，非特异性结合甚至更有挑战性。
近年来，已经开发了更精确和灵敏的测定法，其基于使用(例如超顺磁性)微粒。尤其在此类基于颗粒的测定法中，对非特异性信号的重要贡献来自颗粒-颗粒相互作用和/或颗粒-表面相互作用。
US 5.212.063公开了一种用于通过利用生物素缀合物的免疫测定法检测含有游离生物素的体液中的分析物的方法。该文献提到由核组成并含有具有多个生物素结合位点的聚合物和作为覆盖层的至少一层蛋白的聚合物微粒。
WO 2013/001447描述了具有包含壳结构的涂层的预涂覆的微粒，其中所述壳结构含有包含一种或多种亲和分子(即分析物特异性结合剂)的第一层，并且还含有与第一层偶联的第二层，并且其中所述第一和第二层包含形成网的非亲和间隔分子(non-affinespacer molecules)，其中所述一个或多个亲和分子被嵌入所述涂层结构内，并且其中所述网对非特异性分子产生空间位阻。使用此类特别处理/涂覆的微粒，可以降低由非特异性结合引起的背景。
然而，甚至最先进的测定法仍然表现出显著水平的非特异性结合，其损害检测下限(LOD)或测量范围或两者。测试开发者经常必须在测定灵敏度、测量范围和测定特异性之间妥协。同时测试需要是快速、灵敏、定量准确，且甚至成本节约的。而且，待进行测试的平台需要易于使用和可靠。
总是期望通过增加信号与背景噪声的比率且因此增加测定的灵敏度来改进测定法。增加测定的信号还具有几个仪器的优点，包括：i)需要较不灵敏(且较不昂贵)的检测系统；ii)需要较少量的有价值样品；iii)仪器可以小型化，以便允许较小的仪器和/或在小面积上同时运行许多测定的装置。
然而，尤其在基于颗粒的测定法中，对非特异性信号的重要贡献来自颗粒-颗粒相互作用和颗粒-表面相互作用。
因此需要设计用于改进的基于颗粒的测定方法的新型结构和方法。强烈需要避免与微粒的非特异性结合和微粒的聚集，这是巨量检测测定中的限制因素。
现在已经令人惊讶地发现，包含12至30个聚乙二醇单元的接头分子-一方面结合至结合对的一个成员且另一方面结合至分析物特异性结合剂-可以在基于微粒的结合测定法中非常有利地使用，其中所述微粒涂覆有结合对的另一成员。
发明内容
公开了用于在基于微粒的分析物特异性结合测定中测量分析物的方法，其中所述微粒涂覆有结合对的第一配偶体，所述方法包括a)混合所述涂覆的微粒、结合至结合对的第二配偶体的分析物特异性结合剂和怀疑包含分析物或包含分析物的样品，其中所述结合对的第二配偶体经由包含12至30个乙二醇单元(PEG 12至30)的接头结合至所述分析物特异性结合剂，由此将分析物经由分析物特异性结合剂结合至涂覆的微粒，b)将包含经由结合对和分析物特异性结合剂结合的分析物的微粒从混合物中分离，和c)测量结合至微粒的分析物。
还公开了试剂盒，其在单独的容器中或在单个容器单元的分开的隔室中至少包含涂覆有结合对的第一成员的微粒和结合至该结合对的第二成员的分析物特异性结合剂，其中所述结合对的所述第二成员经由包含12至30个乙二醇单元(PEG 12至30)的接头结合至所述分析物特异性结合剂。
综上，本申请提供了如下项的具体实施方案：
1.用于在基于微粒的分析物特异性结合测定中测量分析物的方法，其中所述微粒涂覆有结合对的第一配偶体，所述方法包括
a)混合所述涂覆的微粒、结合至结合对的第二配偶体的分析物特异性结合剂和怀疑包含分析物或包含分析物的样品，
其中结合对的所述第二配偶体经由包含12至30个乙二醇单元(PEG 12至30)的接头结合至所述分析物特异性结合剂，由此将分析物经由分析物特异性结合剂结合至涂覆的微粒，
b)将包含经由结合对和分析物特异性结合剂结合的分析物的微粒从混合物中分离，和
c)测量结合至微粒的分析物。
2.根据项1所述的方法，其中所述微粒直径为50nm至20μm。
3.根据项1或2所述的方法，其中所述微粒是顺磁性的，并且步骤1(b)中的分离通过磁力。
4.根据项目1至3中任一项所述的方法，其中所述分析物特异性结合剂是至少50个氨基酸的多肽。
5.根据项目1至4中任一项所述的方法，其中所述分析物特异性结合剂是最多10,000个氨基酸的多肽。
6.根据项1至5中任一项所述的方法，其中所述分析物特异性结合剂是抗体或其抗原结合片段。
7.根据项1至6中任一项所述的方法，其中所述分析物以竞争测定形式进行测量。
8.根据项1至6中任一项所述的方法，其中所述分析物以夹心测定形式进行测量。
9.根据项1至8中任一项所述的方法，其中结合至所述微粒的分析物的所述测量基于使用电化学发光标记物。
10.根据项1至9中任一项所述的方法，其中结合对的所述第一配偶体分别选自抗生物素蛋白和/或链霉抗生物素蛋白和FimG，并且其中结合对的所述第二配偶体分别选自生物素或生物素类似物，诸如氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素和DsF。
11.根据项1至10中任一项所述的方法，其中结合对的所述第一配偶体是抗生物素蛋白和/或链霉抗生物素蛋白，并且其中结合对的所述第二配偶体是生物素。
12.根据项1至9中任一项所述的方法，其中结合至结合对的第二配偶体的所述缀合的特异性结合剂包含于组合物中，其中在所述组合物中，结合至分析物特异性结合剂的结合对的第二配偶体之间的平均摩尔比为1.1或更高。
13.试剂盒，其在单独的容器中或在单个容器单元的分开的隔室中至少包含涂覆有结合对的第一配偶体的微粒和结合至所述结合对的第二配偶体的分析物特异性结合剂，其中结合对的所述第二配偶体经由包含12至30个乙二醇单元(PEG 12至30)的接头结合至所述分析物特异性结合剂。
14.项13的试剂盒，其中结合对的所述第一配偶体是抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，并且其中所述结合对的所述第二配偶体选自生物素或生物素类似物，诸如氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素。
15.根据项13或14所述的试剂盒，其在单独的容器中或在单个容器单元的分开的隔室中还包含可检测标记的第二分析物特异性结合剂。
发明详述
在一个实施方案中，本公开涉及用于在基于微粒的分析物特异性结合测定中测量分析物的方法，其中所述微粒涂覆有结合对的第一配偶体，所述方法包括a)混合所述涂覆的微粒、结合至结合对的第二配偶体的分析物特异性结合剂和怀疑包含分析物或包含分析物的样品，其中所述结合对的第二配偶体经由包含12至30个乙二醇单元(PEG 12至30)的接头结合至所述分析物特异性结合剂，由此将分析物经由分析物特异性结合剂结合至涂覆的微粒，b)将包含经由结合对和分析物特异性结合剂结合的分析物的微粒从混合物中分离，和c)测量结合至微粒的分析物。
基于颗粒的分析物特异性结合测定法广泛用于例如某些浊度测定法、某些乳胶凝集测定法以及采用各种各样标记或检测技术的许多灵敏的夹心型测定法。
如本文使用的“颗粒”意指可以归因于物理特性诸如体积、质量或平均尺寸的小的、局部化物体。微粒因此可以是对称的、球状的、基本上球状的或球形的形状，或者是不规则的、不对称的形状或形式。本发明设想的颗粒的尺寸可以变化。在一个实施方案中，使用的是球形，例如直径在纳米和微米范围内的微粒。在一个实施方案中，在根据本公开的方法中使用的微粒具有50纳米至20微米的直径。在一个进一步实施方案中，所述微粒具有100nm至10μm的直径。在一个实施方案中，在根据本公开的方法中使用的微粒具有200nm至5μm或750nm至5μm的直径。
如上文所定义的微粒可以包含本领域技术人员已知的任何合适的材料或由其组成，例如它们可以包含无机或有机材料或由其组成或基本上由其组成。通常，它们可以包含金属或金属的合金或有机材料或由其组成或基本上由其组成，或者包含碳水化合物成分(carbohydrate elements)或由其组成或基本上由其组成。设想的微粒材料的实例包括琼脂糖、聚苯乙烯、胶乳、聚乙烯醇、二氧化硅和铁磁金属、合金或组合材料。在一个实施方案中，所述微粒是磁性或铁磁性金属、合金或组合物。在进一步实施方案中，所述材料可以具有特定特性，并且例如是疏水的或亲水的。此类微粒通常分散在水溶液中并且保留小的负表面电荷，保持微粒分离并避免非特异性聚集。
在本发明的一个实施方案中，所述微粒是顺磁性微粒，并且在根据本公开的测量方法中通过磁力帮助此类颗粒的分离。施加磁力以将顺磁性或磁性颗粒从溶液/悬浮液中拉出并如期望保留它们，同时可以移除溶液/悬浮液的液体，并且可以例如洗涤颗粒。
根据本发明的方法中使用的微粒用特异性结合对的第一成员涂覆。
如本文所用的“结合对”由以高亲和力(即以一纳摩尔或更好的亲和力)彼此结合的两种配偶体组成。结合对的实施方案是例如由受体和配体、半抗原和抗半抗原抗体组成的结合对，以及基于天然存在的高亲和力结合对的结合对。
受体-配体结合对的一个实例是由类固醇激素受体和相应的类固醇激素组成的对。
适合于根据本发明的方法的一种类型的结合对是半抗原和抗半抗原抗体结合对。半抗原是分子量为100-2000道尔顿、优选150-1000道尔顿的有机分子。此小分子可以通过将其与载体分子偶联而赋予免疫原性，并且可以根据标准程序产生抗半抗原抗体。所述半抗原可以选自甾醇类、胆汁酸类、性激素类、皮质激素类、强心苷类、强心苷-糖苷类、蟾蜍二烯羟酸内酯类、甾类-皂角苷元类(steroid-sapogenines)和类固醇生物碱类、强心苷类和强心苷-糖苷类。这些物质类别的代表是洋地黄毒苷(digoxigenin)、洋地黄毒苷元(digitoxigenin)、羟基洋地黄毒苷元(gitoxigenin)、毒毛旋花苷配基(strophanthidin)、异羟基洋地黄毒苷原(digoxin)、洋地黄毒苷(digitoxin)、ditoxin和毒毛旋花苷(strophanthin)。另一种合适的半抗原是例如荧光素。
基于天然存在的高亲和力结合对的结合对的实例是生物素或生物素类似物，诸如氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白以及FimG和DsF结合对。生物素-(链霉)抗生物素蛋白结合对是本领域众所周知的。FimG-DsF结合对的基本原理例如描述于WO2012/028697中。
在一个实施方案中，结合对选自半抗原和抗半抗原抗体、生物素或生物素类似物诸如氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白、FimG和DsF以及受体和配体。
在一个实施方案中，结合对选自半抗原和抗半抗原抗体和生物素或生物素类似物诸如氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素/抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白、FimG和DsF。
在一个实施方案中，所述结合对是生物素(或生物素类似物，诸如氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素)和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。
在一个实施方案中，所述结合对由生物素和链霉抗生物素蛋白组成。
在一个实施方案中，根据本发明的结合对由具有1 0kD或更大的分子量的此类结合对的第一配偶体和具有1kD或更小的分子量的此类结合对的第二配偶体组成。如上所述，在一个实施方案中，具有10kD或更大的分子量的结合对的第一配偶体结合(涂覆)至用于根据本公开的方法中的微粒。
在根据本公开的基于微粒的方法中的一个实施方案中，所述结合对的第一配偶体分别选自抗生物素蛋白和/或链霉抗生物素蛋白和FimG，并且其中所述结合对的第二配偶体分别选自生物素或生物素类似物，诸如氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素和DsF。
在根据本公开的基于微粒的方法中的一个实施方案中，所述结合对的第一配偶体是抗生物素蛋白和/或链霉抗生物素蛋白，并且其中所述结合对的第二配偶体是生物素。
根据本发明的方法中使用的微粒用结合对的第一配偶体“涂覆”。此涂覆根据现有技术程序进行。结合对的第一配偶体可以通过吸附、通过共价结合或两种方法的组合结合至颗粒的表面。微粒任选地可以进一步孵育，例如，与蛋白如牛血清白蛋白一起孵育，以减少其他测定组分的非特异性结合。技术人员完全知道用于此任选阻断非特异性结合的方法。根据本领域中使用的术语，此类涂覆和封闭的微粒也被简称为涂覆的微粒。
结合对的第一配偶体的分子极为靠近地存在于微粒上，为该结合对的第二配偶体提供许多附近的结合位点。对于大多数实际/常规应用，结合对的第一配偶体以饱和浓度涂覆至微粒，产生最佳的涂覆密度。如技术人员所理解，如果期望，可以通过使用次最佳浓度的结合对的第一配偶体来降低涂覆密度。如果次最佳浓度的结合对的第一配偶体将用于涂覆，本领域技术人员将选择平均涂覆密度以匹配用于将分析物特异性结合剂结合至结合对的第二配偶体的接头长度。一般而言：涂覆的微粒上的结合对的第一配偶体的分子之间的平均距离将至多是用于将分析物特异性结合剂结合至结合对的第二配偶体的接头长度的两倍。距离因此是从一个分子的中心至另一个分子的中心。作为一个实例：聚乙二醇单元的平均长度为约0.38nm。因此，具有12个PEG-单元的接头具有约4.5nm的长度。为了允许结合对的第二配偶体的分子结合至相同微粒上的所述结合对的第一配偶体，颗粒上的结合对的第一配偶体的分子之间的平均距离将是9nm或更小。在一个实施方案中，结合对的第一配偶体的分子的平均距离是9nm或更小。在一个实施方案中，结合对的第一配偶体的分子的平均距离分别是9nm或8nm。在一个实施方案中，使用已经以饱和浓度的结合对的第一配偶体涂覆/已经用结合对的第一配偶体涂覆的微粒。
“分析物”或“目标分析物”或“目标分子”可以是可以被分析物特异性结合剂结合的任何分子。在一个实施方案中，本发明上下文中的分析物是核酸(DNA或RNA)分子、肽、蛋白、药物分子、激素或维生素。在一个实施方案中，本发明上下文中的分析物是肽、蛋白、药物分子、激素或维生素。
液体样品可以用于根据本公开的方法中的用于特异性体外检测分析物的方法中。可能已知样品包含分析物，或者可能怀疑其包含分析物。在一个实施方案中，在根据本公开的方法中使用的用于体外诊断的样品是选自全血、血清、血浆、液体、尿液或唾液的体液。在一个实施方案中，怀疑包含分析物或包含分析物的样品是血清、血浆或液体。在一个实施方案中，怀疑包含分析物或包含分析物的样品是血清或血浆。
根据本公开的用于测量分析物的方法利用分析物特异性结合剂。术语“分析物特异性结合剂”是指特异性结合目标分析物的分子。本公开意义上的分析物特异性结合剂通常包含能够结合至分析物(其他术语目标分析物；靶分子)的结合或捕获分子。在一个实施方案中，所述分析物特异性结合剂对其相应的靶分子即分析物至少具有107l/mol的亲和力。在其他实施方案中，分析物特异性结合剂对其靶分子具有108l/mol或甚至109l/mol的亲和力。如技术人员将理解，术语特异性用于表明存在于样品中的其他生物分子不显著性结合至对于分析物特异性的结合剂。在一些实施方案中，结合至除了靶分子以外的生物分子的水平导致为靶分子的亲和力的仅10％、更优选仅5％或更少的结合亲和力。在一个实施方案中，与分析物相比与其他分子的不结合亲和力是可测量的。在一个实施方案中，所述分析物特异性结合剂将满足上述关于亲和力以及特异性的最低标准。
在一个实施方案中，所述分析物特异性结合剂选自适体、肽适体、蛋白、寡核苷酸和分子印迹聚合物。
如在分析物特异性结合剂的上下文中使用的“适体”可以是短的核酸分子，例如RNA、DNA、PNA、CNA、HNA、LNA或ANA分子或本领域技术人员已知的能够结合分析物的任何其他合适的核酸形式。
肽适体是能够特异性结合至包含特定氨基酸序列的蛋白、多肽或肽的适体。通常，肽适体具有包含例如10至20个氨基酸的肽环。在本公开的上下文中，在具体实施方案中，肽适体可以在一个或两个末端连接至支架结构。所述支架结构可以是任何分子，优选蛋白，例如具有良好的溶解性的蛋白。合适的支架分子对于本领域技术人员是已知的。合适的支架分子的实例分别基于细菌蛋白硫氧还蛋白-A和FkpA-或SlyD-蛋白伴侣。适体肽环可以优选插入支架分子的还原活性位点内。或者，葡萄球菌蛋白A及其结构域和这些结构域的衍生物诸如蛋白Z或脂笼蛋白可用作肽适体。
核酸或肽适体可以根据本领域技术人员已知的任何合适的方法(例如，经由PCR或分子合成方法或酵母双杂交方法)产生。
如在分析物特异性结合剂的上下文中使用的“肽”可以包含2至49个氨基酸、氨基酸衍生物或其混合物的区段或者另外(alliteratively)由其组成。所述肽可以是线性的、分支的、环状的或其混合物。肽分析物特异性结合剂也可以连接至如上文定义的支架结构。
如在分析物特异性结合剂的上下文中使用的“多肽”或“蛋白”可以包含多于约50个氨基酸、氨基酸衍生物或其混合物的区段或者另外由其组成。所述蛋白可以具有线性的、分支的和环状形式或者由这些形式的混合物构成。
在一个实施方案中，所述分析物特异性结合剂是至少50个氨基酸的多肽。尽管理论上在分析物特异性结合剂的多肽长度上没有上限，但在一个实施方案中其将具有至多10.000个氨基酸。
如在分析物特异性结合剂的上下文中使用的“寡核苷酸”可以包含10至120个核苷酸、或12至60个、或15至40个核苷酸的区段或者另外由其组成。
寡核苷酸分析物特异性结合剂可以是RNA分子或DNA分子或两者的混合物。
如本文所用的术语“分子印迹聚合物”是指在分子存在的情况下形成的聚合物，所述分子随后被提取，留下互补空腔(印迹)。通常，分子印迹聚合物对原始分子显示特定化学亲和力。分子印迹聚合物可以由本领域技术人员已知的任何合适的聚合单元构成。用于其生产的技术包括聚合技术诸如本体(bulk)、沉淀、乳化、悬浮、分散、胶凝、多步骤溶胀聚合和分层印迹方法。
如分析物特异性结合剂的上下文中使用的“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分(片段)，即含有免疫特异性结合分析物的抗原结合位点的抗体或抗体片段。根据本发明的方法中使用的免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG 1、IgG2、IgG3、lgG4、lgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。抗体可以在它们识别或特异性结合的多肽的表位或部分的方面来描述或指定。特异性表位及其与抗体的相互作用对于本领域技术人员是已知的。
如在抗体的上下文中使用的术语“分析物特异性结合”是指抗体与分析物上的表位的免疫特异性结合。抗体经由其在分析物上的表位的分析物特异性结合的概念是本领域技术人员完全清楚的。
本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且具体涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、由至少两种不同抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的生物活性。在本公开的意义上的抗体还可以是通过抗体与一种或多种其他蛋白或肽的共价或非共价缔合形成的较大融合分子的一部分。
“分离的”抗体是已经从其天然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染组分是会干扰抗体的研究、诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其他蛋白或非蛋白溶质。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％(以抗体的重量计)，并且在一些实施方案中，纯化至大于99％，如使用例如考马斯蓝或银染，在还原或非还原条件下，通过SDS-PAGE测定。
免疫球蛋白G类抗体通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成。每条轻链通过一个共价二硫键连接至重链，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间不同。每条重链和轻链也具有规则间隔的链内二硫键(disulfide bridges)。每条重链在一端具有可变结构域(VH)，随后是多个恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(VL)，并且在其另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。据信特定氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链的可变结构域可以称为“VH”。轻链的可变结构域可以称为“VL”。这些结构域通常是抗体的最多变部分且包含抗原结合位点。
术语“可变的”是指可变结构域的某些部分在抗体间序列上差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的事实。然而，可变性并非均匀分布于抗体的整个可变结构域。其集中于轻链和重链可变结构域中称作高变区(HVR)的三个区段。可变结构域的更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，其大多数采取β-折叠构型，通过三个HVR连接，所述HVR形成连接β-折叠结构(且在一些情况下形成β-折叠结构的部分)的环。每条链中的HVR通过FR区极为靠近地保持在一起，并且与来自另一条链的HVR一起促成形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人，Sequencesof Proteins of Immunological Interest，第五版，National Institute of Health，Bethesda，MD(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出各种效应子功能，诸如抗体参与抗体依赖性的细胞毒性。
基于它们的恒定结构域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以被归为被称为kappa(κ)和lambda(λ)的两种明显不同的类型之一。
根据本发明的方法中使用的抗体可以来自任何动物来源。在一个实施方案中，所述抗体是人、鼠(例如小鼠和大鼠)、驴、猴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡抗体。
根据其重链的恒定结构域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可以被归到不同的类别。存在五种主要类别的人免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几种可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的，并且通常描述于例如Abbas等人Cellular and Mol.Immunology，第4版(w.B.Saunders，Co.，2000)。抗体可以是通过抗体与一种或多种其他蛋白或肽的共价或非共价缔合形成的较大融合分子的一部分。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“整个抗体”在本文中可互换地用于指以其基本上完整形式的抗体，而不是如下定义的抗体片段。该术语具体是指具有含有Fc区的重链的抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；单链抗体分子；scFv、sc(Fv)2；双抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段，各自具有单一抗原结合位点)和剩余的“Fc”片段(其名称反映了其容易结晶的能力)。胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)2片段，其具有两个抗原结合位点(antigen-combining sites)且仍能够交联抗原。
Fab片段含有重链和轻链可变结构域，并且还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab′片段通过在重链CH1结构域的羧基末端添加几个残基、包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸而不同于Fab片段。Fab′-SH是本文中对其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带游离巯基的Fab′的命名。F(ab′)2抗体片段最初作为在它们之间具有铰链半胱氨酸的成对Fab′片段而产生。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
“Fv”是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv种类由紧密、非共价缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头共价连接，使得轻链和重链可以以类似于双链Fv种类(sc(Fv)2)中的“二聚”结构缔合。正是以这种构型，每个可变结构域的三个HVR相互作用以限定VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。总共六个HVR赋予抗体抗原结合特异性。然而，甚至单个可变结构域(或仅包含对抗原特异性的三个HVR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管是以低于整个结合位点的亲和力。
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述片段包含与相同多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不允许同一链上的两个结构域之间的配对的接头，迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价或双特异性的。双抗体更完全地描述于例如，EP 404097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；和Holliger等人，PNAS USA 90：6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也描述于Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)。
如本文所使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，即构成群体的单一抗体除了可以少量存在的可能突变(例如天然存在的突变)以外是相同的。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征不是离散抗体的混合物。在某些实施方案中，此类单克隆抗体通常包括包含结合靶标的多肽序列的抗体，其中通过包括从多个多肽序列中选择单个靶标结合多肽序列的方法获得靶标结合多肽序列。例如，选择过程可以是从许多克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的合并物中选择独特克隆。应当理解，选择的靶标结合序列可进一步改变，例如以改善对靶标的亲和力、将靶标结合序列人源化、改善其在细胞培养物中的产生、降低其在体内的免疫原性、产生多特异性抗体等，并且包含改变的靶标结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体制备物的优势在于它们通常未被其他免疫球蛋白污染。
修饰语“单克隆”表明抗体的特征为从实质上同质的抗体群体获得，并且不应解释为需要通过任何特定方法来生产抗体。例如，待根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来制备，包括例如杂交瘤法(例如Kohler和Milstein.，Nature，256：495-97(1975)；Hongo等人，Hybridoma，14(3)：253-260(1995)，Harlow等人，Antibodies：A LaboratoryManual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版.1988)；Haemmerling等人于：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier，N.Y.，1981))，重组DNA方法(参见例如美国专利号4,816,567)，噬菌体展示技术(参见例如Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，PNAS USA 101(34)：12467-12472(2004)；和Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)，以及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中产生人或人样抗体的技术(参见例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等人，PNAS USA 90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature 362：255-258(1993)；Bruggemann等人，Year in Immunol.7：33(1993)；美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016；Marks等人，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg等人，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-813(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnol.14：845-851(1996)；Neuberger，Nature Biotechnol.14：826(1996)；以及Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。
单克隆抗体在本文中具体包括“嵌合”抗体(其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源)以及此类抗体的片段，只要它们表现出期望的生物学活性(例如，美国专利号4,816,567和Morrison等人，PNAS USA 81：6851-6855(1984))。嵌合抗体包括抗体，其中所述抗体的抗原结合区衍生自通过例如用目标抗原免疫猕猴而产生的抗体。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的HVR的残基被替换为来自具有期望特异性、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的HVR的残基。在一些情况中，将人免疫球蛋白的FR残基替换为相应的非人残基。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体中或在供体抗体中没有发现的残基。可以进行这些修饰以进一步改进抗体性能。通常，人源化抗体将包含至少一个且通常两个可变结构域的基本上全部，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。对于进一步细节，参见例如，Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。还参见例如，Vaswani和Hamilton，Ann.Allergy，Asthma&Immunol.1：105-115(1998)；Harris，Biochem.Soc.Transactions23：1035-1038(1995)；Hurle和Gross，Curr.Op.Biotech.5：428-433(1994)；和美国专利号6,982,321和7,087,409。
“人抗体”是具有对应于由人产生的抗体的氨基酸序列的氨基酸序列和/或使用用于制备如本文所公开的人抗体的任何技术制备的抗体。人抗体的这种定义具体排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域中已知的各种技术(包括噬菌体展示文库)来产生人抗体。Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581(1991)。还可用于制备人单克隆抗体的是以下中描述的方法：Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerner等人，J.Immunol.，147(1)：86-95(1991)。还参见van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.，5：368-74(2001)。可通过向已经修饰以响应于抗原性攻击而产生人抗体、但其内源基因座已经失能的转基因动物、例如免疫的异种小鼠(xenomice)施用抗原来制备人抗体(关于XENOMOUSETM技术，参见例如美国专利号6,075,181和6,150,584)。关于经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体，还参见例如Li等人，PNAS USA，103：3557-3562(2006)。
术语“高变区”、“HVR”或“HV”当用于本文时是指抗体可变结构域的序列高度可变和/或形成结构上确定的环的区域。通常，抗体包含六个HVR；VH中的三个(H1、H2、H3)和VL中的三个(L1、L2、L3)。在天然抗体中，H3和L3展现出六个HVR的最大多样性，并且H3具体被认为在为抗体赋予精细特异性中发挥独特作用。参见例如Xu等人Immunity 13：37-45(2000)；Johnson和wu，Methods in Molecular Biology 248：1-25(Lo，编，Human Press，Totowa，NJ，2003)。事实上，仅由重链组成的天然存在的骆驼抗体在轻链不存在的情况下是有功能的且稳定的。参见例如Hamers-Casterman等人，Nature 363：446-448(1993)和Sheriff等人，Nature Struct.Biol.3：733-736(1996)。
本文中使用且涵盖许多HVR描述。作为Kabat互补决定区(CDR)的HVR基于序列变异性，而且是最常用的(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))。Chothia相反是指结构环的位置(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。AbMHVR代表Kabat CDR和Chothia结构环之间的折衷，并且由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。“接触”HVR基于可得的复合物晶体结构的分析。下文注明来自这些HVR中每一个的残基。
HVR可包含如下“延伸的HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)，46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)以及VH中的26-35(H1)，50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些延伸的HVR定义中的每一个，可变结构域残基根据Kabat等人(同上)编号。
表述“如Kabat中的可变结构域残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变型是指Kabat等人(同上)中的抗体的编辑的用于重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用该编号系统，实际的线性氨基酸序列可以含有更少或额外的氨基酸，其对应于可变结构域的FR或HVR的缩短或插入。例如，重链可变结构域可以包括H2的残基52后的单一氨基酸插入物(根据Kabat，残基52a)以及重链FR残基82后的插入的残基(例如，根据Kabat，残基82a、82b和82c等)。对于给定抗体，残基的Kabat编号可通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列的同源区处的对比来确定。
如本文所公开，结合对的第二配偶体经由包含12至30个乙二醇单元(PEG 12至30)的接头与分析物特异性结合剂结合。
术语“接头”表示可用于将第一部分与第二部分或更多部分缀合(连接)的双官能或多官能部分。包含彼此结合的第一部分和第二部分的缀合物可以使用具有两个反应性官能团(reactive functionalities)的接头方便地制备。在此缀合物中，两个部分“经由”该接头结合。如技术人员显而易见，在此缀合物中，接头的官能部分作为键的一部分而不是未反应的官能部分存在。
不希望束缚于理论，据信包含12至30个乙二醇单元的接头对于本文公开的令人惊讶的发现是关键的。在用于测量分析物的基于微粒的测定的现有技术中，仅严肃考虑短的含PEG接头分子。US 5,521,319公开了一种新型试剂，其证明对于生物分子的生物素化非常有用。教导接头的长度是短的，即至多5个环氧乙烷单元，优选仅1至3个环氧乙烷单元，最优选两个此类单元。与该教导相反，现在令人惊讶地发现，在基于微粒的分析物特异性结合测定中，长接头分子-包含12至30个环氧乙烷单元(＝PEG 12至30)-如果用于将结合对的第二成员(例如生物素)偶联至分析物特异性试剂，将是有利的。
用于将生物素经由PEG-接头连接或偶联至靶分子的适当试剂是例如根据式I的试剂。
如将理解，式I中的(n)涉及乙二醇单元的数目。n优选为12至30。
本发明的方法可以以各种各样的形式构建。此类形式包括本领域已知的形式，诸如夹心测定和竞争性结合测定(参见例如，以下参考文献：Nonradioactive Labeling andDetection of Molecules，Kessler，C.，编，Springer-Verlag：Berlin 1992；TheImmunoassay Handbook，Wild，D.，编，Stackton Press；New York 1994；Keller，G.H.和Manak，M.M.DNA Probes，第2版，MacMillan Publishers Ltd.：London，1993；TietzTextbook of Clinical Chemistry第2版，Burtis等人编，W.B.Saunders and Co.；Philadelphia，1994)。
在根据本公开的方法中，测量分析物。如本领域技术人员将容易理解，与微粒结合的分析物的测量通常通过测量由适当的测定组分上的标记物携带或产生的信号并通过从分析物的标准曲线计算分析物的浓度(即由此测量分析物)来进行。标记物通常与之附接的测定组分是第二分析物特异性结合剂(夹心型测定)，或者该测定利用标记分析物和样品中的分析物之间的竞争。在测量标记物之前，将包含标记的测定组分的部分的微粒与未结合至微粒的标记的测定组分的部分分离。
在一个实施方案中，本公开的方法以夹心测定形式实施。
典型的夹心测定形式包括混合涂覆有结合对的第一配偶体的微粒、结合至结合对的第二配偶体的分析物特异性结合剂、怀疑包含分析物或包含分析物的样品和可检测标记的第二分析物特异性结合剂，其中所述结合对的第二配偶体经由包含12至30个乙二醇单元(PEG 12至30)的接头结合至所述分析物特异性结合剂。如技术人员显而易见，将这些组分混合并孵育足够长的时期以便将可检测标记的分析物特异性结合剂(经由分析物)、(结合至)结合对的第二配偶体的分析物特异性结合剂和结合对的第一配偶体结合至微粒。在一个实施方案中，夹心测定法没有洗涤步骤，此混合/孵育在单个反应容器中进行。添加和混合四种成分(分别为涂覆的微粒、样品、结合至结合对的第二配偶体的分析物特异性结合剂和可检测标记的分析物特异性结合剂)的顺序不是关键的。在一个实施方案中，夹心测定法具有洗涤步骤，涂覆有结合对的第一成员的微粒、样品和结合至结合对的第二配偶体的分析物特异性结合剂的添加和混合在单个反应容器中进行。在该第一(分析物捕获)步骤之后，在添加可检测标记的分析物特异性结合剂之前洗涤分析物现在已结合的微粒。添加和混合前三种成分(分别为涂覆的微粒、样品和结合至结合对的第二配偶体的分析物特异性结合剂)的顺序不是关键的。
在夹心型测定形式中，在一个实施方案中，结合至结合对的第二配偶体的分析物特异性结合剂和可检测标记的分析物特异性结合剂分别各自在不同且不重叠的表位处结合至分析物。
在一个实施方案中，本公开的方法以竞争测定形式实施。
典型的竞争测定形式包括混合涂覆有结合对的第一配偶体的微粒、结合至结合对的第二配偶体的分析物特异性结合剂、怀疑包含分析物或包含分析物的样品和一定量的被可检测标记的分析物，其中所述结合对的第二配偶体经由包含12至30个乙二醇单元(PEG12至30)的接头结合至所述分析物特异性结合剂。如技术人员显而易见，将这些组分混合并孵育足够长的时期以结合可检测标记的分析物的部分，所述部分-在被样品中的分析物竞争之后-能够经由(结合至)结合对的第二配偶体的分析物特异性结合剂和涂覆至微粒的结合对的第一配偶体结合至微粒。
用于标记分析物特异性结合剂或分析物的方法是本领域技术人员众所周知的，并且大量描述于例如Haugland(2003)Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probesand Research Chemicals，Molecular Probes，Inc.；Brinkley(1992)BioconjugateChem.3：2；Garman，(1997)Non-Radioactive Labeling：A Practical Approach，AcademicPress，London；Means(1990)Bioconjugate Chem.1：2；Glazer等人Chemical Modificationof Proteins.Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology(T.S.Work和E.Work，编)American Elsevier Publishing Co.，New York；Lundblad，R.L.和Noyes，C.M.(1984)Chemical Reagents for Protein Modification，Vols.I and II，CRC Press，New York；Pfleiderer，G.(1985)″Chemical Modification of Proteins″，Modern Methods in Protein Chemistry，H.Tschesche，编，Walter DeGruyter，Berlinand New York；和Wong(1991)Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking，CRC Press，Boca Raton，Fla.)；DeLeon-Rodriguez等人，Chem.Eur.J.10(2004)1149-1155；Lewis等人，Bioconj ugate Chem.12(2001)320-324；Li等人，Bioconjugate Chem.13(2002)110-115；Mier等人Bioconjugate Chem.16(2005)240-237。
术语可检测标记的涵盖可以直接或间接检测的标记物。
间接可检测标记的是指例如用半抗原标记并通过携带直接可检测标记物的抗半抗原抗体检测此半抗原化的化合物，或用酶标记并通过其相应的酶活性(导致合适染料底物的转化)检测此酶。各种酶-底物标记物是可获得或公开的(参见，例如，US 4,275,149)。该酶通常催化生色底物的化学改变，其可以使用各种技术进行测量。例如，该酶可以催化底物的颜色变化，其可以分光光度测量。或者，该酶可以改变底物的荧光或化学发光。化学发光底物因化学反应变得被电子激发并且然后可以发射可测量(例如，使用化学发光计)的光或将能量递送至荧光受体。酶促标记物的实例包括萤光素酶(例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；US 4,737,456)、萤光素、2，3-二氢酞嗪二酮类、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶诸如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶((3-galactosidase)、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于将酶缀合至多肽的技术描述于O′Sullivan等人″Methods for the Preparation of Enzyme-AntibodyConjugates for use in Enzyme Immunoassay″，于Methods in Enzym.(由J.Langone&ITVan Vunakis编辑)，Academic Press，New York，73(1981)147-166。
酶-底物组合的实例(US 4,275,149；US 4,318,980)包括，例如：辣根过氧化物酶(HRP)与作为底物的过氧化氢酶，其中所述过氧化氢酶氧化染料前体(例如，邻苯二胺(OPD)或3，3′，5，5′-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；碱性磷酸酶(AP)与作为生色底物的磷酸对硝基苯酯；和β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与生色底物(例如，对硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷酶。
直接可检测的标记物或者提供可检测的信号，或者它们与第二标记物相互作用以修改由第一或第二标记物提供的可检测信号，例如，产生FRET(荧光共振能量转移)。标记物诸如荧光染料和发光(包括化学发光和电化学发光)染料(Briggs等人″Synthesis ofFunctionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and AminoAcids，″J.Chem.Soc.，Perkin-Trans.1(1997)1051-1058)提供可检测信号，并且通常适用于标记。在一个实施方案中，可检测标记的是指即分别对于荧光标记物、化学发光标记物或电化学发光标记物提供或可诱导以提供可检测信号的标记物。
在根据本公开的一个实施方案中，基于微粒的分析物特异性结合测定利用化学发光或电化学发光标记物和相应的光检测系统。测量由标记物产生的光且所述光直接或间接指示分析物的存在或数量。
电化学发光(ECL)测定提供了目标分析物的存在和浓度的灵敏和精确的测量。此类技术使用当在适当的化学环境中电化学氧化或还原时可以诱导发冷光的标记物或其他反应物。此电化学发光由以特定时间和特定方式施加在工作电极上的电压触发。测量由标记物产生的光且所述光指示分析物的存在或数量。为了更全面描述此类ECL技术，可以参考美国专利号5,221,605、美国专利号5,591,581、美国专利号5,597,910、PCT公开申请WO90/05296、PCT公开申请WO92/14139、PCT公开申请WO90/05301、PCT公开申请WO96/24690、PCT公开申请US95/03190、PCT申请US97/16942、PCT公开申请US96/06763、PCT公开申请WO95/08644、PCT公开申请WO96/06946、PCT公开申请WO96/33411、PCT公开申请WO87/06706、PCT公开申请WO96/39534、PCT公开申请WO96/41175、PCT公开申请WO96/40978、PCT/US97/03653和美国专利申请08/437,348(美国专利号5,679,519)。还参考1994年Knight等人的ECL分析应用的综述(Analyst，1994，119：879-890)和其中引用的参考文献。在一个实施方案中，使用电化学发光标记物来实施根据本说明书的方法。
如上所提及，电化学发光由以特定时间和特定方式施加在工作电极上的电压触发。现有技术中没有详细提及的是微粒在工作电极上的分布对测定的质量具有重大影响的事实。微粒之间存在的聚集体越多-根据经验-一种或多种测定特征的质量越低。聚集的颗粒通常导致测量之间更高的变异系数、更高的背景信号和/或降低的测定灵敏度。
如可以容易想象的，使用结合至结合对的第二配偶体且每个分析物特异性结合剂分子包含两个或更多个第二结合配偶体分子的分析物特异性结合剂可以容易地导致涂覆有结合对的第一个配偶体(的许多分子)的微粒的聚集。因此，在现有技术中，已经进行了许多尝试来产生由一个分析物特异性结合剂分子和一个结合对的第二配偶体分子组成的缀合物。适合于获得此类1∶1缀合物的方法例如描述于US 6,391,571中。
近期最重要的位点特异性蛋白标记(特别是蛋白的位点特异性单标记)方法之一是经由酶促反应将生物正交官能团(bioorthogonal functionalities)并入这些蛋白的特定位点处。对于关于“蛋白的酶促标记”的最近综述，参见M.Rashidian等人，BioconjugateChemistry 24(2013)1277-1294。该综述中涵盖的用于位点特异性缀合的酶包括甲酰甘氨酸生成酶、唾液酸转移酶、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶、O-GlcNAc翻译后修饰、sortagging、谷氨酰胺转移酶、法尼基转移酶、生物素连接酶、硫辛酸连接酶和N-肉豆蔻酰基转移酶。
令人惊讶地，如贯穿实施例部分所示，经由包含12至30个乙二醇单元(PEG 12至30)的接头结合至结合对的第二配偶体的单分子的分析物特异性结合剂，例如单生物素化抗体，导致关于变异系数和信噪比的非常好的测定性能。
另外，使用结合至结合对的第二配偶体的分析物特异性结合剂(其中所述结合对的第二配偶体经由包含12至30个乙二醇单元(PEG 12至30)的接头结合至所述分析物特异性结合剂)，似乎不需要单生物素化或去除通过使用标准偶联化学获得的高于1∶1化学计量的缀合物。如预期，包含高于1∶1化学计量的缀合物的缀合物制剂倾向于导致珠粒聚集。然而，如果结合对的第二配偶体经由包含12至30个乙二醇单元(PEG 12至30)的接头结合至分析物特异性结合剂，甚至以高于1∶1化学计量，则该效果更不可见、明显。
不希望受这种理论束缚，可能的解释可能是这些相对长和柔性的PEG接头允许结合对的许多第二配偶体快速结合至涂覆的微粒上存在的和附近的此结合对的第一配偶体的结合位点。相反，分析物特异性结合剂上的结合对的几个第二配偶体可能具有太短的接头，不能结合至同一微粒上的另一第一结合配偶体，并且倾向于在第二微粒上找到合适的第一结合配偶体-由此明显促进珠粒聚集的趋势。图1和图2尝试图示说明该理论。
为了避免用结合对的第二配偶体“过度标记”，到目前为止标准化学必须使用分析物特异性结合剂和结合对的第二成员的相对低的比率。为了实现缀合物制剂的平均1∶1化学计量，通常使用相比于分析物特异性结合剂(例如抗体)1.3倍过量的结合对的第二配偶体(例如生物素化试剂中的生物素)。在此类1.3∶1偶联条件下，所得缀合物制剂包含约37％的非缀合抗体；约37％的单生物素化抗体，但也分别包含18％、6％和2％的双生物素化抗体、三生物素化抗体或多于三生物素化的抗体。通常必须纯化代表1∶1-缀合物的级分用于在商业免疫测定中实现最佳结果。
相反，如果结合对的第二配偶体经由包含12至30个乙二醇单元(PEG 12至30)的接头结合至所述分析物特异性结合剂，则可以使用标准偶联化学-甚至对于以更高的摩尔比偶联/结合的结合对的第二成员-并且不需要分离包含1∶1缀合物的级分。显而易见的是，除了本文公开的方法中的此类缀合物的性能之外，这在此类缀合物的生产中是巨大的优势。
在一个实施方案中，本公开涉及组合物中包含的结合至结合对的第二配偶体的缀合的特异性结合剂，其中在所述组合物中，结合至分析物特异性结合剂的结合对的第二配偶体之间的平均摩尔比为1.1或更高。
在一个实施方案中，本公开涉及组合物中包含的结合至结合对的第二配偶体的缀合的特异性结合剂，其中在所述组合物中，结合至分析物特异性结合剂的结合对的第二配偶体之间的平均摩尔比为1.1至10。
在一个实施方案中，本公开涉及组合物中包含的结合至结合对的第二配偶体的缀合的特异性结合剂，其中在所述组合物中，结合至分析物特异性结合剂的结合对的第二配偶体之间的平均摩尔比为1.2至6。
在一个实施方案中，本公开涉及用于在基于微粒的分析物特异性结合测定中测量分析物的方法，其中所述微粒涂覆有结合对的第一配偶体，所述方法包括a)混合所述涂覆的微粒、结合至结合对的第二配偶体的分析物特异性结合剂和怀疑包含分析物或包含分析物的样品，其中所述结合对的第二配偶体经由包含12至30个乙二醇单元(PEG 12至30)的接头结合至所述分析物特异性结合剂，由此将分析物经由分析物特异性结合剂结合至涂覆的微粒，并且其中组合物中包含结合至结合对的第二配偶体的所述缀合的特异性结合剂，其中在所述组合物中，结合至分析物特异性结合剂的结合对的第二配偶体之间的平均摩尔比为1.1或更高，b)将包含经由结合对和分析物特异性结合剂结合的分析物的微粒从混合物中分离，和c)测量结合至微粒的分析物。
在一个实施方案中，本发明涉及试剂盒，其在单独的容器中或在单个容器单元的分开的隔室中至少包含涂覆有结合对的第一配偶体的微粒和结合至所述结合对的第二配偶体的分析物特异性结合剂，其中所述结合对的第二配偶体经由包含12至30个乙二醇单元(PEG 12至30)的接头结合至所述分析物特异性结合剂。
术语单个容器单元涉及如下事实：对于许多自动化分析仪，如来自Roche诊断的分析仪系列，测量某种分析物所需的试剂以“试剂包”的形式提供，即作为安装在分析仪上并且在不同的隔室中包含测量目标分析物所需的所有关键试剂的一个容器单元。
在一个实施方案中，本发明涉及试剂盒，其中所述结合对的第一配偶体是抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，并且其中所述结合对的所述第二配偶体选自生物素或生物素类似物，诸如氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素。
在一个实施方案中，本公开涉及试剂盒，其在单独的容器中或在单个容器单元的分开的隔室中至少包含涂覆有抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的微粒，和生物素化的分析物特异性结合剂，其中所述生物素经由包含12至30个乙二醇单元(PEG 12至30)的接头结合至所述分析物特异性结合剂。
附图说明
图1：由经由现有技术的接头结合至几个生物素部分(Bi)并结合至不同珠粒上的链霉抗生物素蛋白分子(珠粒上的十字)的分析物特异性结合剂引起的珠粒聚集的示意图。
图2：由于使用经由包含l 2至30个乙二醇单元的接头结合至几个生物素部分(Bi)并结合至相同珠粒上的链霉抗生物素蛋白分子(珠粒上的十字)的分析物特异性结合剂而没有珠粒聚集的示意图。
图3：如在使用生物素-DDS用于生物素化的实验性HCV核心抗原测定中获得的自动化e601分析仪(Roche Diagnostics GmbH)的测量(工作)电极上的珠粒的模式：上面行中的两个图片代表阴性或对照样品中的珠粒分布。下面行中的两个图片代表HCV阳性样品中的珠粒分布。左手侧的两个图片代表用单生物素化抗体的珠粒分布。右手侧的两个图片代表用通过在制备缀合物中每个抗体使用3.5当量的生物素化试剂获得的缀合物制剂的珠粒分布。从右手图片可以明显看出，珠粒分布是非常不均匀的/受干扰，其中电极的左侧部分具有大部分珠粒。
图4：如在使用生物素-PEG24-NHS用于生物素化的实验性HCV核心抗原测定中获得的自动化e601分析仪(Roche Diagnostics GmbH)的测量(工作)电极上的珠粒的模式：上面行中的两个图片代表阴性或对照样品中的珠粒分布。下面行中的两个图片代表HCV阳性样品中的珠粒分布。左手侧的两个图片代表用单生物素化抗体的珠粒分布。右手侧的两个图片代表用通过在制备缀合物中每个抗体使用5当量的生物素化试剂获得的缀合物制剂的珠粒分布。甚至在生物素化试剂/抗体的这种高比率下，所述珠粒在电极上显示均匀的分布。
提供以下实施例、附图和顺序以帮助理解本发明，其真正范围在随附权利要求中记载。应理解的是，在不偏离本发明的精神的情况下可以对所述的程序进行修改。
尽管为了清楚理解的目的已经通过举例说明和实施例的方式较详细地描述了前述发明，但说明书和实施例不应被解释为限制本发明的范围。
具体实施方式
实施例
单克隆抗体通过上文所述的标准杂交瘤技术或通过重组NA技术来制备。
重组DNA技术
使用标准方法来操作DNA，如Sambrook，J.等人，Molecular cloning：Alaboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork，1989中所述。根据制造商的说明使用分子生物学试剂。
基因和寡核苷酸合成
通过Geneart GmbH(Regensburg，德国)的化学合成来制备期望的基因片段。将合成的基因片段克隆至大肠杆菌质粒中用于繁殖/扩增。通过DNA测序验证亚克隆的基因片段的DNA序列。或者，通过退火化学合成的寡核苷酸或通过PCR来装配短的合成DNA片段。相应的寡核苷酸由metabion GmbH(Planegg-Martinsried，德国)制备。
基本/标准哺乳动物表达质粒的描述
为了表达期望的基因/蛋白(例如全长抗体重链、全长抗体轻链或在其N-末端含有寡聚甘氨酸的Fc链)，使用包含以下功能元件的转录单元：
-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子(P-CMV)，其包括内含子A，
-人重链免疫球蛋白5’-非翻译区(5’UTR)，
-鼠免疫球蛋白重链信号序列，
-待表达的基因/蛋白(例如全长抗体重链)，和
-牛生长激素多聚腺苷酸化序列(BGH pA)。
除了包括待表达的期望基因的表达单元/盒之外，基本/标准哺乳动物表达质粒含有
-来自载体pUC18的复制起点，其允许该质粒在大肠杆菌中复制，和
-在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
蛋白测定
使用基于多肽的氨基酸序列计算的摩尔消光系数或使用比色BCA方法，通过测定280nm处的光密度(OD)来测定纯化的多肽的蛋白浓度。
实施例1：活化的生物素化试剂的合成
EP 632 810中公开了现有技术的包含活化生物素的接头(生物素化试剂)、如广泛使用的接头生物素-DDS的合成。
生物素-PEGn-NHS-生物素化试剂(CAS-Nr.365441-71-0；n＝环氧乙烷单元的数目)或者从IRIs Biotech GmbH获得或者内部合成。生物素-PEG～110-NHS(Biotin-PEG-NHS，MW 5000Da)购自Iris Biotech GmbH(德国)。
在从头合成中，通过较短PEG(诸如四甘醇)的逐步伸长，遵循Chen和Baker，J.Org.Chem.1999，64，6840-6873中描述的方法，来保证环氧乙烷单元的离散数目的控制。
在第一步中，已经获得双-三苯甲基-PEGn 1(显而易见，n代表乙二醇单元的数目)。
1的脱保护通过在1M HCl/二氧杂环己烷中在室温下搅拌1小时来进行。蒸发后，将残余物在甲醇中回流，直至获得澄清溶液，并将烧瓶在4℃下保持过夜。过滤后，用己烷萃取溶液，蒸发甲醇层并干燥，以得到作为油或蜡的相应的PEGn-二醇2(稠度取决于PEG的单元长度/数目(n))。
接下来，根据Seitz和Kunz，J.Org.Chem.1997，62，813-826，通过钠催化将PEGn-二醇添加至丙烯酸叔丁酯来实施酸官能团的引入。以该方式获得化合物3。
在0℃下，向HO-PEGn-COOtBu 3(1当量)和三乙胺(2.5当量)于二氯甲烷中的溶液中逐滴添加甲基磺酰氯(2当量)。搅拌1小时后，随后进行含水后处理(aqueous work-up)和蒸发。
通过在二甲基甲酰胺中在室温下搅拌2天来使甲磺酸酯(mesylate)4(1当量)与NaN3(2当量)直接反应。除去固体和二甲基甲酰胺后，随后用乙醚和Na2CO3进行含水后处理。
将粗产物5通过在乙酸乙酯/甲醇15/1中二氧化硅上的柱色谱来纯化。通过在室温下用三苯基膦(1.1当量)在四氢呋喃/水4/1中搅拌24小时来进行叠氮化物5(1当量)的还原。蒸发后，将残余物悬浮于水中，并用乙酸乙酯洗涤数次。将水层蒸发并干燥，以得到作为无色油状物的胺6。
叔丁酯的裂解用5％三氟乙酸/水来进行。通过用水蒸发数次来获得氨基-PEGn-酸7。
生物素通过与相应的N-羟基琥珀酰亚胺酯8(1.05当量)与三乙胺(4当量)在二甲基甲酰胺中在室温下偶联过夜来引入。
蒸发后，通过RP-HPLC在乙腈/水中纯化粗产物9。
最后，通过与N-羟基琥珀酰亚胺(1.1当量)和乙基二甲基氨基丙基碳化二亚胺(1.1当量)在二氯甲烷中反应来形成N-羟基琥珀酰亚胺酯10。反应完成后，反应混合物用二氯甲烷稀释并用水洗涤。根据环氧乙烷单元的数目，蒸发和干燥分别产生作为油、蜡或固体的纯生物素-PEGn-NHS 10。
方案1：生物素-PEG(n)-NHS的合成。
实施例2：生物素和钌部分分别与抗体的偶联
根据本领域技术人员完全熟悉的现有技术程序来获得并纯化抗体。
对于偶联，通常通过N-羟基-琥珀酰亚胺活化的化合物来靶向抗体的赖氨酸ε-氨基基团。在10mg/ml的蛋白浓度，抗体分别与N-羟基-琥珀酰亚胺活化的生物素化试剂和N-羟基-琥珀酰亚胺活化的钌标记试剂反应。生物素化或标记试剂(分别)/蛋白(抗体)的摩尔比范围为1.3∶1至5∶1，这取决于各自的抗体缀合物。反应缓冲液为50mM磷酸钾(pH 8.5)、150mM KCl。反应在室温下进行30分钟，并通过添加L-赖氨酸至10mM的最终浓度来终止。偶联反应后，通过将粗抗体缀合物通过凝胶过滤柱(Superdex 200 HI Load)或通过透析来除去未反应的游离生物素/标记物。
为了获得单生物素化的抗体缀合物，将0.5-1M硫酸铵添加至缀合物溶液。使溶液通过用50mM磷酸钾(pH7.5)、150mM KCl、0.5-1M硫酸铵平衡的链霉抗生物素蛋白突变蛋白吸附剂(参见DE19637718)。没有任何生物素与之偶联/结合的抗体不能结合吸附剂并被洗掉。单生物素化的抗体缀合物用50mM磷酸钾(pH7.5)、150mM KCl和2％DMSO洗脱。用50mM磷酸钾(pH7.5)、150mM KCl和2mM生物素(“+mSA”)洗脱每个抗体具有多于一个生物素的抗体缀合物。
实施例3
生物素化试剂中的接头对HCV核心抗原的免疫学检测的影响
通过使用包含各种接头的生物素化试剂将一种和相同的抗HCV(捕获)抗体缀合至生物素。在自动化e601分析仪(，Roche Diagnostics GmbH)上评价不同的生物素-接头-抗体缀合物的性能。
以夹心测定形式进行测量。e601分析仪中的信号检测基于电化学发光。在该夹心测定中，将生物素-缀合物(即捕获抗体)固定在链霉抗生物素蛋白涂覆的磁珠(平均珠尺寸2.8μm)的表面上。检测-抗体携带络合的钌阳离子作为信号传导部分。在分析物存在的情况下，将显色钌络合物桥接至固相，并在/>e601分析仪的测量室中包含的铂电极处激发后发射620nm处的光。信号输出为任意光单位。用购自几个来源的HCV核心抗原阳性和阴性人血清和血浆样品进行测量。
实验性HCV核心抗原测定如下进行。将50μl正常或HCV抗原阳性样品和25μl含有用于释放抗原的预处理试剂的洗涤剂一起孵育9分钟，随后添加于pH 7.0且包含100mM磷酸钾和225mM KCl的相同生理缓冲液中的35μl的2μg/ml捕获抗体-生物素缀合物和40μl的1μg/ml检测抗体钌标记物缀合物。额外9分钟孵育时间后，添加50μl链霉抗生物素蛋白涂覆的顺磁性微粒并再孵育9分钟。之后，检测HCV核心抗原(经由在这些实验中产生的电化学发光信号)。
表1
不同的HCV捕获抗体缀合物的比较
通常，高信噪比(S/N)和低变异系数(CV)(特别是对于背景信号)是重要的测定性能参数，特别是关于测定的检测下限(测定灵敏度)。如在EP632810中公开，在基于链霉抗生物素蛋白涂覆的微粒的测定法中，生物素-DDS生物素化试剂相对于分别包含较短或较长接头的其他生物素化试剂如生物素-NHS或生物素-X-NHS是优选的。
为了评价工作电极上的珠粒分布模式，光电倍增管被相机取代。通常，在工作电极上在磁捕获期间，顺磁性链霉抗生物素蛋白涂覆的微粒的珠粒聚集和/或不均匀的珠粒分布模式已知会导致部分信号损失，尤其是增加的CV。也已知在一些样品中存在的所谓的基质效应可以进一步增加由珠粒聚集引起的问题。
表1中的数据显示，如果和抗体仅与单个生物素-DDS部分的缀合物相比，每个抗体缀合有多个生物素-DDS部分的抗体具有更高的S/N值。然而，与其单一生物素化的对应物相比，这样做的代价是不含分析物血清的CV值更高。此外，用生物素-DDS对抗体的多重生物素化诱导了顺磁性链霉抗生物素蛋白涂覆的微粒的珠粒聚集，这在工作电极上进行磁性捕获期间通过非常不均匀的珠粒分布模式而变得明显(图3)。(因为这里使用的阴性血清没有基质效应，所以对CV的负面影响仅为中等)。严格的单生物素化的生物素-DDS缀合物在工作电极上显示均匀得多的珠粒模式，因此其不太倾向于基质效应(图3)。
使用包含长得多的接头用于生物素化以产生单生物素化的缀合物的生物素-PEG24-NHS，可以分别增加和降低信噪比和CV值。关于基于生物素-DDS的单缀合物，珠粒模式是非常均匀的(图4)。令人惊讶的是，就生物素-PEG24单缀合物而言，关于信噪比以及关于变异系数两者，可以获得非常好的结果。通过使用每个抗体缀合有多个生物素-PEG24-NHS生物素化试剂的抗体，可以获得与对于单生物素化的缀合物获得的结果相当的均匀的珠粒分布模式和低CV值(图4)。至少在这些实验中使用的每个抗体的生物素残基范围内，信噪比随着每个抗体的生物素残基数目的增加而增加。
实施例4
生物素化试剂中的接头对肌钙蛋白T(TnT)的免疫学检测的影响
通过使用包含各种接头的生物素化试剂将一种和相同的抗肌钙蛋白T(抗TnT)(捕获)抗体缀合至生物素。基于根据Elecsys肌钙蛋白Ths测定试剂盒的说明书的实验方案，在自动化e601分析仪(Roche Diagnostics GmbH)上评价不同生物素-接头-抗体缀合物的性能。
以夹心测定形式进行测量。e601分析仪中的信号检测基于电化学发光。在该夹心测定中，将生物素-缀合物(即捕获抗体)固定在链霉抗生物素蛋白涂覆的磁珠(平均珠尺寸2.8μm)的表面上。检测-抗体携带络合的钌阳离子作为信号传导部分。在分析物存在的情况下，将显色钌络合物桥接至固相，并在/>e601分析仪的测量室中包含的铂电极处激发后发射620nm处的光。信号输出为任意光单位。
用补充限定量的重组人心脏TnT的人血清作为校准物进行测量，并且结果在表2中给出。
表2：用实验性肌钙蛋白T-测定获得的结果
从表2中给出的数据可以得出结论，用长生物素-PEG24-NHS生物素化试剂产生的捕获抗体缀合物相对于较短的生物素-DDS生物素化试剂是优异的，无论生物素和抗体之间的平均比率。(如实施例1中所解释，具有注释“+mSA”的缀合物代表每个抗体包含两个或更多个生物素部分的级分)。
实施例5
在HCV核心抗原原型测定上生物素化试剂中的接头长度的变化
为了确定接头的最佳长度，将不同生物素-PEG(n)-NHS衍生物与HCV捕获抗体缀合，并且在HCV核心抗原实验测定中测量，如实施例3中所述。对于每种生物素化试剂，产生单生物素化和多生物素化的缀合物，且结果在表3中给出。
表3：PEG-接头长度对HCV核心抗原实验测定的性能的影响
如从表3可以看出，用包含12至30个乙二醇单元的接头已经实现了如经由信噪比(S/N)所示的非常好的结果。通过使用生物素-PEG24-NHS生物素化试剂产生的变体倾向于显示有点最佳的信噪比。然而，如从表3可以明显看出，包含12至30个乙二醇单元的接头相对于还测试的较短接头以及较长接头是相当优异的，并且产生良好的结果。
Claims (14)
1.用于在基于微粒的分析物特异性结合测定中测量分析物的方法，其中所述微粒涂覆有结合对的第一配偶体，所述方法包括：
a)混合所述涂覆的微粒、结合至结合对的第二配偶体的分析物特异性结合剂和怀疑包含分析物或包含分析物的样品，
其中结合对的所述第二配偶体经由包含12至30个乙二醇单元(PEG 12至30)的接头结合至所述分析物特异性结合剂，由此将分析物经由分析物特异性结合剂结合至涂覆的微粒，
b)将包含经由结合对和分析物特异性结合剂结合的分析物的微粒从混合物中分离，和
c)测量结合至微粒的分析物，
其中结合至结合对的第二配偶体的所述缀合的特异性结合剂包含于组合物中，其中在所述组合物中，所述结合对的第二配偶体与分析物特异性结合剂之间的平均摩尔比为1.1或更高。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述微粒直径为50nm至20μm。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述微粒是顺磁性的，并且步骤1(b)中的分离通过磁力。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述分析物特异性结合剂是至少50个氨基酸的多肽。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述分析物特异性结合剂是最多10,000个氨基酸的多肽。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述分析物特异性结合剂是抗体或其抗原结合片段。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述分析物以竞争测定形式进行测量。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述分析物以夹心测定形式进行测量。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中结合至所述微粒的分析物的所述测量基于使用电化学发光标记物。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中结合对的所述第一配偶体分别选自抗生物素蛋白和/或链霉抗生物素蛋白和FimG，并且其中结合对的所述第二配偶体分别选自生物素或生物素类似物，诸如氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素和DsF。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中结合对的所述第一配偶体是抗生物素蛋白和/或链霉抗生物素蛋白，并且其中结合对的所述第二配偶体是生物素。
12.试剂盒，其在单独的容器中或在单个容器单元的分开的隔室中至少包含涂覆有结合对的第一配偶体的微粒和结合至所述结合对的第二配偶体的分析物特异性结合剂，其中结合对的所述第二配偶体经由包含12至30个乙二醇单元(PEG 12至30)的接头结合至所述分析物特异性结合剂。
13.权利要求12的试剂盒，其中结合对的所述第一配偶体是抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，并且其中所述结合对的所述第二配偶体选自生物素或生物素类似物，诸如氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素。
14.根据权利要求12或13所述的试剂盒，其在单独的容器中或在单个容器单元的分开的隔室中还包含可检测标记的第二分析物特异性结合剂。
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