JP3935437B2 - トランスコバラミンii分析方法 - Google Patents
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Description
TCを評価するための他の試みは、TCを、HCを含む他の血漿成分と、その親油性を利用して分離することに関係する。そのように、ヘパリンセファロース、シリカゲルまたはセルロースをそれぞれ用いて、TCをHCと分離する方法を開示されている(例えば、非特許文献8、非特許文献9、非特許文献10参照。)。これらの方法は、しかしながら、前記と同じ吸着材に頼るため、前記間接的方法と同じ欠点により損害を被る。また、ホロTCの低い血漿中濃度は、これらの方法を、すでに存在するコバラミン定量方法と組み合わせることを不適切にする。ホロTCの正常範囲は35〜160pMであり、35pM未満の数値は、一般的に、コバラミン欠乏症を示すと考えられている。血漿中コバラミンのためのもっとも日常的な方法について報告されている分析感度は、約40pMであるが、実際問題として、それはしばしばはるかに高く、典型的には約90pMである。このゆえに、正常なホロTCの血漿中レベルは、前記コバラミンの定量のための日常的な方法における前記感度限界よりも下かまたはその近くである。
a)ホロトランスコバラミンと特異的に結合可能な第1のリガンド及びアポトランスコバラミンに結合可能な第2のリガンド、
b)ホロトランスコバラミンに特異的に結合可能な第1のリガンドならびにホロ及びアポトランスコバラミンに結合可能な第2のリガンド、
c)ホロトランスコバラミンに特異的に結合可能な第1の結合相手及びアポトランスコバラミンに結合可能な第2の結合相手、
d)ホロトランスコバラミンに特異的に結合可能な第1の結合相手ならびにホロ及びアポトランスコバラミンに結合可能な第2の結合相手。
(i)トランスコバラミンを含む液体試料を、トランスコバラミン固定リガンドが固定されている多孔質基質と接触させる工程。
(ii)前記(i)工程の前、間または後において、前記試料のトランスコバラミンを、トランスコバラミンに対する第1および第2のレポーター標識結合相手と接触させる工程。ここで、前記第1の結合相手は、ホロトランスコバラミンおよびアポトランスコバラミンの双方に結合可能であるか、またはアポトランスコバラミンに特異的な結合相手であって、前記第2の結合相手は、ホロトランスコバラミンに特異的な結合相手である。
(iii)前記基質に固定された結合相手のレポーター標識からのシグナルを検出し、そのシグナルから前記試料中のトランスコバラミン飽和度を測定する工程。
前記基質に適用する試料は、体液または組織由来液体が好ましく、より好ましくは無細胞液体、特に哺乳類由来の血漿または血清、さらに特に人または患者由来の血漿または血清である。
TC固定リガンドが表面上に固定された多孔質基質;
トランスコバラミンに対する第1のレポーター標識結合相手および第2のレポーター標識結合相手。なお、前記第1の結合相手は、ホロトランスコバラミンおよびアポトランスコバラミンの双方を結合可能なものかまたはアポトランスコバラミンに特異的な結合相手であり、前記第2の結合相手は、ホロトランスコバラミンに特異的な結合相手であり;
洗浄剤(任意);
酵素レポーター標識のための基質(任意);
アポTCおよびホロTCを既知の比率で含む少なくとも1つの較正基準(任意);および
前記レポーター標識からのシグナルを検出できる検出器(任意)。
(i)トランスコバラミンを含む液体試料と、その異なる領域において第1および第2のトランスコバラミン固定リガンドが固定されている多孔質基質とを接触させる工程。ここで、前記第1のリガンドは、ホロトランスコバラミンに特異的に結合でき、前記第2のリガンドは、アポトランスコバラミンまたはアポトランスコバラミンおよびホロトランスコバラミンを固定できる。
(ii)前記工程(i)の前、間または後に、トランスコバラミンのためのレポーター標識した結合相手と前記試料のトランスコバラミンを結合させる工程。
(iii)前記基質の異なる領域上に固定した前記結合相手のレポーター標識からのシグナルを検出し、そこから前記試料中のトランスコバラミン飽和度を測定する工程。
異なる領域で、第1のトランスコバラミン固定リガンドおよび第2のトランスコバラミン固定リガンドが固定されている多孔質基質。ここで、前記第1のリガンドはホロトランスコバラミンに特異的に結合可能で、前記第2のリガンドはアポトランスコバラミン、またはアポトランスコバラミンおよびホロトランスコバラミンを固定可能である。;
トランスコバラミンのためのレポーター標識した結合相手。;
洗浄剤(任意);
酵素レポーター標識のための基質(任意);
アポTCおよびホロTCを既知の比率で含む少なくとも1つの較正基準(任意);および
前記レポーター標識からのシグナルを検出できる検出器(任意)。
図2は、2つの領域をもつ基質を示し、第1はホロTCIIに特異的な固定されたリガンドを含み、第2はアポTCIIに特異的な固定されたリガンドを持ち;
図3は、前記表面上に固定されたTCの抗体を持つ表面プラズモン共鳴検出器内のチップを示す。
A)ビーズ上へのホロTCの固定
0.1M 2−(N−モルホリン)−エタンスルホン酸(MES)(pH5.0)中の0.2M 1−エチル−3−(3−ジメチルアミノ−プロピル)カルボジイミド(EDAC)1mlと0.1M MES(pH5.0)中の2%(w/v)カルボン酸を修飾したビーズ(直径1μm、Merck−Estapor社製)1mLとを混合した。前記混合物をバス・ソニケーション(bath sonication)して前記試薬を分散させ、ついで、室温で一時間、上下に回転させた。前記混合物を300gで遠心し、そのペレットを0.1M MES(pH7.0)で洗浄して遠心し、ついで1.0mLの脱イオン水で再懸濁した。プラスチック製の小さなバイアル瓶中で、前記EDAC活性化ビーズと0.1M 3−[N−モルホリノ]−プロパンスルホン酸(MOPS)(pH7.5)中の1mg/mLホロTCとを同量で混合し、室温で一晩回転させた。その後、前記混合物を0.05%Tween20(水溶液)で2回洗浄して、さらに5mg/mL BSAを含む50mM Tris緩衝液(pH7.4)で2回洗浄した。約10μg/mgのホロTCの単層を持つ被覆したビーズを、50mM Tris緩衝液(pH7.4)、0.15M NaClおよび1mg/mL BSA中で0.1%となるように保存した。
化学工程および酵素工程の組み合わせにより、二本鎖DNA配列のライブラリを準備した。具体的には、40のヌクレオチド長の1014〜1015の一本鎖DNA(ssDNA)配列を合成し、ついで、酵素手法により二本鎖に変換した後、PCR増幅した。第2に、その二本鎖DNAを転写して、一本鎖RNAまたは修飾RNAのライブラリを得た。第3に、そのRNAライブラリを対象とする目的分子で調べた。その選択された分子を逆転写して、PCRにより増幅した(DNAライブラリに対してPCRが十分な程度にまで)。前記対象に結合した配列の部分集合は、第2回目のバイオパンニングのためにプールした。前記選択工程は、だいたい7〜15回行う。
1pmolのファージ提示ライブラリを、100μL PBS−Tween10μgのビーズ上に固定したホロTCおよび100μgのアポTC、1mg/mL BSAまたは3% BLOTTOと混合した。(BLOTTOは、100mMリン酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム中の5%w/v脱脂粉乳、pH7.4、0.01%消泡剤A、0.01%チメロサール(thimerosal)のことである)。その混合物を4℃で一晩インキュベートし、前記ビーズを遠心により選別し、1mL PBS−Tweenで9回洗浄し、標準食塩水で1回洗浄して、緩衝能力を除去した。前記ビーズを600μLの0.1Mグリシン−HCl緩衝液(pH2.2)に再懸濁して、15分後にそのビーズを3000gで3分間の遠心により選別した。その上清を除去して、36μLの2M Tris(pH9.0)で中和して、400μLの大腸菌(例えば、K91−Kan)と混合した。プラスミドを単一のバクテリアクローンから単離して、標準的な方法、例えば、Sambrook J. et al., supraに記載の方法により配列を決定した。前記結合反応および抽出反応を少なくとも3回行った。前記結合反応でBSAおよびBLOTTOを交互に使用して、これらのタンパク質に結合するファージの濃縮を抑制した。
セルロース紙(例えば、Whatman No. 52)を最初に脱イオン水で3分間膨張させ、ついで、3%CNBr(aq)で処理した。そのpHを1mM NaOHの添加により10.5まで上昇させた。30分後、前記セルロース紙を500mLの5μM NaHCO3で12回、500mLの脱イオン水で2回、500mLの25%アセトン、50%アセトンならびに75%アセトンでそれぞれ2回ずつ洗浄した。最後に、500mLアセトンで4回洗浄し、室温で空気乾燥させた。
50μLのヒト血清を、実施例2により調製したディップスティックの膜パッドに塗布した。5分後、前記ディップスティックを100μLのTris緩衝化食塩水(TBS−100mM Tris、pH7.2、150mM塩化ナトリウム)ですすぎ、50μLの検出溶液を添加して5分間インキュベートした。前記検出溶液は、β−ガラクトシダーゼに接合する非重複、抗ヒトTC特異的モノクロナール抗体およびトリ由来のアルカリフォスファターゼに接合する実施例1のホロTCsbp(または非重複抗ヒトTC特異的モノクロナール抗体)を含む。ついで、前記ディップスティックを100μLのTBSですすいだ。TBS中のアルカリフォスファターゼに対する発光基質50μL添加した(例えば、0.25mM Tropix由来のCPD−Star)。前記ディップスティックを照度計で1秒から15分間測定した。ついで、前記ディップスティックを100μLのPBS(リン酸緩衝生理食塩水)ですすぎ、PBS中のβ−ガラクトシダーゼに対する発光基質(例えば、0.1mM Tropix由来Galacton−Star)を50μLのアルカリフォスファターゼ阻害剤(例えば、40μM シクロヘキサンとリスメチレンスルホネート)を添加した。ついで、前記ディップスティックを再び前記照度計で読み取った。最初の読み取り値が前記ディップスティック上のホロTC量を示すのに対し、2回目の読み取り値は全TC量を示す。それらの比は、前記試料中のTCのコバラミン飽和値に独立した値を示す。
i)免疫
BALB/cメスマウスに、AdjuPrime 免疫変調成分(Pierce, IL, USA)と混合した組み換えヒト由来ホロトランスコバラミンを20μg免疫注射(i.p.)し、その後4週間ごとに20μgのブースター注射した。
最後のブースター注射より4日後に脾臓を取り出し、PEG(ベーリンガー・マンハイム社製(ドイツ))を用いて脾臓嚢胞とHAT(ヒポサンチン,アミノプロテイン,チミジン(Hypoxanthine,Aminopterin,Thymidine);シグマ社製)感受性形質細胞種OUR1(X63-Ag8.653のサブクローン)とを細胞融合した。HAT存在下の培地(10% CPSR3(シグマ社製)添加DMEM/Ham's F12(インビトロゲン社製))を含む5×96Fトレイ(ヌンク(Nunc)社製)に、細胞融合生成物を塗布した。一週間後、HT(シグマ社製)を含む培地でその融合物を育てた。
2週間後、固相捕捉アッセイを用いて、培地から前記ハイブリドーマをスクリーニングした。ヒツジ由来の抗マウスIgG抗体(メルク−エスタポア社製(Merck-Estapor)(フランス))で被覆した1μm磁化ビーズ1%の懸濁液10μLと前記細胞媒体とを混合し、室温で1時間保持した。マウスモノクロナール抗体と結合した磁化ビーズを、マグネットを用いて単離して、1mLリン酸緩衝液(pH7.2)、0.15M NaClおよび1mg/mLウシ血清アルブミンで4回洗浄した。57Coで標識したコバラミン(ICN、USA)で前処理したプールしたヒト血清(スキャンティボディ社製(Scantibodies)、USA)100μLで洗浄したビーズを再懸濁し、前記血清中のアポトランスコバラミンを57Coで標識したホロTCに変換した。前記混合物を室温で30分間保持して、マグネットを用いてビーズを単離した。前記ビーズに伴う放射能をガンマカウンターで計測した。
Balb/c腹膜フィダーセル(10000per cell)でプレシードした96ウェルFトレイ(ヌンク社製(Nunc))上で限界希釈することにより、抗トランスコバラミン抗体に陽性のウェルをクローニングした。陽性のクローンを選別し、100%のサブクローンが特異的な抗体を生成するまでクローニングを繰り返した。10%DMSO(シグマ社製)を含むCPR3(シグマ社製)中に細胞を入れ、液体窒素で凍結することに保存した。
前記デキストランで被覆したチップ(ファルマシア社製、スウェーデン)のカルボキシル化した表面を0.05M N−ヒドロキシスクシニイミド(NHS)/0.2M N−エチル−N’−[3−(ジメチルアミノ)プロピル]カルボジイミド塩酸塩(EDC)で活性化し、脱イオン水ですすぎ、0.01 HEPES緩衝液(pH7.4)(0.15M NaCl、0.003M EDTAおよび0.005%ポリソルベート(HBS)含有)中で50μg/mLのmAb1(実施例4より)で共有的に被覆した。未反応のNHSは、1Mエタノールアミンにより反応を遮断し、前記チップをHBSで広範囲にわたって洗浄した。
前記結合の様子は、表面プラズモン共鳴を用いてリアルタイムで追跡し、ビアコア(Biocore)装置(ビアコア社製、スウェーデン)で行った。前記チップに結合する遊離リガンドの量を応答単位(RU)で測定し、なお、前記応答単位とは、結合したリガンドの量と固定したターゲットに対する親和性のどちらも踏まえたものである。mAb1を固定したチップ(実施例5)を前記装置に導入し、5μLの100nMホロトランスコバラミン、5μLの50μg/mL mAb2ならびに5μLの50μg/mL mAb3を連続して注入し、それぞれ注入の間に洗浄工程を行った。前記装置にホロトランスコバラミンを流入した後、565RUのmAb3と前記固定したmAb1とを結合した。ホロトランスコバラミンがない場合は、mAb2もmAb3も前記固定したmAb1を持つチップに結合しなかった。
配列番号2 PCR用プライマー
配列番号3 PCR用プライマー
配列番号4 RTPCR用プライマー
配列番号5 PCR用プライマー
配列番号6 PCR用プライマー
Claims (19)
- トランスコバラミン飽和度を測定するための分析方法であって、液体試料中に含まれるトランスコバラミンを、トランスコバラミン固定化リガンドを固定化した多孔質基質及びレポーターで標識したトランスコバラミン結合相手と接触させて、前記基質に固定化されたレポーター標識からのシグナルを検出する方法であり、前記リガンドが、下記a)又はb)であり、前記結合相手が、下記c)又はd)であることを特徴とする分析方法。
a)ホロトランスコバラミンと特異的に結合可能な第1のリガンド及びアポトランスコバラミンに結合可能な第2のリガンド、
b)ホロトランスコバラミンに特異的に結合可能な第1のリガンドならびにホロ及びアポトランスコバラミンに結合可能な第2のリガンド、
c)ホロトランスコバラミンに特異的に結合可能な第1の結合相手及びアポトランスコバラミンに結合可能な第2の結合相手、
d)ホロトランスコバラミンに特異的に結合可能な第1の結合相手ならびにホロ及びアポトランスコバラミンに結合可能な第2の結合相手。 - 請求項1記載の分析方法であって、下記の(i)〜(iii)の工程を含む方法。
(i)トランスコバラミン固定化リガンドを固定化した多孔質基質と、前記試料を接触させる工程、
(ii)前記工程(i)の前、間又は後に、レポーターで標識された第1及び第2の結合相手と、前記試料のトランスコバラミンを接触させる工程であって、前記第1の結合相手が、ホロ及びアポトランスコバラミンの双方に結合可能な結合相手、又は、アポトランスコバラミン特異的結合相手であり、前記第2の結合相手が、ホロトランスコバラミン特異的結合相手である工程、及び、
(iii)前記基質に固定化した前記結合相手のレポーター標識からの信号を検出し、その信号から、前記試料のトランスコバラミン飽和度を測定する工程。 - 前記基質上に、ホロ及びアポトランスコバラミンの双方を結合可能な前記リガンドを固定化し、前記第1及び第2のレポーター標識からの信号は、内部で区別可能である請求項2記載の方法。
- 請求項1記載の分析方法であって、下記の(i)〜(iii)の工程を含む方法。
(i)第1及び第2のトランスコバラミン固定化リガンドが、異なる領域に固定化された多孔質基質と、液体試料に含まれるトランスコバラミンを接触させる工程であって、前記第1のトランスコバラミン固定化リガンドが、ホロトランスコバラミンに特異的に結合可能であり、前記第2のトランスコバラミン固定化リガンドが、アポトランスコバラミン又はアポ及びホロトランスコバラミンを固定化可能である工程、
(ii)前記工程(i)の前、間又は後に、レポーター標識されたトランスコバラミン結合相手と、前記試料のトランスコバラミンと接触させる工程、及び、
(iii)前記基質の異なる領域上に固定化した前記結合相手のレポーター標識からの信号を検出し、その信号から、前記試料のトランスコバラミン飽和度を測定する工程。 - 前記ホロトランスコバラミン特異的結合相手又は前記ホロトランスコバラミンに特異的に結合可能なリガンドが、モノクローナル抗体を含む請求項2から4のいずれかに記載の方法。
- 前記ホロトランスコバラミン特異的結合相手又は前記ホロトランスコバラミンに特異的に結合可能なリガンドが、アポトランスコバラミンと対比してホロトランスコバラミンに少なくとも10倍の特異性を有する請求項2から5のいずれかに記載方法。
- 前記シグナルが、電磁放射線である請求項2から6のいずれかに記載の方法。
- 前記シグナルを、デジタルカメラにより検出する請求項7記載の方法。
- 前記試料が、血液又は血液由来の液体である請求項2から8のいずれかに記載の方法。
- 前記基質が、セルロースシートである請求項2から9のいずれかに記載の方法。
- 前記基質が、ディップスティック上にマウントされている請求項2から10のいずれかに記載の方法。
- 前記工程(i)において、前記試料を、前記多孔質基質の一方の面に塗布し、前記多孔質基質の対向する面に隣接した吸水性物質により促進される毛管現象により前記多孔質基質内に吸収させる請求項2から11のいずれかに記載の方法。
- 前記レポーター標識された特異的結合相手を、自身の質量のみで標識し、表面プラズモン共鳴により検出する請求項2から6のいずれかに記載の方法。
- 以下のものを含むアッセイキット。
TC固定化リガンドが表面上に固定されている多孔質基質、ならびに、
ホロ及びアポトランスコバラミンの双方に結合可能な結合相手又はアポトランスコバラミン特異的結合相手である第1のレポーター標識トランスコバラミン結合相手、及び、ホロトランスコバラミン特異的結合相手である第2のレポーター標識トランスコバラミン結合相手。 - 以下のものを含むアッセイキット。
ホロトランスコバラミンに特異的に結合可能な第1のトランスコバラミン固定化リガンド、ならびに、アポトランスコバラミン又はアポ及びホロトランスコバラミンを固定化可能な第2のトランスコバラミン固定化リガンドが、異なる領域に固定化された多孔質基質、ならびに、
トランスコバラミンのためのレポーター標識結合相手。 - さらに、洗浄剤を含む請求項14又は15に記載のキット。
- さらに、酵素レポーター標識のための基質を少なくとも1つ含む請求項14から16のいずれかに記載のキット。
- さらに、アポTC及びホロTCを既知の比率で含む較正標準を少なくとも一つ含む請求項14から17のいずれかに記載のキット。
- さらに、前記レポーター標識からシグナルを検出可能な検出器を含む請求項14から18のいずれかに記載のキット。
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