CN114206367A - 抗猪tcn1单克隆抗体及其生产和使用方法 - Google Patents
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Abstract
公开了抗‑猪TCN1单克隆抗体，连同被其识别的表位。还公开了含有所述单克隆抗体的试剂盒和产生所述抗体的方法。进一步公开了使用所述单克隆抗体的方法，诸如(但不限于)用在估计和/或从猪内因子制剂除去TCN1的方法中。
Description
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本申请根据35 USC § 119(e)要求2019年8月9日提交的美国临时申请号62/884,711的权益。以上引用的专利/专利申请的全部内容明确地通过引用并入本文。
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不适用。
背景
钴胺素是一种必需的营养素和B-复合物家族的天然水溶性维生素，其必须与内在因子组合才能被肠道吸收。维生素B12 (氰钴胺素)是造血、神经代谢、DNA和RNA产生以及碳水化合物、脂肪和蛋白代谢所必需的。维生素B12改善代谢循环中的铁功能，并在胆碱合成中协助叶酸。维生素B12代谢与叶酸的代谢相互关联，并且维生素B12的缺乏引起恶性贫血、巨幼细胞性贫血和神经损伤。
钴胺传递蛋白I (TCN1)，也称为咕啉结合蛋白(haptocorrin)、R-因子和R-蛋白，是由口腔的唾液腺产生的糖蛋白。在体内，TCN1主要用于通过产生TCN1/维生素B12复合物来保护钴胺素(维生素B12)免于胃中的酸降解。一旦复合物已经到达更中性的十二指肠，胰腺蛋白酶就降解TCN1，由此释放游离维生素B12，其现在结合内在因子以被回肠肠细胞吸收。
猪内在因子(HIF)制剂通常用于诊断性维生素B12测定。然而，猪TCN1(或猪TCN1、猪TCN1或猪R-蛋白)是猪胃粘膜的粗提取物中的主要HIF-相关蛋白污染物，并且HIF制剂中猪TCN1的存在可损害其中使用HIF制剂的任何B12测定法的完整性；因此，估计和/或除去HIF制剂中存在的任何TCN1是必要的。
然而，目前没有可用于从用于B12测定中的HIF制剂中估计和/或除去猪TCN1的抗猪TCN1单克隆抗体的商业来源。
因此，本领域需要克服现有技术的缺点和缺陷的抗猪TCN1单克隆抗体以及估计猪TCN1和/或从HIF制剂除去猪TCN1的新的和改进的方法。本公开涉及此类抗体、含有所述抗体的试剂盒以及产生和使用所述抗体的方法。
附图简述
图1：根据Allen等人 (J. Biol. Chem. (1973) 248(10):3670-3680)在维生素B12-Sepharose的柱上从猪胃粘膜的粗粉末提取物纯化维生素B12结合蛋白的总级分，并且为了本公开的目的称为“部分纯化的猪R-蛋白”。小图A：还原条件下的SDS-PAGE显示该级分包含天然猪R-蛋白(宽的70-92 kDa条带)和猪内在因子(窄的55 kDa条带)。小图B：等电聚焦表明两种糖基化蛋白(猪R-蛋白和猪内在因子)的等电点几乎相同(pI <4.5)。
图2：来自野猪的钴胺传递蛋白I (TCN1)(SEQ ID NO:1)和内在因子(HIF)(SEQ IDNO:17)的氨基酸序列比对。选择与猪内在因子没有同源性的肽29-39(在本文中也称为R1并指定为SEQ ID NO:2)、肽80-89(在本文中也称为R2并指定为SEQ ID NO:3)和肽200-215(在本文中也称为R3并指定为SEQ ID NO:4)，用于单克隆抗体生成。
图3：肽R1、R2和R3在蛋白球的表面上的位置显示于模型TCN1晶体结构(PDB 4KKJ)的前视图(小图A)和顶视图(小图B)上。
图4：用不同的猪TCN1肽-BSA缀合物免疫的A/J小鼠的免疫血清在用合成肽、肽-OVA缀合物或部分纯化的天然猪R-蛋白包被的ELISA板上滴定。如可以看出，所有动物都对各自的肽和肽-OVA缀合物产生高抗体滴度；然而，只有来自R1-BSA和R2-BSA动物的血清结合部分纯化的天然猪R-蛋白。
图5：171B 1G5 mAb的抗原结合特性。该单克隆抗体针对R2-BSA缀合物生成。如可以看出，171B 1G5 mAb对R2肽具有高度特异性，并且识别天然和重组猪TCN1蛋白。未观察到与猪内在因子的交叉反应性。
图6：在用合成肽或部分纯化的天然猪R-蛋白包被的ELISA板上滴定用部分纯化的天然猪R-蛋白免疫的Balb/C (A)和A/J (B)小鼠的免疫血清。如可以看出，两种品系的小鼠均对猪TCN1产生高抗体滴度，但对合成的R1、R2或R3肽则没有。
图7：选择产生针对天然猪TCN1的单克隆抗体的杂交瘤。在ELISA中针对与重组猪TCN1和部分纯化的天然猪-R-蛋白两者的结合筛选杂交瘤上清液。如可以看出，由171J 3F1和171J 3A6克隆产生的单克隆抗体与重组猪TCN1的结合比天然猪R-蛋白好得多；单克隆抗体171J 9G7同样好地识别两种抗原，并且与重组R蛋白相比，171J 5H12 mAb更强烈地结合天然猪R-蛋白。未观察到与猪内在因子的交叉反应性。
图8：针对猪TCN1肽微阵列测定的小鼠单克隆抗体的表位作图的概述。表位作图的结果证实mAb对猪TCN1具有特异性，并且对于171B 1G5、171J 3F1、171J 3A6和171J 5H12抗体鉴定独特的线性表位。单克隆抗体171J 9G7不结合任何线性猪TCN1或猪内在因子肽。
图9：171B 1G5、171J 3F1、171J 3A6和171J 5H12抗体的线性表位的表面位置显示在模型TCN1晶体结构(PDB 4KKJ)的前视图(小图A)和顶视图(小图B)中。
图10：使用常规产生的171B 1G5单克隆抗体相对于重组产生的171B 1G5单克隆抗体的重组猪TCN1的ELISA滴定结果。如可以看出，该数据证实单克隆抗体的正确测序，因为两条滴定曲线是重叠的。
图11：在具有171J 5H12 mAb的柱上从猪胃粘膜的粉末粗提取物纯化的天然猪R-蛋白亲和力。小图A：还原条件下用考马斯蓝R染色的SDS-PAGE，显示天然猪R-蛋白的样品(宽的70-92 kDa条带)是同质的。小图B：等电聚焦，BioSafe Coomassie染色，显示天然猪TCN1是一种非常酸性的蛋白，其中pI <4.5。
图12：使用用单克隆抗体171J 5H12的ELISA测定法检测猪胃粘膜的粗提取物中的天然猪TCN1。检测限值为至少1 ng/mL。
图13：用171J 5H12 mAb-Sepharose精制的猪内在因子样品。在ELISA测定中针对天然猪TCN1的存在测试在具有171J 5H12单克隆抗体的亲和树脂上耗竭之前和之后的HIF样品。如可以看出，在耗竭后，猪TCN1污染的水平从总蛋白的2.7%显著下降至0.1%。
详细描述
在通过示例性语言和结果的方式详细解释本公开的至少一个实施方案之前，应理解，所述本公开的应用不限于下面的描述中阐述的组分的构造和排列的细节。本公开能够具有其他实施方案，或者能够以各种方式实践或实施。因此，本文使用的语言意欲被给予最广泛的可能范围和含义；并且实施方案意味着是示例性的——而非穷举性的。而且，应该理解，本文采用的措辞和术语是为了描述的目的，并且不应被认为是限制性的。
除非本文另有定义，否则结合本公开使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。进一步，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。通常，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、以及蛋白和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交相关利用的术语及其技术是本领域中众所周知和常用的那些。标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书或如本领域中通常完成的或如本文所述进行。前述技术和程序通常根据本领域中众所周知的常规方法、并且如在本说明书通篇引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述而进行。参见例如，Sambrook等人 Molecular Cloning: ALaboratory Manual (第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, N.Y. (1989)和Coligan等人 Current Protocols in Immunology (CurrentProtocols, Wiley Interscience (1994))，其通过引用并入本文。与本文所述的分析化学、合成有机化学以及药用和药物化学结合利用的命名及其实验室程序和技术是本领域中众所周知和常用的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者治疗。
本说明书中提及的所有专利、公开的专利申请和非专利出版物指示本公开所属领域的技术人员的技术水平。在本申请的任何部分中引用的所有专利、公开的专利申请和非专利出版物在本文中明确地通过引用以其整体并入，其程度如同每个单独的专利或出版物被具体和个别地指出通过引用并入一样。
鉴于本公开，无需过度实验即可制备和执行本文公开的所有组合物、试剂盒和/或方法。尽管已经在具体实施方案的方面描述了所述组合物、试剂盒和/或方法，但对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本公开的构思、精神和范围的情况下，可对所述组合物、试剂盒和/或方法、以及在本文描述的方法的步骤或步骤顺序中应用变化。认为对于本领域技术人员显而易见的所有此类类似的替代和修改在如所附权利要求书限定的本公开的精神、范围和构思内。
如根据本公开所利用，除非另有指示，否则以下术语应理解为具有以下含义：
与权利要求和/或说明书中的术语“包括”结合使用时，术语“一个/种(a)”或“一个/种(an)”的使用可意味着“一个/种(one)”，但它也与“一个/种或多个/种”、“至少一个/种”和“一个/种或多于一个/种”的含义一致。因此，术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该/所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另有明确指示。因此，例如，对“一种化合物”的提及可指一种或多种化合物、2种或更多种化合物、3种或更多种化合物、4种或更多种化合物或更大数目的化合物。术语“多个/种”是指“两个/种或更多个/种”。
术语“至少一个/种”的使用将被理解为包括一个/种以及多于一个/种的任何数量，包括但不限于2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、100个/种等。术语“至少一个/种”可延伸多至100或1000或更多个/种，这取决于它所附接的术语；此外，100/1000的数量不视为限制性的，因为更高的限值也可产生令人满意的结果。此外，术语“X、Y和Z中的至少一个/种”的使用将被理解为包括单独的X，单独的Y和单独的Z，以及X、Y和Z的任何组合。序数术语(即，“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等)的使用仅用于区分两个或更多个事项的目的，并且不意味着暗示例如一个事项相对于另一事项的任何顺序或次序或重要性、或任何添加次序。
在权利要求中使用术语“或”用于意指包括性的“和/或”，除非明确指出仅指替代方案或者除非替代方案是互相排斥的。例如，以下任一种都满足条件“A或B”：A为真(或存在)且B为假(或不存在)，A为假(或不存在)且B为真(或存在)，以及A和B两者均为真(或存在)。
如本文所用，对“一个实施方案(one embodiment)”、“一个实施方案(anembodiment)”、“一些实施方案”、“一个实例(one example)”、“例如”或“一个实例(anexample)”的任何引用意指结合该实施方案描述的具体要素、特征、结构或特点包括在至少一个实施方案中。例如，说明书中各个地方出现的短语“在一些实施方案中”或“一个实例”不一定全部是指同一实施方案。此外，对一个或多个实施方案或实例的所有引用都应被解释为对权利要求非限制性的。
贯穿本申请，术语“约”用于指示，值包括用于测定该值的组合物/仪器/装置、方法的误差的固有变化，或研究受试者间存在的变化。例如，但不通过限制的方式，当利用术语“约”时，指定值可以与指示值相差正负20%，或15%，或12%，或11%，或10%，或9%，或8%，或7%，或6%，或5%，或4%，或3%，或2%，或1%，因为此类变化适用于执行公开的方法并由本领域普通技术人员所理解。
如在本说明书和权利要求中所用，词语“包含(comprising)”(和任何形式的包含，诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(和任何形式的具有，诸如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(和任何形式的包括，诸如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(和任何形式的含有，诸如“含有(contains)”和“含有(contain)”)都是包括性的或开放式的，并且不排除另外的未列举的要素或方法步骤。
如本文所用的术语“或其组合”是指所述术语之前列出的事项的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”意欲包括以下中的至少一个：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，并且如果次序在特定上下文中是重要的，则也包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续该实例，明确包括的是含有一个或多个事项或术语的重复的组合，诸如BB、AAA、AAB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。技术人员将理解，除非从上下文可见，否则通常对任何组合中的事项或术语的数量没有限制。
如本文所用，术语“基本上/实质上(substantially)”意味着随后描述的事件或情况完全发生或者随后描述的事件或情况在大范围或程度上发生。例如，当与具体事件或情况相关时，术语“基本上/实质上”意味着随后描述的事件或情况发生在至少80%的时间、或至少85%的时间、或至少90%的时间、或至少95%的时间。术语“基本上/实质上相邻”可以意指两个事项与彼此100%相邻，或者两个事项与彼此密切接近，但与彼此不是100%相邻，或者两个事项之一的一部分与另一事项不是100%相邻，而是与另一事项密切接近。
术语“类似物”和“衍生物”在本文中可互换使用，并且是指一种物质，在其结构中包含与给定化合物相同基本碳骨架和碳官能度、但也可以含有对其的一个或多个取代的。如本文中所用，术语“取代”将被理解为是指用残基R替换化合物上的至少一个取代基。在某些非限制性实施方案中，R可以包括H，羟基，硫醇，选自氟化物、氯化物、溴化物或亚碘酸盐(iodite)的卤化物，选自下列之一的C1-C4化合物：任选取代的直链、支链或环状烷基，和直链支链或环状烯基，其中任选的取代基选自一种或多种烯基烷基、炔基烷基、环烷基、环烯基烷基、芳基烷基、杂芳基烷基、杂环烷基、任选取代的杂环烯基烷基、芳基环烷基和芳基杂环烷基，其中每个是任选取代的，其中所述任选的取代基选自下列中的一种或多种：烯基烷基、炔基烷基、环烷基、环烯基烷基、芳基烷基、烷基芳基、杂芳基烷基、杂环烷基、任选取代的杂环烯基烷基、芳基环烷基和芳基杂环烷基、苯基、氰基、羟基、烷基、芳基、环烷基、氰基、烷氧基、烷硫基、氨基、-NH(烷基)、-NH(环烷基)2、羧基和-C(O))-烷基。
如本文所用的术语“样品”将被理解为包括可以根据本公开利用的任何类型的生物样品。可利用的流体生物样品的实例包括但不限于：全血或其任何部分(即，血浆或血清)、尿液、唾液、痰、脑脊液(CSF)、皮肤、肠液、腹膜内液、囊液(cystic fluid)、汗液、间质液、细胞外液、泪液、粘液、膀胱洗液(bladder wash)、精液、粪便、胸膜液、鼻咽液、其组合等。
如本文所用的术语“特异性结合配偶体”应理解为是指能够与TCN1特异性缔合以用于其检测的目的的任何分子。例如，但不通过限制的方式，所述特异性结合配偶体可以是抗体、受体、配体、适体、分子印迹聚合物(即无机基质)或其任何组合和/或衍生物，以及能够特异性结合亲巨蛋白(macrophilin)-结合药物的任何其他分子。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白”在本文用来指氨基酸残基的聚合物。如本文所用的术语“多肽”是指天然蛋白、蛋白片段或多肽序列的类似物的通用术语。因此，天然蛋白、蛋白片段和类似物是多肽类的种。如本文所用的术语“分离的肽/多肽/蛋白”是指cDNA、重组RNA或合成来源或其一些组合的肽/多肽/蛋白，依其来源的属性或衍生来源，“分离的肽/多肽/蛋白”：(1)不与自然界中发现的其他肽/多肽/蛋白缔合，(2)没有来自相同来源的其他肽/多肽/蛋白，例如，不含鼠蛋白，(3)由来自不同物种的细胞表达，和/或(4)在自然界中不存在。
如本文所用，术语“氨基酸”包括所有分子，无论是天然的还是合成的，其包括氨基官能团和酸官能团两者并且能够包含在天然存在的氨基酸的聚合物中。示例性氨基酸包括天然存在的氨基酸；其类似物、衍生物和同类物；具有变体侧链的氨基酸类似物；以及上述任一种的所有立体异构体。
术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用。它们是指任何长度的核苷酸的聚合形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析定义的多个基因座(一个基因座)、外显子、内含子、信使RNA (mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可能被非核苷酸组分打断。可以进一步修饰多核苷酸，诸如通过与标记组分缀合。术语“分离的核酸”和“分离的多核苷酸”可互换使用；如果核酸或多核苷酸：(1)不与其中在自然界中发现“分离的多核苷酸”的多核苷酸的全部或部分缔合，(2)与其在自然界中不连接的多核苷酸连接，或(3)在自然界中不作为更大序列的一部分存在，则其被认为是“分离的”。
如本文所用的术语“载体”意指能够转运已与之连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可以连接额外的DNA区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连接至病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞后整合至宿主细胞的基因组中，且由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。
如本文所用的适用于对象的术语“天然存在的”是指对象可在自然界中发现的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中的可以从自然来源分离且尚未通过实验室中人员或其他方式有意修饰的多核苷酸或多肽序列是天然存在的。术语“天然存在的”在本文中可以与术语“天然的”互换使用。
本文所指的术语“选择性杂交”意指可检测地和特异性地结合。在使得与非特异性核酸的可检测结合的可评估量最小化的杂交和洗涤条件下，编码根据发明构思的肽/多肽/蛋白的多核苷酸、寡核苷酸及其片段与核酸链选择性杂交。可以使用高严格条件来实现本领域所知和在本文中所讨论的选择性杂交条件。通常，发明构思的多核苷酸、寡核苷酸和片段和目标核酸序列之间的核酸序列同源性将为至少80%，且最通常地具有至少85%、90%、95%、99%和100%的增加的同源性。如果两个氨基酸序列之间存在部分或完全同一性，则它们是同源的。例如，当两个序列为最大匹配进行比对时，85%同源性意指85%的氨基酸是相同的。在最大匹配中允许空位(在匹配的两个序列的任一个中)；5或更少的空位长度是优选的(但非限制)，而2或更少是更优选的(但非限制)。或者，如该术语在本文中所用，如果使用具有突变数据矩阵和6或更多的空位罚分的程序ALIGN，两个蛋白序列(或由它们衍生出的长度为至少30个氨基酸的多肽序列)具有大于5(以标准偏差单位)的比对评分，则它们是同源的。参见Dayhoff, M.O., Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110(第5卷, National Biomedical Research Foundation (1972))及对此卷的增刊2, pp.1-10。更优选地，当使用ALIGN程序最佳比对时，如果两个序列或其部分的氨基酸大于或等于50%相同，则它们是同源的。本文使用术语“对应于”意指多核苷酸序列与参考多核苷酸序列的全部或部分是同源的(即为相同，非严格进化地相关)，或多肽序列与参考多肽序列相同。与之相比，本文使用术语“与……互补”意指互补序列与参考多核苷酸序列的全部或部分同源。用于举例说明，核苷酸序列“TATAC”对应于参考序列“TATAC”且与参考序列“GTATA”互补。
使用下述术语描述两个或更多个多核苷酸或氨基酸序列之间的序列关系：“参考序列”、“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“基本同一性”。“参考序列”被定义为用作序列比较的基础的序列；参考序列可以是较大序列的子集，例如，为序列表中给定的全长cDNA或基因序列的区段或可以包含完整cDNA或基因序列。通常，参考序列长为至少18个核苷酸或6个氨基酸，通常长为至少24个核苷酸或8个氨基酸，且经常长为至少48个核苷酸或16个氨基酸。因为两个多核苷酸或氨基酸序列可以各自(1)包含在两个分子之间类似的序列(即完整多核苷酸或氨基酸序列的部分)，且(2)可以进一步包含在两个多核苷酸或氨基酸序列之间相异的序列，两个(或更多个)分子之间的序列比较通常通过在“比较窗口”比对两个分子的序列来进行，以鉴定和比较具有序列相似性的局部区域。如本文所用的“比较窗口”是指至少18个连续核苷酸位置或6个氨基酸的概念上的区段，其中多核苷酸序列或氨基酸序列可以与至少18个连续核苷酸或6个氨基酸序列的参考序列比较，且其中当针对两个序列的最佳比对与参考序列(其不包括添加或缺失)比较时，比较窗口中多核苷酸序列的部分可包含20%或更少的添加、缺失、取代等(即空位)。比对比较窗口的序列最佳比对可以通过Smith和Waterman (Adv. Appl. Math., 2:482 (1981))的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch (J. Mol. Biol., 48:443 (1970))的同源性比对算法、通过Pearson和Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 85:2444 (1988))的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机化实施(Wisconsin Genetics Software Package Release7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，(Genetics Computer Group, 575 Science Dr.,Madison, Wis.)，Geneworks，或MacVector软件包)或通过检查进行，且选择各种方法产生的最佳比对(即在比较窗口导致最高同源性百分比)。
术语“序列同一性”意指两个多核苷酸或氨基酸序列在比较窗口是相同的(即在核苷酸-对-核苷酸或残基-对-残基的基础上)。术语“序列同一性百分比”通过如下计算：在比较窗口比较两条最优比对的序列，测定在两条序列中存在相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、U或I)或残基的位置的数目以产生匹配位置数目，将匹配位置数目除以比较窗口中位置的总数(即窗口大小)，且将结果乘以100以产生序列同一性百分比。如本文所用的术语“基本同一性”表示多核苷酸或氨基酸序列的特征，其中在至少18个核苷酸(6个氨基酸)位置的比较窗口，经常为至少24-48个核苷酸(8-16个氨基酸)位置的窗口，多核苷酸或氨基酸包含的序列与参考序列相比具有至少85%序列同一性、诸如至少90%至95%序列同一性、或至少99%序列同一性的序列，其中序列同一性百分比通过在比较窗口比较参考序列与可以包括缺失或添加参考序列的总计20%或更少的序列进行计算。参考序列可以是较大序列的子集。
如本文所用，20种常规氨基酸和它们的缩写遵循常规用法。参见Immunology--ASynthesis (第2版, E. S. Golub和D. R. Gren, 编, Sinauer Associates,Sunderland, Mass. (1991))，其通过引用并入本文。20种常规氨基酸的立体异构体(例如：D-氨基酸)、非天然氨基酸诸如：α-,α-双取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其他非常规的氨基酸也可以是本公开的多肽的合适的组分。非常规的氨基酸的实例包括：正亮氨酸、4-羟基脯氨酸、α-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸、和其他类似氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。在本文所用的多肽标记法中，根据标准用法和惯例，左手方向为氨基末端方向，且右手方向为羧基-末端方向。
如对于多肽所适用，术语“基本同一性”意指当进行最佳比对(诸如通过使用默认空位权重的程序GAP或BESTFIT)时，两个肽序列共有至少80%序列同一性、诸如至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性或至少99%序列同一性。在某些具体(但非限制)实施方案中，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。保守氨基酸取代是指具有类似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸组为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸组为丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸组为天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的氨基酸组为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸组为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；且具有含硫侧链的氨基酸组为半胱氨酸及甲硫氨酸。具体的保守氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
术语参考多肽的“变体”是指相对于参考多肽具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入的多肽。氨基酸取代可以是“保守的”或“非保守的”。“保守”氨基酸取代是指用具有相似特性(诸如但不限于大小和电荷)的另一氨基酸取代多肽中的氨基酸。保守置换是在其侧链相关的氨基酸家族内发生的那些置换。遗传编码的氨基酸通常被分为以下家族：(1)酸性=天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性=赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性=丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电极性=甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。更具体的家族为：丝氨酸和苏氨酸为脂肪族-羟基家族；天冬酰胺和谷氨酰胺为含酰胺家族；丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸为脂肪族家族；且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸为芳香族家族。例如，合理预期以异亮氨酸或缬氨酸对亮氨酸分离置换、以谷氨酸对天冬氨酸分离置换、以丝氨酸对苏氨酸分离置换或使用结构相关氨基酸的类似氨基酸置换，将不会对所得分子的结合或特性具有重大影响，特别是如果置换不涉及框架位点内的氨基酸。氨基酸改变是否导致功能肽可以容易地通过测定多肽衍生物的特异性活性进行确定。抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物可以通过本领域普通技术人员容易地制备。优选的片段或类似物的氨基-和羧基-末端发生在功能结构域的边界附近。结构和功能结构域可以通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公开或私人序列数据库比较来鉴定。在具体(但非限制)实施方案中，使用计算机化比较方法来鉴定序列基序或预测的蛋白构象结构域(其发生在已知结构和/或功能的其他蛋白中)。鉴定折叠成已知三维结构的蛋白序列的方法是已知的(Bowie 等人Science, 253:164 (1991))。因此，上述实例表明本领域技术人员可以识别可用用于定义根据本公开的结构和功能结构域的序列基序和结构构型。
优选的氨基酸取代为以下那些，其：(1)降低对蛋白水解的敏感性、(2)降低对氧化的敏感性、(3)改变用于形成蛋白复合物的结合亲和力、(4)改变结合亲和力，和(5)赋予或修饰此类类似物的其他物理化学或功能特性。类似物可以包括除了天然存在的肽序列以外的序列的各种突变。例如，可在天然存在的序列中(诸如但不限于在形成分子间接触的结构域以外的多肽部分中)进行单一或多氨基酸取代(诸如但不限于保守氨基酸取代)。保守氨基酸取代不应实质上改变亲本序列的结构特征(例如，置换氨基酸不应当趋于破坏亲本序列中存在的螺旋，或中断表征亲本序列的其他类型的二级结构)。本领域公认的多肽二级与三级结构的实例描述于Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton,编, W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to ProteinStructure© (Branden和J. Tooze, 编, Garland Publishing, New York, N.Y.(1991)); 和Thornton等人(Nature 354:105 (1991))，其各自通过引用并入本文。
如本文所用的术语“多肽片段”是指具有氨基-末端和/或羧基-末端缺失、但其中剩余氨基酸序列与天然存在的序列中的对应位置相同的多肽。多肽片段可以是小于参考多肽长度的任何长度。
术语“抗体”以最广义使用，并且具体(但不通过限制的方式)涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和上述任一种的片段和上述任一种的缀合物，只要它们表现出期望的分析物结合的生物活性。因此，术语“抗体”或“抗体肽”是指全长免疫球蛋白分子(即，完整抗体)，或其与完整抗体竞争特异性抗原结合的抗原结合片段。抗原结合片段可以通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割来产生。抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、二硫化物连接的Fv、Fd、双抗体、单链抗体、单结构域抗体(诸如但不限于，NANOBODIES®)和保留完整抗体的可变区的至少一部分的其他抗体片段或其缀合物，抗体替代蛋白或肽(即工程改造的结合蛋白/肽)及其组合或衍生物。参见，例如，Hudson等人 (Nature Med. (2003) 9:129-134)。所述抗体可以是任何类型或类别(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
如本文所用的术语抗体的“抗原结合片段”和“抗原结合部分”是指保留结合抗原的能力的一种或多种抗体片段。抗体的抗原结合功能可以由完整抗体的片段进行。术语抗体的“抗原结合片段”内包括的结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、二硫化物连接的Fv、Fd、双抗体、单链抗体、单结构域抗体(诸如但不限于，NANOBODIES®)、分离的CDRH3和保留完整抗体的可变区的至少一部分的其他抗体片段。这些抗体片段使用常规重组和/或酶促技术获得，并且以与完整抗体相同的方式针对抗原结合进行筛选。
如本文所用的“抗体重链”是指存在于所有呈其天然存在的构象的抗体分子中的两种类型的多肽链中的较大者。
如本文所用的“抗体轻链”是指存在于所有呈其天然存在的构象的抗体分子中的两种类型的多肽链中的较小者。κ和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
术语“CDR”及其复数“多个CDR”是指抗体或抗体片段的互补决定区(CDR)，其决定抗体或抗体片段的结合特征。在大多数情况下，三个CDR存在于轻链可变区(CDRL1、CDRL2和CDRL3)中，并且三个CDR存在于重链可变区(CDRH1、CDRH2和CDRH3)中。CDR对抗体分子的功能活性有贡献，并且通过包含支架或框架区的氨基酸序列分开。在各个CDR中，CDR3序列且特别是CDRH3是最多样的，并且因此对抗体特异性具有最强贡献。存在至少两种用于测定CDR的技术：(1)基于交叉物种序列变异性的方法(即，Kabat等人, Sequences of Proteinsof Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md.(1987)，其以其整体通过引用并入)；和(2)基于抗原-抗体复合物的结晶学研究的方法(Chothia等人, Nature, 342:877 (1989)，其以其整体通过引用并入)。
术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T-细胞受体的任何蛋白决定簇。在某些实施方案中，表位是抗原的被抗体特异结合的区域。表位决定簇通常包括分子的化学活性表面基团，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基。在某些实施方案中，表位可以具有特定三维结构特征(例如，“构象表位”)以及特定电荷特征。
一个表位被定义为与另一个表位“相同”，如果特定抗体特异性结合这两个表位。在某些实施方案中，具有不同一级氨基酸序列的多肽可以包含相同的表位。在某些实施方案中，相同的表位可以具有不同的一级氨基酸序列。如果不同的抗体竞争特异性结合相同表位，则它们被称为结合该相同表位。
当抗体优先识别蛋白和/或大分子的复杂混合物中的抗原时，其“特异结合”该抗原。在某些实施方案中，抗体包含特异性结合特定表位的抗原结合位点。在某些此类实施方案中，抗体能够结合不同的抗原，只要所述不同的抗原包含该特定表位或密切相关的表位。在某些情况下，例如，来自不同物种的同源蛋白可以包含相同表位。在某些实施方案中，抗体以不大于10-6 M、10-7 M、10-8 M或10-9 M的解离常数特异性结合抗原。当抗体特异性结合受体或配体(即，反受体)时，它可以基本上抑制受体与配体的粘附。如本文所用，当过量的抗体使与配体结合的受体的量减少至少约20%、40%、60%或80%、85%或90%时，抗体基本上抑制受体与配体的粘附(如在体外竞争性结合测定中所测量)。
“分离的”抗体是已从产生该抗体的环境的组分中分离和/或回收的抗体。其产生环境的污染组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的材料，并且可包括酶、激素和其他蛋白或非蛋白溶质。在某些实施方案中，如可通过至少三种不同的方法测量的，抗体将被纯化：1) 如通过Lowry方法所测定，至大于50重量%的抗体，诸如超过75重量%或超过85重量%或超过95重量%或超过99重量%；2) 至足以通过使用转杯式测序仪获得N-末端或内部氨基酸序列的至少10个残基，诸如序列的至少15个残基的程度；或3) 至同质，通过使用考马斯蓝或可替代地银染的在还原或非还原条件下的SDS-PAGE。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为产生抗体的环境中的至少一种组分将不存在。然而，通常分离的抗体将通过至少一个纯化步骤制备。此外，“分离的抗体”基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体。然而，分离的抗体可以与其他相关抗原具有一定的交叉反应性。
术语“抗体突变体”是指其中一个或多个氨基酸残基已被修饰的抗体的氨基酸序列变体。此类突变体必需与如下的氨基酸序列具有小于100%序列同一性或相似性，所述氨基酸序列与所述抗体的重链或轻链可变结构域的具有至少75%氨基酸序列同一性或相似性，诸如至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%氨基酸序列同一性或相似性。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从特异性结合相同表位的基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，构成群体的各个抗体除了可少量存在的可能天然存在的突变以外是相同的。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性以外，单克隆抗体的有利之处在于，在一种生产方法中，它们可通过杂交瘤培养来合成，且因此未被其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表明抗体从抗体的基本上同质群体获得的特征，而不应被解释为需要通过任何特定方法来产生抗体。例如，在一个实施方案中，根据本公开产生的单克隆抗体可以通过首先由Kohler和Milstein (Nature, 256:495 (1975))描述的杂交瘤方法来制备。
根据本公开利用的单克隆抗体可以通过本领域已知的任何方法来产生，所述方法包括，但不限于，主动免疫方案的结果；导致在疾病或癌症的过程中天然产生抗体的免疫应答的结果；噬菌体衍生的抗体；等。除了上面列出的杂交瘤产生方法以外，本公开的单克隆抗体可以通过其他各种方法来产生，所述方法诸如，但不限于，重组DNA方法(参见，例如，美国专利号4,816,567)；从噬菌体展示文库分离抗体片段(参见，例如，Clackson等人,Nature (1991) 352:624-628; 和Marks等人, J. Mol. Biol. (1991) 222:581-597)；以及各种其他单克隆抗体产生技术(参见，例如，Harlow和Lane (1988), Antibodies:ALaboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.)。
一旦已获得抗体，例如一旦已鉴定单个B细胞和/或已产生单克隆抗体，就可以获得编码这些抗体的可变区的序列。可例如通过如下获得可变区序列：首先对杂交瘤、B-细胞或噬菌体产生的抗体蛋白进行测序，并确定编码核酸序列。在一个实施方案中，也可以对免疫球蛋白可变区(VH和 VL) DNA或cDNA进行测序。当抗体衍生自杂交瘤细胞系或分离的B-细胞时，可以使用PCR，通过例如Babcook等人(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:7843-7848 (1996))和PCT公开号WO 92/02551中描述的方法对编码可变区的cDNA进行扩增。两篇参考文献的内容均清楚地以其整体通过引用并入本文。
术语“中和抗体”或“中和……的抗体”是指降低包含抗体特异性结合的表位的多肽的至少一种活性的抗体。在某些实施方案中，中和抗体降低体外和/或体内活性。
术语“抗原结合位点”是指抗体的能够特异性结合抗原的部分。在某些实施方案中，抗原结合位点由一个或多个抗体可变区提供。
如本文所用，“基本上纯的”意指目标种类为存在的主要种类(即基于摩尔，其比组合物中任何其他个别种类更丰富)。通常，基本上纯的组合物将包含所有存在于组合物中的所有大分子种类的超过约50%，诸如超过约55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%和99%。在一个实施方案中，目标种类被纯化到基本上同质(在组合物中不能通过常规检测方法检测到污染种类)，其中组合物基本上由单一大分子种类组成。
术语“试剂”是指化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子或由生物材料制成的提取物。在某些实施方案中，“试剂”可以是根据本公开的单克隆抗体。
术语“拮抗剂”是指降低蛋白/酶的活性的试剂。术语“激动剂”是指增加蛋白/酶的活性的试剂。
现在转向本发明的构思，已经鉴定猪钴胺传递蛋白I(TCN1)上的独特和特异性表位，并且已经生成针对这些表位和/或针对猪TCN1的粗制剂的小鼠单克隆抗体。这些抗体具有几种潜在用途，包括(例如但不通过限制的方式)：估计粗的猪肠壁制剂中的TCN1(通常用于分离猪IF)；以及从猪内在因子(HIF)制剂中除去TCN1(诸如但不限于通过使用亲和色谱法)，因为HIF制剂通常用于B12测定。
本公开的某些非限制性实施方案涉及特异性结合猪钴胺传递蛋白-1 (TCN1)的抗体或其抗原结合片段。在一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合选自SEQ ID NO:2、3、4和/或20-23中的至少一个的至少一部分的猪TCN1的表位。
本公开的某些非限制性实施方案涉及特异性结合猪钴胺传递蛋白-1 (TCN1)的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含以下中的一个或多个：(i)具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(ii)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(iii)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(iv)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(v)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(vi)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。在一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含以上(i)-(vi)中的两个、三个、四个或五个。在另一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含以上(i)-(vi)中的全部。
本公开的某些非限制性实施方案涉及特异性结合猪钴胺传递蛋白-1 (TCN1)的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含以下中的一个或多个：(i)具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(ii)具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(iii)具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(iv)具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(v)具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(vi)具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。在一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含以上(i)-(vi)中的两个、三个、四个或五个。在另一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含以上(i)-(vi)中的全部。
本公开的某些非限制性实施方案涉及特异性结合猪钴胺传递蛋白-1 (TCN1)的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含以下中的一个或多个：(i)具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(ii)具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(iii)具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(iv)具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(v)具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(vi)具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。在一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含以上(i)-(vi)中的两个、三个、四个或五个。在另一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含以上(i)-(vi)中的全部。
本公开的某些非限制性实施方案涉及特异性结合猪钴胺传递蛋白-1 (TCN1)的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含以下中的一个或多个：(i)具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(ii)具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(iii)具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(iv)具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(v)具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(vi)具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。在一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含以上(i)-(vi)中的两个、三个、四个或五个。在另一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含以上(i)-(vi)中的全部。
本公开的某些非限制性实施方案涉及特异性结合猪钴胺传递蛋白-1 (TCN1)的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含以下中的一个或多个：(i)具有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(ii)具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(iii)具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(iv)具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(v)具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(vi)具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。在一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含以上(i)-(vi)中的两个、三个、四个或五个。在另一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含以上(i)-(vi)中的全部。
本公开的某些具体非限制性实施方案涉及选自(A)-(E)的抗体或其抗原结合片段，其中：(A)是抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区CDR1、具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区CDR2、具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区CDR3、具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区CDR1、具有SEQ IDNO:15的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；(B)是抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的重链可变区CDR1、具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的重链可变区CDR2、具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的重链可变区CDR3、具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链可变区CDR1、具有SEQ IDNO:32的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；(C)是抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链可变区CDR1、具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链可变区CDR2、具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链可变区CDR3、具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的轻链可变区CDR1、具有SEQ IDNO:44的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；(D)是抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的重链可变区CDR1、具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的重链可变区CDR2、具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的重链可变区CDR3、具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的轻链可变区CDR1、具有SEQ IDNO:56的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；和(E)是抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的重链可变区CDR1、具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链可变区CDR2、具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的重链可变区CDR3、具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链可变区CDR1、具有SEQ IDNO:68的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
所述抗体或其抗原结合片段可以特异性结合猪TCN1的任何表位。例如，但不通过限制的方式，所述抗体或其抗原结合片段可以特异性结合SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的任何部分，或其功能等效物(诸如(但不限于)与 SEQ ID NO:1 的至少一部分具有至少约70%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93 %、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、或至少约99% 同一性的氨基酸序列)。
在具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体/功能片段特异性结合的猪TCN1的表位包含SEQ ID NO:2的至少一部分。在其他具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体/功能片段特异性结合的猪TCN1的表位包含SEQ ID NO:3的至少一部分。在还有其他具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体/功能片段特异性结合的猪TCN1的表位包含SEQ ID NO:4的至少一部分。在还有其他具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体/功能片段特异性结合的猪TCN1的表位包含SEQ ID NO:20的至少一部分。在还有其他具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体/功能片段特异性结合的猪TCN1的表位包含SEQ ID NO:21的至少一部分。在还有其他具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体/功能片段特异性结合的猪TCN1的表位包含SEQ ID NO:22的至少一部分。在还有其他具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体/功能片段特异性结合的猪TCN1的表位包含SEQ ID NO:23的至少一部分。
在一个具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段具有重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:7、25、37、49或61具有至少约70%同一性，诸如(但不限于)与SEQ ID NO:7、25、37、49或61具有至少约75%同一性、至少约80%同一性、至少约85%同一性、至少约90%同一性、至少约91%同一性、至少约92%同一性、至少约93%同一性、至少约94%同一性、至少约95%同一性、至少约96%同一性、至少约97%同一性、至少约98%同一性或至少约99%同一性。
在一个具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段具有重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:7、25、37、49或61的差异少于约25个氨基酸、少于约24个氨基酸、少于约23个氨基酸、少于约22个氨基酸、少于约21个氨基酸、少于约20个氨基酸、少于约19个氨基酸、少于约18个氨基酸、少于约17个氨基酸、少于约16个氨基酸、少于约15个氨基酸、少于约14个氨基酸、少于约13个氨基酸、少于约12个氨基酸、少于约11个氨基酸、少于约10个氨基酸、少于约9个氨基酸、少于约8个氨基酸、少于约7个氨基酸、少于约6个氨基酸、少于约5个氨基酸、少于约4个氨基酸、少于约3个氨基酸、少于约2个氨基酸或少于约1个氨基酸。
在一个具体(但非限制性)实施方案中，并且可替代地和/或除了上述实施方案以外，所述抗体或其抗原结合片段具有轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列与SEQ IDNO:13、30、42、54或66具有至少约70%同一性，诸如(但不限于)与SEQ ID NO:13、30、42、54或66具有至少约75%同一性、至少约80%同一性、至少约85%同一性、至少约90%同一性、至少约91%同一性、至少约92%同一性、至少约93%同一性、至少约94%同一性、至少约95%同一性、至少约96%同一性、至少约97%同一性、至少约98%同一性或至少约99%同一性。
在一个具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段具有轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:13、30、42、54或66的差异少于约21个氨基酸，少于约20个氨基酸，少于约19个氨基酸，少于约18个氨基酸，少于约17个氨基酸，少于约16个氨基酸，少于约15个氨基酸，少于约14个氨基酸，少于约13个氨基酸，少于约12个氨基酸，少于约11个氨基酸，少于约10个氨基酸，少于约9个氨基酸，少于约8个氨基酸，少于约7个氨基酸，少于约6个氨基酸，少于约5个氨基酸，少于约4个氨基酸，少于约3个氨基酸，少于约2个氨基酸，或少于约1个氨基酸。
在一个具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段具有重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:7、25、37、49或61具有至少约90%同一性，和/或所述抗体或其抗原结合片段具有轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列与SEQID NO:13、30、42、54或66具有至少约90%同一性。在一个具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段具有重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:7、25、37、49或61的差异少于约13个氨基酸，所述轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:13、30、42、54或66的差异少于约12个氨基酸。
在另一个具体(但非限制性)实施方案中，分别地，所述抗体或其抗原结合片段具有重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:7、25、37、49或61，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:13、30、42、54或66。
在另一个具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段具有重链，所述重链的氨基酸序列与SEQ ID NO:6具有至少约70%同一性，诸如(但不限于)与SEQ IDNO:6具有至少约75%同一性、至少约80%同一性、至少约85%同一性、至少约90%同一性、至少约91%同一性、至少约92%同一性、至少约93%同一性、至少约94%同一性、至少约95%同一性、至少约96%同一性、至少约97%同一性、至少约98%同一性或至少约99%同一性。
在一个具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段具有重链，所述重链的氨基酸序列与SEQ ID NO:6的差异少于约100个氨基酸，少于约90个氨基酸，少于约80个氨基酸，少于约75个氨基酸，少于约70个氨基酸，少于约65个氨基酸，少于约60个氨基酸，少于约55个氨基酸，少于约50个氨基酸，少于约45个氨基酸，少于约40个氨基酸，少于约35个氨基酸，少于约30个氨基酸，少于约25个氨基酸，少于约24个氨基酸，少于约23个氨基酸，少于约22个氨基酸，少于约21个氨基酸，少于约20个氨基酸，少于约19个氨基酸，少于约18个氨基酸，少于约17个氨基酸，少于约16个氨基酸，少于约15个氨基酸，少于约14个氨基酸，少于约13个氨基酸，少于约12个氨基酸，少于约11个氨基酸，少于约10个氨基酸，少于约9个氨基酸，少于约8个氨基酸，少于约7个氨基酸，少于约6个氨基酸，少于约5个氨基酸，少于约4个氨基酸，少于约3个氨基酸，少于约2个氨基酸，或少于约1个氨基酸。
在一个具体(但非限制性)实施方案中，并且可替代地和/或除了上述实施方案以外，所述抗体或其抗原结合片段具有轻链，所述轻链的氨基酸序列与SEQ ID NO:12具有至少约70%同一性，诸如(但不限于)与SEQ ID NO:12具有至少约75%同一性、至少约80%同一性、至少约85%同一性、至少约90%同一性、至少约91%同一性、至少约92%同一性、至少约93%同一性、至少约94%同一性、至少约95%同一性、至少约96%同一性、至少约97%同一性、至少约98%同一性或至少约99%同一性。
在一个具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段具有轻链，所述轻链的氨基酸序列与SEQ ID NO:12的差异少于约45个氨基酸，少于约40个氨基酸，少于约35个氨基酸，少于约30个氨基酸，少于约25个氨基酸，少于约24个氨基酸，少于约23个氨基酸，少于约22个氨基酸，少于约21个氨基酸，少于约20个氨基酸，少于约19个氨基酸，少于约18个氨基酸，少于约17个氨基酸，少于约16个氨基酸，少于约15个氨基酸，少于约14个氨基酸，少于约13个氨基酸，少于约12个氨基酸，少于约11个氨基酸，少于约10个氨基酸，少于约9个氨基酸，少于约8个氨基酸，少于约7个氨基酸，少于约6个氨基酸，少于约5个氨基酸，少于约4个氨基酸，少于约3个氨基酸，少于约2个氨基酸，或少于约1个氨基酸。
在一个具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段具有重链，所述重链的氨基酸序列与SEQ ID NO:6具有至少约90%同一性，和/或所述抗体或其抗原结合片段具有轻链，所述轻链的氨基酸序列与SEQ ID NO:12具有至少约70%同一性。在一个具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段具有重链和/或轻链，所述重链的氨基酸序列与SEQ ID NO:6的差异少于约47个氨基酸，所述轻链的氨基酸序列与SEQ ID NO:12的差异少于约24个氨基酸。
在另一个具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段具有重链和/或轻链，所述重链的氨基酸序列为SEQ ID NO:6，所述轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO:12。
在又另一个具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或功能片段具有由与SEQ IDNO:5具有至少约70%同一性的多核苷酸编码的重链，或由与SEQ ID NO:24、36、48或60具有至少约70%同一性的多核苷酸编码的重链可变区，诸如(但不限于)与SEQ ID NO:5、24、36、48或60具有至少约75%同一性、至少约80%同一性、至少约85%同一性、至少约90%同一性、至少约91%同一性、至少约92%同一性、至少约93%同一性、至少约94%同一性、至少约95%同一性、至少约96%同一性、至少约97%同一性、至少约98%同一性或至少约99%同一性。
在又另一个具体(但非限制性)实施方案中，并且可替代地和/或除了上述实施方案以外，所述抗体或功能片段具有由与SEQ ID NO:11具有至少约70%同一性的多核苷酸编码的轻链，或由与 SEQ ID NO:29、41、53或65具有至少约70%同一性的多核苷酸编码的轻链可变区，诸如(但不限于)与SEQ ID NO:11、29、41、53或65具有至少约75%同一性、至少约80%同一性、至少约85%同一性、至少约90%同一性、至少约91%同一性、至少约92%同一性、至少约93%同一性、至少约94%同一性、至少约95%同一性、至少约96%同一性、至少约97%同一性、至少约98%同一性或至少约99%同一性。
在又一个进一步具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或功能片段具有重链，所述重链由与SEQ ID NO:5具有至少约70%同一性的多核苷酸编码，和/或所述抗体或功能片段具有轻链，所述轻链由与SEQ ID NO:11具有至少约70%同一性的多核苷酸编码。在又一个进一步具体(但非限制性)实施方案中，分别地，所述抗体或功能片段具有重链可变区，所述重链可变区由与SEQ ID NO:24、36、48或60具有至少约70%同一性的多核苷酸编码，和/或所述抗体或功能片段具有轻链可变区，所述轻链可变区由与SEQ ID NO:29、41、53或65具有至少约70%同一性的多核苷酸编码。
在又另一个具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段具有由不同于SEQ ID NO:5的序列编码的重链，或由不同于SEQ ID NO:24、36、48或60的序列编码的重链可变区，其中所述不同少于约100个核苷酸，少于约90个核苷酸，少于约80个核苷酸，少于约75个核苷酸，少于约70个核苷酸，少于约60个核苷酸，少于约50个核苷酸，少于约45个核苷酸，少于约40个核苷酸，少于约35个核苷酸，少于约30个核苷酸，少于约25个核苷酸，少于约20个核苷酸，少于约15个核苷酸，少于约10个核苷酸，少于约9个核苷酸，少于约8个核苷酸，少于约7个核苷酸，少于约6个核苷酸，少于约5个核苷酸，少于约4个核苷酸，少于约3个核苷酸，少于约2个核苷酸，或少于约1个核苷酸。
在又另一个具体(但非限制性)实施方案中，并且可替代地和/或除了上述实施方案以外，所述抗体或其抗原结合片段具有由不同于SEQ ID NO: 11的序列编码的轻链，或由不同于SEQ ID NO: 30、42、54或66的序列编码的轻链可变区，其中所述不同少于约100个核苷酸，少于约90个核苷酸，少于约80个核苷酸，少于约75个核苷酸，少于约70个核苷酸，少于约60个核苷酸，少于约50个核苷酸，少于约45个核苷酸，少于约40个核苷酸，少于约35个核苷酸，少于约30个核苷酸，少于约25个核苷酸，少于约20个核苷酸，少于约15个核苷酸，少于约10个核苷酸，少于约9个核苷酸，少于约8个核苷酸，少于约7个核苷酸，少于约6个核苷酸，少于约5个核苷酸，少于约4个核苷酸，少于约3个核苷酸，少于约2个核苷酸，或少于约1个核苷酸。
在又另一个具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段具有重链和/或轻链，编码重链的序列与SEQ ID NO:5的差异少于约100个核苷酸，编码轻链的序列与SEQ ID NO:11的差异少于约70个核苷酸。在又另一个具体(但非限制性)实施方案中，分别地，所述抗体或其抗原结合片段具有重链可变区和/或轻链可变区，编码重链可变区的序列与SEQ ID NO:25、37、49或61的差异少于约100个核苷酸，编码轻链可变区的序列与SEQ IDNO:29、41、53或65的差异少于约70个核苷酸。
评估抗体的结合能力的标准测定法是本领域已知的，包括例如(但不通过限制的方式) ELISA、Western印迹和RIA以及本领域众所周知的其他类型的合适测定法。所述抗体的结合动力学(例如，结合亲和力)也可以通过本领域已知的标准测定法、诸如(但不限于)通过Biacore分析来评价。在一些非限制性实施方案中，本文所述的抗体以小于或等于约10-6 M、约10-7 M、约10-8 M、约10-9 M或约10-10 M的解离常数结合上述序列。在一个具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体以小于或等于约10-7 M的解离常数结合猪TCN1的表位。
所述抗体或其抗原结合片段可以是单克隆抗体或其抗原结合片段。或者，所述抗体或其抗原结合片段可以是多克隆抗体或其抗原结合片段。
在某些非限制性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段被进一步定义为选自全长免疫球蛋白分子、scFv、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2、Fv、二硫化物连接的Fv及其组合。
在某些非限制性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是分离的。在具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是纯化的。
本公开还涉及抗体或其功能片段，其与上文所述的任何抗体或功能片段结合相同的表位。
本公开的某些非限制性实施方案还涉及产生抗体或其抗原结合片段的方法，所述抗体或其抗原结合片段可以特异性结合猪钴胺传递蛋白-1 (TCN1)的表位。所述方法包括用包含至少一种SEQ ID NO:2-4和/或20-23的肽的抗原化合物免疫非人动物；和从所述非人动物的血浆回收所述抗体或其抗原结合片段。
本公开的某些非限制性实施方案涉及产生上文所述的任何抗体或其抗原结合片段的杂交瘤。
本公开的某些非限制性实施方案涉及产生抗体或其抗原结合片段的方法，所述抗体或其抗原结合片段可以特异性结合猪钴胺传递蛋白-1 (TCN1)的表位。在该方法中，培养上文所述的杂交瘤以产生上文所述的任何抗体或其抗原结合片段。在至少某些非限制性实施方案中，回收所述抗体或其抗原结合片段。
本公开的某些非限制性实施方案还涉及缀合物，其包含与可检测标记物附接的本文公开或以其他方式考虑的任何抗体或其抗原结合片段。可以根据本公开利用的可检测标记物的非限制性实例包括酶标记物、放射性标记物、荧光标记物、化学发光标记物、生物发光标记物和微粒标记物以及其任何组合。此外，所述可检测标记物可以经由直接或间接缀合附接至所述抗体或功能片段。
本公开的某些非限制性实施方案还涉及缀合物，其包含与固体支持物附接的本文公开或以其他方式考虑的任何抗体或其抗原结合片段。所述抗体/抗原结合片段与固体支持物(经由直接或间接缀合)的附接产生亲和纯化色谱基质，诸如例如(但不通过限制的方式)柱。
本公开的某些非限制性实施方案涉及编码本文公开或以其他方式考虑的任何抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。
在一个具体(但非限制性)实施方案中，编码所述抗体或其抗原结合片段的重链或重链可变区的多核苷酸的一部分与SEQ ID NO:5、24、36、48或60具有至少约70%同一性，诸如(但不限于)与SEQ ID NO:5、24、36、48或60具有至少约75%同一性、至少约80%同一性、至少约85%同一性、至少约90%同一性、至少约91%同一性、至少约92%同一性、至少约93%同一性、至少约94%同一性、至少约95%同一性、至少约96%同一性、至少约97%同一性、至少约98%同一性或至少约99%同一性。
在又另一个具体(但非限制性)实施方案中，并且可替代地和/或除了上述实施方案以外，编码所述抗体或其抗原结合片段的重链或重链可变区的多核苷酸的一部分与SEQID NO:11、29、41、53或65具有至少约70%同一性，诸如(但不限于)与SEQ ID NO:11、29、41、53或65具有至少约75%同一性、至少约80%同一性、至少约85%同一性、至少约90%同一性、至少约91%同一性、至少约92%同一性、至少约93%同一性、至少约94%同一性、至少约95%同一性、至少约96%同一性、至少约97%同一性、至少约98%同一性或至少约99%同一性。
在又另一个具体(但非限制性)实施方案中，分别地，编码所述抗体或其抗原结合片段的重链或重链可变区的多核苷酸的一部分与SEQ ID NO:5、24、36、48或60具有至少约90%同一性，和/或编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链或轻链可变区的多核苷酸的一部分与SEQ ID NO:11、29、41、53或65具有至少约90%同一性。
在又一个进一步具体(但非限制性)实施方案中，分别地，编码所述抗体或其抗原结合片段的重链或重链可变区的多核苷酸的一部分与SEQ ID NO:5、24、36、48或60具有至少约90%同一性，和/或编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链或轻链可变区的多核苷酸的一部分与SEQ ID NO:11、29、41、53或65具有至少约90%同一性。
在另一个具体(但非限制性)实施方案中，对应于所述抗体或其抗原结合片段的重链或重链可变区的序列的一部分和/或对应于所述抗体或其抗原结合片段的轻链或轻链可变区的序列的一部分分别与SEQ ID NO:5、24、36、48或60或SEQ ID NO:11、29、41、53或65的不同在于，少于约100个核苷酸，少于约90个核苷酸，少于约80个核苷酸，少于约75个核苷酸，少于约70个核苷酸，少于约60个核苷酸，少于约50个核苷酸，少于约45个核苷酸，少于约40个核苷酸，少于约35个核苷酸，少于约30个核苷酸，少于约25个核苷酸，少于约20个核苷酸，少于约15个核苷酸，少于约10个核苷酸，少于约9个核苷酸，少于约8个核苷酸，少于约7个核苷酸，少于约6个核苷酸，少于约5个核苷酸，少于约4个核苷酸，少于约3个核苷酸，少于约2个核苷酸，或少于约1个核苷酸。
在又另一个具体(但非限制性)实施方案中，对应于所述抗体或其抗原结合片段的重链或重链可变区的序列的一部分与SEQ ID NO:5、24、36、48或60的差异少于约100个核苷酸，和/或对应于所述抗体或其抗原结合片段的轻链的序列的一部分与SEQ ID NO:11、29、41、53或65的差异少于约70个核苷酸。
本公开的某些非限制性实施方案涉及载体，其包含编码本文描述或以其他方式考虑的抗体或其抗原结合片段的任何多核苷酸。
本公开的某些非限制性实施方案涉及重组宿主细胞，其包含编码本文描述或以其他方式考虑的抗体或其抗原结合片段的任何多核苷酸。本公开的某些非限制性实施方案涉及重组宿主细胞，其包含本文描述或以其他方式考虑的任何载体。
本公开的某些非限制性实施方案涉及产生抗体或其抗原结合片段的方法，所述抗体或其抗原结合片段可以特异性结合猪钴胺传递蛋白-1 (TCN1)。所述方法包括以下步骤：(a)在允许表达由多核苷酸编码的抗体或其抗原结合片段的条件下，在细胞培养物中培养本文描述或以其他方式考虑的任何重组宿主细胞；和(b)从所述细胞培养物分离所述抗体或其抗原结合片段。
本公开的某些非限制性实施方案涉及检测猪内在因子(HIF)制剂中存在的TCN1的方法。所述方法包括以下步骤：在如果HIF制剂中存在TCN1，则形成抗体/TCN1复合物的条件下，使HIF制剂与本文公开或以其他方式考虑的任何抗体或其抗原结合片段接触；和检测形成的任何抗体/TCN1复合物，其中形成的抗体-TCN1复合物的量与HIF制剂中存在的TCN1的量成正比。
在一个具体(但非限制性)实施方案中，将如上文所述的标记物附接至抗体/功能片段以用于检测抗体/TCN1复合物。
本公开的某些非限制性实施方案涉及除去猪内在因子(HIF)制剂中存在的TCN1的方法。所述方法包括以下步骤：在如果HIF制剂中存在TCN1，则形成抗体/TCN1复合物的条件下，使HIF制剂与其中公开或以其他方式考虑的任何抗体或其抗原结合片段接触；和从 HIF制剂中除去所述抗体/TCN1 复合物。
在一个具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与固体支持物附接，如上文所述，其有助于从HIF制剂中除去抗体-TCNl复合物。
在一个具体(但非限制性)实施方案中，所述方法可以进一步包括从所述抗体/TCN1复合物中洗脱TCN1以由此从HIF制剂纯化TCN1的步骤。以这种方式，除去猪内在因子制剂中存在的TCN1的方法还作为从猪内在因子制剂纯化TCN1的方法发挥功能。
本公开的某些非限制性实施方案还包括试剂盒，其含有本文公开或以其他方式考虑的任何抗体/抗原结合片段和/或组合物(诸如包含附接至可检测标记物或固体支持物的抗体/抗原结合片段的组合物)，以及可用于本文所述的测定/方法中，和/或用在已经估计或从HIF制剂除去TCN1之后进行的维生素B12测定中的任何其他试剂。例如(但不通过限制的方式)，所述试剂盒可以进一步包括结合HIF的抗体或其抗原结合片段。
所述组合物/试剂盒/方法的测定组分/试剂可以以允许它们根据本公开发挥功能的任何形式提供。例如，但不通过限制的方式，每种试剂可以以液体形式提供并且以散装和/或单等分试样形式放置在试剂盒内。或者，在一个具体(但非限制性)实施方案中，所述试剂中的一种或多种可以以单等分试样冻干试剂的形式放置在试剂盒中。微流体装置中干燥试剂的使用详细描述于美国专利号9,244,085 (Samproni)，其全部内容在此明确地通过引用并入本文。
除了上文详细描述的测定组分/试剂以外，所述试剂盒可以进一步含有用于进行本文描述或以其他方式考虑的任何具体测定的其他试剂。这些额外试剂的性质将取决于具体测定形式，并且其鉴定完全在本领域普通技术人员的技术内；因此，认为不必进行其进一步的描述。此外，试剂盒中存在的组分/试剂可以各自在分开的容器/隔室中，或者各种组分/试剂可以被组合于一个或多个容器/隔室中，这取决于所述组分/试剂的交叉反应性和稳定性。此外，所述试剂盒可包括其中放置有组分/试剂的微流体装置。
所述试剂盒中的各种组分/试剂的相对量可以大幅变化，以提供这样的组分/试剂的浓度，其显著优化测定方法期间需要发生的反应，并进一步显著优化测定的灵敏度。在适当情况下，试剂盒中的一种或多种组分/试剂可以作为干燥粉末(诸如冻干粉末)提供，并且所述试剂盒可进一步包括用于溶解干燥试剂的赋形剂；以该方式，从这些组分可获得具有用于进行根据本公开的方法或测定的适当浓度的试剂溶液。试剂盒中还可包括阳性和/或阴性对照。此外，所述试剂盒可进一步包括解释如何使用试剂盒的一组书面说明。具有该性质的试剂盒可用于本文描述或以其他方式考虑的任何方法中。
实施例
下文提供了实施例。然而，应理解，本公开的应用不限于本文公开的具体实验、结果和实验室程序。相反，实施例仅作为各个实施方案之一提供，并且意在是示例性的，而非穷举性的。
实施例1：猪TCN1的表位的鉴定和使用合成肽产生抗猪TCN1单克隆抗体
猪R-蛋白(TCN1)是一种糖蛋白，包含392个氨基酸(具有约46 kDa的多肽链Mw)和高达约50% w/w碳水化合物；其氨基酸序列显示于SEQ ID NO:1中。TCN1在维生素B12移动通过胃时保护酸敏感性维生素B12。
为了本公开的目的，Mw为46.3 kDa的重组酵母产生的非糖基化猪TCN1蛋白(LifeSpan Biosciences, Inc., LS-G23154, Seattle, WA)在本文中将被称为“重组猪TCN1”，而从猪胃粘膜的粗粉末提取物纯化并具有约70-92 kDa的Mw的糖基化的猪TCN1在本文中将被称为“天然猪R-蛋白”。
TCN1和内在因子(IF)以及TCN2都对生理活性形式的钴胺素(B12)具有非凡的亲和力，其中KD<1pm；然而，它们各自对非功能性钴胺素类似物表现出不同的选择性。IF以及在某种程度上TCN，对配体结构的变化敏感，这有助于这些蛋白区分生理活性和非活性类咕啉。相反，TCN1可以成功地结合许多甚至缺乏整个核苷酸部分的有缺陷的类咕啉。与载体的结合屏蔽了钴胺素分子的含有核苷酸的下部(也称为α-位点)。相反，在holo-IF和holo-HC的情况下，如从其与外部化合物的反应性判断，钴胺素的具有活性基团的上表面(β-位点)被认为是开放的。
猪TCN1是用于维生素B12测定中的猪内在因子(HIF)制剂中的主要污染物。使用维生素B12-Sepharose上的亲和色谱法可以将维生素B12-结合蛋白与大多数不结合维生素B12的胃蛋白分离，如Allen等人 (J. Biol. Chem. (1973) 248(10):3670-3680)所述。图1显示在维生素B12-Sepharose柱上从猪胃粘膜粗粉末提取物纯化的维生素B12-结合蛋白的总级分。还原条件下的SDS-PAGE(小图A)显示该级分含有天然猪R-蛋白(宽的70-92 kDa条带)和猪内在因子(窄的55 kDa条带)。等电聚焦(小图B)表明两种蛋白的等电点几乎相同(pI <4.5)。
为了本公开的目的，在维生素B12-Sepharose柱上从猪胃粘膜粗粉末提取物纯化的维生素B12-结合蛋白的总级分将在本文中称为“部分纯化的天然猪R-蛋白”。
如图2中可以看出，其含有来自野猪的钴胺传递蛋白I (TCN1)和内在因子(HIF)的氨基酸序列比对。两种蛋白的多肽链具有31%的同一性和49%的同源性。
通过常规方法、诸如硫酸铵分级分离、大小排阻或离子交换色谱法将两种维生素-B12结合蛋白与彼此分离是极其困难的，因为两种蛋白具有相近的分子量和几乎相同的等电点(图1)。在具有猪TCN1-特异性单克隆抗体(mAb)的柱上的亲和色谱法将允许分离猪TCN1和HIF。
据发明人所知，对于人TCN1，仅一种小鼠单克隆抗体克隆3F10是市售可得的，并且没有可用于猪TCN1或猪内在因子(HIF)的单克隆抗体。然而，这种抗人TCN1抗体不与猪TCN1交叉反应。
对天然猪R-蛋白特异性的单克隆抗体将允许开发用于估计粗材料和HIF制剂中的猪TCN1的ELISA。针对猪TCN1的抗体也将允许开发亲和柱(或其他亲和基质)，根据需要，用于从HIF制剂中除去猪TCN1污染物和/或精制纯化的HIF。
具有抗猪R-蛋白单克隆抗体的亲和柱将允许从天然来源纯化天然糖基化的猪R-蛋白。据发明人所知，只有非糖基化的酵母产生的重组猪TCN1蛋白是市售的(LifeSpanBioSciences, Inc., LS-G23154, Seattle, WA)，并且目前没有天然猪TCN1可用。
为了鉴定猪TCN1上的独特和特异性表位，使用基本局部比对搜索工具(BLASTA)软件(国家生物技术信息中心，美国国家医学图书馆，Bethesda，MD)，对来自野猪的TCN1 (或咕啉结合蛋白，登录号P17830.2)和内在因子(HIF，登录号XP_003122730.2)进行氨基酸序列比对。鉴定了几种与HIF不具有同源性的猪TCN1肽，如图2中所示。将这些肽标记为R1、R2和R3，并且其氨基酸序列显示于表1中。
使用来自瑞士生物信息学研究所(Lausanne, Switzerland)的DeepView/Swiss-PdbViewer软件证实R1、R2和R3表位在TCN1分子上的表面定位。使用与氰钴胺素复合的人咕啉结合蛋白的2.35Å分辨率的晶体结构(PDB 4KKJ, (Furger, 等人, J. Biol. Chem.(2013) 288(35): 25466-25476))，作为3D-模型来鉴定肽的位置。R1、R2和R3肽在TCN1分子的表面上的位置显示于图3中的模型晶体结构的前视图(小图A)和顶视图(小图B)。
用FASTA软件(EMBL-EBI, Hinxton, Cambridge)分析R1、R2和R3肽的氨基酸序列证实这些肽代表猪R-蛋白的独特表位。因此，随后针对所述表位之一开发特异性鼠单克隆抗体。
表1：用于生成抗体的猪TCN1的表位
| 肽名称 | SEQ ID NO: | 序列 | SEQ ID NO:1的氨基酸残基 |
| R1 | 2 | SEKDYSHLRLL | 29-39 |
| R2 | 3 | QDDXNRRDXS* | 80-89 |
| R3 | 4 | KRSISNGKIKAAIKDS | 200-215 |
*注意，在SEQ ID NO:3中，在产生肽R2时将两个天然甲硫氨酸残基被修饰为正亮氨酸(并在上述序列中用“X”指示)。
为了产生针对上述表位的单克隆抗体，合成肽及其分别与卵清蛋白(OVA)和牛血清白蛋白(BSA)的缀合物在Bio-Synthesis, Inc. (Lewisville, TX)制备，如表2中所概述。注意，对于肽R2，天然猪TCN1序列中存在的两个甲硫氨酸残基被修饰为正亮氨酸，用于合成用作免疫原的肽及其缀合物。
按照联邦法规和IACUC方案产生抗体。小鼠系统在开发用于体外诊断应用中的抗体方面表现良好，且因此被用于产生抗猪TCN1抗体。
表2：合成的猪TCN1肽和相应的缀合物
* X代表正亮氨酸。
在本实施例中，包含与BSA缀合的Rl、R2或R3肽的免疫原用于腹膜内(IP)免疫雌性BALB/c小鼠、Swiss Webster (SW)小鼠或A/J小鼠以产生针对猪TCN1肽的单克隆抗体。小鼠以3周的间隔接受3次或更多次免疫原注射(50 µg/剂量/动物)。使用在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化的抗原进行初次免疫，随后使用不完全弗氏佐剂(IFA)进行后续加强免疫。
最后一次注射后一周，对小鼠取血，并在ELISA测定中用相应的卵清蛋白缀合物和游离肽测试血清样品的肽-特异性抗体。所有ELISA步骤均在室温下进行。Nunc Maxi-SorpTM平底ELISA板分别用PBS中的2µg/mL和1 µg/mL的肽或肽-OVA缀合物包被，每孔50 µL，持续1小时。将板甩干，并且通过每孔添加200 µL封闭溶液(含有0.05% Tween 20的PBS中的0.5%酪蛋白)封闭剩余的结合位点1小时。将板用含有0.05% Tween 20的Milli-Q水洗涤3次，并将待测试的抗体样品(血清、杂交瘤上清液或PBS中的mAb稀释液)以每孔50µL的体积放置于所述板的孔中。孵育1小时后，如上所述再次洗涤板，并以每孔50μL添加封闭溶液中1:3,000稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP缀合物，持续1小时。洗涤板，并以每孔100µL添加TMB底物(Moss, Pasadena, MD)，持续15分钟。使用ELISA读板器测量样品在650 nm处的光密度。
还测试了血清样品与在维生素B12-Sepharose上部分纯化并被猪内在因子污染的天然猪R-蛋白样品的结合(图1)。为了该目的，ELISA板以每孔50 µL的PBS中1 µg/mL的部分纯化的天然猪R-蛋白包被1小时，且如上文所述进行后续的ELISA步骤。
图4显示选择的A/J小鼠的小鼠取血滴定的结果。分别用R1-BSA、R2-BSA和R3-BSA免疫小鼠#C3、C1和C5。可以看出，所有动物都对各自的肽和肽-OVA缀合物产生高抗体滴度，而只有来自R1-BSA-和R2-BSA-免疫的动物的血清结合天然猪R-蛋白。这些结果证实合成的R1和R2肽诱导对天然猪TCN1的免疫应答。此外，对应于合成R3肽的表位可能不容易用于在天然的、高度糖基化的蛋白上的抗体结合。
选择具有高抗肽抗体滴度的小鼠用于单克隆抗体生成。在融合前，小鼠连续三天接受用相同免疫原的融合前加强(PBS中25 µg/剂量/动物，IP)。在第四天，处死小鼠，并收获脾细胞。在聚乙二醇存在的情况下融合免疫脾细胞和P3-X63Ag8.653鼠骨髓瘤细胞(ATCCCRL-1580TM)。将融合的细胞悬浮于含HAT的培养基中并培养约10-21天。如上所述，使用用相应肽包被的板在ELISA中针对抗-肽抗体筛选杂交瘤上清液。对阳性克隆进行通过有限稀释的亚克隆、扩增和冷冻。在蛋白A Sepharose (GEHealthcare, Chicago, IL)柱上从杂交瘤上清液纯化单克隆抗体。表3代表针对猪TCN1肽生成的一些单克隆抗体的特性。
表3：针对猪TCN1肽生成的单克隆抗体
| 样品 | 免疫原 | 表位 | 表位 SEQ ID NO: | 同种型 | pI |
| 171F 3B9 | R3-BSA | KRSISNGKIKAAIKDS | 4 | IgG2b, κ | 6.0 – 6.7 |
| 171F 9F5 | R3-BSA | KRSISNGKIKAAIKDS | 4 | IgG2b, κ | 6.0 – 6.4 |
| 171F 7B4 | R3-BSA | KRSISNGKIKAAIKDS | 4 | IgG1, κ | 5.7 – 6.0 |
| 171B 1G5 | R2-BSA | QDDMNRRDMS | 3 | IgG2b, κ | 6.0 – 7.1 |
在ELISA测定中测试纯化的mAb与相应肽、部分纯化的天然猪-R-蛋白和重组猪TCN1 (LifeSpan BioSciences, LS-G23154, Seattle, WA)和猪内在因子的结合。为了该目的，将从8 µg/mL开始在PBS中2倍稀释的抗原以每孔50 µL置于ELISA板的孔中，在室温下持续1小时。如上所述，将板甩干，用每孔200 µL封闭溶液封闭，并洗涤3次。以每孔50 µL添加PBS中1 µg/mL的针对猪TCN1肽的单克隆抗体。孵育1小时后，再次洗涤板，并以每孔50 µL添加在封闭溶液中1:3,000稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP缀合物，持续1小时。洗涤板，并以每孔100 µL添加TMB底物(Moss, Pasadena, MD)，持续15分钟。使用ELISA读板器在650 nm处读取板。
尽管所有抗-肽单克隆抗体都表明与相应合成肽的强剂量依赖性结合，但只有针对R2肽生成的171B 1G5 mAb识别重组猪TCN1和部分纯化的天然猪R-蛋白两者。图5显示171B 1G5单克隆抗体结合不同抗原的ELISA结果。可以看出，171B 1G5单克隆抗体结合R2肽以及天然和重组猪TCN1蛋白两者，并且mAb也表明与猪内在因子没有交叉反应性。该测试的结果证实部分纯化的猪R-蛋白的样品含有猪TCN1，并且可用于生成抗猪TCN1单克隆抗体。
实施例2：使用来自天然来源的猪R-蛋白的粗制剂产生抗猪TCN1单克隆抗体
在本实施例中，使用在维生素B12-Sepharose上从猪胃粘膜的粉末粗提取物部分纯化的天然猪R-蛋白的样品(图1)免疫5只BALB/c和10只A/J雌性小鼠来产生针对猪R-蛋白的单克隆抗体。小鼠以3周的间隔接受免疫原的3次腹膜内注射(50 µg/剂量/动物)。使用在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化的抗原进行初次免疫，随后使用不完全弗氏佐剂(IFA)进行后续加强免疫。
最后一次注射后一周，对小鼠取血，并在ELISA测定中测试血清样品的猪TCN1-特异性抗体和与合成肽的结合，如实施例1中所述。171B 1G5 mAb用作在包被的ELISA板上存在猪TCN1蛋白的阳性对照(未显示)。用部分纯化的猪R-蛋白免疫的所有动物都产生对该抗原的高抗体滴度(>1:100,000)。图6呈现Balb/C(小图A)和A/J(小图B)小鼠对不同抗原的取血滴定的实例。可以看出，两种品系的小鼠都对猪TCN1产生高抗体滴度，但没有观察到与合成的R1、R2和R3肽的结合。这些结果表明这些肽可能不代表天然糖基化猪R-蛋白的免疫显性表位。
小鼠在连续三天接受用相同的免疫原的融合前加强(10 μg/剂量/动物，在PBS中，IP)，并且在第四天，收获并冷冻小鼠脾脏。几年后，当重组猪TCN1蛋白变得市售时，根据上述实施例1中描述的标准程序，使用解冻的免疫脾细胞用于制备杂交瘤。筛选杂交瘤上清液对于在每孔50µL体积中以1 µg/mL吸附在ELISA板上的重组猪TCN1 (LifeSpanBioSciences, LS-G23154, Seattle, WA)和部分纯化的天然猪-R蛋白的结合。选择几种对两种抗原均给出阳性信号的杂交瘤。如图7中可见，由171J 3F1和171J 3A6克隆产生的单克隆抗体与重组猪TCN1的结合比天然猪R-蛋白好得多；单克隆抗体171J 9G7同样好地识别两种抗原，并且比重组猪TCN1相比，171J 5H12 mAb更强烈地结合天然猪R-蛋白。未观察到单克隆抗体与猪内在因子的交叉反应性。对杂交瘤进行通过有限稀释的亚克隆、扩增和冷冻。在蛋白A Sepharose (GEHealthcare, Chicago, IL)柱上从杂交瘤上清液纯化单克隆抗体。
在具有14个氨基酸的肽-肽重叠的线性15聚体猪TCN1 (UniProt ID: P17630.2)和猪内在因子(UniProt ID: F1RI90)肽的微阵列上，通过PEPperPRINT GmbH(Heidelberg, Germany)进行单克隆抗体表位作图。简而言之，将肽微阵列与浓度为1、10和100 µg/mL的171B 1G5、171J 3F1、171J 3A6、171J 5H12或171J 9G7单克隆抗体孵育，随后用山羊抗小鼠IgG (H+L)DyLight800二抗染色以及用LI-COR Odyssey成像系统读出。用PepSlide® Analyzer完成微阵列图像分析和肽注释。用二抗对每个肽微阵列变体的预染色未显示任何可能干扰主要测定的背景相互作用。
尽管没有任何mAb显示针对线性猪内在因子肽的任何应答，甚至在100 μg/ml的高抗体浓度下也是如此，但成功地鉴定了171B 1G5、171J 3F1、171J 3A6和171J 5H12抗体的独特线性猪TCN1表位。没有由两种或更多种抗体共享的表位，并且使用FASTA软件(EMBL-EBI, Hinxton, Cambridge)分析它们的氨基酸序列证实所有鉴定的表位对于猪TCN1都是独特的。图8代表针对猪TCN1肽微阵列测定的小鼠mAb的表位作图的概述。
单克隆抗体171J 9G7未显示针对线性猪TCN1或猪内在因子肽的任何应答，甚至在100 μg/ml的高抗体浓度下也是如此。这种负面结果可能由线性肽无法模拟的表位的构象或更复杂的不连续性质导致。
猪TCN1特异性单克隆抗体的特性呈现于表4中。
表4：猪TCN1特异性单克隆抗体的特性
| mAb | 表位 | 表位SEQ ID NO: | AA位置 | 同种型 |
| 171B 1G5 | DMNRRD | 20 | 82-87 | IgG2b, κ |
| 171J 3F1 | LEQIRGIYGASI | 21 | 46-57 | IgG1, κ |
| 171J 3A6 | FIHDHHLVE | 22 | 113-121 | IgG2b, κ |
| 171J 5H12 | EKLGEKFKEEI | 23 | 121-131 | IgG1, κ |
| 171J 9G7 | 构象 | N/A | N/A | IgG1, κ |
171B 1G5、171J 3F1、171J 3A6和171J 5H12单克隆抗体在TCN1分子表面上的线性表位的位置如上文实施例1中所述确定，并且这些位置显示于图9中的模型晶体结构的前视图(小图A)和顶视图(小图B)中。可以看出，所有4种mAb的表位都位于蛋白球的同一侧，因此目前使得难以乃至不可能使用任何一对mAb用于在夹心测定法中检测天然猪TCN1。ELISA和Biacore配对实验证实了该结论(数据未显示)。
使用配备有Biacore T200控制软件2.0.1版(GE Healthcare Bio-Sciences,Pittsburgh, PA)的Biacore T200在动力学实验中确定抗猪TCN1单克隆抗体和TCN1蛋白之间的相互作用的结合参数。使用氨基-偶联化学法，将抗猪TCN1 mAb以700-5,000 RU的密度固定在CM5传感器芯片的流通室2、3和4中的羧甲基葡聚糖表面上。将对照抗体固定在流动室1中以进行体积效应减法。将重组猪TCN1 (LifeSpan BioSciences, LS-G23154,Seattle, WA)或天然猪R-蛋白以30 µL/min流速在8分钟期间注射在具有固定化mAb的表面上，随后解离20分钟。通过注入运行缓冲液(10 mM HEPES、150 mM NaCl、0.05% P-20、pH7.4)一式三份运行缓冲液空白，并用于在拟合前对mAb结合数据进行双重参考。在每个结合循环之后，通过以30 µL/min的流速连续两次注射10 mM甘氨酸、pH 2.0和0.1M碳酸氢钠、pH8.5，每次30秒，使表面再生。在25-1600 nM抗原浓度内收集动力学数据，并全局拟合至简单的1:1相互作用模型。Biacore T200评估软件3.0版(GE Healthcare Bio-Sciences)用于确定猪TCN1特异性mAb相互作用的结合参数。抗猪TCN1单克隆抗体与重组猪TCN1和天然猪R-蛋白结合的动力学参数呈现于表5中。如可以看出，5种抗体中的3种仅与重组猪TCN1相互作用，并且仅171J 5H12 mAb以非常高的亲和力结合天然猪R-蛋白，与该抗原形成极其稳定的复合物。单克隆抗体171J 9G7识别两种抗原，但该抗体对重组蛋白的亲和力是对天然蛋白的亲和力超过500倍更高。
这些结果可以通过两种抗原的糖基化差异来解释。酵母产生的重组猪TCN1(LifeSpan BioSciences, LS-G23154, Seattle, WA)的46.3 kDa的分子量对应于非糖基化多肽链的分子量。如前所提及，天然猪R-蛋白是高度糖基化的，并且包含高达50% w/w的碳水化合物。一方面，糖基化阻止了171J 3F1、171J 3A6和171B 1G5 mAb结合天然抗原，并使171J 9G7 mAb与糖基化猪R-蛋白的相互作用不太有效。另一方面，糖基化促进171J 5H12mAb与天然猪TCN1结合，并且碳水化合物部分是该抗体识别的表位的重要部分。该结论通过天然猪R-蛋白的酶促去糖基化实验证实(数据未显示)。
表5：单克隆抗体与重组和天然猪TCN1结合的动力学参数
实施例3：抗猪TCN1单克隆抗体的测序
提供了如实施例1和2中所产生的产生单克隆抗体171B 1G5、171J 3F1、171J 3A6、171J 5H12和171J 9G7的杂交瘤细胞，并且遵循TRIZOL®试剂(Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA)的技术手册从其中分离总RNA。然后遵循PRIMESCRIPT™第一链cDNA合成试剂盒(Takara Bio USA, Inc., Mountain View, CA)的技术手册使用同种型特异性反义引物或通用引物将总RNA逆转录成cDNA。根据GenScript (Piscataway, NJ)的cDNA末端快速扩增(RACE)的标准操作程序(SOP)扩增VH、VL、CH和CL的抗体片段。将扩增的抗体片段单独地克隆至标准克隆载体中。进行菌落PCR以筛选具有正确大小的插入物的克隆。对于每个片段，对不少于五个具有正确大小的插入物的克隆进行测序，并且每个克隆与其他克隆具有>99%序列同一性。比对不同克隆的序列，并提供共有序列。
为每种单克隆抗体获得的每种DNA和氨基酸序列分配序列标识符，如表6中所概述。这些序列包括每种单克隆抗体的重链和轻链两者的DNA序列、重链和轻链的氨基酸序列、重链和轻链可变区的氨基酸序列以及重链和轻链可变区两者的三个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)的氨基酸序列。
表6：分配给各种抗体序列的序列标识符
此外，每种单克隆抗体的重链和轻链可变区序列的V(D)J连接的IMGT®分析(ImMunoGeneTics信息系统, Montpellier, France)显示于表7中。
表7：V(D)J连接的IMGT®分析
单克隆抗体171B 1G5的同种型是小鼠IgG2b,κ。
合成的重链和轻链基因使用抗猪TCN1单克隆抗体的序列信息来合成，并在哺乳动物细胞中瞬时表达以产生少量重组抗体。表达的抗体在蛋白A亲和柱上纯化，并在ELISA测定中针对猪TCN1结合进行测试，如上所述。图10显示使用常规产生的171B 1G5单克隆抗体相对于重组产生的171B 1G5单克隆抗体的重组猪TCN1的示例性ELISA滴定结果。如可以看出，图10中的数据证实为抗体获得的序列是正确的，因为两条滴定曲线是可重叠的。
实施例4：在具有171J 5H12单克隆抗体的亲和柱上从粗制剂纯化天然猪TCN1蛋白
在本实施例中，单克隆抗体171J 5H12用于制备亲和吸附剂，用于从粗制剂纯化天然猪R-蛋白。通过使用制造商的方案，将30 mg抗猪TCN1单克隆抗体171J 5H12共价固定在3g CNBr-Sepharose 4B Fast Flow (GE Healthcare Bio-Sciences, #17-0981-01,Pittsburg, PA)上来制备亲和树脂，并重新悬浮于PBS、pH 7.4中。通过将42 g粉末悬浮于220 mL含有0.02%叠氮化钠的蒸馏水中来制备猪胃粘膜的粗粉末提取物的20%溶液，并在40℃下搅拌16小时。将所得悬浮液在40℃下以20,000 g离心1小时，并从沉淀倾析出浑浊的上清液，转移至新管中，并再次在40℃下以20,000 g离心40 min。
将粗的猪胃粘膜的澄清水提取物(约180mL)与171J 5H12 mAb-Sepharose (约10mL)混合，并在定轨振荡器上在室温下轻轻搅拌过夜。在含有中等烧结玻璃盘的布氏漏斗上用真空抽吸将亲和树脂与上清液分离，用PBS、pH 7.4洗涤3次，并装入玻璃柱(1.5x7.2 cm,V=12.7 mL)。用100 mL PBS、pH7.4洗涤柱，随后用100 mL的0.1M柠檬酸钠、pH 5.0以10 mL/min的流速洗涤。用100 mL的0.1M柠檬酸钠、pH2.2从柱中洗脱结合的蛋白，并通过280 nm处的吸光度监测级分。合并含有蛋白的级分并针对含有0.02%叠氮化钠、pH 7.4(各2 L)的两次更换的PBS进行透析。从42 g猪胃粘膜的粗粉末提取物纯化出总共7.8 mg蛋白。
如图11中可以看出，与天然猪TCN1一样，在具有171J 5H12 mAb的亲和柱上纯化的蛋白在还原条件下在SDS-PAGE上作为单一70-92 kDa宽的条带迁移(小图A)，并且具有非常酸性的等电点(pI <4.5，小图B)。
通过Bio-Synthesys (Lewisville, TX)通过胰蛋白酶消化凝胶切片中的70-92kDa蛋白进行蛋白鉴定。通过纳米-毛细管LC-MS/MS分析肽，随后进行数据搜索。样品中的主要蛋白被鉴定为猪钴胺传递蛋白I，并且肽覆盖67%猪TCN1序列。
本实施例表明单克隆抗体171J 5H12可用于亲和树脂制备。此类树脂可用于在非常温和的条件下从猪胃粘膜的粗提取物中单步分离同质的天然猪TCN1。
实施例5：使用ELISA用171J 5H12 mAb检测天然猪TCN1
在本实施例中，单克隆抗体171J 5H12用于ELISA测定中，以检测猪内在因子的粗制剂和纯化样品中的天然猪R-蛋白。在具有固定化的171J 5H12单克隆抗体的柱上亲和纯化的天然猪TCN1(图11)用作标准品，以制作标准滴定曲线。所有ELISA步骤都在室温下进行。Nunc Maxi-SorpTM平底ELISA板用PBS中的2 µg/mL的维生素B12-BSA缀合物包被，每孔50µL，持续1小时。将板甩干，用每孔200 µL封闭溶液封闭，并洗涤，如上所述。在PBS中制备天然猪TCN1的2倍稀释液(2000 ng/mL)和待测试样品，并以每孔50 µL的体积置于板的孔中。在孵育1小时并洗涤板后，添加PBS中1µg/mL的171J 5H12 mAb，每孔50µL。将板孵育1小时并洗涤，且然后以每孔50µL添加在封闭溶液中1:3,000稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP缀合物，持续1小时。再次洗涤板，并以每孔100 µL添加TMB底物(Moss, Pasadena, MD)，持续15分钟。使用ELISA读板器在650 nm处读板。
图12表明使用ELISA测定法用单克隆抗体171J 5H12检测猪胃粘膜的粗提取物中的天然猪TCN1。如可以看出，该测定法允许检测样品中至少1 ng/mL的天然猪TCN1。
实施例6：在具有171J 5H12 mAb的亲和树脂上精制猪内在因子样品
在本实施例中，对天然猪TCN1特异性的单克隆抗体171J 5H12用于开发亲和树脂，以根据需要用于从猪内在因子制剂中除去猪TCN1污染物和/或精制纯化的HIF。在实施例5中描述的ELISA测定法中测试猪内在因子的样品，并且检测到低水平的猪TCN1污染。为了除去污染物，在具有固定化的171J 5H12 mAb的亲和树脂上进行样品的耗竭。将如实施例4中所述制备的100 μL的171J 5H12-Sepharose 4B添加至300 μL的HIF (1mg/mL)中，并在室温下在定期轻轻混合的情况下孵育5小时。通过在室温下以3000 g离心15 min来除去亲和树脂，并在ELISA测定法中针对天然猪TCN1的存在测试上清液。图13显示用171J 5H12 mAb-Sepharose精制猪内在因子样品的结果。如可以看出，在耗竭后，猪TCN1污染水平从总蛋白的2.7%下降至0.1%。
因此，根据本公开，已经提供了完全满足上文所述的目的和优点的组合物及其生产和使用方法。尽管已经结合上文阐述的具体附图、实验、结果和语言描述了本公开，但显然，许多替代、修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，意欲涵盖落入本公开的精神和广泛范围内的所有此类替代、修改和变化。
Claims (27)
1.能够特异性结合猪钴胺传递蛋白-1 (TCN1)的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段选自：
(A) 抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区CDR1、具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区CDR2、具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区CDR3、具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区CDR1、具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(B) 抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的重链可变区CDR1、具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的重链可变区CDR2、具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的重链可变区CDR3、具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链可变区CDR1、具有SEQ IDNO:32的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(C) 抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链可变区CDR1、具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链可变区CDR2、具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链可变区CDR3、具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的轻链可变区CDR1、具有SEQ IDNO:44的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(D) 抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的重链可变区CDR1、具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的重链可变区CDR2、具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的重链可变区CDR3、具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的轻链可变区CDR1、具有SEQ IDNO:56的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；和
(E) 抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的重链可变区CDR1、具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链可变区CDR2、具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的重链可变区CDR3、具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链可变区CDR1、具有SEQ IDNO:68的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
2.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中：
(A) 所述抗体或其抗原结合片段特异性结合包含SEQ ID NO:3和20中的至少一个的至少一部分的猪TCN1的表位；
(B) 所述抗体或其抗原结合片段特异性结合包含SEQ ID NO:21的至少一部分的猪TCN1的表位；
(C) 所述抗体或其抗原结合片段特异性结合包含SEQ ID NO:22的至少一部分的猪TCN1的表位；或
(D) 所述抗体或其抗原结合片段特异性结合包含SEQ ID NO:23的至少一部分的猪TCN1的表位。
3.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其进一步定义为单克隆抗体或其抗原结合片段。
4.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中：
(A) 所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区具有与SEQ ID NO:7具有至少约90%同一性的氨基酸序列；
(B) 所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区具有与SEQ ID NO:25具有至少约90%同一性的氨基酸序列；
(C) 所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区具有与SEQ ID NO:37具有至少约90%同一性的氨基酸序列；
(D) 所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区具有与SEQ ID NO:49具有至少约90%同一性的氨基酸序列；或
(E) 所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区具有与SEQ ID NO:61具有至少约90%同一性的氨基酸序列。
5.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中：
(A) 所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区具有与SEQ ID NO:13具有至少约90%同一性的氨基酸序列；
(B) 所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区具有与SEQ ID NO:30具有至少约90%同一性的氨基酸序列；
(C) 所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区具有与SEQ ID NO:42具有至少约90%同一性的氨基酸序列；
(D) 所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区具有与SEQ ID NO:54具有至少约90%同一性的氨基酸序列；或
(E) 所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区具有与SEQ ID NO:66具有至少约90%同一性的氨基酸序列。
6.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中：
(A) 所述抗体或其抗原结合片段的重链和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:7和13的氨基酸序列；
(B) 所述抗体或其抗原结合片段的重链和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:25和30的氨基酸序列；
(C) 所述抗体或其抗原结合片段的重链和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:37和42的氨基酸序列；
(D) 所述抗体或其抗原结合片段的重链和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:49和54的氨基酸序列；或
(E) 所述抗体或其抗原结合片段的重链和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:61和66的氨基酸序列。
7.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其被进一步定义为选自全长免疫球蛋白分子、scFv、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2、 Fv、二硫化物连接的Fv及其组合。
8.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其被进一步定义为纯化的抗体或其抗原结合片段。
9.抗体或其抗原结合片段，其能够特异性结合猪钴胺传递蛋白-1 (TCN1)的表位，所述表位包含 SEQ ID NO:2、3、4、20、21、22或23中的至少一个的部分。
10.产生抗体或其抗原结合片段的方法，所述抗体或其抗原结合片段能够特异性结合猪钴胺传递蛋白-1 (TCN1)的表位，所述方法包括以下步骤：
用包含至少一种SEQ ID NO:2、3、4、20、21、22或23的肽的抗原化合物免疫非人动物；和
从所述非人动物的血浆回收所述抗体或其抗原结合片段。
11.产生权利要求1-9中任一项的抗体或其抗原结合片段的杂交瘤。
12.产生抗体或其抗原结合片段的方法，所述抗体或其抗原结合片段能够特异性结合猪钴胺传递蛋白-1 (TCN1)的表位，所述方法包括以下步骤：
培养根据权利要求11所述的杂交瘤以产生所述抗体或其抗原结合片段；和
回收所述抗体或其抗原结合片段。
13.组合物，其包含：
至少一种权利要求1-9中任一项的抗体或其抗原结合片段；和
与所述至少一种抗体或其抗原结合片段附接的可检测标记物。
14.组合物，其包含：
固体支持物；和
与所述固体支持物结合的至少一种权利要求1-9中任一项的抗体或其抗原结合片段。
15.多核苷酸，其编码权利要求1-9中任一项的抗体或其抗原结合片段。
16.权利要求15的多核苷酸，其中：
(A) 编码所述抗体或其抗原结合片段的重链的多核苷酸的一部分与SEQ ID NO:5具有至少约90%同一性；
(B) 编码所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的多核苷酸的一部分与SEQ IDNO:24具有至少约90%同一性；
(C) 编码所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的多核苷酸的一部分与SEQ IDNO:36具有至少约90%同一性；
(D) 编码所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的多核苷酸的一部分与SEQ IDNO:48具有至少约90%同一性；或
(E) 编码所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的多核苷酸的一部分与SEQ IDNO:60具有至少约90%同一性。
17.权利要求15的多核苷酸，其中：
(A) 编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链的多核苷酸的一部分与SEQ ID NO:11具有至少约90%同一性；
(B) 编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的多核苷酸的一部分与SEQ IDNO:29具有至少约90%同一性；
(C) 编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的多核苷酸的一部分与SEQ IDNO:41具有至少约90%同一性；
(D) 编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的多核苷酸的一部分与SEQ IDNO:53具有至少约90%同一性；或
(E) 编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的多核苷酸的一部分与SEQ IDNO:65具有至少约90%同一性。
18.载体，其包含：
编码权利要求1-9中任一项的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸；和/或
权利要求15-17中任一项的多核苷酸。
19.重组宿主细胞，其包含：
编码权利要求1-9中任一项的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸；和/或
权利要求15-17中任一项的多核苷酸。
20.产生抗体或其抗原结合片段的方法，所述抗体或其抗原结合片段能够特异性结合猪钴胺传递蛋白-1 (TCN1)，所述方法包括以下步骤：
(a) 在允许表达由多核苷酸编码的所述抗体或其抗原结合片段的条件下，在细胞培养物中培养权利要求19的重组宿主细胞；和
(b) 从所述细胞培养物分离所述抗体或其抗原结合片段。
21.检测猪内在因子(HIF)制剂中存在的TCN1的方法，所述方法包括以下步骤：
在如果HIF制剂中存在TCN1，则形成抗体/TCN1复合物的条件下，使所述HIF制剂与权利要求1-9中任一项的抗体或其抗原结合片段接触；和
检测形成的任何抗体/TCN1复合物，其中形成的抗体-TCN1复合物的量与HIF制剂中存在的TCN1的量成正比。
22.权利要求21的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段具有与其附接的标记物，所述标记物用于检测所述抗体/TCN1复合物。
23.除去猪内在因子(HIF)制剂中存在的TCN1的方法，所述方法包括以下步骤：
在如果HIF制剂中存在TCN1，则形成抗体/TCN1复合物的条件下，使所述HIF制剂与权利要求1-9中任一项的抗体或其抗原结合片段接触；和
从HIF制剂中除去所述抗体/TCN1复合物。
24.权利要求23的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段与固体支持物附接，其有助于从所述HIF制剂中除去抗体-TCNl复合物。
25.权利要求23的方法，其进一步包括从所述抗体/TCN1复合物中洗脱TCN1以由此从所述HIF制剂纯化TCN1的步骤。
26.试剂盒，其包含以下中的至少一种：
权利要求1-9中任一项的抗体或其抗原结合片段；
权利要求11的杂交瘤；
权利要求13-14中任一项的组合物；
权利要求15-17中任一项的多核苷酸；
权利要求18的载体；和
权利要求19的重组宿主细胞。
27.权利要求26的试剂盒，其进一步包含能够特异性结合猪内在因子(HIF)的抗体或其抗原结合片段。
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