JP2022543674A - 抗ブタtcn1モノクローナル抗体ならびにその作製方法および使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2019年8月9日に出願された米国仮出願第62/884,711号の米国特許法第119条(e)に基づく利益を主張するものである。上述の特許/特許出願の内容全体を参照によって本明細書に明示的に組み入れる。
該当なし。
ブタRタンパク質(TCN1)は、392個のアミノ酸(約46kDaのポリペプチド鎖Mwを含む)および最大約50%w/w炭水化物を含む糖タンパク質であり;そのアミノ酸配列は配列番号1に示される。TCN1は、酸感受性ビタミンB12が胃を通って移動する間にこれを保護する。
この実施例では、ビタミンB12-セファロースでブタ胃粘膜の粉末粗抽出物から部分的に精製された天然ブタRタンパク質の試料(図1)を使用して、5匹のBALB/cおよび10匹のA/Jメスマウスを免疫して、ブタRタンパク質に対するモノクローナル抗体を作製した。マウスは、免疫原(50μg/投与/動物)の腹腔内注射を3週間間隔で3回受けた。一次免疫は完全フロイントアジュバント(CFA)で乳化した抗原を使用し、それに続くその後の追加免疫は、不完全フロイントアジュバント(IFA)を使用して行った。
モノクローナル抗体171B 1G5、171J 3F1、171J 3A6、171J 5H12、および171J 9G7を産生する実施例1および2のように作製したハイブリドーマ細胞を得、TRIZOL(登録商標)試薬(Thermо Fisher Scientific、Waltham、MA)の技術マニュアルに従って全RNAをそこから単離した。全RNAを次いで、PRIMESCRIPT(商標)First Strand cDNA Synthesis Kit(Takara Biо USA,Inc.、Mоuntain View、CA)の技術マニュアルに従って、アイソタイプ特異的アンチセンスプライマーまたはユニバーサルプライマーのどちらかを使用してcDNAに逆転写した。VH、VL、CH、およびCLの抗体断片を、GenScript(Piscataway、NJ)のcDNA末端の迅速増幅(RACE)の標準的操作手順(SOP)に従って増幅した。増幅抗体断片を、標準的なクローニングベクターに別々にクローニングした。コロニーPCRを行って的確なサイズのインサートを有するクローンをスクリーニングした。的確なサイズのインサートを有する5つ以上のコロニーを各断片について配列決定した。各クローンは、他のクローンに対して>99%の配列同一性を有した。異なるクローンの配列を整列させ、コンセンサス配列を得た。
この実施例では、モノクローナル抗体171J 5H12を使用して、粗製剤から天然ブタRタンパク質を精製するための親和性吸着剤を製造した。親和性樹脂は、30mg抗ブタTCN1モノクローナル抗体171J 5H12を、製造者のプロトコルを使用して3gのCNBr-セファロース 4B Fast Flоw(GE Healthcare Biо-Sciences、#17-0981-01、Pittsburg、PA)に共有結合固定して製造し、PBS、pH7.4に再懸濁した。0.02%アジ化ナトリウムを含有する蒸留水220mLに粉末42gを懸濁して、ブタ胃粘膜の粗粉末抽出物の20%溶液を製造し、40℃で16時間撹拌した。得られた懸濁液を20,000g、1時間、40℃で遠心分離し、混濁した上清をペレットから静かに注ぎ、新しいチューブに移し、再び20,000g、40分間、40℃で遠心分離した。
この実施例では、ブタ内因子の粗製剤および精製試料中の天然ブタRタンパク質を検出するために、モノクローナル抗体171J 5H12をELISAアッセイで使用した。固定化171J 5H12モノクローナル抗体を用いるカラムで精製した天然ブタTCN1親和性(図11)を標準として使用して、標準滴定曲線を作成した。ELISA工程は全て室温で行った。Nunc Maxi-Sorp(商標)平底ELISAプレートを、PBS中2μg/mLのビタミンB12-BSAコンジュゲートを用いて、1ウェルあたり50μLで1時間コーティングした。プレートを軽く叩いて乾燥させ、1ウェルあたり200μLのブロッキング溶液でブロックし、上記のように洗浄した。テストする天然ブタTCN1(2000ng/mL)および試料の2倍希釈液をPBSで製造し、1ウェルあたり容量50μLでプレートのウェルに入れた。1時間インキュベーションし、プレートを洗浄した後、171J 5H12 mAbを1ウェルあたり50μLでPBS中1μg/mLで添加した。プレートを1時間インキュベートし、洗浄し、次いでブロッキング溶液に1:3,000希釈したヤギ抗マウスIgG-HRPコンジュゲートを、1ウェルあたり50μLで1時間添加した。プレートを再び洗浄し、TMB基質(Moss、Pasadena、MD)を1ウェルあたり100μLで15分間添加した。ELISAプレートリーダーを使用して650nmでプレートを読み取った。
この実施例では、天然ブタTCN1に特異的なモノクローナル抗体171J 5H12を、ブタ内因子製剤からのブタTCN1汚染物質の除去、および/または必要に応じて精製HIFの研磨で使用するための親和性樹脂の開発に使用した。ブタ内因子の試料を実施例5に記載したELISAアッセイでテストし、低レベルのブタTCN1汚染を検出した。汚染物質を除去するために、固定化171J 5H12 mAbを用いる親和性樹脂で試料の枯渇を行った。実施例4に記載したように製造した171J 5H12-セファロース4B 100μLをHIF(1mg/mL)300μLに添加し、断続的に穏やかに混合しながら室温で5時間インキュベートした。親和性樹脂を3000gで15分間、室温で遠心分離して除去し、天然ブタTCN1の存在についてELISAアッセイで上清をテストした。図13は、171J 5H12 mAb-セファロースによるブタ内因子試料研磨の結果を示す。見てわかるように、枯渇後、ブタTCN1汚染のレベルは、総タンパク質の2.7%から0.1%まで減少した。
Claims (27)
- ブタトランスコバラミン-1(TCN1)に特異的に結合することができる抗体またはその抗原結合断片であって、該抗体またはその抗原結合断片は:
(A)配列番号8のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域CDR1、配列番号9のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域CDR2、配列番号10のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域CDR3、配列番号14のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域CDR1、配列番号15のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域CDR2、および配列番号16のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域CDR3を含む抗体またはその抗原結合断片;
(B)配列番号26のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域CDR1、配列番号27のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域CDR2、配列番号28のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域CDR3、配列番号31のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域CDR1、配列番号32のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域CDR2、および配列番号33のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域CDR3を含む抗体またはその抗原結合断片;
(C)配列番号38のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域CDR1、配列番号39のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域CDR2、配列番号40のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域CDR3、配列番号43のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域CDR1、配列番号44のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域CDR2、および配列番号45のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域CDR3を含む抗体またはその抗原結合断片;
(D)配列番号50のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域CDR1、配列番号51のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域CDR2、配列番号52のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域CDR3、配列番号55のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域CDR1、配列番号56のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域CDR2、および配列番号57のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域CDR3を含む抗体またはその抗原結合断片;ならびに
(E)配列番号62のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域CDR1、配列番号63のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域CDR2、配列番号64のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域CDR3、配列番号67のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域CDR1、配列番号68のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域CDR2、および配列番号69のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域CDR3を含む抗体またはその抗原結合断片
からなる群から選択される前記抗体またはその抗原結合断片。 - (A)の抗体もしくはその抗原結合断片は、配列番号3および20の少なくとも1つの少なくとも一部を含むブタTCN1のエピトープに特異的に結合する;
(B)の抗体もしくはその抗原結合断片は、配列番号21の少なくとも一部を含むブタTCN1のエピトープに特異的に結合する;
(C)の抗体もしくはその抗原結合断片は、配列番号22の少なくとも一部を含むブタTCN1のエピトープに特異的に結合する;または
(D)の抗体もしくはその抗原結合断片は、配列番号23の少なくとも一部を含むブタTCN1のエピトープに特異的に結合する、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - モノクローナル抗体またはその抗原結合断片としてさらに定義される、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- (A)の抗体もしくはその抗原結合断片の重鎖可変領域は、配列番号7と少なくとも約90%同一であるアミノ酸配列を有する;
(B)の抗体もしくはその抗原結合断片の重鎖可変領域は、配列番号25と少なくとも約90%同一であるアミノ酸配列を有する;
(C)の抗体もしくはその抗原結合断片の重鎖可変領域は、配列番号37と少なくとも約90%同一であるアミノ酸配列を有する;
(D)の抗体もしくはその抗原結合断片の重鎖可変領域は、配列番号49と少なくとも約90%同一であるアミノ酸配列を有する;または
(E)の抗体もしくはその抗原結合断片の重鎖可変領域は、配列番号61と少なくとも約90%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - (A)の抗体もしくはその抗原結合断片の軽鎖可変領域は、配列番号13と少なくとも約90%同一であるアミノ酸配列を有する;
(B)の抗体もしくはその抗原結合断片の軽鎖可変領域は、配列番号30と少なくとも約90%同一であるアミノ酸配列を有する;
(C)の抗体もしくはその抗原結合断片の軽鎖可変領域は、配列番号42と少なくとも約90%同一であるアミノ酸配列を有する;
(D)の抗体もしくはその抗原結合断片の軽鎖可変領域は、配列番号54と少なくとも約90%同一であるアミノ酸配列を有する;または
(E)の抗体もしくはその抗原結合断片の軽鎖可変領域は、配列番号66と少なくとも約90%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の抗体もしくはその抗原結合断片。 - (A)の抗体もしくはその抗原結合断片の重鎖および軽鎖可変領域は、配列番号7および13のアミノ酸配列をそれぞれ有する;
(B)の抗体もしくはその抗原結合断片の重鎖および軽鎖可変領域は、配列番号25および30のアミノ酸配列をそれぞれ有する;
(C)の抗体もしくはその抗原結合断片の重鎖および軽鎖可変領域は、配列番号37および42のアミノ酸配列をそれぞれ有する;
(D)の抗体もしくはその抗原結合断片の重鎖および軽鎖可変領域は、配列番号49および54のアミノ酸配列をそれぞれ有する;または
(E)の抗体もしくはその抗原結合断片の重鎖および軽鎖可変領域は、配列番号61および66のアミノ酸配列をそれぞれ有する、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - 完全長免疫グロブリン分子、scFv、Fab断片、Fab’断片、F(ab’)2、Fv、ジスルフィド結合Fv、およびそれらの組合せから選択されるものとしてさらに定義される、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 精製された抗体またはその抗原結合断片としてさらに定義される、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 配列番号2、3、3、20、21、22、または23の少なくとも1つの一部を含むブタトランスコバラミン-1(TCN1)のエピトープに特異的に結合することができる抗体またはその抗原結合断片。
- ブタトランスコバラミン-1(TCN1)のエピトープに特異的に結合することができる抗体またはその抗原結合断片を作製する方法であって:
配列番号2、3、4、20、21、22、または23の少なくとも1つのペプチドを含む抗原化合物でヒト以外の動物を免疫化する工程と;
抗体またはその抗原結合断片をヒト以外の動物の血漿から回収する工程と
を含む前記方法。 - 請求項1~9のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片を産生するハイブリドーマ。
- ブタトランスコバラミン-1(TCN1)のエピトープに特異的に結合することができる抗体またはその抗原結合断片を産生する方法であって:
請求項11に記載のハイブリドーマを培養して該抗体またはその抗原結合断片を作製する工程と;
抗体またはその抗原結合断片を回収する工程と
を含む前記方法。 - 請求項1~9のいずれか1項に記載の少なくとも1つの抗体またはその抗原結合断片と;
該少なくとも1つの抗体またはその抗原結合断片に付着した検出可能な標識と
を含む、組成物。 - 固体支持体と;
該固体支持体に結合された請求項1~9のいずれか1項に記載の少なくとも1つの抗体またはその抗原結合断片と
を含む、組成物。 - 請求項1~9のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド。
- (A)の抗体もしくはその抗原結合断片の重鎖をコードするポリヌクレオチドの一部は、配列番号5と少なくとも約90%同一である;
(B)の抗体もしくはその抗原結合断片の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドの一部は、配列番号24と少なくとも約90%同一である;
(C)の抗体もしくはその抗原結合断片の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドの一部は、配列番号36と少なくとも約90%同一である;
(D)の抗体もしくはその抗原結合断片の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドの一部は、配列番号48と少なくとも約90%同一である;または
(E)の抗体もしくはその抗原結合断片の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドの一部は、配列番号60と少なくとも約90%同一である、請求項15に記載のポリヌクレオチド。 - (A)の抗体もしくはその抗原結合断片の軽鎖をコードするポリヌクレオチドの一部は、配列番号11と少なくとも約90%同一である;
(B)の抗体もしくはその抗原結合断片の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドの一部は、配列番号29と少なくとも約90%同一である;
(C)の抗体もしくはその抗原結合断片の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドの一部は、配列番号41と少なくとも約90%同一である;
(D)の抗体もしくはその抗原結合断片の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドの一部は、配列番号53と少なくとも約90%同一である;または
(E)の抗体もしくはその抗原結合断片の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドの一部は、配列番号65と少なくとも約90%同一である、請求項15に記載のポリヌクレオチド。 - 請求項1~9のいずれか1項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド;および/または
請求項15~17のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド
を含む、ベクター。 - 請求項1~9のいずれか1項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド;および/または
請求項15~17のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド
を含む、組換え宿主細胞。 - ブタトランスコバラミン-1(TCN1)に特異的に結合することができる抗体またはその抗原結合断片を作製する方法であって:
(a)ポリヌクレオチドによってコードされた抗体またはその抗原結合断片の発現を可能にする条件下の細胞培養で、請求項19に記載の組換え宿主細胞を培養する工程と;
(b)該細胞培養から該抗体またはその抗原結合断片を単離する工程と
を含む前記方法。 - ブタ内因子(HIF)製剤中に存在するTCN1を検出する方法であって:
TCN1がHIF製剤中に存在するならば抗体/TCN1複合体が形成される条件下で、請求項1~9のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片とHIF製剤を接触させる工程と;
形成された抗体-TCN1複合体の量が、HIF製剤中に存在するTCN1の量に正比例する、形成されたいずれかの抗体/TCN1複合体を検出する工程と
を含む前記方法。 - 抗体またはその抗原結合断片は、抗体/TCN1複合体の検出で使用される標識が付着している、請求項21に記載の方法。
- ブタ内因子(HIF)製剤中に存在するTCN1を除去する方法であって:
TCN1がHIF製剤中に存在するならば抗体/TCN1複合体が形成される条件下で、請求項1~9のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片とHIF製剤を接触させる工程と;
抗体/TCN1複合体をHIF製剤から除去する工程と
を含む前記方法。 - 抗体またはその抗原結合断片は、HIF製剤からの抗体-TCN1複合体の除去を助ける固体支持体に付着される、請求項23に記載の方法。
- 抗体/TCN1複合体からTCN1を溶出して、それによりHIF製剤からTCN1を精製する工程をさらに含む、請求項23に記載の方法。
- 請求項1~9のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合断片;
請求項11に記載のハイブリドーマ;
請求項13~14のいずれか1項に記載の組成物;
請求項15~17のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド;
請求項18に記載のベクター;および
請求項19に記載の組換え宿主細胞
の少なくとも1つを含むキット。 - ブタ内因子(HIF)に特異的に結合することができる抗体またはその抗原結合断片をさらに含む、請求項26に記載のキット。
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CLINICAL BIOCHEMISTRY, vol. 40, JPN6023017843, 2007, pages 1392 - 1397, ISSN: 0005054780 * |
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