BR112014007426B1 - Anticorpos contra tl1a e seus usos - Google Patents

Anticorpos contra tl1a e seus usos Download PDF

Info

Publication number
BR112014007426B1
BR112014007426B1 BR112014007426-7A BR112014007426A BR112014007426B1 BR 112014007426 B1 BR112014007426 B1 BR 112014007426B1 BR 112014007426 A BR112014007426 A BR 112014007426A BR 112014007426 B1 BR112014007426 B1 BR 112014007426B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
seq
set forth
sequence set
sequence
threonine
Prior art date
Application number
BR112014007426-7A
Other languages
English (en)
Other versions
BR112014007426A2 (pt
Inventor
Adam Clarke
Andrew James Pow
Debra Tamvakis
George Kopsidas
Anthony Gerard Doyle
Philip Anthony Jennings
Lynn Dorothy Poulton
Matthew Pollard
Original Assignee
Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2011904042A external-priority patent/AU2011904042A0/en
Application filed by Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd filed Critical Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd
Publication of BR112014007426A2 publication Critical patent/BR112014007426A2/pt
Publication of BR112014007426B1 publication Critical patent/BR112014007426B1/pt

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Neurology (AREA)

Abstract

ANTICORPOS CONTRA TL1a E SEUS USOS A presente divulgação fornece ligando la (TL1a)ligação proteínas como TNF compreendendo um domínio de ligação de antígeno de um anticorpo que liga especificamente para TLa e inibe interação de TL1a e Receptor de Morte 3 ( DR3) e que não inibe a interação de TL1a e Receptor chamariz 3 ( DcR3) . A presente divulgação também fornece usos das proteínas de ligação TL1a.

Description

ANTICORPOS CONTRA TLla E SEUS USOS DADOS RELATIVOS A APLICAÇÃO
Esta aplicação reivindica prioridade do Pedido de Patente Australiana No. 2011904042 intitulado "Anticorpos contra TLla e seus Usos" depositado em 30 de setembro de 2011 e Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 61/541,590 intitulado "Anticorpos contra TLla e seus Usos" depositado em 30 de setembro de 2011. O conteúdo inteiro destas aplicações é incorporado neste documento por referência.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
Esta aplicação é depositada junto com uma Listagem de Sequência na forma eletrônica. O conteúdo inteiro da listagem de sequências é incorporado neste documento por referência. -
CAMPO
A presente divulgação relata para proteinas que ligam para TLla e seus usos, exemplo, em terapia, profilaxia, diagnóstico ou prognóstico.
ANTECEDENTES
Ligando la como TNF (TLla, syn. membro 15 da super familia TNF (TNFSF15); TL1 e VEGI) é um membro da superfamilia de fator de necrose de tumor, que é expresso por antigeno presentes em células (incluindo célula dendriticas, células B e macrófagos), células CD4+ e CD8+ T e células endotelial e podem ser expressas na superfície de célula ou secretada como uma citocina solúvel. O receptor para TLla, Receptor de morte 3 (DR3) é expresso por um Variedade de células, incluindo células CD4+ e CD8+ T, células NK, células NKT e células T reguladora de FOXP3+ (Treg). ’ TLla pode também ligar um receptor chamariz (DcR3), que é um inibidor competitivo de DR3. DcR3 também atua como um receptor chamariz para Fas-ligando (Fas-L) e proteina induzivel como linfotoxina que compete com glicoproteina D para ligação mediadora de entrada em células T (LIGHT). Consequentemente, DcR3 é um regulador importante de vários caminhos de transdução de sinal. O caminho de sinalização TLla/DR3 tem sido implicado em vários sistemas biológicos, que estão associados com doenças humanas. Por exemplo, TLla tem mostrado desempenhar um papel na imunidade e na angiogénese.
Usando camundongo deficiente em TLla e/ou DR3, investigadores mostraram que inibindo este caminho pode prover beneficio profilático ou terapêutico- em vários condições imune mediada, tal como, experimental encefalomielite autoimune (EAE; um modelo de esclerose múltipla), colite, doença inflamatória do intestino, asma e artrite. TLla foi também mostrado para promover formação de célula de espuma e placas aterosclerótica.
Será aparente para os especialistas do resultado exposto que TLla apresenta um papel importante em processos biológicos envolvendo várias importantes doenças humanas. Consequentemente, compostos que inibe atividade TLla são desejáveis, exemplo, para seus usos terapêutico, profilático, diagnóstico e prognóstico.
SUMÁRIO
Os inventores produziram proteínas de ligação TLla compreendendo domínios de ligação de antígeno de anticorpos que são capazes de especificamente ligarem para TLla e inibindo interação de TLla e DR3 (assim neutralizando atividade(s) TLla) sem inibir interação de TLla e DcR3. Sem ser limitado por qualquer teoria ou modo de ação, os inventores fundamentados que tais proteínas de ligação TLla podem ser capazes de reduzir ou prevenir sinalização de TLla através de DR3 sem significantemente perturbar a interação homeostática de DcR3 e TLla. Isto preserva o natural efeito antagonistico de DcR3 em interações de TLla- DR3, que pode ser vantajosa porque DcR3 também regula a quantidade de Fas-L e LIGHT livre disponível para ligarem para seus receptores (Fas e H-VEM, respectivamente). Desde morte mediada por Fas desempenha um papel de vigilância no câncer, potenciais consequências a jusante de aumentar a quantidade de DcR3 para ligar para Fas-L poderia incluir o aumento da susceptibilidade para o câncer. Outra vez, sem estar ligado para teoria ou modo de ação, proteínas que especificamente inibe interação de TLla e DR3, mas não DcR3, poderia ser vantajosa no tratamento de doença, mas sem comprometer a segurança.
Uma subclasse das proteinas de ligação TLla identificada pelos inventores foi também encontrada para inibir ou prevenir apoptose de células TF-1 induzida por TLla humano a concentrações baixas, isto é, os anticorpos tem uma concentração efetiva baixa ou ECSQ. Proteínas de ligação TLla capazes de inibir ou prevenir atividade TLla (exemplo, apoptose de células TF-1 induzida por TLla) são algumas vezes referidas neste documento como proteinas altamente potentes ligando TLla.
Os inventores também identificaram uma região de TLla que é contornada por uma proteína altamente potente ligando TLla que liga especificamente para TLla e inibe interação de TLla com DR3 sem inibir a habilidade de TLla para interação com DcR3.
As proteínas de ligação TLla identificada pelos inventores formam a base para vário usos terapêutico/profilático/diagnóstico/prognóstico. Isto é demonstrado pelo uso dos inventores de uma proteína de ligação TLla da revelação para tratar modelos aceitos de colite, com uma proteína mostrando eficácia pelo menos igual dos padrões atuais de cuidado para esta condição. Consequentemente, a presente divulgação fornece uma proteína isolada ou recombinante ligando TLla compreendendo um domínio de ligação de antígeno de um anticorpo, caracterizado por: o domínio de ligação de antígeno especificamente liga para TLla e, caracterizado por: a proteína de ligação TLla inibir interação de TLla e DR3 e não inibir interação de TLla e DcR3.
Em um exemplo, a proteína de ligação TLla não detecta redução de interação de TLla e DcR3. Por exemplo, o efeito da proteína de ligação TLla na interação de TLla e DcR3 é avaliada através de um ensaio de competição de enzima imune enzimática (ELISA). Por exemplo, a proteína de ligação TLla é incubada com TLla (exemplo, humano TLla) e então contactada com um polipeptídeo compreendendo DcR3 (exemplo, humano DcR3 (hDcR3)) fundido para uma região Fc de um anticorpo ("DcR3/Fc") e o nível de limite TLla é detectado. Em um exemplo, o nível de limite TLla na presença ou ausência da proteína não é significantemente diferente e/ou é insuficientemente diferente para permitir o calcular de um EC50.
Em um exemplo, o nível de inibição de interação de TLla e DcR3 (ou DcR3/Fc) na presença da proteína de ligação TLla expressa como uma porcentagem do nível de ligação na ausência da proteína é 25% ou menor, ou 22% ou menor, ou 20% ou menor, ou 18% ou menor, ou 15% ou menor, ou 12% ou menor, ou 10% ou menor, ou 7% ou menor, ou 5% ou menor.
Em um exemplo, a habilidade de uma proteina de ligação TLla para inibir interação de TLla e DR3 ou DcR3 é avaliada por imobilização de DcR3/Fc ou um polipeptideo compreendendo DR3 (exemplo, humano DR3 (hDR3)) fundido para uma região Fc de um anticorpo (DR3/Fc) em. uma superfície sólida ou semi-sólida (exemplo, uma placa ELISA) a uma concentração de cerca de 2μg/ml. A proteina de ligação TLla é então contactada com biotinilatado humano TLla (a uma concentração de cerca de 1 μg/ml) por cerca de 30 minutos então acrescentado para o imobilizado DcR3/Fc ou DR3/Fc. Após a lavagem, limite TLla é detectado. Para determinar porcentagem de ligação ou inibição, dados são normalizados por expressar uma porcentagem de máxima ligação de TLla para o imobilizado DcR3/Fc ou DR3/Fc na ausência de uma proteina de TLla. Para calcular o nível de inibição a múltiplas concentrações da proteína de ligação TLla, um EC5O pode ser determinado.
Em um exemplo, a proteína de ligação TLla inibe interação de TLla e DR3 (ou DR3/Fc) , mas não TLla e DcR3 (ou DcR3/Fc). Por exemplo, a proteína de ligação TLla inibe interação de DR3/Fc e TLla com um EC5o de cerca de 20nM a cerca de 10fM, ou um EC5Q de 20nM ou menor, tal como, 15nM ou menor, por exemplo, llnM ou menor, ,_por exemplo, 5nM ou menor. Em um exemplo, o EC50 é 5nM ou menor. Por exemplo, o EC5O θ 3nM ou menor. ’Por exemplo, o EC50 é 2, 5nM ou menor. Por exemplo, o EC50 é 1 nM ou menor. Por exemplo, o EC5O é 0,5nM ou menor. Em um exemplo, o EC5Q é avaliado usando um ensaio de competição de enzima imuno enzimática (ELISA). Por exemplo, várias concentrações da proteína de ligação TLla são incubadas com TLla (exemplo, humano TLla) (exemplo, cerca de lμg/ml de TLla) e então contactada com o DR3/FC (exemplo, cerca de 2ig/ml do DR3/Fc) e o nível de limite TLla é detectado A concentração de proteína para qual é detectado metade da inibição máxima de ligação ao TLla é considerado o EC50.
Em um exemplo, a proteína de ligação TLla neutraliza atividade TLla em ou sobre uma célula por interferir com interações de TLla e DR3.
Em um exemplo, a proteína de ligação TLla liga para o domínio extracelular de TLla, tal como o domínio extracelular de humano TLla. -Em um exemplo, a proteína de ligação TLla liga para humano TLla produzido por células mamíferas, tal como células humanas. Exemplares proteínas de ligação TLla da presente divulgação reduz o nível de apoptose de células TF-1 cultivada na presença de humano TLla, tal como humano TLla produzido por células mamíferas (exemplo, células humanas) (exemplo, cerca de lOOng humano TLla por ml de cultura) e cicloheximida. Por exemplo, cerca de 7xl04 para 8xl04 células TF-1 (exemplo, 7,5xl04 células) são contactadas com cerca de lμg humano TLla por ml de cultura e cicloheximida. Por exemplo, a proteína de ligação TLla reduz o nível de apoptose das células TF-1 com um EC50 (isto é, uma concentração da proteína de ligação TLla que aumenta 50% da máxima inibição de Apoptose induzida por TLla de células TF-1 aumentando uma proteína de ligação TLla) de 25nM ou menor. Em um exemplo, o Ec50 é 5nM ou menor. Em um exemplo, o Ec50 é 2nM ou menor. Em um exemplo, o Ec50 é 1.5nM ou menor ou l,2nM ou menor ou l,lnM ou menor. Em um exemplo, o Ec5o é InM ou menor. Em um exemplo, o EC5Q é 0,7 5nM ou menor. Em um exemplo, o Ecso é 0,3nM ou menor. Em um exemplo, o Ec5o é 0, InM ou menor. Em um exemplo, o Ec50 é de cerca de l,5nM a cerca de lOfM, tal como de cerca de InM a cerca de 50fM, por exemplo, de cerca de InM a cerca de lOOfM.
Em um exemplo, a proteína de ligação TLla liga para TLla na superfície de uma célula com um EC5Q (isto é, uma concentração da proteína de ligação TLla que aumenta 50% da máxima ligando para a célula aumentada pela proteína de ligação TLla) de cerca de lOnM ou menor, exemplo, como determinado usando citometria de fluxo. Em um exemplo, the citometria de fluxo é realizada com cerca de 2xl05 a 3xl05 células (exemplo, 2,5xl05 células). Em um exemplo, o Ecso é 5nM ou menor. Em um exemplo, o EC50 é 2nM ou menor. Em um exemplo, o Ecso é de cerca de 10,0nM ou 5,0nM ou l,0nM ou 0.5nM ou 0,lnM a cerca de lOnM.
A presente divulgação também fornece uma proteína isolada ou recombinante ligando TLla compreendendo um domínio de ligação de antígeno de um anticorpo, caracterizado por: o domínio de ligação de antígeno ligar especificamente para TLla e inibir a interação de biotinilatado TLla e DR3/Fc com um EC5o de cerca de 2,5nM ou menor, tal como InM ou menor ou de cerca de 2,5nM, ou cerca de l,0nM, ou cerca de 0,5nM, ou cerca de 0,lnM a cerca de 10fM em uma competição ELISA, caracterizado por: o DR3/Fc é imobilizado em um substrato sólido ou semi-sólido (exemplo, um substrato sólido tal como uma placa ELISA) a uma concentração de cerca de 2 μg/ml, e caracterizado por: o biotinilatado TLla ser contactado por cerca de 30 minutos a uma concentração de cerca de 1 μg/ml com uma proteina de ligação TLla a um intervalo de concentração de cerca de 10 μg/ml a cerca de 0,01 μg/ml e é então contactado para o imobilizado DR3/Fc, e caracterizado por: a proteina de ligação TLla não detectar redução de interação de biotinilatado TLla e DcR3/Fc em uma competição ELISA comparado com o nivel da ligação de biotinilatado TLla a DcR3/Fc na ausência da proteina de ligação TLla, caracterizado por: a DcR3/Fc ser imobilizado em um substrato sólido ou semi-sólido (exemplo, um substrato sólido tal como uma placa ELISA) a uma concentração de cerca de 2 μg/ml, caracterizado por: o biotinilatado TLla ser contactado por cerca de 30 minutos a uma concentração de cerca de lμg/ml com a proteina de ligação TLla -a uma concentração de cerca de 10 μg/ml 0,1 μg/ml e é então contactado para o imobilizado DcR3/Fc.
A presente divulgação também fornece uma proteina isolada ou recombinante ligando TLla compreendendo um dominio de ligação de antigeno de um anticorpo, caracterizado por: o dominio de ligação de antigeno ligar especificamente ao TLla e inibir a interação de biotinilatado TLla e DR3/Fc com um EC50 de cerca de 2,5nM ou menor, tal como InM ou menor ou de cerca de 2,5nM, ou cerca de l,0nM, ou cerca de 0,5nM, ou cerca de 0,lnM a cerca de 10fM em uma competição ELISA, caracterizado por: o DR3/Fc ser imobilizado em um substrato sólido ou semi- sólido (exemplo, um substrato sólido tal como uma placa ELISA) a uma concentração de cerca de 2 μg/ml, e caracterizado por: o biotinilatado TLla ser contactado por cerca de 30 minutos a uma concentração de cerca de 1 μg/ml com uma proteina de ligação TLl-a a um intervalo de concentração de cerca de 10 μg/ml a cerca de 0,01 μg/ml e é então contactado pra o imobilizado DR3/Fc, e caracterizado por: uma proteina de ligação TLla não reduz interação detectável de biotinilatado TLla e DcR3/Fc em uma competição ELISA comparado para o nivel da ligação de biotinilatado TLla a DcR3/Fc na ausência da proteina de ligação TLla, e caracterizado por: o DcR3/Fc ser imobilizado em um substrato sólido ou semi-sólido (exemplo, um substrato sólido tal como uma placa ELISA) a uma concentração de cerca de 2 μg/ml, caracterizado por: o biotinilatado TLla ser contactado por cerca de 30 minutos a uma concentração de cerca de 1 μg/ml com a proteina de ligação TLla a uma concentração de cerca de 10 μg/ml a 0,1 μg/ml e é então contactado para o imobilizado DcR3/Fc e caracterizado por: a proteina de ligação TLla reduzir o nivel de apoptose de células TF-1 cultivada na presença de humano TLla produzido por células humanas e cicloheximida com um EC50 (isto é, uma concentração da proteina de ligação TLla que aumenta 50% da máxima inibição de Apoptose induzida por TLla de células TF-1 aumentada pela proteina de ligação TLla) de 25nM ou menor, ou de cerca de 1,5 nM ou l,0nM ou 0,5nM ou 0,lnM ou 0,05nM a cerca de 10fM caracterizado por: cerca de 7,5xl04 células TF-1 são contactada com cerca de lOOng humano TLla por ml de cultura e cerca de 10μg/ml cicloheximida com a proteina de ligação TLla a uma concentração de cerca de 5μg/ml ou menor por cerca de 4 a 5 horas.
Em um exemplo, a TLla é biotinilatado em um site, isto é, a biotina é ligada só para um aminoácido em TLla.
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla não detecta redução de interação da biotinilatado TLla e DcR3/Fc na competição ELISA comparado com o nível da ligação de biotinilatado TLla para DcR3/Fc na ausência da proteína de ligação TLla, caracterizado por: a biotinilatado TLla ser contactada por cerca de 30 minutos a uma concentração de cerca de 1 μg/ml com a proteína de ligação TLla a uma concentração de cerca de 100 μg/ml e é então contactado para o imobilizado DcR3/Fc.
Em um exemplo, a proteína de ligação TLla não reduz detecável interação da biotinilatado TLla e DcR3/Fc na competição ELISA comparada com o nível da ligação de biotinilatado TLla para DcR3/Fc na ausência da proteína de ligação de TLla-, caracterizado por: a biotinilatado TLla ser contactado por cerca de 30 minutos a uma concentração de cerca de 1 μg/ml com a proteína de ligação TLla a uma concentração de cerca de 10 μg/ml e é então contactado para o imobilizado DcR3/Fc.
Em um exemplo, a proteína de ligação TLla reduz o nível de apoptose das células TF-1 com um EC50 de 22nM ou menor. Em um exemplo, o Ecso é lOnM ou menor. Em um exemplo, o Ec50 é 5nM ou menor. Em um exemplo, o Ec50 é 2nM ou menor. Em um exemplo, o EC50 é l,5nM ou menor ou l,2nM ou menor ou l,lnM ou menor. Em um exemplo, o Ecso é InM ou menor. Em um exemplo, o EC50 é 0,75nM ou menor. Em um exemplo, o EC5Q é 0,3nM ou menor. Em um exemplo, o Ec5o é 0,InM ou menor.
A presente divulgação adicionalmente, ou alternativamente, fornece uma proteína isolada ou recombinánte ligando TLla compreendendo um domínio de ligação de antígeno de um anticorpo, caracterizado por: o domínio de ligação de antígeno especificamente ligar para TLla e, caracterizado por: a proteína de ligação TLla inibir interação de TLla e DR3 e não inibir interação de TLla e DcR3, e caracterizado por: a proteina de ligação TLla ligar um forma mutante TLla humano solúvel compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 202 em que a arginina na posição 32 foi substituída com alanina e/ou a arginina na posição 85 foi substituída com alanina a um nivel que é pelo menos 7 5% menor que o nivel com que a proteina de ligação TLla liga para TLla humano solúvel compreendendo uma sequência estabelecida em SEQ ID NO: 202,
Em um exemplo, a forma mutante de TL1 humano solúvel é imobilizado em um sólido ou semi-substrato sólido (exemplo, um substrato sólido tal como uma placa ELISA) a uma concentração de cerca de 1 μg/ml, e caracterizado por: uma proteina de ligação TLla a um intervalo de concentração de cerca de 10 μg/ml a cerca de 0,01 μg/ml é então contactado para o imobilizado mutante TLla.
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla ligada a uma forma mutante de TL1 humano solúvel compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 202 em que a arginina na posição 32 foi substituída com alanina e/ou a arginina na posição 85 foi substituída com alanina a um nivel que não é maior que 25% do nivel com que uma proteina liga para TL1 humano solúvel compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 202. Por exemplo, o nivel de ligação da proteina de ligação TLla para uma forma mutante de TL1 humano solúvel não é maior que 25% do nível com que uma proteína liga para TL1 humano solúvel, quando a proteína de ligação TLla é testada a uma concentração de 10 μg/ml.
A presente divulgação adicionalmente, ou alternativamente, fornece uma proteína isolada ou recombinante ligando TLla compreendendo um domínio de ligação de antigeno de um anticorpo, caracterizado por: o dominio de ligação de antigeno especificamente ligar para TLla e, caracterizado por: a proteina de ligação TLla inibir interação de TLla e DR3 e não inibir interação de TLla e DcR3, e caracterizado por: a proteina de ligação TLla ligar uma forma mutante de TL1 humano solúvel compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 202 em que a arginina na posição 32 foi substituída com alanina e/ou a arginina na posição 85 foi substituída com alanina a um nivel que é pelo 75% mais baixo que o nivel com que uma proteina liga para TL1 humano solúvel compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 202, caracterizado por: a forma mutante de TLla ser imobilizado em um substrato sól-ido ou semi-sólido a uma concentração de cerca de 1 μg/ml, e caracterizado por: uma proteina de ligação TLla a uma concentração de 10 μg/ml ser então contactado para o imobilizado mutante TLla.
Em um exemplo, a forma mutante de TL1 humano solúvel compreender uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 202 em que a arginina na posição 32 foi substituída com alanina.
Em um exemplo, a forma mutante de TL1 humano solúvel compreender uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 202 em que a arginina na posição 85 foi substituída com alanina.
Em um exemplo, a forma mutante de TL1 humano solúvel compreender uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 202 em que a arginina na posição 32 foi substituída com alanina e em que a arginina na posição 85 foi substituída com alanina. ’
Em um exemplo, o nivel de ligação da proteina de ligação TLla pará uma forma mutante de TL1 humano solúvel é pelo menos 80% ou 85% ou 90% ou 95% menor que o nivel com que uma proteína liga para TL1 humano solúvel compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 202.
Em um exemplo, a proteína de ligação TLla não detecta ligação para a forma mutante de TL1 humano solúvel.
Em um exemplo, a ligação da proteína de ligação TLla ao TL1 humano solúvel ou a forma mutante desta é avaliada usando Ressonância de Superfície de Plasma. Por exemplo, o TL1 humano solúvel ou a forma mutante deste é imobilizado (exemplo, a uma concentração de cerca de 1 μg/ml) e a proteína de ligação TLla (exemplo, a uma concentração de cerca de 500 ng/ml) contactado ao imobilizado TL1 humano solúvel ou a forma mutante deste e ligação detectada por Ressonância de Superfície de Plasma. Por comparação o nível de ligação para o TL1 humano solúvel ou a forma mutante deste e a comparação pode ser feita para determinar uma proteína de ligação TLla que ligar a um nível that é pelo menos 75% menor que o nível com que uma proteína liga para TL1 humano solúvel.
Em um exemplo, a ligação da proteína de ligação TLla ao TL1 humano solúvel ou a forma mutante deste é avaliada usando ELISA. Por exemplo, o TL1 humano solúvel ou a forma mutante deste é imobilizado (exemplo, a uma concentração de cerca de 1 μg/ml) e a proteína de ligação TLla (exemplo, a uma concentração de cerca de 10 μg/ml) contactado ao imobilizado TL1 humano solúvel ou a forma mutante deste e ligação detectável por ELISA (exemplo, usando métodos padrões na matéria).
Em um exemplo, a proteína de ligação TLla liga para um epítopo dentro do TLla compreendendo resíduos correspondendo a arginina na posição 32 da SEQ ID NO: 202 e a arginina na posição 85 de SEQ ID NO: 202. Em um exemplo, o epitopo é urn epitopo conformacional.
Em um exemplo, a proteína de ligação TLla liga pelo menos resíduos de aminoácido arginina na posição 32 e arginina na posição 85 de um humano TLla que compreender uma sequência de aminoácido conforme estabelecido na SEQ ID NO:202.
Exemplares proteínas de ligação TLla tendo as característica de ligação conforme estabelecido nos parágrafos anteriores serão evidentes para os especialistas na matéria a partir da descrição neste documento e incluem aqueles que compreender os seguintes pares de VH e VL: (i) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 137 e um VL compreendendo uma sequência - estabelecida na SEQ ID NO: 138; (ii)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 162 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 172; ou (iv)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 17 3 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 174. VH e VL abrangendo os acima mencionados sequências será aparente para uma pessoa experiente da descrição neste documento e são paa ser aplicada mutatis mutandis para o presente exemplo da divulgação.
Em um exemplo, a proteína de ligação TLla da divulgação inibes interação de TLla de humano, cinomólogos macaco ou macaco rhesus e DR3. Tais proteínas de ligação TLla são úteis para caracterização em modelos animais de doença humana.
Em um exemplo, a proteína de ligação TLla da divulgação não detecta inibi a interação de TLla de rato, porco, coelho ou porco da índia e DR3, exemplo, a proteína de ligação TLla não detectável inibe o nível de apoptose de células TF-1 cultivadas na presença do relevante TLla, exemplo determindo usando um ensaio descrito neste documento.,
Em um exemplo, a proteína de ligação TLla da divulgação detectável inibe interação de TLla de camundongo e DR3. Por exemplo, a proteína de ligação TLla detectável inibe o nível de apoptose de células TF-1 cultivadas na presença do relevante TLla, exemplo como determinado usando um ensaio descrito neste documento.
Em um exemplo, a proteína de ligação TLla da divulgação detectável liga para uma isoforma de TLla consisting de aminoácidos 72-251 de SEQ ID NO: 123 e/ou para uma isoforma de TLla consistindo de aminoácidos 84-251 de SEQ ID NO: 123. Por exemplo, ligação é avaliada por um ELISA em que uma isoforma de TLla é imobilizado a uma concentração de IQg/ml e a proteína de ligação TLla é contactada para a isoform e o nível de ligação avaliada.
A presente divulgação adicionalmente ou alternativamente fornece uma proteína isolada ou recombinante ligando TLla compreendendo um domínio de ligação de antigeno de um anticorpo compreendendo qualquer um ou mais de the seguindo: (i)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 94 e um VL compreendendo uma sequência (ii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 137 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 138; (iii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 162 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 172; ou (iv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 173 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 174.
A presente divulgação adicionalmente ou alternativamente fornece uma proteina isolada ou recombinante ligando TLla compreendendo um dominio de ligação de antigeno de um anticorpo compreendendo qualquer uma ou mais da seguintes: (i) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 6; (ii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 10 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 14; (iii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 18 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 22; (iv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 26 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 30; (v) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO:' 34 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO:38; (vi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (vii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 50 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 54; (viii)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 58 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (ix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (x) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 66 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (xi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 70 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (xii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 7 4 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (xiii)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 7 8 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (xiv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 58 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 82; (xv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 8 6 e um VL compreendendo uma sequência ’estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xvi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 90 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xvii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 58 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (xviii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 154 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 164; (xix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 155 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 163; (xx) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 156- e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 165; (xxi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 157 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 166; (xxii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 158 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 167; (xxiii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 159 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 168; (xxiv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 160 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 169; (xxv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 161 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 170; (xxvi)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 234 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 169; (xxvii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 154 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxviii)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 155 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxix)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 156 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxx) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 157 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxxi)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 158 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxxii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 159 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxxiii)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 160 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxxiv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 161 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxxv)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 234 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; ' (xxxvi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 164; (xxxvii)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 165; (xxxviii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 166; (xxxix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 167; (xl) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 168; (xli) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 169; (xlii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 170; (xliii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 171; (xliv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 172; (xlv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 175 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 188; (xlvi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 176 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 189; (xlvii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 177 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 190; (xlviii)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 178 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 191; (xlix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 179 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 192; (l)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 180 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 193; (li) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 181 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 194; (lii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 182 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 195; (liii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 183 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 196; (liv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 184 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 197; (lv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 185 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 198; (Ivi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 186 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 199; ou (Ivii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 187 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 200.
Em um exemplo particular, existe o fornecimento de uma proteina isolada ou recombinante ligando TLla compreendendo um dominio de ligação de antigeno de um anticorpo compreendendo um VH e um VL, caracterizado por: o VH e VL respectivamente compreender sequências selecionadas do grupo consistindo de (i)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (ii) um VH codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 106 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 107 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (iii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 175 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 188; (iv) um VH ’ codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 222 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 228 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (v)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 176 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 189; (vi) um VH codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 223 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 228 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (vii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 177 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 190; (viii) um VH codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 224 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 229 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob' condições de moderada a alta severidade; (ix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 178 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 191; (x) um VH codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 224 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 230 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (xi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NG: 179 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 192; (xii) um VH codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 224 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 231 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (xiii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 180 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 193; (xiv) um VH codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 224 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 228 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (xv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 181 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 194; (xvi) um VH codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 225 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos- cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 230 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (xvii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 183 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 196; (xviii) um VH codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 226 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 230 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (xix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 185 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 198; (xx) um VH codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 226 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 232 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (xxi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 186 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 199; (xxii) um VH codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 227 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 232 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (xxiii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 187 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 200; e (xxiv) um VH codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 227 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 233 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade.
A presente divulgação adicionalmente ou alternativamente fornece uma proteina isolada ou recombinante ligando TLla compreendendo um dominio de ligação de antigeno de um anticorpo compreendendo um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46, caracterizado por: o VH e/ou VL compreender uma ou mais das seguintes substituições ou grupos de substituições: (i) o VH compreender uma alanina na posição 16 da SEQ ID NO: 42; (ii) o VH compreender uma alanina na posição 100 da SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 da SEQ ID NO: 46; (iii) o VH compreender uma serina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (iv) o VH compreender uma histidina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (v) o VH compreender uma leucina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (vi) o VH compreender um ácido aspártico na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (vii) o VH compreender uma tirosina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 4 6; (viii) o VH compreender uma prolina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (ix) o VH compreender uma glutamina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (x) o VH compreender uma lisina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xi) o VH compreender uma alamina na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xii) o VH compreender uma serina na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 4 6; (xiii) o VH compreender uma histidina na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xiv) o VH compreender uma leucina na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xv) o VH compreender um ácido aspártico na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xvi) o VH compreender uma tirosina na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xvii) o VH compreender uma glutamina na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xviii) o VH compreender uma lisina na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xix) o VH compreender uma alamina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 4 6; (xx) o VH compreender uma serina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxi) o VH compreender uma histidina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxii) o VH compreender uma leucina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 4 6; (xxiii) o VH compreender uma tirosina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxiv) o VH compreender uma prolina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 4 6; (xxv) o VH compreender uma glutamina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxvi) o VH compreender uma lisina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 7 6 de SEQ ID 'NO: 4 6; (xxvii) o VH compreender uma alamina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 4 6; (xxviii) o VH compreender uma serina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxix) o VH compreender uma histidina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxx) o VH compreender uma leucina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 4 6; (xxxi) o VH compreender um ácido aspártico na posição 103 de SEQ ID NO: 42- e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxii) o VH compreender uma tirosina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxiii) o VH compreender uma prolina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxiv) o VH compreender uma glutamina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxv) o VH compreender uma lisina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxvi) o VH compreender uma serina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; ’ (xxxvii)o VH compreender uma histidina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxviii) o VH compreender uma leucina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxix) o VH compreender um ácido aspártico na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xl) o VH compreender uma tirosina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xli) o VH compreender uma prolina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posi-ção 76 de SEQ ID NO: 46; (xlii) o VH compreender uma glutamina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xliii) o VH compreender uma lisina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xliv) o VH compreender uma alamina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xlv) o VH compreender uma histidina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xlvi) o VH compreender uma leucina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xlvii) o VH compreender um ácido aspártico na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xlviii)o VH compreender uma tirosina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; .(xlix) o VH compreender uma prolina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (l)o VH compreender uma glutamina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (li) o VH compreender uma lisina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Iii) o VH compreender uma alamina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (liii) o VH compreender uma serina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (liv) o VH compreender uma histidina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (lv) o VH compreender uma leucina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Ivi) o VH compreender um ácido aspártico na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Ivii) o VH compreender uma tirosina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 4 6; (Iviii) o VH compreender uma prolina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (lix) o VH compreender uma glutamina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (lx) o VH compreender uma lisina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Ixi) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma alamina na posição 23 de SEQ ID NO: 46; (Ixii) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender um ácido aspártico na posição 28 de SEQ ID NO: 4 6; (Ixiii) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma tirosina na posição 33 de SEQ ID NO: 4 6; (Ixiv) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender um ácido aspártico na posição 34 de SEQ ID NO: 46; (Ixv) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma asparagina na posição 53 de SEQ ID NO: 46; (Ixvi) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma serina na posição (Ixvii) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma alamina na posição 82 de SEQ ID NO: 46; (Ixviii)o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma serina na posição 95 de SEQ ID NO: 4 6; (Ixix) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma serina na posição 96 de SEQ ID NO: 46; (Ixx) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Ixxi) o VH compreender uma serina na posição 47 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23 de SEQ ID NO: 46; (Ixxii) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma alamina na posição 72, um ácido aspártico na posição 73, uma argemina na posição 74 e uma treonina na posição 76 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o V:. compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Ixxiii)o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51 e um ácido glutâmico na posição 102 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma serina na posição 24 e uma treonina na posição 7 6 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; (Ixxiv) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma .leucina na posição 51 e um ácido glutâmico na posição 102 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24 e uma treonina na posição 76 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; (Ixxv) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51 e um ácido glutâmico na posição 102 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23 e uma treonina na posição 76 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; (Ixxvi) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51 e um ácido glutâmico na posição 102 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Ixxvii)o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51, um ácido glutâmico na posição 102 e uma alamina na posição 105 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24 e uma treonina na posição 76 cada um relativo a SEQ ID NO: 4 6; (Ixxviii) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51, um ácido glutâmico na posição 102 e uma alamina na posição 105 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 4 6; (Ixxix) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma alamina na posição 72, um ácido aspártico na posição 73, uma argemina na posição 74 e uma treonina na posição 76 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24 e uma treonina na posição 76 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; (Ixxx) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma alamina na posição 72, um ácido aspártico na posição 73, uma argemina na posição 74 e uma treonina na posição 76 cada um relativo a' SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24, uma treonina na posição 76 e um ácido glutâmico na posição 51 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; (Ixxxi) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51, uma alamina na posição 72, um ácido aspártico na posição 73, uma argemina na posição 74, uma treonina na posição 76, um ácido glutâmico na posição 102 e uma alamina na posição 105 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24, uma treonina na posição 76 e um ácido glutâmico na posição 51 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; e (Ixxxii)o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51, uma alamina na posição 72, um ácido aspártico na posição 73, uma argemina na posição 74, uma treonina na posição 76, um ácido glutâmico na posição 102 e uma alamina na posição 105 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24, uma treonina na posição 76 e uma glicina na posição 51 cada um relativo a SEQ ID NO: 46.
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla compreender um dominio de ligação de antigeno de um anticorpo compreendendo qualquer um ou mais dos seguindo: (i) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 6 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 30; (ii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 34 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO:38; e (iii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46.
Em um exemplo particular, é provido uma proteina isolada ou recombinante ligando TLla compreendendo um dominio de ligação de antigeno de um anticorpo compreendendo um VH e um VL, caracterizado por: o VH e VL respectivamente compreender sequências selecionadas do grupo consistindo de: (i) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (ii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 17 5 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 188; (iii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 17 6 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 189; (iv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 177 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 190; (v) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 17 8 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 191; (vi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 17 9 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 192; (vii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 180 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 193; (viii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 181 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 194; (ix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 183 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 196; (x) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 185 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 198; (xi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 186 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 199; e (xii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 187 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 200.
Em um exemplo, uma proteina de ligação TLla da presente divulgação compreende um domínio de ligação de antígeno compreendendo um CDR3 de uma região variável de um anticorpo declarado acima. Por exemplo, o CDR3 é definido de acordo com o sistema de numeração Kabat e compreende uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93 ou uma sequência rotulada como "CDR3" e mostrada em negrito na Figura IA a 1H ou na Figura 9B ou 9C ou uma sequência compreendendo aminoácidos 99 a 108 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 175 a 187 ou aminoácidos 91 a 100 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 188 a 200 ou 234. Por exemplo, o CDR3 é definido de acordo com o sistema de numeração Kabat e compreende uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 45 ou 49 ou uma sequência compreendendo aminoácidos 99 a 108 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 175 a 181, 183 ou 185 a 187 ou aminoácidos 91 a 100 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 188 a 194, 196 ou 198 a 200.
Em outro exemplo, o CDR3 (exemplo, um HCDR3) é definido de acordo com o aprimorado sistema de numeração Chothia e compreende uma sequência rotulada como "CDR3" e mostrada em sublinhado em qualquer uma das Figuras IA, 1C, 1D ou 1E ou 9B. .
Em um exemplo, o CDR3 compreende uma sequência EVPX1TAX2FEY (SEQ ID NO: 143), caracterizado por: Xi ser ácido aspártico ou ácido glutâmico e X2 ser serina ou alanina.
Em um exemplo, o CDR3 compreende uma sequência EX1PX2X3AX4FX5Y (SEQ ID NO: 235), caracterizado por: Xi ser um aminiácido selecionado do grupo consistindo de valina, alanina, serina, histidina, ácido aspártico, leucina, tirosina, prolina, glutamina ou lisina; X2 ser um aminiácido selecionado do grupo consistindo de alanina, serina, histidina, lisina, ácido glutâmico ou ácido aspártico; X3 ser um aminoácido selecionado do grupo consistindo de alanina, serina, ácido aspártico, tirosina ou treonina; X4 ser um aminoácido selecionado do grupo consistindo de serina, alanina, histidina, leucina, ácido aspártico ou tirosina; e X5 ser um aminoácido selecionado do grupo consistindo de alanina, serina, histidina, leucina, ácido aspártico, prolina, glutamina, ácido glutâmico ou lisina.
Em um exemplo, o CDR3 (exemplo, um LCDR3) compreende uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 141 (ou sequência rotulada como CDR3 em negruto na sequência rotulada "Consenso" na Figura 1F ou 9C). Por exemplo, o dominio de ligação de antigeno compreende três CDRs de uma região variável do anticorpo.
Em alguns exemplos da divulgação, o dominio de ligação de antigeno é um anticorpo região variável compreendendo três CDRs de uma região variável, compreendendo uma sequência de aminoácido estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 95, 137, 138, 152 to 200 ou 234.
Em alguns exemplos, o dominio de ligação de antigeno é um anticorpo de região variável compreendendo três CDRs - de uma região variável compreendendo: (a) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e compreendendo uma ou mais das seguintes substituições ou grupos de substituições: (i)uma alamina na posição 16 de SEQ ID NO: 42; (ü) (iii) (iv) (v) (vi) uma alamina na posição 100 de SEQ ID NO: 42; uma serina na posição 100 de SEQ ID NO: 42; uma histidina na posição 100 uma leucina na posição 100 de um ácido aspártico na posição de SEQ ID NO: 42; / NO: SEQ ID NO: SEQ 42 ! ID 100 de 42; (vii) uma tirosina na posição 1 .00 de SEQ ID NO: 42; (viii ) uma prolina na posição 100 de SEQ ID NO: 42; (ix) uma glutamina na posição 100 de SEQ ID NO: 42; (x)uma lisina na posição 100 de SEQ ID NO: 42; (xi) uma alamina na posição 101 de SEQ ID NO: 42; 42; (xii) (xiii) (xiv) uma serina na posição 101 de SEQ ID NO: 42; NO: 42; uma uma histidina leucina na na posição posição 101 101 de de SEQ SEQ ID ID NO: 5 (xv) um . ácido aspártico na posição io: L de SEQ ID NO: 42; (xvi) uma tirosina na posição ' 101 de SEQ ID NO: 42; (xvii) uma glutamina na posição 101 de SEQ ID NO: 10 42; (xviii) uma lisina na posição 101 de SEQ ID NO: 42; (xix) uma alamina na i posição 102 de SEQ ID NO: 42; (xx) uma serina na posição 102 de SEQ ID NO: 42; (xxi) uma histidina na posição 102 de SEQ ID NO: 15 42; (xxii) uma leucina na 1 posição 102 de SEQ ID NO: 42; (xxiii) uma tirosina na posição 102 de SEQ ID NO: 42; (xxiv) uma prolina na 1 posição 102 de SEQ ID NO: 42; 20 42; (xxv) uma glutamina na posição 102 de SEQ ID NO: (xxvi) uma lisina na posição 102 de S ;EQ ID NO: 42; (xxvii) uma alamina na 1 posição 103 ; de SEQ ID NO: 42; (xxviii ) uma serina na posição 103 de S ;EQ ID NO: 42; 25 42; (xxix) uma histidina na posição 103 de SEQ ID NO: (xxx) uma leucina na 1 posição 103 ; de SEQ ID NO: 42; (xxxi) um ácido aspártico na posição 103 de SEQ ID NO: 42; 30 (xxxii) uma tirosina na posição 103 de SEQ ID NO: 42; (xxxiii)uma prolina na posição 103 de SEQ ID NO: 42; (xxxiv) uma glutamina na posição 103 de SEQ ID NO: 42; (xxxv) uma lisina na posição 103 de SEQ ID NO: 42; (xxxvi) uma serina na posição 104 de SEQ ID NO: 42; (xxxvii)uma histidina na posição 104 de SEQ ID NO: 42; (xxxviii) uma leucina na posição 104 de SEQ ID NO: 42; (xxxix) um ácido aspártico na posição 104 de SEQ ID NO: 42; (xl) uma tirosina i na posição 104 de SEQ ID NO: 42; (xli) uma prolina na posição 104 de S-EQ ID NO: 42; (xlii) uma glutamina na posição 104 de SEQ ID NO: 42; (xliii) uma lisina na posição 104 de SEQ ID NO: 42; (xliv) uma alamina na posição 105 de SEQ ID NO: 42; (xlv) uma histidina na posição 105 de SEQ ID NO: 42; (xlvi) uma leucina na posição 105 de SEQ ID NO: 42; (xlvii) urn ácido aspártico na posição 105 de SEQ ID NO: 42; (xlviii)uma tirosina na posição 105 de SEQ ID NO: 42; (xlix) uma prolina na posição 105 de SEQ ID NO: 42; (1) uma glutamina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 r di) uma lisina na posição 105 de SEQ ID NO: 42; (lii) uma alamina na posição 107 de SEQ ID NO: 42; (liii) uma serina na posição 107 de SEQ ID NO: 42; (liv) uma histidina na posição 107 de SEQ ID NO: 42; (1V) uma leucina na posição 107 de SEQ ID NO: 42; (Ivi) um ácido aspártico na posição 107 de SEQ ID NO: 42; (Ivii) uma tirosina na posição 107 de SEQ ID NO: 42; (Iviii) uma prolina na posição 107 de SEQ ID NO: 42; (lix) uma glutamina na posição 107 de SEQ ID NO: 42; (1X) uma lisina na posição 107 de S >EQ ID NO: 42; (Ixi) uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42; (Ixii) uma serina na posição 47 de SEQ ID NO: 42; (Ixiii) uma prolina na posição 41, i ama alamina na posição 72, um ácido aspártico na posição 73 e uma arginina na posição 74 e uma treonina na posição 76 cada um relativo a SEQ ID NO: 42; (Ixiv) uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51 e um ácido glutâmico na posição 102 cada um relativo a SEQ ID NO: 42; (Ixv) uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51, um ácido glutâmico na posição 102 e uma alamina na posição 105 cada um relativo a SEQ ID NO: 42; (Ixvi) uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51, uma alamina na posição 72, um ácido aspártico na posição 73, uma arginina na posição 74, uma treonina na posição 76, um ácido glutâmico na posição 102 e uma alamina na posição 105; ou (b) um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46 e compreendendo uma ou mais das seguintes substituições ou grupos de substituições: i) uma ii) iii) treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; uma uma treonina na posição 23 de SEQ ID NO: 46; asparagina na posição 28 de SEQ ID NO: 46; :iv) uma tirosina na posição 33 de SEQ ID NO: 46; ,v) um ácido aspártico na posição 34 de SEQ ID NO: 4 6; :vi) uma asparagina na posição 53 de SEQ ID NO: 4 6; (vii) uma serina na posição 54 de SEQ ID NO: 46; ; viü) uma alamina na posição 82 de SEQ ID NO: 46; (ix) uma serina na posição 95 de SEQ ID NO: 46; (x) uma serina na posição 96 de SEQ ID NO: 46; (xi) uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24 e uma t reonina na posição 76 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; (xii) uma treonina na posição 23 e uma treonina na posição 76 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; (xiii) uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24, uma treonina na posição 76 e um ácido glutâmico na posição 51 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; ou (xiv) uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24, uma treonina na posição 76 e uma glicina na posição 51 cada um relativo a SEQ ID NO: 46. Por exemplo, o dominio de ligação de antigeno é um VH compreendendo três CDRs de uma sequência de aminoácido estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 1'0, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 70, 74, 78, 86, 90, 94, 137, 152, 154 a 162, 173, 175 a 187 ou 234.
Em um exemplo, o CDRs são definido de acordo com o sistema de numeração Kabat. Por exemplo, a proteina de ligação TLla compreender um VH incluindo o CDRs como segue: (i)um CDR1 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3, um CDR2 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 4 (caracterizado por: qualquer um ou mais dos cinco C-terminal aminoácidos do CDR2 de sequência de aminoácido serem substituída com qualquer outro aminoácido de ocorrência naturalmente) e um CDR3 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 5 (ou sequências rotulada como CDRs 1, 2 e 3 em negrito do anticorpo C336 na Figura IA); (ii) um CDR1 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 11, um CDR2 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 12 (caracterizado por: qualquer um ou mais dos cinco C-terminal aminoácidos do CDR2 de sequência de aminoácido srem substituídos com qualquer outro aminoácido de ocorrência natural) e um CDR3 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 13 (ou sequências rotulada como CDRs 1, 2 e 3 negrito no anticorpo C334 na Figura IA); (iii) um CDR1 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 19, um CDR2 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 20 (caracterizado por: qualquer um ou mais dos cinco C-terminal aminoácidos do CDR2 de sequência de aminoácido serem substituidos com qualquer outro aminoácido de ocorrência natural) e um CDR3 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 21 (ou sequências rotulada 'como CDRs 1, 2 e 3 em negrito do anticorpo C333 na Figura IA); (iv) um CDR1 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 27, um CDR2 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 28 (caracterizado por: qualquer um ou mais dos cinco C-terminal aminoácidos do CDR2 de sequência de aminoácido serem substituidos com qualquer outro aminoácido de ocorrência natural) e um CDR3 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 29 (ou sequências rotulada como CDRs 1, 2 e 3 em negrito do anticorpo C323 na Figura IA); (v) um CDR1 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 35, um CDR2 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 36 (caracterizado por: qualquer um ou mais dos cinco C-terminal aminoácidos do CDR2 sequência de aminoácido serem substituidos com qualquer outro aminoácido de ocorrência natural) e um CDR3 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 37 (ou sequências rotulada como CDRs 1, 2 e 3 em negrito do anticorpo C321 na Figura IA); (vi) um CDR1 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 43, um CDR2 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 44 (caracterizado por: qualquer um ou mais dos cinco C-terminal aminoácidos do CDR2 sequência de aminoácido serem substituidos com qualquer outro aminoácido de ocorrência natural) e um CDR3 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 45 (ou sequências rotulada como CDRs 1, 2 e 3 em negrito do anticorpo C320 na Figura IA); (vii) um CDR1 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 51, um CDR2 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 52 (caracterizado por: qualquer um ou mais dos cinco C-terminal aminoácidos do CDR2 sequência de aminoácido serem substituidos com qualquer outro aminoácido de ocorrência natural) e um CDR3 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 53 (ou sequências rotulada como CDRs 1, 2 e 3 em negrito do anticorpo C319 na Figura IA); (viii) um CDR1 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 67, um CDR2 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 68 (caracterizado por: qualquer um ou mais dos cinco C-terminal aminoácidos do CDR2 sequência de aminoácido serem substituidos com qualquer outro aminoácido de ocorrência natural) e um CDR3 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 69 (ou sequências rotulada como CDRs 1, 2 e 3 em negrito do anticorpo C320-90 na Figura 1C); (ix) um CDR1 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: -71, um CDR2 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 72 (caracterizado por: qualquer um ou mais dos cinco C-terminal aminoácidos do CDR2 sequência de aminoácido serem substituidos com qualquer outro aminoácido de ocorrência natural) e um CDR3 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 73 (ou sequências rotulada como CDRs 1, 2 e 3 em negrito do anticorpo C320-103 na Figura 1C); (x) um CDR1 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 75, um CDR2 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 76 (caracterizado por: qualquer um ou mais dos cinco C-terminal aminoácidos do CDR2 sequência de aminoácido serem substituidos com qualquer outro aminoácido de ocorrência natural) e um CDR3 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 77 (ou sequências rotulada como CDRs 1, 2 e 3 em negrito do anticorpo C320-114 na Figura 1C); (xi) um CDR1 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 79, um CDR2 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 80 (caracterizado por: qualquer um ou mais dos cinco C-terminal aminoácidos do CDR2 sequência de aminoácido serem substituidos com qualquer outro aminoácido de ocorrência natural) e um CDR3 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 81 (ou sequências rotulada como CDRs 1, 2 e 3 em negrito do anticorpo C320-115 na Figura 1C); (xii) um CDR1 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 87, um CDR2 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 88 (caracterizado por: qualquer um ou mais dos cinco C-terminal aminoácidos do CDR2 sequência de aminoácido serem substituidos com qualquer outro aminoácido de ocorrência natural) e um CDR3 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 89 (ou sequências rotuíada como CDRs 1, 2 e 3 em negrito do anticorpo C320-129 na Figura 1C); (xiii) um CDR1 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 91, um CDR2 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 92 (caracterizado por: qualquer um ou mais dos cinco C-terminal aminoácidos do CDR2 sequência de aminoácido serem substituidos com qualquer outro aminoácido de ocorrência natural) e um CDR3 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 93 (ou sequências rotulada como CDRs 1, 2 e 3 em negrito do anticorpo C320-130 na Figura 1C); (xiv) um CDR1 compreendendo uma sequência estabelecida in aminoácidos 31 to 35 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 175 to 187 , um CDR2 compreendendo aminoácidos 50 to 66 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 175 to 187 (caracterizado por: qualquer um ou mais dos cinco C- terminal aminoácidos do CDR2 sequêcia de amoniácido serem substituidos com qualquer outro aminoácido de ocorrência natural) e aminoácidos 99 a 108 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 175 a 187; e (xv) um CDR1 compreendendo uma sequência estabelecida in aminoácidos 26 to 35 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 175 to 187 , um CDR2 compreendendo aminoácidos 50 to 66 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 175 to 187 (caracterizado por: qualquer um ou mais dos cinco C- terminal aminoácidos do CDR2 sequêcia de amoniácido serem substituidos com qualquer outro aminoácido de ocorrência natural) e aminoácidos 99 a 108 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 175 a 187. Por exemplo, a proteina de ligação TLla compreende um VH incluindo CDRs como segue: (i)um CDR1 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 43, um CDR2 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 44 (caracterizado por: qualquer um ou mais dos cinco C-terminal aminoácidos do CDR2 sequêcia de amoniácido serem substituidos com qualquer outro aminoácido de ocorrência natural) e um CDR3 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 45 (ou sequências rotulada como CDRs 1, 2 e 3 em negrito do anticorpo C320 na Figura IA); (ii) um CDR1 compreendendo uma sequência estabelecida in aminoácidos 31 to 35 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 175 to 181, 183 ou 185 to 187, um CDR2 compreendendo aminoácidos 50 to 66 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 175 to 181, 183 ou 185 to 187 (caracterizado por: qualquer um ou mais dos cinco C-terminal aminoácidos do CDR2 sequêcia de amoniácido serem substituídos com qualquer outro aminoácido de ocorrência natural) e aminoácidos 99 to 108 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 175 to 181, 183 ou 185 to 187; ou (iii) um CDR1 compreendendo uma sequência estabelecida in aminoácidos 26 to 35 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 175 to 181., 183 ou 185 to 187, um CDR2 compreendendo aminoácidos 50 to 66 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 175 to 181, 183 ou 185 to 187 (caracterizado por: qualquer um ou mais dos cinco C-terminal aminoácidos do CDR2 sequêcia de amoniácido serem substituídos com qualquer outro aminoácido de ocorrência natural) e aminoácidos 99 to 108 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 175 to 181, 183 ou 185 to 187
Em um exemplo, a proteína de ligação TLla compreende um VH incluindo CDRs como segue: (i)um CDR1 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 43 (ou sequência rotulada como CDR 1 em negrito da sequência rotulada "Consenso" na Figura 1E); (ii) um CDR2 compreendendo uma sequência WXiNPNSGNTGYAQKFQG (SEQ ID NO: 142), caracterizado por: Xi ser metionina ou leucina (ou sequência rotulada como CDR 2 em negrito da sequência rotulada "Consenso" na Figura 1E ou Figura 9B); e (iii) um CDR3 compreendendo uma sequência EVPXITAX2FEY (SEQ ID NO: 143), caracterizado por: Xi ser ácido aspártico ou ácido glutâmico e X2 ser serina ou alanina.' (ou sequência rotulada como CDR3 em negrito da sequência rotulada "Consenso" na Figura 1E ou Figura 9B) ou compreendendo uma sequência EXIPX2X3AX4FX5Y (SEQ ID NO: 235), caracterizado por:: Xi ser um aminoácido selecionado do grupo consistindo de valina, alanina, serina, histidina, ácido aspártico, leucina, tirosina, prolina, glutamina ou lisina; X2 ser um aminoácido selecionado do grupo consistindo de alanina, serina, histidina, lisina, ácido glutâmico ou ácido aspártico; X3 ser um aminoácido selecionado do grupo consistindo de alanina, serina, ácido aspártico, tirosina ou treonina; X4 ser um aminoácido selecionado do grupo consistindo de serina, alanina, histidina, leucina, ácido aspártico ou tirosina; e X5 ser um aminoácido selecionado do grupo consistindo de alanina, serina, histidina, leucina, ácido aspártico, prolina, glutamina, ácido glutâmico ou lisina. Adicionais residuos adequados para inclusão em CDR3 são descritos neste documento e são para ser levados a aplicar mutatis mutandis para o presente exemplo da divulgação.
Em um exemplo, os CDRs são definidos de acordo com o aprimorado sistema de numeração Chothia. Por exemplo, a proteina de ligação TLla compreende um VH incluindo CDRs rotulada como CDRs 1, 2 e 3 em sublinhado no anticorpo 336, 334, 333, 323, 321, 320 ou 319 na Figura IA ou do anticorpo C320-90, C320-103, C320-114, C320-115, C320-129 ou C320-130 na Figura 1C ou da sequência rotulada "Consenso" na Figura 1C ou Figura 1E ou Figura 9B.
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla adicionalmente compreende os seguintes: (i)uma cadeia pesada FR1 compreendendo uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 144; (ii) uma cadeia pesada FR2 compreendendo uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 145; (iii) uma cadeia pesada FR3 compreendendo uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 146; e (iv) uma cadeia pesada FR4 compreendendo uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 147.
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla compreende os seguintes: (v) uma cadeia pesada FR1 compreendendo uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 144; (vi) uma cadeia pesada CDR1 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 43; (vii) uma cadeia pesada FR2 compreendendo uma sequência de- aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 145; (viii) uma cadeia pesada CDR2 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 142; (ix) ma cadeia pesada FR3 compreendendo uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 146; (x) ) uma cadeia pesada CDR3 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 143 ou 235; e (xi) ) uma cadeia pesada FR4 compreendendo uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 147. Por exemplo, o dominio de ligação de antigeno é um VL compreendendo três CDRs de uma sequência de aminoácido estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 82, 95, 153, 163 to 172, 174, ou 188 a 200. Em um exemplo, os CDRs são definidos de acordo com o sistema de numeração Kabat. Por exemplo, a proteina de ligação TLla compreende um VL incluindo CDRs como segue: (i) um CDR1 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 7, um CDR2 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 8 e um CDR3 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 9 (ou sequências rotulada como CDRs 1, 2 e 3 em negrito do anticorpo C336 na Figura IB); (ii) um CDR1 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 15, um CDR2 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 16 e um CDR3 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 17 (ou sequências rotulada como CDRs 1, 2 e 3 em negrito do anticorpo C334 na Figura IB); (iii) um CDR1 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 23, um- CDR2 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 24 e um CDR3 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 25 (ou sequências rotulada como CDRs 1, 2 e 3 em negrito do anticorpo C333 na Figura IB); (iv) um CDR1 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 31, um CDR2 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 32 e um CDR3 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 33 (ou sequências rotulada como CDRs 1, 2 e 3 em negrito do anticorpo C323 na Figura IB); (v) um CDR1 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 39, um CDR2 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 40 e um CDR3 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 41 (ou sequências rotulada como CDRs 1, 2 e 3 em negrito do anticorpo C321 na Figura IB); ’ (vi) um CDR1 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 47, um CDR2 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 48 e um CDR3 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 49 (ou sequências rotulada como CDRs 1, 2 e 3 em negrito do anticorpo C320 na Figura 1B); (vii) um CDR1 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 55, um CDR2 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 56 e um CDR3 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 57 (ou sequências rotulada como CDRs 1, 2 e 3 em negrito do anticorpo C319 na Figura 1B); (viii) um CDR1 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 83, um CDR2 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 84 e um CDR3 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 85 (ou sequências rotulada como CDRs 1, 2 e 3 em negrito do anticorpo C320-120 na Figura 1F); ou (ix) um CDR1 compreendendo aminoácidos 23 to 36 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 188 to 200, um CDR2 compreendendo aminoácidos 52 to 58 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 188 to 200 e um CDR3 compreendendo aminoácidos 91 to 100 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 188 to 200.
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla compreende um VL incluindo CDRs como segue: (i)um CDR1 compreendendo uma sequência X1X2SSSDIGAGLGVH (SEQ ID NO: 139), caracterizado por: Xi ser alanina ou treonina; X2 ser glicina ou serina (ou sequência rotulada como CDR 1 em negrito da sequência rotulada Consenso" na Figura 9C); (ii) um CDR2 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 140; e (iii) um CDR3 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 141.
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla adicionalmente compreende o seguinte: (iv) uma cadeia leve FR1 compreendendo uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 148; (v) ) uma cadeia leve FR2 compreendendo uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 149; (vi) ) uma cadeia leve FR3 compreendendo uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 150; e (vii) uma cadeia leve FR4 compreendendo uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 151.
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla compreende o seguinte: (viii) cadeia leve FR1 compreendendo uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 148; (ix) uma cadeia leve CDR1 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 139; (x) i) uma cadeia leve FR2 compreendendo uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 149; (xi) uma cadeia leve CDR2 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 140; (xii) a cadeia leve FR3 compreendendo uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 150; (xiii) uma cadeia leve CDR3 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 141; e (xiv) uma cadeia leve FR4 compreendendo uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 151.
Em um exemplo, os CDRs são definidos de acordo com o aprimorado sistema de numeração Chothia. Por exemplo, a proteina de ligação TLla compreende um VL incluindo CDRs rotulados como CDRs 1, 2 e 3 sublinhados do anticorpo 336, 334, 333, 323, 321, 320 ou 319 na Figura IB ou de anticorpo C320-120 na Figura IF ou da sequência rotulada "Consenso" na Figura 1H. e Figura 9.
Em um exemplo, o dominio de ligação de antigeno compreende seis CDRs de um dos seguintes pares de região variável: (i)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 6; (ii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 10 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 14; (iii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 18 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 22; (iv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 26 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 30; (v) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 34 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO:38; (vi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (vii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 50 e um VL compreendendo uma (viii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 58 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (ix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (x)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 66 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (xi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 70 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (xii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 74 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (xiii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 78 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (xiv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 58 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 82; (xv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 86 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xvi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 90 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xvii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 58 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (xviii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 154 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 164; (xix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 155 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 163; (xx) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 156 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 165; (xxi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 157 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 166; (xxii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 158 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 167; (xxiii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 159 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 168; (xxiv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 160 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 169; (xxv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 161 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 170; (xxvi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 234 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 169; (xxvii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 154 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida' na SEQ ID NO: 46; (xxviii)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 155 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 156 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxx) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 157 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxxi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 158 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxxii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 159 e um VL -compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxxiii)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 160 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxxiv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 161 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxxv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 234 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxxvi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 164; (xxxvii)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 165; (xxxviii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 166; (xxxix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 167; (xl) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 168; (xli) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 169; (xlii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 170; (xliii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 171; (xliv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 172; (xlv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 175 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 188; (xlvi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 17 6 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 189; (xlvii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 177 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 190; (xlviii)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 178 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 191; (xlix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 17 9 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 192; (l)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 180 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 193; (li) urn VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 181 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 194; (lii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 182 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 195; (liii) urn VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 183 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 196; (liv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 184 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 197; (Iv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 185 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 198; (Ivi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 186 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 199; ou (Ivii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 187 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 200.
Em um exemplo, o domínio de ligação de antígeno compreende seis CDRs de um anticorpo compreendendo um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46, caracterizado por: o VH e/ou VL compreender uma ou mais das seguintes substituições ou grupos de substituições: . (i)o VH compreender uma alamina na posição 16 de SEQ ID NO: 42; (ii) o VH compreender uma alamina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (iii) o VH compreender uma serina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (iv) o VH compreender uma histidina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (v) o VH compreender uma leucina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (vi) o VH compreender um ácido aspártico na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (vii) o VH compreender uma tirosina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (viii) o VH compreender uma prolina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (ix) o VH compreender uma glutamina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (x) o VH compreender uma lisina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xi) o VH compreender uma alamina na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xii) o VH compreender uma serina na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xiii) o VH compreender uma histidina na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xiv) o VH compreender uma leucina na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xv) o VH compreender um ácido aspártico na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xvi) o VH compreender uma tirosina na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 4 6; (xvii) o VH compreender uma glutamina na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xviii) o VH compreender uma lisina ’na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 7 6 de' SEQ ID NO: 4 6; (xix) o VH compreender uma alamina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xx) o VH compreender uma serina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxi) o VH compreender uma histidina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxii) o VH compreender uma leucina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxiii) o VH compreender uma tirosina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxiv) o VH compreender uma prolina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxv) o VH compreender uma glutamina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxvi) o VH compreender uma lisina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxvii) o VH compreender uma alamina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; . (xxviii)o VH compreender uma serina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; ' (xxix) o VH compreender uma histidina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxx) o VH compreender uma leucina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxi) o VH compreender um ácido aspártico na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxii) o VH compreender uma tirosina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxiii)o VH compreender uma prolina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina-na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxiv) o VH compreender uma glutamina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxv) o VH compreender uma lisina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxvi) o VH compreender uma serina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxvii) o VH compreender uma histidina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxviii) o VH compreender uma leucina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; ' (xxxix) o VH compreender um ácido aspártico na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xl) o VH compreender uma tirosina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xli) o VH compreender uma prolina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xlii) o VH compreender uma glutamina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xliii) o VH compreender uma lisina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xliv) o VH compreender uma alamina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xlv) o VH compreender uma histidina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xlvi) o VH compreender uma leucina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xlvii) o VH compreender um ácido aspártico na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xlviii)o VH compreender uma tirosina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xlix) o VH compreender uma prolina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 4 6; (I) o VH compreender uma glutamina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 4 6; (II) o VH compreender uma lisina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 4 6; (III) o VH compreender uma alamina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (1111) o VH compreender uma serina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (liv) o VH compreender uma histidina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Iv) o VH compreender uma leucina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Ivi) o VH compreender um ácido aspártico na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Ivii) o VH compreender urna tirosina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Iviii) o VH compreender uma prolina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (lix) o VH compreender uma glutamina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (lx) o VH compreender uma lisina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Ixi) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma alamina na posição 23 de SEQ ID NO: 46; (Ixii) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender um ácido aspártico na posição 28 de SEQ ID NO: 46; (Ixiii) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma tirosina na posição 33 de SEQ ID NO: 46; (Ixiv) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender um ácido aspártico na posição 34 de SEQ ID NO: 46; (Ixv) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma asparagina na posição 53 de SEQ ID NO: 46; (Ixvi) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma serina na posição 54 de SEQ ID NO: 46; (Ixvii) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma alamina na posição 82 de SEQ ID NO: 46; (Ixviii)o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma serina na posição 95 de SEQ ID NO: 46; (Ixix) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma serina na posição 96 de SEQ ID NO: 46; (Ixx) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Ixxi) o VH compreender uma serina na posição 47 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23 de SEQ ID NO: 46; (Ixxii) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma alamina na posição 72, um ácido aspártico na posição 73 e uma argemina na posição 74 e uma treonina na posição 76 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina- na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Ixxiii)o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51 e um ácido glutâmico na posição 102 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma serina na posição 24- ,e uma treonina na posição 7 6 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; (Ixxiv) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51 e um ácido glutâmico na posição 102 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24 e uma treonina na posição 76 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; (Ixxv) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51 e um ácido glutâmico na posição 102 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23 e uma treonina na posição 76 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; (IxxVi) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51 e um ácido glutâmico na posição 102 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Ixxvii)o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51, um ácido glutâmico na posição 102 e uma alamina na posição 105 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24 e uma treonina na posição 7 6 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; (Ixxviii) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51, um ácido glutâmico na posição 102 e uma alamina na posição 105 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Ixxix) o VH compreender - uma prolina na posição 41, uma alamina na posição 72, um ácido aspártico na posição 73 uma argemina na posição 74 e uma treonina na posição 7 6 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24 e uma treonina na posição 76 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; (Ixxx) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma alamina na posição 72, um ácido aspártico na posição 73 uma argemina na posição 74 e uma treonina na posição 7 6 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24, uma treonina na posição 76 e um ácido glutâmico na posição 51 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; (Ixxxi) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51, uma alamina na posição 72, um ácido aspártico na posição 73, uma argemina na posição 74, uma treonina na posição 76, um ácido glutâmico na posição 102 e uma alamina na posição 105 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24, uma treonina na posição 76 e um ácido glutâmico na posição 51 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; ou (Ixxxii)o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51, uma alamina na posição 72, um ácido aspártico na posição 73, uma argemina na posição 74, uma treonina na posição 76, um ácido glutâmico na posição 102 e uma alamina na posição 105 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24, uma treonina na posição 7 6 e uma glicina na posição 51 cada um relativo a SEQ ID NO: 46.
Em um exemplo, o dominio de ligação de antigeno compreende seis CDRs de um dos seguintes pares de região variável: (i)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (ii) um VH codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 106 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 107 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (iii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 17 5 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 188; (iv) um VH codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 222 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 228 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (v) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 17 6 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 189; (vi) um Vji codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 223 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 228 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (vii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 177 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 190; (viii) um VH codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 224 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 229 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (ix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 178 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 191; (x) um VH codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 224 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 230 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (xi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 179 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 192; (xii) um VH codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 224 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 231 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (xiii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 180 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 193; (xiv) um VH codificada por um ácido nucléico sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 224 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 228 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (xv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 181 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 194; (xvi) um VH codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 225 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 230 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (xvii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 183 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 196; (xviii) um VH codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 226 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 230 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (xix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 185 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 198; (xx) um VH codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 226 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 232 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (xxi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 186 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 199; e (xxii) um VH codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 227 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 232 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (xxiii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 187 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 200; ou (xxiv) um VH codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 227 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 233 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade.
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla compreende os seguintes seis CDRs: (i)uma cadeia pesada CDR1 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 43 (ou sequência rotulada como CDR 1 em negrito da sequência rotulada "Consenso" na Figura 1E) ; (ii) uma cadeia pesada CDR2 compreendendo uma sequência WXiNPNSGNTGYAQKFQG (SEQ ID NO: 142), caracterizado por: Xi ser metioni-na ou leucina (ou sequência rotulada como CDR 2 em negrito da sequência rotulada "Consenso" na Figura 1E); (iii) uma cadeia pesada CDR3 compreendendo uma sequência EVPXITAX2FEY (SEQ ID NO: 143), caracterizado por: Xi ser ácido aspártico ou ácido glutâmico e X2 ser serina ou alanina. (ou a sequência rotulada como CDR 3 em negrito da sequência rotulada "Consenso" na Figura 9B) ou uma sequência EX1PX2X3AX4FX5Y (SEQ ID NO: 235) , caracterizado por: : Xi ser um aminiácido selecionado do grupo consistindo de valina, alanina, serina, histidina, ácido aspártico, leucina, tirosina, prolina, glutamina ou lisina; X2 ser um aminiácido selecionado do grupo consistindo de alanina, serina, histidina, lisina, ácido glutâmico ou ácido aspártico; X3 ser um aminiácido selecionado do grupo consistindo de alanina, serina, ácido aspártico, tirosina ou treonina; X4 ser um aminiácido selecionado do grupo consistindo de serina, alanina, histidina, leucina, ácido aspártico ou tirosina; e X5 ser um aminiácido selecionado do grupo consistindo de alanina, serina, histidina, leucina, ácido aspártico, prolina, glutamina, ácido glutâmico ou lisina.; (iv) um CDR1 compreendendo uma sequência X1X2SSSDIGAGLGVH (SEQ ID NO: 139), caracterizado por: Xi ser alanina ou treonina; X2 ser glicina ou serina (ou sequência rotulada como CDR 1 em negrito da sequência rotulada "Consenso" na Figura 9C); (v) um CDR2 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 48; e (vi) um CDR3 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 49
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla compreender o seguinte: (a) um VH compreendendo: (i)uma cadeia pesada FR1 compreendendo uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 144; (ii) uma cadeia pesada CDR1 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 43; (iii) uma cadeia pesada FR2 compreendendo uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 145; (iv) uma cadeia pesada CDR2 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 142; (v)uma cadeia pesada FR3 compreendendo uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 146; (vi) uma cadeia pesada CDR3 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 143 ou 235; e (vii) uma cadeia pesada FR4 compreendendo uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 147; e (b) um VL compreendendo: (i)uma cadeia leve FR1 compreendendo uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 148; (ii) uma cadeia leve CDR1 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 139; (iii) uma cadeia leve FR2 compreendendo uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 149; (iv) uma cadeia leve CDR2 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 48; (v)uma cadeia leve FR3 compreendendo uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 150; (vi) uma cadeia leve CDR3 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 49; e (vii) uma cadeia leve FR4 compreendendo uma sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 151.
Adicional resíduos adequados para inclusão em cadeia pesada CDR3 são descritas neste documento e são para se tomadas para aplicar mutatis mutandis para o presente exemplo da divulgação.
Em um exemplo, o CDRs são definidos de acordo com o sistema de numeração Kabat. Exemplares CDRs definidos de acordo com o sistema de numeração Kabat são descritos acima e/ou nas Figuras IA a 1H, 9B ou 9C rotulada como CDRs 1 a 3 em negrito e são para tomar para aplicar mutatis mutandis para o presente exemplo da divulgação.
Em um exemplo, o CDRs são definidos de acordo com o aprimorado sistema de numeração Chothia. Exemplares CDRs definidos de acordo com o aprimorado sistema de numeração Chothia são descritos acima e/ou nas Figuras IA a 1H rotulada como CDRs 1 a em sublinhado e são tomadas para aplicar mutatis mutandis para o presente exemplo da divulgação.
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla compreende uma região variável do anticorpo. .
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla compreende um VH compreendendo uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 70, 74, 78, 86, 90, 94, 137, 152, 154 a 62, 173, 175 a 87 ou 234 ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 80% de identidade com qualquer uma das acima mencionadas. Em um exemplo, o VH compreende uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 26, 34, 42 ou 94 ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 80% de identidade com qualquer uma das acima mencionadas. Em um exemplo, o VH compreender uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 42, 175 to 181, 183 ou 185 to 187 ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 80% de identidade com qualquer uma das acima mencionadas.
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla compreende um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 94, 137, 152, 162 ou 173. Em um exemplo, o VH compreende uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 42, 58, 66, 70, 74, 78, 86 ou 90. Em um exemplo, o VH compreende uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42. '
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla compreende um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e compreendendo uma ou mais das seguintes substituições ou grupos de substituições: (i)uma alamina na posição 16 de SEQ ID NO: 42; (ii) uma alamina na posição 100 de SEQ ID NO: 42; (iii) uma serina na posição 100 de SEQ ID NO: 42; (iv) uma histidina na posição 100 de SEQ ID NO: 42; (v)uma leucina na posição 100 de SEQ ID NO: 42; (vi) um ácido aspártico na posição 100 de SEQ ID NO: 42; (vii) uma tirosina na posição 100 de SEQ ID NO: 42; (viii) uma prolina na posição 100 de SEQ ID NO: 42; (ix) uma glutamina na posição 100 de SEQ ID NO: 42; (x) uma lisina na posição 100 de SEQ ID NO: 42; (xi) uma alamina na posição 101 de SEQ ID NO: 42; (xii) uma serina na posição 101 de SEQ ID NO: 42; (xiii) uma histidina na posição 101 de SEQ ID NO: 42; (xiv) uma leucina na posição 101 de SEQ ID NO: 42; (xv) um ácido aspártico na posição 101 de SEQ ID NO: 42; (xvi) uma tirosina na posição 101 de SEQ ID NO: 42; (xvii) uma glutamina na posição 101 de SEQ ID NO: 42; (xviii) uma lisina na posição 101'de SEQ ID NO: 42; (xix) uma alamina na posição 102 de SEQ ID NO: 42; (XX) uma serina na posição 102 de SEQ ID NO: 42; (xxi) uma histidina na posição 102 de SEQ ID NO: 42; (xxii) uma leucina na posição 102 de SEQ ID NO: 42; (xxiii) uma tirosina na posição 102 de SEQ ID NO: 42; (xxiv) uma prolina na posição 102 de SEQ ID NO: 42; (xxv) uma glutamina na posição 102 de SEQ ID NO: 42; (xxvi) uma lisina na posição 102 de SEQ ID NO: 42; (xxvii) uma alamina na posição 103 de SEQ ID NO: 42; (xxviii) uma serina na posição 103 de SEQ ID NO: 42; (xxix) uma histidina na posição 103 de SEQ ID NO: 42; (xxx) uma leucina na posição 103 de SEQ ID NO: 42; (xxxi) um ácido aspártico na posição 103 de SEQ ID NO: 42; (xxxii) uma tirosina na posição 103 de SEQ ID NO: 42; (xxxiii) uma prolina na posição 103 de SEQ ID NO: 42; (xxxiv) uma glutamina na posição 103 de SEQ ID NO: 42; (xxxv) uma lisina na posição 103 de SEQ ID NO: 42; (xxxvi) uma serina na posição 104 de SEQ ID NO: 42; (xxxvii) uma histidina na posição 104 de SEQ ID NO: 42; (xxxviii) uma leucina na posição 104 de SEQ ID NO: 42; (xxxix) um ácido aspártico na posição 104 de SEQ ID NO: 42; (xl) uma tirosina na posição 104 de SEQ ID NO: 42; (xii) uma prolina na posição 104 de SEQ ID NO: 42; (xiii) uma glutamina na posição 104 de SEQ ID NO: 42; (xliii) uma lisina na posição 104 de SEQ ID NO: 42; (xliv) uma alamina na posição 105 de SEQ ID NO: 42; (Xlv) uma histidina na posição 105 de SEQ ID NO: 42; (xlvi) uma leucina na posição 105 de SEQ ID NO: 42; NO: (xlvii) 42; um ácido aspártico na posição 105 de SEQ ID 42; (xiviii; ) uma tirosina na posição 105 de SEQ ID NO: (xlix) uma prolina na posição 105 de SEQ ID NO: 42; (1)uma glutamina na posição 105 de SEQ ID NO: 42; di) uma lisina na posição 105 de SEQ ID NO: 42; (lii) uma alamina na posição 107 de SEQ ID NO: 42; (liii) uma serina na posição 107 de SEQ ID NO: 42; div) uma histidina na posição 107 de SEQ ID NO: 42’; (Iv) uma leucina na posição 107 de SEQ ID NO: 42; (Ivi) um ácido aspártico na posição 10' 7 de SEQ ID NO: 42; (Ivii) uma tirosina na posição 107 de SEQ ID NO: 42; (Iviii) uma prolina na posição 107 de SEQ ID NO: 42; (lix) uma glutamina na posição 107 de SEQ ID NO: 42; (lx) uma lisina na posição 107 de S ;EQ ID NO: 42; (Ixi) uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42; (Ixii) uma serina na posição 47 de SEQ ID NO: 42; (Ixiii) uma prolina na posição 41, uma alamina na posição 72, um ácido aspártico na posição 73 uma argemina na posição 74 e uma treonina na posição 76 cada um relativo a SEQ ID NO: 42; (Ixiv) uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51 e um ácido glutâmico na posição 102 cada um relativo a SEQ ID NO: 42; (Ixv) uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51, um ácido glutâmico na posição 102 e uma alamina na posição 105 cada um relativo a SEQ ID NO: 42; (Ixvi) uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51, uma alamina na posição 72, a ácido aspártico na posição 73, uma arginina na posição 74, uma treonina na posição 76 um ácido glutâmico na posição 102 e uma alamina na posição 105; ou (Ixvii) uma sequência tendo pelo menos cerca de 80% de identidade com qualquer uma das acima mencionadas.
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla compreende um VH codificado por um ácido nucléico compreendendo uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 113, 114, 115, 117, 118 ou 222 a 227 ou uma sequência pelo menos cerca de 80% idêntica destas ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade.
Em um exemplo, a proteína de ligação TLla compreende um VH codificado por um ácido nucléico compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 106 ou 222 a 227 ou uma sequência pelo menos cerca de 80% idêntica a esta ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade.
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla compreende um VL compreendendo uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 82, 95, 138, 153, 163 ou 174, ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 80% de identidade com qualquer uma das acima mencionadas. Em um exemplo, o VL compreende uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 30, 38, 46, 188 a 194, 196 ou 198 a 200 ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 80% de identidade com qualquer uma das acima mencionadas.
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla compreende um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 95, 138, 153, 163 ou 174. Em um exemplo, a proteina de ligação TLla compreende um VL compreendendo uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 46, 62 ou 82. Em um exemplo, a proteina de ligação TLla compreende um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46.
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla compreende um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 4 6 e compreendendo uma ou mais das seguintes substituições ou grupos de substituições: (i) uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (ii) uma treonina na posição 23 de SEQ ID NO: 46; (iii) uma asparagina na posição 28 de SEQ ID NO: 46; (iv) uma tirosina na posição 33 de SEQ ID NO: 46; (v) um ácido aspártico na posição 34 de SEQ ID NO: 4 6; (vi) uma asparagina na posição 53 de SEQ ID NO: 46; (vii) uma serina na posição 54 de SEQ ID NO: 46; (viii)uma alamina na posição 82 de SEQ ID NO: 46; (ix) uma serina na posição 95 de SEQ ID NO: 46; (x) uma serina na posição 96 de SEQ ID NO: 46; (xi) uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24 e uma treonina na posição 76 cada uma relativo a SEQ ID NO: 46; (xii) uma treonina na posição 23 e uma treonina na posição 76 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; (xiii) uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24, uma treonina na posição 76 e um ácido glutâmico na posição 51 cada uma relativa a SEQ ID NO: 46; (xiv) uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24, uma treonina na posição 7 6 e uma glicina na posição 51 cada uma relativa a SEQ ID NO: 46; ou (xv) uma sequência tendo pelo menos cerca de 80% de identidade com qualquer uma das acima mencionadas.
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla compreende um VL codificado por um ácido nucléico compreendendo uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 116 ou 228 a 233 ou uma sequência pelo menos cerca de 80% idêntica destas ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade.
Em um exemplo, uma proteina compreende um VL codificado por um ácido nucléico compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 107 ou 228 a 233 ou uma sequência pelo menos cerca de 80% idêntica destas ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade.
Em um exemplo, 'a proteina de ligação TLla é um anticorpo de dominio, opcionalmente ligado para uma cadeia pesada de região constante ou um Fc ou uma cadeia pesada de domínio constante (CH) 2 e/ou CH3 ou uma proteina que liga para uma célula de efeito imune.
Em um exemplo, a proteína de ligação TLla da presente divulgação compreende pelo menos um VH e um VL, caracterizado por: o VH e VL ligarem para formar um Fv compreendendo o domínio de ligação de antigeno. Por exemplo, a proteína de ligação TLla compreender qualquer dos seguintes pares de VH e VL: (i)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 6; (ii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 10 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 14; (iii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 18 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 22; (iv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 26 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 30; (v) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 34 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO:38; (vi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (vii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 50 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 54; (viii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 58 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (ix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (x) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 66 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (xi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 70 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (xii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO:- 74 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (xiii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 78 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (xiv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 58 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 82; (xv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 8 6 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xvi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 90 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xvii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 58 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (xviii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 154 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 164; (xix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 155 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 163; (xx) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 156 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 165; (xxi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 157 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 166; (xxii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 158 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 167; (xxiii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 159 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 168; (xxiv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 160 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 169; (xxv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 161 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 170; (xxvi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 234 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 169; (xxvii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 154 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; ’ (xxviii)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 155 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 156 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; . (xxx) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 157 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxxi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 158 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxxii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 159 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxxiii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 160 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxxiv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 161 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxxv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 234 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxxvi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 164; (xxxvii)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 165; (xxxviii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 166; (xxxix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 167; (xl) um VH . compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 168; (xii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 169; (xiii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 170; (xliii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 171; (xliv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 172; (xlv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 175 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 188; (xlvi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 176 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 189; ' (xlvii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 177 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 190; (xlviii)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 178 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 191; (xlix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 179 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 192; (1)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 180 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 193; (li) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 181 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 194; (Iii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 182 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 195; (liii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 183 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 196; (liv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 184 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 197; (lv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 185 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 198; (Ivi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 186 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 199; ou (Ivii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 187 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 200.
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla compreende qualquer um dos seguintes pares de VH e VL: (i) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 26 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 30; (ii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 34 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO:38; (iii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (iv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 17 5 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 188; (v) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 176 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 189; (vi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 177 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 190; (vii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 178 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 191; (viii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 17 9 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 192; (ix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 180 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 193; (x) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 181 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 194; (xi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 183 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 196; (xii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 185 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 198; (xiii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 186 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 199; ou (xiv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 187 e- um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 200;
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla compreende um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 94 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 95.
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla compreende um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 137 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 138.
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla compreende um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 152 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 153.
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla compreende um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 173 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 174.
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla compreender qualquer um dos seguintes pares de VH e VL: (i)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 58 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (ii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (iii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 66 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (iv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 70 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; - (v) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 74 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (vi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 78 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (vii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 58 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 82; (viii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 8 6 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (ix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 90 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; ou (x) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 58 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62. Por exemplo, a proteina de ligação TLla compreende um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46, caracterizado por: o VH e/ou VL compreender uma ou mais das seguintes substituições ou grupos de substituições: (xi) VH compreender uma alamina na posição 16 de SEQ ID NO: 42; (xii) o VH compreender uma alamina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 4 6; (xiii) o VH compreender uma serina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xiv) o VH compreender uma histidina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xv) o VH compreender uma leucina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xvi) o VH compreender um ácido aspártico na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xvii) o VH compreender uma tirosina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xviii) o VH compreender uma prolina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xix) o VH compreender uma glutamina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xx) VH compreender uma lisina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 4 6; (xxi) o VH compreender uma alamina na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxii) o VH compreender uma serina na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxiii) o VH compreender uma histidina na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxiv) o VH compreender uma leucina na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxv) o VH compreender um ácido aspártico na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxvi) o VH compreender uma tirosina na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxvii) o VH compreender uma glutamina na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xviii) o VH compreender uma lisina na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xix) o VH compreender uma alamina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xx) o VH compreender uma serina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxi) o VH compreender uma histidina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxii) o VH compreender uma leucina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxiii) o VH compreender uma tirosina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxiv) o VH compreender uma prolina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxv) o VH compreender uma glutamina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxvi) o VH compreender uma lisina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxvii) o VH compreender uma alamina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxviii)o VH compreender uma serina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 4 6; (xxix) o VH compreender uma histidina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxx) o VH compreender uma leucina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxi) o VH compreender um ácido aspártico na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxii) o VH compreender uma tirosina na posição 103 de SEQ ID NG: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxiii) o VH compreender uma prolina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxiv) o VH compreender uma glutamina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxv) o VH compreender uma lisina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxvi) o VH compreender uma serina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxvii)o VH compreender uma histidina na posição’ 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID 'NO: 46; (xxxviii) o VH compreender uma leucina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxix) o VH compreender um ácido aspártico na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xl) o VH compreender uma tirosina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xii) o VH compreender uma prolina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xiii) o VH compreender uma glutamina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xliii) o VH compreender uma lisina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xliv) o VH compreender uma alamina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xlv) o VH compreender uma histidina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xlvi) o VH compreender uma leucina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xlvii) o VH compreender um ácido aspártico na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xlviii)o VH compreender uma tirosina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xlix) o VH compreender uma prolina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 4 6; (l)o VH compreender uma glutamina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 4 6; (li) o VH compreender uma lisina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (lii) o VH compreender uma alamina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (liii) o VH compreender uma serina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (liv) o VH compreender uma histidina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Iv) o VH compreender uma leucina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Ivi) o VH compreender um ácido aspártico na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Ivii) o VH compreender uma tirosina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Iviii) o VH compreender uma prolina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 4 6; (lix) o VH compreender uma glutamina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (lx) . o VH compreender uma lisina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Ixi) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma alamina na posição 23 de SEQ ID NO: 46; (Ixii) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender um ácido aspártico na posição 28 de SEQ ID NO: 46; (Ixiii) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma tirosina na posição 33 de SEQ ID NO: 46; (Ixiv) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender um ácido aspártico na posição 34 de SEQ ID NO: 46; (Ixv) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma asparagina na posição 53 de SEQ ID NO: 46; (Ixvi) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma serina na posição 54 de SEQ ID NO: 46; (Ixvii) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender a alanina na posição 82 de SEQ ID NO: 46; (Ixviii)o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma serina na posição 95 de SEQ ID NO: 4 6; (Ixix) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma serina na posição 96 de SEQ ID NO: 46; (Ixx) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Ixxi) o VH compreender uma serina na posição 47 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23 de SEQ ID NO: 4 6; (Ixxii) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma alamina na posição 72, um ácido aspártico na posição 73 uma argemina na posição 74 e uma treonina na posição 7 6 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Ixxiii)o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51 e um ácido glutâmico na posição 102 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma serina na posição 24 e uma treonina na posição 7 6 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; (Ixxiv) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51 e um ácido glutâmico na posição 102 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24 e uma treonina na posição 76 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; (Ixxv) o VH'compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51 e um ácido glutâmico na posição 102 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23 e uma treonina na posição 76 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; (Ixxvi) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51 e um ácido glutâmico na posição 102 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Ixxvii)o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51, um ácido glutâmico na posição 102 e uma alamina na posição 105 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24 e uma treonina na posição 7 6 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; (Ixxviii) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51, um ácido glutâmico na posição 102 e uma alamina na posição 105 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Ixxix) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma alamina na posição 72, um ácido aspártico na posição 73 uma argemina na posição 7 4 e uma treonina na posição 7 6 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24 e uma treonina na posição 76 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; (Ixxx) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma alamina na posição 72, um ácido aspártico na posição 73 uma argemina na posição 74 e uma treonina na posição 7 6 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24, uma treonina na posição 76 e um ácido glutâmico na posição 51 cada’ um relativo a SEQ ID NO: 4 6; (Ixxxi) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51, uma alamina na posição 72, um ácido aspártico na posição 73, uma argemina na posição 74, uma treonina na posição 76, um ácido glutâmico na posição 102 e uma alamina na posição 105 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24, uma treonina na posição 76 e um ácido glutâmico na posição 51 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; ou (Ixxxii)o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51, uma alamina na posição 72, um ácido aspártico na posição 73, uma argemina na posição 74, uma treonina na posição 76, um ácido glutâmico na posição 102 e uma alamina na posição 105 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24, uma treonina na posição 76 e uma glicina na posição 51 cada um relativo a SEQ ID NO: 46.
Em um exemplo, o VH e o VL estão em uma cadeia simples de polipeptideo. Por exemplo, a proteina de ligação TLla é: (i) um fragmento FV de cadeia simples (scFv); (ii) um scFv dimérico (di-scFv); (iii) um de (i) ou (ii) ligado para uma cadeia pesada de região constante ou um Fc ou uma cadeia pesada de dominio constante (CH) 2 e/ou CH3; ou (iv) um de (i) ou (ii) ligada para uma proteina que liga para uma célula de efeito imune.
Em outro exemplo, o VL e VH são cadeias separada de polipeptideo. Por exemplo, a proteina de ligação TLla é: (i)um diacorpo; (ii) um triacorpo; (iii)um tretacorpo; (iv) um Fab; (v) um F(ab') 2; (vi) um Fv; (vii) um de (i) to (vi) ligado para uma cadeia pesada de região constante ou um Fc ou uma cadeia pesada de dominio constante (CH) 2 e/ou CH3; ou (viii) um de (i) to (vi) ligado para uma proteina que liga para uma célula de efeito imune.
Em uma forma exemplar da presente divulgação, a proteina de ligação TLla é um anticorpo. Proteinas exemplares ligando TLla da presente divulgação são quimérica, desimunizado, humanizada, humana, simunizada ou primatizada. -
Em um exemplo, a divulgação fornece um anticorpo compreendendo um dominio de ligação de antigeno, caracterizado por: o dominio de ligação de antigeno especificamente ligar para TLla e, caracterizado por: o anticorpo inibir interação de TLla e DR3 e não inibir interação de TLla e DcR3, o dominio de ligação de antigeno compreendendo qualquer um dos: (i)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 6; (ii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 10 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 14; (iii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 18 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 22; (iv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 26 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 30; (v) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 34 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO:38; (vi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (vii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 50 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 54; (viii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 58 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (ix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (x) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 66 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (xi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 70 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (xii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 7 4 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (xiii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 78 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (xiv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 58 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 82; (xv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 86 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xvi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 90 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xvii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 58 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (xviii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 154 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 164; (xix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 155 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 163; (xx) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 156 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 165; (xxi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 157 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 166; (xxii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 158 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 167; (xxiii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 159 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 168; (xxiv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 160 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 169; (xxv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 161 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 170; (xxvi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 234 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 169; (xxvii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 154 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxviii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 155 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 156 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxx) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 157 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxxi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 158 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxxii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 159 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxxiii)um VH 'compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 160 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxxiv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 161 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxxv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 234 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxxvi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 164; (xxxvii)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 165; (xxxviii) um VH compreendendo uma sequência estabel-ecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 166; (xxxix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 167; (xl) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 168; (xli) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 169; (xlii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 170; (xliii) um VH compreendendo uma ’ sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência êstabelecida na SEQ ID NO: 171; (xliv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 172; (xlv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 17 5 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 188; (xlvi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 17 6 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 189; (xlvii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 177 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 190; (xlviii)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 178 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 191; (xlix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 179 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 192; (l)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 180 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 193; (li) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 181 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 194; (lii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 182 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 195; (liii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 183 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 196; (liv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 184 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 197; (Iv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 185 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 198; (Ivi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 186 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 199; ou (Ivii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 187 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 200.
Em um exemplo, o anticorpo compreende qualquer um dos seguintes pares de VH e VL: - (i)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 6 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 30; (ii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 34 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO:38; e (iii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46.
Em um exemplo, o anticorpo compreende qualquer um dos seguintes pares de VH e VL: (i) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (ii) um VH codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificado por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 107 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (iii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 17 5 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 188; (iv) um VH codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 222 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 228 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (v)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 17 6 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 189; (vi) um VH codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 223 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 228 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (vii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 177 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 190; (viii) um VH codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 224 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 229 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (ix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 178 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 191; (x) um VH codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 224 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 230 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (xi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 179 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 192; (xii) um VH codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 224 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 231 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (xiii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 180 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 193; (xiv) um VH codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 224 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 228 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (xv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 181 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 194; (xvi) um VH codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 225 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 230 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (xvii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 183 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 196; (xviii) um VH codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 226 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 230 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (xix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida -na SEQ ID NO: 185 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 198; (xx) um VH codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 226 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 232 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (xxi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 186 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 199; (xxii) um VH codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID ácido nucléico que hibridiza mesmo sob moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 232 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (xxiii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 187 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 200; ou (xxiv) um VH codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 227 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um VL codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 233 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade.
Em um exemplo, o anticorpo compreende um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 94 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 95.
Em um exemplo, o anticorpo compreende qualquer um dos seguintes pares de VH e VL: (i) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 58 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (ii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (iii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 66 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (iv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 70 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (v) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 74 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (vi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 78 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (vii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 58 e um VL compreendendo uma - sequência estabelecida na SEQ ID NO: 82; (viii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 86 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (ix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 90 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; ou (x) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 58 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62.
A presente divulgação também fornece uma ligação de anticorpo TLla compreendendo um VH de SEQ ID NO: 42 e um VL de SEQ ID NO:46.
A presente divulgação também fornece uma ligação de anticorpo TLla compreendendo um VH de SEQ ID NO: 17 5 e um VL de SEQ ID NO: 188.
A presente divulgação também fornece uma ligação de anticorpo TLla compreendendo um VH de SEQ ID NO: 17 6 e um VL de SEQ ID NO: 189.
A presente divulgação também fornece uma ligação de anticorpo TLla compreendendo um VH de SEQ ID NO: 177 e um VL de SEQ ID NO: 190.
A presente divulgação também fornece uma ligação de anticorpo TLla compreendendo um VH de SEQ ID NO: 178 e um VL de SEQ ID NO: 191.
A presente divulgação também fornece uma ligação de anticorpo TLla compreendendo um VH de SEQ ID NO: 17 9 e um VL de SEQ ID NO: 192.
A presente divulgação também fornece a A TLla- ligação anticorpo compreendendo um VH de SEQ ID NO: 180 e um VL de SEQ ID NO: 193.
A presente divulgação também fornece uma ligação de anticorpo TLla compreendendo um VH de SEQ ID NO: 181 e um VL de SEQ ID NO: 194.
A presente divulgação também fornece uma ligação de anticorpo TLla compreendendo um VH de SEQ ID NO: 183 e um VL de SEQ ID NO: 196.
A presente divulgação também fornece uma ligação de anticorpo TLla compreendendo um VH de SEQ ID NO: 185 e um VL de SEQ ID NO: 198.
A presente divulgação também fornece uma ligação de anticorpo TLla compreendendo um VH de SEQ ID NO: 186 e um VL de SEQ ID NO: 199.
A presente divulgação também fornece uma ligação de anticorpo TLla compreendendo um VH de SEQ ID NO: 187 e um VL de SEQ ID NO: 200. Os Anticorpos estabelecidas na lista anterior fornecem um ou mais das seguintes vantagens: (i)inibe interação de TLla com DR3 e não inibe interação de TLla e DcR3 como determinado pelos métodos descritos neste documento; (ii) reduz o nivel de apoptose das células TF-1 (exemplo, cerca de 7xl04 células-8xl04 células (exemplo, 7,5xl04 células)) com um EC50 de menos que cerca de 2nM (tal como menor que cerca de l,5nM ou l,2nM ou l,lnM; ou InM ou menor) comparado com o nivel de apoptose na ausência da proteimna ligando TLla; ou (iii) liga para TLla na superficie de uma célula com um EC50 de menor que cerca de lOnM, tal como menor que cerca de 5nM ou 3nM ou 2nM, exemplo, como avaliado usando citometria de fluxo realizada com cerca de 2xl05 a 3xl05 células (exemplo, 2,5xl05 células).
Em um exemplo, o anticorpo compreende um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 137 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 138.
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla compreende um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 152 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 153.
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla compreende um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 162 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 172.’
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla compreende um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 163 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 174. Por exemplo, o anticorpo compreende um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46, caracterizado por: o VH e/ou VL compreender uma ou mais das seguintes substituições ou grupos de substituições: (i)o VH compreender uma alamina na posição 16 de SEQ ID NO: 42; (ii) o VH compreender uma alamina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (iii) o VH compreender uma serina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (iv) o VH compreender uma histidina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (v) o VH compreender uma leucina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 4 6; (vi) o VH compreender um ácido aspártico na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (vii) o VH compreender uma tirosina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; ' (viii) o VH compreender uma prolina na posição 100 'de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (ix) o VH compreender uma glutamina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (x)o VH compreender uma lisina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xi) o VH compreender uma alamina na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xii) o VH compreender uma serina na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xiii) o VH compreender uma histidina na posição 101 de SEQ ID NO: -42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xiv) o VH compreender uma leucina na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xv) o VH compreender um ácido aspártico na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xvi) o VH compreender uma tirosina na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xvii) o VH compreender uma glutamina na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xviii) o VH compreender uma lisina na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; ’ (xix) o VH compreender uma alamina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 4 6; (xx) o VH compreender uma serina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxi) o VH compreender uma histidina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxii) o VH compreender uma leucina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxiii) o VH compreender uma tirosina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxiv) o VH compreender uma prolina na posição 102 de SEQ ID NÒ: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxv) o VH compreender uma glutamina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxvi) o VH compreender uma lisina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxvii) o VH compreender uma alamina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxviii)o VH compreender uma serina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; • (xxix) o VH compreender uma histidina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxx) o VH compreender uma leucina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxi) o VH compreender um ácido aspártico na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxii) o VH compreender uma tirosina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxiii)o VH compreender uma prolina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxiv) o VH compreender uma glutamina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxv) o VH compreender uma lisina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxvi) o VH compreender uma serina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxvii)o VH compreender uma histidina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxviii) o VH compreender uma leucina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxix) o VH compreender um ácido aspártico na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xl) o VH compreender uma tirosina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xli) o ,VH compreender uma prolina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xlii) o VH compreender uma glutamina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xliii) o VH compreender uma lisina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xliv) o VH compreender uma alamina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xlv) o VH compreender uma histidina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xlvi) o VH compreender uma leucina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xlvii) o VH compreender um ácido aspártico na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xlviii)o VH compreender uma tirosina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xlix) o VH compreender uma prolina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (I) o VH compreender uma glutamina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (II) o VH compreender uma lisina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (III) o VH compreender uma alamina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 4 6; (1111) o VH compreender uma serina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 4 6; (liv) o VH compreender uma histidina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Iv) o VH compreender uma leucina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Ivi) o VH compreender um ácido aspártico na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Ivii) o VH compreender uma tirosina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Iviii) o VH compreender uma prolina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (lix) o VH compreender uma glutamina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (lx) o VH compreender uma lisina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Ixi) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma alamina na posição 23 de SEQ ID NO: 46; (Ixii) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender um ácido aspártico na posição 28 de SEQ ID NO: 46; (Ixiii) o VH compreender uma treonina na posição 41 de -SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma tirosina na posição 33 de SEQ ID NO: 46; (Ixiv) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender um ácido aspártico na posição 34 de SEQ ID NO: 46; (Ixv) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma asparagina na posição 53 de SEQ ID NO: 46; (Ixvi) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma serina na posição 54 de SEQ ID NO: 46; (Ixvii) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender a alanina na posição 82 de SEQ ID NO: 46; (Ixviii)o VH compreender uma treonina 'na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma serina na posição 95 de SEQ ID NO: 46; (Ixix) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma serina na posição 96 de SEQ ID NO: 46; (Ixx) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Ixxi) o VH compreender uma serina na posição 47 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23 de SEQ ID NO: 46; (Ixxii) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma alamina na posição 72, um ácido aspártico na posição 73 uma argemina na posição 7 4 e uma treonina na posição 7 6 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Ixxiii)o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51 e um ácido glutâmico na posição 102 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma serina na posição 24 e uma treonina na posição 7 6 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; (Ixxiv) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51 e um ácido glutâmico na posição 102 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24 e uma treonina na posição 76 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; (Ixxv) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51 e um ácido glutâmico na posição 102 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23 e uma treonina na posição 76 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; (Ixxvi) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51 e um ácido glutâmico na posição 102 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Ixxvii)o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51, um ácido glutâmico na posição 102 e uma alamina na posição 105 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24 e uma treonina na posição 7 6 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; (Ixxviii) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51, um ácido glutâmico na posição 102 e uma alamina na posição 105 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Ixxix) o VH compreender uma prolina na po-sição 41, uma alamina na posição 72, um ácido aspártico na posição 73 uma argemina na posição 7 4 e uma treonina na posição 7 6 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24 e uma treonina na posição 76 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; (Ixxx) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma alamina na posição 72, um ácido aspártico na posição 73 uma argemina na posição 74 e uma treonina na posição 7 6 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24, uma treonina na posição 76 e um ácido glutâmico na posição 51 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; (Ixxxi) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51, uma alamina na posição 72, um ácido aspártico na posição 73, uma argemina na posição 74, uma treonina na posição 76, um ácido glutâmico na posição 102 e uma alamina na posição 105 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24, uma treonina na posição 76 e um ácido glutâmico na posição 51 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; ou (Ixxxii)o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51, uma alamina na posição 72, um ácido aspártico na posição 73, uma argemina na posição 74, uma treonina na posição 76, um ácido glutâmico na posição 102 e uma alamina na posição 105 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24, uma treonina na posição 76 e uma glicina na posição 51 cada um relativo a SEQ ID NO: 46.
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla da presente divulgação compreende uma imunoglobuliina de região contante de cadeia pesada de primata humano ou não humano selecionada de um grupo consistindo de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgM, IgE e IgA. Uma imunoglobuliina de região contante de cadeia pesada é um IgG de região constante, exemplo, um IgGl região constante, tal como um IgGl de região constante de humana. Por exemplo, um IgGl de região constante de humano compreende uma região Fc compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 134. Em um exemplo, a imunoglobuliina de região contante de cadeia pesada de primata humano ou não humano não tem um residuo de lisina C-terminal.
Em outro exemplo, a proteina de ligação TLla da presente divulgação compreende uma imunoglobulin de região constante de cadeia leve de primata humano ou não humano selecionda de um grupo consistindo de kappa ou lambda. Em um exemplo, a proteina de ligação TLla compreende uma região constante cadeia leve de humano compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 135 (kappa) ou SEQ ID NO: 136 (lambda).
A presente divulgação também fornece um. ácido nucléico isolada ou recombinante codificando a proteina de ligação TLla da presente divulgação ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 80% de identidade desta ou uma sequência que hidridiza esta sob condições de moderada a alta severidade. A este respeito, a divulgação não é limitada para os específicos ácidos nucléicos exemplificados descritos neste documento, mas também engloba qualquer ácido nucléico que codifica uma proteina de ligação TLla da divulgação como o resultado de degeneração do código genético. Por exemplo, o ácido nucléico pode ser codon otimizado para expressão em um particular tipo de célula.
Em um exemplo, o ácido nucléico compreende uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 96 a 118 ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 80% de identidade destas ou uma sequência que hidridiza estas sob condições de moderada a alta severidade.
Em um exemplo, o ácido nucléico compreende uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 102 ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 80% de identidade desta ou uma sequência quet hidridiza esta sob condições moderada a alta severidade.
Em um exemplo, o ácido nucléico compreende uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 103 ou uma sequência tendo’ pelo menos cerca de 80% de identidade desta ou uma sequência que hidridiza esta sob condições moderada a alta severidade.
Em um exemplo, a ácido nucléico compreende uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 102 e uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 103 ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 80% de identidade desta ou uma sequência que hidridiza sob condições de moderada a alta severidade.
Em um exemplo, o ácido nucléico compreende uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 104 ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 80% de identidade desta ou uma sequência que hidridiza esta sob condições de moderada a alta severidade.
Em um exemplo, o ácido nucléico compreende uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 105 ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 80% de identidade desta ou uma sequência que hidridiza esta sob condições de moderada a alta severidade.
Em um exemplo, o ácido nucléico compreende uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 104 e uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 105 ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 80% de identidade destas ou uma sequência que hidridiza estas sob condições de moderada a alta severidade.
Em um exemplo, o ácido nucléico compreende uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 106 ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 80% de identidade destas ou uma sequência que hidridiza estas sob condições de moderada a alta severidade.
Em um exemplo, o ácido nucléico compreende uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 107 ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 80% de identidade desta ou uma sequência que hidridiza esta sob condições de moderada a alta severidade.
Em um exemplo, o ácido nucléico compreende uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 106 e uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 107 ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 80% de identidade destas ou uma sequência que hibridiza esta sob condições de moderada a alta severidade.
Em um exemplo, o ácido nucléico compreende uma sequência pelo menos 95% idêntica com uma sequência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 106, 107 ou 222 233 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade.
Em um exemplo, o ácido nucléico compreende um ou mais dos seguintes: (i)-um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 106 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 107 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (ii) um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 222 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 228 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (iii) ' um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 223 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 228 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (iv) um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 224 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 229 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta seve-ridade; (v)um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 224 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 230 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (vi) um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 224 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 231 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (vii) um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 224 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 228 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (viii) um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 225 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ-ID NO: 230 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (ix) um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 226 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 230 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (x)um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 226 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 232 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; (xi) um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 227 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 232 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade; ou (xii) um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 227 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade e um ácido nucléico compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 95% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 233 ou um ácido nucléico que hibridiza mesmo sob condições de moderada a alta severidade. Sequências de ácido nucléicos exemplares e combinações destas são apresentadas na Tabela 1 e são para ser tomada para dar apoio literal para cada sequência individual e combinações destas.
Em um exemplo, tal um ácido nucléico é incluido em uma construção de expressão em que um ácido nucléico está operacilnalmente ligado para um promotor. Tal uma construção de expressão pode ser em um Vector, exemplo um plasmideo.
Em exemplos da divulgação direcionados para proteinas simples de polipeptídeo ligando TLla, uma construção de expressão pode compreender um promotor ligado para um ácido nucléico codificado com cadeia de polipeptideo.
Em exemplos direcionados para um polipeptideos múltiplos que formam uma proteinaa de ligação TLla, uma construção de expressão da divulgação compreende um ácido nucléico codificando um dos polipeptideos (exemplo, compreendendo um VH) oligado operacionalmente para um promotor e um ácido nucléico codificando outro dos polipeptideos (exemplo, compreendendo um VL) ligado operacionalmente para um promotor.
Em outro exemplo, a construção de expressão é uma construção de expressão bicistrônica, exemplo, compreendendo os seguintes ligando operacionalmente componentes em 5' a 3' ordem: (i) A presente divulgação também contempla constr um promotor (ii) um ácido nucléico que codifica um primeiro polipeptideo; (iii) r<?úma entrada de site ribossoma; e (iv) um ácido nucléico que codifica um segundo polipeptideo. Por exemplo, o primeiro polipeptideo compreende um VH e o segundo polipeptideo compreende um VL, ou o primeiro polipeptideo compreender um VL e o segundo polipeptideo compreende um VH.ução de expressões separadas uma das quais codifica um primeiro polipeptideo (exemplo, compreendendo um VH) e outra dqa qual codifica um segundo polipeptideo (exemplo, compreendendo um VL) . Por exemplo, a presente divulgação também fornece uma composição compreendendo: (i)uma primeira construção de expressão compreendendo um ácido nucléico codificando um polipeptideo (exemplo, compreendendo um VH ligado operacionalmente para um promotor); e (ii) uma segunda construção de expressão compreendendo um ácido nucléico codificando um polipeptideo (exemplo, compreendendo um VL ligado operacionalmente para um promotor), caracterizado por: o primeiro e segundo polipeptideos associados para formar uma proteina de ligação TLla da presente divulgação.
A presente divulgação também fornece um célula isolada expressando uma proteina de ligação TLla da divulgação ou uma célula recombinante geneticamente modificada para expressar uma proteina de ligação de TLla da divulgação.
Em um exemplo, a célula compreende a construção de expressão da divulgação ou: (i)a primeira construção de expressão compreendendo um ácido nucléico codifica um polipeptideo (exemplo, compreendendo um VH) ligado operacionalmente para um promotor; e (ii) a segundo construção de expressão compreendendo um ácido nucléico codifica um polipeptideo (exemplo, compreendendo um VL) ligado operacionalmente para um promotor, caracterizado por: o primeiro e segundo polipeptideos estarem associados para formar uma proteina de ligação TLla da presente divulgação. Exemplos de células da presente divulgação incluem célula de bactéria, célula de levedura, célula de inseto ou célula de mamifero. Células exemplares são mamiferas.
A presente divulgação adicionalmente fornece métodos para produzir uma proteina de ligação TLla da divulgação. Por exemplo, tal método envolve manter a construção de expressão (s) da divulgação sob condições suficientes para a proteina de ligação TLla ser produzido.
Em um exemplo, um método para produção de uma proteina de ligação TLla da divulgação compreende a cultura da célula da divulgação sob condições suficientes para proteina ser produzido e, opcionalmente, segregrada.
Em um exemplo, o método para produção de uma proteina de ligação TLla da divulgação adicionalmente compreende isolar a proteina.
A presente divulgação também fornece uma composição compreendendo uma proteina de logação de TLla, ácido nucléico, construção de expressão ou célula da presente divulgação e um-transportador adequado. Em um exemplo, a composição compreende a proteina de ligação TLla da presente divulgação e um transportador adequado. Em um exemplo, o transportador é aceitável farmaceuticamente, exemplo, a composição é uma composição farmacêutica.
A presente divulgação também fornece um método para tratar ou prevenir sintoma de uma condição (exemplo, uma condição mediada por TLla) em uma célula, tecido, órgão ou sujeito, o método compreende administrar uma proteina de ligação TLla, ácido nucléico, construção de expressão, célula ou composição da presente divulgação para a célula, tecido, órgão ou sujeito. Em um exemplo, a presente divulgação fornece um método para tratar ou prevenir uma condição (exemplo, uma condição mediada por TLla) em um sujeito, o método compreende administrar uma proteina dé liogação TLla, ácido nucléico, construção de expressão, célula ou composiçãó da presente divulgação para o sujeito. A este respeito, um método de prevenir a condição pode prevenir um reincidência de uma condição tendo uma forma remitente recorrente, tal como esclerose múltipla, exemplo, uma proteina é administrada durante remisão para assim prevenir a reincidência.
A presente divulgação também fornece um método para induzir ou aumentar angiogenese em um sujeito, o método compreende administrar uma proteina de ligação TLla, ácido nucléico, construção de expressão, célula ou composição da presente divulgação para o sujeito.
A presente divulgação também fornece o uso d proteina de ligação TLla, ácido nucléico, construção de expressão, célula ou composição da presente divulgação em medicina.
A presente divulgação também fornece para uso da proteina de ligação TLla-, ácido nucléico, construção de expressão, ou célula na fabricação de um medicament ou prevenção para tratar ou prevenir sintoma de uma condição (exemplo, uma condição mediada por TLla) ou para tratar ou prevenir uma condição (exemplo, uma condição mediada por TLla) ou para induzir ou melhorar angiogénese em um sujeito.
A presente divulgação também fornece uma proteina de ligação TLla, ácido nucléico, construção de expressão, ou célula para uso no tratamento ou prevenir sintoma de uma condição (exemplo, uma condição medida por TLla) ou para tratar ou prevenir uma condição (exemplo, uma condição medida por TLla) ou para induzir ou melhorar angiogénese em um sujeito.
Em um exemplo, um método de tratamento ou profilaxia da presente divulgação adicionalmerite compreende diagnosticar a condição, exemplo, por realizar um dos método descritoneste documento.
Em um exemplo, um método de tratamento ou profilaxia da presente divulgação adicionalmente compreende detectar o nivel de TLla em um sujeito e administrar uma dose adicional da proteina de ligação TLla, ácido nucléico, construção de expressão, célula ou composição da divulgação se o nivel de TLla não é significantemente reduzido ou não é reduzido para um nivel not associado com a condição.
A presente divulgação também fornece um método para inibir interação de TLla e DR3 (e um um exemplo, não inibindo interação de TLla e DcR3) em uma célula, tecido, órgão ou sujeito, o método compreendendo administrar uma proteina de ligação TLla, ácido nucléico, construção de expressão, célula ou composição da presente divulgação para a célula, tecido, órgão ou sujeito. Em um exemplo, o sujeito sofre de uma condição (exemplo, uma condição medida por TLla).
A presente divulgação também fornece um método para detectar TLla em uma amostra, o método compreendendo contatar uma amostra com a proteina de ligação TLla da presente divulgação tal que formas complexa de uma proteina antigena detecte o complexo, caracterizado por: s tetecção do complexo ser indicativo de TLla na amostra.
A presente divulgação também fornece um método para detectar TLla em um sujeito, o método compreendendo detectar a proteina de ligação TLla da presente divulgação no sujeito, caracterizado por: uma proteina ser conjugada para um rotulo detectável. Em um exemplo, o método compreende administrar uma proteina para o sujeito.
A presente divulgação também fornece um método para diagnosticar uma condição medida por TLla em um sujeito, o método compreendendo realizar o método da divulgação para detectar TLla em uma amostra do sujeito, caracterizado por: a detecção de TLla em uma amostra ser indicativo da condição medida por TLla.
Em um exemplo, o método compreende determinar o nivel de TLla na amostra, caracterizado por: um aumento ou redução do nivel de TLla na amostra comparado com uma amostra de controle ser indicativo do condição medida por TLla.
Em um exemplo, o resultado de um método para detectar, ou diagnosticar/prognosticar TLla de uma condição são providos, exemplo, em papel ou forma legivel por máquina.
A presente divulgação também fornece um método compreendendo obter os resultados de um método para detectar TLla ou diagnostico/prognostico de uma condição da presente divulgação e administrar uma composição terapêutica ou profilática ou recomendar tal administração. Em um exemplo, a composição é uma composição da presente divulgação. Condições exemplares a serem tratadas, prevenidas, diagnosticadas ou prognosticadas são condições mediadas por TH17, condições inflamátorias, condições autoimune ou condições associadas com ou causada por insuficiente angiogénese. Condições adequadas são descritas neste documento.
Em um exemplo, uma condição a ser tratada, prevenida, diagnosticada ou prognosticada é uma doença autoimune. Por exemplo, a condição é uveite, cplite ulcerativa, doença de Crohn, sindrome de intestino irritável, artrite reumatóide, poliartrite, esclerose múltipla, asma ou doença pulmunar obstrutiva crônica.
Em um exemplo, a condição é uma condição de intestino inflmatório, tal como, colite, exemplo, colite ulcerativa ou doença de Crohn.
A presente divulgação também, fornece um método de seleção de uma proteina de ligação TLla que ligar especificamente para TLla e inibe interação de TLla e DR3 e que não inibe interação de TLla e DcR3 de uma pluralidade de proteinas de ligação TLla, o método compreendendo: contatar a pluralidade de proteinas de ligação TLla para uma muteina TLla em que uma arginina na posição de aminoácido 32 da SEQ ID NO:202 foi substituída com uma alamina e/ou a arginina na posição de aminoácido 85 foi substituída com alanina sob condições suficiente para permitir a ligação de proteinas de ligação TLla para a muteina para formar uma Proteina de ligação TLla-TLla muteina complexa e uma pluralidade esgotada de proteinas de ligação TLla que não ligo para a muteina TLla da pluralidade esgotada de proteinas de ligação TLla, caracterizado por: as proteinas coletadas ligando TLla liga especificamente para TLla e inibe interação de TLla e DR3 e não inibe interação de TLla e DcR3.
A presente divulgação também fornece um método de isolar uma proteina de ligação TLla que liga especificamente para TLla e inibe interação de TLla e DR3 e que não inibe interação de TLla e DcR3 de uma pluralidade de proteinas de ligação TLla, o método compreendendo isolar a pluralidade de proteinas de ligação TLla, uma ou mais proteinas de ligação TLla que não liga para uma muteina TLla em que uma arginina na posição do aminoácido 32 da SEQ ID NO:202 foi substituída com uma alamina e/ou a arginina na posição do aminoácido 85 foi substituída com alanina.
A pluralidade de proteínas de ligação TLla pode esta presente em uma bibliotéca de de anticorpos ou domínios de ligação de antigeno, tal como, uma exibição de fagos, exibição ribosoime ou biblioteca de exibição de levedura. A pluralidade de proteínas de ligação TLla pode estar presente em um antisoro. A pluralidade de proteínas de ligação TLla pode estar presente em cultura de supernadantes de hibridoma.
A presente divulgação também fornece um polipeptideo isolado compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID - NO: 202 em que uma arginina na posição do aminoácido 32 foi substituido com uma alamina e/ou a arginina na posição do aminoácido 85 foi substituída com alanina.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FIGURAS
As Figuras IA a 1H são representações em diagrama mostrando sequência de região variável de anticorpos. No alinhamento mostrado nas Figuras ID a 1H qualquer aminoácidos idênticos são indicados por um periodo de, isto é, ".". A Figura IA mostra sequência de regiões VH de anticorpos anti TLla humano. A Figura 1B mostra sequência de VL regiões de anticorpos anti TLla humano. A Figura 1C mostra sequência de Regiões VH de anticorpo anti-TLla de C320 e alguns derivados destes. A Figura 1D mostra alinhamento de sequência de VH de selecionada de anticorpos humano nos quais oo VH CDRs 1, 2 e '3 de C320 foram enxeertado. A Figura 1E mostra uma sequência de a consenso de’ regiões VH de derivados de C320. A Figura 1F mostra sequência de regiões VL de anticorpo anti-TLla C320 e derivados destes. A Figura 1G mostra um alinhamento de sequência de VL de anticorpos humano e que os VL CDRs 1, 2 e 3 de C320 foram enxertados. A Figura 1H mostra um sequência consenso de regiões VL de derivados de C320. As regiões em caixa contêm CDRs (como indicado) como definido pelo sistema de numeração Kabat e sistema melhorado de numeração Chothia. CDRs definidos pelo sistema de numeração Kabat são mostrados em negrito. Os CDRs definido pelo sistema melhorado de numeração Chothia são sublinhados.
A Figura 2 é uma representação gráfica mostrando resultado de um ensaio de potência demonstrando a habilidade de um intervalo de anticorpos anti-TLla para inibir apoptose induzida por TLla de células TF-1. Five μg/ml de anti-TLla anticorpos foram rastreada por suas habilidade para inibir Apoptose induzida por TLla em células TF-1.
A Figura 3 é uma representação gráfica do resultado de um ensaio para identificar anticorpos anti-TLla altamente potente. O mostrado representa o nivel de inibição de Apoptose induzida por TLla de células TF-1 aumentada as várias concentrações de anticorpos de teste (máxima concentração testada 5μg/ml). Estes niveis permitem a determinação do Ecso de anticorpos anti-TLla para a inibição de Apoptose induzida por TLla de células TF-1, que permite para comparações funcionais baseada na potência relativa.
A Figura 4A é uma representação gráfica mostrando o nivel de inibição de interação de TLla com DR3 melhorada em várias concentrações de' anticorpos de teste (máxima concentração testada 25μg/ml). Anticorpos C320, C321 e C323 inibiram a interação entre TLla e DR3 em numerosas concentrações.
A Figura 4B é uma representação gráfica mostrando o nivel de inibição de interação de TLla com DcR3 melhorada em várias concentrações de anticorpos de teste (máxima concentração testada 25μg/ml). Nos Anticorpos C320, C321 e C323 não foi detectável a inibição de interação entre TLla e DcR3 em concentrações de anticorpo de 10 μg/ml ou menor.
A Figura 4C é uma representação gráfica mostrando o nivel de inibição de interação de TLla com DR3 melhorada em várias concentrações de anticorpos de teste (máxima concentração testada 10μg/ml). Anticorpos C320-0, C320-168 e C320-179 inibem a interação entre TLla e DR3 em numerosas concentrações. Anticorpos 1B4 e C300-25 estão-incluidos com o propósito de comparação.
A Figura 4D é uma representação gráfica mostrando o nivel de inibição de interação de TLla e DcR3 melhorada em várias concentrações de anticorpos ce teste (máxima concentração testada 100μg/ml). Nos Anticorpos C320-0, C320-168 e C320-179 não foi detectável a inibição de interação entre TLla e DcR3. Anticorpos 1B4 e C300-25 inibiram a interação entre TLla e DcR3 em várias concentrações e estão incluidos com o propósito de comparação.
A Figura 5A inclui duas representações gráficas mostrando a ligação de várias concentrações de anticorpos de teste para TL1 humano solúvel (SEQ ID NO: 202; painel superior) e TL1 humano solúvel em que arginina no residue 32 foi substituída com alanina (muteina R32A, painel inferior). Anticorpos C320-0, C320-168 e C320-179 todos os limites TLla em várias concentrações mas não muteina R32A TLla. Anticorpos anti-TLla 1B4 e 16H2 (como descritos em US20090280116) limita ambos TLla e muteina R32A TLla em várias concentrações. O anticorpo isotipo controle não se ligou a qualquer forma de TLla
A Figura 5B é uma representação gráfica mostrando a ligação de várias concentrações de anticorpos de teste para TL1 humano solúvel em que a arginina no residue 85 foi substituída com alanina (muteina R85A, painel superior) e TL1 humano solúvel em que a argininas no resíduo 32 e resíduo 85 foram substituídas com alanina (muteina R32A+R85A, painel inferior). Os Anticorpos C320-0, C320-168 e C320-179 não ligaram muteina R85A ou R32A+R85A TLla. Anticorpos anti-TLla 1B4 e 16H2 (como descritos em US20090280116) ambos os limites muteina R85A ou R32A+R85A TLla em várias concentrações. . O anticorpo isotipo controle não se ligou a qualquer forma de TLla
A Figura 5C é uma representação gráfica mostrando a ligação de TL1 humano solúvel, TLla muteina R32A e TLla muteina R85A a uma concentração de IDg/ml para receptores DR3 e DcR3. TLla limita amobs os receptores igualqmente bem. TLla muteina R32A e R85A limita DcR3 para uma extensão similar emo fez TLla, mas limite de DR3 em uma nível approximadamente 50% ou mais baixa que ligação de TLla para DcR3
A Figura 5D é uma representação de diagrama apresentando a estrutura de cristal de raio de trimerico humano TLla (PDB: 3K51) (cinza) com os resíduos R32 e R85 realçado em preto em cada monômero.
A Figura 6 é uma representação de diagrama mostrando a habilidade de anticorpos C320, C321, C323 e 1B4 para ligar à superfície de célula TLlaA ligação foi avaliada usando citometria de fluxo, em que os resultados são apresenrtados com intensidade média de fluorescência (MFI). Todos os anticorpos, exceto o controle do isotipo, limite TLla
A Figura 7A é uma represenação gráfica mostrando produção de superfície de célula TLla por mitógeno (Concanavalin A) as células mononucleares do sangue periférico estimuladas (PBMCs). O gráfico sombreado representa um anticorpo de controle isotipo e o gráfico de linha representa superfície de célula TLla como detectada pelo rato quimérico anti-humano TLla humano.
A Figura 7B é uma represenação gráfica mostrando aumento da produção de secretado TLla em PBMCs como estimulação de mitógeno (Concanavalin A)- é aumentada.
A Figura 8A é uma represenação gráfica mostrando a habilidade de anticorpos anti-TLla (máxima concentração testada 50μg/ml) para inibir produção de interferon y (IFN- Y) induzida por endógeno humano TLla. Endógeno TLla melhora a produção de citocina e stimulado PBMCs. Anticorpos C320 e C323 inibe a produção de IFNDD . Anticorpo 1B4 é incluído para o propósito de comparação.
A Figura 8B é uma represenação gráfica mostrando a habilidade de anticorpos anti-TLla (máxima concentração testada 50μg/ml) para inibir produção de IL-13 induzida por endógeno humano TLla. Endógeno TLla melhora a produção de citocina por estimulaar PBMCs. Anticorpos C320 e C323 inibem a produção de IL-13 anticorpo 1B4 é incluído para o propósito de comparação.
A Figura 9A é uma representação de diagrama mostrando um alinhamento da sequência de cadeia leve de C320 contra a sequência germinativa de homologia mais elevada, IGLVl-40*01. Qualquer aminoácidos idênticos são indicados por um periodo, isto é, ".". Diferenças nas sequência de aminoácidos na região de CDR são identificadas.
A Figura 9B é uma representação em diagrama mostrando um alinhamento de regiões VH r de anticorpos identificaos neste documento. .
A Figura 9C é uma representação em diagrama mostrando um alinhamento de regiões VL de anticorpos identificaos neste documento.
A Figura 9D é uma cópia de uma representação fotográfica mostrando a focalização isoelétrica em gel comparando com C320-168, C320-163 e C320-170. C320-168 tendo 5-6 isoforma de cargas distintas comparado com 1-2 isoformas visualizadas por C320-163 e C320-170.
A Figura 9E é uma representação gráfica mostrando a habilidade de anticorpos C320-168, C32Õ-179 e C320-183 para neutralizas Apoptose induzida por TLla de células TF-1 em várias concentrações (máxima concentração testada 10μg/ml). Anticorpos C320-0 e 1B4 são incluidos para comparação. Todos os anticorpos inibem Apoptose induzida por TLla de células TF-1 em múltiplas concentrações.
A Figura 10A é uma representação gráfica mostrando a área total de colon ulcerado (cm2) em ratos nos dias seguinte de colite induzida por DNBS. Ratos foram tratados com anticorpo C320-168 (10mg/kg), veiculo (controle negativa) dias 0 e 4 ou sulfasalazina (padrão de cuidados compostos) diariamente do dia 0 (com resultado para cada grupo de tratamento indicado). C320-168 reduzida área média de ulcera comparado com animais de tratamento de veiculo numa extensão comparável com sulfassalazina.
A Figura lOB é uma representação gráfica mostrando a troca de peso (g) nos ratos no dia seguinte a colite induzida por oxazalona. Os ratos foram tratados com anticorpo 0320-168 (10mg/kg) ou controle de isotipo control (10mg/kg) nos dias 0 e 4 ou sulf asalazina (SoC (5-ASA); padrão de cuidados compostos) diariamente do dia 0 (com resultado para cada grupo de tratamento indicado.) 0320-168 melhora na perda de peso em relação ao anticorpo de controlo de isotipo para uma extensão comparável com sulfassalazina.
A Figura 10C é uma representação gráfica mostrando consistência das fezes (DAI - Disease Activity Index) em ratos nos dias seguintes a colite induzida por oxazalona. Os ratos foram tratados com anticorpo 0320-168 (10mg/kg) ou controle de isotipo (10mg/kg) nos dias 0 e 4 ou sulfasalazina (SoC (5-ASA); padrão de cuidados compostos) diariamente do dia 0(com resultado para cada grupo de tratamento indicado). C320-168 melhoram os sinais clinicos da doença (consistência das fezes) relativo anticorpo de controle isotipo.
A Figura 11A é uma representação gráfica mostrando consistência das fezes (DAI - Disease Activity Index) nos dias seguintes de colite induzida por sulfato de sódio dextran (DSS). Os ratos foram tratados com anticorpo 0320168 (10mg/kg), ou controle de isotipo (10mg/kg) duas vezes por semana a partir do dia 4 de indução da doença ou sulfasalazina (SoC (5-ASA); padrão de cuidado composto) diariamente do dia 4 depois da indução da doença (com resultado for cada grupo de tratamento indicado). 0320-168 melhorou ’os sinais clinicos da doença (consistência das fezes) relativo ao anticorpo de controle de isotipo para uma similar extensão com sulfasalazina.
A Figura 11B é uma representação gráfica mostrando a troca de peso (%) nos ratos nos dias seguintes a colite induzida por DSS. Os ratos foram tratados com anticorpo C320-168 (10mg/kg ou controle isotipo (10mg/kg) duas vezes por semana a partir do dia 4 de indução da doença ou sulfasalazine (SoC (5-ASA); padrão de cuidado composto) diariamente depois do dia 4 da indução da doença (com resultado para cada grupo de tratamento indicado). C320-168 melhorou perda de peso relativo ao anticorpo de controle isotipo para uma extensão similar com sulfasalazina
A Figura 12 é uma representação gráfica mostrando o resultado de um ensaio ELISA-para identificar a ligação de anticorpos para diferentee isoforma de TLla. Ambos C320-168 e C320-179 limite o maior (72-251) e menor (84-251) isoforma de sóluvel, clivado TLla.
DESCRIÇÃO DETALHADA Geral
Ao longo desta eespecificaação, a menos que especificamente indicado de outra maneira ou que o contexto exija de outra maneira, uma referência para um único passo, uma composição de matéria, grupo de passos ou grupos de composições da matéria englobará uma e uma pluralidade (isto é um ou mais) destes passos, composições de matérias, grupos de passos ou grupos de composições da matéria. Assim, como usado neste documento, as formas singulares "a"e "o" incluem aspectos plurais a menor que o contexto claramente indique ao contrário. Por exemplo, referência para "um" inclui um único tanto quanto dois ou mais; referência para "uma" inclui um único tanto quanto dois ou mais; referência para "o" inclui um único tanto quanto dois ou mais e assim por diante. Cada exemplo da presente divulgação descritos neste documento é para ser aplicado mutatis mutandis para cada um e todos os outro exemplo a menos que especificamente indicado de outra maneira.
Estes experiêntes na matéria apreciará que a divulgação neste documento é susceptível para variações e modificações outra que estas especificamente descritas, è para ser entendido que a divulgação inclui todas estas variações e modificações. A divulgação também inclui todos os passos, recursos, composições e compostos referenciados para ou indicado nesta eespecificaação, individualmente ou colletivamente, e qualquer e todas as combinações ou qualquer dois ou mais dos ditos passos ou recursos.
A presente divulgação não é para ser limitada no escopo do sexemplos específicos descritos neste documento, que são entendidos somente para o propósito de exemplificação. Produtos funcionalmente equivalentes, composições e métodos estão claramente dentro do escopo da divulgação, como descritos neste documento.
A presente divulgação é realizada sem experimentação indevida usando, a menos que indicado em contrário, técnicas convencionais de biologia molecular, microbiológia, virologia, tecnologia de DNA recombinante, sintese de peptideo em solução, síntese de fase sólida de peptideo, e imunologia. Tais procedimentos são descritos, por exemplo, em "Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Second Edition (1989), Vols I, TI, e III completos; Benny K.C.Lo, Antibody Engineering: Methods and Protocols, (2004) Humana Press, Vol. 248; DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I e II (D. N. Glover, ed., 1985), IRL Press, Oxford, whole of text; Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait, ed, 1984) IRL Press, Oxford, o texto completo, e particularmente os artigos neste documento de Gait, ppl-22; Atkinson et al., pp35-81; Sproat et al., pp 83-115; e Wu et al., pp 135-151; 4. Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. , 1985) IRL Press, Oxford, whole of text; Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (1986) IRL Press, Oxford, whole of text; Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.), whole of séries; J.F. Ramalho Ortigao, "The Chemistry of Peptide Synthesis" In: Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website (Interactiva, Germany); Sakakibara Biochem. Biophys. Res. Commun. 73: 336-342, 1976; Merrifield J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154, 1963; Barany and Merrifield (1979) in The Peptides (Gross, E. and Meienhofer, J. eds.), vol. 2, pp. 1-284, Academic Press, New York. 12. Wünsch, E., ed. (1974) Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie (Müler, E. , ed.), vol. 15, 4th edn., Partes 1 e 2, Thieme, Stuttgart; Bodanszky, M. (1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. & Bodanszky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky Int. J. Peptide Proteina Res. 25: 449-474, 1985; Handbook of Experimental Imunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); e Animal Cell Culture: Practical Approach, Third Edition (John R. W. Masters, ed., 2000), ISBN 0199637970", conjuto de textos. O termo "e/ou", exemplo, "X e/ou Y" pode ser entendido para significar "X e Y" ou "X ou Y" e devem ser tomadas para fornecer suporte explicito para ambos os significados ou para qualquer significado. Ao longo desta especificação a palavra "compreendem", ou variações tal como "compreende" ou "compreendendo", será entendida implicando a inclusão de um elemento declarado, inteiro ou passo, ou grupo de elementos, inteiros ou passos, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, inteiro ou passo, ou grupo de elementos, inteiros ou passos.
Chave para Lista de Sequência SEQ ID NO: 1: sequência de aminoácido de humano TLla dominio extracelular com N-terminal HIS e etiquetas FLAG SEQ ID NO 2: sequência de aminoácido de C336 VH SEQ ID NO: 3: sequência de aminoácido de C336 HCDR1 SEQ ID NO: 4: sequência de aminoácido de C336 HCDR2 SEQ ID NO: 5: sequência de aminoácido de C336 HCDR3 SEQ ID NO: 6: sequência de aminoácido de C336 VL SEQ ID NO: 7: sequência de aminoácido de C336 LCDR1 SEQ ID NO: 8: sequência de aminoácido de 0336 LCDR2 SEQ ID NO: 9: sequência de aminoácido de C336 LCDR3 SEQ ID NO: 10 : sequência de aminoácido de C334 VH SEQ ID NO: 11: sequência de aminoácido de 0334 HCDR1 ’ SEQ ID NO: 12: sequência de aminoácido de C334 SEQ ID NO: 13: sequência de aminoácido de C334 HCDR3 SEQ ID NO: 14 : sequência de aminoácido de C334 vL SEQ ID NO: 15: sequência de aminoácido de C334 5 LCDR1 SEQ ID NO: 16: sequência de aminoácido de C334 LCDR2 SEQ ID NO: 17: sequência de aminoácido de C334 LCDR3 10 SEQ ID NO: 18 : sequência de aminoácido de C 1333 VH SEQ ID NO: 19: sequência de aminoácido de C333 HCDR1 SEQ ID NO: 20: sequência de aminoácido de C333 HCDR2 15 HCDR3 SEQ ID NO: 21: sequência de aminoácido de C333 SEQ ID NO: 22: sequência de aminoácido de C 2333 VL SEQ ID NO: 23: sequência de aminoácido de C333 LCDR1 20 LCDR2 SEQ ID NO: 24: sequência de aminoácido de C333 SEQ ID NO: 25: sequência de aminoácido de C333 LCDR3 SEQ ID NO: 26: sequência de aminoácido de ( 2323 VH 25 HCDR1 SEQ ID NO: 27: sequência de aminoácido de C323 SEQ ID NO: 28: sequência de aminoácido de C323 HCDR2 SEQ ID NO: : 29: sequência de aminoácido de C323 30 HCDR3 SEQ ID NO: 30: sequência de aminoácido de ( 3323 vL LCDR1 SEQ ID NO: 31: sequência de aminoácido de C323 SEQ ID NO: 32: sequência de aminoácido de C323 LCDR2 5 LCDR3 SEQ ID NO: 33: sequência de aminoácido de C323 SEQ ID NO: 34 : sequência de aminoácido de C321 VH SEQ ID NO: 35: sequência de aminoácido de C321 HCDR1 10 HCDR2 SEQ ID NO: 36: sequência de aminoácido de C321 SEQ ID NO: 37 : sequência de aminoácido de C321 HCDR3 SEQ ID NO: 38 : sequência de aminoácido de C321 VL 15 LCDR1 SEQ ID NO: 39: sequência de aminoácido de C321 SEQ ID NO: 40: sequência de aminoácido de C321 LCDR2 SEQ ID NO: 41: sequência de aminoácido de C321 20 LCDR3 SEQ ID NO: 42: sequência de aminoácido de C :320 VH SEQ ID NO: 43: sequência de aminoácido de C320 HCDR1 SEQ ID NO: 44 : sequência de aminoácido de C320 25 HCDR2 SEQ ID NO: 45: sequência de aminoácido de C320 HCDR3 SEQ ID NO: 46: sequência de aminoácido de C320 'VL SEQ ID NO: 47 : sequência de aminoácido de C320 SEQ ID NO: 4 8 : sequência de aminoácido de C320 LCDR2 SEQ ID NO: 4 9 : sequência de aminoácido de C320 LCDR3 5 SEQ ID NO: 50: sequência de aminoácido de C319 VH SEQ ID NO: 51 : sequência de aminoácido de C319 HCDR1 SEQ ID NO: 52 : sequência de aminoácido de C319 HCDR2 10 SEQ ID NO: 53 : sequência de aminoácido de C319 HCDR3 SEQ ID NO: 54: sequência de aminoácido de C319 vL SEQ ID NO: 55 : sequência de aminoácido de C319 LCDR1 - 15 SEQ ID NO: 56 : sequência de aminoácido de C319 LCDR2 SEQ ID NO: 57 : sequência de aminoácido de C319 LCDR3 SEQ ID NO: 58: sequência de aminoácido de C320- 3 VH 20 SEQ ID NO: 59: sequência de aminoácido de C320-3 HCDR1 SEQ ID NO: 60: sequência de aminoácido de C320-3 HCDR2 SEQ ID NO: 61: sequência de aminoácido de C320-3 25 HCDR3 SEQ ID NO: 62: sequência de aminoácido de C320- 5 VL SEQ ID NO: 63: sequência de aminoácido de C320-5 LCDR1 SEQ ID NO: 64: sequência de aminoácido de C320-5 30 LCDR2 SEQ ID NO: 65: sequência . de aminoácido de C320-5 LCDR3 SEQ ID NO: 66: sequência de j aminoácido de C320-90 VH SEQ ID NO.- 67: sequência de aminoácido de C320-90 5 HCDR1 SEQ ID NO: 68: sequência de aminoácido de C320-90 HCDR2 SEQ ID NO: 69: sequência de aminoácido de C320-90 HCDR3 10 VH SEQ ID NO: 70: sequência de aminoácido de C320-103 SEQ ID NO: 71: sequência de aminoácido de C320-103 HCDR1 SEQ ID NO: 72: sequência de aminoácido de C320-103- 15 HCDR2 SEQ ID NO: 73: sequência de aminoácido de C320-103 HCDR3 SEQ ID NO: 74: sequência de aminoácido de C320-114 VH 20 SEQ ID NO: 75: sequência de aminoácido de C320-114 HCDR1 SEQ ID NO.- 76: sequência de aminoácido de C320-114 HCDR2 SEQ ID NO: 77: sequência de aminoácido de C320-114 25 HCDR3 SEQ ID NO: 78: sequência de aminoácido de C320-115 VH SEQ ID NO: 79: sequência de aminoácido de C320-115 HCDR1 30 SEQ ID NO: 80: sequência de aminoácido de C320-115 SEQ ID NO: 81: sequência de aminoácido de C320-115 HCDR3 SEQ ID NO: 82: sequência de aminoácido de C320-120 VL SEQ ID NO: 83: sequência de aminoácido de C320-120 LCDR1 SEQ ID NO: 84: sequência de aminoácido de C320-120 LCDR2 SEQ ID NO: 85: sequência de aminoácido de C320-120 LCDR3 SEQ ID NO: 86: sequência de aminoácido de C320-129 VH SEQ ID NO: 87: sequência de aminoácido de C320-129 HCDR1 SEQ ID NO: 88: sequência de aminoácido de C320-129 HCDR2 SEQ ID NO: 89: sequência de aminoácido de C320-129 HCDR3 SEQ ID NO: 90: sequência de aminoácido de C320-130 VH SEQ ID NO: 91: sequência de aminoácido de C320-130 HCDR1 SEQ ID NO: 92: sequência de aminoácido de C320-130 HCDR2 SEQ ID NO: 93: sequência de aminoácido de C320-130 HCDR3 SEQ ID NO: 94: sequência de aminoácido de VH sequência de consenso de C320 e derivados SEQ ID NO: 95: sequência de aminoácido de VL sequência de consenso de C320 e derivados SEQ ID NO: VH de C336 SEQ ID NO: vL de C336 5 SEQ ID NO: VH de C334 SEQ ID NO.- vL de C334 SEQ ID NO: 10 VH de C333 SEQ ID NO: vL de C333 SEQ ID NO.- VH de C323 15 SEQ ID NO: VL de C323 SEQ ID NO: VH de C321 SEQ ID NO: 20 vL de C321 SEQ ID NO: VH de C320 SEQ ID NO: vL de C320 25 SEQ ID NO: VH de C319 SEQ ID NO: vL de C319 SEQ ID NO: 30 VH de C320- -3 96: sequência de nucleotideo codificando 97: sequência de nucleotideo codificando 98: sequência de nucleotideo codificando 99: sequência de nucleotideo codificando 100: sequência de nucleotideo codifiçando 101: sequência de nucleotideo codificando 102: sequência de nucleotideo codificando 103: sequência de nucleotideo codificando 104: sequência de nucleotideo codificando 105: sequência de nucleotideo codificando 106: sequência de nucleotideo codificando 107: sequência de nucleotideo codificando 108: sequência de nucleotideo codificando 109: sequência de nucleotideo codificando 110: sequência de nucleotideo codificando SEQ ID NO: 111: sequência de nucleotideo codificando VL de C320-5 SEQ ID NO: 112: sequência de nucleotideo codificando VH de C320-90 SEQ ID NO: 113: sequência de nucleotideo codificando VH de C320-103 SEQ ID NO: 114: sequência de nucleotideo codificando VH de C320-114 SEQ ID NO: 115: sequência de nucleotideo codificando VH de C320-115 SEQ ID NO: 116: sequência de nucleotideo codificando VL de C320-120 SEQ ID NO: 117: sequência de nucleotideo codificando VH de C320-129 SEQ ID NO: 118: sequência de nucleotideo codificando VH de C320-130 SEQ ID NO: 119: sequência de aminoácido de VH de anticorpo humanizado 1B4 SEQ ID NO: 120: sequência de aminoácido de VL de anticorpo humanizado 1B4 SEQ ID NO: 121: sequência de nucleotideo codificando VH de anticorpo humanizado 1B4 SEQ ID NO: 122: sequência de nucleotideo codificando VL de anticorpo humanizado 1B4 SEQ ID NO: 123: sequência de aminoácido de humano TLla (derivado de GenBank Gene adesão no 9966 desde 8 de maios de 2011) SEQ ID NO: 124: sequência dê aminoácido de rato TLla Dominio Extracelular SEQ ID NO: 125: sequência de aminoácido de cinomolgus/Rhesus TLla Extracelular Dominio SEQ ID NO: 126: sequência de aminoácido de camundongo TLla Extracelular Dominio SEQ ID NO: 127: sequência de aminoácido de coelho TLla Extracelular Dominio SEQ ID NO: 128: sequência de aminoácido de guinea Pig TLla Extracelular Dominio SEQ ID NO: 129: sequência de aminoácido de humano
Receptor de Morte 3 (derivado de Genbank Gene Adesão No. 8718 a partir de 8 de maio de 2011) • SEQ ID NO: 130: sequência de aminoácido de humano Receptor chamariz 3 (derivado de Genbank Gene Adesão No. 8771 a partir de 8 de maio de 2011) • SEQ ID NO: 131: sequência de região de TLla SEQ ID NO: 1-32: sequência de região de TLla SEQ ID NO: 133: sequência de região de TLla SEQ ID NO: IgGl região Fc 134: sequência de aminoácido de humano SEQ ID NO: 135: sequência de aminoácido de humano kappa região constante SEQ ID NO: 136: sequência de aminoácido de humano lambda região constante. SEQ ID NO: 137: sequência de aminoácido de VH sequência de consenso de C320 e derivados SEQ ID NO: 138: sequência de aminoácido de VL sequência de consenso de C320 e derivados SEQ ID NO 139: sequência de aminoácido de LCDR1 sequência de consenso de C320 e derivados SEQ ID NO 140: sequência de aminoácido de LCDR2 sequência de consenso de C320 e derivados SEQ ID NO 141: sequência de aminoácido de LCDR3 sequência de consenso de C320 e derivados SEQ ID NO 142: sequência de aminoácido de HCDR2 sequência SEQ de consenso de ID NO 143: C320 e derivados sequência de aminoácido de HCDR3 sequência SEQ de consenso de ID NO: 144: C320 e derivados sequência de aminoácido de HFR1 sequência SEQ de consenso de ID NO: 145: C320 e derivados sequência de aminoácido de HFR2 sequência SEQ de consenso de ID NO: 146: C320 e derivados sequência de aminoácido de HFR3 sequência SEQ de consenso de ID NO: 147: 0320 e derivados sequência de aminoácido de HFR4 sequência SEQ de consenso de ID NO: 148: C320 e derivados sequência de aminoácido de LFR1 sequência SEQ de consenso de ID NO: 149: 0320 e derivados - sequência de aminoácido de LFR2 sequência SEQ de consenso de ' ID NO: 150: 0320 e derivados sequência de aminoácido de LFR3 sequência SEQ de consenso de ID NO: 151: 0320 e derivados sequência de aminoácido de LFR4 sequência SEQ de consenso de ID NO: 152: 0320 e derivados : sequência de aminoácido de VH sequência SEQ de consenso de ID NO: 153: 0320 e derivados : sequência de aminoácido de vL sequência SEQ de consenso de ID NO: 154: 0320 e derivados : sequência de aminoácido de VH compreendendo CDRs de C320 enxertado de FRs de anticorpo 1TZG. SEQ ID NO: 155: sequência de aminoácido de VH compreendendo CDRs de C320 enxertado de FRs de anticorpo 1RHH. SEQ ID NO: 156: sequência de aminoácido de VH compreendendo CDRs de C320 enxertado de FRs de anticorpo 2DD8 . SEQ ID NO: 157: sequência de aminoácido de VH compreendendo CDRs de C320 enxertado de FRs de anticorpo 2JB5. SEQ ID NO: 158: sequência de aminoácido de VH compreendendo CDRs de C320 enxertado de FRs de anticorpo 3FKU. SEQ ID NO: 159: sequência de aminoácido de VH compreendendo CDRs de C320 enxertado de FRs de anticorpo 3GBM. SEQ ID NO: 160: sequência de aminoácido de VH compreendendo CDRs de C320 enxertado de FRs de anticorpo 3LMJ. SEQ ID NO: 161: sequência de aminoácido de VH compreendendo CDRs de C320 enxertado de FRs de anticorpo 3P30. SEQ ID NO: 162: sequência de aminoácido de VH sequência de consenso de C320 e derivados SEQ ID NO: 163: sequência de aminoácido de VL compreendendo CDRs de C320 enxertado de FRs de anticorpo 1RHH. SEQ ID NO: 164: sequência de aminoácido de VL compreendendo CDRs de C320 enxertado de FRs de anticorpo 1TZGL. SEQ ID NO: 165: sequência de aminoácido de VL compreendendo CDRs de C320 enxertado de FRs de anticorpo 2DD8 . SEQ ID NO: 166: sequência de aminoácido de VL compreendendo CDRs de C320 enxertado de FRs de anticorpo 2JB5. SEQ ID NO: 167: sequência de aminoácido de VL compreendendo CDRs de C320 enxertado de FRs de anticorpo 3FKU. SEQ ID NO: 168: sequência de aminoácido de VL compreendendo CDRs de C320 enxertado de FRs de anticorpo 3GBM. SEQ ID NO: 169: sequência de aminoácido de VL compreendendo CDRs de C320 enxertado de FRs de anticorpo 3LMJ. SEQ ID NO: 170: sequência de aminoácido de VL compreendendo CDRs de C320 enxertado de FRs de anticorpo 3P30. SEQ ID NO: 171: sequência de aminoácido de VL compreendendo CDRs de C320 enxertado de FRs de anticorpo 3IYW. SEQ ID NO: 172: sequência de aminoácido de VL sequência de consenso de C320 e derivados SEQ ID NO: 173: sequência de aminoácido de VH sequência de consenso de C320 e derivados SEQ ID NO: 174: sequência de aminoácido de VL sequência de consenso de C320 e derivados SEQ ID NO: 175: sequência de aminoácido de VH de anticorpo C320-162 SEQ ID NO: 176: sequência de aminoácido de VH de anticorpo C320-163 SEQ ID NO: 177: sequência de aminoácido de VH de anticorpo C320-164 SEQ ID NO: 178: sequência de aminoácido de VH de anticorpo C320-165 SEQ ID NO: 179: sequência de aminoácido de VH de anticorpo C320-166 5 SEQ ID NO: 180: sequência de aminoácido de VH de anticorpo C320-167 SEQ ID NO: 181: sequência de aminoácido de VH de anticorpo C320-168 SEQ ID NO: 182: sequência de aminoácido de VH de 10 anticorpo C320-169 SEQ ID NO: 183: sequência de aminoácido de VH de anticorpo C320-170 SEQ ID NO: 184 : sequência de aminoácido de VH de anticorpo 0320-171 15 SEQ ID NO: 185: sequência de aminoácido de VH de anticorpo 0320-172 SEQ ID NO: 186: sequência de aminoácido de VH de anticorpo 0320-179 SEQ ID NO: 187 : sequência de aminoácido de VH de 20 anticorpo 0320-183 SEQ ID NO: 188: sequência de aminoácido de vL de anticorpo C320-162 SEQ ID NO: 189: sequência de aminoácido de VL de anticorpo 0320-163 25 SEQ ID NO: 190: sequência de aminoácido de vL de anticorpo C320-164 SEQ ID NO: 191: sequência de aminoácido de vL de anticorpo 0320-165 SEQ ID NO: 192: sequência de aminoácido de vL de 30 anticorpo C320-166 SEQ ID NO: 193: sequência de aminoácido de VL de anticorpo SEQ C320-167 ID NO: 194 : sequência de aminoácido de vL de anticorpo SEQ C320-168 ID NO: 195: sequência de aminoácido de vL de anticorpo SEQ C320-169 ID NO: 196: sequência de aminoácido de vL de anticorpo SEQ C320-170 ID NO: 197: sequência de aminoácido de vL de anticorpo SEQ C320-171 ID NO: 198: sequência de aminoácido de vL de anticorpo SEQ C320-172 ID NO: 199: sequência de aminoácido de vL de anticorpo SEQ C320-179 ID NO: 200: sequência de aminoácido de vL de anticorpo SEQ C320-183 ID NO: 201: sequência de aminoácido de vL de sequência germinativa IGLVl-40*l SEQ ID NO: 202: sequência de aminoácido de TL1 humano solúvel SEQ ID NO: 203: sequência de aminoácido de N-ligado site de glicosilação em VH de C320 SEQ ID NO: 204: sequência de aminoácido de VH de 1TZG correspondendo para N-ligando site de glicosilação em VH de C320 SEQ ID NO: 205: sequência de aminoácido de peptideo de VH de C320-168 SEQ ID NO: 206: sequência de aminoácido de peptideo de VL de C320-168 ’ SEQ ID NO: 207: sequência de aminoácido de influenza peptideo SEQ ID NO: 208: sequência de aminoácido peptideo de VL de 0320-168 SEQ ID NO: 209: sequência de aminoácido peptideo de VL de C320-168 SEQ ID NO: 210: sequência de aminoácido peptideo de VL de C320-168 SEQ ID NO: 211: sequência de aminoácido peptideo de VL de C320-168 SEQ ID NO: 212: sequência de aminoácido peptideo de VL de C320-168 SEQ ID NO: 213: sequência de aminoácido peptideo de VL de 0320-168 SEQ ID NO: 214: sequência de aminoácido peptideo de VL de C320-168 SEQ ID NO: 215: sequência de aminoácido peptideo de VL de C320-168 SEQ ID NO: 216: sequência de aminoácido peptideo de VL de C320-168 SEQ ID NO: 217: sequência de aminoácido peptideo de VL de C320-168 SEQ ID NO: 218: sequência de aminoácido peptideo de VL de C320-168 SEQ ID NO: 219: sequência de aminoácido peptideo de VL de C320-168 SEQ ID NO: 220: sequência de aminoácido peptideo de VL de 0320-168 SEQ ID NO: 221: sequência de aminoácido peptideo de VL de 0320-168 SEQ ID NO: 222: sequência de nucleotideo VH de anticorpo C320-162 de mutante de mutante de mutante de mutante de mutante de mutante de mutante de mutante de mutante de mutante de mutante de mutante de mutante de mutante codificando SEQ ID NO: 223: sequência de nucleotideo codificando VH de anticorpo C320-163 SEQ ID NO: 224: sequência de nucleotideo codificando VH de anticorpos C320-164, C320-165, C320-166 e C320-167. SEQ ID NO: 225: sequência de nucleotideo codificando VH de anticorpos C320-168 e C320-169 SEQ ID NO: 226: sequência de nucleotideo codificando VH de anticorpos C320-170 e C320-172 SEQ ID NO: 227: sequência de nucleotideo codificando VH de anticorpos C320-179 e C320-183 SEQ ID NO: 228: sequência de nucleotideo codificando VL de anticorpos C320-162, C320-163, C320-167 e 0320-169. SEQ ID NO: 229: sequência de nucleotideo codificando VL de anticorpo C320-164 - SEQ ID NO: 230: sequência de nucleotideo codificando VL de anticorpos 0320-165, C320-168 e C320-170. SEQ ID NO: 231: sequência de nucleotideo codificando VL de anticorpo C320-166 SEQ ID NO: 232: sequência de nucleotideo codificando VL de anticorpos C320-172 e C320-179 SEQ ID NO: 233: sequência de nucleotideo codificando VL de anticorpo C320-183 SEQ ID NO: 234: sequência de aminoácido de C320-13 e C320-22 SEQ ID NO: 235: sequência de aminoácido de consenso de HCDR3 de C320 e derivados
Definições Selecionadas
Para o propósito de nomenclatura e não para limitação da sequência de aminoácido de humano TLla está estabelecida na SEQ ID NO: 123. Sequências adicionais a de TLla humano estão estabelecidas em Genbank Gene Adesão No. 9966. Adequadamente, em um exemplo, a sequência de aminoácido de humano TLla compreende uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 123. Outras isoformas de TLla foram descritos: 72-251 (Posição 72 a 251 de SEQ ID No: 123), 84-251 (Posição 84 a 251 de SEQ ID No: 123); 101-251 ou VEGI-174 (Posição 101 a 251 de SEQ ID No: 123) e 86-251 ou VEGI-192 (Posição 86 a 251 na SEQ ID No: 123) . A sequência do dominio extracelular de TLla de várias espécies é conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1 (aminoácidos 16 a 184; humano), SEQ ID NO: 124 (rato), SEQ ID NO: 125 (cinomolgo/macaco hesus), SEQ ID NO: 126 (camundongo), SEQ ID NO: 127 (coelho) e SEQ ID NO: 128 (porco da india) . Formas gerais de TLla um homotrimer em um sujeito e sinaliza através de DR3. Proteinas exemplares ligando TLla da divulgação ligam para ou ligam especificamente para humano TLla (abreviado neste documento como TLla humano), incluindo formas recombinantes destes.
Para o propósito de nomenclatura e não limitação, uma sequência de um humano DR3 é conforme estabelecido na SEQ ID NO: 129. Sequências adicionais a partir de humano DR3 estão estabelecidas em Genbank Gene Adesão No. 8718. Em um exemplo, DR3 englobado pela presente divulgação é humano DR3 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 129.
Para o propósito de nomenclatura e não limitação, uma sequência de um humano DcR3 é conforme estabelecido na SEQ ID NO: 130. Sequências adicionais a partir de humano DcR3 estão estabelecidas em Genbank Gene Adesão No. 8771. Em um exemplo, DcR3 englobado pela presente divulgação é humano DcR3 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 130. O termo "proteína isolada" ou "polipeptideo isolado" é entendido para significar uma proteína ou polipeptídeo que em virtude de sua origem ou fonte de derivação não é associada com componentes associados naturalmente que acompanham em seus estados nativo; é substancialmente livre de outras proteínas da mesma fonte. A proteína pode ser apresentada substancialmente livre de componentes naturalmente associados ou substancialmente purificado por isolação, usando técnicas de purificação de proteína conhecida na matéria. Por "substancialmente purificado" significa que uma proteína é substancialmente livre de agentes de contaminação, exemplo, pelo menos cerca de 70% ou 75% ou 80% ou 85% ou 90% ou 95% ou 96% ou 97% ou 98% ou 99% livre de agentes de contaminação. O termo "recombinante" será entendido para significar o produto de artificial recombinação genética. De acordo, com o contexto de uma proteína recombinante compreendendo um domínio de ligação de antigeno, este termo não engloba um anticorpo ocorrendo naturalmente no interior do corpo do sujeito que é o produto de natural recombinação que ocorre durante maturação de célula B. Entretanto, se cada um dos anticorpo é isolado, é para ser considerado uma proteína isolada compreendendo um domínio de ligação de antigeno. Similarmente, se o ácido nucléico codificando uma proteína é isolado e expresso usando meios recombinantes, uma proteína resultante é uma proteína recombinante compreendendo um anticorpo de domínio de ligação de antigeno. A proteína recombinante também engloba uma proteína expressa por meios recombinantes artificiais quando está dentro de uma célula, tecido ou sujeito, exemplo, em que é expressa. O termo "Proteina de ligação TLla" deve ser tomada para incluir uma simples cadeia de polipeptideo (isto é, uma série de contiguos aminoácidos ligados por ligação de peptideo) , ou uma série de cadeias de polipeptideo covalentemente ou não covalentemente ligada para uma outra (isto é, um polipeptideo complexo) capaz de ligar para TLla na maneira descrita e/ou reivindicada neste documento. Por exemplo, as séries de cadeias de polipeptideo podem ser covalentemente ligadas usando uma adequada ligação quimica ou um dissulfeto. Exemplos de ligações não covalentes incluem ligações de hidrogênio, ligações iônicas, forças de Van der Waals, e interações hidrofóbicas. O termo "polipeptideo" ou "cadeia de polipeptideo" Será entendido a partir do parágrafo precedente para significar uma série de aminoácidos contiguos ligados por ligações peptidicas. Como usado neste documento, o termo "dominio de ligação de antigeno" será tomado para significar uma região de um anticorpo que é capaz de especificamente ligar para um antigeno, isto é, um VH ou um VL ou um Fv compreendendo ambos um VH e um VL. O dominio de ligação de antigeno não precisa estar no contexto de um anticorpo inteiro, exemplo, pode ser em isolação (exemplo, um anticorpo de dominio) ou em outra forma, exemplo, a partir dos descritos neste documento, tal como um scFv.
Para o propósito da presente divulgação, o termo "anticorpo" inclui uma proteina capaz de especificamente ligar para um ou alguns antigenos estreitamente relacionados (exemplo, TLla) em virtude de um dominio de ligação de antigeno contido dentro de um Fv. Este termo inclui quatro cadeias de anticorpos (exemplo, duas cadeias leves e duas cadeia pesadas), anticorpos recombinantes ou modificados (exemplo, anticorpos quiméricos, anticorpo humanizados, anticorpos humano, anticorpos enxertados CDR, anticorpos privatizados, anticorpos desimunizado, anticorpo sinhumanizados, meio-anticorpos, anticorpos biespecifico). Um anticorpo geralmente compreende dominio constante, que pode ser organizado em uma região constante ou fragmento constante ou fragmento cristalizado (Fc) . Formas exemplares de anticorpos compreendem uma estrutura de quatro cadeias como suas unidades básicas. Anticorpos de comprimento total compreendem duas cadeia pesadas (~50 a 70 kD) covalentemente ligadas e duas cadeias leves (—23 kDa cada). Uma cadeia leva geralmente compreendendo uma região variável- (se presente) e um dominio constante e em mamíferos é uma cadeia leve K OU uma cadeia leve À. A cadeia pesada geralmente compreende uma região variável e um ou dois domínios constante(s) ligado para a região de dobradiça para dominio constante(s) adicional. Cadeias pesada de mamíferos são de um dos seguintes tipos α, δ, e, Y, ou μ. Cada cadeia leve é também covalentemente ligada para uma das cadeias pesadas. Por exemplo, as duas cadeias pesadas e as cadeias pesada e leve são mantidas juntas por ligação de dissulfeto inter cadeias e por interações não covalentes. 0 número de ligações de dissulfeto entre cadeias pode variar entre diferentes tipos de anticorpos. Cada cadeia tem uma região variável N-terminal (VH ou VL caracterizado por: cada uma terem aproximadamente 110 aminoácidos no comprimento) e um ou mais ’dominios constantes no C- terminus. O dominio constante da cadeia leve (CL que é aproximadamente 110 aminoácidos no comprimento) é alinhado e o dissulfeto ligado para o primeiro dominio constante da cadeia pesada (CH1 que é 330 a 440 aminoácidos no comprimento). A região variável de cadeia leve é alinhada com a região variável da cadeia pesada. A cadeia pesada de anticorpo pode compreender 2 ou mais adicionais Dominios CH (tal como, CH2, CH3 e semelhantes) e pode compreender uma região de dobradiça entre os dominio constantes CH1 e CH2. Os Anticorpos podem ser de qualquer tipo (exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, e IgY) , classe (exemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi e IgA2) ou subclasses. Em um exemplo, o anticorpo é um anticorpo de murino (rato ou camundongo) ou um anticorpo de primata (tal como, humano). Em um exemplo na cadeia pesada de anticorpo falta um residue de lisina C-terminal. Em um exemplo, o anticorpo é humanizado, sinhumanizado, quimérico, enxertado com CDR ou desimunizado.
Como usado neste documento, "região variável" refere-se para as porções da cadeia leve e/ou pesada de um anticorpo como definido neste documento que é capaz de especificamente ligar para um antigeno e, inclui sequência de aminoácidos de regiões determinantes complementaridade (CDRs); isto é, CDR1, CDR2, e CDR3, e regiões de framework (FRs) . Por exemplo, a região variável compreende três ou quatro FRs (exemplo, FR1, FR2, FR3 e opcionalmente FR4) juntos com três CDRs. VH refere-se para a região variável da cadeia pesada. VL refere-se para a região da cadeia leve.
Como usado neste documento, o termo "regiões determinantes de complementaridade" (syn. CDRs; isto é, CDR1, CDR2, e CDR3) refere-se para os residues de aminoácido de um região variável de anticorpo a presença dos quais são maiores contribuidores para antigeno de ligação especifica. Cada dominio de região variável (VH ou VL) tipicamente tem três CDR regiões identificada como CDR1, CDR2 e CDR3. Em um exemplo, as posições de aminoácido atribuídas para CDRs e FRs são definidas de acordo Kabat Sequences of Proteínas of Imunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 e 1991 (também referidos neste documento como "o sistema de numeração Kabat"). Em outro exemplo, as posições de aminoácido atribuídas para CDRs e FRs são definidas de acordo com aprimorado esquema de numeração Chothia (http://www.bioinfo.org.uk/mdex.html). De acordo com o sistema de numeração Kabat, VH FRs e CDRs são posicionados como segue: residuos 1 a 30 (FR1), 31 a 35 (CDR1), 36 a 49 (FR2), 50 a 65 (CDR2), 66 a 94 (FR3), 95 a 102 (CDR3) er 103 a 113 (FR4). De acordo com o sistema de numeração Kabat, VL FRs e CDRs são posicionados como segue: residuos 1 a 23 (FR1), 24 a 34 (CDR1), ’35 a 49 (FR2), 50 a 56 (CDR2), 57 a 88 (FR3), 89 a 97 (CDR3) e 98 a 107 (FR4). A presente divulgação não é limitada para FRs e CDRs como definido pelo sistema de numeração Kabat, mas inclui todos os sistemas de numeração, incluindo o sistema de numeração canônico ou de Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917, 1987; Chothia et al., Nature 342: 877-883, 1989; e/ou Al- Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273: 927-948, 1997; o sistema de numeração de Honnegher e Plükthun J. Mol. Biol. 309: 657-670, 2001; ou o sistema IMGT discutido em Giudicélulai et al., Ácido nucléicos Res. 25: 206-211 1997. Em um exemplo, os CDRs são definidos de acordo com o sistema de numeração Kabat. Opcionalmente, a cadeia pesada CDR2 de acordo com o sistema de numeração Kabat nãó compreender os cinco aminoácidos C-terminal listados neste documento ou qualquer um ou mais destes aminoácidos são substituidos com outros aminoácido de ocorrência natural. Em uma adicional, ou alternativa, opção, a cadeia leve CDR1 não compreender os quatro aminoácidos N-terminal listados neste documento ou qualquer um ou mais destes aminoácidos são substituidos com outro aminoácido de ocorrência natural. A este respeito, Padlan et al., FASEB J.r 9: 133-139, 1995 estabelece que os cinco aminoácidos C-terminal da cadeia pesada CDR2 e/ou os quatro aminoácidos N- terminal de cadeia leve CDR1 não são geralmente envolvidas em ligação de antigeno. "Regiões de Framework" (FRs) são estes residuos de região variável outro que o residuo CDR.
Como usado neste documento, o termo "Fv" pode ser usado para significar qualquer proteina, que compreende polipeptideos de múltiplos ou um polipeptideo simples, com um VL e um VH associados e forma um complexo tendo um dominio de ligação de antigeno, isto é, capaz de especificamente ligarem para um antigeno. O VH e o VL que formam o dominio de ligação de antigeno podem ser em uma cadeia simples de polipeptideo ou em cadeias diferente de polipeptideo. Além disso, um Fv da divulgação (tanto quanto qualquer proteina da divulgação) pode ter dominios múltiplos de ligação de antigeno que pode ou não ligar o mesmo antigeno. Este termo será entendido para englobar fragmentos diretamente derivados de um anticorpo tanto quanto proteinas correspondendo para tal um fragmento produzido usando meios recombinantes. Em alguns exemplos, o VH não é ligada para uma cadeia pesada de dominio constante (CH) 1 e/ou o VL não é ligada para uma cadeia leve de dominio constante (CL) . Exemplar Fv contendo polipeptideos ou proteinas incluem um fragmento Fab, um fragmento Fab, um fragmento F(ab'), um scFv, um diacorpo, um triacorpo, um tretacorpo ou complexo de alta ordem, ou qualquer dos acima mencionados ligados para uma região constante ou Dominio destes, exemplo, Dominio CH2 ou CH3, exemplo, um minicorpo. Um "Fragmento Fab" consistindo de uma ligação de fragmento de antigeno monovalente de um anticorpo, e pode ser produzido por digestão de em anticorpo completo com a enzima papain, para render um fragmento consistindo de uma cadeia leve intacta e uma porção de uma cadeia pesada ou pode ser produzido usando meios recombinantes. Um "Fragmento Fab" de um anticorpo pode ser obtido por tratamento de um anticorpo completo com pepsin, seguido por redução, para render uma molécula consistindo de uma cadeia leve intacta e uma porção de uma cadeia pesada compreendendo um VH e um dominio constante simples. Os dois fragmentos Fab são obtidos por anticorpo tratado nesta maneira. Um fragmento Fab pode também ser produzido por meios recombinantes. Um "fragmento F(ab’)2" de um anticorpo consiste de um dimer de dois fragmentos Fab ligados juntos por duas ligações de dissulfeto, e é obtido por tratamento de uma molécula de anticorpo completo com a enzima pepsin, sem subsequente redução. Um fragmento "Fab2z/ é um fragmento recombinante compreendendo dois fragmentos Fab ligados usando, por exemplo uma leucina zipper ou um Dominio CH3. Uma "cadeia simples Fv" ou "scFv" é uma molécula recombinante contendo a região de fragmento variável (Fv) de um anticorpo em que uma região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada são covalentemente ligadas por uma adequada, ligação flexivel de polipeptideo.
Como usado neste documento, o termo "ligar" em referência para a interação de uma proteina de ligação TLla ou um dominio de ligação de antigeno deste com um antigeno significa que a interação é dependente da presença de uma 5 particular estrutura (exemplo, um determinante antigênico ou epitopo) no antigeno. Por exemplo, um anticorpo reconhece e liga para uma especifica estrutura de proteina em vez de proteínas gerais. Se um anticorpo liga para epitopo "A", a presença de uma molécula contendo epitopo 10 "A" (ou livre, não rotulada "A") , em uma reação contendo rotulada "A" e o anticorpo, reduzirá a quantidade de rotulado "A" limite para o anticorpo.
Como usado neste documento, o termo "especificamente ligar" ou "ligar especificamente " deve ser entendido que 15 uma proteina da divulgação reage ou associa mais frequentemente, mais rapidamente, com maior duração e/ou com maior afinidade com um particular antigeno ou célula expressando o mesmo que do com alternativos antigenos ou células. Por exemplo, uma proteina que especificamente liga 20 para um antigeno que liga antigeno com maior afinidade, avidez, mais prontamente, e/ou com maior duração que liga para outros antigenos. Por exemplo, uma proteina liga para TLla (exemplo, TLla humano) com materialmente maior afinidade que para outras superfamilia e ligandos TNF ou 25 para antigenos comumente reconhecido por anticorpos poli reativos naturais (isto é, por anticorpos de ocorrência natural que sabe ligar uma variedade de antigenos que se encontra naturalmente em humanos)’. Também é entendido por leitura desta definição que, por exemplo, uma proteina que ' 30 especificamente liga para um primeiro antigeno pode ou não especificamente ligar para um segundo antigeno. Como tal, "ligação especifica" não necessariamente requer ligação exclusiva ou ligação não detectável de outro antigeno, isto é o significado do termo "ligação seletiva". Em um exemplo, "ligação especifica" de uma proteina de ligação TLla da divulgação para um antigeno, significa que uma proteina liga para o antigeno com um equilíbrio constante (KD) de lOOnM ou menor, tal como 50nM ou menor, por exemplo, 20nM ou menor, tal como, 15nM ou menor ou lOnM ou menor ou 5nM ou menor.
Como usado neste documento, o termo "ligação não detectável" será entendido para significar que uma Proteina de ligação TLla, exemplo, um anticorpo, liga para um antigeno candidato a uma nível menor que 20%, ou 10% ou 6% ou 5% acima da- referência. A referência pode ser o nivel do sinal de ligação detectado na ausência da proteína de ligação TLla e/ou na presença de uma proteína de controle negativo (exemplo, um anticorpo de controle de isotipo) e/ou o nível de ligação detectável na presença de um antígeno de controle negativo. O nível de ligação é detectado, por exemplo, usando ELISA em que um antígeno é imobilizado e contactado com uma Proteína de ligação TLla.
Como usado neste documento, o termo " epitopo" (syn. "antigênico determinante") será entendido para significar uma região de TLla para qual uma proteína compreendendo um domínio de ligação de antígeno se liga para um anticorpo. Este termo não é necessariamente limitado para os resíduos específica ou estrutura para qual a proteína faz contato. Por exemplo, este termo inclui a região abrangendo aminoácidos contactado pela proteína e/ou pelo menos 5 a 10 ou 2 a 5 ou 1 a 3 ’aminoácidos fora desta região. Em alguns exemplos, o epitopo é uma série linear de aminoácidos. Um epitopo pode também compreender uma séries de descontínuos aminoácidos que são posicionados próximo de outro quando TLla é dobrado, isto é, uma " epitopo conformacional". O experiente também estará ciente que o termo " epitopo" não é limitado para peptídeos ou polipeptídeos. Por exemplo, o termo " epitopo" inclui agrupamentos de superfícies quimicamente ativas de moléculas tal como cadeias laterais de açúcar, cadeias laterais de fosforil, ou cadeias laterais de, e, em certos exemplos, pode ter específicas características de três estruturas dimensiona, e/ou específica características de carga. Um epitopo ou peptideo ou polipeptídeo compreendendo o mesmo pode ser administrado para um animal para gerar anticorpos contra o epitopo. -
Como usado neste documento, o termo "inibir interação de TLla e DR3" será entendido para significar que em um ensaio para medir a ligação de TLla e DR3, uma proteína é capaz de inibir 50% de ligação (isto é, tem um EC5O) de menos que cerca de 13nM, por exemplo, menor que cerca de lOnM, tal como menor que cerca de 7nM, exemplo, menor que cerca de 5nM, por exemplo, menor que cerca de 3nM.
Como usado neste documento, o termo "não inibe interação de TLla e DcR3" será entendido para significar que uma proteína de ligação TLla descrita neste documento não inibe interação de TLla e DcR3 (isto é, tal que interação não é detectável), exemplo, usando um ensaio ELISA descrito neste documento). Por exemplo, a uma concentração de 100μg/ml, a proteína não inibe completamente interação de TLla e DcR3. Em alguns exemplos, a proteína reduz a interação de TLla e DcR3 para menos que cerca de 20% ou 15% ou 10%, exemplo, quando testada a uma concentração de 10μg/ml ou 100μg/ml.
Como usado neste documento, o termo "redução não detectável" será entendido para significar que uma proteina das descritas neste documento reduz ligação de TLla (ou uma forma biotinilatado destas) para DcR3 por não mais que 20% ou 8% ou 6% ou 5% ou 4% ou 3% ou 2% acima do nivel de interação na ausência da proteina ou acima do nivel de referência de interação, quando testado a uma concentração de 10μg/ml ou 100μg/ml. A referência pode ser o nivel do sinal de ligação detectado na ausência da proteina e/ou na presença de uma proteina de controle negativo (exemplo, um anticorpo de controle de isotipo).
Como usado neste documento, o termo "neutralizar" deve ser entendido como uma proteina de ligação TLla é capaz de reduzir ou prevenir atividade mediada por TLla em uma célula. Métodos para determinar neutralização são conhecidos na matéria e/ou descritos neste documento. Por exemplo, células TF-1 são contactado com TLla, tal como humano TLla (exemplo, expressada por uma célula mamifera) e cicloheximida na presença ou ausência da proteina de ligação TLla. Uma proteina de ligação TLla que reduz o nivel de apoptose das células comparado com o nivel na ausência da proteina é considerado para "neutralizar" atividade TLla.
Como usado neste documento, o termo "condição" refere-se para um rompimento de ou interferência com a função normal, e não é para ser limitado para qualquer especifica condição, e incluirá doenças ou desordens.
Como usado neste documento, uma "Condição associada a TLla" refere-se para qualquer condição que é causada por ou associada com TLla ou uma célula expressando TLla. O experiente na matéria será prontamente capaz de determine tais condições baseado na divulgação neste documento e/ou por realizar um ensaio para diagnostica uma condição associada a TLla das descritas neste documento. A este respeito, em alguns exemplos a condição é uma condição inflamatória, uma condição autoimune e uma condição que pode ser tratada por melhora de angiogénese. Uma descrição de condições exemplares é incluida neste documento.
Como usado neste documento, o termo "prevenir", "evitar" ou "prevenção" inclui administrar uma proteina da divulgação para assim parar ou impedir o desenvolvimento de pelo menos um sintoma de a condição. Este termo também engloba tratamento de um sujeito em remissão para prevenir ou dificulta recaida. Por exemplo, um sujeito sofrendo de recaida remitente de esclerose múltipla é tratado durante remissão para assim prevenir uma recaida.
Como usado neste documento, o termos "tratando", "tratar" ou "tratamento" inclui administrar uma proteina descrita neste documento para assim reduzir ou eliminar pelo menos um sintoma de uma doença ou condição especifica.
Como usado neste documento, o termo "sujeito" será tomado para significar qualquer animal, tal como, um mamifero. Em um exemplo, o mamifero é um humano ou primata não humano. Em um exemplo, o mamifero é um humano.
A referência neste documento para uma "amostra" será entendido como uma referência para qualquer amostra derivada de um sujeito tal como, mas não limitado para, um liquido do corpo (exemplo, sangue ou fração de sangue tal como soro ou plasma, lágrima, urina, liquido sinovial ou liquido cerebroespinhal) , material celular (exemplo tecido aspirado), amostra de tecido biópsia ou espécimes cirúrgicas. Em alguns exemplos, a "amostra" é qualquer um ou mais de soro, plasma, PBMCs, ou uma fração de creme leucocitário
Como usado neste documento, o termo "diagnóstico", e variantes desta tal como, mas não limitado para, "diagnóstico", "diagnosticado" ou "diagnosticando" inclui qualquer diagnóstico primário de um estado clinico ou diagnóstico de doença recorrente. "Prognóstico", "prognosticando" e variantes destas como usado neste documento refere-se para par ao resultado provável ou curso de uma doença, incluindo a chance de recuperação ou recorrência ou o resultado do tratamento.
O termo "construção de expressão" é para ser usado no contexto amplo e inclui um ácido nucléico compreendendo um ou mais sequências de promotor ligado operacionalmente com um ou mais ácido nucléicos como descrito neste documento.
O termo "vetor de expressão" refere-se para um ácido nucléico compreendendo uma construção de expressão que é adicionalmente capaz de manter e ou replicar ácido nucléico em uma formato exprimivel. Por exemplo, uma vetor de expressão pode compreender um plasmideo, bacteriófago, fagomideo, cosmideo, fragmento de virus sub-genômico ou genômico. A seleção de vetores apropriados está dentro do conhecimento dos experientes na matéria.
Como usado neste documento, o termo "promotor" é para ser usado 'no contexto amplo e inclui a sequência transcricional regulatória com um gene genônico, incluindo o TATA box ou elemento iniciador, que é requerido para apurar iniciação de transcrição, com ou sem adicionais elementos regulatórios (exemplo, sequências de ativação upstream, sites de ligação de fator de transcrição, intensificadores e silenciadores) que altera expressão de um ácido nucléico, exemplo, em resposta para um desenvolvimento e/ou estimulo externo, ou de uma maneira especifica do tecido. No contexto presente, o termo "promotor" é também usado para descrever um ácido nucléico recombinante, sintético ou fusão, ou derivados que conferem ativar ou aumentar a expressão de um ácido nucléico para o qual é ligado operacionalmente. Um promotor exemplar promotor pode conter adicional cópias de um ou mais específicos elementos regulatórios para aumentar ainda mais a expressão e/ou alterar a expressão espacial ou temporal do referido ácido nucléico.
Como usado neste documento, o termo "ligado operacionalmente para" significa posicionando um promotor relativo para um ácido nucléico tal que a expressão do ácido nucléico é controlada pelo promotor. Um promotor pode ser ligado operacionalmente para numerosos ácidos nucléicos, exemplo, através de um site de entrada de interna de ribossomo.
Proteínas Compreendendo Anticorpo de Domínios de Ligação de Antigeno Anticorpos Métodos Baseado em Imunização
Para gerar anticorpos, TLla ou um fragmento transportando epitopo ou porção deste ou uma forma modificada destes (exemplo, uma proteina de fusão compreendendo a humano epitopo dentro de uma proteína TLla dè rato) ou ácido nucléico codificando a mesma, opcionalmente formulado com qualquer adequado ou desejado adjuvante e/ou transportador aceitável farmaceuticamente, é administrado para um sujeito (por exemplo, sujeito animal não humano, tal como, um rato, um camundongo, uma galinha etc.) na forma de uma composição injetável. Exemplares animais não humanos são mamiferos, tal como animais murinos (exemplo, ratos ou camundongo). Injeção pode ser intranasal, intramuscular, subcutânea, intravenosa, intradermal, intraperitoneal, ou por outra rota conhecida. Opcionalmente, o TLla ou fragmento transportando epitopo ou porção deste ou um ácido nucléico codificando o mesmo é administrado várias vezes. Meios para preparar e caracterizar anticorpos são conhecidos na matéria (Ver, exemplo Anticorpos: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). -
A produção de anticorpos policlonais pode ser monitorada por amostra de sangue do animal imunizado em várias pontos seguindo imunização. Uma segundo, injeção de reforço, pode ser dada, se requerido para atingir uma concentração de anticorpo desejado. O processo de reforço e concentração é repetido até uma adequada concentração ser melhorada. Quando um desejado nível de imunogenicidade é obtido, o animal imunizado é sangrado e o soro isolado e armazenado, e/ou o animal é usado para gerar anticorpos monoclonais (mAbs).
Anticorpos Monoclonais são exemplares anticorpos contemplados pela presente divulgação. Geralmente, produção de monoclonal anticorpos envolve, imunizar um sujeito (exemplo, um roedor, exemplo, rato ou camundongo) com TLla ou um fragmento transportando epitopo ou porção deste ou um ácido nucléico codificando o mesmo sob condições suficientes para estimular as células produtoras de anticorpo. Em alguns exemplos, um rato geneticamente projetado para expressar proteinas de imunoglobulina humana e não expressar proteinas de imunoglobulina de murino, é imunizado para produzir um anticorpo (exemplo, a como de descritos em PCT/US2007/008231 e/ou Lonberg et al., Nature 368: 856-859, 1994). Seguindo imunização, células somáticas produtoras de anticorpo (exemplo, B linfocitos) são fundido com células imortais, exemplo, células imortais de mieloma. Vários métodos para produzir tais células fundidas (hibridomas) são conhecidas na matéria e descritas, por exemplo, em Kohler and Milstein, Nature 256: 495-497, 1975. As células de hibridoma pode então ser cultivadas sob condições suficientes para a produção de anticorpos.
A presente divulgação contempla outro métodos para produzir anticorpos, exemplo, tecnologia ABL-MYC (a partir do descrito, por exemplo, em Largaespada et al., Curr. Top. Microbiol. Imunol, 166: 91-96, 1990).
Anticorpos adequados são então selecionados baseado nos métodos descritos neste documento.
Métodos baseados em Biblioteca
A presente divulgação também engloba triagem de biblioteca de anticorpos ou proteinas compreendendo dominios de ligação de antigeno destes (exemplo, compreendendo regiões variáveis destes) para identificar uma proteina de ligação TLla da divulgação.
Exemplos de biblioteca contempladas por esta divulgação incluem biblioteca naive (de sujeitos inconteste), biblioteca imunizado (de sujeitos imunizado com um antigeno) ou biblioteca sintética. Ácidos nucléicos codificando anticorpos ou regiões deste (exemplo, região variável) são clonados por técnicas convencionais (exemplo,
como descrito em Sambrook e Russell, eds, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed, vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) e usado para codificar e mostrar proteinas usando um método conhecido na matéria. Outras técnicas para produção de biblioteca de proteinas são descritas, por exemplo, em US 6300064 (exemplo, a HuCAL biblioteca de Morphosys AG); US 5885793; US 6204023; US 6291158; ou US 6248516.
As proteinas de ligação TLla de acordo com a divulgação podem ser proteinas solúveis secretadas ou pode ser apresentada como uma proteina de fusão na superficie de uma célula, ou particula (exemplo, um fago ou outro virus, um ribossomo ou um spore). Vários formatos de exibição de biblioteca são conhecidos na matéria. Por exemplo, a biblioteca é biblioteca de exibição in vitro (exemplo, uma biblioteca de exibição de ribossomo, uma biblioteca de exibição de covalente ou uma biblioteca de exibição de mRNA, exemplo, como descritos em US 7270969) . Em ainda outro exemplo, a biblioteca de exibição é uma biblioteca de exibição de fago caracterizado por: proteinas compreendendo dominios de ligação de antigeno de anticorpos serem expressas em fage, exemplo, a partir dos descritos em US 6300064; US 5885793; US 6204023; US 6291158; ou US 6248516. Outros métodos de exibição de fago são conhecidos na matéria e são contemplados pela presente divulgação. Similarmente, métodos de exibição de célula são contemplados pela divulgação, exemplo, biblioteca de exibição de bactéria, exemplo, a partir dos descritos em US 5516637; biblioteca de exibição de levedura, exemplo, a partir dos descritos em US 6423538 ou uma biblioteca de exibição de mamiferos.
Os métodos para o rastreio de bibliotecas de exibição são conhecidos na matéria. Em um exemplo, a biblioteca de exibição da presente divulgação é rastreada usando purificação por afinidade, exemplo, a partir dos descritos no Escopo (In: Proteina purification: principles and practice, Third Edition, Springer Verlag, 1994). Métodos de purificação por afinidade tipicamente envolve contatar proteinas compreendendo dominios de ligação de antigeno exibição por biblioteca com um antigeno alvo (exemplo, TLla) e, seguindo lavagem, elução destes dominios que permanecem limite para o antigeno.
Qualquer região variável ou scFvs identificado por rastreamento são prontamente modificadas dentro de um anticorpo completo, se desejado. Métodos exemplares para modificação ou reformatação de região variável ou scFvs em um anticorpo completo são descritos, por exemplo, em Jones et al., J. Imunol. Method 354: 85-90, 2010; ou Jostock et al., J. Imunol. Method, 289: 65-80, 2004. Alternativamente, ou adicionalmente, métodos padrões de clonagem são usados, exemplo, a partir dos descritos em Ausubel et al., (In: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987), e/ou (Sambrook et al., (In: Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001).
Proteínas de Ligação de Desimunizado, Quimérico, Enxerto de CDR, Humanizado, Sinhumanizsdo, Primatizado, Humano e Combinação de TLla
As proteínas de ligação TLla da presente divulgação podem ser proteinas de enxerto de CDR que incluem CDRs de um anticorpo de uma espécie não humana (exemplo, rato ou
camundongo ou primata não humano) enxertado de ou inserido no FRs de um anticorpo humano ou que inclua CDRs de um anticorpo de um tipo de anticorpo (exemplo, um tipo de anticorpo humano) enxertado de ou inserido no FRs de outro tipo de anticorpo (exemplo, outro tipo de anticorpo humano). Este termo também engloba uma proteina composta compreendendo, por exemplo, um ou mais regiões variáveis de enxerto de CDR e um ou mais, exemplo, regiões variáveis de humano, regiões variáveis de quimérico, regiões variáveis de sinhumanizado ou regiões variáveis de primatizado. Tais proteinas são exemplificadas neste documento pelos anticorpos designados de C320-16 a C320-33.
As proteinas de ligação TLla da presente divulgação pode ser uma proteina humanizada.
O termo "proteina humanizada" será entendida para referir-se para uma proteina compreendendo uma região variável como humana, que inclui CDRs de um anticorpo de uma espécie não humana (exemplo, rato ou camundongo ou primata não humano) enxertado de ou inserido em FRs de um anticorpo humano (este tipo de anticorpo é também referido como um "anticorpo de enxerto de CDR"). Proteinas humanizadas também incluem proteinas em que um ou mais resíduos da proteina humana são modificados por um ou mais substituições de aminoácido e/ou um ou mais residues de FR da proteina humana são recolocados para correspondentes resíduos não humano. Proteina humanizadas podem também compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo humano ou no anticorpo não humano. Qualquer regiões da proteina adicional (exemplo, região Fc) são geralmente humana. Humanização pode ser realizada usando um método conhecido na matéria, exemplo, US 5225539, US 6054297, US 7566771 ou US 5585089. O termo "proteina humanizada" também engloba uma proteina super-humanizada, exemplo, a partir do descrito em US 7732578. Tais termos também englobam um composto de proteina compreendendo, por exemplo, uma ou mais região variável humanizada e um ou mais, exemplo, região variável humana, região variável quimérica, região variável sinhumanizada ou região variável primatizada.
Em um exemplo, uma proteina humanizada ligando TLla compreende as regiões entre 27d e 34, 50 e 55, e 89 e 96 em uma sequência de cadeia leve descrita neste documento; e 31 e 35b, 50 e 58, e 95 e 101 em uma sequência de cadeia pesada descrita neste documento (numerada de acordo com o sistema de numeração Kabat). Neste respeito, Padlan et al., FASEB J. , 9: 133-139, 1995 apresenta evidencia que estas regiões são aquelas com mais proteina quimérica para ligar ou contatar antigeno.
As proteinas de ligação TLla da presente divulgação podem ser proteinas humanas. O termo "proteina humana" com usado neste documento refere-se para proteinas tendo variável e, opcionalmente, regiões constante de anticorpo encontrada em humanas, exemplo no germinal humano ou células somáticas ou de biblioteca produzida usando tais regiões. Os anticorpos "humanos" podem incluir residues de aminoácido não codificados por sequências humana, exemplo mutações introduzidas por mutações dirigidas aleatórias ou a local in vitro (em particular mutações que envolve substituições conservativas ou mutações em um número pequeno de residues da proteina, exemplo in 1, '2, 3, 4 ou 5 dos residues da proteina). Estes "anticorpo humanos" não necessariamente necessários para ser gerado como um resultado de uma resposta imune de um humano, preferencialmente, eles podem ser gerados usando meios recombinantes (exemplo, varredura de uma biblioteca de exibição de fago ) e/ou por um animal transgênico (exemplo, um rato) compreendendo ácido nucléico codificando anticorpo humano de região constante de e/ou variável usando seleção guiada (exemplo, a partir das descrições em US 5565332). Este termo também engloba formas de afinidade maturada de tais anticorpos. Para o propósito da presente divulgação, uma proteina humana também será considerada para incluir uma proteina compreendendo FRs de um anticorpo humano ou FRs compreendendo sequências de uma sequência de consenso de humano FRs e na qual um ou mais dos CDRs são randômico ou semi-randômico, exemplo, como descrito em US 6300064 e/ou US 6248516. -
Exemplares proteina humanas ligando TLla são anticorpos compreendendo os seguindo pares de região variável: (i)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 6; (ii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 10 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 14; (iii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 18 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 22; (iv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 26 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 30; (v) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 34 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO:38; (vi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (vii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 50 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 54; (viii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 58 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (ix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (x) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 66 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (xi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 70 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (xii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 74 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (xiii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 78 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (xiv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 58 e um VL compreendendo uma (xv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 86 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xvi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 90 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; . (xvii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 58 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 62; (xviii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 154 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 164; (xix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 155 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 163; (xx) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 156 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 165; (xxi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 157 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 166; (xxii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 158 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 167; (xxiii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 159 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 168; (xxiv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 160 e um VL compreendendo uma (xxv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 161 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 170; (xxvi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 234 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 169; (xxvii) um VH . compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 154 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxviii)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 155 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 156 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxx) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 157 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxxi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 158 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxxii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 159 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxxiii)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 160 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; ’(xxxiv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 161 e um VL compreendendo uma (xxxv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 234 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxxvi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 164; (xxxvii)um VH compreendendo uma . sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 165; (xxxviii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 166; (xxxix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 167; (xl) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 168; (xli) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 169; (xlii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 170; (xliii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 171; (xliv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma (xlv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 175 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 188; (xlvi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 17 6 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 189; (xlvii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 177 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 190; (xlviii)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 178 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 191; (xlix) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 17 9 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 192; (l)um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 180 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 193; (li) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 181 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 194; (Iii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 182 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 195; (liii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 183 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 196; (liv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 184 e um VL compreendendo uma (Iv) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 185 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 198; (Ivi) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 186 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 199; ou (Ivii) um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 187 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 200. Adicionais proteina humanas exemplares ligando TLla são anticorpos compreendendo um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46, caracterizado por: o VH e/ou VL compreender uma ou mais das seguintes substituições ou grupos de substituições: (i)o VH compreender uma alamina na posição 16 de SEQ ID NO: 42; (ii) o VH compreender uma alamina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (iii) o VH compreender uma serina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (iv) o VH compreender uma histidina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (v) o VH compreender uma leucina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (vi) o VH compreender um ácido aspártico na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (vii) o VH compreender uma tirosina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (viii) o VH compreender uma prolina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (ix) o VH compreender uma glutamina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (x) o VH compreender uma lisina na posição 100 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xi) o VH compreender uma alamina na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 4 6; (xii) o VH compreender uma serina na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 4 6; (xiii) o VH compreender uma histidina na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xiv) o VH compreender uma leucina na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xv) o VH compreender um ácido aspártico na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xvi) o VH compreender uma tirosina na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xvii) o VH compreender uma glutamina na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xviii) o VH compreender uma lisina na posição 101 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xix) o VH compreender uma alamina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xx) o VH compreender uma serina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxi) o VH compreender uma histidina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxii) o VH compreender uma leucina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxiii) o VH compreender uma tirosina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxiv) o VH compreender uma prolina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxv) o VH compreender uma glutamina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxvi) o VH compreender uma lisina na posição 102 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 4 6; (xxvii) o VH compreender uma alamina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 4 6; (xxviii)o VH compreender uma serina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 4 6; (xxix) o VH compreender uma histidina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxx) o VH compreender uma leucina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxi) o VH compreender um ácido aspártico na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxii) o VH compreender uma tirosina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxiii)o VH compreender uma prolina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxiv) o VH compreender uma glutamina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxv) ' o VH compreender uma lisina na posição 103 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxvi) o VH compreender uma serina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxvii)o VH compreender uma histidina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxviii) o VH compreender uma leucina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xxxix) o VH compreender um ácido aspártico na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xl) o VH compreender uma tirosina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xli) o VH compreender uma prolina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xlii) o VH compreender uma glutamina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xliii) o VH compreender uma lisina na posição 104 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xliv) o VH compreender uma alamina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xlv) o VH compreender uma' histidina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xlvi) o VH compreender uma leucina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xlvii) o VH compreender um ácido aspártico na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xlviii)o VH compreender uma tirosina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (xlix) o VH compreender uma prolina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (l)o VH compreender uma glutamina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o-VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (li) o VH compreender uma lisina na posição 105 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 4 6; (lii) o VH compreender uma alamina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (liii) o VH compreender uma serina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (liv) o VH compreender uma histidina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Iv) o VH compreender uma leucina na posição 107 ' de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; ’ (Ivi) o VH compreender um ácido aspártico na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Ivii) o VH compreender uma tirosina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Iviii) o VH compreender uma prolina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (lix) o VH compreender uma glutamina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (lx) o VH compreender uma lisina na posição 107 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma t-reonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Ixi) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma alamina na posição 23 de SEQ ID NO: 46; (Ixii) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender um ácido aspártico na posição 28 de SEQ ID NO: 46; (Ixiii) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma tirosina na posição 33 de SEQ ID NO: 46; (Ixiv) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender um ácido aspártico na posição 34 de SEQ ID NO: 46; (Ixv) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma asparagina na posição 53 de SEQ ID NO: 46; ' (Ixvi) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma serina na posição 54 de SEQ ID NO: 4 6; (Ixvii) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma alamina na posição 82 de SEQ ID NO: 46; (Ixviii)o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma serina na posição 95 de SEQ ID NO: 46; (Ixix) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma serina na posição 96 de SEQ ID NO: 46; (Ixx) o VH compreender uma treonina na posição 41 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Ixxi) o VH compreender uma serina na posição 47 de SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23 de SEQ ID NO: 46; (Ixxii) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma alamina na posição 72, um ácido aspártico na posição 73, uma argemina na posição 74 e uma treonina na posição 76 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Ixxiii)o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51 e um ácido glutâmico na posição 102 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma serina na posição 24 e uma treonina na posição 7 6 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; (Ixxiv) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51 e um ácido glutâmico na posição 102 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24 e uma treonina na posição 76 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; (Ixxv) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51 e um ácido glutâmico na posição 102 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23 e uma treonina na posição 76 cada um relativo a SEQ. ID NO: 46; (Ixxvi) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51 e um ácido glutâmico na posição 102 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Ixxvii)o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51, um ácido glutâmico na posição 102 e uma alamina na posição 105 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24 e uma treonina na posição 7 6 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; (Ixxviii) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51, um ácido glutâmico na posição 102 e uma alamina na posição 105 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (Ixxix) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma alamina na posição 72, um ácido aspártico na posição 73, uma argemina na posição 74 e uma treonina na posição 76 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24 e uma treonina na posição 76 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; (Ixxx) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma alamina na posição 72, um ácido aspártico na posição 73, uma arginina na posição 74 e uma treonina na posição 76 cada uma relativa a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24, uma treonina na posição 76 e um ácido glutâmico na posição 51 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; (Ixxxi) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51, uma alamina na posição 72, um ácido aspártico na posição 73, uma argemina na posição 74, uma treonina na posição 76, um ácido glutâmico na posição 102 e uma alamina na posição 105 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24, uma treonina na posição 76 e um ácido glutâmico na posição 51 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; e (i) o VH compreender uma prolina na posição 41, uma leucina na posição 51, uma alamina na posição 72, um ácido aspártico na posição 73, uma argemina na posição 74, uma treonina na posição 76, um ácido glutâmico na posição 102 e uma alamina na posição 105 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender uma treonina na posição 23, uma serina na posição 24, uma treonina na posição 76 e uma glicina na posição 51 cada um relativo a SEQ ID NO: 46. Opcionalmente, o VH é ligado para uma região de cadeia pesada constante, exemplo, uma região constante de cadeia pesada IgGl. Em um exemplo, uma região constante de cadeia pesada falta residue de c-terminal lisina. Opcionalmente, o VL é ligada para uma região constante de cadeia leve.
As proteinas de ligação TLla da presente divulgação podem ser proteina ‘ sinhumanizadas. 0 termo "sinhumanizada proteina" refere-se para uma proteina preparada por um método descrito em W02007/019620. A proteina sinhumanizada ligando TLla inclui uma região variável de um anticorpo, caracterizado por: a região variável compreender FRs de uma região variável de anticorpo de primata do Novo Mundo e CDRs de um região variável de anticorpo de primata não do Novo Mundo. Por exemplo, a proteina sinhumanizada ligando TLla inclui uma região variável de um anticorpo, caracterizado por: a região variável compreender FRs de uma região variável de anticorpo primata do Novo Mundo e CDRs de um rato ou camundongo anticorpo. Em um exemplo, a proteina sinhumanizada ligando TLla é uma ligação de anticorpo TLla em que uma ou ambas regiões variáveis são sinhumanizada. Este termo também engloba um composto de proteina compreendendo, por exemplo, uma ou mais região variável sinhumanizada e um ou mais, exemplo, região variável de humano ou região variável humanizada ou região variável quimérica.
As proteinas de ligação TLla da presente divulgação podem ser proteinas primatizada. Uma "proteina primatizada" compreende região variável(s) de um anticorpo gerado seguindo imunização de um primata não humano (exemplo, um macaco cinomólogo ). Opcionalmente, as regiões variáveis do anticorpo de primata não humano são ligados para região constante de humano para produzir um anticorpo primatizado. Métodos exemplares para produzir anticorpo primatizado são descritos em US 6113898. Este termo também engloba um composto de proteina compreendendo, por exemplo, uma ou mais região variável de primatizado e um ou mais, exemplo, região variável de humano ou região variável humanizada ou região variável quimérica. '
Em um exemplo a proteina de ligação TLla da divulgação é uma proteina quimérica. O termo "proteinas quimérica" refere-se para proteinas em que um dominio de ligação de antigeno é de uma espécie particular (exemplo, murino, tal como rato ou camundongo) ou pertencem a uma classe ou subclasse particular de anticorpo , enquanto que o restante da proteina é de uma proteina derivada de outra espécie (tal como, por exemplo, humana ou primata não humana) ou pertence para outra classe ou subclasse de anticorpo. Em um exemplo, uma proteina quimérica é um anticorpo quimérico compreendendo um VH e/ou um VL de um anticorpo não humano (exemplo, um anticorpo de murino) e o restante das regiões de anticorpo são de um anticorpo humano. A produção de tais proteinas quiméricas é conhecida na matéria, e pode ser melhorada meios padronizados (como descritos, exemplo, em US 6331415; US 5807715; US 4816567 e US 4816397). Este termo também engloba um composto de proteina compreendendo, por exemplo, uma ou mais região variável quimérica e um ou mais, exemplo, região variável humana ou região variável humanizada ou região variável quimérica.
A presente divulgação também contempla uma Proteina de ligação deimunizado TLla, exemplo, como descritos em W02000/34317 e W02004/108158. Anticorpos e proteinas deimunizado têm um ou mais epitopos, exemplo, epitopos de célula B ou epitopos de célula T removido (isto é, mutado)para assim reduzir a probabilidade que um sujeito gere uma resposta imune contra o anticorpo ou proteina. Por exemplo, uma proteina de ligação TLla da divulgação é analisado para identificar uma ou mais epitopos de célula B ou T e um ou mais residues de aminoácido dentro do epitopo é mutado para assim reduzir a imunogenicidade da proteina de ligação TLla. 'Os presentes inventores usaram tais técnicas para identificar epitopos que são previsto para ligar para moléculas MHC Classe II e identificar proteina de ligação TLlas de menor probabilidade de induzir uma resposta imune em um sujeito.
Será aparente para os especialista a partir do exposto na divulgação que uma "composto" de proteina compreende uma forma de VH (exemplo, humano) e outra forma de VL (exemplo, humanizada). A presente divulgação explicitamente engloba todas as combinações de formas de VH e VL.
Outras Proteinas Ligando TLla Compreendendo um Dominio de Ligação de Antigeno
A presente divulgação também contempla outras proteinas de ligação TLla compreendendo uma região variável ou dominio de ligação de antigeno de um ant-icorpo, tal como: (i) um anticorpo de dominio simples, que é uma cadeia simples de polipeptideo compreendendo todos ou uma porção do VH ou um VL de um anticorpo (ver, exemplo, US 6248516); (ii) anticorpos, triacorpos e tetracorpos, exemplo, como descritos em US 5844094 e/ou US 2008152586; (iii) scFvs, exemplo, como descritos em US 5260203; (iv) minicorpos, exemplo, como descritos em US 5837821; (v) proteinas biespecifica "chave e buraco" como descritas em US 5731168; (vi) proteinas heteroconjugadas, exemplo, como descritas em US 4676980; (vii) proteinas heteroconjugadas produzidas usando uma quimica de ligação cruzada, exemplo, como descritos em US 4676980; (viii) fragmentos Fab'-SH, exemplo, como descritos em Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225, 1992; ou (ix) Fabβ (exemplo, como descritos em EP19930302894). Fusões de Dominio Constante
A presente divulgação engloba uma proteina de ligação TLla compreendendo um dominio de ligação de antigeno de um anticorpo e uma região constante ou Fc ou um Dominio destes, exemplo, Dominio CH2 e/ou CH3. Adequadas regiões e/ou dominios constantes será aparente para os especialistas e/ou as sequência de tais polipeptideos são prontamente disponíveis a partir de base de dados disponível publicamente. Kabat et al também prover descrição de algumas adequadas regiões/dominios constantes. Regiões e/ou dominios constantes deste são úteis para prover atividades biológicas tal como, dimerização, estende meia vida de soro (exemplo, por ligarem para FcRn), citotoxicidade de célula dependente de anticorpo (antibodydependent cell citotoxicidade - ADCC), citocidade dependente de complemento (complement dependent citotoxicidade - CDC), fagocitose de célula dependente de anticorpo (antibody-dependent cell fagocitose - ADCP).
A presente divulgação também contempla proteinas de ligação TLla compreendendo regiões ou dominios constantes mutante, exemplo, como descrito em US 7217797; US 7217798; ou US 20090041770 (tendo aumento de meia vida) ou US 2005037000 (aumento ADCC).
A C-terminal lisina da região constante de cadeia pesada de um anticorpo da divulgação ou proteina de ligação TLla da divulgação compreendendo uma região constante ou Fc pode ser removida, por exemplo, durante a produção ou purificação do anticorpo, ou por engenharia recombinante do ácido nucléico codificando uma cadeia pesada do anticorpo ou proteina. Consequentemente, anticorpos inteiros ou proteinas pode compreender anticorpo ou populações de proteina com todos os resíduos C-terminal lisina removidos, o anticorpo ou populações de proteína sem os resíduos C- terminal lisina removidos, ou anticorpo ou populações de proteína tendo uma mistura de anticorpos com e sem os resíduo C-terminal lisina. Em alguns exemplos, o anticorpo ou populações de proteína podem adicionalmente compreender anticorpos ou proteínas em que um resíduo C-terminal lisina é removido em uma região constante da cadeia pesada. Similarmente, uma composição de anticorpos ou proteínas pode compreender a mesma ou uma mistura similar de anticorpos ou populações de proteína com ou sem o resíduo C-terminal lisina.
Melhorar da Função Efetora
Em um exemplo, a proteína de ligação TLla da presente divulgação pode induzir função efetora ou melhorar a função efetora. No contexto da presente divulgação, "função efetora" refere-se para estas atividades biológicas mediada por células ou proteínas que ligam para a região Fc (uma sequência de região nativa Fc ou sequência de aminoácido de região variante Fc) de um anticorpo que resulta na morte de uma célula. Exemplos de função efetoras induzidas por anticorpos incluem: complement citotoxicidade ' dependente de complemento; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (Antibody-Dependent-Cell- Mediated Cytotoxicity - ADCC); fagocitose de célula dependente de anticorpo (antibody-dependent-cellphagocytosis - ADCP) ; e ativação de Célula B.
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla da presente divulgação liga para TLla na superficie de uma célula de tai forma que seja capaz de induzir uma função efetora, tai como, ADCC ou CDC. Por exemplo, a proteina de ligação TLla permanece limitada para o TLla na superficie da célula por um tempo suficiente para induzir uma função efetora, tai como ADCC e/ou CDC.
Em um exemplo, uma proteina de ligação TLla da presente divulgação é capaz de induzir melhora da função efetora, exemplo, em virtude de uma modificada região Fc ou em virtude de compreender uma região capaz de ligar para uma célula de efeito imune. Por exemplo, o nivel de função efetora é aumentado comparado com o nivel induzido por uma região Fc de IgGl ou IgG3 humano. Melhora da função efetora induzida por uma proteina de ligação TLla da divulgação pode resultar em melhora dos efeitos terapêuticos ou profiláticos, exemplo, por não só broquear a ação de TLla, mas também para matar ou esvaziar células causando uma condição, exemplo, por matar células T auto reativas.
Em um exemplo, a região Fc de uma proteina de ligação TLla da divulgação é modificada para aumentar o nivel da função efetora sendo capaz de indução comparada com a região Fc sem a modificação. Tais modificações podem ser no nivel de aminoácido e/ou no nivel da estrutura secundária e/ou no nivel da estrutura terciária e/ou para a glicosilação da região Fc. O destinatário especializado apreciará que a maior função efetora pode ser manifestada em qualquer de uma das várias maneiras, por exemplo, com um nivel superior de efeito, um efeito mais duradouro ou uma taxa mais rápida do efeito.
Em um exemplo, a região Fc compreende um ou mais modificações de aminoácido que aumenta sua habilidade para induzir melhora da função efetora. Em um exemplo, a região Fc ligar com maior afinidade para um ou mais FcyRs, tal como FcyRIII. Em um exemplo, a região Fc compreende pelo menos uma substituição de aminoácido em uma posição selecionada do grupo consistindo de: 230, 233, 234, 235, 239, 240, 243, 264, 266, 272, 274, 275, 276, 278, 302, 318, 324, 32-5, 326, 328, 330, 332, e 335, numerada de acordo com o UE indice de Kabat. Em um exemplo, a região Fc compreende as seguintes substituições de aminoácido S239D/I332E, numerada de acordo com o UE índice de Kabat. Esta região Fc tem aumento de cerca de 14 vezes na afinidade para FcyRIIIa comparado com um região FC de tipo selvagem e cerca de aumento de 3,3 da habilidade para induzir ADCC comparado com uma região FC de tipo selvagem. Em um exemplo, a região Fc compreender as seguintes substituições de aminoácido S239D/A330L/I332E, numerada de acordo com o UE índice de Kabat. Esta região Fc tem aumento de cerca de vezes na afinidade para FcyRHIa comparado com uma região FC de tipo selvagem e aumento de cerca de 323 vezes de habilidade para induzir ADCC comparado com uma região FC de tipo selvagem.
Substituições adicionais de aminoácido que aumenta habilidade'de uma região Fc para induzir função efetora são conhecidas na matéria e/ou descritas, por exemplo, em US 6737056 ou US 7317091.
Em um exemplo, a glicosilação da região Fc é alterada pelo aumento de sua habilidade para induzir melhora da função efetora. Com este respeito, anticorpos nativos produzido por células mamiferas tipicamente compreende um oligossacarideo ramificado, biramificado que é geralmente ligado para uma ligação N para Asn297 do domínio CH2 da região Fc. O oligossacarideo pode incluir vários carboidratos, exemplo, mannose, N-acetil glucosamina (GlcNAc), galactose, e ácido sialico, tanto quanto uma fucose ligada para a GlcNAc no "tronco" da estrutura do biramificada oligossacarideo. Em alguns exemplos, região Fcs de acordo com a presente divulgação compreende uma estrutura de a carboidrato que falta fucose ligada (diretamente ou indiretamente) para uma região Fc, isto é, a região Fc é "afucosilatada". Tais variantes podem ter uma maior habilidade para induzir ADCC. Métodos para produzir anticorpos afucosilatado incluem, expressando o anticorpo ou fragmento de ligação do antigénio dos mesmos em uma linha de células incapaz de expressar a-1,6- fucosiltransferase (FUT8) (exemplo, como descritos em Yumane-Ohnuki et al., Biotechnol. Bioengineer. 87: 614-622, 2004), expressar o anticorpo ou ligação fragmento de antigeno deste em células expressando uma pequena interferencia de RNA contra FUT8 (exemplo, como descritos em Mori et al., Biotechnol. Bioengineer., 88: 901-908, 2004), expressando o anticorpo ou ligação fragmento do antigeno deste em células incapaz de expressar guanosina difosfato (GDP)-mannose 4,6-dehi’dratase (GMD) (exemplo, como descritos em Kanda et al., J. Biotechnol., 130: 300- 310, 2007). A presente divulgação também contempla o uso de proteinas tendo um nivel reduzido de fucosilação, exemplo, produzido usando uma linha de célula modificada para expressar β—(1, 4)-N-acetilglucosaminil transferase III (GnT-III) (exemplo, como descritos em Umãna et al., Nat. Biotechnol. 17: 176-180, 1999).
Outros métodos incluem o uso de linha de célula que inerentemente produz anticorpos capazes de induzir melhora da função efetora mediada por Fc (exemplo pato embrionário derivado células tronco par a produção de vacinas virai, W02008/129058; A produção de proteina recombinante em células de ave EBX®, WO 2008/142124).
As proteinas de ligação TLla da presente divulgação também incluem estas com oligossacarideo divididos, exemplo, em que um oligossacarideo biramificada ligada para a região Fc é dividido por GlcNAc. Tais proteinas podem ter reduzida fucosilação e/ou melhora da função ADCC. Exemplos de tais proteinas são descritas, exemplo, em US 6602684 e US 20050123546.
As proteinas de ligação TLla com pelo menos um residue de galactose no oligossacarideo ligado para a região Fc são também contemplados. Tais proteinas podem ter melhor função CDC. Tais proteinas são descritas, exemplo, em WO1997/30087 e WO1999/22764.
As proteinas de ligação TLla podem também compreender uma região Fc capaz de induzir melhores niveis de CDC. Por exemplo, hibridos de IgGl e IgG3 produzem anticorpos tendo melhor atividade CDC (Natsume et al., Cancer Res. 68: 3863-3872, 2008) .
As proteinas de ligação TLla podem também Ou alternativamente ser fundida para ou conjugada para proteínas (exemplo, região variável de anticorpo) que liga para células efetoras imune, exemplo, em virtude de ligarem para CD3 ou CD16.
Métodos para determinar função efetora são conhecidos na matéria. Em um exemplo, o nível de atividade ADCC é avaliada usando um ensaio de liberação de 51Cr, um ensaio de liberação de európio ou um ensaio de liberação de 35S. Em cada um destes ensaios, células expressando TLla são cultivadas com um ou mais dos compostos descritos por um tempo e sob condições suficientes para o composto ser tomado pela célula. No caso de um ensaio de liberação de 35S, as células podem ser cultivadas com 35S-rotulada metionina e/ou cisteina por um tempo suficiente para o rotulado aminoácidos ser incorporado dentro das proteínas sintetizadas recentemente. As células estão então em cultura na presença ou ausência da proteína e na presença de imune células efetoras, exemplo, células PBMCs e/ou NK. A quantidade de 51Cr, európio e/ou 35S no meio de cultura da célula é então detectado, e um aumento na presença da proteína comparado com a ausência de proteína indica que a ligação molécula/agente tem função efetora. Exemplares Publicações descrevendo ensaios para avaliar o nível de ADCC induzido por uma proteína inclui Hellstrom et al. Proc. Natl Acad. Sei. USA 83: 7059-7063, 1986 e Bruggemann et al., J. Exp. Med. 166: 1351-1361, 1987.
Outros ensaios para avaliar o nível de ADCC induzido por uma proteína inclui ensaio de citotoxicidade de ACTI™ não radioativo para citometria de fluxo (CélulaTechnology, Inc. CA, USA) ou ensaio de citotoxicidade de CytoTox 96® não radioativo (Promega, WI, USA).
Alternativamente, ou adicionalmente, a função efetora de uma proteina de ligação TLla é avaliada pela determinação de sua afinidade para um ou mais FcyRs, exemplo, como descrito em US 7317091.
Ensaios de ligação de Clq pode também ser conduzido para confirmar que a proteina de ligação TLla é capaz de ligar Clq e pode induzir. CDC. Para avaliar a completa ativação, um ensaio de CDC pode ser realizado (ver, por exemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Imunol. Metodhs 202: 163, 1996).
Em outro exemplo, a proteina de ligação TLla compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que aumenta a meia vida da proteina. Por exemplo, a proteina de ligação TLla compreende uma região constante compreendendo um ou mais substituições de aminoácido que aumenta a afinidade da região constante para a região neonatal Fc (FcRn). Por exemplo, a região constante tem aumento de afinidade para FcRn a pH baixo, exemplo, cerca de pH 6,0, para facilitar ligação Fc/FcRn em um endossomo. Em um exemplo, a região constante tem aumento de afinidade por FcRn a cerca de pH 6 comparada com sua afinidade a cerca de pH 7,4, que facilita a reliberação de Fc no sangue seguindo reciclagem celular. Estas substituições de aminoácido são útil para estender a meia vida de um proteina de ligação TLla, por reduzir liberação do sangue.
Substituições exemplares de aminoácido incluem T250Q e/ou M428L ou T252A, T254S e T266F ou M252Y, S254T e T256E ou H433K 'e N434F de acordo com o sistema de numeração UE. Substituições adicionais ou alternativas de aminoácido são descritas, por exemplo, em US 20070135620 ou US 7083784.
Proteinas de Ligação TLla Estabilizada
As proteinas de ligação TLla da presente divulgação podem compreender uma região constante IgG4 ou uma estabilizada região constante IgG4. O termo "estabilizada região constante IgG4" será entendida para significar uma região constante IgG4 que foi modificada para reduzir troca de ramificação Fab ou a propensão para sofrer troca de ramificação Fab ou formação de uma metade de anticorpo ou uma propensão para formar uma metade de anticorpo. "Troca de ramificação de Fab" refere-se para um tipo de modificação de proteina para IgG4 humano, em que uma cadeia pesada IgG4 e cadeia leve ligada (metade da molécula) é trocada por um par de cadeia pesada de outra molécula IgG4. Assim, moléculas IgG4 podem adquirir duas distintas ramificações Fab reconhecendo dois antigenos distintos (resultando em moléculas biespecificas). troca de ramificação de Fab ocorre naturalmente in vivo e pode ser induzida in vitro por células de sangue purificado ou agentes redutores tal como reduzido glutationa. A "metade de anticorpo" forma quando um anticorpo IgG4 desagrega para formar duas moléculas cada uma contendo uma única cadeia simples e uma única cadeia leve.
Em um exemplo, uma estabilizada região constante IgG4 compreende uma prolina na posição 241 da região de dobradiça de acordo com o sistema de Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Imunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 1987 e/ou 1991). Esta posição corresponde para a posição 228 da região de dobradiça de ’ acordo com o sistema de numeração UE (Kabat et al., Sequences of Proteins of Imunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 2001 and Edelman et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63: 78-85, 1969). Em humano IgG4, este resíduo é geralmente uma serina. Seguindo substituição da serina por prolina, a região de dobradiça IgG4 compreende uma sequência CPPC. A este respeito, 0 experiente na matéria estará ciente que a "região de dobradiça" é uma porção rica de prolina de um região constante de anticorpo de cadeia pesada que ligue as regiões Fc e Fab que confere mobilidade nas duas ramificações Fab de um anticorpo. A região de dobradiça inclui residues de cisteina que são envolvidos na ligação de inter cadeia pesada de dissulfeto. É geralmente definido como alongamento de Glu226 para Pro243 de humano IgGl de acordo com o sistema de numeração de Kabat. As regiões de dobradiça de outros isotipos IgG podem ser alinhadas com a sequência IgGl por colocando o primeiro e último residues de cisteina formando uma inter cadeia pesada dissulfeto (S-S) ligado nas mesmas posições (ver por exemplo W02010/080538) .
Proteinas de Ligação de TLla Mutante
A presente divulgação também fornece uma proteina de ligação TL1 ou um ácido nucléico codificando a mesma tendo pelo menos 80% de identidade com uma sequência descrita neste documento. Em um exemplo, uma proteina de ligação TLla ou ácido nucléico da divulgação compreende a sequência pelo menos cerca de 85% ou 90% ou 95% ou 97% ou 98% ou 99% idêntica a uma sequência descrita neste documento, caracterizado por: a proteina especificamente ligar para TLla e inibir interação de TLla e DR3 e hão inibir interação de TLla e DcR3.
Alternativàmente, ou adicionalmente, a proteina de ligação TLla compreende um CDR (exemplo, três CDRs) pelo menos cerca de 80% ou 85% ou 90% ou 95% ou 97% ou 98% ou 99% idêntica ao CDR(s) de um VH ou VL como descritos neste documento de acordo com qualquer exemplo, caracterizado por: a proteina ser capaz de especificamente ligar para TLla e inibir interação de TLla e DR3, caracterizado por: a proteina não inibir interação de TLla e DcR3. A este respeito, os inventores produziram numerosos anticorpos tendo diversas sequências dentro de seus CDRs. Os Métodos para determinar a ligação de uma proteina TLla e determinar a interação de TLla e DR3 ou TLla e DcR3 são descritos neste documento.
Por exemplo, os inventores identificaram um grupo de proteinas de ligação TLla compartilhando 60% da identidade em seus HCDR1 de acordo com o sistema de numeração Kabat e outro subgrupo de proteinas compartilhando 80% de identidade em seus HCDR1 de acordo com o sistema de numeração Kabat. Os inventores também identificaram uma subclasse de proteinas de ligação TLla compartilhando 40% de identidade ou 47% de identidade em seus HCDR2 de acordo com o sistema de numeração Kabat.
Como divulgado neste documento, é também conhecido na matéria que cinco residuos C-terminal de cadeia pesada CDR2 podem ser mutado para substituições conservativas ou não conservativas de aminoácido (31% de residuos) (Padlan et ai., FASEB J. 9: 133-139, 1995) . Assim, uma proteína pode compreender um CDR2 tendo pelo menos cerca de 69% de identidade para uma sequência de cadeia pesada CDR2 descrita neste documento. Os inventores também identificaram uma classe de proteínas compreendendo variantes das regiões variáveis de anticorpo C320 descritos neste documento. Estes variantes permitem identificação de sites dentro das regiões variáveis que pode ser substituída sem perda da função. Por exemplo, os inventores identificaram vários resíduos em um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 que pode ser substituída sem perda de função. Consequantemente, a divulgação engloba proteínas compreendendo um VH com pelo menos cerca de 86% de identidade com uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42. A este respeito, os inventores produziram uma forma modificada de SEQ ID NO: 42 tendo cerca de 17 substituições de aminoácidos (isto é, cerca de 86% de identidade desta) que conserva uma função dita neste documento. A este respeito, os inventores também produziram uma forma - modificada de SEQ ID NO: 42 tendo cerca de 90 ou 94% de identidade desta que conserva uma função dita neste documento. Em um exemplo, a sequência tem pelo menos cerca de 95% ou 96% ou 97% ou 98% de identidade com uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42. A este respeito, os inventores produziram proteínas tendo cerca de 97% ou 98% ou 99% de identidade com uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42. Em um exemplo, a sequência tem pelo menos cerca de 99% de identidade com uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42. Em um exemplo, a sequência tem pelo menos cerca de 99,2% de identidade com uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42.
Em um exemplo, a proteína de ligação TLla compreende entre 1 e 17 substituições de aminoácido comparado com a SEQ ID NO: 42. Por exemplo, a proteína de ligação TLla compreende 1 ou 2 ou 3 ou 4 ou 5 ou 6 ou 7 ou 8 ou 9 ou 10 ou 11 ou 12 ou 13 ou 14 ou 15 ou 16 ou 17 substituições de aminoácidos comparado com a SEQ ID NO: 42.
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla compreende entre 1 e 17 substituições de aminoácidos no FRs comparado com a SEQ ID NO: 42. Por exemplo, a proteina de ligação TLla compreende 1 ou 2 ou 3 ou 4 ou 5 ou 6 ou 7 ou 8 ou 9 ou 10 ou . 11 ou 12 ou 13 ou 14 ou 15 ou 16 ou 17 substituições de aminoácidos no FRs comparado com a SEQ ID NO: 42. Em um exemplo, a substituição não é na posição 73 de SEQ ID NO: 42.
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla compreende entre 1 e 3 substituições de aminoácidos em CDR3 comparado com a SEQ ID NO: 42. Por exemplo, a proteina de ligação TLla compreende 1 ou 2 ou 3 substituições de aminoácidos no CDR3 comparado com a SEQ ID NO: 42. Em um exemplo, a substituição não é em uma ou mais das posições 99 ou 101 ou 104 ou’108 da SEQ ID NO: 42.
Em um exemplo, proteína de ligação TLla compreende uma ou mais substituições para prevenir ou reduzir glicosilação da proteína, caracterizado por: a(s) substituição(s) serem entre os aminoácidos 72 a 76 da SEQ ID NO: 42. Por exemplo, a proteína compreende uma alamina no lugar da arginina na posição 71 e/ou um ácido aspártico no lugar da asparagina na posição 72 e/ou uma arginina no lugar da treonina na posição 73 e/ou uma treonina no lugar da isoleucina na posição 75 da SEQ ID NO: 42.
Em um exemplo, o VH da proteína não é glicosilatado e/ou não compreende um site de consenso para glicosilação ligada a N.
Em um exemplo, uma proteína de ligação TLla da divulgação compreende um mutante de uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42, caracterizado por: a sequência mutante pelo menos compreender uma serina na posição 16 da SEQ ID NO: 42.
Em um exemplo, uma proteina de ligação TLla da divulgação compreende um mutante de uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42, caracterizado por: a sequência mutante pelo menos compreender uma prolina na posição 41.
Em um exemplo, uma proteina de ligação TLla da divulgação compreende um mutante de uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42, caracterizado por: a sequência mutante pelo menos compreender uma arginina na posição 74.
Em um exemplo, uma proteina de ligação TLla da divulgação compreende um mutante de uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42, caracterizado por: a sequência mutante pelo menos compreender um ácido glutâmico ou glicina na posição 49 da SEQ ID NO: 42.
Em um exemplo, uma proteina de ligação TLla da divulgação compreende um mutante de uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42, caracterizado por: a sequência mutante pelo menos compreender uma prolina na posição 41 e uma leucina na posição 51 e um ácido glutâmico na posição 102 e uma alamina na posição 105 cada um relativo a SEQ ID NO: 42.
Em um exemplo, uma proteina de ligação TLla da divulgação compreende um mutante de uma sequência estabelecida ná SEQ ID NO: 42, caracterizado por: a sequência mutante pelo menos compreender uma prolina na posição 41 e uma leucina na posição 51 e uma alamina na posição 72 e um ácido aspártico na posição 73 e uma arginina na posição 74 e um ácido glutâmico na posição 102 e uma alamina na posição 105 cada um relativo a SEQ ID NO: 42.
Em um exemplo, uma proteina de ligação TLla da divulgação compreende um mutante de uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42, caracterizado por: a sequência mutante pelo menos compreender uma prolina na posição 41 e uma leucina na posição 51 e uma alamina na posição 72 e um ácido aspártico na posição 73 e uma argemina na posição 74 e uma treonina na posição 76 e um ácido glutâmico na posição 102 e uma alamina na posição 105 cada um relativo a SEQ ID NO: 42.
Os inventores identificaram um site dentro de HCDR2 que pode ser substituído. juntamente com as observações de Padlan et al., supra, a divulgação assim fornece uma proteina compreendendo um VH compreendendo um CDR2 tendo uma sequência pelo menos cerca de 65% idêntica a uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 44. Em um exemplo, a porcentagem de identidade é pelo menos cerca de 70% ou 75% ou 80% ou 90%. Em um exemplo, a porcentagem de identidade é pelo menos cerca de 94%.
Os inventores identificaram numerosos sites dentro de HCDR3 que podem ser substituídos. A divulgação assim fornece uma proteina compreendendo um VH compreendendo um CDR3 tendo uma sequência pelo menos cerca de 60% idêntica a uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 45. Em um exemplo, a porcentagem de identidade é pelo menos cerca de 70% idêntica a uma sequência estabelecida’ na SEQ ID NO: 45, exemplo, como exemplificado neste documento. Em um exemplo, a porcentagem de identidade é pelo menos cerca de 75% ou 80% ou 90%. Em um exemplo, a porcentagem de identidade é pelo menos cerca de 90%.
Em um exemplo, uma forma mutante de SEQ ID NO: 45 compreende um ácido glutâmico na posição 1 da SEQ ID NO: 45 e/ou uma prolina na posição 3 da SEQ ID NO: 45 e/ou uma alamina na posição 6 da SEQ ID NO: 45. Opcionalmente, a forma mutante adicionalmente compreende uma fenilalanina na posição 8 da SEQ ID NO: 45 e/ou uma tirosina na posição 10 da SEQ ID NO: 45.
Adicionais resíduos que podem ser mutados estão definidos nas Figuras 1C-1E e na SEQ ID NOs: 94, 137, 152, 162 e 173.
Em um exemplo, os inventores identificaram vários resíduos em um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46 que podem ser substituídos sem perda de função. Consequentemente, a divulgação engloba proteínas compreendendo um VL com pelo menos cerca de 95% de identidade com uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46. Por exemplo, os inventores tiveram 32 resíduos mutados no VL sem perda de função, significando a divulgação fornece uma proteína tendo pelo menos cerca de 71% de identidade com uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46.
Em um exemplo, a porcentagem de identidade é pelo menos cerca de 75% ou 80% ou 90% ou 95% ou 97%. Em um exemplo, a porcentagem de identidade é pelo menos cerca de 98%. Em um exemplo, a porcentagem de identidade é pelo menos cerca de 99%. Em um exemplo, a porcentagem de identidade é pelo menos cerca de 99,1%.
Em um exemplo, a proteína de ligação TLla compreende entre 1 e 17 substituições de aminoácidos comparado com SEQ ID NO: 42. Por exemplo, a proteína de ligação TLla compreende 1 ou 2 ou 3 ou 4 ou 5 ou 6 ou 7 ou 8 ou 9 ou 10 ou 11 ou 12 ou 13 ou 14 ou 15 ou 16 ou 17 ou 18 ou 19 ou 20 ou 21 ou 22 ou 23 ou 24 ou 25 ou 26 ou 27 ou 28 ou 29 ou 30 ou 31 ou 32 substituições de aminoácidos comparado com SEQ ID NO: 46.
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla compreender entre 1 e 32 substituições de aminoácidos no FRs comparado com SEQ ID NO: 46. Por exemplo, a proteina de ligação TLla compreende 1 ou 2 ou 3 ou 4 ou 5 ou 6 ou 7 ou 8 ou 9 ou 10 ou 11 ou 12 ou 13 ou 14 ou 15 ou 16 ou 17 ou 18 ou 19 ou 20 ou 21 ou 22 ou 23 ou 24 ou 25 ou 26 ou 27 ou 28 ou 29 ou 30 ou 31 ou 32 substituições de aminoácidos no FRs comparado com SEQ ID NO: 46.
Em um exemplo, uma proteina de- ligação TLla compreende entre 1 e 3 substituições de aminoácidos em um CDR comparado com SEQ ID NO: 46. Por exemplo, a proteina de ligação TLla compreende 1 ou 2 ou 3 substituições de aminoácidos em um CDR comparado com SEQ ID NO: 46. Em um exemplo, a substituição não é em uma ou mais das posições 34, 54, 94 de SEQ ID NO: 46.
Em um exemplo, uma proteina de ligação TLla da divulgação compreende um mutante de uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46, caracterizado por: a sequência mutante pelo menos compreender uma serina na posição 24 de SEQ ID NO: 46.
Em um exemplo, uma proteina de ligação TLla da divulgação compreende um mutante de uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46, caracterizado por: a sequência mutante pelo menos compreender uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46. ’
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla da divulgação compreende um mutante de uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46, caracterizado por: a sequência mutante pelo menos compreender uma glutamina na posição 81 de SEQ ID NO: 46.
Em um exemplo, uma proteina de ligação TLla da divulgação compreende um mutante de uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46, caracterizado por: a sequência mutante pelo menos compreender uma treonina na posição 23 e uma serina na posição 24 e uma treonina na posição 76 cada um relativo a SEQ ID NO: 46.
Em um exemplo, a proteina de ligação TLla da divulgação compreende um mutante de uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46, caracterizado por: a sequência mutante pelo menos compreender uma treonina na posição 23 e uma serina na posição 24 e uma treonina na posição 76 e um ácido glutâmico na posição 51 cada um relativo à SEQ ID NO: 46.
Os inventores identificaram uma pluralidade de sites dentro de LCDR1 que pode ser substituído. A divulgação assim fornece uma proteina compreendendo um VL compreendendo um CDR1 tendo uma sequência pelo menos cerca de 60% idêntica com uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 47. Em um exemplo, a porcentagem de identidade é pelo menos cerca de 70% ou 75% ou 80% ou 90%. Por exemplo, os inventores têm mutado dois sites dentro de LCDR1 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 47, assim produzindo uma proteina tendo pelo menos cerca de 86 de identidade com a sequência enumerada. Em um exemplo, a porcentagem de identidade é pelo menos cerca de 90%.
Em um exemplo, uma proteina de ligação TLla da divulgação compreende um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 42 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 46, caracterizado por: o VH e/ou VL compreender uma ou mais das seguintes substituições ou grupos de substituições: (i)o VH compreender pelo menos uma serina na posição 16 de SEQ ID NO: 42; (ii) o VL compreender pelo menos uma treonina na posição 76 de SEQ ID NO: 46; (iii) o VL compreender pelo menos uma glutamina na posição 81 de SEQ ID NO: 46; (iv) o VH compreender pelo menos uma prolina na posição 41 e uma leucina na posição 51 e um ácido glutâmico na posição 102 e uma alamina na posição 105 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e o VL compreender pelo menos uma treonina na posição 23 e uma serina na posição 24 e uma treonina na posição 76 cada um relativo a SEQ ID NO: 46; ou (v)o VH compreender pelo menos uma prolina na posição 41 e uma leucina na posição 51 e uma alamina na posição 72 e um ácido aspártico na posição 73 e uma argemina na posição 74 e um ácido glutâmico na posição 102 e uma alamina na posição 105 cada um relativo a SEQ ID NO: 42 e um VL compreender pelo menos uma treonina na posição 23 e uma serina na posição 24 e uma treonina na posição 76 e um ácido glutâmico na posição 51 cada um relativo a SEQ ID NO: 46.
Em outro exemplo, um ácido nucléico da divulgação compreende uma sequência pelo menos cerca de 80% ou 85% ou 90% ou 95% ou 97% ou 98% ou 99% idêntica com uma sequência estabelecida neste documento e codifica uma proteina de ligação TLla que é capaz de especificamente ligar para TLla e inibir interação de TLla e DR3, caracterizado por: a proteina não inibir interação de TLla e DcR3. A presente divulgação também engloba ácido nucléicos codificando uma proteina de ligação TLla da divulgação, que difere de uma sequência exemplificada neste documento como um resultado de degeneração do código genético. 0 % de identidade de um ácido nucléico ou polipeptideo é determinado por GAP (Needleman e Wunsch. Mol. Biol. 48, 443-453, 1970) análise (programa GCG) com uma criação penalidade gap=5, e uma extensão de penalidade gap=0,3. A sequência de consulta é pelo menos 50 residuos no comprimento, e a análise GAP alinha as duas sequências sobre a região de pelo menos 50 residuos. Por exemplo, a sequência de consulta é pelo menos de 100 residuos no comprimido e a análise GAP alinha as duas sequências sobre uma região de pelo menos 100 residuos. Por exemplo, as duas sequências são alinhadas sobre os seus comprimentos inteiro.
Como discutido acima, a presente divulgação também contempla um ácido nucléico que hidridiza sob condições rigorosa de hibridização com um ácido nucléico codificando uma proteina de ligação TLla descrita neste documento, exemplo, ácido nucléico codificando um VH ou VL de anticorpo 0319, C320, 0321, 0323, 0333, 0334, 0336, C320-3, 0320-5, 0320-90, 0320-103, 0320-114, 0320-115, 0320-120, 0320-129, 0320-130, 0320-135, 0320-162, 0320-163, 0320-164, 0320-165, 0320-166, 0320-167, 0320-168, 0320-169, 0320-170, 0320-171, 0320-172, 0320-179 ou, 0320-183. Uma "severidade moderada" é definida neste documento como sendo uma hibridização e/ou lavagem conduzido em 2 x SSC tampão, 0,1% (p/v) SDS a uma temperatura no intervalo de 45°C a 65°C, ou condições equivalente. Uma "severidade rigorosa" é definido neste documento como sendo uma hibridização e/ou lavagem conduzido em 0,1 x SSC buffer, 0,1% (w/v) SDS, ou sal de baixa concentração, e a uma temperatura de pelo menos 65°C, ou condições equivalente. Referência neste documento para um particular nivel de severidade engloba condições equivalentes usando soluções lavagem/hibridização outras que SSC conhecidas por experientes na matéria. Por exemplo, métodos para calcular a temperatura na qual a fita de ligação de um ácido nucléico de fita dupla dissociará (também conhecida como temperatura de fusão, ou (melting temperature - Tm) são conhecidas na matéria. Uma temperatura que é similar (exemplo, dentro do limite de 5°C ou dentro do limite de 10°C) ou igual a Tm de um ácido nucléico é considerada como sendo de alta severidade. A severidade média é para ser considerada como sendo dentro do limite de 10°C a 20°C ou 10°C a 15°C da calculada Tm do ácido nucléico.
A presente divulgação também contempla formas mutantes de uma proteina de ligação TLla da divulgação compreendendo uma ou mais substituições conservativa de aminoácidos comparado com uma sequência estabelecida neste documento. Em alguns exemplos, a proteina de ligação TLla compreende 10 ou menos, exemplo, 9 ou 8 ou 7 ou 6 ou 5 ou 4 ou 3 ou 2 ou 1 substituições conservativa de aminoácidos. Uma "substituição conservativa de aminoácido" é uma em que um residuo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido tendo uma similar e/ou hidropaticidade e/ou hidrofilicidade.
As famílias de resíduos de aminoácido tendo cadeia lateral similar foram definidas na matéria, incluindo cadeias laterais básicas (exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídicas (exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polar não carregada (exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina), cadeias laterais não polar (exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofan), cadeias laterais de ramificação β (exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofan, histidina). Os índices hidropáticos são descritos, por exemplo, em Kyte e Doolittle J. Mol. Biol.-, 157: 105-132,1982 e índices hidrofílico são descritos, por exemplo, em US 4554101.
A presente divulgação também contempla trocas não conservativas de aminoácido. Por exemplo, de particular interesse são substituições de aminoácidos carregado com outro aminoácido carregados com aminoácidos carregado neutro ou positivamente. Em alguns exemplos, a proteína de ligação TLla compreende 10 ou menos, exemplo, 9 ou 8 ou 7 ou 6 ou 5 ou 4 ou 3 ou 2 ou 1 substituições não conservativa de aminoácidos.
Em um exemplo, a mutação (s) ocorre dentro de um FR de um domínio de ligação de antigeno de uma proteína de ligação TLla da divulgação. Em outro exemplo, a mutação(s) ocorre dentro de um CDR de uma proteína de ligação TLla da divulgação.
Métodos exemplares para produzir formas mutantes de uma proteína de ligação TLla incluem: • mutagênese de DNA (Thie et al., Métodos Mol. Biol. 525: 309-322, 2009) ou RNA (Kopsidas et al., Imunol. Lett. 107:163-168, 2006; Kopsidas et al. BMC Biotechnology, 7: 18, 2007; e WO1999/058661); • introdução de um ácido nucléico codificando o polipeptideo em uma célula mutante, exemplo, XL-lRed, XL- mutS e XL-mutS-Kanr célula de bactérias (Stratagene); • DNA shuffling, exemplo, como descrito em Stemmer, Nature 370: 389-91,1994; e •mutagênese direcionada de site, exemplo, como descrito em Dieffenbach (ed) e Dveksler (ed) (In: PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, NY, 1995).
Métodos exemplares para determinar atividade biológica das proteinas de ligação TLla mutante da divulgação será aparente para os especialistas e/ou descritas neste documento, exemplo, ligação de antigeno. Por exemplo, métodos para determinar ligação de antigeno, inibição de ligação competitiva, afinidade, associação, dissociação e eficácia terapêutico são descritos neste documento.
Proteinas Exemplares de Ligação de TLla
Regiões variáveis exemplares contendo proteinas de ligação TLla produzido pelos inventores e suas codificando ácido nucléicos são descritas nas Tabelas 1 e 2. Tabela 1: Sequências exemplares de proteinas de ligação de TLla e codificando ácidos nucléicos
Figure img0001
Figure img0002
Figure img0003
Figure img0004
Tabela 2: Substituições de Aminoácido em VH (relativo à SEQ ID NO: 42) e VL (relativo à SEQ ID NO: 46) de Proteinas Exemplares de Ligação TLla.
Figure img0005
Figure img0006
Figure img0007
Figure img0008
Figure img0009
1 substituições são listadas como: resíduo na SEQ ID NO: 42 ou 46; posição na SEQ ID NO: 42 ou 46; substituído aminoácido, isto é, A16S em VH, significa que na posição 16 de SEQ ID NO: 42 existe uma alamina que foi substituída com uma serina em uma proteína de ligação TLla.
Métodos para Produção de Proteínas Expressão Recombinante
Como discutido neste documento, um ácido nucléico codificando uma proteína de ligação TLla da divulgação (e/ou polipeptídeos incluído em tais uma Proteína de ligação TLla) é introduzido em uma construção de expressão, tais que é ligada operacionalmente para um promotor para assim facilitar sua expressão. Os Métodos para produção de construção de expressões, exemplo, clonagem na construção de expressões/vetores são conhecidas na matéria e/ou descritos em Ausubel et al. , (In: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987), e (Sambrook et al., (In: Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001) e US 7270969.
Em um exemplo, a proteína de ligação TLla da divulgação é expressa em uma célula de bactéria.
Promotores típicos adequados para expressão em células de bactéria tal como, por exemplo, uma célula de bactéria selecionada do grupo compreendendo E. coli, Staphylococcus sp, Corynebacterium sp. , Salmonella sp. , Bacillus sp., e Pseudomonas sp., include, mas não são limitadas para um promotor tal como lacz, Ipp, a temperatura-sensitiva (L ou (R promotores, T7, T3, SP6 ou promotores semi artificial tal como o IPTG-induzível promotor tac ou promotor lacUV5.
Em outro exemplo, a proteína de ligação TLla é expressa em uma célula de levedura. Promotores típicos adequados para expressão em células de levedura tal como, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae e S. pombe, incluem, mas não são limitados para promotores dos seguintes genes ADH1, GALI, GAL4, CUP1, PHO5, nmt, RPR1, ou TEF1.
Em um exemplo adicional, a proteína de ligação TLla é expressa em uma célula de inseto. Promotores típicos adequados para expressão em células de inseto, ou em insetos, incluem, mas não são limitados para, o promotor OPEI2, o promotor de inseto actin isolado de Bombyx muri, o promotor Drosophila sp. dsh (Marsh et al., Hum. Mol. Genet. 9: 13-25, 2000).
Uma proteína de ligação TLla da divulgação pode também ser expressa em células de planta. Promotores para expressar peptídeos em células de planta são conhecidos na matéria, e incluem, mas não são limitados para, o promotor de gene Hordeum vulgare amylase, o promotor de vírus mosaico de couve flor 35S, o promotor de gene sintase de nopalina (nopaline synthase - NOS), e o promotor de induzível de planta auxin Pl e P2.
Em um exemplo, uma proteína de ligação TLla da divulgação é expressa em uma célula mamífera ou em um mamífero, promotores típicos adequados para expressão em uma célula de mamífero inclui, por exemplo, com promotor selecionada do grupo consistindo de elementos de retroviral LTR, o promotor precoce de SV40, o promotor tardio SV40, o promotor CMV IE (citomegalovírus precoce imediato), o promotor EFi (do fator 1 de alongamento humano), o promotor EM7, o promotor UbC (de ubiquitin C humana). Exemplos úteis de linhas de célula hospedeira de mamíferas incluem linha de rim de macaco CV1 transformada por SV40 (COS-7); linha de rim de embrião humano (HEK-293 células) ; células de rim de hamster bebê ( baby hamster kidney - BHK); células de ovário de hamster chineses ( Chinese hamster ovary - CHO) ; células de rim de macaco verde Africano (VERO-76); ou células de mieloma (exemplo, células NS/0).
Outros elementos de construção de expressões/vetores são conhecidas na matéria e incluem, por exemplo, intensificadores, terminadores transcrípcionais, sequências de poliadenilação, ácido nucléicos que codificam rotulados e origens de replicação selecionáveis ou detectáveis..
Em um exemplo, uma construção de expressão é uma construção de expressão bicistrônico. Por "bicistrônico" entende-se uma única molécula de ácido nucléico que é capaz de codificar dois polipeptideos distintos de diferentes regiões do ácido nucléico, por exemplo, um único ácido nucléico capaz de codificar um VH contendo polipeptideo e um VL contendo polipeptideo como distintos polipeptideos. Geralmente, as regiões codificando cada polipeptideo distinto são separadas por um site de entrada de reibossoma (internal ribosome entry site - IRES) e a região 5' do IRES não compreende uma sequência transcrição terminal. Exemplares IRESs são descritos, por exemplo, em US 20090247455.
Após a produção de uma construção de expressão adequado, é introduzida em uma célula adequada usando qualquer método conhecido na matéria. Métodos exemplares incluem microinjeção, transfecção mediada por DEAE-dextran, transfecção mediada por lipossomas tal como usando reagentes comercialmente disponíveis, PEG-mediada incorporação de DNA, eletroporação e bombardeamento de micropartícula como por uso de cobertura de DNA tungsten ou partículas de ouro (Agracetus Inc., WI, USA) entre outras.
As células usadas para produzir a proteína de ligação TLla desta divulgação são então colocadas em cultura sob condições conhecida na matéria para produzir uma proteína de ligação TLla da divulgação.
Sistemas de expressão de célula livre são também contemplados pela presente divulgação, exemplo, os sistemas TNT T7 e TNT T3 (Promega), os vetores pEXPl-DEST e pEXP2- DEST (Invitrogen).
Purificação de Proteína
Após produção/expressão, uma proteína de ligação TLla da divulgação é purificada usando um método conhecido na matéria. Tais purificações fornecem a proteína da divulgação substancialmente livre de proteína não específicas, ácidos, lipídeos, carboidratos, e semelhantes. Em um exemplo, a proteína será uma preparação caracterizado por: mais que cerca de 90% (exemplo 95%, 98% ou 99%) dá proteína na preparação é uma proteína de ligação TLla da divulgação. '
Métodos padrões de purificação de peptideo são empregados para obter uma proteína de ligação TLla isolada da divulgação, incluindo, mas não limitado para várias cromatografia líquida de alta pressão (ou performance) (High-Pressure Liquid Chromatography - HPLC) e protocolos de isolação de polipeptideo não HPLC, tal como cromatografia de exclusão de tamanho, de troca de ion, cromatografia interação hidrofóbica, cromatografia de modo misto, métodos de separação de fase, separações eletroforetica, métodos de precipitação, métodos de imunização dentro /fora, imunocromatografia, e/ou outro métodos.
Em um exemplo, purificação por afinidade é útil para isolar uma proteína de fusão compreendendo um rótulo marca. Métodos para isolar uma proteína usando cromatografia de afinidade são conhecidos na matéria e descritos, por exemplo, em Scopes (In: Protein purification: principles and practice, Third Edition, Springer Verlag, 1994). Por exemplo, um anticorpo ou composto que liga para o rótulo (no caso de uma etiqueta de polihistidina esta pode ser, por exemplo, níquel-NTA) é imobilizado em um suporte sólido. Uma amostra compreendendo uma proteína é então contactada para o imobilizado anticorpo ou composto por um tempo e sob condições suficientes para ocorrer a ligação. Após a lavagem para remover qualquer proteína não ligada ou não ligada especificamente, a proteína é eluída. No caso de uma proteína de ligação TLla compreendendo a região Fc de um anticorpo, proteína A ou proteína G ou formas modificadas deste pode ser usada para purificação de afinidade. Proteína A é útil para isolação de proteínas purificadas compreendendo um humano yl r y2, ou y4 cadeia pesada região Fc. Proteina G é recomendada para todos os rato Fc isotipos e para humano y3.
Conjugados
Em um exemplo, uma proteina de ligação TLla da presente divulgação é conjugado com um composto. Por exemplo, o composto é selecionada do grupo consistindo de um radioisotopo, um marcador detectável, um composto terapêutico, um colóide, uma toxina, um ácido nucléico, um peptideo, uma proteina, um composto que aumenta a meia vida da proteina de ligação TLla em um sujeito e misturas destes.
O outro composto pode ser diretamente ou indiretamente ligado para uma proteina de ligação TLla (exemplo pode compreender uma ligação no caso de ligação indireta). Exemplos de compostos incluem um radioisotopo (exemplo, iodina-131, ittrio-90 ou indio-111), a rotulado detectável (exemplo, uma fluoróforo ou um nanocristal fluorescente ou ponto quântico), um composto terapêutico (exemplo, um quimoterapêutico ou um anti-inflamatória), um colóide (exemplo, gold), uma toxina (exemplo, ricina ou toxóide tetânico), um ácido nucléico, um peptideo (exemplo, uma proteina ligada a albina de soro ) , uma proteina (exemplo, uma proteina compreendendo um dominio de ligação de antigeno de um anticorpo ou albumina de soro) , um composto que aumentas a meia vida da proteina de ligação TLla em um sujeito (exemplo, polietileno glicol ou outros polimeros solúveis em água tendo esta atividade) e misturas destes. Compostos exemplares que podem ser conjugados com uma proteina de ligação TLla da divulgação e métodos para tais conjugação são conhecida na matéria e descritos, por exemplo, em W02010/059821.
A proteína de ligação TLla pode ser conjugada com nanoparticulas (por exemplo, com revisto em Kogan et al., Nanomedicine (Lond). 2: 287-306, 2007). As nano partículas podem ser nano partículas metálicas. 5 A proteína de ligação TLla pode ser compreendida em minicélulas de bactéria direcionada para anticorpo (por exemplo, como, descritos em PCT/IB2005/000204).
Alguns compostos exemplares que podem ser conjugados com uma proteína de ligação TLla da presente divulgação são 10 listados na Tabela 3. Tabela 3. Compostos Úteis de Conjugação.
Figure img0010
Figure img0011
Ensaios de Rastreamento
As proteínas de ligação TLla compreendendo anticorpo de domínios ligação da presente divulgação são rapidamente 5 rastreada por atividade biológica, exemplo, como descrito abaixo.
Ensaios de Ligação
Uma forma de ensaio é um ensaio de ligação de antígeno, exemplo, como descritos em Scopes (In: Protein 10 purification: principles and practice, Third Edition, Springer Verlag, 1994). Tais método geralmente envolve marcação da proteína de ligação TLla e contatar com antígeno imobilizado. Após a lavagem para remover proteína de ligação não específica, a quantidade de rotulado e, como 15 uma consequência, proteína de ligação é detectável. Naturalmente, a proteina de ligação TLla pode ser imobilizada e a antigeno rotulado. ensaio tipo Panning, exemplo, como descritos ou exemplificados neste documento podem também ser usados. Alternativamente, ou adicionalmente, ensaios de superficie ressonância de plasma pode ser usado.
Em um exemplo, uma ensaio de ligação é realizado com peptideo compreendendo um epitopo de TLla. Neste caso, proteinas de ligação TLla que ligam com uma especifica região de TLla são selecionadas.
Inibição de Interação de TLla e DR3
Métodos para identificar proteinas de ligação TLla que inibem interação de TLla e DR3 será aparente para os -especialistas baseado nas descrições neste documento. Por exemplo, DR3 (exemplo, 2μg/ml de DR3) é imobilizado em uma superficie e contatada com TLla (exemplo, lμg/ml TLla) e com uma proteina de ligação TLla para ser testada (no caso de controles, um anticorpo de controle de isotipo pareado é acrescentado). Um nivel reduzido de TLla ligado para o DR3 na presença da proteina de ligação TLla comparado com na ausência da proteina de ligação TLla indica que a proteina de ligação TLla inibe ligação de TLla para DR3. 0 ensaio pode também ser realizado com imobilizado TLla par ao qual o DR3 é contatado. O ensaio pode também ser realizado com rotulado TLla e/ou DR3 par auxiliar a detecção.
Em alguns exemplos, várias concentrações da proteina de ligação TLla são testadas e a concentração na qual 50% da máxima inibição de ligação de TLla com DR3 pela proteina de ' ligação TLla é determinada (esta concentração é conhecida como EC50) . Em um exemplo, o Ec50 de uma proteina de ligação TLla da presente divulgação é menor que cerca de 5nM ou 4nM ou 3,5nM ou 3nM ou 2,5nM ou 2,3nM ou InM ou 0,5nM. Em um exemplo, o Ec50 é menor que 3nM. Em um exemplo, o Ec5o é menor que 2,5nM. Em um exemplo, o Ec50 é menor que InM. Em um exemplo, o Ec50 é menor que 0,5nM.
Em alguns exemplos, a inibição máxima de interação de TLla e DR3 é avaliada pela determinação do nivel de interação de TLla e DR3 na presença e ausência de uma proteina de ligação TLla. O nivel de inibição de interação de TLla e DR3 na presença da proteina é então expressada como uma porcentagem do nivel de interação na ausência da proteina. Em um exemplo, a proteina de ligação TLla inibe pelo menos cerca de 80% de interação entre TLla e DR3. Por exemplo, a porcentagem- de inibição é pelo menos cerca de 84% ou 85% ou 90% ou 93% ou 94% ou 95%. Em um exemplo, a porcentagem de inibição é pelo menos cerca de 93%. Em um exemplo, a porcentagem de inibição é pelo menos cerca de 94%. Em um exemplo, a porcentagem de inibição é avaliada usando um polipeptideo compreendendo DR3 fundido com uma região Fc de anticorpo. Em um exemplo, a proteina de ligação TLla é usada a uma concentração de cerca de 10μg/ml.
Inibição Seletiva de Interação de TLla e DR3
Métodos para identificar proteínas de ligação TLla que inibe interação de TLla e DR3 mas não de TLla e DcR3 será aparente para os especialistas e/ou os descritos neste documento.
Por exemplo, DcR3 (exemplo, 2μg/ml DcR3) é imobilizado em uma superfície e contatado com TLla (exemplo, lμg/ml TLla) e uma proteína de ligação TLla para ser testado (no caso de controles negativo, um anticorpo de controle de isotipo pareado é usado) . O nivel de TLla ligado para DcR3 é então determinado. Um reduzido nivel de TLla ligando com o DcR3 na presença da proteina de ligação TLla comparado com na ausência da proteina de ligação TLla indica que a proteina de ligação TLla inibe ligação de TLla com DcR3. Um nivel similar de ligação de TLla na presença ou ausência da proteina de ligação TLla indica que a proteina de ligação TLla não inibe interação de TLla e DcR3. 0 ensaio pode também ser realizado com imobilizado TLla para o qual DcR3 é contatado.
Em alguns exemplos, várias concentrações da proteina de ligação TLla são testadas para determinar o nivel de inibição de interação de TLla com DcR3 em diferentes concentrações. -
Em alguns exemplos, a inibição máxima de interação de TLla e DcR3 é avaliada pela determinação do nível de interação de TLla e DcR3 na presença e ausência de uma proteína de ligação TLla. O nível de inibição de interação de TLla e DcR3 na presença da proteína é então expressado como uma porcentagem do nível de interação na ausência da proteína. Em um exemplo, a proteína de ligação TLla a uma concentração de 10μg/ml inibe 25% ou menos da interação entre TLla e DcR3. Por exemplo, a porcentagem de inibição é 20% ou menos ou 18% ou menos ou 15% ou menos ou 12% ou menos ou 10% ou menos ou 8% ou menos ou 5% ou menos. Em um exemplo, a porcentagem de inibição é cerca de 18% ou menos. Em um exemplo, a porcentagem de inibição é cerca de 7% ou menos. Em um exemplo, a porcentagem de inibição é cerca de 5% ou menos. Em um exemplo, a porcentagem de inibição é avaliada usando um polipeptideo compreendendo DcR3 fundido com uma região Fc anticorpo. Em um exemplo, a proteína de ligação TLla é usada a uma concentração de cerca de lOμg/ml.
Ensaios de Neutralização
Métodos para identificar proteinas de ligação TLla que neutraliza atividade TLla através DR3 também será aparente para os especialistas, exemplo, baseado na descrição neste documento. Por exemplo, células expressando DR3 (exemplo, células TF-1) (exemplo, cerca de 7xl04 células a 8xl04 células - exemplo, 7,5xl04 células) são contatadas com TLla e uma inibidor de sintese de proteina (exemplo cicloheximida) na presença ou ausência de uma proteina de ligação TLla para ser testada. O nivel de apoptose das células é então avaliada, exemplo, por detecção de ativação de captação de caspases ou iodeto de propidio ou outros ensaios conhecidos. Uma proteina de ligação TLla que reduz o nivel de apoptose comparado com o nivel de apoptose na ausência da proteina de ligação TLla é considerado para inibir atividade TLla ou neutralizar atividade TLla através DR3.
Em alguns exemplos, várias concentrações da proteina de ligação TLla são testadas para determinar o nivel de neutralização a diferentes concentrações. Em alguns exemplos, a concentração na qual 50% da máxima inibição de apoptose da proteina de ligação TLla é determinada (esta concentração é conhecida como EC50) . Em um exemplo, o Ecso de uma proteina de ligação TLla da divulgação é 3nM ou menor, por exemplo, cerca de 2,5nM ou menor, tal como cerca de 2,4nM ou menor, por exemplo, cerca de 2nM ou menor, tal como cerca de l,5nM ou menor, tal como cerca de InM ou menor. Em um exemplo, o Ec50 de uma proteina de ligação TLla da presente divulgação é cerca de 0,99nM ou menor. Em um exemplo, o Ec50 de uma proteina de ligação TLla da presente divulgação é cerca de 0,6nM ou menor. Em um exemplo, o Ec50 de uma proteina de ligação TLla da presente divulgação é cerca de 0,4nM ou menor.
A habilidade de uma proteina de ligação TLla da divulgação para neutralizar atividade de TLla pode também ser avaliada por determinação de suas habilidade par reduzir secreção de citocina por células imune. Por exemplo, PBMCs são contatado com Concanavalin A na presença ou ausência de uma proteina de ligação TLla. O nivel de secreção de uma citocina induzida em TLla (exemplo, interferon y ou IL-13) é então avaliada, exemplo, usando um ELISA. Redução de secreção de citocina na presença da proteina de ligação TLla comparado com na ausência da proteina indicada que a proteina de ligação TLla neutraliza atividade TLla.
Em alguns exemplos, várias concentrações da proteina de ligação TLla são testadas para determinar o nivel de redução na secreção de citocina a diferentes concentrações. Em alguns exemplos, a concentração e que 50% da máxima inibição de secreção de citocina pela proteina de ligação TLla é determinada (esta concentração é conhecida como EC5Q) . Por exemplo, o Ec50 para inibir secreção de interferon-y é 4nM ou menor, tal como 3nM ou menor ou 2,5nm ou menor ou 2nM ou menor. Em outro exemplo, o Ec50 para inibição de secreção de IL-13 é 15nM ou menor, tal como lOnM ou menor, por exemplo, 5nM ou menor, tal como lnM ou menor. Por exemplo, o Ec50 para inibição de secreção de IL- 13 é 0,5nM ou menor.
Outros ensaios para determinar a neutralização de atividade TLla inclui determinar o nivel de proliferação, migração e formação de tubo de células endotelial na presença e ausência da proteina de ligação TLla. Por exemplo, células endoteliais são colocadas em cultura em uma matriz Extracelular, exemplo, Matrigel™, e o nivel de migração e/ou formação de tubo é determinada, exemplo, usando microscópio. Um aumento na migração e/ou formação de tubo na presença da proteina de ligação TLla comparada com na ausência da proteina de ligação TLla indica que a proteina de ligação TLla neutraliza atividade TLla através de DR3.
Ensaios in vivo de plug Matrigel™ podem também ser realizados, exemplo, essencialmente como descritos em Bagley et al., Cancer Res 63: 5866, 2003.
Ensaios adicionais incluem avaliar a habilidade de uma proteina de ligação TLla para reduzir ou prevenir interferon y secreção de sangue periférico de células T e/ou células NK estimulada com IL-12 e/ou IL-18 ou em atividade de monócitos FcyR. Ensaios In Vivo
As proteinas de ligação TLla da presente divulgação podem também ser avaliadas pela eficácia terapêutica em um modelo animal de uma condição, exemplo, uma condição medida por TLla. Por exemplo, a proteina de ligação TLla é administrada para um modelo de doença de intestino inflamatória ou colite (exemplo, sulfato de sódio de dextran (dextran sódio sulfate - DSS)- colite induzida ou modelo adaptativo de transferência de colite CD45Rb (exemplo, Kanai et al., Inflamm. Intestino Dis. 12: 89-99, 2006) . Em outro exemplo, uma proteina de ligação TLla é administrada para um modelo de esclerose múltipla, exemplo, modelos de EAE em que um rato ou camundongo é imunizado com uma proteina de bainha de mielina ou peptideo derivado destes (exemplo, MOG, MBP ou PLP) e uma resposta imune é gerada contra a proteina assim induzindo um modelo de esclerose múltipla. Modelos exemplares de EAE são visto em, por exemplo em Tsunoda e Fujinami, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 55: 673-686, 1996. A proteina de ligação TLla pode também ou alternativamente ser testada em um modelo de artrite exemplo, um cepa de rato SKG (Sakaguchi et ai., Nature 426: 454-460, 1995), modelo de artrite de colágeno de camundongo tipo II, modelo de artrite de colágeno de rato tipo II ou modelos de artrite induzida de antigeno (Bendele J. Musculoskel. Neuron. Interact. 1: 377-385, 2001) e/ou a modelo de doença inflamatórias das vias respiratórias (por exemplo, desafio de OVA ou desafio de antigeno barata), ou em um modelo de inflamatória uveite por exemplo interfotoreceptor retinóide ligando uveoretinite induzido por imunização de proteina (Caspi, Curr Protoc Imunol Chapter 15: unit 15.6, 2003).
A habilidade de uma proteina de ligação TLla da presente divulgação para neutralize atividade TLla pode também ou alternativamente ser avaliada em um modelo de enxerto versus resposta de hospedeiro, exemplo, em que esplenócitos de um animal são injetados em um animal alogénico (exemplo, um MHC ou HLA animal não pareado). Ensaios Mapeando Epitopo
Em outro exemplo, o limite de epitopo por uma proteina descrita neste documento é mapeada. Métodos de mapeamento de Epitopo serão aparentes para os especialistas. Por exemplo, uma série de peptideos que se sobrepõem abrangendo a sequência de TL1 ou uma região desta compreendendo um epitopo de interesse, exemplo, peptideos compreendendo 10 a 15 aminoácidos são produzidos. A proteina de ligação TLla é então contatada para cada peptideo ou uma combinação deste e o peptideo(s) para o qual se liga determinado. Isto permite a determinação de peptideo (s) compreendendo o epitopo para os quais a proteina de ligação TLla se liga. Se múltiplos peptideos não contiguos são limite para a proteina, a proteina pode ligar um epitopo conformacional.
Alternativamente, ou em adição, residuos de aminoácido dentro do TLla são mutado, exemplo, por metagênese de varredura de alanina, e mutações que reduzem ou previnem ligação de proteina são determinadas. Qualquer mutação que reduz ou previne ligação da proteina de ligação TLla é conhecidamente para estar dentro do limite do epitopo pela proteina. Uma forma deste método é exemplificada neste documento.
Um método adicional envolve ligação de TLla ou uma região deste para uma proteina de ligação TLla imobilizada da presente divulgação e digerindo o complexo resultante com proteases. Os peptideo que permanecem limite para a proteina imobilizada são então isolados e analisados, exemplo, usando espectrometria de massa, para determinar suas sequências.
Ensaios de Afinidade
Opcionalmente, a constante dissociação (Kd) ou constante associação (Ka) ou constante equilíbrio (KD) de uma proteina de ligação TLla para TLla ou um peptideo compreendendo um epitopo deste é determinado. Estas constantes para uma proteina de ligação TLla são em um exemplo medidas por um ensaio de ligação de TLla por marcador radioativo ou marcação fluorescente. Este ensaio equilibra a proteina com um concentração minima de TLla rotulado na presença de uma série de rotulação de TLla não rotulado. Após a lavagem para remover TLla não limite, a quantidade de rotulo é determinado.
Medidas de afinidade podem ser determinadas por metodologia padrão para reações de anticorpos, por exemplo, imunoensaios, ressonância de superficie plasma resonance (Surface Plasmon Resonance - SPR) (Rich e Myszka Curr. Opin. Biotechnol 11: :54, 2000; Englebienne Analyst. 123: 1599, 1998), isothermal titration calorimetry (ITC) ou outro ensaios de interação cinética conhecidos na matéria.
Em um exemplo, as constantes são medidas pelo-uso de ensaios de ressonância de superficie de plasma, exemplo, usando ressonância de superficie de plasma Biacore (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) com imobilizado TLla ou uma região deste. Métodos exemplares de SPR são descritos em US 7229619.
Em um exemplo, uma proteina de ligação TLla como descrito neste documento de acordo com qualquer exemplo tem um KD para TLla de lOOnM ou menor, tal como 50nM ou menor, por exemplo, 20nM ou menor, por exemplo, lOnM ou menor ou 6nM ou menor. Por exemplo, uma proteina de ligação TLla tem um KD de 5,5nM ou menor. Por exemplo, uma proteina de ligação TLla tem um KD de 5nM ou menor. Por exemplo, uma proteina de ligação TLla tem um KD de 4nM ou menor.
Ensaios de Meia Vida
Algumas proteinas de ligação TLla englobadas pela presente divulgação tem uma melhora da meia vida, exemplo, são modificadas para estender suas meia vida comparada com proteinas de ligação TLla que não são modificadas. Métodos para determinar uma proteina de ligação TLla com uma meia vida melhorada será aparente para uma pessoa experiente. Por exemplo, uma habilidade de uma proteina de ligação TLla para ligar a um receptor neonatal Fc (FcRn) é avaliada. A este respeito, aumenta da afinidade de ligação pelo aumento de . media vida de soro de FcRn da proteina de ligação TLla (ver por exemplo, Kim et al., Eur. J. Imunol. 24: 2429, 1994) .
Uma meia vida de uma proteina de ligação TLla da divulgação pode também ser medida por estudos farmacocinético, exemplo, de acordo com o método descrito por Kim et al, Eur. J. de Imunol. 24: 542, 1994. De acordo com este método de radiorotulada proteina de ligação TLla é injetada intravenosamente no camundongo e sua concentração de plasma é periodicamente medida com uma função do tempo, por exemplo, de 3 minutos a 72 horas depois da injeção. A curva de depuração assim obtida deve ser bifásica, isto é, uma fase alfa e uma beta. Para a determinação da meia vida in vivo da proteina de ligação TLla, a razão de depuração na fase beta é calculada e comparada com aquela do tipo selvagem ou não modificada Proteina de ligação TLla.
Ensaios de Estabilidade
A estabilidade de uma proteina de ligação TLla da divulgação pode ser avaliada por qualquer um de uma variedade de ensaios. Por exemplo, a proteina de ligação TLla é exposta para uma condição, exemplo, calor ou ácido ou armazenada por um periodo de tempo (exemplo, 1 mês) a temperatura ambiente. Agregação da proteina de ligação TLla pode então ser avaliada pela determinação turvação (com um aumento na turvação seguido por exposição para a condição indicativa de instabilidade) , cromatografia de exclusão de tamanho, eletroforese de não redução de gel ou a ligação ou estudo de neutralização descrito neste documento.
Composições Farmacêuticas e Métodos de Tratamento
A proteina de ligação TLla da presente divulgação ou ácido nucléico codificando a mesma ou célula expressando a mesma (syn. ingrediente ativo) é útil para administração parenteral, topical, oral, ou local, administração aerossol, ou administração transdermal, para tratamento profilático ou terapêutico. Formulação de uma proteina de ligação TLla ou ácido nucléico que codifica a mesma ou célula expressando a mesma para ser administrada variará de acordo com a rota de administração e formulação (exemplo, solução, emulsão, cápsula) selecionada. Uma composição farmacêutica apropriada compreendendo proteina de ligação TLla ou ácido nucléico que codifica a mesma ou célula expressando a mesma para ser administrada pode ser preparada em um transportador fisiologicamente aceitável. Uma mistura de proteinas de ligação TLla pode também ser usado. Para soluções ou emulsões, adequados transportadores incluem, por exemplo, soluções aquosa ou alcoólico-aquosa, emulsões ou suspensões, incluindo meios salino e tampões. Veiculos parenteral podem incluir solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer com lactado ou óleos fixadores. Uma variedade de apropriados transportadores aquosos são conhecidos para os especialistas, incluindo água, salina tamponada, pólios (exemplo, glicerol, propileno glicol, polietileno glicolliquido), solução de dextrose e glicina. Veiculos intravenoso podem incluir vários aditivos, preservativos, ou fluido, nutriente ou eletrólito reforçado (Ver, em geral, Remington's Pharmaceutical Science, 16th Edition, Mack, Ed. 1980). As composições podem opcionalmente conter substâncias auxiliares aceitáveis farmaceuticamente como requerido para aproximar condições fisiológicas tal como ajuste de pH e agentes tampão e agentes de ajuste de toxicidade, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio e sódio lactado. A proteina de ligação TLla desta divulgação pode ser liofilizado para armazenagem e reconstituído em um transportador adequado para o uso de acordo com as técnicas de liofilização e reconstituição conhecidas na arte.
A concentração ótima do ingrediente(s) ativo mo meio escolhido pode ser determinado empiricamente, de acordo com procedimentos bem conhecidos para os especialistas, e dependerá da formulação farmacêutica final desejada.
Os intervalos de dosagem para a administração da proteina de ligação TLla da divulgação são aqueles suficientemente grande para produzir o efeito desejado. Por exemplo, a composição compreende uma quantidade efetiva terapeuticamente ou profilaticamente de uma proteina de ligação TLla ou ácido nucléico que codifica a mesma ou célula expressando a mesma.
Como usado neste documento, o termo "quantidade efetiva" deve ser entendido como uma quantidade suficiente da proteina de ligação TLla, ácido nucléico ou células para induzir/aumentar ou inibir / reduzir / prevenir sinalização de TLla em um sujeito. O experiente na matéria estará ciente que uma tal quantidade variara dependendo, por exemplo, da proteína de ligação TLla, ácido nucléico ou células e/ou o particular sujeito e/ou o tipo ou severidade de uma condição sendo tratada. Consequentemente, este termo não é para ser construído para limitar a divulgação para um quantidade específica, exemplo, peso ou número de proteínas de ligação TLla, ácido nucléicos ou células.
Como usado neste documento, o termo "quantidade terapeuticamente efetiva" deve ser usada para significar uma quantidade suficiente de Proteína de ligação TLla, ácido nucléico ou células para reduzir ou inibir uma ou mais sintomas de uma condição.
Como usado neste documento, o termo "quantidade profilaticamente efetiva" deve ser usada para significar uma quantidade suficiente de Proteína de ligação TLla, ácido nucléico ou células para prevenir ou inibir ou retardar o inicio de um ou mais sintoma detectáveis de uma condição.
A dosagem não deve ser tão grande que cause efeitos colaterais, tal como sintomas de hiper viscosidade, edema pulmonar, insuficiência cardíaca congestiva, e semelhantes. Geralmente, a dosagem variara com a idade, condição, sexo e extensão da doença no paciente e pode ser determinada por um experiente na matéria. A dosagem pode ser ajustada pelo médico individual no evento de qualquer complicação. A dosagem pode variar de cerca de 0, 1 mg/kg a cerca de 300 mg/kg, exemplo, de cerca de 0,2 mg/kg a cerca de 200 mg/kg, tal como, de cerca de 0,5 mg/kg a cerca de 20 mg/kg, em um ou mais administrações de doses diárias, por um ou vários dias.
Em um exemplo, a proteína de ligação TLla é administrada a uma dosagem de entre cerca de lmg/kg a cerca de 15mg/kg. Em ’um exemplo, a proteína de ligação TLla é administrado a uma dosagem de entre cerca de 2mg/kg a cerca de lOmg/kg. Em um exemplo, a proteina de ligação TLla é administrado subcutaneamente ou intravenosamente.
Em alguns exemplos, a proteina de ligação TLla ou outro ingrediente ativo é administrado a uma dose inicial (ou carga) , a uma dose mais elevada do que as doses subsequentes (doses de manutenção). Por exemplo, a ligação molécula é administrado a uma dose inicial de entre cerca de lmg/kg a cerca de 30mg/kg. A molécula de ligação é então administrada a uma dose de manutenção de entre cerca de 0,0001mg/kg a cerca de lmg/kg. As doses de manutenção podem ser administradas a cada 7 a 35 dias, tal como, a cada 14 ou 21 ou 28 dias.
Em alguns exemplos, um regime de escalonamento de dose é usado, em que uma proteina d-e ligação TLla ou outro ingrediente ativo é inicialmente administrado a uma dose inferir a que é usada nas doses subsequentes. Este regime de dosagem é útil no caso do sujeito sofrer evento adverso inicialmente. No caso de um sujeito que não esta respondendo adequadamente ao tratamento, múltiplas doses em uma semana pode ser administrada. Alternativamente, ou adição, aumento de doses pode ser administrado.
Uma ou mais proteinas de ligação TLla da presente divulgação podem ser administradas para um individuo por uma rota apropriada, sozinha ou em combinação com (antes, em simultâneo com, ou após) outra droga ou agente. Por exemplo, a proteina de ligação TLla da presente divulgação pode também ser usada em combinação com proteinas, exemplo, um agonista TNF, um anticorpo anti-IL-12/23, um anti- inflamatória, um corticosteróide, metotrexata ou um analgésico. A proteina de ligação TLla da presente divulgação, podem ser usados como composições administradas separadamente, dadas em conjunto com antibióticos e/ou agentes antimicrobianos.
Será apreciado por experientes na matéria que as proteinas de ligação TLla da presente divulgação podem ser introduzidas dentro do sujeito por administrar um construção de expressão da divulgação ou uma expressão de célula de uma proteina de ligação TLla da divulgação. Um variedade de métodos podem ser usados para introduzir um ácido nucléico codificando o anticorpo dentro de uma célula alvo in vivo. Por exemplo, o ácido nucléico livre pode ser injetado no site alvo, pode ser encapsulado dentro de liposomas, ou pode ser introduzido por meio de um vetor virai. –
Ensaios de Detecção de TLla
Os ensaios seguintes podem ser realizada com uma proteina de ligação TLla da divulgação, exemplo, uma proteina de ligação TLla conjugada com um rotulo detectável como discutido neste documento. A detecção de TLla com um ensaio descritos neste documento é útil para diagnosticar ou prognosticar uma condição.
Um imunoensaio é um formato de ensaio exemplar para diagnosticar uma condição em um sujeito ou detectar TLla em uma amostra. A presente divulgação contempla qualquer forma de imunoensaio, incluindo Western blotting, ensaio imunoenzimático (Enzyme-Linked ImunoSorbent Assay - ELISA), ensaio imunofluorescente (Fluorescence-Linked ImunoSorbent Assay FLISA), ensaio de competição, radioimunoensaio, imunoensaio de fluxo lateral, imunoensaio através de fluxo, ensaio eletroquimioluminescente, ensaios baseado em nefelómetro, ensaio turbidimétrico, e ensaio baseado em seleção de atividade de fluorescência de célula (fluorescence activated cell sorting - FACS).
Uma forma de um adequada imunoensaio é, por exemplo, um ELISA ou FLISA.
Em uma forma tal ensaio envolve imobilizar uma proteina de ligação TLla da divulgação em uma matriz sólido, tal como, por exemplo um micro poço ou vareta de poliestireno ou policarbonato, uma membrana, ou um suporte de vidro (exemplo uma lâmina de vidro). Uma amostra de teste é então colocado em contato direto com a proteina de ligação TLla e TLla na amostra é delimitado ou capturado. Após a lavagem para remover qualquer proteina não ligada na amostra, uma proteina que se liga para TLla em um epitopo distinto é colocada em contato direto com o TLla capturado. Esta detector de proteina é geralmente rotulado com uma molécula repórter detectável, tal como por exemplo, uma enzima (exemplo peroxidase de rábano ( horseradish peroxidase - HRP), fostatase alcalina (alkaline phosphatase - AP) ou galactosidase β-) no caso de um ELISA ou um fluoróforo no caso de um FLISA. Alternativamente, uma segunda proteina rotulada pode ser usada que liga para a proteina detectada. Após a lavagem para remove qualquer proteina não ligada a molécula repórter detectável é detectável pela adição de um substrato no caso de um ELISA, tal como por exemplo peróxido de hidrogênio, TMB, ou toluidina, ou 5-bromo-4-cloro-3-indol-beta-D- galaotopiranosida (x-gal). Naturalmente, a proteina imobilizada (capturada) e a proteina detectada pode ser usada de maneira oposta. O nivel do antigeno na amostra é então determinado quantidades conhecidas do marcador ou por comparação com uma amostra de controle.
Os ensaios descritos acima são prontamente modificados para o uso de quimioluminescência ou eletroquimioluminescência como a base para detecção.
Como será aparente para os especialistas, outros métodos de detecção baseado em um ensaio de imunosorbente são útil na realização da presente divulgação. Por exemplo, um método imunosorbente baseado na descrição supra usando um radiomarcação para detecção, ou um etiquetagem ouro (exemplo ouro coloidal) para a detecção, ou um liposoma, por exemplo, encapsulamento NAD+ para detecção ou um ensaio imunosorbente ligado a acridinio.
Em alguns exemplos da divulgação, o nivel de TLla é determinado usando uma superfície de detecção de ressonância de plasma (exemplo, BIAcore™, GE Healthcare, Piscataway, N.J.), um fluxo através do dispositivo, por exemplo, como descrito em US 7205159; um dispositivo de micro ou nano imunoensaio (exemplo, como descrito em US 20030124619); um dispositivo de fluxo lateral (exemplo, como descrito em US 20040228761 ou US 20040265926); um imunoensaio de polarização fluorescente ( fluorescence polarization immunoassay - FPIA exemplo, como descrito em US 4593089 ou US 4751190); ou um ensaio imunoturbidimetrico (exemplo, como descrito em US 5571728 ou US 6248597).
Amostras e Amostras de Controle
Como será aparente para os especialistas, alguns dos exemplos descritos neste documento requerem algum grau de quantificação para determinar o nivel de TLla. Tal quantificação pode ser determinada pela inclusão de uma amostra de controle adequada em um ensaio da divulgação.
Em um exemplo, a amostra de controle adequada é uma amostra que é derivada de um sujeito saudável ou um sujeito normal. No presente contexto, o termo "sujeito saudável" pode ser usado para significar um individuo que é conhecido por não sofrer de uma condição associada com TLla, exemplo, uma condição inflamatória.
O termo "sujeito normal" pode ser usado para significar um individuo tendo um nível normal de TLla em uma amostra comparada com uma população de indivíduos.
A presente divulgação também contempla a amostra de controle com sendo um conjunto de dados obtido de um sujeito normal e/ou saudável ou uma população de sujeitos normais e/ou saudáveis.
Em um exemplo, um método da divulgação adicionalmente compreende determinar o nível de TLla em uma amostra de controle, exemplo, usando um método descrito neste documento.
Em um exemplo, uma amostra do sujeito e uma amostra de controle são ensaiadas a aproximadamente ou substancialmente ao mesmo tempo.
Em um exemplo, a amostra do sujeito e a amostra de controle são ensaiadas usando o mesmo método da divulgação ' como descrito neste documento em qualquer um ou mais exemplos para permitir a comparação de resultado.
Condições
Condições exemplares que podem ser tratadas/prevenidas/diagnostiçadas/prognosticadas, pela realização de um método da divulgação incluem doenças autoimune, condições inflamatórias, e condições caracterizadas por angiogénese insuficiente.
Em um exemplo, a condição é uma doença autoimune.
Condições exemplares incluem doença de intestino inflamatória (Inflammatory Bowel Disease - IBD) , sindrome de intestino irritável (Irritable Bowel Syndrome - IBS), doença de Crohn, colite ulcerativa, doença diverticular, lúpus eritematoso sistêmico (systemic lupus erythematosus), artrite reumató-ide, artrite juvenil crônica, espondiloartropatias, esclerose sistêmica (escleroderma), miopatia idiopatica inflamatória (dermatomiosite, polimiosite), sindrome de Sjogren, vasculite sistêmica, sarcoidose, doenças desmielinizante do sistema nervoso central e periférico tal como esclerose múltipla, poli neuropatia idiopática, doença ocular mediada por autoimune ou imune tal como uveite autoimune e uveite associada com várias vasculites, doenças de pele mediada por autoimune ou imune incluindo doenças da pele bolhosa, eritema multiforma e dermatite de contato, psoriase, doenças alérgicas do pulmão tal como asma, hipersensibilidade das vias respiratórias, pneumonia sinofilica, doença pulmonar obstrutiva crônica (Chronic Obstructive Pulmonary Disease - COPD), fibrose pulmonar idiopática e pneumonia por hipersensibilidade, aterosclerose ou doença de hospedeiro versus enxerto. Em ' um exemplo, a condição é artrite, exemplo, artrite reumatoide, poli artrite, osteoartrite ou uma espondiloartropatia. A este respeito, Bull et al., J. Exp. Med. 205: 2457, 2008 mostrou que anticorpos que antagonize TLla são úteis para o tratamento de artrite reumatóide. A natureza seletiva das proteinas de ligação TLla da presente divulgação tornam-nas úteis para o tratamento de artrite reumatóide.
Em um exemplo, a condição é esclerose múltipla. A este respeito, US 20090317388 mostra que camundongo deficiente em TLla não desenvolveram experimental autoimune encefalomielite (Experimental Autoimmune Encephalomyelitis - EAE), que é um modelo aceitável de esclerose múltipla.
Em um exemplo, a condição inflamatória é uma condição de mucosa inflamatória, exemplo, uma doença inflamatória do intestino (exemplo, doença inflamatória do intestino, doença de Crohn ou colite ulcerativa), ou uma doença inflamatória do pulmão (exemplo, hiper reatividade das vias respiratórias ou asma).
Em um exemplo, a condição é doença inflamatória do intestino e/ou colite. A este respeito, Takedatsu et al., Gastroenterology 135: 552, 2008 mostrou que anticorpos que antagonize TLla são úteis para o tratamento de colite.
Em um exemplo, a condição é asma ou hipersensibilidade das vias respiratórias ou doença pulmonar obstrutiva crônica (Obstructive Pulmonary Disease - COPD) .
Em outro exemplo, a condição é uma doenças de pele inflamatória (exemplo, uma doenças de pele mediada por autoimune ou imune), exemplo, uma doenças de pele bolhosa, eritema multiforma, dermatite de contato.
Alternativamente, a doença de pele é psoriase.’
Condições exemplares caracterizadas por angiogénese insuficiente incluem doença cardiovascular, condições autoimune (exemplo, artrite reumatóide, artrite psoriática, lúpus eritematoso sistêmico (Systemic Lupus Erythematosus - SLE) e esclerose sistêmica) , vasculite associada com anticorpos citoplasmáticos de neutrófilos (antineutrophil cytoplasmic antibodies - ANCA), isquemia (incluindo isquemia resultante de um transplante) ou necrose. Kits
A presente divulgação adicionalmente compreende um kit compreendendo um ou mais dos seguindo: (i)uma proteina de ligação TLla da divulgação ou construção de expressão(s) codificando a mesma; (ii) uma célula da divulgação; ou (iii) uma composição farmacêutica da divulgação. No caso de um kit para detecção de TLla, o kit pode adicionalmente compreender um meios de detecção, exemplo, ligado para uma proteina de ligação TLla da divulgação. No caso de um kit para uso terapêutico/profilático, o kit pode adicionalmente compreender um transportador aceitável farmaceuticamente. Opcionalmente um kit da divulgação é empacotado com instruções para uso em um método descrito neste documento de acordo com qualquer exemplo.
A presente divulgação inclui os seguintes Exemplos não limitantes.
Exemplo 1: Materiais e Métodos
Nos exemplos seguintes, referência para uma posição de um resíduo é uma referência para a posição na sequência relevante conforme estabelecido neste documento, a menos que de outra maneira indicado.
1.1 Sistema de Expressão de HEK293/pTT5
Para todas as transfecções envolvendo o sistema de expressão HEK293E/pTT5 (Durocher et ai., Nucl. Acids Res., 30: E9, 2002) , células HEK293E foram cultivadas em meio de crescimento completo de célula (1 1 de meio de F17 (Invitrogen), 9 ml de Pluronic F68 (Invitrogen), 2mM
Glutamina contendo 20% (p/v) Triptona NI (Organotechnie) com Geneticin™ (50 mg/ml, Invitrogen) a 50 μl/100 ml cultura) . No dia antes de transfecção, as células foram colhidas por centrifugação e re-suspensa em meio fresco sem Geneticin™. No dia seguinte, DNA foi misturado com um reagente de transfecção comercial e a mistura de DNA transfectado acrescentada para a cultura a conta gota. A cultura foi incubada durante a noite a 37°C, 5% CO2 e 120rpm sem Geneticin™. No dia seguinte 12,5 ml de Triptona e 250 μl de Geneticin™ foram acrescentados por 500 ml cultura. A cultura foi incubada a 37°C, 5% CO2 e 120rpm por sete dias, então os supernadantes foram colhidos e purificados. 1.2 Proteina TLla
O TLla humano foi conseguido (Peprotech e Genscript: ambos expressado E.coli) ou produzido em mamíferas sistema de expressão HEK293E/pTT5 , usando uma construção de expressão de DNA codificado para o dominio extracelular (ECD) de humano TLla com um N-terminalmente localizado HIS e FLAG tag (SEQ ID NO: 1) . A cultura de supernadantes contendo as proteina TLla segregadas foi colhidas por centrifugação a 2000 g por 10 minutos para remover as células. A proteina TLla foi purificada dos supernadantes usando uma HisTrap™ HP coluna (GE Healthcare). A proteina eludida foi trocada de tampão em PBS usando um HiLoad 16/60 Superdex 200 prep coluna de grade (GE Healthcare) e aproximadamente fração de 70kDa foi separada por filtração em um HiLoad 26/60 Superdex 200 prep coluna de grade (GE Healthcare). Para as experiências de exibição em fagos, recombinante TLla humano (Peprotech, Genscript HEK293E- derivado) foi biotinilatado usando um Kit de EZ-link Sulfo- NHS-LC-biotin (Pierce) a uma razão de 3:1 de biotina:TLla. A biotina livre foi removida da preparação de proteina por diálise contra PBS usando um Slide-A-Lyzer diálise cassete com um peso molecular de 3,5 kDa . TLla também foi produzido com uma marca que permitiu único biotinilação local. Esta proteina TLla foi expressada em células HEK-293 e purificada como descrito previamente. Foi então biotinilatada usando uma enzima que seletivamente incorpora uma biotina na proteina TLla.
1.3 Exibição de Fagos
Anticorpos que ligam especificamente para TLla foram isolados de uma biblioteca de fagomideo simples compreendendo mais que lOxlO10 fragmentos de individual FAb humano. Os anticorpos anti-TLla foram isolados de uma biblioteca de exibição de fago ao longo de vários "panning" ou "campanhas" (ou seja, experiências de exibição em fagos discretos com diferentes reagentes ou condições de "panning"). O protocolo geral seguindo o método delineado por Marks e Bradbury {Methods Mol. Biol. 248: 161-176, 2004) • Cada campanha de exibição de fago envolve três rodadas de panning. Para cada rodada, aproximadamente IxlO13 partículas de fago foram bloqueadas por misturar 1:1 com tampão de bloqueio (5% de leite desnatado em fosfato tamponado salino (Phosphate Buffered Saline - PBS) pH 7,4) e incubado por lh a temperatura ambiente. A biblioteca de fago bloqueada foi então pré esgotado por ligantes de estreptavidina por incubação por 45 minutos com 100 μL de Dinagrânulos acoplado com estreptavidina (Invitrogen), que foram bloqueados como descritos para a biblioteca. Os grânulos (e ligandos de estreptavidina ligados para eles) foram descartados após o passo de incubação.
Recombinante de antigeno TLla de humano foi preparado por panning para capturar na superficie de Dynabeas acoplados com estreptavidina (Invitrogen). Para alcançar este objetivo, 10 a 100 pmol de biotinlatado TLla foi incubado com 100 μL de grânulos por 45 minutos a temperatura ambiente. O resultante complexo de grânulos TLla foram lavados com PBS para remover TLla livre e então usado na subsequente reação de panning.
Panning da biblioteca foi realizada por mistura da biblioteca pré-bloqueada e esgotada com complexo de grânulos TLla em um tubo micro centrifugo de 1,5 ml e em rotação por 2 horas a temperatura ambiente. Fagos não especificamente limitados foram removidos usando uma séries de lavagens. Cada lavagem envolve puxar complexos de grânulos da solução na parede de tubo usando uma cremalheira magnética, aspirando o supernadante e então os grânulos re-suspenso em tampão de lavagem fresco. Este foi repetido um número de vezes com lavagem tampão PBS (PBS com 0,5% leite desnatado) ou lavagem tampão PBS-T (PBS com 0,05% TWEEN-20 (Sigma) e 0,5% leite desnatado) . Fago que permaneceu ligado após o processo de lavagem foram eluidas do complexo de grânulos TLla por incubação com 0,5 ml de 100 mM trietilamina (TEA) (Merck) por 20 minutos a temperatura ambiente. Os fago eludidos 'de saida' foram neutralizados por adição de 0,25 ml de 1 M Tris-HCl pH 7,4 (Sigma).
No final do primeira e segunda rodada de panning, os fagos de saida foram acrescentados para uma cultura de 10 ml de crescimento exponencial de TGI E. coli (meio de crescimento de levedura-triptona (Yeast-Tryptone - YT) ) e permitido para infectar as células por incubação por 30 minutos a 37 °C sem agitação, então com agitação de 250 rpm por 30 minutos. Os f.agomideos codificando a exibição de fago saida foram então resgatados como partículas de fago seguindo um protocolo padrão (Marks e Bradbury, supra) .
No final da terceira rodada de panning células TG1 foram infectadas com fago de saida, mas as células foram colocadas em um meio de crescimento sólido YT (suplementado com 2% glicose e 100 μg/ml carbenicillina) a uma diluição suficiente para produzir discreta colônia de E. coli. Estas colônia foram usadas para inoculada cultura líquida de 1 ml para permitir expressão de fragmentos de FAb para uso em experiências de rastreio.
1.4 Rastreamento de FAbs baseado em SPR para Ligação de TLla
Cada colônia individual de E. coli foi usada para expressar um FAb que poderia ser rastreado por atividade de ligação TLla. Colônias foram inoculadas em 1 ml de cultura de partida YT (suplementada com 100 μg/ml carbenicilina e 2% glicose) em placas 96-poços deepwell (Costar) e incubadas durante a noite a 30°C com agitação a 650 rpm. Estas culturas de partida foram diluídas 1:50 em uma expressão de cultura de 1 ml (YT suplementada só com 100 μg/ml carbenicilalina) e cultivada até uma densidade óptica de 0,8 a 1,0 a 600 nm. A expressão FAb foi induzida por adição de isopropil-beta-D-tiogalactopiranosida para uma concentração final de 1 mM. As culturas foram incubadas a 20°C por 16 horas.
Amostras FAb foram preparadas por colheita de células por centrifugação (2500 g, 10 minutos) e realizada uma extração periplásmica. A célula de peletização foi resuspensa em 75 μL de tampão de extração (30mM Tris-HCl, pH 8,0, lmM EDTA, 20% Sucarose) e agitada a 1000 rpm por 10 minutos a 4 °C. A preparação de extração foi completada por adição de 225 μL de H20, agitado a 1000 rpm por 1 hora e o extrato limpo por centrifugação a 2500g por 10 minutos. Os supernadantes foram recuperados, filtrados através Acroprep 100 kDa peso molecular de placas cortados (Pali Corporation) e armazenados a 4 °C até se requerido para experimentos adicionais.
As amostras FAb foram rastreada por atividade de ligação TLla usando um ensaio de ressonância de superficie plasma (Surface Plasmon Resonance - SPR) . Um alto rendimento de rastreamento SPR foi conduzido usando um BIAcore 4000 Biosensor (GE Healthcare) em um ensaio passagem de analito de concentração única. Aproximadamente 10.000 RU de anticorpo antiV5 (Invitrogen cat#R960CUS) foi imobilizado em uma Série CM5 S Sensor chip, usando quimica padrão de acoplamento de amina a pH 5,5 em manchas de 1, 2, 4 & 5 de cada um dos quatros fluxos de partida de células dos 3 não modificados, o tampão de corrida usado foi HBS- EP+ (GE Healthcare) e todas as interações medidas a 25°C e taxa de coleta de dados definido para 10 Hz. Preparação de periplásmico bruto de V5-tagged FAbs, foram diluídos duas vezes em tampão de corrida antes de capturar em um razão de fluxo de 10ul/m por 100 segundos (tipicamente cerca de 200RU de FAb foi capturado) uma mancha de 1 ou 5 de cada fluxo de célula. Seguindo um curto período de estabilização, trimer TLla humano foi passado através de todas as manchas dos quatros fluxos de células simultaneamente a uma razão de fluxo de 30μl/m por 100 segundos. Dissociação da interação foi mediada por 100 segundos antes de a regeneração retornar para o anticorpo antiV5 usando um pulso de 30 segundos de lOOmM de ácido fosfórico. Os sensorgramas gerados foram referenciados contra um adjacente mancha de anticorpo antiV5 para cada fluxo de célula, e equipado usando uma 1:1 equação de Langmuir para determinar ka, kd e KD. Os dados do processo de rastreamento de SPR foi usado para selecionar potenciais ligandos de TLla. Valores kd de FAb foram classificados e acima de 200 dos ligantes mais fortes foram submetidos para uma análise de sequência de DNA. FAb com sequências únicas foram selecionados para conversão de anticorpos IgGi humano de comprimento completo. 1.5 Sequenciamento de Região Variável Sequenciamento de DNA foi conduzido pelo grupo genético de diagnóstico aplicado do Departamento de Patologia da Universidade de Melbourne (Melbourne, Austrália). DNA Fagomídeo (aproximadamente 500 ng) foi misturado com 5 pmols do primer apropriado para sequenciamento da cadeia Fab VH ou VL. Reações de sequenciamento foram conduzidas usando um Kit de ciclo de sequenciamento de BigDye® Terminator v3.1 (Applied Biosystems) de acordo com instruções do fabricante. Amostras foram analisadas por separação capilar em "3130x1 Genetic Analyzers" (Applied Biosystems). Os dados de cromatograma de sequência foi analisado usando o "Chromas Lite software package" (Technelysium, Brisbane, QLD, Australia). Arquivos de texto de sequência foram transladados para sequência de aminoácidos e analisado usando o "SeqAgent software package" (Xoma, Berkely, CA, USA) .
1.6 Construção de Vetores de Expressão de Anticorpos
Cadeias de aminoácido VH foram expressadas com uma região constante humana (cadeia pesada CH1 de IgGl humano, dobradiça, Domínios CH2 e CH3 (exemplo, SwissProt No. P01857)). Isto foi melhorada por translação de retorno de sequência de aminoácidos em uma das sequências de DNA que foram sintetizadas de novo por montagem de sintético oligonucleotídeos. Seguindo síntese de gene a sequência completa foi subclonada em múltiplos site de clonagem do vetor de cadeia pesada pTT5 (Durocher et al. , Nucl. Acids Res. 30: E9, 2002). Cadeias de aminoácido VL foram expressas com uma região constante de cadeia leve de kappuma humano (SwissProt No. P01834.1) ou uma região constante de cadeia leve de lambda humano (SwissProt No. P0CG05.1) por subclonagem da sequência em um site de clonagem múltiplo do vetor de cadeia leve de pTT5.
Alternativamente, sequências FAb VH e VL foram amplificadas diretamente de fagomídeo DNA por PCR e subclonadas no vetor de expressões IgG. Reações de PCR foram conduzidas usando um Kit Platinum PCR Supermix (Invitrogen) com as instruções do fabricante. Aproximadamente 50ng de template fagomídeo DNA codificando um FAb foi misturado com 10 pmols do apropriado primeres PCR direto e reverso e o reagente Supermix PCR para um volume final de 50μL. Cada reação usou uma sequência especifica de primer direto combinado com um genérico primer reverso especifico VH ou VL. Para facilitar clonagem em vetores de expressões IgG, primeres para amplificação de VH foram projetados para acrescentar 5' BsiWl e 3' Nhel sites de restrições de enzima, primeres para VL-kappa acrescentado amplificação de 5' BssHll e 3' BsiWl sites e primeres para amplificação de VL-lambda acrescentou sites 5' BssHll e 3' Avrll.
Os PCRs foram conduzido em PCR de para fina (96- poços GeneAmp® PCR sistema 9700, Applied Biosystems, Scoresby, Victoria, Austrália). As condições cíclicas compreendem um passo inicial de desnaturação de cinco minutos a 94 °C, seguido por ciclos de amplificação (desnaturação a 94°C por 30 segundos, seguido por recozimento de primer a 55°C por 30 segundos, então extensão a 68°C por 30 a 90 segundos), e um passo de extensão final a 68°C por sete minutos. Os amplificados genes VH foram purificados usando um Kit de purificação Minelute PCR (Qiagen), digerido com enzimas BsiWl e Nhel (New England Biolabs) e repurificado usando um kit Minelute Reaction Clean-up (Qiagen). Genes de kappa VL amplificados foram preparados similarmente, mas a digestão foi conduzido usando BssHll e BsiWl. Genes de lambda VL amplificados foram também preparados do mesmo modo, mas digerido com BssHll e Avrll. Os fragmentos de genes VH e VL resultantes foram clonados em site de multiclonagem do apropriado vetor de cadeia leve ou pesada pTT5 (cadeia leve kappa ou lambda), como descritos acima.
1.7 Expressão e Purificação de Anticorpos
Cadeia pesada e leve de DNA foram co-transfectada no sistema de expressão HEK293/pTT5 e cultivadas por sete dias. Os supernadantes derivados destas transfecções foram ajustados para pH 7,4 antes de ser carregado em uma coluna HiTrap Proteina A (5 ml, GE Healthcare) . A coluna foi lavada com 50 ml de PBS (pH 7,4) . A Elução foi realizada usando 0, 1M de ácido citrico, pH 2,5. O anticorpo eluido foi dessalinezado usando colunas de Zeba Desalting (Pierce) em PBS (pH 7,4). O anticorpo foi analisado usando SDS-PAGE. A concentração do anticorpo foi determinada usando um Kit de ensaio BCA (Pierce). Para conversão entre as concentrações de anticorpo em μg/ml e as concentrações molares,-um peso molecular de 150kDa foi usado para todos os anticorpos. 1.8 Ensaio de Potência de Linha de Célula TF-1 Para determinar quais os anticorpos anti-TLla funcionalmente neutraliza a atividade anti-TLla lógica de TLla, anticorpos foram testados por suas habilidades para neutralizar Apoptose induzida por TLla em uma linha de célula TF-1. 0 TF-1 de célula eritroleucémica humana (ATCC: CRL-2003) foi mantida em cultura sob condições padrão. As células TF-1 (7,5xl04/well) foram incubadas em placas de 96 poços "black-sided" (Greiner) com recombinante TLla humano 100ng/ml e cicloheximida 10μg/ml para induzir apoptose. Os anticorpos teste a uma concentração de 10μg/ml (66,7nM) ou menor foram acrescentado para as placas e incubadas por 4 to 5 horas. Indução de apoptose foi então avaliada 'usando p Kit Homogeneous Caspases (Roche) de acordo com instruções do fabricante. Nos experimentos para testar a habilidade de anticorpos para neutralizar função de TLla de cinomólogos e macaco rhesus, rato, camundongo, porco da índia, porco ou coelho, a apropriada espécies de TLla foi substituída por TLla humano neste protocolo. Os dados foram normalizados por expressar como uma porcentagem de máxima apoptose (níveis de apoptose melhorada por recombinante TLla humano mais cicloheximida na ausência de anticorpo anti-TLla).
1.9 Seletividade de Receptor de Anticorpos Lead
TLla se ligar a ambos receptor de sinalização cognitivo, DR3, e para um receptor chamariz, DcR3, que também serve como um receptor chamariz para os membros da família TNF Fas-L e LIGHT. Os anticorpos foram avaliados pela suas habilidades para inibir ligação de TLla para seus receptores em uma competição ELISA. Quimera DR3/Fc (R&D Systems) ou Quimera DcR3/Fc (R&D Systems) foi coberto em uma placa de 96 poços (Maxisorp, Nunc) a uma concentração de 2μg/ml. os anticorpos de teste diluídos em série foram pré incubados com site simples biotinilatado de recombinante TLla humano lμg/ml por 30 minutos então acrescentado para os poços de cobertura DR3/Fc ou DcR3/Fc. Ligação- de TLla foi detectada usando estreptavidina-peroxidase de rábano 1:2000 (BD Pharmingen). OS dados foram normalizados por expressar como uma porcentagem de ligação máxima de TLla para o receptor na ausência de anticorpo anti-TLla.
Um anticorpo descrito para inibir atividade TLla (1B4; que tem um VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 119 e um VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 120, que é descrito em ’WO 2009/064854 e Publicação de Deposito de Patente US 200900280116) foi incluído nos ensaios para comparação.
1.10 Mapeamento de Epitopo
O Mapeamento de Epitopo foi realizado usando experimentos de exploração de alanina. Análise de modelagem foi conduzido para determinar exposição provável de residuos em TLla. Construtores de TLla foram então designados em que cada destes residuos teoricamente expostos foi substituído com uma alamina. Estes construtores foram então expressados e supernadantes da expressão de cultura testados para expressão de proteina e ligação para anticorpo anti-TLla C320 usando SPR. Um chip sensor de Ni-NTA (Biacore) foi usado para capturar o alvo HIS muteina TLla do supernadante de transfectados células HEK-293E. A muteina foi capturada na fluxo de célula 2 (ou 4) e então C320 foi passado pelo fluxo de célula 1 + 2 (ou 3 + 4). A expressão de muteina (RU) foi determinada com uma troca em RU no final da injeção da muteina. A ligação C320 (RU) foi determinado como a troca em RU determinado no final da injeção de C320.
Construtores TLla que expressaram, mas aparentemente perderam ligarem para C320 foram re-transfectados e purificados por teste com ELISA. Placas ELISA foram cobertas com policlonal TLla anti-humano de coelho (Peprotech) (lμg/ml), Quimera DR3/Fc (R&D systems) (2μg/ml) ou Quimera DcR3/Fc c (R&D systems) (lμg/ml). Muteinas TLla ou TLla não substituído foram acrescentados as placas a uma concentração de lμg/ml. Ligação de TLla foi então detectada com biotinilatado policlonal TLla anti-humano de coelho (Peprotech) (250ng/ml) e estreptavidina-peroxidase de rábano (BD Pharmingen) 1:2000. Construtores que poderiam ser detectadôs por policlonal anti-TLla foram considerados para ser expressado e apropriadamente dobrado.
Apropriadamente expressado e construtores dobrados não se ligam para um ou qualquer um dos receptores foram considerados importantes para a ligação TLla para este receptor. Anticorpo de teste ligando para muteina TLla foi testado por ELISA direto. Placas de ELISA foram cobertas com diferentes muteinas TLla (lμg/ml). Anticorpos de teste diluidos em série foram então acrescentado, e anticorpos de ligação foram detectados com anti-Humano de IgG-peroxidase de rábano (Invitrogen) 1:2000. Anticorpos de teste ligando para diferentes isoformas TLla foi detectados usando o mesmo método.
1.11 Criação de Membrana de Ligação TLla (mbTLla)- Expressando Linha de Célula
Células HEK 293 foram el-etroporadas com um Vetor contendo uma sequência codificando TLla de comprimento completo (SEQ ID NO: 123) e mantida em meio seletivo (meio suplementado com blasticidina 6μg/ml). Depois de múltiplas passagens, as células foram testadas pela superfície de célula expressão de TLla por citometria de fluxo. 2,5xl05 células por poços foram colocadas em placas de fundo redondo de 96 poços (Corning) e incubadas com biotinilatado policlonal TLla anti-humano de coelho (Peprotech) no gelo por 30 minutos. Amostras foram lavadas e então incubadas com estreptavidina-FITC por 30 minutos adicionais em gelo. As amostras foram então lavadas, resuspendidas e dados adquiridos em um citometria de fluxo.
1.12 Detecção de Citometria de Fluxo.
Depois de estabilizar a expressão de superfície de célula de TLla foi confirmada (a partir do descrito no Exemplo 1,10), anticorpos C320, ' C321 e C323 foram rastreados usando ambos células transfectadas e não transfectadas (2,5xl05 células por poços nas placas de fundo redondo de 96 placas (Corning)) a concentrações decrescentes partindo de 10μg/ml. Policlonal anti-humano de cabra IgG-FITC (Sigma) a uma diluição de 1:200 foi usado como detecção anticorpo. Anticorpo Anti-TLla 1B4 foi incluído para comparação.
1.13 produção de Inibição de Citocina
Para caracterizações adicionais de anticorpos descritos neste documento, suas funções de células humanas primarias foram testadas. Para confirmar produção de endógeno TLla, PBMCs foram isolados da cobertura tampão em um gradiente lymphoprep (Nycomed) e cultivadas em placas de tecido de cultura de 96 poços (Corning) com Concanavalina A concentrações decrescente partindo de 2μg/ml. As placas foram incubadas durante a noite então supernadantes foram colhidos e ensaiados por TLla usando o Kit TLla humano ELISA (Peprotech). Adicionalmente, células aderentes foram colhidas e avaliadas pela expressão TLla por citometria de fluxo usando biotinilatado TLla anti-humano (Peprotech) 1:100 e estreptavidina-FITC (Zymed) 1:200.
1.14 Experimentos Focalização Isoelétrica de Gel
Focalização isoelétrica de gel foi realizada usando o sistema NOVEX© célula X Surelock™ (Life Technologies) de acordo com instruções do fabricante. 1.15 HPLC de Proteina A
Supernadantes de células HEK-293E transfectada para expressar transitoriamente anticorpos foram analisado por HPLC de Proteína A usando um POROS A/20 2,1x30mm Id coluna (Applied Biosystems) conectado para um sistema de ' cromatografia Agilent 1100. A coluna foi equilibrada com fosfato tamponada salino (PBS) pH 7,4, 0,2 ml de supernadante HEK-293E contento proteína foi carregado e a proteína eludida com PBS ajustado para pH 2,2. Os cromatogramas no comprimento de onda de 215 nm ou 280 nm foram integrados usando o software do fabricante e a área sob a curva (AUC) relatada.
1.16 Expressão de Anticorpo e Ligação de Antigeno conforme determinado por SPR
Usando um chip sensor CM5 (Biacore) Proteína A foi ligada para a superfície do chip usando ligação de amina. Proteína A foi ligada no fluxo de célula 1 e 2 (ou alternativamente 3 e 4) usando um Biacore 3000. Supernadantes celular de células HEK-293 contendo anticorpo foram passados através da superfície da célula de fluxo 2, enquanto o tampão (HBS-EP) foi passado através da célula de fluxo 1. No final da injeção do supernadante a troca em unidade de resposta foi medida. Este valor é relatado como captura de Proteína A (SPR) . O % expresso é a Proteína A capturada (SPR) do anticorpo testado como uma porcentagem da Proteína A capturada (SPR) de C320 no mesmo experimento. Para determinar se o anticorpo liga TLla, o TLla foi então passado através da célula de fluxo 1 e 2. Os sensorgramas foram referenciados duas vezes (célula de fluxo 2 é subtraída da célula de fluxo 1 e em tampão em branco).
Exemplo 2: Resultado de Exibição em Fagos
Esforço de exibição em fagos foram conduzidas contra recombinante humano TLla. Seis esforços discretos foram conduzidos usando recombinante, recombinante TLla expressando bactéria. Um número pequeno de FAbs foram isolados que limita TLla, com nenhum anticorpo isolado neutralizado.
Esforços subsequentes foram conduzidos com TLla expressando mamíferos. A porcentagem de FAbs isolado que limita TLla foi substancialmente mais alta usando mamífero partindo de derivado de TLla que TLla derivado de bactéria. O número de FAbs que foram mostrados para ser positivo para ligação de TLla através do esforço de exibição total de fago foi em excesso de 200. Destes, 55 FAbs com sequência única foram identificados, dos quais 29 foram selecionados por conversão de anticorpo IgGl de comprimento completo. Exemplo 3: Neutralização de Atividade TLla
A habilidade de anticorpos IgGl de comprimento completo compreendendo FAbs isolados usando exibição de fago para inibir ou reduzir Apoptose induzida por TLla foi avaliada como descrito acima (Exemplo 1.8). Sob estas condições, 15/29 dos anticorpos testado mostraram mais que 50% de inibição de Apoptose induzida por TLla (Figura 2) . Estes anticorpos incluem: C319, C320, C321, C323, C333, C334, C335, C336.
Estes dados demonstram que enquanto anticorpos podem ser isolados com ligação para TLla, apenas um subconjunto limitado destes anticorpos têm a especificidade requerida para inibir a funcionalidade de atividade TLla.
Dentro do grupo de anticorpos que demonstraram inibição de recombinante humano TLla, o relativo perfil de inibição de cada anticorpo foi avaliado usando o valor de EC50 (Tabela 4 e Figura 3). Só anticorpos 0320, C321 e C323 tinham um valor EC50 de inibição de InM ou menor. Tabela 4: Válor EC50 de Anticorpo para Inibição de Apoptose induzida por Tlla
Figure img0012
Figure img0013
Exemplo 4: Seletividade de Receptor
Os Anticorpos C320, C321 e C323 inibem interação de TLla com DR3 (Figura 4A), mas não inibem interação de TLla com DcR3 (Figura 4B) . Usando o mesmo ensaio, anticorpos C319, C333, C334 e C336 foram mostrados para demonstrar a mesma neutralização de seletiva. Usando um ensaio similar a ligação de anticorpos C320 e derivados destes descritos abaixo, particularmente C320-168 e C320-179, foram mostrado para inibir interação de TLla com DR3 (Figura 4C) com um EC50 1 nM ou menor.
Estes anticorpos também não inibem interação de TLla com DcR3 (Figura 4D) quando testado a intervalos de concentrações de 0,1 μg/ml s 100 μg/ml. Este resultado contrasta com aquele de anticorpos C300-25 e 1B4. A este respeito, anticorpo C300-25 é um anticorpo monoclonal de camundongo produzido pelos inventores. Tabela 5: Valores de EC50 Anticorpo para inibição de interação de TLla com receptores DR3 e DcR3
Figure img0014
Figure img0015
DNI - Não inibe (did not inibe) DR3 e DcR3 foram mostrados para competir para ligação com TLla. Por isso, foi inesperado que os anticorpos foram isolados com especificidade, visando um epitopo em TLla que é neutralizado por DR3, mas não DcR3. Este resultado indica que anticorpos descritos neste documento são capazes de prevenir atividade TLla através de ser receptor DR3 cognato sem perturbar a natural função antagonistico função de DcR3 ou um homeostática balanço de ligação DcR3. Se~m estar ligado para qualquer teoria ou modo de ação, tal inibição seletiva pode ser biologicamente relevante porque DcR3 regula a quantidade de Fas-L livre e disponível LIGHT para ligarem para seus receptores de sinalização cognato (Fas e H-VEM, respectivamente). Consequentemente, inibindo a interação entre TLla e DcR3 poderia aumentar a quantidade de Fas-L e limite de LIGHT por DcR3 assim reduzindo a quantidade disponível para sinalização através de seus receptores cognatos. Como a morte mediadas por Fas desempenha um papel no controle de câncer, as potenciais consequências a jusante de aumentar a quantidade de DcR3 para se ligar ao Fas-L poderia incluir um aumento susceptibilidade para o câncer. Novamente, sem estar ligado para teoria ou modo de ação, anticorpos isolados que especificamente inibem interação de TLla e DR3, mas não de DcR3, poderia ser vantajosos no tratamento de doença, mas sem comprometer a segurança.
Exemplo 5: Mapeamento de Epitopo
Substituições de Aminoácido foram introduzidos na sequência de TLla solúvel (SEQ ID NO: 202) para gerar uma séries de muteinas TLla. Usando um ensaio de análise de muteina baseada em 5 SPR descrito no Exemplo 1.10, muteinas TLla em supernadantes de células HEK-293E transfectadas foram testadas para niveis de expressão níveis e ligação para C320. Os resultados são apresentados na Tabela 6. Tabela 6: Expressão e Ligação de TL1 humano solúvel e 10 muteinas destes para Anticorpo C320
Figure img0016
Figure img0017
Figure img0018
Muteinas que expressão bem (expressão de Muteina maior que 2000 RU) mas falham para ligar anticorpo C320 (ligação TLla menor que 17 RU) foram selecionadas para análise adicional.
Muteinas com substituições nos aminoácidos G53 e A55 expressaram mal e tiveram reduzida ligação para policlonal anti-TLla, sugerindo que estes são importante residuos para integridade estrutural de TLla. Os outros muteinas também expressaram adequadamente, limite policlonal anti-TLla e correu equivalentemente para TLla tipo selvagem ambos reduziu e não reduziu gel SDS-PAGE. Todas estas características sugerem que as muteinas foram apropriadamente expressadas e dobraram as proteinas TLla.
As muteinas exibindo diferentes padrões de ligação para diferentes anticorpos monoclonal anti-TLla descritos neste documento. Anticorpos C320, C320-168 e C320-179 não detectaram ligação para as muteinas R32A e R85A ou para uma muteina contendo ambas destas substituições (Figura 5A e B) . C320 também mostrou desprezível ligação para as muteinas P35A, T168A e E170A enquanto C320-168 e C320-179 reduziram ligação para estas muteinas, mas não para a mesma extensão como C320. Em contraste, anticorpos 1B4 e 16H2 que se ligam a TLla mostraram ligação para as muteinas R32A, R85A, P35A, T168A maior que 50% da TLla tipo selvagem, indicando que os aminoácidos nestas posições não são crucial para a ligação de 1B4 e 16H2 para TLla.
Dados que os anticorpos C320, C320-168 e C320-179 inibem a ligação de TLla para DR3 mas não DcR3, os anticorpos são igualmente ligados para aminoácidos envolvidos na ligação de DR3 para TLla e rompe esta interação. DR3, mas não DcR3, tem significantemente redução de ligação para as muteinas R32A e R85A, sugerindo que estes residues são envolvidos com TLla ligando para DR3 (Figura 5C). O site de ligação dos anticorpos C320, C320-168 e C320-179 em TLla é ilustrado na Figura 5D. Como pode ser visto do diagrama, os residues R32 e R85, enquanto estão distante na sequência primária de aminoácido são localizados adjacentes de cada outra estrutura de proteina terciária. Por isso, estes podem ser considerados residues chaves dentro do epitopo em TLla para o qual os anticorpos C320, C320-168 e C320-179 ligam.
Exemplo 6 - Caracterização de Ligação de Anticorpos para superficie de Célula TLla
TLla, como a maioria dos membro da superfamilia ligando TNF, está presente como uma forma de superficie de célula que é clivada para gerar TLla solúvel e como para outros membros da forma de membrana de TL1 (mbTLla) foi mostrado para ter função biológica. Portanto para neutralizar a atividade de TLla será vantajoso ter anticorpos que ligam fortemente para ambos TLla membrana e solúvel. Anticorpos que apresentam inibição funcional de TLla foram rastreados por citometria de fluxo em uma linha de célula humano transfectada estável com uma membrana TLla ancorada (produzida como descrito no Exemplo 1.11).
Anticorpos C320, C321, C323 e 1B4 todos limitado para o TLla de linha de célula transfectada (Figura 6) com EC50S de 0,5 a 2nM, mas não células normais não transfectada. Para caracterizações adicionais de anticorpos descritos neste documento, suas funções em células primárias humanas foram testadas. PBMCs foram isolados como descrito no Exemplo 1.12. Usando as condições de ensaio descritos no Exemplo 1.13 estas células foram mostradas para produzir ambos mbTLla (Figura 7A) e TLla solúvel (Figura 7B). PBMCs foram estimulados como descrito no Exemplo 1.13 e ensaiado para produção de citocina na presença de -anticorpos anti-TLla. Um vez que nenhum TLla exógenos foi acrescentado para a cultura de célula, os efeitos de anticorpos anti-TLla foram devido a neutralização de endógeno TLla. Anticorpos, C320 e C323 demonstraram boa inibição de produção de citocina induzida por TLla endógeno por PBMCs (Figura 8) . Esta inibição foi aparente nas citocinas tipicamente produzidas por células Thl (IFN-y Figura 8A) e células Th2 (IL-13; Figura 8B) . estes dados demonstram que estes anticorpos são apropriados para serem capazes de inibir produzido TLla de células primárias humanas, e que estes anticorpos poderiam ser usados como um reagente de diagnóstico para detectar TLla em células ou em soro.
Exemplo 7: Gerando Variantes de Melhoramento de C320
O anticorpo C320 foi adicionalmente otimizado através de alterações para a sequência de anticorpo com o objetivo de produzir um efeito positivo em propriedades biofísicas de anticorpo enquanto tendo impacto mínimo na potência de C320. Por exemplo, alterações que aumentam o nível de expressão do anticorpo com concomitantemente aumento de níveis de produção são desejados. Remoção de um site de glicosilação ligando N no VH através de substituição de aminoácido para reduzir produto de heterogeneidade pode adicionalmente melhorar C320. Substituição de resíduos de aminoácido com o potencial para impactar a estabilidade do anticorpo através de oxidação ou isomerização durante a purificação ou armazenagem com aminoácidos que não submete a tais transições (Wang et al., Journal de Pharmaceutical Sciences 96:1-26, 2006) pode adicionalmente melhorar C320. Substituição de sequências raras ou não linha de germe C320 que podem potencialmente contribuir para imunogenicidade com estes de menor previsão de imunogenicidade poderia adicionalmente melhorar C320. Tais trocas são descritas em mais detalhes como segue.
Melhorar a Expressão de C320
Um banco de dados de sequências de aminoácidos de anticorpos germinativos humano foi interrogado pelo Basic Local Alignment Search Tool searches (BLAST: Altschul et al., J Mol Biol 215: 403-410, 1990) usando a sequência de aminoácidos C320 VH e VL. Isto identificou vinte das sequência de anticorpo humano homólogos germinativas destes C320 VH e C320 VL, respectivamente. Alinhamento das sequência germinativas humano com estes C320 permite a identificação de resíduos presente em C320 mas não comumente na maioria dos germinais. O aminoácido mais comum das sequências germinativas foi substituído na sequência de aminoácido C320. Tabela 7 lista as substituições de aminoácidos e os impactos resultantes no nivel de expressão de cada anticorpo de transfecção de transiente em células HEK-293E. Tabela 7: Efeito de substituições de Aminoácidos em 5 Expressão e Potência
Figure img0019
Substituições de Aminoácido são relativos a SEQ ID NO: 42 para cadeia pesada e SEQ ID NO: 46 for cadeia leve. Duas substituições, presente em C320-3 e C320-5 elevou o nivel de expressão do anticorpo mais que duas 10 vezes e enquanto impacta minimamente a potência do anticorpo em um ensaio de potência de TF-1. Um anticorpo adicionalmente incorporando ambas as substituições, C320135, teve equivalentemente aumentada a potência e mantida a melhora no nivel de expressão. 15 C320-4 contendo um N73D (N72D de acordo com o sistema de numeração de Kabat) substituição que auxilia na melhora da expressão enquanto também atende para remover uma modificada glicosilação ligando N. No entanto, a substituição de N73D aboliu a expressão de anticorpo, sugerindo N73 é desejável para expressão do anticorpo. Para adicional melhora da expressão C320 o CDRs de C320 foram enxertados em outros frameworks de anticorpos possuindo uma estrutura conhecida de cristal. Esta abordagem incomum foi adotada como anticorpos de estrutura de cristal usualmente possuindo um par pareado VH:VL. Para selecionar anticorpos com adequado VH e VL frameworks BLAST pesquisas de um banco de dados de estruturas de cristal foram realizadas para identificar anticorpos de sequência de aminoácido similar ao C320. Pesquisa BLAST usando o C320 VH foram usada para identificar as 100 sequências de anticorpo mais homologas com estruturas de cristal conhecida. Similarmente, a 100 sequências de anticorpo mais homologas para o C320 VL com estruturas de cristal conhecida foram identificadas. Estruturas de cristal que aparecem em ambas as listas de cadeia leve e pesada foram consideradas adequadas receptores de frameworks para enxerto de CDR. Estas foram 1TZG, 1RHH, 2DD8, 2JB5, 3FKU, 3GBM, 3IYW, 3LMJ, e 3P30. Os CDRs de C320 foram então usados para recolocar as sequências de CDR presente em cada uma das sequências de anticorpo acima. Um alinhamento de cada uma das sequência contendo as regiões de C320 CDR é dada na Figura 1D (cadeia pesada) e Figura 1G (cadeia leve). Os anticorpos de cadeias pesadas e leves foram então emparelhadas como segue e avaliada para expressão de proteina o e ligação de TLla e o resultado listado na Tabela 8. Tabela 8: Resultado de Enxerto de CDR em Expressão e Ligação de Tlla
Figure img0020
Figure img0021
Nota: As sequências das cadeias pesada e leve desses anticorpos estão listadas nas Figura ID e 1G. RU é unidades de resposta - uma medida de ligação para a superficie usando SPR e AEC é a área sob a curva.
Quando os CDRs de C320 foram . enxertados em diferentes frameworks de anticorpo um grande número dos resultantes anticorpos expressados a um nivel acima que do anticorpo C320. O anticorpo C320-16, em que uma cadeia pesada C320 CDRs foram enxertadas no framework do anticorpo 1TZG e foi emparelhada com a cadeia leve C320, expressaram 3 vezes mais que C320. Este experimente também demonstra que é possivel a troca do isotipo do anticorpo e reter expressão proteina e ligação para TLla usando esta abordagem, como algumas das cadeia leve de frameworks de anticorpo dentre as quais cadeia leve C320 CDRs foram enxertadas do isotipo kappa isotipo como oposto para o isotipo lambda presente em C320.
Para adicional melhora da expressão do anticorpo, substituições de aminoácidos foram introduzidas na região CDR3 da cadeia pesada variável de C320 e o anticorpos transfectados nas células HEK-293E e rastreada por niveis expressão usando HPLC de Proteina A e captura de Proteina A usando ressonância de superficie plasma (Surface Plasmon Resonance - SPR). Os resultados são descritos na Tabela 9. Tabela 9: Efeito de substituições de HCDR3 na Expressão
Figure img0022
Figure img0023
Figure img0024
Figure img0025
Nota: Substituições nesta Tabela refere-se para estas feitas no anticorpo C320 Vários anticorpos foram gerados que tinham niveis de expressão significativamente acima daquele C320 como 5 determinado pela capture em superficie de Proteina A. Vários dos anticorpos de expressão elevada foram re- transfectados, purificado por cromatografia de Proteina A e suas potências medidas num ensaio de TF-1. Os resultados são listados na Tabela 10. 10 Tabela 10. Efeito de substituições de HCDR3 na inibição de Tlla
Figure img0026
Figure img0027
Nota: As Substituições nesta Tabela refere-se para estas feitas no anticorpo C320
A potência dos anticorpos resultantes está em um intervalo reduzido comparado com C320, tal como C320-119, 5 para niveis equivalentes do C320. _ A sequência de cadeia leve de C320 foi alinhada contra a sequência germinativa de maior homologia, IGLV1- 40*01. Diferenças nas sequências de aminoácidos nas regiões de CDR foram identificadas, como mostrado na Figura 9A. Em 10 uma posição na qual as sequências diferem de uma substituição atrás do aminoácido da sequência germinativa C320 foi realizada. Os anticorpos foram expressos em células HEK-293, purificados e a proteina rendeu relativo ao determinado de C320. Um ensaio de potência usando 15 células TF-1 foi usado para caracterizar o perfil de inibição dos anticorpos. Os resultados são exibidos na Tabela 11. Tabela 11. Efeito da Linha de germe C320 na Inibição de Tfla
Figure img0028
Figure img0029
Nota: AS Substituições nesta Tabela refere-se para aquelas feitas no anticorpo C320 0 anticorpo C320-120 demonstrou um bom nivel de expressão e a maior potência de todos os anticorpos 5 testados neste experimento. Algumas das substituições, tal como esta em C320-123 e C320-125 resultou em anticorpos que expressão, mas não inibe ou fracamente inibe apoptose induzida por TLla em células TF-1. Isto sugere que 'os aminoácidos nas posições G34 (G32 de acordo com o sistema 10 de numeração de Kabat) e Y54 (Y52 de acordo com o sistema de numeração de Kabat) da cadeia leve variável pode ser importante para melhorar o anticorpo para inibir a atividade de TLla.
Remoção de Oxidação Putativa e Sites de Isomerização de 15 C320
Análise de aminoácido de uma sequências de cadeia pesada e leve identificando vários aminoácidos que pode submeter a oxidação ou isomerização. Particular ênfase anticorpo. Trocas destes aminoácidos podem, durante algum tempo, alterar o perfil de ligação do anticorpo. Na cadeia pesada variável M51 (M51 de acordo com o sistema de numeração de Kabat) foi identificada como um potencial site de oxidação juntamente com o potencial do site de isomerização de aspartato D102 (D98 de acordo com o sistema de numeração de Kabat). Na cadeia leve, D94 (D92.de acordo com o sistema de numeração de Kabat) foi identificado como um potencial site isomerização. Para reduzir o impacto potencial destas questões variantes previstas de C320 foram produzidos contendo substituições de aminoácidos conservativa ou semi-conservativas nestas posições. Estas substituições e seus impactos na potência dos variantes C320 resultantes são listados na Tabela 12. Tabela 12. Efeito de Substituições de aminoácidos em Expressão e Inibição de Tlla
Figure img0030
Nota: As Substituições nesta Tabela refere-se para estas no anticorpo C320, com substituições de cadeia pesada relativa para SEQ ID NO: 42 e substituições de cadeia leve relativa à SEQ ID NO: 46
A oxidação potencial e site de isomerização presente na cadeia pesada foram substituidos com sucesso com aminoácidos conservatives que resultou em melhora da expressão e retenção de potência. A substituição de D94E na região de cadeia leve CDR resultou em um anticorpo que expressou niveis similares ao C320, mas teve potência significantemente reduzido, indicando que D94 da cadeia leve pode ser importante na mediação da atividade funcional de C320.
Remoção do Site de N-glicosilação da Cadeia Pesada C320
Como uma tentativa anterior para remover o site VH de glicosilação NTS por substituição para DTS (N73D; N72D de acordo com o sistema de numeração de Kabat) não foi bem sucedida, novas tentativas de romper um motivo de glicosilação ligada a N, NX(S/T) (onde X/P) usando uma gama mais ampla de substituições foram feitas. Primeiramente, residuos adicionais foram testados no lugar da asparagina na posição 73. Posteriormente a substituição T74P (T73P de acordo com o sistema de numeração de Kabat) foi testada, uma vez a prolina nesta posição é conhecida para prevenir glicosilação ligada a N. Uma gama de aminoácidos foram também testados no lugar de S75 (S74 de acordo com o sistema de numeração de Kabat). Os construtores testado em tentativas para remover este site glicosilação e seus impactos nos niveis de expressão do anticorpo são listados na Tabela 13. Tabela 13: Efeito das Substituições de Aminoácidos em Niveis de Expressão
Figure img0031
Figure img0032
Nota: As Substituições nesta Tabela refere-se para estas feitas no anticorpo C320
A maioria dos variantes do C320 testados exibiram niveis de expressão mais baixos comparados com C320, 5 sugerindo que substituição individual aminoácidos presente em modificado NTS, em C320, reduz a expressão do anticorpo.
Um resultado de tentativas anteriores para melhorar a expressão de C320 por enxerto de C320 CDRs em diferentes frameworks de anticorpo foi o anticorpo designado C320-16, 10 que usou os frameworks de 1TZG. Este anticorpo expressou bem e limita TLla (Tabela 7). Os frameworks de 1TZG e C320- 16 foram desprovido da sequência de glicosilação ligando N, com o RNTSI (SEQ ID NO: 203) na posições 72 através de 76 da SEQ ID NO: 42 (71 através da 75 de acordo com o sistema de numeração de Kabat) de sequência de C320 VH é recolocada por ADRST (SEQ ID NO: 204) na correspondente sequência VH de 1TZG.
A variante da expressão C320-135 que compreendendo melhora de substituições VH T41P e VL A73T foi submetida a adicional engenharia de cadeia pesada. A sequência C320 VH RNTSI (SEQ ID NO: 203) na posições 71 através de 75 foi substituida por ADRST (SEQ ID NO: 204) da correspondente sequência VH de 1TZG para produzir anticorpo C320-163. Este anticorpo, agora desprovida de um site de glicosilação ligando N, expressado quando transfectado em células HEK— 293E e, quando purificado, foi capaz de inibição funcional de TLla mediada apoptose de células TF-1 (Tabela 14). Variantes Melhoradas de C320
As substituições de aminoácidos identificadas nos experimentos anteriores como conferir propriedades vantajosas sobre C320 foram subsequentemente combinadas e os anticorpos resultantes expressados, purificado e ensaiado por potência. As sequências destas são listadas na Figura 9B (pesada variável) e Figura 9C (leve variável). Potência comparativa e dado de expressão de cada anticorpo é listado na Tabela 14. Tabela 14: Efeito de Substituições de Aminoácidos na Expressão e inibição de Tlla
Figure img0033
Figure img0034
* Nota: DNI = Não inibe (did not inibe)
Comparação de anticorpos C320-168 (contendo um motivo de glican ligado a N) com C320-163 e C320-170 (falta modivo de ligação de glican com N) em um focasado 5 isoelétrico (Isoelectric Focusing - IEF) gel demonstrou remoção de carga heterogeneidade do perfil do anticorpo na remoção do site de glicosilação ligado a N (Figura 9D) . 0320-168 tem de 5 a 6 distintos isoformas carregadas comparadas com 1-2 isoformas visualizadas por 0320-163 e 10 C320-170. Esta redução na heterogeneidade de carga é uma propriedade vantajosa provendo melhora lote a lote da consistência em larga escala do processo de fabricação (Wang et al., Journal de Pharmaceutical Sciences 96:1-26, 2006). 15 Dos anticorpos testados, duas foram mais potentes que o anticorpo C320 parental - C320-168 e C320-179 (Figura 9E) . Ambos destes variantes C320 incluem substituição da região variável de cadeia leve G24S (G25S de acordo com o sistema de numeração de Kabat) que foi encontrado para melhorar a potência em ensaios de TF-1 em combinação com as outras vantajosas de substituições de aminoácidos descritas anteriormente.
Remoção dos Previstos Peptideos ligantes de MHC Anticorpos Classe II
A sequência de aminoácido de C320-168 de regiões variáveis de cadeia pesada e leve foram analisadas em silico usando o pacote de software Epibase™ (LONZA). Este software prevê a propensão de sequências de peptideo presente em C320-168 para ligar a MHC Classe II alleles. Tal ligação de peptideos a MHC Classe II alleles é um passo importante em uma resposta imune de hospedeiro contra o anticorpo administrado.
Uma sequência de peptideo na cadeia pesada de C320168, GLEWMGWLNPNSGNT (SEQ ID NO: 205), foi prevista para ser fortemente ligada para DRB1*O4O1. Uma sequência de peptideo na cadeia leve de C320-168, LLIYGYYNRPSGVPD (SEQ ID NO: 206), foi prevista para ser fortemente ligada a DRBl*1101, DRBl*1104 e DRBl*1501.
As sequência de peptideo a acima listadas e versões modificadas destas sequências de peptideo foram sintetizadas e incubadas com o correspondente proteina MHC Classe II e uma ELISA realizada para determinar se o peptideo formou um complexo com a proteina MHC Classe II. O peptideo influenza, PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO: 207), foi usado como controle positivo nestes ensaios para indicar a formação de u’m peptideo: complexo de MHC Classe II. A ligação de cada peptideo para o MHC Classe II allele é listada na Tabela 14. Tabele 14. Ligação de Peptideos para MHC Classe II
Figure img0035
Figure img0036
Os peptideos que podem ser imunologicamente significante ou justificar uma investigação mais aprofundada como bons ligadores são considerados para ser estes peptideos com escores 15% do controle positivo. Por esse motivo o peptideo GLEWMGWLNPNSGNT (SEQ ID NO: 205) tem uma baixa probabilidade de ser imunogênico e nenhuma tentativa foi feita para modificar este motivo em anticorpos C320 relatado.
O peptideo “LLIYGYYNRPSGVPD (SEQ ID NO: 206) foi mostrado para formar um complexo com proteina MHC Classe II DRB1*15O1 (123% ligação) mas não DRBl*1101 ou DRB1*11O4. Uma tentativa para reduzir a formação do peptideo: complexo de MHC Classe II foi feita pela modificação do residue de tirosina na quarta posição do peptideo (correspondendo a posição 51 (posição 49 de acordo com o sistema de numeração de Kabat) no caso de uma sequência C320-168 cadeia leve variável) para um dos ácido glutâmico, glicina, prolina, ou lisina. A introdução de um residuo de ácido glutâmico ou uma glicina nesta posição reduz a formação do complexo por mais de 50% (Tabela 14). Introdução de prolina nesta posição preveni formação do complexo. Anticorpos C320-172 e C320-179 incorporou substituição de Y51E (Y49E de acordo com o sistema de numeração de Kabat), em suas regiões VL, enquanto C320-183 incorporou a troca de Y51G (Y49G de acordo com o sistema de numeração de Kabat) na região VL.
Todos os três anticorpos expressado e inibiu funcionalidade TLla, como ilustrado na Tabela 13. Expressão de anticorpo C320-171 incorporando substituição Y51E (Y49P de acordo com o sistema de numeração de Kabat) foi detectada, entretanto, estes anticorpo não conseguiram inibir funcionalidade TLla, indicando que nem todos os aminoácidos são tolerados na posição 49 na cadeia leve (Tabela 13).
Exemplo 8 - Geração de Potência Alta de Anticorpos Seletivos DR3
Novos anticorpos capazes de neutralizar atividade TLla com alta potência e capaz de inibir atividade seletiva mediada por TLla-DR3 são gerados por focar no anticorpo epitopo C320 no TLla. Por exemplo, região variável mutante e/ou substituições individuais mostrando aumento de expressão e/ou neutralização de TLla- (exemplo, como descrito no Exemplo 7) são combinadas e re-testado para determinar se a melhora é aditiva.
Em outras abordagens anticorpos que se ligam ao epitopo ligado por C320 são selecionados por qualquer uma de uma variedade de técnicas..
8.1 Seleção de uma Biblioteca de Anticorpo Usando o Anticorpo C320
Um protocolo de exibição em fagos é utilizada em que uma primeira etapa e conduzida usando uma densidade de antigeno (isto é biotinlatado TLla) de cerca de 100 pmol e um passo de elução baseada em TEA como descrito previamente. A segundo e terceira etapa usa um antigeno de densidade reduzida (exemplo, cerca de 50 pmol). Fago são eluido por adição de C320 IgG a uma 10-vezes de excesso molar e incubada as reações a temperatura ambiente por 2, 5, 10 ou 20 minutos. O IgG é esperado para eápecificamente desloca e eluir fago expressando FAbs que limite o epitopo C320. Ligandos não específicos e limite de fago para outras regiões na superfície TLla são menor provável para eluir sob estas condições.
O regime de lavagem compreende seis lavagens com M-PBS para as etapas 1 e 2. Para a etapa 3 as lavagens são três lavagens com PBST e então três lavagens com PBS. Fagos eluídos são usados para infectar TGI E. coli para resgate de fagomídeo ou geração de colônias para triagem como descrito para outros experimentos de exibição fago.
8.2 Seleção/Produção de Anticorpos Usando Mutante TLla
Usando versões mutadas de TLla como reagentes de panning para exibição de fago, os anticorpos que reconhecem um epitopo similar para aquele de C320 pode ser obtido. Uma biblioteca de exibição de fago pode ser esgotada de anticorpos que reconhecem TLla com uma substituição de aminoácido de R32A e/ou R85A. A biblioteca pode então ser deslocada contra TLla. Os resultantes anticorpos isolados provavelmente ligarão para os resíduos R32 e/ou R85.
Exemplo 9: Maturação de Afinidade de C320
Anticorpo C320 já é um inibidor potente de atividade TLla. Por tanto, potência pode ser melhorada usando abordagens de maturação de afinidade. Melhora da potência frequentemente confere vantagens de dosagem e eficácia. Numerosos métodos para maturação de afinidade de anticorpos são conhecidas na matéria. Muitas destas são baseadas na estratégia geral de painéis ou biblioteca de proteínas variantes por mutagênese seguido pela seleção e/ou triagem para melhora da afinidade. Mutagênese é frequentemente realizada em nível de DNA, por exemplo, por propensão de erro de PCR (Thie et al., Métodos Mol. Biol. 525: 309-322, xv, 2009), por mistura de gene (Kolkman e Stemmer, Nat. Biotechnol. 19: 423-428, 2001), pelo uso de químicas mutagênica ou irradiação, pelo uso de cepas 'mutante' com propensão de replicação de erro de máquina (Greener et al., In Vitro Mutagenesis Protocols. (Humana press, NJ ),1996) ou pela abordagem de hipermutação somática que subordina máquinas de maturação de afinidade natural (Peled et al., Annu. Rev. Imunol. 26: 481-511, 2008). Mutagênese é também realizada no nivel de RNA, por exemplo pelo uso de Qβ replicase (Kopsidas et al., Imunol. Lett. 107: 163-168, 2006). Métodos baseados em biblioteca permitem triagem para melhorar as proteinas variantes são baseados em várias tecnologias de exibição tal como fago, levedura, ribossomo, bactéria ou células mamiferas, e são conhecidas na matéria. (Benhar, Expert Opin. Biol. Ther. 7: 763-779, 2007). Maturação de afinidade é também melhorada por métodos direcionados/preditivos, por exemplo, por mutagênese direcionada a site ou sintese de gene guiado por resultados de modelagem de proteina 3D (ver, por exemplo, US 6,180,370 ou US 5,225,539) Maturação de afinidade usando exibição de ribossomo (Kopsidas et al., BMC Biotechnol. 7: 18, 2007) é realizada usando RNA que codifica o Dominios VL e VH de um anticorpo relacionado com C320 no fármaco de scFv. A biblioteca de variantes destes RNA é gerada usando replicase de Qβ (tipicamente 1 a 3 trocas por molécula) e esta biblioteca é exibida e selecionada no ribossomos para a ligação para TLla. Ligação fenotipo-genotipo é melhorada porque os construtores de RNA permanecem ligadas para o ribossomo transladando a funcionalidade da proteina scFv. Complexos de scFv-RNA-ribossomo relatado por C320 são deslocados contra TLla e isolados. O RNA é convertido no DNA e incorporado em um sistema de expressão de bactéria. Bactéria individual codificando um simples scFv são então isoladas e induzidas para expressar o scFv. Usando uma competição ELISA, scFvs com uma afinidade mais alta para TLla que um ScFv relacionado com C320 são identificados. Estes scFvs são convertidos em anticorpos de comprimento completo que são rastreada no ensaio de apoptose de TF-1 como descrito no Exemplo 1.8 para determine melhora na inibição de atividade biológica de TLla sobre C320.
Exemplo 11: Eficácia de Anticorpos Anti-TLla em Modelo Animal de Colite
Os anticorpos anti-TLla reativo através de roedores aqui descritos foram testados em modelos de roedores de colite aguda induzida por administração intraretal de di ou tri ácido itrobenzenesulfonico (D/TNBS) ou oxazolona, e colite crônica induzida por administração de DSS em bebidas de água (a partir do descrito em Wirtz et al., Nat. Protoc. 2: 541-546, 2007). DNBS e oxazolona induzem ulceração localizada e inflamação. A administração de DSS induz robusta inflamação generalizada do trato intestinal caracterizada por lesões erosivas e infiltrado inflamatório. Sintomas de todos estes modelos usualmente incluem diarréia, sangue oculto, perda de peso e ocasionalmente prolapso retal.
Em um modelo de profilático, tratamento de anticorpo foi graduado no inicio da administração do composto induzindo ’colite. Em um modelo terapêutico, tratamento de anticorpo foi graduado depois de vários dias do começo da indução. O efeito do tratamento no peso, consistência das fezes e sangue oculto, tanto quanto efeitos microscópicos na integridade epitelial e grau de infiltrado inflamatório foi determinado. Diariamente o escore clinico foi realizada baseado na consistência das fezes e presença de sangue oculto dando um escore do indice de atividade da doença ( Disease Activity Index - DAI).
Anticorpo C320-168 mostrou eficácia comparável com os composto de cuidado padrão quando dosado profilaticamente em colite induzida por DNBS ou oxazolona (Figuras 10A-10C), e quando dosado terapeuticamente em colite induzida em DSS (Figuras 11A e 11B).
Exemplo 12: Eficácia de Anticorpos Anti-TLla e Modelo Animal de Doença
Anticorpos são adicionalmente testados em um modelo roedor de esclerose múltipla (Racke, Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 9, Unit 9 7, 2001). Neste modelo de demielinação central aguda ou crônica é induzida pela administração de medula espinhal homogeneizada ou peptideos mielina purificados em adjuvante. Esta administração causa destruição autoimune da bainha de mielina em torno dos neurônios da medula espinhal que levam à fraqueza nas pernas que pode desenvolver para paralisia, e é caracterizada por infiltrado inflamatória significante na medula espinhal. A forma aguda é monofásica e animais recuperam espontaneamente. A forma crônica assemelha-se a recorrente remitente esclerose múltipla e consiste de dois ou mais episódios de fraqueza/paralisia dos membros posteriores.

Claims (9)

1. Anticorpo isolado ou recombinante do ligante 1a (TL1a) do tipo TNF ou domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a TL1a, caracterizado por o anticorpo ou domínio de ligação ao antígeno do mesmo compreender uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 186 e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 199.
2. Anticorpo ou seu domínio de ligação ao antígeno, de acordo com com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu domínio de ligação ao antígeno compreende um domínio constante da cadeia pesada de IgG1.
3. Anticorpo ou seu domínio de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu domínio de ligação ao antígeno compreende um domínio constante da cadeia leve lambda.
4. Anticorpo ou domínio de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou o domínio de ligação ao antígeno compreende um domínio constante da cadeia pesada de IgG1 humana e um domínio constante da cadeia leve lambda humana.
5. Composição caracterizada por compreender o anticorpo ou seu domínio de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e um transportador adequado.
6. Uso do anticorpo ou do seu domínio de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma doença autoimune.
7. Método in vitro para detectar TL1a em uma amostra, o método caracterizado por compreender o contato de uma amostra com o anticorpo ou seu domínio de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, de modo que um complexo antígeno-anticorpo ou domínio de ligação antígeno- antígeno formas complexas e detecção do complexo, em que a detecção do complexo é indicativa de TL1a na amostra.
8. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a doença auto-imune é asma.
9. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a doença auto-imune é colite ulcerosa, doença de Crohn, síndrome do intestino irritável, artrite reumatóide, poliartrite, esclerose múltipla, uveíte ou doença pulmonar obstrutiva crônica.
BR112014007426-7A 2011-09-30 2012-09-28 Anticorpos contra tl1a e seus usos BR112014007426B1 (pt)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161541590P 2011-09-30 2011-09-30
AU2011904042 2011-09-30
AU2011904042A AU2011904042A0 (en) 2011-09-30 Antibodies against TL1a and uses thereof
US61/541,590 2011-09-30
PCT/AU2012/001161 WO2013044298A1 (en) 2011-09-30 2012-09-28 Antibodies against tl1a and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BR112014007426A2 BR112014007426A2 (pt) 2019-01-15
BR112014007426B1 true BR112014007426B1 (pt) 2023-01-03

Family

ID=47994017

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR122020013379-1A BR122020013379B1 (pt) 2011-09-30 2012-09-28 Anticorpos contra tl1a e seus usos
BR112014007426-7A BR112014007426B1 (pt) 2011-09-30 2012-09-28 Anticorpos contra tl1a e seus usos

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR122020013379-1A BR122020013379B1 (pt) 2011-09-30 2012-09-28 Anticorpos contra tl1a e seus usos

Country Status (13)

Country Link
US (4) US20140255302A1 (pt)
EP (2) EP3495389A1 (pt)
JP (1) JP2014531210A (pt)
KR (1) KR101982899B1 (pt)
CN (1) CN104114577A (pt)
AU (1) AU2012315474B2 (pt)
BR (2) BR122020013379B1 (pt)
CA (1) CA2850549C (pt)
EA (1) EA035018B1 (pt)
IL (1) IL231777B (pt)
MX (1) MX2014003689A (pt)
WO (1) WO2013044298A1 (pt)
ZA (1) ZA201401843B (pt)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010062960A2 (en) 2008-11-26 2010-06-03 Cedars-Sinai Medical Center METHODS OF DETERMINING RESPONSIVENESS TO ANTI-TNFα THERAPY IN INFLAMMATORY BOWEL DISEASE
WO2013044298A1 (en) 2011-09-30 2013-04-04 Cephalon Australia Pty Ltd Antibodies against tl1a and uses thereof
EP2978440B1 (en) * 2013-03-27 2019-10-02 Cedars-Sinai Medical Center Treating fibrosis by inhibiting tl1a and diagnosing fibrosis by detecting il31ra
CN103275902B (zh) * 2013-06-05 2015-03-11 南昌大学 一种富集分离幽门螺杆菌的方法
US10316083B2 (en) 2013-07-19 2019-06-11 Cedars-Sinai Medical Center Signature of TL1A (TNFSF15) signaling pathway
MY182271A (en) * 2013-11-13 2021-01-18 Pfizer Tumor necrosis factor-like ligand 1a specific antibodies and compositions and uses thereof
JP6730271B2 (ja) * 2014-10-29 2020-07-29 テバ・ファーマシューティカルズ・オーストラリア・ピーティワイ・リミテッド インターフェロンα２Ｂバリアント
CN106317218B (zh) * 2015-07-03 2021-03-16 厦门鹭佳生物科技有限公司 一种新的败血症多肽及其在败血症诊断中的应用
TWI703158B (zh) * 2015-09-18 2020-09-01 美商希佛隆公司 特異性結合tl1a之抗體
WO2017077715A1 (en) * 2015-11-02 2017-05-11 La Jolla Institute For Allergy & Immunology Method and medicament for treating airway and/or lung diseases
CR20180365A (es) 2015-12-16 2018-09-28 Amgen Inc PROTEÍNAS DE UNIÓN AL ANTÍGENO BISPECÍFICO DE ANTI-TL1A/ANTI-TNF-a Y SUS USOS
CN118773299A (zh) 2016-03-17 2024-10-15 西达-赛奈医疗中心 通过rnaset2诊断炎性肠病的方法
AU2017264578A1 (en) * 2016-05-09 2019-01-03 Bristol-Myers Squibb Company TL1A antibodies and uses thereof
CA3031028C (en) * 2016-07-25 2024-02-13 Lu Wang Affinity chromatography wash buffer
KR20190082815A (ko) * 2016-10-26 2019-07-10 세다르스-신나이 메디칼 센터 중화 항-tl1a 단일 클론 항체
US11426706B2 (en) 2017-06-21 2022-08-30 Cephalon, Inc. Cation exchange chromatography wash buffer
JP7332627B2 (ja) 2018-04-25 2023-08-23 プロメテウス バイオサイエンシーズ，インク． 最適化された抗ｔｌ１ａ抗体
JP7504992B2 (ja) 2019-10-24 2024-06-24 プロメテウス バイオサイエンシーズ，インク． Ｔｎｆ様リガンド１ａ（ｔｌ１ａ）に対するヒト化抗体およびその使用
WO2023244089A1 (ko) * 2022-06-17 2023-12-21 주식회사 셀렉신 인간 dr3에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
WO2024026395A1 (en) 2022-07-27 2024-02-01 Cephalon Llc Anti-tl1a antibodies for the treatment of ulcerative colitis and crohn's disease
WO2024026386A1 (en) 2022-07-27 2024-02-01 Cephalon Llc Anti-tl1a antibody formulations

Family Cites Families (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4593089A (en) 1980-07-30 1986-06-03 Abbott Laboratories Fluorescent polarization immunoassay utilizing substituted triazinylaminofluorescein aminoglycosides
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US4751190A (en) 1985-07-22 1988-06-14 Abbott Laboratories Fluorescence polarization immunoassay and reagents for use therein
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
ES2052027T5 (es) 1988-11-11 2005-04-16 Medical Research Council Clonacion de secuencias de dominio variable de inmunoglobulina.
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
WO1993011236A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
DE4211351A1 (de) 1992-04-04 1993-10-07 Behringwerke Ag Verfahren zur Analyse partikelverstärkter Agglutinationsreaktionen auf Zentrifugalanalysatoren durch Bestimmung der Trübungsaufhellung
US20080152586A1 (en) 1992-09-25 2008-06-26 Avipep Pty Limited High avidity polyvalent and polyspecific reagents
DE69334287D1 (de) 1992-09-25 2009-07-09 Avipep Pty Ltd Zielmoleküle-bindende Polypeptide bestehend aus einer IG-artigen VL Domäne die an eine IG-artige VH Domäne gebunden ist
CA2126967A1 (en) 1992-11-04 1994-05-11 Anna M. Wu Novel antibody construct
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
US7820798B2 (en) 1994-11-07 2010-10-26 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor-gamma
US7597886B2 (en) 1994-11-07 2009-10-06 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor-gamma
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6113898A (en) 1995-06-07 2000-09-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Human B7.1-specific primatized antibodies and transfectomas expressing said antibodies
DE69621940T2 (de) 1995-08-18 2003-01-16 Morphosys Ag Protein-/(poly)peptidbibliotheken
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6541213B1 (en) 1996-03-29 2003-04-01 University Of Washington Microscale diffusion immunoassay
US6699658B1 (en) 1996-05-31 2004-03-02 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
CA2244326C (en) 1997-08-11 2006-03-28 Shinichi Eda Microparticle enhanced light scattering agglutination assay and microparticle reagents therefor
EP1028751B1 (en) 1997-10-31 2008-12-31 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
EP1071700B1 (en) 1998-04-20 2010-02-17 GlycArt Biotechnology AG Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
US6562622B1 (en) 1998-05-08 2003-05-13 Diatech Pty, Ltd Continuous in vitro evolution
CA2342967A1 (en) 1998-12-08 2000-06-15 Biovation Limited Modifying protein immunogenicity
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6566051B1 (en) 1999-01-15 2003-05-20 Medtox Scientific, Inc. Lateral flow test strip
US7270969B2 (en) 1999-05-05 2007-09-18 Phylogica Limited Methods of constructing and screening diverse expression libraries
US7229619B1 (en) 2000-11-28 2007-06-12 Medimmune, Inc. Methods of administering/dosing anti-RSV antibodies for prophylaxis and treatment
DE60143544D1 (de) 2000-12-12 2011-01-05 Medimmune Llc Moleküle mit längeren halbwertszeiten, zusammensetzungen und deren verwendung
AU2002368077B2 (en) 2001-07-12 2010-03-04 Jefferson Foote Super humanized antibodies
EP1419387B1 (en) 2001-08-20 2012-01-04 Proteome Systems Ltd. Diagnostic testing process
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
WO2004046729A2 (en) 2002-11-21 2004-06-03 The University Of Leicester Bodily fluid markers of tissue hypoxia
EP1587540B1 (en) 2003-01-09 2021-09-15 MacroGenics, Inc. IDENTIFICATION AND ENGINEERING OF ANTIBODIES WITH VARIANT Fc REGIONS AND METHODS OF USING SAME
JP2006526414A (ja) 2003-06-02 2006-11-24 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 脱免疫化抗ｃｄ３抗体
ES2428321T3 (es) 2003-08-20 2013-11-07 University Of Miami Composiciones y métodos para tratar la enfermedad del pulmón inflamado
WO2005037867A1 (en) 2003-10-15 2005-04-28 Pdl Biopharma, Inc. ALTERATION OF Fc-FUSION PROTEIN SERUM HALF-LIVES BY MUTAGENESIS OF POSITIONS 250, 314 AND/OR 428 OF THE HEAVY CHAIN CONSTANT REGION OF IG
SG10202008722QA (en) 2003-11-05 2020-10-29 Roche Glycart Ag Cd20 antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function
WO2005092927A1 (en) 2004-03-23 2005-10-06 Biogen Idec Ma Inc. Receptor coupling agents and therapeutic uses thereof
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US20070135620A1 (en) 2004-11-12 2007-06-14 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
CA2602709A1 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Telethon Institute For Child Health Research Isolation of inhibitor of ires-mediated translation
US20090317388A1 (en) 2005-05-25 2009-12-24 Linda Burkly Tl1a in treatment of disease
KR20080068004A (ko) 2005-08-15 2008-07-22 아라나 테라퓨틱스 리미티드 뉴 월드 영장류 구조형성영역을 가진 조작 항체
CN101253199B (zh) * 2005-08-30 2019-06-14 迈阿密大学 免疫调节肿瘤坏死因子受体25(tnfr25)的激动剂、拮抗剂和免疫毒素
US20090269345A1 (en) 2005-12-23 2009-10-29 Rong Fan CLN248 Antibody Compositions and Methods of Use
US20110217310A1 (en) * 2007-01-10 2011-09-08 Siegel Richard M Blockade of tl1a-dr3 interactions to ameliorate t cell mediated disease pathology
US20100190162A1 (en) 2007-02-26 2010-07-29 Cedars-Sinai Medical Center Methods of using single nucleotide polymorphisms in the tl1a gene to predict or diagnose inflammatory bowel disease
EP1985305A1 (en) 2007-04-24 2008-10-29 Vivalis Duck embryonic derived stem cell lines for the production of viral vaccines
EP1995309A1 (en) 2007-05-21 2008-11-26 Vivalis Recombinant protein production in avian EBx® cells
BRPI0819205A2 (pt) 2007-11-13 2015-06-23 Teva Biopharmaceuticals Usa Inc Anticorpos humanizados contra tl1a
AR074369A1 (es) 2008-11-20 2011-01-12 Genentech Inc Anticuerpos anti-unc 5b (receptor de netrina) y metodos de uso
SG10201407908VA (en) 2008-12-19 2015-01-29 Macrogenics Inc Covalent diabodies and uses thereof
US20120073585A1 (en) 2009-04-08 2012-03-29 Cedars-Sinai Medical Center Methods of predicting complication and surgery in crohn's disease
US20130195884A1 (en) 2009-12-31 2013-08-01 Deutsches Krebsforschungszentrum Novel modulators of trail signalling
JO3375B1 (ar) 2010-11-08 2019-03-13 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية للجين a1 الشبيه بعامل النخر الورمي (tl1a)
JP2014518883A (ja) 2011-05-20 2014-08-07 ガバメント・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ，アズ・リプリゼンテッド・バイ・ザ・セクレタリー，デパートメント・オブ・ヘルス・アンド・ヒューマン・サーヴィシズ Ｔ細胞媒介疾病の病態を改善させるためのｔｌ１ａ−ｄｒ３相互作用の遮断及びその抗体
WO2013044298A1 (en) 2011-09-30 2013-04-04 Cephalon Australia Pty Ltd Antibodies against tl1a and uses thereof
WO2014106602A1 (en) 2013-01-02 2014-07-10 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Antibodies that bind to tl1a and their uses
EP2978440B1 (en) 2013-03-27 2019-10-02 Cedars-Sinai Medical Center Treating fibrosis by inhibiting tl1a and diagnosing fibrosis by detecting il31ra
WO2014186665A2 (en) 2013-05-17 2014-11-20 Cedars-Sinai Medical Center Distinct effects of ifn-gamma and il-17 on tl1a modulated inflammation and fibrosis
US10316083B2 (en) 2013-07-19 2019-06-11 Cedars-Sinai Medical Center Signature of TL1A (TNFSF15) signaling pathway
CN105636648A (zh) 2013-09-06 2016-06-01 雪松-西奈医学中心 用于抗tl1a疗法的系统、装置和方法
MY182271A (en) 2013-11-13 2021-01-18 Pfizer Tumor necrosis factor-like ligand 1a specific antibodies and compositions and uses thereof
TWI703158B (zh) 2015-09-18 2020-09-01 美商希佛隆公司 特異性結合tl1a之抗體
CR20180365A (es) 2015-12-16 2018-09-28 Amgen Inc PROTEÍNAS DE UNIÓN AL ANTÍGENO BISPECÍFICO DE ANTI-TL1A/ANTI-TNF-a Y SUS USOS

Also Published As

Publication number Publication date
ZA201401843B (en) 2015-07-29
EP2760889A4 (en) 2015-04-15
US20140255302A1 (en) 2014-09-11
MX2014003689A (es) 2014-12-05
AU2012315474B2 (en) 2017-10-26
US20240141053A1 (en) 2024-05-02
WO2013044298A1 (en) 2013-04-04
EA201400390A1 (ru) 2014-09-30
EP3495389A1 (en) 2019-06-12
KR20140101727A (ko) 2014-08-20
CA2850549A1 (en) 2013-04-04
JP2014531210A (ja) 2014-11-27
BR112014007426A2 (pt) 2019-01-15
IL231777B (en) 2019-01-31
CA2850549C (en) 2023-03-14
BR122020013379B1 (pt) 2023-01-03
AU2012315474A1 (en) 2014-03-20
CN104114577A (zh) 2014-10-22
EA035018B1 (ru) 2020-04-17
KR101982899B1 (ko) 2019-05-27
IL231777A0 (en) 2014-05-28
US20160333104A1 (en) 2016-11-17
US10822422B2 (en) 2020-11-03
US20210347904A1 (en) 2021-11-11
EP2760889A1 (en) 2014-08-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240141053A1 (en) Antibodies against tl1a and uses thereof
US20200239586A1 (en) Fn14 Binding Proteins and Uses Thereof
US9127057B2 (en) Anti-IL-23 heterodimer specific antibodies
RU2737145C2 (ru) Антитело, которое обладает способностью нейтрализовать субстанцию, обладающую активностью, альтернативной функции фактора свертывания viii (fviii)
RU2752595C2 (ru) Способ измерения реактивности fviii
AU2015336931B2 (en) CD83 binding proteins and uses thereof
AU2012201635B2 (en) anti-NPY and PYY antibodies and uses thereof
AU2014203658B2 (en) FN14 binding proteins and uses thereof
NZ622092B2 (en) Antibodies against tl1a and uses thereof
NZ622092A (en) Antibodies against tl1a and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
B25D Requested change of name of applicant approved

Owner name: TEVA PHARMACEUTICALS AUSTRALIA PTY LTD. (AU)

B25B Requested transfer of rights rejected

Owner name: TEVA PHARMACEUTICALS AUSTRALIA PTY LTD. (AU)

B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B25L Entry of change of name and/or headquarter and transfer of application, patent and certificate of addition of invention: publication cancelled

Owner name: TEVA PHARMACEUTICALS AUSTRALIA PTY LTD. (AU)

B25L Entry of change of name and/or headquarter and transfer of application, patent and certificate of addition of invention: publication cancelled

Owner name: TEVA PHARMACEUTICALS AUSTRALIA PTY LTD. (AU)

B15I Others concerning applications: loss of priority

Free format text: PERDA DA PRIORIDADE US 61/541,590 DE 30/09/2011 REIVINDICADA NO PCT/AU2012/001161 POR NAO ENVIO DE DOCUMENTO COMPROBATORIO DE CESSAO DA MESMA CONFORME AS DISPOSICOES PREVISTAS NA LEI 9.279 DE 14/05/1996 (LPI) ART. 16 6O, ITEM 27 DO ATO NORMATIVO 128/1997, ART. 28 DA RESOLUCAO INPI-PR 77/2013 E ART 3O DA IN 179 DE 21/02/2017 UMA VEZ QUE DEPOSITANTE CONSTANTE DA PETICAO DE REQUERIMENTO DO PEDIDO PCT E DISTINTO DAQUELE QUE DEPOSITOU A PRIORIDADE REIVINDICADA.

B12F Other appeals [chapter 12.6 patent gazette]
B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]
B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]
B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 28/09/2012, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF, QUE DETERMINA A ALTERACAO DO PRAZO DE CONCESSAO.