KR20220153109A - Rnaset2를 통한 염증성 장 질환의 진단 방법 - Google Patents

Rnaset2를 통한 염증성 장 질환의 진단 방법 Download PDF

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KR20220153109A
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레베카 곤스카이
스테판 알 타간
리차드 엘 딤
필립 플레슈너
더모트 피 맥거번
자닌 빌스보러
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세다르스-신나이 메디칼 센터
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Abstract

본 발명은 RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ를 사용하여, 크론병(CD: Crohn's Disease), 궤양성 대장염(UC: Ulcerative Colitis) 및/또는 약물 불응성 궤양성 대장염(MR-UC: Medically Refractive Ulcerative Colitis)을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 염증성 장 질환을 진단하는 방법을 기술한다. 또한, 본 발명은 환자 확인 및/또는 계층화를 위한 방법을 제공한다.

Description

RNASET2를 통한 염증성 장 질환의 진단 방법{METHODS OF DIAGNOSING INFLAMMATORY BOWEL DISEASE THROUGH RNASET2}
연방 후원 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)이 수여한 허가 번호 DK043211, DK046763, DK062413, HS021747, AI067068, DE023798, DK084554, RR033176 및 TR000124 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
발명의 분야
본 발명은 염증성 장 질환, 그리고 질병 중증도 및 항-TL1A 요법의 표적화를 위한 바이오마커로서의 RNASET2에 관한 것이다.
본원에서 모든 간행물은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 참조로 포함된다고 구체적으로 그리고 개별적으로 나타낸 것과 같이 동일한 정도로 참고로 포함된다. 하기 설명은 본 발명을 이해하는데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 본원에 제공된 정보가 선행 기술임을 또는 현재 청구된 발명과 관련이 있음을 인정하거나 구체적으로 또는 암시적으로 참조된 간행물이 선행 기술임을 결코 인정하는 것은 아니다.
염증성 장 질환(IBD: Inflammatory bowel disease)에는 위장관의 만성의 재발성 염증 장애인 크론병(CD: Crohn's disease)과 궤양성 대장염(UC: ulcerative colitis)의 두 가지 흔한 형태가 있다. 유전적 요인은 아슈케나지(Ashkenazi) 유대인의 IBD 비율의 증가, IBD의 가족 집적, 및 이란성 쌍생아에 비해 일란성에서 IBD의 일치의 증가로 입증된 바와 같이, IBD 발병기전에 중요한 역할을 한다(S. Vermeire, P. Rutgeerts, Genes Immun 6, 637 (2005)). 더욱이, 유전적 분석은 IBD를 특정 유전적 변이와 연관시켰다. CD와 UC는 일부 유전적 감수성 유전자 좌를 공유하지만 그 외에는 상이한 관련 장애로 생각된다.
IBD는 일반적으로 유전적으로 감수성이 있는 개체에서 공생 세균 총에 대한 부적절한 면역 반응에 의해 유발되는 것으로 생각된다. CD와 UC의 높은 임상적 이질성과 유전적 복잡성은 질병을 유발하는 근본적인 생물학적 경로가 환자들의 하위군에서 거의 확실하게 상이함을 시사한다. 따라서 조기 및 표적 치료법의 개발은, 특히 중증에 비해 전체적인 경증 질병 경과를 예측하는데에, 하위군의 계층화 및 예후 바이오마커의 확인을 요구한다. 201개의 IBD 감수성 유전자 좌가 확인되었지만, 이들의 기능적 유의성에 대해서는 거의 알려지지 않고 있다. TNFSF15의 유전적 변이는 여러 집단에서 CD와 관련이 있으며, 이것이 코딩하는 단백질인 TL1A는 점막 염증의 핵심 매개 인자이다. TL1A 발현은 CD와 UC 모두의 장 염증 부위에서 상승 조절된다. IBD 환자에서, TL1A의 수준 상승은 TNFSF15 유전자형 및 질병의 중증도와 상관관계가 있다. TL1A의 혈청/조직 수준이 상승한 CD 환자는 섬유증/협착 질병 행태가 발생할 위험이 증가한다. 시험관 내에서 TL1A는 인터루킨 12(IL-12) 및 인터루킨 18(IL-18)(12/18)과 상승작용하여 점막 염증의 또 다른 핵심 매개 인자인 IFN-γ 생산을 신속하게 상승시킨다.
따라서, IBD, CD, UC 및/또는 MR-UC을 치료하기 위해 환자를 진단하고 확인하는 방법에 대한 요구가 당업계에서 남아있다.
예시적인 실시양태는 참조된 도면에 예시되어 있다. 본원에 개시된 실시양태 및 도면은 제한적이라기보다는 예시적인 것으로 간주하도록 의도된다.
도 1은 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, 관련없는 소장에서의 RNASET2 eQTL 마이크로어레이를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, RNASET2 주요 대립 유전자가 CD 환자의 S상 결장 및 직장에서 RNASET2의 발현 감소와 관련된다는 것을 보여준다.
도 3은 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, RNASET2 주요 대립 유전자가 UC 환자의 S상 결장 및 직장에서 RNASET2의 발현 감소와 관련된다는 것을 보여준다.
도 4는 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, RNASET2 위험 대립 유전자가 CD 및 UC 환자의 염증성 대장에서 RNASET2의 발현 감소와 관련된다는 것을 보여준다. rs1819333에 대해서 유사한 결과가 관찰되었다.
도 5는 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, RNASET2 주요 대립 유전자가 CD 수술로부터의 소장에서 RNASET2의 발현 감소와 관련된다는 것을 보여준다.
도 6은 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, EBV 형질전환된 B 세포주에서의 RNASET2 eQTL을 나타낸다. 주요 대립 유전자는 EBV 형질전환된 B 세포주에서 낮은 수준의 RNASET2 mRNA 발현과 관련된다.
도 7은 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, IL-12, IL-18, 및/또는 TL1A 및 처리 후의 RNASET2 발현을 나타낸다.
도 8A-8C는 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, CD 환자에서 RNASET2 발현을 나타낸다. A) 연간 0 또는 1회, 다중의 질병 발적이 있는 환자에서 RNASET2 발현. B) 질병 관리를 위해 외과적 개입이 필요하거나 수술이 필요하지 않은 약물 불응성 환자에서 TL1A 처리 후 RNASET2 발현. C) 추가 데이터 샘플을 포함하여 32명의 CD 환자에서 연간 질병 발적을 기준으로 한 RNASET2 발현.
도 9는 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, RNASET2 위험 대립 유전자를 갖는 IBD 환자에서 RNASET2의 발현 감소를 나타낸다.
도 10은 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, CD 및 UC 환자에서 RNASET2 메틸화 vs. GWAS p 값을 나타낸다.
도 11은 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, 불응성 IBD에서 RNASET2의 eQTL을 나타낸다. 일루미나(Illumina) 발현 어레이를 사용한, 질병 관리를 위해 외과적 개입이 필요한 11명의 CD 및 10명의 UC 환자의 CD3+ 말초 T 세포로부터의 RNASET2 SNP(rs2149085, rs1819333 및 rs9355610).
도 12는 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, 85명의 CD 환자의 CD 소장(회장)의 외과적 절제에서 애질런트(Agilent) 발현 어레이를 사용한 RNASET2의 eQTL을 나타낸다.
도 13A-13D는 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, 불응성 IBD에서 RNASET2의 mQTL을 나타낸다. A) 불응성 IBD에서 RNASET2의 mQTL 및 B) 정상 또는 경증 질병 환자에서 RNASET2의 mQTL. C) 질병 관리를 위해 외과적 개입이 필요한 불응성 질병을 갖는 20명의 CD 환자의 CD3+ 말초 T 세포의 mQTL(cg25258033) D) 추가 데이터 샘플을 포함하여, IBD 치료법에 반응하는 16명의 환자와 9명의 정상 대조군.
도 14A-14B는 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, 불응성 또는 경증 질병을 갖는 환자에서 RNASET2에 걸친 eQTL 및 mQTL의 맵핑을 나타낸다. A) 불응성 또는 경증 질병을 갖는 환자에서 RNASET2에 걸친 eQTL 및 mQTL. B) 추가의 데이터 샘플을 포함하여, 불응성 또는 경증 질병을 갖는 환자(정상 환자 포함)의 말초와 점막 구획의 CD3+ T 세포를 사용하여 계산된 eQTL 및 mQTL.
도 15는 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, IL-12, IL-18 및/또는 TL1A로 자극된 CD4+ T 세포의 분류 및 IFNγ 발현을 나타낸다. 4명의 공여자(D1-4)로부터의 재조합 인간 IL-12(500 pg/ml) 및 IL-18(50 ng/ml) 및 TL1A(100 ng/ml)로 8시간 동안 자극한 CD4+ T 세포에 대한 측면 산란 vs. IFN-γ의 히스토그램.
도 16은 본 발명의 다양한 실시양태들에 따라서, 중심 상관관계 및 평균 연관을 이용하는 계층적 클러스터링의 덴드로그램을 나타낸다.
도 17은 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, 발현 수준을 기준으로 하여 IFNγ 분비 및 비분비 하위군을 분류하는 클래스 예측 분석을 나타낸다. 764개의 예측 유전자의 히트 맵.
도 18은 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, 다른 영역에 비해 GWAS에서 증가된 차등 발현된 유전자의 비율을 나타낸다.
도 19는 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, T 세포에서 전사된 183개의 IBD 관련 SNP 영역을 나타낸다.
도 20은 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, IBD 위험 예측 유전자의 클래스 예측 GWAS 전사체의 화산 플롯을 나타낸다.
도 21A-21B는 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, RNASET2의 침묵이 IFN-γ 분비를 상승시킨다는 것을 보여준다. A) RNASET2 siRNA에 의한 RNASET2의 억제. B) IFN-γ 분비에 대한 RNASET2 침묵의 효과. 대조군의 스크램블(scrambled) siRNA에 비해 RNASET2 siRNA로 형질감염된 세포에서 상승된 IFN-γ 발현.
도 22는 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, IFN-γ와 RNASET2 발현의 역 상관관계를 입증한다.
도 23은 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, 21명의 IBD 환자의 CD3+ T 세포(첫 번째 인트론 내 1.4 kb에 위치한 cg25258033)에서 RNASET2 메틸화와 발현의 음의 상관관계를 입증한다.
도 24A-24D는 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, RNA-seq를 사용하여 질병 관리를 위해 외과적 개입이 필요한 불응성 질병을 갖는 환자의 CD3+ T 세포에서 RNASET2와 TNFSF15 발현의 상관관계를 나타낸다. A) 불응성 CD에서 RNASET2 vs. TL1A의 상관관계. B) 38명의 CD 환자의 CD3+ 말초 T 세포에서 RNASET2와 TNFSF15 발현의 상관관계. C) 100명의 CD 환자의 데이터를 나타내고, D) 138명의 환자의 데이터를 합하여 나타낸다.
도 25는 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, RNASET2의 발현 vs. A) PU.1 및 B) ELF1의 상관관계를 나타낸다. 위험 SNP rs2149092 C/T (서열 번호 2)는 IRF4, PU.1, 및 ELF-1 결합 부위를 제거한다. C- 비위험 및 T = 위험 대립 유전자.
도 26은 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, 21명의 IBD 환자에서 RNASET2 전사 개시 부위의 100kb 내에 위치한 메틸화와 발현의 상관관계를 나타낸다.
도 27은 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, CD4+ T 세포에서 IFN-γ 생산 및 비생산 수준의 IFN-γ 발현을 나타낸다.
도 28은 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, RNASET2 유전자 좌에 대하여 eQTL p 값과 GWAS p 값의 상관관계를 나타낸다. GWAS p 값은 18729명의 CD 및 34897명의 대조군의 데이터를 근거로 한다. eQTL p 값은 질병 관리를 위해 외과적 개입이 필요한 불응성 질병을 갖는 71명의 환자에 대한 RNASET2의 유전자형 분석 및 RNA-seq 기반 발현을 근거로 한다.
도 29는 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, IFN-γ 분비에 대한 RNASET2 침묵 효과를 나타낸다. RNASET2 특이적 siRNA에 의한 RNASET2 발현의 억제는 모든 실험에서 50%보다 컸다.
도 30은 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, ASCA 혈청반응 양성과 RNASET2의 발현 감소의 연관성을 나타낸다.
도 31은 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, 관통 질병과 RNASET2의 발현 감소의 연관성을 나타낸다. 몬트리올 질병 분류(B1, B2 및 B3)를 기준으로 한 71명의 CD 환자의 RNA-seq에 의한 RNASET2의 발현.
도 32는 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, RNASET2 질병 관련 SNP를 갖는 환자가 재수술까지 시간단축을 나타냈다는 것을 도시한다. 여러 번 수술을 받은 154명의 CD 환자에 대하여 IBD 위험 SNP rs9355610 (서열 번호 3)의 보유를 기준으로 한 수술 사이의 시간.
도 33은 rs2149092 SNP (서열 번호 2)가 DNA 형태를 변경한다는 것을 나타낸다.
도 34는 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, RNASET2 vs. Ets1 발현의 상관관계를 나타낸다.
도 35는 rs2149092 SNP (서열 번호 2)가 Ets1 결합 부위에서 DNA 형태를 비튼다는 것을 나타낸다.
도 36A-36C는 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, RNASET2 질병 관련 변이 rs2149092 (서열 번호 2)의 잠재적인 조절 기능, RNASET2 변이 rs2149092(C-비위험 대립 유전자/T-위험 대립 유전자)의 전향적인 조절 역할의 확인. A) ETS 및 IRF4 전사인자의 결합 모티프에서 rs2149092 C에서 T로의 변이의 예측된 파괴. 변이체 모티프에서 중앙 ETS는 밑줄로 나타낸다. B) ETS1, IRF4 및 SPI1 전사인자 결합 및 rs2149092 변이 주변의 게놈 서열과 정렬된 히스톤 H3K4me1 및 H3K4ac의 CHIP-seq 및 히스톤 변형 프로파일. C) RNA-seq를 사용한, 질병 관리를 위해 외과적 개입이 필요한 108명의 CD 환자의 CD3+ 말초 T 세포에서 RNASET2의 발현과 다중 ETS 및 JUN 전사인자의 상관관계.
도 37A-37G는 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, IFN-γ 분비 및 세포 응집에 대한 RNASET2 침묵의 효과를 나타낸다. A) RNASET2 또는 대조군(NC) siRNA에 의한 RNASET2 발현의 침묵. B) IFN-γ 분비에 대한 RNASET2 침묵의 효과. 패널 A 및 B는 결과가 유사한 7회의 실험(도 29) 중 6회를 나타낸다. C) CD4+ T 세포는 미처리(UT)하거나 D) TL1A로 24시간 동안 자극하였다. 세포 내 IFN-γ 염색 및 세포 응집은 유세포 측정법으로 측정하였다. 세포는 IFN-γ 분비 및 비분비 집단(왼쪽 패널)으로 분류한 후 프로피디움 요오다이드(PI; propidium iodide)를 사용하여 단일 및 응집 세포 분획에 대해 분석하였다(히스토그램, 오른쪽 패널). 각 히스토그램의 첫 번째 피크는 단일 세포(검은 괄호)에 해당하고 나머지 피크는 세포 응집체(회색 괄호)에 해당한다. 4회 실험을 나타낸다. E) TL1A 자극 후 IFN-γ 분비(IFN-γ+) 및 비분비(IFN-γ-) 집단에서 단일 세포 및 세포 응집체의 비율. F) IFN-γ 분비 세포 수의 배수 증가율(4회 실험의 평균). G) CD4+ T 세포는 TL1A 자극 전에 대조 IgG 또는 LFA1 차단 Ab(aLFA1)로 사전 처리하였다. ELISA에 의해 측정된 IFN-γ 분비의 LFA1 매개된 차단에 대한 전체 p 값은 0.047이었다.
도 38은 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, 수술시의 RNASET2 질병 위험 변이 SNP와 티오푸린 또는 항-TNF 요법의 치료 실패, ANCA 혈청반응 양성 및 장 절제의 길이 증가와의 연관성을 나타낸다(표 18에 요약된 데이터).
도 39는 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, 수술 후에 예방 조치를 받지 않은 38명의 환자에서 RNASET2 질병 위험 변이 SNP와 질병 재발의 연관성을 나타낸다. 수술 후 내시경 검사를 수행하고 루트기어츠(Rutgeerts) 점수로 분류하였다(표 18에 요약된 데이터).
도 40은 RNASET2 유전자 좌의 조직 특이적 기능을 표시하여 나타낸다. H3K4me3, H3K4me1의 히트맵 및 REMC로부터의 RNAseq 데이터.
도 41은 RNA-seq를 사용한, 불응성 질병을 갖는 108명의 CD 환자의 CD3+ 말초 T 세포에서 RNASET2 발현과 다중 ETS 및 IRF4 전사인자의 상관관계를 나타낸다.
도 42는 대조군(NC) 또는 RNASET2 siRNA로 침묵 후 미처리 세포에 비해 CD4+ T 세포에서 표시된 유전자의 단백질 발현을 보여주는 히트 맵을 나타낸다. 결과는 건강한 4명의 공여자의 것이다. 오른쪽 칼럼은 비분비 CD4+ T 세포와 비교하여 IFN-γ 분비의 차등 유전자 발현을 나타낸다.
도 43은 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서, IgG ASCA 혈청반응 양성(왼쪽 패널) 또는 항-TNF(중간 패널) 또는 티오푸린(우측 패널)의 수술 전의 치료 실패를 기준으로 한 71명의 CD 환자의 ICAM1 발현 수준(RNA-seq으로 측정)과 관련된 임상 질병 파라미터를 나타낸다.
본원에 인용된 모든 참고 문헌은 완전히 개시된 것처럼 그 전문이 참고로 포함된다. 또한, RNASET2와 관련된 서열은 개시된 rs 번호를 통해 완전히 개시된 것처럼 그 전체가 참고로 포함된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 문헌[Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3 rd ed., Revised, J. Wiley & Sons (New York, NY 2006); 및 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4 th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2012)]은 당업자에게 본 출원에서 사용되는 많은 용어에 대한 일반적인 지침을 제공한다. 항체 제조 방법에 대한 참고를 위해, 문헌[D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual 2 nd ed. (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor NY, 2013); Kohler and Milstein, (1976) Eur. J. Immunol. 6: 511; 미국 특허 제5,585,089호(Queen et al.); Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988); Bird, Science 242:423-42 (1988); Tomlinson I. and Holliger P. (2000) Methods Enzymol, 326, 461-479; Holliger P. (2005) Nat. Biotechnol. Sep;23(9):1126-36)]을 참조한다.
당업자는 본 발명의 실시에 사용될 수 있는, 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 많은 방법 및 재료를 인식할 것이다. 실제로, 본 발명은 기재된 방법 및 재료에 결코 제한되지 않는다. 본 발명의 목적을 위해, 아래에 하기 용어를 정의한다.
본원에서 사용되는 "생물학적 샘플"의 비제한적인 예는 핵산 및/또는 단백질을 얻을 수 있는 임의의 생물학적 물질을 의미한다. 비제한적인 예로서, 상기 용어는 전혈, 말초 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 점액, 소변, 정액, 림프, 대변 추출물, 볼 스왑(swab), 세포 또는 기타 체액 또는 조직을 포함하며, 조직은 외과적 생검 또는 외과적 절제술을 통해 얻은 조직을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 대안적으로, 샘플은 1차 환자 유래 세포주, 또는 보존된 샘플 또는 신선한 냉동 샘플의 형태로 보관된 환자 샘플을 통해 얻을 수 있다.
본원에서 사용되는 "치료" 및 "치료하는"은 치료 요법 및 예방 또는 방어 조치 모두를 의미하며, 그 목적은 표적화된 병리학적 상태를 예방 또는 지연(감소)시키고, 병리학적 상태를 방지하고, 양호한 전체 생존을 추구하거나 획득하고, 치료가 궁극적으로 실패하더라도 개인의 병태 발생 확률을 낮추는 것이다. 치료가 필요한 사람은 이미 그 병태가 있는 사람뿐만 아니라 그 병태에 걸리기 쉬운 사람 또는 그 병태가 예방되어야 할 사람을 포함한다.
본원에서 사용되는 "SNP(single nucleotide polymorphism)"는 단일 뉴클레오티드 다형성을 의미한다.
본원에서 사용되는 "위험 변이"는 대립 유전자로서, 그 존재가 위험 변이를 가지지 않는 개체에 비해 크론병, 궤양성 대장염 및 약물 불응성 궤양성 대장염을 포함하지만 이에 제한되지 않는 염증성 장 질환에 대한 감수성의 증가와 관련된 대립 유전자를 지칭한다.
본원에서 사용되는 "IBD", "CD", "UC" 및 "MR-UC"는 각각 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 대장염 및 약물 불응성 궤양성 대장염을 지칭한다.
본원에서 사용되는 "IBD"는 "CD", "UC" 및/또는 "MR-UC"를 포함한다.
본원에서 사용되는 "ANCA(anti-neutrophil cytoplasmic antibody)"는 항-호중구 세포질 항체를 의미한다.
본원에서 사용되는 "OmpC(outer membrane protein C)"는 외막 단백질 C를 의미한다.
본원에서 사용되는 "eQTL(expression quantitative trait loci)"은 발현 양적 형질 유전자 좌를 의미한다.
본원에서 사용되는 "mQTL(methylation quantitative trait loci)"은 메틸화 양적 형질 유전자 좌를 의미한다.
RNASET2 SNP의 비제한적인 예는 rs1819333, rs2149092, rs9355610, rs2149085, rs1410295 및 rs9366093이다.
본원은 환자 집단의 질병 중증도의 바이오마커로서 RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ를 사용하여 염증성 장 질환을 진단하는 방법 및 항-TL1A 요법을 위한 환자 집단을 선별하는 방법을 기재한다. 추가로 이들 환자 집단을 치료하는 방법을 기재한다.
RNASET2(리보뉴클레아제 T2)는 세포 외 RN아제를 코딩하며 인간 Rh/T2/S 패밀리의 산성 리보뉴클레아제(산 가수분해)의 유일한 구성원으로, 이들은 산성 pH에서만 활성을 보인다. RNASET2의 최적 활성은 pH 5에서이고 폴리-A 및 폴리-U를 우선적으로 절단한다. 이는 촉매 기능을 하는 두 개의 영역을 포함하며 구아닐산이 이어지는 아데닐산 근처에서 우선적인 절단을 나타낸다. RNASET2의 3개의 이소형, 27KD, 31KD 및 36KD 이소형이 발견되었다. 27KD 및 31KD 이소형은 36KD 이소형의 단백질 분해 절단의 결과로 생각된다. 세 가지 이소형 모두 글리코실화된다. 세포 하 분획법은 전체 길이의 RNASET2가 소포체에 위치하고, 2개의 더 작은 RNASET2 단백질 분해 산물이 리소좀 분획에 위치한다는 것을 보여준다. RNASET2는 바이러스에서 인간까지의 문(phylum)에서 매우 보존적이며, 이는 진화에 있어 중요한 기능을 시사한다.
TL1A(TNFSF15)는 면역 복합체에 의한 또는 장내 미생물과의 상호작용을 통한 자극 후에 단핵구, 대식세포, 및 수지상 세포와 같이 면역계의 활성화된 세포에서 주로 발현되는 종양 괴사 인자 패밀리 구성원이다. TL1A 발현은 염증성 장 질환에서 상승하고 TL1A 수준이 높을수록 질병의 중증도와 관련된다. 전체 게놈 연관성 연구(GWAS: Genome-Wide Association Studies)는 TNFSF15 SNP가 IBD와 관련됨을 확인하였다. 연구는 쥣과 대장염 모델에서 중화 TL1A 항체가 대장염을 약화시키는 한편, 구성적 TL1A 발현은 쥣과 회맹부 염증 및 장 섬유성 협착증 악화를 나타낸다는 것을 보였다.
IFN-γ는 IBD에서 점막 염증의 생성 및 지속에 핵심적인 역할을 한다. TL1A는 PB T 세포에서 IL-12/IL-18 매개된 IFN-γ 분비를 증가시킨다.
본 발명자들은 IFN-γ 생산을 TL1A 매개로 상승시키는 요소로서 IBD 감수성 유전자인 RNASET2를 확인한다. 또한, RNASET2의 기능적 변이는 하나 이상의 질병 발적 및 협착/관통 질병 행태를 특징으로 하는 더 "중증"의 CD 표현형과 관련된다. 특정 이론에 구애받지 않고서, 본 발명자는 RNASET2가 중증 질병 병리 생물학과 관련된 치료 바이오마커로서 역할을 하고 TL1A 유도 염증 경로를 표적화하는 요법이 가장 유익할 가능성이 있는 환자 집단의 확인을 가능하게 한다고 생각한다. TNFSF15 질병 관련 변이는 TL1A의 증가되고 지속되는 발현과 상관관계가 있다. TNFSF15는 GWAS에서 IBD 관련 유전자로 확인되고 확정되었으며, 장염의 위치 및 중증도뿐만 아니라 협착 질병의 발생을 조절하는데 역할을 한다고 생각된다. TL1A가 구성적으로 발현되는 트랜스제닉 마우스는 회장 및 결장 섬유증과 함께 장염이 발생하였으며, 이는 항-TL1A 치료에 의해 역전되었다. UC에서, 약물 불응성 질병의 발생과 TL1A 유전자 좌 사이에 강한 연관성이 있다. TL1A가 IBD 발병기전과 관련된 중요한 염증 유발성(pro-inflammatory) 사이토카인이지만, 상승된 사이토카인 분비 및 염증의 근본적인 분자 경로는 잘 알려지지 않았다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 T 세포에서 사이토카인 발현, 특히 IFN-γ를 유도하는 TL1A 의존성 분자 유발 인자를 조사하였다. 이 접근법은 IFN-γ 생산의 TL1A 매개된 상승의 요소로서 RNASET2의 하향 조절을 확인하였다.
본 발명자들은 RNASET2 질병 위험 SNP의 CD 환자로부터 단리된 T 세포의 발현 감소 및 과메틸화와 기능적 연관성뿐 아니라, 복잡성/내성의 질병 행태 및 질병의 신속한 재발을 시사하는 임상 파라미터와의 연관성을 입증한다. 본 발명자들은 RNASET2 발현을 조절하는 데 있어 ETS TF의 조절 잠재력 및 IFN-γ 생산의 RNASET2 매개된 상승 조절의 요소로서 ICAM1을 통한 동형(homotypic) T 세포 응집의 관련을 보여준다. 이 데이터는 RNASET2를 잠재적 치료 바이오마커로서 특징짓고 정의된 IBD 집단 내에서 추가적인 치료 조절을 위한 고유의 경로를 확인한다.
본 발명자들은 IBD 환자에서, RNASET2의 발현과 TNFSF15 사이에 유의한 역 상관관계가 있음을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 DNA 과메틸화와 RNASET2의 발현 감소 사이의 기능적 연관성을 입증한다.
본 발명자들은 말초 T 세포 및 소장의 외과적 절제로부터 단리된 샘플에서 GWAS를 통해 확인된 RNASET2 IBD 위험 대립 유전자와 유의한 eQTL 중첩이 있음을 발견하였다. 유의한 RNASET2 eQTL(rs429083)은 전체 흉선 조직 샘플에서 자가면역 관련 위험 변이를 측정한 최근 보고에 설명되었다. 이 SNP는 그 데이터에서도 가장 유의한 eQTL을 입증하였다. 또한, 연구는 RNASET2의 발현 수준 감소가 CD 환자에서 복잡하고 내성인 질병을 시사하는 임상 파라미터와 상관관계가 있었다는 임상적으로 관련이 있는 증거를 제공한다. 특히, RNASET2 질병 위험 SNP를 보유한 CD 환자는 협착/관통 질병 행태의 발생이 증가하였다. RNASET2 발현은 연간 하나 이상의 질병 발적을 나타내는 CD 환자로부터 단리된 T 세포에서 유의하게 낮았다. 유사하게, RNASET2 발현은 질병 관리를 위한 외과적 개입이 필요한 약물 불응성 CD 환자(항-TNF 요법에 반응하지 않는 11명 중 9명)로부터의 소장 점막 샘플뿐만 아니라 말초 샘플에서도 감소한다. 이 결과와 일치하여, 최근의 한 연구는 항-TNF 요법에 내성을 갖는 환자의 전혈에서 유의한 RNASET2 eQTL을 보고하였다. 또한, RNASET2 질병 관련 SNP는 항-TNF 요법의 치료 실패 그리고 전체 질병 중증도의 임상 특징인 > 40cm의 장 절제와 상관관계가 있었다. 여러 번 절제 이력이 있는 환자에서, RNASET2 질병 위험 SNP는 재수술까지의 시간 단축과 관련이 있었다. 마찬가지로, RNASET2 질병 관련 SNP는 더 중증의(> 2) 루트기어츠 점수를 특징으로 하는 내시경 검사의 재발과 관련이 있었으며, 이는 특정 이론에 구애받지 않고서, 조기 임상 재발 및 재수술의 필요성을 예측할 수 있다.
RNASET2 발현을 조절하는 전사 조절 영역 및 결합 인자도 마찬가지로 거의 정의되어 있지 않다. GWAS에 의해 확인된 질병 관련 변이의 대부분은 프로모터 또는 인핸서 서열에 상응하는 조절의 비코딩 영역 내에 존재한다. 특정 이론에 구애받지 않고서, 연구는 전사인자 결합 부위의 파괴를 통한 전사 조절의 변경이 질병 과정에서 역할을 할 수 있음을 시사한다. 본 연구에서, 발명자는 TF 모티프 분석을 이용하여 eQTL 및 mQTL을 입증하는 다수의 변이로부터 전향적인 조절 SNP를 우선 순위화하고 확인하였다. rs2149092 질병 관련 SNP는 보존된 ETS 공통 결합 서열을 변경하고 아마도 IRF4, SPI1 및 ELF1을 포함하는 다수의 중첩하는 TF 결합 부위의 결합을 방해할 것 같다. 더욱이, RNASET2 발현 수준과 ETS 및 JUN TF 패밀리 구성원 사이에는 강한 양성의 상관관계가 있다. 흥미롭게도, IRF4, SPI1 및 ELF1은 T 세포 발생에 연관되었으며 IRF4 및 ELF1은 GWAS에 의해 IBD와 관련되었다. 특정 이론에 구애받지 않고서, 이 데이터는 TF-DNA 상호작용의 조절 인자로서 rs2049092의 기능적 역할을 뒷받침하고 TL1A가 질병에서 RNASET2의 발현을 약화시키는 기계적 경로를 결정하기 위한 전향적 연구 단계를 설정한다.
본 연구에서, 발명자들은 RNASET2와 세포 부착 분자 ICAM1 사이의 기능적 관계를 설명한다. TL1A에 반응하여 상승한 IFN-γ 분비는 한편으로는 RNASET2 발현의 감소, 다른 한편으로는 ICAM1의 수준증가를 수반하였다. TL1A 매개된 IFN-γ 분비는 ICAM1-LFA1 상호작용의 Ab 차단에 의해 억제되었다. ICAM1-LFA1 결합은 고전적으로 내피세포와 T 세포 사이에서 발생하는 것으로 정의되지만, 이러한 상호작용은 최근에 활성화된 T 세포의 동형 세포 응집을 매개하는데 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 동형 T-T 응집체는 하나의 T 세포에서 다른 T 세포로 IFN-γ 및 IL2의 시냅스 기반 사이토카인 전달을 촉진하여 IL-2 수용체 라이게이션(ligation) 및 후속적인 STAT5 인산화를 유도하는 것으로 나타났다. 본 발명자들은 상승한 세포 응집이 IFN-γ 생산 세포의 특징이며 TL1A 자극이 세포 응집체의 개수 및 크기를 증가시킨다는 것을 입증한다. 특정 이론에 구애받지 않고서, 이 결과는 RNASET2가 인테그린 신호전달 경로를 통해 작용하여 하류 IFN-γ 분비를 조절할 수 있음을 시사한다.
결론적으로, 본 발명자들은 2개의 IBD 감수성 유전자인 TNFSF15와 RNASET2 사이의 새로운 기능적이고 생물학적인 관계를 확인하였다. 본 발명자들은 RNASET2 발현 감소가 활성화된 T 세포에 의한 TL1A 유도 염증 유발성 사이토카인 생산과 기능적으로 관련되고 RNASET2 IBD 감수성 변이와 기능적으로 관련된다는 증거를 제공한다. 마찬가지로, 본 연구는 RNASET2 발현 감소와 더 중증 형태의 IBD 염증 사이의 연관성을 입증하며, 이는, 특정 이론에 구애받기를 바라지 않고서, TL1A 매개된 경로에 의해 유발된 질병 병리학의 기초가 된다고 본 발명자들은 생각한다. RNASET2의 발현 감소 및 후생적인 DNA 메틸화의 변경은 더 중증 질병의 표현형을 갖는 IBD 환자의 서브세트의 특징이 된다. 본 발명자들은 RNASET2 질병 위험 SNP의 CD 환자로부터 단리된 T 세포에서 감소 발현 및 과메틸화와의 기능적 연관성뿐 아니라 복잡성/내성의 질병 행태 및 질병의 신속한 재발를 시사하는 임상 파라미터와의 연관성을 입증한다. 본 발명자들은 RNASET2 발현을 조절하는 데 있어 ETS TF의 조절 잠재력 및 IFN-γ 생산의 RNASET2 매개된 상승 조절의 요소로서 ICAM1을 통한 동형 T 세포 응집의 관련을 보여준다. 이 데이터는 RNASET2를 잠재적 치료 바이오마커로서 특징짓고 정의된 IBD 집단 내에서 추가적인 치료 조절을 위한 고유의 경로를 확인한다. 따라서, RNASET2 발현은 현재의 치료 전략에 반응하지 않는 환자 집단을 확인하는 더 중증 형태의 염증의 새로운 질병 바이오마커로서 역할을 하며, 이들은 대안적인 RNASET2 매개된 치료 방법이 유익할 수 있다.
본원에 개시된 바와 같이, 본 발명자들은 IBD 환자 코호트에서 RNASET2 관련 SNP를 확인하였다. 본 발명자들은 CD 환자 코호트에서 RNASET2 관련 SNP를 확인하였다. 본 발명자들은 UC 환자 코호트에서 RNASET2 관련 SNP를 확인하였다. 본 발명자들은 MR-UC 환자 코호트에서 RNASET2 관련 SNP를 확인하였다. SNP는 질병 위치, 질병 행태 및 수술 필요성과 관련이 있다. 본 발명자들은 또한 IBD 환자 코호트에서 질병 중증도 및 관련된 RNASET2 위험 SNP에 대한 바이오마커로서 RNASET2를 확인하였다. RNASET2는 CD 환자 코호트에서 질병의 중증도 및 관련된 RNASET2 위험 SNP에 대한 바이오마커로서 확인되었다. RNASET2는 UC 환자 코호트에서 질병의 중증도 및 관련 RNASET2 위험 SNP에 대한 바이오마커로서 확인되었다. RNASET2는 MR-UC 환자 코호트에서 질병 중증도 및 관련 RNASET2 위험 SNP에 대한 바이오마커로서 확인되었다. 또한, 본 발명자들은 RNASET2, TL1A 발현 및 IFN-γ 분비 사이의 상관관계를 입증한다.
본 발명은 이러한 결과에 적어도 부분적으로 기초한다. 본 발명은 RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ를 사용하여 IBD 환자를 진단하고 치료가 필요한 환자를 확인하는 방법에 대한 당 업계의 요구를 다룬다. 본 발명은 또한 환자 확인 및/또는 계층화 방법을 제공한다.
진단
본 발명의 다양한 실시양태는 대상체에서 염증성 장 질환(IBD)을 진단하는 방법으로서, 대상체로부터 샘플을 얻는 단계; RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재 또는 부재를 결정하는 데 적합화된 분석법을 상기 샘플에 대해 수행하는 단계; 및 RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재에 기초하여 대상체에서 IBD를 진단하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 염증성 장 질환은 크론병, 궤양성 대장염 또는 약물 불응성 궤양성 대장염이다. 다양한 실시양태에서, RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이는 rs1819333, rs2149092, rs9355610, rs2149085, rs1410295 또는 rs9366093이다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 2, 3, 4, 5 또는 6개의 RNASET2 위험 변이가 존재하는 경우, 상기 대상체는 IBD로 진단된다. 다양한 실시양태에서, rs2149085에 대한 위험 대립 유전자는 T 대립 유전자이다. 다양한 다른 실시양태에서, RNASET2 위험 변이는 RNASET2 위험 변이 rs429083, 및 rs1819333, rs2149092, rs9355610, rs2149085, rs1410295, rs9366093 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 RNASET2 위험 변이이다. 다양한 다른 실시양태에서, RNASET2 위험 변이는 표 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 13의 하나 이상의 RNASET2 위험 변이, 및 rs1819333, rs2149092, rs9355610, rs2149085, rs1410295, rs9366093 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 RNASET2 위험 변이이다. 다양한 다른 실시양태에서, RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이는 rs1819333, rs2149092, rs9355610 또는 rs2149085이다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 2, 3 또는 4개의 RNASET2 위험 변이 rs1819333, rs2149092, rs9355610 또는 rs2149085가 존재하는 경우, 상기 대상체는 IBD로 진단된다. 다른 실시양태에서, 샘플에서 더 많은 수의 위험 변이의 존재는 대상체가 치료를 더 많이 필요로 한다는 것을 나타낸다. 일부 실시양태에서, RNASET2 위험 변이의 검출은 대상체에서 치료의 필요성을 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 항-TL1A 요법이 필요한 것으로 확인된다. 다양한 실시양태에서, IBD로 진단된 대상체는 티오푸린 및 항-TNF 요법의 치료 실패를 보인다. 다양한 다른 실시양태에서, IBD로 진단된 대상체는 외과적 개입이 필요하다고 결정된다. 일부 실시양태에서, 외과적 개입은 장 절제술이다.
<표 1>
Figure pat00001
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 대상체에서 염증성 장 질환 (IBD)을 진단하는 방법은 RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, RNASET2가 감소되고/되거나 TL1A 및/또는 IFN-γ 수준이 증가된 대상체는 IBD로 진단된다. 다양한 실시양태에서, 염증성 장 질환은 크론병이다. 다양한 실시양태에서, 염증성 장 질환은 궤양성 대장염이다. 다양한 실시양태에서, 염증성 장 질환은 약물 불응성 궤양성 대장염이다. 다양한 실시양태에서, 염증성 장 질환은 질병 관리를 위해 외과적 개입이 필요한 CD 환자이다. 또 다른 실시양태에서, RNASET2가 감소되고/되거나, TL1A 및/또는 IFN-γ 수준이 증가된 대상체는 RNASET2를 증가시키고/거나, TL1A 및/또는 IFN-γ를 감소시키는 치료가 필요한 개체로서 확인된다. 다른 실시양태에서, 대상체는 항-TL1A 요법이 필요한 것으로 확인된다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 RNASET2의 증가를 유발하는 치료법이 필요한 것으로 확인된다. 특정 다른 실시양태에서, 대상체는 IFN-γ 및/또는 TL1A의 감소를 유발하는 치료법이 필요한 것으로 확인된다.
다양한 실시양태에서, RNASET2 위험 변이 및/또는 RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ 발현 수준의 검출은 대상체로부터의 생물학적 샘플의 핵산을 분석함으로써 수행될 수 있다. 중합효소 연쇄 반응 기반 분석, 서열 분석 및 전기영동 분석을 제한 없이 포함하는 다양한 장치 및/또는 방법을 사용하여 RNASET2 위험 변이를 검출할 수 있다. RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ의 발현 수준은 정량 PCR, 노던 블롯 및 마이크로어레이를 제한 없이 포함하는 다양한 장치 및/또는 방법을 사용하여 검출할 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "핵산"은 예를 들어 게놈 DNA, cDNA 및 mRNA를 포함하는 단일 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA 분자와 같은 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 용어 핵산은 천연 및 합성 기원의 핵산 분자뿐만 아니라 천연 핵산 분자의 센스 또는 안티센스 가닥 또는 둘 모두를 나타내는 선형, 원형 또는 분지 형태의 분자를 포함한다.
다양한 다른 실시양태에서, RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ의 발현 수준을 결정하는 단계는 대상체로부터의 생물학적 샘플의 단백질을 분석함으로써 수행될 수 있다. ELISA, 면역 조직 화학, 및 웨스턴 블롯을 제한 없이 포함하는 다양한 장치 및/또는 방법을 사용하여 RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ 발현 수준을 검출할 수 있다.
본 발명의 다양한 실시양태는 또한 약물 불응성 궤양성 대장염(MR-UC)을 진단하는 방법으로서, 상기 대상체로부터 샘플을 얻는 단계; RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재 또는 부재를 결정하는 데 적합화된 분석법을 상기 샘플에 대해 수행하는 단계; 및 RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재에 기초하여 대상체에서 MR-UC를 진단하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 다양한 실시양태에서, RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이는 rs1819333, rs2149092, rs9355610, rs2149085, rs1410295 또는 rs9366093이다. 다양한 실시양태에서, rs2149085에 대한 위험 대립 유전자는 T 대립 유전자이다. 다양한 다른 실시양태에서, RNASET2 위험 변이는 RNASET2 위험 변이 rs429083, 및 rs1819333, rs2149092, rs9355610, rs2149085, rs1410295, rs9366093 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 RNASET2 위험 변이이다. 다양한 다른 실시양태에서, RNASET2 위험 변이는 표 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 13의 하나 이상의 RNASET2 위험 변이, 및 rs1819333, rs2149092, rs9355610, rs2149085, rs1410295, rs9366093 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 RNASET2 위험 변이이다. 다양한 다른 실시양태에서, RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이는 rs1819333, rs2149092, rs9355610 또는 rs2149085이다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 2, 3 또는 4개의 RNASET2 위험 변이 rs1819333, rs2149092, rs9355610 또는 rs2149085가 존재하는 경우 상기 대상체는 IBD로 진단된다.
다양한 실시양태에서, MR-UC로 진단된 환자는 티오푸린 및 항-TNF 요법의 치료 실패를 보인다. 다양한 다른 실시양태에서, MR-UC로 진단된 환자는 외과적 개입이 필요하다고 결정된다. 일부 실시양태에서, 외과적 개입은 장 절제술이다. 다양한 실시양태에서, MR-UC로 진단된 환자는 재조합 RNASET2 및 항-ICAM1과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 RNASET2 매개 요법이 필요하다고 결정된다. 다양한 실시양태에서, RNASET2 매개 요법은 RNASET2의 상류 및/또는 하류에 있는 유전자를 표적화하는 항체 또는 소형 분자이다.
다양한 다른 실시양태에서, 상기 방법은 RNASET2의 메틸화 수준을 결정하는 단계, 및 RNASET2 메틸화가 증가된 대상체에서 IBD를 진단하는 단계를 더 포함한다. 다른 실시양태에서, RNASET2의 메틸화 수준을 결정하여 MR-UC를 갖는 대상체를 진단한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 RNASET2 메틸화의 감소를 유발하는 치료법이 필요한 것으로 확인된다. 다른 실시양태에서, 환자는 항-TL1A 요법이 필요한 것으로 확인된다.
본 발명의 다양한 실시양태는 MR-UC로 진단된 대상체의 치료법을 제공한다. MR-UC 대상체는 항-TNF 요법, 티오푸린 요법, 코르티코스테로이드 및 사이클로스포린과 같은 현재의 통상적인 의학 요법에 대해 불응성이다. 다양한 실시양태에서, MR-UC로 진단된 대상체는 RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ를 모방, 조절 및/또는 표적화하는 치료법과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 비통상적인 치료법으로 치료된다. 다양한 실시양태에서, RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ를 모방, 조절 및/또는 표적화하는 치료법은 항체 및/또는 침묵 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, MR-UC로 진단된 대상체는 재조합 RNASET2 및 항-ICAM1과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 RNASET2 매개 요법이 필요하다고 결정된다. 다양한 실시양태에서, RNASET2 매개 요법은 RNASET2의 상류 및/또는 하류에 있는 유전자를 표적화하는 항체 또는 소형 분자이다.
다양한 실시양태에서, 대상체는 RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ를 모방하는 치료법이 필요한 것으로 확인된다. 다른 실시양태에서, 대상체는 RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ를 조절하는 치료법이 필요한 것으로 확인된다. 일부 다른 실시양태에서, 대상체는 RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ를 표적화하는 치료법이 필요한 것으로 확인된다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ를 모방, 조절 및/또는 표적화하는 치료법이 필요한 것으로 확인된다. 다양한 실시양태에서, RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ를 모방, 조절 및/또는 표적화하는 치료법은 항체 및/또는 침묵 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 질병은 IBD이다. 다양한 실시양태에서, 질병은 CD이다. 다양한 실시양태에서, 질병은 UC이다. 다양한 실시양태에서, 질병은 MR-UC이다. 다양한 실시양태에서, 진단된 대상체는 질병 관리를 위해 외과적 개입이 필요한 CD 환자이다.
다양한 실시양태에서, RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재는 RNASET2의 발현 감소와 관련된다. 다른 실시양태에서, RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재는 말초 및 점막 조직에서 RNASET2의 발현 감소와 관련된다. 일부 다른 실시양태에서, RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재는 질병 관리를 위해 외과적 개입이 필요한 대상체에서 DNA 과메틸화와 관련된다. 또 다른 실시양태에서, RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재는 티오푸린 및/또는 항-TNF 요법의 치료 실패와 관련된다. 일부 다른 실시양태에서, RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재는 ANCA 혈청반응 양성과 관련된다. 다양한 다른 실시양태에서, RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재는 장 절제의 전체 길이 증가와 관련된다.
대상체 확인 및/또는 계층화
본 발명의 다양한 실시양태는 치료를 위해 염증성 장 질환 대상체를 확인하는 방법으로서, RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ의 발현 수준을 결정하는 단계; 및 치료가 필요한 대상체를 RNASET2의 수준이 감소되고/되거나 TL1A 및/또는 IFN-γ 수준이 증가된 대상체로서 확인하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 다양한 실시양태에서, 염증성 장 질환은 크론병이다. 다양한 실시양태에서, 염증성 장 질환은 궤양성 대장염이다. 다양한 실시양태에서, 염증성 장 질환은 약물 불응성 궤양성 대장염이다. 다양한 다른 실시양태에서, 대상체는 RNASET2의 증가를 야기하는 치료법이 필요한 것으로 확인된다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 TL1A 및/또는 IFN-γ의 감소를 유발하는 치료법이 필요한 것으로 확인된다. 특정 실시양태에서, 환자는 항-TL1A 요법이 필요한 것으로 확인된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ를 모방, 조절 및/또는 표적화하는 치료법이 필요한 것으로 확인된다. 다양한 실시양태에서, RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ를 모방, 조절 및/또는 표적화하는 치료법은 항체 및/또는 침묵 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 "환자 위험 계층화"는 대상체를 치료가 필요한 위험군으로 분리하는 과정을 의미한다.
본 발명의 다양한 실시양태는 건강한 개체에 비교하여 치료가 필요한 대상체를 확인하기 위한 환자 위험 계층화의 방법을 제공한다. 다양한 실시양태에서, 대상체는 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ의 검출에 기초하여 계층화된다. 일부 실시양태에서, RNASET2의 감소는 치료가 필요한 IBD 환자를 나타낸다. 일부 실시양태에서, RNASET2의 감소는 치료가 필요한 CD 환자를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 환자는 질병 관리를 위해 외과적 개입이 필요한 CD 환자이다. 일부 실시양태에서, RNASET2의 감소는 치료가 필요한 UC 환자를 나타낸다. 일부 실시양태에서, RNASET2의 감소는 치료가 필요한 MR-UC 환자를 나타낸다. 다양한 다른 실시양태에서, TL1A 및/또는 IFN-γ의 증가는 치료가 필요한 IBD 환자를 나타낸다. 다양한 다른 실시양태에서, TL1A 및/또는 IFN-γ의 증가는 치료가 필요한 CD 환자를 나타낸다. 다양한 다른 실시양태에서, TL1A 및/또는 IFN-γ의 증가는 치료가 필요한 UC 환자를 나타낸다. 다양한 다른 실시양태에서, TL1A 및/또는 IFN-γ의 증가는 치료가 필요한 MR-UC 환자를 나타낸다. 특정 다른 실시양태에서, RNASET2의 감소, TL1A의 증가, 및 IFN-γ의 증가는 대상체가 IBD의 치료를 필요로 함을 나타낸다. 특정 다른 실시양태에서, RNASET2의 감소, TL1A의 증가, 및 IFN-γ의 증가는 치료가 필요한 CD를 갖는 대상체를 나타낸다. 특정 다른 실시양태에서, RNASET2의 감소, TL1A의 증가, 및 IFN-γ의 증가는 치료가 필요한 UC를 갖는 대상체를 나타낸다. 특정 다른 실시양태에서, RNASET2의 감소, TL1A의 증가, 및 IFN-γ의 증가는 치료가 필요한 MR-UC를 갖는 대상체를 나타낸다. 다양한 실시양태에서, 유전자의 검출은 대상체의 치료법을 위한 지침을 제공한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ를 모방, 조절 및/또는 표적화하는 치료법이 필요한 것으로 확인된다. 다양한 실시양태에서, RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ를 모방, 조절 및/또는 표적화하는 치료법은 항체 및/또는 침묵 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다양한 다른 실시양태에서, 치료가 필요한 대상체를 확인하기 위한 환자 위험 계층화 방법은 이전에 치료된 적이 있는 건강한 개체와 관련된다. 다양한 다른 실시양태에서, 치료가 필요한 대상체를 확인하기 위한 환자 위험 계층화 방법은 의학적으로 반응하는 개체와 관련된다.
본 발명의 다양한 실시양태는 MR-UC로 진단된 대상체의 치료법을 제공한다. MR-UC 대상체는 항-TNF 요법, 티오푸린 요법, 코르티코스테로이드 및 사이클로스포린과 같은, 현재 사용되는 통상적인 의학 요법에 불응성이다. 다양한 실시양태에서, MR-UC로 진단된 대상체는 RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ를 모방, 조절 및/또는 표적화하는 치료법과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 비통상적인 치료법으로 치료된다. 다양한 실시양태에서, RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ를 모방, 조절 및/또는 표적화하는 치료법은 항체 및/또는 침묵 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, MR-UC로 진단된 대상체는 재조합 RNASET2 및 항-ICAM1과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 RNASET2 매개 요법이 필요하다고 결정된다. 다양한 실시양태에서, RNASET2 매개 요법은 RNASET2의 상류 및/또는 하류에 있는 유전자를 표적화하는 항체 또는 소형 분자이다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 대상체 확인 및/또는 계층화 방법은 하나 이상의 위험 변이의 존재를 결정하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 위험 변이는 rs1819333, rs2149092, rs9355610, rs2149085, rs1410295 또는 rs9366093을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 2, 3, 4, 5 또는 6개의 RNASET2 위험 변이가 존재하는 경우, 대상체를 치료가 필요한 IBD로 확인하는 단계를 포함한다. 다양한 실시양태에서, rs2149085에 대한 위험 대립 유전자는 T 대립 유전자이다. 다양한 다른 실시양태에서, RNASET2 위험 변이는 RNASET2 위험 변이 rs429083, 및 rs1819333, rs2149092, rs9355610, rs2149085, rs1410295, rs9366093 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 RNASET2 위험 변이이다. 다양한 다른 실시양태에서, RNASET2 위험 변이는 표 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 13의 하나 이상의 RNASET2 위험 변이, 및 rs1819333, rs2149092, rs9355610, rs2149085, rs1410295, rs9366093 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 RNASET2 위험 변이이다. 다양한 다른 실시양태에서, RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이는 rs1819333, rs2149092, rs9355610 또는 rs2149085이다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 2, 3 또는 4개의 RNASET2 위험 변이 rs1819333, rs2149092, rs9355610 또는 rs2149085가 존재하는 경우 상기 대상체는 IBD로 진단된다. 다양한 다른 실시양태에서, 생물학적 샘플에서 위험 변이의 검출은 대상체를 치료가 필요한 군으로 계층화한다. 다른 실시양태에서, 샘플에서 더 많은 수의 위험 변이의 존재는 대상체가 치료가 더 많이 필요하다는 것을 나타낸다. 일부 실시양태에서, RNASET2 위험 변이의 검출은 대상체에서 치료의 필요성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 대상체는 항-TL1A 요법이 필요한 것으로 확인된다. 다양한 실시양태에서, 대상체는 재조합 RNASET2 및 항-ICAM1과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 RNASET2 매개 요법이 필요한 것으로 확인된다. 다양한 실시양태에서, RNASET2 매개 요법은 RNASET2의 상류 및/또는 하류에 있는 유전자를 표적화하는 항체 또는 소형 분자이다.
다양한 실시양태에서, RNASET2 위험 변이의 검출은 본원에서 논의된 바와 같이 대상체로부터의 생물학적 샘플의 핵산을 분석함으로써 수행될 수 있다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 대상체 확인 및/또는 계층화 방법은 건강한 개체에 비교하여 RNASET2 메틸화 수준을 검출하기 위해 샘플을 분석하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시양태에서, RNASET2의 메틸화 수준이 증가된 대상체는 치료가 필요한 개체로서 확인된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 RNASET2 메틸화 수준 및 하나 이상의 RNASET2 위험 변이에 대해 평가된다. 특정 실시양태에서, RNASET2 메틸화의 증가 및 하나 이상의 RNASET2 위험 변이의 존재를 보이는 대상체는 치료가 필요한 대상체로 확인된다. 다른 실시양태에서, 샘플은 RNASET2의 메틸화 수준 및 RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ의 발현 수준에 대해 평가된다. 특정 실시양태에서, RNASET2 메틸화의 증가 및 RNASET2의 감소, TL1A 및/또는 IFN-γ의 증가를 보이는 대상체는 치료가 필요한 대상체로 확인된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ를 모방, 조절 및/또는 표적화하는 치료법이 필요한 것으로 확인된다. 다양한 실시양태에서, RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ를 모방, 조절 및/또는 표적화하는 치료법은 항체 및/또는 침묵 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 항-TL1A 요법이 필요한 것으로 확인된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 RNASET2 메틸화의 감소를 유발하는 치료법이 필요한 것으로 확인된다. 다양한 다른 실시양태에서, RNASET2 메틸화의 증가의 검출은 수술이 필요한 중증 CD 환자를 나타낸다. 추가의 실시양태에서, 대상체는 결장 절제술 및/또는 항-TL1A 요법을 포함하는 치료법이 필요한 것으로 확인된다.
다양한 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 대상체 확인 및/또는 계층화 방법은 건강한 개체에 비교하여 적어도 하나의 미생물 항원(혈청학적 인자)의 증가 또는 감소를 검출하기 위해 샘플을 분석하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 평가되는 미생물 항원(혈청학적 인자)은 ANCA, ASCA, OmpC, I2 및 CBir를 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플은 하나 이상의 미생물 항원(혈청학적 인자) 및 하나 이상의 RNASET2 위험 변이에 대해 평가된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 위험 혈청학적 인자 및 하나 이상의 RNASET2 위험 변이의 존재를 보이는 대상체는 치료가 필요한 대상체로 확인된다. 또 다른 실시양태에서, 샘플은 하나 이상의 위험 혈청학적 인자 및 RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ의 발현 수준에 대해 평가된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 위험 혈청학적 인자 및 RNASET2의 감소, TL1A 및/또는 IFN-γ의 증가를 보이는 대상체는 치료가 필요한 대상체로 확인된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 RNASET2, TL1A 및/또는 IFNγ를 모방, 조절 및/또는 표적화하는 치료법이 필요한 것으로 확인된다. 다양한 실시양태에서, RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ를 모방, 조절 및/또는 표적화하는 치료법은 항체 및/또는 침묵 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 치료법은 항-TL1A 요법이다. 다양한 실시양태에서, 치료법은 재조합 RNASET2 및 항-ICAM1과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 RNASET2 매개 요법이다. 다양한 실시양태에서, RNASET2 매개 요법은 RNASET2의 상류 및/또는 하류에 있는 유전자를 표적화하는 항체 또는 소형 분자이다.
다양한 실시양태에서, IBD로 확인된 대상체는 티오푸린 및 항-TNF 요법의 치료 실패를 보인다. 다양한 다른 실시양태에서, IBD로 확인된 대상체는 외과적 개입이 필요하다고 결정된다. 일부 다른 실시양태에서, 외과적 개입은 장 절제술이다. 본 발명의 다양한 실시양태는 또한 염증성 장 질환을 갖는 대상체를 위해 수술을 선택하는 방법으로서, 대상체로부터 샘플을 얻는 단계; RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재 또는 부재를 결정하는 데 적합화된 분석법을 상기 샘플에 대해 수행하는 단계; RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재에 기초하여 대상체에서 MR-UC를 진단하는 단계; 및 MR-UC로 진단된 대상체를 위해 수술을 선택하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이는 rs1819333, rs2149092, rs9355610, rs2149085, rs1410295 또는 rs9366093이다. 다양한 다른 실시양태에서, RNASET2 위험 변이는 RNASET2 위험 변이 rs429083, 및 rs1819333, rs2149092, rs9355610, rs2149085, rs1410295, rs9366093 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 RNASET2 위험 변이이다. 다양한 다른 실시양태에서, RNASET2 위험 변이는 표 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 13의 하나 이상의 RNASET2 위험 변이, 및 rs1819333, rs2149092, rs9355610, rs2149085, rs1410295, rs9366093 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 RNASET2 위험 변이이다. 다양한 다른 실시양태에서, RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이는 rs1819333, rs2149092, rs9355610 또는 rs2149085이다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 2, 3 또는 4개의 RNASET2 위험 변이 rs1819333, rs2149092, rs9355610 또는 rs2149085가 존재하는 경우 상기 대상체는 IBD로 진단된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 RNASET2의 메틸화 수준을 결정하는 단계를 더 포함한다. 다양한 실시양태에서, RNASET2의 메틸화 수준이 증가된 대상체는 수술이 필요한 대상체로 확인된다. 다른 실시양태에서, RNASET2 메틸화의 증가 및 RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재를 보이는 대상체는 수술이 필요한 대상체로 확인된다.
다양한 실시양태에서, RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재는 RNASET2의 발현 감소와 관련된다. 다른 실시양태에서, RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재는 말초 및 점막 조직에서 RNASET2의 발현 감소와 관련된다. 일부 다른 실시양태에서, RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재는 질병 관리를 위해 외과적 개입이 필요한 환자에서 DNA과 메틸화와 관련된다. 또 다른 실시양태에서, RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재는 티오푸린 및/또는 항-TNF 요법의 치료 실패와 관련된다. 일부 다른 실시양태에서, RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재는 ANCA 혈청반응 양성과 관련된다. 다양한 다른 실시양태에서, RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재는 장 절제의 전체 길이 증가와 관련된다.
본 발명의 다양한 실시양태는 염증성 장 질환을 갖는 대상체에 대해 치료법을 선택하는 방법으로서, 대상체로부터 샘플을 얻는 단계; RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재 또는 부재를 결정하는 데 적합화된 분석법을 상기 샘플에 대해 수행하는 단계; RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재에 기초하여 대상체에서 약물 불응성 궤양성 대장염(MR-UC)을 진단하는 단계; 및 MR-UC로 진단받은 대상체에 대해, 치료법으로서 수술을 선택하고 치료법으로서 티오푸린 또는 항-TNF를 선택하지 않는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 다양한 실시양태에서, RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이는 rs1819333, rs2149092, rs9355610, rs2149085, rs1410295 또는 rs9366093이다. 다양한 다른 실시양태에서, RNASET2 위험 변이는 RNASET2 위험 변이 rs429083, 및 rs1819333, rs2149092, rs9355610, rs2149085, rs1410295, rs9366093 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 RNASET2 위험 변이이다. 다양한 다른 실시양태에서, RNASET2 위험 변이는 표 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 13의 하나 이상의 RNASET2 위험 변이, 및 rs1819333, rs2149092, rs9355610, rs2149085, rs1410295, rs9366093 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 RNASET2 위험 변이이다. 다양한 다른 실시양태에서, RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이는 rs1819333, rs2149092, rs9355610 또는 rs2149085이다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 2, 3 또는 4개의 RNASET2 위험 변이 rs1819333, rs2149092, rs9355610 또는 rs2149085가 존재하는 경우 상기 대상체는 IBD로 진단된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 RNASET2의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하며, 메틸화 증가는 대상체가 외과적 개입을 필요로 함을 나타낸다.
본 발명의 다양한 실시양태는 MR-UC로 진단된 대상체의 치료법을 제공한다. MR-UC 대상체는 항-TNF 요법, 티오푸린 요법, 코르티코스테로이드 및 사이클로스포린과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 현재 사용되는 통상적인 의학 요법에 대해 불응성이다. 다양한 실시양태에서, MR-UC로 진단된 대상체는 RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ를 모방, 조절 및/또는 표적화하는 치료법과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 비통상적인 치료법으로 치료된다. 다양한 실시양태에서, RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ를 모방, 조절 및/또는 표적화하는 치료법은 항체 및/또는 침묵 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, MR-UC로 진단된 환자는 재조합 RNASET2 및 항-ICAM1과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 RNASET2 매개 요법이 필요하다고 결정된다. 다양한 실시양태에서, RNASET2 매개 요법은 RNASET2의 상류 및/또는 하류에 있는 유전자를 표적화하는 항체 또는 소형 분자이다.
메틸화의 검출
다양한 실시양태는 염증성 장 질환(IBD)을 갖는 대상체를 진단하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 RNASET2의 메틸화 수준을 결정하는 단계; 및 IBD를 갖는 대상체를 RNASET2 메틸화가 증가된 대상체로 확인하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 IBD를 갖는 대상체를 RNASET2 메틸화가 증가하고 RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이가 존재하는 대상체로 확인하는 단계를 포함한다. 다양한 다른 실시양태에서, 상기 방법은 RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ의 발현 수준을 결정하는 단계; 대상체가 RNASET2의 감소, TL1A의 증가, IFN-γ의 증가 및/또는 RNASET2 메틸화의 증가를 보일 경우 대상체를 IBD로 진단하는 단계를 포함한다.
다양한 실시양태는 치료가 필요한 염증성 장 질환(IBD)을 갖는 대상체를 확인하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 RNASET2의 메틸화 수준을 결정하는 단계; 치료가 필요한 대상체를 RNASET2 메틸화가 증가된 대상체로서 확인하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ의 발현 수준 및 RNASET2의 메틸화 수준을 결정하여 치료가 필요한 염증성 장 질환이 있는 대상체를 확인한다. 다양한 실시양태에서, 상기 방법은 치료가 필요한 대상체를RNASET2의 감소, TL1A의 증가, IFN-γ의 증가 및/또는 RNASET2 메틸화의 증가를 보이는 대상체로 결정하는 단계를 포함한다. 다양한 다른 실시양태에서, 상기 방법은 RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재 또는 부재를 결정하는 단계 및 치료가 필요한 IBD를 갖는 대상체를 RNASET2 메틸화가 증가되고 하나 이상의 RNASET2 위험 변이가 존재하는 대상체로서 확인하는 단계를 포함한다.
다양한 실시양태에서, 메틸화의 증가는 외과적 개입이 필요한 대상체를 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, RNASET2 메틸화의 증가는 외과적 개입이 필요함을 나타낸다.
메틸화의 수준을 검출하는 다양한 방법은 하기 분석을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 질량 분광법, 메틸화 특이적 PCR(MSP: methylation specific PCR), 전체 게놈 비설파이트 서열분석(BS-Seq), HELP 분석, 칩-온- 칩(ChIP-on-chip) 분석, 제한 효소 표시 게놈 스캐닝(restriction landmark genomic scanning), 메틸화 DNA 면역 침전(MeDIP, MeDIP-칩, MeDIPseq), 비설파이트 처리된 DNA의 파이로시퀀싱, DNA 아데닌 메틸 전이효소 활성에 대한 분자 브레이크 라이트(break light) 분석, 메틸 민감성 서던 블롯팅, 메틸CpG 결합 단백질(MBP: MethylCpG Binding Protein) 및/또는 메틸 결합 도메인(MBD: Methyl Binding Domain)을 이용한 메틸화 및 비-메틸화 분획으로 분리된 천연 DNA, 메틸레이션에픽 비드칩(MethylationEpic BeadChip), 일루미나 인피늄 메틸화 450 비드칩(Illumina Infinium Methylation 450 BeadChip), 고해상도 용융 분석(HRM 또는 HRMA), 및/또는 고대 DNA 메틸화 재구성을 포함하는 다양한 화학 요법.
본 발명의 다양한 실시양태는 대상체로부터 샘플을 얻는 단계; RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재 또는 부재를 결정하는 데 적합화된 분석법을 상기 샘플에 대해 수행하는 단계; 및 RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재에 기초하여 대상체에서 IBD를 진단하는 단계를 포함하는 방법에 의한 염증성 장 질환 (IBD)으로 진단된 대상체의 치료법을 제공한다. 다양한 실시양태에서, 염증성 장 질환은 크론병, 궤양성 대장염 또는 약물 불응성 궤양성 대장염이다.
본 발명의 다양한 실시양태는 환자로부터 샘플을 얻는 단계; RNASET2에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재 또는 부재를 결정하는 데 적합화된 분석법을 상기 샘플에 대해 수행하는 단계; 및 RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재에 기초하여 대상체에서 MR-UC를 진단하는 단계를 포함하는 방법에 의한 약물 불응성 궤양성 대장염(MR-UC)으로 진단된 대상체의 치료법을제공한다.
본 발명의 다양한 실시양태는 MR-UC로 진단된 대상체의 치료법을 제공한다. MR-UC 대상체는 항-TNF 요법 및 티오푸린 요법과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 현재 사용되는 통상적인 의학 요법에 대해 불응성이다. 다양한 실시양태에서, MR-UC로 진단된 대상체는 RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ를 모방, 조절 및/또는 표적화하는 치료법과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 비통상적인 치료법으로 치료된다. 다양한 실시양태에서, RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ를 모방, 조절 및/또는 표적화하는 치료법은 항체 및/또는 침묵 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, MR-UC로 진단된 대상체는 재조합 RNASET2 및 항-ICAM1과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 RNASET2 매개 요법이 필요하다고 결정된다. 다양한 실시양태에서, RNASET2 매개 요법은 RNASET2의 상류 및/또는 하류에 있는 유전자를 표적화하는 항체 또는 소형 분자이다.
생물학적 샘플, 샘플 제조 및 발현 검출
다양한 실시양태에서, 본 발명에 포함되는 단계는 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계를 포함한다. 생물학적 샘플은 외과적 생검 또는 외과적 절제를 통해 얻을 수 있다. 대안적으로, 1차 환자 유래 세포주 또는 FFPE(포르말린 고정, 파라핀 함몰) 샘플, 또는 신선한 냉동 샘플의 형태로 보관된 환자 샘플을 통해 샘플을 얻을 수 있다. 샘플은 또한 전혈, 말초 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 볼 스왑 또는 기타 체액 또는 조직을 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 샘플은 대장 및/또는 소장으로부터의 조직을 포함한다. 다양한 다른 실시양태에서, 대장 샘플은 맹장, 결장(상행 결장, 횡행 결장, 하행 결장 및 S상 결장), 직장 및/또는 항문관을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 소장 샘플은 십이지장, 공장 및/또는 회장을 포함한다.
본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 대상체의 생물학적 샘플(즉, 조직 및/또는 세포)로부터 유래한 핵산 또는 단백질 샘플은 당 업계에 공지된 수단에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 수술 절차 또는 바늘 생검 흡인을 사용하여 대상체로부터 생물학적 샘플을 수집할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비정상 조직 및/또는 정상 조직으로부터의 세포 샘플을 농축 및/또는 정제하는 것이 중요하다. 다른 실시양태에서, 비정상적인 조직 및/또는 세포 샘플을 이어서 미세 해부하여 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 게놈 핵산 또는 전구 RNA의 추출 전에 정상 조직의 오염량을 감소시킬 수 있다. 이러한 농축 및/또는 정제는 바늘 미세 절제, 레이저 미세 절제, 형광 활성화 세포 분류 및 면역 세포 분류와 같이 당 업계에 잘 알려진 방법에 따라 수행될 수 있다.
개체로부터의 핵산 및/또는 단백질의 분석은 임의의 다양한 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 다양한 실시양태에서, RNASET2에 대한 유전자 발현 수준을 분석하는 단계는 노던 블롯, 역전사 PCR, 실시간 PCR, 유전자 발현의 연속 분석(SAGE: serial analysis of gene expression), DNA 마이크로어레이, 타일링(tiling) 어레이, RNA-Seq, 또는 이들의 조합을 포함한다. 다양한 다른 실시양태에서, RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ에 대한 유전자 발현 수준을 분석한다. 다른 실시양태에서, RNASET2의 메틸화 수준을 결정한다.
다양한 실시양태에서, 단백질 발현을 검출하는 방법 및 시스템은 ELISA, 면역 조직 화학, 웨스턴 블롯, 유세포 측정법, 형광 제자리 혼성화(FISH: fluorescence in situ hybridization), 방사 면역 측정 및 친화성 정제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
유전자 발현 수준의 분석은 중합 효소 연쇄 반응에 의한 개체의 핵산 증폭을 포함할 수 있다. 핵산의 증폭을 위한 중합 효소 연쇄 반응의 사용은 당 업계에 잘 알려져있다(예를 들어, 문헌[Mullis et al. (Eds.), The Polymerase Chain Reaction, Birkhauser, Boston, (1994)] 참조).
"정량적" 증폭 방법은 당업자에게 잘 알려져있다. 예를 들어, 정량 PCR은 동일한 프라이머를 사용하여 알고 있는 양의 대조군 서열을 동시에 동시-증폭하는 단계를 포함한다. 이것은 PCR 반응을 보정하는데 사용할 수 있는 내부 표준을 제공한다. 정량 PCR을 위한 상세한 프로토콜은 문헌[Innis, et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y.)]에 제공된다. 정량 PCR 분석을 이용한 미소부수체 유전자 좌의 DNA 복제본 수의 측정은 문헌[Ginzonger, et al. (2000) Cancer Research 60:5405-5409]에 기재되어 있다. 유전자에 대해 공지된 핵산 서열은 당업자가 통상적으로 유전자의 임의의 부분을 증폭시키는 프라이머를 선택할 수 있도록 하기에 충분하다. 또한, 본 발명의 방법에 형광원 정량 PCR이 사용될 수 있다. 형광원 정량 PCR에서, 정량은 형광 신호(예를 들어, 택맨(TaqMan) 및 사이버 그린(sybr green))의 양에 기초한다.
다른 적합한 증폭 방법으로는 리가아제 연쇄 반응(LCR: ligase chain reaction)(Wu and Wallace (1989) Genomics 4: 560, Landegren, et al. (1988) Science 241:1077, 및d Barringer et al. (1990) Gene 89: 117)), 전사 증폭(Kwoh, et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173), 자가-유지 서열 복제(Guatelli, et al. (1990) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87: 1874), 도트 PCR 및 링커 어댑터 PCR 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
혼성화에 적합한 DNA 샘플은 예를 들어, 게놈 DNA, 게놈 DNA의 단편, 어댑터 서열에 라이게이션된 게놈 DNA의 단편 또는 클론닝된 서열의 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 증폭에 의해 얻을 수 있다. 원하는 특이성 및 최적 증폭 특성을 갖는 프라이머 설계에 올리고(Oligo) 버전 5.0(National Biosciences)과 같은 당 업계에 잘 알려진 컴퓨터 프로그램이 사용될 수 있다. PCR 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져있으며, 예를 들어, 문헌[Innis et al., eds., 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods And Applications, Academic Press Inc., San Diego, Calif.]에 기재되어있다. 제어된 로봇 시스템이 핵산을 단리 및 증폭하는데 유용하며 사용될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.
혼성화
본 발명의 방법에 사용된 대상체로부터 유래한 핵산 샘플은 RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ를 확인하기 위한 프로브(예를 들어, 올리고뉴클레오티드 프로브)를 포함하는 어레이에, 항존 유전자 발현이 또한 평가되어야 하는 경우에 선택된 항존 유전자를 확인하기 위한 프로브를 포함하는 어레이에, 혼성화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 프로브는 DNA 칩(예를 들어, SNP 올리고뉴클레오티드 프로브) 상에 타일링될 수 있는 프로브 어레이를 포함한다. 본 발명의 방법에서 사용되는 혼성화 및 세척 조건은 본 발명에 의해 분석되는 핵산 샘플이 어레이의 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열에, 바람직하게는 그의 상보적인 DNA가 위치하는 특정 어레이 부위에, 특이적으로 결합하거나 또는 특이적으로 혼성화하도록 선택된다. 일부 실시양태에서, 상보적인 DNA는, 예를 들어 애피메트릭스(Affymetrix) 올리고뉴클레오티드 어레이에서, 사용되는 바와 같이 완전하게 일치되거나 어느 정도 불일치될 수 있다. 어레이의 단일 가닥의 합성 올리고데옥시리보핵산 DNA 프로브는 예를 들어 자가-상보적 서열로 인해 형성되는 헤어핀 또는 이량체를 제거하기 위해, 대상체의 핵산 샘플과 접촉하기 전에 변성되어야만 할 수 있다.
최적의 혼성화 조건은 프로브의 길이 및 대상체의 핵산 샘플 유형에 따라 달라질 것이다. 핵산에 대한 특이적(즉, 엄격한) 혼성화 조건에 대한 일반적인 파라미터는 문헌[Sambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4 th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2012); Ausubel et al., eds., 1989, Current Protocols in Molecules Biology, Vol. 1, Green Publishing Associates, Inc., John Wiley & Sons, Inc., New York, at pp. 2.10.1-2.10.16]에 기재되어 있다. 예시적인 유용한 혼성화 조건은 예를 들어 문헌[Tijessen, 1993, Hybridization with Nucleic Acid Probes, Elsevier Science Publishers B. V. and Kricka, 1992, Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press, Sandie해, Calif.]에 제공된다.
올리고뉴클레오티드 핵산 어레이
본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, DNA 어레이를 사용하여 상보적인 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브와 핵산 서열의 혼성화 수준을 측정함으로써 유전자의 발현 수준을 결정할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 "프로브"(즉, 정의된 서열을 갖는 핵산 분자)를 사용하는 다양한 포맷의 DNA 어레이가 당업자에게 잘 알려져있다. 전형적으로, 각각 정의된 서열을 갖는 핵산 프로브 세트는 각각의 상이한 프로브가 소정의 영역에 고정된 방식으로 고상 지지체 상에 고정된다. 특정 실시양태에서, 프로브 세트는 지지체 상에 위치 결정이 가능한(positionally addressable) 결합(예를 들어, 혼성화) 부위의 어레이를 형성한다. 이러한 결합 부위는 각각은 지지체 상의 소정의 영역에 결합된 프로브의 다수의 올리고뉴클레오티드 분자를 포함한다. 보다 구체적으로, 어레이의 각각의 프로브는 바람직하게는 고상 지지체 상에 아는 소정의 위치에 위치하여 각 프로브의 정체(즉, 서열)가 어레이 상(지지체 또는 표면상)의 그의 위치로부터 결정될 수 있다. 마이크로어레이는 여러 가지 방법으로 제조될 수 있으며, 그 중 몇 가지를 본원에 기재한다. 그러나 생산된 마이크로어레이는 특정 특성을 공유하며 재현성이 있어 주어진 어레이의 여러 복사본을 생성하고 서로 쉽게 비교할 수 있다.
일부 실시양태에서, 마이크로어레이는 결합 (예를 들어, 핵산 혼성화) 조건하에서 안정한 물질로 제조된다. 마이크로어레이는 바람직하게는 작고, 예를 들어 약 1 ㎠ 내지 25 ㎠, 바람직하게는 약 1 내지 3 ㎠이다. 그러나 더 큰 어레이와 더 작은 어레이도 모두 고려되고, 예를 들어 매우 많은 수의 상이한 프로브를 동시에 평가하기 위해, 바람직할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 지지체 상에서 직접 합성되어 어레이를 형성할 수 있다. 프로브는 유리, 플라스틱(예를 들어, 폴리프로필렌, 나일론), 폴리아크릴아미드, 니트로셀룰로오스, 겔, 또는 다른 다공성 또는 비다공성 물질로 제조될 수 있는 고상 지지체 또는 표면에 부착될 수 있다. 고정된 프로브 세트 또는 고정된 프로브의 어레이는 고정된 프로브에 상보적인 서열을 갖는 핵산이 프로브에 혼성화 또는 결합하도록 표지된 핵산 종을 함유하는 샘플과 접촉된다. 임의의 결합되지 않은 물질을 분리(예를 들어, 세척함으로써)한 후, 결합된 표지 서열을 검출하고 측정한다. 측정은 전형적으로 컴퓨터에 의해 지원받아 수행된다. DNA 어레이 기술은 RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ의 발현 수준, 항존 유전자 및 RNASET2의 메틸화 상태를 결정하는 것을 가능하게 한다.
특정 실시양태에서, 고밀도 올리고뉴클레오티드 어레이가 본 발명의 방법에 사용된다. 표면상의 정의된 위치에서 정의된 서열에 상보적인 수천개의 올리고뉴클레오티드를 함유하는 이들 어레이는 예를 들어 포토리소그래피 기술(예를 들어, 문헌(Fodor et al., 1991, Science 251:767-773; Pease et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:5022-5026; Lockhart et al., 1996, Nature Biotechnology 14:1675; 미국 특허 제5,578,832호; 제5,556,752호; 제5,510,270호; 제5,445,934호; 제5,744,305호; 및 제6,040,138호) 참조)에 의해 표면상의 제자리에서 합성될 수 있다. 제자리 올리고뉴클레오티드 합성을 위한 잉크젯 기술을 사용하여 어레이를 생성하는 방법이 또한 당 업계에 공지되어있다(예를 들어, 문헌[1998년 9월 24일에 공개된 국제 특허 공개 WO 98/41531호(Blanchar), Blanchard et al., 1996, Biosensors And Bioelectronics 11:687-690; Blanchard, 1998, in Synthetic DNA Arrays in Genetic Engineering, Vol. 20, J. K. Setlow, Ed., Plenum Press, New York at pages 111-123] 참조). 표면에 핵산을 부착시키는 또 다른 방법은 일반적으로 문헌[Schena et al. (1995, Science 270:467-470)]에 의해 일반적으로 기재된 바와 같이 유리 플레이트 상에 프린팅함에 의한다. 예를 들어 마스킹(masking)(Maskos and Southern, 1992, Nucl. Acids. Res. 20:1679-1684)에 의해 마이크로어레이를 제조하는 다른 방법이 또한 사용될 수 있다. 이들 방법이 사용될 때, 공지된 서열의 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 15 내지 60-mer)는 유도체화된 유리 슬라이드와 같은 표면상에 직접 합성된다. 생성된 어레이는 각 유익한 정보를 주는 관심의 유전자 좌(예를 들어, SNP, RFLP, STR 등)에 상응하는 몇몇 올리고뉴클레오티드 분자와 중복될 수 있다.
DNA 어레이의 올리고뉴클레오티드 프로브를 생성하기 위한 하나의 예시적인 수단은 예를 들어 N-포스포네이트 또는 포스포르아미다이트 화학을 사용하는 합성 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 합성에 의한다(Froehler et al., 1986, Nucleic Acid Res. 14:5399-5407; McBride et al., 1983, Tetrahedron Lett. 24:246-248). 합성 서열은 전형적으로 약 15 내지 약 600개의 염기 길이, 더 전형적으로는 약 20 내지 약 100개의 염기, 가장 바람직하게는 약 40 내지 약 70개의 염기 길이이다. 일부 실시양태에서, 합성 핵산은 비천연 염기, 예를 들어, 그러나 결코 이에 제한되지 않는 이노신을 포함한다. 전술한 바와 같이, 핵산 유사체는 혼성화를 위한 결합 부위로서 사용될 수 있다. 적합한 핵산 유사체의 예는 펩티드 핵산(예를 들어, 문헌[Egholm et al., 1993, Nature 363:566-568; 미국 특허 제5,539,083호) 참조)이다. 또 다른 실시양태에서, 혼성화 부위(즉, 프로브)는 SNP 또는 이의 상보체에 상응하는 게놈 DNA의 영역의 플라스미드 또는 파지 클론으로부터 제조된다. 본 발명의 방법에 사용되는 올리고뉴클레오티드 프로브의 크기는 적어도 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 혼성화가 상보적인 서열에 대해 선택적이지만, 완전하게 상보적이지 않은 다른 서열이 또한 주어진 프로브에 일정 수준으로 소정의 프로브에 혼성화할 수 있음은 당 업계에 잘 알려져있다. 따라서, 샘플의 혼성화를 최적화하기 위해, 약간의 변이를 갖는 다수의 올리고뉴클레오티드 프로브가 사용될 수 있다. 혼성화를 더욱 최적화하기 위해, 혼성화 엄격도 조건, 예를 들어 혼성화 온도 및 염 농도를 당 업계에 공지된 방법에 의해 변경할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 고밀도 올리고뉴클레오티드 어레이는 RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ 및 항존 유전자에 상응하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 메틸화된 RNASET2에 상응한다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 대상체의 게놈에서 유익한 정보를 주는 관심의 각 유전자 좌(예를 들어, SNP, RFLP, STR 등)의 일부분에 상응하는 DNA 또는 DNA "모방체"(예를 들어, 유도체 및 유사체)를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 염기 모이어티, 당 모이어티 또는 인산 골격에서 변형될 수 있다. 예시적인 DNA 모방체로는 예를 들어 포스포로티오에이트가 포함된다. 각각의 SNP 유전자 좌에 대해, 샘플 핵산의 서열에 상보적인 다수의 상이한 올리고뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 예를 들어, 유익한 정보를 주는 관심의 단일 유전자 좌(예를 들어, SNP, RFLP, STR 등)에 대해, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 상이한 올리고뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 유익한 정보를 주는 특정의 관심 유전자 좌에 대한 각각의 올리고뉴클레오티드는 SNP 주변의 완벽한 일치, 불일치 및 측면 서열에서 약간의 변이를 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 유익한 정보를 주는 특정의 관심 유전자 좌에 대한 프로브가 표적 부위를 포함하는 게놈 영역에 걸쳐 있거나 이에 걸쳐 타일링되는 중첩 및/또는 연속적인 중첩 서열을 포함하고, 여기서 모든 프로브가 표적 부위를 포함하도록 프로브를 생성한다. 예로써, 중첩 프로브 서열은 소정의 염기 간격의 단으로, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 염기 간격의 단으로 타일링될 수 있다. 특정 실시양태에서, 분석은 문헌[Wang et al. (2007) Genome Biol. 8, R246]에 의해 기술된 바와 같이 분자 도치 프로브 프로토콜과 함께 사용하기에 적합한 어레이를 사용하여 수행될 수 있다. 매우 유사한(즉, 상동성) 서열의 핵산 종에 표적화되는 올리고뉴클레오티드 프로브의 경우, 유사한 프로브 사이의 "교차-혼성화"가 혼성화 측정의 결과를 상당히 오염시키고 혼동시킬 수 있다. 교차-혼성화는 검출되어야 하는 서열(즉, 특정 SNP)이 단지 단일 뉴클레오티드만이 상이한 다른 서열과 구별되어야 하기 때문에 SNP의 검출에서 특히 중요한 문제이다. 교차-혼성화는 혼성화 엄격도 조건 및/또는 혼성화 후 세척 과정을 조절함으로써 최소화될 수 있다. 매우 엄격한 조건은 뉴클레오티드 서열의 대립 유전자 변이체, 예를 들어 10-30개 뉴클레오티드 당 약 1개의 불일치의 검출을 허용한다. 상이한 모든 핵산 서열에 대해 최적인 단일 혼성화 또는 세척 조건은 없으며, 이러한 조건은 제조사가 제안하는 조건과 동일할 수 있거나 당업자에 의해 조절될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 프로브는 칩이라 불리는 유리 슬라이드 상에 고정된다(즉, 타일링된다). 예를 들어, DNA 마이크로어레이는 올리고뉴클레오티드(용액 중 정제된 단일 가닥 DNA 서열)가 어레이 상에 올리고뉴클레오티드를 코딩하는 단일 DNA 샘플에 해당하는 각각의 스폿을 갖는 (대략적으로) 직사각형 어레이에 로봇에 의해 인쇄된 칩을 포함할 수 있다. 요약하면, 공정은 슬라이드 서열과 표지된 샘플 사이에서 혼성화가 일어나기에 적합한 조건하에서 DNA 마이크로어레이 칩을 표지된 샘플로 뒤덮는 단계를 포함하며, 이어서, 어레이를 세척 및 건조하고, 어레이를 레이저 현미경으로 스캔하여 혼성화를 검출한다. 특정 실시양태에서, 프로브가 어레이 상에 나타나는(단일의 관심 유전자 좌에 대한 일치/불일치 프로브 또는 관심의 한 유전자 좌로 계수되는 단일의 관심 유전자에 걸쳐 타일링된 프로브를 가진) 적어도 250, 500, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 20,000, 21,000, 22,000, 23,000, 24,000, 25,000, 26,000, 27,000, 28,000, 29,000, 30,000, 31,000, 32,000, 33,000,34,000, 35,000, 36,000, 37,000, 38,000, 39,000, 40,000, 41,000, 42,000, 43,000, 44,000, 45,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000개 이상의 또는 그 사이의 임의의 범위의 RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ 또는 항존 유전자가 존재한다. 어레이당 프로브되는 RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ 또는 항존 유전자의 최대 개수는 대상체 종의 게놈 크기 및 유전적 다양성에 의해 결정된다. DNA 칩은 당 업계에 잘 알려져있으며, 특정 종에 특이적인 서열을 갖는 사전-5 제작된 형태로 구입할 수 있다. 다른 실시양태에서, SNP 및/또는 DNA 복제본 수는 상기에 추가로 기재된 바와 같이 "차세대 서열분석 방법"과 같은 서열분석 방법을 사용하여 검출 및 정량될 수 있다.
표지
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 단백질, 폴리펩티드, 핵산, 이의 단편, 또는 어댑터 영역에 라이게이션된 이의 단편은 검출 가능하게 표지된다. 예를 들어, 검출 가능한 표지는 예를 들어 뉴클레오티드 유사체의 혼입에 의한 형광 표지일 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 다른 표지에는 비오틴, 이미노비오틴, 항원, 보조 인자, 디니트로페놀, 리포산, 올레핀 화합물, 검출 가능한 폴리펩티드, 전자 풍부 분자, 기질에 작용하여 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 효소, 및 방사성 동위원소를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법과 함께 사용될 수 있는 방사성 동위원소는 32P 및 14C를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 적합한 형광 분자는 플루오세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 텍사스 레드(texas red), 5' 카복시-플루오레세인("FAM"), 2',7'-디메톡시-4',5'-디클로로-6-카복시 플루오레세인("JOE"), N, N, N', N'-테트라메틸-6-카복시-로다민("TAMRA"), 6-카복시-X-로다민("ROX"), HEX, TET, IRD40, 및 IRD41을 포함하나 이에 제한되지 않는다..
본 발명에 따른 사용에 적합한 형광 분자는 하기를 더 포함한다; Cy2, Cy3, Cy3.5, CY5, Cy5.5, Cy7 및 FLUORX를 포함하지만 이에 제한되지 않는 시아민 염료; BODIPY-FL, BODIPY-TR, BODIPY-TMR, BODIPY-630/650, 및 BODIPY-650/670을 포함하나 이에 제한되지 않는 BODIPY 염료; 및 알렉사(ALEXA)-488, 알렉사-532, 알렉사-546, 알렉사-568, 및 알렉사-594를 포함하나 이에 제한되지 않는 알렉사 염료뿐만 아니라; 당업자에게 공지된 다른 형광 염료. 본 발명에 적합한 전자 풍부 지표 분자는 페리틴, 헤모시아닌 및 콜로이드성 금을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
2색 형광 표지 및 검출법도 사용될 수 있다(Shena et al., 1995, Science 270:467-470). 두 개 이상의 표지를 사용하면 실험 조건(예를 들어, 혼성화 조건)의 사소한 차이로 인한 변이를 검출하는데 유용할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 상이한 색상의 5, 10, 20 또는 100가지 이상의 염료가 표지에 사용될 수 있다. 이러한 표지는 또한 동시에 본 발명에 포함되는 다수의 샘플의 분석을 허용할 것이다.
본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 표지된 핵산 샘플, 이의 단편, 또는 어댑터 영역에 라이게이션된 이의 단편은 프로브에 상보적인 서열을 갖는 샘플 핵산이 이에 혼성화할 수 있는 조건하에 다수의 올리고뉴클레오티드 프로브와 접촉된다. 사용되는 표지 유형에 따라, 혼성화 신호는 X 선 필름, 포스포 이미저, 또는 CCD 카메라를 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 형광 표지된 프로브가 사용될 때, 전사체 어레이의 각 부위에서의 형광 방출은 바람직하게는 공초점 레이저 현미경으로 스캐닝함으로써 검출할 수 있다. 한 실시양태에서, 사용된 2개의 형광단 각각에 대해 적절한 여기 라인을 사용하는 별도의 스캔이 수행된다. 별법으로, 두 개의 형광단에 특이적인 파장에서 샘플을 동시에 조사할 수 있는 레이저를 사용할 수 있으며 두 개의 형광단의 방출을 동시에 분석할 수 있다(문헌[Shalon et al. (1996) Genome Res. 6, 639-645] 참조). 바람직한 실시양태에서, 어레이는 컴퓨터 제어된 X-Y 스테이지 및 현미경 대물렌즈가 구비된 레이저 형광 스캐너로 스캐닝된다. 두 개의 형광단의 순차적인 여기는 멀티 라인, 혼합 가스 레이저로 달성되며 방출된 빛은 파장 별로 분리되어 두 개의 광전자 증배관으로 검출된다. 이러한 형광 레이저 스캐닝 장치는 예를 들어 문헌[Schena et al. (1996) Genome Res. 6, 639-645]에 기재되어 있다. 별법으로, 문헌[Ferguson et al. (1996) Nat. Biotech. 14, 1681-1684]에 기재된 것과 같은 광섬유 번들이 사용될 수 있다. 그런 후, 결과 신호를 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 분석하여 RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ 및 항존 유전자의 발현을 결정할 수 있다.
대상체의 게놈 DNA가 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 단편화되고 분석 전에 증폭되는 다른 실시양태에서, 증폭은 대상체의 게놈 DNA의 클로닝 영역을 포함할 수 있다. 상기 방법에서, DNA 영역의 증폭은 클로닝 과정을 통해 달성된다. 예를 들어, 발현 벡터는 대상체의 게놈 DNA의 다량의 특정 단편을 발현하도록 조작될 수 있다(Sambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4 th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2012)).
대상체의 DNA가 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 단편화되고 분석 전에 증폭되는 또 다른 실시양태에서, 증폭은 대상체로부터의 유전자를 코딩하는 핵산, 또는 핵산의 유전자와 측면 게놈 부위를 발현하는 단계를 포함한다. 이어서, 인트론을 포함하는 전체 전사체를 포함하는 RNA(전구 전령(pre-messenger) RNA)를 단리하여 본 발명의 방법에 사용하여 암의 유전적 특성을 분석하고 제공한다. 특정 실시양태에서, 증폭은 필요하지 않다. 이러한 실시양태에서, 대상체의 게놈 DNA 또는 전구 RNA는 제한 엔도뉴클레아제 또는 다른 방법을 사용하여 단편화될 수 있다. 생성된 단편은 SNP 프로브에 혼성화될 수 있다. 전형적으로, DNA는 단편을 증폭하는 경우에 필요한 DNA 또는 전구-mRNA의 양과 비교하여 더 많은 양의 DNA가 분리되어야 한다. 예를 들어, 대상체의 핵산이 증폭되지 않는 경우, 혼성화에 사용하기 위한 대상체의 DNA 샘플은 약 400 ng, 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng, 또는 1000 ng 이상의 DNA 일 수 있다. 별법으로, 다른 실시양태에서, 분석에 매우 적은 양, 예를 들어 400 ng, 300 ng, 200 ng, 100 ng, 90 ng, 85 ng, 80 ng, 75 ng, 70 ng, 65 ng, 60 ng, 55 ng, 50 ng 이하의 핵산이 필요한 방법이 사용된다. 예를 들어, 분자 도치 프로브(MIP: molecular inversion probe) 분석법에 사용된다. 이러한 기술은 쉽게 이용 가능하지만 일반적으로 DNA 품질이 감소되고/되거나(예를 들어, 작고 단편화된 DNA), 대량의 핵산을 제공하지 못하는 특징을 갖는 파라핀 매몰된 포르말린 고정 재료 또는 작은 코어 바늘 생검과 같은 임상 샘플을 분석하는데 특히 유용하다.
일단 발현 수준이 결정되면, 결과 데이터는 당업자에 의해 사용되는 잘 알려진 방법에 기초한 다양한 알고리즘을 사용하여 분석될 수 있다.
키트
본 발명은 또한 대상체를 IBD로 진단하고/하거나 치료가 필요한 대상체를 확인하기 위한 키트에 관한 것이다. 키트는 대상체를 진단하고/하거나 치료가 필요한 대상체를 확인하는 본 발명의 방법을 실시하는데 유용하다. 키트는 하나 이상의 본 발명의 조성물을 포함하는 물질 또는 구성요소의 집합체이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 키트는 전술한 바와 같이 RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ에 대한 프라이머 및 프로브를 포함하는 조성물을 함유한다.
본 발명의 키트에 구성된 구성요소의 정확한 특성은 그 의도된 목적에 따라 결정된다. 예를 들어, 일부 실시양태는 위험 변이 및/또는 유전자 발현 수준을 평가하기 위한 목적으로 구성된다. 일부 실시양태에서, 키트는 샘플에서 RNASET2의 유전자 발현 수준을 검출하도록 구성된다. 또 다른 실시양태에서, 키트는 샘플에서 RNASET2 및/또는 TL1A의 유전자 발현 수준을 검출하도록 구성된다. 일부 다른 실시양태에서, 키트는 샘플에서 RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ의 유전자 발현 수준을 검출하도록 구성된다. 다양한 다른 실시양태에서, 키트는 샘플에서 RNASET2 위험 변이를 검출하도록 구성된다. 또 다른 실시양태에서, 키트는 샘플에서 RNASET2의 메틸화 수준을 검출하도록 구성된다. 한 실시양태에서, 키트는 특히 포유동물 대상체를 평가하기 위한 목적으로 구성된다. 다른 실시양태에서, 키트는 특히 인간 대상체를 평가하기 위한 목적으로 구성된다. 추가의 실시양태에서, 키트는 농장 동물, 가축 및 실험용 동물과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 대상체를 평가하는 수의학 적용을 위해 구성된다.
사용 설명서가 키트에 포함될 수 있다. "사용 설명서"는 전형적으로 대상체를 IBD로 진단하고/하거나 대상체를 치료가 필요한 IBD로 확인하는 것과 같이 원하는 결과를 얻기 위해 키트의 구성요소를 사용하는데 사용되는 기술을 설명하는 실질적인 내용을 포함한다. 경우에 따라, 키트는 또한 다른 유용한 구성요소, 예를 들어 프라이머, 희석액, 완충액, 피펫팅 또는 측정 도구 또는 당업자가 쉽게 인식할 수 있는 다른 유용한 용품을 포함한다.
키트에 구성된 재료 또는 구성 요소는 조작성과 유용성을 유지하는 편리하고 적절한 방법으로 보관되어 의사에게 제공될 수 있다. 예를 들어, 구성요소는 용해, 탈수 또는 동결 건조된 형태일 수 있다. 이들은 실온, 냉장 또는 냉동 온도로 제공될 수 있다. 구성 요소는 전형적으로 적절한 포장재에 들어 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "포장재"라는 용어는 본 발명의 조성물 등과 같은 키트 내용물을 보관하는데 사용되는 하나 이상의 물리적 구조를 의미한다. 포장재는 잘 알려진 방법으로, 바람직하게는 멸균의, 오염이 없는 환경을 제공하도록 구성된다. 키트에 사용되는 포장재는 유전자 발현 분석에 통상적으로 사용되는 포장재이다. 본원에서 사용되는 용어 "패키지"는 개별 키트 구성요소를 담을 수 있는 유리, 플라스틱, 종이, 호일 등과 같은 적절한 고체 매트릭스 또는 물질을 지칭한다. 따라서, 예를 들어, 패키지는 RNASET2, TL1A, IFN-γ 및/또는 RNASET2 메틸화를 위한 프라이머 및 프로브를 함유하는 본 발명의 조성물의 적절한 양을 담는데 사용되는 유리 바이알 일 수 있다. 포장재에는 일반적으로 키트 및/또는 이의 구성요소의 내용물 및/또는 목적을 나타내는 외부 표지가 있다.
실시예
하기 실시예는 청구된 발명을 보다 잘 예시하기 위해 제공되며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석해서는 안 된다. 특정 물질이 언급되는 범위에서, 이는 예시의 목적일 뿐이며, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 당업자는 본 발명의 능력을 발휘하지 않으면서 그리고 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 동등한 수단 또는 반응물을 개발할 수 있다.
실시예 1
제브라피쉬에서 RNASET2가 소실되면 리소좀 내에 분해되지 않은 rRNA가 축적된다. RNASET2의 주요 대립 유전자는 (i) IBD, CD(rs9355610), B1 및 ANCA 수준과 pos/neg(rs1410925) 둘 다에 대해 위험이며, B3 및 ASCA IgA와 IgG 수준 둘 다 및 pos/neg(rs1410925)에 대해 방어적이다(표 2). 주요 대립 유전자 rs9355610은 IBD 환자의 CD 소장 및 직장, EBV 형질전환된 B 세포 및 CD3+ PBL에서 낮은 수준의 RNASET2 mRNA 발현과 관련된다. 주요 대립 유전자는 또한 CD S상 결장에서 RNASET2 mRNA와 관련된다. 낮은 수준의 RNASET2와 증가된 수준의 pANCA는 주요 대립 유전자와 관련된다. RNASET2 유전자 좌에서의 메틸화는 RNASET2 mRNA 발현과 역 상관관계가 있다.
<표 2>
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<표 3>
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<표 5>
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<표 6>
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<표 8>
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<표 9>
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<표 10>
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<표 11>
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<표 12>
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<표 13>
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대립 유전자 위험은 오즈비(OR: Odds ratio)에 의해 정의한다. A1 대립 유전자와 OR <1로 나타날 때, 주요 대립 유전자는 위험 대립 유전자이다(A2는 위험임). OR >1이면, 소수 대립 유전자 (A1)은 위험 대립 유전자이다. A1과 오즈비를 알면 어느 대립 유전자가 위험하고 어느 것이 방어적인지를 결정할 수 있다.
실시예 2
상승된 IFN-γ 발현을 통한 염증의 TL1A 증가의 분자 기전은 RNAseq를 사용하여 정의하였다. CD4+ T 세포를 미처리 조건에서 또는 1 ㎍ 규모의 IL12 및 IL18 또는 IL12 및 IL18 및 TLA1로 처리하여 분석하였다. 10ng 규모에서, CD4+ T 세포를 IFN-γ와 함께 또는 없이, IL12 및 IL18 및 TLA1로 처리하여 분석하였다. RNAseq 데이터 예비스크리닝은 실패한 모든 프로브 데이터, FPKM> 5인 3개 미만의 샘플을 갖는 모든 유전자를 제거하였다. 이 기준을 사용하여 8695개의 유전자가 예비스크리닝을 통과하였으며 쌍을 이룬 샘플을 사용하는 클래스 비교에 BRB 어레이 툴(BRB Array Tools)을 이용하였다.
본 발명자들은 분자 수준에서 TL1A 처리가 RNASET2의 발현 감소를 매개하는 것 이외에 IFN-γ의 발현 상승을 매개한다는 것을 입증한다. RNASET2의 발현 감소는 다음의 CD 환자에서 검출된다: 1) 만성 활동성 질병, 2) 외과적 개입이 필요한 불응성 질병, 3) 항-TNF 요법에 경험이 없는 환자, 4) OmpC+, ANCA- 혈청학적 인자와 관련 및 5) RNASET2 위험 SNP rs9355610, rs1819333, rs2149085와 관련.
실시예 3
TNFSF15와 그가 코딩하는 단백질 TL1A는 IBD와 관련되며 점막 염증의 핵심 매개 인자이다. IBD 환자에서, 상승된 TL1A의 수준은 질병의 중증도 및 유전자형과 상관관계가 있다. TL1A는 IFN-γ 생산의 현저한 상승을 매개한다. IBD 환자(20명 크론병[CD], 20명 궤양성 대장염[UC])로부터 단리된 T 세포에서 정상(NL)과 비교하여 TL1A 반응 바이오마커를 RNAseq에 의해 확인하고 qPCR에 의해 입증하였다. NL과 IBD 환자의 샘플의 추가적인 코호트를 이용하여 GWAS와 관련하여 발현/메틸화 양적 형질 유전자 좌(eQTL/mQTL)를 입증하고 측정하였다. RNAseq 발현 클러스터링은 TL1A 처리 세포 vs. 미처리 세포에서 차이가 있었다. 세포 외 T2 RN아제를 코딩하는 유전자인 RNASET2는 TL1A 처리 후 하향 조절되었다. 이전의 연구들은 RNASET2와 CD 감수성을 연관시켰다. CD 환자에서 RNASET2 발현은 경증 질병에 비해 "중증"에서 낮았다. 즉, 다중의 질병 플레어-업(flare-up)(p<0.009), 약물 불응성(p<0.024)이었다. RNASET2에 대한 질병 위험 대립 유전자 rs1819333(p = 0.015) 및 상승된 TL1A 발현과 관련된 TNFSF15 대립 유전자, rs6478108, rs6478109 및 rs7848647(p = 0.01)는 RNASET2 발현 감소와 상관관계가 있었다. 또한, RNASET2의 siRNA 침묵은 TL1A 매개된 IFN-γ 분비를 상승시켰다. 특정 이론에 구애받지 않고서, 본 발명자는 RNASET2의 하향 조절이 TL1A에 의해 유발된 중증 CD의 특징이라고 생각한다.
NL, CD 또는 UC 환자로부터 새로이 단리된 비자극 T 세포의 각각의 코호트에서 RNASET2 발현 및 DNA 메틸화를 조사하였다. RNASET2 유전자 좌에서 메틸화는 mRNA 발현과 역 상관관계가 있었다. RNASET2 대립 유전자의 eQTL은 발현 감소와 관련이 있었다. 외과적 개입이 필요한 중증 질병을 갖는 CD 환자에서 유의하게 상승된 RNASET2 메틸화가 관찰되었다(표 14). NL 또는 경증 환자에서 상관관계는 관찰되지 않았다. 마찬가지로, RNASET2 메틸화 증가는 TL1A 발현 상승과 관련된 TNFSF15 위험 대립 유전자와 관련되었다(표 14). 후생적으로, RNASET2 eQTL/mQTL 영역은 히스톤 H3K4me3 및 H3K27ac 및 DN아제 HS 활성화 부위와 중첩된다. 이 영역은 NFκB, jun, ATF3 및 CEBPD에 대한 전사인자 결합과 함께 위치하며, 이들 모두는 TL1A 치료에 반응하여 상향 조절된다. 이 결과는 RNASET2가 IFN-γ 생산 조절에 관여하는 TL1A 반응 유전자임을 확인해준다. 중증 질병의 CD 환자에서 과메틸화 및RNASET2의 발현 감소가 있으며, 이는 생체 내에서 TL1A에 대한 사전 노출을 반영할 수 있다. 따라서, 특정 이론에 구애받지 않고서, 본 발명자들은 RNASET2가 항-TL1A 요법로부터 가장 유익한 CD 환자의 서브세트를 확인하기 위한 신규의 가능성 있는 질병 중증도 바이오마커로서 역할을 한다고 생각한다.
<표 14>
Figure pat00015
본 발명자들은 11명의 UC CD3+ PBT(약물 불응성), 43명의 CD CD3+ PBT(약물 불응성 23명, 경증 20명) 및 17명의 정상 CD93+ PBT를 포함하는 3개의 코호트의 환자를 추가로 분석하였다. 샘플은 인피늄 450 메틸화 어레이에서 시행하였으며 11명의 CD, 12명의 UC 및 4명의 NL 샘플은 인피늄 발현 어레이에서 시행하였다. 본 발명자들은 CD4+ T 세포의 TL1A 처리 후 RNASET2 발현이 감소하고 RNASET2의 침묵이 TL1A 매개된 IFN-γ 분비를 상승시킨다는 것을 입증한다.
<표 15>
Figure pat00016
후생 연구는 RNASET2 eQTL/mQTL 영역이 1) 히스톤 H3K4me3 및 H3K27ac, 2) DN아제 HS에 대한 후생적 활성화 부위와 중첩되며, 3) TL1A 치료에 반응하여 모두 상승조절되는 NFkB, jun, ATF3 및 CEBPD에 대한 전사인자 결합과 함께 위치한다. 또한, 말초 혈액으로부터의 1차 T 기억세포에서 인핸서 요소, CD4+ 미접촉 T 세포에서 DNA아제 HS 부위 및 eQTL RPS6KA2 단핵 세포가 rs1819333 대립 유전자와 연관되었다.
실시예 4
TL1A는 IL-12/IL-18과 상승작용하여 (6-8시간 내에) IFN-γ 발현을 현저히 상승시킨다. RNAseq 분석을 사용하여 IFN-γ 발현을 조절하는 TL1A 반응 유전자를 확인하였다. TL1A 활성화된 전체 CD4+ T 세포 집단에서 20개의 유전자가 차등 발현되었다(2배 이상). 이것은 IFN-γ를 분비하는 T 세포가 전체 CD4+ T 세포 집단 중 아주 작은 서브세트(1-3%)만을 구성한다는 사실에 크게 기인할 수 있다(도 15). 건강한 공여자의 CD4 T 세포를 IL12/IL18 및 TL1A로 8시간 처리한 후 IFN-γ 분비 및 비분비 서브세트로 분류하고(도 15) mRNA의 전체 게놈 전사 분석(GWAS)을 수행하였다. 전체 8075개의 발현 유전자 세트의 무감독 계층적 클러스터링은 TL1A 매개된 IFN-γ 분비 및 비분비 부분집단을 명확하게 구별한다(도 16).
발현 수준을 기준으로 IFN-γ- 분비 및 비분비 부분집단을 분류하는 클래스 예측 분석을 수행하였다. 최상의 예측 전사체 목록은 IFN-γ 분비 서브세트(p 값 <0.00005) 사이에 2배 이상의 차등 발현을 보이는 764개의 유전자로 이루어졌다(도 17). 유전자 온톨로지 분석은 차등 발현된 유전자가 프로테아솜, 아폽토시스, RNA 발현 및 T 세포 수용체의 신호전달과 관련된 경로에서 풍부하였으며 인플릭시맙의 하류 표적임을 보였다(활성화 Z 점수 = -4, p 값 = 2e-15). GWAS는 여러 IBD 위험 변이 SNP를 확인하였다. 다른 영역 내 예측 유전자의 비율에 비해 IBD 위험 SNP의 0.5 MB 내에 위치한 전사체의 비율이 유의하게 증가하였다(14% vs. 9%, p 값 = 3.3e-6). 실제로, 차등 발현된 전사체는 모든 IBD 위험 관련 영역의 34%에 맵핑되었다(도 18). 특정 이론에 구애받지 않고서, 데이터는 IFN-γ 발현의 TL1A 매개된 조정뿐만 아니라 IBD 감수성과 발병기전을 조절하는 기여 인자로서 이들 유전자가 크게 기여함을 입증한다.
IBD 위험 유전자 좌와 관련된 차등 발현되는 예측 전사체의 유의성과 크기를 시각화한 화산 플롯을 통해 후보 유전자의 우선순위를 정할 수 있었다(도 20). 이들 유전자 중 IFN-γ의 TL1A 매개된 발현이 가장 유의하게 상향 조절되었고 RNASET2가 가장 유의하게 하향 조절되었음을 확인하였다(도 20). Rh/T2/S 리보뉴클레아제 패밀리의 구성원인 RNASET2가 발현에 있어 5배 이상의 TL1A 매개된 하향 조절을 나타내는 유일한 IBD 위험 관련 유전자였다. RNASET2는 GWAS에 의해 가능성 있는 IBD 위험 유전자로 확인되었다. IBD 발병기전에서 RNASET2의 기능적 역할이 알려지지 않았기 때문에, IBD에서 RNASET2의 발현 조절을 조사하였다. 특정 이론에 구애받지 않고서, 본 발명자들은 RNASET2가 '클래스 예측' 유전자이기 때문에, 전체 CD4+ T 세포에서 차등적인 발현이 검출될 수 있다고 생각한다. CD, UC 환자 또는 NL 대조군의 휴지 또는 IL12/IL18 처리된 CD4+ T 세포를 단리하고 RNASET2 수준을 8시간 동안 TL1A의 존재 또는 부재하에서 비교하였다. 도 7에서 볼 수 있듯이, NL 공여자의 세포에서 관찰된 것과는 대조적으로, IBD 환자는 TL1A 매개된 RNASET2 발현 수준의 감소를 나타내지 않았다. 오히려 RNASET2의 감소된 발현 수준은 경증 질병 과정과 비교하여 "중증"의 CD 환자에서 관련되었다. RNASET2 발현은 연간 다중의 질병 발적을 나타내는 CD 환자에서 단리된 세포에서 유의하게 낮았으며(p <0.001)(도 8A 및 8C), 마찬가지로 질병 관리를 위해 외과적 개입이 필요한 약물 불응성 CD 환자에서 RNASET2 발현 감소가 검출되었다(p <0.024) (도 8B). UC 환자에서 비슷한 경향이 나타났다.
유전자 발현 양적 형질(eQTL)을 수행하여 RNASET2 유전자 변이와 유전자 전사체 발현 수준 사이의 기능적 상관관계를 특성화하였다. 한국인 CD 집단에서 확인된 백인 rs1819333 및 rs2149085에서의 IBD 위험 SNP 태깅은 둘 다 RNASET2 프로모터 영역 내에서 전사 개시 부위로부터 -3.5 kb 내에 위치한다. 추가 프로모터 SNP, rs9355610은 그레이브 자가면역 갑상선 질환에 대한 감수성과 관련이 있는 것으로 나타났다. CD 환자로부터 단리된 말초 세포에서 RNASET2 질병 위험 대립 유전자 rs1819333(p = 0.015) 및 rs2149085(p = 0.015), 게다가 rs9355610(p = 0.04)은 eQTL을 나타내며 RNASET2의 발현 감소와 관련이 있었다(도 9). 특정 이론에 구애받지 않고서, 데이터는 RNASET2의 하향 조절이 IFN-γ 발현을 변경시키는 경로를 나타낸다. IFN-γ의 발현 조절에서의 RNASET2의 기능적 역할은 siRNA 매개된 침묵을 이용하여 확인되었다. CD4+ T 세포를 RNASET2 mRNA를 표적화하는 siRNA 또는 대조군 siRNA로 형질감염시킨 후 IL12/IL18 및 TL1A로 처리하였다. RNASET2 mRNA 자체의 발현은 RNASET2 siRNA에 의해 60-70% 억제를 나타내었다(도 21A). 동시에, 대조군 스크램블 siRNA와 비교하여 RNASET2 siRNA로 형질감염된 세포에서 IFN-γ 발현의 유의한 상승(> 1.5배)이 확인되었다(도 21B).
특정 이론에 구애받지 않고서, 본 발명자들은, 크론병의 발병기전에서 IFNγ의 중추적인 역할을 고려하여, 이들 데이터에서 종합적으로 RNASET2의 하향 조절이 TL1A에 의해 유발된 중증 CD의 바이오마커로 역할을 할 수 있음을 나타낸다고 생각한다. NL, CD 및 UC 환자로부터 새로이 단리된 비자극 T 세포의 각각의 코호트에서 RNASET2 발현을 조사하였다. DNA 메틸화는 유전자 발현에 영향을 미치고, 대부분의 질병 위험 유전자 다형성이 후성적인 변형을 거친 영역에서 전사된 엑손 외부로 맵핑되기 때문에, RNASET2의 DNA 메틸화 상태를 또한 조사하였다. CD 및 UC 환자의 비자극된 T 세포에서 IFNγ 발현 수준과 RNASET2 사이의 역 상관관계가 관찰되었다(도 22). 더욱이, 도 10에 나타난 바와 같이, 주로 전사 개시 부위(TSS: transcriptional start site)로부터 50kb 상류 및 하류 내에서 거리에 반비례하는 발현과 메틸화 사이의 유의한 음의 상관관계가 있었다. 추가로, IBD 질병 위험 유전 변이체와 메틸화와 발현 수준에 상관관계가 있는 영역 사이에는 상당한 중첩이 있었다(도 10). 가장 강한 상관관계(p = 8.5x10-5)는 첫 번째 인트론 내의 CpG 부위(1.4kb)에서 관찰되었다(도 23).
RNASET2 유전자 변이와 유전자 전사체 발현 수준 사이의 기능적 상관관계는 불응성 질병을 갖는 IBD 환자의 비자극된 말초 T 세포에서 감소 발현이 RNASET2 위험 대립 유전자 변이 SNP와 상호관련이 있는 것으로 확인되었다(도 11). 또한, 유전자 발현 마이크로어레이를 이용하여 소장의 외과적 절제로 얻은 조직으로부터 추출한 mRNA에 대해 유사한 eQTL이 관찰되었다(도 12). RNASET2 유전자 변이와 메틸화 사이의 상관관계, mQTL도 조사하였으며 불응성 질병을 갖는 IBD 환자에서 메틸화의 증가에 따라 유의한 mQTL이 관찰되었다(도 13A-13D). 대조적으로, 경증 질병 또는 NL 대상체 환자로부터 단리된 세포에서는 mQTL이 검출되지 않았다.
유전자 발현(eQTL)과 DNA 메틸화(mQTL)에 영향을 미치는 이러한 유전적 변이의 역할은 RNASET2 유전자 좌에 걸친 모든 유익한 정보를 주는 SNP에 맵핑되었다(도 14). 약물 불응성 질병을 갖는 IBD 환자로부터 단리된 T 세포에서 CCR6 유전자 좌 내에서 RNASET2 TSS의 10kb 하류에서 -170Kb 상류까지 강하게 중첩되는 eQTL과 mQTL이 있다. 마찬가지로 불응성 질병 환자에서 비자극된 말초 T 세포의 RNSASET2 발현과 소장의 외과적 절제를 비교했을 때 eQTL이 현저히 중첩되었다. 대조적으로, 경증 질병 또는 NL 대상체에서는 mQTL이 검출되지 않았다(도 14A 및 14B). 이것은 특정 이론에 구애받지 않고서, 데이터에서 RNASET2의 하향 조절이 TL1A 매개된 IFN-γ 발현 상승의 요소임을 시사한다. 또한, 공지된 IBD 위험 변이 SNP를 갖는 IBD 환자에서 RNASET2의 후성적 조절 및 유전자 발현 감소는 더 증증의 질병 과정과 관련된다.
실시예 5
방법
NL(정상) 공여자로부터 단리된 말초 T 세포를 TL1A의 존재 또는 부재하에 8시간 동안 배양하였다. 유전자 발현 프로파일링은 유세포 측정법으로 정제된 인터페론 감마(IFN-γ) 생산 세포의 서브세트를 사용하여 RNA 서열분석(RNA-seq) 및 정량적 중합 효소 연쇄 반응(qPCR)에 의해 수행하였다. 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA) 및 소형 간섭 RNA(siRNA) 억제 및 qPCR을 사용하여 IFN-γ의 TL1A 매개된 발현에서 리보뉴클레아제 T2(RNASET2)의 역할을 측정하였다. 유사한 방식으로 자극된 IBD 환자(20명 CD 및 20명 UC)로부터 단리된 말초 T 세포를 사용하여 IBD에서의 RNASET2의 역할을 조사하였다. NL 및 IBD 환자 또는 소장(SB) 외과적 절제로부터 비자극된 T 세포의 추가 샘플을 사용하여 결과를 입증하였으며 유전자형 분석 및 임상 데이터를 기반으로 발현 양적 형질 유전자 좌(eQTL) 및 메틸화 양적 형질 유전자 좌(mQTL)에 대해 분석하였다.
전사인자(TF) 결합 부위의 예측된 모티프 파괴에 대한 스크리닝은 후보의 조절 SNP를 확인하였다. 프로테옴 분석과 사이토카인 분비 측정을 사용하여 단백질 발현에 대한 RNASET2 지정 소형 간섭 RNA(siRNA)의 영향을 결정하였다. 세포 응집은 유세포 측정법으로 측정하였다.
연구 대상체
시더스 시나이 메디컬 센터(Cedars-Sinai Medical Center)의 에프. 위자자 재단 염증성 장 및 면역 생물학 연구소(F. Widjaja Foundation Inflammatory Bowel and Immunobiology Research Institute)의 미리아드 IBD 바이오뱅크(MIRIAD IBD Biobank)를 통해 인간 대상체를 모집하였다. 모든 대조 대상체는 약물치료가 필요하지 않으며 자가면역 질환이나 IBD의 공지된 개인 이력이나 가족력이 없는 건강한 개체였다. 모든 참여 대상체로부터 사전 동의서(시다 시나이 메디컬 센터의 기관 검토위원회 승인받음)을 받았다. IBD 환자는 의학 요법 실패 후 질병 관리를 위해 외과적 개입이 필요한 경우 "불응성"으로 정의하였다. IBD 환자는 샘플 수집시 이전 수술이 없고 활동성 질병이 없는 경우 "경증"으로 정의하였다. 연간 하나 이상의 질병 발적을 나타내는 CD 환자는 연간 질병 발적이 없는 환자와 비교하여 "중증 질병"이 있는 것으로 정의하였다. 외과적 절제를 받은 564명의 CD 환자로부터 임상적 특징을 전향적으로 수집하였다.
림프구 집단의 단리
말초 혈액 단핵 세포(PBMC: peripheral blood mononuclear cell)는 피콜-하이팩(Ficoll-Hypaque) 구배 분리법에 의해 건강한 지원자로부터 단리하였다. CD3+ T 세포(PBT)는 CD3 면역 자성 비드(Miltenyi Biotech, 캘리포니아주 오번 소재)를 사용하여 단리하였으며 순도는 95% 이상이었다. CD4+ T 세포는 자성 비드(Stemcell Technologies, 캐나다 브리티시 컬럼비아주 밴쿠버 소재)를 이용한 고갈에 의한 음성 선별법을 이용하여 단리하였으며 순도는 95% 이상이었다.
인피늄 450K 비드 칩 분석
CD3+ T 세포로부터의 DNA 샘플은 1 ㎍의 입력으로 자이모(Zymo) EZ DNA 메틸화 키트(Zymo Research)를 사용하여 비설파이트 전환하였다. 이 분석은 일루미나 인피늄 인간 메틸화 450 비드칩 키트(Illumina Inc., 캘리포니아주 샌디에고 소재)를 사용하여 일루미나 인피늄 메틸화 지침에 따라 수행하였다. 게놈스튜디오(GenomeStudio) 소프트웨어를 사용하여 데이터를 시각화하고 표준화하였다. 메틸화 β 값은 (메틸화된 프로브 신호)/(전체 신호)의 비율로서 재계산하였다.
IFN-γ 분석
IFN-γ는 증폭 ELISA로 측정하였다. 그라이너 바이오-원(Greiner Bio-One) (Longwood, FL) ELISA 플레이트를 5 μg/ml 단클론 항 IFN-γ(BD Biosciences, ㅁ, 매사추세츠주 워번 소재) 100 ㎕로 밤새 코팅하였다. 샘플과 표준을 24시간 동안 첨가한 다음 2.5 μg/ml 다클론 비오티닐화 토끼 항-IFN-γ(BD Biosciences) 100 ㎕를 2시간 동안 첨가하였다. 이어서, 여기에 100㎕의 1/1000 희석된 알칼리 포스파타아제-접합된 스트렙타비딘(Jackson ImmunoResearch Laboratories, 펜실베니아주 웨스트 그로브 소재)을 2시간 동안 첨가하였다. 기질, 0.2 mM NADP(Sigma-Aldrich, 미주리주 세인트 루이스 소재)을 30분간 첨가한 후 증폭시약(3% 2-프로판올, 1 mM 요오도니트로테트라졸륨 바이올렛, 75 μg/ml 알코올 탈수소효소 및 50 ㎍/㎖ 디아포라아제; 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))로 30분간 처리하였다. E 맥스(E mas) 플레이트 판독기(Molecular Devices, 캘리포니아주 서니베일 소재)를 사용하여 플레이트를 490 nm에서 판독하였다.
CD3 + T 세포의 유전자 발현 분석
일루미나 전체 게놈 발현 비드칩(Illumina genome-wide expression BeadChip)(HumanHT-12_V4_0_R2) (Illumina) 또는 뉴젠(Nugen) 인간 FFPE RNA-seq 라이브러리 시스템을 사용하여 CD3+ T 세포의 발현 분석을 수행하였다. 일루미나 유전자 발현 데이터는 BRB 어레이 툴과 R의 루미(lumi) 패키지를 사용하여 처리하였다. 데이터를 log2 변환시키고 로버스트 스플라인(robust spline) 정규화를 사용하여 정규화하였다. RNA-Seq 라이브러리는 뉴젠 인간 FFPE RNA-seq 라이브러리 시스템으로 제조하였다. 작업 흐름은 cDNA 생성, 단편화, 말단 복구, 어댑터 라이게이션 및 PCR 증폭으로 이루어진다. 1개 레인에서 샘플을 멀티플렉싱하기 위해 상이한 어댑터를 사용하였다. 서열분석은 일루미나 NextSeq 500에서 단일 판독 75회를 수행하였다. 데이터 품질 검사는 일루미나 SAV에서 수행하였다. 디멀티플렉싱은 일루미나 Bcl2fastq2 v 2.17 프로그램으로 수행하였다. 판독은 보우타이2(Bowtie2) 버전 2.1.0을 사용하여 최신 UCSC 전사체 세트에 먼저 맵핑하였으며 유전자 발현 수준은 RSEM v1.2.15를 사용하여 추정하였다. FPKM을 사용하여 유전자 발현을 정규화하였다.
siRNA 억제 및 정량적 프로테옴 분석
새로이 단리된 CD4+ T 세포(15 x 106)를 10% 송아지 태아 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지에서 밤새 배양하고, 세척하고, 250 ㎕ 신선 배지에 재현탁하고, 150 pmole의 RNASET2 siRNA 또는 대조군 siRNA 존재하에서 BTX 일렉트로 스퀘어 포레이터(BTX Electro Square Porator) ECM 830(Genetronics, Inc., 캘리포니아주 샌디에고 소재)에서 4mm(간격 폭)의 큐벳을 사용하여 전기천공하였다(600V, 500μsec의 9회 펄스, 펄스 사이 100μsec). siRNA 억제에 사용된 서열은 표 16에 나타냈다.
<표 16>
Figure pat00017
직렬 질량 태깅(TMT: tandem mass tagging) 기반 정량적 프로테옴 분석은 기재된 바와 같이 수행하였다(Qu et al., Sci Rep 2016; 6:32007). 각 샘플에 대해, 50 μg의 단백질을 필터 보조 샘플 제조(FASP: filter-aided sample preparation)를 사용하여 트립신 펩티드로 동시에 분해하였다(Wisniewski et al., Nat. Methods 2009;6:359-62). 8개의 샘플 및 혼합(pooled) 내부 표준으로부터 유래한 펩티드를 TMT10plex 시약 세트(Thermo Scientific)로 표지하고, 혼합하고, 탈염하고, 고 pH 액체 크로마토그래피에 의해 24개의 분획으로 분리하고, 8개의 분획으로 연결하였다. 분획화된 펩티드를 50 cm 이지-스프레이(EASY-Spray) 분석 칼럼에서 분석하고, 직렬 질량 분석을 위한 고 에너지 충돌 해리(HCD: higher-energy collisional dissociation) 방법을 사용하여 데이터 의존 획득 모드에서 LTQ 오비트랩 엘리트(Orbitrap Elite) 질량 분석기(Thermo Scientific)로 분석하였다. 획득한 원시 데이터는 시퀘스트(SEQUEST) 알고리즘을 사용하여 프로테옴 디스커버러(Proteome Discoverer) (v2.1)로 인간 유니포트(Human Uniprot) 데이터베이스(10/17/15에 공개됨, 20,982개 서열을 포함)에 대해 검색하였다. 엄격한 1% 거짓 발견율을 설정하여 펩티드 및 단백질 식별을 여과하였다. 전구이온 간섭이 >30%인 펩티드는 단백질 정량에서 제외하였다.
유세포 분석 및 세포 응집의 분석
IFN-γ 분비 CD4+ T 세포는 재조합 인간 IL-12(500 pg/ml, R & D Systems, 미네소타주 미네아폴리스 소재) 및 IL-18(50 ng/ml, R & D Systems) 및 TL1A(100 ng/ml, Fitzgerald Industries International, 매사추세츠주 액톤 소재)으로 8시간 동안 활성화 후에 유세포 분석에 의해 단리하였다. IFN-γ 분비 CD4+ T 세포는 IFN-γ 분비 분석 세포 농축 및 검출 키트(Miltenyi Biotec, 캘리포니아주 샌디에고 소재)를 사용하여 검출하였다. 세포는 FACS 아리아(Aria) II(BD Biosciences, 캘리포니아주 산호세 소재)에서 분류하였다.
세포 내 IFN-γ 생산 및 세포 응집체 분석은 본질적으로 기재된 바와 같이 수행하였다(Dezorella et al., Cytometry B Clin Cytom 2016:90:257-66). 간략하게, 세포를 휴지시키거나 IL12/IL18 및 TL1A로 24시간 동안 자극하고, 마지막 4시간 동안 버펠딘 A(Berfeldin A)(10ug/ml)를 첨가하였다. 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 0.1% 트리톤(Triton) X-100 및 0.2% 사포닌으로 투과성으로 만들고, 세포 내 IFN-γ(브릴리언트 바이올렛 421-IFN-γ, eBioscience) 또는 이소형 대조군에 대해 염색하였다. 샘플을 세척하고 세포 응집(프로피디움 요오다이드)에 대해 염색하였다. 세포를 CyAnTM ADP 유세포 분석기(Dako, 미국 캘리포니아 카핀테리아 소재)에서 얻어 플로우조(FlowJo) 소프트웨어(TreeStar Inc., 미국 오리건주 애쉬랜드)로 분석하였다. LFA1 차단 분석을 위해, 단클론 대조군 마우스 IgG1k (15ug/ml) 또는 항-LFA1 (TS1/18)가 있는 원추형 마이크로플레이트에서 세포를 예비 인큐베이션한 후 IL12, IL18 및 TL1A로 24시간 동안 자극하였다.
qPCR
RN이지(RNeasy) 키트(Qiagen, Inc., 캘리포니아 발렌시아 소재)를 사용하여 전체 RNA를 단리하고 실시간 정량 RT-PCR로 유전자 발현을 측정하였다. 옴니스크립트(Omniscript) 키트와 프로토콜(Qiagen)을 사용하는 각 RT-PCR 반응에 프라이머로서 올리고(dT)(Integrated DNA Technologies)와 함께 500 ng의 전체 RNA를 사용하였다. 실시간 PCR은 마스터사이클러® ep 리얼플렉스(Mastercycler® ep realplex) PCR 검출 시스템(Eppendorf, 뉴욕주 하우포지 소재)을 사용하여 수행하였다. PCR 분석은 2회 실시하였다. 프라이머 서열(Integrated DNA Technologies)은 인트론에 걸쳐 있으며 표 17에 나타낸다.
<표 17>
Figure pat00018
유전자형 분석
일루미나 휴먼이뮤노 비드칩(Illumina HumanImmuno BeadChip) 어레이를 사용하여 백인 대상체에 대한 유전자형 데이터를 얻었다. 마커는 다음을 기준으로 제외하였다. 유의도 p = 10-3을 이용한 하디-와인버그(Hardy-Weinberg) 평형의 검정; 유전자형 비율이 < 100%(eQTL 및 mQTL 연관성일 경우) 또는 < 98% 미만(GWAS일 경우)이었을 경우 그리고 소수 대립 유전자 빈도가 < 5% 미만이었을 경우. IBD(Identity-by-descent)는 PLINK를 사용하여 관련 개체를 제외하였다(Pi-hat 점수> 0.25). 어드믹스쳐(ADMIXTURE)를 사용하여 인종 분석을 수행하여 개체에 대해 인종 비율을 얻었다. 백인 비율 ≥ 0.75인 개체는 백인으로 분류하였다. 독립적인 백인 샘플은 관련성 점검(컷-오프 pi-hat 점수 사용) 및 어드믹스쳐의 인종 분석을 기준으로 식별하였으며, 모든 후속 연관성은 이 샘플을 사용하여 수행하였다. 독립적인 백인 샘플에 대한 유전자형 데이터의 주요 구성 요소는 트레이스(TRACE)를 사용하여 생성하였다. LDHeatmap R 패키지를 사용하여 139명의 대상체에 대한 유전자형 데이터를 사용하여 RNASET2 유전자 좌의 SNP에 대한 LD 플롯을 생성하였다. IIBDGC 코호트의 QC 및 유전자형 분석의 세부 사항은 이전 보고(Jostins et al., Nature 2012; 491:119-24 및 Liu et al., Nat Genet 2015;47:979-86)에서 찾아볼 수 있다. 간략하게, 누락 데이터가 > 5%인 샘플, 인구 계층화로부터 비유럽 조상의 샘플 또는 비정상적인 평균 세기 값의 샘플, 및 누락 데이터가 > 2% 또는 HWE p 값 <10-10인 SNP를 대조군에서 제거한 후 이뮤노칩(ImmunoChip)을 사용하여 유전자형을 분석한 18,602건의 CD 사례와 33,938건의 비 IBD 대조군을 분석에 포함하였다. IIBDGC의 CD 사례 중 13,511건은 이전에 보고된 몬트리올 분류(Cleynen et al., Lancet 2016;387:P156-67)(B1, 비협착 및 비관통 질병, B2, 협착 및 B3, 관통 질병으로 기재됨)를 기준으로 수집된 질병 행태 정보가 있다.
소장 외과 샘풀의 발현 데이터
애질런트 특징 추출 소프트웨어를 사용하여 추출한 단일 채널 마이크로어레이 발현 데이터를 세인트 루이스 소재의 워싱턴 대학(Washington University)의 게놈 기술 액세스 센터(Genome Technology Access Center)에서 받았다. 기술 사본으로 이용 가능한 원시 발현 데이터는 R 버전 3.2.2에서 구현된 LIMMA 패키지를 사용하여 정규화하였다. 발현 데이터 전처리는 발현 데이터의 배경 보정, 이어서 log2-전환 및 분위-정규화를 포함하였다.
EQTL 및 mQTL 맵핑
eQTL 및 mQTL 맵핑은 매트릭스(Matrix) eQTL R 패키지에서 구현하였다. 소장 수술 샘플에 대해, eQTL 맵핑은 독립적인 백인 샘플(n = 85)을 사용하여 수행하였다. 유전자형과 프로브 발현 수준(eQTL의 경우) 또는 메틸화 β 값(mQTL의 경우) 사이의 연관성은 부가적인 유전자형 효과가 있는 선형 회귀 모델을 사용하여 수행하였다. 모든 연관성은 유전형과 함께 공변량으로서 유전자형 데이터의 성별과 처음 두 가지 주요 요소로 수행하였다. 200 KB의 RNASET2 TSS 내 약 200개의 유전 변이를 사용하여 RNASET2 유전자 발현 또는 메틸화 수준과의 연관성을 수행하였다.
후보의 조절 SNP의 모티프의 분석 및 확인
QTL 및 mQTL을 나타내는 모든 변이체를 바이오컨덕터 모티프브레이크R(bioconductor motifbreakR) 패키지(Coetzee et al., Bioinformatics 2015;31:3847-9)를 사용하여 TF 결합 모티프의 예측된 파괴에 대해 분석하였다. CD 환자의 RNAseq 데이터를 사용하여 발현된 것으로 확인된 T 세포 특이적 TF만을 이월하였다. 그런 후, 후보 조절 SNP를 로드맵 후성 유전체학 맵핑 콘소시움(REMC: Roadmap Epigenomics Mapping Consortium) 데이터(Roadmap Epigenomics C. et al, Nature 2015;518:317-30)에 근거하여 잠재적 기능성에 대해 분석하였다. 잠재적 활성 인핸서 영역은 히스톤 변형 H3K4me1과 H3K27ac 신호의 중첩에 기초하여 결정하였다(Coetzee et al., Hum Mol Genet 2015;24:3595-607). TF 조절의 잠재적 기능성은 REMC CHIP-seq 결합 신호 및 레귤롬(Regulome) 데이터에 기초하여 결정하였다.
경로 분석
경로 분석은 키아젠 인제뉴어티® 경로 분석(Qiagen's Ingenuity® Pathway Analysis)(IPA®, Qiagen, 레드우드 시티 소재, www.qiagen.com/ingenuity) 및 DAVID(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, http://david.abcc.ncifcrf.gov)를 사용하여 수행하였다.
통계 분석
모델링, 데이터 분석 및 데이터 마이닝은 BRB 어레이 툴(brb.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools) 및 R-프로그램(버전 2.2.2, www.r-project.org)을 사용하여 수행하였다. 클래스 예측 분석은 0.001의 최소 p 값을 기초로 하여 복합 공변량 예측 변수, 대각 선형 판별 분석, k-최근접 이웃(k = 1 및 3 사용), 최근접 중심 및 서포트 벡터 머신(support vector machine)을 사용하였다. 클러스터 분석은 클러스터(Cluster) 3.0 및 자바 트리뷰(Java Treeview) 1.1.6r4를 사용하여 수행하였다. 통계적 유의성에 대한 검정은 JMP 통계 소프트웨어(노스캐롤라이나 케리 소재)를 사용하여 결정하였다. rs1819333과 rs9355610 SNP와 치료 실패, ANCA 혈청반응 양성, 절제된 대장 길이 및 재수술까지의 시간 사이에서 임상적 연관성에 대한 검정은 모수적 스튜던트 T 검정과 피어슨 상관관계; 피셔의 정확성 검정 및 카플란-마이어의 생존 곡선을 사용한 연관성 및 추세의 검정에 의해 계산하였다. 내시경 검사 재발과의 연관성은 코크란-아미티지(Cochran-Armitage) 추세 검정으로 계산하였다.
결과
본 연구에서, 본 발명자들은 사이토카인 생산의 TL1A 매개된 상승의 요소로서와 질병 중증도의 새로운 가능성 있는 바이오마커로서의 IBD 감수성 유전자인 RNASET2의 하향 조절을 확인하였다. siRNA 침묵에 따른 RNASET2의 하향 조절은 특정 이론에 구애받지 않고서, IFN-γ 분비를 증가시켜 염증 반응을 조절하는 역할을 뒤받침하였다. RNASET2 발현의 감소는 연간 질병 발병이 없는 환자에 비해 연간 1회 이상의 질병 발적이 있는 CD 환자의 말초 T 세포에서도 관찰되었다. 기능적으로, 양적 형질 유전자 좌는 불응성인 CD 환자에서 말초 및 점막 조직에서 발현 감소(eQTL) 및 의학적으로 DNA 과메틸화(mQTL)에 대해 RNASET2 질병 위험 변이와 관련되었으나 경증 질병 환자에서는 그렇지 않았다. 또한, RNASET2 질병 위험 변이는 협착/관통 질병 행태 발달의 증가와 관련되었다. 게다가, RNASET2 질병 위험 변이는 부분적으로 치료 약물 실패, ANCA 혈청반응 양성, 장의 절제 길이 증가, 재수술까지의 시간 단축 및 수술 후 내시경 검사에서 높은(> 2) 루트기어츠 점수로 정의되는 복잡성/내성의 CD 표현형과 관련되었다. RNASET2 질병 위험 변이체의 모티브 스크리닝은 잠재적인 인핸서 영역 내에 위치한 공통 ETS-TF 결합 부위의 파괴가 예측된 rs2149092를 확인하였으며, 이는 RNASET2 시스-조절 요소에 대한 이해를 제공하였다. RNASET2는 여러 개의 ETS 전사인자의 발현과 상관관계가 있었다. 마지막으로 RNASET2의 siRNA 침묵은 IFN-γ를 상승시키고 ICAM1과 동시에 T 세포 응집을 증가시키는 한편, 항-LFA1의 응집 차단은 IFN-γ 분비를 억제하였다.
IFN-γ 생산의 TL1A 매개된 상승과 관련된 차등적 유전자 발현의 확인
주요 IBD 염증 유발성 사이토카인인 IFN-γ 생산의 TL1A 매개된 상승에 관여하는 기본 분자 경로를 확인하기 위해, CD4+ T 세포를 TL1A로 처리하고 IFN-γ 분비 및 비분비 서브세트로 분류하고 RNA-seq로 분석하였다(도 15 및 도 27). 발현된 유전자 세트의 무감독 계층적 클러스터링은 TL1A 매개된 IFN-γ 분비 및 비 분비 군을 명확하게 구별하였다(도 16). IFN-γ 분비/비분비 서브세트(p 값 <1 x 10-5) 사이에 두 배 이상의 차등 발현된 764개의 "예측" 유전자(도 17)를 확인하였다. 유전자 온톨로지 분석은 차등 발현된 유전자가 T 세포 수용체의 신호전달, 아폽토시스, 및 RNA 발현과 관련된 경로에 풍부하였으며 항-TNF 생물학적 약물인 인플릭시맙의 하류 표적임을 나타냈다. 예측 유전자는 다른 영역에 비해 GWAS로 확인된 IBD 감수성 변이(단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)의 상류 또는 하류 0.25 MB) 측면 영역에 상당히 풍부하였다(14% vs. 9%, p 값은 3.3 x 10-6, 초기하 검정). 특정 이론에 구애받지 않고서, 이들 데이터는 이들 유전자가 IFN-γ 발현의 TL1A 매개된 조절뿐만 아니라 IBD 위험 관련 유전자 좌와의 중첩에 기여함을 시사한다. IBD 위험 관련 예측 유전자 중, IFN-γ의 발현이 가장 유의하게 상향 조절된 것으로 확인되었고 RNASET2가 가장 유의하게 감소된 유전자로 확인되었다(도 20). RNASET2가 IFN-γ 분비 CD4+ 서브세트에서 5배 이상의 하향 조절된 유일한 IBD 위험 관련 유전자였다.
발현과 DNA 메틸화 수준의 역 상관관계를 나타내는 RNASET2 영역은 질병 위험과 관련된 변이의 측면 영역과 중첩된다
RNASET2는 리보뉴클레아제의 Rh/T2/S 패밀리의 유일한 인간 구성원이며, 난소암, 흑색종 및 비호지킨 림프종에서 그 발현이 감소한다. 크론병/IBD의 발병기전에서 IFN-γ의 핵심적인 역할을 고려할 때, 특정 이론에 구애받지 않고서, 이 데이터는 총체적으로 RNASET2의 하향 조절이 TL1A 매개된 '중증' CD를 확인한다는 것을 시사한다. NL, CD 및 UC 환자의 각각의 코호트에서 새로이 단리된 비자극 말초 CD3+ T 세포에서 RNASET2 발현을 조사하였다. DNA 메틸화는 유전자 발현에 영향을 미치는 기전, 특히 전사된 엑솜(exome) 밖에 맵핑되는 질병 관련 유전 변이에 영향을 미치는 기전 중 하나로 이해되기 때문에, 본 발명자들은 RNASET2 유전자 좌에 걸쳐 DNA 메틸화 상태를 조사하였다. RNA-seq 분석은 합쳐진 138명의 CD 환자로 구성된 두 개의 독립 코호트의 말초 T 세포에서 TNFSF15 발현 수준과 RNASET2의 역 상관관계가 있음을 입증하였다(도 24A 및 24D). 각 코호트를 따로 분석할 때에도 이러한 결과는 일관되었다(도 24B 및 24C). 또한, 발현과 메틸화 사이에 유의한 음성적 상관관계가 있었으며(도 23), 주로 전사 개시 부위(TSS)의 상류와 하류에서 50kb 이내였다(도 26). RNASET2의 첫 번째 인트론 내에서 CpG 부위(1.4kb)에서 메틸화와 발현의 가장 강한 상관관계가 관찰되었다(p=8.5x10-5)(도 26). 추가로, 유럽 조상 집단에서 RNASET2 유전자 좌를 태깅한 IBD 위험 SNP를 포함한 CD 질병의 유전적 위험 변이, rs1819333이 메틸화 및 발현 수준에 대해 상관관계가 있는 영역과 중첩되었다(도 10).
RNASET2 질병 위험 대립 유전자는 불응성 질병을 갖는 CD 환자에서 RNASET2 발현 감소 및 DNA 메틸화 증가와 연관된다
RNASET2 유전자 변이와 유전자 전사체 발현 수준 사이의 기능적 상관관계를 특성화하기 위해 유전자 발현 양적 형질(eQTL)을 수행하였다. IBD 위험에 대한 질병 관련 SNP 유럽인에서 rs1819333와 한국인에서 rs2149085, 게다가 그레이브스 병과 관련된 위험 SNP, rs9355610는 RNASET2의 전사 개시 부위로부터 -13 kb에 위치한다. RNASET2 IBD 위험 유전자형과 유전자 전사 발현 수준 사이의 기능적 상관관계는 불응성 질병을 갖는 IBD 환자로부터 단리된 비자극 말초 CD3+ T 세포에서 확립되었다. 데이터는 RNASET2 위험 대립 유전자 rs2149085, rs1819333 및 rs9355610을 보유한 대상체의 T 세포에서 RNASET2 발현이 유의하게 감소되었음을 입증하였다(도 11). 이러한 결과는 외과적 절제시 CD 대상체로부터 얻은 염증이 생기지 않은 소장 조직에서 추출한 mRNA에 대해 관찰된 유의한 eQTL로 입증되었다(도 12). RNASET2 유전자 변이와 메틸화의 상관관계인 mQTL도 조사하였다. 불응성 질병을 갖는 CD 환자에서 메틸화의 증가와 함께 유의한 mQTL이 관찰되었다(도 13A 및 13C). 대조적으로, mQTL은 경증 질병을 갖는 CD 환자 또는 NL 대상체로부터 단리된 세포에서는 검출되지 않았다(도 13B 및 13D). 또한, RNASET2 질병 위험 SNP를 보유한 CD 환자와 관련된 복잡한 질병 행태, 협착/관통 표현형(몬트리올 분류 B1 vs. B2 및 B3)의 유의한 증가가 있었다(rs1819333/rs2149085 p = 0.05, rs9355610 p = 0.01).
유전자 발현(eQTL)과 DNA 메틸화(mQTL)는 RNASET2 유전자 좌에 걸친 모든 유익한 정보를 주는 SNP에 맵핑되었다(LD 플롯). 약물 불응성 질병을 갖는 환자로부터 단리된 T 세포에는, 케모카인(C-C 모티프) 수용체 6(CCR6)의 첫 번째 인트론까지 섬유아세포 성장 인자 수용체 1 종양 유전자 파트너(FGFR1OP: fibroblast growth factor receptor 1 oncogene partner)에 걸쳐있는 RNASET2 TSS의 10kb 하류에서 -170 kb 상류까지 강력한 중첩 eQTL과 mQTL이 있다. 마찬가지로, 불응성 질병을 갖는 CD 환자에서 비자극된 말초 T 세포의 RNASET2 발현을 소장 절제와 비교했을 때 eQTL에 중첩이 있었다. 대조적으로, 경증 질병을 갖는 CD 환자 또는 NL 대상체에서 약간의 mQTL 연관성이 검출되었다(도 14A 및 14B). FGFR1OP 또는 CCR6에 대한 eQTL 연관성은 검출되지 않았다. 이 데이터는 약물 불응성 질병을 갖는 CD 환자로부터 단리된 말초 T 세포의 별도의 코호트에서 추가로 입증되었다. CD와 관련된 RNASET2 위험 변이와 상응하는 eQTL 사이에는 유의한 중첩이 있었으며(도 28), 이는 특정 이론에 구애받지 않고서 질병을 매개하는 데 있어 RNASET2의 기능적 역할을 시사한다.
CD에서 RNASET2의 약화된 발현
IBD 발병기전에서 RNASET2의 역할을 확립하기 위해서, IBD 환자로부터 단리 된 CD4+ T 세포에서 RNASET2 발현의 조절을 조사하고 TL1A의 존재 또는 부재 하에서 정상(NL) 공여자와 비교하였다. 도 7에서 알 수 있듯이, NL 공여자는 RNASET2 발현 수준에서 TL1A 매개된 감소를 나타냈으나 IBD 환자는 그러지 않았다. 대신에, RNASET2의 발현 수준 감소는 연간 질병 발적이 없는 환자와 비교하여 더 중증 질병을 갖는 CD 환자(연간 1회 이상의 질병 발적을 나타내는 CD 환자)에서 확인되었다(도 8A 및 8C).
RNASET2 질병 위험 대립 유전자는 복잡하고 내성의 질병 행태과 관련된다
RNASET2와 질병 활성도 및 중증도 사이의 연관성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 외과적 절제을 받고 전향적으로 추적된 564명의 CD 환자들의 코호트를 이용하였다. 수술 적응증을 포함한 임상 특성을 RNASET2 위험 변이(rs1819333 및 rs9355610)와의 연관성에 대해 평가하였다. RNASET2 질병 위험 변이 SNP는 복잡한 협착/관통 표현형(몬트리올 분류 B1 vs. B2 및 B3)과 관련되었다 (표 18). 수술 당시 RNASET2 질병 위험 변이 SNP를 갖는 환자는 전체 질병 중증도에 기인한 특징인 티오푸린 또는 항-TNF 요법의 치료 실패, ANCA 혈청반응 양성(항-TNF 요법에 대한 반응 결여와 관련된 마커), 및 장 절제 길이의 증가와 관련되었다(표 18 및 도 38-39). 스테로이드 또는 설파살라진의 치료 실패에 대한 연관성은 관찰되지 않았다. 또한, 질병 관리를 위해 여러 번의 절제가 필요했던 RNASET2 질병 위험 변이 SNP 환자는 재수술까지 시간 단축을 보였다(도 32).
<표 18>
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마찬가지로, RNASET2 위험 SNP는 더 중증 질병의 재발과 관련되었다. 수술 후 내시경 검사는 수술 후 예방조치를 받지 않은 루트기어츠 점수가 높은(> 2) 환자로 분류된 환자에서 RNASET2 위험 SNP의 연관성을 밝혔다(표 18). 임상 재발에 대한 연관성은 관찰되지 않았다. RNASET2의 발현 감소는 또한 관통 질병 표현형(도 31) 및 ASCA 혈청반응 양성(도 30)과 관련되었다. 특정 이론에 구애받지 않고서, 이 데이터는 복잡하고 내성의 질병 행태를 시사하는 임상 파라미터와 RNASET2 질병 위험 SNP의 연관성을 뒷받침한다.
질병 태깅 SNP를 갖는 LD에서의 RNASET2 변이는 ETS 전사인자 결합 모티프를 파괴한다
상기에 제시된 데이터는 기능성/인과성을 결정하는데 어려움을 일으키는 eQTL 및 mQTL과 관련된, 연관 불평형에 있는 많은, 100개가 넘는 CD RNASET2 위험 변이 사이에 상당한 중첩을 입증한다. CD와 관련된 대부분의 RNASET2 위험 변이가 비코딩 영역에 위치하기 때문에, 이러한 SNP가 조절 기능의 조절을 통해 발현을 변경할 가능성이 있다. 또한, 특정 이론에 구애받지 않고서, 연구는 질병과 관련된 SNP가 대개 질병과 관련된 세포 유형의 활성 인핸서 영역 내에 존재하며 TF 결합 모티프를 파괴할 수 있음을 시사한다. REMC 데이터는 RNASET2 유전자 좌가 추정적인 활성 인핸서 히스톤 변형 및 활성 유전자 발현에 의해 다른 조직과 비해 1차 T 세포에서 현저하다는 것을 입증한다(도 40). RNASET2 발현을 조절하는 분자 경로에 대해 이해하고, 후보가 되는 기능적 SNP의 수를 우선순위화하기 위해, 본 발명자는 모티프 분석을 수행하여 eQTL/mQTL과 관련된 모든 SNP에 걸쳐 TF 모티프 파괴를 예측하였다. T 세포에서 발현된 TF의 모티프를 파괴하는 변이를 선택하였으며, LD에서 RNASET2 질병 지표 SNP rs1819333을 갖는 후보 변이가 주목되었다. 지표 SNP(LD R2=1)로부터 -569 bp에 위치하는 rs2049092 SNP 질병 위험 변이는 대부분의 ETS 전사인자에 의해 이용되는 고도로 보존된 TTCC 모티프 내에 놓여 있으며 TF 결합을 파괴할 것으로 예측된다. 서열 분석은 JUN 결합 부위에 인접한 IRF4 및 Spi1 결합 부위의 중첩을 입증한다(도 36A). 레귤롬 및 REMC 데이터는 활성 인핸서 요소를 나타내는 히스톤 변형과 중첩되는 림프아세포 주에서 ETS1, IRF4 및 Spi1 결합의 TF 점유를 입증한다(도 36B). 더욱이, ETS와 JUN TF의 여러 구성원들과 RNASET2의 발현 사이에는 강한 상관관계가 있다(도 36C와 41). IRF4에 대해서 상관관계는 관찰되지 않았다(도 41). 특정 이론에 구애받지 않고서, 이 데이터는 면역 구획에서 RNASET2 발현의 관련성을 강화하고 RNASET2의 전사 조절에서 ETS 및 JUN 전사인자에 대한 기능적 역할을 뒷받침한다.
RNASET2의 침묵은 ICAM1 발현 및 동형 T 세포 응집의 상향 조절을 통해 IFN-γ 분비를 향상시킨다
siRNA 침묵을 이용하여 IFN-γ 분비 조절에서 RNASET2의 기능적 역할을 시험하였다. CD4+ T 세포를 RNASET2 mRNA를 표적화하는 siRNA로 형질감염시킨 후, TL1A로 자극하였다. RNASET2를 표적화하는 siRNA로 형질감염된 세포는 대조군 siRNA와 비교하여 RNASET2 발현의 60-70% 억제를 나타내었고(도 21A 및 37A), TL1A 매개된 IFN-γ 분비에서 병행한 유의한 상승(> 1.5 배)이 관찰되었다(도 21B 및 도 37B). 특정 이론에 구애받지 않고서, 이 데이터는 RNASET2의 하향 조절이 IFN-γ 발현을 조절한다는 것을 시사한다.
이 과정에 관여하는 신호 전달 경로를 정의하기 위해, 단백질 분석을 수행하였다. IFNγ 분비 및 비분비 T 세포(RNAseq 분석의 데이터)를 비교할 때 RNASET2의 siRNA 침묵 후 발현의 조절 및 TL1A 매개된 차등 발현 모두를 나타내는 것을 기준으로 하여 후보 표적을 선별하였다. 비분비 T 세포와 비교하여 RNASET2 침묵에 반응하여 그리고 IFNγ 분비에서 상향 조절된 단백질 중 하나는 ICAM1이었다(도 42). ICAM1은 최근에 질병 위험 변이와 관련된 유전자 발현이 상향 조절되는 IBD 감수성 유전자 좌로 확인되었다. ICAM1은 혈관 내피 및 백혈구에 의해 일반적으로 발현되는 막 횡단 부착 단백질이다. ICAM가 T 세포 상의 LFA1 수용체에 결합하면 세포-세포 상호작용을 촉진하고 안정화시킨다. 연구는 활성화된 T 세포 상에서 ICAM1의 발현 증가를 입증하였고 동형 T 세포 응집 및 후속 T 세포 분화를 유도하는 데 있어서 ICAM1-LFA1 결합에 대한 역할을 제안하였다. TL1A 매개된 IFN-γ 분비에 대한 세포-세포 접촉의 효과를 조사하기 위해, 평평한 바닥 및 원추형 바닥 마이크로 웰에서 인큐베이션하였다. 세포가 가까운 세포-세포 원추형 기하학적 구조에서 인큐베이션되었을 때 IFN-γ 생산의 3배 이상 증가가 지속적으로 관찰되었다(데이터 미제시). 그 후, 유세포 측정법을 사용하여 TL1A 매개된 IFN-γ 생산 상승이 동형 T 세포 응집에 의해 촉진된다는 가설을 시험하였다. 간략하게, T 세포를 TL1A의 존재 또는 부재하에 자극한 후, 세포 내 IFN-γ(도 37C 및 37D, 좌측 패널)에 대해 항체로 그리고 세포 응집(도 37C 및 37D, 상부 및 오른쪽 아래 패널)에 대해 프로피디움 요오다이드(PI)를 이용하여 염색하였다. PI로 표지된 피크는 단일 세포 vs. 세포 응집체를 식별할 수 있게 하는 사건당 세포의 수에 해당한다. 각 히스토그램의 첫 번째 피크는 단일 세포 사건(검정 괄호)과 다음 피크는 다세포 응집체(회색 괄호)에 해당한다. 비자극된 T 세포의 작은 비율만이 IFN-γ를 분비하엿고, 이들 세포는 단일 세포 사건 및 세포 응집체로 거의 동일하게 분포하였다(도 37E 왼쪽 패널). TL1A 자극 후, 세포 응집체의 비율과 크기 모두(도 37D와 비교하여 도 37C의 오른쪽 위 패널)뿐 아니라 IFN-γ 생산 세포의 전체 수(6배)(도 37E 및 37F)에서 유의한 증가 및 IFN-γ 분비에서 30배 증가(자료 미제시)가 있었다. 대조적으로, IFN-γ를 생산하지 않는 대부분의 T 세포는 이들이 TL1A 자극이 있거나 없이 배양되는지에 관계없이 단일 세포 사건으로 구성된다(도 37E 오른쪽 패널). 특정 이론에 구애받지 않고서, 이 결과는 세포 응집이 IFN-γ를 생산하는 세포 수의 증가와 전체 IFN-γ 생산량의 증가에 기여할 수 있음과, TL1A 자극이 이 과정을 향상시킬 수 있음을 시사한다. ICAM1-LFA1 결합을 통한 세포 응집을 매개하는 TL1A의 기능적 역할을 LFA-1 차단 항체를 사용하여 시험하였다. 도 37G에서 알 수 있는 바와 같이, IgG 대조 항체(p 값 = 0.047)와 비교하여, LFA-1 결합 차단에 반응하여 IFN-γ 분비가 전체적으로 43% 감소하였다. 특정 이론에 구애받지 않고서, 이들 데이터를 종합하면, RNASET2의 TL1A 매개된 하향 조절 및 이에 수반되는 ICAM1 발현의 증가가 동형 T 세포 응집 및 IFN-γ 생산 증대를 촉진한다는 것을 나타낸다. ICAM1의 발현 증가는 CD에서 ASCA 혈청반응 양성 및 항-TNF 및 티오푸린의 수술 전 치료 실패와 관련되었으며(도 43), 임상 파라미터는 RNASET2 및 질병 활성도의 감소와 관련되었음이 주목된다.
실시예 6
201개의 GWAS IBD 감수성 유전자 좌에서 sRNASET2와 TNFSF15 모두를 확인하였다. TNFSF15에 의해 코딩되는 단백질인 TL1A는 점막 염증의 핵심 매개 인자이다. 상승된 TL1A 수준은 TNFSF15 유전자형 및 질병의 중증도와 관련이 있다. 본 발명자들은 TL1A가 T 세포에서 RNASET2의 발현을 하향 조절한다는 것을 확인하였다. TNFSF15와 RNASET2 발현은 CD 환자의 T 세포에서 역 상관관계가 있다(p = 5x10-16). IBD 예후 바이오마커로서의 RNASET2의 가능성을 조사하였다.
수술(n = 21) 및 소장 수술 샘플(n = 85)의 말초 T 세포에서 발현 및 메틸화 양적 형질 유전자 좌(eQTL/mQTL)를 조사하여 IBD에서 RNASET2 질병 관련 SNP의 역할을 분석하였다. 외과적 절제를 받은 CD 환자(n = 584)를 전향적으로 추적하였다. 수술 적응증을 포함한 임상 특성을 RNASET2 위험 변이(rs1819333 및 rs9355610)와의 연관성에 대해 평가하였다.
RNASET2 질병 관련 SNP는 IBD 치료제에 반응하는 환자(n = 16)에 비해 질병 관리를 위해 외과적 개입이 필요한 환자에서 말초 및 점막 조직에서의 RNASET2 발현 감소(eQTL)와 DNA 과메틸화(mQTL)(p <0.001)와 상관관계가 있었다. RNASET2 질병 관련 SNP는 티오푸린(p = 0.02, OR = 1.7) 또는 항-TNF 요법(p = 0.04, OR = 1.59), ANCA 혈청반응 양성(항-TNF 요법에 대하여 반응 결여와 관련된 마커)(p = 0.02, OR = 2.27), 장 절제의 전체 길이 증가(> 30 cm p = 0.004, OR = 2.13/ > 40 cm p = 0.03, OR = 1.96)와 관련되었다. RNASET2 질병 관련 SNP를 갖는 환자는 재수술까지의 시간 단축을 보였다(p = 0.04, z 점수 = 2.16). 루트기어츠 점수가 높은 수술 후 내시경 검사(n = 369)는 수술 후 예방 조치를 받지 않은 환자(p = 0.02, z 점수 = 2.56) 또는 항-TNF 요법 단독 환자(p = 0.03, z 점수 = 2.46)에서 RNASET2 위험 SNP와 관련이 있었지만, 다른 IBD 치료법 환자와의 연관성은 발견되지 않았다.
본 연구는 임상적으로 관련된 질병 행태과 관련된 RNASET2 질병 관련 SNP의 기능적 결과를 확인한다. RNASET2 위험 SNP는 복잡하고 내성의 질병 행태를 시사하는 임상 파라미터와 관련이 있었다. 또한, 수술과 질병의 재발 후 치료법에 대한 반응은 RNASET2 위험 SNP와 관련이 있었다. 특정 이론에 구애받지 않고서, 본 발명잘들의 이전 결과와 종합한 이들 결과는 RNASET2의 조절이 TL1A에 의해 유발된 질병 병리학의 근간을 이루고 대체 치료 방법이 유익할 수 있는 현재 치료 전략에 반응하지 않는 대상체를 확인하는 질병 바이오마커로서 역할을 할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 7
<표 19>
Figure pat00020
<표 20>
Figure pat00021
rs2149092(C-비위험 대립 유전자/T-위험 대립 유전자) 위험 SNP는 IRF4/PU.1/ELF-1 결합 부위를 없앤다. IRF4는 림프구 특이적이며 Th1, Th2, Th9, Th17 및 T reg 서브세트의 분화에 필수적인 IBD 감수성 SNP이다. ELF-1은 일본인 집단에서 CD 감수성 SNP이다. 이는 림프구 세포에서 발현되는 ETS 패밀리의 전사인자로서, 발현의 인핸서 및 억제 인자로서 작용하며, IL2 및 IL23 신호 전달에 관여한다. PU.1은 ETS 패밀리 전사인자이기도 하며 T 세포 발달의 초기 단계에 필수적이다. 이는 점막에서 발견되는 γδ T 세포를 하향 조절하고 선천성 면역에서 역할을 하며, TH9 세포에서 발현될 때 이 세포는 장 상피 세포에서 IL-9 수용체 신호 전달을 통해 T 세포 매개 대장염을 일으킨다.
RNASET2 발현은 IFN-γ 분비 CD4+ T 세포에서 TL1A 처리 후 감소하고 RNASET2의 침묵은 TL1A 매개된 IFN-γ 분비를 상승시킨다. 티오푸린 요법의 치료 실패, 항-TNF 요법의 치료 실패, ANCA 혈청반응 양성, B2/B3 vs. B1(협착/관통 vs. 비관통/비협착) 질병, 장 절제 길이의 증가, 2차 수술까지의 시간 단축, 루트기어츠 점수가 높은 질병의 내시경 검사의 재발을 포함하나 이에 제한되지 않는 RNASET2 질병 관련 SNP에 대해 임상적 상관관계가 확인되었다.
본 발명의 다양한 실시양태는 상기 상세한 설명에 기재되어 있다. 이러한 설명이 상기 실시양태를 직접적으로 설명하지만, 당업자는 본 명세서에 도시되고 기재된 특정 실시양태에 대하여 변형 및/또는 변이를 생각해 낼 수 있음을 이해할 것이다. 이 설명의 이해의 범위 내에 있는 이러한 임의의 변형 또는 변이도 본원에 포함되는 것으로 의도된다. 구체적으로 언급하지 않는 한, 명세서 및 청구의 범위에 있는 단어 및 어구는 적용되는 기술 분야의 당업자에게 통상적이며 익숙한 의미를 부여받는 것이 본 발명자의 의도이다.
본 출원의 출원 당시에 본 출원인에게 공지된 본 발명의 다양한 실시양태에 대한 상기 설명은 예시 및 설명을 목적으로 제시되고 의도된다. 본 설명은 포괄적이지 않으며 본 발명을 개시된 정확한 형태로 제한하지 않는 것으로 의도되며 많은 변형 및 변이가 상기 교시의 견지에서 가능하다. 기재된 실시양태는 본 발명의 원리와 그 실제 적용을 설명하고 당업자가 다양한 실시양태에서 그리고 고려되는 특정 용도에 적합한 다양한 변형을 통해 본 발명을 이용할 수 있게 하는 역할을 한다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 수행하기 위해 개시된 특정 실시양태에 제한되지 않는 것을 의도한다.
본 발명의 특정 실시양태를 보여주고 기재하였지만, 본원의 교시를 기초로 하여 본 발명 및 그의 경계 측면을 벗어나지 않고 변경 및 변형이 이루어질 수 있으며, 첨부된 청구 범위는 본 발명의 진정한 사상및 범위 내에 있는 바와 같은 그러한 모든 변경 및 변형을 그 범위 내에 포함한다는 것이 당업자에게 명백해질 것이다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 용어는 일반적으로 "개방" 용어로 의도된다는 것을 당 업자는 이해할 것이다(예를 들어, "포함하는"이라는 용어는 "포함하지만 이에 제한되지 않는"으로 해석되어야 하고, "갖는"이라는 용어는 "적어도 갖는"으로 해석되어야 하며, "포함한다"는 "포함하지만 이에 제한되지 않는다" 등으로 해석되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> CEDARS-SINAI MEDICAL CENTER GONSKY, Rebecca TARGAN, Stephan R. DEEM, Richard FLESHNER, Phillip MCGOVERN, Dermot P. BILSBOROUGH, Janine <120> METHODS OF DIAGNOSING INFLAMMATORY BOWEL DISEASE THROUGH RNASET2 <130> 065472-000535WO00 <150> 62/309,817 <151> 2016-03-17 <150> 62/457,048 <151> 2017-02-09 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1001 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ctggcatggg ccccaccaag accccatatc tcattccgta ttcacaattt taccttcttg 60 ttcttaaaga aggacatcca aatggaaaag ctctcaaccc cccaaaactt ggatgtgaac 120 ctggagcatc tgtcatctgt cttgttcact acttgtccac ctaccaggat cctaaacgga 180 accctacgta gggaagaggc agtggctgta aaggctggat ttgggtctgg aagccgccca 240 gctttacgaa aacaaagagg gctccagcat caagcaggtg ggcaggggcc agagtgggaa 300 ttacattgac tcacacaaca tagtgtaaaa gggtacaaac tatgaggttt aaaagatgct 360 gctggcttgt atagaaacat gtccttagga gaggggaggg ggacaggatg gcaacagcca 420 tgtctatgaa cagacatcct taaatccttg ttaattctga agagaccaag atactttcac 480 cacacaacct cttcttggca ktagctccag gtttcctgtt tccatgccag cttttgctgg 540 gttatgctac aataatacac cgcccccaaa tctcagtgtc tcacttaaac ggaagttgat 600 catttatcat tcatttgccc 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Claims (34)

  1. 대상체에서 염증성 장 질환(IBD: inflammatory bowel disease)을 진단하는 방법으로서,
    대상체로부터 샘플을 얻는 단계;
    RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재 또는 부재를 결정하는 데 적합화된 분석법을 상기 샘플에 대해 수행하는 단계; 및
    RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재에 기초하여 대상체에서 IBD를 진단하는 단계
    를 포함하는, 대상체에서 염증성 장 질환을 진단하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 염증성 장질환은 크론병, 궤양성 대장염 또는 약물 불응성 궤양성 대장염인 방법.
  3. 제1항에 있어서, RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이는 rs1819333, rs2149092, rs9355610 또는 rs2149085인 방법.
  4. 제1항에 있어서, RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이는 rs1819333, rs2149092, rs9355610, rs2149085, rs1410295 또는 rs9366093인 방법.
  5. 제1항에 있어서, IBD로 진단된 대상체는 티오푸린 및 항-TNF 요법의 치료 실패를 보이는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, IBD로 진단된 대상체는 외과적 개입이 필요하다고 결정되는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 외과적 개입은 장 절제술인 방법.
  8. 제1항에 있어서, RNASET2의 메틸화 수준을 결정하는 단계를 더 포함하며, 메틸화 증가는 대상체가 외과적 개입을 필요로 함을 나타내는 것인 방법.
  9. 치료를 위해 염증성 장 질환을 갖는 대상체를 확인하는 방법으로서,
    RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ의 발현 수준을 결정하는 단계; 및
    치료가 필요한 대상체를 RNASET2의 수준이 감소되고/되거나, TL1A 및/또는 IFN-γ 수준이 증가된 대상체로서 확인하는 단계
    를 포함하는, 치료를 위해 염증성 장 질환을 갖는 대상체를 확인하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 염증성 장질환은 크론병, 궤양성 대장염 또는 약물 불응성 궤양성 대장염인 방법.
  11. 제9항에 있어서, RNASET2의 메틸화 수준을 결정하는 단계, 및 치료가 필요한 대상체를 RNASET2의 메틸화가 증가된 대상체로서 확인하는 단계를 더 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 치료는 외과적 개입인 방법.
  13. 대상체로부터의 생물학적 샘플에 대해, RNASET2, TL1A 및/또는 IFN-γ 발현 수준에 대한 분석을 수행하는 단계; 및
    RNASET2의 발현 감소 및/또는 TL1A 및/또는 IFN-γ의 발현 증가가 발견될 때, 대상체를 IBD로 진단하는 단계
    를 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 염증성 장질환은 크론병, 궤양성 대장염 또는 약물 불응성 궤양성 대장염인 방법.
  15. 제13항에 있어서, RNASET2의 메틸화 수준을 결정하는 단계를 더 포함하며, 메틸화 증가는 대상체가 외과적 개입을 필요로 함을 나타내는 것인 방법.
  16. 대상체로부터의 생물학적 샘플을 평가하여, RNASET2에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재 또는 부재를 결정하는 단계; 및
    RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재가 발견될 때, 대상체를 치료가 필요한 IBD로 확인하는 단계
    를 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 염증성 장질환은 크론병, 궤양성 대장염 또는 약물 불응성 궤양성 대장염인 방법.
  18. 제16항에 있어서, RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이는 rs1819333, rs2149092, rs9355610 및/또는 rs2149085를 포함하는 것인 방법.
  19. 제16항에 있어서, RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이는 rs1819333, rs2149092, rs9355610, rs2149085, rs1410295 및/또는 rs9366093을 포함하는 것인 방법.
  20. 제16항에 있어서, IBD로 확인된 대상체는 티오푸린 및 항-TNF 요법의 치료 실패를 보이는 것인 방법.
  21. 제16항에 있어서, IBD로 확인된 대상체는 외과적 개입이 필요하다고 결정되는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 외과적 개입은 장 절제술인 방법.
  23. 제16항에 있어서, RNASET2의 메틸화 수준을 결정하는 단계를 더 포함하며, 메틸화 증가는 대상체가 외과적 개입을 필요로 함을 나타내는 것인 방법.
  24. 약물 불응성 궤양성 대장염(MR-UC: medically refractive ulcerative colitis)을 진단하는 방법으로서,
    대상체로부터 샘플을 얻는 단계;
    RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재 또는 부재를 결정하는 데 적합화된 분석법을 상기 샘플에 대해 수행하는 단계; 및
    RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재에 기초하여 대상체에서 MR-UC를 진단하는 단계
    를 포함하는, MR-UC를 진단하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이는 rs1819333, rs2149092, rs9355610 또는 rs2149085인 방법.
  26. 제24항에 있어서, RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이는 rs1819333, rs2149092, rs9355610, rs2149085, rs1410295 또는 rs9366093인 방법.
  27. 제24항에 있어서, MR-UC로 진단된 대상체는 티오푸린 및 항-TNF 요법의 치료 실패를 보이는 것인 방법.
  28. 제24항에 있어서, MR-UC로 진단된 대상체는 외과적 개입이 필요하다고 결정되는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 외과적 개입은 장 절제술인 방법.
  30. 제24항에 있어서, RNASET2의 메틸화 수준을 결정하는 단계를 더 포함하며, 메틸화 증가는 대상체가 외과적 개입을 필요로 함을 나타내는 것인 방법.
  31. 염증성 장 질환을 갖는 대상체에 대해 치료법을 선택하는 방법으로서,
    대상체로부터 샘플을 얻는 단계;
    RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재 또는 부재를 결정하는 데 적합화된 분석법을 상기 샘플에 대해 수행하는 단계;
    RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이의 존재에 기초하여 대상체에서 약물 불응성 궤양성 대장염(MR-UC)을 진단하는 단계; 및
    MR-UC로 진단된 대상체에 대해, 치료법으로서 수술을 선택하고 치료법으로서 티오푸린 또는 항-TNF를 선택하지 않는 단계
    를 포함하는, 염증성 장 질환을 갖는 대상체에 대해 치료법을 선택하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이는 rs1819333, rs2149092, rs9355610 또는 rs2149085인 방법.
  33. 제31항에 있어서, RNASET2 유전자에서의 하나 이상의 위험 변이는 rs1819333, rs2149092, rs9355610, rs2149085, rs1410295 또는 rs9366093인 방법.
  34. 제31항에 있어서, RNASET2의 메틸화 수준을 결정하는 단계를 더 포함하며, 메틸화 증가는 대상체가 외과적 개입을 필요로 함을 나타내는 것인 방법.
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