ES2301280A1 - Metodo para diagnosticar la enfermedad de alzheimer. - Google Patents
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Abstract
Método para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer. La presente invención se refiere a un método para diagnosticar y/o pronosticar la enfermedad de Alzheimer mediante la determinación del nivel de expresión de un gen que codifica un marcador lisosomal. (Ver figura)
Description
Método para diagnosticar la enfermedad de
Alzheimer.
La presente invención tiene su campo de
aplicación dentro del sector sanitario, principalmente aquel
relacionado con las enfermedades neurodegenerativas, en concreto
está dirigida a métodos de diagnóstico de la Enfermedad de
Alzheimer.
La enfermedad de Alzheimer (EA) está considerada
como la principal causa de demencia, siendo ésta la cuarta causa de
muerte en países desarrollados (1). Se define como un padecimiento
neurodegenerativo del sistema nervioso central y se caracteriza por
un deterioro progresivo de las funciones cerebrales superiores.
Microscópicamente la EA se caracteriza por la
presencia de placas seniles (difusas y clásicas), ovillos
neurofibrilares, hilos del neurópilo, degeneración neuronal,
depósitos de la proteína \betaA-amiloide,
degeneración gránulo-vacuolar y presencia de cuerpos
de Hirano, entre otras patologías (2).
Para diagnosticar la EA se utilizan unos
criterios clínicos bien establecidos por la cuarta edición del
manual de diagnóstico y estadístico de la sociedad Americana de
Psiquiatría (DSM-IV) (3) o por el Instituto
Nacional de Trastornos Neurológicos, Alteraciones de la
Comunicación, Ictus y Enfermedad de Alzheimer y Enfermedades
Asociadas (NINCDS-ADRDA) (4) (National Institute of
Neurologic, Communicative Disorders and Stroke - Alzheimer's
Disease and Related Disorders Association). Sin embargo, el mayor
dilema de estos estudios clínicos es la certeza diagnóstica.
Actualmente la única manera de confirmar el diagnóstico clínico es
haciendo un análisis post-mortem en tejido
cerebral para encontrar la existencia de placas y ovillos
neurofibrilares.
En los últimos años, se han estudiado distintos
marcadores genéticos para su aplicación en el diagnóstico de EA
como son:
- -
- determinación de mutaciones en el gen de la proteína precursora amiloide (PPA), mutaciones en el gen de la presenilina-1 (PSI) y presenilina-2 (PS2), únicamente válidos para un número reducido de casos de EA de aparición precoz o familiar (5).
- -
- valor genético del genotipo ApoE, que se determina tan sólo en aquellos casos en los que se cumplen los criterios clínicos de EA probable, el problema es que da un número elevado de falsos positivos.
Además de estos marcadores genéticos, existen
marcadores bioquímicos como:
- -
- la proteína Tau: esta proteína se determina mediante anticuerpos neuronales capaces de detectar la tau en el líquido cefalorraquídeo, sin embargo los niveles de tau en EA no guardan relación con la edad, sexo, evolución de la enfermedad, ni con el grado de demencia, además de detectarse niveles elevados de tau en otras patologías como meningitis, infiltraciones meníngeas, demencias frontales y Creutzfeldt-Jacob.
- -
- la proteína \betaA-amiloide: esta proteína carece de utilidad diagnóstica en las formas esporádicas de la EA (6).
Actualmente no se dispone todavía de ningún
instrumento diagnóstico escasamente invasivo y con adecuada
sensibilidad, especificidad y valor predictivo para la Enfermedad
de Alzheimer. Además esta enfermedad conlleva un enorme coste social
debido, entre otros, a la incapacidad de los pacientes de valerse
por sí mismos, por lo que existe la necesidad de un método de
diagnóstico fiable mediante marcadores que permita prevenir la
enfermedad, mejorar el tratamiento y pronosticar la evolución de la
enfermedad.
La presente invención proporciona un método para
el diagnóstico y/o pronóstico de la Enfermedad de Alzheimer
mediante la determinación del nivel de expresión de un gen que
codifica un marcador lisosomal. El marcador lisosomal es
preferiblemente Lamp-1 o
Lamp-2.
Un aspecto particular de la invención lo
constituye un método para el diagnóstico y/o pronóstico de la
Enfermedad de Alzheimer mediante la determinación del nivel de
expresión de un gen que codifica un marcador lisosomal en una
muestra biológica y la comparación de dicho nivel con un valor de
referencia, donde la alteración de dicho nivel es indicativo de la
Enfermedad de Alzheimer y del estadio de dicha enfermedad.
"Valor de referencia" en la presente
invención designa unos niveles de mRNA y de proteína codificada por
el gen marcador lisosomal presentes en un individuo sano que no
sufre EA ni otras enfermedades que afecten a los niveles de mRNA ni
de proteína codificada por el gen marcador lisosomal.
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención, el gen que codifica el marcador lisosomal es
preferiblemente Lamp-1 o Lamp-2.
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención, la muestra biológica comprende un tejido,
preferentemente dicho tejido es un homogeneizado de tejido,
preferiblemente el homogeneizado de tejido se obtiene a partir de
células de tejido nervioso o células neuroendocrinas
periféricas.
De acuerdo con otra realización preferida de la
invención, la muestra biológica es un fluido biológico,
preferentemente dicho fluido biológico comprende líquido
cefalorraquídeo, sangre o suero.
De acuerdo con una realización preferida de la
invención, la determinación del nivel de expresión del gen que
codifica un marcador lisosomal se realiza mediante el análisis de la
cantidad de RNA codificado por dicho gen o fragmentos del mismo. El
gen que codifica el marcador lisosomal es preferiblemente
Lamp-1 o Lamp-2.
Preferentemente, el análisis de la cantidad de
RNA codificado por dicho gen o fragmentos del mismo se realiza
mediante amplificación, utilizando oligonucleótidos específicos para
PCR, SDA o cualquier otro método de amplificación de cDNA que
permita una estimación cuantitativa de los niveles del trascrito
del marcador lisosomal.
Preferentemente, el análisis de la cantidad de
RNA codificado por dicho gen o fragmentos del mismo se realiza
mediante biochips de DNA realizados con oligonucleótidos
depositados por cualquier mecanismo conocido por un experto medio en
la materia o sintetizados in situ mediante fotolitografía o
mediante cualquier otro mecanismo conocido por un experto medio en
la materia.
De acuerdo con una realización preferida de la
invención, la determinación del nivel de expresión del gen que
codifica un marcador lisosomal se realiza mediante el análisis de la
cantidad de proteína codificada por dicho gen o fragmentos de la
misma. El gen que codifica un marcador lisosomal es preferiblemente
Lamp-1 o Lamp-2.
Preferentemente, el análisis de la cantidad de
proteína codificada por dicho gen o fragmentos de la misma se
realiza mediante Western-blot.
Preferiblemente, el análisis de la cantidad de
proteína codificada por dicho gen o fragmentos de la misma se
realiza mediante chips de proteína utilizando anticuerpos o
fragmentos de anticuerpos específicos contra el marcador lisosomal o
mediante perfiles proteicos realizados por espectrometría de masas
o por cualquier otro mecanismo que permita una estimación
cuantitativa de los niveles de proteína o del marcador
lisosomal.
Preferiblemente, el análisis de la cantidad de
proteína codificada pro dicho gen o fragmentos de la misma se
realiza mediante técnicas inmunohistoquímicas.
De acuerdo con una realización preferida de la
invención, la determinación del nivel de expresión del gen que
codifica un marcador lisosomal se realiza mediante análisis de
imagen.
De acuerdo con una realización preferida de la
invención, la determinación del nivel de expresión del gen que
codifica un marcador lisosomal se realiza mediante análisis de
imagen a partir de la cuantificación sobre imágenes
inmunohistoquímicas. Ejemplos de métodos de cuantificación
incluyen, pero no se limitan a, morfometría, densitometría e
intensidad de fluorescencia.
Un aspecto particular de la invención lo
constituye un kit para el diagnóstico y/o pronóstico de la
Enfermedad de Alzheimer que comprende los reactivos necesarios para
llevar a cabo la determinación del nivel de expresión de un gen que
codifica un marcador lisosomal, preferiblemente para determinar el
nivel de expresión de Lamp-1 o
Lamp-2. El kit permite llevar a cabo el método
según la invención que se acaba de describir.
Preferiblemente el kit para el diagnóstico y/o
pronóstico de la Enfermedad de Alzheimer comprende los reactivos
necesarios para la determinación del nivel de RNA codificado por el
gen marcador lisosomal. Preferentemente comprende los reactivos
necesarios para la determinación del nivel de RNA codificado por el
gen marcador lisosomal mediante amplificación.
Preferiblemente el kit para el diagnóstico y/o
pronóstico de la Enfermedad de Alzheimer comprende los reactivos
necesarios para la determinación del nivel de RNA codificado por el
gen marcador lisosomal. Preferentemente comprende los reactivos
necesarios para la determinación del nivel de RNA codificado pro el
gen marcador lisosomal mediante biochips de DNA.
Preferiblemente el kit para el diagnóstico y/o
pronóstico de la Enfermedad de Alzheimer comprende los reactivos
necesarios para la determinación del nivel de proteína codificada
por el gen marcador lisosomal. Preferentemente comprende los
reactivos necesarios para la determinación del nivel de proteína
codificada por el gen marcador lisosomal mediante
Western-blot.
Preferiblemente el kit para el diagnóstico y/o
pronóstico de la Enfermedad de Alzheimer comprende los reactivos
necesarios para la determinación del nivel de proteína codificada
por el gen marcador lisosomal. Preferentemente comprende los
reactivos necesarios para la determinación del nivel de proteína
codificada por el gen marcador lisosomal mediante chips de
proteína.
Preferiblemente el kit para el diagnóstico y/o
pronóstico de la Enfermedad de Alzheimer comprende los reactivos
necesarios para la determinación del nivel de proteína codificada
por el gen marcador lisosomal. Preferentemente comprende los
reactivos necesarios para la determinación del nivel de proteína
codificada por el gen marcador lisosomal mediante técnicas
inmunohistoquímicas.
De acuerdo con una realización preferida de la
invención la determinación del nivel de expresión de un gen que
codifica un marcador lisosomal se realiza mediante una sustancia
indicadora que se une específicamente al RNA o a la proteína
codificados por dicho gen.
"Sustancia indicadora" en la presente
invención se refiere a un anticuerpo, un anticuerpo monoclonal, un
oligonucleótido, una macromolécula, una molécula orgánica o, en
general, cualquier sustancia que pueda unirse específicamente al
RNA o a la proteína codificados por el gen que codifica un marcador
lisosomal. Dicha sustancia indicadora comprende un marcaje que
puede ser un enzima, un radioisótopo, un colorante, un compuesto
fluoresecente, un compuesto quimioluminiscente, un compuesto
bioluminiscente, un quelato metálico o, en general, cualquier
marcaje conocido en el estado de la técnica que pueda detectarse
mediante un método de detección.
Un aspecto particular de la invención lo
constituye un kit para el diagnóstico y/o pronóstico de la
Enfermedad de Alzheimer que comprende los reactivos necesarios para
llevar a cabo la determinación del nivel de expresión del gen que
codifica un marcador lisosomal que comprende una composición que
contiene una sustancia indicadora que se une específicamente al RNA
o a la proteína codificados por dicho gen, donde dicha sustancia
indicadora está marcada con un marcador detectable y un líquido
fisiológicamente aceptable.
Un aspecto particular de la invención lo
constituye el uso de al menos un gen que codifica una marcador
lisosomal seleccionado entre Lamp-1 y
Lamp-2, como marcador genético para el diagnóstico
de la Enfermedad de Alzheimer.
Otros aspectos de la invención se harán
aparentes para el experto medio en la materia.
Figura 1: A: Amplificación de
Lamp-1 usando diluciones sucesivas de RNA de
cerebros humanos control. La línea horizontal representa la línea
umbral ajustada manualmente en la fase exponencial. La intensidad
de fluorescencia incrementa con el aumento de los ciclos PCR. El
número de ciclos PCR en los cuales la intensidad de fluorescencia
excedió la línea umbral se definió como el valor de CT en el cual
se basó la cuantificación relativa. B: Curvas estándar
representativas para \beta-actina y
Lamp-1 construidas a partir de varias
concentraciones de RNA de cerebros humanos control. Los valores CT
(eje Y) frente al logaritmo de la concentración de RNA de las
muestras control (eje X) mostraban una correlación lineal
inversa.
Figura 2: A: Niveles de mRNA de
Lamp-1 (media \pm SEM) en la corteza frontal de
las muestras control (C, n = 4), seis casos de EA estadios
I-IIA/B (según Braak and BraaK) (ADI, n = 6), y
cinco casos de EA estadios V-VIC (ADV, n = 5). Los
niveles de mRNA de Lamp-1 fueron normalizados con
\beta-actina.
B: Niveles de mRNA de Lamp-1
normalizados con \beta-actina y GUS en la corteza
frontal de una única muestra (3 h
post-mortem). Las muestras fueron congeladas
directamente en nitrógeno líquido (0 h) o dejadas a temperatura
ambiente durante 3, 6 o 22 horas y luego congeladas en nitrógeno
líquido. No hay degradación aparente del mRNA hasta las 22 h.
*p<0.05 comparada con las muestras control (ANOVA con
post-hoc LSD test).
Figura 3: Lamp-1
(aproximadamente 125 KDa) tal y como se detectó mediante Western
Blot en homogenizados de la corteza frontal (área 8). La
\beta-actina es utilizada como control de carga
de proteína. La imagen es representativa de todas las muestras
indicadas en la Tabla I. Los análisis densitométricos de los niveles
de proteína Lamp-1 (media \pm SEM) fueron
realizados con el software TotalLab v2.01. Los valores de proteína
Lamp-1 se normalizaron con
\beta-actina ***p<0.001 comparados con las
muestras control (ANOVA con post-hoc LSD
test); n.s.; diferencias no significativas cuando se comparó con
los controles.
Figura 4: Análisis de la imagen de la
inmunorreactividad Lamp-1 en la corteza frontal
(A-E) y en hipocampo (F) en control (A, B) y en los
casos EA (estadios VC) (C-F). Se encontró una
inmunorreactividad Lamp-1 moderada en el citoplasma
de neuronas con EA. Los ovillos neurofibrilares no se tiñeron con
anticuerpos Lamp-1 (D, E). Las neuronas con
degeneración granulovacuolar presentaban una inmunorreactividad
Lamp-1 fuerte. A y C línea en C = 50 \mum. B,
D-F, línea en F = 25 \mum.
Figura 5: El análisis de imagen de la
inmunorreactividad Lamp-1 indicó que se localizaba
además de en las neuronas, en el proceso celular que rodea los
depósitos amiloides en las placas seniles
(A-D).
Línea = 50 \mum.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Figura 6: Análisis de imagen de la
inmunofluorescencia de doble marcaje para Lamp-1
(A, D) y para Tau-Fosforilada (anticuerpo AT8, B,
E), en EA (superposición C y F). La mayoría de las neuronas con
depósitos de proteína Tau-fosforilada muestran una
baja expresión de Lamp-1, mientras que sólo algunas
neuronas con una inmunorreactividad Lamp-1 fuerte
presentan depósito de proteínas Tau-fosforilada (A,
B, y D, E). Las secciones control teñidas únicamente con
anticuerpos secundarios fueron negativas (G-I).
Figura 7: Análisis de imagen de la
inmunofluorescencia de doble marcaje para Lamp-1
(A, D, G) y para \betaA-amiloide (B, E, H), y
microscopia confocal (superposición C, F). Se encontraron depósitos
inmunoreactivos Lamp-1 alrededor de las placas
amiloides (A-C). La inmunorreactividad
Lamp-1 aparece con condensación
\betaA-amiloides en las placas seniles. Pocos o
ningún perfil inmunoreactivo Lamp-1 aparecen en las
placas difusas (D-F), mientras que el proceso
inmunoreactivo Lamp-1 incrementa en las placas con
núcleos amiloides (G-I). Las secciones control
teñidas únicamente con anticuerpos secundarios fueron negativas
(J-L).
Figura 8: A: Niveles de proteína
Lamp-1, analizados por Western blot, en la corteza
cerebral en el caso de EA con encefalitis tras la inmunización con
péptido \betaA. No se observaron diferencias en los niveles de
expresión cuando se compararon con EA estadio
V-VI/C.
B: El análisis de imagen de la
inmunorreactividad Lamp-1 indicó que principalmente
aparecía en las células microgliales que rodean los depósitos
colapsados amiloides (A-C) y en células gigantes
multinucleadas (D-F), siendo el resultado de la
fagocitosis de los restos \betaA-amiloide.
A y B, línea en B = 50 \mum,
C-F, línea en F = 25 \mum.
Figura 9: Análisis de imagen de la
inmunofluorescencia de doble marcaje para Lamp-1
(A, D) y para CD68 (B, E), y microscopia confocal (superposición, C,
F) en el caso EA con encefalitis tras la inmunización con el
péptido \betaA. Se encontró inmunorreactividad
Lamp-1 en células microgliales y en células
gigantes multinucleadas (A-F). Las secciones control
teñidas únicamente con anticuerpos secundarios fueron negativas
(G-I).
La presente invención proporciona un método de
diagnóstico y/o pronóstico de la enfermedad de Alzheimer de forma
sencilla y fiable, de gran importancia para un diagnóstico temprano
de la enfermedad y para valorar la evolución del paciente con
EA.
Se realizó un experimento en el que se
compararon los niveles de expresión del mRNA de
Lamp-1 y de la proteína en muestras cerebrales de
pacientes con EA y muestras cerebrales control.
Las muestras de cerebro se obtuvieron por
autopsia de 11 pacientes con EA y 4 controles. Se pidió el
consentimiento informado de los pacientes o de sus familiares y el
estudio fue aprobado por los comités de ética.
El tiempo entre la muerte y el procesamiento del
tejido fue de 2-10 horas. La mitad del cerebro fue
cortado en secciones coronales de 1 centímetro de espesor, y se
congelaron en hielo seco a -80ºC hasta su uso.
Para los exámenes morfológicos, los cerebros
fueron fijados por inmersión en un tampón de formalina al 10%
durante dos o tres semanas.
El estudio neuropatológico fue llevado a cabo en
secciones de parafina sin cera de 4 \mum de espesor del frontal
(área 8), motor primario, sensor primario, parietal, temporal
superior, temporal inferior, cingulado anterior, insular anterior y
córtice primario y asociativo visual; cortex entorinal e hipocampo;
caudado, putamen y pallidum; tálamo medio y posterior; subtálamo;
núcleo de Meynert; amígdala; mesencéfalo, pons y bulbo; y cortex
cerebelar y núcleo dentado.
Las secciones fueron teñidas con hematoxilina y
eosina, azul oscuro luxol con el método Klüver Barrera y para
inmunohistoquímica de las proteínas ácidas de las fibras gliales,
CD 68 y lecitina de tomate para microglia,
\betaA-amiloide, pan-tau, tau
fosforilada específicamente Thrl8l, Ser202, Ser214, Ser262, Ser396
y Ser422 y \alphaB-cristalina,
\alpha-sinucleína y ubiquitina.
Los estados de AD fueron establecidos de acuerdo
con la carga de depósito amiloide y según la patología
neurofibrilar siguiendo la clasificación de Braak and Braak (7):
Estado A: depósitos iniciales en el neocortex
basal
Estado B: depósitos extendidos en áreas
asociadas a neocortex
Estado C: fuertes depósitos en todo el
cortex
I-II: estados patología
neurofribrilar en transentorinal
III-IV: límbico
V-VI: neocortical
\global\parskip1.000000\baselineskip
6 pacientes fueron catalogados como AD
I-IIA/B, y 5 como AD V-VIC. Los
principales datos clínicos y neuropatológicos están resumidos en la
Tabla 1. Estos pacientes no presentaron ninguna patología asociada
(vasculares, sinucleinopatías). Se incluyó en el estudio el cerebro
de un caso de AD que presentó encefalitis post inmunización con
péptido amiloide (11) con propósitos comparativos.
Además se incluyeron muestras de corteza frontal
de un control individual, estas muestras se obtuvieron a las 3
horas post-mortem unas fueron congeladas
inmediatamente y otras se almacenaron a 4ºC durante 3 horas, 6 y 22
horas y después se congelaron para limitar el retraso variable
post-mortem en los tejidos procesados y su
efecto en la preservación del mRNA de Lamp-1.
Una vez preparadas las muestras, se procedió a
la determinación tanto del mRNA de Lamp-1 como de
la proteína, y se realizaron estudios bioquímicos,
inmunohistoquímicos y microscópicos como se describe en los
ejemplos. Las muestras de cerebros control y enfermos fueron
procesados en paralelo. Los resultados de estos estudios demuestran
que existe un incremento de los niveles de expresión del mRNA de
lamp-1 y de la proteína en la corteza cerebral en
estadios de EA avanzados. Además Lamp-1 está
localizado en el citoplasma de las neuronas y en neuritas
distróficas que rodean las placas seniles.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar
pero no limitar la presente invención.
El RNA total se aisló usando Trizol Reagent®
(Life Technologies) seguido por RNeasy Protect Mini Kit (Qiagen).
Los tejidos cerebrales humanos congelados fueron directamente
homogenizados en 1 ml de Trizol por 100 mg de tejido. El RNA total
fue extraído siguiendo el protocolo sugerido por el proveedor. A
continuación el RNA total purificado se resuspendió en 100 \mul
de agua libre de RNasa, el mRNA se purificó siguiendo el protocolo
de RNeasy Protect Mini Kit con mínimas modificaciones. El
tratamiento con DNasa se descartó debido a la eliminación del DNA
genómico durante la extracción con Trizol. La concentración de cada
muestra se midió a A_{260}, y se confirmó la integridad del RNA
mediante electroforesis en gel
formaldehído-agarosa.
A continuación se realizó la síntesis de cDNA y
PCR TaqMan. Para cada 100 \mul de reacción de transcripción
reversa, se mezclaron 2 \mug de RNA humano con hexámeros random
2.5 \muM, buffer RT TaqMan 1x, 5.5 mM MgCl_{2}, 500 \muM de
cada dATP, dTTP, dCTP y dGTP, 0.4 U/\mul de inhibidor de RNasa y
1.25 U/pl de transcriptasa reversa MultiScribe (Applied
Biosystems). Las reacciones se llevaron a cabo a 25ºC durante 10
minutos para maximizar la unión del RNA molde al cebador, seguido
de 30 min. a 48ºC y después por incubación durante 5 min. a 95ºC
para desactivar la transcriptasa reversa. Para comprobar el grado
de contaminación por DNA genómico, se realizaron reacciones
paralelas para cada muestra de RNA en ausencia de transcriptasa
reversa MultiScribe.
La sonda TaqMan (Applied Biosystems) se une a la
hebra de DNA molde entre los cebadores directo y reverso. La sonda
contiene un colorante indicador que es liberado por la Taq
polimerasa durante la amplificación, por lo que la fluorescencia
originada será proporcional a la cantidad de producto
acumulado.
Como controles internos se utilizaron la
\beta-actina y la
\beta-glucuronidasa (GUS). Los cebadores y las
sondas fluorescentes específicas para Lamp-1, GUS y
\beta-actina se adquirieron de
Taq-Man Gene Expression Assays (Applied
Biosystems).
Los ensayos TaqMan PCR para
Lamp-1 y para los controles internos se realizaron
por triplicado sobre muestras de cDNA en placas de 96 pocillos
sobre un sistema ABI Prism 7700 Sequence Detection (PE Applied
Biosystem). Por cada 20 \mul de reacción TaqMan, 9 \mul de cDNA
(diluido 1/50, correspondiente aproximadamente a 4 ng de RNA) fue
mezclado con 1 \mul 20x TaqMan Gene Expression Assays y 10 \mul
de 2x TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystem). Se
llevaron a cabo ensayos paralelos para cada muestra usando
cebadores y sondas con \beta-actina y GUS para la
normalización. La reacción fue llevada a cabo usando los siguientes
parámetros: 50ºC durante 2 minutos, 95ºC durante 10 minutos y 40
ciclos a 95ºC durante 15 segundos y 60ºC durante 1 minuto. Las
curvas estándar fueron preparadas para Lamp-1 y
para cada control interno usando diluciones en serie de muestras
control de RNA humano. Finalmente los datos TaqMan PCR fueron
capturados usando el Sequence Detector Sotware (SDS versión 1.9;
Applied Biosystem).
El incremento de los niveles de mRNA de
Lamp-1 fueron confirmados mediante ensayos PCR
TaqMan con las muestras de cerebro control y con EA. EL ABI 7700
mide la acumulación de fluorescencia de los productos PCR por
monitorización continua del umbral del ciclo (Ct) que es un valor
arbitrario asignado manualmente a un nivel por encima de la línea
de base, en la fase exponencial de la PCR donde no hay ningún
componente limitante. El valor Ct establece el punto en el que la
amplificación de la muestra cruza el umbral (Figura 1A). Para cada
muestra, la cantidad de diana y de controles internos se
determinaron a partir de las curvas estándar que fueron trazadas
mostrando el Ct (Y) frente al log de los ng de RNA control total. La
cantidad de cada diana Lamp-1 fue dividida por la
cantidad de los controles internos para obtener un valor de diana
normalizado que permitió la determinación de los niveles relativos
de mRNA de Lamp-1 en las muestras control y en las
muestras patológicas. Los niveles de los controles internos usados
para normalizar los valores de mRNA de Lamp-1 no
estaban modificados en las muestras patológicas en comparación con
los controles y además eran similares entre las distintas
patologías.
Los resultados mostraron un incremento relativo
de los niveles del mRNA de Lamp-1 en la corteza
frontal en EA perteneciente a los estados V-VIC
cuando se compararon con los controles: p<0.05, ANOVA con el
test LSD (post-hoc Fisher's least significant
difference) (Figura 2A). Los niveles de mRNA de
Lamp-1 en la corteza frontal, no estaban modificados
en los estadios tempranos de EA (Estados I-TIA/B)
(Figura 2A) en comparación con los valores control.
Las muestras congeladas de corteza frontal (área
8, 100 mg) fueron directamente homogeneizadas en 1 ml de tampón de
Tisis (20 mM Hepes, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl_{2}, 1 mM EDTA, 1 mM
EGTA, 1 mN DDT, 2 mM PMSF, 1 \mug/ml aprotinina, leupeptina y
pepstatina) y sometidos a sonicación. Los lisados se centrifugaron a
5.000 rpm durante 10 minutos a 4ºC y se determinó la concentración
de proteínas mediante el método BCA (Pierce). 50 \mug de
proteínas totales se sometieron a 95ºC y a continuación se cargaron
en geles SDS-poliacrilamida con un tampón de
elución Tris-glicina.
Las proteínas fueron sometidas a electroforesis
usando un sistema Mini-Protean
(Bio-Rad) y transferidas a membranas de
nitrocelulosa (Bio-Rad) con un Mini Trans Blot
electrophoresis transfer cell (Bio-Rad) durante 1
hora a 100 V. Las membranas de nitrocelulosa fueron bloqueadas con
Tween 20 TBS (TBST), que contenía el 5% de leche desnatada, durante
30 minutos. A continuación las membranas se incubaron a 4ºC durante
toda la noche con uno de los anticuerpos primarios en TBST con 3% de
BSA. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anticuerpo
anti-Lamp-1 (H-228,
sc-5570, Santa Cruz) dilución 1:1000, anticuerpo
anti-\beta-actina (clon
AC-74, Sigma) dilución 1:5000. Después de la
incubación con el anticuerpo primario, las membranas se lavaron tres
veces con TBST durante 5 minutos a temperatura ambiente y a
continuación se incubaron con anticuerpos anti-IgG
de conejo y de ratón marcados con peroxidasa de rábano (Dako)
dilución 1:1000 (1:5000 para \beta-actina)
durante una hora a temperatura ambiente. Posteriormente las
membranas se lavaron 4 veces, 5 minutos cada vez con TBST a
temperatura ambiente y reveladas con el sistema por
quimioluminiscencia ECL Western blotting system
(Amersham/Pharmacia) a continuación se expusieron las membranas a
películas autorradiográficas (Hyperfilm ECL, Amersham).
La cuantificación densitométrica de las bandas
de Western Blot se realizó mediante el software TotalLab v2.01.
Para el análisis estadístico se utilizó el software Statgraphics
Plus v5.
Los resultados mostraron que los niveles de
proteína Lamp-1, al igual que los niveles de mRNA
de Lamp-1, estaban aumentados en la corteza frontal
en los estadios de EA V-VIC (p<0.001, ANOVA con
el test LSD), pero no estaban aumentados en los estadios de EA
tempranos I-IIA/B en comparación con las muestras
control (Figura 3).
Las secciones sin cera de 5 \mum de espesor de
la corteza frontal, hipocampo y corteza entorinal se procesaron
para la inmunohistoquímica siguiendo el método
estreptavidina-biotina peroxidasa (LSAB). Después de
la incubación con metanol y H_{2}O_{2} en PBS y suero normal,
las secciones se incubaron con anticuerpo
anti-Lamp-1 (Santa Cruz) en una
dilución 1:100. Después de la incubación con el anticuerpo primario,
las secciones se incubaron con LASB durante 15 minutos a
temperatura ambiente. La reacción peroxidasa se visualizó con
diaminobenzidina y H_{2}O_{2}. El control de la inmunotinción
incluyó la omisión del anticuerpo primario, no se obtuvo señal
siguiendo la incubación con el anticuerpo secundario
exclusivamente. Las secciones fueron ligeramente teñidas con
hematoxilina.
La inmunorreactividad moderada de
Lamp-1 caracterizada por pequeños gránulos
citoplasmáticos, se encontró en neuronas y células microgliales en
muestras control (Figura 4A, B), mientras que en neuronas
corticales en EA, se encontró un incremento de la
inmunorreactividad de Lamp-1 (Figura 4C).
Curiosamente, este incremento no estaba asociado a la patología NFT
en neuronas individuales, ya que no se encontró inmunorreactividad
de Lamp-1 en los ovillos (Figura 4D, E). También se
encontró un incremento de la inmunorreactividad
Lamp-1 en neuronas con degeneración granulovacuolar
en el hipocampo (Figura 4F), y una fuerte inmunorreactividad de
Lamp-1 en las células de las placas neuríticas
(Figura 5), siendo limitada en la corteza frontal de EA estadios
I-IIB (caso 8), pero fue muy visible en la corteza
frontal de EA estadios V/VIC.
Las secciones sin cera de la corteza frontal
fueron teñidas con una solución saturada de negro sudan B (Merck)
durante 30 minutos para bloquear la autofluorescencia de los
gránulos de lipofuscina presentes en los cuerpos de las neuronas,
aclarados en etanol al 70% y lavados con agua destilada. Las
secciones fueron incubadas a 4ºC durante toda la noche con un
anticuerpo policlonal anti-Lamp-1 de
ratón (Santa Cruz) usando una dilución 1:100 y el anticuerpo
monoclonal \betaA-amiloide (Dako) dilución 1:50,
anticuerpo anti-AT8 de ratón (Innogenetics, Gent)
dilución 1:50, o CD68 (Dako) dilución 1:100. A continuación las
secciones se lavaron en PBS, y se incubaron en oscuridad con el
cóctel de anticuerpos secundarios y diluidos en la misma solución
transportadora que los anticuerpos primarios durante 45 minutos a
temperatura ambiente. Los anticuerpos secundarios fueron: Alexa488
de conejo (verde) y Alexa 546 de ratón (rojo) (ambos de Molecular
Probes, OR) en dilución 1:400. Después del lavado con PBS las
secciones fueron montadas en medio Immuno Fluore mounting (ICN
Biomedicals, Barcelona) selladas y secadas toda la noche. Las
secciones fueron examinadas con el microscopio confocal Leica
TCS-SL.
La ausencia de co-localización
de la expresión de Lamp-1 y degeneración
neurofibrilar, tal como se puso de manifiesto con el anticuerpo
AT8, fue también demostrado con inmunofluorescencia de doble
marcaje y microscopia confocal. Las neuronas que mostraban una
inmunorreactividad fuerte Lamp-1, presentaban unos
depósitos bajos de la proteína tau-fosforilada
inmunoreactiva, mientras que las neuronas de las placas
neurofibrilares mostraban una inmunorreactividad baja
Lamp-1 (Figura 6).
La fuerte inmunorreactividad asociada a las
placas estaba restringida al proceso celular que rodeaba las zonas
centrales del amiloide, tal como fue revelado en las secciones
inmunoteñidas con Lamp-1 y
\betaA-amiloide. La inmunorreactividad de
Lamp-1 fue raramente observada en asociación con
las placas difusas, aunque aparece un poco de inmunorreactividad en
procesos de condensación de la (3A-amiloide (Figura
7).
Inmunorreactividad de Lamp-1 en
EA con encefalitis tras inmunización con \betaA.
Pacientes EA con encefalitis tras inmunización
con \betaA mostraron una carga amiloide cerebral reducida
comparados con enfermos EA convencionales, una reducida o ausente
tau-fosforilada en el resto de las placas y una
marcada activación de la microglia y en células gigantes
multinucleadas con restos \betaA-amiloide (13).
Los niveles de expresión en Western blot fueron similares en este
caso a los EA convencionales (Figura 8A).
Sin embargo, en línea con las observaciones
neuropatológicas, la inmunoreactividad lamp-1 se
encontró en células microgliales que rodean las placas
\betaA-amiloides densas y en células gigantes
multinucleares (Figura 8B).
Las pruebas de expresión de
Lamp-1 fueron comprobadas pro inmunofluorescencia de
doble marcaje Lamp-1 y CD68, usado como marcador de
microglia y células gigantes multinucleadas examinándolas con
microscopio confocal (Figura 9).
Los datos muestran un aumento de
Lamp-1, en la corteza cerebral en los casos de EA,
cuyo mRNA y niveles de proteína se incrementan con la progresión de
dicha enfermedad. Técnicas inmunohistoquímicas, inmunofluorescencia
de doble marcaje y microscopio confocal mostraron una localización
de Lamp-1 predominantemente en neuritas que rodean
las placas amiloides. Las hidrolasas lisosomales se localizaron en
pericarion y dendritas proximales en neuronas corticales de
cerebros EA, y en niveles altos en las placas seniles (8, 9).
Existen varios estudios que sugieren que las
perturbaciones lisosomales promueven el depósito
\betaA-amiloide en los cerebros EA (10, 15) y que
las mutaciones en la presenilina están asociadas con una patología
lisosomal neuronal acelerada (17). La expresión de
Lamp-1 está más relacionada con las neuritas
distróficas de las placas seniles que con los depósitos difusos
amiloides, aunque el proceso de inmunorreactividad de
Lamp-1 también ocurre en las placas corticales
difusas, en cerebelo y placas difusas estriatales (9). En esta
línea, hay que anotar que las dendritas y sinapsis en EA contienen
el número de lisosomas incrementado (12).
La catepsina D se ha implicado también en la
degradación de la proteína Tau, sugiriendo un papel de los
lisosomas en la degradación del ovillo neurofibrilar en EA (13). En
relación a esto, ratones transgénicos con triple mutación en la
proteína Tau, muestran un incremento en el número de lisosomas que
muestran una morfología aberrante, así como un depósito de Tau
hiperfosforilada en neuronas corticales y del hipocampo (14). Estos
datos sugieren que las anormalidades lisosomales pueden ser causa de
la degeneración en neuronas con depósitos de Tau
hiperfosforilada.
Los resultados muestran una relación inversa
entre la expresión de Lamp-1 y el depósito de Tau
hiperfosforilada en neuronas corticales con ovillos neurofibrilares
en EA, aunque se encontró una inmunorreactividad marcada en las
neuronas con degeneración granulovacuolar.
El estudio del caso de EA con encefalitis tras
la inmunización con \betaA muestra datos relevantes. Estudios
neuropatológicos en un limitado número de casos muestran una
reducida carga amiloide y placas amiloides disminuidas junto con una
activación de la microglia y con la presencia de células gigantes
multinucleadas llenas de restos amiloides; la proteína Tau
hiperfosforilada no se observó en placas colapsadas, aunque las
neuronas con ovillos neurofibrilares no están afectadas (11, 16). La
inmunoreactividad Lamp-1 no se encontró en el
proceso neuronal tras la inmunización con \betaA, pero si se
encofró en células microgliales activadas y en células gigantes
multinuceladas que contenían restos amiloides y celulares.
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pathology". J. Neuropathol. Exp. Neurol. 63 (2004)
821-830.
Claims (18)
1. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de
la EA que comprende:
- -
- determinar el nivel de expresión de un gen que codifica un marcador lisosomal en una muestra biológica
- -
- comparar dicho nivel de expresión con un valor de referencia
donde la alteración de dicho nivel es indicativo
de EA.
2. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de
la EA según la reivindicación 1, donde el gen que codifica un
marcador lisosomal es Lamp-1.
3. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de
la EA según la reivindicación 1, donde el gen que codifica un
marcador lisosomal es Lamp-2.
4. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de
la EA según cualquiera de las reivindicaciones 1-3,
donde la muestra biológica comprende un tejido.
5. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de
la EA según cualquiera de las reivindicaciones 1-3,
donde la muestra biológica es un fluido.
6. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de
la EA según la reivindicación 5, donde el fluido comprende líquido
cefalorraquídeo.
7. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de
la EA según cualquiera de las reivindicaciones 1-3,
donde la determinación del nivel de expresión del gen que codifica
un marcador lisosoma se realiza mediante el análisis de la cantidad
de RNA codificado por dicho gen o fragmentos del mismo.
8. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de
la EA según la reivindicación 7, donde el análisis de la cantidad
de RNA se realiza mediante amplificación.
9. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de
la EA según la reivindicación 7, donde el análisis de la cantidad
de RNA se realiza mediante biochips de DNA.
10. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de
la EA según cualquiera de las reivindicaciones 1-3,
donde la determinación del nivel de expresión del gen que codifica
un marcador lisosomal se realiza mediante el análisis de la cantidad
de proteína codificada por dicho gen y/o fragmentos de la
misma.
11. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de
EA según la reivindicación 10, donde el análisis de la cantidad de
proteína se realiza mediante Western Blot.
12. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de
EA según la reivindicación 10, donde el análisis de la cantidad de
proteína se realiza mediante chips de proteína.
13. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de
EA según la reivindicación 10, donde el análisis de la cantidad de
proteína se realiza mediante inmunohistoquímica.
14. Kit para el diagnóstico y/o pronóstico de EA
que comprende los reactivos necesarios para la determinación del
nivel de expresión del gen que codifica un marcador lisosomal según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
15. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de
EA según cualquiera de las reivindicaciones 1-3,
donde la determinación del nivel de expresión del gen que codifica
un marcador lisosomal se realiza mediante una sustancia indicadora
que se une específicamente al RNA o a la proteína codificados por
dicho gen.
16. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de
EA según la reivindicación 15, donde el nivel de expresión del gen
marcador lisosomal se determina mediante imagen.
17. Kit para el diagnóstico y/o pronóstico de EA
según cualquiera de las reivindicaciones 15-16 que
comprende una composición que contiene una sustancia indicadora que
se une específicamente al RNA o a la proteína codificados por dicho
gen, donde dicha sustancia indicadora está marcada con un marcador
detectable, y un líquido portador fisiológicamente aceptable.
18. Uso de al menos un gen que codifica un
marcador lisosomal seleccionado entre Lamp- 1 o
Lamp-2 como marcador genético para el diagnóstico de
EA.
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