JP2008545424A - 神経変性疾患用の診断・治療標的ｓｌｃ３９ａ１２タンパク質 - Google Patents

Abstract

本発明は、アルツハイマー病患者におけるＳＬＣ３９Ａ１２遺伝子、及びそのタンパク質産物の調節不全を開示する。この知見に基づいて、本発明は、対象におけるアルツハイマー病を診断及び予知する方法、及び対象がアルツハイマー病を発症するリスクが高いかどうかを判定する方法を提供する。また、本発明は、ＳＬＣ３９Ａ１２遺伝子及びその対応する遺伝子産物を用いて、アルツハイマー病及び関連神経変性疾患を治療及び予防する治療及び予防方法を提供する。神経変性疾患の調節薬剤をスクリーニングする方法も開示する。

Description

本発明は、対象における神経変性疾患の進行を診断、予知及び監視する方法に関する。また、神経変性疾患の薬剤を調節するための治療管理（ｔｈｅｒａｐｙ ｃｏｎｔｒｏｌ）及びスクリーニングの方法も提供する。本発明は、薬剤組成物、キット及び組み換え動物モデルも開示する。

神経変性疾患、特にアルツハイマー病（ＡＤ）は、患者の生活を大きく衰弱させる影響がある。また、神経変性疾患は、健康上、社会的及び経済的に非常に大きな負担になる。ＡＤは、最も一般的な神経変性疾患であり、全認知症例の約７０％を占める。ＡＤは、恐らく最も破壊的な加齢神経変性症状であり、６５歳を超える人口の約１０％、８５歳を超える人口の最高４５％で発症する（Ｖｉｃｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０００， ６０： １３９−１６５； Ｗａｌｓｈ ａｎｄ Ｓｅｌｋｏｅ， Ｎｅｕｒｏｎ ２００４， ４４： １８１−１９３）。現在、ＡＤは、米国、欧州及び日本において推定１２００万例に上る。この状況は、先進国においては老人の数が人口統計上増加しており、必然的に悪化している。ＡＤ患者の脳に生じる神経病理学的特徴は、アミロイドβタンパク質で構成される老人斑、並びに異常な繊維状構造の出現及び神経原線維変化の形成と同時に発生する重大な細胞骨格変化である。

アミロイドβタンパク質は、異なる種類のプロテアーゼによるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の開裂によって生成する（Ｓｅｌｋｏｅ ａｎｄ Ｋｏｐａｎ， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２００３， ２６：５６５−５９７； Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００３， ３５：１５０５−１５３５）。２つのタイプの斑、すなわち、びまん性老人斑と神経突起斑を、ＡＤ患者の脳中で検出することができる。これらの斑は、主に大脳皮質及び海馬に見られる。脳中の有毒なＡβの沈着は、ＡＤの極めて初期に始まり、ＡＤ病状をもたらす後続の破壊的過程に重要な役割を果たすと考えられている。ＡＤの他の病理学的特徴は、神経原線維変化（ＮＦＴ）、及び神経じゅう毛糸として記述される異常な神経突起である（Ｂｒａａｋ ａｎｄ Ｂｒａａｋ， Ｊ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ １９９８， ５３： １２７−１４０）。ＮＦＴは、ニューロン中に出現し、化学変化したタウからなり、互いに巻きついた二重らせん状細線維（ＰＨＦ）を形成する。ＡＤに特徴的なことには、凝集して二重らせん状細線維を形成する微小管関連タンパク質タウは、とりわけＳｅｒ２１４を含めて、ある特定のアミノ酸位置が異常にリン酸化されている。タウのリン酸化パターンは、ニューロンの完全性の喪失と相関すると考えられ、ＮＦＴの形成に並行して、ニューロンの減少を認めることができる（Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊｅｎｋｉｎｓ， Ｊ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｉｓ １９９６， １： ３８−５８； Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｈａｒｔｉｇａｎ， Ｊ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｉｓ １９９９， １： ３２９−３５１）。神経原線維変化の出現、及びその数の増加は、ＡＤの臨床的重症度と良く相関する（Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０００， ５５： ３７０−３７６）。ＡＤは、初期に起こる記憶形成の欠陥、及び最終的なより高度の認知機能の完全な低下に関連した進行性疾患である。認知障害としては、とりわけ、記憶障害、失語症、失認、遂行機能の喪失などが挙げられる。ＡＤの原因の特徴は、神経細胞の特定の脳領域及び亜集団が変性過程に対して選択的に脆弱であることである。具体的には、下側頭葉領域及び海馬が、初期に影響を受け、疾患の進行中により重度に影響を受ける。一方、前頭皮質、後頭皮質及び小脳内のニューロンは、ほとんど無傷であり、神経変性から保護される（Ｔｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １９８１， １０： １８４−９２）。

現在、ＡＤは不治の病であり、ＡＤの進行を抑える有効な治療もなく、さらには存命中に高い確率でＡＤを診断する有効な処置すらない。個体にＡＤを発症させる幾つかのリスク因子が確認された。とりわけ、アポリポタンパク質Ｅ遺伝子（ＡｐｏＥ）の３種類の異なる既存の対立遺伝子（イプシロン２、３及び４）のうちイプシロン４対立遺伝子が最も顕著である（Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９３， ９０： １９７７−８１； Ｒｏｓｅｓ， Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １９９８， ８５５： ７３８−４３）。染色体２１上のアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、染色体１４上のプレセニリン−１、及び染色体１上のプレセニリン−２の遺伝子欠陥に起因する早発性ＡＤの例はまれであるが、主要な形態である遅発性散発性ＡＤは、まだ病因が不明である。神経変性疾患の晩期発症及び複雑な原因は、治療薬及び診断薬の開発にとって大変な難題である。薬物標的候補及び診断マーカー候補のプールを拡大することが極めて重要である。

したがって、本発明の一目的は、神経疾患の原因を洞察し、神経疾患のとりわけ診断及び治療開発に適した方法、材料、薬剤、組成物及び動物モデルを提供することである。この目的は、独立請求項の特徴によって解決された。下位クレーム（ｓｕｂｃｌａｉｍ）は、本発明の好ましい実施形態を規定するものである。

本発明は、金属イオン輸送体溶質キャリアファミリー（ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｆａｍｉｌｙ）３９メンバー１２、ＳＬＣ３９Ａ１２と、神経変性疾患、特にアルツハイマー病との関連性の知見に基づく。人体全体にわたる幾つかの生物学的機能に加えて、亜鉛は、タンパク質機能を調節することによって、又はイオン信号として、ニューロンの機能に重要な役割を果たす（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２００５， ＡＯＰ， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｎ１６７１）。具体的には、Ｚｎ^２＋ニューロンのシナプス放出が、グルタミン酸の放出と同期することが記載されている。したがって、ニューロンのこの特定の亜集団は、その細胞体と一緒に主に大脳皮質及び辺縁系構造の中に存在し、「ｇｌｕｚｉｎｅｒｇ」とも称される（Ｓｌｏｍｉａｎｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １９９０， ３８：８４３−８５４； Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｏｎ ＆ Ｂｕｓｈ， ＢｉｏＭｅｔａｌｓ ２００１， １４：３５３−３６６）。亜鉛ホメオスタシスの調節に必要な亜鉛の能動及び／又は受動輸送は、溶質キャリア（ＳＬＣ）遺伝子シリーズのメンバーである亜鉛輸送体によって行われる（Ｌｉｕｚｚｉ ａｎｄ Ｃｏｕｓｉｎｓ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｎｕｔｒ． ２００４， ２４：１５１−１７２）。ＳＬＣファミリーは、全部で４３個の異なるＳＬＣ輸送体サブファミリーを含み、受動輸送体、イオン結合（ｉｏｎ ｃｏｕｐｌｅｄ）輸送体及び交換体を含む約３００種類の異なるヒト輸送体遺伝子を包含する（Ｈｅｄｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ． ２００４， ４４７：４６５−４６８）。全亜鉛輸送体は、膜貫通領域を有し、特定のアミノ酸相同性に応じて２つの異なるＳＬＣファミリー（ＳＬＣ３０及びＳＬＣ３９）に属する（Ｅｉｄｅ， Ｐｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ． ２００４， ４４７：７９６−８００）。

ヒトにおいては、ＳＬＣ３０タンパク質の一部として知られる少なくとも９種類の亜鉛輸送体（別名ＺｎＴファミリー）、及びＳＬＣ３９タンパク質の一部として知られる１５種類の亜鉛輸送体（別名Ｚｉｐファミリー）がある。Ｚｉｐタンパク質の大部分は、細胞外又は小胞内のアミノ及びカルボキシ末端を有する８回膜貫通領域を有する。その共通の特徴は、保存されたヒスチジンリッチ部分（ＨＸ）_{ｎ＝３−６}を有する膜貫通領域３と４の間に極めて短いカルボキシ末端と長いループ領域を有することである。Ｚｉｐタンパク質の構造及び機能についての知識は、主に、ヒトＺｉｐ輸送体ｈＺｉｐ１−４についての研究に基づくが、Ｚｉｐタンパク質の大部分に対する正確な輸送タイプ及び基質についての情報は、主に配列相同性の研究から得られる（Ｌｉｕｚｚｉ ａｎｄ Ｃｏｕｓｉｎｓ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｎｕｔｒ． ２００４， ２４：１５１−１７２）。

ＳＬＣ３９Ａ１２遺伝子のタンパク質は、ＺＩＰ亜鉛輸送体のＬＩＶ−１サブファミリー（ＬＺＴサブファミリー）に属する。他のＺＩＰ輸送体に対して、ＬＺＴタンパク質は、配列全体にわたってヒスチジンリッチ繰り返しの出現率が最高７倍であり、他の亜鉛輸送体では前例のない、保存されたプロリン及びグルタミン酸残基を含む独特のモチーフ（ＨＥＸＰＨＥＸＧＤ）を有する。また、ＬＺＴタンパク質は、長いＮ末端、及び保存された膜貫通領域を有する。亜鉛及びＰＤＦメタロプロテアーゼ中に存在するコンセンサス配列内の制限されたセットは、膜状仮足へのＬＺＴタンパク質の局在化と一緒に、膜型マトリックスメタロプロテアーゼの細胞部位を反映している。細胞の原形質膜上に位置するＬＺＴタンパク質が亜鉛流入輸送体として機能し得る証拠が記載された（Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ２００３， １６１１：１６−３０）。

ヒト染色体１０ｐ１２．３３上に存在するＳＬＣ３９Ａ１２（ＬＺＴ−Ｈｓ８、ＦＬＪ３０４９９）遺伝子は、１２個のエキソンからなる。この遺伝子は、３１３０塩基対の長さのｍＲＮＡ転写物に転写される。コード領域は、計算分子量７６．５ｋＤａの６９０アミノ酸長タンパク質をコードする２０７６塩基対からなる（ＢＣ０３５１１８； Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ２００２， ９９：１６８９９−１６９０３）。他のスプライスバリアントのうち、計算分子量７３ｋＤａの６５４アミノ酸からなる１種類のＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質変異体がアノテートされた（ＡＫ０５５０６１； Ｈｕｂｂａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｓｅｍｂｌ ２００５， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００５， ３３； Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ：Ｄ４４７−５３）。ＮＣＢＩのＵｎｉＧｅｎｅデータセットの電子的（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ）ノーザン分析によれば、ＳＬＣ３９Ａ１２ ｍＲＮＡは、脳組織中で専ら発現されると考えられるのに対して、ＬＺＴタンパク質ファミリーの他の全メンバーは、広範に発現し、又は脳とは異なる組織において組織特異的に発現する。これは、中枢神経系のみでの発現を記述したＴａｙｌｏｒ及びＮｉｃｈｏｌｓｏｎ（Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ２００３， １６１１：１６−３０）によって確認された。ＳＬＣ３９Ａ１２と神経変性疾患、特にアルツハイマー病との関係は、今までに開示されていない。

本明細書及び特許請求の範囲において使用する単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に記載しない限り、複数形を含む。例えば、「細胞」は複数の細胞も意味する。以下同様である。

本明細書及び特許請求の範囲において使用する「及び／又は」という用語は、この用語の前後の句を代替物又は組合せとみなすべきであることを意味する。例えば、「レベル及び／又は活性の測定」という表現は、レベルのみ、活性のみ、又はレベルと活性の両方を測定することを意味する。

本明細書では「レベル」という用語は、転写産物、例えばｍＲＮＡ、翻訳産物、例えばタンパク質、ポリペプチドなどの物質の量又は濃度の尺度又は基準を含むものとする。

本明細書では「活性」という用語は、転写産物、翻訳産物などの物質の生物学的効果をもたらす能力の基準、又は生物活性分子のレベルの基準と理解されるものとする。「活性」という用語は、生物活性及び／又は薬理活性とも称し、輸送体又は輸送体サブユニットの結合、拮抗、抑圧、遮断、中和又は隔離、並びに輸送体又は輸送体サブユニットの活性化、アゴナイゼーション（ａｇｏｎｉｚａｔｉｏｎ）及び上方制御を指す。

本明細書では「レベル」及び／又は「活性」という用語は、遺伝子発現レベル又は遺伝子活性も指す。遺伝子発現は、遺伝子産物の産生をもたらす転写及び翻訳による、遺伝子に含まれる情報の利用として定義し得る。

「調節不全」とは、遺伝子発現の増加又は減少、及び／又は遺伝子産物の安定性の向上又は低下を意味するものとする。遺伝子産物は、ＲＮＡ又はタンパク質を含み、遺伝子発現の結果である。遺伝子産物の量によって、遺伝子の活性、及びその遺伝子産物の安定性を測定することができる。

本明細書及び特許請求の範囲において使用する「遺伝子」という用語は、コード領域（エキソン）と非コード領域（例えば、プロモーター又はエンハンサー、イントロン、リーダー、トレーラー配列などの非コード調節要素）の両方を含む。

「ＯＲＦ」という用語は、「オープンリーディングフレーム」の頭字語であり、少なくとも１個の読み枠中に終止コドンを含まない核酸配列を指し、したがって一連のアミノ酸に潜在的に翻訳することができる。

「調節要素」は、誘導及び非誘導プロモーター、エンハンサー、オペレーター並びに遺伝子発現を駆動し、調節する他の要素を含むものとする。

本明細書では「断片」という用語は、例えば、選択的にスプライスされた、短縮された、又は分割された、転写産物又は翻訳産物を含むものとする。例えば、配列番号１、配列番号２及び配列番号３のタンパク質は、ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物であり、スプライスバリアントを構成する。

本明細書では「誘導体」という用語は、変異した、ＲＮＡ編集された、化学修飾された、若しくは改変された転写産物を指し、又は変異した、化学修飾された、若しくは改変された翻訳産物を指す。明確にするために、例えば、誘導転写物は、核酸配列中に単一又は複数のヌクレオチド欠失、挿入、交換などの改変を有する転写物を指す。例えば、誘導翻訳産物は、改変されたリン酸化、グリコシル化、アセチル化、脂質化などのプロセスによって、又は改変されたシグナルペプチド切断若しくは他のタイプの成熟切断（ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｃｌｅａｖａｇｅ）によって、生成し得る。これらのプロセスは、翻訳後に起こり得る。

本発明及び特許請求の範囲において使用する「調節物質」という用語は、遺伝子のレベル及び／又は活性、遺伝子の転写産物、又は遺伝子の翻訳産物を変化又は改変し得る分子を指す。「調節物質」とは、タンパク質の機能特性を促進又は阻害する、したがって「調節する」、結合、拮抗、抑圧、遮断、中和又は隔離、活性化、アゴナイゼーション（ａｇｏｎｉｚａｔｉｏｎ）及び上方制御を「調節する」、能力を有する分子を指す。「調節」は、細胞の生物活性に影響を及ぼす能力を指すのにも使用する。「調節物質」は、遺伝子の転写産物又は翻訳産物の生物活性を変化又は改変し得ることが好ましい。例えば、前記調節は、生物活性及び／又は薬理活性の増加若しくは減少、結合特性の変化、又は遺伝子の前記翻訳産物の生物学的、機能的若しくは免疫学的諸性質の任意の他の変化若しくは改変であり得る。

「薬剤」、「試薬」又は「化合物」という用語は、細胞、組織、体液に対して、又は試験する任意の生物系若しくは任意のアッセイ系に関連して、正又は負の生物学的効果を有する、任意の物質、化学物質、組成物又は抽出物を指す。これらは、標的の作動物質、拮抗物質、部分作動物質又は逆作動物質であり得る。かかる薬剤、試薬又は化合物は、核酸、天然若しくは合成のペプチド若しくはタンパク質複合体、又は融合タンパク質であり得る。これらは、抗体、有機又は無機の分子又は組成物、小分子、薬物、及び前記薬剤のいずれかの任意の組合せでもあり得る。これらは、試験、診断又は治療目的で使用することができる。

「オリゴヌクレオチドプライマー」又は「プライマー」という用語は、相補的塩基対のハイブリダイゼーションによって所与の標的ポリヌクレオチドにアニールすることができ、ポリメラーゼによって伸長させることができる短い核酸配列を指す。これらは、特定の配列に特異的であるように選択することができ、又は無作為に選択することができ、例えば、混合して、すべての可能な配列を与える（ｐｒｉｍｅ）。本明細書において使用するプライマーの長さは、１０ヌクレオチドから８０ヌクレオチドまで変動し得る。「プローブ」は、本明細書に記載及び開示する核酸配列の短い核酸配列、又はその相補配列である。「プローブ」は、完全長配列、又は所与の配列の断片、誘導体、アイソフォーム若しくは変異体を含み得る。「プローブ」と評価試料のハイブリダイゼーション複合体を同定することによって、試料中の他の類似の配列の存在を検出することができる。

本明細書では「相同体又は相同性」は、あるヌクレオチド又はペプチド配列と別のヌクレオチド又はペプチド配列との同一性及び／又は類似性の程度によって決定される、前記比較配列間の関連性を記述するのに当分野で使用される用語である。

当分野では、「同一性」及び「類似性」という用語は、問い合わせ配列と、好ましくは同じタイプの他の配列（核酸又はタンパク質配列）とを照合することによって求められる、ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列の関連性の程度を意味する。「同一性」及び「類似性」を計算し、決定する、好ましいコンピュータプログラム方法としては、ＧＣＧ ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９９０， ２１５： ４０３−４１０； Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９７， ２５： ３３８９−３４０２； Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９８４， １２： ３８７）、ＢＬＡＳＴＮ ２．０（Ｇｉｓｈ Ｗ．， ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ， １９９６−２００２）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９８８， ８５： ２４４４−２４４８）、重複が最大になる１対のコンティグを求め、整列させるＧＣＧ ＧｅｌＭｅｒｇｅ（Ｗｉｌｂｕｒ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． １９８４， ４４： ５５７−５６７； Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９７０， ４８： ４４３−４５３）などが挙げられるが、これらだけに限定されない。

本明細書では「変異体」という用語は、本発明で開示するポリペプチド及びタンパク質に関連して、本発明の天然ポリペプチド又はタンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端及び／又は天然アミノ酸配列内に、１個以上のアミノ酸が付加及び／又は置換及び／又は欠失及び／又は挿入されているが、その本質的な諸性質を保持している、任意のポリペプチド又はタンパク質を指す。また、本明細書では「変異体」という用語は、本発明で開示する遺伝子転写物に関連して、１個以上のヌクレオチドが付加及び／又は置換及び／又は欠失された、任意のｍＲＮＡを指す。

また、「変異体」という用語は、ポリペプチド又はタンパク質の任意のより短い、又はより長い、ポリペプチド又はタンパク質を含むものとする。「変異体」は、配列番号１、２又は３のＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質の少なくとも２００アミノ酸長にわたって、少なくとも約８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性を有する配列も含むものとする。「変異体」は、例えば、極めて保存的な領域における保存的アミノ酸置換を有するタンパク質も含む。

また、「変異体」という用語は、遺伝子転写物の任意のより短い、又はより長い、遺伝子転写物を含むものとする。「変異体」は、配列番号４、５又は６のＳＬＣ３９Ａ１２遺伝子転写物の少なくとも６００ヌクレオチド長にわたって、少なくとも約８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性を有する配列も含むものとする。代替塩基配列のためにコドンが別のコドンで置換されているが、ＤＮＡ配列によって翻訳されたアミノ酸配列は不変である配列変化を含むものとする。当分野で公知のこの現象は、特定のアミノ酸を翻訳するコドンセットの冗長性と呼ばれる。

本発明の「タンパク質及びポリペプチド」は、配列番号１、２又は３のＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質のアミノ酸配列を含むタンパク質の変異体、断片及び化学誘導体を含む。アルギニンとリジン、バリンとロイシン、アスパラギンとグルタミンなど、機能性に影響を及ぼさないアミノ酸交換を含むものとする。天然から単離することができる、又は組み換え及び／又は合成手段によって製造することができる、タンパク質及びポリペプチドが含まれ得る。未変性タンパク質又はポリペプチドとは、天然の切断型又は分泌型、天然の変異型（例えば、スプライスバリアント）、及び天然の対立遺伝子変異体を指す。

本明細書では「単離された」という用語は、分子又は物質がその自然環境から変更され、及び／又は取り出され、すなわち分子又は物質が通常存在する、細胞又は生きている生物体から単離され、かつ自然界において付随することが判明している共存成分から分離され、又は本質的に精製された、分子又は物質を指すとみなされる。この概念は、さらに、かかる分子をコードする配列が、その自然状態では連結されないポリヌクレオチドに人工的に連結され得ることを意味し、かかる分子が、組み換え及び／又は合成手段によって製造され得ることを意味する。かかる分子は「非天然」であるとも言える。前記目的のためであっても、これらの配列を、生きている、又は死んでいる生物体に当業者に公知の方法によって導入することができ、これらの配列が依然として前記生物体中に存在する場合でも、これらの配列はやはり単離されているとみなされる。本発明において、「リスク」、「感受性」及び「素因」という用語は、等価であり、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を発症する可能性に関して使用される。

「ＡＤ」という用語は、アルツハイマー病を意味するものとする。本明細書では「ＡＤ型神経病理」、「ＡＤ病理」は、本発明に記載の、また、最新技術の文献から一般に公知の、神経病理学的、神経生理学的、組織病理学的及び臨床的な特徴、徴候及び症候を指す（Ｉｑｂａｌ， Ｓｗａａｂ， Ｗｉｎｂｌａｄ ａｎｄ Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ， Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ （Ｅｔｉｏｌｏｇｙ， Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）， Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｗｅｉｎｈｅｉｍ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， １９９９； Ｓｃｉｎｔｏ ａｎｄ Ｄａｆｆｎｅｒ， Ｅａｒｌｙ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， ２０００； Ｍａｙｅｕｘ ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔｅｎ， Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ： Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅ ｔｏ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｅｒｌｉｎ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９９； Ｙｏｕｎｋｉｎ， Ｔａｎｚｉ ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔｅｎ， Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎｓ ａｎｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｅｒｌｉｎ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９８参照）。

「ブラーク病期」又は「ブラーク病期分類」という用語は、Ｂｒａａｋ ａｎｄ Ｂｒａａｋ（Ｂｒａａｋ ａｎｄ Ｂｒａａｋ， Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ １９９１， ８２： ２３９−２５９）によって提案された判定基準に従った脳の分類を指す。ＡＤのブラーク病期分類は、前脳の限定された領域における神経原線維の病理の程度及び分布を評価し、ＡＤの神経病理的進行を６段階に分類する（病期０から６）。ブラーク病期分類は、死後のＡＤの神経病理学的病期分類において、確立され、広く容認されている手順である。精神状態及び認知機能／障害に関するＡＤ患者の臨床症状と、剖検後に得られた対応するブラーク病期との間に有意な相関のあることが確認された（Ｂａｎｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９９３， １６２： １７９−１８２； Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ ２０００， ９９： ５７９−５８２）。同様に、神経原線維の変化と神経細胞病理との相関が見出され（Ｒｏｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ ２００２， １０３：３６３−３６９）、どちらも認知機能を予測すると報告された（Ｇｉａｎｎａｋｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２００３， ６０： １４９５−１５００； Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ ２００４， ６１：３７８−３８４）。さらに、ベータ−アミロイドペプチドの沈着を含み、最後に神経原線維変化が形成される発症カスケードが提案された。したがって、神経原線維変化の形成は、分子／細胞レベルにおける初期のＡＤ特異的現象が先行することの証拠になる（Ｍｅｔｓａａｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ ２００３， ２４：５６３−５７２）。

したがって、本発明においては、ブラーク病期は、個々のドナーの臨床症状／状態とは無関係に、すなわち報告される精神病、認知障害、他の神経精神医学的パラメータの低下、又はＡＤの明白な臨床診断の有無とは無関係に、疾患進行の代用マーカーとして使用される。すなわち、ブラーク病期分類が、分子及び細胞的な根本的発症機序全般を反映し、したがって脳の（病前の）病的状態を規定する、神経原線維の変化と推定される。これは、例えば、ブラーク１の病期にあるドナーが、定義上、病期２（又はそれ以上）のドナーよりも分子／細胞的原因のより初期の段階にあり、したがって、ブラーク病期１のドナーは、例えば、それよりも高いブラーク病期のドナーと比較して、対照個体とみなし得ることを意味する。この点で、対照個体と罹患個体の区別は、健康な対照ドナーとＡＤ患者の臨床診断に基づく区別と必ずしも同じではなく、代用マーカーであるブラーク病期から推定され、また、ブラーク病期によって反映される（病前の）病的状態の推定された差を表す。

本発明においては、ブラーク病期０は、アルツハイマー病の徴候及び症候を示していないと考えられる人を表し得るものであり、ブラーク病期１から４は、前記個体がＡＤの臨床徴候及び症候を既に示しているかどうかによって健康な対照個体又はＡＤ患者を表し得る。ブラーク病期が高いほど、ＡＤの徴候及び症候を示す可能性が高く、又はＡＤの徴候及び症候を生じるリスクが高い。神経病理学的評価、すなわち、ＡＤの病変が認知症の根本的原因である確率を推定する場合には、推奨がＢｒａａｋ Ｈ．（ｗｗｗ．ａｌｚｆｏｒｕｍ．ｏｒｇ）によって与えられる。

対照から得られる値は、既知の健康状態を表す基準値であり、患者から得られる値は、既知の疾患状態を表す基準値である。

本発明による神経変性疾患又は障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、ピック病、前頭側頭型認知症、進行性核性麻ひ、大脳皮質基底核変性症、脳血管性認知症、多系統萎縮症、し銀性顆粒認知症及び他のタウオパチー並びに軽度の認知障害を含む。神経変性過程を含む更なる症状は、例えば、虚血性脳卒中、加齢黄斑変性症、ナルコレプシー、運動ニューロン疾患、プリオン病、外傷性神経損傷及び修復並びに多発性硬化症である。

本発明は、溶質キャリアファミリー、ＳＬＣ３９Ａ１２とも称される金属イオン輸送体溶質キャリアファミリー３９メンバー１２の遺伝子の、また、特定の試料、ＡＤ患者の特定の脳領域、相互比較及び／又は同齢対照個体との比較において異なるブラーク病期にグループ分けされた各個体の特定の脳領域における、前記遺伝子ＳＬＣ３９Ａ１２のタンパク質産物の、同定、差次的発現、差次的調節、調節不全を開示する。本発明は、ＡＤ患者の下側頭葉皮質及び前頭皮質においてＳＬＣ３９Ａ１２ ｍＲＮＡレベルが増加し、上方制御される点で、対照個体のそれぞれの脳領域と比較して、ＡＤ患者の脳において、ＳＬＣ３９Ａ１２の遺伝子発現が変化し、調節不全であることを開示する。また、本発明は、ＳＬＣ３９Ａ１２発現が、異なるブラーク病期にグループ分けされた各個体の特定の脳領域において異なり、主に下側頭葉皮質において、発現レベルの増加が初期のブラーク病期（ブラーク１−３）において既に始まり、晩期のブラーク病期（ブラーク４−６）に向かって次第に増加することを開示する。

ＡＤ患者と対照個体を比較すると、また、異なるブラーク病期を比較すると、ＳＬＣ３９Ａ１２遺伝子転写レベルにおいて観察される差は、ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質レベルにおいて見出すことができる実質的な差によってさらに裏付けられる。対照個体と比較して、ＡＤ患者の脳試料では、ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質レベルが実質的に増加している。ＡＤ型病理の発症と並行した、ＳＬＣ３９Ａ１２遺伝子発現のこの調節不全、並びに対応する遺伝子産物のレベルの変化及び局在化は、ＳＬＣ３９Ａ１２とＡＤの関連性を明らかに反映しており、疾患の過程における進行性の病理学的現象を示している。この関連性の更なる証拠は、トランスジェニックショウジョウバエにおけるＳＬＣ３９Ａ１２遺伝子とタウタンパク質の変異体であるＰ３０１Ｌとの同時発現によって、ＡＤにおいて異常にリン酸化されることが実証されたタウ中のアミノ酸位置であるＳｅｒ２１４のリン酸化が増加するという知見によってもたらされる。したがって、ＳＬＣ３９Ａ１２は、ＡＤに至る分子病理学的現象のカスケードに因果的に関与し得るものであり、したがって、ＡＤ及び他の神経変性疾患に対する、小分子を主体とした治療薬の特定及び開発の有望な標的になり得る。

現在まで、ＳＬＣ３９Ａ１２遺伝子発現の調節不全と神経変性疾患、特にＡＤの病理との関係を実証した実験は記述されていない。同様に、ＳＬＣ３９Ａ１２遺伝子の変異が、前記疾患と関連があることも記述されていない。ＳＬＣ３９Ａ１２遺伝子とかかる疾患を関連付けることによって、とりわけ前記疾患の診断及び治療のための、新しい方法がもたらされる。さらに、ＳＬＣ３９Ａ１２と、ＡＤの発症過程の初期に既に発生している病理学的現象とを関連付けることによって、ＡＤ病理の開始を阻止する治療の可能性がもたらされる。治療は、修復不能な脳の損傷が起こる前に施される。その結果、本発明は、診断評価、治療を受けている人の診断監視、予後、及び神経変性疾患、特にＡＤの素因の特定に有用である。

本発明は、ＳＬＣ３９Ａ１２をコードする遺伝子、及びＡＤ患者の特定の脳領域におけるその遺伝子産物の調節不全を開示する。下側頭葉、嗅内皮質、海馬及びへん桃体内のニューロンは、ＡＤにおける変性過程を受けやすい（Ｔｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １９８１， １０：１８４−１９２）。これらの脳領域は、学習及び記憶機能の処理に主に関与し、ＡＤにおけるニューロンの減少及び変性に対して選択的な脆弱性を示す。これに対し、前頭皮質、後頭皮質及び小脳内のニューロンは、ほとんど無傷のままであり、神経変性プロセスから保護されている。ＡＤ患者及び同齢対照の前頭皮質（Ｆ）及び下側頭葉皮質（Ｔ）から得られた脳組織を本明細書で開示する実施例に使用した。その結果、ＳＬＣ３９Ａ１２遺伝子並びにその対応する転写及び／又は翻訳産物は、原因となる役割を果たし、及び／又は選択的ニューロン変性及び／又は神経保護に対して影響を及ぼす。

一態様においては、本発明は、対象における神経変性疾患を診断若しくは予知する方法、対象が前記疾患を発症する素因を有するどうか、前記疾患を発症するリスクが大きいかどうかを判定する方法、又は神経変性疾患を有する対象に施した治療の効果を監視する方法を特徴とする。本方法は、前記対象から得られた試料中の（ｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は（ｉｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は（ｉｉｉ）前記転写又は翻訳産物の断片、誘導体又は変異体のレベル、発現若しくは活性、又は前記レベル、発現及び前記活性を測定すること、前記転写産物及び／又は前記翻訳産物及び／又はその前記断片、誘導体又は変異体の前記レベル、発現及び／又は前記活性を、既知の疾患状態（患者）を表す基準値、及び／又は既知の健康状態（対照）を表す基準値、及び／又は既知のブラーク病期を表す基準値と比較すること、前記レベル及び／又は前記活性が、既知の健康状態を表す基準値と比較して変動するかどうか、変化するかどうか、及び／又は既知の疾患状態を表す基準値と類似若しくは同じであるかどうか、及び／又は既知のブラーク病期を表す基準値と比較して類似しているかどうか（これらは、前記対象が神経変性疾患を有することの指標、前記対象が前記疾患の徴候及び症候を生じるリスクが大きいことの指標である。）を解析し、それによって前記対象における前記神経変性疾患を診断若しくは予後判定すること、又は前記対象が前記神経変性疾患を発症するリスクが大きいかどうかを判定することを含む。「対象における」という表現は、対象が罹患した疾患に関係する限り、すなわち、前記疾患が対象「中」に存在する限り、開示した方法の結果を指す。

更に別の態様においては、本発明は、対象における神経変性疾患の進行を監視する方法を特徴とする。前記対象から得られた試料中の（ｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は（ｉｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は（ｉｉｉ）前記転写又は翻訳産物の断片、誘導体又は変異体のレベル、発現若しくは活性、又は前記レベル、発現及び前記活性を測定する。前記レベル、発現及び／又は前記活性を、既知の疾患若しくは健康状態又は既知のブラーク病期を表す基準値と比較する。それによって、前記対象における前記神経変性疾患の進行を監視する。

更に別の態様においては、本発明は、前記疾患の治療を受ける対象から得られた試料中の（ｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は（ｉｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は（ｉｉｉ）前記転写又は翻訳産物の断片、誘導体又は変異体のレベル、発現若しくは活性、又は前記レベル、発現及び前記活性を測定することを含む、神経変性疾患に対する治療を評価する方法、又は治療の効果を監視する方法を特徴とする。前記レベル、発現若しくは前記活性、又は前記レベル、発現及び前記活性を、既知の疾患若しくは健康状態又は既知のブラーク病期を表す基準値と比較し、それによって前記神経変性疾患に対する治療を評価する。

好ましい実施形態においては、前記疾患の進行を監視するために、ある期間にわたって前記対象から採取した一連の試料中の（ｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は（ｉｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は（ｉｉｉ）前記転写又は翻訳産物の断片、誘導体又は変異体のレベル、発現若しくは活性、又は前記レベルと前記活性の両方を比較する。更に好ましい実施形態においては、前記対象は、前記試料採集の１回以上の前に治療を受ける。更に別の好ましい実施形態においては、前記レベル及び／又は活性を、前記対象の前記治療の前後に測定する。

ＳＬＣ３９Ａ１２の前記転写産物及び／又は前記翻訳産物及びその断片、誘導体又は変異体の前記レベル、発現及び／又は前記活性は、ＡＤ患者から得られた試料において、ＡＤに罹患していない対照の人から得られた試料と比較して、増加し、上方制御されていることが好ましい。例えば、ＳＬＣ３９Ａ１２の転写産物及び／又は翻訳産物及びその断片、誘導体又は変異体の発現及び／又は活性を患者の試料から測定し、健康な対照対象の試料（基準試料）中のＳＬＣ３９Ａ１２の転写産物及び／又は翻訳産物及びその断片、誘導体又は変異体の発現及び／又は活性と比較する。

本明細書で特許請求する本発明の方法、キット、組み換え動物、分子、アッセイ及び使用の好ましい実施形態においては、前記ＳＬＣ３９Ａ１２遺伝子は、配列番号１（スプライスバリアント１（ｓｖ１）、Ｇｅｎｂａｎｋ／Ｅｎｓｅｍｂｌ受託番号ＢＣ０９４７００／ＥＮＳＴ０００００３７７３６９）、配列番号２（スプライスバリアント２（ｓｖ２）、Ｇｅｎｂａｎｋ／Ｅｎｓｅｍｂｌ受託番号Ｑ５ＶＷＶ９，ＢＣ０３５１１８／ＥＮＳＴ０００００３７７３７１）、又は配列番号３（スプライスバリアント３（ｓｖ３）、Ｇｅｎｂａｎｋ／Ｅｎｓｅｍｂｌ受託番号Ｑ５ＶＷＶ８／ＥＮＳＴ０００００２７７６３３）のタンパク質をコードする。前記スプライスバリアントのアミノ酸配列は、それぞれ、Ｅｎｓｅｍｂｌ ＩＤ ＥＮＳＴ０００００３７７３６９のｃＤＮＡ配列に対応する配列番号４、Ｅｎｓｅｍｂｌ ＩＤ ＥＮＳＴ０００００３７７３７１のｃＤＮＡ配列に対応する配列番号５、及びＥｎｓｅｍｂｌ ＩＤ ＥＮＳＴ０００００２７７６３３のｃＤＮＡ配列に対応する配列番号６の各ｍＲＮＡ配列から推定された。本発明においては、ＳＬＣ３９Ａ１２は、ヒトＳＬＣ３９Ａ１２スプライスバリアントのコード配列（ｃｄｓ）を表す配列番号７、８及び９の核酸配列も指す。本発明においては、前記配列は、本明細書で使用する用語に従って「単離されて」いる。また、本発明においては、前記ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質（スプライスバリアントｓｖ１、ｓｖ２及びｖ３）をコードする遺伝子を、ＳＬＣ３９Ａ１２遺伝子、又は単にＳＬＣ３９Ａ１２とも総称する。ＳＬＣ３９Ａ１２のタンパク質（スプライスバリアントｓｖ１、ｓｖ２及びｖ３）を、ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質、ＳＬＣ３９Ａ１２スプライスバリアント、又は単にＳＬＣ３９Ａ１２とも総称する。

本明細書で特許請求する本発明の方法、キット、組み換え動物、分子、アッセイ及び使用の更に好ましい実施形態においては、前記神経変性疾患又は障害はアルツハイマー病であり、前記対象はアルツハイマー病の徴候及び症候を示す。

分析され、判定される試料は、脳組織若しくは他の組織又は体細胞を含む群から選択されることが好ましい。試料は、脳脊髄液、又は唾液、尿、便、血液、血清 血しょう若しくは粘液を含めた他の体液も含み得る。好ましくは、神経変性疾患に対する、本発明による診断、予後、進行監視又は治療評価の各方法は、ｅｘ ｃｏｒｐｏｒｅで実施することができ、かかる方法は、対象、患者又は対照の人から取り出し、収集し、又は単離した試料、例えば、体液又は細胞に好ましくは関係する。

更に好ましい実施形態においては、前記基準値は、前記神経変性疾患に罹患していない対象から得られた試料（対照試料、対照、健康な対照の人）、神経変性疾患、特にアルツハイマー病に罹患した対象から得られた試料（患者試料、患者、ＡＤ試料）、又はＡＤの徴候及び症候を示し得る、若しくは示さなくてもよい、特定のブラーク病期の人から得られた試料中の（ｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は（ｉｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は（ｉｉｉ）前記転写又は翻訳産物の断片、誘導体又は変異体のレベル、発現若しくは活性、又は前記レベルと前記活性の両方の基準値である。

好ましい実施形態においては、既知の健康状態（対照試料）を表す基準値に対する、前記対象から採取された試料細胞、組織又は体液中のＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又はＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又はその断片、誘導体若しくは変異体のレベル及び／又は活性及び／又は発現の変化によって、神経変性疾患、特にＡＤに罹患することの診断、予後、又はリスクの増加が示される。

更に好ましい実施形態においては、神経変性疾患、特にアルツハイマー病（ＡＤ患者試料）の既知の疾患状態を表す基準値に対して、対象から得られた試料細胞、組織又は体液中のＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又はＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又はその断片、誘導体若しくは変異体のレベル及び／又は活性及び／又は発現が同じである、又は類似していることは、前記神経変性疾患に罹患することの診断、予後、又はリスクの増加を示す。

別の更に好ましい実施形態においては、ＡＤの徴候及び症候を生じるリスクが高いことを示す既知のブラーク病期を表す基準値に対して、対象から得られた試料細胞、組織又は体液中のＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又はＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又はその断片、誘導体若しくは変異体のレベル、発現及び／又は活性が同じである、又は類似していることは、ＡＤに罹患することの診断、予後、又はリスクの増加を示す。

しかし、ＳＬＣ３９Ａ１２の前記転写産物及び／又は前記翻訳産物及びその断片、誘導体若しくは変異体の前記変動した、変化したレベル、変化した発現、及び／又は前記変化した活性は、増加、上方制御であることが好ましい。

好ましい実施形態においては、ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の転写産物及び／又は発現のレベルは、対象から得られた試料において、対象の試料から抽出したＲＮＡを逆転写して得られるｃＤＮＡから前記遺伝子特異的配列を増幅するプライマーの組合せを有する定量的ＰＣＲ分析によって測定される。プライマーの組合せ（配列番号１０、配列番号１１）を本発明の実施例１（ｖｉ）に示すが、本発明で開示する配列から作製される他のプライマーも使用することができる。前記遺伝子に特異的であるプローブを用いたノーザンブロット又はリボヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）を適用することもできる。マイクロチップを用いたマイクロアレイ技術によって、転写産物を測定することが更に好ましい場合もある。これらの技術は、当業者に公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２００１； Ｓｃｈｅｎａ Ｍ．， Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｎａｔｉｃｋ， ＭＡ， ２０００参照）。免疫測定法の例は、国際公開第０２／１４５４３号に開示及び記載されている酵素活性の検出及び測定法である。

本発明は、本発明で開示するその核酸配列、断片又は変異体に独特なプライマー及びプローブの構築及び使用にも関する。オリゴヌクレオチドプライマー及び／又はプローブは、蛍光性、生物発光性、磁性又は放射性物質で特異的に標識することができる。本発明は、さらに、適切な組合せの前記特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いた、その前記核酸配列又は断片及び変異体の検出及び生成に関係する。当業者に周知の方法であるＰＣＲ分析を、前記プライマーの組合せを用いて実施して、核酸を含む試料から、前記遺伝子特異的核酸配列を増幅することができる。かかる試料は、健康な対象、罹患した対象、又は特定のブラーク病期にある対象から得ることができる。増幅によって特定の核酸産物が生成するかどうか、また、長さの異なる断片が得られるかどうかによって、神経変性疾患、特にアルツハイマー病に罹患しているかどうかを示すことができる。したがって、本発明は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病に関連し得る、試験核酸配列を含む所与の試料中の遺伝子変異及び一塩基多形を検出するのに有用である、少なくとも１０塩基長の核酸配列、オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブからコード配列全体及び遺伝子配列全体までを提供する。この特徴は、ＤＮＡを用いた迅速な診断テストを、好ましくはキットの形式でも、開発するのに有用である。ＳＬＣ３９Ａ１２用プライマーを実施例１（ｖｉ）に例示する。

また、ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は前記翻訳産物の断片、誘導体若しくは変異体のレベル及び／又は活性及び／又は発現、及び／又は前記翻訳産物、及び／又はその断片、誘導体若しくは変異体のレベル又は活性は、免疫測定法、活性アッセイ、例えば、細胞の亜鉛取り込みアッセイ、タウの凝集及び／又はリン酸化を測定するアッセイ、及び／又は結合アッセイを用いて検出することができる。これらのアッセイは、抗プロテイン抗体又は抗プロテイン抗体に結合する二次抗体のどちらかに結合した、酵素標識、クロモ力学標識、放射性標識、磁性標識又は発光標識を使用することによって、前記タンパク質分子と抗プロテイン抗体との結合量を測定することができる。また、他の高親和性リガンドを使用することもできる。使用することができる免疫測定法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、及び当業者に公知の他の技術が挙げられる（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９９及びＥｄｗａｒｄｓ Ｒ， Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ； Ｅｎｇｌａｎｄ， １９９９参照）。これらの全検出技術は、マイクロアレイ、タンパク質アレイ、抗体マイクロアレイ、組織マイクロアレイ、電子バイオチップ又はタンパク質チップを用いた技術の形式で使用することもできる（Ｓｃｈｅｎａ Ｍ．， Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｎａｔｉｃｋ， ＭＡ， ２０００参照）。

別の態様においては、本発明は、対象における、神経変性疾患、特にＡＤを診断若しくは予知するキット、又は神経変性疾患、特にＡＤを発症する対象の傾向若しくは素因を求めるキット、又は神経変性疾患、特にＡＤを有する対象に施した治療の効果を監視するキットを特徴とする。前記キットは、
（ａ）（ｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の転写産物を選択的に検出する試薬、（ｉｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物を選択的に検出する試薬、及び／又は（ｉｉｉ）前記転写又は翻訳産物の断片、誘導体又は変異体を検出する試薬からなる群から選択される少なくとも１種類の試薬、
（ｂ）
− 前記対象から得られた試料において、前記転写産物及び／又は前記翻訳産物及び／又は上記の断片、誘導体若しくは変異体のレベル若しくは活性、又は前記レベルと前記活性の両方、及び／又は発現を測定すること、
− 前記転写産物及び／又は前記翻訳産物及び／又はその断片、誘導体若しくは変異体の前記レベル及び／又は前記活性及び／又は発現を、既知の疾患状態（患者）を表す基準値、及び／又は既知の健康状態（対照）を表す基準値、及び／又は既知のブラーク病期を表す基準値と比較すること、
− 前記レベル及び／又は前記活性及び／又は発現が、既知の健康状態を表す基準値に対して変動しているかどうか、及び／又は既知の疾患状態を表す基準値、若しくは既知のブラーク病期を表す基準値と類似若しくは同じであるかどうかを解析すること、並びに
− 神経変性疾患、特にＡＤを診断若しくは予知すること、又はかかる疾患を発症する前記対象の傾向若しくは素因を求めること（ここで、既知の健康状態（対照）を表す基準値と比較して、前記転写産物及び／又は前記翻訳産物及び／又はその断片、誘導体若しくは変異体のレベル、発現若しくは活性、又は前記レベルと前記活性の両方の変動若しくは変化、及び／又は前記転写産物及び／又は前記翻訳産物及び／又はその断片、誘導体若しくは変異体のレベル若しくは活性、又は前記レベルと前記活性の両方が、既知の疾患状態（患者試料）、好ましくはＡＤの疾患状態（ＡＤ患者）を表す基準値、及び／又は既知のブラーク病期を表す基準値と類似若しくは同じであることが、神経変性疾患、特にＡＤの診断若しくは予後、又はかかる疾患を発症する傾向若しくは素因の増加、ＡＤの徴候及び症候を生じるリスクが高いことを示す。）
によって、神経変性疾患、特にＡＤを診断若しくは予知するための説明書、かかる疾患を発症する対象の傾向若しくは素因を求めるための説明書、又は治療の効果を監視する説明書を含む。本発明によるキットは、神経変性疾患、特にＡＤを発症するリスクがある個体を特定するのに特に有用であり得る。

ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする、好ましくは配列番号１、２又は３のスプライスバリアントをコードする、遺伝子の転写産物及び／又は翻訳産物を選択的に検出する試薬は、種々の長さの配列、配列断片、抗体、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、リボザイムであり得る。かかる試薬は、その断片、誘導体又は変異体の検出にも使用することができる。

更に別の態様においては本発明は、対象における、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を診断又は予知する方法、かかる疾患を発症する対象の傾向又は素因を求める方法、及び神経変性疾患、特にＡＤを有する対象に施した治療の効果を監視する方法におけるキットの使用を特徴とする。

その結果、本発明によるキットは、疾患発症前の、疾患過程において不可逆的損傷が生じる前の、初期の予防措置又は治療的介入のために、特定の個体を標的にする手段として役立ち得る。また、好ましい実施形態においては、本発明によるキットは、対象における、神経変性疾患、特にＡＤの進行の監視、及び前記対象のかかる疾患に対する治療処置の成功又は失敗の監視に有用である。

別の態様においては、本発明は、（ｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子、及び／又は（ｉｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は（ｉｉｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、誘導体若しくは変異体のレベル若しくは活性、又は前記レベルと前記活性の両方に直接的又は間接的に影響を及ぼす、薬剤、調節物質、拮抗物質、作動物質又は抗体を治療又は予防に有効な量及び処方で、神経変性疾患の治療を必要とする対象に投与することを含む、対象における、神経変性疾患、特にＡＤを治療又は予防する方法を特徴とする。前記薬剤は、小分子を含んでいてもよく、又はペプチド、オリゴペプチド若しくはポリペプチドを含んでいてもよい。前記ペプチド、オリゴペプチド又はポリペプチドは、ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物又はその断片、誘導体若しくは変異体のアミノ酸配列を含み得る。本発明による、神経変性疾患、特にＡＤを治療又は予防する薬剤は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドからもなり得る。前記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、センス方向又はアンチセンス方向の、ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を含み得る。

好ましい実施形態においては、本方法は、前記薬剤を投与するために、遺伝子療法及び／又はアンチセンス核酸技術のそれ自体公知の方法の適用を含む。一般に、遺伝子療法としては、幾つかの手法、すなわち、変異遺伝子の分子置換、治療タンパク質の合成をもたらす新しい遺伝子の添加、組み換え発現方法又は薬物による、内因性細胞の遺伝子発現の調節などが挙げられる。遺伝子移入技術は、詳述されており（例えば、Ｂｅｈｒ， Ａｃｃ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ １９９３， ２６： ２７４−２７８及びＭｕｌｌｉｇａｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９３， ２６０： ９２６−９３１参照）、細胞へのＤＮＡの機械的微量注入などの直接遺伝子移入技術、（組み換えウイルス、特にレトロウイルスのような）生物学的ベクター又はモデルリポソームを用いた間接的技術、ポリカチオンとのＤＮＡ共沈による形質移入に基づく技術、化学的手段（溶媒、洗浄剤、ポリマー、酵素）又は物理的手段（機械衝撃、浸透圧衝撃、熱衝撃、電気衝撃）による細胞膜撹乱（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）などが挙げられる。出生後の中枢神経系への遺伝子移入が詳述されている（例えば、Ｗｏｌｆｆ， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ １９９３， ３： ７４３−７４８参照）。

特に、本発明は、アンチセンス核酸療法の手段、すなわち、アンチセンス核酸又はその誘導体をある重要な細胞に導入することによって、不適当に発現された遺伝子、又は不完全な遺伝子を下方制御する手段によって、神経変性疾患を治療又は予防する方法を特徴とする（例えば、Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ， ＤＮ＆Ｐ １９９２， ５： ３８９−３９５； Ａｇｒａｗａｌ ａｎｄ Ａｋｈｔａｒ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９５， １３： １９７−１９９； Ｃｒｏｏｋｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９２， １０： ８８２−６参照）。ハイブリダイゼーション戦略とは別に、疾患のメッセージを輸送するＲＮＡを破壊するリボザイム、すなわち酵素として作用するＲＮＡ分子の適用も記述されている（例えば、Ｂａｒｉｎａｇａ， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９３， ２６２： １５１２−１５１４参照）。好ましい実施形態においては、治療対象はヒトであり、治療用アンチセンス核酸又はその誘導体は、ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の転写産物を対象にする。対象の中枢神経系、好ましくは脳の細胞をかかる方法で治療することが好ましい。細胞への貫入は、アンチセンス核酸及びその誘導体とキャリア粒子とのカップリングなどの公知の戦略、又は上記技術によって実施することができる。標的の治療用オリゴデオキシヌクレオチドを投与する戦略は、当業者に公知である（例えば、Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９２， １０： ２８１−２８７参照）。送達を単なる局所適用によって実施することができる場合もある。更なる手法は、アンチセンスＲＮＡの細胞内発現を対象とする。この戦略においては、標的核酸の領域に相補的であるＲＮＡの合成を誘導する組み換え遺伝子で細胞を生体外で形質転換する。細胞内で発現されるアンチセンスＲＮＡを治療に使用することは、遺伝子療法に手順が類似している。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として種々知られる、二本鎖ＲＮＡの使用によって遺伝子の細胞内発現を制御する最近開発された方法は、核酸療法のための別の有効な手法となり得る（Ｈａｎｎｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ ２００２， ４１８： ２４４−２５１）。

更に好ましい実施形態においては、本方法は、前記対象の中枢神経系、好ましくは脳中にドナー細胞を移植することを含み、又は移植片拒絶を最小限に抑える、若しくは減少させるように好ましくは処理されたドナー細胞を移植することを含み、前記ドナー細胞は、前記薬剤をコードする少なくとも１種類の導入遺伝子の挿入によって遺伝子改変されている。前記導入遺伝子は、ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターによって輸送し得る。導入遺伝子は、導入遺伝子をコードするＤＮＡを非ウイルス性の物理的形質移入によって、特に微量注入によって、ドナー細胞に挿入することができる。導入遺伝子は、電気穿孔法、化学的形質移入、特にリン酸カルシウム形質移入、又はリポソームによる形質移入によって、挿入することもできる（Ｍｃ Ｃｅｌｌａｎｄ ａｎｄ Ｐａｒｄｅｅ， Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ： Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ａｎｄ Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｎａｔｉｃｋ， ＭＡ， １９９９参照）。

好ましい実施形態においては、神経変性疾患、特にＡＤを治療及び予防するための前記薬剤は、対象細胞を前記対象に導入することを含む方法によって、前記対象、好ましくはヒトに投与することができる治療タンパク質である。前記対象細胞は、前記治療タンパク質をコードするＤＮＡセグメントが挿入されるようにインビトロで処理されている。前記対象細胞は、前記対象において前記治療タンパク質の治療有効量をインビボで発現する。前記ＤＮＡセグメントは、ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターによって前記細胞にインビトロで挿入することができる。

本発明による治療又は予防方法は、上記細胞療法及び遺伝子療法のいずれかと組み合わせた、治療クローニング、移植、並びに胚性幹細胞又は胚性胚細胞及びニューロン成体幹細胞を用いた幹細胞療法の適用を含む。幹細胞は、全能性又は多能性であり得る。幹細胞は、器官特異的でもあり得る。罹患した、及び／又は損傷を受けた、脳細胞又は組織を修復する戦略は以下を含む。（ｉ）ドナー細胞を成体組織から採取すること。ドナー細胞の核を、遺伝物質が除去された未受精卵細胞に移植する。胚性幹細胞を、体細胞核移植した細胞の胚盤胞段階から単離する。次いで、分化因子を使用して、幹細胞から特殊な細胞タイプ、好ましくは神経細胞への定方向の発達がもたらされる（Ｌａｎｚａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９９９， ９： ９７５−９７７）。又は（ｉｉ）インビトロでの増殖と、それに続く移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）及び移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）のために、中枢神経系又は骨髄（間葉幹細胞）から単離された成体幹細胞を精製すること。又は（ｉｉｉ）内因性神経幹細胞を直接誘導して、機能的ニューロンに増殖、移動及び分化させること（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ＤＡ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２００２， ２： ３４−４２）。成体脳の胚中心は、ニューロン損傷又は機能不全がないので、成体神経幹細胞は、損傷を受けた脳組織、又は罹患した脳組織の修復に大きな可能性を有する（Ｃｏｌｍａｎ Ａ， Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｌｄ ２００１， ７： ６６−７１）。

好ましい実施形態においては、本発明による治療又は予防の対象は、ヒト、非ヒト実験動物、例えばマウス若しくはラット、家畜、又は非ヒト霊長類とすることができる。実験動物は、神経変性疾患用動物モデル、例えば、ＡＤ型神経病理を有するトランスジェニックマウス及び／又はノックアウトマウスとすることができる。

更に別の態様においては、本発明は、（ｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子、及び／又は（ｉｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は（ｉｉｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、誘導体若しくは変異体からなる群から選択される少なくとも１種類の物質の活性若しくはレベル、又は前記活性と前記レベルの両方、及び／又は発現の薬剤、拮抗物質、作動物質又は調節物質を特徴とする。前記薬剤、拮抗物質若しくは作動物質又は前記調節物質は、神経変性疾患、特にＡＤの治療において、潜在的活性を有する。

別の態様においては、本発明は、神経変性疾患、特にＡＤの治療又は予防用医薬品の製造における、（ｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子、及び／又は（ｉｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は（ｉｉｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、誘導体若しくは変異体からなる群から選択される少なくとも１種類の物質の活性若しくはレベル、又は前記活性と前記レベルの両方、及び／又は発現の薬剤、抗体、拮抗物質若しくは作動物質又は調節物質の使用を規定する。前記抗体は、（好ましくは配列番号１、２又は３を有する）ＳＬＣ３９Ａ１２をコードする遺伝子の翻訳産物、又はかかる翻訳産物の断片、誘導体若しくは変異体である、免疫原と特異的に免疫反応し得る。

更に別の態様においては、本発明は、前記薬剤、抗体、拮抗物質若しくは作動物質又は調節物質と、好ましくは薬剤担体とを含む、薬剤組成物を特徴とする。前記担体とは、調節物質が一緒に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤又はビヒクルを指す。

一態様においては、本発明は、前記薬剤組成物の治療有効量又は予防有効量を充填した１個以上の容器を含むキットも提供する。

更に別の態様においては、本発明は、天然ＳＬＣ３９Ａ１２遺伝子転写制御要素ではない転写要素の制御下にある、（好ましくは配列番号１、２又は３を有する）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする非天然ＳＬＣ３９Ａ１２遺伝子配列、又はその断片、誘導体若しくは変異体を含む、組み換え、遺伝子改変非ヒト動物を特徴とする。前記組み換え、非ヒト動物の作製は、（ｉ）前記遺伝子配列及び選択マーカー配列を含む、遺伝子ターゲティング構築体を用意すること、（ｉｉ）前記ターゲティング構築体を非ヒト動物の幹細胞に導入すること、（ｉｉｉ）前記非ヒト動物幹細胞を非ヒト胚に導入すること、（ｉｖ）前記胚を偽妊娠非ヒト動物に移植すること、（ｖ）前記胚を満期（ｔｅｒｍ）まで発達させること、（ｖｉ）そのゲノムが、両方の対立遺伝子に前記遺伝子配列の改変を含む、遺伝子改変非ヒト動物を特定すること、及び（ｖｉｉ）段階（ｖｉ）の遺伝子改変非ヒト動物を飼育して、そのゲノムが前記遺伝子配列の改変を含む遺伝子改変非ヒト動物を得ることを含み、前記遺伝子の発現、異所性発現、低発現、非発現又は過剰発現、前記遺伝子配列の破壊又は変更によって、神経変性疾患、特にＡＤの徴候及び症候を生じる素因のある前記非ヒト動物が作製される。かかる動物を作製及び構築する戦略及び技術は、当業者に公知である（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８９， ２４４： １２８８−１２９２、Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９４、及びＪａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ａｂｂｏｔｔ， Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｅｎｇｌａｎｄ， １９９９）。

かかる遺伝子改変組み換え非ヒト動物を、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を検討するための動物モデル、試験動物又は対照動物として使用することが好ましい。かかる動物は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を治療する診断薬及び治療薬の開発において、化合物、薬剤及び調節物質のスクリーニング、試験及び検証に有用であり得る。スクリーニング方法におけるかかる遺伝子改変動物の使用を本発明で開示する。

更に別の態様においては、本発明は、（好ましくは配列番号１、２又は３を有する）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質、又はその断片、誘導体若しくは変異体をコードする遺伝子配列が、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を治療する診断薬及び治療薬の開発において、化合物、薬剤及び調節物質のスクリーニング、試験及び検証のために、異所性発現、低発現、非発現若しくは過剰発現され、又は破壊され、若しくは別の様式で変更された、細胞を使用する。スクリーニング方法におけるかかる細胞の使用を本発明で開示する。

別の態様においては、本発明は、神経変性疾患、特にＡＤ、又は関連疾患及び障害の治療用の薬剤、調節物質、拮抗物質若しくは作動物質をスクリーニングする方法を特徴とする。この薬剤、調節物質、拮抗物質又は作動物質は、（ｉ）（好ましくは配列番号１、２又は３を有する）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子、及び／又は（ｉｉ）（好ましくは配列番号１、２又は３を有する）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は（ｉｉｉ）（好ましくは配列番号１、２又は３を有する）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、誘導体若しくは変異体からなる群から選択される１種類以上の物質の発現及び／又はレベル及び／又は活性を変化させる能力を有する。このスクリーニング方法は、（ａ）細胞を試験化合物と接触させること、（ｂ）（ｉ）から（ｉｖ）に列挙する１種類以上の物質の活性及び／又はレベル、又は活性とレベルの両方、及び／又は発現を測定すること、（ｃ）前記試験化合物と接触していない対照細胞において、前記物質の活性及び／又はレベル、又は活性とレベルの両方、及び／又は発現を測定すること、並びに（ｄ）段階（ｂ）と（ｃ）の各細胞中の物質のレベル及び／又は活性及び／又は発現を比較することを含み、接触させた細胞における前記物質の活性及び／又はレベル及び／又は発現の変化によって、試験化合物が神経変性疾患及び障害の治療用の薬剤、調節物質、拮抗物質又は作動物質であることが示される。前記細胞は、本発明で開示する細胞であり得る。

別の一態様においては、本発明は、神経変性疾患、特にＡＤ、又は関連疾患及び障害の治療用の薬剤、調節物質、拮抗物質又は作動物質をスクリーニングする方法を特徴とする。この薬剤、調節物質、拮抗物質又は作動物質は、（ｉ）（好ましくは配列番号１、２又は３を有する）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子、及び／又は（ｉｉ）（好ましくは配列番号１、２又は３を有する）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は（ｉｉｉ）（好ましくは配列番号１、２又は３を有する）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、誘導体若しくは変異体からなる群から選択される１種類以上の物質の発現及び／又はレベル及び／又は活性を変化させる能力を有する。この方法は、（ａ）神経変性疾患又は関連疾患若しくは障害の徴候及び症候を生じやすい、又は既に生じた、非ヒト試験動物に試験化合物を投与すること（前記動物は、本発明で開示する動物モデルであり得る。）、（ｂ）（ｉ）から（ｉｖ）に列挙する１種類以上の物質の活性及び／又はレベル及び／又は発現を測定すること、（ｃ）神経変性疾患又は関連疾患若しくは障害の前記徴候及び症候を同じく生じやすい、又は既に生じた、かかる試験化合物が投与されていない、非ヒト対照動物における前記物質の活性及び／又はレベル及び／又は発現を測定すること、並びに（ｄ）段階（ｂ）と（ｃ）の各動物における前記物質の活性及び／又はレベル及び／又は発現を比較することを含み、非ヒト試験動物における物質の活性及び／又はレベル及び／又は発現の変化によって、試験化合物が、神経変性疾患及び障害の治療用の薬剤、調節物質、拮抗物質又は作動物質であることが示される。

別の実施形態においては、本発明は、（ｉ）上記スクリーニングアッセイ方法によって、神経変性疾患の薬剤、調節物質、拮抗物質又は作動物質を特定する段階と、（ｉｉ）前記薬剤、調節物質、拮抗物質又は作動物質を薬剤担体と混合する段階とを含む、医薬品を製造する方法を提供する。しかし、前記薬剤、調節物質、拮抗物質又は作動物質を、別のタイプのスクリーニング方法及びアッセイによって特定することもできる。

別の態様においては、本発明は、リガンドと（好ましくは配列番号１、２又は３を有する）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質、又はその断片、誘導体若しくは変異体との結合の阻害度又は促進度を求めるために、及び／又は前記化合物と（好ましくは配列番号１、２又は３を有する）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質、又はその断片、誘導体若しくは変異体との結合度を求めるために、化合物を試験するアッセイ、好ましくは複数の化合物をハイスループット形式でスクリーニングするアッセイを規定する。リガンドと、ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質又はその断片、誘導体若しくは変異体との結合の阻害を明らかにするために、前記スクリーニングアッセイは、（ｉ）前記ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質又はその断片、誘導体若しくは変異体の懸濁液を複数の容器に添加する段階、（ｉｉ）前記阻害についてスクリーニングされる化合物又は複数の化合物を前記複数の容器に添加する段階、（ｉｉｉ）検出可能な、好ましくは蛍光標識されたリガンドを前記容器に添加する段階、（ｉｖ）前記ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質又はその前記断片、誘導体若しくは変異体と、前記化合物又は複数の化合物と、前記検出可能な、好ましくは蛍光標識されたリガンドとをインキュベートする段階、（ｖ）前記ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質又はその前記断片、誘導体若しくは変異体と結合したリガンドの量、好ましくはその蛍光を測定する段階、並びに（ｖｉ）前記化合物の１種類以上による、前記リガンドと前記ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質又はその前記断片、誘導体若しくは変異体との結合の阻害度を求める段階を含む。前記ＳＬＣ３９Ａ１２翻訳産物又はその断片、誘導体若しくは変異体を人工リポソーム中に再構成して、対応するタンパク質リポソームを作製し、リガンドと前記ＳＬＣ３９Ａ１２翻訳産物との結合の阻害を求めることが好ましい場合もある。ＳＬＣ３９Ａ１２翻訳産物を洗浄剤からリポソーム中に再構成する方法は、詳述されている（Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９， ３８： ９４５６−９４６４； Ｋｒｉｖｏｓｈｅｅｖ ａｎｄ Ｕｓａｎｏｖ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ｍｏｓｃｏｗ １９９７， ６２： １０６４−１０７３）。蛍光標識リガンドを利用する代わりに、当業者に公知の任意の他の検出可能な標識、例えば放射能標識を使用し、それに応じてその標識を検出することが好ましい態様もあり得る。前記方法は、新規化合物の特定に、並びにリガンドとＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質又はその断片、誘導体若しくは変異体をコードする遺伝子の遺伝子産物との結合を阻害する能力が改善又は最適化された化合物の評価に、有用であり得る。担体粒子の使用に基づく蛍光結合アッセイの一例は、国際公開第００／５２４５１号に開示及び記載されている。更なる例は、国際公開第０２／０１２２６号に記載の競合アッセイ法である。本発明のスクリーニングアッセイのための好ましい信号検出方法は、以下の特許出願、すなわち、国際公開第９６／１３７４４号、同９８／１６８１４号、同９８／２３９４２号、同９９／１７０８６号、同９９／３４１９５号、同００／６６９８５号、同０１／５９４３６号及び同０１／５９４１６号に記載されている。

更なる一実施形態においては、本発明は、（ｉ）上記阻害結合アッセイによって、リガンドとＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子産物との結合の阻害剤として化合物を特定する段階と、（ｉｉ）化合物と薬剤担体を混合する段階とを含む、医薬品を製造する方法を提供する。しかし、前記化合物を他のタイプのスクリーニングアッセイによって特定することもできる。

また、本発明は、化合物を試験して、好ましくは複数の化合物をハイスループット形式でスクリーニングして、前記化合物と（好ましくは配列番号１、２又は３を有する）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質又はその断片、誘導体若しくは変異体との結合度を求めるアッセイを提供する。前記スクリーニングアッセイは、（ｉ）前記ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質又はその断片、誘導体若しくは変異体の懸濁液を複数の容器に添加すること、（ｉｉ）前記結合についてスクリーニングされる、検出可能な、好ましくは蛍光標識された化合物、又は検出可能な、好ましくは蛍光標識された複数の化合物を前記複数の容器に添加すること、（ｉｉｉ）前記ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質又はその前記断片、誘導体若しくは変異体と、前記検出可能な、好ましくは蛍光標識された化合物、又は検出可能な、好ましくは蛍光標識された複数の化合物とをインキュベートすること、（ｉｖ）前記ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質又はその前記断片、誘導体若しくは変異体と結合した化合物の量、好ましくはその蛍光を測定すること、並びに（ｖ）前記化合物の１種類以上による、前記ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質又はその前記断片、誘導体若しくは変異体との結合度を求めることを含む。このタイプのアッセイにおいては、蛍光標識を使用することが好ましい場合がある。しかし、任意の他のタイプの検出可能な標識を使用することもできる。このタイプのアッセイにおいても、ＳＬＣ３９Ａ１２翻訳産物又はその断片、誘導体若しくは変異体を、本発明に記載の人工リポソーム中に再構成することが好ましい場合もある。前記アッセイ方法は、ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質又はその断片、誘導体若しくは変異体との結合能力が改善又は最適化された、新規化合物の特定、及び化合物の評価に有用であり得る。

更なる一実施形態においては、本発明は、（ｉ）上記結合アッセイによって、ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子産物との結合剤として化合物を特定する段階と、（ｉｉ）化合物と薬剤担体を混合する段階とを含む、医薬品を製造する方法を提供する。しかし、前記化合物を他のタイプのスクリーニングアッセイによって特定することもできる。

別の実施形態においては、本発明は、本明細書で特許請求するスクリーニングアッセイによる方法のいずれかによって得ることができる医薬品を規定する。更なる一実施形態においては、本発明は、本明細書で特許請求するスクリーニングアッセイによる方法のいずれかによって得られる医薬品を規定する。

一般に、上記アッセイ及びスクリーニング方法、並びにそれから特定される薬物分子（例えば、薬剤、調節物質、拮抗物質、作動物質）候補は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の治療又は予防に対して適用可能である。

本発明の別の態様は、ＳＬＣ３９Ａ１２をコードする遺伝子の翻訳産物であるタンパク質分子、及び（好ましくは配列番号１、２又は３を有する）前記タンパク質分子又はその断片、誘導体若しくは変異体を、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を検出するための診断上の標的として使用することを特徴とする。

本発明は、さらに、ＳＬＣ３９Ａ１２をコードする遺伝子の翻訳産物であるタンパク質分子、及び（好ましくは配列番号１、２又は３を有する）前記タンパク質分子又はその断片、誘導体若しくは変異体を、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を予防、治療又は改善する薬剤、調節物質、拮抗物質、作動物質、試薬又は化合物のスクリーニング標的として使用することを特徴とする。

本発明は、免疫原と特異的に免疫反応する抗体を特徴とする。前記免疫原は、（好ましくは配列番号１、２又は３を有する）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードするＳＬＣ３９Ａ１２遺伝子の翻訳産物又はその断片、誘導体若しくは変異体である。免疫原は、前記遺伝子の翻訳産物の免疫原エピトープ、抗原エピトープ又は一部を含み得る。翻訳産物の前記免疫原性又は抗原性部分はポリペプチドであり、前記ポリペプチドは動物において抗体応答を誘発し、前記抗体と免疫特異的に結合する。抗体を作製する方法は、当分野で周知である（Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８参照）。本発明では「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、組み換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ）抗体、抗イディオタイプ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、これらの断片など、当分野で公知である抗体の全形態を包含する（Ｄｕｂｅｌ ａｎｄ Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ， Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９９９）。本発明の抗体は、例えば、酵素免疫測定法（例えば、酵素結合免疫吸着検定法、ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法、化学発光免疫測定法、ウエスタンブロット、免疫沈降、抗体マイクロアレイなどの最新技術に基づく種々の診断及び治療方法に有用である（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９９及びＥｄｗａｒｄｓ Ｒ．， Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｅｎｇｌａｎｄ， １９９９参照）。これらの方法は、ＳＬＣ３９Ａ１２遺伝子の翻訳産物又はその断片、誘導体若しくは変異体の検出を含む。

本発明の好ましい実施形態においては、前記抗体は、前記抗体を用いた前記細胞の免疫細胞化学的染色を含む、対象から得られた試料中の細胞の病理学的状態の検出に使用することができる。ここで、既知の健康状態を示す細胞と比較した、前記細胞における染色度又は染色パターンの変化によって、前記細胞の病理学的状態が示される。好ましくは、病理学的状態は、神経変性疾患、特にＡＤに関係する。細胞の免疫細胞化学的染色は、当分野で周知である幾つかの異なる実験法によって実施することができる。しかし、抗体結合を検出する自動化された方法を適用することが好ましい場合もある。ここで、細胞の染色度の測定、又は細胞若しくは細胞下の染色パターン、細胞表面上、若しくは細胞小器官間及び他の細胞内構造間の抗原の形態上の分布の測定は、米国特許第６１５０１７３号に記載の方法によって実施される。

本発明の他の特徴及び利点は、以下の図の説明及び実施例から明らかになるはずである。以下の図の説明及び実施例は、単なる説明のためのものであって、開示の残りの部分を決して限定するものではない。

図：
図１に、ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析によって測定し、比較した、異なるブラーク病期に対応する個体から得たヒト脳組織試料におけるＳＬＣ３９Ａ１２遺伝子由来のｍＲＮＡのレベルの違いの識別を示す。図１によれば、それぞれのｍＲＮＡ種のレベルは、ＡＤの進行と定量的に相関し、したがってＢｒａａｋ及びＢｒａａｋ（Ｂｒａａｋ病期分類）に従った脳組織試料の神経病理学的病期分類によって測定されたＡＤを示す。ブラーク病期０の５名の異なるドナー（Ｃ０１１、Ｃ０１２、Ｃ０２６、Ｃ０２７及びＣ０３２）、ブラーク病期１の７名の異なるドナー（Ｃ０１４、Ｃ０２８、Ｃ０２９、Ｃ０３０、Ｃ０３６、Ｃ０３８及びＣ０３９）、ブラーク病期２の５名の異なるドナー（Ｃ００８、Ｃ０３１、Ｃ０３３、Ｃ０３４及びＤＥ０３）、ブラーク病期３の４名の異なるドナー（Ｃ０２５、ＤＥ０７、ＤＥ１１及びＣ０５７）、及びブラーク病期４の４名の異なるドナー（Ｐ０１２、Ｐ０４６、Ｐ０４７及びＰ０６８）の各々の前頭皮質及び下側頭葉皮質のｃＲＮＡプローブを、それぞれＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ Ａｒｒａｙの分析にかけた。主に下側頭組織において、ブラーク病期に合わせたＳＬＣ３９Ａ１２遺伝子の連続的な上方制御を反映した差が見られる。

図２は、定量ＲＴ−ＰＣＲ分析によって測定したＡＤを表す、異なるブラーク病期に対応する個体から得たヒト脳組織試料におけるＳＬＣ３９Ａ１２遺伝子由来のｍＲＮＡのレベルの違いを検証するためのデータである。Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ急速サーマルサイクリング技術を用いた定量ＲＴ−ＰＣＲを実施し、同じドナーの前頭皮質（Ｆｒｏｎｔａｌ）及び下側頭葉皮質（Ｔｅｍｐｏｒａｌ）のｃＤＮＡをＧｅｎｅＣｈｉｐ解析に使用したのと同様に適用した。データを、その遺伝子発現レベルに有意差を示さない標準遺伝子であるサイクロフィリンＢの値に正規化した。最低のブラーク病期０の試料を高いブラーク病期４を示す試料と比較すると、ＳＬＣ３９Ａ１２の遺伝子発現レベルにおける実質的な差が明らかである。

図３は、定量ＲＴ−ＰＣＲによって、また、９８％信頼水準における中央値の統計学的方法を用いて、測定したＡＤを表す、異なるブラーク病期に対応する個体から得たヒト脳組織試料におけるＳＬＣ３９Ａ１２遺伝子由来のｍＲＮＡの絶対レベルの分析結果である（Ｓａｃｈｓ Ｌ （１９８８） Ｓｔａｔｉｓｔｉｓｃｈｅ Ｍｅｔｈｏｄｅｎ： Ｐｌａｎｕｎｇ ｕｎｄ Ａｕｓｗｅｒｔｕｎｇ． Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐ．６０）。ブラーク病期０から２の対象を含む対照群を規定することによってデータを計算した。このデータを、ブラーク病期３から４を含む進行したＡＤ病理を有する規定の群に対して計算したデータと比較する。上方制御を反映する実質的な差が、前頭及び下側頭葉皮質において見られ、ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析から得られた結果を裏付けている。上方制御を反映する有意差が、ブラーク病期０−２の下側頭葉皮質（Ｔ）をブラーク病期３−４と比較して示され、ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析から得られた結果を裏付けている。前記差は、対照の人の下側頭葉皮質と比較して、進行したＡＤ病理の個体の側頭葉皮質におけるＳＬＣ３９Ａ１２の上方制御を反映している。

図４Ａに、ヒトＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質のアミノ酸配列である配列番号１を示す（スプライスバリアント１、ｓｖ１）（ＵｎｉＰｒｏｔプライマリアクセッション番号Ｑ５０４Ｙ０）。このＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質は、６９１個のアミノ酸を含む。

図４Ｂに、ヒトＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質のアミノ酸配列である配列番号２を示す（スプライスバリアント２、ｓｖ２）（ＵｎｉＰｒｏｔプライマリアクセッション番号Ｑ５ＶＷＶ９）。このＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質は、６９０個のアミノ酸を含む。

図４Ｃに、ヒトＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質のアミノ酸配列である配列番号３を示す（スプライスバリアント３、ｓｖ３）（ＵｎｉＰｒｏｔプライマリアクセッション番号Ｑ５ＶＷＶ８）。このＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質は、６５４個のアミノ酸を含む。

図５Ａに、２６７８個のヌクレオチドを含むＳＬＣ３９Ａ１２ ｓｖ１タンパク質をコードするヒトＳＬＣ３９Ａ１２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である配列番号４を示す（スプライスバリアント１、ｓｖ１）（Ｅｎｓｅｍｂｌ転写物ＩＤ番号ＥＮＳＴ０００００３７７３６９）。

図５Ｂに、２７２５個のヌクレオチドを含むＳＬＣ３９Ａ１２ ｓｖ２タンパク質をコードするヒトＳＬＣ３９Ａ１２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である配列番号５を示す（スプライスバリアント２、ｓｖ２）（Ｅｎｓｅｍｂｌ転写物ＩＤ番号ＥＮＳＴ０００００３７７３７１）。

図５Ｃに、２６３５個のヌクレオチドを含むＳＬＣ３９Ａ１２ ｓｖ３タンパク質をコードするヒトＳＬＣ３９Ａ１２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である配列番号６を示す（スプライスバリアント３、ｓｖ３）（Ｅｎｓｅｍｂｌ転写物ＩＤ番号ＥＮＳＴ０００００２７７６３３）。

図６Ａに、配列番号４のヌクレオチド１５０から２２２５を含む、２０７６個のヌクレオチドを含むヒトＳＬＣ３９Ａ１２ ｓｖ１のコード配列（ｃｄｓ）である配列番号７を示す。

図６Ｂに、配列番号５のヌクレオチド１９９から２２７１を含む、２０７３個のヌクレオチドを含むヒトＳＬＣ３９Ａ１２ ｓｖ２のコード配列（ｃｄｓ）である配列番号８を示す。

図６Ｃに、配列番号６のヌクレオチド２２１から２１８５を含む、１９６５個のヌクレオチドを含むヒトＳＬＣ３９Ａ１２ ｓｖ３のコード配列（ｃｄｓ）である配列番号９を示す。

図７は、定量ＲＴ−ＰＣＲによるＳＬＣ３９Ａ１２転写レベルプロファイリングに使用したプライマー（プライマーＡ、配列番号１０及びプライマーＢ、配列番号１１）と、配列番号４、ＳＬＣ３９Ａ１２ ｃＤＮＡの対応する切取り配列（ｃｌｉｐｐｉｎｇ）との配列アラインメントである。

図８は、ＳＬＣ３９Ａ１２ ｃＤＮＡ配列 配列番号４、ＳＬＣ３９Ａ１２コード配列 配列番号７、及びＳＬＣ３９Ａ１２転写レベルプロファイリングに使用した両方のプライマー配列（配列番号１０、配列番号１１）のアラインメントを示す略図である。配列位置を右側に示す。

図９は、親和性精製されたポリクローナルウサギ抗ＳＬＣ３９Ａ１２抗血清ＨＫＱ１の免疫ブロット（ウエスタンブロット）分析結果である。ヒト脳組織ホモジネートから得られたタンパク質抽出物、及びＣ末端がｍｙｃ標識されたヒトＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質を過剰発現する、安定に形質移入されたＨ４細胞の溶解物から、又は未処理Ｈ４細胞（負の対照）の溶解物から得られたタンパク質抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ポリフッ化ビニリデン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜にブロットし、ＨＫＱ１又は抗ｍｙｃ抗体、続いて適切な西洋わさびペルオキシダーゼ複合二次抗血清でプローブした。ブロットを高感度化学発光基質に浸漬し、発光をＸ線フィルムで検出した。レーン１、４、７はヒト脳新皮質タンパク質抽出物を含み、レーン２、５、８は、形質移入Ｈ４細胞を過剰発現するｍｙｃ標識ヒトＳＬＣ３９Ａ１２から得られたタンパク質抽出物を含み、レーン３、６、９は、未処理Ｈ４細胞から得られたタンパク質抽出物を含む。レーン１から３はＨＫＱ１（１：３０００）でプローブされたものであり、レーン４から６は、特異的ペプチドと一緒にプレインキュベートした後にＨＫＱ１（１：３０００）でプローブされたものであり、レーン７から９は抗ｍｙｃ抗体（１：３０００）でプローブされたものである。「Ｍ」の印を付けたレーンは分子量マーカーを含む。この例によれば、ＨＫＱ１によって、約７０から９０ｋＤａの間を泳動する二重バンド（矢印）が検出される。これは、ＳＬＣ３９Ａ１２完全長タンパク質の翻訳後修飾の異なるアイソフォーム（ｓｖ１、ｓｖ２、ｓｖ３）及び／又は異なる状態の存在を恐らくは示している。この信号は、ヒト脳抽出物（レーン１）では弱く、負の対照細胞抽出物（レーン３）では検出されない。この信号は、特異的ペプチドとのプレインキュベーションによって完全に消失する。抗ｍｙｃ抗体によって、ＳＬＣ３９Ａ１２完全長タンパク質が約７０−９０ｋＤａで泳動する二重バンドとして検出される（レーン８）。ペプチドでブロックされたにもかかわらず、約４０及び約５０ｋＤａでより速く泳動するバンドは、負の対照においても検出されるので（レーン３）、非特異的交差反応性タンパク質である可能性が最も高い。レーン７−９の約４３ｋＤａ及び約５５ｋＤａのバンドは非特異的である。

図１０は、ヒト脳組織におけるＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質の産生及び局在化の免疫組織化学分析結果である。この典型的な例によれば、ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質は、ニューロン及びグリアの核及び細胞質並びに神経網において特異的に免疫検出される。親和性精製されたポリクローナルウサギ抗ＳＬＣ３９Ａ１２抗血清ＨＫＱ１を、間接的免疫蛍光染色に使用した。示したのは、死後の新鮮凍結ヒト側頭前脳試料から得られたアセトン固定クリオスタット切片の免疫蛍光顕微鏡写真である。特異的ＳＬＣ３９Ａ１２免疫反応性は、親和性精製ポリクローナルウサギ抗ＳＬＣ３９Ａ１２抗血清ＨＫＱ１、続いてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８複合ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗血清（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって明らかになり、左側の画像（「ペプチドなし」）中の緑色信号として可視化された。緑色信号は、抗血清を特異的ペプチド抗原と一緒にプレインキュベートして中和（ペプチドブロック）すると消失する（右側の画像「ペプチドあり」）。これによって、免疫反応信号の特異性が確認される。

図１１Ａ及び１１Ｂは、同齢の非ＡＤ対照個体から得られた脳試料と比較して、ＡＤ患者から得られたヒト脳試料において観察される、大脳皮質及び大脳白質におけるＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質発現の増加を例示している。示したのは、括弧内に示したブラーク病期のＡＤ患者及び同齢の非ＡＤ対照ドナーから得られた、死後の新鮮凍結ヒト前脳試料のアセトン固定クリオスタット切片の二重免疫蛍光顕微鏡写真である。特異的ＳＬＣ３９Ａ１２免疫反応性は、親和性精製ポリクローナルウサギ抗ＳＬＣ３９Ａ１２抗血清ＨＫＱ１、続いてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８複合ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗血清（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって明らかになり、緑色信号として可視化された。ニューロン特異的マーカータンパク質ＮｅｕＮを、マウスモノクローナル抗ＮｅｕＮ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、続いてＣｙ３複合ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗血清（Ｊａｃｋｓｏｎ／Ｄｉａｎｏｖａ）によって検出し、赤色で可視化した。核をＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）によって青色に染色した。スケールバーは長さ１００μｍである。略語は、Ｆ 前頭、ＩＴ 下側頭、ｅｘ 終脳新皮質、ｗｍ 終脳白質である。本明細書に記載する知見は代表的なものであり、タンパク質レベルでのＳＬＣ３９Ａ１２発現に関して対照とＡＤ試料の実質的な差を示している。対照では、ＳＬＣ３９Ａ１２免疫反応性レベルの増加が低度から中度である、存在するとしてもほんの極少数の星状細胞（細胞体及びプロセス）を、皮質神経網（図１１Ａ）又は白質（図１１Ｂ）から識別することができる。対照とは異なり、ＡＤ患者の試料は、多数の極度のＳＬＣ３９Ａ１２免疫陽性、恐らくは反応性の星状細胞（細胞体及びプロセス）が、皮質（図１１Ａ）と白質（図１１Ｂ）の両方で一貫して見られる。この知見は、対照と比較して、ＡＤ患者の前脳皮質試料におけるＳＬＣ３９Ａ１２ ｍＲＮＡレベルが増加していることを示す、ｑＰＣＲプロファイリングデータと一致している。したがって、ＳＬＣ３９Ａ１２遺伝子発現の増加とＡＤ病理の関係を裏付けている。

図１２は、ヒトＳＬＣ３９Ａ１２に対するウサギポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロットによる、ｇｍｒ−ＧＡＬ４の制御下にある３つの独立したＳＬＣ３９Ａ１２トランスジェニックハエ系統によって発現されるＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質の検出結果である。等量のタンパク質を各レーンに載せた。レーン１：非トランスジェニック対照ハエ。ＳＬＣ３９Ａ１２は、非トランスジェニック野生型ハエでは発現されない。レーン２：ｗ；遺伝的背景を示すｇｍｒ−ＧＡＬ４／ＴａｕＰ３０１Ｌ対照ハエ。ＳＬＣ３９Ａ１２は、非トランスジェニック対照ハエでも発現されない。レーン３−５：ＳＬＣ３９Ａ１２とＴａｕＰ３０１Ｌを同時発現するハエのホモジネート。注：ＳＬＣ３９Ａ１２は、抗体によって見掛け分子量６６ｋＤ及び１２０ｋＤ（黒矢印）で検出される。トランスジェニックハエでは、ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質は、２量体として主に検出される。使用した遺伝子型は、（１）ｗ１１１８、（２）ｗ；ｇｍｒ−ＧＡＬ４、ＵＡＳ−ＴａｕＰ３１０Ｌ／＋、（３）ｗ；＋／ＵＡＳ−ＳＬＣ３９Ａ１２＃４；ｇｍｒ−ＧＡＬ４、ＵＡＳ−ＴａｕＰ３１０Ｌ／＋、（４）ｗ；＋／ＵＡＳ−ＳＬＣ３９Ａ１２＃３０；ｇｍｒ−ＧＡＬ４、ＵＡＳ−ＴａｕＰ３１０Ｌ／＋、（５）ｗ；ｇｍｒ−ＧＡＬ４、ＵＡＳ−ＴａｕＰ３１０Ｌ／ＵＡＳ−ＳＬＣ３９Ａ１２＃４７であった。

図１３は、ｇｍｒ−ＧＡＬ４の制御下にある３つの独立したＳＬＣ３９Ａ１２トランスジェニックハエ系統によって発現されるＳＬＣ３９Ａ１２ ｍＲＮＡレベルの、ＳＬＣ３９Ａ１２特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによる比較である。反応効率を、ＳＬＣ３９Ａ１２特異的プライマー対のＲＴ−ＰＣＲ反応のサイクル数及び効率によって計算し（Ｅ＝１．７９）、ショウジョウバエハウスキーピング遺伝子（ｒｐ４９、リボソームタンパク質４９）の発現に対して正規化した。この計算に基づくと、ＳＬＣ３９Ａ１２は、ｇｍｒ−ＧＡＬ４（ＴａｕＰ３０１Ｌ）の制御下にあるＴａｕＰ３０１Ｌを発現する対照ハエでは発現されない。ＳＬＣ３９Ａ１２は、ＵＡＳ−ＴａｕＰ３０１Ｌ／ＵＡＳ−ＳＬＣ３９Ａ１２二重トランスジェニックハエにおいて異なるレベルで発現される。発現効率の順は、ＳＬＣ３９Ａ１２＃４７＞ＳＬＣ３９Ａ１２＃４＞ＳＬＣ３９Ａ１２＃３０である。測定を各遺伝子型に対して３つ組で実施した。使用した遺伝子型は、（１）ｗ；ｇｍｒ−ＧＡＬ４、ＵＡＳ−ＴａｕＰ３１０Ｌ／＋、（２）ｗ；＋／ＵＡＳ−ＳＬＣ３９Ａ１２＃４；ｇｍｒ−ＧＡＬ４、ＵＡＳ−ＴａｕＰ３１０Ｌ／＋、（３）ｗ；＋／ＵＡＳ−ＳＬＣ３９Ａ１２＃３０；ｇｍｒ−ＧＡＬ４、ＵＡＳ−ＴａｕＰ３１０Ｌ／＋、（４）ｗ；ｇｍｒ−ＧＡＬ４、ＵＡＳ−ＴａｕＰ３１０Ｌ／ＵＡＳ−ＳＬＣ３９Ａ１２＃４７であった。

図１４は、ショウジョウバエにおけるＳＬＣ３９Ａ１２の過剰発現がＴａｕＰ３０１Ｌのリン酸化を加速することを示す。ＴａｕＰ３０１Ｌのリン酸化Ｓｅｒ２１４を定量すると、対照ハエ（ＴａｕＰ３０１Ｌ）と比較して、ＴａｕＰ３０１ＬとＳＬＣ３９Ａ１２（＃４、＃４７）を同時発現する３つのハエ系統のうち２つにおいて、ＴａｕＰ３０１Ｌリン酸化が投与量に依存してかなり増加することが明らかになった。ＳＬＣ３９Ａ１２＃４及び＃４７が、ＳＬＣ３９Ａ１２＃３０よりも強く発現されることに注意されたい。統計解析をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ３．０２によって実施した。ｎ＝１２／遺伝子型、ｐ＝＜０．００２。使用した遺伝子型は、（１）ｗ；ｇｍｒ−ＧＡＬ４、ＵＡＳ−ＴａｕＰ３１０Ｌ／＋、（２）ｗ；＋／ＵＡＳ−ＳＬＣ３９Ａ１２＃４；ｇｍｒ−ＧＡＬ４、ＵＡＳ−ＴａｕＰ３１０Ｌ／＋、（３）ｗ；＋／ＵＡＳ−ＳＬＣ３９Ａ１２＃３０；ｇｍｒ−ＧＡＬ４、ＵＡＳ−ＴａｕＰ３１０Ｌ／＋、（４）ｗ；ｇｍｒ−ＧＡＬ４、ＵＡＳ−ＴａｕＰ３１０Ｌ／ＵＡＳ−ＳＬＣ３９Ａ１２＃４７であった。

図１５は、Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｍｕｔａｎｔ ＡＰＰを安定に同時発現するＨ４神経こう腫細胞におけるＳＬＣ３９Ａ１２発現のウエスタンブロット分析結果である。ＳＬＣ３９Ａ１２をＣ末端においてｍｙｃ標識し、組織培養細胞に導入した。ＳＬＣ３９Ａ１２の発現は、ＣＭＶプロモーターによって駆動される。細胞を収集し、溶解し、ｍｙｃエピトープに対する抗体を用いたウエスタンブロット分析に１：３０００希釈にて供した。レーンＢにおいて、約８５ｋＤａで泳動するバンドが見えるようになった。無関係なタンパク質を発現する対照細胞系では、同じ分子量で泳動する、対応するバンドは見られない（レーンＡ）。

図１６は、免疫蛍光分析による、Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｍｕｔａｎｔ ＡＰＰを安定に発現するＨ４神経こう腫細胞におけるＳＬＣ３９Ａ１２発現結果である。ＳＬＣ３９Ａ１２をＣ末端においてｍｙｃ標識し、組織培養細胞に導入した。ＳＬＣ３９Ａ１２の発現は、ＣＭＶプロモーターの制御下にある。ＳＬＣ３９Ａ１２を発現する細胞をカバーガラス上に蒔き、インキュベーション２４時間後、細胞を免疫蛍光分析用にメタノールで固定した。ＳＬＣ３９Ａ１２の発現をｍｙｃエピトープに対する抗体を用いて１：３０００希釈で検出し、続いて抗ｍｙｃ抗体に対する蛍光標識抗体と一緒にインキュベートした（１：１０００）。次いで、細胞を顕微鏡スライドに載せ、蛍光顕微鏡を用いて分析した。ＳＬＣ３９Ａ１２の発現を細胞質中及び細胞血しょう膜において可視化した（左及び中央の写真。細胞の境界における強い発現を指し示す矢じりは、膜における局在化を示している。）。矢印は、細胞核を示す。緑色蛍光は検出されず、ＳＬＣ３９Ａ１２が発現していないことを示している。左及び右の写真の青色は、細胞核を示し、ＤＡＰＩ（１：１０００）によって可視化された。

図１７は、亜鉛取り込みアッセイによる、亜鉛輸送体としてのＳＬＣ３９Ａ１２の機能の検証結果である。ａ）５０μＭ亜鉛又はｂ）２５μＭ亜鉛／イオノフォアの適用から６０分後の、ＳＬＣ３９Ａ１２又はＳＬＣ３９Ａ１を過剰発現する接着Ｈ４細胞における亜鉛蓄積を示す。（ＲＦＵ＝相対蛍光単位）。ＲＦＵ信号は、ＳＬＣ３９Ａ１２及びＳＬＣ３９Ａ１を過剰発現するＨ４又はＨ４ＡＰＰｓｗ細胞では、６０分後に亜鉛が対照細胞の１．５−２倍蓄積したことを示している。亜鉛／イオノフォアを細胞に添加すると、輸送体とは無関係な亜鉛流入が細胞中で発現し、亜鉛のみと一緒にインキュベートした細胞の約７倍の蛍光値をもたらす。統計解析のために、表中の亜鉛及び亜鉛／イオノフォア処理細胞のＲＦＵ値をＨ４対照細胞のＲＦＵ値とＴ検定分析によって９５％の信頼区間で比較した。Ｔ検定分析によれば、ＳＬＣ３９Ａ１２及びＳＬＣ３９Ａ１を過剰発現する細胞の蛍光信号は、亜鉛の存在下でＨ４対照細胞と比較して統計的に有意であり、亜鉛イオンの取り込みが増加したことを示している。亜鉛／イオノフォア処理細胞の場合には統計的有意差は認められず、同一量の細胞が蒔かれたことを示している。要するに、ＳＬＣ３９Ａ１２は、Ｈ４細胞において過剰発現されると、亜鉛の細胞内濃度を増加させる。したがって、ＳＬＣ３９Ａ１２が亜鉛輸送体として機能していることが証明された。

ヒト脳組織試料において、アルツハイマー病に関係して差次的に発現される遺伝子の特定及び検証。

ＡＤ関連遺伝子の発現における特異的差を確認するために、臨床的及び神経病理学的に特徴が十分明らかである個体から得たヒト脳組織標本由来の多様なｃＲＮＡプローブを用いて、ＧｅｎｅＣｈｉｐマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）分析を実施した。この技術は、同義遺伝子の発現プロファイルを作製し、異なる組織試料中に存在するｍＲＮＡ集団を比較するために、広く用いられている。本発明においては、選択した死後の脳組織標本（前頭及び下側頭葉皮質）中に存在するｍＲＮＡ集団を分析した。健康な対照個体（ブラーク０）からＡＤの徴候及び症候を示す個体（ブラーク４）までの全範囲を反映した異なるブラーク病期にグループ分けすることができる個体から組織試料を得た。個々の遺伝子の差次的発現を、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを用いた実時間定量ＰＣＲを適用して検証した。また、健康な段階と疾患段階の特異的差を、免疫組織化学分析用の遺伝子産物特異的抗体を用いてタンパク質レベルで解析した。これらの方法を、疾患の初期に発生する病理学的現象を示す、初期のブラーク病期における発現レベルの差を特異的に検出するように設計した。したがって、差次的であることが確認された前記遺伝子は、ＡＤの原因に有効に関係付けられる。

（ｉ）ＡＤ患者からの脳組織解剖体：
ＡＤ患者及び同齢対照対象から脳組織を収集した。死後６時間以内に、試料をドライアイスで即座に凍結した。各組織から得た試料切片をパラホルムアルデヒドで固定し、神経原線維の病理の種々の段階において、Ｂｒａａｋ ａｎｄ Ｂｒａａｋに従ってブラーク病期（０−６）に神経病理学的に分類した。差次的発現分析のための脳領域を特定し、ＲＮＡの抽出を実施するまで−８０℃で保存した。

（ｉｉ）全ｍＲＮＡの単離：
ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造者の手順に従って全ＲＮＡを死後の凍結脳組織から抽出した。２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いた真核生物全ＲＮＡ Ｎａｎｏ ＬａｂＣｈｉｐシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を適用して、正確なＲＮＡ濃度及びＲＮＡ品質を求めた。調製したＲＮＡの更なる品質試験のために、すなわち部分的分解を排除し、ＤＮＡ混入を検査するために、基準対照として特別に設計されたイントロンＧＡＰＤＨオリゴヌクレオチド及びゲノムＤＮＡを利用して、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ技術（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、製造者によって提供された手順書に記載のように融解曲線を作製した。

（ｉｉｉ）プローブ合成：
ここでは、（ｉｉ）に記載したように抽出した全ＲＮＡを出発材料として用いた。ｃＤＮＡを作製するために、ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを製造者（Ｒｏｃｈｅ）の手順に従って実施した。インビトロ転写Ｔ７−Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ−Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を製造者の手順に従って適用して、ｃＤＮＡ試料をｃＲＮＡに転写し、ビオチンで標識した。２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いたｍＲＮＡ Ｓｍｅａｒ Ｎａｎｏ ＬａｂＣｈｉｐシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を適用して、ｃＲＮＡの品質を確認した。正確なｃＲＮＡ濃度を光分析（ＯＤ２６０／２８０ｎｍ）によって測定した。

（ｉｖ）ＧｅｎｅＣｈｉｐハイブリダイゼーション：
精製、断片化されたビオチン標識ｃＲＮＡプローブを、市販スパイクコントロール（ｓｐｉｋｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）ｂｉｏＢ（１．５ｐＭ）、ｂｉｏＣ（５ｐＭ）、ｂｉｏＤ（２５ｐＭ）及びｃｒｅ（１００ｐＭ）と一緒に、各々６０ｎｇ／μｌの濃度でハイブリダイゼーション緩衝剤（０．１ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ、０．５ｍｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ、１×ＭＥＳ）に再懸濁させ、続いて９９℃で５分間変性した。続いて、プローブを１つのプレハイブリダイズ（１×ＭＥＳ）されたＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に各々適用した。アレイハイブリダイゼーションを４５℃及び６０ｒｐｍで終夜実施した。ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＣＯＳ）１．２（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）によって制御された指示ＥｕｋＧｅ＿ＷＳ２ｖ４（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に従ってマイクロアレイを洗浄し、染色した。

（ｖ）ＧｅｎｅＣｈｉｐデータ解析：
ＧＣＯＳ １．２ソフトウェア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）によって制御されたＧｅｎｅＳｃａｎｎｅｒ ３０００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて蛍光生データを収集した。ＤｅｃｉｓｉｏｎＳｉｔｅ ８．０ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｓｐｏｔｆｉｒｅ）を用いてデータ解析を実施した。生データを、ＧＣＯＳ １．２ソフトウェア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）によって「ｐｒｅｓｅｎｔ」と印を付けられた生データに限定した。生データをパーセンタイル値によって正規化した。Ｓｐｏｔｆｉｒｅソフトウェアのプロファイル検索ツールを用いて、差次的ｍＲＮＡ発現プロファイルを検出した。ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子に対するかかるＧｅｎｅＣｈｉｐデータ解析の結果を図１に示す。

（ｖｉ）定量ＲＴ−ＰＣＲ：
差次的ＳＬＣ３９Ａ１２遺伝子発現の積極的確証（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｒｒｏｂｏｒａｔｉｏｎ）をＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ技術（Ｒｏｃｈｅ）を用いて実施した。この技術は、ポリメラーゼ連鎖反応のための急速サーマルサイクリング、及び増幅中の蛍光信号の実時間測定を特徴とし、したがって、終点の読み取りではなく、動力学的読み取りによって、ＲＴ−ＰＣＲ産物を極めて正確に定量することができる。ＡＤ患者及び同齢対照個体それぞれの前頭及び側頭皮質から得られたＳＬＣ３９Ａ１２ ｃＤＮＡの相対量を、ブラーク病期１つにつき４から９個の組織において測定した。

まず、検量線を作成して、ＳＬＣ３９Ａ１２をコードする遺伝子に特異的な以下のプライマーを用いたＰＣＲの効率を求めた。

プライマーＡ、配列番号１０、５’−ＧＧＡＴＴＡＴＡＣＡＴＴＧＧＣＣＴＴＴＣＣＧ−３’（配列番号４のヌクレオチド２０４３−２０６４）及びプライマーＢ、配列番号１１、３’−ＣＡＣＡＡＣＧＡＣＣＣＴＧＧＡＴＧＡＴＧ−５’（配列番号４のヌクレオチド２１７０−２１８９）。

ＰＣＲ増幅（９５℃１秒、５６℃５秒及び７２℃５秒）を、（ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、反応緩衝剤、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを含むｄＮＴＰ混合物、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ色素及び１ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含む）ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ混合物（Ｒｏｃｈｅ）、０．５μＭプライマー、ｃＤＮＡ希釈シリーズ（ヒト全脳ｃＤＮＡ ４０、２０、１０、５、１及び０．５ｎｇの最終濃度；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）２μｌ及び追加の３ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含む２０μｌの体積で実施した。融解曲線分析によれば、約８２．５℃に単一ピークが出現し、プライマーの２量体は見られなかった。２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いたＤＮＡ ５００ ＬａｂＣｈｉｐシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を適用して、ｑＰＣＲ産物の品質及びサイズを求めた。ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子に対する１４７ｂｐの予想サイズにおける単一ピークが、試料の電気泳動図において認められた。

ＭｇＣｌ_２（３ｍＭの代わりに追加の１ｍＭを添加した。）以外は同様にして、特異的プライマー配列番号１２、５’−ＡＣＴＧＡＡＧＣＡＣＴＡＣＧＧＧＣＣＴＧ−３’及び配列番号１３、５’−ＡＧＣＣＧＴＴＧＧＴ−ＧＴＣＴＴＴＧＣＣ−３’を用い、ｑＰＣＲプロトコルを適用して、サイクロフィリンＢのＰＣＲ効率を求めた。融解曲線分析によれば、約８７℃に単一ピークが出現し、プライマーの２量体は見られなかった。ＰＣＲ産物のＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ分析では、予想サイズ（６２ｂｐ）の単一ピークが出現した。

基準値を計算するために、まず、使用ｃＤＮＡ濃度の対数をＳＬＣ３９Ａ１２及びサイクロフィリンＢそれぞれのしきいサイクル値Ｃ_ｔに対してプロットした。検量線の傾き及び切片（すなわち線形回帰）を計算した。第２の段階において、対照及びＡＤ患者の前頭及び下側頭葉皮質のｍＲＮＡ発現を並行して分析した。Ｃ_ｔ値を測定し、対応する検量線を用いてｎｇ全脳ｃＤＮＡに換算した：
１０＾（Ｃ_ｔ値−切片）／傾き ［ｎｇ全脳ｃＤＮＡ］
計算したｃＤＮＡ濃度値を、各試験組織プローブに対して並行分析したサイクロフィリンＢに対して正規化した。したがって、得られた値は、任意の相対発現レベルとして定義される。ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子に対するかかる定量ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を図２に示す。

（ｖｉｉ）異なるブラーク病期のドナー群と比較したｍＲＮＡ発現の統計解析。

この分析のために、異なる実験間の異なる時点における実時間定量ＰＣＲ（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ法）の絶対値は、標準物質を使用せずに定量的比較に使用するのに十分一貫していることが証明された。１００を超える組織に対するｑＰＣＲ実験のいずれにおいても正規化のための標準としてサイクロフィリンを使用した。とりわけ、サイクロフィリンは、正規化実験において最も一貫して発現されるハウスキーピング遺伝子であることが判明した。したがって、概念の証明を、サイクロフィリンのために作成された値を用いて行った。

第１の分析には、３名の異なるドナー由来の前頭皮質及び下側頭葉皮質組織のｑＰＣＲ実験から得られたサイクロフィリン値を用いた。各組織から同じｃＤＮＡ調製物を全部の分析実験に使用した。この分析内では、データ数が少ないので、値の正規分布は得られなかった。したがって、中央値の方法及びその９８％信頼水準を適用した（Ｓａｃｈｓ Ｌ （１９８８） Ｓｔａｔｉｓｔｉｓｃｈｅ Ｍｅｔｈｏｄｅｎ： Ｐｌａｎｕｎｇ ｕｎｄ Ａｕｓｗｅｒｔｕｎｇ． Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐ．６０）。この分析によれば、中央の偏差（ｍｉｄｄｌｅ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）は、絶対値の比較では中央値から８．７％であり、相対比較では中央値から６．６％であった。

第２の分析では、各々２名の異なるドナー由来の前頭皮質及び下側頭葉皮質組織のｑＰＣＲ実験から得られたサイクロフィリン値を用いたが、異なる時点からの異なるｃＤＮＡ調製物を使用した。この分析によれば、中央の偏差（ｍｉｄｄｌｅ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）は、絶対値の比較では中央値から２９．２％であり、相対比較では中央値から１７．６％であった。この分析から、ｑＰＣＲ実験から得られた絶対値は使用することができるが、中央値からの中央の偏差は更に考慮すべきと結論された。

ＳＬＣ３９Ａ１２に対する絶対値の詳細な分析を、中央値の方法及びその９８％信頼水準を用いて実施した。平均とは対照的に、中央値の計算は、単一のデータ異常値に影響されないので、非正規及び／又は非対称（ａｓｓｙｍｅｔｒｉｃ）分布の少数データに最適な方法である（Ｓａｃｈｓ Ｌ （１９８８） Ｓｔａｔｉｓｔｉｓｃｈｅ Ｍｅｔｈｏｄｅｎ： Ｐｌａｎｕｎｇ ｕｎｄ Ａｕｓｗｅｒｔｕｎｇ． Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐ．６０）。したがって、ＳＬＣ３９Ａ１２の絶対レベルを、サイクロフィリンを用いた相対正規化後に使用した。中央値及び９８％信頼水準を、低レベルブラーク病期（ブラーク０−ブラーク２）からなる群及び高レベルブラーク病期（ブラーク３−ブラーク４）からなる群に対して計算した。分析は、ＡＤ病理の過程におけるｍＲＮＡ発現差の初期の発生を確認することを目的にした。前記分析結果を図３に示す。

（ｖｉｉｉ）特異抗体の作製：
ヒトＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質を特異的に認識する抗体を、標準免疫化プロトコルと、それに続く生成ポリクローナル免疫血清の親和性精製によって、ウサギにおいて作製した（Ｄａｖｉｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ＧｍｂＨ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。ヒトＳＬＣ３９Ａ１２完全長タンパク質の独特のアミノ酸配列切取り配列を模倣して、特異抗原ペプチドを設計し、合成した。例えば、ヒトＳＬＣ３９Ａ１２完全長タンパク質の４２８位から４３４位に対応する独特のアミノ酸配列であるペプチドＨＫＱＥＡＰＥＦＧＨＦＨＥＳＫＧＨ（アミノ末端からカルボキシ末端まで、１文字表記）を、免疫化及び親和性精製用の特異抗原として選択し、合成した。得られた親和性精製抗血清を「ＨＫＱ１」と呼ぶ。その特異性及び感受性を、ヒト脳組織ホモジネートから調製されたタンパク質抽出物、及びｍｙｃ標識ヒトＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質を過剰発現する、安定に形質移入された細胞、又は負の対照としての非形質導入未処理細胞の細胞溶解物から調製されたタンパク質抽出物を用いて、免疫ブロットによって確認した。抗体を対応する特異的ペプチドと一緒にプレインキュベートして中和すると、免疫反応信号が消失し、その特異性（ペプチドブロック）が確認された。これを、免疫ブロット及び組織切片（免疫蛍光組織学、免疫組織化学）について実施した。

（ｉｘ）免疫組織化学分析を適用した、ＳＬＣ３９Ａ１２遺伝子の差次的発現、及びタンパク質レベルにおけるＡＤとの関連性の検証：
ヒト脳におけるＳＬＣ３９Ａ１２の免疫蛍光染色のために、また、ＡＤ患部組織を対照組織と比較するために、（上文及び下文で単に「ブラーク病期」と称する）Ｂｒａａｋ ａｎｄ Ｂｒａａｋによる神経原線維病理の種々の病期にある、臨床的に診断され、神経病理学的に確認されたＡＤ患者を含むドナーから得られた死後の新鮮凍結前頭及び側頭前脳試料、並びにＡＤの臨床学的徴候も神経病理学的徴候もない同齢の非ＡＤ対照個体から得られた死後の新鮮凍結前頭及び側頭前脳試料を、クリオスタット（Ｌｅｉｃａ ＣＭ３０５０Ｓ）によって厚さ１４μｍに切断した。組織切片を室温で風乾し、アセトンで１０分間固定し、再度風乾した。ＰＢＳで洗浄後、切片を１０％正常ヤギ血清のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液と一緒に３０分間プレインキュベートし、次いでブロッキング緩衝剤（１％ウシ血清アルブミンのＰＢＳ溶液）で１：２０希釈した、親和性精製抗ＳＬＣ３９Ａ１２ウサギポリクローナル抗血清ＨＫＱ１と一緒に４℃で終夜インキュベートした。ＰＢＳで３回リンス後、切片を、ブロッキング緩衝剤で１：１５００希釈したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８複合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗血清（Ｊａｃｋｓｏｎ／Ｄｉａｎｏｖａ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と一緒に室温で２時間インキュベートし、次いでＰＢＳで再度洗浄した。（核を含む）ニューロン細胞体の同時染色を、ニューロン特異的マーカータンパク質ＮｅｕＮに対するマウスモノクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、ＵＫ；１：３５０希釈）、続いて二次Ｃｙ３複合ヤギ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ／Ｄｉａｎｏｖａ；１：１０００希釈）を用いて、上述したように実施した。切片を０．５μＭ ＤＡＰＩのＰＢＳ溶液と一緒に３分間インキュベートすることによって核を染色した。リポフスチンの自己蛍光を遮断するために、切片を親油性黒色色素スダンブラックＢ（１％ｗ／ｖ）の７０％エタノール溶液で室温で５分間処理し、次いで７０％エタノール、蒸留水及びＰＢＳに順次浸漬した。切片をＰｒｏＬｏｎｇ−Ｇｏｌｄ抗退色（ａｎｔｉｆａｄｅ）封入剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で覆った（ｃｏｖｅｒｓｌｉｐｐｅｄ）。水銀灯を備えた正立顕微鏡（ＢＸ５１、Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、顕微鏡落射蛍光画像を得た。適切な二色フィルターと鏡の組合せ（以下、「チャネル」と呼ぶ。）を、蛍光色素（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８、Ｃｙ３、ＤＡＰＩ）の特異的励起に、また、前記抗体による特異的標識に起因する放射蛍光、又は核ＤＡＰＩ染色の読み取りに、使用した。顕微鏡画像を、電荷結合ディスプレイカメラ及び適切な画像収集・処理ソフトウェア（ＣｏｌｏｒＶｉｅｗ−ＩＩ ａｎｄ ＡｎａｌｙＳＩＳ、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｓｏｆｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＧｍｂＨ、Ｍｕｎｓｔｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてデジタル方式で取り込んだ。例えば３つの異なるチャネルからの信号が共存する可能性を解析するために、上で指定した免疫標識及び核（ＤＡＰＩ）をＲＧＢモードで同時表示させるために、異なるチャネルから得られた蛍光顕微鏡写真を重ね合わせた。

トランスジェニックキイロショウジョウバエ、及び細胞を用いた亜鉛取り込みアッセイを使用した、ＡＤにおけるＳＬＣ３９Ａ１２の機能の分析。

ヒトＢＡＣＥトランスジェニックハエをＧｒｅｅｖｅ等（Ｇｒｅｅｖｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２００４， ２４： ３８９９−３９０６）に従って作製した。ヒトＴａｕＰ３０１Ｌトランスジェニックハエ及びＳＬＣ３９Ａ１２ｍｙｃトランスジェニックハエを以下の通り作製した。ヒト微小管関連タンパク質タウアイソフォームＮＰ＿００５９０１．２（ＲｅｆＳｅｑペプチドＩＤ）のオープンリーディングフレーム全体を含む１．４ｋｂ ＥｃｏＲＩ制限酵素断片を、ＧＡＬ４結合部位ＵＡＳ下流のｐＵＡＳＴのＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした（Ｂｒａｎｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｉｍｏｎ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １９９３， １１８： ４０１−１５）。ＣからＴへの（ｃＣ／Ｔｇｇｇａｇｇｃｇ）変異を導入して、アミノ酸位置３０１のプロリン（ＣＣＧ）をロイシン（ＣＴＧ）に変更した（ＴａｕＰ３０１Ｌ、ｃＤＮＡはＪｕｒｇｅｎ Ｇｏｅｔｚの好意によって提供された。Ｇｏｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１； ２４ Ｖｏｌ．２９３． ｎｏ．５５３４， ｐｐ．１４９１−１４９５）。Ｃ末端がｍｙｃ標識されたＳＬＣ３９Ａ１２（ＳＬＣ３９Ａ１２ｍｙｃ）のオープンリーディングフレーム全体を含む２１２２ｂｐ ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ制限酵素断片を、ＧＡＬ４結合部位ＵＡＳ下流のｐＵＡＳＴのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位にサブクローニングした（Ｂｒａｎｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｉｍｏｎ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １９９３， １１８： ４０１−１５）。Ｐ因子によって媒介される生殖系列形質転換を、Ｓｐｒａｄｌｉｎｇ ａｎｄ Ｒｕｂｉｎによって記述されたように実施した（Ｒｕｂｉｎ ａｎｄ Ｓｐｒａｄｌｉｎｇ， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８２， ２１８： ３４８−５３； Ｓｐｒａｄｌｉｎｇ ａｎｄ Ｒｕｂｉｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８２， ２１８： ３４１−７）。３つの独立したヒトＴａｕＰ３０１Ｌトランスジェニックハエ系統を作製し、完全長タウタンパク質の発現について試験した。１３の独立したＳＬＣ３９Ａ１２ｍｙｃトランスジェニックハエ系統を作製し、３系統を分析用に選択した。

ヒトＡＰＰ及びショウジョウバエプレセニリントランスジェニックハエ、ＵＡＳ−ＡＰＰ６９５ＩＩ及びＵＡＳ−ＤＰｓｎ変異体（Ｌ２３５Ｐ）は、Ｒ． Ｐａｒｏ及びＥ． Ｆｏｒｔｉｎｉの好意によって提供された（Ｆｏｓｓｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９８， ９５： １３７０３−８； Ｙｅ ａｎｄ Ｆｏｒｔｉｎｉ， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９９， １４６： １３５１−６４）。Ｆ． Ｐｉｇｎｏｎｉから入手したｇｍｒ−ＧＡＬ４ドライバー系統（ｄｒｉｖｅｒ ｌｉｎｅ）を用いて、導入遺伝子の眼特異的発現を実施した。

（ｉ）トランスジェニックハエの遺伝学：
遺伝的交雑を標準ショウジョウバエ培地上で２５℃で設定した。使用した遺伝子型は、ｗ；ＵＡＳ−ｈＡＰＰ６９５、ＵＡＳ−ｈＢＡＣＥ４３７／ＣｙＯ；ｇｍｒ−ＧＡＬ４／Ｔｍ３ − ｗ；ＵＡＳ−ｈＡＰＰ６９５、ＵＡＳ−ｈＢＡＣＥ４３７／ＣｙＯ；ｇｍｒ−ＧＡＬ４、ＵＡＳ−ＤＰｓｎＬ２３５Ｐ／Ｔｍ３ − ｗ；ｇｍｒ−ＧＡＬ４、ＵＡＳ−ＴａｕＰ３１０Ｌ／Ｔｍ６ − ｗ；ＵＡＳ−ＳＬＣ３９Ａ１２ｍｙｃ＃４（第２染色体、同型接合生存性） − ｗ；ＵＡＳ−ＳＬＣ３９Ａ１２ｍｙｃ＃３０（第２染色体、同型接合生存性） − ｗ；ＵＡＳ−ＳＬＣ３９Ａ１２ｍｙｃ＃４７（第３染色体、同型接合生存性）であった。

（ｉｉ）免疫ブロット分析によるＳＬＣ３９Ａ１２トランスジェニックハエの発現解析：
ウエスタンブロット法によるタンパク質分析のために、ハエの頭部を１×ＰＢＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及びプロテアーゼ−阻害剤混合物Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）中でホモジナイズした。等量のタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＧｍｂＨ）に移し、５％低脂肪乳で室温で２時間ブロックし、ウサギポリクローナル抗体ＨＫＱ１（抗ＳＬＣ３９Ａ１２）と一緒にインキュベートした。結合した抗体をヤギ抗ウサギペルオキシダーゼ複合二次抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）によって検出した。

（ｉｉｉ）ＲＴ−ＰＣＲによるＳＬＣ３９Ａ１２トランスジェニックハエの発現解析：
トランスジェニックショウジョウバエにおけるトランスジェニックＳＬＣ３９Ａ１２発現を検出するために、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ反応）反応を、本発明に記載のように（実施例（ｖｉ））、ＳＬＣ３９Ａ１２特異的プライマー（５’−ＧＧＡＴＴＡＴＡＣＡＴＴＧＧＣＣＴＴＴＣＣＧ、３’−ＣＡＴＣＡＴＣＣＡＧ ＧＧＴＣＧＴＴＧＴＧ）を用いて実施した。

（ｉｖ）ｐＳｅｒ２１４特異的ＥＬＩＳＡ：
１０個のハエの頭部を、ホスファターゼ阻害剤（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４；１００ｍＭ ＮａＣｌ；１ｍＭ ＥＤＴＡ；１ｍＭ ＥＧＴＡ；１ｍＭ ＮａＦ；２０ｍＭ Ｎａ４Ｐ２Ｏ７；２ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４；１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００；１０％グリセリン；０．１％ＳＤＳ；０．５％デオキシコレート、１０μＭオカダ酸）を含む細胞溶解緩衝剤５０μｌ中でホモジナイズした。溶解物を１３０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を１：１００希釈で使用して、ＴａｕＰ３０１ＬのＳｅｒ２１４におけるリン酸化を、Ｈｕｍａｎ Ｔａｕ［ｐＳ２１４］Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を用いて製造者の手順に従って測定した。リン酸化Ｓ２１４の量を、Ｈｕｍａｎ Ｔａｕ［全量］Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を用いて、ＴａｕＰ３０１Ｌの総量に対して正規化した。同じ溶解物を１：８０００希釈で使用した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ３．０２を統計解析に使用した。

（ｖ）ＳＬＣ３９Ａ１２又はＳＬＣ３９Ａ１を安定に発現する細胞の作製：
ＳＬＣ３９Ａ１２又はＳＬＣ３９Ａ１を、Ｓｗｅｄｉｓｈ変異アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を発現するＨ４神経こう腫細胞系に導入し、抗生物質Ｇ４１８を基本的に製造者の手順に従って添加した後、クローン細胞系を単離した（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２１７５６１）。ＳＬＣ３９Ａ１２とＳＬＣ３９Ａ１の両方のＣ末端をｍｙｃエピトープで標識して、免疫蛍光における分析ができるようにした。

（ｖｉ）亜鉛取り込みアッセイ：
１×１０^４個の細胞を３８４ウェル細胞培養プレート（黒色、透明底）に蒔き、３７℃及び８．５％ＣＯ２で終夜インキュベートした。培地を除去し、細胞を５０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．０からなる緩衝剤５０μｌで１回洗浄し、３．５ｍＭ ＦｌｕｏＺｉｎ １（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｆ−２４１８１）を含む５０ｍＭ ＭＯＰＳ中で３７℃及び８．５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。クエンチャー（５０ｍＭ ＭＯＰＳ中のＢｒｉｌｌａｎｔ Ｂｌａｃｋ、ｐＨ７．０）を適用して、培地のバックグラウンド蛍光を減少させ、亜鉛特異的イオノフォアのピリチオン（Ｓｉｇｍａ Ｈ７０２９）２５μＭと一緒に５０μＭ亜鉛又は２５μＭ亜鉛を添加した。６０分後に蛍光強度を、ＢＭＧ Ｆｌｕｏｓｔａｒリーダーを用いて測定した。緩衝剤対照の平均ＲＦＵ（相対蛍光単位）を、亜鉛及び亜鉛／イオノフォア処理細胞のＲＦＵ値から差し引いた。統計解析のために、ＳＬＣ３９Ａ１２又はＳＬＣ３９Ａ１を過剰発現する亜鉛又は亜鉛／イオノフォア処理細胞のＲＦＵ値を、９５％信頼区間のＴ検定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）によって、亜鉛適用から６０分後に、亜鉛又は亜鉛／イオノフォア処理対照細胞のＲＦＵ値と比較した。少なくとも２つの独立した実験から得られたデータを組み合わせた（ｎ≧８）。

ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析によって測定し、比較した、異なるブラーク病期に対応する個体から得たヒト脳組織試料におけるＳＬＣ３９Ａ１２遺伝子由来のｍＲＮＡのレベルの違いの識別を示すグラフである。このグラフは、それぞれのｍＲＮＡ種のレベルがＡＤの進行と定量的に相関し、したがってＢｒａａｋ ａｎｄ Ｂｒａａｋ（ブラーク病期分類）に従った脳組織試料の神経病理学的病期分類によって測定されたＡＤを表すことを示している。 定量ＲＴ−ＰＣＲ分析によって測定したＡＤを表す、異なるブラーク病期に対応する個体から得たヒト脳組織試料におけるＳＬＣ３９Ａ１２遺伝子由来のｍＲＮＡのレベルの違いを検証するためのデータである。 定量ＲＴ−ＰＣＲによって、また、９８％信頼水準における中央値の統計学的方法を用いて、測定したＡＤを表す、異なるブラーク病期に対応する個体から得たヒト脳組織試料におけるＳＬＣ３９Ａ１２遺伝子由来のｍＲＮＡの絶対レベルの分析結果を示すグラフである。 ヒトＳＬＣ３９Ａ１２スプライスバリアント１タンパク質のアミノ酸配列である配列番号１を示す図である。 ヒトＳＬＣ３９Ａ１２スプライスバリアント２タンパク質のアミノ酸配列である配列番号２を示す図である。 ヒトＳＬＣ３９Ａ１２スプライスバリアント３タンパク質のアミノ酸配列である配列番号３を示す図である。 ヒトＳＬＣ３９Ａ１２スプライスバリアント１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である配列番号４を示す図である。 ヒトＳＬＣ３９Ａ１２スプライスバリアント１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である配列番号４を示す図である。 ヒトＳＬＣ３９Ａ１２スプライスバリアント２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である配列番号５を示す図である。 ヒトＳＬＣ３９Ａ１２スプライスバリアント２ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である配列番号５を示す図である。 ヒトＳＬＣ３９Ａ１２スプライスバリアント３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である配列番号６を示す図である。 ヒトＳＬＣ３９Ａ１２スプライスバリアント３ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である配列番号６を示す図である。 ヒトＳＬＣ３９Ａ１２スプライスバリアント１のコード配列（ｃｄｓ）である配列番号７を示す図である。 ヒトＳＬＣ３９Ａ１２スプライスバリアント２のコード配列（ｃｄｓ）である配列番号８を示す図である。 ヒトＳＬＣ３９Ａ１２スプライスバリアント３のコード配列（ｃｄｓ）である配列番号９を示す図である。 定量ＲＴ−ＰＣＲによるＳＬＣ３９Ａ１２転写レベルプロファイリングに使用したプライマーと、ＳＬＣ３９Ａ１２ ｃＤＮＡの対応する切取り配列（ｃｌｉｐｐｉｎｇ）との配列アラインメントを示す図である。 ＳＬＣ３９Ａ１２転写レベルプロファイリングに使用した、ＳＬＣ３９Ａ１２ ｃＤＮＡ配列、コード配列、及び両方のプライマー配列のアラインメントを示す略図である。 親和性精製されたポリクローナルウサギ抗ＳＬＣ３９Ａ１２抗血清ＨＫＱ１の免疫ブロット（ウエスタンブロット）分析結果を示す図である。 親和性精製されたポリクローナルウサギ抗ＳＬＣ３９Ａ１２抗血清ＨＫＱ１の免疫蛍光分析結果を示すグラフである。 ＡＤの徴候及び症候がないと診断された同齢対照（ブラーク１−３）から得たそれぞれの試料において観測したレベルと比較して、ＡＤ患者（ブラーク４−６）から得た大脳皮質組織試料中のＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質レベルが増加したことを示すグラフである。 ＡＤの徴候及び症候がないと診断された同齢対照（ブラーク１及び２）から得たそれぞれの試料において観測したレベルと比較して、ＡＤ患者（ブラーク４及び５）から得た大脳白質組織試料中のＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質レベルが増加したことを示すグラフである。 ｇｍｒ−ＧＡＬ４の制御下にある３つの独立したＳＬＣ３９Ａ１２トランスジェニックハエ系統によって発現されるＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質のウエスタンブロット分析による検出を示す図である。 ｇｍｒ−ＧＡＬ４の制御下にある３つの独立したＳＬＣ３９Ａ１２トランスジェニックハエ系統によって発現されるＳＬＣ３９Ａ１２ ｍＲＮＡレベルの、ＳＬＣ３９Ａ１２特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによる比較を示す表である。 ＴａｕＰ３０１ＬトランスジェニックショウジョウバエにおけるＳＬＣ３９Ａ１２の同時発現によって、対照ハエ（ＴａｕＰ３０１Ｌ）と比較して、変異タウタンパク質のＳｅｒ２１４のリン酸化が投与量に依存してかなり増加することを示すグラフである。 ウエスタンブロット分析によって、Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｍｕｔａｎｔ ＡＰＰを安定に発現するＨ４神経こう腫細胞におけるＳＬＣ３９Ａ１２発現を示す図である。 免疫蛍光分析によって、Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｍｕｔａｎｔ ＡＰＰを安定に発現するＨ４神経こう腫細胞におけるＳＬＣ３９Ａ１２発現を示す図である。 亜鉛取り込みアッセイによって、亜鉛輸送体としてのＳＬＣ３９Ａ１２の機能を検証するグラフである。ＳＬＣ３９Ａ１２は、Ｈ４細胞中で過剰発現されると、亜鉛の細胞内濃度を増加させる。この細胞アッセイは、ＳＬＣ３９Ａ１２の小分子ベースの調節物質を特定する手段を提供する。

Claims (32)

1. 以下の段階を含む、対象における神経変性疾患を診断若しくは予知する方法、又は対象が前記疾患を発症する素因を有するどうかを判定する方法、又は神経変性疾患を有する対象に施した治療の効果を監視する方法：
   （ａ）前記対象から得られた試料中の（ｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は（ｉｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は（ｉｉｉ）前記転写若しくは翻訳産物の断片、誘導体若しくは変異体のレベル及び／又は活性を測定する段階、
   （ｂ）前記転写産物及び／又は前記翻訳産物及び／又はその前記断片、誘導体若しくは変異体の前記レベル及び／又は前記活性を、既知の疾患状態及び／又は既知の健康状態及び／又は既知のブラーク病期を表す基準値と比較する段階、
   （ｃ）前記レベル及び／又は前記活性が、既知の健康状態を表す基準値に対して変動するかどうか、及び／又は既知の疾患状態若しくは既知のブラーク病期を表す基準値と類似若しくは同じであるかどうか（これらは、前記対象が神経変性疾患を有することの指標、又は前記対象が前記疾患を発症するリスクが大きいことの指標、又は前記治療が前記対象において効果を有することの指標である。）を解析する段階。
2. 前記神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項１に記載の方法。
3. ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする前記遺伝子が配列番号１、２又は３のＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子であり、ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の前記翻訳産物が配列番号１、２又は３のＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質である、請求項１又は２に記載の方法。
4. （ｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は（ｉｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は（ｉｉｉ）前記転写若しくは翻訳産物の断片、誘導体若しくは変異体を検出する試薬からなる群から選択される少なくとも１種類の試薬を含む、請求項１に記載の方法によって、対象における神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を診断若しくは予知するための、又はかかる疾患を発症する対象の素因を明らかにするための、又は神経変性疾患を有する対象に施した治療の効果を監視するための、キットの使用。
5. ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質が配列番号１、２又は３を有する、請求項４に記載の使用。
6. 天然ＳＬＣ３９Ａ１２遺伝子転写制御要素ではない転写要素の制御下にある、ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質又はその断片、誘導体若しくは変異体をコードする非天然遺伝子配列を含み、前記遺伝子配列の発現、破壊又は変更によって、神経変性疾患の徴候、特にアルツハイマー病に関係する徴候を生じる素因がある非ヒト動物がもたらされる、遺伝子改変非ヒト動物。
7. 前記徴候が神経原線維変化（ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅｓ）の形成を含む、及び／又は前記動物が昆虫若しくはげっ歯類である、請求項６に記載の動物。
8. ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする非天然遺伝子配列を含み、ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質が配列番号１、２又は３を有する、請求項６又は７に記載の動物。
9. 神経変性疾患、特にアルツハイマー病の治療に有用である診断薬及び治療薬の開発における化合物、薬剤及び調節物質のスクリーニング、試験及び／又は検証のための非ヒト試験動物及び／又は対照動物としての、請求項６から８の一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物の使用。
10. ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質又はその断片、誘導体若しくは変異体をコードする遺伝子配列が、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の治療に有用である診断薬及び治療薬の開発における化合物、薬剤及び調節物質のスクリーニング、試験及び／又は検証のために発現、破壊又は変更された、細胞の使用。
11. 前記遺伝子配列の発現、破壊又は変更によって、神経変性疾患の徴候、特にアルツハイマー病に関係する徴候、並びに二重らせん状細線維（ＰＨＦ）の形成、及び／又はタウタンパク質の凝集、及び／又はタウタンパク質のリン酸化を含むより特別な徴候を生じる素因がある細胞が生成する、請求項１０に記載の細胞の使用。
12. ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質が、配列番号１、２又は３を有する、請求項１０又は１１に記載の細胞の使用。
13. （ａ）細胞を試験化合物と接触させること、
    （ｂ）（ｉ）から（ｉｖ）に列挙する１種類以上の物質の活性及び／又はレベル及び／又は発現を測定すること、
    （ｃ）前記試験化合物と接触していない対照細胞において、（ｉ）から（ｉｖ）に列挙する１種類以上の物質の活性及び／又はレベル及び／又は発現を測定すること、並びに
    段階（ｂ）と（ｃ）の各細胞における前記物質のレベル及び／又は活性及び／又は発現を比較すること、を含み、接触させた細胞における前記物質の活性及び／又はレベル及び／又は発現の変化によって、試験化合物が神経変性疾患治療用の薬剤、調節物質、拮抗物質又は作動物質であることが示される、
    （ｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子、及び／又は
    （ｉｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は
    （ｉｉｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は
    （ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、誘導体若しくは変異体
    からなる群から選択される１種類以上の物質の発現、レベル又は活性を変化させる能力を有する、神経変性疾患、特にアルツハイマー病又は関連疾患の治療又は予防用の薬剤、調節物質、拮抗物質又は作動物質を特定するためのスクリーニング方法。
14. ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質が配列番号１、２又は３を有する、請求項１３に記載の方法。
15. （ａ）神経変性疾患又は関連疾患若しくは障害の徴候及び症候を生じやすい、又は既に生じた非ヒト試験動物に試験化合物を投与すること、
    （ｂ）（ｉ）から（ｉｖ）に列挙する１種類以上の物質の活性及び／又はレベル及び／又は発現を測定すること、
    （ｃ）神経変性疾患又は関連疾患若しくは障害の徴候及び症候を生じやすい、又は既に生じた、かかる試験化合物が投与されていない非ヒト対照動物において、（ｉ）又は（ｉｖ）に列挙する１種類以上の物質の活性及び／又はレベル及び／又は発現を測定すること、
    （ｄ）段階（ｂ）と（ｃ）の各動物における前記物質の活性及び／又はレベル及び／又は発現を比較すること、を含み、非ヒト試験動物における物質の活性及び／又はレベル及び／又は発現の変化によって、試験化合物が神経変性疾患治療用の薬剤、調節物質、拮抗物質又は作動物質であることが示される、
    （ｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子、及び／又は
    （ｉｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は
    （ｉｉｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は
    （ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、誘導体若しくは変異体
    からなる群から選択される１種類以上の物質の発現、レベル又は活性を変化させる能力を有する、神経変性疾患、特にアルツハイマー病又は関連疾患の治療用の薬剤、調節物質、拮抗物質又は作動物質を特定するためのスクリーニング方法。
16. ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質が配列番号１、２又は３を有する、請求項１５に記載の方法。
17. リガンドとＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質又はその断片、誘導体若しくは変異体との結合の阻害度又は増強度が決定される、及び／又は化合物とＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質又はその断片、誘導体若しくは変異体との結合度が決定される、神経変性疾患、特にアルツハイマー病又は関連疾患の治療又は予防用の薬剤、調節物質、拮抗物質又は作動物質を特定するために、化合物を試験する、又は複数の化合物を、好ましくはハイスループット形式で、スクリーニングする、アッセイ。
18. ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質が配列番号１、２又は３を有する、請求項１７に記載のアッセイ。
19. 神経変性疾患、特にアルツハイマー病の治療において潜在的活性を有する、
    （ｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子、及び／又は
    （ｉｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は
    （ｉｉｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質及び／又は配列番号３をコードする遺伝子の翻訳産物、
    （ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、誘導体又は変異体
    からなる群から選択される少なくとも１種類の物質のレベル及び／又は活性及び／又は発現の薬剤、調節物質、拮抗物質又は作動物質。
20. ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質が配列番号１、２又は３を有する、請求項１９に記載の薬剤、調節物質、拮抗物質又は作動物質。
21. 神経変性疾患、特にアルツハイマー病の治療又は予防用の医薬品の製造における、請求項１９又は２０に記載の薬剤、調節物質、拮抗物質又は作動物質の使用、及び／又はＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質又はその断片、誘導体若しくは変異体をコードする遺伝子の翻訳産物である免疫原と特異的に免疫反応する抗体の使用。
22. ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質が配列番号１、２又は３を有する、請求項２１に記載の使用。
23. 請求項１３から１８のいずれか一項に記載のアッセイによって得ることができる、請求項１９から２２のいずれか一項に記載の少なくとも１種類の物質のレベル及び／又は活性及び／又は発現の薬剤、調節物質、拮抗物質又は作動物質。
24. 請求項１９、２０又は２３のいずれか一項に記載の薬剤、調節物質、拮抗物質、作動物質又は抗体を治療又は予防に有効な量及び処方で、神経変性疾患の治療を必要とする対象に投与することを含む、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を治療又は予防する方法。
25. 神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を検出するための診断上の標的としての、ＳＬＣ３９Ａ１２又はその断片、誘導体若しくは変異体をコードする遺伝子の翻訳産物であるタンパク質分子の使用。
26. ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質が配列番号１、２又は３を有する、請求項２５に記載の使用。
27. 神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を予防、治療又は改善する調節物質、薬剤又は化合物のスクリーニング標的としての、ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質又はその断片、誘導体若しくは変異体をコードする遺伝子の翻訳産物であるタンパク質分子の使用。
28. ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質が配列番号１、２又は３を有する、請求項２７に記載の使用。
29. ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質又はその断片、誘導体若しくは変異体をコードする遺伝子の翻訳産物である免疫原と特異的に免疫反応する抗体を用いた、対象から得られた試料中の細胞の免疫細胞化学的染色を含み、既知の健康状態を示す細胞と比較して、対象から得られた試料中の前記細胞における染色度又は染色パターンの変化によって、神経変性疾患、特にアルツハイマー病に関係する前記細胞の病理学的状態が示される、対象から得られた試料中の細胞の病理学的状態を検出するための前記抗体の使用。
30. ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質が配列番号１、２又は３を有する、請求項２９に記載の使用。
31. （ｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子、及び／又は
    （ｉｉ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は
    （ｉｖ）ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は
    （ｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、誘導体若しくは変異体
    からなる群から選択される少なくとも１種類の物質のレベル及び／又は活性及び／又は発現の拮抗物質を含み、
    拮抗物質が、アンチセンス核酸、抗体又は抗体断片、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、アプタマー及びこれらの組合せからなる群から選択される、医薬品。
32. ＳＬＣ３９Ａ１２タンパク質が配列番号１、２又は３を有する、請求項３１に記載の医薬品。

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