JP2009528264A - Il−31アンタゴニストを用いて神経組織における疼痛及び炎症を治療する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
すべて同じ個体に由来する5つのヒト脳組織サンプル及び脊髄サンプル、そして異なる患者由来の脊髄後根神経節(DRG)をこの試験においてアッセイした。
A.方法I(IL−31処理マウスのカプサイシン処置)
TacI遺伝子を欠損するホモ接合性のマウスは、検出可能なサブスタンスP又はニューロキニンAを発現しない。これらのマウスは、中度〜強度の刺激に対する侵害受容性の疼痛反応が顕著に減少し、そしてしたがって疼痛/かゆみの進行と炎症性疾患状態に対するタキキニンペプチドの寄与を研究するための有用なツールである。12週齢のTac1ノックアウトマウスに、1μg/日のIL-31タンパク質を送達するための14日間浸透圧ポンプを移植し、毎日、脱毛症及びそう痒について、以下の基準:0=ひっかきなし、動物は正常に見える、1=小部分における被毛の菲薄化、引っかきが認められる、2=わずかな脱毛(小さなまだら)、引っかき、3=中度の脱毛、引っかき、および4=重度の脱毛、過度の引っかき、を用いて観察した。
およそ8〜12週齢の正常な雌性BALB/cマウス(CRL)に、1μg/日のmIL-31を送達する14日間浸透圧ポンプ(Alzet、#2002)を皮下に移植した。各群のマウスは、IL-31送達の1週間前から開始して週に2日、10mg/kg(200μg/マウス)のラット抗−マウスIL-31モノクローナル抗体の腹腔内(i.p.)注射を受けた。対照群のマウスは、同一の投薬スケジュールで、ビヒクル(PBS/0.1%BSA)のi.p.注射を受けた。毎日、脱毛症及びそう痒について、以下の基準:0=ひっかきなし、動物は正常に見える、1=小部分における被毛の菲薄化、引っかきが認められる、2=わずかな脱毛(小さなまだら)、引っかき、3=中度の脱毛、引っかき、および4=重度の脱毛、過度の引っかき、を用いてマウスを評点した。
IL-31RA/OSMRベータ受容体ルシフェラーゼアッセイ
修飾されたc-fos Sis誘導性要素(m67SIE又はhSIE)(Sadowski, H. et al., Science 261:1739-1744, 1993)、p21 WAF1遺伝子からのp21 SIE1(Chin, Y. et al., Science 272:719-722, 1996)、β−カゼイン遺伝子の乳腺応答要素(Schmitt-Ney, M. et al., Mol. Cell. Biol. 11:3745-3755, 1991)、及びFeg RI遺伝子のSTAT誘導性要素(Seidel, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92:3041-3045, 1995)を含む、4つの遺伝子からのSTAT転写制御因子結合要素を含む相補的オリゴヌクレオチドを用いて、KZ134プラスミドを構築した。これらのオリゴヌクレオチドは、Asp718-XhoI適合性末端を含み、同じ酵素で消化され、そしてネオマイシン選択マーカーを含む、c-fosプロモーターを有するレシピエントであるホタルルシフェラーゼレポーターベクター中に標準的な方法を用いてライゲーションした(Poulsen, L.K. et al., J. Biol. Chem. 273:6229-6232, 1998)。KZ134プラスミドは、標準的なトランスフェクション及び選択方法を用いて安定にBaF3細胞をトランスフェクトしてBaF3/KZ134細胞株を作製するために使用した。
アデノウイルスSTAT/SREレポーター遺伝子による一過性の感染によって形質導入されたヒト上皮細胞株におけるルシフェラーゼアッセイ
IL-31活性の阻害、減少、及び/又は中和は、ルシフェラーゼアッセイによって測定可能である。例えば、形質導入されたヒト細胞株を96ウエル平底プレートに、各細胞タイプについて指定された通常の増殖培地中、10,000細胞/ウエルで蒔くことができる。翌日、アデノウイルスレポーターコンストラクト、KZ136で、5000の感染多重度で、細胞を感染させた。KZ136レポーターは、血清応答要素に加えてSTAT要素を含む。全体積は、2mMのL-グルタミン(GibcoBRL)、1mMのピルビン酸ナトリウム(GibcoBRL)および1×インシュリン−トランスフェリン−セレニウムサプリメント(GibcoBRL)を補充したDMEM(以下、「無血清培地」という)をもちいて100μl/ウエルである。細胞を一夜培養する。
炎症性腸疾患由来の結腸組織におけるIL-31分析
A)IL−31免疫組織化学:
ABC-eliteベースの検出システムによって、炎症性腸疾患患者由来の胃腸組織においてヒトIL-31を検出するために、ポリクローナル抗体(1.0mg/mlにアフィニティー精製した、ウサギ抗−ヒトIL-31 CEE)を使用した。同じプロトコール及び抗体濃度を用いて、1.66mg/mlに精製された正常なウサギ血清、プロテインAを陰性対照として使用した。
組織の小部分を、インサイチュハイブリダイゼーション(ISH)を用いても分析した。ISHでは、粘膜下層及び脂肪組織中のわずかな浸潤細胞においてIL-31 mRNAを観察した。IHCを用いて、我々は、先に述べた細胞集団並びに固有層及び肉芽腫中心中の細胞において陽性に染色されたIL31タンパク質を観察した。これら2つのアッセイの間の相違は、アッセイ感度により説明されうる。
A) IL-31Ra免疫組織学:
炎症性腸疾患患者由来の胃腸組織中のヒトIL-31RAを、ABC-eliteに基づく検出系によって検出するために、ポリクローナル抗体(1.33mg/mlまでアフィニティー精製された、ウサギ抗−ヒトIL-31RA(バージョン4)CEE抗体)を使用した。同じプロトコールと抗体濃度を用いて、1.66mg/mlまで精製された正常ウサギ血清、プロテインAを陰性対照として使用した。ウサギ抗−ヒトIL-31RA(バージョン4)抗体を1:2000(665ng/ml)で使用した。
先の試験において、ISHを用いて5つの組織を試験し、そのうちの3つはクローン病の結腸であった。これらのクローン病組織においては、それらの正常な対応物に比べて顕著にIL-31RA mRNAが上方制御され、シグナルは肉芽腫小結節並びに粘膜下層の結合組織及び脂肪組織領域中の多くの浸潤細胞に局在した。IHC及びインサイチュ分析の間の矛盾についての可能性のある理由は、一過性のmRNA発現、タンパク質プロセシング時間、IL-31RAタンパク質の安定性、及び/又は2つのアッセイの間の感度の相違を含む。
病気の易罹患性及び重篤度の潜在的相違を調べるために、EμLck IL-31トランスジェニックマウス及び非トランスジェニック同腹仔対照マウスを、粘膜炎症のデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘発モデルにおいて試験した。飲料水中の2〜3%DSSを与えた正常マウスは、ヒト炎症性腸疾患に似た症状と病理を発生させた(Strober, Fuss and Blumberg, Annu. Rev. Immunol. 2002を参照のこと)。機械的に、DSSは大腸の粘膜上皮バリアを破壊し、これはその後に炎症を引き起こす。この炎症の結果、DSS処理マウスは体重減少し、そして下痢を発生する。疾患活動指数(DAI)を用いてマウスを大腸炎の重篤度に関してモニターし、この指数は、体重、便の一貫性及び便中の血液に基づく累積スコアである。DSSは、急性又は慢性の大腸炎を誘発するために使用可能である。急性大腸炎は、第0日から第7日までの飲料水中のDSS(われわれの試験においては2%又は3%)の送達によって誘発される一方、慢性大腸炎は、5日間の飲料水中のDSSの送達によって誘発され、その後、DSS処理を繰り返す前に7〜12日間の回復相がある。
皮膚中の抗体のバイオアベイラビリティー及び分布を直接的に分析するために、本発明の分子とともにミクロ透析が使用可能である。ミクロ透析は、細胞内液を収集し、分析するために使用する。間質液中の抗体は、ルミネックスビーズに架橋された、種特異的抗−IgG抗体を用いて測定可能である。さらに、遊離〜IgG結合したIL-31の評価は、抗−IgGでなく抗−IL31抗体を二次抗体として使用して行う。IL-31によるケラチノサイト及び/又は脊髄後根神経節の活性化により産生された、前炎症性サイトカイン及びケモカインをアッセイする。British J. Dermatology 142(6); 1114-1120,(2000);J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 73; 299-302, (2002);Am J. Physiol Heart Circ. Physiol 286; 108-112, (2004);Neuroscience Letters 230; 117-120, (1997);及びAAPS J. 7(3); E686-E692, (2005)を参照のこと。Steinhoff, M., et al., J. Neuroscience, 23(15): 6176-6180, 2003も参照のこと。
Claims (27)
- 哺乳動物の神経組織における炎症を治療するための方法であって、神経組織とIL-31アンタゴニストを混合することを含み、ここで、前記炎症が減少され、制限され、予防され、最小化され、又は中和される、前記方法。
- 前記IL-31アンタゴニストが、配列番号2の残基27〜残基164に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する、請求項1に記載の方法。
- 前記アンタゴニストが抗体である、請求項1に記載の方法。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項3に記載の方法。
- 前記神経組織が脊髄後根神経節又は脊髄組織を含む、請求項1に記載の方法。
- 哺乳動物における疼痛を治療するための方法であって、前記哺乳動物由来の神経組織をIL-31アンタゴニストと混合することを含み、ここで、前記炎症が減少され、制限され、予防され、最小化され、又は中和される、前記方法。
- 前記IL-31アンタゴニストが、配列番号2の残基27〜残基164に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する、請求項6に記載の方法。
- 前記アゴニストが抗体である、請求項6に記載の方法。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項6に記載の方法。
- 前記神経組織が脊髄後根神経節又は脊髄組織を含む、請求項6に記載の方法。
- 脊髄後根神経節細胞中における、IL-31誘発性のシグナル伝達をアンタゴナイズする方法であって、IL-31アンタゴニストと脊髄後根神経節細胞を混合することを含み、それによって前記シグナル伝達が阻害される、前記方法。
- 前記IL-31アンタゴニストが、配列番号2の残基27〜残基164に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する、請求項11に記載の方法。
- 前記アンタゴニストが抗体である、請求項11に記載の方法。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項13に記載の方法。
- 火傷に伴う症状を治療するための方法であって、火傷組織とIL-31アンタゴニストを混合することを含む、前記方法。
- 前記IL-31アンタゴニストが、配列番号2の残基27〜残基164に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する、請求項15に記載の方法。
- 前記アンタゴニストが抗体である、請求項16に記載の方法。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項16に記載の方法。
- 前記症状が疼痛又はかゆみである、請求項15に記載の方法。
- 哺乳動物におけるウイルス感染に伴う症状を治療するための方法であって、IL-31アンタゴニストを前記哺乳動物に投与することを含む、前記方法。
- 前記IL-31アンタゴニストが、配列番号2の残基27〜残基164に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する、請求項20に記載の方法。
- 前記アンタゴニストが抗体である、請求項21に記載の方法。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項22に記載の方法。
- 炎症性腸疾患に伴う疼痛を治療するための方法であって、神経組織とIL-31アンタゴニストを混合することを含み、ここで、前記疼痛が減少され、制限され、予防され、又は中和される、前記方法。
- 前記IL-31アンタゴニストが、配列番号2の残基27〜残基164に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する、請求項24に記載の方法。
- 前記アンタゴニストが抗体である、請求項24に記載の方法。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項24に記載の方法。
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