KR20120001916A

KR20120001916A - 아스피린 과민성 천식의 진단용 ｓｎｐ 유전자 세트

Info

Publication number: KR20120001916A
Application number: KR1020100062545A
Authority: KR
Inventors: 박해심; 김승현; 예영민
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2010-06-30
Filing date: 2010-06-30
Publication date: 2012-01-05

Abstract

본 발명은 서열번호 1 내지 72의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드들에서, 27번째 염기가 변이되고 상기 27번째 염기를 포함하는 20-400개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드들 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드들을 포함하는 아스피린 과민성 천식 진단용 SNP 유전자 세트, 이를 포함하는 키트, 마이크로 어레이 및 이를 이용한 아스피린 과민성 천식 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 서열번호 1 내지 72의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드들에서, 27번째 염기가 변이되고 상기 27번째 염기를 포함하는 20-400개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드들, 그의 상보적 폴리뉴클레오티드들 또는 이들이 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 아스피린 과민성 천식 진단용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 개시된 아스피린 과민성 천식에 특이적으로 발현율이 높은 SNP 유전자 세트는 아스피린 과민성 천식의 예방, 진단 및 치료의 분야에서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

아스피린 과민성 천식의 진단용 ＳＮＰ 유전자 세트{SNP gene set for diagnosis of aspirin-induced asthma}

본 발명은 서열번호 1 내지 72의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드들에서, 27번째 염기가 변이되고 상기 27번째 염기를 포함하는 20-400개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드들 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드들을 포함하는 아스피린 과민성 천식 진단용 SNP 유전자 세트, 이를 포함하는 키트, 마이크로 어레이 및 이를 이용한 아스피린 과민성 천식 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 서열번호 1 내지 72의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드들에서, 27번째 염기가 변이되고 상기 27번째 염기를 포함하는 20-400개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드들, 그의 상보적 폴리뉴클레오티드들 또는 이들이 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 아스피린 과민성 천식 진단용 조성물에 관한 것이다.

약물 알레르기 질환은 면역계가 특정 약물에 대해 비정상적인 반응을 보일 때 발생하는 질환으로 특정 약물의 경우에는 치명저일 수 있다. 2006년 약물 유전체 연구 사업단 발표 자료에 의하면 약물 알레르기 환자 1373명 중 아스피린 알레르기가 50% 정도로 가장 흔하고, 다음으로 항생제, 항결핵제 등의 약물에 의한 알레르기 질환의 발생빈도가 높은 것으로 나타났다.

약물 알레르기의 임상양상은 피부발진, 호흡곤란 전신고열 간기능 장애 등으로 다양하고 심하게 나타나며, 가장 빈번하게 처방되는 약물인 아스피린과 진통 소염제에 의한 알레르기 질환(아스피린 과민성 천식)은 심한 천식과 비염뿐 아니라 치명적 전신 반응인 아나팔락시스(anaphylaxis)에 대한 위험이 있기에 조기 진단을 통한 예방법 수립이 절실히 요구되는 실정이다.

아스피린 과민성 천식 진단을 위한 검사방법은 원인 약물 흡입 또는 섭취 후 발생하는 알레르기 표현형에 따라 아스피린 과민성 천식을 진단하는 약물 유발 검사방법이 사용되고 있으나, 유발 검사는 침습적이어서 환자에게 불편을 야기하고 원인 약물 주입에 따른 위험성이 높아 조기 진단에 제한이 있는 단점이 있다. 진단 방법상의 이러한 단점을 극복하기 위하여 다양한 방법들이 시도되고 있으며, 그 중 하나로 아스피린 과민성 천식에서 특이적으로 발현되는 유전자를 이용한 방법들이 모색되고 있다.

이에, 본 발명자들은 한국인에 있어서 아스피린 과민성 천식에 특이적으로 나타나는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 찾아내고자, 50만개의 단일염기다형성 칩 (SNP chip)을 이용하여 한국인 아스피린 과민성 천식 환자와 일반 천식 환자군을 질병 대조군으로 그리고 천식 관련 질환을 갖지 않은 정상군을 정상 대조군으로 하여 전체 게놈 연관성 분석 연구(genome-wide association study)를 진행하고 2단계 연관성 분석을 수행하였다. 그 결과, 아스피린 과민성 천식 환자에 특이적으로 나타나는 단일염기다형성을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1 내지 72의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드들에서, 27번째 염기가 변이되고 상기 27번째 염기를 포함하는 20-400개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드들 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드들을 포함하는 아스피린 과민성 천식 진단용 SNP 유전자 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 서열번호 1 내지 72의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드들에서, 27번째 염기가 변이되고 상기 27번째 염기를 포함하는 20-400개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드들, 그의 상보적 폴리뉴클레오티드들 또는 이들이 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 아스피린 과민성 천식 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 SNP 유전자 세트를 포함하는 아스피린 과민성 천식 진단용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 SNP 유전자 세트를 포함하는 아스피린 과민성 천식 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 SNP 유전자 세트를 포함하는 아스피린 과민성 천식 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 내지 72의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드들에서, 27번째 염기가 변이되고 상기 27번째 염기를 포함하는 20-400개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드들 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드들을 포함하는 아스피린 과민성 천식 진단용 SNP 유전자 세트에 관한 것이다.

본 발명에서는 아스피린 과민성 천식에서 특이적으로 발현되는 유전자의 다형성 부위 및 SNP 선별을 위하여, 아스피린 과민성 천식 환자, 아스피린 내성 천식 환자를 대상으로 Affymetrix SNP 칩을 이용하여 단일염기다형성 분석을 시행하고, SNP 칩 데이터 필터링을 수행하여 SNP들 중 call rate가 97% 이하이거나 minor allele frequency가 1%미만, 정상인에서 Hardy-Weinberg equilibrium(H.W.E.) (p < 0.0001)인 SNP들이 제외되었다. 또한 연관성 분석에서 p-value<0.0001 이하의 SNP들을 대상으로 군집 품질 관리(Cluster quality control)를 진행하였다. 이러한 과정을 통해 필터링된 SNP에 대해 2단계 연관성 분석을 시행하였다. 1단계 연관성 분석을 통해 일반 천식과 연관성을 보이는 SNP는 2단계 분석 대상에서 제외하였다. 2단계 연관성 분석은 모수적 방법(parametric test)인 Chi-square test 와 비모수적 방법(non-parametric test)인 Cochran-Armitage trend test을 통해 질환군과 대조군의 유전자형의 빈도를 비교하였다. 또한, 유전형 빈도 비교에서 성별과 나이의 보정 분석을 하기 위해 로지스틱 회귀 분석(logistic regression test)을 이용하였다. 그 결과 총 210개의 아스피린 과민성 천식 질환에서 특이적으로 발현되는 단일염기다형성을 선별하였고, 그 중에 p value가 0.01 이하의 통계적 유의성을 가지도록 cut off 값을 적용하여 최종적으로 72개의 단일염기다형성을 선별하였다(표 1).

본 발명의 용어, "아스피린 과민성 천식"은 소아에서는 비교적 드물지만 성인 환자의 약 10%에서 아스피린 또는 비스테로이드성 소염제(상대적으로 아세트아미노펜이나 셀레콕시브는 비교적 안전함) 투여로 인해 증상이 악화되는 천식을 의미한다. 아스피린 과민성 천식 환자의 경우 아스피린을 투여하게 되면 대개 심한 콧물이 나고 급성 천식 증상과 피부 발적이 발생한다. 심한 경우에는 쇼크, 의식상실, 호흡정지 등 치명적인 결과를 초래하기도 한다. 아스피린 과민성 천식 환자의 기도상피 조직에서는 호산구 증가, 상피세포 손상, 사이토카인 생산, 부착분자의 증가 등을 볼 수 있다. 기도의 호산구 증가는 매우 특징적인 소견으로 일반 천식보다 약 4배, 정상인보다는 약 15배 정도 증가한다.

본 발명의 용어, "SNP (single nucleotide polymorphism)"는 단일 염기에서의 다형성(polymorphism) 즉, 어느 집단에 있어 전체 게놈(genomome)에 있는 일부 염기가 염색체 마다 다른 경우가 존재하는데, 통상적으로 SNP는 300 내지 1000개의 염기에 하나 정도 존재하기 때문에 인간 게놈 DNA 전체에는 적어도 300만개의 SNP가 존재하게 된다.

SNP의 종류로는, 프로모터 영역 등의 전사활성 조절에 관계하는 영역에 존재하는 rSNP (regulatory SNP), 엑손 (exon) 부분에서 아미노산 변이를 일으키는 cSNP (coding SNP), 인트론 (intron) 영역에 존재하는 iSNP (intronic SNP), 엑손부분에서 사일런스 (silence) 변이를 일으키는 sSNP (silent SNP), 및 그 외 게놈 영역에서 나타나는 gSNP (genome SNP)와 같은 SNP가 존재한다.

게놈 유전자의 99.9%는 개체 내에서 공통적이고, 나머지의 0.1%가 특정 질환에 대한 과민성이나 약제에 대한 부작용 등과 관련한 개체 차이에 관여하고 있다고 여겨지고 있는데, 이러한 과민성 또는 부작용과 직접적으로 관련 있다고 생각되는 것이 바로 SNP이다. SNP는 출현 빈도가 높고, 게놈 전체 상에 거의 균등하게 분포하고 있기 때문에, 상기 과민성 또는 부작용과 유전자의 관련성을 연구하는 신뢰성 높은 유전자 다형성이라고 판단되고 있다. 따라서 이러한 SNP의 변화를 효과적으로 분석하는 경우, 자연적인 유전자 변형과 관련된 각종 질환과의 연관성과 관련된 정보를 효과적으로 분석할 수 있어, 유전적 질환의 스크리닝 및 개인별 맞춤 치료에 큰 기여를 할 수 있다.

이러한 SNP의 위치는 보통 매우 보존된 서열들이 그 전후로 존재하게 된다. SNP는 보통 특정 위치의 한 염기가 다른 염기로 치환되어 일어나게 되는데, 뉴클레오티드의 결실이나 중복에 의해서도 일어난다. 특히, 대립유전자형 (allele)의 빈도가 5% 이하인 경우를 rare SNP (레어 SNP)라고 하며, 대립 유전자형의 빈도가 5% 이상인 경우에는 common SNP (커먼 SNP)라고 한다. rare SNP는 민족 별 또는 인종별로 다르게 나타날 수 있다. 이러한 rare SNP, 일정하게 정의된 집단 (population)의 정의를 인류 전체로 볼 것인지, 특정 집단에 한정하여 볼 것인지에 따라 rare SNP의 범위가 변화할 수 있고, 한 집단에서 common SNP로 보이는 변이라 하더라도, 다른 집단에서는 rare SNP의 양상을 나타낼 수 있음은 자명하다.

본 발명에 있어서, 서열번호 1 내지 72의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 SNP 서열로 다형성 부위를 포함하는 서열을 말한다. 상기 SNP 서열은 아스피린 과민성 천식 질환 여부를 예측 내지 진단하는 바이오 마커의 기능을 하므로, 이하 본 발명에서 상기 SNP 서열은 '마커'라고도 칭한다.

본 발명에서 용어, "다형성 부위 (Polymorphic site)"는 여러 가지 염기가 발견되는 유전자좌위(locus)를 말한다. 본 발명의 SNP 서열의 다형성 부위의 위치는 27번이다. 본 발명에서 서열번호 1 내지 72의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드의 다형성 부위는 아스피린 과민성 천식과 연관성이 있다.

본 발명의 SNP 유전자 세트는 서열번호 1 내지 72의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드들의 상기 27번째 다형성 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드들 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드들을 포함한다.

이때, 상기 SNP 유전자 세트가 포함하는 폴리뉴클레오티드들 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드들은 20-400개의 연속 DNA 서열로 구성되거나, 바람직하게는 20-100개의 연속 DNA 서열로 구성되거나, 더욱 바람직하게는 10-52개의 연속 DNA 서열로 구성된다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 내지 72의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드들에서, 27번째 염기가 변이되고 상기 27번째 염기를 포함하는 20-400개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드들, 그의 상보적 폴리뉴클레오티드들 또는 이들이 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 아스피린 과민성 천식 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "진단은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것으로 서, 본 발명의 목적상, 아스피린 과민성의 발병 여부를 확인하는 것뿐만 아니라 아스피린 과민성의 치료 후 해당 개체의 재발, 전이, 약물 반응성, 내성 등과 같은 여부를 판단하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상 진단은 아스피린 과민성 질환의 발병 여부, 바람직하게 본 발명의 유전자 발현 프로파일링을 사용하여 아스피린 과민성 질환에서 특이적으로 발현되는 유전자 및 염색체의 확인 및 지도화를 통하여 아스피린 과민성 환자의 진단 및 치료를 위한 것이다.

본 발명에서 용어, "진단용 조성물"은 아스피린 과민성 천식에 대한 재발 환자군과 대조군을 진단할 수 있는 물질로, 대조군에 비하여 환자군에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: 폴리뉴클레오티드들, 그의 상보적 폴리뉴클레 등), 지질, 당지질, 당단백 등과 같은 유기 생체 분자 등을 진단용 마커로서 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 용어, "상기 폴리뉴클레오티드들, 그의 상보적 폴리뉴클레오티드들 또는 이들이 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제"란 상기와 같이 아스피린 과민성 질환에서 발현이 증가하는 마커인 표 1에 기재된 유전자 또는 이들 유전자에 의해 코딩된 단백질의 발현수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 바람직하게는 마커에 특이적인 항체, 프라이머 또는 프로브를 말한다.

본 발명에서 폴리뉴클레오티드들, 그의 상보적 폴리뉴클레오티드들의 발현 수준 측정이란 아스피린 과민성 질환을 가진 환자의 진단을 위하여 생물학적 시료에서 폴리뉴클레오티드들, 그의 상보적 폴리뉴클레오티드들의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 폴리뉴클레오티드들, 그의 상보적 폴리뉴클레오티드들 의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(northern blotting), 또는 DNA 마이크로어레이 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 폴리뉴클레오티드들, 그의 상보적 폴리뉴클레오티드들의 발현 수준을 특정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 쌍 또는 프로브이며, 상기 SNP 서열을 표 1에 도시하였으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 SNP 서열의 다형성 부위를 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3발단 수산화기(free 3' htdroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명에서는 본 발명의 SNP 서열의 다형성 부위를 특이적으로 증폭하는 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성여부를 통해 아스피린 과민성 질환의 진단에 이용할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형가능하다.

본 발명의 용어, "프로브"란 폴리뉴클레오티드들, 그의 상보적 폴리뉴클레오티드들과 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 표지(Labelling)되어 있어서 특정 폴리뉴클레오티드들, 그의 상보적 폴리뉴클레오티드들의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 폴리뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작 될 수 있다. 본 발명에서는 본 발명의 SNP 서열의 다형성 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용한 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 아스피린 과민성 질환을 진단 및 예측할 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카마메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등) 로의 변형이 있다.

본 발명에서 단밸질 발현 수준 측정이란 아스피린 과민성 질환을 예측 및 진단하기 위하여 생물학적 시료의 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 폴리뉴클레오티드들, 그의 상보적 폴리뉴클레오티드들이 코딩하는 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴블럿(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석법(Radioimmunoassay), 방사면역 확산법(Radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(Rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역 침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

단백질 수준을 측정하는 제제는 바람직하게 항체이다.

본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수항체도 포함된다.

본 발명의 아스피린 과민성 질환 진단의 마커로 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 내지 72의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드들에서, 27번째 염기가 변이되고 상기 27번째 염기를 포함하는 20-400개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드들 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드들을 포함하는 아스피린 과민성 천식 진단용 SNP 유전자 세트를 포함하는 마이크로 어레이 및 키트에 관한 것이다.

본 발명의 키트는 아스피린 과민성 천식에서 발현되는 마커 유전자의 폴리뉴클레오티드들, 그의 상보적 폴리뉴클레 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 확인하여 마커를 검출함으로써 아스피린 과민성 천식을 진단할 수 있다. 본 발명의 마커 검출용 키트에는 아스피린 과민성 천식의 발병 및 진단과 관련한 진단 마커의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에서 상기 마커 유전자들의 폴리뉴클레오티드들, 그의 상보적 폴리뉴클레오티드들 또는 이들이 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Tag-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPCwater), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 마커 유전자들의 코딩에 의해 발현된 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 DNA 마이크로어레이 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. DNA 마이크로어레이 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, DNA 마이크로어레이 칩은 서열번호 1 내지 72의 유전자 또는 그 단편에 해당하는 폴리뉴클레오티드 또는 상보적 폴리뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 본 발명의 DNA 마이크로어레이 칩은 본 발명의 마커를 이용하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조 방법에 의하여 용이하게 제조될 수 있다. DNA 마이크로어레이 칩을 제작하기 위하여, 상기 탐색된 마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기한 상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법등을 사용하는 것이 바람직하나 이들 예에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 상기 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하나 이들 예에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 본 발명의 SNP 유전자 세트를 사용한 아스피린 과민성 천식 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것으로 보다 구체적으로 개체의 시료로부터 DNA 샘플을 수득하는 단계, 및 상기 단계에서 수득한 DNA에서 서열번호 1 내지 72의 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보적 폴리뉴클레오티드 중의 27번째 염기의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계를 포함할 수 있다.

추가적으로, 상기 27번째 염기의 뉴클레오티드 서열을 결정한 결과 27번째 염기가 변이된 경우 상기 개체를 아스피린 과민성 천식에 걸릴 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 판정하는 단계를 포함할 수도 있다.

본 발명에서 용어 "개체의 시료"란 마커 유전자의 발현 수준이 차이 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 아스피린 과민성 천식 환자의 시료를 대상으로 하였다.

상기 방법 중 개체의 시료로부터 DNA 샘플을 얻는 단계는 통상의 DNA 분리방법에 의하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR 을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그외 리가제 연쇄반응(LCR), 전사증폭(transcription amplication), 및 자가유지 서열 복제 및 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA)이 사용될 수 있다. 마지막 두 가지 방법은 등온전사에 근거한 등온반응과 관련되는 것으로서, 증폭산물로서 30배 또는 100배의 단일가닥 RNA 및 이중가닥 DNA를 생산한다. 또한, 상기 단계에서 수득한 DNA에서 서열번호 1 내지 72의 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보적 폴리뉴클레오티드 중의 27번째 염기의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계는 상기 기재한 바와 같이 서열번호 1 내지 72의 DNA 서열 중 변이된 27번째 염기를 포함하는 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드들, 그의 상보적 폴리뉴클레오티드들, 또는 이들이 코딩하는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 수행될 수 있다.

또한, 상기 27번째 염기의 서열을 결정한 결과 27번째 염기가 변이된 경우 상기 개체를 아스피린 과민성 천식에 걸릴 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 판정할 수 있다.

본 발명에 개시된 아스피린 과민성 천식에 특이적으로 발현율이 높은 SNP 유전자 세트는 아스피린 과민성 천식의 예방, 진단 및 치료의 분야에서 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 아스피린 과민성 천식에 특이적으로 발현되는 SNP를 선별하는 과정을 나타내는 모식도이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명의 예시일 뿐 본 발명이 이에 한정되지 않는다.

실시예 1: 시험방법

1-1 피검자 선정

아주대병원 알레르기-류마티스내과로 내원한 445명의 천식 환자군 (아스피린 과민성 천식 환자 192명과 아스피린 내성 천식 환자 253명)을 대상으로 하였다.

아스피린 과민성 천식의 진단은 아스피린 과민성의 과거력이 있으면서 lysine-aspirin 기관지유발시험에서 양성 반응을 보인 경우 또 는 과거력은 없더라도 lysine-aspirin 기관지 유발시험에서 양성 반응을 보인 경우로 하였으며, 아스피린 내성 천식 환자들은 아스피린 과민 성의 과거력이 없으면서 lysine-aspirin 기관 지유발시험에서 음성 반응을 보인 천식 환자들을 대상으로 하였다. Lysine-aspirin 기관지 유발시험은 Park 등 (Clin Exp Allergy 1995;25:38-40) 이 보고한 방법으로 하였다(Park HS. Early and late onset asthmatic responses following lysine-aspirin inhalation in aspirin-sensitive asthmatic patients. Clin Exp Allergy 1995;25:38-40).

모든 대상 환자들에서 연구 참여에 대한 동의서를 받았으며, 모든 연구 과정은 아주대 병원의 윤리위원회의 승인을 받았다.

실시예 2: Affymetrix SNP 칩을 이용한 단일염기다형성 분석

Affymetrix GeneChip Human Mapping 500K Array(Affymetrix,Santa Clara,CA,USA) 를 사용하여 총 445명의 천식 환자 (아스피린 과민성 천식 환자 192명과 아스피린 내성 천식 환자 253명) 시료들을 유전자형분석(genotyping)을 하였다. Mapping assay는 각각 대략 262,000의 SNP를 포함하는 Nsp I array와 238,000인 Sty I arrays로 구성하였다. 대략 250 ng의 게놈 DNA가 Affymetrix사의 프로토콜에 따라 Nsp I 와 Sty I 에 융합되어 있다. 게놈 DNA를 각각 Nsp I 또는 Sty I 제한효소로 자르고 여기에 linker DNA를 ligation하여 universal PCR이 가능하도록 하였다. 이들 시료를 PCR로 증폭하고 다시 fragmentation 한 후에 end-labeling 하였다. 이후에 유전자칩(genechip)에 혼성화시켜 각 스팟에서 시그날을 분석하였다. BRLMM 알고리즘을 이용하여 유전자형을 불러오게 된다.

2000명의 정상대조군에 대한 SNP 유전자형 정보는 질병관리본부 국립보건연구원 유전체센터에서 제공 받아 연관성 분석에 사용하였다.

실시예 3: SNP칩 데이터 필터링

SNP CHIP 데이터 50만개를 1차 품질관리(Quality control)를 이용하여 실행하였다. PLINK 프로그램(http://pngu.mgh.harvard.edu/~purcell/plink)을 이용하여 생 데이터(raw data)의 품질관리(Quality control)을 통해 시료 및 SNP필터링을 진행하였다.

연관성 분석 대상 시료 선정은 QQ plot을 이용하여 call rate가 95% 이상을 나타내는 시료를 선택하였고 X-염색체의 이형접합성 (Heterozygosity)을 통해 각 샘플의 성별을 구별하였다. 또한 IBS (identity by state) 테스트를 통해 대상인들간의 혈연정도를 분석하여 비혈연관계에 있는 대상자들을 선정하였다.

연관성 분석 대상 SNP 선정은 SNP들 중 call rate가 97% 이하이거나 변이형 유전자 빈도 (minor allele frequency, MAF)가 1%미만, 정상인에서 Hardy-Weinberg equilibrium(H.W.E.) (p < 0.0001)인 SNP들이 제외되었다. 또한 연관성 분석에서 p-value<0.0001 이하의 SNP들을 대상으로 군집 품질 관리(Cluster quality control)를 진행하였다. 군집 품질 관리는 각각의 SNP가 3가지의 유전자형으로 독립적으로 읽혀졌는지를 파악할 수 있게 유전자형 종류별로 그룹을 이룬 이미지 파일로 분석하였다. 1차 품질관리를 통과하였더라도 유전자형의 분포가 군집을 명확하게 이루고 있지 않을 경우 제외시켰다. 필터링 후 총 275, 862개의 단일염기다형성들에 대해 2단계 연관성 분석(association test)을 실시하였다.

실시예 4: 연관성 분석

연관성 분석은 모수적 방법(parametric test)인 Chi-square test 와 비모수적 방법(non-parametric test)인 Cochran-Armitage trend test을 통해 질환군과 대조군의 유전자형의 빈도를 비교하였다. 또한 유전형 빈도 비교에서 성별과 나이의 보정 분석을 하기 위해 로지스틱 회귀 분석(logistic regression test)을 이용하였다.

1단계 연관성 분석은 아스피린 내성 천식 (일반 천식) 환자군과 정상대조군간의 유전자형 빈도를 모수적, 비모수적 통계 방법으로 비교 분석하여 일반천식과 연관성을 보이는 단일염기다형성들은 2단계 연관성 분석 대상에서 제외하였다.

2단계 연관성 분석은 1단계 분석결과 일반 천식과 연관성을 보이지 않는 226,570개의 단일염기다형성들에 대해 아스피린 과민성 천식 환자군과 정상대조군간의 유전자형 빈도를 모수적, 비모수적 통계 방법으로 비교 분석하였다. 2단계 연관성 분석 결과 아스피린 과민성 천식과 관련된 210개의 단일염기다형성 중 1 × 10³이하의 높은 유의성을 보인 72개의 아스피린 과민성 천식 특이 단일염기다형성들을 발굴하였다(표 1).

실시예 5: 통계적 분석

표본집단 안에서 각 유전자의 Hardy-Weinberg Equilibrium (H.W.E.)을 분석하기 위해 순열 검정 테스트(permutation test)를 실시하였다. 모든 단일염기 다형성과 천식과의 연관성 분석을 위해 모수적 방법인 chi-square 테스트, 비모수적 방법인 Cochran-Armitage trend 테스트를 사용하였다. 또한 아스피린 과민성 질환 환자와 정상인 간의 유전자형(genotype)과 반수체형(haplotype) 분석은 세 가지 유전적 모델 (dominant, recessive, codominant)을 성별과 나이로 보정한 로지스틱 회귀 (logistic regression) 분석을 이용하여 연관성 분석을 실시하였다. 교차율 (Odds ratio)과 신뢰구간 (confidence interval)은 SAS (version9.1.3: SAS Institute Inc.,Cary,NC,USA)를 이용하여 chi-square 테스트로 구하였다.

시험결과

실험예 1: 아스피린 과민성 천식 질환 특이 단일염기다형성의 분석

50만개의 단일염기다형성 세트로 구성된 SNP microarray를 이용하여 총 445명의 천식 환자(아스피린 과민성 천식 환자 192명과 아스피린 내성 천식 환자 253명)를 대상으로 아스피린 과민성 천식 질환에 대한 전장 게놈 연관성 분석 (genome-wide association analysis)을 수행하여 아스피린 과민성 천식 질환의 조기진단용 유전자 마커를 발굴하고자 하였다.

이에, 연관성 분석 대상 시료로 선정된 총 425명의 천식 환자군 (아스피린 과민성 천식 환자 179명과 아스피린 내성 천식 환자 246 명) 그리고 정상 대조군 1989명을 대상으로 50만개의 단일염기다형성들의 유전자형을 분석 비교하였는바, 각 단일염기다형성 유전자형에 대한 원 자료(raw data)를 1차 품질 관리(quality control)를 수행하여 총 275,862 개의 단일염기다형성들에 대해서만 2단계 연관성 분석(association test)을 실시하였다.

1단계 연관성 분석은 아스피린 내성 천식 (일반 천식) 환자군과 정상대조군간의 유전자형 빈도를 모수적, 비모수적 통계 방법으로 비교 분석하여 일반천식과 연관성을 보이는 단일염기다형성들은 2단계 연관성 분석 대상에서 제외함으로써 질병 대조군인 일반 천식 관련 SNP들의 효과를 배제하였다. 총 226,570개의 단일염기다형성이 1단계 과정을 통과하였다.

2단계 연관성 분석은 1단계 분석결과 일반 천식과 연관성을 보이지 않는 226,570개의 단일염기다형성들에 대해 아스피린 과민성 천식 환자군과 정상대조군간의 유전자형 빈도를 모수적, 비모수적 통계 방법으로 비교 분석하였고 그 결과 1 × 10³이하의 높은 유의성을 보인 210개의 아스피린 과민성 천식 특이 단일염기다형성들을 발굴하였다.

또한, 발굴된 210개의 단일염기다형성 중 p value가 0.001이하의 통계적 유의성을 갖는 cut off 값을 적용하여 최종적으로 72개의 단일염기다형성을 선별하였다. 하기 표1에 선별된 72개의 단일염기다형성을 나타내었다.

표 1에 있어서, 각 컬럼이 의미하는 바는 다음과 같다.

ㆍSNP ID는 본 발명에서 개시한 SNP를 식별하기 위해 부여한 명칭을 나타낸다.

ㆍrs 번호는 NCBI 진뱅크에서 부여한 SNP 명칭이다.

ㆍMajor allele은 27번째 다형성 부위의 단일염기다형성의 변이되지 않은 염기를 기재한 것이다.

ㆍMinor allele은 27번째 다형성 부위의 단일염기다형성의 변이된 염기를 기재한 것이다.

ㆍChr(Chromosome)는 SNP 서열을 포함하는 염색체를 나타낸다.

ㆍPhsical Location는 SNP 서열을 포함하는 유전자의 염색체상의 위치를 나타낸다.

ㆍCloset RefSeq Gene는 관련 유전자를 나타낸다.

ㆍMAF(minor allele frequency)는 변이형 유전자 빈도를 나타낸다.

ㆍAIA MAF는 아스피린 과민성 천식(aspirin-induced asthma) 환자군내에서 해당 SNP의 변이형 유전자 빈도(MAF) %를 나타낸다.

ㆍNC MAF는 정상 대조군(nomal control) 내에서 해당 SNP의 변이형 유전자 빈도(MAF) %를나타낸다.

ㆍTrend P value는 본 발명의 SNP가 갖는 P 값의 경향성을 나타낸 것이다.

ㆍregression p-value는 본 발명의 SNP 선별의 회귀분석 p 값을 나타낸 것이다.

ㆍLocation relative gene는 유전자내 SNP의 위치를 나타낸다.

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> SNP gene set for diagnosis of aspirin-induced asthma <130> PA100211KR <160> 72 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 52 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 agatttccag gaaggaggaa gtagagtgga gtcagaagtt caacagaagt ca 52 <210> 2 <211> 52 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 caggaaactt gtgagaaacc tatgcagcat aaaattaata tgatttcaat cc 52 <210> 3 <211> 52 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 tgtctcatgt cttattaact ttagagtttc aaagactttc caattgtgta gc 52 <210> 4 <211> 52 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 aagtggactc gttctgacct tttctggccc tggtcccacc ctgttaaaac aa 52 <210> 5 <211> 52 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ttctgcctca gaatgagtgt cctgatgttg ataccaggag ccaaaaatgc aa 52 <210> 6 <211> 52 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 agagtcagtc cttccgtgag cttttcggtc tgcctagaca ttggctatct tt 52 <210> 7 <211> 52 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 tgctttagca agtagaaata cctggtgcaa gcatggacac tcttttctgt tt 52 <210> 8 <211> 52 <212> 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ctttcaccaa tcactctcca ta 52 <210> 68 <211> 52 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 68 aggccccggc atcgatcaac tccatctgtc cttacaccca ccctgcatgc ga 52 <210> 69 <211> 52 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 69 aaagagccaa cactggcaag cgaatggagt taaccttgag ggcctttaac aa 52 <210> 70 <211> 52 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 70 ttccaaggtc taaacaaatc ttctgggctc ttgccaaagt ttttattgaa tt 52 <210> 71 <211> 52 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 71 gaaacacttg gcttggtgag ttgagataat ggattctagc ccctgattgc tt 52 <210> 72 <211> 52 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 72 gtatcacacc ccctgagttc tgtggagaga ctatgtatat ccttatttac ta 52

Claims

서열번호 1 내지 72의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드들에서, 27번째 염기가 변이되고 상기 27번째 염기를 포함하는 20-400개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드들 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드들을 포함하는 아스피린 과민성 천식 진단용 SNP 유전자 세트.
서열번호 1 내지 72의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드들에서, 27번째 염기가 변이되고 상기 27번째 염기를 포함하는 20-400개의 연속 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드들 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드들 또는 이들이 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 아스피린 과민성 천식 진단용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드들의 존부를 측정하는 제재는 서열번호 1 내지 72의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드들과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드인 조성물.
제3항에 있어서, 상기 혼성화하는 폴리뉴클레오티드는 프라이머 또는 프로브인 조성물.
제1항을 포함하는 아스피린 과민성 천식 진단용 마이크로어레이.
제1항을 포함하는 아스피린 과민성 천식 진단용 키트.
제1항을 사용한 아스피린 과민성 천식 진단을 위한 정보제공방법.
제7항에 있어서, 하기 단계를 포함하는 정보제공방법:
(1) 개체로부터 DNA 샘플을 수득하는 단계; 및
(2) 단계 (1)에서 수득한 DNA에서 서열번호 1 내지 72의 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보적 폴리뉴클레오티드 중의 27번째 염기의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계.
제8항에 있어서, 상기 27번째 염기의 뉴클레오티드 서열을 결정한 결과 27번째 염기가 변이된 경우 상기 개체를 아스피린 과민성 천식에 걸릴 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 판정하는 단계를 포함하는 정보제공방법.