CN106536749B - 用于预测硫代嘌呤诱导的白细胞减少症风险的组合物，所述组合物含有nudt15基因中的单核苷酸多态性标记 - Google Patents

用于预测硫代嘌呤诱导的白细胞减少症风险的组合物，所述组合物含有nudt15基因中的单核苷酸多态性标记 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于预测硫代嘌呤诱导的白细胞减少症风险的组合物，所述组合物含有NUDT15基因中的单核苷酸多态性标记；本发明特别涉及：用于预测克罗恩病、溃疡性结肠炎、白血病或器官移植患者中的硫代嘌呤诱导的白细胞减少症风险的组合物，所述组合物含有NUDT15基因中的单核苷酸多态性标记；用于预测该风险的试剂盒；以及用于预测该风险的方法。根据本发明，能够在克罗恩病、溃疡性结肠炎、白血病或器官移植患者中对对于在硫代嘌呤治疗期间发生的白细胞减少症高度敏感的患者进行早期快速分类，因此能有效地实施患者个性化的治疗。

Description

用于预测硫代嘌呤诱导的白细胞减少症风险的组合物，所述 组合物含有NUDT15基因中的单核苷酸多态性标记
技术领域
本发明的构思涉及用于预测克罗恩病、溃疡性结肠炎、白血病或器官移植患者中的硫代嘌呤(thiopurine)诱导的白细胞减少症(leukopenia)风险的组合物，所述组合物含有NUDT15基因中的单核苷酸多态性标记；用于预测该风险的试剂盒；以及用于预测该风险的方法。
背景技术
硫代嘌呤药物硫唑嘌呤(AZA)和6-巯基嘌呤(6-MP)广泛地应用于癌症、器官移植和自体免疫疾病或炎症性疾病(例如炎症性肠病(IBD))患者的治疗。用于治疗IBD的推荐剂量对于AZA来说为2.0-3.0mg/kg/天，对于6-MP来说为1.0-1.5mg/kg/天。然而，应用AZA/6-MP的主要缺陷之一在于骨髓抑制(myelosuppression)，在利用这些药剂治疗的白种人IBD患者的2％至5％中发生骨髓抑制。因此，为了降低骨髓抑制的风险，美国食品与药品管理局建议在开始硫代嘌呤治疗前进行硫代嘌呤S-甲基转移酶(TPMT)基因活性测试或酶活性测试。然而，以往的研究显示，在硫唑嘌呤治疗过程中经历骨髓抑制的IBD患者仅有1/4具有TPMT突变，这表明在大多数患者中骨髓抑制由其它因素引起。因此，在硫代嘌呤治疗开始之前预先测试TPMT状态的实用性尚存质疑。进一步地，虽然亚洲人中TPMT突变的频率(2％至3％)比白种人(约10％)低，但是与白种人相比，亚洲人在硫代嘌呤治疗过程中白细胞减少症的发生非常普遍。在之前的研究中，在硫代嘌呤治疗过程中，在31.2％的韩国克罗恩病(CD)患者中观察到白细胞减少症(定义为白细胞[WBC]计数<3000/mm3)。观察到白细胞减少症时的AZA的中值剂量(median dose)仅为1.34mg/kg/天。在另一项韩国多中心研究中，在39.6％的IBD患者中注意到白细胞减少症(WBC<3000/mm3)；在这些患者中AZA的平均剂量为1.80mg/kg/天。在一项日本的研究中，尽管在大多数患者中AZA的每日剂量仅有50mg，在15.8％的具有野生型TPMT的日本IBD患者中发现白细胞减少症(WBC<3000/mm3)。鉴于在硫代嘌呤治疗过程中发生白细胞减少症的亚洲IBD患者中仅有0至5.6％存在TPMT突变，亚洲人群中的白细胞减少症的遗传基础仍然知之甚少。
发明内容
技术问题
本发明的构思提供了用于预测白细胞减少症风险的组合物，所述组合物含有NUDT15基因中的单核苷酸多态性标记。
本发明的构思提供了用于预测白细胞减少症风险的方法，所述方法包括确定NUDT15基因中的单核苷酸多态性标记的基因型的步骤。
本发明的构思提供了用于预测白细胞减少症风险的试剂盒，其中，所述试剂盒包含探针或者引物，所述探针特异性结合于含有NUDT15基因中的单核苷酸多态性标记的多核苷酸，所述引物用于扩增所述多核苷酸。
技术方案
根据本发明构思的一个方面，提供用于预测白细胞减少症风险的组合物，其中，所述组合物含有由10-100个连续的DNA序列组成的多核苷酸或其互补多核苷酸，其中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1第101位的核苷酸和SEQ ID NO:1第102位的核苷酸中的至少一个单核苷酸多态性(SNP)标记。
根据本发明构思的另一方面，提供用于预测白细胞减少症风险的方法，其中，所述方法包括确定SEQ ID NO:1第101位的核苷酸或SEQ ID NO:1第102位的核苷酸的基因型的步骤。
根据本发明构思的另一方面，提供用于预测白细胞减少症风险的试剂盒，其中，所述试剂盒包含探针或者引物，所述探针特异性结合于所述多核苷酸，所述引物用于扩增所述多核苷酸。
有益效果
如本文所述，本发明构思的方面涉及用于预测克罗恩病、溃疡性结肠炎、白血病或器官移植患者中的硫代嘌呤诱导的白细胞减少症风险的组合物，所述组合物含有NUDT15基因中的单核苷酸多态性标记；用于预测该风险的试剂盒；以及用于预测该风险的方法。根据本发明，能够在克罗恩病、溃疡性结肠炎、白血病或器官移植患者中对对于在硫代嘌呤治疗期间发生的白细胞减少症高度敏感的患者进行早期快速分类，因此能有效地实施患者个性化的治疗。
附图说明
图1展示了对作为受试者的在韩国首尔Asan医疗中心使用硫代嘌呤的1191名克罗恩病(CD)患者进行分析的示意图；以及
图2显示了在转染野生型或突变型NUDT15后经7.5μM 6-MP处理的Jurkat细胞的敏感性的结果。图2A.通过RT-PCR分析所测定的在转染野生型或突变型NUDT15的Jurkat细胞中NUDT15的mRNA水平。图2B.与转染野生型NUDT15的对照细胞相比，转染突变型NUDT15的活细胞的数目减少。图2C.使用膜联蛋白V(annexin V)和碘化丙啶染色测量的细胞毒性测定法的结果，显示与转染野生型NUDT15的细胞相比，转染突变型NUDT15的细胞对6-MP更敏感。数据以3次独立试验的平均值±标准差展示。
具体实施方式
为了确定与在克罗恩病、溃疡性结肠炎、白血病或器官移植患者的硫代嘌呤治疗过程中发生的白细胞减少症有关的敏感基因，本发明人使用免疫芯片实施了大规模关联分析，从而完成了本发明。
本发明提供用于预测白细胞减少症风险的组合物，所述组合物含有由10-100个连续的DNA序列组成的多核苷酸或其互补多核苷酸，其中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1第101位的核苷酸和SEQ ID NO:1第102位的核苷酸中的至少一个单核苷酸多态性(SNP)标记。
在一些实施方式中，SEQ ID NO:1第101位的核苷酸的等位基因型(allelotype)可以是C/T，并且SEQ ID NO:1第102位的核苷酸的等位基因型可以是A/G。
在一些实施方式中，所述白细胞减少症可以由硫代嘌呤诱导。在一些实施方式中，所述组合物优选用于在利用硫代嘌呤治疗的克罗恩病、溃疡性结肠炎、白血病或器官移植患者中预测白细胞减少症风险，但实施方式不限于此。
在一些实施方式中，所述硫代嘌呤优选为硫唑嘌呤(AZA)或6-巯基嘌呤(6-MP)，但实施方式不限于此。
包含SEQ ID NO:1第101位的核苷酸的多核苷酸的多态性SNP突变可以由rs116855232表示。rs116855232存在于染色体13q14的NUDT15中，其等位基因型为C/T。根据多碱基记录法(multiple base transcript method)记录SEQ ID NO:1第101位的核苷酸，由于它可以是C或T，记为“y”。
包含SEQ ID NO:1第102位的核苷酸的多核苷酸的多态性SNP突变可以由rs147390019表示。rs147390019存在于染色体13q14的NUDT15中，其等位基因型为A/G。根据多碱基记录法记录SEQ ID NO:1第102位的核苷酸，由于它可以是A或G，记为“r”。
NUDT15蛋白(NCBI登录号NP_060753.1)由164个氨基酸组成，氨基酸序列记录于SEQ ID NO:2中。
当SEQ ID NO:1第101位的核苷酸是C时，NUDT15蛋白(SEQ ID NO:2)第139位的氨基酸是精氨酸(R)；当SEQ ID NO:1第101位的核苷酸是T时，NUDT15蛋白(SEQ ID NO:2)第139位的氨基酸是半胱氨酸(C)。
当SEQ ID NO:1第102位的核苷酸是G时，NUDT15蛋白(SEQ ID NO:2)第139位的氨基酸是精氨酸(R)；当SEQ ID NO:1第102位的核苷酸是A时，NUDT15蛋白(SEQ ID NO:2)第139位的氨基酸是组氨酸(H)。
本文所使用的术语“多态性”是指在单个基因座上存在两个或更多个等位基因的情况；术语“多态性位点”是指存在等位基因的基因座。当在多态性位点中只有单个碱基因人而异时，该情况被称作单核苷酸多态性，即“SNP”。
本文所使用的术语“连锁不平衡”是指在群体遗传学中实质上存在于同一染色体上的两个或更多个基因座处等位基因的非随机关联。
本发明提供用于预测白细胞减少症风险的方法，所述方法包括：从样品提取DNA；从所提取的DNA确定SEQ ID NO:1第101位的核苷酸或SEQ ID NO:1第102位的核苷酸的基因型；以及使用所确定的基因型预测白细胞减少症风险。
在一些实施方式中，当SEQ ID NO:1第101位的核苷酸的基因型是T或者当SEQ IDNO:1第102位的核苷酸的基因型是A时，预测白细胞减少症风险的步骤可将白细胞减少症风险预测为高。
在一些实施方式中，所述白细胞减少症可以由硫代嘌呤诱导。在一些实施方式中，所述硫代嘌呤优选为硫唑嘌呤(AZA)或6-巯基嘌呤(6-MP)，但实施方式不限于此。
在从样品提取DNA的步骤中，可从受试者的所有类型的细胞(例如血细胞、皮肤细胞、粘膜细胞或毛发细胞)分离DNA。从相应的细胞提取DNA的方法没有特别的限制，可以使用本领域惯用技术或提取DNA的商购试剂盒。
在确定基因型的步骤中，可以实施基因序列分析。序列分析可以通过使用本领域的任何惯用方法来实施，或者具体来说，可以通过使用但不限于自动DNA测序仪或选自惯用方法中的任一种来实施，例如焦磷酸测序、PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)、PCR-序列特异性寡核苷酸(PCR-SSO)、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)杂交(其中，PCR-SSO与斑点杂交组合)、TaqMan-PCR、MALDI-TOF/MS、滚环扩增(RCA)、高分辨率熔解(HRM)、引物延伸、Southern印迹杂交和斑点杂交。
本发明提供用于预测白细胞减少症风险的试剂盒，所述试剂盒包含探针或者引物，所述探针特异性结合于多核苷酸或其互补多核苷酸，所述引物用于扩增所述多核苷酸或其互补多核苷酸，其中，所述多核苷酸由10-100个连续的DNA序列组成，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1第101位的核苷酸和SEQ ID NO:1第102位的核苷酸中的至少一个单核苷酸多态性(SNP)标记。所述试剂盒优选是PCR试剂盒或DNA芯片试剂盒，但实施方式不限于此。
所述“探针”表示核酸片段(例如RNA或DNA)，其为具有数个碱基的短片段或具有数百个碱基的长片段，可以与mRNA特异性结合；对探针进行标记从而允许确认特定mRNA的存在和表达量。探针可以被制备成寡核苷酸探针、单链DNA探针、双链DNA探针或RNA探针的形式。可根据本领域惯用方法适当选择用于适合探针的选择和杂交的条件。
所述“引物”是具有短的游离3'-羟基基团并可与互补模板形成碱基对的核酸序列。引物表示其功能在于作为模板链复制起始点的短核酸序列。在适当的缓冲溶液中及温度下，在聚合反应试剂(即DNA聚合酶或反转录酶)和4种不同的核苷三磷酸的存在下，引物可以启动DNA合成。可根据本领域惯用方法对PCR条件以及正义引物和反义引物的长度进行适当选择。
实施例
以下，参照下述实施例详细说明本发明的一个或多个实施方式。然而，这些实施例仅是用于举例说明本发明的内容，并不旨在限制本发明的范围。提供本发明的实施例以使得本公开透彻且完整并将本发明的范围完全传达给本领域技术人员。
<实验实施例>
在本文中，将实施例作为对于根据本发明的各实施方式而言通用的实验实施例而提供。
1.研究人群
将在韩国首尔Asan医疗中心使用硫代嘌呤的1191名CD患者中的978名患者纳入本发明(参见图1、表1)。由于认为余下的213名患者接受了不充分的硫代嘌呤治疗，将他们排除在本发明之外。将未经历白细胞减少症但由于种种原因未接受≥8周的≥1mg/kg/天的AZA的患者(图1)认为是接受了不充分的治疗。978名参与者中，66名在硫代嘌呤治疗的最初8周内经历白细胞减少症(定义为早发性白细胞减少症病例)；280名在最初8周过后经历白细胞减少症(定义为迟发性白细胞减少症病例)；632名虽然接受了≥8周的≥1mg/kg/天的AZA，但未经历白细胞减少症(定义为对照)。所有研究参与者均为韩国血统。CD的诊断基于常规临床判断、放射性检查、内视镜检查和组织病理学检查标准。本研究得到Asan医疗中心机构审查委员会批准，并获得所有参与者的书面知情同意。
表1
*值为中值(范围)。CD表示克罗恩病。
Figure BDA0001117960400000072
全部分类变量的P值视情况使用卡方检验或费舍尔精确检验计算。连续变量的P值使用Mann-Whitney U检验计算。
2.硫代嘌呤的使用
硫代嘌呤的用药策略是开始给予低剂量的AZA或6-MP，并在几个月内缓慢增加用药，直至达到基于体重的目标剂量。本发明人未在硫代嘌呤治疗开始之前检查TPMT基因型或酶活性。由于不良事件造成的硫代嘌呤药物剂量调整或中断的决定由医师基于个案(case-by-case)做出。
3.白细胞减少症的判断
对每个患者的医疗记录进行回顾性评估，由不知道基因分型结果的3名医师中的2名对关于硫代嘌呤治疗的信息进行独立评估，所述信息包括剂量和治疗时间以及白细胞减少症的时机和严重程度。
在Asan医疗中心，WBC计数的正常范围介于4,000-10,000/mm3之间。在本研究中，白细胞减少症被定义为WBC计数低于3000/mm3，即，美国国立癌症研究所的不良事件通用术语标准(NCI-CTCAE)4.0版的2级或更高：2级介于2,000-3,000/mm3之间，3级介于1,000-2,000/mm3之间，4级低于1,000/mm3。介于3,000-4,000/mm3之间(NCI-CTCAE 1级)的WBC计数不认为是白细胞减少症，但是认为是临界白细胞减少症。在白细胞减少症多次发作的患者中，根据第一次发作时的最低计数确定白细胞减少症的级别。通过将6-MP剂量乘以2.08，将6-MP的剂量调整为AZA当量。
4.单核苷酸多态性基因分型以及关联分析
对硫代嘌呤治疗后发生白细胞减少症的197个病例(33名患有早发性白细胞减少症，164名患有迟发性白细胞减少症)以及307名未经历白细胞减少症的对照患者进行探索分析(discovery analysis)，没有发现任何P<10-5的信号。基于早发性白细胞减少症患者比迟发性白细胞减少症患者具有更大遗传变异效果的预测，接下来的分析关注于早发性白细胞减少症。使用免疫芯片在探索群组(discovery cohort)的33个早发性白细胞减少症病例和307名对照中实施探索分析。使用TaqMan SNP基因分型测定法在再现群组(replicationcohort)的另外33个早发性白细胞减少症病例以及325名对照中对探索分析选出的SNP实施第一阶段再现分析(replication analysis)。然后，在使用探索群组和再现群组中的280个迟发性白细胞减少症病例以及632名对照的第二阶段再现分析中，对探索分析和第一阶段再现分析中识别的SNP进行验证(图1)。我们还确定了所有参与者的TPMT基因型(rs1142345)。
5.填补(imputation)
为了改进遗传变异的覆盖范围，使用来自于1,000Genomes Project数据库(2012年2月发布)的亚洲人参考实验对象(Asian reference panel)(东京的日本人和北京的汉族人)以及IMPUTE(v2.0)，将未分型的基因型填补到探索样品中。
6.NUDT15的转染和细胞凋亡分析
为了研究NUDT15的编码变异(R139C)在硫代嘌呤诱导的细胞毒性效应中的功能性作用，本发明人测量了转染野生型或突变型NUDT15后Jurkat细胞对6-MP的敏感性。
使用脂质体2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)，用NUDT15野生型(139R)或NUDT15突变型(139C)转染Jurkat细胞。转染后，使细胞在37℃、5％CO2中恢复24小时，然后使用7.5μM6-MP(Sigma Aldrich，St.Louis，MS)处理细胞。通过细胞存活率和细胞凋亡分析测量细胞对7.5μM 6-MP的敏感性。为了评估细胞存活率，用培养基将细胞稀释4倍，然后使用台盼蓝细胞存活染色液稀释2倍。使用具有100×放大倍率的显微镜，通过血细胞计数器进行细胞计数，测量细胞存活率。在细胞凋亡分析中使用FITC膜联蛋白V/死细胞凋亡试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)。用PBS对细胞进行洗涤，并重悬于100μl 1×膜联蛋白结合缓冲液(包含10mM HEPES、140mM NaCl和2.5mM CaCl2，pH 7.4)(1×106个细胞/ml)中。然后，将细胞与1μl碘化丙啶(100μg/ml，在1×膜联蛋白结合缓冲液中稀释)和5μl FITC膜联蛋白V在室温下反应15分钟，然后向其中加入400μl 1×膜联蛋白结合缓冲液。使用膜联蛋白V和碘化丙啶染料，通过BD FACS Canto II(BD Biosciences，San Jose，CA)测量取决于药物处理的细胞凋亡。数据使用学生t检验进行分析，具有P<0.05的值被认为是统计学显著的。
<实施例1>早发性白细胞减少症中的探索关联分析
本发明人在33例早发性白细胞减少症患者和307名对照中对96,048个经基因分型的SNP进行探索关联分析，在分位数-分位数分布(quantile-quantile distribution)的尾部观察到P值过高，而总分布未显示出归因于群体分层(population stratification)而上涨(inflation)的任何迹象(λGC＝1.041)。探索分析表明P<10-5的4个关联，发现于3p25.1上的rs9843344(FBLN2)、6p22.3上的rs1986731(CMAHP-假基因)、8q24.22上的rs2945770(ST3GAL1)及14q31.1上的rs17109616(NRXN3)。另外，暗示性关联也发现于TPMT基因座内，其最主要的SNP为rs1142345(TPMT*3C)(优势比(odds ratio)，7.11；P＝1.61×10-4)(参见表2)。为了在探索分析中改进遗传变异的覆盖范围，本发明人还实施了453,532个填补的SNP的关联分析，并发现1q32、8q22、13q14和14q31上的4个P<10-5的额外基因座。只有13q14上的SUCLA2/NUDT15/MED4区域显示P<10-19的多重信号(rs79076357、rs1168552132、rs142829497、rs73481212)，其中最高值为rs142829497(优势比，24.2；P＝2.36×10-23)。除rs142829497以外，还选择了导致NUDT15第139位的氨基酸置换(碱性精氨酸变为极性半胱氨酸)的rs116855232进行验证。
表2
Figure BDA0001117960400000101
*P值使用等位基因关联检验计算。
Figure BDA0001117960400000102
组合P值使用Cochran-Mantel-Haenszel检验计算。
Figure BDA0001117960400000103
P BD：针对优势比异质性的Breslow-Day检验的渐近P值。
§这些SNP基于探索集合P<10-5中的填补数据而选择，所示出的数值为基因型经过确认的数据。
Chr表示染色体；CI表示置信区间；F_A，病例中的次要等位基因频率；F_U，对照中的次要等位基因频率；OR，优势比。
<实施例2>再现分析
为了验证探索分析所发现的SNP，本发明人首先在额外的33例早发性白细胞减少症患者和325名对照中对10个SNP进行基因分型。用rs73481212代替由于测定失败而从进一步分析中排除的rs142829497。确认了13q14上的SUCLA2/NUDT15/MED4区域内的2个SNP在全基因组上的显著性(表2)。非同义SNP rs116855232(R139C)在免疫芯片和验证的组合分析中显示最大的显著性和最强的关联性(优势比，35.6；组合P＝4.88×10-94)(表3)。另一个SNP rs73481212显示组合P值为1.92×10-70(表2)。rs73481212与rs116855232处于连锁不平衡(LD)，并且其关联性不独立于rs116855232(R139C)。定义完善的TPMT*3C等位基因(rs1142345)在验证样品中也显示出一致的关联性(P<0.05)，但是来自于组合样品的证据(P值为2.95×10-5)没有达到全基因组显著性(表2)。
表3
Figure BDA0001117960400000104
*P值使用等位基因关联检验计算。
Figure BDA0001117960400000105
组合P值使用Cochran-Mantel-Haenszel检验计算。
Figure BDA0001117960400000106
P BD：针对早发性和迟发性白细胞减少症之间优势比异质性的Breslow-Day检验的渐近P值。
CI表示置信区间；MAF，次要等位基因频率。
由于rs116855232处于包含SUCLA2、NUDT15和MED4的约185kb的LD区域内，本发明人在韩国人的SUCLA2/NUDT15/MED4区域内寻找非同义SNP。存在2个额外的非同义SNP，SUCLA2内的rs7320366和NUDT15内的rs186364861，两者都与rs116855232处于低LD(分别为r2＝0.33、0)。然而，只有rs7320366显示显著性，但是与白细胞减少症的关联性相对不强(优势比，5.03；组合P＝3.55×10-20)。随后的条件Logistic回归分析表明，SUCLA2中的rs7320366的关联性并不独立于最主要的SNP(NUDT15中的rs116855232)的关联性。
由于明确了rs116855232的T等位基因在早发性白细胞减少症的发生中起重要作用，本发明人随后实施了rs116855232与迟发性白细胞减少症病例的关联分析。如表4所示，与迟发性白细胞减少症的关联性比与早发性白细胞减少症的关联性弱得多。
表4
Figure BDA0001117960400000111
*P值使用等位基因关联检验计算。
Figure BDA0001117960400000112
组合P值使用Cochran-Mantel-Haenszel检验计算。
Figure BDA0001117960400000113
P BD：针对早发性和迟发性白细胞减少症之间优势比异质性的Breslow-Day检验的渐近P值。
CI表示置信区间；MAF，次要等位基因频率。
<实施例3>作为白细胞减少症的风险预测指标的NUDT15R139C
基于探索分析和再现分析的合并样品，本发明人发现NUDT15 139C等位基因存在于全部白细胞减少症病例的42.5％(147/346)以及对照的6.8％(43/632)中(表5)，表明NUDT15 139C的存在作为全部白细胞减少症的风险预测指标具有42.5％(147/346)的灵敏度和93.2％(589/632)的特异性，其曲线下面积(AUC)值为0.68。就预测硫代嘌呤诱导的白细胞减少症而言，NUDT15 139C等位基因的阳性预测值和阴性预测值分别为77.4％(147/190)和74.7％(589/788)。
表5
Figure BDA0001117960400000115
P值使用费舍尔精确检验计算。
Figure BDA0001117960400000116
P值使用等位基因关联检验计算。
CI表示置信区间；NA为不适用。
当分析缩小至早发性白细胞减少症，NUDT15 139C等位基因存在于89.4％(59/66)的早发性白细胞减少症病例中，而仅存在于14.4％(131/912)的对照和迟发性白细胞减少症病例的组合样品中(表5)，表明NUDT15139C的存在作为早发性白细胞减少症的风险预测指标具有89.4％(59/66)的灵敏度和85.6％(781/912)的特异性，其曲线下面积(AUC)值为0.89。就预测硫代嘌呤诱导的早发性白细胞减少症而言，NUDT15139C等位基因的阳性预测值和阴性预测值分别为31.1％(59/190)和99.1％(781/788)。
根据上述结果，当与不携带NUDT15 139C等位基因拷贝的受试者相比时，携带1个拷贝的受试者发生硫代嘌呤诱导的早发性白细胞减少症的风险高88倍(杂合子优势比)(表5)。未发现139C等位基因为纯合子的对照。另外，随着NUDT15 139C等位基因拷贝数增加，白细胞减少症发生时硫代嘌呤的剂量降低，从硫代嘌呤治疗开始至白细胞减少症发生的时间间隔变短，并且白细胞减少症的级别变得更高(表6)。
表6
Figure BDA0001117960400000121
*值为中值(范围)。
Figure BDA0001117960400000122
全部分类变量的P值使用费舍尔精确检验计算。连续变量的P值使用Krus Kal-Wallis检验计算。
另一方面，TPMT*3C等位基因存在于12.1％(8/66)的早发性白细胞减少症病例中，而仅存在于2.2％(20/912)的对照和迟发性白细胞减少症病例的组合样品中，表明TPMT*3C等位基因的存在作为早发性白细胞减少症的风险预测指标具有12.1％(8/66)的灵敏度和97.8％(892/912)的特异性。在早发性和迟发性白细胞减少症的组合分析中，TPMT*3C等位基因存在于3.8％(13/346)的全部白细胞减少症病例以及2.4％(15/632)的对照中，表明TPMT*3C等位基因的存在作为全部白细胞减少症的风险预测指标具有3.8％(13/346)的灵敏度和97.6％(617/632)的特异性。
<实施例4>rs116855232的生物功能性结果
使用6-MP处理24小时后，与转染野生型的对照细胞相比，转染突变型NUDT15的存活细胞的数目减少(p<0.001，图2)。与转染野生型的对照细胞相比，在转染突变型的细胞中，细胞凋亡标记表面膜联蛋白4也显著增加(P＝0.02)，支持了突变型NUDT15在硫代嘌呤诱导的细胞毒性中的作用。
<实施例5>作为白细胞减少症的风险预测指标的NUDT15R139H
通过额外的分析，本发明人确认7名不具有NUDT15 139C等位基因的早发性白细胞减少症患者中的2名患者具有组氨酸(而不是半胱氨酸)作为第139位的氨基酸，并且，作为全部迟发性白细胞减少症患者和对照的分析结果，确认迟发性白细胞减少症患者中的4名患者具有组氨酸作为第139位的氨基酸(表7至表9)。
表7
补充表格。2个单核苷酸多态性(SNP)与硫代嘌呤诱导的早发性白细胞减少症的关联(早发性vs无)。
Chr，染色体；F_A，病例的次要等位基因频率；F_U，对照的次要等位基因频率；OR，优势比；CI，置信区间。
表8
补充表格。4个单核苷酸多态性(SNP)与硫代嘌呤诱导的迟发性白细胞减少症的关联(迟发性vs无)。
Figure BDA0001117960400000132
Chr，染色体；F_A，病例的次要等位基因频率；F_U，对照的次要等位基因频率；OR，优势比；CI，置信区间。
表9
补充表格。2个单核苷酸多态性(SNP)与硫代嘌呤诱导的白细胞减少症的关联(早发性+迟发性vs无)。
Chr，染色体；F_A，病例的次要等位基因频率；F_U，对照的次要等位基因频率；OR，优势比；CI，置信区间。
尽管通过具体地参照示例性实施方式对本发明的多种实施方式进行了详细描述，本领域技术人员将清楚理解的是，本文所使用的这些具体技术仅作为优选实例提供，并且本发明的各种实施方式的范围不应当局限于此。因此，本发明的实际范围应当仅被所附权利要求和所有等价的权利要求所定义。
Figure IDA0001117960460000011
Figure IDA0001117960460000021

Claims (7)

1.用于预测由硫代嘌呤诱导的白细胞减少症风险的组合物，其中，所述组合物含有由10-100个连续的DNA序列组成的多核苷酸或其互补多核苷酸，其中，所述多核苷酸包含SEQID NO:1第101位的核苷酸的等位基因型C/T和SEQ ID NO:1第102位的核苷酸的等位基因型A/G中的至少一个单核苷酸多态性(SNP)标记。
2.权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物用于在利用硫代嘌呤治疗的克罗恩病、溃疡性结肠炎、白血病或移植患者中预测白细胞减少症风险。
3.权利要求1所述的组合物，其中，所述硫代嘌呤是硫唑嘌呤(AZA)或6-巯基嘌呤(6-MP)。
4.组合物在制造用于预测由硫代嘌呤诱导的白细胞减少症风险的试剂盒中的用途，其中，所述组合物含有由10-100个连续的DNA序列组成的多核苷酸或其互补多核苷酸，其中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1第101位的核苷酸的等位基因型C/T和SEQ ID NO:1第102位的核苷酸的等位基因型A/G中的至少一个单核苷酸多态性(SNP)标记。
5.权利要求4所述的用途，其中，所述硫代嘌呤是硫唑嘌呤(AZA)或6-巯基嘌呤(6-MP)。
6.用于预测由硫代嘌呤诱导的白细胞减少症风险的试剂盒，所述试剂盒包含探针或者引物，所述探针特异性结合于多核苷酸或其互补多核苷酸，所述引物用于扩增所述多核苷酸或其互补多核苷酸，其中，所述多核苷酸由10-100个连续的DNA序列组成，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1第101位的核苷酸的等位基因型C/T和SEQ ID NO:1第102位的核苷酸的等位基因型A/G中的至少一个单核苷酸多态性(SNP)标记。
7.权利要求6所述的试剂盒，其中，所述硫代嘌呤是硫唑嘌呤(AZA)或6-巯基嘌呤(6-MP)。
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