CN107299137A - 一组高特异性的nudt15引物及探针 - Google Patents

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朱方何
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Abstract

本发明公开了一种高特异性的检测NUDT15基因的试剂盒，试剂盒含有检测NUDT15基因的探针和引物。该引物及探针对NUDT15的检测效果好，精确度高，检测时的信号强度大，因此可以极大地方便检测，并可用于检测巯嘌呤类药物适用性。

Description

一组高特异性的NUDT15引物及探针
技术领域
本发明涉及生物检测领域，特别涉及一组高特异性的NUDT15引物及探针。
背景技术
在临床上，使用巯嘌呤类药物可引起白细胞减少症，这不良反应可严重威胁患者的生命安全，美国的FDA建议，在使用巯基嘌呤类药物前接受TPMT(巯基嘌呤甲基转移酶)检测。然而让人遗憾的是，只有四分一使用巯基嘌呤出现白细胞减少的患者被检测出存在TPMT突变。
巯嘌呤类药物(如常见的咪唑硫嘌呤及6-巯基嘌呤)，广泛地应用在自身免疫疾病，器官移植及炎症疾病上。在欧洲，超过5％的炎症肠道疾病患者在接受巯基嘌呤药物治疗后出现白细胞减少症。近年发现，在使用巯嘌呤类药物后出现的不耐受的白血病患者和克罗恩病(炎症肠道病)均与NUDT15基因突变有很强的相关性。突变型的NUDT15的患病率可比野生型高出88倍。故而，检测NUDT15比检测TPMT更具有说服性和实际意义。
PCR-荧光探针法是一种高特异性的基因分型的检测方法，使用PCR-荧光探针法检测NUDT15的基因型，可以为医生在患者的个性化用药上提供帮助与指导。而PCR-荧光探针法的关键是获得特异性的引物和探针。目前，市面上并没有专门针对NUDT15的检测产品，因此设计专门的引物及探针具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于公开一组高特异性的NUDT15引物及探针。
本发明所采取的技术方案是：一种高特异性的检测NUDT15基因的试剂盒，试剂盒含有检测NUDT15基因的探针和引物。
优选的，检测NUDT15基因的引物是：
正向引物：5-’CCCACCAGATGGTTCAGATCTT-3’(SEQ ID NO：1)；
反向引物：5’-GTGGGTTCCTTGGGAAGAACTA-3’(SEQ ID NO：2)。
优选的，检测NUDT15基因的野生型探针序列是：ACAACGCAGTCCC(SEQ ID NO：3)。
优选的，检测NUDT15基因的突变体探针序列是：ACAACACAGTCCCC(SEQ ID NO：4)。
优选的，检测NUDT15基因的野生型探针含有发光基团和猝灭基团。
优选的，检测NUDT15基因的野生型探针含有发光基团FAM和猝灭基团MGB。
优选的，检测NUDT15基因的突变体探针含有发光基团和猝灭基团。
优选的，检测NUDT15基因的突变体探针含有发光基团VIC和猝灭基团MGB。
试剂盒在巯嘌呤类药物的适用性检测中的应用。
本发明的有益效果是：该引物及探针对NUDT15的检测效果好，精确度高，检测时的信号强度高，因此可以极大地方便检测，并可用于检测巯嘌呤类药物的适用性。
具体实施方式
实施例1
1)引物及探针的设计及筛选
NUD15-rs116855232位点设计多组引物及探针，并验证其扩增效率及特异性。
设计的引物及探针对如下：
2)以质粒为样本，验证各引物对及探针扩增效果及特异性。结果如下：
由上表可知，虽然三对引物均能对样本进行扩增，也能正确分型。但扩增效果并不一致，引物对1的信号强度比引物2及3都强，Ct值在18左右。引物对2信号强度最低，且Ct值在28左右，引物对3的信号强度介于两者之间，Ct值在26左右。故此，引物对1即本发明的引物对，具有明显的优势。
3)灵敏度度验证
考虑到引物对2信号强度不满足要求，故只验证引物对1及引物对2，取成人血液样本提取的DNA，稀释成50ng/μL、5ng/μL、0.5ng/μL，进行扩增。
结果表明，引物对2在样本浓度为5ng/μL开始，信号强度低，而引物对1在样本浓度为0.5ng/μL时仍能达到检测效果，灵敏度高。
将三种基因型的质粒稀释至104copies/μL，以此为模板，用引物对1进行的扩增，观察其信号强度及Ct值，若无信号或Ct值大于35，则视为该样品未扩增。结果表明本发明引物检出率为100％，特异性为100％。
4)本发明的引物对1及探针，检验66个样本，用直接测序法验证结果，结果如下：
野生型 杂合突变 纯合突变
直接测序法 54 11 1
本发明 54 11 1
符合率 100％ 100％ 100％
总结：本发明的引物和探针检测符合率为100％，特异性好，符合基因分型的要求。
实施例2：
用实施例1所筛选出的引物对1及探针，检测成人血液样本提取的DNA(样本1)，然后用直接测序法进行验证。
使用DNA提取试剂盒提取样本1的DNA。将提取出的基因组DNA溶解于TE缓冲溶液中，经紫外分光光度计测定浓度，配成50ng/μL的溶液，作为PCR扩增模板，进行检测。
样本检测结果为杂合型，Ct-FAM为27.635、Ct-VIC为29.423，与直接测序结果一致。
实施例3
用实施例1所筛选出的引物对1及探针，检测成人血液样本提取的DNA(样本2)，然后用直接测序法进行验证。
使用DNA提取试剂盒提取样本2的DNA。将提取出的基因组DNA溶解于TE缓冲溶液中，经紫外分光光度计测定浓度，配成100ng/μL的溶液，作为PCR扩增模板，进行检测。
样本检测结果为野生型，Ct值19.07，与直接测序结果一致。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州海思医疗科技有限公司
<120> 一组高特异性的NUDT15引物及探针
<130>
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cccaccagat ggttcagatc tt 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtgggttcct tgggaagaac ta 22
<210> 3
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acaacgcagt ccc 13
<210> 4
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
acaacacagt cccc 14
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
caccagcagg ttcagatcta 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atgggttcct tcggaagaac 20
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ccttccagat ggttcagatc tca 23
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gtggagtcct tgggaagaag t 21

Claims (9)

1.一种高特异性的检测NUDT15基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有检测NUDT15基因的探针和引物。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，检测NUDT15基因的引物是：
正向引物：5-’CCCACCAGATGGTTCAGATCTT-3’(SEQ ID NO：1)；
反向引物：5’-GTGGGTTCCTTGGGAAGAACTA-3’(SEQ ID NO：2)。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，检测NUDT15基因的野生型探针序列是：
ACAACGCAGTCCC(SEQ ID NO：3)，或其反向互补序列。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，检测NUDT15基因的突变体探针序列是：
ACAACACAGTCCCC(SEQ ID NO：4)，或其反向互补序列。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，检测NUDT15基因的野生型探针含有发光基团和猝灭基团。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，检测NUDT15基因的野生型探针含有发光基团FAM和猝灭基团MGB。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，检测NUDT15基因的突变体探针含有发光基团和猝灭基团，其是该发光基团与野生型探针发光基团不同。
8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，检测NUDT15基因的突变体探针含有发光基团VIC和猝灭基团MGB。
9.权利要求1～8任一项所述试剂盒在检测巯嘌呤类药物应用的适用性中的应用。
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