CN105671199A - 结肠癌化疗药物伊立替康敏感性相关基因ugt1a1的snp检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

结肠癌化疗药物伊立替康敏感性相关基因ugt1a1的snp检测试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种结肠癌化疗药物伊立替康敏感性相关基因UGT1A1的SNP检测试剂盒及其使用方法。分别加入检测UGT1A1*28多态性和UGT1A1*6多态性的对应特异引物和荧光探针，构成实时荧光定量PCR体系，经过Real-time？PCR反应，本领域技术人员通过荧光定量PCR仪所收集的数据确定检测对应UGT1A1基因位点的基因型。具有快速、灵敏、容易判断等优点，适合临床的检测和推广。

Description

结肠癌化疗药物伊立替康敏感性相关基因UGT1A1的SNP检测试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及医疗检测领域，更具体的说是涉及一种结肠癌化疗药物伊立替康敏感性相关基因UGT1A1的SNP检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
伊立替康(Irinotecan，CPT-11)，也叫开普拓，它对大多数的癌症都具有有效的抗癌活性，是最普遍的化疗处方药物之一，特别是对提高结直肠癌根治术后的长期生存率具有重要意义。然而20％的患者采用以伊利替康为基础的联合化疗方案，会发生严重的3-4级中性粒细胞减少及腹泻，毒性反应是这些患者不能耐受此药治疗的关键原因。伊立替康是无活性的前药，需经羟酸酯酶的活化转变为其活性代谢产物SN-38而发挥效用。具有药物活性的SN-38的主要清除途径，是通过肝脏UGT1A1的糖基化作用转变为无活性的SN-38G，后者通过尿液、胆汁排出体内。研究发现UGT1A1的表达是高度可变的，由此引起不同患者间SN-38糖基化反应的速率相差最高达50倍。UGT1A1基因启动子区具有一定多态性，其不典型TATA盒区域中包含了5-8个TA重复序列。其中以含6个TA重复序列的基因型最为常见。随着TA重复序列数目的增加，UGT1A1表达下降。UGT1A1*28指UGT1A1启动子不典型TATA盒区域包含了7个TA重复序列，该变异型与UGT1A1表达下降有关。在伊立替康治疗中，UGT1A1*28的突变导致活性代谢产物SN-38的显著积累，从而导致发生腹泻/中性粒细胞减少的几率显著增加。另外，UGT1A1*6发生突变后，会导致UGT1A1酶活性降低，也会导致SN-38在体内的积累。因此，UGT1A1基因型的检测可用于临床预测与伊立替康相关的严重毒副作用的发生。美国食品和药品监督管理局要求伊立替康的包装上注明该药容易使UGT1A1*28纯合突变患者产生嗜中性白血球减少症，并且叮嘱临床医师慎重考虑给药剂量。
目前针对基因多态性的检测方法最常见方法为测序法，该方法适合高通量多位点的检测，但操作耗时长且灵敏度低，不适合快速临床检测；高分辨率溶解曲线法对设备要求比较特殊，需要具有安装高分辨率软件、温度比较敏感的机器才能使用，它的临床推广存在一定的困难。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种能够实现快速检测结肠癌化疗药物伊立替康敏感性相关基因UGT1A1的SNP检测试剂盒及其使用方法。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种结肠癌化疗药物伊立替康敏感性相关基因UGT1A1的SNP检测试剂盒，其特征在于：包括下列体积份的组成构成：
所述引物为UGT1A1*28引物和UGT1A1*6引物，
所述UGT1A1*28包括：
正向引物：UGT1A1*28-F：5’-AACATTAACTTGGTGTATCG-3’；
反向引物：UGT1A1*28-R：5’-TCCTGCCAGAGGTTCG-3’；
所述UGT1A1*6引物包括：
正向引物：UGT1A1*6-F：5’-CACCTGACGCCTCGTTGTA-3’；
反向引物：UGT1A1*6-R：5’-CAGGGTACGTCTTCAAGGTGTAAA-3’；
所述探针为UGT1A1*28探针和UGT1A1*6探针
UGT1A1*28探针包括：
UGT1A1*28野生型探针：
5’-荧光基团-TTGCCATATATATATATATAAGTAGGA-MGB-3’；
UGT1A1*28突变型探针：
5’-荧光基团-TGCCATATATATATATATATAAGTAGGA-MGB-3’；
所述UGT1A1*6探针包括：
UGT1A1*6野生型探针：5’-荧光基团-CATCAGAGACGGAGCAT-MGB-3’；
UGT1A1*6突变型探针：5’-荧光基团-ATCAGAGACAGAGCAT-MGB-3’。
作为本发明的进一步改进，所述预混物为2×PCR酶反应预混液，所述2×PCR酶反应预混液含有0.1units/μl的TaqDNAPolymerase(recombinant)、4mmol/L的MgCl2、0.5mmol/L的dNTPs。
作为本发明的进一步改进，所述溶剂为双蒸水。
作为本发明的进一步改进，所述引物和探针体积比为1∶1。
作为本发明的进一步改进，所述正向引物和反向引物用量相同。
作为本发明的进一步改进，所述UGT1A1*28野生型探针和UGT1A1*28突变型探针用量相同。
作为本发明的进一步改进，所述UGT1A1*6野生型探针和UGT1A1*6突变型探针用量相同。
试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)提取待测人的基因组DNA；
2)每个PCR体系为包含体积分的：预混液10～25份，DNA模板1份，引物1～2份、探针1～2份；
3)将配置好的PCR体系放入荧光定量PCR仪中，进行Real-timePCR检测；反应条件为：
95℃10分钟预变性；循环阶段，95℃15秒并在此采集荧光信号，60℃1分钟，40-60个循环；
4)通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
作为本发明的最优选方案，
1)提取待测人的基因组DNA；
2)每个PCR体系中，包含2×PCR酶反应预混液15μL，DNA模板1μL，正向反向引物各1μL，野生型和突变型荧光探针各1μL，双蒸水10μL；
其中2×PCR酶反应预混液成分及含量：TaqDNAPolymerase(recombinant)：0.1units/μl；MgCl2：4mmol/L；dNTPs(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)：0.5mmol/L；
其中基因组DNA模板中DNA含量10-100ng，正向反向引物浓度100-1000nM，野生型和突变型荧光探针浓度100-1000nM；
3)将配置好的PCR体系放入荧光定量PCR仪中，进行Real-timePCR检测；反应条件为：
95℃10分钟预变性；循环阶段，95℃15秒并在此采集荧光信号，60℃1分钟，40-60个循环；
4)通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
以人基因组DNA为模板，分别加入检测UGT1A1*28型、UGT1A1*6型多态性的对应特异引物和荧光探针，构成实时荧光定量PCR体系，经过Real-timePCR反应，通过荧光定量PCR仪所收集的数据确定UGT1A1的基因型。
本发明的有益效果，本发明与现有技术中的直接测序法相比，不需要复杂的设备，本身就是对人体基因组中的一个序列进行检测。用荧光PCR法直接对提取出来的人DNA进行检测，具有较高的分辨度，不需要测序仪器，就可以是实现对于结肠癌化疗药物伊立替康敏感性相关基因的检测。同时，也大大缩短了检测时间，在判断上也十分直观，从最终导出的数据图中就可以直接得出结论，在判断上更加容易。
本申请方案具有快速、灵敏、容易判断等优点，适合临床的检测和推广。
附图说明
图1为UGT1A1*28位点野生型样品荧光定量PCR曲线图。
图2为UGT1A1*28位点杂合突变型样品荧光定量PCR曲线图。
图3为UGT1A1*28位点纯合突变型样品荧光定量PCR曲线图。
图4为UGT1A1*6位点野生型样品荧光定量PCR曲线图。
图5为UGT1A1*6位点杂合突变型样品荧光定量PCR曲线图。
图6为UGT1A1*6位点纯合突变型样品荧光定量PCR曲线图。
具体实施方式
下面将结合附图所给出的实施例对本发明做进一步的详述。
参照图1所示，本实施例的一种结肠癌化疗药物伊立替康敏感性相关基因UGT1A1的SNP检测试剂盒，其特征在于：包括下列体积份的组成构成：
所述引物为UGT1A1*28引物和UGT1A1*6引物，
所述UGT1A1*28包括：
正向引物：UGT1A1*28-F：5’-AACATTAACTTGGTGTATCG-3’；
反向引物：UGT1A1*28-R：5’-TCCTGCCAGAGGTTCG-3’；
所述UGT1A1*6引物包括：
正向引物：UGT1A1*6-F：5’-CACCTGACGCCTCGTTGTA-3’；
反向引物：UGT1A1*6-R：5’-CAGGGTACGTCTTCAAGGTGTAAA-3’；
所述探针为UGT1A1*28探针和UGT1A1*6探针
UGT1A1*28探针包括：
UGT1A1*28野生型探针：
5’-荧光基团-TTGCCATATATATATATATAAGTAGGA-MGB-3’；
UGT1A1*28突变型探针：
5’-荧光基团-TGCCATATATATATATATATAAGTAGGA-MGB-3’；
所述UGT1A1*6探针包括：
UGT1A1*6野生型探针：5’-荧光基团-CATCAGAGACGGAGCAT-MGB-3’；
UGT1A1*6突变型探针：5’-荧光基团-ATCAGAGACAGAGCAT-MGB-3’。
作为改进的一种具体实施方式，所述预混物为2×PCR酶反应预混液，所述2×PCR酶反应预混液含有0.1units/μl的TaqDNAPolymerase(recombinant)、4mmol/L的MgCl2、0.5mmol/L的dNTPs。
作为改进的一种具体实施方式，所述溶剂为双蒸水。
作为改进的一种具体实施方式，所述引物和探针体积比为1∶1。
作为改进的一种具体实施方式，所述正向引物和反向引物用量相同。
作为改进的一种具体实施方式，所述UGT1A1*28野生型探针和UGT1A1*28突变型探针用量相同。
作为改进的一种具体实施方式，所述UGT1A1*6野生型探针和UGT1A1*6突变型探针用量相同。
试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)提取待测人的基因组DNA；
2)每个PCR体系为包含体积分的：预混液10～25份，DNA模板1份，引物1～2份、探针1～2份；
3)将配置好的PCR体系放入荧光定量PCR仪中，进行Real-timePCR检测；反应条件为：
95℃10分钟预变性；循环阶段，95℃15秒并在此采集荧光信号，60℃1分钟，40-60个循环；
4)通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
作为本发明的最优选方案，
1)提取待测人的基因组DNA；
2)每个PCR体系中，包含2×PCR酶反应预混液15μL，DNA模板1μL，正向反向引物各1μL，野生型和突变型荧光探针各1μL，双蒸水10μL；
其中2×PCR酶反应预混液成分及含量：TaqDNAPolymerase(recombinant)：0.1units/μl；MgCl2：4mmol/L；dNTPs(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)：0.5mmol/L；
其中基因组DNA模板中DNA含量10-100ng，正向反向引物浓度100-1000nM，野生型和突变型荧光探针浓度100-1000nM；
3)将配置好的PCR体系放入荧光定量PCR仪中，进行Real-timePCR检测；反应条件为：
95℃10分钟预变性；循环阶段，95℃15秒并在此采集荧光信号，60℃1分钟，40-60个循环；
4)通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
以最优方案进行检测，选取样本为UGT1A1*28位点野生型样品、UGT1A1*28位点杂合突变型样品、UGT1A1*28位点纯合突变型样品、UGT1A1*6位点野生型样品、UGT1A1*6位点杂合突变型样品、UGT1A1*6位点纯合突变型样品进行检测。检测结果如图1至图6所示。
通过图1至图6的数据显示，本发明的试剂盒在检测结肠癌化疗药物伊立替康敏感性相关基因时，具有快速、灵敏、容易判断等优点，适合临床的检测和推广。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种结肠癌化疗药物伊立替康敏感性相关基因UGT1A1的SNP检测试剂盒，其特征在于：包括下列体积份的组成构成：
所述引物为UGT1A1*28引物和UGT1A1*6引物，
所述UGT1A1*28包括：
正向引物：UGT1A1*28-F：5’-AACATTAACTTGGTGTATCG-3’；
反向引物：UGT1A1*28-R：5’-TCCTGCCAGAGGTTCG-3’；
所述UGT1A1*6引物包括：
正向引物：UGT1A1*6-F：5’-CACCTGACGCCTCGTTGTA-3’；
反向引物：UGT1A1*6-R：5’-CAGGGTACGTCTTCAAGGTGTAAA-3’；
所述探针为UGT1A1*28探针和UGT1A1*6探针
UGT1A1*28探针包括：
UGT1A1*28野生型探针：
5’-荧光基团-TTGCCATATATATATATATAAGTAGGA-MGB-3’；
UGT1A1*28突变型探针：
5’-荧光基团-TGCCATATATATATATATATAAGTAGGA-MGB-3’；
所述UGT1A1*6探针包括：
UGT1A1*6野生型探针：5’-荧光基团-CATCAGAGACGGAGCAT-MGB-3’；
UGT1A1*6突变型探针：5’-荧光基团-ATCAGAGACAGAGCAT-MGB-3’。
2.根据权利要求1所述的结肠癌化疗药物伊立替康敏感性相关基因UGT1A1的SNP检测试剂盒，其特征在于：所述预混物为2×PCR酶反应预混液，所述2×PCR酶反应预混液含有0.1units/μl的TaqDNAPolymerase(recombinant)、4mmol/L的MgCl2、0.5mmol/L的dNTPs。
3.根据权利要求1和2所述的结肠癌化疗药物伊立替康敏感性相关基因UGT1A1的SNP检测试剂盒，其特征在于：所述溶剂为双蒸水。
4.根据权利要求3所述的结肠癌化疗药物伊立替康敏感性相关基因UGT1A1的SNP检测试剂盒，其特征在于：所述引物和探针体积比为1∶1。
5.根据权利要求1所述的结肠癌化疗药物伊立替康敏感性相关基因UGT1A1的SNP检测试剂盒，其特征在于：所述正向引物和反向引物用量相同。
6.根据权利要求1所述的结肠癌化疗药物伊立替康敏感性相关基因UGT1A1的SNP检测试剂盒，其特征在于：所述野生型探针和突变型探针用量相同。
7.如权利要求1至6所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)提取待测人的基因组DNA；
2)每个PCR体系为包含体积份的：预混液10～25份，DNA模板1份，引物1～2份、探针1～2份；
3)将配置好的PCR体系放入荧光定量PCR仪中，进行Real-timePCR检测；反应条件为：
95℃10分钟预变性；循环阶段，95℃15秒并在此采集荧光信号，60℃1分钟，40-60个循环；
4)通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
8.如权利要求7所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)提取待测人的基因组DNA；
2)每个PCR体系，包含2×PCR酶反应预混液15μL，DNA模板1μL，正向反向引物各1μL，野生型和突变型荧光探针各1μL，双蒸水10μL；
其中2×PCR酶反应预混液成分及含量：TaqDNAPolymerase(recombinant)：0.1units/μl；MgCl2：4mmol/L；dNTPs(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)：0.5mmol/L；
其中基因组DNA模板中DNA含量10-100ng，正向反向引物浓度100-1000nM，野生型和突变型荧光探针浓度100-1000nM；
3)将配置好的PCR体系放入荧光定量PCR仪中，进行Real-timePCR检测；反应条件为：
95℃10分钟预变性；循环阶段，95℃15秒并在此采集荧光信号，60℃1分钟，40-60个循环；
4)通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
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