CN109371127A - 一种同时快速检测ugt1a1*6型与ugt1a1*28型基因多态性的试剂盒及方法 - Google Patents

一种同时快速检测ugt1a1*6型与ugt1a1*28型基因多态性的试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的试剂盒及方法，属于基因检测技术领域，用于检测与肿瘤化疗药物伊立替康不良反应相关基因UGT1A1*6型与*UGT1A1*28型基因多态性，包括用于人全血样本快速处理的样本处理试剂、经预混单人份分装的基因检测试剂、阳性对照品和阴性对照品。本发明在保证检出特异性和灵敏的基础之上，实现便捷、快速、高效地检测，减少检测操作步骤、缩减检测反应时间的同时减低了生产成本和检测成本，有利于临床检测分析应用。

Description

一种同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的 试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及一种基因多态性检测试剂盒及方法，特别是涉及一种同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的试剂盒及方法，属于基因检测技术领域。
背景技术
尿苷二磷酸葡萄糖醛酰转移酶(UGTs)是一大类能催化葡萄糖醛酸与亲核底物结合的膜结合酶，主要存在于肝脏和肝外组织内质网，UGT分为两个家族，已经发现有17种人类的基因编码不同序列的UGT，酶的表达具有明显的组织特异性，主要在肝脏中表达，其他组织包括脑、肾、胃肠道等，UDP-葡萄糖醛基转移酶1A1(简称UGT1A1)，参与多种物质的葡萄糖醛基化，这一结合反应的目的在于增加底物的水溶性，增加从胆汁和尿液中的排泄量，达到物质代谢、解毒的目的，UGT1A1基因有30多个等位基因，其中一些SNP可影响酶的功能和分步。
伊立替康是(Irenotecan，CPT-11)是喜树碱半合成衍生物，在体内经羟酸酯酶水解成7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)，SN-38是DNA拓扑异构酶I的抑制剂，作用于细胞周期S期，抑制、干扰DNA修复和转录，伊立替康自用于临床后，一直是治疗直结肠癌最有效的化疗药物之一，但在临床使用中，也发现伊立替康会导致严重的血液毒性和消化道毒性，表现为腹泻和中性粒细胞减少，发生率可达30％和50％，严重时会导致死亡。
临床研究表明UGT1A1*6型和*UGT1A1*28型与伊立替康引发的副反应有着强相关性，且种族差异，在高加索患者中，UGT1A1*28纯和子(TA7/7)和杂合子(TA6/7)显著增加患者发生严重粒细胞减少和腹泻的风险，而在亚洲患者中，UGT1A1*6型突变显著增加患者发生3-4级中性粒细胞减少、血小板减少及腹泻的风险。
UGT1A1*6型的多态性表现为c.211G>A。亚洲人群中，A/G和A/A携带者在伊立替康治疗中，发生3-4级中性粒细胞减少和非血液学毒性的风险显著提高，UGT1A1*6型突变在亚洲人群中的携带比例高达13-23％，UGT1A1*28多态性是指UGT1A1基因启动子区TA碱基重复序列的多态性，正常野生型为6个TA重复序列(TA6)，而*UGT1A1*28型则含7个TA重复序列(TA7)，根据TA重复序列的多少，可以分为*1/*1、*1/*28和*28/*28。UGT1A1*28纯合突变型在非洲人和高加索人中频率较高达到12-27％和5-15％，在亚洲人中，仅为1.2-5％。
发明内容
本发明的主要目的是为了提供一种同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的试剂盒及方法，解决现有技术检测UGT1A1*6型与*UGT1A1*28型基因多态性时对样本处理要求高、检测周期长、操作复杂、成本高和特异性不强等不足。
本发明的目的可以通过采用如下技术方案达到：
一种同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的试剂盒，用于检测与肿瘤化疗药物伊立替康不良反应相关基因UGT1A1*6型与*UGT1A1*28型基因多态性，包括样本处理试剂、基因检测试剂、阳性对照品和阴性对照品。
进一步的，基因检测试剂采用PCR8联管单人份预混分装，包括：
检测UGT1A1*6型引物对：SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2；
检测UGT1A1*6(211G＞A)型特异性探针SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4；
检测UGT1A1*28(6TA＞7TA)型引物对：SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6；
检测UGT1A1*28型特异性探针SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8；
探针核酸序列5’采用FAM、JOE、VIC、NED和ROX中的一种修饰，探针核酸序列3’采用MGB-NFQ基团修饰。
进一步的，引物探针设计如下：
SEQ ID NO.1为UGT1A1 211G＞A上游引物：
5’-AGCTCCACCTTCTTATCTCTG-3’；
SEQ ID NO.2为UGT1A1 211G＞A下游引物：
5’-TTGTGCAGTAAGTGGGAACA-3’；
SEQ ID NO.3为UGT1A1 211G荧光探针：
5’-荧光基团-TAAATGCTCGTCTCT-MGB-NFQ-3’；
SEQ ID NO.4为UGT1A1 211A荧光探针：
5’-荧光基团-TAAATGCTCtGTCTCT-MGB-NFQ-3’；
SEQ ID NO.5为UGT1A1 6TA＞7TA上游引物：
5’-CATTAACTTGGTGTATCGATTGGT-3’；
SEQ ID NO.6为UGT1A1 6TA＞7TA下游引物：
5’-CAGCATGGGACACCACTG-3’；
SEQ ID NO.7为UGT1A1 6TA荧光探针：
5’-荧光基团-TGCCATATATATATATATAGTAG-MGB-NFQ-3’；
SEQ ID NO.8为UGT1A1 7TA荧光探针：
5’-荧光基团-GCCATATATATATATATATAAGTA-MGB-NFQ-3’。
进一步的，基因检测试剂还包括：还包括用于内部质控的内参引物对SEQ IDNO.11-SEQ ID NO.12和内参探针SEQ ID NO.13，探针采用TaqMan探针，5’修饰CY5荧光基团，3’采用BHQ淬灭基团修饰。
进一步的，引物探针设计如下：
SEQ ID NO.11为内参上游引物：
5’-CCTTCCTGCCACCGCTGAT-3’；
SEQ ID NO.12为内参下游引物：
5’-TGCCTTCGCAACCATTCCCTTA-3’；
SEQ ID NO.13为内参探针：
5’-荧光基团-CGCTATGCTCCGCGCGCATCGTCTGCTC-BHQ-3’。
进一步的，基因检测试剂还包括：具有抗PCR酶抑制剂的PCR预混液-TaqPathProAmp Master Mix，预混液包含经修饰后的Hotstart-Taq聚合酶、UNG酶、ROX荧光校准染料、dNTP、MgCl2、PCR buffer。
进一步的，阳性对照品为混合UGT1A1 211G、211A、6TA、7TA基因质粒DNA和内参质粒DNA；阴性对照品为不含靶基因和内参基因的超纯水。
一种同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的方法，包括如下步骤：
步骤1：取EDTA抗凝全血样本，取2μL，加入20μL样本处理试剂，在37℃条件下孵育5min；
步骤2：将步骤1所得样本2μL，分别加入到18μL预混分装的MTHFR、MTRR野生型和突变型基因检测试剂中，混匀后进行PCR扩增检测；
步骤3：设置仪器反应流程和参数，检测反应；
步骤4：根据同一基因位点野生型和突变型荧光通道Ct.值之差△Ct.值确定样本基因分型。
进一步的，步骤3中，反应参数为：
第1阶段：95℃，10min，1个循环；
第2阶段：95℃，10S，40个循环；
第3阶段：60℃，30S，40个循环，在第3阶段打开荧光通道收集荧光值。
进一步的，步骤4中，基因分型判读结果如下：
内参Ct值≤35，△Ct.＝Ct突变-Ct野生，△Ct.≥3，基因型别为：UGT1A1【211G/G、6TA/6TA】；
内参Ct值≤35，△Ct.＝Ct突变-Ct野生，-3＜△Ct.＜3，基因型别为：UGT1A1【211G/A、6TA/7TA】；
内参Ct值≤35，△Ct.＝Ct突变-Ct野生，△Ct.≤-3，基因型别为：UGT1A1【211A/A、7TA/7TA】。
本发明的有益技术效果：
1、本发明提供的同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的试剂盒及方法，针对样本需要进行gDNA提取纯化等耗时、耗力、耗费的操作，配套了样本快速处理试剂，极大地降低了操作步骤和操作时间，具体地处理方法为：取2μLEDTA抗凝全血样本，加入到20μL样本处理试剂，在37℃条件下孵育5min即完成处理。
2、本发明提供的同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的试剂盒及方法，针对样本处理方式的改变和多重PCR反应体系的要求，采用含经修饰的Hotstart-Taq聚合酶和优化的缓冲体系的PCR预混液-TaqPath ProAmp Master Mix，使检测体系对于样本的抗抑制能力大大提升，使基因检测试剂具备高效多重PCR反应能力，预混液含稳定试剂成分，有利于混合状态下的试剂长期稳定保存，增强了试剂的稳定性。
3、本发明提供的同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的试剂盒及方法，针对每次检测，每个检测体系只能进行单重PCR反应，每个反应体系只能检测一个基因位点多态性的不足，基因检测试剂将多对引物和多条经不同荧光染料基团修饰的特异性荧光探针与PCR预混液配制预混成一个反应体系，利用TaqPath ProAmp Master Mix预混液多重反应能力，使不同靶基因在多对特异性引物结合下高效多重PCR扩增，并利用标记不同荧光染料基团的MGB-NFQ和TaqMan-BHQ荧光探针对目标产物进行实时检测分析，所有检测引物和特异性探针配制成一个检测试剂，预混单管包装，方便检测，实现了一个反应体系的多基因变异分析，减低生产和检测成本的同时提升了检测效率。
附图说明
图1为本发明检测结果为UGT1A1 211G/G、6TA/6TA；
图2为本发明检测结果为UGT1A1 211G/A、6TA/6TA；
图3为本发明检测结果为UGT1A1 211G/A、6TA/7TA；
图4为本发明检测结果为UGT1A1 211A/A、6TA/6TA；
图5为本发明检测结果为UGT1A1 211A/A、6TA/7TA；
图6为本发明检测结果为UGT1A1 211A/A、7TA/7TA。
具体实施方式
为使本领域技术人员更加清楚和明确本发明的技术方案，下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
在本实施例中，是根据图形结果判读基因型，图1为本发明检测结果为UGT1A1211G/G、6TA/6TA。
在本实施例中，是根据图形结果判读基因型，图2为本发明检测结果为UGT1A1211G/A、6TA/6TA。
在本实施例中，是根据图形结果判读基因型，图3为本发明检测结果为UGT1A1211G/A、6TA/7TA。
在本实施例中，是根据图形结果判读基因型，图4为本发明检测结果为UGT1A1211A/A、6TA/6TA。
在本实施例中，是根据图形结果判读基因型，图5为本发明检测结果为UGT1A1211A/A、6TA/7TA。
在本实施例中，是根据图形结果判读基因型，图6为本发明检测结果为UGT1A1211A/A、7TA/7TA。
本实施例提供的用于检测与肿瘤化疗药物伊立替康不良反应相关基因UGT1A1*6型与*UGT1A1*28型基因多态性，包括用于人全血样本快速处理的样本处理试剂、经预混单人份分装的基因检测试剂、阳性对照品和阴性对照品。
在本实施例中，本实施例针对现有技术检测UGT1A1*6型与*UGT1A1*28型基因多态性时对样本处理要求高、检测周期长、操作复杂、成本高和特异性不强等不足，提供了一种基于实时荧光定量PCR技术平台的检测试剂盒和方法。
在本实施例中，本实施例为提升检测的特异性和灵敏性，采用根据靶基因序列设计的特异性扩增引物对和MGB-NFQ荧光探针，进行特异扩增和实时检测分析，使其能特异性地检出UGT1A1*6型与*UGT1A1*28型基因多态性型基因突变。
在本实施例中，引物和探针设计如下：
UGT1A1 211G＞A上游引物：
5’-AGCTCCACCTTCTTATCTCTG-3’(SEQ ID NO.1)；
UGT1A1 211G＞A下游引物：
5’-TTGTGCAGTAAGTGGGAACA-3’(SEQ ID NO.2)；
UGT1A1 211G荧光探针：
5’-荧光基团-TAAATGCTCGTCTCT-MGB-NFQ-3’(SEQ ID NO.3)；
UGT1A1 211A荧光探针：
5’-荧光基团-TAAATGCTCTGTCTCT-MGB-NFQ-3’(SEQ ID NO.4)；
UGT1A1 6TA＞7TA上游引物：
5’-CATTAACTTGGTGTATCGATTGGT-3’(SEQ ID NO.5)；
UGT1A1 6TA＞7TA下游引物：
5’-CAGCATGGGACACCACTG-3’(SEQ ID NO.6)；
UGT1A1 6TA荧光探针：
5’-荧光基团-TGCCATATATATATATATAGTAG-MGB-NFQ-3’(SEQ ID NO.7)；
UGT1A1 7TA荧光探针：
5’-荧光基团-GCCATATATATATATATATAAGTA-MGB-NFQ-3’(SEQ ID NO.8)；
内参上游引物：
5’-CCTTCCTGCCACCGCTGAT-3’(SEQ ID NO.13)；
内参下游引物：
5’-TGCCTTCGCAACCATTCCCTTA-3’(SEQ ID NO.14)；
内参探针：
5’-荧光基团-CGCTATGCTCCGCGCGCATCGTCTGCTC-BHQ-3’(SEQ ID NO.15)；
探针核酸序列5’采用FAM、JOE、VIC、NED和ROX中的一种修饰，探针核酸序列3’采用MGB-NFQ基团修饰。
在本实施例中，本实施例针对样本需要进行gDNA提取纯化等耗时、耗力、耗费的操作，配套了样本快速处理试剂，极大地降低了操作步骤和操作时间，具体地处理方法为：取2μLEDTA抗凝全血样本，加入到20μL样本处理试剂，在37℃条件下孵育5min即完成处理。
在本实施例中，本实施例针对样本处理方式的改变和多重PCR反应体系的要求，采用含经修饰的Hotstart-Taq聚合酶和优化的缓冲体系的PCR预混液-TaqPath ProAmpMaster Mix，使检测体系对于样本的抗抑制能力大大提升，使基因检测试剂具备高效多重PCR反应能力，预混液含稳定试剂成分，有利于混合状态下的试剂长期稳定保存，增强了试剂的稳定性。
在本实施例中，本实施例针对每次检测，每个检测体系只能进行单重PCR反应，每个反应体系只能检测一个基因位点多态性的不足，基因检测试剂将多对引物和多条经不同荧光染料基团修饰的特异性荧光探针与PCR预混液配制预混成一个反应体系，利用TaqPathProAmp Master Mix预混液多重反应能力，使不同靶基因在多对特异性引物结合下高效多重PCR扩增，并利用标记不同荧光染料基团的MGB-NFQ和TaqMan-BHQ荧光探针对目标产物进行实时检测分析。所有检测引物和特异性探针配制成一个检测试剂，预混单管包装，方便检测，实现了一个反应体系的多基因变异分析。减低生产和检测成本的同时提升了检测效率，检测试剂组成成分如下表1所示：
表1检测试剂组成成分
在本实施例中，本实施例针对检测质控需求，设置了阳性对照品和阴性对照品，阳性对照品为混合UGT1A1 211G、211A、6TA、7TA基因及内参基因质粒的混合核酸溶液，浓度0.01-1pg/μl，空白对照是不含靶基因核酸的超纯水，检测时视对照品为待测样本，加入基因检测试剂，阳性对照品各检测信号和内参信号曲线应呈S型升起，且对应Ct.值小于阳性判定值，空白对照品应无曲线升起，且对应Ct.值大于阳性判定值，否则检测失效，结果不可信。
在本实施例中，本实施例的检测流程：
第1步：样本快速处理，取EDTA抗凝全血样本，取2μL，加入20μL样本处理试剂，在37℃条件下孵育5min；
第2步：将第1步所得样本2μL，分别加入到18μL预混分装的野生型和突变型基因检测试剂中，混匀后进行PCR扩增；
第3步：设置仪器反应流程和参数，用于检测反应，反应参数为：
第1阶段：95℃，10min，1个循环；
第2阶段：95℃，10S，40个循环；
第3阶段：60℃，30S，40个循环，在第,3阶段打开荧光通道收集荧光值；
第4步：根据同一基因位点野生型和突变型荧光通道Ct.值之差△Ct.值确定样本基因分型，检测阳性结果应有典型S型扩增曲线升起，且Ct.值小于判定值。
检测时设置仪器反应参数，打开仪器相应荧光收集通道。
反应参数为：
第1阶段：95℃，10min，1个循环；
第2阶段：95℃，10S，40个循环；
第3阶段：60℃，30S，40个循环。
在第3阶段打开荧光通道收集荧光值，仪器根据通道荧光信号值变化情况，生产扩增曲线并获得扩增Ct.值，阳性值判定如表2所示：
表2阳性值判定
内参Ct值 Ct突变-Ct野生 基因型别
≤35 △Ct.≥3 UGT1A1【211G/G、6TA/6TA】
≤35 -3＜△Ct.＜3 UGT1A1【211G/A、6TA/7TA】
≤35 △Ct.≤-3 UGT1A1【211A/A、7TA/7TA】
在本实施例中，将金标准sanger测序法鉴定为UGT1A1 211GG、211GA、211AA和6TA/6TA、6TA/7TA、7TA/7TA基因样本，加入UGT1A1基因检测试剂进行同步盲测。最后揭盲，与金标准结果对比，结果本试剂盒及检测方法测得的结果均与测序法结果相符。
在本实施例中，本实施例提供的同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的试剂盒及方法，针对样本需要进行gDNA提取纯化等耗时、耗力、耗费的操作，配套了样本快速处理试剂，极大地降低了操作步骤和操作时间，具体地处理方法为：取2μLEDTA抗凝全血样本，加入到20μL样本处理试剂，在37℃条件下孵育5min即完成处理。
在本实施例中，本实施例提供的同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的试剂盒及方法，针对样本处理方式的改变和多重PCR反应体系的要求，采用含经修饰的Hotstart-Taq聚合酶和优化的缓冲体系的PCR预混液-TaqPath ProAmp Master Mix，使检测体系对于样本的抗抑制能力大大提升，使基因检测试剂具备高效多重PCR反应能力，预混液含稳定试剂成分，有利于混合状态下的试剂长期稳定保存，增强了试剂的稳定性。
在本实施例中，本实施例提供的同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的试剂盒及方法，针对每次检测，每个检测体系只能进行单重PCR反应，每个反应体系只能检测一个基因位点多态性的不足，基因检测试剂将多对引物和多条经不同荧光染料基团修饰的特异性荧光探针与PCR预混液配制预混成一个反应体系，利用TaqPath ProAmpMaster Mix预混液多重反应能力，使不同靶基因在多对特异性引物结合下高效多重PCR扩增，并利用标记不同荧光染料基团的MGB-NFQ和TaqMan-BHQ荧光探针对目标产物进行实时检测分析，所有检测引物和特异性探针配制成一个检测试剂，预混单管包装，方便检测，实现了一个反应体系的多基因变异分析，减低生产和检测成本的同时提升了检测效率。
综上所述，在本实施例中，本实施例提供的同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的试剂盒及方法，在保证检出特异性和灵敏的基础之上，实现便捷、快速、高效地检测，减少检测操作步骤、缩减检测反应时间的同时减低了生产成本和检测成本，有利于临床检测分析应用。
以上所述，仅为本发明进一步的实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所公开的范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的试剂盒，其特征在于，用于检测与肿瘤化疗药物伊立替康不良反应相关基因UGT1A1*6型与*UGT1A1*28型基因多态性，包括样本处理试剂、基因检测试剂、阳性对照品和阴性对照品。
2.如权利要求1所述的一种同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的试剂盒，其特征在于，基因检测试剂采用PCR8联管单人份预混分装，包括：
检测UGT1A1*6型引物对：SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2；
检测UGT1A1*6(211G＞A)型特异性探针SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4；
检测UGT1A1*28(6TA＞7TA)型引物对：SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6；
检测UGT1A1*28型特异性探针SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8；
探针核酸序列5’采用FAM、JOE、VIC、NED和ROX中的一种修饰，探针核酸序列3’采用MGB-NFQ基团修饰。
3.如权利要求2所述的一种同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的试剂盒，其特征在于，引物探针设计如下：
SEQ ID NO.1为UGT1A1 211G＞A上游引物：
5’-AGCTCCACCTTCTTATCTCTG-3’；
SEQ ID NO.2为UGT1A1 211G＞A下游引物：
5’-TTGTGCAGTAAGTGGGAACA-3’；
SEQ ID NO.3为UGT1A1 211G荧光探针：
5’-荧光基团-TAAATGCTCGTCTCT-MGB-NFQ-3’；
SEQ ID NO.4为UGT1A1 211A荧光探针：
5’-荧光基团-TAAATGCTCTGTCTCT-MGB-NFQ-3’；
SEQ ID NO.5为UGT1A1 6TA＞7TA上游引物：
5’-CATTAACTTGGTGTATCGATTGGT-3’；
SEQ ID NO.6为UGT1A1 6TA＞7TA下游引物：
5’-CAGCATGGGACACCACTG-3’；
SEQ ID NO.7为UGT1A1 6TA荧光探针：
5’-荧光基团-TGCCATATATATATATATAGTAG-MGB-NFQ-3’；
SEQ ID NO.8为UGT1A1 7TA荧光探针：
5’-荧光基团-GCCATATATATATATATATAAGTA-MGB-NFQ-3’。
4.如权利要求1所述的一种同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的试剂盒，其特征在于，基因检测试剂还包括：还包括用于内部质控的内参引物对SEQ IDNO.11-SEQ ID NO.12和内参探针SEQ ID NO.13，探针采用TaqMan探针，5’修饰CY5荧光基团，3’采用BHQ淬灭基团修饰。
5.如权利要求4所述的一种同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的试剂盒，其特征在于，引物探针设计如下：
SEQ ID NO.11为内参上游引物：
5’-CCTTCCTGCCACCGCTGAT-3’；
SEQ ID NO.12为内参下游引物：
5’-TGCCTTCGCAACCATTCCCTTA-3’；
SEQ ID NO.13为内参探针：
5’-荧光基团-CGCTATGCTCCGCGCGCATCGTCTGCTC-BHQ-3’。
6.如权利要求1所述的一种同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的试剂盒，其特征在于，基因检测试剂还包括：具有抗PCR酶抑制剂的PCR预混液-TaqPathProAmp Master Mix，预混液包含经修饰后的Hotstart-Taq聚合酶、UNG酶、ROX荧光校准染料、dNTP、MgCl2、PCR buffer。
7.如权利要求1所述的一种同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的试剂盒，其特征在于，阳性对照品为混合UGT1A1 211G、211A、6TA、7TA基因质粒DNA和内参质粒DNA；阴性对照品为不含靶基因和内参基因的超纯水。
8.一种同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：取EDTA抗凝全血样本，取2μL，加入20μL样本处理试剂，在37℃条件下孵育5min；
步骤2：将步骤1所得样本2μL，分别加入到18μL预混分装的MTHFR、MTRR野生型和突变型基因检测试剂中，混匀后进行PCR扩增检测；
步骤3：设置仪器反应流程和参数，检测反应；
步骤4：根据同一基因位点野生型和突变型荧光通道Ct.值之差△Ct.值确定样本基因分型。
9.如权利要求8所述的一种同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的方法，其特征在于，步骤3中，反应参数为：
第1阶段：95℃，10min，1个循环；
第2阶段：95℃，10S，40个循环；
第3阶段：60℃，30S，40个循环，在第3阶段打开荧光通道收集荧光值。
10.如权利要求8所述的一种同时快速检测UGT1A1*6型与UGT1A1*28型基因多态性的方法，其特征在于，步骤4中，基因分型判读结果如下：
内参Ct值≤35，△Ct.＝Ct突变-Ct野生，△Ct.≥3，基因型别为：UGT1A1【211G/G、6TA/6TA】；
内参Ct值≤35，△Ct.＝Ct突变-Ct野生，-3＜△Ct.＜3，基因型别为：UGT1A1【211G/A、6TA/7TA】；
内参Ct值≤35，△Ct.＝Ct突变-Ct野生，△Ct.≤-3，基因型别为：UGT1A1【211A/A、7TA/7TA】。
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